ES2936109T3 - Inhibición de TMPRSS6 mediada por interferencia de ARN - Google Patents

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Abstract

La presente invención se refiere a productos y composiciones y sus usos. En particular, la invención se refiere a productos de ácido nucleico que interfieren con la expresión del gen TMPRSS6 o inhiben su expresión y usos terapéuticos tales como para el tratamiento de hemocromatosis, porfiria y trastornos sanguíneos tales como β-talasemias, enfermedad de células falciformes y sobrecarga transfusional de hierro o mielodisplásica. síndrome. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Inhibición de TMPRSS6 mediada por interferencia de ARN
La presente invención se refiere a productos y composiciones y a sus usos. En particular, la invención se refiere a productos de ácido nucleico que interfieren con la expresión del gen TMPRSS6 o inhiben su expresión, y a usos terapéuticos tales como para el tratamiento de la hemocromatosis, la porfiria y trastornos sanguíneos tale como ptalasemia, enfermedad de células falciformes y sobrecarga transfusional de hierro.
Antecedentes
Se ha demostrado que el ARN bicatenario (ARNbc) capaz de unirse complementariamente al ARNm expresado puede bloquear la expresión génica (Fire et al., 1998, Nature. 19 de febrero de 1998; 391(6669):806-11 y Elbashir et al., 2001, Nature. 24 de mayo de 2001; 411(6836):494-8) mediante un mecanismo que se ha denominado interferencia por ARN (iARN). Los ARNbc cortos dirigen el silenciamiento posterior a la transcripción específico de los genes en muchos organismos, incluidos los vertebrados, y se han convertido en una herramienta útil para estudiar la función de los genes. La iARN está mediada por el complejo silenciador inducido por ARN (RISC, RNA-induced silencing complex), una nucleasa multicomponente específica de secuencia que destruye los ARN mensajeros homólogos al desencadenante del silenciamiento cargado en el complejo RISC. El ARN interferente (ARNi), tal como los ARNip, los ARN antisentido y los microARN son oligonucleótidos que evitan la formación de proteínas mediante el silenciamiento génico, es decir, la inhibición de la traducción génica de la proteína a través de la degradación de las moléculas de ARNm. Los agentes silenciadores de genes son cada vez más importantes para aplicaciones terapéuticas en medicina.
De acuerdo con Watts y Corey en el Journal of Pathology (2012; Vol 226, p 365-379) hay algoritmos que se pueden utilizar para diseñar desencadenantes del silenciamiento de ácidos nucleicos, pero todos estos tienen limitaciones importantes. Pueden ser necesarios varios métodos experimentales para identificar potentes ARNip, ya que los algoritmos no tienen en cuenta factores tales como la estructura terciaria del ARNm diana o la participación de las proteínas de unión al ARN. Por tanto, el descubrimiento de un potente desencadenante del silenciamiento de ácidos nucleicos con efectos colaterales mínimos es un proceso complejo. Para el desarrollo farmacéutico de estas moléculas altamente cargadas es necesario que se puedan sintetizar económicamente, distribuirse a los tejidos diana, entrar en las células y funcionar dentro de los límites aceptables de toxicidad.
La matriptasa-2 (MT-2) es el producto del gen TMPRSS6. La MT-2 es una serina proteasa transmembrana de tipo II que desempeña un papel fundamental en la regulación de la homeostasis del hierro. La MT-2 es un regulador negativo de la expresión génica de la hormona peptídica hepcidina. La hepcidina se produce y secreta predominantemente en el hígado. La hepcidina regula el balance de hierro en el organismo al actuar como un regulador negativo de la absorción de hierro gastrointestinal y la liberación de hierro de las reservas celulares. La regulación al alza de la hepcidina conduce a una reducción de la disponibilidad de hierro en el organismo (McDonald et al., American Journal of Physiology, 2015, vol 08 n. 7, C539-C547). Los niveles de hepcidina son bajos en pacientes con sobrecarga de hierro. Por tanto, un objetivo posible para reducir la sobrecarga de hierro es aumentar la hepcidina mediante el silenciamiento de la expresión del gen TMPRSS6 en el hígado.
TMPRSS6 se expresa principalmente en el hígado, aunque también se encuentran altos niveles de ARNm de TMPRSS6 en el riñón, con niveles más bajos en el útero y cantidades mucho más pequeñas detectadas en muchos otros tejidos (Ramsay et al., Haematologica (2009), 94(*6), 84-849).
Varios trastornos están asociados con la sobrecarga de hierro, una afección caracterizada por un aumento de los niveles de hierro en la sangre y los tejidos, tales como hemocromatosis hereditaria, porfiria cutánea tardía y trastornos de la sangre, tales como p-talasemia, anemia sideroblástica congénita (ASC), anemia diseritropoyética congénita (ADC), síndromes de insuficiencia medular, mielodisplasia y enfermedad de células falciformes (ECF). Adicionalmente, todas las poblaciones de pacientes que reciben transfusiones de sangre con regularidad corren el riesgo de desarrollar una sobrecarga transfusional de hierro (Coates, Free Rad Biol Med 2014, Vol. 72, 23-40, Bulaj et al., Blood 2000, vol.
95, 1565-71). Tanto un artículo de Nai et al. (Blood, 2012, Vol 119, n.° 21, pág. 5021-5027) y Guo et al. (The Journal of Clinical Investigation, 2013, Vol 123, n.° 4, pág. 1531-1541) muestran cómo una deleción o reducción de la expresión de TMPRSS6 fue eficaz en el tratamiento de la p-talasemia en ratones. Un artículo de Schmidt (2013, Blood, Vol. 121, 7, pág. 1200-1208) explora el uso del ácido nucleico de TMPRSS6 para disminuir la sobrecarga de hierro en modelos de ratón con hemocromatosis hereditaria y p-talasemia. En ambos modelos, los autores determinaron que el tratamiento con nanopartículas lipídicas (NPL) y ácido nucleico de TMPRSS6 indujo hepcidina y disminuyó los niveles de hierro sérico y tisular durante hasta 21 días. Además, un artículo de Schmidt et al. (American Journal of Hematology, 2015, Vol 90, n.° 4, pág. 310-313) demostró que las NPL y el ácido nucleico de TMPRSS6 más la terapia con deferiprona quelante de hierro oral redujeron la sobrecarga secundaria de hierro en el modelo de ratón de p-talasemia.
Por consiguiente, actualmente se necesitan métodos para el tratamiento eficaz de los trastornos asociados con la sobrecarga de hierro, y la presente invención aborda esta necesidad.
El documento WO 2014/190157 describe agentes de iARN dirigidos al gen TMPRSS6 y métodos para usar dichos agentes de iARN para inhibir la expresión de TMPRSS6, así como métodos para tratar sujetos que tienen un trastorno asociado con TMPRSS6.
Un primer aspecto de la invención se refiere a un ácido nucleico para inhibir la expresión de TMPRSS6, que comprende una región bicatenaria que comprende una primera cadena y una segunda cadena que es al menos parcialmente complementaria a la primera cadena, en donde dicha primera cadena es al menos parcialmente complementaria a una parte de un ARN transcrito a partir del gen TMPRSS6, en donde dicho ácido nucleico comprende la siguiente primera cadena:
5'-3': aaccagaagaagcagguga;
opcionalmente en donde el ácido nucleico comprende además la siguiente segunda cadena:
5'-3': ucaccugcuucuucugguu.
La primera cadena puede comprender o consistir en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 333 y/o la segunda cadena puede comprender la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 334.
Figure imgf000003_0002
La primera cadena puede comprender o consistir en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 17 y/o la segunda cadena puede comprender la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 18, en concreto:
Figure imgf000003_0001
Un ácido nucleico puede divulgarse en el presente documento en una secuencia que enumera la asociación con un enlazador y/o ligando particular, pero cualquier referencia al enlazador o ligando en el contexto del listado de secuencias es opcional, aunque se prefieren estas características. Determinados enlazadores preferidos se describen junto con determinadas secuencias de ácidos nucleicos.
La segunda cadena puede tener una longitud de 17 a 35 nucleótidos y al menos una región bicatenaria puede tener una longitud de 10 a 25 nucleótidos. La región bicatenaria puede comprender dos cadenas separadas o puede comprender una sola cadena que comprende la primera cadena y la segunda cadena.
El ácido nucleico puede: a) tener extremos romos en ambos extremos; b) tener un saliente en un extremo y un extremo romo en el otro; o c) tener un saliente en ambos extremos.
Pueden modificarse uno o más nucleótidos en la cadena primera y/o segunda, para formar nucleótidos modificados. Pueden modificarse uno o más de los nucleótidos impares de la primera cadena. Pueden modificarse uno o más de los nucleótidos pares de la primera cadena mediante al menos una segunda modificación, en donde la al menos segunda modificación es diferente de la modificación en el uno o más nucleótidos impares. Al menos uno de los uno o más nucleótidos pares modificados puede estar adyacente a al menos uno de los uno o más nucleótidos impares modificados.
Puede modificarse una pluralidad de nucleótidos impares en la primera cadena en el ácido nucleico de la invención. Una pluralidad de nucleótidos pares en la primera cadena puede modificarse mediante una segunda modificación. La primera cadena puede comprender nucleótidos adyacentes que se modifican mediante una modificación común. La primera cadena también puede comprender nucleótidos adyacentes que se modifican mediante una segunda modificación diferente.
Uno o más de los nucleótidos impares de la segunda cadena pueden modificarse mediante una modificación que sea diferente de la modificación de los nucleótidos impares de la primera cadena y/o uno o más de los nucleótidos pares de la segunda cadena pueden modificarse mediante la misma modificación de los nucleótidos impares de la primera cadena. Al menos uno de los uno o más nucleótidos pares modificados de la segunda cadena puede estar adyacente al uno o más nucleótidos impares modificados. Una pluralidad de nucleótidos impares de la segunda cadena puede modificarse mediante una modificación común y/o una pluralidad de nucleótidos pares puede modificarse mediante la misma modificación que está presente en los nucleótidos impares de la primera cadena. Una pluralidad de nucleótidos impares en la segunda cadena puede modificarse mediante una segunda modificación, en donde la segunda modificación es diferente de la modificación de los nucleótidos impares de la primera cadena.
La segunda cadena puede comprender nucleótidos adyacentes que se modifican mediante una modificación común, que puede ser una segunda modificación que sea diferente de la modificación de los nucleótidos impares de la primera cadena.
En el ácido nucleico de la invención, cada uno de los nucleótidos impares en la primera cadena y cada uno de los nucleótidos pares en la segunda cadena pueden modificarse con una modificación común y, cada uno de los nucleótidos pares puede modificarse en la primera cadena con una segunda modificación y cada uno de los nucleótidos impares puede modificarse en la segunda cadena con una segunda modificación diferente.
El ácido nucleico de la invención puede tener los nucleótidos modificados de la primera cadena desplazados por al menos un nucleótido con respecto a los nucleótidos sin modificar o modificados de manera diferente de la segunda cadena.
La modificación y/o modificaciones pueden seleccionarse cada una individualmente del grupo que consiste en desoxitimina 3'-terminal, 2'-O-metilo, una modificación con 2'-desoxi, una modificación con 2'-amino, una modificación con 2'-alquilo, una modificación con morfolino, una modificación con fosforamidato, una modificación con grupo 5'-fosforotioato, una modificación con fosfato en 5' o mimético de fosfato en 5' y un derivado de colesterilo o una modificación de grupo bisdecilamida del ácido dodecanoico y/o el nucleótido modificado puede ser uno cualquiera de entre un nucleótido bloqueado, un nucleótido abásico o una base no natural que comprende nucleótido.
Al menos una modificación puede ser 2'-O-metilo y/o al menos una modificación puede ser 2'-F.
En algunas realizaciones, dicha primera cadena comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 333, en donde los nucleótidos de la primera cadena se modifican mediante una primera modificación en los nucleótidos impares y se modifican mediante una segunda modificación en los nucleótidos pares, y los nucleótidos de la segunda cadena se modifican mediante una tercera modificación en los nucleótidos pares y se modifican mediante una cuarta modificación los nucleótidos impares, en donde al menos la primera modificación es diferente de la segunda modificación y la tercera modificación es diferente de la cuarta modificación.
En realizaciones adicionales, dicha segunda cadena puede comprender la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 334, en donde los nucleótidos de la primera cadena se modifican mediante una primera modificación en los nucleótidos impares y se modifican mediante una segunda modificación en los nucleótidos pares, y los nucleótidos de la segunda cadena se modifican mediante una tercera modificación en los nucleótidos pares y se modifican mediante una cuarta modificación los nucleótidos impares, en donde al menos la primera modificación es diferente de la segunda modificación y la tercera modificación es diferente de la cuarta modificación.
La tercera modificación y la primera modificación pueden ser las mismas y/o la segunda modificación y la cuarta modificación pueden ser las mismas.
La primera modificación puede ser 2'OMe y la segunda modificación puede ser 2'F.
En el ácido nucleico de cualquier aspecto, la primera cadena puede comprender la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 17 y la segunda cadena puede comprender la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 18. La secuencia y las modificaciones pueden ser como se muestra en la siguiente tabla:
Figure imgf000004_0001
en donde las modificaciones específicas están representadas por los siguientes números
1 = 2 F-dU,
2 = 2'F-dA,
3 = 2'F-dC,
4 = 2'F-dG,
5 = 2'-OMe-rU;
6 = 2'-OMe-rA;
7 = 2'-OMe-rC;
8 = 2'-OMe-rG.
Como se ha enseñado anteriormente, estas son secuencias preferidas, junto con las otras secuencias preferidas.
Un ácido nucleico de la invención puede comprender un enlace fosforotioato entre uno, dos o tres nucleótidos 3'-terminales y/o uno, dos o tres nucleótidos 5'-terminales de la primera y/o la segunda cadena. Puede comprender dos enlaces fosforotioato entre cada uno de los tres nucleótidos 3' terminales y entre cada uno de los tres nucleótidos 5' terminales de la primera cadena, y dos enlaces fosforotioato entre los tres nucleótidos terminales del extremo 3' de la segunda cadena.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico o el ácido nucleico conjugado se estabiliza en el extremo 5' y/o 3' de una o ambas cadenas. En realizaciones adicionales, el ácido nucleico o un ácido nucleico conjugado comprende un enlace fosforotioato entre cada uno de los tres nucleótidos 3'-terminales y entre cada uno de los tres nucleótidos 5'-terminales en la primera cadena, y un enlace fosforotioato entre los tres nucleótidos terminales del extremo 3' de la segunda cadena, que tiene la estructura
Figure imgf000005_0001
Dicho ácido nucleico puede conjugarse con un ligando.
En algunas realizaciones, dicha primera cadena comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 333, en donde el ácido nucleico está conjugado con un ligando.
En realizaciones adicionales, la segunda cadena comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 334, en donde el ácido nucleico está conjugado con un ligando.
El ligando puede comprender (i) una o más fracciones de N-acetil-galactosamina (GalNAc) y derivados de las mismas, y (ii) un enlazador, en donde el enlazador conjuga las fracciones de GalNAc con una secuencia como se define en cualquier aspecto anterior. El enlazador puede ser una estructura ramificada bivalente, trivalente o tetravalente. Los nucleótidos pueden modificarse como se define en el presente documento.
El ligando puede comprender la fórmula I:
[S-X1-P-X2]a-A-enlazador- (I)
en donde:
S representa un sacárido, en donde el sacárido es N-acetil-galactosamina;
X1 representa alquileno C3-C6 o (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2- en donde m es 1, 2 o 3;
P es un fosfato o fosfato modificado (preferentemente un tiofosfato);
X2 es alquileno o un alquilenéter de fórmula (-CH2VO-CH 2- donde n = 1-6;
A es una unidad de ramificación;
X3 representa una unidad de unión;
en donde un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención está conjugado con X3 a través de un fosfato o fosfato modificado (preferentemente un tiofosfato).
Por lo tanto, la presente invención proporciona además un ácido nucleico conjugado que tiene una de las siguientes estructuras
Figure imgf000006_0001
Figure imgf000007_0001
Figure imgf000008_0001
Figure imgf000009_0001
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en donde Z representa un ácido nucleico como se ha definido anteriormente en el presente documento.
Como alternativa, un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención puede conjugarse con un ligando de la siguiente estructura
Figure imgf000010_0002
La invención también proporciona una composición que comprende un ácido nucleico como se define en el presente documento y una formulación que comprende:
i) un lípido catiónico, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;
ii) un esteroide;
iii) un fosfolípido de fosfatidiletanolamina;
iv) un lípido PEGilado.
El contenido del componente lipídico catiónico en la formulación puede ser de aproximadamente el 55 % en moles a aproximadamente el 65 % en moles del contenido total de lípidos de la formulación lipídica, preferentemente aproximadamente el 59 % en moles del contenido total de lípidos de la formulación lipídica.
La formulación puede comprender un lípido catiónico que tiene la estructura
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un esteroide que tiene la estructura;
Figure imgf000011_0002
un fosfolípido de fosfatidiletanolamina que tiene la estructura;
Figure imgf000011_0003
y un lípido PEGilado que tiene la estructura;
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La invención también proporciona una composición que comprende un ácido nucleico o un ácido nucleico conjugado de cualquier aspecto de la invención y un excipiente fisiológicamente aceptable.
También se proporciona un ácido nucleico o un ácido nucleico conjugado de acuerdo con cualquier aspecto de la invención para uso en terapia.
El ácido nucleico o ácido nucleico conjugado de acuerdo con la invención se puede administrar a un individuo que necesite tratamiento. El ácido nucleico o ácido nucleico conjugado se puede administrar al sujeto por vía subcutánea, intravenosa o utilizando cualquier otra vía de aplicación tal como oral, rectal o intraperitoneal.
La enfermedad o el trastorno puede seleccionarse del grupo que comprende hemocromatosis, porfiria cutánea tardía y trastornos de la sangre, tales como p-talasemia o enfermedad de células falciformes, anemia diseritropoyética congénita, síndromes de insuficiencia medular, mielodisplasia y sobrecarga transfusional de hierro. El trastorno puede estar asociado con la sobrecarga de hierro y el trastorno asociado con la sobrecarga de hierro puede ser la enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer o ataxia de Friedreich.
También se proporciona un ácido nucleico o un ácido nucleico conjugado o una composición como se describe en el presente documento para su uso en el tratamiento de una enfermedad o un trastorno, en donde la enfermedad o el trastorno se selecciona del grupo que comprende hemocromatosis, porfiria eritropoyética, porfiria cutánea tardía y trastornos de la sangre, tales como p-talasemia o enfermedad de células falciformes, anemia diseritropoyética congénita, síndromes de insuficiencia medular, mielodisplasia y sobrecarga transfusional de hierro.
En algunas realizaciones, la enfermedad o el trastorno se selecciona del grupo que comprende hemocromatosis, porfiria eritropoyética, sobrecarga transfusional de hierro y trastornos de la sangre.
También se incluye un método para preparar un ácido nucleico o ácido nucleico conjugado de acuerdo con la invención.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a un ácido nucleico bicatenario y dirigido a una transcripción de ARN expresada de TMPRSS6 y a composiciones del mismo. Estos ácidos nucleicos se pueden utilizar en el tratamiento de varias enfermedades y trastornos en los que es deseable una expresión reducida del producto del gen TMPRSS6.
Un aspecto de la invención se refiere a un ácido nucleico para inhibir la expresión de TMPRSS6 en una célula, que comprende una región bicatenaria que comprende una primera cadena y una segunda cadena que es al menos parcialmente complementaria a la primera cadena, en donde dicha primera cadena es al menos parcialmente complementaria a una parte de un ARN transcrito a partir del gen TMPRSS6, en donde dicho ácido nucleico comprende la siguiente primera cadena:
5'-3': aaccagaagaagcagguga;
opcionalmente en donde el ácido nucleico comprende además la siguiente segunda cadena:
5'-3': ucaccugcuucuucugguu.
Por ácido nucleico se entiende un ácido nucleico que comprende dos cadenas que comprenden nucleótidos, que es capaz de interferir con la expresión génica. La inhibición puede ser completa o parcial y da como resultado la regulación negativa de la expresión génica de una manera dirigida. El ácido nucleico comprende dos cadenas de polinucleótidos separadas; la primera cadena, que también puede ser una cadena guía; y una segunda cadena, que también puede ser una cadena pasajero. La primera cadena y la segunda cadena pueden ser parte de la misma molécula polinucleotídica que es autocomplementaria y se "pliega" para formar una molécula bicatenaria. El ácido nucleico puede ser una molécula de ARNip.
El ácido nucleico puede comprender ribonucleótidos, ribonucleótidos modificados, desoxinucleótidos, desoxirribonucleótidos o nucleótidos análogos. El ácido nucleico puede comprender además una parte de ácido nucleico bicatenario o región bicatenaria formada por toda o una parte de la primera cadena (también conocida en la materia como cadena guía) y toda o una parte de la segunda cadena (también conocida en la materia como pasajero). La región bicatenaria se define como que comienza con el primer par de bases formado entre la primera cadena y la segunda cadena y termina con el último par de bases formado entre la primera cadena y la segunda cadena, ambos inclusive.
Por región bicatenaria se entiende la región en dos oligonucleótidos complementarios o sustancialmente complementarios que forman pares de bases entre sí, ya sea mediante apareamiento de bases de Watson-Crick o de cualquier otra manera que permita la formación de una región bicatenaria entre cadenas oligonucleotídicas que sean complementarias o sustancialmente complementarias. Por ejemplo, una cadena de oligonucleótidos que tiene 21 unidades de nucleótidos puede emparejarse con otro oligonucleótido de 21 unidades de nucleótidos, aunque solo 19 nucleótidos en cada cadena son complementarios o sustancialmente complementarios, de manera que la "región bicatenaria" consiste en 19 pares de bases. Los pares de bases restantes pueden existir como salientes en 5' y 3' o como regiones monocatenarias. Además, dentro de la región bicatenaria, no se necesita el 100% de complementariedad; se permite una complementariedad sustancial dentro de una región bicatenaria. Complementariedad sustancial se refiere a la complementariedad entre las cadenas de manera que sean capaces de hibridarse en condiciones biológicas. Se conocen bien en la materia técnicas para determinar empíricamente si dos cadenas son capaces de hibridarse en condiciones biológicas. Como alternativa, pueden sintetizarse dos cadenas y añadirse juntas en condiciones biológicas para determinar si se hibridan entre sí.
La parte de la primera cadena y la parte de la segunda cadena que forman al menos una región bicatenaria pueden ser totalmente complementarias y al menos parcialmente complementarias entre sí.
Dependiendo de la longitud de un ácido nucleico, no se requiere necesariamente un emparejamiento perfecto en términos de complementariedad de bases entre la primera cadena y la segunda cadena. No obstante, las cadenas primera y segunda deben ser capaces de hibridarse en condiciones fisiológicas.
La complementariedad entre la primera cadena y la segunda cadena en la al menos una región bicatenaria puede ser perfecta ya que no hay emparejamientos incorrectos de nucleótidos o nucleótidos adicionales/eliminados en ninguna de las cadenas. Como alternativa, la complementariedad puede no ser perfecta. La complementariedad puede ser de al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 %.
La combinación de ácidos nucleicos que consiste en SEQ ID NO: 17 y 18 es una combinación preferida.
El ácido nucleico implica la formación de una región bicatenaria entre la totalidad o una parte de la primera cadena y una parte del ácido nucleico diana, TMPRSS6. La parte del ácido nucleico diana que forma una región bicatenaria con la primera cadena, definida como que comienza con el primer par de bases formado entre la primera cadena y la secuencia diana y que termina con el último par de bases formado entre la primera cadena y la secuencia diana, ambos inclusive, es la secuencia de ácido nucleico diana o simplemente, la secuencia diana. No es necesario que la región bicatenaria formada entre la primera cadena y la segunda cadena sea la misma que la región bicatenaria formada entre la primera cadena y la secuencia diana. Es decir, la segunda cadena puede tener una secuencia diferente de la secuencia diana, sin embargo, la primera cadena debe poder formar una estructura bicatenaria tanto con la segunda cadena como con la secuencia diana.
La complementariedad entre la primera cadena y la secuencia diana puede ser perfecta (sin emparejamientos incorrectos de nucleótidos o nucleótidos adicionales/eliminados en ninguno de los ácidos nucleicos).
La complementariedad entre la primera cadena y la secuencia diana puede no ser perfecta. La complementariedad puede ser de aproximadamente el 70% a aproximadamente el 100%. De manera más específica, la complementariedad puede ser de al menos un 70 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 %, o un valor intermedio.
La identidad entre la primera cadena y la secuencia complementaria de la secuencia diana puede ser del aproximadamente 75 % a aproximadamente el 100 %. De manera más específica, la complementariedad puede ser de al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 %, o un valor intermedio, siempre que un ácido nucleico sea capaz de reducir o inhibir la expresión de TMPRSS6.
Un ácido nucleico con menos del 100 % de complementariedad entre la primera cadena y la secuencia diana puede ser capaz de reducir la expresión de TMPRSS6 al mismo nivel que un ácido nucleico con complementariedad perfecta entre la primera cadena y la secuencia diana. Como alternativa, puede ser capaz de reducir la expresión de TMPRSS6 a un nivel del 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 % del nivel de expresión alcanzado por el ácido nucleico con complementariedad perfecta.
El ácido nucleico puede comprender una segunda cadena que tenga una longitud de 19-25 nucleótidos. La primera cadena y la segunda cadena pueden ser de diferentes longitudes.
El ácido nucleico puede tener una longitud de 23-24 pares de nucleótidos. El ácido nucleico puede tener una longitud de 19-21 pares de nucleótidos. El ácido nucleico puede tener una longitud de 21-23 pares de nucleótidos.
El ácido nucleico puede comprender una región bicatenaria que consiste en 19-25 pares de bases de nucleótidos. La región bicatenaria puede consistir en 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 pares de bases que pueden ser contiguas. El ácido nucleico puede comprender una secuencia de primera cadena de SEQ ID NO: 17. El ácido nucleico puede comprender una secuencia de segunda cadena de SEQ ID NO: 18. El ácido nucleico de la invención puede comprender SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18.
En un aspecto adicional, el ácido nucleico descrito en el presente documento puede reducir la expresión de TMPRSS6 en una célula en al menos el 15 % en comparación con el nivel observado en ausencia de un inhibidor, que puede ser el ácido nucleico. Todas las características preferidas de cualquiera de los aspectos anteriores también se aplican a este aspecto. En concreto, la expresión de TMPRSS6 en una célula puede reducirse al 90 %, 80 %, 70 %, 60 %, 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 15 % o menos, y valores intermedios, en comparación con la observada en ausencia de un inhibidor (que puede ser el ácido nucleico).
Salientes
El ácido nucleico puede tener extremos romos en ambos extremos; tener un saliente en un extremo y un extremo romo en el otro extremo; o tener un saliente en ambos extremos.
Un "saliente", como se utiliza en el presente documento, tiene su significado normal y habitual en la materia, es decir, una parte monocatenaria de un ácido nucleico que se prolonga más allá del nucleótido terminal de una cadena complementaria en un ácido nucleico bicatenario. La expresión "extremo romo" incluye ácido nucleico bicatenario por el que ambas cadenas terminan en la misma posición, independientemente de si el nucleótido o los nucleótidos terminales están emparejados por las bases. El nucleótido terminal de una primera cadena y una segunda cadena en un extremo romo pueden estar emparejados por las bases. El nucleótido terminal de una primera cadena y una segunda cadena en un extremo romo pueden no estar emparejados. Los dos nucleótidos terminales de una primera cadena y una segunda cadena en un extremo romo pueden estar emparejados por las bases. Los dos nucleótidos terminales de una primera cadena y una segunda cadena en un extremo romo pueden no estar emparejados.
El ácido nucleico puede tener un saliente en un extremo y un extremo romo en el otro. El ácido nucleico puede tener un saliente en ambos extremos. El ácido nucleico puede tener extremos romos en ambos extremos. El ácido nucleico puede tener extremos romos en el extremo con el extremo 5' de la primera cadena y el extremo 3' de la segunda cadena o en el extremo 3' de la primera cadena y el extremo 5' de la segunda cadena.
El ácido nucleico puede comprender un saliente en un extremo 3' o 5'. El ácido nucleico puede tener un saliente en 3' en la primera cadena. El ácido nucleico puede tener un saliente en 3' en la segunda cadena. El ácido nucleico puede tener un saliente en 5' en la primera cadena. El ácido nucleico puede tener un saliente en 5' en la segunda cadena. El ácido nucleico puede tener un saliente tanto en el extremo 5' como en el extremo 3' de la primera cadena. El ácido nucleico puede tener un saliente tanto en el extremo 5' como en el extremo 3' de la segunda cadena. El ácido nucleico puede tener un saliente en 5' en la primera cadena y un saliente en 3' en la segunda cadena. El ácido nucleico puede tener un saliente en 3' en la primera cadena y un saliente en 5' en la segunda cadena. El ácido nucleico puede tener un saliente en 3' en la primera cadena y un saliente en 3' en la segunda cadena. El ácido nucleico puede tener un saliente en 5' en la primera cadena y un saliente en 5' en la segunda cadena.
Un saliente en el extremo 3' o 5' de la segunda cadena o la primera cadena puede seleccionarse entre 1, 2, 3, 4 y 5 nucleótidos de longitud. Opcionalmente, un saliente puede consistir en 1 o 2 nucleótidos, que pueden estar modificados o no.
Modificaciones
Los polinucleótidos sin modificar, en particular los ribonucleótidos, pueden ser propensos a la degradación por nucleasas celulares, y, como tal, la modificación/nucleótidos modificados pueden incluirse en el ácido nucleico de la invención.
Puede modificarse uno o más nucleótidos en las cadenas segunda y/o primera del ácido nucleico de la invención.
Las modificaciones del ácido nucleico de la presente invención generalmente proporcionan una herramienta poderosa para superar limitaciones potenciales, incluyendo, pero sin limitación, la estabilidad in vitro e in vivo, y la biodisponibilidad inherente a las moléculas de ARN nativas. El ácido nucleico de acuerdo con la invención puede modificarse mediante modificaciones químicas. El ácido nucleico modificado también puede minimizar la posibilidad de inducir actividad interferón en seres humanos. La modificación puede potenciar adicionalmente la administración funcional de un ácido nucleico a una célula diana. El ácido nucleico modificado de la presente invención puede comprender uno o más ribonucleótidos modificados químicamente de una o las dos de entre la primera cadena o la segunda cadena. Un ribonucleótido puede comprender una modificación química de la base, el azúcar o los fracciones de fosfato. El ácido ribonucleico puede modificarse mediante sustitución o inserción con análogos de ácidos nucleicos o bases.
Se apreciará que la divulgación de un ácido nucleico modificado, en particular como un ARN modificado, proporciona tanto una divulgación de la secuencia de ácido nucleico "primaria" como también las modificaciones de esa secuencia. Por lo tanto, una lista de secuencias proporciona tanto la información sobre la secuencia de ácido nucleico primaria como también una secuencia modificada. Para evitar dudas, y la invención se refiere tanto a secuencias de ácido nucleico no modificadas, parcialmente modificado y cualquier secuencia para la que las modificaciones se hayan definido completamente.
Puede modificarse uno o más nucleótidos de un ácido nucleico de la presente invención. El ácido nucleico puede comprender al menos un nucleótido modificado. El nucleótido modificado puede estar en la primera cadena. El nucleótido modificado puede estar en la segunda cadena. El nucleótido modificado puede estar en la región bicatenaria. El nucleótido modificado puede estar fuera de la región bicatenaria, es decir, en una región monocatenaria. El nucleótido modificado puede estar en la primera cadena y puede estar fuera de la región bicatenaria. El nucleótido modificado puede estar en la segunda cadena y puede estar fuera de la región bicatenaria. El nucleótido terminal en 3' de la primera cadena puede ser un nucleótido modificado. El nucleótido terminal en 3' de la segunda cadena puede ser un nucleótido modificado. El nucleótido terminal en 5' de la primera cadena puede ser un nucleótido modificado. El nucleótido terminal en 5' de la segunda cadena puede ser un nucleótido modificado.
Un ácido nucleico de la invención puede tener 1 nucleótido modificado o un ácido nucleico de la invención puede tener aproximadamente 2-4 nucleótidos modificados, o un ácido nucleico puede tener aproximadamente 4-6 nucleótidos modificados, aproximadamente 6-8 nucleótidos modificados, aproximadamente 8-10 nucleótidos modificados, aproximadamente 10-12 nucleótidos modificados, aproximadamente 12-14 nucleótidos modificados, aproximadamente 14-16 nucleótidos modificados, aproximadamente 16-18 nucleótidos modificados, aproximadamente 18-20 nucleótidos modificados, aproximadamente 20-22 nucleótidos modificados, aproximadamente 22-24 nucleótidos modificados, 24-26 nucleótidos modificados o aproximadamente 26-28 nucleótidos modificados. En cada caso, el ácido nucleico que comprende dichos nucleótidos modificados conserva al menos el 50 % de su actividad en comparación con el mismo ácido nucleico, pero sin dichos nucleótidos modificados. El ácido nucleico puede conservar el 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % o un valor intermedio de su actividad en comparación con el mismo ácido nucleico pero sin dichos nucleótidos modificados, o puede tener más del 100 % de la actividad del mismo nucleótido sin dichos nucleótidos modificados.
El nucleótido modificado puede ser una purina o una pirimidina. Al menos la mitad de las purinas pueden modificarse. Al menos la mitad de las pirimidinas pueden modificarse. Todas las purinas pueden modificarse. Todas las pirimidinas pueden modificarse. Los nucleótidos modificados pueden seleccionarse del grupo que consiste en un nucleótido de desoxitimina (dT) 3'-terminal, un nucleótido modificado con 2'-O-metilo, un nucleótido modificado en 2', un nucleótido modificado con 2'-desoxi, un nucleótido bloqueado, un nucleótido abásico, un nucleótido modificado con 2'-amino, un nucleótido modificado con 2'-alquilo, un nucleótido de morfolino, un fosforoamidato, un nucleótido de base no natural, un nucleótido que comprende un grupo 5'-fosforotioato, un nucleótido que comprende un fosfato en 5' o mimético de fosfato de 5' y un nucleótido terminal unido a un derivado de colesterilo o un grupo bisdecilamida del ácido dodecanoico.
El ácido nucleico puede comprender un nucleótido que comprenda un nucleótido modificado, en donde la base se selecciona entre 2-aminoadenosina, 2,6-diaminopurina, inosina, piridin-4-ona, piridin-2-ona, fenilo, pseudouracilo, 2,4,6-trimetoxibenceno, 3-metil-uracilo, dihidrouridina, naftilo, aminofenilo, 5-alquilcitidina (p. ej., 5-metilcitidina), 5-alquiluridina (p. ej., ribotimidina), 5-halouridina (p. ej., 5-bromouridina), 6-azapirimidina, 6-alquilpirimidina (p. ej., 6-metiluridina), propina, quesosina, 2-tiouridina, 4-tiouridina, wibutosina, wybutoxosina, 4-acetilcitidina, 5-(carboxihidroximetil)uridina, 5'-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluridina, p-D-galactosilqueosina, 1-metiladenosina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanosina, 3-metilcitidina, 2-metiladenosina, 2-metilguanosina, N6-metiladenosina, 7-metilguanosina, 5-metoxiaminometil-2-tiouridina, 5-metilaminometiluridina, 5-metilcarbonilmetiluridina, 5-metiloxiuridina, 5-metil-2-tiouridina, 2-metiltio-N6-isopenteniladenosina, p-D-manosilqueosina, ácido uridina-5-oxiacético y 2-tiocitidina.
Los ácidos nucleicos que se analizan en el presente documento incluyen ARN sin modificar así como ARN que se ha modificado, p. ej., para mejorar la eficacia, y polímeros de sustitutos de nucleósido. El ARN sin modificar se refiere a una molécula en la que los componentes del ácido nucleico, en concreto, azúcares, bases y fracciones de fosfato, son iguales o esencialmente iguales a los que se producen en la naturaleza, por ejemplo, los que se producen de forma natural en el cuerpo humano. El nucleótido modificado, como se utiliza en el presente documento, se refiere a un nucleótido en donde uno o más de los componentes del ácido nucleico, en concreto, azúcares, bases y fracciones de fosfato, son diferentes de los que se producen en la naturaleza. Aunque se les denomina nucleótidos modificados, incluirán, por supuesto, debido a la modificación, moléculas que no sean nucleótidos, por ejemplo, moléculas de polinucleótidos en las que la cadena principal de ribofosfato se reemplaza con una construcción sin ribofosfato que permite la hibridación entre cadenas, es decir, los nucleótidos modificados imitan la cadena principal de ribofosfato.
Muchas de las modificaciones que se describen a continuación que se producen dentro de un ácido nucleico se repetirán dentro de una molécula de polinucleótido, tal como una modificación de una base, una fracción de fosfato o el O no enlazante de una fracción de fosfato. En algunos casos, la modificación se producirá en todas las posiciones/nucleótidos posibles en el polinucleótido, pero en muchos casos no se producirá. Una modificación solo puede producirse en una posición terminal en 3' o 5', solo puede producirse en regiones terminales, tal como en una posición en un nucleótido terminal o en los últimos 2, 3, 4, 5 o 10 nucleótidos de una cadena. Una modificación puede producirse en una región bicatenaria, una región monocatenaria o en ambas. Una modificación puede producirse solo en la región bicatenaria de un ácido nucleico de la invención o puede producirse solo en una región monocatenaria de un ácido nucleico de la invención. Una modificación con fosforotioato en una posición O no enlazante puede producirse solo en uno o en ambos extremos, puede producirse solo en una región terminal, p. ej., en una posición en un nucleótido terminal o en los últimos 2, 3, 4 o 5 nucleótidos de un cadena, o puede producirse en regiones bicatenarias y/o monocatenarias, en particular en los extremos. El extremo 5' o los extremos 3' pueden estar fosforilados.
La estabilidad de un ácido nucleico de la invención puede aumentarse mediante la inclusión de bases particulares en salientes, o mediante la inclusión nucleótidos modificados, en salientes monocatenarios, p. ej., en un saliente en 5' o 3', o en ambos. Los nucleótidos de purina pueden incluirse en salientes. Todas o algunas de las bases en un saliente en 3' o 5' pueden modificarse. Las modificaciones pueden incluir el uso de modificaciones en el grupo 2'-OH del azúcar ribosa, el uso de desoxirribonucleótidos, en lugar de ribonucleótidos, y modificaciones en el grupo fosfato, tales como modificaciones de fosforotioato. No es necesario que los salientes sean homólogos con la secuencia diana.
Los salientes en 5' o 3' en la cadena sentido, en la cadena antisentido o en ambas cadenas del agente de ARNbc de la invención pueden fosforilarse. En algunas realizaciones, la región saliente contiene dos nucleótidos que tienen un fosforotioato entre los dos nucleótidos, donde los dos nucleótidos pueden ser iguales o diferentes. En una realización, el saliente está presente en el extremo 3 'de la cadena sentido, cadena antisentido o ambas cadenas. En una realización, este saliente en 3' está presente en la cadena antisentido. En una realización, este saliente en 3' está presente en la cadena sentido.
Las nucleasas pueden hidrolizar enlaces fosfodiéster de ácido nucleico. No obstante, las modificaciones químicas de los ácidos nucleicos pueden conferir propiedades mejoradas, y, pueden hacer que los oligorribonucleótidos sean más estables a las nucleasas.
Los ácidos nucleicos modificados, como se utilizan en el presente documento, pueden incluir uno o más de:
(i) alteración, p. ej., reemplazo, de uno o los dos oxígenos de fosfato no enlazantes y/o de uno o más de los oxígenos de fosfato enlazantes (denominados enlazantes incluso si están en el extremo 5' y 3' del ácido nucleico de la invención);
(ii) alteración, p. ej., reemplazo, de un constituyente del azúcar ribosa, p. ej., del 2'-hidroxilo en el azúcar ribosa; (iii) reemplazo de la fracción de fosfato con "desfosfo" enlazadores;
(iv) modificación o reemplazo de una base de origen natural;
(v) reemplazo o modificación de la cadena principal de ribosa-fosfato;
(vi) modificación del extremo 3' o del extremo 5' del ARN, p. ej., eliminación, modificación o reemplazo de un grupo fosfato terminal o conjugación de una fracción, p. ej., una fracción marcada con fluorescencia, en el extremo 3' o 5' del ARN.
Los términos reemplazo, modificación, alteración, indican una diferencia con respecto a una molécula de origen natural.
Se analizan modificaciones específicas con más detalle a continuación.
Los ejemplos de grupos fosfato modificados incluyen fosforotioato, fosforoselenatos, fosfatos de borano, ésteres de fosfato de borano, fosfonatos de hidrógeno, fosforamidatos, fosfonatos de alquilo o arilo y fosfotriésteres. Los fosforoditioatos tienen ambos oxígenos no enlazantes reemplazados por azufre. Uno, cada uno o los dos oxígenos no enlazantes del grupo fosfato pueden ser independientemente uno cualquiera de S, Se, B, C, H, N u OR (R es alquilo o arilo).
El enlazador de fosfato también se puede modificar mediante reemplazo de un oxígeno enlazante por nitrógeno (fosfoamidatos puenteados), azufre (fosforotioatos puenteados) y carbono (fosfonatos de metileno puenteados). El reemplazo puede producirse en un oxígeno terminal. Es posible reemplazar los oxígenos no enlazantes por nitrógeno.
Un nucleótido modificado puede incluir la modificación de los grupos azúcar. El grupo 2'-hidroxilo (OH) puede modificarse o reemplazarse con varios sustituyentes "oxi" o "desoxi" diferentes.
Los ejemplos de modificaciones del grupo "oxi"-2'-hidroxilo incluyen alcoxi o ariloxi (OR, p. ej., R=H, alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo o azúcar); polietilenglicoles (PEG), O(CH2CH2O)nCH2CH2OR; los ácidos nucleicos "bloqueados" (ANB) en los que el 2'-hidroxilo se conecta, p. ej., mediante un puente de metileno, con el carbono en 4' del mismo azúcar ribosa; O-AMINA (AMINA=NH2; alquilamino, dialquilamino, heterociclilo, arilamino, diarilamino, heteroarilamino o diheteroarilamino, etilendiamina, poliamino) y aminoalcoxi, O(CH2)nAMINA, (p. ej., AMINA=NH2; alquilamino, dialquilamino, heterociclilo, arilamino, diarilamino, heteroarilamino o diheteroarilamino, etilendiamina, poliamino).
Las modificaciones "desoxi" incluyen hidrógeno halo; amino (p. ej., NH2; alquilamino, dialquilamino, heterociclilo, arilamino, diarilamino, heteroarilamino, diheteroarilamino o aminoácido); NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-AMINA (AMINA=NH2; alquilamino, dialquilamino, heterociclilo, arilamino, diarilamino, heteroarilamino o diheteroarilamino), -NHC(O)R (R = alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo o azúcar), ciano; mercapto; alquil-tioalquilo; tioalcoxi; y alquilo, cicloalquilo, arilo, alquenilo y alquinilo, que pueden estar opcionalmente sustituidos con, p. ej., una funcionalidad amino. Otros sustituyentes de determinadas realizaciones incluyen 2'-metoxietilo, 2 -OCH3, 2'-O-alilo, 2'-C-alilo y 2'-fluoro.
El grupo azúcar también puede contener uno o más carbonos que posean la configuración estereoquímica opuesta a la del carbono correspondiente en la ribosa. Por lo tanto, un nucleótido modificado puede contener un azúcar tal como arabinosa.
Los nucleótidos modificados también pueden incluir azúcares "abásicos", que carecen de una nucleobase en C-I'. Estos azúcares abásicos pueden contener además modificaciones en uno o más de los átomos de azúcar constituyentes.
Las modificaciones en 2' pueden usarse junto con una o más modificaciones del enlazador de fosfato (p. ej., fosforotioato).
El grupo fosfato puede reemplazarse por enlazadores que no contengan fósforo.
Los ejemplos de fracciones que pueden reemplazar el grupo fosfato incluyen siloxano, carbonato, carboximetilo, carbamato, amida, tioéter, enlazador de óxido de etileno, sulfonato, sulfonamida, tioformacetal, formacetal, oxima, metilenimino, metilenmetilimino, metilenhidrazo, metilendimetilhidrazo y metilenoximetilimino. En determinadas realizaciones, los reemplazos pueden incluir los grupos metilencarbonilamino y metilenmetilimino.
El enlazador de fosfato y el azúcar ribosa pueden reemplazarse por nucleótidos resistentes a nucleasas.
Los ejemplos incluyen los sustitutos de mofilino, ciclobutilo, pirrolidina y nucleósido de ácido nucleico peptídico (ANP). En determinadas realizaciones, pueden usarse sustitutos de ANP.
Los extremos 3' y 5' de un oligonucleótido pueden modificarse. Dichas modificaciones pueden estar en el extremo 3' o el extremo 5' o en ambos extremos de la molécula. Pueden incluir la modificación o el reemplazo de un fosfato terminal completo o de uno o más de los átomos del grupo fosfato. Por ejemplo, los extremos 3' y 5' de un oligonucleótido pueden conjugarse con otras entidades moleculares funcionales tales como fracciones de marcaje, p. ej., fluoróforos (p. ej., pireno, TAMRA, fluoresceína, colorantes Cy3 o Cy5) o grupos protectores (basados, p. ej., en azufre, silicio, boro o éster). Las entidades moleculares funcionales pueden unirse al azúcar a través de un grupo fosfato y/o un enlazador. El átomo terminal del enlazador puede conectarse a o reemplazar el átomo de enlace del grupo fosfato o el grupo O, N, S o C-3' o C-5' del azúcar. Como alternativa, el enlazador puede conectarse a o reemplazar el átomo terminal de un sustituto de nucleótido (p. ej., ANP). Estos espaciadores o enlazadores pueden incluir, p. ej., -(CH2V , —(CH2)nN—, -(CH2)nO-, -(CH2)nS-, O(CH2CH2O)nCH2CH2OH (p. ej., n = 3 o 6), azúcares abásicos, amida, carboxi, amina, oxiamina, oxiimina, tioéter, disulfuro, tiourea, sulfonamida o morfolino, o reactivos de biotina y fluoresceína. El extremo 3' puede ser un grupo -OH.
Otros ejemplos de modificaciones terminales incluyen colorantes, agentes intercalantes (p. ej., acridinas), reticulantes (p. ej., psoraleno, mitomicina C), porfirinas (TPPC4, texafirina, safirina), hidrocarburos aromáticos policíclicos (p. ej., fenacina, dihidrofenacina), endonucleasas artificiales (p. ej., EDTA), portadores lipófilos (p. ej., colesterol, ácido cólico, ácido adamantano acético, ácido 1-pireno butírico, dihidrotestosterona, 1,3-Bis-O(hexadecil)glicerol, grupo geraniloxihexilo, hexadecilglicerol, borneol, mentol, 1,3-propanodiol, grupo heptadecilo, ácido palmítico, ácido mirístico, O3-ácido (oleoil)litocólico, O3-ácido (oleoil)colénico, dimetoxitritilo o fenoxacina) y conjugados peptídicos (p. ej., péptido antennapedia, péptido Tat), agentes alquilantes, fosfato, amino, mercapto, PEG (p. ej., PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, poliamino, alquilo, alquilo sustituido, marcadores radiomarcados, enzimas, haptenos (p. ej., biotina), facilitadores de transporte/absorción (p. ej., aspirina, vitamina E, ácido fólico), ribonucleasas sintéticas (p. ej., imidazol, bisimidazol, histamina, grupos imidazol, conjugados acridina-imidazol, complejos Eu3+ de tetraazamacrociclos).
Pueden añadirse modificaciones terminales por una serie de razones, que incluyen modular la actividad o modular la resistencia a la degradación. Las modificaciones terminales útiles para modular la actividad incluyen la modificación del extremo 5' con fosfato o análogos de fosfato. Los ácidos nucleicos de la invención, en la primera o segunda cadena, pueden estar fosforilados en 5' o incluir un análogo de fosforilo en el extremo primario 5'. Las modificaciones con 5'-fosfato incluyen aquellas que son compatibles con el silenciamiento génico mediado por RISC. Las modificaciones adecuadas incluyen: 5'-monofosfato ((HO)2(O)P-O-5'); 5'-difosfato ((HO)2(O)P--O--P(HO)(O)-O-5'); 5'-trifosfato ((HO)2(O)P--O-(HO)(O)P--O--P(HO)(O)--O-5'); caperuza de 5'-guanosina (7-metilada o no metilada) (7m-G-O-5'-(HO)(O)P--O--(HO)(O)P--O--P(HO)(O)--O-5'); caperuza de 5'-adenosina (Appp) y cualquier estructura de protección de nucleótido modificada o sin modificar (N--O-5'-(HO)(O)P--O-(HO)(O)P--O--P(HO)(O)--O-5'); 5'-monotiofosfato (fosforotioato; (HO)2(S)P-O-5'); 5'-monoditiofosfato (fosforoditioato; (HO)(HS)(S)P-O-5'), 5'-fosforotiolato ((HO)2(O)P-S-5'); cualquier combinación adicional de oxígeno/azufre reemplazó al monofosfato, difosfato y trifosfatos (p. ej., 5'-atiotrifosfato, 5'-Y-tiotrifosfato, etc.), 5'-fosforamidatos ((HO)2(O)P-NH-5', (HO)(NH2)(O)P-O-5'), 5'-alquilfosfonatos (R = alquilo = metilo, etilo, isopropilo, propilo, etc., p. ej., RP(OH)(O)-O-5'-, (OH)2(O)P-5'-CH2-), 5'vinilfosfonato, 5'-alquiléterfosfonatos (R = alquiléter = metoximetilo (MeOCH2-), etoximetilo, etc., p. ej., RP(OH)(O)-O-5'-).
El ácido nucleico de la presente invención puede incluir una o más modificaciones de fosforotioato en uno o más de los extremos terminales de la primera y/o la segunda cadena. Opcionalmente, cada uno o cualquiera de los extremos de la primera cadena puede comprender uno o dos o tres nucleótidos modificados con fosforotioato. Opcionalmente, cada uno de los extremos de la segunda cadena puede comprender uno o dos o tres nucleótidos modificados con fosforotioato. Opcionalmente, ambos extremos de la primera cadena y el extremo 5' de la segunda cadena pueden comprender dos nucleótidos modificados con fosforotioato. Por nucleótido modificado con fosforotioato se entiende que el enlace entre el nucleótido y el nucleótido adyacente comprende un grupo fosforotioato en lugar de un grupo fosfato convencional.
Las modificaciones terminales también pueden ser útiles para controlar la distribución y en dichos casos los grupos que han de añadirse pueden incluir fluoróforos, p. ej., fluoresceína o un colorante Alexa. Las modificaciones terminales también pueden ser útiles para potenciar la absorción, las modificaciones útiles para esto incluyen el colesterol. Las modificaciones terminales también pueden ser útiles para reticular un agente de ARN con otra fracción.
Nucleótidos
La adenina, la guanina, la citosina y el uracilo son las bases más comunes que se encuentran en el ARN. Estas bases pueden modificarse o reemplazarse para proporcionar ARN que tengan propiedades mejoradas. P. ej., pueden prepararse oligorribonucleótidos resistentes a nucleasas con estas bases o con nucleobases sintéticas y naturales (p. ej., inosina, timina, xantina, hipoxantina, nubularina, isoguanisina o tubercidina) y una cualquiera de las modificaciones anteriores. Como alternativa, pueden emplearse análogos sustituidos o modificados de cualquiera de las bases anteriores y "bases universales". Los ejemplos incluyen 2-aminoadenina, 6-metilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-propilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinil uracilo y citosina, 6-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 5-halouracilo, 5-(2-aminopropil)uracilo, 5-amino alil uracilo, 8-halo, amino, tiol, tioalquilo, hidroxilo y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas 5-sustituidos, 7-metilguanina, pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas N-2, N-6 y O-6 sustituidas, incluyendo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina, dihidrouracilo, 3-deaza-5-azacitosina, 2-aminopurina, 5-alquiluracilo, 7-alquilguanina, 5-alquilcitosina, 7-desazaadenina, N6,N6-dimetiladenina, 2,6-diaminopurina, 5-amino-alil-uracilo, N3-metiluracilo, 1,2,4-triazoles sustituidos, 2-piridinona, 5-nitroindol, 3-nitropirrol, 5-metoxiuracilo, ácido uracil-5-oxiacético, 5-metoxicarbonilmetiluracilo, 5-metil-2-tiouracilo, 5-metoxicarbonilmetil-2-tiouracilo, 5-metilaminometil-2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-carboxipropil)uracilo, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N<4>-acetilcitosina, 2-tiocitosina, N6-metiladenina, N6-isopentiladenina, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, N-metilguaninas o bases O-alquiladas.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "análogo de nucleótido no emparejado" significa un análogo de nucleótido que incluye una fracción de emparejamiento que no es una base que incluye, pero sin limitación: 6 des amino adenosina (Nebularina), 4-Me-indol, 3-nitropirrol, 5-nitroindol, Ds, Pa, N3-Me ribo U, N3-Me riboT, N3-Me dC, N3-Me-dT, N1-Me-dG, N1-Me-dA, N3-metil-dC, N3-Me dC. En algunas realizaciones, el análogo de nucleótido sin emparejamiento de bases es un ribonucleótido. En otras realizaciones es un desoxirribonucleótido.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión, "grupo funcional terminal" incluye, sin limitación, un halógeno, alcohol, amina, carboxílico, éster, amida, aldehído, cetona, grupos éter.
Determinadas fracciones pueden estar unidas al extremo 5' de la primera cadena o la segunda cadena e incluyen una fracción ribosa abásica, una fracción de desoxirribosa abásica, modificaciones de ribosa abásica y fracciones de desoxirribosa abásicas que incluyen modificaciones con 2'-O-alquilo; fracciones de ribosa abásica invertida y desoxirribosa abásica y modificaciones de los mismos, C6-imino-Pi; un nucleótido espejo que incluye L-ADN y L-ARN; nucleótido de 5'OMe; y análogos de nucleótidos que incluyen nucleótido de 4',5'-metileno; 1-(p-D-eritrofuranosil)nucleótido; 4'-tio nucleótido, nucleótido carbocíclico; fosfato de 5'-amino-alquilo; fosfato de 1,3-diamino-2-propilo, fosfato de 3-aminopropilo; fosfato de 6-aminohexilo; fosfato de 12-aminododecilo; fosfato de hidroxipropilo; nucleótido de 1,5-anhidrohexitol; a-nucleótido; nucleótido de treo-pentofuranosilo; 3',4'-seco nucleótido acíclico; nucleótido de 3,4-dihidroxibutilo; nucleótido de 3,5-dihidroxipentilo, fracción abásica invertida 5'-5'; fosfato de 1,4-butanodiol; 5'-amino; y metilfosfonato de unión y no de unión y fracciones de 5'-mercapto.
Los ácidos nucleicos de la invención pueden incluir uno o más nucleótidos invertidos, por ejemplo, timidina invertida o adenina invertida (por ejemplo, véase Takei et al., 2002. JBC 277 (26):23800-06).
Como se utiliza en el presente documento, el término "inhibir", "regular negativamente" o "reducir" con respecto a la expresión génica significa que la expresión del gen, o el nivel de moléculas de ARN o moléculas de ARN equivalentes que codifican una o más proteínas o subunidades de proteínas (p. ej., ARNm), o la actividad de una o más proteínas, subunidades de proteínas o péptidos, se reduce por debajo de la observada en ausencia de un ácido nucleico conjugado de la invención o en referencia a una molécula de ARNip sin homología conocida con las transcripciones humanas (en el presente documento denominado control sin silenciamiento). Dicho control puede conjugarse y modificarse de manera análoga a la molécula de la invención y administrarse en la célula diana por la misma vía; por ejemplo, la expresión puede reducirse al 90 %, 80 %, 70 %, 60 %, 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 15 % o un valor intermedio, en ausencia del ácido nucleico o ácido nucleico conjugado de la invención, o en presencia de un control sin silenciamiento.
El ácido nucleico de la presente invención puede comprender un nucleótido abásico. El término "abásico", como se usa en el presente documento, se refiere a fracciones que carecen de una base o que tienen otros grupos químicos en lugar de una base en la posición 1', por ejemplo, un derivado de ribosa desoxiabásico unido en 3',3' o unido en 5',5'.
El ácido nucleico puede comprender uno o más nucleótidos en las cadenas segunda y/o primera que se modifican. Pueden modificarse nucleótidos alternos, para formar nucleótidos modificados.
Alternos, como se describe en el presente documento, significa que se produce uno tras otro de manera regular. En otras palabras, alternos significa que se produce a su vez repetidamente. Por ejemplo, si se modifica un nucleótido, el siguiente nucleótido contiguo no se modifica y el siguiente nucleótido contiguo se modifica y así sucesivamente. Un nucleótido puede estar modificado con una primera modificación, el siguiente nucleótido contiguo puede modificarse con una segunda modificación y el siguiente nucleótido contiguo se modifica con la primera modificación y así sucesivamente, donde las modificaciones primera y segunda son diferentes.
Pueden modificarse uno o más de los nucleótidos impares de la primera cadena del ácido nucleico de la invención, en donde la primera cadena se numera de 5' a 3'. El término "impar" como se describe en el presente documento significa un número no divisible entre dos. Son ejemplos de números impares 1, 3, 5, 7, 9, 11 y así sucesivamente. Pueden modificarse uno o más de los nucleótidos pares de la primera cadena del ácido nucleico de la invención, en donde la primera cadena se numera de 5' a 3'. El término "par" como se describe en el presente documento significa un número que se divide en partes iguales entre dos. Son ejemplos de números pares 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 y así sucesivamente. Pueden modificarse uno o más de los nucleótidos impares de la segunda cadena del ácido nucleico de la invención, en donde la segunda cadena se numera de 3' a 5'. Pueden modificarse uno o más de los nucleótidos pares de la segunda cadena del ácido nucleico de la invención, en donde la segunda cadena se numera de 3' a 5'.
Pueden modificarse uno o más nucleótidos en la cadena primera y/o segunda, para formar nucleótidos modificados. Pueden modificarse uno o más de los nucleótidos impares de la primera cadena. Pueden modificarse uno o más de los nucleótidos pares de la primera cadena mediante al menos una segunda modificación, en donde la al menos segunda modificación es diferente de la modificación en uno o más nucleótidos añadidos. Al menos uno de los uno o más nucleótidos pares modificados puede estar adyacente a al menos uno de los uno o más nucleótidos impares modificados.
Puede modificarse una pluralidad de nucleótidos impares en la primera cadena en el ácido nucleico de la invención. Una pluralidad de nucleótidos pares en la primera cadena puede modificarse mediante una segunda modificación. La primera cadena puede comprender nucleótidos adyacentes que se modifican mediante una modificación común. La primera cadena también puede comprender nucleótidos adyacentes que se modifican mediante una segunda modificación diferente.
Uno o más de los nucleótidos impares de la segunda cadena pueden modificarse mediante una modificación que sea diferente de la modificación de los nucleótidos impares de la primera cadena y/o uno o más de los nucleótidos pares de la segunda cadena lo pueden ser mediante la misma modificación de los nucleótidos impares de la primera cadena. Al menos uno de los uno o más nucleótidos pares modificados de la segunda cadena puede estar adyacente al uno o más nucleótidos impares modificados. Una pluralidad de nucleótidos impares de la segunda cadena puede modificarse mediante una modificación común y/o una pluralidad de nucleótidos pares puede modificarse mediante la misma modificación que está presente en los nucleótidos impares de la primera cadena. Una pluralidad de nucleótidos impares en la segunda cadena puede modificarse mediante una segunda modificación, en donde la segunda modificación es diferente de la modificación de los nucleótidos impares de la primera cadena.
La segunda cadena puede comprender nucleótidos adyacentes que se modifican mediante una modificación común, que puede ser una segunda modificación que sea diferente de la modificación de los nucleótidos impares de la primera cadena.
En el ácido nucleico de la invención, cada uno de los nucleótidos impares en la primera cadena y cada uno de los nucleótidos pares en la segunda cadena pueden modificarse con una modificación común y, cada uno de los nucleótidos pares puede modificarse en la primera cadena con una segunda modificación y cada uno de los nucleótidos impares puede modificarse en la segunda cadena con la segunda modificación.
El ácido nucleico de la invención puede tener los nucleótidos modificados de la primera cadena desplazados por al menos un nucleótido con respecto a los nucleótidos sin modificar o modificados de manera diferente de la segunda cadena.
Uno o más o cada uno de los nucleótidos impares pueden modificarse en la primera cadena y uno o más o cada uno de los nucleótidos pares pueden modificarse en la segunda cadena. Uno o más o cada uno de los nucleótidos alternos en una de las dos o las dos cadenas pueden modificarse mediante una segunda modificación. Uno o más o cada uno de los nucleótidos pares pueden modificarse en la primera cadena y uno o más o cada uno de los nucleótidos pares pueden modificarse en la segunda cadena. Uno o más o cada uno de los nucleótidos alternos en una de las dos o las dos cadenas pueden modificarse mediante una segunda modificación. Uno o más o cada uno de los nucleótidos impares pueden modificarse en la primera cadena y uno o más de los nucleótidos impares pueden modificarse en la segunda cadena mediante una modificación común. Uno o más o cada uno de los nucleótidos alternos en una de las dos o las dos cadenas pueden modificarse mediante una segunda modificación. Uno o más o cada uno de los nucleótidos pares pueden modificarse en la primera cadena y uno o más o cada uno de los nucleótidos impares pueden modificarse en la segunda cadena mediante una modificación común. Uno o más o cada uno de los nucleótidos alternos en una de las dos o las dos cadenas pueden modificarse mediante una segunda modificación.
El ácido nucleico de la invención puede comprender construcciones monocatenarias o bicatenarias que comprendan al menos dos regiones de modificaciones alternas en una o ambas cadenas. Estas regiones alternas pueden comprender hasta aproximadamente 12 nucleótidos, pero preferentemente comprenden de aproximadamente 3 a aproximadamente 10 nucleótidos. Las regiones de nucleótidos alternos pueden ubicarse en los extremos de una o ambas cadenas del ácido nucleico de la invención. El ácido nucleico puede comprender de 4 a aproximadamente 10 nucleótidos de nucleótidos alternos en cada extremo (3' y 5') y estas regiones pueden estar separadas por aproximadamente 5 a aproximadamente 12 nucleótidos contiguos no modificados o modificados de manera diferente o común.
Pueden modificarse los nucleótidos impares de la primera cadena y los nucleótidos pares pueden modificarse con una segunda modificación. La segunda cadena puede comprender nucleótidos adyacentes que están modificados con una modificación común, que puede ser la misma modificación de los nucleótidos impares de la primera cadena. También se pueden modificar uno o más nucleótidos de la segunda cadena con la segunda modificación. Uno o más nucleótidos con la segunda modificación pueden ser adyacentes entre sí y con nucleótidos que tengan una modificación que sea la misma que la modificación de los nucleótidos impares de la primera cadena. La primera cadena también puede comprender enlaces de fosforotioato entre los dos nucleótidos en el extremo 3' y en el extremo 5'. La segunda cadena puede comprender un enlace de fosforotioato entre los dos nucleótidos en el extremo 5'. La segunda cadena también puede conjugarse con un ligando en el extremo 5'.
El ácido nucleico de la invención puede comprender una primera cadena que comprenda nucleótidos adyacentes que están modificados con una modificación común. Uno o más de dichos nucleótidos pueden estar adyacentes a uno o más nucleótidos que pueden estar modificados con una segunda modificación. Uno o más nucleótidos con la segunda modificación pueden ser adyacentes. La segunda cadena puede comprender nucleótidos adyacentes que están modificados con una modificación común, que puede ser igual a una de las modificaciones de uno o más nucleótidos de la primera cadena. También se pueden modificar uno o más nucleótidos de la segunda cadena con la segunda modificación. Uno o más nucleótidos con la segunda modificación pueden ser adyacentes. La primera cadena también puede comprender enlaces de fosforotioato entre los dos nucleótidos en el extremo 5' y en el extremo 3'. La segunda cadena puede comprender un enlace de fosforotioato entre los dos nucleótidos en el extremo 3'. La segunda cadena también puede conjugarse con un ligando en el extremo 5'.
Los nucleótidos numerados de 5' a 3' en la primera cadena y 3' y 5' en la segunda cadena, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 y 25 pueden modificarse mediante una modificación en la primera cadena. Los nucleótidos numerados 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24 pueden modificarse mediante una segunda modificación en la primera cadena. Los nucleótidos numerados 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 pueden modificarse mediante una modificación en la segunda cadena. Los nucleótidos numerados 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24 pueden modificarse mediante una segunda modificación en la segunda cadena. Los nucleótidos están numerados para el ácido nucleico de la presente invención de 5' a 3' en la primera cadena y 3' y 5' en la segunda cadena.
Los nucleótidos numerados 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24 pueden modificarse mediante una modificación en la primera cadena. Los nucleótidos numerados 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21,23 pueden modificarse mediante una segunda modificación en la primera cadena. Los nucleótidos numerados 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 pueden modificarse mediante una modificación en la segunda cadena.
Los nucleótidos numerados 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24 pueden modificarse mediante una segunda modificación en la segunda cadena.
Evidentemente, si la primera y/o la segunda cadena tienen una longitud inferior a 25 nucleótidos, tal como 19 nucleótidos de longitud, no hay nucleótidos numerados 20, 21, 22, 23, 24 y 25 por modificar. El experto en la materia entiende que la descripción anterior se aplica a cadenas más cortas, en consecuencia.
Uno o más nucleótidos modificados en la primera cadena pueden emparejarse con nucleótidos modificados en la segunda cadena que tengan una modificación común. Uno o más nucleótidos modificados en la primera cadena pueden emparejarse con nucleótidos modificados en la segunda cadena que tengan una modificación diferente. Uno o más nucleótidos modificados en la primera cadena pueden emparejarse con nucleótidos no modificados en la segunda cadena. Uno o más nucleótidos modificados en la segunda cadena pueden emparejarse con nucleótidos no modificados en la primera cadena. En otras palabras, los nucleótidos alternos pueden estar alineados en las dos cadenas tal como, por ejemplo, por ejemplo, todas las modificaciones de las regiones alternas de la segunda cadena se emparejan con modificaciones idénticas de la primera cadena o, como alternativa, las modificaciones pueden compensarse con un nucleótido con las modificaciones comunes de las regiones alternas de una cadena emparejadas con modificaciones diferentes (es decir, una segunda modificación o modificación adicional) en la otra cadena. Otra opción es tener modificaciones diferentes en cada una de las cadenas.
Las modificaciones de la primera cadena pueden estar desplazadas por un nucleótido en relación con los nucleótidos modificados de la segunda cadena, de manera que los nucleótidos modificados comunes no se emparejan entre sí.
La modificación y/o modificaciones pueden seleccionarse cada una individualmente del grupo que consiste en desoxitimina 3'-terminal, 2'-O-metilo, una modificación con 2'-desoxi, una modificación con 2'-amino, una modificación con 2'-alquilo, una modificación con morfolino, una modificación con fosforamidato, una modificación con grupo 5'-fosforotioato, una modificación con fosfato en 5' o mimético de fosfato en 5' y un derivado de colesterilo o una modificación de grupo bisdecilamida del ácido dodecanoico y/o el nucleótido modificado puede ser uno cualquiera de entre un nucleótido bloqueado, un nucleótido abásico o una base no natural que comprende nucleótido.
Al menos una modificación puede ser 2'-O-metilo y/o al menos una modificación puede ser 2'-F. Otras modificaciones, como se describe en el presente documento, pueden estar presentes en la primera y/o la segunda cadena.
A lo largo de la descripción de la invención, "modificación igual o común" significa la misma modificación de cualquier nucleótido, ya sea A, G, C o U modificado con un grupo tal como un grupo metilo o un grupo fluoro. No se entiende la misma adición en el mismo nucleótido. Por ejemplo, 2'F-dU, 2'F-dA, 2'F-dC, 2'F-dG se consideran todos iguales o una modificación común, como son 2'-OMe-rU, 2'-OMe-rA; 2'-OMe-rC; 2'-OMe-rG. Una modificación 2'F es una modificación diferente a una modificación 2'OMe.
Algunas secuencias de ácidos nucleicos modificadas representativas de la presente invención se muestran en los ejemplos. Estos ejemplos pretenden ser representativos y no limitativos.
Preferentemente, el ácido nucleico puede comprender una modificación y la segunda o posterior modificación, que se seleccionan individualmente del grupo que comprende la modificación 2'-O-metilo y la modificación 2'-F. El ácido nucleico puede comprender una modificación que sea 2'-O-metilo (2'OMe) que puede ser una primera modificación y una segunda modificación que sea 2'-F. El ácido nucleico de la invención también puede incluir una modificación de fosforotioato y/o una modificación de desoxi que puede estar presente en o entre los 1, 2 o 3 nucleótidos terminales de todos los extremos o de cualquier extremo de cada cadena o ambas cadenas.
El ácido nucleico de la invención puede conjugarse con un ligando.
Algunos ligandos pueden tener propiedades endosomolíticas. Los ligandos endosomolíticos favorecen la lisis del endosoma y/o el transporte de la composición de la invención, o de sus componentes, desde el endosoma hasta el citoplasma de la célula. El ligando endosomolítico puede ser un péptido polianiónico o un peptidomimético que muestra fusogenicidad y actividad de membrana dependiente del pH. El componente endosomolítico puede contener un grupo químico que sufre un cambio de carga o protonación en respuesta a un cambio de pH. El componente endosomolítico puede ser lineal o ramificado.
Los ligandos pueden incluir modificadores terapéuticos, p. ej., para mejorar la absorción; compuestos de diagnóstico o grupos indicadores, p. ej., para controlar la distribución; agentes de reticulación; y fracciones que confieren resistencia nuclear. Los ejemplos generales incluyen lípidos, esteroides, vitaminas, azúcares, proteínas, péptidos, poliaminas e imitadores de péptidos. Los ligandos pueden incluir una sustancia de origen natural, tal como una proteína, un hidrato de carbono o un lípido. El ligando puede ser una molécula recombinante o sintética.
Los ligandos también pueden incluir grupos de direccionamiento, p. ej., un agente dirigido a células o tejidos. El ligando de direccionamiento puede ser una lectina, glucoproteína, lípido o proteína.
Otros ejemplos de ligandos incluyen tintes, agentes intercalantes, reticulantes, porfirinas, hidrocarburos aromáticos policíclicos, endonucleasas artificiales o un quelante, moléculas lipófilas, agentes alquilantes, fosfato, amino, mercapto, PEG, MPEG, alquilo, alquilo sustituido, marcadores radiomarcados, enzimas, haptenos, facilitadores de transporte/absorción, ribonucelasas sintéticas o agrupamientos de imidazol.
Los ligandos pueden ser proteínas, p. ej., glucoproteínas o péptidos. Los ligandos también pueden ser hormonas o receptores de hormonas. También pueden incluir especies no peptídicas, tales como lípidos, lectinas, hidratos de carbono, vitaminas o cofactores.
El ligando puede ser una sustancia tal como un fármaco que puede aumentar la absorción del ácido nucleico en una célula, por ejemplo, mediante la alteración del citoesqueleto de la célula.
El ligando puede aumentar la absorción del ácido nucleico en la célula mediante la activación de una respuesta inflamatoria. Dichos ligandos incluyen el factor de necrosis tumoral a (TNF-a), interleucina-1 p o interferón y.
El ligando puede ser un lípido o una molécula basada en lípidos. El lípido o la molécula basada en lípidos se une preferentemente a una proteína sérica. Preferentemente, el ligando basado en lípidos se une a la albúmina sérica humana (HSA, Human Serum Albumin). Un lípido o molécula basada en lípidos puede aumentar la resistencia a la degradación del conjugado, aumentar el direccionamiento o el transporte a la célula diana, y/o puede ajustar la unión a una proteína sérica. Se puede utilizar un ligando basado en lípidos para modular la unión del conjugado a un tejido diana.
El ligando puede ser un esteroide. Preferentemente, el ligando es colesterol o un derivado de colesterol.
El ligando puede ser una fracción, p. ej., una vitamina, que es absorbida por una célula diana. Algunas vitaminas ilustrativas incluyen vitamina A, E, K y las vitaminas B. Las vitaminas pueden ser absorbidas por una célula en proliferación, que puede ser útil para administrar el ácido nucleico a células tales como células tumorales malignas o no malignas.
El ligando puede ser un agente de permeación celular, tal como un agente de permeación celular helicoidal. Preferentemente dicho agente es anfipático.
El ligando puede ser un péptido o un peptidomimético. Un peptidomimético es una molécula capaz de plegarse en una estructura tridimensional definida similar a un péptido natural. El ligando peptídico o peptidomimético puede incluir péptidos de origen natural o modificados, o ambos. Un péptido o peptidomimético puede ser un péptido de permeación celular, un péptido catiónico, un péptido anfipático o un péptido hidrófobo. La fracción peptídica puede ser un péptido dendrímero, un péptido restringido o un péptido reticulado. La fracción peptídica puede incluir una secuencia de translocación de membrana hidrófoba. La fracción peptídica puede ser un péptido capaz de transportar moléculas polares grandes tales como péptidos, oligonucleótidos y proteínas a través de las membranas celulares, p. ej., secuencias de la proteína Tat del VIH (GRKKRRQRRRPPQ) y la proteína Antennapedia de Drosophila (RQIKIWFQNRRMKWKK). Preferentemente, el péptido o peptidomimético es un péptido de direccionamiento a células, p. ej., arginina-glicina-ácido aspártico (RGD)-péptido.
El ligando puede ser un péptido de permeación celular que es capaz de permear, por ejemplo, una célula microbiana o una célula de mamífero.
El ligando puede ser un modulador farmacocinético. El modulador farmacocinético puede ser lipófilos, ácidos biliares, esteroides, análogos de fosfolípidos, péptidos, agentes de unión a proteínas, PEG, vitaminas, etc.
Cuando dos o más ligandos están presentes, todos los ligandos pueden tener las mismas propiedades, tener todos propiedades diferentes o algunos ligandos tienen las mismas propiedades mientras que otros tienen propiedades diferentes. Por ejemplo, un ligando puede tener propiedades de direccionamiento, tener actividad endosomolítica o tener propiedades moduladoras PK. En una realización preferida, todos los ligandos tienen propiedades diferentes.
Los ligandos se pueden acoplar al ácido nucleico en el extremo 3', en el extremo 5' y/o en una posición interna. Preferentemente, el ligando se acopla al ácido nucleico a través de un enlace o anclaje intermedio.
El ácido nucleico es un ácido nucleico bicatenario. En un ácido nucleico bicatenario, el ligando puede unirse a una o ambas cadenas. En algunas realizaciones, un ácido nucleico bicatenario contiene un ligando conjugado con la cadena sentido. En otras realizaciones, un ácido nucleico bicatenario contiene un ligando conjugado con la cadena antisentido.
Los ligandos se pueden conjugar con nucleobases, fracciones de azúcar o enlaces internucleosídicos de moléculas de ácido nucleico. La conjugación con nucleobases de purina o derivados de las mismas puede producirse en cualquier posición, incluidos los átomos endocíclicos y exocíclicos. La conjugación con nucleótidos de pirimidina o derivados de los mismos también puede producirse en cualquier posición. La conjugación con fracciones de azúcar de nucleósidos puede producirse en cualquier átomo de carbono. La conjugación a enlaces internucleosídicos puede ocurrir en el átomo de fósforo de un enlace que contiene fósforo o en un átomo de oxígeno, nitrógeno o azufre unido al átomo de fósforo. Para enlaces internucleosídicos que contienen amina o amida, la conjugación puede producirse en el átomo de nitrógeno de la amina o amida o en un átomo de carbono adyacente.
Normalmente el ligando es un hidrato de carbono, p. ej., un monosacárido, disacárido, trisacárido, tetrasacárido o polisacárido. El ligando puede conjugarse con el ácido nucleico mediante un enlazador. El enlazador puede ser un enlazador ramificado monovalente, bivalente o trivalente.
La administración eficaz de oligonucleótidos, en particular de ácidos nucleicos bicatenarios de la invención, a células in vivo es importante y requiere un direccionamiento específico y una protección sustancial del ambiente extracelular, en particular de las proteínas del suero. Un método para lograr un direccionamiento específico es conjugar un ligando con el ácido nucleico. El ligando ayuda a dirigir el ácido nucleico al sitio diana necesario. Existe la necesidad de conjugar ligandos apropiados para las moléculas receptoras deseadas para que las moléculas conjugadas sean captadas por las células diana mediante mecanismos tales como diferentes vías de endocitosis mediadas por receptores o procesos funcionalmente análogos. La fracción de direccionamiento o el ligando puede ser cualquier resto o ligando que sea capaz de dirigirse a un receptor específico.
Por ejemplo, el receptor de asialoglucoproteína (ASGP-R) es un receptor de alta capacidad, que es muy abundante en los hepatocitos. Una de las primeras divulgaciones de glucósidos de agrupación triantenaria fue en la patente de los EE. UU. número US 5.885.968. Los conjugados que tienen tres ligandos GalNAc y que comprenden grupos fosfato son conocidos y se describen en Dubber et al. (2003, Bioconjug. Chem. enero-febrero de 2003; 14(1):239-46). El ASGP-R muestra una afinidad 50 veces mayor por la N-acetil-D-galactosilamina (GalNAc) que por la D-Gal.
Los hepatocitos que expresan la lectina (receptor de asialoglucoproteína; ASGPR), que reconoce de manera específica subunidades de p-galactosilo terminales de proteínas glucosiladas u otros oligosacáridos (Weigel, P. H. et al., Biochim. Biophys. Acta. 19 de septiembre de 2002;1572(2-3):341-63), puede utilizarse para dirigir un fármaco al hígado mediante el acoplamiento covalente de galactosa o galactosamina a la sustancia farmacológica (Ishibashi, S.; et al., J Biol. Chem. 11 de noviembre de 1994; 269(45):27803-6). Además, la afinidad de unión puede aumentarse significativamente por el efecto de valencia múltiple, que se consigue mediante la repetición de la unidad de direccionamiento (E. A. L. Biessen et al., 1995).
El ASGPR es un mediador para un transporte endosómico activo de glucoproteínas que contienen p-galactosilo terminal, por tanto, ASGPR es altamente adecuado para la administración dirigida de fármacos candidatos como el ácido nucleico, que debe administrarse en una célula (Akinc et al.).
El ligando se puede unir al ácido nucleico de la invención a través de un enlazador, que puede ser un enlazador ramificado bivalente o trivalente o tetramérico.
El sacárido, que también puede denominarse ligando, puede seleccionarse para que tenga una afinidad por al menos un tipo de receptor en una célula diana. En concreto, el receptor está en la superficie de una célula hepática de mamífero, por ejemplo, el receptor hepático de asialoglucoproteína (ASGP-R).
El sacárido puede seleccionarse entre N-acetil-galactosamina, manosa, galactosa, glucosa, glucosamona y fucosa. El sacárido puede ser N-acetil-galactosamina (GalNAc).
Por lo tanto, un ligando para su uso en la presente invención puede comprender (i) una o más fracciones de N-acetilgalactosamina (GalNAc) y derivados de las mismas, y (ii) un enlazador, en donde el enlazador conjuga las fracciones de GalNAc con una secuencia como se define en cualquier aspecto anterior. El enlazador puede ser una estructura ramificada bivalente, trivalente o tetravalente. Los nucleótidos pueden modificarse como se define en el presente documento.
"GalNAc" se refiere a 2-(acetilamino)-2-desoxi-D-galactopiranosa, habitualmente denominada en la bibliografía N-acetil-galactosamina. La referencia a "GalNAc" o a "N-acetil-galactosamina" incluye tanto la forma p: 2-(Acetilamino)-2-desoxi-p-D-galactopiranosa como la forma a: 2-(Acetilamino)-2-desoxi-a-D-galactopiranosa. Tanto la forma p: 2-(Acetilamino)-2-desoxi-p-D-galactopiranosa como la forma a: 2-(Acetilamino)-2-desoxi-a-D-galactopiranosa pueden usarse indistintamente. Preferentemente, los compuestos de la invención comprenden la forma p, 2-(Acetilamino)-2-desoxi-p-D-galactopiranosa.
El ligando puede comprender GalNAc.
El ligando puede comprender un compuesto de fórmula I:
[S-X1-P-X2]3-A-X3- (I)
en donde:
S representa un sacárido, en donde el sacárido es N-acetil-galactosamina;
X1 representa alquileno C3-C6 o (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2- en donde m es 1, 2 o 3;
P es un fosfato o fosfato modificado (preferentemente un tiofosfato);
X2 es alquileno o un alquilenéter de fórmula (-CH2 V O-CH2- donde n = 1-6;
A es una unidad de ramificación;
X3 representa una unidad de unión;
en donde un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención está conjugado con X3 a través de un fosfato o fosfato modificado (preferentemente un tiofosfato).
En la fórmula I, la unidad de ramificación "A" tiene tres ramificaciones con el fin de alojar las tres fracciones sacarídicas. La unidad de ramificación se une de manera covalente a las partes ancladas restantes del ligando y el ácido nucleico. La unidad de ramificación puede comprender un grupo alifático ramificado que comprenda grupos seleccionados entre grupos alquilo, amida, disulfuro, polietilenglicol, éter, tioéter e hidroxiamino. La unidad de ramificación puede comprender grupos seleccionados entre grupos alquilo y éter.
La unidad de ramificación A puede tener una estructura seleccionada entre:
Figure imgf000023_0001
en donde cada A1 representa independientemente O, S, C=O o NH; y cada n representa independientemente un número entero de 1 a 20.
La unidad de ramificación puede tener una estructura seleccionada entre:
Figure imgf000024_0001
en donde cada A1 representa independientemente O, S, C=O o NH; y
cada n representa independientemente un número entero de 1 a 20.
La unidad de ramificación puede tener una estructura seleccionada entre:
Figure imgf000024_0002
en donde A1 es O, S, C=O o NH; y
cada n representa independientemente un número entero de 1 a 20.
La unidad de ramificación puede tener la estructura:
Figure imgf000024_0003
La unidad de ramificación puede tener la estructura:
Figure imgf000024_0004
La unidad de ramificación puede tener la estructura:
Figure imgf000025_0001
Opcionalmente, la unidad de ramificación consiste en solo un átomo de carbono.
La porción "X3" de los compuestos de fórmula I es una unidad de unión. La unidad de unión es lineal y se une covalentemente a la unidad de ramificación y al ácido nucleico.
X3 se puede seleccionar de alquileno C1-C20, -alquenilen C2-C20-, un alquilenéter de fórmula -(alquilen C1-C20HO-(alquileno C1-C20)-, -C(O)-alquilen C1-C20-, -alquilen C0-C4(Cy)alquileno C0-C4, en donde Cy representa un anillo cicloalquileno, arileno, heterociclileno o heteroarileno de 5 o 6 miembros sustituido o no sustituido, -alquilen C1-C4-NHC(O)-alquileno C1-C4-, -alquilen C1-C4-C(O)NH-alquileno C1-C4-, -alquilen C1-C4-SC(O)-alquileno C1-C4-, -alquilen C1-C4-C(O)S-alquileno C1-C4-, -alquilen C1-C4-OC(O)-alquileno C1-C4-, -alquilen C1-C4-C(O)O-alquileno C1-C4- y -alquilen C1-C6-S-S-alquileno C1-C6-.
X3 puede ser un alquilenéter de fórmula -(alquilen C1-C20)-O-(alquileno C1-C20)-. X3 puede ser un alquilenéter de fórmula -(alquilen C1-C20)-O-(alquileno C4-C20)-, en donde dicho (alquileno C4-C20) se une a Z. X3 puede seleccionarse del grupo que consiste en -CH2-O-C3H6-, -CH2-O-C4H8-, -CH2-O-C6H12- y -CH2-O-C8H16-, especialmente -CH2-O-C4H8-, -CH2-O-C6H12- y -CH2-O-C8H16-, en donde, en cada caso, el grupo -CH2- se une a A.
El ligando puede comprender un compuesto de fórmula (II):
[S-X1-P-X2]3-A-X3- (II)
en donde:
S representa un sacárido;
X1 representa alquileno C3-C6 o (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2- en donde m es 1, 2 o 3;
P es un fosfato o fosfato modificado (preferentemente un tiofosfato);
X2 es alquileno C1-C8;
A es una unidad de ramificación seleccionada entre:
Figure imgf000025_0002
A1 = O, NH A1 = O, NH A2 = NH, CH2, O
n = 1 a 4 n = 1 a 4
X3 es una unidad de unión;
en donde un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención está conjugado con X3 a través de un fosfato o fosfato modificado (preferentemente un tiofosfato).
La unidad de ramificación A puede tener la estructura:
Figure imgf000025_0003
La unidad de ramificación A puede tener la
Figure imgf000026_0001
en donde X3 se une al átomo de nitrógeno.
X3 puede ser alquileno C1-C20. Preferentemente, X3 se selecciona del grupo que consiste en -C3H6-, - C4H8-, -C6H12- y -C8H16-, especialmente -C4H8-, -C6H12- y -C8H16-.
El ligando puede comprender un compuesto de fórmula (III):
[S-X1-P-X2]3-A-X3- (III)
en donde:
S representa un sacárido;
X1 representa alquileno C3-C6 o (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2- en donde m es 1, 2 o 3;
P es un fosfato o fosfato modificado (preferentemente un tiofosfato);
X2 es un alquilenéter de fórmula -C3H6-O-CH2-;
A es una unidad de ramificación;
X3 es un alquilenéter de fórmula seleccionada del grupo que consiste en -CH2-O-CH2-, - CH2-O-C2H4-, -CH2-O-C3H6-, -CH2-O-C4H8-, -CH2-O-C5H10-, -CH2-O-C6H12-, -CH2-O-C7H14- y -CH2-O-C8H16-, en donde en cada caso el grupo -CH2- se une a A,
Z es el ácido nucleico;
y en donde el enlace entre X3 y Z es un fosfato o tiofosfato
La unidad de ramificación puede comprender carbono. Preferentemente, la unidad de ramificación es carbono.
X3 puede seleccionarse del grupo que consiste en -CH2-O-C4H8-, -CH2-O-C5H10-, -CH2-O-C6H12-, -CH2-O-C7H14-y -CH2-O-C8H16-. Preferentemente, X3 se selecciona del grupo que consiste en -CH2-O-C4H8-, -CH2-O-C6H12- y -CH2-O-C8H16.
Para cualquiera de los aspectos anteriores, cuando P representa un grupo fosfato modificado, P se puede representar por:
Figure imgf000026_0002
en donde Y1 e Y2 representan cada uno independientemente =O, =S, -O' , -OH, -SH, -BH3, -OCH2CO2, - OCH2CO2Rx, -OCH2C(S)ORx y -ORx, en donde Rx representa alquilo C1-C6 y en donde
Figure imgf000026_0003
indica unión al resto del compuesto.
Por fosfato modificado se entiende un grupo fosfato en donde se reemplaza uno o más de los oxígenos. Los ejemplos de grupos fosfato modificados incluyen fosforotioato, fosforoselenatos, fosfatos de borano, ésteres de fosfato de borano, fosfonatos de hidrógeno, fosforamidatos, fosfonatos de alquilo o arilo y fosfotriésteres. Los fosforoditioatos tienen ambos oxígenos no enlazantes reemplazados por azufre. Uno, cada uno o los dos oxígenos no enlazantes del grupo fosfato pueden ser independientemente uno cualquiera de S, Se, B, C, H, N u OR (R es alquilo o arilo).
El enlazador de fosfato también se puede modificar mediante reemplazo de un oxígeno enlazante por nitrógeno (fosfoamidatos puenteados), azufre (fosforotioatos puenteados) y carbono (fosfonatos de metileno puenteados). El reemplazo puede producirse en un oxígeno terminal. Es posible reemplazar los oxígenos no enlazantes por nitrógeno.
Por ejemplo, Y1 puede representar -OH e Y2 puede representar =O o =S; o
Y1 puede representar -O- e Y2 puede representar =O o =S;
Y1 puede representar =O e Y2 puede representar -CH3, -SH, -ORx o -BH3
Y1 puede representar =S e Y2 puede representar -CH3, ORx o -SH.
El experto en la materia comprenderá que en determinados casos habrá deslocalización entre Y1 e Y2.
Preferentemente, el grupo fosfato modificado es un grupo tiofosfato. Los grupos tiofosfato incluyen bitiofosfato (es decir, donde Y1 representa =S e Y2 representa -S‘) y monotiofosfato (es decir, donde Y1 representa -O' e Y2 representa =S, o donde Y1 representa =O e Y2 representa -S‘). Preferentemente, P es un monotiofosfato. Los inventores han descubierto que los conjugados que tienen grupos tiofosfato en reemplazo de los grupos fosfato tienen una potencia y duración de la acción in vivo mejoradas.
P también puede ser un fosfato de etilo (es decir, donde Y1 representa =O e Y2 representa OCH2CH3).
El sacárido puede seleccionarse para que tenga una afinidad por al menos un tipo de receptor en una célula diana. En concreto, el receptor está en la superficie de una célula hepática de mamífero, por ejemplo, el receptor hepático de asialoglucoproteína (ASGP-R).
Para cualquiera de los aspectos anteriores, el sacárido se puede seleccionar de N-acetilo con uno o más de galactosamina, manosa, galactosa, glucosa, glucosamina y fructosa. Preferentemente, el sacárido son dos moléculas de N-acetil-galactosamina (GalNAc). Los compuestos de la invención pueden tener 3 ligandos que son cada uno preferentemente N-acetil-galactosamina.
"GalNAc" se refiere a 2-(acetilamino)-2-desoxi-D-galactopiranosa, habitualmente denominada en la bibliografía N-acetil-galactosamina. La referencia a "GalNAc" o a "N-acetil-galactosamina" incluye tanto la forma p: 2-(Acetilamino)-2-desoxi-p-D-galactopiranosa como la forma a: 2-(Acetilamino)-2-desoxi-a-D-galactopiranosa. En determinadas realizaciones, tanto la forma p: 2-(Acetilamino)-2-desoxi-p-D-galactopiranosa como la forma a: 2-(Acetilamino)-2-desoxi-a-D-galactopiranosa pueden usarse indistintamente. Preferentemente, los compuestos de la invención comprenden la forma p, 2-(Acetilamino)-2-desoxi-p-D-galactopiranosa.
Figure imgf000027_0001
2-(Acetilamino)-2-desoxi-D-galactopiranosa
Figure imgf000027_0002
2-(Acetilamino)-2-desoxi-p-D-galactopiranosa
Figure imgf000028_0001
2-(Acetilamino)-2-desoxi-a-D-galactopiranosa
Para cualquiera de los compuestos anteriores de fórmula (III), X1 puede ser (-CH2-CH2-O)(-CH2)2-. X1 puede ser (-CH2-CH2-O)2(-CH2)2-. X1 puede ser (-CH2-CH2-O)3(-CH2)2-. Preferentemente, X1 es (-CH2-CH2-O)2(-CH2)2-. Como alternativa, X1 representa alquileno C3-C6. X1 puede ser propileno. X1 puede ser butileno. X1 puede ser pentileno. X1 puede ser hexileno. Preferentemente, el alquilo es un alquileno lineal. En concreto, X1 puede ser butileno.
Para compuestos de fórmula (III), X2 representa un alquilenéter de fórmula -C3H6-O-CH2-, es decir, alcoxi C3-metileno o -CH2CH2CH2OCH2-.
La invención proporciona un ácido nucleico conjugado que tiene una de las siguientes estructuras:
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
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Figure imgf000032_0001
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Los nucleótidos de la primera y/o segunda cadena pueden estar modificados, como se describe en el presente documento. Preferentemente, el ácido nucleico comprende SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 conjugadas con un ligando de fórmula I (como se ha establecido anteriormente), y en donde la primera cadena está modificada con una modificación 2'OMe en los nucleótidos impares y está modificada con un 2'F en los nucleótidos pares, y la segunda cadena está modificada con un 2'OMe en los nucleótidos pares y está modificada con un 2'F en los nucleótidos impares.
Más preferentemente, el ácido nucleico comprende SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18, en donde el ácido nucleico está conjugado con un ligando de fórmula I (como se ha establecido anteriormente), y además en donde el ácido nucleico tiene un patrón de modificación como se muestra a continuación, que se extrae de la Tabla 1 que se proporciona en el presente documento.
Figure imgf000033_0002
en donde las modificaciones específicas están representadas por números
1 = 2'F-dU,
2 = 2'F-dA,
3 = 2'F-dC,
4 = 2'F-dG,
5 = 2'-OMe-rU;
6 = 2'-OMe-rA;
7 = 2'-OMe-rC;
8 = 2'-OMe-rG.
El ligando puede comprender GalNAc, y la Figura 8a o la Figura 8b ilustran mejor la presente invención.
Un grupo enlazante escindible es un enlazador que es estable fuera de la célula pero que se escinde al entrar en una célula diana. La escisión libera las dos partes que el enlazador mantiene unidas.
En una realización preferida, el ácido nucleico de la invención comprende un grupo enlazante escindible que se escinde al menos 10 veces o más, preferentemente al menos 100 veces más rápido en una célula diana o en una primera condición de referencia (que puede, por ejemplo, seleccionarse para imitar o representar condiciones intracelulares) que en la sangre de un sujeto, o en una segunda condición de referencia (que puede, por ejemplo, seleccionarse para imitar o representar las condiciones que se encuentran en la sangre o el suero).
Los grupos de unión escindibles son susceptibles a los agentes de escisión, p. ej., pH, potencial rédox o la presencia de moléculas degradantes. Las moléculas degradantes incluyen enzimas oxidativas o reductoras, agentes reductores (tales como los mercaptanos), esterasas, endosomas o agentes que pueden crear un ambiente ácido, enzimas que pueden hidrolizar o degradar un grupo enlazante escindible con ácido actuando como un ácido general, peptidasas y fosfatasas.
Un grupo enlazante escindible puede ser un enlace disulfuro, que es susceptible al pH.
Un enlazador puede incluir un grupo enlazante escindible que sea escindible por una enzima en particular. El tipo de grupo enlazante escindible incorporado en un enlazador puede depender de la célula diana. Por ejemplo, se prefiere un enlazador que incluye un grupo éster cuando la diana es una célula hepática. Los enlazadores que contienen enlaces peptídicos se pueden utilizar cuando se dirigen a células ricas en peptidasas, como células hepáticas y sinoviocitos.
En general, se puede evaluar la idoneidad de un grupo enlazante escindible candidato probando la capacidad de un agente degradante (o condición) para escindir el grupo enlazante candidato. También será deseable probar la capacidad del grupo enlazante escindible candidato para resistir la escisión en la sangre o cuando está en contacto con otro tejido no diana. En realizaciones preferidas, los compuestos candidatos útiles se escinden al menos 2, 4, 10 o 100 veces más rápido en la célula (o en condiciones in vitro seleccionadas para imitar las condiciones intracelulares) en comparación con la sangre o el suero (o en condiciones in vitro seleccionadas para imitar las condiciones extracelulares).
En un aspecto, el grupo enlazante escindible puede ser un grupo enlazante escindible rédox. El grupo enlazante escindible rédox puede ser un grupo enlazante disulfuro.
En un aspecto, el grupo enlazante puede ser un grupo enlazante escindible a base de fosfato. Las realizaciones preferidas son -O-P(O)(OH)-O-, -O-P(S)(OH)-O-, -O-P(S)(SH)-O-, -S-P(O)(OH)-O-, -OP(O)(OH)-S-, -S-P(O)(OH)-S-, -O-P(S)(OH)-S-, -S-P(S)(OH)-O-, -O-P(O)(H)-O-, -O-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-O-, -S-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-S-, -O-P(S)(H)-S-. Una realización preferida es -O-P(O)(OH)-O-.
En un aspecto, el grupo enlazante escindible puede ser un grupo enlazante escindible con ácido. Preferentemente, el grupo enlazante escindible con ácido se escinde en entornos en los que el pH es 6,5 o inferior, o es escidido por agentes tales como enzimas que pueden actuar como un ácido general. Los ejemplos de grupos enlazantes escindibles con ácido incluyen, entre otros, hidrazonas, ésteres y ésteres de aminoácidos. Los grupos escindibles con ácido pueden tener la fórmula general -C=NN-; C(O)O u -OC(O). Una realización preferida es un grupo enlazante donde el carbono unido al oxígeno del éster (el grupo alcoxi) es un grupo arilo, grupo alquilo sustituido o grupo alquilo terciario tal como dimetilpentilo o t-butilo.
En una realización, el grupo enlazante escindible puede ser un grupo enlazante escindible a base de éster. Los ejemplos de grupos de unión escindibles a base de éster incluyen, pero sin limitación, ésteres de grupos alquileno, alquenileno y alquinileno.
En una realización, el grupo enlazante escindible puede ser un grupo enlazante escindible a base de péptidos. Los grupos enlazantes escindibles a base de péptidos son enlaces peptídicos formados entre aminoácidos para producir oligopéptidos (p. ej., dipéptidos, tripéptidos, etc.) y polipéptidos. El grupo de escisión a base de péptidos generalmente se limita al enlace peptídico (es decir, el enlace amida) formado entre aminoácidos que producen péptidos y proteínas, y no incluye el grupo funcional amida completo. Los grupos enlazantes escindibles a base de péptidos tienen la fórmula general -NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-, donde RA y RB son los grupos R de los dos aminoácidos adyacentes.
El ácido nucleico como se describe en el presente documento puede formularse con un lípido en forma de liposoma. Dicha formulación puede describirse en la materia como un lipoplejo. La formulación con un lípido/liposoma se puede utilizar para ayudar con la administración del ácido nucleico de la invención a las células diana. El sistema de administración de lípidos descrito en el presente documento puede utilizarse como una alternativa a un ligando conjugado. Las modificaciones descritas en el presente documento pueden estar presentes cuando se utiliza el ácido nucleico de la invención con un sistema de administración de lípidos o con un sistema de administración de conjugados con ligandos.
Dicho lipoplejo puede comprender una formulación lipídica que comprende:
i) un lípido catiónico, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;
ii) un esteroide;
iii) un fosfolípido de fosfatidiletanolamina;
iv) un lípido PEGilado.
El lípido catiónico puede ser un lípido catiónico amino.
El lípido catiónico puede tener la fórmula (I):
Figure imgf000035_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde:
X representa O, S o NH;
R1 y R2 representan cada uno independientemente una cadena alquilo C4-C22 lineal o ramificada o una cadena alquenilo C4-C22 lineal o ramificada con uno o más dobles enlaces, en donde la cadena de alquilo o alquenilo contiene opcionalmente un éster, una amida o un disulfuro intermedio;
cuando X representa S o NH, R3 y R4 representan cada uno independientemente hidrógeno, metilo, etilo, una fracción de monoamina o poliamina, o R3 y R4 juntos forman un anillo de heterociclilo;
cuando X representa O, R3 y R4 representan cada uno independientemente hidrógeno, metilo, etilo, una fracción de monoamina o poliamina, o R3 y R4 juntos forman un anillo heterociclilo, o R3 representa hidrógeno y R4 representa C(NH)(NH2).
El lípido catiónico puede tener la fórmula (IA):
Figure imgf000035_0002
El lípido catiónico puede tener la fórmula (IB):
Figure imgf000035_0003
El contenido del componente lipídico catiónico puede ser de aproximadamente el 55 % en moles a aproximadamente el 65 % en moles del contenido total de lípidos de la formulación. En concreto, el componente lipídico catiónico es aproximadamente el 59 % en moles del contenido total de lípidos de la formulación.
Las formulaciones comprenden además un esteroide. El esteroide puede ser colesterol. El contenido del esteroide puede ser de aproximadamente el 26 % en moles a aproximadamente el 35 % en moles del contenido total de lípidos de la formulación lipídica. De manera más particular, el contenido de esteroide puede ser de aproximadamente el 30 % en moles del contenido total de lípidos de la formulación lipídica.
El fosfolípido de fosfatidiletanolamina se puede seleccionar del grupo que consiste en 1,2-difitanoíl-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DPhyPE), 1,2-dioleoíl-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), 1,2-diestearoíl-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DSPE), 1,2-dilauroíl-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DLPE), 1,2-dimiristoíl-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DMPE), 1,2-dipalmitoíl-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DPPE), 1,2-dilinoleoíl-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DLoPE), 1-palmitoíl-2-oleoíl-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (POPE), 1,2-dierucoíl-sn-glicero-3 fosfoetanolamina (DEPE), 1,2-discualeoíl-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DSQPE) y 1-estearoíl-2-linoleoíl-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (SLPE). El contenido del fosfolípido puede ser de aproximadamente el 10% en moles del contenido total de lípidos de la formulación.
El lípido PEGilado se puede seleccionar del grupo que consiste en 1,2-dimiristoíl-sn-glicerol, metoxipolietilenglicol (DMG-PEG) y C16-Ceramida-PEG. El contenido del lípido PEGilado puede ser de aproximadamente el 1 al 5 % en moles del contenido total de lípidos de la formulación.
El contenido del componente lipídico catiónico en la formulación puede ser de aproximadamente el 55 % en moles a aproximadamente el 65% en moles del contenido total de lípidos de la formulación lipídica, preferentemente aproximadamente el 59 % en moles del contenido total de lípidos de la formulación lipídica.
La formulación puede tener una proporción molar de los componentes de i):ii): iii): iv) seleccionada entre 55:34:10:1; 56:33:10:1; 57:32:10:1; 58:31:10:1; 59:30:10:1; 60:29:10:1; 61:28:10:1; 62:27:10:1; 63:26:10:1; 64:25:10:1; y 65:24:10:1.
La formulación puede comprender un lípido catiónico que tiene la estructura
Figure imgf000036_0001
un esteroide que tiene la estructura
Figure imgf000036_0002
un fosfolípido de fosfatidiletanolamina que tiene la estructura
Figure imgf000036_0003
Y un lípido PEGilado que tiene la estructura
Figure imgf000037_0001
Las composiciones de liposomas neutros se pueden formar a partir de, por ejemplo, dimiristoíl-fosfatidilcolina (DMPC) o dipalmitoíl-fosfatidilcolina (DPPC). Las composiciones de liposomas aniónicos se pueden formar a partir de dimiristoíl-fosfatidilglicerol, mientras que los liposomas fusogénicos aniónicos pueden formarse principalmente a partir de dioleoíl-fosfatidiletanolamina (DOPE). Se puede formar otro tipo de composición liposomal a partir de fosfatidilcolina (PC, PhosphatidylCholine) tal como, por ejemplo, PC de soja y PC de huevo. Otro tipo se forma a partir de mezclas de fosfolípidos y/o fosfatidilcolina y/o colesterol.
Un lípido catiónico sintético cargado positivamente, el cloruro de N-[I-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA) se puede utilizar para formar pequeños liposomas que interactúan espontáneamente con el ácido nucleico para formar complejos de lípido y ácido nucleico que son capaces de fusionarse con los lípidos cargados negativamente de las membranas celulares de las células de cultivo de tejidos. Los análogos de DOTMA también se pueden utilizar para formar liposomas.
Los derivados y análogos de los lípidos descritos en el presente documento también se pueden utilizar para formar liposomas.
Un liposoma que contiene un ácido nucleico se puede preparar mediante varios métodos. En un ejemplo, el componente lipídico de un liposoma se disuelve en un detergente para que se formen micelas con el componente lipídico. Por ejemplo, el componente lipídico puede ser un lípido catiónico anfipático o un conjugado de lípido. El detergente puede tener una elevada concentración clave de micelas y puede ser no iónico. Detergentes ilustrativos incluyen colato, CHAPS, octilglucósido, desoxicolato y lauroíl sarcosina. A continuación, se añade la preparación de ácido nucleico a las micelas que incluyen el componente lipídico. Los grupos catiónicos del lípido interactúan con el ácido nucleico y se condensan alrededor del ácido nucleico para formar un liposoma. Después de la condensación, se elimina el detergente, p. ej., mediante diálisis, para producir una preparación liposomal de ácido nucleico.
Si es necesario, se puede añadir un compuesto portador que ayude en la condensación durante la reacción de condensación, p. ej., mediante adición controlada. Por ejemplo, el compuesto portador puede ser un polímero distinto de un ácido nucleico (p. ej., espermina o espermidina). También se puede ajustar el pH para favorecer la condensación.
Las formulaciones de ácido nucleico pueden incluir un tensioactivo. En una realización, el ácido nucleico se formula como una emulsión que incluye un tensioactivo.
Un tensioactivo que no está ionizado es un tensioactivo no iónico. Los ejemplos incluyen ésteres no iónicos, tales como ésteres de etilenglicol, ésteres de propilenglicol, ésteres de glicerilo, etc., alcanolamidas no iónicas, y éteres tales como etoxilatos de alcohol graso, alcoholes propoxilados y polímeros en bloque etoxilados/propoxilados.
Un tensioactivo que lleva una carga negativa cuando se disuelve o dispersa en agua es un tensioactivo aniónico. Los ejemplos incluyen carboxilatos, tales como jabones, lactilatos de acilo, amidas de acilo de aminoácidos, ésteres de ácido sulfúrico tales como sulfatos de alquilo y sulfatos de alquilo etoxilados, sulfonatos tales como sulfonatos de alquilbenceno, isetionatos de acilo, tauratos y sulfosuccinatos de acilo, y fosfatos.
Un tensioactivo que lleva una carga positiva cuando se disuelve o dispersa en agua es un tensioactivo catiónico. Los ejemplos incluyen sales de amonio cuaternario y aminas etoxiladas.
Un tensioactivo que tiene la capacidad de llevar una carga positiva o negativa es un tensioactivo anfótero. Los ejemplos incluyen derivados del ácido acrílico, alquilamidas sustituidas, N-alquilbetaínas y fosfátidos.
Las "micelas" se definen en el presente documento como un tipo particular de ensamblaje molecular en donde las moléculas anfipáticas se organizan en una estructura esférica de modo que todas las partes hidrófobas de las moléculas se dirigen hacia adentro, dejando las partes hidrófilas en contacto con la fase acuosa circundante. La disposición inversa existe si el ambiente es hidrófobo. Se puede formar una micela mediante la mezcla de una solución acuosa del ácido nucleico, un sulfato de alquilo de metal alcalino y al menos un compuesto formador de micelas.
Ejemplos de compuestos formadores de micelas incluyen lecitina, ácido hialurónico, sales farmacéuticamente aceptables de ácido hialurónico, ácido glicólico, ácido láctico, extracto de camomila, extracto de pepino, ácido oleico, ácido linoleico, ácido linolénico, monooleína, monooleatos, monolauratos, aceite de borraja, aceite de onagra, mentol, trihidroxi oxocolanil glicina y sales farmacéuticamente aceptables de la misma, glicerina, poliglicerina, lisina, polilisina, trioleína, éteres de polioxietileno y análogos de los mismos, éteres alquílicos de polidocanol y análogos de los mismos, quenodesoxicolato, desoxicolato y mezclas de los mismos.
Se puede añadir fenol y/o m-cresol a la composición micelar mixta para actuar como estabilizador y conservante. Puede añadirse un agente isotónico tal como glicerina.
Se puede incorporar una preparación de ácido nucleico en una partícula tal como una micropartícula. Las micropartículas se pueden producir mediante desecación por pulverización, liofilización, evaporación, desecación por lecho fluido, desecación al vacío o una combinación de estos métodos.
La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un ácido nucleico o ácido nucleico conjugado de la invención. Las composiciones farmacéuticas pueden usarse como medicamentos o como agentes de diagnóstico, solos o junto con otros agentes. Por ejemplo, un ácido nucleico o ácido nucleico conjugado de la invención se puede combinar con un vehículo de administración (p. ej., liposomas) y excipientes, tales como portadores y diluyentes. También pueden añadirse otros agentes tales como conservantes y estabilizantes. Se conocen en la técnica y dentro del conocimiento del experto métodos para la administración de ácidos nucleicos.
Un ácido nucleico o ácido nucleico conjugado de la invención también se puede administrar junto con otros compuestos terapéuticos, ya sea administrado por separado o simultáneamente, p. ej., en forma de una dosis unitaria combinada. La invención también incluye una composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico o un ácido nucleico conjugado de la invención en un excipiente fisiológicamente/farmacéuticamente aceptable, tal como un estabilizante, conservante, diluyente, tampón y similares.
La composición farmacéutica puede estar especialmente formulada para su administración en forma sólida o líquida. La composición puede formularse para administración oral, administración parenteral (que incluye, por ejemplo, inyección subcutánea, intramuscular, intravenosa o epidural), aplicación tópica, administración intravaginal o intrarrectal, administración sublingual, administración ocular, administración transdérmica o administración nasal. Se prefieren los métodos de administración subcutáneos o intravenosos.
Los expertos en la materia pueden determinar niveles de dosificación para el medicamento y las composiciones farmacéuticas de la invención mediante experimentación rutinaria. En una realización, una dosis unitaria puede contener entre aproximadamente 0,01 mg/kg y aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal de ácido nucleico o ácido nucleico conjugado. Como alternativa, la dosis puede ser de 10 mg/kg a 25 mg/kg de peso corporal, o de 1 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal, o de 0,05 mg/kg a 5 mg/kg de peso corporal, o de 0,1 mg/kg a 5 mg/kg de peso corporal, o de 0,1 mg/kg a 1 mg/kg de peso corporal, o de 0,1 mg/kg a 0,5 mg/kg de peso corporal, o de 0,5 mg/kg a 1 mg/kg de peso corporal. Los niveles de dosificación también se pueden calcular a través de otros parámetros tales como, p. ej., el área de la superficial corporal.
La composición farmacéutica puede ser una suspensión o solución acuosa inyectable estéril o en forma liofilizada. En una realización, la composición farmacéutica puede comprender lipoplejos liofilizados o una suspensión acuosa de lipoplejos. Preferentemente, los lipoplejos comprenden un ácido nucleico de la presente invención. Dichos lipoplejos pueden utilizarse para administrar el ácido nucleico de la invención a una célula diana in vitro o in vivo.
Las composiciones farmacéuticas y los medicamentos de la presente invención pueden administrarse a un sujeto mamífero en una dosis farmacéuticamente eficaz. El mamífero puede seleccionarse entre un ser humano, un primate no humano, un simio o prosimio, un perro, un gato, un caballo, ganado vacuno, un cerdo, una cabra, una oveja, un ratón, una rata, un hámster, un erizo y un conejillo de Indias, u otras especies de relevancia. Por este motivo, el término "TMPRSS6", como se usa en el presente documento, representa ácido nucleico o proteína en cualquiera de las especies mencionadas anteriormente, pero preferentemente este término indica ácidos nucleicos o proteínas humanas.
Un aspecto adicional de la invención se refiere a un ácido nucleico de la invención o a la composición farmacéutica que comprende el ácido nucleico de la invención para su uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad o un trastorno. La enfermedad o el trastorno puede seleccionarse del grupo que comprende hemocromatosis, porfiria cutánea tardía y trastornos de la sangre, tales como p-talasemias o enfermedad de células falciformes, anemia diseritropoyética congénita, síndrome de insuficiencia medular, mielodisplasia y sobrecarga transfusional de hierro. El trastorno puede estar asociado con la sobrecarga de hierro y el trastorno asociado con la sobrecarga de hierro puede ser la enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer o ataxia de Friedreich.
En concreto, algunos aspectos preferidos de la invención incluyen:
Cualquier ácido nucleico como se divulga en el presente documento para su uso en uno o más, o la totalidad, de:
(i) tratamiento de la anemia, determinada opcionalmente de manera adecuada por un aumento de la hemoglobina o del hematocrito, o por una disminución en los reticulocitos como se divulga mediante los métodos del presente documento; y/o
(ii) reducción de la esplenomegalia, determinada opcionalmente por una reducción del tamaño del bazo en peso como se describe mediante los métodos del presente documento: y/o
(iii) mejora de la eritropoyesis ineficaz en el bazo, determinada opcionalmente por la reducción de la proporción relativa de células eritroides inmaduras en el bazo determinada mediante análisis de FACS (Fluorescent-Activated Cell Sorting, clasificación de células activada por fluorescencia), como se describe en el presente documento; y/o (iv) mejora de la maduración de los glóbulos rojos/la eritropoyesis en la médula ósea, determinada opcionalmente por una disminución en la proporción relativa de células progenitoras eritroides y un aumento de las células eritroides desnucleadas determinado mediante análisis de FACS, como se describe en el presente documento.
La invención incluye una composición farmacéutica que comprende una o más moléculas de iARN de acuerdo con la presente invención en un excipiente fisiológicamente/farmacéuticamente aceptable, tal como un estabilizador, conservante, diluyente, tampón y similares.
La composición farmacéutica puede ser una suspensión o solución acuosa inyectable estéril o estar en forma liofilizada.
Las composiciones farmacéuticamente aceptables pueden comprender una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más ácido(s) nucleico(s) en cualquier realización de acuerdo con la invención, tomados solos o formulados con uno o más portadores, excipientes y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables.
Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como portadores farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; (2) almidones, tales como almidón de maíz y almidón de patata; (3) celulosa y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa, etilcelulosa y acetato de celulosa; (4) tragacanto en polvo; (5) malta; (6) gelatina; (7) agentes lubricantes, tales como el estado de magnesio, laurilsulfato de sodio y talco; (8) excipientes, tales como manteca de cacao y ceras para supositorio; (9) aceites, tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; (10) glicoles, tales como propilenglicol; (11) polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; (12) ésteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; (13) agar; (14) agentes tamponadores, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; (15) ácido algínico; (16) agua apirógena; (17) solución salina isotónica; (18) solución de Ringer; (19) alcohol etílico; (20) soluciones de pH tamponado; (21) poliésteres, policarbonatos y/o polianhídridos; (22) agentes de carga, tales como polipéptidos y aminoácidos (23) componente sérico, tal como seroalbúmina, HDL y LDL; y (22) otras sustancias compatibles no tóxicas empleadas en formulaciones farmacéuticas.
Los estabilizadores pueden ser agentes que estabilizan el agente de ácido nucleico, por ejemplo, una proteína que puede formar complejos con el ácido nucleico, quelantes (p. ej., EDTA), sales, Inhibidores de la ARNasa e inhibidores de la ADNasa.
En algunos casos, es deseable retardar la absorción del fármaco por inyección subcutánea o intramuscular para prolongar el efecto del fármaco. Esto puede lograrse mediante el uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo que tiene poca solubilidad en agua. La velocidad de absorción del fármaco depende por tanto de su velocidad de disolución que, a su vez, puede depender del tamaño del cristal y de la forma cristalina. Como alternativa, la absorción retardada de una forma de fármaco administrada por vía parenteral se logra mediante la disolución o suspensión del fármaco en un vehículo oleoso.
El ácido nucleico descrito en el presente documento puede inhibir la expresión de TMPRSS6. El ácido nucleico descrito en el presente documento puede inhibir parcialmente la expresión de TMPRSS6 en una célula. La inhibición puede ser completa, es decir, el 0 % del nivel de expresión de TMPRSS6 en ausencia del ácido nucleico de la invención. La inhibición de la expresión de TMPRSS6 puede ser parcial, es decir, puede ser del 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % de la expresión de TMRPSS6 en ausencia de un ácido nucleico de la invención. La inhibición puede durar 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 10 semanas, 11 semanas, 12 semanas, 13 semanas, 14 semanas o hasta 6 meses, cuando se utiliza en un sujeto, tal como un sujeto humano. Un ácido nucleico o ácido nucleico conjugado de la invención, o composiciones que incluyen el mismo, puede(n) ser para uso en un régimen que comprende tratamientos una o dos veces por semana, cada semana, cada dos semanas, cada tres semanas, cada cuatro semanas, cada cinco semanas, cada seis semanas, cada siete semanas o cada ocho semanas, o en regímenes con frecuencia de dosificación variable, tal como combinaciones de los intervalos antes mencionados. El ácido nucleico puede ser para uso por vía subcutánea, intravenosa o utilizando cualquier otra vía de aplicación tal como oral, rectal o intraperitoneal.
En células y/o sujetos tratados con, o que reciben, el ácido nucleico de la presente invención, la expresión de TMPRSS6 se puede inhibir en comparación con las células y/o sujetos no tratados en un intervalo del 15 % al 100 %, pero al menos aproximadamente el 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 100 %. El nivel de inhibición puede permitir el tratamiento de una enfermedad asociada con la expresión o sobreexpresión de TMPRSS6, o puede permitir una mayor investigación de las funciones del producto del gen TMPRSS6.
La expresión del gen de hepcidina en células y/o sujetos tratados con un ácido nucleico o ácido nucleico conjugado de la invención puede aumentar en comparación con las células y/o sujetos no tratados en al menos aproximadamente 1,2 veces, aproximadamente 1,5 veces, aproximadamente 2 veces, aproximadamente 3 veces, aproximadamente 4 veces o aproximadamente 5 veces, debido a la inhibición total o parcial de la expresión del gen TMPRSS6. Esto puede conducir a que la concentración de hepcidina sérica en los sujetos tratados con un ácido nucleico o un ácido nucleico conjugado de la invención pueda aumentar en comparación con los sujetos no tratados en al menos aproximadamente el 10%, aproximadamente el 25%, aproximadamente el 50%, aproximadamente el 100%, aproximadamente el 150 %, aproximadamente el 200 %, aproximadamente el 250 %, aproximadamente el 300 % o aproximadamente el 500 %.
La concentración de hierro sérico o plasma en sujetos tratados con un ácido nucleico o un ácido nucleico conjugado de la invención puede disminuir en comparación con los sujetos no tratados en al menos aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 80 %. La saturación de transferrina es una prueba médica de laboratorio que mide la cantidad de transferrina que se une al hierro. La saturación de transferrina, medido como un porcentaje, es un valor médico de laboratorio que mide el valor del hierro sérico dividido entre la capacidad total de unión al hierro de la transferrina. La saturación de transferrina en sujetos tratados con un ácido nucleico o un ácido nucleico conjugado de la invención puede disminuir en comparación con los sujetos no tratados en al menos aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 80 %.
Otro aspecto de la invención se refiere al ácido nucleico de la invención en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir una enfermedad o un trastorno, tales como una enfermedad o un trastorno como los enumerados anteriormente.
También se incluye en la invención un método para tratar o prevenir una enfermedad o un trastorno, tal como aquellas enumeradas anteriormente, que comprende la administración de una composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico o un ácido nucleico conjugado de la invención, a un individuo que necesita tratamiento. La composición se puede administrar dos veces por semana, una vez por semana, cada dos semanas, cada tres semanas, cada cuatro semanas, cada cinco semanas, cada seis semanas, cada siete semanas o cada ocho semanas. El ácido nucleico o ácido nucleico conjugado puede ser para uso por vía subcutánea o intravenosa u otras vías de aplicación tales como oral, rectal o intraperitoneal.
En una realización, a un sujeto se le administra una dosis inicial y una o más dosis de mantenimiento de un agente de ácido nucleico. La dosis o dosis de mantenimiento pueden ser iguales o inferiores a la dosis inicial, p. ej., la mitad de la dosis inicial. Las dosis de mantenimiento son, por ejemplo, administradas no más de una vez cada 2, 5, 10 o 30 días. La pauta de tratamiento puede durar un período de tiempo que variará dependiendo de la naturaleza de la enfermedad en particular, su intensidad y el estado general del paciente.
En una realización, la composición incluye una pluralidad de especies de agentes de ácido nucleico. En otra realización, la especie de agente de ácido nucleico tiene secuencias que no se superponen y no son adyacentes a otra especie con respecto a una secuencia diana de origen natural. En otra realización, la pluralidad de especies de agentes de ácido nucleico es específica para diferentes genes diana de origen natural. En otra realización, el agente de ácido nucleico es específico de alelo.
El ácido nucleico o ácido nucleico conjugado de la presente invención también se puede administrar o utilizar junto con otros compuestos terapéuticos, ya sean administrados por separado o simultáneamente, p. ej., como dosis unitaria combinada.
El ácido nucleico o ácido nucleico conjugado de la presente invención se puede producir con métodos habituales en la materia, que incluyen síntesis química o expresión del ácido nucleico in vitro (p. ej., transcripción run-off) o in vivo. Por ejemplo, con síntesis química en fase sólida o con un vector de expresión basado en ácido nucleico que incluye derivados víricos o sistemas de expresión parcial o completamente sintéticos. En una realización, el vector de expresión se puede utilizar para producir el ácido nucleico de la invención in vitro, dentro de un organismo hospedador intermedio o tipo de célula, dentro de un organismo intermedio o final o dentro de la célula diana deseada. Los métodos para la producción (síntesis o transcripción enzimática) del ácido nucleico descrito en el presente documento se conocen por los expertos en la materia.
En realizaciones adicionales de la invención, la invención se refiere a cualquier ácido nucleico, ácido nucleico conjugado, ácido nucleico para su uso, método, composición o uso de acuerdo con cualquier divulgación del presente documento, en donde el ácido nucleico comprende una modificación de vinil-(E)-fosfonato, tal como una modificación de vinil-(E)-fosfonato en 5', preferentemente una modificación de vinil-(E)-fosfonato en 5' junto con una modificación 2'-F en la segunda posición de la primera cadena.
En realizaciones adicionales de la invención, la invención se refiere a cualquier ácido nucleico, ácido nucleico conjugado, ácido nucleico para su uso, método, composición o uso de acuerdo con cualquier divulgación del presente documento, en donde el nucleótido terminal en el extremo 3' de al menos una de la primera cadena y de la segunda cadena es un nucleótido invertido y está unido al nucleótido adyacente a través del carbono 3' del nucleótido terminal y el carbono 3' del nucleótido adyacente y/o el nucleótido terminal en el extremo 5' de al menos una de la primera cadena y de la segunda cadena es un nucleótido invertido y está unido al nucleótido adyacente a través del carbono 5' del nucleótido terminal y el carbono 5' del nucleótido adyacente, opcionalmente en donde
a. el nucleótido invertido 3' y/o 5' de la primera y/o segunda cadena está unido al nucleótido adyacente a través de un grupo fosfato mediante un enlace fosfodiéster; o
b. el nucleótido invertido 3' y/o 5' de la primera y/o segunda cadena está unido al nucleótido adyacente a través de un grupo fosforotioato o
c. el nucleótido invertido 3' y/o 5' de la primera y/o segunda cadena está unido al nucleótido adyacente a través de un grupo fosforoditioato.
En realizaciones adicionales de la invención, la invención se refiere a cualquier ácido nucleico, ácido nucleico conjugado, ácido nucleico para su uso, método, composición o uso de acuerdo con cualquier divulgación del presente documento, en donde el ácido nucleico comprende un enlace fosforoditioato,
opcionalmente en donde el enlace es entre los 2 nucleótidos más 5' y/o los 2 nucleótidos más 3' de la segunda cadena, y/o
opcionalmente en donde el ácido nucleico adicionalmente no comprende ningún enlace fosforotioato interno.
En realizaciones adicionales de la invención, la invención se refiere a una secuencia de ácido nucleico divulgada en el presente documento, en donde la primera cadena y/o la segunda cadena del ácido nucleico comprende al menos un primer y un segundo tipo de ribonucleótido modificado, y en donde hay más del primer tipo de ribonucleótido modificado que del segundo tipo de nucleótido modificado (por ejemplo, más modificación O-metilo en 2' que modificación fluoro en 2'), bien contando en cada cadena individualmente, o tanto por la primera como por la segunda cadena.
Para evitar dudas, el ácido nucleico puede tener más de dos tipos de modificación.
Otra realización de la invención se refiere a cualquier secuencia de ácido nucleico divulgada en el presente documento, en donde más del 50 % de los nucleótidos de la primera y/o segunda cadena comprenden una modificación O-metilo en 2', tal como más del 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 % u 85 %, o más, de la primera y/o segunda cadena comprenden una modificación O-metilo en 2', preferentemente medida como un porcentaje de los nucleótidos totales tanto de la primera como de la segunda cadena.
Otra realización de la invención se refiere a cualquier secuencia de ácido nucleico divulgada en el presente documento en donde más del 50 % de los nucleótidos de la primera y/o segunda cadena comprenden una modificación de ARN natural, tal como en donde más del 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 % u 85 % o más de la primera y/o segunda cadena comprende dicha modificación, preferentemente medida como un porcentaje de los nucleótidos totales tanto de la primera como de la segunda cadena. Las modificaciones naturales adecuadas incluyen, así como 2-O'-metilo, otras modificaciones de azúcar en 2', en particular, una modificación 2'-H que da lugar a un nucleótido de ADN.
Otra realización de la invención se refiere a cualquier secuencia de ácido nucleico divulgada en el presente documento que comprende no más del 20 %, tal como no más del 15 %, tal como no más del 10 %, de nucleótidos que tienen modificaciones en 2' que no son modificaciones O-metilo en 2' en la primera y/o segunda cadena, preferentemente como un porcentaje de los nucleótidos totales tanto de la primera como de la segunda cadena.
Otra realización de la invención se refiere a cualquier secuencia de ácido nucleico divulgada en el presente documento que comprende no más del 20 %, (tal como no más del 15 % o no más del 10 %) de modificaciones fluoro en 2' en la primera y/o segunda cadena, preferentemente como porcentaje de los nucleótidos totales de ambas cadenas.
El ácido nucleico puede ser cualquiera de los divulgados en el presente documento.
A continuación, se describirá la invención con referencia a las siguientes figuras y ejemplos no limitantes en los que:
la Figura 1 muestra los resultados de una selección de moléculas de iARN para la inhibición de la expresión de TMPRSS6 en células Hep3B humanas;
la Figura 2 muestra la respuesta a la dosis de moléculas de iARN de TMPRSS6 en células Hep3B humanas; la Figura 3 muestra la reducción de la expresión de TMPRSS6 en tejido hepático de ratón mediante diferentes dosis de moléculas de ARNip-GalNAc;
la Figura 4 muestra la duración de la inhibición del gen diana TMPRSS6 por moléculas de ARNip de TMPRSS6 y la inducción de la expresión de ARNm de HAMP en ratones;
la Figura 5 muestra que la inhibición de la expresión de TMPRSS6 mediante el tratamiento con moléculas de ARNip de TMPRSS6 reduce los niveles de hierro en el suero durante un tiempo prolongado;
la Figura 6 muestra la reducción de la expresión de TMRPSS6 en hepatocitos primarios de ratón mediante la absorción mediada por receptor de moléculas de iARN conjugadas con GalNAc;
la Figura 7 muestra las moléculas de iARN conjugadas con GalNAc utilizadas en los ejemplos 1, 3, 4, 26 a 31 y 34 a 38;
las Figuras 8a, 8b y 8c muestran la estructura de los ligandos de GalNAc denominados en el presente documento respectivamente GN, GN2 y GN3 con los que se conjugaron los oligonucleótidos (véase también debajo de esta nomenclatura de los ejemplos, donde TMPRSS6 hcm-9 está conjugado con cada uno de GN, GN2 y g N3); la Figura 9 muestra la reducción de la expresión de TMPRSS6 por diferentes variantes de modificación de ARNip en células Hep3B humanas;
la Figura 10 muestra la reducción de la expresión de TMPRSS6 por diferentes conjugados de ARNip-GalNAc mediante la absorción mediada por receptor;
la Figura 11 muestra la reducción de TMPRSS6 y la inducción de la expresión de HAMP por diferentes conjugados de ARNip-GalNAc en ratones;
la Figura 12 muestra las secuencias y modificaciones de las moléculas de ARNip-GalNAc de los Ejemplos 8, 9 y 10;
la Figura 13 muestra la reducción de la expresión de TMPRSS6 en el tejido hepático y la reducción de los niveles de hierro sérico en ratones en diferentes momentos después de una inyección única con conjugados de ARNip; la Figura 14 muestra la reducción de los niveles de ARNm de TMPRSS6 en el hígado y la reducción de los niveles de hierro sérico en ratones mediante diferentes dosis de moléculas de ARNip conjugadas con GalNAc;
la Figura 15 muestra el efecto de diferentes patrones de modificación sobre la actividad de una molécula de ARNip en células Hep3B humanas;
la Figura 16 muestra el efecto de diferentes variantes de modificación de moléculas de ARNip conjugadas con GalNAc sobre la inhibición de la expresión de TMPRSS6 en células Hep3B humanas;
la Figura 17 muestra el efecto de una variante de modificación de un ARNip conjugado con GalNAc sobre la inhibición de la expresión de TMPRSS6 en hepatocitos primarios de ratón mediante la absorción mediada por receptor;
la Figura 18 muestra la reducción de la expresión de TMPRSS6 por diferentes variantes de modificación de ARNip en células Hep3B humanas;
la Figura 19 muestra la influencia de los nucleótidos A y G invertidos sobre la actividad de iARN en células Hep3B humanas;
la Figura 20 muestra la influencia de los nucleótidos de ARN invertidos en la estabilidad del ARNip;
la Figura 21 muestra la influencia de los nucleótidos de ARN invertidos sobre la actividad de ARNip en células Hep3B humanas;
la Figura 22 muestra la influencia de los nucleótidos de ARN invertidos sobre la actividad de iARN en células Hep3B humanas;
la Figura 23 muestra la influencia de los nucleótidos de ARN invertidos sobre la actividad de los ARNip conjugados con GalNAc en hepatocitos primarios de ratón mediante la absorción mediada por receptor;
la Figura 24 muestra el efecto del enlace fosforoditioato sobre la estabilidad de las moléculas de ARNip conjugadas con GalNAc;
la Figura 25 muestra el efecto del enlace fosforoditioato sobre la actividad de una molécula de ARNip conjugada con GalNAc sobre la expresión de TMPRSS6 en hepatocitos primarios de ratón;
la Figura 26 muestra el efecto del enlace fosforoditioato sobre la estabilidad de una molécula de ARNip conjugada con GalNAc;
la Figura 27 muestra la inhibición de la expresión de TMPRSS6 en hepatocitos primarios de ratón por un conjugado de ARNip-GalNAc que contiene enlaces fosforoditioato;
la Figura 28 muestra la reducción de la expresión de TMPRSS6 por diferentes dosis de ARNip-GalNAc en un modelo animal para hemocromatosis hereditaria;
la Figura 29 muestra el aumento de los niveles de hepcidina sérica por diferentes dosis de ARNip-GalNAc en un modelo animal para la hemocromatosis hereditaria;
la Figura 30 muestra la reducción de los niveles de hierro sérico por diferentes dosis de ARNip-GalNAc en un modelo animal para la hemocromatosis hereditaria;
la Figura 31 muestra la reducción de la saturación de transferrina por diferentes dosis de ARNip-GalNAc en un modelo animal para la hemocromatosis hereditaria;
la Figura 32 muestra el aumento de la capacidad de fijación de hierro insaturado por diferentes dosis de ARNip-GalNAc en un modelo animal para la hemocromatosis hereditaria;
la Figura 33 muestra la reducción de los niveles de hierro tisular por los ARNip-GalNAc en un modelo animal para la hemocromatosis hereditaria;
la Figura 34 muestra la reducción de los niveles de ARNm de TMPRSS6 humanos en células Hep3B mediante la administración liposomal de 43 ARNip adicionales;
la Figura 35 muestra las curvas de respuesta a la dosis de diferentes ARNip para la inhibición de la expresión de TMPRSS6 en células Hep3B;
la Figura 36 muestra la reducción de la expresión de TMPRSS6 en hepatocitos humanos primarios mediante la absorción mediada por receptor de conjugados de ARNip-GalNAc a diferentes concentraciones;
la Figura 37 muestra el aumento de los valores de hematocrito en un modelo de roedor para la • -talasemia intermedia mediante el tratamiento con conjugados de ARNip-GalNAc;
la Figura 38 muestra la reducción de las amplitudes de distribución de los glóbulos rojos en un modelo de roedor para la • - talasemia intermedia mediante el tratamiento con conjugados de ARNip-GalNAc.
La Figura 39 muestra la reducción en la proporción de reticulocitos en la sangre de un modelo de roedor para la • - talasemia intermedia mediante el tratamiento con conjugados de ARNip-GalNAc;
la Figura 40 muestra la reducción de especies reactivas del oxígeno en glóbulos rojos de un modelo de roedor para la • -talasemia intermedia mediante el tratamiento con conjugados de ARNip-GalNAc.
La Figura 41 muestra que el ARNip de TMPRSS6 con GalNAc aumenta los niveles de hemoglobina en un modelo de roedor para la • - talasemia intermedia.
La Figura 42 muestra que TMPRSS6 con GalNAc reduce la esplenomegalia en un modelo de roedor para la • -talasemia intermedia.
La Figura 43 muestra que TMPRSS6 con GalNAc mejora la maduración de glóbulos rojos en la médula ósea. La Figura 44 muestra que TMPRSS6 con GalNAc reduce la eritropoyesis ineficaz en el bazo.
La Figura 45 a y b muestra las curvas de respuesta a la dosis de los conjugados de ARNip contra TMPRSS6 en hepatocitos humanos primarios.
La Figura 46 muestra la inhibición de la expresión de ARNm de TMPRSS6 por conjugados de ARNip en hepatocitos humanos primarios.
La Figura 47 muestra las secuencias y el patrón de modificación de los conjugados de ARNip-GalNAc que se probaron para determinar la inhibición de la expresión de TMPRSS6 en hepatocitos humanos primarios.
La Figura 48 muestra secuencias específicas de ácidos nucleicos utilizados en el Ejemplo 44.
La Figura 49 muestra la absorción mediada por receptor en hepatocitos primarios de ratón por conjugados de ARNip-GalNAc dirigidos a TMPRSS6 que contienen diferentes químicas de estabilización de extremos (fosforotioato, fosforoditioato, fosfodiéster).
La Figura 50 muestra la estabilidad sérica de los conjugados de ARNip-GalNAc con fosforotioatos, fosforoditioatos y fosfodiésteres en posiciones terminales y en la fracción de GalNAc.
La Figura 51 muestra la inhibición de la expresión del gen TMPRSS6 en hepatocitos murinos primarios 24 h después del tratamiento con ARNip de TMPRSS6 portador de vinil-(E)-fosfonato 2'OMe-uracilo en la posición 5' de la cadena antisentido y dos enlaces de fosforotioato entre los tres primeros nucleótidos (X0204), vinil-(E)-fosfonato 2'OMe-uracilo en la posición 5' de la cadena antisentido y enlaces fosfodiéster entre los tres primeros nucleótidos (X0205), (X0139) o tetrámero (X0140)) o un agrupamiento de GalNAc trimérico similar a un árbol (X0004) o un ARNip-GalNAc no dirigido (X0028) a las concentraciones indicadas o no tratadas (NT).
La Figura 52 muestra la estabilidad sérica de los conjugados de ARNip frente a un control positivo menos estabilizado para la degradación de nucleasas.
Ejemplos
Ejemplo 1
Se sintetizaron ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, mediante oligonucleótidos como se establece en las tablas a continuación.
El método de síntesis fue el siguiente, tomando como ejemplo una de las secuencias de la invención: STS012 (GN-TMPRSS6-hcm-9)
Primera cadena
5'mA (ps) fA (ps) mC fC mA fG mA fA mG fA mA fG mC fA mG fG mU (ps) fG (ps) mA 3'
Segunda cadena
5'[ST23 (ps)]3 trebler largo (ps) fU mC fA mC fC mU fG mC fU mU fC mU fU mC fU mG fG (ps) mU (ps) fU 3'
fN (N = A, C, G, U) indica 2'Fluoro, 2'-desoxinucleósidos
mN (N = A, C, G, U) indica nucleósidos 2'O-metilo
(ps) indica un enlace fosforotioato
ST23 es una fosforamidita GalNAc C4 (componentes de la estructura como se muestra a continuación)
Figure imgf000044_0001
Trebler largo (STKS)
Un ejemplo adicional es GN2-TMPRSS6-hcm-9 (STS12009L4):
Primera cadena
5'mA (ps) fA (ps) mC fC mA fG mA fA mG fA mA fG mC fA mG fG mU (ps) fG (ps) mA 3'
Segunda cadena
5'[ST23 (ps)]3 ST41 (ps) fU mC fA mC fC mU fG mC fU mU fC mU fU mC fU mG fG (ps) mU (ps) fU 3'
fN (N = A, C, G, U) indica 2'Fluoro, 2'-desoxinucleósidos
mN (N = A, C, G, U) indica nucleósidos 2'O-metilo
(ps) indica un enlace fosforotioato
ST23 es como se ha explicado anteriormente.
ST41 es el siguiente (y como se describe en el documento WO2017/174657):
Figure imgf000044_0002
Todos los oligonucleótidos se obtuvieron de un fabricante comercial de oligonucleótidos (Eurogentech, Bélgica; Biospring, Alemania) o se sintetizaron en un sintetizador oligopiloto AKTA mediante química de fosforamidita convencional. Se utilizaron soportes sólidos disponibles en el mercado y fosforamiditas de ARN 2'O-Metilo, fosforamiditas de ADN 2'Fluoro (todas de protección convencional) y fosforamidita trebler larga disponible en el mercado (Glen research). La síntesis se realizó utilizando soluciones 0,1 M de la fosforamidita en acetonitrilo seco y se utilizó benciltiotetrazol (BTT) como activador (0,3 M en acetonitrilo). Todos los demás reactivos eran reactivos convencionales disponibles comercialmente.
La síntesis de oligonucleótidos que contenían PS2 se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Glen Research, AM Biotech). La fosfoamidita de vinil-(E)-fosfonato 2'OMe-uracilo se sintetizó y utilizó en la síntesis de oligonucleótidos de acuerdo con los métodos publicados en la bibliografía (Haraszti et al., Nuc. Acids Res., 45(13), 2017, 7581-7592).
Conjugación del sinthon GalNAc (ST23) se consiguió mediante el acoplamiento de la fosforamidita respectiva al extremo 5' de la oligocadena en condiciones convencionales de acoplamiento de fosforamidita. Los fosforotioatos se introdujeron mediante reactivos de tiolación convencionales disponibles en el mercado (EDITH, tecnologías Link).
Las cadenas sencillas se escindieron de CPG utilizando metilamina. Cuando se utilizaron nucleósidos de ARN protegidos por TBDMS, se realizó un tratamiento adicional con TEA*3HF para eliminar la protección de sililo. El oligonucleótido en bruto resultante se purificó mediante cromatografía de intercambio iónico (Resource Q, 6 ml, GE Healthcare) en un sistema de HPLC AKTA Pure utilizando un gradiente de cloruro de sodio. Las fracciones que contenían producto se agruparon, se desalaron en una columna de exclusión por tamaño (Zetadex, EMP Biotech) y se liofilizaron.
Para la hibridación, se disolvieron en agua cantidades equimolares de las cadenas individuales respectivas y se calentaron a 80 °C
durante 5 min. Después de enfriar, se liofilizó la estructura bicatenaria resultante. Las secuencias de los ácidos nucleicos resultantes (ARNip) se exponen en la Tabla 1.
Tabla 1
Figure imgf000045_0001
Tabla 1: secuencias de ácido nucleico probadas para determinar la inhibición de la expresión de TMPRSS6. Los ácidos nucleicos fueron sintetizados por Biospring, Frankfurt. Las modificaciones de los nucleótidos se representan con los siguientes números (columna 4), 1 = 2'F-dU, 2 = F'-dA, 3 = 2'F-dC, 4 = 2'F-dG, 5 = 2'-OMe-dU; 6 = 2'-OMe-rA; 7 = 2'-OMe-dC; 8 = 2'-OMe-dG.
Tabla 2
Figure imgf000046_0002
Tabla 2 - la posición inicial de cada secuencia de ácido nucleico dentro de la secuencia de ARNm de TMPRSS6 Ref NM_001289000.1.
Selección para la inhibición de la expresión de TMPRSS6 en células Hep3B humanas.
Se sembraron células en placas a una densidad celular de 80.000 células por placa de 6 pocillos. Al día siguiente, las células se transfectaron con ácido nucleico 20 nM (enumerado en la Tabla 1) y AtuFECT a 1 pg/ml (formulación 50:50 de lípido catiónico Atufect01 y lípido fusogénico DPhyPE). Dos días después de la transfección, se lisaron las células y se determinaron los niveles de ARNm de TMPRSS6 mediante q-RT-PCR utilizando los amplicones de la Tabla 3. Los niveles de ARNm de TMPRSS6 se normalizaron con respecto a los niveles de expresión del gen constitutivo PTEN. Los ácidos nucleicos para la luciferasa y PTEN se utilizaron como ácidos nucleicos de control no dirigidos. Los resultados se muestran en la Figura 1.
Tabla 3
Figure imgf000046_0001
continuación
Figure imgf000047_0001
Tabla 3: secuencias de conjuntos de amplicón de TMPRSS6, Actina, PTEN y HAMP utilizados para medir los niveles de ARNm de los respectivos genes.
Ejemplo 2
Respuesta a la dosis de ácidos nucleicos de TMPRSS6 para la inhibición de la expresión de TMPRSS6 en células Hep3B humanas.
Se sembraron células en placas a una densidad celular de 150.000 células por placa de 6 pocillos. Al día siguiente, las células se transfectaron con 1 |jg/ml de AtuFECT (formulación 50:50 de lípido catiónico Atufect01 y lípido fusogénico DPhyPE) y diferentes cantidades de ácidos nucleicos TMPRSS6 (30; 10; 3; 1; 0,3; 0,1, 0,003 nM, respectivamente) como se muestra en el eje X del gráfico de la Figura 2. Para muestras de control no dirigidas, las células se transfectaron con ácido nucleico 30 y 10 nM para luciferasa. Dos días después de la transfección, se lisaron las células y se determinaron los niveles de ARNm mediante q-RT-PCR. Los niveles de ARNm de TMPRSS6 se normalizaron con respecto a los niveles de expresión del gen constitutivo PTEN. La mayor reducción de la expresión del ARNm de TMPRSS6 se observó con el ácido nucleico TMPRSS6-hcm9. La transfección con ácido nucleico de luciferasa no afectó a los niveles de ARNm de TMPRSS6. Los resultados se muestran en la Figura 2. Las secuencias de moléculas de iARN se representan en la Tabla 1.
Ejemplo 3
Inhibición de la expresión de TMPRSS6 en tejido hepático mediante diferentes dosis de ácidos nucleicos con GalNAc.
Los ratones C57/BL6 se trataron con una dosis única de 10, 3 o 1 mg/kg de conjugados de ácido nucleico con GalNAc mediante administración subcutánea. La secuencia y las modificaciones de los respectivos conjugados de ARNip se muestran en la Figura 7. Los ARNip se conjugan con el enlazador GalNAc (GN) representado en la Figura 8a y descrito en la misma. Los grupos de control se trataron con solución salina isotónica o con conjugado de control no dirigido, GN-TTR-hc, respectivamente. La expresión del gen diana en tejido hepático se evaluó mediante qRT PCR tres días después de la inyección subcutánea de los conjugados. Se aisló el ARN total de muestras de tejido congeladas instantáneamente y se realizó la qRT-PCR como se ha descrito anteriormente (Kuhla et al. 2015, Apoptosis Vol 4, 500-11). Las sondas TaqMan que se utilizaron se muestran en la Tabla 3. Los resultados se muestran en la Figura 3.
Ejemplo 4
Duración de la inhibición del gen diana por moléculas de iARN de TMPRSS6.
Los ratones se trataron con 3 mg/kg de moléculas de iARN de TMPRSS6 con GalNAc mediante inyección subcutánea. La secuencia y las modificaciones de los respectivos conjugados de ARNip se muestran en la Figura 7. Se evaluó la expresión del ARNm diana en tejido hepático los días 7, 14, 21, 27, 34 o 41 después del tratamiento (días posteriores a la inyección, dpi). Se observa una reducción de la expresión de TMPRSS6 en el hígado hasta el día 41 después de la inyección. La expresión del ARNm de HAMP (hepcidina) aumenta en el hígado de ratones tratados con la molécula de iARN TMPRSS6 con GN. Los resultados se muestran en la Figura 4.
Ejemplo 5
La inhibición de la expresión de TMPRSS6 mediante el tratamiento con ARNip de TMPRSS6 reduce los niveles de hierro en la sangre.
Se analizaron los niveles de hierro en suero 7, 14, 21, 27, 34 y 41 días después de que los ratones fueran tratados por vía subcutánea con 3 mg/kg de conjugados de ácido nucleico y GalNAc. Los niveles de hierro sérico se redujeron hasta 41 días después de la inyección (dpi 41). La secuencia y las modificaciones de los respectivos conjugados de ARNip se muestran en la Figura 7. Los resultados se muestran en la Figura 5.
Ejemplo 6
Inhibición de la expresión de TMPRSS6 mediante la absorción mediada por receptor.
Se sembraron hepatocitos primarios de ratón en placas recubiertas de colágeno y se incubaron con conjugados de ARNip diluidos en medio de cultivo celular a una concentración de 100 nM a 0,03 nM como se indica. 24 horas después de exponer las células a los conjugados de ARNip, se extrajo el ARN total y se cuantificó la expresión de TMPRSS6 mediante qRT-PCR Taqman. Los niveles de ARNm de TMPRSS6 se normalizaron con respecto a los niveles de ARNm de actina. Se observó una inhibición dependiente de la dosis de la expresión de TMPRSS6 por ambos conjugados de ARNip de TMPRSS6 y GalNAc. El conjugado GN2-Luc-ARNip1 y GalNAc (GN2-Luc) se usó como control no dirigido y no afectó a la expresión del ARNm de TMPRSS6. La secuencia y las modificaciones de los respectivos conjugados de ARNip se representan en la Figura 7. Los resultados se muestran en la Figura 6.
Ejemplo 7
Se sintetizaron más ARNip de TMPRSS6, de acuerdo con el método descrito anteriormente. Las secuencias y modificaciones se muestran en la siguiente Tabla 4:
Variantes de modificación de un ARNip dirigido a TMPRSS6 (ID de secuencia 17 y 18). Para cada estructura bicatenaria, la primera secuencia (cadena A) se enumera arriba y la segunda secuencia (cadena B) abajo. Todas las secuencias corresponden a SEQ ID NO: 17 (arriba) y SEQ ID NO: 18 (abajo). Los códigos de modificación se enumeran al final de la Tabla 4.
Estructura bicatenaria
Tabla 4
ID cadena A cadena B secuencia (5'-3') secuencia y química (5'-3') TMP01 TMPJH01A aaccagaagaagcagguga 6273646282647284546
TMPJH01B ucaccugcuucuucugguu 1727354715351718451 TMP02 TMPJH02A aaccagaagaagcagguga 2237242282243284142
TMPJH02B ucaccugcuucuucugguu 1723314715355754815 TMP03 TMPJH03A aaccagaagaagcagguga 2273282646283248182
TMPJH03B ucaccugcuucuucugguu 5363718351715354815 TMP04 TMPJH04A aaccagaagaagcagguga 2273282646683248182
TMPJH03B ucaccugcuucuucugguu 5363718351715354815 TMP05 TMPJH01A aaccagaagaagcagguga 6273646282647284546
TMPJH03B ucaccugcuucuucugguu 5363718351715354815 TMP06 TMPJH05A aaccagaagaagcagguga 2273242242643244542
TMPJH05B ucaccugcuucuucugguu 5727354315355754455 TMP07 TMPJH06A aaccagaagaagcagguga 2277646242643244542
TMPJH05B ucaccugcuucuucugguu 5727354315355754455 TMP08 TMPJH07A aaccagaagaagcagguga 2277686242643244542
TMPJH05B ucaccugcuucuucugguu 5727354315355754455 TMP09 TMPJH08A aaccagaagaagcagguga 2273242246687244542
TMPJH05B________ ucaccugcuucuucugguu 5727354315355754455 TMP10 TMPJH09A aaccagaagaagcagguga 2273242682687244542
TMPJH05B ucaccugcuucuucugguu 5727354315355754455 TMP11 TMPJH10A aaccagaagaagcagguga 2273242242643284586
TMPJH05B ucaccugcuucuucugguu 5727354315355754455 (continuación)
ID cadena A cadena B secuencia (5'-3') secuencia y química (5'-3') TMP12 TMPJH11A aaccagaagaagcagguga 2273242242643288586 TMPJH05B ucaccugcuucuucugguu 5727354315355754455 TMP13 TMPJH12A aaccagaagaagcagguga 2273242246687284586 TMPJH05B ucaccugcuucuucugguu 5727354315355754455 TMP14 TMPJH13A aaccagaagaagcagguga 6277646246687284586 TMPJH13B ucaccugcuucuucugguu 5767354315755758855 TMP15 TMPJH14A aaccagaagaagcagguga 2273282282283284182 TMPJH14B ucaccugcuucuucugguu 5327318315315318415 TMP16 TMPJH15A aaccagaagaagcagguga 2273282282643284182 TMPJH14B ucaccugcuucuucugguu 5327318315315318415 TMP17 TMPJH16A aaccagaagaagcagguga 2237242242247244582 TMPJH16B ucaccugcuucuucugguu 1723314355311358411 TMP18 TMPJH10A aaccagaagaagcagguga 2273242242643284586 TMPJH01B ucaccugcuucuucugguu 1727354715351718451 TMP19 TMPJH10A aaccagaagaagcagguga 2273242242643284586 TMPJH02B ucaccugcuucuucugguu 1723314715355754815 TMP20 TMPJH10A aaccagaagaagcagguga 2273242242643284586 TMPJH03B ucaccugcuucuucugguu 5363718351715354815 ID de ructura
bicat. la es
enari .t
a cad .ena A . cad .enaB secuencia (5'-3') secuencia y química (5'-3') TMP21 TMPJH10A aaccagaagaagcagguga 2273242242643284586 TMPJH13B ucaccugcuucuucugguu 5767354315755758855 TMP22 TMPJH10A aaccagaagaagcagguga 2273242242643284586 TMPJH14B ucaccugcuucuucugguu 5327318315315318415 TMP23 TMPJH10A aaccagaagaagcagguga 2273242242643284586 TMPJH16B ucaccugcuucuucugguu 1723314355311358411 TMP24 TMPJH02A aaccagaagaagcagguga 2237242282243284142 TMPJH01B ucaccugcuucuucugguu 1727354715351718451 TMP25 TMPJH02A aaccagaagaagcagguga 2237242282243284142 TMPJH03B ucaccugcuucuucugguu 5363718351715354815 TMP26 TMPJH02A aaccagaagaagcagguga 2237242282243284142 TMPJH05B ucaccugcuucuucugguu 5727354315355754455 TMP27 TMPJH02A aaccagaagaagcagguga 2237242282243284142 TMPJH13B ucaccugcuucuucugguu 5767354315755758855 TMP28 TMPJH02A aaccagaagaagcagguga 2237242282243284142 TMPJH14B ucaccugcuucuucugguu 5327318315315318415 TMP29 TMPJH02A aaccagaagaagcagguga 2237242282243284142 TMPJH16B ucaccugcuucuucugguu 1723314355311358411 TMP30 TMPJH13A aaccagaagaagcagguga 6277646246687284586 TMPJH01B ucaccugcuucuucugguu 1727354715351718451 TMP31 TMPJH13A aaccagaagaagcagguga 6277646246687284586 TMPJH02B ucaccugcuucuucugguu 1723314715355754815 (continuación)
ID de la estructura
bicatenaria cadena A cadena B secuencia (5’-3’) secuencia y química (5’-3’) TMP32 TMPJH13A aaccagaagaagcagguga 6277646246687284586 TMPJH03B ucaccugcuucuucugguu 5363718351715354815 TMP33 TMPJH13A aaccagaagaagcagguga 6277646246687284586 TMPJH05B ucaccugcuucuucugguu 5727354315355754455 TMP34 TMPJH13A aaccagaagaagcagguga 6277646246687284586 TMPJH14B ucaccugcuucuucugguu 5327318315315318415 TMP35 TMPJH13A aaccagaagaagcagguga 6277646246687284586 TMPJH16B ucaccugcuucuucugguu 1723314355311358411 TMP36 TMPJH10A aaccagaagaagcagguga 2273242242643284586 TMPJH01B ucaccugcuucuucugguu 1727354715351718451 TMP37 TMPJH17A aaccagaagaagcagguga 2273282242643284586 TMPJH01B ucaccugcuucuucugguu 1727354715351718451 TMP38 TMPJH18A aaccagaagaagcagguga 6277682242643288142 TMPJH01B ucaccugcuucuucugguu 1727354715351718451 TMP39 TMPJH19A aaccagaagaagcagguga 6277682242643288586 TMPJH01B ucaccugcuucuucugguu 1727354715351718451 TMP40 TMPJH20A aaccagaagaagcagguga 2233282242643284142 TMPJH01B ucaccugcuucuucugguu 1727354715351718451 TMP41 TMPJH21A aaccagaagaagcagguga 2277282242643284586 TMPJH01B ucaccugcuucuucugguu 1727354715351718451 TMP42 TMPJH22A aaccagaagaagcagguga 2273282642643284586 TMPJH01B ucaccugcuucuucugguu 1727354715351718451 TMP43 TMPJH23A aaccagaagaagcagguga 2273282282643284586 TMPJH01B ucaccugcuucuucugguu 1727354715351718451 TMP44 TMPJH24A aaccagaagaagcagguga 2273282246643284586 TMPJH01B ucaccugcuucuucugguu 1727354715351718451 TMP45 TMPJH25A aaccagaagaagcagguga 2273282242683284586 TMPJH01B ucaccugcuucuucugguu 1727354715351718451 TMP46 TMPJH26A aaccagaagaagcagguga 2273282242647284586 TMPJH01B ucaccugcuucuucugguu 1727354715351718451 TMP47 TMPJH01A aaccagaagaagcagguga 6273646282647284546 TMPJH05B ucaccugcuucuucugguu 5727354315355754455 TMP48 TMPJH01A aaccagaagaagcagguga 6273646282647284546 TMPJH27B ucaccugcuucuucugguu 5727754715355754855 TMP49 TMPJH01A aaccagaagaagcagguga 6273646282647284546 TMPJH28B ucaccugcuucuucugguu 1723314311351714411 TMP50 TMPJH01A aaccagaagaagcagguga 6273646282647284546 TMPJH29B ucaccugcuucuucugguu 5767354315355754455 TMP51 TMPJH01A aaccagaagaagcagguga 6273646282647284546 (continuación)
ID de la estructura
bicatenaria cadena A cadena B secuencia (5'-3') secuencia y química (5'-3')
TMPJH30B ucaccugcuucuucugguu 5727754315355754455 TMP52 TMPJH01A aaccagaagaagcagguga 6273646282647284546
TMPJH31B ucaccugcuucuucugguu 5727358315355754455
TMP53 TMPJH01A aaccagaagaagcagguga 6273646282647284546
TMPJH32B ucaccugcuucuucugguu 5727354315755754455
TMP54 TMPJH01A aaccagaagaagcagguga 6273646282647284546
TMPJH33B ucaccugcuucuucugguu 5727354315355758455
1 = 2'F-dU
2 = 2'F-dA
3 = 2'F-dC
4 = 2'F-dG
5 = 2'OMe-rU
6 = 2'OMe-rA
7 = 2'OMe-rC
8 = 2'OMe-rG
Tabla 4: las modificaciones están representadas por números que se muestran en las filas de abajo de la tabla, y para cada estructura bicatenaria, la primera cadena está arriba y la segunda cadena está abajo.
Se probaron diferentes variantes de modificación de un ARNip dirigido a TMPRSS6 en células Hep3B humanas. Los ARNip dirigidos a PTEN y Luciferasa se utilizaron como controles no relacionados y no dirigidos, respectivamente. Todos los ARNip se transfectaron con 1 pg/ml de Atufect a 1 nM (0,1 nM cuando se indica). El ARN total se extrajo 48 h después de la transfección y los niveles de ARNm de TMPRSS6 se cuantificaron mediante qRT-PCR Taqman. Los niveles de ARNm de TMPRSS6 se normalizaron con respecto a los niveles de ARNm de actina. Cada barra representa la media /- DT de tres repeticiones técnicas. Los resultados se muestran en la Figura 9.
Ejemplo 8
Se sintetizaron variantes de modificación de un ARNip conjugado con GalNAc dirigido a TMPRSS6 y se muestran en la Figura 12. Para cada estructura bicatenaria, la secuencia de la primera cadena se enumera arriba y la secuencia de la segunda cadena abajo. Las modificaciones se representan como números y son las siguientes: GN indica conjugación con un enlazador GalNAc de acuerdo con la Figura 8a. La secuencia y modificación de STS12 (GN-TMPRSS6-hcm9) también se muestra en la Figura 7.
Ejemplo 9
Diferentes variantes de modificación de una secuencia conjugada con GalNAc dirigida a TMPRSS6 (STS012) reducen la expresión de TMPRSS6 en hepatocitos primarios de ratón. Para la absorción mediada por receptores, las células se incubaron con conjugado de ARNip 100, 10, 1 y 0,1 nM durante 24 horas. Se extrajo el ARN total y los niveles de ARNm de TMPRSS6 se cuantificaron mediante qRT-PCR Taqman. Los niveles de ARNm de TMPRSS6 se normalizaron con respecto a los niveles de ARNm de actina. En la Figura 10, se muestra la media /- DT de cada tres repeticiones técnicas.
Ejemplo 10
Se probaron diferentes variantes de modificación de una secuencia conjugada con GalNAc dirigida a TMPRSS6 (STS012, GN-TMPRSS6-hcm9) in vivo. Se inyectaron por vía subcutánea 1 mg/kg y 3 mg/kg de conjugado de ARNip-GalNAc en ratones C57BL/6JOlaHsd macho. 14 días después del tratamiento, se analizaron los niveles de ARNm de TMPRSS6 (A) y HAMP (B) en el hígado mediante qRT-PCR Taqman. Las barras representan la media de al menos 4 animales /- d T. Los resultados se muestran en la Figura 11.
Ejemplo 11
Se probaron dos variantes de modificación diferentes de una secuencia conjugada con GalNAc dirigida a TMPRSS6 (STS012) in vivo. Se inyectaron por vía subcutánea 1 mg/kg de conjugados de ARNip-GalNAc en ratones C57BL/6JOlaHsd macho. 14 y 28 días después del tratamiento, se analizaron los niveles de ARNm de TMPRSS6 en el hígado mediante qRT-PCR Taqman (A). Adicionalmente, se analizaron los niveles de hierro sérico (B). Los resultados se muestran en la Figura 13. Los diagramas de caja representan la mediana de 4 animales. El análisis estadístico se basa en la prueba de Kruskal-Wallis con la prueba de comparación múltiple de Dunn frente al grupo de PBS.
Las secuencias son como en el Ejemplo 10.
Ejemplo 12
Se probaron dos variantes de modificación diferentes de una secuencia conjugada con GalNAc dirigida a TMPRSS6 (STS12009L4, GN2-TMPRSS6-hcm9) in vivo. Se inyectaron por vía subcutánea 1 mg/kg y 0,3 mg/kg de conjugados de ARNip-GalNAc en ratones C57BL/6JOlaHsd macho. 14 días después del tratamiento, se analizaron los niveles de ARNm de TMPRSS6 en el hígado mediante qRT-PCR Taqman (A). Adicionalmente, se analizaron los niveles de hierro sérico (B). Los resultados se muestran en la Figura 14. Los diagramas de caja representan la mediana de 4 animales. El análisis estadístico se basa en la prueba de Kruskal-Wallis con la prueba de comparación múltiple de Dunn frente al grupo de PBS.
Las estructuras bicatenarias utilizadas se muestran a continuación en la Tabla 5. Todas las secuencias corresponden a SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18
Tabla 5
ID de la estructura bicatenaria secuencia y química (arriba: primera cadena, abajo: segunda cadena, ambas 5'-3')
STS mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmU(ps)fG(ps)mA 12009L4
GN2-fUmCfAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfG(ps)mU(ps)fU
STS
12009V2L4 mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmU(ps)fG(ps)mA
GN2-mUmCmAmCfCmUfGfCfUmUmCmUmUmCmUmGmG(ps)mU(ps)mU
STS mA(ps)fA(ps)mCmCmAmGmAmAmGmAmAfGmCfAmGmGmU(ps)mG(ps)mA 12009V8L4
GN2-mUmCmAmCfCmUfGfCfUmUmCmUmUmCmUmGmG(ps)mU(ps)mU
GN2-Luc mU(ps)fU(ps)mAfGmUfAmAfAmCfCmUfUmUfUmGfAmG(ps)fA(ps)mC
GN2-fGmUfCmUfCmAfAmAfAmGfGmUfUmUfAmCfU(ps)mA(ps)fA
mA, mU, mC, mG - ARN 2'-OMe
fA, fU, fC, fG - ADN 2'-F
(ps) - fosforotioato
GN2 = estructura de GalNAc de acuerdo con la Figura 8B
Tabla 5: variantes de modificación de secuencias conjugadas con GalNAc dirigidas a TMPRSS6.
Ejemplo 13
Se probaron diferentes variantes de modificación de un ARNip dirigido a TMPRSS6 en células Hep3B humanas. Se utilizó un ARNip dirigido a la luciferasa como control no dirigido. Todos los ARNip se transfectaron con 1 pg/ml de Atufect a 1 nM y 0,1 nM. El ARN total se extrajo 48 h después de la transfección y los niveles de ARNm de t Mp RSS6 se cuantificaron mediante qRT-PCR Taqman. Los niveles de ARNm de TMPRSS6 se normalizaron con respecto a niveles de ARNm de PTEN. Los resultados se muestran en la Figura 15. Cada barra representa la media /- DT de tres repeticiones técnicas.
Las secuencias se muestran en la siguiente Tabla 6. Todas las secuencias corresponden a SEQ ID NO: 17 (arriba) y SEQ ID NO: 18 (abajo).
Tabla 6
ID de la
estructura
bicatenaria secuencia y química (arriba: primera cadena, abajo: segunda cadena, ambas 5'-3') TMP01 mAfAmCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUfGmA
fUmCfAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfGmUfU
TMP66 mAfAmCfCmAmGfAmAmGmAmAmGmCfAmGmGmUmGmA
mUmCmAmCmCmUfGmCfUmUmCmUmUmCmUmGmGmUmU
TMP69 fAfAfCfCfAmGfAfAfGfAmAfGfCfAmGfGfllfGfA
fUmCfAfCfCfUfGfCfUfUfCmUfUmCfUfGfGfUfU
TMP79 fAfAmCfCfAmGfAfAfGfAmAfGfCfAmGfGmUmGmA
mUmCfAmCfCmUfGfCfUmUmCmUmUmCmUfGfGmUmU
TMP80 fAfAmCmCfAmGfAfAfGfAmAfGfCfAmGfGmUmGmA
mUmCfAmCfCmUfGfCfUmUmCmUmUmCmUfGfGmUmU
TMP81 fAfAmCfCfAmGfAfAfGfAmAfGmCfAmGfGmUmGmA
mUmCfAmCfCmUfGfCfUmUmCmUmUmCmUfGfGmUmU mA, mU, mC, mG-2 '-OMe
ARN fA, fU, fC, fG - ADN 2'-F
(ps) - fosforotioato
Tabla 6: diferentes variantes de modificación de un ARNip dirigido a TMPRSS6.
Ejemplo 14
Se probaron variantes de modificación de un ARNip conjugado con GalNAc dirigido a TMPRSS6 en células Hep3B humanas. Se sembraron 150.000 células por 6 pocillos. Después de 24 h, se transfectaron conjugados de ARNip con 1 |jg/ml de Atufect a 10, 1, 0,1, 0,01 y 0,001 nM (A) o 5, 0,5, 0,05, 0,005 nM (B). Se utilizó un conjugado de ARNip-GalNAc contra Luciferasa como control no dirigido. El ARN total se extrajo 72 h después de la transfección y los niveles de ARNm de TMPRSS6 se cuantificaron mediante qRT-PCR Taqman. Los niveles de ARNm de t Mp RSS6 se normalizaron con respecto a los niveles de ARNm de PTEN (A) o niveles de ARNm de actina (B). Los resultados se muestran en la Figura 16. Cada barra representa la media /- DT de tres repeticiones técnicas.
Las secuencias se muestran en la Tabla 7, a continuación.
Figure imgf000054_0001
Tabla 7: variantes de modificación de un ARNip conjugado con GalNAc dirigido a TMPRSS6
Ejemplo 15
Se probó una variante de modificación de una secuencia conjugada con GalNAc dirigida a TMPRSS6 (STS12009L4) en hepatocitos primarios de ratón. Para la absorción mediada por receptores, se incubaron células con conjugado de ARNip a 100, 25, 5, 1, 0,25 y 0,05 nM durante 24 h. Se utilizaron como controles un conjugado de ARNip-GalNAc dirigido a una secuencia no relacionada (GN-TTR) y un conjugado de ARNip-GalNAc no dirigido (GN-Luc). Se extrajo el ARN total y los niveles de ARNm de TMPRSS6 se cuantificaron mediante qRT-PCR Taqman. Los niveles de ARNm de TMPRSS6 se normalizaron con respecto a niveles de ARNm de PTEN. Los resultados se muestran en la Figura 17. Se muestra la media /- DT de cada tres repeticiones técnicas.
Las secuencias se muestran en la Tabla 7, anterior.
Ejemplo 16
Se probaron diferentes variantes que contenían ADN y LNA de un ARNip dirigido a TMPRSS6 en células Hep3B humanas. Por lo tanto, se sembraron 150.000 células por 6 pocillos. Después de 24 h, se transfectaron los ARNip con 1 |jg/ml de Atufect a ARNip 0,1 nM. El ARN total se extrajo 48 h después de la transfección y los niveles de ARNm de TMPRSS6 se cuantificaron mediante qRT-PCR Taqman. Los niveles de ARNm de TMPRSS6 se normalizaron con respecto a los niveles de ARNm de actina. Los resultados se muestran en la Figura 18. Cada barra representa la media /- DT de tres repeticiones técnicas.
Las secuencias se muestran en la Tabla 8, a continuación. Todas las secuencias corresponden a SEQ ID NO: 17 (arriba) y SEQ ID NO: 18 (abajo).
Tabla 8
ID de la estructura
bicatenaria secuencia y química (arriba: primera cadena, abajo: segunda cadena, ambas 5'-3') TMP01 mAfAmCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUfGmA fUmCfAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfGmUfU
TMP95 mAfAmCmCmAmGmAmAmGmAmAmGmCfAmGmGmUmGmA fUmCfAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfGmUfU
TMP99 mAfAmCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUfGmA mUmCmAmCmCmUfGmCfUmUmCmUmUmCmUmGmGmUmU TMP112 mA[A]mCmCmAmGmAmAmGmAmAmGmCfAmGmGmUmGmA fUmCfAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfGmUfU
TMP114 mAfAmCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUfGmA mUmCmAmCmCmU{G}mCfUmUmCmUmUmCmUmGmGmUmU TMP115 mAfAmCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUfGmA mUmCmAmCmCmUfGmC{U}mUmCmUmUmCmUmGmGmUmU TMP116 mAfAmCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUfGmA mUmCmAmCmCmU[G]mCfUmUmCmUmUmCmUmGmGmUmU TMP117 mAfAmCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUfGmA mUmCmAmCmCmUfGmC[U]mUmCmUmUmCmUmGmGmUmU
mA, mU, mC, mG-2'-OMe
ARN fA, fU, fC, fG -ARN 2'-F
[A], [T], [C], [G] -A D N
{A}, {U}, {C}, {G} -L N A
(ps) - fosforotioato
Tabla 8: diferentes variantes que contienen ADN y LNA de un ARNip dirigido a TMPRSS6.
Ejemplo 17
Se analizó la influencia de los nucleótidos de ARN A y G invertidos en las posiciones 3' terminales mediante un ARNip contra TMPRSS6. TMP70 contiene fosforotioatos en todos los extremos, mientras que TMP82 y TMP83 contienen ivA (TMP82) e ivG (TMP83) en el extremo 3' de la cadena antisentido y en el extremo 3' de la cadena sentido. Ambos nucleótidos invertidos están presentes además en el nucleótido terminal de las respectivas cadenas y están unidos mediante un enlace de fosforotioato. Se incluyeron como controles un ARNip no relacionado (PTEN) y un ARNip no dirigido (Luci). Todas las variantes probadas muestran una actividad comparable en las condiciones probadas. El experimento se realizó en células Hep3B. Las células se sembraron a una densidad de 150.000 células por 6 pocillos, se transfectaron con ARNip 1 nM y 0,1 nM y Atufect a 1 pg/ml después de 24 h y se lisaron después de 48 h. Se extrajo el ARN total y se determinaron los niveles de ARNm de TMPRSS6 y actina mediante qRT-PCR Taqman. Los resultados se muestran en la Figura 19. Cada barra representa la media ± Dt de tres repeticiones técnicas. Las secuencias se muestran en la siguiente Tabla 9. Las secuencias corresponden a SEQ ID NO: 17 (arriba) o SEQ ID NO: 18 (abajo).
Tabla 9
ID de la secuencia y química (arriba: primera cadena, abajo: segunda cadena, ambas 5'-3') estructura
bicatenaria
TMP70 mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmU(ps)fG(ps)mA fU(ps)mC(ps)fAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfG(ps)mU(ps)fU TMP82 mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUfGmA(ps)ivA fU(ps)mC(ps)fAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfGmUfU(ps)ivA
TMP83 mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUfGmA(ps)ivG fU(ps)mC(ps)fAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfGmUfU(ps)ivG mA, mU, mC, mG - ARN 2'-OMe
fA, fU, fC, fG- ADN 2'-F
ivA, ivG - ARN invertido (3'-3')
(ps) - fosforotioato
Tabla 9: un ARNip contra TMPRSS6 que incluye nucleótidos de ARN invertidos en diferentes posiciones.
Ejemplo 18
Se probaron diferentes estructuras bicatenarias de ARNip que contenían nucleótidos de ARN invertidos en ambos extremos 3' para determinar la estabilidad sérica. TMP84-TMP87 contienen ARN invertido además del último nucleótido de la cadena sentido y en lugar del último nucleótido de la cadena antisentido. TMP88-TMP91 contienen ARN invertido además del último nucleótido de la cadena antisentido y en lugar del último nucleótido de la cadena con sentido. Todos los nucleótidos de ARN invertidos sustituyen a los fosforotioatos utilizados en los extremos. En el diseño de TMP84-TMP87, ivA e ivG confieren mayor estabilidad a la secuencia probada que ivU e ivC (parte A). En el diseño de TMP88-TMP91, no hay influencia de la identidad de la base sobre la estabilidad de la estructura bicatenaria (parte B).
Los resultados se muestran en la Figura 20. "NT" indica muestras no tratadas. "FBS" indica estructuras bicatenarias de ARNip que se incubaron a una concentración final de 5 pM con FBS al 50 % durante 3 días, se extrajeron con fenol/cloroformo y se hicieron precipitar con etanol. Las muestras se analizaron en geles de poliacrilamida TBE al 20 % en electroforesis en gel nativo.
Las secuencias se muestran en la Tabla 10, a continuación, y corresponden a SEQ ID NO: 17 (arriba) y SEQ ID NO: 18 (abajo).
Tabla 10
ID de la
estructura secuencia y química (arriba: primera cadena, abajo: segunda cadena, ambas 5'-3') bicatenaria
TMP70 mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmU(ps)fG(ps)mA fU(ps)mC(ps)fAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfG(ps)mU(ps)fU TMP84 mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUfG ivA fU(ps)mC(ps)fAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfGmUfU ivG TMP85 mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUfG ivU fU(ps)mC(ps)fAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfGmUfU ivG TMP86 mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUfG ivC fU(ps)mC(ps)fAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfGmUfU ivG TMP87 mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUfG ivG fU(ps)mC(ps)fAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfGmUfU ivG
TMP88 mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUfGmA ivG fU(ps)mC(ps)fAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfGmU ivA
TMP89 mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUfGmA ivG fU(ps)mC(ps)fAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfGmU ivU
TMP90 mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUfGmA ivG fU(ps)mC(ps)fAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfGmU ivC TMP91 mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUfGmA ivG fU(ps)mC(ps)fAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfGmU ivG mA, mU, mC, mG - ARN 2'-OMe
fA, fU, fC, fG - ADN 2'-F
ivA, ivU, ivC, ivG -ARN invertido (3'-3')
(ps) - fosforotioato
Tabla 10: Diferentes estructuras bicatenarias de ARNip que contienen nucleótidos de ARN invertidos en ambos extremos 3'.
Ejemplo 19
Se analizó la influencia de los nucleótidos de ARN invertidos en las posiciones 3' terminales mediante un ARNip contra TMPRSS6. TMP70 contiene fosforotioatos en todos los extremos, mientras que TMP84-TMP87 contienen ivG en el extremo 3' de la cadena sentido. El nucleótido de ARN invertido está presente además del último nucleótido y sustituye a dos fosforotioatos. En el extremo 3' antisentido, se probaron ivA (t Mp 84), ivU (TMP85), ivC (TMP86) e ivG (TMP87). Estos nucleótidos de ARN invertidos se añadieron en lugar del nucleótido terminal y sustituyeron a los fosforotioatos. Como controles, se incluyeron un ARNip no relacionado (PTEN) y un ARNip no dirigido (Luci). Todas las variantes probadas muestran una actividad comparable en las condiciones probadas.
El experimento se realizó en Hep3B. Las células se sembraron a una densidad de 150.000 células por 6 pocillos, se transfectaron con ARNip 1 nM y 0,1 nM y Atufect a 1 pg/ml después de 24 h y se lisaron después de 48 h. Se extrajo el ARN total y se determinaron los niveles de ARNm de TMPRSS6 y actina mediante qRT-PCR Taqman. Los resultados se muestran en la Figura 21. Cada barra representa la media ± DT de tres repeticiones técnicas.
Las secuencias son como en la Tabla 10, anterior.
Ejemplo 20
Se analizó la influencia de los nucleótidos de ARN invertidos en las posiciones 3' terminales mediante un ARNip contra TMPRSS6. TMP70 contiene fosforotioatos en todos los extremos, mientras que TMP88-TMP91 contienen ivG en el extremo 3' de la cadena antisentido. El nucleótido de ARN invertido está presente además del último nucleótido y sustituye a dos fosforotioatos. En el extremo 3' sentido, se probaron ivA (TMP88), ivU (TMP89), ivC (TMP90) e ivG (TMP91). Estos nucleótidos de ARN invertidos se añadieron en lugar del nucleótido terminal y sustituyeron a los fosforotioatos. Como controles, se incluyeron un ARNip no relacionado (PTEN) y un ARNip no dirigido (Luci). Todas las variantes probadas muestran una actividad comparable en las condiciones probadas.
El experimento se realizó en Hep3B. Las células se sembraron a una densidad de 150.000 células por 6 pocillos, se transfectaron con ARNip 1 nM y 0,1 nM y Atufect a 1 pg/ml después de 24 h y se lisaron después de 48 h. Se extrajo el ARN total y se determinaron los niveles de ARNm de TMPRSS6 y actina mediante qRT-PCR Taqman. Los resultados se muestran en la Figura 22. Cada barra representa la media ± DT de tres repeticiones técnicas.
Los resultados son tal como se muestran en la Tabla 10, anterior.
Ejemplo 21
Se analizó la influencia de los nucleótidos de ARN invertidos en las posiciones 3' terminales mediante un conjugado de ARNip-GalNAc dirigido a TMPRSS6 en transfecciones liposomales. STS12009-L4 contiene fosforotioatos en todos los extremos no conjugados, mientras que las variantes analizadas contienen un nucleótido de ARN invertido en el extremo 3' de la cadena sentido y antisentido. El ARN invertido está presente además en el último nucleótido y sustituye a dos fosforotioatos terminales (STS12009V10-L4 y -V11-L4) o se utiliza además de los fosforotioatos terminales (STS12009V29-L4 y STS12009V30-L4). Se utilizaron A invertido (STS12009V10-L4 y -V29-L4) y G invertido (STS12009V11-L4 y -V30-L4). Todas las variantes probadas muestran una actividad comparable en las condiciones probadas.
El experimento se realizó en Hep3B. Las células se sembraron a una densidad de 150.000 células por 6 pocillos, se transfectaron con ARNip 5 nM y 0,0016 nM y Atufect a 1 pg/ml después de 24 h y se lisaron después de 48 h. Se extrajo el ARN total y se determinaron los niveles de ARNm de TMPRSS6 y actina mediante qRT-PCR Taqman. Los resultados se muestran en la Figura 23. Cada barra representa la media ± DT de tres repeticiones técnicas.
Las secuencias se establecen en la Tabla 11, a continuación y corresponden a SEQ ID NO: 17 (arriba) y SEQ ID NO: 18 (abajo).
____________________________Tabla 11____________________________________________ ID de la
estructura secuencia y química (arriba: primera cadena, abajo: segunda cadena, ambas 5'-3') bicatenaria
STS12009L4 mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmU(ps)fG(ps)mA
GN2-fUmCfAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfG(ps)mU(ps)fU
STS12009V10L4
mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUfGmAivA
GN2-fUmCfAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfGmUfUivA
STS12009V11L4
mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUfGmAivG
GN2-fUmCfAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfGmUfUivG STS12009V29L4 mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmU(ps)fG(ps)mAivA
GN2-fUmCfAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfG(ps)mU(ps)fUivA (continuación)
ID de la
estructura secuencia y química (arriba: primera cadena, abajo: segunda cadena, ambas 5'-3') bicatenaria
STS12009V30L4 mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmU(ps)fG(ps)mAivG
GN2-fUmCfAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfG(ps)mU(ps)fUivG
mA, mU, mC, mG - ARN 2'-OMe
fA, fU, fC, fG- ADN 2'-F
ivA, ivG - ARN invertido (3'-3')
(ps) - fosforotioato
GN2= estructura de GalNAc de acuerdo con la Figura 8B
Tabla 11: una secuencia de ARNip que incluye nucleótidos de ARN invertidos en los extremos 3'
Ejemplo 22
Ensayo de estabilidad sérica de conjugados de ARNip-GalNAc que contienen un PS2 en extremos individuales. Se conjugó GalNAc al extremo 5' de la cadena sentido y se estabilizó internamente mediante cuatro PS. Las modificaciones de fosforoditioato se colocaron en los extremos 5' antisentido (STS12009V37L4), 3' antisentido (STS12009V36L4) y 3' sentido (STS12009V34L4). STS12009L4 contiene cada dos PS terminales en los extremos 5' antisentido, 3' antisentido y 3' sentido, GalNAc está unido al extremo 5' sentido y estabilizado por cuatro PS internos. Se incubaron conjugados de ARNip-GalNAc 5 pM con FBS al 50 % durante 3 días a 37 °C. Se extrajo el ARN y se analizó en geles de poliacrilamida TBE al 20 %. Los resultados se muestran en la Figura 24. "NT" indica muestras no tratadas, "FBS" indica tratamiento con FBS. "Control" indica un conjugado de ARNip-GalNAc menos estabilizado de secuencia diferente.
Las secuencias se muestran en la Tabla 12, a continuación, y corresponden a SEQ ID NO: 17 (arriba) y SEQ ID NO: 18 (abajo).
Tabla 12
ID de la secuencia y química (arriba: primera cadena, abajo: segunda cadena, ambas 5'-3') estructura
bicatenaria
STS12009L4 mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmU(ps)fG(ps)mA
GN2-fUmCfAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfG(ps)mU(ps)fU
STS12009V34L4 mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmU(ps)fG(ps)mA
GN2-fUmCfAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfGmU(ps2)fU
STS12009V36L4 mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUfG(ps2)mA
GN2-fUmCfAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfG(ps)mU(ps)fU
STS12009V37L4 mA(ps2)fAmCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmU(ps)fG(ps)mA
GN2-fUmCfAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfG(ps)mU(ps)fU
mA, mU, mC, mG - ARN 2'-OMe
fA, fU, fC, fG - ADN 2'-F
(ps) - fosforotioato
(ps2) - fosforoditioato
GN2 = estructura de GalNAc de acuerdo con la Figura 8B
Tabla 12: conjugados de ARNip-GalNAc que contienen un PS2 (fosforoditioato) en los extremos individuales.
Ejemplo 23
Actividad de conjugados de ARNip-GalNAc que contienen un PS2 en extremos individuales. Se conjugó GalNAc al extremo 5' de la cadena sentido y se estabilizó internamente mediante cuatro PS. Las modificaciones de fosforoditioato se colocaron en los extremos 5' antisentido (STS12009V37L4), 3' antisentido (STS12009V36L4) y 3' sentido (STS12009V34L4). El experimento se realizó en hepatocitos primarios de ratón. Las células se sembraron a una densidad de 250.000 células por pocillo de 6 y se trataron con ARNip-GalNAc 100 nM, 10 nM y 1 nM. Las transfecciones con ARNip-GalNAc l0 nM y Atufect 1 pg/ml sirvieron como control. Las células se lisaron después de 24 h, se extrajo el ARN total y se determinaron los niveles de ARNm de TMPRSS6 y PTEN mediante qRT-PCR Taqman. Los resultados se muestran en la Figura 25. Cada barra representa la media ± DT de tres repeticiones técnicas.
Las secuencias son las establecidas en la Tabla 12, anterior.
Ejemplo 24
Ensayo de estabilidad sérica de un conjugado de ARNip-GalNAc (STS12009V40L4) que contiene cada uno PS2 en el extremo 5' de la segunda cadena y en el extremo 3' de la segunda cadena. Se conjugó GalNAc al extremo 5' de la segunda cadena y no se estabilizó con ningún PS interno. STS12009L4 contiene cada dos PS terminales en los extremos 5' antisentido, 3' antisentido y 3' sentido, GalNAc está unido al extremo 5' sentido y estabilizado por cuatro PS internos. Se incubaron conjugados de ARNip-GalNAc 5 pM con FBS al 50 % durante 3 días a 37 °C. Se extrajo el ARN y se analizó en geles de poliacrilamida TBE al 20 %. Los resultados se muestran en la Figura 26. "NT" indica muestras no tratadas, "FBS" indica tratamiento con FBS. "Control" indica un conjugado de ARNip-GalNAc menos estabilizado de secuencia diferente.
Las secuencias se establecen en la Tabla 13, a continuación, y son SEQ ID NO: 17 (arriba) y SEQ ID NO: 18 (abajo). ______________________________________________Tabla 13______________________________________________ ID de la secuencia y química (arriba: primera cadena, abajo: segunda cadena, ambas 5'-3') estructura
bicatenaria
STS12009L4
mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmU(ps)fG(ps)mA GN2-fUmCfAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfG(ps)mU(ps)fU STS12009V40L4 mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmU(ps)fG(ps)mA GNo-fU(ps2)mCfAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfGmU(ps2)fU mA, mU, mC, mG - ARN 2'-OMe
fA, fU, fC, fG - ADN 2'-F
(ps) - fosforotioato
(ps2) - fosforoditioato
GN2 - GalNAc, estructura de acuerdo con la Figura 8B
GNo - GN2 con fosfodiésteres en lugar de (ps)
Tabla 13: conjugado de ARNip-GalNAc que contiene cada PS2 en el extremo 5' de la segunda cadena y en el extremo 3' de la segunda cadena.
Ejemplo 25
Actividad de un conjugado de ARNip-GalNAc (STS12009V40L4) que contiene cada PS2 en el extremo 5' de la cadena sentido y en el extremo 3' de la cadena sentido. Se conjugó GalNAc con el extremo 5' de la cadena sentido y no se estabilizó con ningún PS interno. STS12009L4 contiene cada dos PS terminales en los extremos 5' antisentido, 3' antisentido y 3' sentido, GalNAc está unido al extremo 5' sentido y estabilizado por cuatro PS internos. El experimento se realizó en hepatocitos primarios de ratón. Las células se sembraron a una densidad de 250.000 células por pocillo de 6 y se trataron con ARNip-GalNAc 100 nM, 10 nM y 1 nM. Un conjugado con GalNAc de un ARNip contra Luciferasa ("GalNAc-Luc") sirvió como control. Las células se lisaron después de 24 h, se extrajo el ARN total y se determinaron los niveles de ARNm de TMPRSS6 y PTEN mediante qRT-PCR Taqman. Los resultados se muestran en la Figura 27. Cada barra representa la media ± DT de tres repeticiones técnicas.
Las secuencias son las establecidas en la Tabla 13, anterior.
Ejemplo 26
Inhibición de la expresión de TMPRSS6 por diferentes dosis de ARNip-GalNAc en modelo animal para la hemocromatosis hereditaria. Se trataron ratones HFE ~-~ hembra (Herrmann et al., J. Mol. Con (Berl), 200482, 39-48) por vía subcutánea con una dosis única de 1 o 3 mg/kg de conjugado de ARNip-GalNAc, respectivamente. Los grupos de control se trataron con PBS o con el control no dirigido ARNip1-GN2-Luc (GN2-Luc) mediante inyección subcutánea. La expresión del gen diana en tejido hepático se evaluó mediante qRT PCR tres semanas después de la inyección de los conjugados. Media /- DT de los grupos. Estadística: Prueba de Kruskal-Wallis con Dunn sin corregir. La secuencia y la modificación de los conjugados de ARNip se representan en la Figura 7. Los resultados se muestran en la Figura 28. Valores de P: ****P<,001; ***P<0,005; **,01; *P<,05.
Ejemplo 27
Aumento de los niveles séricos de hepcidina por diferentes dosis de ARNip-GalNAc en un modelo animal para la hemocromatosis hereditaria. Se trataron ratones HFE ~-~ con una dosis única de 1 o 3 mg/kg de conjugado de ARNip-GalNAc mediante inyección subcutánea. Los grupos de control se trataron con PBS o con conjugado de control no dirigido de ARNip1-GN2-Luc (GN2-Luc). Los niveles de hepcidina se determinaron en muestras de suero recolectadas tres semanas después de la inyección de los conjugados utilizando el kit ELISA (Intrinsic Life Science). Medias de grupo con DT. Prueba de Kruskal-Wallis con prueba de Dunn no corregida frente al grupo de control (ARNip-GN2-Luc). Los resultados se muestran en la Figura 29. Valores de P: ****P<,001; ***P<0,005; **,01; *P<,05.
Ejemplo 28
Reducción de los niveles de hierro sérico por diferentes dosis de ARNip-GalNAc en modelo animal para la hemocromatosis hereditaria. Se trataron ratones HFE ~-~ con una dosis única de 1 o 3 mg/kg de conjugado de ARNip-GalNAc mediante administración subcutánea. Los grupos de control se trataron con PBS o con conjugado de control no dirigido de (ARNip-GN2-Luc). Los niveles de hierro sérico se determinaron tres semanas después del tratamiento. Medias /- DT de los grupos. Prueba de Kruskal-Wallis con prueba de Dunn no corregida frente al grupo de control (GN2-Luc). Las secuencias y modificaciones de los conjugados de ARNip se representan en la Figura 7. Los resultados se muestran en la Figura 30. Valores de P: ****P<,001; ***P<0,005; **,01; *P<,05.
Ejemplo 29
Reducción de la saturación de transferrina por diferentes dosis de ARNip-GalNAc en modelo animal para la hemocromatosis hereditaria. Se trataron ratones HFE ~-~ con una dosis única de 1 o 3 mg/kg de conjugado de ARNip-GalNAc mediante administración subcutánea. Los grupos de control se trataron con PBS o con conjugado de control no dirigido ARNip1-GN2-Luc (GN2-Luc). El % de saturación de transferrina en muestras de sangre se determinó tres semanas después del tratamiento. Medias de grupo con DT. Prueba de Kruskal-Wallis con prueba de Dunn no corregida frente al grupo de control (GN2-Luc). La secuencia y la modificación de los conjugados de ARNip se representan en la Figura 7. Los resultados se muestran en la Figura 31. Valores de P: ****P<,001; ***P<0,005; **,01; *P<,05.
Ejemplo 30
Aumento de la capacidad de unión de hierro no saturado (CUHNS) en modelo animal para la hemocromatosis hereditaria. Se trataron ratones HFE ~-~ con una dosis única de 1 o 3 mg/kg de conjugado de ARNip-GalNAc mediante administración subcutánea. Los grupos de control se trataron con PBS o con conjugado de control no dirigido ARNip1-GN2-Luc (GN2-LUC). Se recogieron muestras de suero tres semanas después del tratamiento para la determinación de la CUHNS. Medias de grupo con DT. Prueba de Kruskal-Wallis con prueba de Dunn no corregida frente al grupo de control (GN2-Luc). Los resultados se muestran en la Figura 32. Valores de P: ****P<,001; ***P<0,005; **,01; *P<,05.
Ejemplo 31
Reducción de los niveles de hierro tisular por ARNip-GalNAc en modelo animal para la hemocromatosis hereditaria. Se trataron ratones HFE ~-~ con una dosis única de 1 o 3 mg/kg de conjugado de ARNip-GalNAc mediante administración subcutánea. Los grupos de control se trataron con PBS o con conjugado de control no dirigido ARNip1-GN2-Luc (GN2-Luc). Los niveles de hierro en el tejido renal se evaluaron tres semanas después del tratamiento. Box y Wiskers (Tukey, valores de la mediana) Prueba de Kruskal-Wallis con prueba de Dunn no corregida frente al grupo de control (GN2-Luc). Los resultados se muestran en la Figura 33.
Ejemplo comparativo 32
Reducción de la expresión del ARNm de TMPRSS6 por diferentes ARNip en células Hep3B.
Se sembraron 8000 células por pocillo en placas de 96 pocillos. Al día siguiente, las células se transfectaron con ARNip 20 nM y AtuFECT a 1 pg/ml. Dos días después de la transfección, las células se lisaron y los niveles de ARNm de TMPRSS6 se determinaron mediante q-RT-PCR. Los niveles de ARNm de TMPRSS6 se normalizaron con respecto a los niveles de expresión del gen constitutivo ApoB. Se utilizó un ARNip contra Luciferasa como control no dirigido. En la Figura 34, se muestra la inhibición promedio y la desviación típica de los valores por triplicado en relación con las células no tratadas. Las secuencias de los ARNip se muestran en la Tabla 14, a continuación.
Figure imgf000062_0001
(continuación)
Figure imgf000063_0001
(continuación)
Figure imgf000064_0001
(continuación)
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(continuación)
Figure imgf000066_0001
Tabla 14
Tabla 14: secuencias de ARNip contra TMPRSS6 probadas en el Ejemplo 32. fU, fA, fC, fG - desoxinucleótidos modificados con 2'F. mU, mA, mC, mG - nucleótidos modificados con 2'O-metilo.
Ejemplo comparativo 33
Respuesta a la dosis de ARNip contra TMPRSS6 en células Hep3B.
Se sembraron 8000 células por pocilio en placas de 96 pocilios. Al día siguiente, las células se transfectaron con ARNip a las concentraciones indicadas (100 nM-0,03 nM) y AtuFECT a 1 |jg/ml. Dos días después de la transfección, las células se lisaron y los niveles de ARNm de TMPRSS6 se determinaron mediante q-RT-PCR. Los niveles de ARNm de TMPRSS6 se normalizaron con respecto a los niveles de expresión del gen constitutivo ApoB. En la Figura 35, se muestra la inhibición promedio y la desviación típica de los valores por triplicado en relación con las células tratadas con 100 nM de un ARNip de control de luciferasa no dirigido. La Tabla 15, a continuación, muestra la inhibición máxima, la CI 50 y el intervalo de confianza del 95 % de acuerdo con las curvas dosis-respuesta que se muestran en la Figura 35.
Tabla 15
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Tabla 15: inhibición máxima, CI50 e intervalo de confianza del 95 % de acuerdo con la respuesta a las dosis mostrada en la Fig. 35.
Ejemplo 34
Inhibición de la expresión de ARNm de TMPRSS6 mediante la absorción mediada por receptor en hepatocitos humanos primarios.
Se sembraron hepatocitos humanos primarios en placas recubiertas de colágeno y se incubaron con conjugados de ARNip diluidos en medio de cultivo celular a concentraciones de 300 nM a 1 nM como se indica. 24 horas después de exponer las células a los conjugados de ARNip, se extrajo el ARN total y se cuantificó la expresión de TMPRSS6 mediante qRT-PCR Taqman. Los niveles de ARNm de TMpRSS6 se normalizaron con respecto a los niveles de ARNm de actina y a los niveles de ARNm diana de células tratadas con conjugado de ARNip de control no dirigido ARNip 1-GN2-Luc (GN2-Luc). Se observó una inhibición dependiente de la dosis de la expresión de TMPRSS6 mediante el conjugado de ARNip de TMPRSS6-GalNAc. Las secuencias y modificaciones de los conjugados se representan en la Figura 7. Los resultados se muestran en la Figura 36.
Ejemplo 35
El ARNip de TMPRSS6-GalNAc aumenta los valores de hematocrito en un modelo de roedor para la • -talasemia intermedia.
Se trataron ratones Hbbth3/+ (Yang et al. 1995, PNAS Vol. 92, 11608-11612) en día 1 y día 15 por vía subcutánea con GN2-TMPRSS6-hcm9 (GN2-TMP) a 3 mg/kg, ARNip 1-GN2-Luc (GN2-Luc) o PBS como control no dirigido o como control de vehículo, respectivamente. En el día 36, se recogió sangre entera en tubos recubiertos con heparina para un examen sanguíneo completo. Los ratones Hbb th3/+ se obtuvieron de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) y se mantuvieron en un fondo C57BL/6. Se recogieron muestras de sangre de ratones de tipo silvestre (WT, Wild Type) no tratados (C57BL/6) y se analizaron para realizar comparaciones. Mancha de puntos de dispersión, media /- DT; n = 3-6. Estadística: prueba de la t para datos independientes con corrección de Welch. Los resultados se muestran en la Figura 37.
Ejemplo 36
El ARNip de TMPRSS6-GalNAc reduce la amplitud de distribución de los glóbulos rojos en el modelo de roedor para la b-thalassemia intermedia.
Se trataron ratones Hbbth3/+ (Yang et al. 1995, PNAS Vol. 92, 11608-11612) en día 1 y día 15 por vía subcutánea con GN2-TMPRSS6-hcm9 (GN2-TMP) a 3 mg/kg, ARNip1-GN2-Luc (GN2-Luc) o PBS como control no dirigido o como control de vehículo, respectivamente. En el día 36, se recogió sangre entera en tubos recubiertos con heparina para un examen sanguíneo completo. Los ratones Hbb th3/+ se obtuvieron de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) y se mantuvieron en un fondo C57BL/6. Se recogieron muestras de sangre de ratones de tipo silvestre (WT) no tratados (C57BL/6) y se analizaron para realizar comparaciones. Mancha de puntos de dispersión, media /- DT; n = 3-6. Estadística: prueba de la t para datos independientes con corrección de Welch. Los resultados se muestran en la Figura 38.
Ejemplos 37
El ARNip de TMPRSS6 GalNAc reduce la proporción de reticulocitos en el modelo de roedores para la • • talasemia intermedia.
Se trataron ratones Hbbth3/+ (Yang et al. 1995, PNAS Vol. 92, 11608-11612) en día 1 y día 15 por vía subcutánea con GN2-TMPRSS6 hcm9 (GN2-TMP) a 3 mg/kg, ARNip 1-GN2-Luc (GN2-Luc) o PBS como control no dirigido o como control de vehículo, respectivamente. En el día 36, se recogió sangre entera en tubos recubiertos con heparina para un examen sanguíneo completo. Los ratones Hbb th3/+ se obtuvieron de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) y se mantuvieron en un fondo C57BL/6. Se recogieron muestras de sangre de ratones de tipo silvestre (WT) no tratados (C57BL/6) y se analizaron para realizar comparaciones. Mancha de puntos de dispersión, media /- DT; n = 3-6. Estadística: prueba de la t para datos independientes con corrección de Welch. Los resultados se muestran en la Figura 39.
Ejemplos 38
El ARNip de TMPRSS6 GalNAc reduce la cantidad de Especies Reactivas del Oxígeno (ERO) en modelos de roedores para la • -talasemia intermedia. Los ratones Hbbth3/+ (Th3/+; Yang et al. 1995, PNAS Vol. 92, 11608-11612) se trataron el día 1 y el día 15 por vía subcutánea con GN2-TMPRSS6 hcm9 (GN2-TMP) o ARNip1-GN2-Luc (GN2-Luc) a 3 mg/kg como control no dirigido. En el día 36, se recogió sangre entera en tubos recubiertos con heparina para un examen sanguíneo completo. Las mediciones de ERO se realizaron 5 min después de la adición de 2'7'-dicloro-fluoresceína como indicador (Siwaponanan et al., 2017 Blood, 129, 3087-3099). Las muestras de sangre de ratones tratados con GN2-TMPRSS6 hcm9 se midieron dos veces. Los ratones Hbb th3/+ (Th3/+) se obtuvieron de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) y se mantuvieron en un fondo C57BL/6. Se recogieron muestras de sangre de ratones de tipo silvestre (WT) no tratados (C57BL/6) y se analizaron para realizar comparaciones. Mancha de puntos de dispersión, media /-DT; n = 4-6. Estadística: prueba de la t para datos independientes con corrección de Welch. Los resultados se muestran en la Figura 40.
Ejemplo 39
El ARNip de TMPRSS6-GalNAc aumenta los niveles de hemoglobina en un modelo de roedor para la • -talasemia intermedia. Se trataron ratones Hbbth3/+ (Yang et al. 1995, PNAS Vol. 92, 11608-11612) en día 1 y día 15 por vía subcutánea con GN2-TMPRSS6-hcm9 (GN2-TMP), ARNip 1-GN2-Luc (GN2-Luc) o PBS a 3 mg/kg como control no dirigido o como control de vehículo, respectivamente. En el día 36, se recogió sangre entera en tubos recubiertos con heparina para un examen sanguíneo completo. Los ratones Hbb th3/+ se obtuvieron de Jackson Laboratory (Bar Harbor, m E) y se mantuvieron en un fondo C57BL/6. Se recogieron muestras de sangre de ratones de tipo silvestre (wt) no tratados (C57BL/6) y se analizaron para realizar comparaciones. Mancha de puntos de dispersión, media /- DT; n = 5-7. Estadística: pruebas de t de Welch sin corregir para comparación múltiple. Los resultados se muestran en la Figura 41. Los conjugados de ARNip se representan en la Figura 7.
Ejemplo 40
TMPRSS6 GalNAc reduce la esplenomegalia en un modelo de roedores para la • -talasemia intermedia. Se trataron ratones Hbbth3/+ (Yang et al. 1995, PNAS Vol. 92, 11608-11612) en día 1 y día 15 por vía subcutánea con GN2-TMPRSS6-hcm9 (GN2-TMP) a 3 mg/kg, ARNip 1-GN2-Luc (GN2-Luc) o PBS como control no dirigido o como control de vehículo, respectivamente. El día 39 se evaluaron los pesos del bazo. Los ratones Hbb th3/+ se obtuvieron de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) y se mantuvieron en un fondo C57BL/6. Se evaluaron los pesos del bazo de los ratones de tipo silvestre (wt) (C57BL/6) tratados con PBS para realizar comparaciones. Mancha de puntos de dispersión, media /- DT; n = 5-7. Estadística: pruebas de t de Welch sin corregir para comparación múltiple. Los resultados se muestran en la Figura 42. Los conjugados de ARNip se representan en la Figura 7.
Ejemplo 41
TMPRSS6 GalNAc mejora la maduración de los glóbulos rojos en la médula ósea. Se trataron ratones Hbbth3/+ (Yang et al. 1995, PNAS Vol. 92, 11608-11612) en día 1 y día 15 por vía subcutánea con GN2-TMPRSS6-hcm9 (GN2-TMP) a 3 mg/kg, ARNip 1-GN2-Luc (GN2-Luc) o PBS como control no dirigido o como control de vehículo, el día 39 se recogieron células de la médula ósea y se analizaron mediante análisis de FACS. Las células eritroides viables se separaron en distintas poblaciones basándose en la tinción con CD71, Ter119 y CD44. Los ratones Hbb th3/+ se obtuvieron de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) y se mantuvieron en un fondo C57BL/6. Se evaluaron las células eritroides de la médula ósea de ratones de tipo silvestre (wt) (C57BL/6) tratadas con PBS para realizar comparaciones. Gráfico de barras, media /- DT; n = 5-7. Estadística: pruebas de t de Welch sin corregir para comparación múltiple. Los resultados se muestran en la Figura 43. Los conjugados de ARNip se representan en la Figura 7.
Ejemplo 42
TMPRSS6 GalNAc reduce la eritropoyesis ineficaz en el bazo. Se trataron ratones Hbbth3/+ (Yang et al. 1995, PNAS Vol. 92, 11608-11612) en día 1 y día 15 por vía subcutánea con GN2-TMPRSS6 hcm9 (GN2-TMP) a 3 mg/kg, ARNip 1-GN2-Luc (GN2-Luc) o PBS como control no dirigido o como control de vehículo, respectivamente. El día 39 se recogieron células del bazo y se analizaron mediante análisis de FACS. Las células eritroides viables se separaron en distintas poblaciones basándose en la tinción con CD71, Ter119 y CD44. Los ratones Hbb th3/+ se obtuvieron de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) y se mantuvieron en un fondo C57BL/6. Se evaluaron las células eritroides de ratones de tipo silvestre (wt) (C57BL/6) tratadas con PBS para realizar comparaciones. Gráfico de barras, media /-DT; n = 5-7. Estadística: pruebas de t de Welch sin corregir para comparación múltiple. Los resultados se muestran en la Figura 44. Los conjugados de ARNip se representan en la Figura 7.
Ejemplo 43
Reducción de la expresión de TMPRSS6 en hepatocitos humanos por conjugados de ARNip-GalNAc.
Se sembraron 30.000 células por pocillo de hepatocitos primarios humanos en placas de 96 pocillos recubiertas con colágeno. Las células se trataron con las cantidades indicadas de conjugados de ARNip inmediatamente después de la siembra. Las células se sembraron 24 horas después del tratamiento y se analizó la expresión de ARNm de TMPRSS6 mediante qRT-PCR Taqman. Se muestran los valores por triplicado de TMPRSS6 normalizados con respecto a ApoB (constitutivo) y a la media de las células no tratadas.
Los resultados se muestran en la Figura 45a, 45b y la Figura 46, y las secuencias se muestran en la Figura 47. El enlazador GN3 descrito se muestra en la Figura 8C.
Ejemplo 44
Ensayo de estabilidad sérica de conjugados de ARNip-GalNAc con fosforotioatos, fosforoditioatos y fosfodiésteres en posiciones terminales y en la fracción de GalNAc. Se conjugó GalNAc con el extremo 5' de la cadena sentido y se estabilizó internamente con cuatro PS (STS12009L4) o no, luego se utilizaron enlaces fosfodiéster en su lugar (STS12009V54L50-V57L50). Se colocaron modificaciones de fosforoditioato en todas las posiciones terminales de la estructura bicatenaria excepto en el extremo 5' de la primera cadena (-V54L50), solo en los extremos 3' (-V55L50, -V57L50) o en el extremo 3'- de la segunda cadena solamente (-V56L50). En determinados diseños, se utilizaron fosfodiésteres en posiciones terminales de la estructura bicatenaria de ARNip (-V56L50, -V57L50). Se incubaron conjugados de ARNip-GalNAc 5 pM con FBS al 50 % durante 3 días a 37 °C. Se extrajo el ARN y se analizó en geles de poliacrilamida TBE al 20 %. "NT" indica muestras no tratadas, "FBS" indica tratamiento con FBS. "Control" indica un conjugado de ARNip-GalNAc menos estabilizado de secuencia diferente.
Se probaron los conjugados de GalNAc de un ARNip dirigido a TMPRSS6 que contenían diferentes químicas de estabilización de extremos (fosforotioato, fosforoditioato, fosfodiéster) mediante absorción mediada por receptor en hepatocitos primarios de ratón. Se conjugó GalNAc al extremo 5' de la segunda cadena y se estabilizó internamente mediante cuatro PS (STS12009L4) o no, luego se utilizaron enlaces fosfodiéster en su lugar (STS12009V54L50-V57L50). Se colocaron modificaciones de fosforoditioato en todas las posiciones terminales de la estructura bicatenaria excepto en el extremo 5' de la primera cadena (-V54L50), solo en los extremos 3' (-V55L50, -V57L50) o solo en el extremo 3' de la segunda cadena (-V56L50). En determinados diseños, se utilizaron fosfodiésteres en posiciones terminales de la estructura bicatenaria de ARNip (-V56L50, -V57L50). El experimento se realizó en hepatocitos primarios de ratón. Las células se sembraron a una densidad de 20.000 células por 96 pocillos y se trataron con GalNAc-ARNip de 125 nM a 0,2 nM. Las células se lisaron después de 24 h, se extrajo el a Rn total y se determinaron los niveles de ARNm de TMPRSS6 y PTEN mediante qRT-PCR Taqman. Cada barra representa la media ± DT de tres repeticiones técnicas.
Los resultados y las secuencias relevantes se muestran en las Figuras 48-50.
Ejemplo 45
Reducción de la expresión de TMPRSS6 en hepatocitos murinos primarios mediante conjugados de ARNip-GalNAc con 2'-O-metil-uridina o 5'-(E)-vinilfosfonato-2'-O-metil-uridina reemplazando la 2'-O-metil-adenina en la posición 5' de la primera cadena.
Se sembraron hepatocitos primarios murinos en placas de 96 pocillos recubiertas previamente con colágeno (Thermo Fisher Scientific, n.° A1142803) a una densidad celular de 30.000 células por pocillo y se trataron con conjugados de ARNip a concentraciones que variaban entre 100 nM y 0,1 nM. 24 horas después del tratamiento, las células se lisaron y el ARN se extrajo con el kit InviTrap® RNA Cell Ht S 96/C24 * 96 prep. (Stratec n.° 7061300400) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los niveles de transcripciones de TMPRSS6 y ARNm constitutivo (PtenlI) se cuantificaron mediante análisis TaqMan.
Conjugados de ARNip:
Figure imgf000070_0001
continuación
Figure imgf000071_0001
Leyenda:
mN 2-O-metil ribonucleótido (p. ej., mU-2'-O-metil-uracilo)
fN 2'-fluororibonucleótido (p. ej., fC-2'-fluorocitidina)
(ps) fosforotioato
vinilvinilfosfonato-(E)-fosfonato
Estructura GN2 de acuerdo con la Figura 8B
Cebador y sondas TaqMan
Figure imgf000071_0002
Leyenda:
FAM - 6-carboxifluoresceína (colorante fluorescente)
TAMRA - tetrametilrodamina (desactivador)
BHQ1 - Black Hole Quencher 1 (desactivador oscuro)
Respuesta a la dosis in vitro
Expresión del gen diana en hepatocitos murinos primarios 24 h después del tratamiento con ARNip de TMPRSS6 portador de vinil-(E)-fosfonato 2'OMe-uracilo en la posición 5' de la cadena antisentido y dos enlaces fosforotioato entre los tres primeros nucleótidos (STS12209V4L4 ), vinil-(E)-fosfonato 2'OMe-uracilo en la posición 5' de la cadena antisentido y enlaces fosfodiéster entre los tres primeros nucleótidos (STS12209V5L4), portador de 2'-O-metil-uracilo y dos enlaces fosforotioato entre los tres primeros nucleótidos en la posición 5' (STS12209L4) o portador de 2'-O-metiluracilo y dos enlaces fosfodiéster entre los tres primeros nucleótidos en la posición 5' (STS12209V1L4) o (STS12009L4) como referencia o un ARNip-GalNAc no dirigido (STS18001) a las concentraciones indicadas o sin tratar (NT).
Los resultados se muestran en la Figura 51.
Estabilidad sérica
Estabilidad sérica de conjugados de ARNip incubados durante 4 horas (4h) o 3 días (3d) o sin tratar (0h) en FCS al 50 % a 37 °C. A continuación, se extrajo el ARN mediante extracción con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico. Se visualizó la degradación mediante electroforesis en gel de poliacrilamida TBE y tinción de ARN con SybrGold.
Los resultados se muestran en la Figura 52: Estabilidad sérica de los conjugados de ARNip frente a un control positivo menos estabilizado para la degradación de nucleasas.
TABLA MARI DE E EN IA
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(continuación)
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(continuación)
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(continuación)
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Cuando se muestran enlazadores específicos o enlaces modificados dentro de una secuencia de ARN, tales como PS, PS2, GN, GN2, GN3, etc., éstos son partes opcionales de la secuencia, pero son una realización preferida de esa secuencia. Pueden utilizarse las siguientes abreviaturas:
Figure imgf000085_0002
(continuación)
Figure imgf000086_0001
(continuación)
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(continuación)
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Claims (18)

REIVINDICACIONES
1. Un ácido nucleico para inhibir la expresión de TMPRSS6, que comprende una región bicatenaria que comprende una primera cadena y una segunda cadena que es al menos parcialmente complementaria a la primera cadena, en donde dicha primera cadena es al menos parcialmente complementaria a una parte de ARN transcrito a partir del gen TMPRSS6, en donde dicho ácido nucleico comprende la siguiente primera cadena:
5'-3': aaccagaagaagcagguga;
opcionalmente en donde el ácido nucleico comprende además la siguiente segunda cadena:
5'-3': ucaccugcuucuucugguu.
2. Un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, en donde se modifican uno o más nucleótidos en la primera y/o en la segunda cadenas, para formar nucleótidos modificados.
3. Un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2, en donde dicha primera cadena comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 17, y en donde dicha segunda cadena comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 18.
Figure imgf000089_0001
en donde las modificaciones específicas están representadas por los siguientes números
1 = 2'F-dU,
2 = 2'F-dA,
3 = 2'F-dC,
4 = 2'F-dG,
5 = 2'-OMe-rU;
6 = 2'-OMe-rA;
7 = 2'-OMe-rC;
8 = 2'-OMe-rG.
4. Un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la primera cadena consiste en la secuencia: 5'-3': aaccagaagaagcagguga.
5. Un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4, en donde se modifican uno o más nucleótidos en la primera y/o en la segunda cadenas, para formar nucleótidos modificados.
6. Un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 5, en donde dicha primera cadena consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 17, y en donde dicha segunda cadena comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 18.
Figure imgf000089_0002
en donde las modificaciones específicas están representadas por los siguientes números
1 = 2'F-dU,
2 = 2'F-dA,
3 = 2'F-dC,
4 = 2'F-dG,
5 = 2'-OMe-rU;
6 = 2'-OMe-rA;
7 = 2'-OMe-rC;
8 = 2'-OMe-rG.
7. Un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores conjugado con un ligando, opcionalmente en el extremo 5' de la segunda cadena.
8. Un ácido nucleico conjugado de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el ligando comprende (i) una o más fracciones de N-acetil-galactosamina (GalNAc) y derivados de las mismas, y (ii) un enlazador, en donde el enlazador conjuga las fracciones de GalNAc con el ácido nucleico.
9. Un ácido nucleico conjugado de acuerdo con la reivindicación 7 o la reivindicación 8, en donde el enlazador es una estructura ramificada bivalente, trivalente o tetravalente.
10. Un ácido nucleico conjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, que tiene la estructura:
Figure imgf000090_0001
Figure imgf000091_0001
Figure imgf000092_0001
Figure imgf000093_0001
en donde Z es un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
11. Un ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o un ácido nucleico conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en donde el ácido nucleico está estabilizado en los extremos 5' y/o 3' de una cualquiera o de ambas cadenas.
12. Un ácido nucleico o un ácido nucleico conjugado de acuerdo con la reivindicación 11 que comprende un enlace fosforotioato entre los uno, dos o tres nucleótidos 3' y/o nucleótidos 5' terminales de la primera y/o de la segunda cadenas, o que comprende un enlace fosforoditioato.
13. Un ácido nucleico o un ácido nucleico conjugado de acuerdo con la reivindicación 12 que comprende un enlace fosforotioato entre cada uno de los tres nucleótidos 3'-terminales y entre cada uno de los tres nucleótidos 5'-terminales en la primera cadena, y un enlace fosforotioato entre los tres nucleótidos terminales del extremo 3' de la segunda cadena, que tiene la estructura
Figure imgf000094_0001
14. Una composición que comprende un ácido nucleico o un ácido nucleico conjugado de cualquiera de las reivindicaciones anteriores y un excipiente fisiológicamente aceptable.
15. Un ácido nucleico o un ácido nucleico conjugado o una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso en terapia.
16. Un ácido nucleico o un ácido nucleico conjugado o una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso en el tratamiento de una enfermedad o de un trastorno, en donde la enfermedad o el trastorno se seleccionan del grupo que comprende hemocromatosis, porfiria eritropoyética, porfiria cutánea tardía y trastornos de la sangre, tales como p-talasemia o enfermedad de células falciformes, anemia diseritropoyética congénita, síndromes de insuficiencia medular, mielodisplasia y sobrecarga transfusional de hierro.
17. El ácido nucleico o el ácido nucleico conjugado o la composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 16, en donde dicha enfermedad o dicho trastorno se seleccionan del grupo que comprende hemocromatosis, porfiria eritropoyética, sobrecarga transfusional de hierro y trastornos de la sangre.
18. Un ácido nucleico o un ácido nucleico conjugado para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en donde el ácido nucleico es para uno o más o la totalidad de:
(i) tratamiento de la anemia, determinada opcionalmente de manera adecuada por un aumento de la hemoglobina; y/o
(ii) mejora de la esplenomegalia, determinada opcionalmente por una reducción del tamaño o peso del bazo: y/o (iii) reducción de la eritropoyesis por estrés en el bazo, determinada opcionalmente por la proporción de eritroblastos y células eritroides desnucleadas determinada mediante análisis de FACS; y/o
(iv) mejora de la maduración de los glóbulos rojos/la eritropoyesis en la médula ósea, determinada opcionalmente por la proporción de eritroblastos y células eritroides desnucleadas determinada mediante análisis de FACS.
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