ES2935767T3 - Proceso de fermentación - Google Patents
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Abstract
Un método para alterar el perfil de metabolitos de una fermentación, aumentando el flujo a través de acetolactato. Los métodos comprenden aumentar la producción de uno o más productos derivados del acetolactato. Además se proporciona un método para aumentar la producción de 2,3-butanodiol por fermentación microbiana de sustratos gaseosos, comprendiendo el método proporcionar un compuesto que inhibe una o más enzimas que convierten el acetolactato en aminoácidos de cadena ramificada para la fermentación. La presente invención proporciona además métodos para aumentar la producción de 2,3-butanodiol en relación con otros productos de fermentación tales como etanol y ácido acético. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Proceso de fermentación
Campo
La presente invención se refiere a métodos para alterar el perfil de metabolitos de un sistema de fermentación utilizando un compuesto. En particular, la invención se refiere a métodos para aumentar la producción de productos derivados de acetolactato.
Antecedentes de la invención
Los biocombustibles para transporte son sustitutos atractivos de la gasolina y se están introduciendo rápidamente en los mercados de combustibles como mezclas de baja concentración. Los biocombustibles, derivados de fuentes vegetales naturales, son más ecológicamente sostenibles que los derivados de los recursos fósiles (tales como gasolina), su uso permite una reducción en los niveles del denominado gas de dióxido de carbono (CO2) fósil, que se libera a la atmósfera como resultado de la combustión del combustible. Además, los biocombustibles se pueden producir localmente en muchas zonas geográficas y pueden actuar para reducir la dependencia de los recursos energéticos fósiles importados. Los alcoholes adecuados para su uso como biocombustibles incluyen etanol, butanol y 2,3-butanodiol.
El etanol se está convirtiendo rápidamente en un importante combustible de transporte líquido rico en hidrógeno en todo el mundo. El consumo mundial de etanol en 2002 fue de aproximadamente 10,8 mil millones de galones. También se espera que el mercado global de la industria del etanol como combustible crezca considerablemente en el futuro, debido a un mayor interés en el etanol en Europa, Japón, los EE.UU. y diversas naciones en desarrollo.
Los butanodioles, incluido 1,2-butanodiol, 1,3-butanodiol, 1,4-butanodiol y el 2,3-butanodiol se puede considerar que tienen una diversidad de ventajas sobre el etanol. Al igual que el etanol, los butanodioles pueden utilizarse directamente como un aditivo de combustible para automóviles. También pueden transformarse con relativa facilidad en diversos otros productos de valor posiblemente más alto y/o de mayor energía. Por ejemplo, el 2,3-butanodiol puede convertirse fácilmente, mediante un proceso de dos etapas, en un dímero de ocho carbonos que puede utilizarse como combustible de aviación.
La versatilidad del 2,3-butanodiol proviene de su estructura principal difuncional, es decir, 2 grupos hidroxilo se encuentran en átomos de C adyacentes permitiendo que la molécula se transforme muy fácilmente en sustancias tales como butadieno, butadiona, acetoína, metiletil cetona etc. Estos compuestos químicos se utilizan como moléculas base para fabricar una amplia gama de productos químicos producidos industrialmente.
Además, el 2,3-butanodiol puede usarse como combustible en un motor de combustión interna. En muchos sentidos, es más similar a la gasolina que al etanol. Como el interés en la producción y aplicación de combustibles ecológicamente sostenibles se ha fortalecido, ha aumentado el interés en los procesos biológicos para producir 2,3-butanodiol (a menudo denominado biobutanol).
El monóxido de carbono (CO) es un subproducto importante de la combustión incompleta de materiales orgánicos tales como carbón o petróleo y productos derivados del petróleo. Aunque la combustión completa de precursores que contienen carbono produce CO2 y agua como únicos productos finales, algunos procesos industriales requieren temperaturas elevadas que favorezcan la acumulación de monóxido de carbono sobre CO2. Un ejemplo es la industria del acero, donde se necesitan altas temperaturas para generar las calidades de acero deseadas. Por ejemplo, se informa que la industria del acero en Australia produce y libera a la atmósfera más de 500.000 toneladas de CO anualmente.
Asimismo, el CO también es un componente principal del gas de síntesis, donde se generan cantidades variables de CO y H2 por gasificación de un combustible que contiene carbono. Por ejemplo, el gas de síntesis puede producirse mediante el craqueo de la biomasa orgánica de maderas de desecho y de madera para generar precursores para la producción de combustibles y productos químicos más complejos.
La liberación de CO a la atmósfera puede tener un impacto medioambiental significativo. Además, se puede exigir el pago de impuestos sobre las emisiones, lo que aumenta los costes para las plantas industriales. Dado que el CO es una molécula rica en energía reactiva, se puede utilizar como compuesto precursor para la producción de una diversidad de productos químicos. Sin embargo, esta valiosa materia prima no se ha utilizado para producir 2,3-butanodiol.
Se ha demostrado que el 2,3-butanodiol puede producirse por fermentación microbiana de materia prima que contiene carbohidratos (Syu MJ, Appl Microbiol Biotechnol 55:10-18 (2001), Qin et al., Chinese JChem Eng 14(1): 132-136 (2006)). El 2,3-butanodiol también puede producirse por fermentación microbiana de biomasa de cultivos como la remolacha azucarera, maíz, trigo y caña de azúcar. Sin embargo, el coste de estas materias primas de carbohidratos
depende de su valor como alimento humano o animal y el cultivo de plantas productoras de almidón o sacarosa para la producción de 2,3-butanodiol no es económicamente sostenible en todas las zonas geográficas. Por lo tanto, es interesante desarrollar tecnologías para convertir los recursos de carbono de bajo coste y/o más abundantes en 2,3-butanodiol.
Se ha demostrado la producción de 2,3-butanodiol por fermentación microbiana de sustratos gaseosos que comprenden CO. Sin embargo, la producción de 2,3-butanodiol mediante estos procesos ha sido un producto secundario. La producción de otros productos, incluido el etanol, se favorece en la fermentación. El butanodiol tiene mayor valor que los otros productos producidos en dichas fermentaciones. Es deseable poder repercutir sobre la fermentación de tal manera que se aumente la producción de 2,3-butanodiol. Anteriormente se ha demostrado que el aumento de la productividad de 2,3-butanodiol estaba influenciado por una tasa de consumo de hidrógeno por un cultivo microbiano (documento WO2012131627).
Sigue existiendo la necesidad en la técnica de aumentar la capacidad de producir productos valiosos a partir de sustratos gaseosos industriales de maneras económicamente beneficiosas. Existe la necesidad de mejorar la producción de 2,3-butanodiol en relación con la producción de otros productos que se producen habitualmente en la fermentación de sustratos gaseosos mediante bacterias carboxidotróficas.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona una respuesta a la necesidad en la materia. La presente invención proporciona métodos para alterar el perfil de metabolitos de una fermentación. En particular, la invención proporciona métodos para aumentar el flujo a través de acetolactato. En determinadas realizaciones, la invención proporciona métodos para aumentar la producción de uno o más productos derivados de acetolactato. En una realización particular, la invención proporciona un método para aumentar la producción de 2,3-butanodiol por fermentación microbiana de sustratos gaseosos. También se describen métodos para aumentar la producción de 2,3-butanodiol en relación con otros productos de fermentación tales como etanol y ácido acético.
En un primer aspecto, la invención proporciona un método para aumentar la producción de al menos un producto derivado de acetolactato, comprendiendo el método: a. proporcionar un sustrato gaseoso seleccionado del grupo que consiste en CO, CO2 , H2 y mezclas de los mismos, a un biorreactor que comprenda un cultivo de al menos un microorganismo carboxidotrófico acetogénico en un medio nutritivo líquido; y b. fermentar dicho cultivo de al menos un microorganismo carboxidotrófico acetogénico para producir al menos un producto de fermentación a partir de dicho sustrato gaseoso; y c. inhibir el flujo de carbono a los aminoácidos de cadena ramificada mediante la adición de al menos un compuesto al medio nutritivo líquido, en donde el al menos un compuesto se selecciona del grupo que consiste en ácido 2-hidroxiisobutírico (2-HIBA), ácido 2-hidroxil-2-metilbutírico, 2-hidroxibutirato, ácido 2-hidroxi-3-metilbutírico, 2-ceto-3-hidroxiisovalerato y 2-cetoisovalerato.
En un segundo aspecto, la invención proporciona el método del primer aspecto, en donde el al menos un producto de fermentación se selecciona del grupo que consiste en ácido acético, etanol, 2,3-butanodiol, 2-butanona, 2-butanol, acetoína, isopropanol, lactato, succinato, metil etil cetona (MEC), propanodiol, 2-propanol, acetoína, iso-butanol, citramalato, butadieno, ácido poliláctico, 3-hidroxibutirato, isobutileno, 3-hidroxi propionato (3HP), acetona y ácidos grasos.
En un tercer aspecto, la invención proporciona el método del primer aspecto, en donde el sustrato gaseoso comprende CO, CO2 y H2.
En un cuarto aspecto, la invención proporciona el método del primer aspecto, en donde el al menos un microorganismo carboxidotrófico acetogénico se selecciona del grupo que consiste en Clostridium, Moorella, Oxobacter, Peptostreptococcus, Acetobacterium, Eubacterium o Butyribacterium.
En un quinto aspecto, la invención proporciona el método del cuarto aspecto, en donde el microorganismo carboxidotrófico acetogénico se selecciona del grupo que consiste en Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahli, Clostridium carboxidivorans, Clostridium drakei, Clostridium scatologenes, Clostridium aceticum, Clostridium formicoaceticum, Clostridium magnum, Butyribacterium methylotrophicum, Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchi, Blautia producta, Eubacterium limosum, Moorella thermoacetica, Sporomusa ovata, Sporomusa silvacetica, Sporomusa sphaeroides, Oxobacter pfennigii y Thermoanaerobacter kiuvi.
En un sexto aspecto, la invención proporciona un método para aumentar la producción de 2,3-butanodiol, comprendiendo el método; a. añadir un sustrato gaseoso que comprenda CO a un biorreactor que comprenda un cultivo de al menos un microorganismo carboxidotrófico acetogénico en un medio nutritivo líquido, para producir al menos 2,3-butanodiol; y b. proporcionar al medio nutritivo líquido al menos un compuesto que inhiba el flujo de carbono a los aminoácidos de cadena ramificada, en donde el al menos un compuesto se selecciona del grupo que consiste en ácido 2-hidroxiisobutírico (2-HIBA), ácido 2-hidroxil-2-metilbutírico, 2-hidroxibutirato, ácido 2-hidroxi-3-metilbutírico, 2-ceto-3-hidroxiisovalerato y 2-cetoisovalerato.
En un séptimo aspecto, la invención proporciona el método del sexto aspecto en el que el método produce además al menos un producto seleccionado del grupo que consiste en ácido acético, etanol, 2-butanona, 2-butanol, acetoína, isopropanol, lactato, succinato, metil etil cetona (MEC), propanodiol, 2-propanol, acetoína, iso-butanol, citramalato, butadieno, ácido poliláctico, 3-hidroxibutirato, isobutileno, 3-hidroxi propionato (3HP), acetona y ácidos grasos. En un octavo aspecto, la invención proporciona el método del sexto aspecto en el que el microorganismo carboxidotrófico acetogénico se selecciona del grupo que consiste en Clostridium, Moorella, Oxobacter, Peptostreptococcus, Acetobacterium, Eubacterium o Butyribacterium.
En un noveno aspecto, la invención proporciona el método del sexto aspecto en el donde el método produce además etanol y en donde: a. el 2,3-butanodiol se produce a una tasa de al menos 10 g/l por día; y b. una relación entre el etanol y el 2,3-butanodiol está comprendida entre 4:1 y 1:2.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra el impacto de la adición de 2-HIBA sobre el perfil de metabolitos de una fermentación.
La figura 2 muestra una curva de eliminación exponencial del 2-HIBA basada en la tasa de dilución líquida y en la tasa de dilución bacteriana.
La figura 3 muestra el perfil de metabolitos de un biorreactor en donde se añadió continuamente 2-HIBA a la fermentación de manera que la concentración de 2-HIBA se mantuvo en 0,5 g/l (4,8 mM).
La figura 4 muestra el perfil de metabolitos de un biorreactor en donde la cantidad de 2-HIBA añadida continuamente a la fermentación se aumentó a 1,0 g/l (9,6 mM).
La figura 5 muestra el perfil de gas de un biorreactor, donde se añadió continuamente 2-HIBA a la fermentación de manera que la concentración de 2-HIBA se mantuvo a 0,5 g/l (4,8 mM).
La figura 6 muestra el perfil de gas de un biorreactor, donde la cantidad de 2-HIBA añadida continuamente a la fermentación se aumentó a 1,0 g/l (9,6 mM).
La figura 7 muestra el perfil de metabolitos de un sistema de 2 reactores donde la concentración de 2-HIBA aumenta de 0,5 g/l (4,8 mM) a 1,0 g/l (9,6 mM)
La figura 8: muestra el impacto de diferentes concentraciones de 2-HiBA sobre la relación etanol: 2,3-BDO. La figura 9: muestra el perfil de metabolitos de fermentación con 0,05 g/l (0,48 mM) de 2-HIBA en el medio. La figura 10: muestra el perfil de gas de la fermentación con 0,05 g/l (0,48 mM) de 2-HiBA en el medio
La figura 11: muestra la concentración de aminoácidos de cadena ramificada y de biomasa después de la adición de 100 mg (0,96 mM) de HiBA
La figura 12: es una representación esquemática del impacto de 2-HIBA sobre el metabolismo de LZ1561.
La figura 13 muestra el perfil de metabolitos de una fermentación que muestra el impacto de la adición de ácido 2-hidroxi-2metilbutírico 15 mM.
La figura 14: muestra el balance comparativo de carbono en un biorreactor antes y después de la adición de 2-HIBA
Descripción detallada de la invención
La presente invención proporciona métodos para la producción de uno o más productos mediante la fermentación microbiana de un sustrato gaseoso.
El sustrato gaseoso puede seleccionarse del grupo que consiste en CO, CO2, H2 , N2 , CH4 y mezclas de los mismos. La invención proporciona métodos para aumentar la producción de uno o más productos derivados de acetolactato.
Definiciones
Las expresiones "productos derivados de acetolactato" o "productos procedentes de acetolactato" o expresiones similares, como se usan en el presente documento, pretenden abarcar productos de fermentación que tienen un precursor de acetolactato. Estos productos incluyen, aunque sin limitación, 2,3-butanodiol, 2-butanona, 2-butanol y acetoína.
La expresión "aminoácido de cadena ramificada" o expresiones similares, pretenden abarcar leucina, isoleucina y valina.
Debe interpretarse que la expresión "2,3-butanodiol" incluye todas las formas enantioméricas y diastereoméricas del compuesto, incluyendo (R,R), (S,S) y formas meso, en formas racémicas, parcialmente estereoisoméricamente puras y/o sustancialmente estereoisoméricamente puras.
El término "biorreactor" incluye un dispositivo de fermentación que consiste en uno o más recipientes y/o disposiciones en torres o tuberías, que incluye el reactor de tanque agitado de flujo continuo (RTAFC), un reactor de células inmovilizadas (RCI), un reactor de lecho percolador (RLP), una columna de burbujas, un fermentador de elevación de gases, un mezclador estático, un reactor de circuito circulante, un reactor de membrana, tal como un biorreactor de membrana de fibra hueca (BR MFH) u otro recipiente u otro dispositivo adecuado para el contacto gas-líquido. Como se describe a continuación, el biorreactor puede comprender un primer reactor de crecimiento y un segundo reactor de fermentación. Como tal, cuando se hace referencia a la adición de un sustrato, por ejemplo, un sustrato que comprende monóxido de carbono, al biorreactor o a la reacción de fermentación, debe entenderse que incluye la adición a uno o a ambos de estos reactores cuando sea apropiado.
La expresión "sustrato gaseoso" y/o "sustrato" incluye cualquier gas que contenga un compuesto o elemento utilizado por un microorganismo como fuente de carbono y opcionalmente fuente de energía en la fermentación. El sustrato gaseoso contendrá normalmente una proporción significativa de cualquiera de CO, CO2 , CH4 , H2 o mezclas de los mismos.
La expresión "sustrato que comprende monóxido de carbono" y expresiones similares, incluyen cualquier sustrato en el que una o más cepas de bacterias disponen de monóxido de carbono para su crecimiento y/o fermentación, por ejemplo.
Los "sustratos gaseosos que comprenden monóxido de carbono" incluyen cualquier gas que contenga un nivel de monóxido de carbono. El sustrato gaseoso contendrá normalmente una proporción importante de CO, preferentemente, al menos del 15 % al 95 % de CO en volumen.
Un "sustrato que comprende CO2" incluye cualquier corriente de sustrato que contenga un nivel de dióxido de carbono. Sin embargo, debe apreciarse que el sustrato gaseoso puede proporcionarse en formas alternativas. Por ejemplo, el sustrato gaseoso que contiene CO2 puede proporcionarse disuelto en un líquido. Esencialmente, un líquido se satura con un gas que contiene dióxido de carbono y después ese líquido se añade al biorreactor. Esto puede conseguirse usando metodología convencional. Como ejemplo, podría utilizarse un generador de dispersión de microburbujas (Hensirisak et. al. Scale-up of microbubble dispersion generator for aerobic fermentation; Applied Biochemistry and Biotechnology Volumen 101, Número 3/octubre de 2002). Como ejemplo adicional, el sustrato gaseoso que contiene CO2 y H2 puede adsorberse sobre un soporte sólido.
El término "producto", como se usa en el presente documento, pretende abarcar sustancias producidas por la fermentación microbiana. El producto puede incluir alcoholes, ácidos u otros productos químicos. Los productos también pueden incluir gases producidos por el proceso de fermentación microbiana.
Las expresiones "que aumenta la eficacia", "eficacia aumentada" y similares, cuando se utilizan en relación a un proceso de fermentación, incluyen, aunque sin limitación, aumentar uno o más de la tasa de crecimiento de microorganismos que catalizan la fermentación, la tasa de crecimiento y/o de producción del producto a concentraciones elevadas de butanodiol, el volumen del producto deseado producido por volumen de sustrato consumido, la tasa de producción o el nivel de producción del producto deseado, y la proporción relativa del producto deseado producido en comparación con otros subproductos de la fermentación.
Las expresiones "productividad" o "tasa de producción" se refieren a la productividad volumétrica de un producto. En sistemas continuos, la productividad volumétrica se calcula como la relación entre la concentración en estado estacionario del producto y el tiempo de retención de líquido. En sistemas discontinuos, la productividad volumétrica se calcula como la concentración y el tiempo necesario para producir dicha concentración en un sistema discontinuo. La productividad volumétrica se expresa como g/l/día.
Salvo que el contexto requiera otra cosa, las expresiones "fermentación", "proceso de fermentación" o "reacción de fermentación" y similares, como se usan en el presente documento, pretenden abarcar tanto la fase de crecimiento como la fase de biosíntesis de productos del proceso.
Un "microorganismo precursor" es un microorganismo que se utiliza para generar un microorganismo recombinante de la invención. El microorganismo precursor puede ser uno que se presente en la naturaleza (es decir, un microorganismo de tipo silvestre) o uno que se haya modificado anteriormente pero que no exprese o sobreexprese una o más de las enzimas que son objeto de la presente invención. Por consiguiente, los microorganismos se han modificado para expresar o sobreexpresar una o más enzimas que no se expresaban o sobreexpresaban en el
microorganismo precursor.
El término "exógeno" se refiere a ácidos nucleicos que se originan fuera del microorganismo en el que se introducen. Los ácidos nucleicos exógenos pueden derivar de cualquier fuente apropiada, incluyendo, aunque sin limitación, el microorganismo en el que se van a introducir (por ejemplo, en un microorganismo precursor del que deriva el microorganismo recombinante), cepas o especies de microorganismos que difieren del organismo en el que se van a introducir, o pueden crearse de manera artificial o recombinante. "Exógeno" también puede usarse para referirse a proteínas. Esto se refiere a una proteína que no está presente en el microorganismo precursor del que deriva el microorganismo recombinante.
El término "endógeno", como se usa en relación a un microorganismo recombinante y a un ácido nucleico o proteína, se refiere a cualquier ácido nucleico o proteína que esté presente en un microorganismo precursor del que deriva el microorganismo recombinante.
"Sobreexpresión", "exceso de expresión", y términos y expresiones similares, deben tomarse en términos generales para incluir cualquier aumento en la expresión de una o más proteínas en comparación con el nivel de expresión de la proteína de un microorganismo precursor en las mismas condiciones. No debe interpretarse en el sentido de que la proteína se expresa a un nivel particular.
Aunque la siguiente descripción se centra en realizaciones particulares de la invención, es decir, en la producción de 2,3-BDO, utilizando CO como sustrato principal, debe apreciarse que la invención puede aplicarse a la producción de alcoholes y/o ácidos alternativos y al uso de sustratos alternativos, como sabrán los expertos con conocimientos habituales en la materia a la que se refiere la invención. Más particularmente, la invención puede aplicarse a la producción de productos derivados de acetolactato usando un sustrato gaseoso seleccionado del grupo que consiste en CO, CO2 , H2 , CH4 y mezclas de los mismos.
En la materia se conocen bien procesos de fermentación microbiana de sustratos gaseosos que comprenden monóxido de carbono para producir productos tales como etanol y acetato. Dichos procesos proporcionan un medio para producir combustibles comercialmente útiles a partir de gases residuales industriales que comprenden CO.
Por consiguiente, los inventores son los primeros en idear un proceso para producir altas concentraciones de 2,3-butanodiol a través de la fermentación microbiana de un sustrato gaseoso que comprende CO. En una primera fase, un sustrato gaseoso que comprende CO se suministra a un biorreactor que contiene un cultivo de uno o más microorganismos suspendidos en medios nutrientes líquidos. El sustrato gaseoso se fermenta en condiciones anaerobias para producir uno o más alcoholes y/o uno o más ácidos o mezclas de los mismos. Para alterar el perfil de metabolitos de la fermentación se proporcionan compuestos a la fermentación.
Los inventores demostraron que la adición de ácido 2-hidroxiiosbuítrico (2-HIBA) al biorreactor induce una mayor producción de 2,3-BDO. En realizaciones particulares, el proceso produce 2,3-BDO y etanol. La relación entre el 2,3-butanodiol y el etanol que se produce mediante el método de la presente invención puede estar comprendida entre 1:10 y 10:1. El proceso puede producir 2,3-butanodiol y etanol a una relación de 1:4 o 1:3 o 1:2 o 1:1 o 1:2.
Los inventores descubrieron que, la adición de 2-HIBA a la fermentación, a una concentración de entre 0,01 g/l - 2,0 g/l (0,096 a 19,2 mM), aumentaba significativamente la concentración de 2,3-BDO. También demostraron que la adición de 2-HIBA mejoraba significativamente la relación etanol:2,3-BDO.
Los inventores han demostrado que puede añadirse 2-HIBA a un sistema de fermentación de manera continua a concentraciones de entre 0,01 g/l/día - 2,0 g/l/día (0,096 a 19,2 mM/día) para mejorar la relación etanol: 2,3-BDO sin que ello afecte a la estabilidad global de la fermentación.
Se realizaron mediciones del balance de carbono para confirmar el cambio a una mayor producción de 2,3-butanodiol después de la adición de 2-HIBA. Los balances de carbono mostraron un claro aumento en la producción de 2,3-butanodiol, acompañada de una disminución en la producción de etanol, acetato y biomasa. La figura 14 muestra el balance comparativo de carbono en un biorreactor antes y después de la adición de 2-HIBA.
Los inventores descubrieron además que las bacterias no absorben ni convierten el 2-HIBA en productos. Los inventores demostraron que el 2-HIBA aumentaba la producción de 2,3-BDO y mejoraba la relación etanol: 2,3-BDO sin que se consuma en la fermentación. Dado que el 2-HIBA no se consume en la fermentación, es posible recuperar el 2-HIBA que sale del biorreactor y devolverlo al mismo para mejorar la eficacia de la fermentación.
La adición de 2-HIBA causa impacto en el metabolismo de Clostridium autoethanogenum. La figura 12 es una representación esquemática que muestra el impacto del 2-HIBA sobre el metabolismo de Clostridium autoethanogenum. En los sistemas naturales, la expresión y la actividad de la acetolactato sintasa IlvBN está regulada a la baja por la síntesis de aminoácidos de cadena ramificada. La adición de 2-HIBA a la fermentación inhibe la biosíntesis de la cetol-ácido reductoisomerasa IlvC y de aminoácidos de cadena ramificada, lo que produce una disminución en la concentración de valina, isoleucina, y leucina. Como resultado, la inhibición por retroalimentación
de la enzima IlvBN por valina, isoleucina y leucina, se elimina. Esto provoca un aumento en la producción de acetolactato. Un aumento en la reserva de acetolactato conduce a un exceso de carbono a 2,3-butanodiol. La conversión de acetolactato y acetoína a 2,3-BDO no está limitada por la velocidad, y la conversión a 2,3-BDO se produce libremente sin necesidad de regular al alza las enzimas responsables de la conversión de acetolactato a acetoína y/o la conversión de acetoína a 2,3-BDO.
El 2-HIBA es un ácido carboxílico C4 y un alfahidroxiácido. Es un compuesto químico que no sintetiza Clostridium autoethanogenum y rara vez se encuentra en la naturaleza.
La cetol-ácido reductoisomerasa se inhibe con la presencia de 2-HIBA. Se considera que otros compuestos que tienen características estructurales similares a las del 2-HIBA y los sustratos sobre los que actúa la enzima (acetolactato, 2-oxo-3-hidroxiisovalerato y 2,3-dihidroxi-3-metilbutanoato) tendrían un efecto similar sobre la cetol-ácido reductoisomerasa. Los inhibidores de la cetol-ácido reductoisomerasa incluyen compuestos que inhiben una o más enzimas que convierten el acetolactato en aminoácidos de cadena ramificada. Normalmente, los compuestos inhiben la cetol-ácido reductoisomerasa.
Normalmente, el compuesto comprende un resto de ácido carboxílico, y el compuesto esta sustituido en el átomo de carbono alfa del resto de ácido carboxílico por un grupo hidroxilo o un grupo carbonilo. Preferentemente, el compuesto comprende un resto de ácido carboxílico, y el compuesto está sustituido en el átomo de carbono alfa del resto de ácido carboxílico por un grupo hidroxilo. Más preferentemente, el compuesto comprende un resto de ácido carboxílico, el compuesto está sustituido en el átomo de carbono alfa del resto de ácido carboxílico por un grupo hidroxilo, y el compuesto está ramificado en el átomo de carbono alfa del resto de ácido carboxílico. Con esto se quiere decir que además del grupo hidroxilo unido al átomo de carbono alfa del resto de ácido carboxílico, hay uno o dos sustituyentes que no son hidrógeno también unidos al átomo de carbono alfa del resto de ácido carboxílico.
Los compuestos de fórmula (I), que contienen uno o más centros quirales, pueden utilizarse en forma enantiomérica pura o en forma de una mezcla de isómeros. Para evitar dudas, si se desea, los compuestos de fórmula I pueden utilizarse en forma de sales y/o solvatos de los mismos. Adicionalmente, para disipar cualquier duda, los compuestos de la invención pueden utilizarse en cualquier forma tautomérica.
Las formas salinas habituales incluyen sales con metales y compuestos de amina. Las sales con metales pueden incluir sales con metales alcalinos (por ejemplo, sodio o potasio) y metales alcalinotérreos (por ejemplo, calcio o magnesio). Las sales con aminas pueden incluir sales con alquilaminas, aralquilaminas y aminas heterocíclicas.
Normalmente, un grupo alquilo C1-C6 es un grupo alquilo C1-C4 , preferentemente un grupo alquilo C1-C3 , en algunas circunstancias un grupo alquilo C1-C2. Como ejemplos de un grupo alquilo C1-C6 se incluyen metilo, etilo, n-propilo, ipropilo, n-butilo, i-butilo, s-butilo, t-butilo y hexilo. Se prefieren los grupos metilo, etilo e i-propilo. Para evitar dudas, cuando en un compuesto de fórmula (I) hay dos restos alquilo, los restos alquilo pueden ser iguales o diferentes. Normalmente, los restos alquilo no están sustituidos.
Un grupo hidroxialquilo C1-C6 es normalmente un grupo alquilo C1-C6 de este tipo sustituido por uno o más grupos hidroxilo (-OH). Normalmente, está sustituido por 1,2 o 3 grupos hidroxilo, preferentemente 1 o 2, más preferentemente un grupo hidroxilo. Normalmente, un grupo alcoxi C1-C6 es un grupo alcoxi C1-C4 , preferentemente un grupo hidroxialquilo C1-C3. Los grupos hidroxialquilo preferidos son grupos -C(OH)(CH3)2. Normalmente, los grupos hidroxialquilo no están sustituidos con grupos distintos de los grupos hidroxilo mencionados anteriormente.
Normalmente, R1 es un grupo alquilo C1-C4 lineal o ramificado, un grupo hidroxialquilo C1-C4 lineal o ramificado o un grupo -(C=O)R, donde R es un grupo alquilo C1-C4 lineal o ramificado. Preferentemente, R1 es un grupo alquilo C1-C3 lineal o ramificado, un grupo hidroxialquilo C1-C3 lineal o ramificado o un grupo -(C=O)R, donde R es un grupo alquilo C1-C3 lineal o ramificado. Más preferentemente, R1 es un grupo alquilo C1-C3 lineal o ramificado, un grupo hidroxialquilo C3 ramificado o un grupo -(C=O)R, donde R es un grupo metilo. Mucho más preferentemente, R1 es metilo, etilo, ipropilo, un grupo -C(OH)(CH3 )2 o un grupo -(C=O)R, donde R es un grupo metilo.
Normalmente, R2 es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C1-C4 lineal o ramificado, un grupo hidroxialquilo C1-C4 lineal o ramificado o un grupo -(C=O)R, donde R es un grupo alquilo C1-C4 lineal o ramificado. Preferentemente, R2 es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C1-C3 lineal o ramificado o un grupo hidroxialquilo C1-C3 lineal o ramificado. Más preferentemente, R2 es un átomo de hidrógeno o un grupo metilo. Mucho más preferentemente, R2 es un átomo de hidrógeno o un grupo metilo.
Normalmente, R1 es un grupo alquilo C1-C4 lineal o ramificado, un grupo hidroxialquilo C1-C4 lineal o ramificado o un grupo -(C=O)R, donde R es un grupo alquilo C1-C4 lineal o ramificado y R2 es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C1-C4 lineal o ramificado, un grupo hidroxialquilo C1-C4 lineal o ramificado o un grupo -(C=O)R, donde R es un grupo alquilo C1-C4 lineal o ramificado. Preferentemente, R1 es un grupo alquilo C1-C3 lineal o ramificado, un grupo hidroxialquilo C1-C3 lineal o ramificado o un grupo -(C=O)R, donde R es un grupo alquilo C1-C3 lineal o ramificado y R2 es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C1-C3 lineal o ramificado o un grupo hidroxialquilo C1-C3 lineal o ramificado. Más preferentemente R1 es un grupo alquilo C1-C3 lineal o ramificado, un grupo hidroxialquilo C3 ramificado
o un grupo -(C=O)R, donde R es un grupo metilo y R2 es un átomo de hidrógeno o un grupo metilo o etilo. Más preferentemente R1 es metilo, etilo, i-propilo, un grupo -C(OH)(CH3)2 o un grupo -(C=O)R, donde R es un grupo metilo y R2 es un átomo de hidrógeno o un grupo metilo.
Normalmente, R1 y R2 no son ninguno un grupo -(C=O)R como se ha definido anteriormente. Normalmente, R1 y R2 no son ninguno un grupo hidroxialquilo C1-C6 como se ha definido anteriormente. Por tanto, normalmente, R1 es como se ha definido anteriormente; y R2 es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C1-C6 lineal o ramificado, preferentemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C1-C4 lineal o ramificado, más preferentemente un átomo de hidrógeno o un grupo metilo o etilo, lo más preferentemente un átomo de hidrógeno o un grupo metilo.
En determinadas circunstancias, puede ser preferible que tanto R1 y R2 sean grupos alquilo. En este caso, R1 es un grupo alquilo C1-C6 lineal o ramificado y R2 es un grupo alquilo C1-C6 lineal o ramificado. Preferentemente, R1 es un grupo alquilo C1-C4 lineal o ramificado y R2 es un grupo alquilo C1-C4 lineal o ramificado. Más preferentemente, R1 es un grupo alquilo C1-C3 lineal o ramificado y R2 es un grupo alquilo C1-C3 lineal o ramificado. Incluso más preferentemente, R1 es un grupo metilo o etilo y R2 es un grupo metilo o etilo. Mucho más preferentemente, tanto R1 como R2 son grupos metilo.
Son compuestos particularmente preferidos de fórmula I el ácido 2-hidroxiisobutírico, ácido 2-hidroxil-2-metilbutírico, 2-hidroxibutirato y ácido 2-hidroxi-3-metilbutírico. Se prefiere especialmente el ácido 2-hidroxiisobutírico. Por tanto, los compuestos particularmente preferidos de fórmula I se eligen normalmente de los siguientes compuestos:
y
Normalmente, R3 es un grupo alquilo C1-C4 lineal o ramificado o un grupo hidroxialquilo C1-C4 lineal o ramificado. Preferentemente, R3 es un grupo alquilo C1-C3 lineal o ramificado o un grupo hidroxialquilo C1-C3 lineal o ramificado. Mucho más preferentemente, R3 es i-propilo o -C(OH)(CH)3)2. Los compuestos particularmente preferidos de fórmula II son 2-ceto-3-hidroxiisovalerato y 2-cetoisovalerato. Por tanto, los compuestos particularmente preferidos de fórmula II se eligen normalmente de los siguientes compuestos:
Como ejemplos de inhibidores de la cetol-ácido reductoisomerasa se incluyen, aunque sin limitación, ceto p hidroxiisovalerato, hidroxibutirato, hidroxil a metilbutirato, hidroxiisovalerato, ceto isovalerato (Arfin et al, Purification and Properties of the Acetohydroxy Acid Isomeroreductase of Salmonella typhimurium. The Journal of Biomedical Chemistry 1969, Vol.244, N.° 5, págs. 1118-1127) y oxalil hidroxamatos (Aulabaugh et al, Oxalyl Hydroxamates as Reaction-Intermediate Analogues for Ketol-Acid Reductoisomerase, Biochemistry 1990, 29, págs. 2824-2830). Otros ejemplos de compuestos que influyen en la vía IlvC incluyen, ácido 2-hidroxil-2-metilbutírico, 2-hidroxibutirato, ácido 2-hidroxi-3-metilbutírico, 2-ceto-3-hidroxiisovalerato y 2-cetoisovalerato.
La adición de uno o más de los compuestos inhibidores que se han comentado para la fermentación, aumenta la producción de acetolactato mediante el mecanismo descrito anteriormente de inhibición de la producción de aminoácidos de cadena ramificada. El aumento en la reserva de acetolactato produce un aumento del flujo de carbono
a otros productos derivados de acetolactato, incluyendo 2,3-butanodiol.
Se añade un compuesto inhibidor al medio nutritivo líquido en concentraciones suficientes para provocar una respuesta inhibidora sobre la producción de aminoácidos ramificados y aumentar la producción de otros productos derivados de acetolactato. El compuesto puede añadirse al medio nutritivo líquido de forma continua a concentraciones de entre 0,05 mM y 50 mM. La cantidad de un producto derivado de acetolactato que se produce por la adición del compuesto a la fermentación, en comparación con una fermentación sin la adición del compuesto es al menos un 10 % más alta, al menos un 20 % más alta, al menos un 30 % más alta, al menos un 40 % más alta, al menos un 50 % más alta, al menos un 60 % más alta, al menos un 70 % más alta, al menos un 80 % más alta, al menos un 90 % más alta, al menos un 100 % más alta, al menos un 110 % más alta, al menos un 120 % más alta, al menos un 130 % más alta, al menos un 140 % más alta, al menos un 150 % más alta.
La fermentación puede llevarse a cabo en cualquier biorreactor adecuado, tal como un reactor de células inmovilizadas, un reactor de elevación de gases, un reactor de columna de burbujas (RCB), un reactor de membrana, tal como un biorreactor de membrana de fibra hueca (BR MFH) o un reactor de lecho percolador (RLP). El biorreactor puede comprender un primer reactor de crecimiento en el que los microorganismos se cultivan, y un segundo reactor de fermentación, al que puede suministrarse caldo de fermentación desde el reactor de crecimiento y en el que puede producirse la mayor parte del producto de fermentación (p. ej., etanol y acetato). El biorreactor puede adaptarse para recibir un sustrato gaseoso seleccionado del grupo que consiste en c O, CO2 , H2 y mezclas de los mismos.
En realizaciones particulares, el microorganismo es una bacteria carboxidotrófica. En diversas realizaciones, el microorganismo carboxidotrófico se selecciona de Clostridium, Moorella, Oxobacter, Peptostreptococcus, Acetobacterium, Eubacterium o Butyribacterium. En diversas realizaciones, el microorganismo se selecciona del grupo que comprende Clostridium autoethanogenum, Clostridium Ijungdahli, Clostridium carboxidivorans, Clostridium drakei, Clostridium scatologenes, Clostridium aceticum, Clostridium formicoaceticum, Clostridium magnum, Butyribacterium methylotrophicum, Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchi, Blautia producta, Eubacterium limosum, Moorella thermoacetica, Sporomusa ovata, Sporomusa silvacetica, Sporomusa sphaeroides, Oxobacter pfennigii y Thermoanaerobacter kiuvi.
En realizaciones particulares, el microorganismo es Clostridium autoethanogenum o Clostridium ljungdahlii. En una realización particular, el microorganismo es Clostridium autoethanogenum. El microorganismo puede tener las características identificativas del número de registro DSMZ10061 o DSMZ23693.
Microorganismo recombinante para inhibir la síntesis de AACR
Un aspecto de la invención es la provisión de microorganismos acetogénicos carboxidotróficos que tienen una capacidad reducida para convertir sustratos gaseosos carbonosos en aminoácidos de cadena ramificada. Una enzima, que es una cetol-ácido reductoisomerasa, puede inactivarse por mutación para reducir, parcial o totalmente, su actividad. Si los microorganismos, de manera natural o a través de modificación, tienen la capacidad de producir compuestos útiles que contienen carbono derivados de acetolactato, la reducción de la capacidad de la cetol-ácido reductoisomerasa conducirá a la acumulación del compuesto útil.
Con referencia a la figura 12, la expresión y actividad de la acetolactato sintasa IlvBN está regulada a la baja por aminoácidos de cadena ramificada. La inhibición de la cetol-ácido reductoisomerasa IlvC, una enzima que cataliza una etapa en la biosíntesis de aminoácidos de cadena ramificada, produce una disminución en la producción de valina, isoleucina, y leucina. Como resultado, se activa la expresión de los genes que codifican la enzima IlvBN y se elimina la inhibición por retroalimentación de la enzima IlvBN por parte de los aminoácidos de cadena ramificada. Esto provoca un aumento en la producción de acetolactato. Un aumento en la reserva de acetolactato conduce a un mayor flujo de carbono a los productos derivados de acetolactato, incluyendo 2,3-butanodiol, acetoína, 2-butanol y 2-butanona.
Los microorganismos que pueden modificarse de acuerdo con la invención incluyen cualquiera que pueda producir un producto derivado de acetolactato, tal como acetoína, butanodiol, butanona y 2-butanol. El microorganismo también debe tener un gen de la cetol-ácido reductoisomerasa. La cetol-ácido reductoisomerasa puede tener una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 1.
Pueden realizarse mutaciones inactivadoras mediante cualquier medio conocido en la materia para ese microorganismo en particular. La mutagénesis química, mutagénesis por transposones, mutagénesis vírica, mutagénesis in vitro, son medios ilustrativos. Las mutaciones inactivadoras pueden reducir parcialmente o eliminar totalmente la actividad de la cetol-ácido reductoisomerasa. Estas pueden ser, por ejemplo, mutaciones por inserciones, deleciones, sustituciones o mutaciones sin sentido. Las mutaciones pueden reducir la actividad enzimática del microorganismo en al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 % o al menos un 90 %. Esto se puede realizarse reduciendo la propia actividad enzimática o reduciendo la cantidad de enzima.
La actividad de la cetol-ácido reductoisomerasa puede inactivarse totalmente, como ocurre, por ejemplo, en el caso de genes inactivados. Si la actividad de la cetol-ácido reductoisomerasa está totalmente inactivada, es necesario
complementar la fermentación con aminoácidos de cadena ramificada o con sus precursores biológicos inmediatos.
Microorganismos recombinantes para aumentar la síntesis de acetolactato
Puede utilizarse un microorganismo acetogénico carboxidotrófico que comprenda una o más modificaciones genéticas que se adaptan para aumentar el nivel de actividad de la acetolactato sintasa. Después del crecimiento sobre, y/o la fermentación de, un sustrato carbonoso gaseoso, el microorganismo produce una mayor cantidad de acetolactato en comparación con un microorganismo precursor. La acetolactato sintasa puede tener una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2.
Se pretende que una "acetolactato sintasa" incluya tanto enzimas catabólicas de acetolactato sintasa como enzimas anabólicas de acetolactato (o acetohidroxiácido) sintasa.
La una o más modificaciones genéticas que se adaptan para aumentar el nivel de acetolactato sintasa pueden comprender, la sobreexpresión de una acetolactato sintasa catabólica endógena, la expresión de una acetolactato sintasa catabólica exógena, la expresión de una acetolactato sintasa anabólica exógena, la sobreexpresión de una acetolactato sintasa anabólica endógena, la sustitución de una acetolactato sintasa endógena por una acetolactato sintasa catabólica exógena, la sustitución de una acetolactato sintasa endógena por una acetolactato sintasa anabólica exógena, o la sobreexpresión de una subunidad de una sintasa anabólica endógena, siendo dicha subunidad insensible a la inhibición por retroalimentación por parte de aminoácidos de cadena ramificada.
Una "modificación genética que está adaptada para aumentar la actividad de la acetolactato sintasa", como se ha mencionado anteriormente en el presente documento, debe tomarse en términos generales para incluir cualquier modificación genética que al menos aumente la expresión de la acetolactato sintasa, la biosíntesis de acetolactato, la función de acetolactato sintasa y/o el nivel de actividad de acetolactato sintasa. Debe entenderse que la expresión incluye, por ejemplo: la modificación de un gen que codifique una o más acetolactato sintasas; la modificación de un elemento regulador genético implicado en la expresión de un gen que codifique una acetolactato sintasa; la introducción de un ácido nucleico que codifique una acetolactato sintasa; la introducción de un ácido nucleico que produzca (o aumente el nivel de expresión, actividad o función de) una proteína que aumente la expresión de acetolactato sintasa, la biosíntesis de acetolactato, la función de acetolactato sintasa y/o el nivel de actividad de acetolactato sintasa. Los expertos apreciarán fácilmente que pueden realizarse otras modificaciones genéticas para conseguir un aumento de la actividad de la acetolactato sintasa.
Los microorganismos que pueden modificarse incluyen, aunque sin limitación, bacterias carboxidotróficas, tales como especies de Clostridium, C. autoethanogenum, C. Ijungdahlii y C. ragsdalei. Otros microorganismos carboxidotróficos que podrían utilizarse incluyen Clostridium carboxidovirans, Clostridium drakei, Clostridium scatologenes, Clostridium aceticum, Clostridium formicoaceticum, Clostridium magnum, Butyribacterium methylotrophicum, Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchii, Blautia producta, Eubacterium limosum, Moorella thermoacetica, Moorella thermautotrophica, Sporomusa ovata, Sporomusa silvacetica, Sporomusa sphaeroides, Oxobacter pfennigii y Thermoanaerobacter kiuvi. Otras bacterias que pueden modificarse incluyen las de los géneros Escherichia, Saccharomyces, Clostridium, Bacillus, Lactococcus, Zymomonas, Corynebacterium, Pichia, Candida, Hansenula, Trichoderma, Acetobacterium, Ralstonia, Salmonella, Klebsiella, Paenibacillus, Pseudomonas, Lactobacillus, Rhodococcus, Enterococcus, Alkaligenes y Brevibacterium.
Fermentación
Se conocen procesos para la producción de etanol y otros alcoholes a partir de sustratos gaseosos (tales como los descritos en el apartado anterior de Antecedentes). Como ejemplos de procesos se incluyen los descritos, por ejemplo, en los documentos WO 2007/117157 y WO 2008/115080, así como en las patentes de Estados Unidos n.° 634o 581, 6 136577, 5593886, 5807722 y 5821111.
Se sabe que diversas bacterias anaerobias son capaces de llevar a cabo la fermentación de sustrato gaseoso a alcoholes, incluyendo n-butanol y etanol, y ácido acético, y que son adecuadas para su uso en el proceso de la presente invención. Como ejemplos de dichas bacterias que son adecuadas para su uso en la invención se incluyen las del género Clostridium, tales como cepas de Clostridium ljungdahlii, incluyendo las descritas en los documentos WO 00/68407, EP 117309, en las patentes de Estados Unidos n.° 5173429, 5593886 y 6368819, en los documentos WO 98/00558 y WO 02/08438, Clostridium carboxydivorans (Liou et al., International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 33: págs. 2085-2091) y Clostridium autoethanogenum (Abrini et al., Archives of Microbiology 161: págs. 345-351). Otras bacterias adecuadas incluyen las del género Moorella, incluyendo Moorella sp HUC22-1 (Sakai et al., Biotechnology Letters 29: págs. 1607-1612), y las del género Carboxydothermus (Svetlichny, V.A., et al. (1991), Systematic and Applied Microbiology 14: 254-260). Además, un experto en la materia puede utilizar otras bacterias anaerobias carboxidotróficas en los procesos de la invención. Al tener en cuenta la presente divulgación, también se apreciará que en los procesos de la presente invención, puede utilizarse un cultivo mixto de dos o más bacterias.
El cultivo de las bacterias que se utilizan en un método de la invención, puede realizarse utilizando cualquiera de los
diversos procesos conocidos en la materia para cultivar y fermentar sustratos utilizando bacterias anaerobias. En el apartado de "Ejemplos" se proporcionan técnicas ilustrativas. Como ejemplo adicional, pueden utilizarse los procesos descritos en general en los siguientes artículos que utilizan sustratos gaseosos para la fermentación: (i) K. T. Klasson, et al. (1991). Bioreactors for synthesis gas fermentations resources. Conservation and Recycling, 5; 145-165; (ii) K. T. Klasson, et al. (1991). Bioreactor design for synthesis gas fermentations. Fuel. 70. 605-614; (iii) K. T. Klasson, et al. (1992). Bioconversion of synthesis gas into liquid or gaseous fuels. Enzyme and Microbial Technology. 14; 602-608; (iv) J. L. Vega, et al. (1989). Study of Gaseous Substrate Fermentation: Carbon Monoxide Conversion to Acetate. 2. Continuous Culture. Biotech. Bioeng. 34. 6. 785-793; (vi) J. L. Vega, et al. (1989). Study of gaseous substrate fermentations: Carbon monoxide conversion to acetate. 1. Cultivo discontinuo. Biotechnology and Bioengineering. 34.
6. 774-784; (vii) J. L. Vega, et al. (1990). Design of Bioreactors for Coal Synthesis Gas Fermentations. Resources, Conservation and Recycling. 3. 149-160.
En una realización, el microorganismo o microorganismo precursor se selecciona del grupo de bacterias carboxidotróficas del género Clostridia que comprende Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium ragsdalei, Clostridium carboxidivorans, Clostridium drakei, Clostridium scatologenes, Clostridium aceticum, Clostridium formicoaceticum, Clostridium magnum. El microorganismo puede ser del grupo de bacterias carboxidotróficas del género Clostridia que comprende las especies C. autoethanogenum, C. ljungdahlii y C. ragsdalei y cepas aisladas relacionadas. Estas incluyen, aunque sin limitación, cepas de C. autoethanogenum JAI-1T (DSM10061) (Abrini, Naveau, y Nyns, 1994), C. autoethanogenum LBS1560 (DSM19630) (documento WO/2009/064200), C. autoethanogenum LBS1561 (DSM23693), C. ljungdahlii PETCT (DSM13528 = ATCC 55383) (Tanner, Miller, y Yang, 1993), C. ljungdahlii ERI-2 (ATCC 55380) (patente de Estados Unidos 5593886), C. ljungdahlii C-01 (ATCC 55988) (patente de Estados Unidos 6368819), C. ljungdahlii O-52 (ATCC 55989) (patente de Estados Unidos 6368819), C. ragsdalei P11T (ATCC BAA-622) (documento WO 2008/028055), cepas aisladas relacionadas tales como "C. coskatii" (documento US20110229947) y "Clostridium sp." (Tyurin y Kiriukhin, 2012), o cepas mutadas tales como C. ljungdahlii OTA-1 (Tirado-Acevedo O. Production of Bioethanol from Synthesis Gas Using Clostridium ljungdahlii. Tesis doctoral, North Carolina State University, 2010). Estas cepas forman un subgrupo dentro del grupo I de ARNr Clostridial, y su gen de ARNr 16S es idéntico en más del 99 %, con un contenido similar de GC bajo de aproximadamente un 30 %. Sin embargo, la reasociación de ADN-ADN y los experimentos de huella de ADN mostraron que estas cepas pertenecían a especies distintas (documento WO 2008/028055).
Todas las especies del grupo mencionado anteriormente tienen una morfología y tamaño similares (el crecimiento logarítmico de las células varía de 0,5 a 0,7 x 3-5 pm), son mesófilas (temperatura óptima de crecimiento entre 30 37 °C) y estrictamente anaerobias (Abrini et al., 1994; Tanner et al., 1993)(documento WO 2008/028055). Asimismo, todas ellas comparten los mismos rasgos filogenéticos principales, tales como el mismo intervalo de pH (pH 4-7,5, con un pH inicial óptimo de 5,5-6), un fuerte crecimiento autotrófico en gases que contienen CO con tasas de crecimiento similares, y un perfil metabólico similar con etanol y ácido acético como productos finales de fermentación principal, y pequeñas cantidades de 2,3-butanodiol y ácido láctico formadas en determinadas condiciones (Abrini et al., 1994; Kopke et al., 2011; Tanner et al., 1993)(documento WO 2008/028055). La producción de indol también se observó con las tres especies. Sin embargo, las especies se diferencian en la utilización del sustrato de varios azúcares (por ejemplo, ramnosa, arabinosa), ácidos (p. ej. gluconato, citrato), aminoácidos (por ejemplo, arginina, histidina) u otros sustratos (por ejemplo, betaína, butanol). Además, se descubrió que algunas de las especies eran auxótrofas a determinadas vitaminas (por ejemplo, tiamina, biotina) mientras que otras no lo eran. Se ha descubierto que la organización y el número de genes de la ruta Wood-Ljungdahl, responsable de la absorción de gases, son iguales en todas las especies, a pesar de las diferencias en las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos (Kopke et al., 2011). También se ha demostrado la reducción de ácidos carboxílicos en sus correspondientes alcoholes en una serie de estos organismos (Perez, Richter, Loftus, y Angenent, 2012). Por lo tanto, estos rasgos no son específicos de un organismo como C. autoethanogenum o C. ljungdahlii, sino rasgos generales de bacterias carboxidotróficas sintetizadoras de etanol del género Clostridia y puede esperarse que el mecanismo funcione de manera similar en estas cepas, aunque puede haber diferencias en el rendimiento (Perez et al., 2012).
Un ejemplo de microorganismo adecuado para su uso en la presente invención es Clostridium autoethanogenum. El Clostridium autoethanogenum puede ser un Clostridium autoethanogenum que tenga las características identificativas de la cepa depositada en el German Resource Centre for Biological Material (DSMZ) con el número de depósito identificativo 19630. Como alternativa, el Clostridium autoethanogenum puede ser un Clostridium autoethanogenum que tenga las características identificativas del número de depósito DSMZ 10061 del DSMZ.
La fermentación puede llevarse a cabo en cualquier biorreactor adecuado. El biorreactor puede comprender un primer reactor de crecimiento en el que se cultiven los microorganismos y un segundo reactor de fermentación, al que puede suministrarse caldo de fermentación desde el reactor de crecimiento y en el que se produce la mayor parte del producto de fermentación (p. ej., etanol y acetato).
El sustrato gaseoso
El sustrato que contiene CO
Un sustrato que comprende monóxido de carbono, preferentemente un sustrato gaseoso que comprende monóxido
de carbono, se usa en la reacción de fermentación para producir etanol en los métodos de la invención. El sustrato gaseoso puede ser un gas residual obtenido como un subproducto de un proceso industrial, o de alguna otra fuente tal como gases de escape de motor de combustión (por ejemplo, de automóviles). El proceso industrial puede seleccionarse del grupo que consiste en la fabricación de productos de metales ferrosos, tales como un molino de acero, fabricación de productos no ferrosos, procesos de refinamiento de petróleo, gasificación de carbón, producción de energía eléctrica, producción de negro de carbón, producción de amoniaco, producción de metanol y fabricación de coque. En este caso, antes de emitirse a la atmósfera, el gas que contiene CO puede capturarse del proceso industrial, usando cualquier método conveniente.
Dependiendo de la composición del sustrato gaseoso que comprende monóxido de carbono, también puede ser deseable tratarlo para retirar cualquier impureza no deseada, tal como partículas de polvo antes de introducirlo a la fermentación. Por ejemplo, el sustrato gaseoso puede filtrarse o lavarse usando métodos conocidos.
El sustrato gaseoso que comprende monóxido de carbono puede obtenerse de la gasificación de biomasa. El proceso de gasificación implica la combustión parcial de biomasa en una alimentación restringida de aire u oxígeno. El gas resultante comprende principalmente CO y H2 , con volúmenes mínimos de CO2 , metano, etileno y etano. Por ejemplo, los subproductos de biomasa obtenidos durante la extracción y el procesamiento de productos alimenticios, tales como azúcar de caña de azúcar o el almidón de maíz o granos, o los residuos de biomasa no alimentaria generados por la industria forestal, pueden gasificarse para producir un gas que contenga CO adecuado para su uso en la presente invención.
El sustrato que contiene CO normalmente contendrá una proporción importante de CO, tal como al menos del 15 % al 100 % de CO en volumen, del 40 % al 95 % de CO en volumen, del 40 % al 60 % de CO en volumen y del 45 % al 55 % de CO en volumen. El sustrato puede comprender 25 % o 30 % o 35 % o 40 % o 45 % o 50 % de CO, o 55 % de CO o 60 % de CO en volumen. Los sustratos que tienen concentraciones más bajas de CO, tal como del 6 %, también pueden ser apropiados, particularmente cuando también están presentes el H2 y el CO2.
El sustrato gaseoso también puede contener algo de CO2 por ejemplo, tal como del 1 % al 80 % en volumen o del 1 % al 30 % en volumen. Puede contener del 5 % al 10 % en volumen. El sustrato gaseoso puede contener aproximadamente un 20 % de CO2 en volumen.
Normalmente, el dióxido de carbono se añadirá a la reacción de fermentación en estado gaseoso. Sin embargo, la invención no debe considerarse limitada a la adición del sustrato en este estado. Por ejemplo, el monóxido de carbono podría proporcionarse en un líquido. Por ejemplo, un líquido puede saturarse con un gas que contiene monóxido de carbono y después ese líquido puede añadirse a un biorreactor. Esto puede conseguirse usando metodología convencional. Como ejemplo, podría utilizarse un generador de dispersión de microburbujas (Hensirisak et. al. Scaleup of microbubble dispersion generator for aerobic fermentation; Applied Biochemistry and Biotechnology Volumen 101, Número 3/octubre de 2002).
En una realización de la invención, puede utilizarse una combinación de dos o más sustratos diferentes en la reacción de fermentación.
Además, a menudo es deseable aumentar la concentración de CO de una corriente de sustrato (o presión parcial de CO en un sustrato gaseoso) y por tanto aumentar la eficacia de las reacciones de fermentación donde el CO es un sustrato. El aumento de la presión parcial de CO en un sustrato gaseoso aumenta la transferencia de masa de CO a un medio de fermentación. La composición de las corrientes de gas que se utilizan para su suministro a una reacción de fermentación, puede tener un impacto significativo sobre la eficacia y/o los costes de esa reacción. Por ejemplo, el O2 puede reducir la eficacia de un proceso de fermentación anaerobia. El procesamiento de gases no deseados o innecesarios en las fases de un proceso de fermentación antes o después de la fermentación, puede aumentar la carga en dichas fases (por ejemplo, cuando la corriente de gas se comprime antes de entrar en un biorreactor, puede utilizarse energía innecesaria para comprimir gases que no son necesarios en la fermentación). Por consiguiente, puede ser deseable tratar las corrientes de sustrato, particularmente corrientes de sustrato procedentes de fuentes industriales, para retirar componentes no deseados y aumentar la concentración de componentes deseables.
El sustrato que contiene H2 y CO2
En la reacción de fermentación, para producir acetato de acuerdo con ciertas realizaciones de la invención, se utiliza un sustrato que comprende dióxido de carbono e hidrógeno. El sustrato gaseoso puede ser un gas residual obtenido como subproducto de un proceso industrial, como se ha indicado anteriormente en relación al sustrato que contiene CO. Un destinatario cualificado entendería que el proceso de producción de CO2 no se limita a los comentados. El CO2 y el H2 pueden derivar de cualquier fuente adecuada. El CO2 y el H2 pueden derivar de la misma fuente o, como alternativa, el CO2 y el H2 pueden derivar de diferentes fuentes y después mezclarse para producir un sustrato que comprenda CO2 y H2.
El sustrato que comprende CO2 y H2 puede contener al menos un 5 % de CO2 en volumen, al menos un 10 % de CO2 en volumen, al menos un 15 % de CO2 en volumen, al menos un 20 % de CO2 en volumen, al menos un 30 % de CO2
en volumen o al menos un 40 % de CO2 en volumen. También pueden ser apropiados sustratos que tengan mayor concentración de CO2 , tal como de al menos un 70 % en volumen.
El sustrato que comprende CO2 y H2 puede comprender al menos un 30 % de H2 en volumen, al menos un 40 % de H2 en volumen, al menos un 50 % de H2 en volumen, al menos un 60 % de H2 en volumen, al menos un 70 % de H2 en volumen o al menos un 80 % de H2 en volumen. También pueden ser apropiados sustratos que tengan concentraciones más bajas de H2 , tales como de aproximadamente un 5 % de H2 en volumen o de aproximadamente un 10 % de H2 en volumen o aproximadamente un 15 % de H2 en volumen o de aproximadamente un 20 % de H2 en volumen.
Gas de emisión industrial como recurso para la fermentación
Los gases residuales industriales se utilizan en una reacción de fermentación sin que se utilicen etapas adicionales de depuración o pretratamiento, o solo mínimas, para hacer que los gases sean adecuados para ello.
Los gases residuales pueden proceder de diversos procesos industriales. La invención es particularmente aplicable para la producción de etanol a partir de sustratos gaseosos tales como gases de combustión industriales que contienen CO2/H2 en grandes cantidades. Los ejemplos incluyen gases producidos durante la fabricación de productos de metales ferrosos, fabricación de productos no ferrosos, procesos de refinería, procesos de refinamiento de petróleo, gasificación de carbón, gasificación de biomasa, producción de energía eléctrica, producción de negro de carbón, producción de amoniaco, producción de metanol y fabricación de coque. El sustrato que contiene CO2/H2 puede derivar de la gasificación de biomasa o de residuos sólidos urbanos. Los gases residuales pueden generarse durante un proceso de fabricación de acero. Por ejemplo, los expertos en la materia apreciarán que los gases residuales producidos durante varias fases del proceso de fabricación de acero tienen altas concentraciones de CO2 y H2.
Los gases residuales producidos durante la carburación del acero se hacen pasar opcionalmente por agua para eliminar las partículas antes de pasar a una chimenea o conducto de humos para dirigir los gases residuales a la atmósfera. Normalmente, los gases se conducen a la pila de residuos con uno o varios ventiladores.
Al menos una parte del gas residual producido durante la descarburación del acero puede desviarse a un sistema de fermentación a través de medios de conducción adecuados. Como ejemplo, se pueden conectar tuberías u otros medios de transferencia a la pila de gas residual de una acería para desviar al menos una parte del gas residual a un sistema de fermentación. De nuevo, pueden utilizarse uno o más ventiladores para desviar al menos una parte del gas residual al sistema de fermentación. Los medios de conducción pueden estar adaptados para proporcionar al menos una parte del gas residual producido durante la descarburación del acero a un sistema de fermentación. El control y los medios para suministrar gases a un biorreactor serán fácilmente evidentes para los expertos en la materia a la que se refiere la invención.
Aunque las acerías pueden adaptarse para producir acero de manera sustancialmente continua y, posteriormente, gases residuales, los aspectos particulares del proceso pueden ser intermitentes. Normalmente, la descarburación del acero es un proceso discontinuo que dura de varios minutos a varias horas. Como tales, los medios de conducción pueden adaptarse para desviar al menos una parte del gas residual, tal como el gas producido durante la descarburación del acero, al sistema de fermentación, si se determina que el gas residual tiene una composición deseable.
El pH del contenido del biorreactor utilizado en el proceso de fermentación puede ajustarse según sea necesario. El pH apropiado dependerá de las condiciones requeridas para una reacción de fermentación particular teniendo en cuenta los medios nutritivos y los microorganismos utilizados, como apreciarán los expertos habituales en la materia a la que se refiere la invención. En la fermentación de un sustrato gaseoso que contiene CO2 utilizando Clostridium autoethanogenum, el pH puede ajustarse a de aproximadamente 4,5 a 6,5. Otros ejemplos incluyen un pH de 5,5 a 6,5 utilizando Moorella thermoacetica para la producción de ácido acético, un pH de 4,5 a 6,5 utilizando Clostridium acetobutylicum para la producción de butanol y un pH de 7 utilizando Carboxydothermus hygrogenaformans para la producción de hidrógeno. Los expertos en la materia conocerán los medios adecuados para mantener el biorreactor al pH requerido. Sin embargo, como ejemplo, para aumentar y disminuir el pH del medio de fermentación y mantener el pH deseado, pueden utilizarse bases acuosas, tales como NaOH, y ácidos acuosos, tales como H2SO4.
Un beneficio adicional de la invención es que, dado que antes de su uso en una reacción de fermentación, los gases residuales no se someten, o solo mínimamente, a ningún proceso de depuración y/u otros procesos de tratamiento, los gases contendrán material adicional resultante del proceso industrial, cuyo material adicional puede utilizarse, al menos en parte, como materia prima para la reacción de fermentación.
El gas de síntesis procedente del gas natural también puede utilizarse en el proceso de fermentación. Existen diversos métodos conocidos para reformar una corriente de gas natural para producir gas de síntesis. El uso final del gas de síntesis puede determinar las propiedades óptimas del gas de síntesis. El tipo de método de reformado y las condiciones de funcionamiento utilizadas, determinan la concentración del gas de síntesis. Como tal, la composición del gas de síntesis depende de la elección del catalizador, de la temperatura y presión de funcionamiento del
reformador y de la relación entre el gas natural y el CO2 , el H2O y/o el O2 o cualquier combinación de CO2 , H2 y O2. Un experto en la materia entendería que pueden utilizarse diversas tecnologías de reformado para obtener un gas de síntesis con una composición deseada.
Mezcla de corrientes
Puede ser deseable mezclar una corriente de sustrato reformada que comprenda CO y H2 con una o varias corrientes adicionales para mejorar la eficacia, la producción de alcohol y/o la captura de carbono global de la reacción de fermentación. Sin desear quedar ligado a ninguna teoría, las bacterias carboxidotróficas pueden convertir CO en etanol de acuerdo con la siguiente ecuación:
6CO 3H2O ^ C2H5OH 4CO2
Sin embargo, en presencia de H2 , la conversión global puede ser la siguiente:
6CO 12H2 ^ 3C2H5OH 3H2O
Por consiguiente, las corrientes con alto contenido de CO pueden mezclarse con corrientes de sustrato reformadas que comprendan CO y H2 para aumentar la relación CO:H2 para optimizar la eficacia de la fermentación. Como ejemplo, las corrientes residuales industriales, tales como los gases de emisión de una acería, tienen un alto contenido de CO, pero incluyen una cantidad mínima, o ninguna, de H2. Como tal, puede ser deseable mezclar una o varias corrientes que comprendan CO y H2 con la corriente residual que comprenda CO, antes de proporcionar la corriente de sustrato mezclada al fermentador. La eficacia global, la productividad de alcohol y/o la captura de carbono global de la fermentación, dependerán de la estequiometría del CO y H2 en la corriente mezclada. Sin embargo, la corriente mezclada puede comprender sustancialmente CO y H2 en las siguientes proporciones molares: 20:1, 10:1, 5:1, 3:1, 2:1, 1:1 o 1:2.
Además, puede ser deseable proporcionar CO y H2 en relaciones particulares en diferentes fases de la fermentación. Por ejemplo, pueden proporcionarse corrientes de sustrato con un contenido relativamente alto de H2 (tal como 1:2 CO:H2) a la fase de fermentación durante el arranque y/o las fases de crecimiento microbiano rápido. Sin embargo, cuando la fase de crecimiento se ralentiza, de modo que el cultivo se mantenga a una densidad microbiana sustancialmente estacionaria, el contenido de CO puede aumentar (tal como al menos 1: 1 o 2: 1 o más, en donde la concentración de H2 puede ser mayor o igual a cero).
La mezcla de corrientes también puede tener otras ventajas, particularmente en los casos en los que una corriente residual que comprende CO es de naturaleza intermitente. Por ejemplo, una corriente residual intermitente que comprende CO puede mezclarse con una corriente de sustrato reformada sustancialmente continua que comprenda CO y H2 y proporcionarse al fermentador. La composición y el caudal de la corriente mezclada sustancialmente continua, pueden variar de acuerdo con la corriente intermitente para mantener el abastecimiento de una corriente de sustrato de composición y caudal sustancialmente continuos en el fermentador.
Medios
Se apreciará que, para que se produzca el crecimiento del uno o más microorganismos y sustrato para la fermentación de etanol y/o acetato, además del sustrato, será necesario suministrar al biorreactor un medio nutritivo líquido adecuado. Un medio nutritivo contendrá componentes, tales como vitaminas y minerales, suficientes como para permitir el crecimiento del microorganismo utilizado. Solo como ejemplo, medios anaerobios adecuados para el crecimiento de Clostridium autoethanogenum conocidos en la materia, se describen, por ejemplo, en Abrini et al (Clostridium autoethanogenum, sp. Nov., An Anaerobic Bacterium That Produces Ethanol From Carbon Monoxide; Arch. Microbiol., 161: 345-351 (1994)). Más adelante, la sección de "Ejemplos" del presente documento proporciona ejemplos adicionales de medios adecuados.
El biorreactor
La fermentación puede llevarse a cabo en cualquier biorreactor adecuado, tal como un reactor de células inmovilizadas, un reactor de elevación de gases, un reactor de columna de burbujas (RCB), un reactor de membrana, tal como un biorreactor de membrana de fibra hueca (BR MFH) o un reactor de lecho percolador (RLP). Además, el biorreactor puede comprender un primer reactor de crecimiento en el que se cultivan los microorganismos y un segundo reactor de fermentación, al que puede suministrarse caldo de fermentación desde el reactor de crecimiento y en el que puede producirse la mayor parte del producto de fermentación (p. ej., etanol y acetato). El biorreactor puede estar adaptado para recibir un sustrato que contenga CO2 , H2 y, opcionalmente, CO.
Fermentación
Se conocen procesos para la producción de etanol y otros alcoholes a partir de sustratos gaseosos. Como ejemplos de procesos se incluyen los descritos, por ejemplo, en los documentos WO2007/117157, WO2008/115080,
WO2009/022925, WO2009/064200, US 6340581, US 6136577, US 5593886, US 5807722 y US 5821 111.
Condiciones de fermentación
De manera deseable, la fermentación debe realizarse en condiciones apropiadas para que se produzca la fermentación del sustrato a etanol y/o acetato. Las condiciones de reacción que deben tenerse en cuenta incluyen temperatura, caudal de los medios, pH, potencial redox de los medios, velocidad de agitación (en caso de utilizar un reactor de tanque con agitación continua), nivel de inóculo, concentraciones máximas de sustrato y velocidades de introducción del sustrato en el biorreactor para garantizar que el nivel de sustrato no se vuelva limitante, y concentraciones máximas de producto para impedir la inhibición del producto.
Las condiciones de reacción óptimas dependerán en parte del microorganismo particular utilizado. Sin embargo, en general, se prefiere que la fermentación se realice a una presión superior a la presión ambiente. El funcionamiento a presiones aumentadas permite un aumento significativo en la tasa de transferencia de CO desde la fase gaseosa a la fase líquida, donde el microorganismo puede absorberlo como fuente de carbono para la producción de etanol. Esto a su vez significa que el tiempo de retención (definido como el volumen de líquido en el biorreactor dividido entre el caudal de gas de entrada) puede reducirse cuando los biorreactores se mantienen a presión elevada en lugar de a presión atmosférica.
Además, dado que una determinada tasa de conversión de CO en producto depende en parte una función del tiempo de retención del sustrato, y que conseguir un tiempo de retención deseado dictamina a su vez el volumen necesario de un biorreactor, el uso de sistemas presurizados puede reducir en gran medida el volumen necesario del biorreactor y, en consecuencia, el coste de capital del equipo de fermentación. De acuerdo con los ejemplos proporcionados en la patente de Estados Unidos n.° 5593886, el volumen del reactor puede reducirse en proporción lineal al aumento de la presión de funcionamiento del reactor, es decir, los biorreactores que funcionan a 10 atmósferas de presión solo necesitan tener una décima parte del volumen de los que funcionan a 1 atmósfera de presión.
Los beneficios de llevar a cabo una fermentación de gas a producto a presiones elevadas también se han descrito en otra parte. Por ejemplo, en el documento WO 02/08438 se describen fermentaciones de gas a etanol realizadas a presiones de 0,20 MPa (30 psig) y 0,51 MPa (75 psig), proporcionando productividades de etanol de 150 g/l/día y 369 g/l/día, respectivamente. Sin embargo, en fermentaciones de ejemplo realizadas con medios y composiciones de gas de entrada similares a presión atmosférica, se observó que se producía entre 10 y 20 veces menos etanol por litro y día.
En los siguientes documentos se detallan ejemplos de condiciones de fermentación que son adecuadas para la fermentación anaerobia de un sustrato que comprende CO, WO2007/117157, WO2008/115080, WO2009/022925 y WO2009/064200. Se reconoce que las condiciones de fermentación indicadas en dichos documentos pueden modificarse fácilmente de conformidad con los métodos de la presente invención.
Productos de fermentación
Los métodos de la invención pueden utilizarse para producir cualquiera de una diversidad de productos hidrocarbonados. Esto incluye alcoholes, ácidos y/o dioles. Más particularmente, la invención puede ser aplicable a la fermentación para producir butirato, propionato, caproato, etanol, propanol, butanol, 2,3-butanodiol, propileno, butadieno, iso-butileno y etileno. En una realización, la invención puede utilizarse para producir alcoholes incluyendo, pero sin limitación, propanol y butanol. Después, el(los) alcohol(es) puede(n) reaccionar con acetato para producir uno o más productos incluyendo acetato de propilo o acetato de butilo. Un experto en la materia entendería que la invención no se limita a los alcoholes y a los productos mencionados, y que para producir un producto puede utilizarse cualquier alcohol y/o ácido apropiado.
Estos y otros productos pueden ser valiosos para otros muchos procesos, tales como la producción de plásticos, productos farmacéuticos y agroquímicos. En una realización, el producto de fermentación se utiliza para producir hidrocarburos de la gama de gasolina (8 carbonos), hidrocarburos diésel (12 carbonos) o hidrocarburos de combustible para aviones (12 carbonos).
Los métodos de la invención también pueden aplicarse a fermentaciones aerobias, a fermentaciones anaerobias o aerobias de otros productos, incluyendo, pero sin limitación, isopropanol. Los métodos de la invención también pueden aplicarse a fermentaciones aerobias y a fermentaciones anaerobias o aerobias de otros productos, incluyendo, pero sin limitación, isopropanol.
Al menos una parte de un producto hidrocarbonado producido a través de fermentación, puede reutilizarse en el proceso de reformado con vapor. Esto puede realizarse porque los hidrocarburos distintos del CH4 son capaces de reaccionar con el vapor sobre un catalizador para producir H2 y CO. En una realización particular, el etanol se recicla para utilizarse como materia prima para el proceso de reformado con vapor. En una realización adicional, la materia prima y/o el producto hidrocarbonado se pasa a través de un prerreformador antes de utilizarse en el proceso de reformado con vapor. El paso a través de un prerreformador, completa parcialmente la etapa de reformado con vapor
del proceso de reformado con vapor que puede aumentar la eficacia de la producción de hidrógeno y reducir la capacidad requerida del horno de reformado con vapor.
Los métodos de la invención también pueden aplicarse a fermentaciones aerobias y a fermentaciones anaerobias o aerobias de otros productos, incluyendo, pero sin limitación, isopropanol.
Más particularmente, la invención puede ser aplicable a la fermentación en etanol y/o acetato. Después, estos productos pueden reaccionar entre sí para producir productos químicos incluyendo ésteres. El etanol y el acetato producidos por fermentación pueden reaccionar entre sí para producir acetato de etilo. El acetato de etilo puede ser valioso para muchos otros procesos, tales como la producción de disolventes, incluidos los revestimientos de superficies y diluyentes, así como en la fabricación de productos farmacéuticos, saborizantes y esencias.
Recuperación de los productos
Los productos de la reacción de fermentación pueden recuperarse usando métodos conocidos. Como métodos ilustrativos se incluyen los descritos en los documentos WO07/117157, WO08/115080, US 6340581, US 6136577, US 5593886, US 5807722 y US 5821 111. Sin embargo, brevemente y solo como ejemplo, el etanol puede recuperarse del caldo de fermentación mediante métodos tales como destilación o evaporación fraccionada, y fermentación extractiva.
La destilación de etanol de un caldo de fermentación produce una mezcla azeotrópica de etanol y agua (es decir, 95 % de etanol y 5 % de agua). Posteriormente, puede obtenerse etanol anhidro utilizando tecnología de deshidratación de etanol mediante tamizado molecular, que también se conoce bien en la materia.
Los procedimientos de fermentación extractiva implican el uso de un disolvente miscible en agua que presenta un bajo riesgo de toxicidad para el organismo de fermentación, para recuperar el etanol del caldo de fermentación diluido. Por ejemplo, el alcohol oleílico es un disolvente que puede utilizarse en este tipo de proceso de extracción. El alcohol oleílico se introduce de manera continua en un fermentador, después de lo cual este disolvente sube formando una capa en la parte superior del fermentador que se extrae continuamente y se suministra a través de una centrífuga. Después, el agua y las células se separan fácilmente del alcohol oleílico y se devuelven al fermentador, mientras que el disolvente cargado con etanol se suministra a una unidad de vaporización instantánea. La mayor parte del etanol se evapora y condensa, mientras que el alcohol oleílico no es volátil y se recupera para su reutilización en la fermentación.
El acetato, que puede producirse como subproducto en la reacción de fermentación, también puede recuperarse del caldo de fermentación usando métodos conocidos en la materia.
Por ejemplo, puede usarse un sistema de adsorción que incluya un filtro de carbón activado. En este caso, se prefiere que las células microbianas se retiren primero del caldo de fermentación usando una unidad de separación adecuada. En la materia se conocen numerosos métodos basados en filtración para generar un caldo de fermentación acelular para la recuperación del producto. El filtrado acelular que contiene etanol y acetato, se hace pasar después a través de una columna que contiene carbón activado para adsorber el acetato. El carbón activado adsorbe más fácilmente el acetato en forma ácida (ácido acético) en lugar de en forma salina (acetato). Por lo tanto, se prefiere que el pH del caldo de fermentación se reduzca a menos de aproximadamente 3 antes de hacerlo pasar a través de la columna de carbón activado, para convertir la mayor parte del acetato en la forma de ácido acético.
El ácido acético adsorbido en el carbón activado puede recuperarse mediante elución utilizado métodos conocidos en la materia. Por ejemplo, puede usarse etanol para eluir el acetato unido. El etanol producido mediante el propio proceso de fermentación, puede utilizarse para eluir el acetato. Dado que el punto de ebullición del etanol es de 78,8 °C y que el del ácido acético es de 107 °C, el etanol y el acetato pueden separarse fácilmente entre sí usando un método basado en la volatilidad, tal como la destilación.
También se conocen en la materia, y pueden utilizarse, otros métodos para recuperar acetato de un caldo de fermentación. Por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos n.° 6368819 y 6753 170, se describe un sistema de disolvente y codisolvente que puede utilizarse para la extracción de ácido acético de caldos de fermentación. Como en el ejemplo del sistema a base de alcohol oleílico descrito para la fermentación extractiva de etanol, los sistemas descritos en las patentes de Estados Unidos n.° 6368819 y 6753 170, describen un disolvente/codisolvente inmiscible en agua que puede mezclarse con el caldo de fermentación en presencia o ausencia de los microorganismos fermentados para extraer el producto de ácido acético. Después, el disolvente/cosolvente que contiene el producto de ácido acético se separa del caldo por destilación. Después, puede usarse una segunda etapa de destilación para purificar el ácido acético del sistema disolvente/cosolvente.
Los productos de la reacción de fermentación (por ejemplo, etanol y acetato) pueden recuperarse del caldo de fermentación retirando de manera continua una parte del caldo del biorreactor de fermentación, separando las células microbianas del caldo (convenientemente por filtración) y recuperando uno o más productos del caldo simultánea o secuencialmente. En el caso del etanol, puede recuperarse convenientemente por destilación, y el acetato puede
recuperarse por adsorción sobre carbón activado, usando los métodos descritos anteriormente. Las células microbianas separadas se devuelven preferentemente al biorreactor de fermentación. El filtrado acelular que queda después de haber retirado el etanol y el acetato, también se devuelve preferentemente al biorreactor de fermentación. Al filtrado acelular pueden añadirse nutrientes adicionales (tales como vitaminas B), para reponer el medio nutritivo antes de que se devuelva al biorreactor. Además, si como se ha descrito anteriormente, el pH del caldo se ajustó para mejorar la adsorción del ácido acético por el carbón activado, el pH debe reajustarse a un pH similar al del caldo en el biorreactor de fermentación, antes de ser devuelto al biorreactor.
La biomasa recuperada del biorreactor puede someterse a digestión anaerobia en una digestión para producir un producto de biomasa, preferentemente metano. Este producto de biomasa puede utilizarse como materia prima para el proceso de reformado con vapor o puede utilizarse para producir calor complementario para impulsar una o más de las reacciones definidas en el presente documento.
Generalidades
Las realizaciones de la invención se describen como ejemplo. Sin embargo, debe apreciarse, que es posible que etapas o fases particulares, que son necesarias en una realización, no lo sean en otra. En cambio, etapas o fases incluidas en la descripción de una realización particular, pueden utilizarse opcionalmente de manera ventajosa en realizaciones donde no se mencionen específicamente.
Aunque la invención se describe en términos generales con referencia a cualquier tipo de corriente que pueda desplazarse a través o alrededor del sistema o sistemas mediante cualquier medio de transferencia conocido, el sustrato y/o las corrientes de escape pueden ser gaseosos. Los expertos en la materia apreciarán que pueden acoplarse fases particulares a través de medios de conducto adecuados o similares, configurables para recibir o pasar corrientes a través de un sistema. Puede proporcionarse una bomba o un compresor para facilitar el suministro de las corrientes a fases particulares. Asimismo, puede utilizarse un compresor para aumentar la presión del gas proporcionado a una o más fases, por ejemplo el biorreactor. Como se analiza anteriormente en el presente documento, la presión de los gases dentro de un biorreactor puede afectar a la eficacia de la reacción de fermentación realizada en el mismo. Por tanto, la presión puede ajustarse para mejorar la eficacia de la fermentación. En la materia se sabe cuáles son las presiones adecuadas para llevar a cabo reacciones habituales.
Además, los sistemas o procesos pueden incluir opcionalmente medios para regular y/o controlar otros parámetros para mejorar la eficacia global del proceso. Se pueden incorporar uno o más procesadores al sistema para regular y/o controlar parámetros particulares del proceso. Por ejemplo, esto puede incluir medios de determinación para comprobar la composición del sustrato y/o de la(s) corriente(s) de escape. Además, los sistemas o procesos pueden incluir un medio para controlar el suministro de la(s) corriente(s) de sustrato a fases o elementos particulares dentro de un sistema particular si el medio determinante determina que la corriente tiene una composición adecuada para una fase particular. Por ejemplo, en los casos en que una corriente de sustrato gaseoso contenga niveles bajos de CO2 o H2 o niveles altos de O2 que puedan ser perjudiciales para una reacción de fermentación, la corriente de sustrato puede desviarse fuera del biorreactor. El sistema puede incluir medios para comprobar y controlar el destino de una corriente y/o el caudal del sustrato, de tal manera que una corriente con una composición deseada o adecuada pueda suministrarse a una fase particular.
Además, puede ser necesario calentar o enfriar componentes particulares del sistema o corriente(s) de sustrato antes o durante una o más fases del proceso. En tales casos, se pueden utilizar medios de calentamiento o enfriamiento conocidos. Por ejemplo, para calentar o enfriar las corrientes de sustrato pueden emplearse intercambiadores términos.
Asimismo, el sistema puede incluir una o más etapas de tratamiento previo/posterior para mejorar el funcionamiento o la eficacia de una fase en particular. Por ejemplo, una etapa de pretratamiento puede incluir medios para eliminar partículas y/o hidrocarburos de cadena larga o alquitranes de una corriente de sustrato gaseoso. Otras operaciones previas o posteriores que pueden realizarse incluyen la separación del (de los) producto(s) deseado(s) procedente(s) de fases particulares, tales como, por ejemplo, la fase de producción en el biorreactor (p. ej., la eliminación de etanol por destilación).
A continuación, se describirá la invención, solo como ejemplo, con referencia a los siguientes Ejemplos.
Ejemplos
Materiales y métodos
Tabla 1: Medios de fermentación
continuación
Preparación del medio en el biorreactor:
Se llevaron a cabo fermentaciones con C. autoethanogenum DSM23693 en biorreactores de 1,5 l a 37 °C. Los medios se prepararon de acuerdo con la Tabla 1. Para lograr la anaerobicidad, el recipiente del reactor se roció con nitrógeno. Antes de la inoculación, el gas se cambió a gas de acería que contenía H2 (3 %), N2 (30 %), CO (47 %) y CO2 (20 %) o gases puros (CO al 50 %, CO2 al 18 - 40 %, con balance de N2). El flujo de gas se fijó inicialmente a 67 ml/min/l, aumentando a 200 ml/min durante la fase exponencial media, mientras que se aumentó la agitación de 200 a 800 rpm. Se administró Na2S al biorreactor a 0,25 ml/h. Una vez que la DO600 alcanzó 1,5, el biorreactor se cambió a un modo continuo a una tasa de dilución de 2,0 -1,6 d-1 y una tasa de dilución bacteriana de 0,9 - 0,6 d-1. Durante el modo continuo, el gas y la agitación se ajustaron a 900 - 950 rpm y a 800 - 900 ml/min. El Na2S se aumentó a 1,0 ml/h.
Procedimientos de muestreo y analíticos:
Se tomaron muestras de cultivo líquido a diferentes intervalos durante toda la fermentación. Estas muestras se utilizaron para establecer la densidad óptica a 600 nm (espectrofotómetro) y el nivel de sustratos y productos (cromatografía líquida de alta resolución - HPLC, por las siglas del inglés)). Se utilizó HPLC habitualmente para cuantificar el nivel de acetato, etanol y 2,3-butanodiol. Las composiciones de los gases de entrada y salida se analizaron utilizando un cromatógrafo de gases (CG), permitiendo medir el consumo de CO y H2 consumo y la producción de CO2 por el cultivo.
Ejemplo 1:
Los impactos del 2-HIBA se investigaron en un sistema de un solo reactor que se había optimizado para la producción de 2,3-BDO. Esto se hizo para determinar el impacto que tendría este producto químico en un sistema de alto rendimiento y obtener información sobre concentraciones adecuadas que no interfirieran con la estabilidad global de la fermentación. Se añadieron 0,5 g/l (4,8 mM) de 2-HIBA al fermentador el día 7,95, los resultados de este estudio se muestran en la Figura 1. La adición de 2-HIBA alteró el perfil de metabolitos de la fermentación aumentando la producción de 2,3-butanodiol mientras disminuía la producción de etanol, acetato y biomasa.
La concentración de 2,3-BDO aumentó de 6 g/l a 12 g/l, disminuyendo la relación de 4:1 a tan solo 1,4:1. Se demostró
que esta adición no tenía ningún impacto perjudicial en la absorción de gas, aunque la concentración de etanol y biomasa disminuyó como resultado de la adición. La concentración de 2-HIBA se comprobó en la salida de líquido del reactor. Los resultados de esta investigación se muestran en la Figura 2. La curva indica que esta eliminación inicial se producía a una tasa similar a la de la tasa de dilución de 1,8 día-1 mientras que la eliminación global del 2-HIBA coincidió con la tasa de dilución bacteriana de 0,7 día-1. Los resultados muestran que el 2-HIBA no se convierte en el reactor. El 2-HIBA se elimina del fermentador de acuerdo con la tasa de dilución bacteriana. Esto es importante ya que muestra que las bacterias no consumen el 2-HIBA.
Ejemplo 2:
Se utilizó un sistema de dos reactores para examinar el impacto de la adición continua del 2-HIBA en el perfil de metabolitos. Inicialmente, se añadieron 0,5 g/l/día (4,8 mM/día) de 2-HIBA solo al R2, esto aumentó la producción de 2.3- BDO pero la relación disminuyo únicamente a tan solo 1,9:1. A continuación, se añadió continuamente 2-HIBA a 0,5 g/l/día (4,8 mM/día) al R1. Dado que las bacterias no convierten el 2-HIBA, se planteó la hipótesis de que la adición al R1 aumentaría significativamente la producción global de 2,3-BDO. Esto se conseguiría mejorando la concentración tanto en el R1 como en el R2, ya que el 2-HIBA se transfiere del R1 al R2 (a través del flujo de líquido) junto con la mejora de las concentraciones de 2,3-BDO. Los resultados de esta adición continua se muestran en las Figuras 3- 6. La concentración de 2,3-BDO aumentó de 5,7 g/l a 14 g/l en el R1 y de 16 g/l a 21 g/l en el R2 (véanse las Figuras 3 y 4). La relación etanol: 2,3-BDO disminuyó a 1:1 en el R1 y a 1,3:1 en el R2 y se mantuvo estable durante un período de ocho días. La mejora de la relación se logró como resultado de una mayor concentración de 2,3-BDO y una disminución en la producción de etanol.
Con el tiempo, la concentración de etanol después de la adición de 2-HIBA mejoró, mientras que la concentración de 2.3- BDO se mantuvo estable, esto tuvo el efecto de mejorar la productividad total de alcohol del sistema. Como se muestra en los datos de gas (Figuras 5 y 6) la adición de 2-HIBA no tuvo ningún impacto negativo sobre la absorción de CO e hidrógeno. Todos los parámetros se resumen en las Tablas 1 y 2. La Tabla 2 muestra los promedios de metabolitos de R1 y R2 en un sistema de dos fermentadores conectados durante ocho días de funcionamiento estable. La Tabla 3 muestra los promedios de datos de gas de R1 y R2 en un sistema de dos fermentadores conectados durante ocho días de funcionamiento estable. El sistema de fermentación perdió estabilidad debido a un fallo mecánico en la unidad de control R1 que provocó fallos en el sistema de control de agitación, temperatura y pH y el colapso de la fermentación.
Tabla 2:
Promedio Acetato Etanol g/l 2,3 BDO g/l Lactato Biomasa Etanol: 2, 3 productividad g/l g/l g/l BDO de 2, 3 BDO
en g/l/día
R1 6,5 14,4 13,7 0,0 9,2 1,05:1 27
R2 7,8 28,3 21,3 0,0 15,6 1,3:1 16
Tabla 3:
Promedio absorción de producción producción de % de utilización
CO mMol/l de H2 mMol/l CO2 mMol/l de CO
R1 -8830 423 5630 53
R2 413 4932 63
7930
Ejemplo 3:
Los resultados obtenidos en el Ejemplo 2 se repitieron con el objetivo de mejorar el título global de 2,3-BDO. En este experimento, la concentración de 2-HIBA se aumentó a 1 g/l/día (9,6 mM/día). Al igual que con los resultados obtenidos en el experimento anterior, la absorción de gas no se vio afectada negativamente y la relación etanol: 2,3-BDO en el R2 se mantuvo estable durante un período de siete días a 1,3:1. La adición de 1 g/l/día (9,6 mM/día) mejoró la concentración global de 2,3-BDO que llegó a alcanzar hasta 23,9 g/l (véase la Figura 7).
Ejemplo 4:
Determinación de la concentración mínima necesaria para provocar un impacto en la producción de 2,3-butanodiol.
En los ejemplos 1 a 3, se probaron concentraciones de 0,5 g/l - 1 g/l (4,8 - 9,6 mM) y se demostró que tenían un impacto significativo en la producción de 2,3-butanodiol y etanol. Para comprender las concentraciones mínimas necesarias para generar el mismo efecto, la concentración utilizada disminuyó a 0,1 g/l (0,96 mM) en un ejemplo y a 0,05 g/l (0,48 mM) en otro ejemplo. En ambas fermentaciones se aumentó el gas para minimizar el acetato y maximizar la producción de etanol. Para maximizar la producción de 2,3-BDO, se mezcló CO2 adicional en la corriente de gas, la mezcla de gases utilizada fue CO al 50 %, CO2 al 35 %, H2 al 1,5 % con balance de N2. La tasa de dilución y la tasa
de dilución bacteriana se ajustaron a 1,8 día-1 y 0,8 día-1, respectivamente. Una vez que se recopilaron datos estables, se inició la adición continua de 2-HIBA a través del medio y se observó el impacto resultante en las concentraciones de metabolitos. En la Tabla 4 se muestra un resumen de los datos antes y después de la adición para cada ejemplo.
En ambos ejemplos, la relación antes de la adición de 2-HIBA fue de 2:1 y el impacto resultante en la relación Etanol: 2,3-BDO fue proporcional a la concentración de 2-HIBA utilizada. En el primer ejemplo donde se usó 0,1 g/l (0,96 mM) la relación mejoró a 1:1 y cuando la concentración se redujo a la mitad (en el segundo ejemplo) la respuesta fue una mejora en la relación a solo 1,5:1.
Tabla 4: Impacto de diferentes concentraciones de 2-HiBA en dos fermentaciones diferentes.
En dos experimentos adicionales se añadieron concentraciones de 0,01 g/l a 0,1 g/l (0,096, 0,24, 0,48, 0,72, 0,96 mM) y se observó el impacto sobre los metabolitos. De nuevo, las fermentaciones tuvieron un aumento de gas para minimizar el acetato y maximizar la producción de etanol con CO2 mezclado en la corriente de gas para maximizar la producción de 2,3-BDO. La tasa de dilución y la tasa de dilución bacteriana se ajustaron a 1,8 día-1 y 0,9 día-1, respectivamente. La mezcla de gases utilizada fue CO al 42 %, CO2 al 35 %, H2 al 1,5 % con balance de N2. Al cotejar los datos de los cuatro ejemplos, se observa que por cada 0,05 g/l (0,48 mM) que se añaden a una fermentación estable, la relación etanol:2,3-BDO disminuye en 0,5 unidades. Estos resultados se muestran en la Figura 8. Estos resultados muestran que el impacto de 2-HiBA es independiente de la relación inicial de etanol: 2,3-butanodiol, también muestran que concentraciones tan bajas como 0,01 g/l (0,096 mM) causan impacto en la producción de 2,3-butanodiol.
Ejemplo 5:
Para averiguar si el 2-HIBA impactaba negativamente sobre el crecimiento, se inició una fermentación en presencia de 0,05 g/l (0,48 mM) de 2-HIBA. Durante el crecimiento, se aumentaron el gas y la agitación, de modo que el día 5,0 la agitación había alcanzado un máximo de 950 rpm y el flujo de gas de 800 ml/min. En este momento, la tasa de dilución era de 1,8 día'1 y la tasa de dilución bacteriana de 0,85 día'1. La presencia de 2-HIBA no tuvo ningún impacto en el crecimiento de la fermentación, pero sí aumentó la rapidez con la que se podía alcanzar una relación Etanol: 2,3-Butanodiol baja. El día 2,0 la relación Etanol: 2,3-BDO había alcanzado 2:1 y después continuó disminuyendo lentamente, alcanzando finalmente la relación 1,1:1 con una concentración media de etanol de 17 g/l y una concentración de 2,3-butanodiol de 15,5 g/l. Los resultados de esta fermentación se muestran en las Figuras 9 y 10.
Estos resultados muestran que es posible añadir 2-HiBA en los medios de fermentación sin un impacto negativo en el crecimiento, siendo 0,05 g/l (0,48 mM) suficiente para alcanzar una relación Etanol: 2,3-BDO en el intervalo de 1:1.
Ejemplo 6:
Expresión del gen 2-HIBA
Para comprender el impacto de 2-HIBA sobre el metabolismo de LZ1561, se tomaron muestras para el análisis de la expresión génica. Un reactor arrancó en modo discontinuo y después de 1 día cambio a continuo a un valor D = 1,4 día-1. El flujo de gas y la agitación se ajustaron para minimizar el acetato y maximizar la producción de etanol y 2,3-BDO. El día 7 la relación Etanol: 2,3-BDO era inferior a 5:1 y el gas había alcanzado un absorción de CO diana de entre 5 -6 mol/l/día. El día 9,6 se tomó una muestra para el análisis de la expresión génica que representaba datos estables sin 2-HIBA. El día 10,78 se añadieron 0,5 g/l (4,8 mM) de 2-HIBA a la fermentación en forma de inyección y después mediante la adición en el frasco de medios. Después de la adición de 2-HIBA se observó una respuesta característica en los metabolitos, esto incluyó la disminución de acetato, etanol y biomasa con aumento de 2,3-BDO. El día 13,8 se tomó otra muestra para el análisis de la expresión génica que representaba la adición estable de 2-HIBA. La Tabla 5 indica los dos momentos en los que se recopilaron datos para el análisis de la expresión génica. Antes de la adición de 2-HIBA la relación Etanol: 2,3-BDO fue de 4:1, después de la adición, la relación alcanzó 1,5:1. Se descubrió que un pequeño subconjunto de genes estaba significativamente regulado al alza o a la baja, estos genes se muestran en las Tablas 6 y 7. Los resultados de este análisis indicaron muy claramente que el 2-HIBA interactúa con la ruta de la biosíntesis de aminoácidos de cadena ramificada (AACR). A partir de los resultados se propuso un modo de acción del 2-HIBA que se ilustra y describe en la Figura 11.
Tabla 5: Muestras tomadas para el análisis diferencial de la expresión génica
Tabla 6: Genes diferencialmente regulados al alza entre la adición de 2-HIBA 0 mM y la adición de 2-HIBA 4,8 mM, estas enzimas se visualizan en la Fi ura 4.
Ejemplo 7:
T l 7: n if r n i lm n r l l nr l i i n 2-HIBA mM l ^ i i n 2-HIBA 4 mM
Comprobación de la producción de AACR durante la adición de 2-HIBA
Para generar más pruebas de que el 2-HiBA interfiere con la producción de aminoácidos de cadena ramificada, las concentraciones de estos aminoácidos se comprobaron directamente antes y después de la adición de 2-HIBA. En la Figura 11 se ilustran los resultados; inmediatamente después de la adición de 2-HIBA las concentraciones de valina, leucina e isoleucina disminuyen así como la biomasa. Con el tiempo, la concentración de biomasa se aplana y la concentración de isoleucina parece recuperarse, permaneciendo la concentración de leucina y valina por debajo del valor anterior a la adición de 2-HIBA. Estos datos parecen colaborar con los datos de expresión génica que muestran que la producción de 2,3-BDO aumenta debido a una interferencia de la vía de los aminoácidos de cadena ramificada.
Adición de otros inhibidores conocidos
Se añadió 2-hidroxi-2-metilbutirato a una fermentación optimizada para la producción de 2,3-butanodiol. Este compuesto químico se eligió basándose en su relación estructural con 2-HiBA y en su referencia en la bibliografía como un inhibidor conocido de ilvC. Se añadió una sola adición de ácido 2-hidroxi-2-metilbutírico (15 mM) a un reactor estable el día 13,2 y se observaron los resultados en el perfil de metabolitos. Los resultados se muestran en la Figura 13. La adición pareció aumentar la producción de 2,3-Butanodiol y disminuir la relación Etanol: 2,3-BDO.
Ejemplo 8:
Reducción de flujo de acetolactato a 2,3-dihidroxi-3-metilbutirato
Para inhibir el flujo de acetolactato a 2,3-dihidroxi-3-metilbutirato, se elimina un gen de la cetol-ácido reductoisomerasa.
Esto puede realizarse mediante la alteración de genes utilizando el sistema ClosTron (Heap et al 2007).
La desactivación del gen de la cetol-ácido reductoisomerasa requiere que la fermentación funcione en presencia de aminoácidos de cadena ramificada complementarios, ya que es un gen necesario para la biosíntesis de aminoácidos de cadena ramificada, que son esenciales para el crecimiento microbiano. Los aminoácidos de cadena ramificada se añaden a niveles limitantes, de tal manera que la ruta de la biosíntesis de aminoácidos de cadena ramificada está regulada al alza y es activa.
Como alternativa, el gen natural de la cetol-ácido reductoisomerasa (SEQ ID NO: 1), se elimina mediante el mecanismo descrito anteriormente, y en el microorganismo se inserta un gen exógeno de la cetol-ácido reductoisomerasa que tiene una actividad más baja que la del gen natural. El gen exógeno de la cetol-ácido reductoisomerasa puede ser una enzima homóloga de otro organismo que tenga menor actividad en el hospedador, o un mutante de la enzima natural que tenga menor actividad. En Escherichia coli se han identificado mutaciones en el sitio activo que reducen la actividad (Tyagi et al 2005), y en C. autoethanogenum se conservan residuos clave, lo que permite que estas mutaciones se repliquen para generar un mutante de la enzima natural con actividad reducida. La eliminación del gen natural y el reemplazo por un gen menos activo da como resultado una cepa que tiene un flujo reducido desde el acetolactato hacia los aminoácidos de cadena ramificada. Como consecuencia, la reserva de acetolactato disponible aumenta.
Ejemplo 9
Aumento del flujo de piruvato a 2-hidroxi-2-metil-3-cetobutirato (acetolactato)
Para aumentar el flujo de piruvato a 2-hidroxi-2-metil-3-cetobutirato (acetolactato), la acetolactato sintasa catabólica natural se sobreexpresa.
El gen de la acetolactato sintasa (alsS) catabólica natural (SEQ ID NO: 2), se clona en los sitios NdeI y NheI de pMTL83155 (WO2013185123A1) para generar un plásmido de sobreexpresión, que expresa la alsS bajo el control de la región promotora del operón fosfotransacetilasa-acetato cinasa.
El plásmido de sobreexpresión puede producirse de manera similar usando una acetolactato sintasa catabólica de otro microorganismo, una acetolactato sintasa anabólica natural o una acetolactato sintasa anabólica de otro microorganismo.
Se considera que el uso de una acetolactato sintasa catabólica de otro microorganismo o de una acetolactato sintasa anabólica de otro microorganismo puede tener una mayor afinidad hacia el piruvato y una cinética de reacción más rápida. Se considera además que la acetolactato sintasa anabólica de otro microorganismo puede ser una enzima que se identifique como insensible a la inhibición por retroalimentación. También se considera que la subunidad pequeña del mutante de la acetolactato sintasa anabólica que es insensible a las inhibiciones por retroalimentación está sobreexpresada.
El plásmido de sobreexpresión se introduce en Clostridium autoethanogenum. Esto da como resultado una cepa de C. autoethanogenum adaptada para aumentar el flujo de piruvato a acetolactato.
En el presente documento se ha descrito la invención con referencia a determinadas realizaciones preferidas, para permitir al lector llevar a la practica la invención sin excesiva experimentación. Los expertos en la materia apreciarán que la invención puede llevarse a la práctica en una gran cantidad de variaciones y modificaciones distintas de las descritas específicamente. Debe entenderse que la invención incluye todas estas variaciones y modificaciones. Asimismo, se proporcionan títulos, encabezamientos o similares para ayudar al lector a comprender este documento y no deben interpretarse como una limitación del alcance de la presente invención.
Más particularmente, como apreciará un experto en la materia, las implementaciones de las realizaciones de la invención, pueden incluir uno o más elementos adicionales. Es posible que en un ejemplo concreto o en la descripción sólo se hayan mostrado los elementos necesarios para comprender la invención en sus diversos aspectos.
La referencia a cualquier técnica anterior en esta memoria descriptiva no es y no debería tomarse como un reconocimiento o cualquier forma de sugerencia de que esa técnica anterior forma parte del conocimiento general común en el campo de actividad en cualquier país.
A lo largo de esta memoria descriptiva y de cualquiera de las siguientes reivindicaciones, a menos que el contexto requiera lo contrario, el término "comprende", la expresión "que comprende" y similares, deben interpretarse en un sentido inclusivo y no exclusivo, es decir, en el sentido de "incluyendo, pero sin limitación".
Claims (9)
1. Un método para aumentar la producción de al menos un producto derivado de acetolactato, comprendiendo el método:
a. proporcionar un sustrato gaseoso seleccionado del grupo que consiste en CO, CO2 , H2 y mezclas de los mismos, a un biorreactor que comprenda un cultivo de al menos un microorganismo carboxidotrófico acetogénico en un medio nutritivo líquido; y
b. fermentar dicho cultivo de al menos un microorganismo carboxidotrófico acetogénico para producir al menos un producto de fermentación a partir de dicho sustrato gaseoso; y
c. inhibir el flujo de carbono a los aminoácidos de cadena ramificada mediante la adición de al menos un compuesto al medio nutritivo líquido, en donde el al menos un compuesto se selecciona del grupo que consiste en ácido 2-hidroxiisobutírico (2-HIBA), ácido 2-hidroxil-2-metilbutírico, 2-hidroxibutirato, ácido 2-hidroxi-3-metilbutírico, 2-ceto-3-hidroxiisovalerato y 2-cetoisovalerato.
2. El método de la reivindicación 1, en donde el al menos un producto de fermentación se selecciona del grupo que consiste en ácido acético, etanol, 2,3-butanodiol, 2-butanona, 2-butanol, acetoína, iso-propanol, lactato, succinato, metil etil cetona (MEC), propanodiol, 2-propanol, acetoína, iso-butanol, citramalato, butadieno, ácido poliláctico, 3-hidroxibutirato, isobutileno, 3-hidroxi propionato (3HP), acetona y ácidos grasos.
3. El método de la reivindicación 1, en donde el sustrato gaseoso comprende CO, CO2 y H2.
4. El método de la reivindicación 1, en donde el al menos un microorganismo carboxidotrófico acetogénico se selecciona del grupo que consiste en Clostridium, Moorella, Oxobacter, Peptostreptococcus, Acetobacterium, Eubacterium o Butyribacterium.
5. El método de la reivindicación 4, en donde el microorganismo carboxidotrófico acetogénico se selecciona del grupo que consiste en Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahli, Clostridium carboxidivorans, Clostridium drakei, Clostridium scatologenes, Clostridium aceticum, Clostridium formicoaceticum, Clostridium magnum, Butyribacterium methylotrophicum, Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchi, Blautia producta, Eubacterium limosum, Moorella thermoacetica, Sporomusa ovata, Sporomusa silvacetica, Sporomusa sphaeroides, Oxobacter pfennigii y Thermoanaerobacter kiuvi.
6. Un método para aumentar la producción de 2,3-butanodiol, comprendiendo el método;
a. proporcionar un sustrato gaseoso que comprende CO a un biorreactor que comprende un cultivo de al menos un microorganismo carboxidotrófico acetogénico en un medio nutritivo líquido, para producir al menos 2,3-butanodiol; y
b. añadir al medio nutritivo líquido al menos un compuesto que inhiba el flujo de carbono a los aminoácidos de cadena ramificada, en donde el al menos un compuesto se selecciona del grupo que consiste en ácido 2-hidroxiisobutírico (2-HIBA), ácido 2-hidroxil-2-metilbutírico, 2-hidroxibutirato, ácido 2-hidroxi-3-metilbutírico, 2-ceto-3-hidroxiisovalerato y 2-cetoisovalerato.
7. El método de la reivindicación 6, en donde el método produce además al menos un producto seleccionado del grupo que consiste en ácido acético, etanol, 2-butanona, 2-butanol, acetoína, iso-propanol, lactato, succinato, metil etil cetona (MEC), propanodiol, 2-propanol, acetoína, iso-butanol, citramalato, butadieno, ácido poliláctico, 3-hidroxibutirato, isobutileno, 3-hidroxi propionato (3HP), acetona y ácidos grasos.
8. El método de la reivindicación 6, en donde el microorganismo carboxidotrófico acetogénico se selecciona del grupo que consiste en Clostridium, Moorella, Oxobacter, Peptostreptococcus, Acetobacterium, Eubacterium o Butyribacterium.
9. El método de la reivindicación 6, en donde el método produce además etanol y en donde:
a. el 2,3-butanodiol se produce a una tasa de al menos 10 g/l por día; y
b. una relación entre el etanol y el 2,3-butanodiol está comprendida entre 4:1 y 1:2.
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