ES2935913T3 - Péptido - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona un péptido que comprende cualquiera de (i) una secuencia de aminoácidos LSSTQAQQSY (SEQ ID NO: 1), (ii) una secuencia de aminoácidos LSSTQAQQSW (SEQ ID NO: 6) y (iii) una secuencia de aminoácidos LSSTQAQQSF (SEC ID Nº: 7). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Péptido

Campo técnico

La presente invención se refiere a un péptido novedoso. La presente invención también se refiere a un producto farmacéutico y a un producto alimenticio que comprende el péptido.

Antecedentes de la técnica

Japón se enfrenta a una sociedad súper envejecida en la que una de cada cuatro personas es anciana. En una sociedad tan envejecida, se desea la realización de una sociedad dinámica con salud y longevidad. Sin embargo, los ancianos tienen problemas de función neurológica reducida, tal como disminución de la motivación, aumento del estrés y disminución del apetito.

En el campo de los productos alimenticios para cuidados de enfermería se han desarrollado productos alimenticios blandos para abordar la reducción en la función de deglución y/o masticación. En el futuro, habrá una necesidad de desarrollar productos alimenticios para cuidados de enfermería de última generación con una funcionalidad que pueda mejorar la función neurológica reducida descrita anteriormente.

El documento JP2014-162735A divulga un péptido derivado de gluten de trigo que presenta actividad antidepresiva. Sin embargo, no existen péptidos conocidos que puedan mejorar la disminución de la motivación.

El documento JP2007-091656A divulga péptidos ansiolíticos derivados de una proteína de soja.

El documento JP2010-222300A se refiere a medios para seleccionar péptidos funcionales de manera eficaz.

El documento JP2009-247270 describe una preparación farmacéutica sólida que contiene un hidrolizado de termolisina de proteína de soja.

El documento EP 2 130533 A1 describe productos farmacéuticoss y alimentos funcionales que están hechos de un nutriente o ingrediente alimenticio seguro que tiene un efecto tranquilizante.

El documento US 2010/210564 A1 describe un producto farmacéutico o un producto alimenticio que incluye como principio activo un péptido que contiene Tyr, Phe, Trp o His y un aminoácido hidrófobo adyacente al mismo, o un análogo del mismo.

Sumario de la invención

Problema técnico

Un objeto de la presente invención es proporcionar un péptido novedoso que tiene un efecto de mejora sobre la disminución de la motivación, la depresión o un trastorno del estado de ánimo, y un producto farmacéutico y un producto alimenticio que comprende el péptido.

Solución al problema

Los presentes inventores realizaron una extensa investigación para lograr el objeto anterior y lograron aislar un novedoso péptido que tiene un efecto de mejora sobre la disminución de la motivación, la depresión o un trastorno del estado de ánimo. Los presentes inventores realizaron además una investigación basada en este hallazgo y consiguieron la presente invención.

Más específicamente, la presente invención proporciona un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos LSSTQAQQSY (SEQ ID NO: 1).

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende el péptido de la presente invención y un portador, diluyente o excipiente.

La presente invención también proporciona un producto alimenticio que comprende el péptido de la presente invención. Además, la presente invención proporciona el péptido, la composición farmacéutica o el producto alimenticio de la presente invención para su uso en el tratamiento de depresión o un estado provocado por la misma.

La presente invención también proporcionar el uso del péptido o producto alimenticio de la invención como potenciador de motivación en un sujeto, en el que el uso es no terapéutico.

En las reivindicaciones se proporcionan aspectos adicionales de la invención.

Efectos ventajosos de la invención

La composición farmacéutica y el producto alimenticio que contienen el péptido de la presente invención como principio activo tiene un alto efecto antidepresivo/efecto de potenciación de la motivación con pocos efectos secundarios y son adecuados para su uso a largo plazo. Además, la composición farmacéutica y el producto alimenticio de la presente invención son eficaces por administración oral.

Además, pueden ingerirse péptidos naturales de cadena corta como alimento; por tanto, cuando se ingieren como alimentos por individuos que no están enfermos, pero que tienen un problema de disminución de la motivación, puede esperarse que tales péptidos prevengan enfermedades en tales individuos.

El péptido de la presente invención es un digesto enzimático de proteína p-conglicinina de soja y, por tanto, está libre de efectos secundarios. Además, la proteína p-conglicinina de soja, que es abundante en la soja, puede producirse a bajo coste.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1A muestra un método para la prueba de suspensión por la cola. Como animales de experimentación, se usaron ratones macho ddY de 24 a 30 g. La figura 1B muestra un método para la prueba de natación forzada.

La figura 2 muestra métodos para la prueba de suspensión por la cola y la prueba de natación forzada. Las pruebas se realizaron 30 minutos después de la administración oral (por vía oral (v.o.)) de una sustancia de prueba (digesto enzimático o péptido). En la prueba de suspensión por la cola, se midió el tiempo de inmovilidad durante el periodo desde 0 hasta 6 minutos, y en la prueba de natación forzada, se midió el tiempo de inmovilidad durante el periodo desde 0 hasta 8 minutos.

La figura 3A muestra un método para la prueba del laberinto en cruz elevado (EPM), y la figura 3B muestra un método para la prueba del campo abierto (DE).

La figura 4 muestra métodos para la prueba del laberinto en cruz elevado y la prueba del campo abierto. Las pruebas se realizaron 30 minutos después de la administración oral (por vía oral (v.o.)) de una sustancia de prueba (digesto enzimático o péptido), y se realizó la evaluación durante un periodo de prueba de 5 minutos. Como animales de experimentación, se usaron ratones macho ddY de 24 a 30 g.

La figura 5 muestra los resultados de la prueba de suspensión por la cola en ratones a los que se les administró por vía oral individualmente cada digesto enzimático.

La figura 6 muestra los resultados de la prueba de natación forzada en ratones a los que se les administró por vía oral un digesto enzimático.

La figura 7 muestra los resultados de la prueba de suspensión por la cola en ratones a los que se les administró por vía oral un péptido.

La figura 8 muestra los resultados de la prueba de natación forzada en ratones a los que se les administró por vía oral un péptido.

La figura 9 muestra los resultados de investigar las relaciones estructura-actividad de péptidos mediante los resultados de la prueba de suspensión por la cola.

La figura 10 muestra los resultados de investigar el mecanismo de acción de digestos enzimáticos, usando antagonistas, mediante los resultados de la prueba de suspensión por la cola.

La figura 11 muestra los resultados de investigar el mecanismo de acción de péptidos, usando antagonistas, mediante los resultados de la prueba de suspensión por la cola.

La figura 12 muestra un modelo supuesto del mecanismo de acción por el que se produce un efecto antidepresivo (efecto de potenciación de la motivación).

La figura 13 muestra los resultados de la prueba del laberinto en cruz elevado en ratones a los que se les administró por vía oral un digesto enzimático.

La figura 14 muestra los resultados de la prueba del laberinto en cruz elevado en ratones a los que se les administró por vía oral un péptido.

La figura 15 muestra los resultados de la prueba del campo abierto en ratones a los que se les administró por vía oral un péptido.

La figura 16 muestra los resultados de la prueba de suspensión por la cola en ratones a los que se les administró por vía oral individualmente cada péptido.

Descripción de las realizaciones

El péptido de la presente invención es un péptido de 10 residuos, el péptido consiste en LSSTQAQQSY (SEQ ID NO: 1).

Cada uno de los aminoácidos que forman el péptido puede ser un L-aminoácido, D-aminoácido o DL-aminoácido (la mezcla de D-aminoácido y L-aminoácido, incluyendo tanto un aminoácido racémico como un aminoácido que contiene un exceso de cualquiera de los enantiómeros). Preferiblemente, el péptido contiene sólo L-aminoácidos o sólo D-aminoácidos. Particularmente, se prefiere un péptido que contenga sólo L-aminoácidos.

Cuando el péptido usado en la presente invención tiene dos o más carbonos asimétricos, también puede usarse su enantiómero, diastereómero(s) o una mezcla de los mismos en cualquier razón. La separación del enantiómero o diastereómero puede realizarse usando una columna general, por ejemplo, usando una columna quiral, mediante un método en el que el enantiómero o diastereómero se resuelve ópticamente en forma de un derivado introduciendo un grupo ópticamente activo, y el grupo ópticamente activo se retira posteriormente; un método en el que el enantiómero o diastereómero se resuelve ópticamente formando una sal con un ácido o base ópticamente activo; o cualquier otro método conocido.

El péptido puede tener una o más modificaciones. El extremo amino terminal (extremo N-terminal) del péptido puede tener una modificación, tal como un grupo amino (NH²-) libre o un grupo acetilo (CH³CO-). El extremo carboxilo terminal (extremo C-terminal) del péptido puede tener una modificación, tal como un grupo carboxilo (-COOH) libre o un grupo amida. Los residuos de aminoácido del péptido pueden no estar modificados o tener una modificación, tal como un grupo fosfato o una cadena de azúcar.

El péptido de la presente invención puede estar en forma de sal (sal de adición de ácido o sal de base). Los ejemplos de sales de adición de ácido incluyen sales con ácidos inorgánicos, tales como ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido bromhídrico y ácido perclórico; y sales con ácidos orgánicos, tales como ácido cítrico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido málico, ácido tartárico, ácido p-toluenosulfónico, ácido bencenosulfónico, ácido metanosulfónico y ácido trifluoroacético. Los ejemplos de sales de base incluyen sales con metales alcalinos, tales como sodio, potasio y litio; sales con metales alcalinotérreos, tales como calcio y magnesio; y similares.

El péptido de la presente invención puede estar en forma de solvato. Los ejemplos de solvatos incluyen solvatos con agua (hidratos), metanol, etanol, isopropanol, ácido acético, tetrahidrofurano, acetona, dimetilformamida, dimetilsulfóxido, dimetilacetamida, acetamida, etilenglicol, propilenglicol, dimetoxietano y similares.

El péptido de la presente invención puede obtenerse hidrolizando la proteína p-conglicinina (P-CG), que es una proteína de almacenamiento principal de la soja, usando termolisina.

La termolisina es una enzima proteolítica (proteasa) conocida derivada de la bacteria termoestable Bacillus thermoproteolyticus (EC3.4.24.4). La termolisina puede usarse como aditivo alimentario en Japón. Como termolisina, puede usarse termolisina disponible comercialmente, por ejemplo, de calidad reactivo o calidad aditivo alimentario.

El sustrato que va a hidrolizarse con termolisina no está particularmente limitado siempre que contenga proteína p-CG de soja. Los ejemplos incluyen la propia soja, el bagazo obtenido extrayendo el aceite de soja de las semillas de soja (también denominada harina o soja desgrasada), la proteína p-conglicinina purificada y similares.

La hidrólisis usando termolisina se realiza en condiciones tales que se obtiene un péptido que consiste en 10 residuos de aminoácido. La temperatura de reacción puede seleccionarse adecuadamente, por ejemplo, desde 30 hasta 70°C, desde 30 hasta 40°C, desde 40 hasta 70°C, o desde 50 hasta 65°C. El tiempo de reacción puede seleccionarse adecuadamente, por ejemplo, desde aproximadamente 30 minutos hasta 48 horas, desde aproximadamente 1 hasta 10 horas, o desde aproximadamente 2 hasta 8 horas. El pH al que se lleva a cabo la reacción puede seleccionarse adecuadamente del intervalo de pH de aproximadamente 6,5 a 8,5 o de aproximadamente 7 a 8. En una realización preferida, la reacción puede realizarse durante de aproximadamente 2 a 8 horas en las siguientes condiciones: una temperatura de aproximadamente 30 a 40°C y un pH de 6,5 a 8,5 (en particular, aproximadamente pH 7,5).

El péptido de la presente invención no puede obtenerse en condiciones tales que la hidrólisis se realice excesivamente.

Si es necesario, la termolisina se desactiva calentando a una temperatura a la que se desactiva la termolisina (por ejemplo, calentando a una temperatura que supera 80°C durante de aproximadamente 5 a 60 minutos).

El producto de hidrólisis puede usarse como tal, o purificarse para separar el principio activo, péptido, que va a usarse.

El péptido de la presente invención también puede obtenerse mediante un método de síntesis de péptidos. Específicamente, se usa generalmente un método en fase de disolución o un método en fase sólida en la síntesis de péptidos. Entre estos, un material de partida que tiene un grupo carboxilo reactivo puede condensarse con un material de partida que tiene un grupo amino reactivo mediante un método a través de un éster activo usando HBTU, etc. o mediante un método usando un agente de acoplamiento, tal como carbodiimida. Cuando el producto de condensación resultante tiene un grupo protector, el péptido también puede producirse retirando el grupo protector.

Los grupos funcionales que no deberían estar implicados en la reacción de esta etapa de reacción se protegen con grupos protectores. Los ejemplos de grupos protectores amino incluyen benciloxicarbonilo (CBZ), t-butiloxicarbonilo (Boc), 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) y similares. Los ejemplos de grupos protectores carboxilo incluyen grupos capaces de formar ésteres de alquilo, ésteres de bencilo, y similares. En el caso de un método en fase sólida, el grupo carboxilo C-terminal se une a un soporte, tal como resina de clorotritilo, resina de clorometilo, resina de oximetilo o resina de alcohol p-alcoxibencílico. La reacción de condensación se lleva a cabo en presencia de un agente de condensación, tal como carbodiimida, o usando un éster activo de aminoácido protector de N o un éster activo de péptido.

El grupo protector se retira después de completarse la reacción de condensación. En el caso de un método en fase sólida, también se escinde el enlace entre el extremo C-terminal del péptido y la resina. Además, el péptido de la presente invención se purifica según un método general. Los ejemplos de métodos de purificación incluyen cromatografía de intercambio iónico, cromatografía líquida de fase inversa, cromatografía de afinidad, y similares. El péptido sintetizado se analiza mediante la técnica de degradación de Edman, usando un secuenciador de proteínas, CG-EM, o similares que lee una secuencia de aminoácidos a partir del extremo C-terminal.

El péptido de la presente invención también puede sintetizarse según un método enzimático (véase el documento WO2003/010307).

El péptido de la presente invención es eficaz en mejorar o tratar la disminución de la motivación, la depresión o un trastorno del estado de ánimo, o estados (síntomas) provocados por los mismos. Las expresiones “disminución de la motivación” y “trastorno del estado de ánimo” tal como se usan en el presente documento incluyen impulsos de la mente (ánimo), tal como sentirse desmotivado y no tener interés ni preocuparse por nada. “Disminución de la motivación” y “trastorno del estado de ánimo” no se limitan a enfermedades o estados que resultan de la depresión, y también incluyen el envejecimiento (senescencia), estrés (por ejemplo, trastorno de adaptación), y estados similares de los que no están diagnosticados de depresión.

Puede evaluarse el efecto de tratar o mejorar la disminución de la motivación (que puede expresarse de otro modo como “efecto de potenciación de la motivación”), por ejemplo, usando como índice una reducción en el tiempo de inmovilidad en la prueba de suspensión por la cola o la prueba de natación forzada, ambas de las cuales se usan para evaluar fármacos antidepresivos terapéuticos en ratones.

El péptido de la presente invención también tiene un efecto ansiolítico y también es eficaz en mejorar o tratar la ansiedad. El efecto ansiolítico puede evaluarse mediante, por ejemplo, la prueba del laberinto en cruz elevado o la prueba del campo abierto. La depresión es provocada por el siguiente círculo vicioso: en primer lugar, se provoca el estrés, uno siente que no cuenta con el apoyo de los que le rodean, se produce una disfunción cerebral, la manera de ver las cosas se vuelve negativa, y entonces sobreestima la carga y siente más estrés (véase la página 14 de Chiryo Gaidorain II Daiutsubyosei Shogai (directrices de tratamiento II de trastorno depresivo grave) por la Japanese Society of Mood Disorders). Puede esperarse que el péptido de la presente invención, que presenta un efecto antiestrés, elimine las causas de la disminución de la motivación, la depresión o un trastorno del estado de ánimo, o estados (síntomas) provocados por los mismos.

El péptido de la presente invención puede proporcionarse como composición farmacéutica o producto alimenticio (composición alimenticia).

La vía de administración del péptido de la presente invención o un producto que contiene el péptido de la presente invención no está particularmente limitada. El péptido o el producto puede administrarse por vía oral, parenteral o intrarrectal. El péptido o el producto puede administrarse por vía oral o no oral. Entre estas, se prefiere la administración oral porque el efecto obtenido es alto.

La dosis del péptido varía dependiendo del tipo de compuesto, el modo de administración, y el estado, edad, y similares de un individuo al que se le administra el péptido. La dosis diaria para un adulto es normalmente de 0,01 a 500 mg/kg, preferiblemente de 0,05 a 100 mg/kg, y más preferiblemente de 0,1 a 30 mg/kg. El péptido (principio activo) de la presente invención se administra normalmente en forma de una composición farmacéutica preparada mezclando con uno o más portadores farmacéuticos. Se usa un portador farmacéutico que se use habitualmente en el campo de las preparaciones farmacéuticas y que no reaccione con el péptido de la presente invención.

El péptido de la presente invención puede usarse por sí mismo como producto farmacéutico o producto alimenticio, o puede usarse individualmente o en una combinación con portadores no tóxicos adecuados para la administración oral, diluyentes, o excipientes para elaborar preparaciones alimenticias o preparaciones farmacéuticas tales como comprimidos (comprimidos no recubiertos, comprimidos recubiertos con azúcar, comprimidos efervescentes, comprimidos recubiertos con película, comprimidos masticables, y similares), cápsulas, trociscos, polvos, gránulos finos, gránulos, disoluciones, suspensiones, emulsiones, pastas, cremas, inyecciones (incluyendo infusiones tales como infusiones de aminoácidos e infusiones de electrolitos), y preparaciones de liberación mantenida incluyendo comprimidos con recubrimiento entérico, cápsulas y gránulos. La cantidad del péptido en el producto alimenticio puede seleccionarse adecuadamente y está normalmente en el intervalo del 0,01 al 100% en peso.

Los ejemplos específicos de portadores farmacéuticos o portadores para administración oral, diluyentes, excipientes, y sustancias similares que pueden añadirse al producto farmacéutico o el producto alimenticio incluyen lactosa, glucosa, manitol, dextrina, ciclodextrina, almidón, sacarosa, aluminometasilicato de magnesio, silicato de aluminio sintético, carboximetilcelulosa de sodio, hidroxipropil almidón, carboximetilcelulosa de calcio, resinas de intercambio iónico, metilcelulosa, gelatina, goma arábiga, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, polivinilpirrolidona, poli(alcohol vinílico), ácido silícico anhidro ligero, estearato de magnesio, talco, tragacanto, bentonita, Veegum, óxido de titanio, ésteres de ácidos grasos de sorbitano, laurilsulfato de sodio, glicerina, ésteres de glicerol de ácidos grasos, lanolina purificada, glicerogelatina, polisorbato, macrogol, aceites vegetales, ceras, parafina líquida, vaselina blanca, fluorocarbono, tensioactivos no iónicos, propilenglicol, agua, y similares.

Los ejemplos de la forma de dosificación incluyen comprimidos, cápsulas, gránulos, polvos, jarabes, suspensiones, supositorios, pomadas, cremas, geles, parches, inhalatorios, inyecciones, y similares. Estas preparaciones se preparan según métodos generales. Las preparaciones líquidas pueden disolverse o suspenderse en agua u otros disolventes adecuados antes de su uso. Los comprimidos y gránulos pueden recubrirse usando métodos conocidos. Se preparan inyecciones disolviendo el péptido de la presente invención en agua. Según se requiera, las inyecciones también pueden prepararse disolviendo el péptido en solución salina fisiológica o una disolución de glucosa, o pueden contener adicionalmente tampones o conservantes.

Estas preparaciones pueden contener el péptido de la presente invención en una cantidad del 0,01 al 100% en peso, y preferiblemente del 1 al 90% en peso. Estas preparaciones también pueden contener otros componentes terapéuticamente beneficiosos.

Las preparaciones sólidas para administración oral pueden prepararse mezclando el principio activo con excipientes, tales como lactosa, almidón, celulosa cristalina, lactato de calcio y anhídrido de ácido silícico, para formar polvos. Además, también pueden añadirse, si es necesario, por ejemplo, aglutinantes, tales como sacarosa, hidroxipropilcelulosa y polivinilpirrolidona; y disgregantes, tales como carboximetilcelulosa y carboximetilcelulosa de calcio, y las mezclas resultantes se granulan en seco o en húmedo para formar gránulos. Los comprimidos pueden prepararse mediante preparación de comprimidos con estos polvos o gránulos tal como son, o después de añadir lubricantes, tales como estearato de magnesio y talco, a los mismos. Estos gránulos o comprimidos pueden recubrirse con bases de recubrimiento entérico, tales como ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa y polímero de ácido metacrílicometacrilato de metilo, para formar preparaciones con recubrimiento entérico; o recubrirse con, por ejemplo, etilcelulosa, cera de carnauba o aceite hidrogenado para formar preparaciones de liberación mantenida. Pueden prepararse cápsulas rellenando las cápsulas duras con polvos o gránulos, o recubriendo con películas de gelatina el principio activo tal como es, o después de disolverlo en glicerina, polietilenglicol, aceite de sésamo, aceite de oliva, o similares, para formar cápsulas blandas.

Las preparaciones líquidas para administración oral pueden prepararse disolviendo en agua el principio activo junto con agentes edulcorantes, tales como sacarosa, sorbitol y glicerina, para formar jarabes transparentes; añadiendo adicionalmente aceites esenciales, etanol, etc., a las mismas para formar elixires; o añadiendo adicionalmente goma arábiga, tragacanto, polisorbato 80, carboximetilcelulosa de sodio, etc., a las mismas para formar emulsiones o suspensiones. Estas preparaciones líquidas pueden contener opcionalmente agentes que mejoran el sabor, agentes colorantes, conservantes, etc.

Los ejemplos específicos de formas de productos alimenticios que pueden prepararse añadiendo o combinando el péptido de la presente invención incluyen bebidas (tal como café, cacao, zumos, refrescos, bebidas gaseosas, bebidas de té, té verde, té negro, té oolong, bebidas lácteas, bebidas con bacterias del ácido láctico, bebidas de yogur, bebidas carbonatadas, y bebidas no alcohólicas y bebidas alcohólicas similares), dulces (tal como caramelos duros, chicle, gominolas, jaleas, pudin, espumas, tartas, caramelos, galletas, galletas saladas, chocolate, y dulces helados (por ejemplo, helados, polos, sorbetes y granizado)), polvo aderezado para espolvorear sobre el arroz, aderezos, aliños, productos de soja procesados (por ejemplo, cuajada de soja, miso, salsa de soja, yuba (lámina de cuajada de soja), harina de soja y soja fermentada), productos cárnicos procesados (por ejemplo, filetes para hamburguesa, pastel de carne, albóndigas y tsukune (carne con forma de bolas con el tamaño de un bocado)), productos de carne de pescado procesados (por ejemplo, kamaboko (pasta de pescado al vapor) y chikuwa (una clase de pasta de pescado)), alimentos en bolsas esterilizables, alimentos similares a jales (por ejemplo, jaleas, agar y bebidas similares a jaleas), y similares. Los productos alimenticios que pueden prepararse añadiendo o combinando el péptido de la presente invención pueden tomar la forma de alimentos naturales, alimentos funcionales, complementos nutricionales, complementos alimenticios, alimentos para usos sanitarios especificados, alimentos para enfermos/alimentos combinados para enfermos (una categoría de alimentos para usos alimenticios especiales, aprobados por el Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar de Japón), y alimentos para ancianos (una categoría de alimentos para usos alimenticios especiales, aprobados por el Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar de Japón). Estos alimentos pueden estar en forma de comprimidos no recubiertos, comprimidos recubiertos con película, comprimidos recubiertos con azúcar, gránulos, polvos, comprimidos, cápsulas (incluyendo cápsulas tanto duras como blandas), formas masticables, jarabes, bebidas, y similares. La preparación de productos alimenticios obtenidos añadiendo o combinando el péptido de la presente invención puede realizarse según métodos conocidos.

Ejemplos

Métodos

Prueba de suspensión por la cola

Tal como se muestra en la figura 1A, se suspendió por su cola a cada ratón (ratones ddY, macho, de 24 a 30 g), y se midió la cantidad de tiempo para que el ratón perdiera la motivación y se quedara inmóvil después de mostrar inicialmente comportamientos de escape (tiempo de inmovilidad). La prueba se llevó a cabo (0 minutos) 30 minutos después de la administración de una sustancia de prueba, y se midió el tiempo de inmovilidad durante el periodo desde 0 hasta 6 minutos (figura 2).

Cuando se administra un fármaco antidepresivo, tal como imipramina, se reduce el tiempo de inmovilidad. Por tanto, cuando se observa una reducción en el tiempo de inmovilidad, puede evaluarse que la sustancia de prueba tiene un efecto similar a un antidepresivo. La inmovilidad se considera un estado de desesperanza; por tanto, una reducción en el tiempo de inmovilidad también sirve como índice de la mejora de un estado de desesperanza, es decir, la potenciación de la motivación.

Prueba de natación forzada

Tal como se muestra en la figura 1B, se colocó cada ratón (ratones ddY, macho, de 24 a 30 g) en un baño de agua del que no se podía escapar y se le forzó a nadar, y se midió la cantidad de tiempo para que el ratón perdiera la motivación y se quedara inmóvil después de mostrar inicialmente comportamientos de escape (tiempo de inmovilidad). La prueba se llevó a cabo (0 minutos) 30 minutos después de la administración de una sustancia de prueba, y se midió el tiempo de inmovilidad durante el periodo desde 0 hasta 8 minutos (figura 2).

Como en la prueba de suspensión por la cola, cuando se administra un fármaco antidepresivo, tal como imipramina, se reduce el tiempo de inmovilidad. Por tanto, cuando se observa una reducción en el tiempo de inmovilidad, puede evaluarse que la sustancia de prueba tiene un efecto similar a un antidepresivo. La inmovilidad se considera un estado de desesperanza; por tanto, una reducción en el tiempo de inmovilidad también sirve como índice de la mejora de un estado de desesperanza, es decir, la potenciación de la motivación.

Prueba del laberinto en cruz elevado (EPM)

El laberinto en cruz elevado incluye dos brazos abiertos (25 * 5 cm) y dos brazos cerrados (25 * 5 * 15 cm), que están unidos a una plataforma central a 50 cm de altura sobre el suelo (véase la figura 3A). Debido a que los brazos cerrados están rodeados por paredes, un ratón puede caminar de manera segura en los brazos cerrados a pesar de la posición elevada. Por otro lado, debido a que los brazos abiertos no están rodeados por paredes, un ratón que camina a lo largo de los brazos abiertos se siente ansioso de que pueda caer desde la posición elevada. Por tanto, cuanto más tiempo pasa el ratón en los brazos abiertos, o mayor es el número de entradas en los brazos abiertos, menos ansioso se siente el ratón. Por tanto, la actividad ansiolítica se determina basándose en estos índices.

Tal como se muestra en la figura 4, se administró una sustancia de prueba a ratones (ratones ddY, macho, de 24 a 30 g) 30 minutos antes de la prueba. Se colocó cada ratón en una parte de la plataforma central frente a uno de los brazos abiertos 30 minutos después de la administración, y se comenzó la prueba. Durante el tiempo de prueba de 5 minutos, se registró el tiempo acumulado pasado en los brazos abiertos (tiempo en los brazos abiertos), el número de visitas a los brazos abiertos (visita a los brazos abiertos), y el número total a cualquiera de los brazos (visitas totales). El porcentaje de tiempo pasado en los brazos abiertos y el porcentaje del número de visitas a los brazos abiertos se calcularon como índices de ansiedad.

Prueba del campo abierto

Los ratones prefieren generalmente la parte periférica de un círculo, y rara vez presentan comportamientos exploradores en la parte central (véase la figura 3B). Similar al caso de la prueba del laberinto en cruz elevado, cuanto mayor sea el porcentaje de comportamientos exploradores de un ratón en la parte central de un círculo, menos ansioso se siente el ratón. Por tanto, la actividad ansiolítica se determina besándose en este índice.

Tal como se muestra en la figura 4, se administró una sustancia de prueba a ratones (ratones ddY, macho, de 24 a 30 g) 30 minutos antes de la prueba. Se colocó cada ratón en un campo abierto 30 minutos después de la administración, y se comenzó la prueba. Se evaluaron el porcentaje de comportamientos exploradores en la parte central del círculo (el tiempo pasado en el círculo central (campo abierto) (tiempo en un círculo de 12 cm) y el porcentaje del número de visitas al círculo central (visitas a un círculo de 12 cm)) durante el tiempo de prueba de 5 minutos.

Análisis estadístico

Los datos obtenidos a partir de las pruebas se representaron como la suma de la media y el error estándar de la media (EEM). Los datos se analizaron mediante un ANOVA de un factor o de dos factores, seguido por la prueba de Fisher para comparaciones múltiples. La diferencia se consideró significativa cuando p<0,05 (“*” en los gráficos) o cuando p<0,01 (“**” en los gráficos).

Ejemplo de producción

Digestos enzimáticos

Se mezclaron proteína p-conglicina (P-CG) purificada y una enzima digestiva en la razón en peso de enzima:p-CG = 1:100 (concentración final de p-CG: 20 mg/ml), y se llevó a cabo una reacción en el tampón unido.

Las enzimas usadas y las condiciones de reacción son las siguientes:

(i) termolisina (Seikagaku Corporation); temperatura de reacción: 37°C, tiempo de reacción: 5 horas; tampón de reacción: pH 7,5

(ii) subtilisina (Sigma); temperatura de reacción: 37°C, tiempo de reacción: 5 horas; tampón de reacción: pH 7,5 (iii) Sumizyme (Seikagaku Corporation); temperatura de reacción: 50°C, tiempo de reacción: 5 horas; tampón de reacción: pH 7,0.

Después de los tiempos de reacción anteriores, se hirvieron las muestras (100°C, durante 10 minutos) para detener las reacciones enzimáticas.

Péptidos

Los péptidos LSSTQAQQSY (SEQ ID NO: 1), LSSTQAQQS (SEQ ID NO: 2), SSTQAQQSY (SEQ ID NO: 3), LSSTQ (SeQ ID NO: 4) y AQQSY (sEq ID NO: 5) se sintetizaron mediante un método convencional.

Experimentos y resultados

Ejemplo 1: Prueba de suspensión por la cola (digestos enzimáticos)

Se usaron 30 mg/kg del digesto de termolisina de p-CG, 30 mg/kg del digesto de subtilisina de p-CG, y 30 mg/kg del digesto de Sumizyme de p-CG como sustancias de prueba. Se realizó la prueba de suspensión por la cola usando ratones a los que se les administró por vía oral individualmente cada sustancia de prueba (n=16-20). Se realizó la administración de sólo solución salina fisiológica, que es un disolvente, como control (lo mismo aplica a continuación en el presente documento).

La figura 5A muestra los resultados. Se observó una reducción en el tiempo de inmovilidad sólo en el caso de usar el digesto de termolisina, entre los tres digestos, en comparación con el control.

Ejemplo 2: Prueba de suspensión por la cola (digesto enzimático)

Se realizó la prueba de suspensión por la cola usando ratones a los que se les administró por vía oral 10 mg/kg o 30 mg/kg del digesto de termolisina de p-CG como sustancia de prueba (n=11 -12).

La figura 5B muestra los resultados. Se observó una reducción en el tiempo de inmovilidad dependiendo de la concentración del digesto de termolisina.

Ejemplo 3: Prueba de natación forzada (digesto enzimático)

Se realizó la prueba de natación forzada usando ratones a los que se les administró 30 mg/kg o 100 mg/kg del digesto de termolisina de p-CG como sustancia de prueba (n=6).

La figura 6 muestra los resultados. Se observó una reducción en el tiempo de inmovilidad cuando se les administró por vía oral 100 mg/kg del digesto.

Ejemplo 4: Prueba de suspensión por la cola (péptido)

Se realizó la prueba de suspensión por la cola usando ratones a los que se les administró 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 1 mg/kg o 3 mg/kg del péptido LSSTQAQQSY como sustancia de prueba (n=8-10).

La figura 7 muestra los resultados. El tiempo de inmovilidad se redujo significativamente mediante la administración por vía oral del péptido en una cantidad de 0,3 mg/kg o más.

Ejemplo 5: Prueba de natación forzada (péptido)

Se realizó la prueba de natación forzada usando ratones a los que se les administró 0,3 mg/kg o 1 mg/kg del péptido LSSTQAQQSY como sustancia de prueba (n=12-13).

La figura 8 muestra los resultados. El tiempo de inmovilidad se redujo significativamente mediante la administración por vía oral del péptido en una cantidad de 1 mg/kg o más.

Ejemplo de referencia 1

Se cuantificó el péptido LSSTQAQQSY contenido en el digesto de termolisina de p-CG, el digesto de subtilisina de p-CG y el digesto de Sumizyme de p-CG mediante UPLC-ESI-EM.

Los resultados mostraron que el digesto de termolisina de p-CG contenía el péptido LSSTQAQQSY en una cantidad de 266 mg (21% en moles) por 100 g del digesto, mientras que el péptido LSSTQAQQSY no se detectó en el digesto de subtilisina o el digesto de Sumizyme.

Este resultado y los resultados de los ejemplos 1 a 5 revelaron que el péptido LSSTQAQQSY, que contiene el digesto de termolisina de p-CG, presenta un efecto antidepresivo (efecto de potenciación de la motivación).

Ejemplo 6: Relaciones estructura-actividad de los péptidos

Se usaron el péptido LSSTQAQQS (SEQ ID NO: 2), que tiene una única deleción de residuo en el extremo C-terminal del péptido LSSTQAQQSY, el péptido SSTQAQqSy (SEQ ID NO: 3), que tiene una única deleción de residuo en el extremo N-terminal del péptido LSSTQAQQSY, el péptido LSSTQ (SeQ ID NO: 4), que consiste en 5 residuos que están en la mitad N-terminal del péptido LSSTQAQQSY, y el péptido AQQSY (SEQ ID NO: 5), que consiste en 5 residuos que están en la mitad C-terminal del péptido LSSTQAQQSY, como sustancias de prueba. Se realizó la prueba de suspensión por la cola usando ratones a los que se les administró por vía oral individualmente 0,3 mg/kg de cada sustancia de prueba (n=5-6 ó 18-19).

La figura 9 muestra los resultados. No se observó ninguna reducción significativa en el tiempo de inmovilidad en cualquier caso en comparación con el caso de usar el péptido LSSTQAQQSY. Este resultado reveló que ninguno del lado N-terminal y el lado C-terminal del péptido LSSTQAQQSY solo es importante, y que el péptido de 10 residuos de longitud completa logra el mayor efecto de reducción del tiempo de inmovilidad.

Ejemplo 7: Investigación del mecanismo de acción usando antagonistas (digesto enzimático)

Se realizó la prueba de suspensión por la cola usando ratones a los que se les administró por vía oral (v.o.) 30 mg/kg del digesto de termolisina de p-CG en combinación con cada uno de los antagonistas de diversos receptores. Se usaron tres clases de antagonistas, es decir, WAY100135, que es un antagonista del receptor 5-HT1A de serotonina (dosis: 10 mg/kg), SCH23390, que es un antagonista del receptor D1 de dopamina (dosis: 30 |ig/kg) y bicuculina, que es un antagonista del receptor GABA-A (dosis: 30 mg/kg).

La figura 10 muestra los resultados. Una reducción en el tiempo de inmovilidad se suprimió significativamente cuando se usó el digesto en combinación con cualquiera de los inhibidores.

Ejemplo 8: Investigación del mecanismo de acción usando antagonistas (péptido)

Se realizó la prueba de suspensión por la cola usando ratones a los que les administró por vía oral (v.o.) 0,3 mg/kg del péptido LSSTQAQQSY en combinación con cada uno de los antagonistas de diversos receptores. Se usaron tres clases de antagonistas, es decir, WAY100135, que es un antagonista del receptor 5-HT1A de serotonina (dosis: 10 mg/kg), SCH23390, que es un antagonista del receptor D1 de dopamina (dosis: 30 |ig/kg), y bicuculina, que es un antagonista del receptor GABA-A (dosis: 30 mg/kg).

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos LSSTQAQQSY (SEQ ID NO: 1).

2. Composición farmacéutica que comprende el péptido según la reivindicación 1 y un portador, diluyente o excipiente.

3. Composición farmacéutica según la reivindicación 2, en la que la cantidad del péptido en la composición farmacéutica es del 1% en peso al 90% en peso de la composición farmacéutica.

4. Producto alimenticio que comprende el péptido según la reivindicación 1.

5. Péptido según la reivindicación 1, para su uso como medicamento.

6. Composición farmacéutica según la reivindicación 2 ó 3, para su uso como medicamento.

7. Producto alimenticio según la reivindicación 4, para su uso como medicamento.

Péptido según la reivindicación 1, para su uso en el tratamiento de depresión o un estado provocado por la misma.

9. Composición farmacéutica según la reivindicación 2 ó 3, para su uso en el tratamiento de depresión o un estado provocado por la misma.

Producto alimenticio según la reivindicación 4, para su uso en el tratamiento de depresión o un estado provocado por la misma.

11. Uso del péptido según la reivindicación 1, como potenciador de motivación en un sujeto, en el que el uso es no terapéutico.

12. Uso del producto alimenticio según la reivindicación 4, como potenciador de motivación en un sujeto, en el que el uso es no terapéutico.