ES2936117T3 - Vectores recombinantes de VHT que expresan múltiples antígenos de patógenos aviares y vacunas que los comprenden - Google Patents

Vectores recombinantes de VHT que expresan múltiples antígenos de patógenos aviares y vacunas que los comprenden Download PDF

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Joyce Pritchard
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
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Abstract

La presente invención proporciona vectores del herpesvirus de pavos recombinantes (HVT) que contienen y expresan antígenos de patógenos aviares, composiciones que comprenden los vectores HVT recombinantes y vacunas polivalentes que comprenden los vectores HVT recombinantes. La presente invención proporciona además métodos de vacunación contra una variedad de patógenos aviares y métodos para producir los vectores HVT recombinantes. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Vectores recombinantes de VHT que expresan múltiples antígenos de patógenos aviares y vacunas que los comprenden
REFERENCIA CRUZADA DE SOLICITUDES RELACIONADAS
[0001] La presente solicitud reivindica la prioridad de la solicitud provisional de EE.UU. 62/433.842 presentada el 14 de diciembre de 2016.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
[0002] La presente invención se refiere a vectores virales recombinantes para la inserción y la expresión de genes exógenos para su uso como vehículos de inmunización segura para la protección contra una variedad de patógenos. También se refiere a una composición o vacuna multivalente que comprende uno o más vectores virales recombinantes para la protección contra una variedad de patógenos. En el presente documento se describen los procedimientos de fabricación y uso de los vectores virales recombinantes.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
[0003] La vacunación de aves domésticas se utiliza de manera amplia para proteger a las bandadas de aves domésticas contra enfermedades graves que incluyen enfermedad de Newcastle (ND), enfermedad de bursitis infecciosa (IBD), enfermedad de Marek (MD), bronquitis infecciosa (IB), laringotraqueítis infecciosa (ITL) y gripe aviar (AI). La ND está causada por paramixovirus 1 aviar (APMV-1), también denominado virus de ND (n Dv ) que pertenece a la familia Paramyxoviridae. La MD está causada por Gallid herpesvirus 2 (familia Herpesviridae), también conocido como virus de DM de serotipo 1 (MDV1). La IB está causada por el virus de IB (IBV) que pertenece a la familia Coronaviridae, la ILT está causada por Gallid herpesvirus 1 (familia Herpesviridae), también denominado virus de ILT (ILTV) y AI está causada por virus de AI (AIV) que pertenece a la familia Orthomyxoviridae.
[0004] Se ha propuesto un número de vectores virales aviares recombinantes con el fin de vacunar a las aves contra estos patógenos aviares. Los vectores virales utilizados comprenden virus de la viruela de las aves, especialmente, viruela aviar (EP-A-0,517,292), virus de Marek, tal como serotipos 1,2 y 3 (HVT) (WO87/04463; WO2013/082317), o alternativamente los ITLV, NDV y adenovirus aviar. Cuando algunos de estos vectores aviares recombinantes se utilizaron para la vacunación, muestran niveles variables de protección.
[0005] Se han desarrollado y licenciado varios vectores recombinantes de herpesvirus de pavos (HVT, también denominado Meleagrid herpesvirus 1 o MDV de serotipo 3) que expresan antígenos de diferentes patógenos (Patentes de EE. UU. Números 5,980,906, 5,853,733, 6,183,753, 5,187,087) que incluyen IBDV, NDV, ILTV y AIV. De interés particular es un gen protector de VP2 de IBDV que expresa el vector de HVT que ha mostrado ventajas claras sobre vacunas clásicas de IBD (Bublot et al J.Comp. Path. 2007, Volumen 137, S81-S84; US 5,980,906). Otros vectores de HVT de interés son aquellos que expresan gen o genes protectores de NDV (Morgan et al 1992, Avian dis. 36, 858-70; US 6,866,852; US 5,650,153), ILTV (Johnson et al, 2010 Avian Dis 54, 1251-1259; US 6,299,882; US 5,853,733, EP 1801204), o NDV y IBDV (US 9,114,108; WO 2016102647, WO 2013/057235, WO 2015032910, WO 2013144355). US2016/0158347 describió el uso del agonista TLR21 de oligodesoxinucleótido para aumentar la respuesta inmune contra el antígeno que se expresa por el vector de HVT.
[0006] Uno de los problemas prácticos de utilizar conjuntamente varias vacunas recombinantes basadas en HVT es su interferencia. Se induce una protección más baja como mínimo contra una de las enfermedades cuando se mezclan dos recombinantes de HVT que expresan antígenos diferentes (Rudolf Heine 2011; Issues of the Poultry Recombinant Viral Vector Vaccines which May Cause an Effect on the Economic Benefits of those Vaccines; artículo presentado al XVII Congreso de la World Veterinary Poultry Association (WVPA) en Cancún, México,14-18 de agosto de 2011; Slacum G, Hein R. y Lynch P., 2009, The compatibility of HVT recombinants with other Marek's disease vaccines, 58a Conferencia Europea de Enfermedades Avícolas, Sacramento, CA, EE. UU., 23-25 de marzo, página 84).
[0007] Considerando el efecto potencial de patógenos animales, tales como NDV e IBDV, sobre la salud pública veterinaria y la economía, se necesitan procedimientos eficaces de prevención de la infección y protección de animales. Existe la necesidad de una solución de vacunas combinadas de vectores eficaces y un procedimiento adecuado de fabricación de la vacuna que podrían remediar el problema de interferencia que se observa entre dos vacunas de vector basadas en HVT.
[0008] El documento WO2013082327 da a conocer diferentes vectores de HVT que comprenden una o más secuencias heterólogas para la expresión de antígenos de patógenos aviares. El uso de una secuencia de IRES o P2A no se divulga.
[0009] El documento WO2016102647 da a conocer un casete de expresión para la expresión de VP2 de IBDV y NDV-F a partir del sitio US2 de HVT. El uso de una secuencia de IRES o P2A no se divulga.
[0010] El documento CN106701693 da a conocer HVT recombinante que comprende secuencias que codifican NDV-F y VP2 de IBDV. El uso de una secuencia de IRES o P2A no se divulga.
CARACTERÍSTICAS
Características de la invención:
[0011] En un primer aspecto, la presente invención proporciona un vector de herpesvirus recombinante de pavos (HVT) que comprende dos polinucleótidos heterólogos, donde cada uno codifica y expresa un antígeno de un patógeno aviar, en donde los dos antígenos son diferentes, en donde los dos polinucleótidos heterólogos se insertan en una región no esencial del genoma de HVT, además en donde los dos polinucleótidos heterólogos están unidos por un polinucleótido que codifica P2A.
[0012] En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un vector de HVT recombinante que comprende dos polinucleótidos heterólogos, donde cada uno codifica y expresa un antígeno de un patógeno aviar, en donde los dos antígenos son diferentes, en donde los dos polinucleótidos heterólogos se insertan en una región no esencial del genoma de HVT, además en donde los dos polinucleótidos heterólogos están unidos por IRES.
[0013] En un tercer aspecto, la presente invención proporciona una composición o una vacuna que comprende uno o más vectores de HVT de acuerdo con la invención.
[0014] En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona una composición, vacuna o vector de la invención para su uso en un procedimiento de vacunación o inducción de una respuesta protectora en un animal contra uno o más patógenos aviares, que comprende como mínimo una administración de la composición o vector, en donde el animal es un ave.
Características de las principales enseñanzas técnicas:
[0015] En el presente documento se describen resultados sorprendentes cuando las composiciones o vacunas polivalentes que comprenden un vector de HVT recombinante eran eficaces para proteger a los animales frente a una variedad de patógenos aviares sin interferencia. También se observaron resultados sorprendentes cuando diferentes combinaciones de promotores/enlazadores, gen optimizado por codones, colas de poliA y sitios de inserción confirieron diferentes niveles de eficacia y estabilidad a la expresión de uno o más genes heterólogos in vivo e in vitro. En el presente documento se describen vectores de HVT estables que son capaces de expresar de manera eficaz múltiples genes y de superar el problema bien conocido de que los vectores de HVT con múltiples inserciones son menos estables.
[0016] En el presente documento se describe un vector de HVT recombinante que comprende uno, dos o más polinucleótidos heterólogos que codifican y expresan como mínimo un antígeno de un patógeno aviar.
[0017] En el presente documento se describe una composición o una vacuna que comprenden uno o más vectores de HVT recombinantes, que comprenden uno, dos o más polinucleótidos heterólogos que codifican y expresan como mínimo un antígeno de un patógeno aviar.
[0018] En el presente documento se describe un procedimiento de vacunación de un animal o de inducción de una respuesta inmunogénica o protectora en un animal, que comprende como mínimo una administración de la composición o vector de la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0019] La siguiente descripción detallada, proporcionada a modo de ejemplo, se puede entender conjuntamente con los dibujos adjuntos, en los que:
Figura 1 es una tabla que muestra la SEQ ID NO asignada a cada secuencia de ADN y proteínas.
Figura 2 describe la estructura del genoma de HVT y sus sitios de inserción.
Figura 3 muestra un mapa del plásmido pFSV40VP2.
Figura 4 muestra la representación esquemática de los sitios de unión a cebador para vHVT309.
Figura 5 describe el resultado de identidad por PCR de vHVT309.
Figura 6 muestra un mapa del plásmido pFIRESVP2.
Figura 7 muestra la representación esquemática de los sitios de unión a cebador para vHVT310.
Figura 8 describe el resultado de identidad por PCR de vHVT310.
Figura 9 muestra un mapa del plásmido pFP2AVP2.
Figura 10 muestra la representación esquemática de los sitios de unión a cebador para vHVT311.
Figura 11 describe el resultado de identidad por PCR de vHVT311.
Figura 12 muestra un mapa del plásmido pVP2IRESgD.
Figura 13 muestra la representación esquemática de los sitios de unión a cebador para vHVT317.
Figura 14 describe el resultado de identidad por PCR de vHVT317.
Figura 15 muestra un mapa del plásmido pFwtSV40VP2.
Figura 16 muestra la representación esquemática de los sitios de unión a cebador para vHVT313.
Figura 17 describe el resultado de identidad por PCR de vHVT313.
Figura 18 muestra un mapa del plásmido pVP2IRESFwt.
Figura 19 muestra la representación esquemática de los sitios de unión a cebador para vHVT316.
Figura 20 describe el resultado de identidad por PCR de vHVT316.
Figure 21A-21D muestra las alineaciones de secuencias de ADN y proteínas.
Figura 22 muestra un mapa del plásmido US2SVgDwtsyn de HVT.
Figura 23 muestra un mapa del plásmido pHVTIG1gDCaFopt.
Figura 24 muestra la representación esquemática de los sitios de unión a cebador para vHVT308.
Figura 25 describe el resultado de identidad por PCR de vHVT308.
Figura 26 muestra un mapa del plásmido pFwtIRESgD.
Figura 27 muestra la representación esquemática de los sitios de unión a cebador para vHVT322.
Figura 28 describe el resultado de identidad por PCR de vHVT322.
Figura 29 muestra un mapa del plásmido pHVTUS2SVgDwtsyn.
Figura 30 muestra la representación esquemática de los sitios de unión a cebador para vHVT406.
Figura 31 describe el resultado de identidad por PCR de vHVT406.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
[0020] Los términos singulares «un», «una» y «los/las» incluyen los referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De manera similar, la palabra «o» pretender incluir «y» a menos que el contexto indique claramente lo contrario. La palabra «o» significa cualquier miembro de una lista particular y también incluye cualquier combinación de los miembros de aquella lista.
[0021] También se entenderá que, aunque los términos primero, segundo, etc. pueden utilizarse en el presente documento para describir diferentes elementos, estos elementos no deberían estar limitados por estos términos. Estos términos se utilizan únicamente para distinguir un elemento del otro. Por ejemplo, una primera expresión podría denominarse una segunda expresión, y, de manera similar, una segunda expresión podría denominarse una primera expresión. Todos los procedimientos o procesos descritos en el presente documento se pueden llevar a cabo en cualquier orden adecuado, a menos que se indique lo contrario en el presente documento o a menos que este en desacuerdo con el contexto.
[0022] El término "animal" se utiliza en el presente documento para incluir a todos los mamíferos, aves y peces. El animal, tal como se utiliza en el presente documento, puede seleccionarse entre el grupo que consiste en equinos (por ejemplo, caballos), caninos (por ejemplo, perros, lobos, zorros, coyotes, chacales), felinos (por ejemplo, leones, tigres, gatos domésticos, gatos salvajes, otros gatos grandes y otros felinos que incluyen guepardos y linces), bovinos (por ejemplo, ganado), porcinos (por ejemplo, cerdos), ovinos (por ejemplo, ovejas, cabras, lamas, bisontes), aves (por ejemplo, gallinas, patos, gansos, pavos, codornices, faisanes, loros, pinzones, halcones, cuervos, avestruces, emús y casuarios), primates (por ejemplo, prosimios, tarseros, monos, gibones, simios), humanos y peces. El término «animal» incluye también a un animal individual en todas las etapas de desarrollo, incluyendo las etapas embrionaria y fetal.
[0023] El término «aproximadamente», tal como se utiliza en el presente documento, significa aproximadamente, en la región de, más o menos, o alrededor de. Cuando el término «aproximadamente» se utiliza en conjunto con un intervalo numérico, modifica aquel intervalo extendiendo los límites por encima y por debajo de los valores numéricos establecidos. De manera general, el término «aproximadamente» se utiliza en el presente documento para modificar un valor numérico por encima y por debajo del valor declarado mediante una diferencia del 10 %. En un aspecto, el término «aproximadamente» significa más o menos el 20 % del valor numérico del número con el que se está utilizando. Por consiguiente, aproximadamente el 50 % significa el intervalo del 45 % - 55 %. Los intervalos numéricos enumerados en el presente documento mediante los extremos incluyen todos los números y fracciones comprendidos dentro de ese intervalo (por ejemplo, desde 1 hasta 5 incluye 1, 1,5, 2, 2,75, 3, 3,90, 4 y 5). También se entiende que todos los números y fracciones de los mismos pueden modificarse por el término «aproximadamente».
[0024] Los términos «polipéptido» y «proteína» se utilizan de manera intercambiable en el presente documento para hacer referencia a un polímero de residuos de aminoácidos consecutivos.
[0025] El término «ácido nucleico», «nucleótido» y «polinucleótido» se utilizan de manera intercambiable y hacen referencia a ARN, ADN, ADNc o ARNc y los derivados de los mismos, tales como aquellos que contienen esqueletos modificadas. Se debería entender que en el presente documento se describen polinucleótidos que comprenden secuencias complementarias a aquellas descritas en el presente documento. El «polinucleótido» contemplado en el presente documento incluye tanto la cadena directa (5' a 3') como la cadena complementaria inversa (3' a 5'). Los polinucleótidos descritos en el presente documento pueden prepararse de diferentes maneras (por ejemplo, mediante síntesis química, mediante clonación de genes, etc.) y pueden tomar varias formas (por ejemplo, lineales o ramificados, de cadena única o doble, o un híbrido de las mismas, cebadores, sondas, etc.).
[0026] El término «ADN genómico» o «genoma» se utiliza de manera intercambiable y hace referencia a la información genética hereditaria de un organismo huésped. El ADN genómico comprende el ADN del núcleo (también denominado ADN cromosómico), pero también el ADN de los plastos (por ejemplo, cloroplastos) y otros orgánulos celulares (por ejemplo, mitocondrias). El ADN genómico o genoma contemplado en el presente documento también hace referencia al ARN de un virus. El ARN puede ser ARN de cadena positiva o de cadena negativa. El término «ADN genómico» contemplado en el presente documento incluye el ADN genómico que contiene secuencias complementarias a aquellas descritas en el presente documento. El término «ADN genómico» también hace referencia a ARN mensajero (ARNm), ADN complementario (ADNc) y ARN complementario (ARNc).
[0027] El término «gen» se utiliza en un sentido amplio para hacer referencia a cualquier segmento de polinucleótido asociado a una función biológica. De este modo, los genes o los polinucleótidos incluyen intrones y exones como en la secuencia genómica, o solamente las secuencias de codificación como en ADNc, tal como un marco de lectura abierto (ORF), empezando desde el codón de inicio (codón de metionina) y finalizando con una señal de terminación (codón de terminación). Los genes y los polinucleótidos pueden incluir también las regiones que regulan su expresión, tal como inicio de la transcripción, traducción y terminación de la transcripción. De este modo, también se incluyen los promotores y las regiones de unión a ribosomas (de manera general estos elementos reguladores se encuentran aproximadamente entre 60 y 250 nucleótidos en la dirección 5' del codón de inicio de la secuencia de codificación o gen; Doree S M et al.; Pandher K et al.; Chung J Y et al.), los terminadores de la transcripción (de manera general el terminador se ubica a menos de aproximadamente 50 nucleótidos en la dirección 3' del codón de terminación de la secuencia de codificación o gen; Ward C K et al.). El gen o el polinucleótido también hacen referencia a un fragmento de ácido nucleico que expresa ARNm o ARN funcional, o codifica una proteína específica y que incluye secuencias reguladoras.
[0028] El término «ADN heterólogo», tal como se utiliza en el presente documento, hace referencia al ADN derivado de un organismo diferente, tal como un tipo de célula diferente o una especie diferente del receptor. El término también hace referencia a un ADN o un fragmento del mismo en el mismo genoma del ADN huésped, en donde el ADN heterólogo está insertado en una región del genoma que es diferente de su localización original.
[0029] Tal como se utiliza en el presente documento, el término «antígeno» o «inmunógeno» significa una sustancia que induce una respuesta inmune específica en un animal huésped. El antígeno puede comprender un organismo completo, muerto, atenuado o vivo; una subunidad o parte de un organismo; un vector recombinante que contiene una inserción con propiedades inmunogénicas; una parte o fragmento de ADN capaz de inducir una respuesta inmune al presentarse a un animal huésped; un polipéptido, un epítopo, un hapteno o cualquier combinación de los mismos. Alternativamente, el inmunógeno o el antígeno pueden comprender una toxina o una antitoxina.
[0030] El término «proteína o péptido inmunogénico», tal como se utiliza en el presente documento, incluye los polipéptidos que son inmunológicamente activos en el sentido que cuando se administran al huésped, son capaces de provocar una respuesta inmune de tipo humoral y/o celular dirigida contra la proteína. Preferiblemente, el fragmento de proteína es tal que posee sustancialmente la misma actividad inmunológica que la proteína total. De este modo, un fragmento de proteína descrito en el presente documento comprende o consiste esencialmente en o consiste en como mínimo un epítopo o un determinante antigénico. Una proteína o un polipéptido «inmunogénico», tal como se utiliza en el presente documento, incluye la secuencia de longitud completa de la proteína, análogos de los mismos o fragmentos inmunogénicos de los mismos. Por «fragmento inmunogénico» se entiende un fragmento de una proteína que incluye uno o más epítopos y, por tanto, provoca la respuesta inmunológica descrita anteriormente. Dichos fragmentos pueden identificarse usando cualquier número de técnicas de mapeo de epítopos bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, los epítopos lineales pueden determinarse mediante, por ejemplo, la síntesis simultánea de cantidades grandes de péptidos sobre soportes sólidos, correspondiendo los péptidos a las porciones de la molécula de proteína, y la reacción de los péptidos con los anticuerpos mientras los péptidos todavía estén unidos a los soportes. De manera similar, los epítopos conformacionales se identifican fácilmente determinando la conformación espacial de aminoácidos, tal como, por ejemplo, mediante cristalografía de rayos X y la resonancia magnética nuclear bidimensional.
[0031] El término «proteína o péptido inmunogénico» contempla adicionalmente las eliminaciones, las adiciones y las sustituciones en la secuencia, siempre que el polipéptido funcione para producir una respuesta inmunológica tal como se define en el presente documento. El término «variación conservadora» significa la sustitución de un residuo de aminoácido por otro residuo biológicamente similar o la sustitución de un nucleótido en una secuencia de nucleótidos de tal modo que el residuo de aminoácido codificado no cambie o sea otro residuo biológicamente similar. A este respecto, las sustituciones particularmente preferidas serán generalmente de naturaleza conservadora, es decir, aquellas sustituciones que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos. Por ejemplo, los aminoácidos se dividen generalmente en cuatro familias: (1) ácidos: aspartato y glutamato; (2) básicos: lisina, arginina, histidina; (3) no polares: alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polares no cargados: glicina, asparagina, glutamina, cistina, serina, treonina, tirosina. La fenilalanina, el triptófano y la tirosina a veces se clasifican como aminoácidos aromáticos. Los ejemplos de variaciones conservadoras incluyen la sustitución de un residuo hidrófobo, tal como isoleucina, valina, leucina o metionina, por otro residuo hidrófobo, o la sustitución de un residuo polar por otro residuo polar, tal como la sustitución de arginina por lisina, ácido glutámico por ácido aspártico, o glutamina por asparagina, y similares; o una sustitución conservadora similar de un aminoácido con un aminoácido relacionado estructuralmente que no tendrá un efecto mayor sobre la actividad biológica. Las proteínas que tienen sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la molécula de referencia, pero que poseen sustituciones de aminoácidos menores que no afectan sustancialmente a la inmunogenicidad de la proteína se encuentran, por lo tanto, dentro de la definición del polipéptido de referencia. Todos los polipéptidos producidos por estas modificaciones se incluyen en el presente documento. El término «variación conservadora» también incluye el uso de un aminoácido sustituido en lugar de un aminoácido original no sustituido a condición de que los anticuerpos desarrollados contra el polipéptido sustituido también inmunoreaccionen con el polipéptido no sustituido.
[0032] El término «epítopo» se refiere al sitio en un antígeno o un hapteno al que responden las células B y/o las células T específicas. El término también se utiliza de manera intercambiable con «determinante antigénico» o «sitio determinante antigénico». Los anticuerpos que reconocen el mismo epítopo se pueden identificar en un inmunoensayo simple que muestra la capacidad de un anticuerpo para bloquear la unión de otro anticuerpo a un antígeno diana.
[0033] Una «respuesta inmunológica» a una composición o una vacuna es el desarrollo en el huésped de una respuesta inmune celular y/o mediada por anticuerpos a una composición o una vacuna de interés. Normalmente, una «respuesta inmunológica» incluye, pero no se limita a, uno o más de los siguientes efectos: la producción de anticuerpos, células B, células T auxiliares y/o células T citotóxicas, dirigidos específicamente a un antígeno o antígenos incluidos en la composición o vacuna de interés. Preferiblemente, el huésped mostrará una respuesta inmunológica terapéutica o protectora, de tal manera que se aumentará la resistencia a una nueva infección y/o se reducirá la gravedad clínica de la enfermedad. Dicha protección se demostrará mediante una reducción o una ausencia de los síntomas que normalmente presenta un huésped infectado, un tiempo de recuperación más rápido y/o un título viral reducido en el huésped infectado.
[0034] Los términos «recombinante» y «modificado genéticamente» se utilizan de manera intercambiable y hacen referencia a cualquier modificación, alteración o diseño de un polinucleótido o una proteína en su forma o estructura nativa, o cualquier modificación, alteración o diseño de un polinucleótido o una proteína en su ambiente o entorno nativo. La modificación, alteración o diseño de un polinucleótido o una proteína pueden incluir, pero no limitarse a, la eliminación de uno o más nucleótidos o aminoácidos, la eliminación de un gen completo, la optimización de codones de un gen, la sustitución conservadora de aminoácidos, la inserción de uno o más polinucleótidos heterólogos.
[0035] Los términos «vacuna o composición polivalente», «combinación o vacuna o composición combo» y «vacuna o composición multivalente» se utilizan de manera intercambiable para hacer referencia a una composición o una vacuna que contiene más de una composición o vacuna. La vacuna o composición polivalente puede contener dos, tres, cuatro o más composiciones o vacunas. La vacuna o composición polivalente puede comprender vectores virales recombinantes, virus de tipo salvaje activos o atenuados o muertos o una mezcla de vectores virales recombinantes y virus de tipo salvaje en formas activa o atenuada o muerta.
[0036] En el presente documento se describe un vector viral de HVT recombinante que comprende uno, dos o más polinucleótidos heterólogos que codifican y expresan como mínimo un antígeno o polipéptido de un patógeno aviar. Las cepas de HVT utilizadas para el vector viral recombinante pueden ser cualquier cepa de HVT que incluyen, pero no se limita a, la cepa FC126 de HVT (Igarashi T. et al., J. Gen. Virol. 70, 1789-1804, 1989).
[0037] Los genes que codifican un antígeno o polipéptido pueden ser aquellos que codifican la proteína de fusión del Virus de Enfermedad de Newcastle (NDV-F), la hemaglutinina neuraminidasa del Virus de la Enfermedad de Newcastle (NDV-HN), la glicoproteína C (gC) del Virus de la Enfermedad de Marek, la glicoproteína B (gB) del Virus de la Enfermedad de Marek, la glicoproteína E (gE) del Virus de la Enfermedad de Marek, la glicoproteína I (gI) del Virus de la Enfermedad de Marek, la glicoproteína H (gH) del Virus de la Enfermedad de Marek o glicoproteína L (gL) del Virus de la Enfermedad de Marek, VP2 del Virus de la Enfermedad Infecciosa de la Bolsa (IBDV), VPX de IBDV, VP3 de IBDV, VP4 de IBDV, glicoproteína B del ILTV, glicoproteína I del ILTV, UL32 de ILTV, glicoproteína D del ILTV, glicoproteína E del ILTV, glicoproteína C del ILTV, hemaglutinina (HA) de la gripe, neuraminidasa (NA) de la gripe, genes protectores derivados de Mycoplasma gallisepticum (MG), o Mycoplasma synoviae (MS), o combinaciones de los mismos. El antígeno o el polipéptido puede ser cualquier antígeno del patógeno aviar seleccionado entre el grupo que consiste en virus de encefalomielitis aviar, reovirus aviar, paramixovirus aviar, metapneumovirus aviar, virus de la gripe aviar, adenovirus aviar, virus de la viruela aviar, coronavirus aviar, rotavirus aviar, virus de la anemia del pollo, astrovirus aviar, parvovirus aviar, retrovirus aviar, picornavirus aviar, coccidiosis (Eimeria sp.), Campylobacter sp., Salmonella sp., Pasteurella sp., Avibacterium sp., Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, Clostridium sp. y Escherichia coli.
[0038] Además, los homólogos de antígeno o polinucleótidos mencionados anteriormente se contemplan en el presente documento. Tal como se utiliza en el presente documento, el término «homólogos» incluye ortólogos, análogos y parálogos. El término «análogos» hace referencia a dos polinucleótidos o polipéptidos que tienen la misma función o similar, pero que se han desarrollado por separado en organismos no relacionados. El término «ortólogos» hace referencia a dos polinucleótidos o polipéptidos de especies diferentes, pero que se han desarrollado a partir de un gen ancestral común mediante especiación. Normalmente, los ortólogos codifican los polipéptidos que tienen las funciones iguales o similares. El término «parálogos» hace referencia a dos polinucleótidos o polipéptidos que están relacionados mediante duplicación dentro de un genoma. Normalmente los parálogos tienen funciones diferentes, pero estas funciones pueden tener relación. Los análogos, los ortólogos y los parálogos de un polipéptido de tipo salvaje pueden diferenciarse del polipéptido de tipo salvaje por modificaciones postraduccionales, por diferencias en secuencias de aminoácidos o por ambas. En particular, los homólogos descritos en el presente documento mostrarán de manera general como mínimo un 80-85 %, 85-90 %, 90-95 %, o 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con todas o una parte de secuencias de polinucleótido o polipéptido de antígenos descritos anteriormente, y mostrarán una función similar.
[0039] En el presente documento se describe un vector vírico de HVT recombinante que comprende uno, dos o más polinucleótidos heterólogos que codifican y expresan el antígeno o polipéptido de n DV-F, el antígeno o polipéptido VP2 de IBDV, el antígeno o polipéptido gD de ILTV o una combinación de los mismos. En el presente documento se describe el antígeno o el polipéptido de NDV-F que tiene como mínimo el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene la secuencia como la establecida en las SEQ ID NO: 5 o 22, o una variante conservadora, una variante alélica, un homólogo o un fragmento inmunogénico que comprende como mínimo ocho o como mínimo diez aminoácidos consecutivos de uno de estos polipéptidos o una combinación de estos polipéptidos. En el presente documento se describe el polinucleótido heterólogo que codifica un antígeno o polipéptido de NDV-F que tiene como mínimo el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene la secuencia como la establecida en la SEQ ID NO: 5. En el presente documento se describe el polinucleótido heterólogo que tiene como mínimo el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con un polinucleótido que tiene la secuencia como la establecida en la SEQ ID NO: 21.
[0040] En el presente documento se describe el antígeno o el polipéptido de VP2 de IBDV que tiene como mínimo el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene la secuencia como la establecida en la SEQ ID NO: 2, o una variante conservadora, una variante alélica, un homólogo o un fragmento inmunogénico que comprende como mínimo ocho o como mínimo diez aminoácidos consecutivos de uno de estos polipéptidos o una combinación de estos polipéptidos. En el presente documento se describe el polinucleótido heterólogo que codifica un antígeno o polipéptido de VP2 de IBDV que tiene como mínimo el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene la secuencia como la establecida en la SEQ ID NO: 2. En el presente documento se describe el polinucleótido heterólogo que tiene como mínimo el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con un polinucleótido que tiene la secuencia como la establecida en la SEQ ID NO: 1.
[0041] En el presente documento se describe el antígeno o el polipéptido gD de ILTV que tiene como mínimo el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene la secuencia como la establecida en la SEQ ID NO: 17, o una variante conservadora, una variante alélica, un homólogo o un fragmento inmunogénico que comprende como mínimo ocho o como mínimo diez aminoácidos consecutivos de uno de estos polipéptidos o una combinación de estos polipéptidos. En el presente documento se describe el polinucleótido heterólogo que codifica un antígeno o polipéptido gD de ILTV que tiene como mínimo el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene la secuencia como la establecida en la SEQ ID NO: 17. En el presente documento se describe el polinucleótido heterólogo que tiene como mínimo el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con un polinucleótido que tiene la secuencia como la establecida en la SEQ ID NO: 16.
[0042] Las variantes incluyen variantes alélicas. El término «variante alélica» hace referencia a un polinucleótido o un polipéptido que contiene polimorfismos que provocan cambios en las secuencias de aminoácidos de una proteína y que existen dentro de una población natural (por ejemplo, una especie o variedad de virus). Tales variaciones alélicas naturales típicamente pueden dar lugar a una variación del 1-5 % en un polinucleótido o un polipéptido. Las variantes alélicas pueden identificarse mediante la secuenciación de la secuencia de ácido nucleico de interés en un número de especies diferentes, que se puede llevar a cabo fácilmente utilizando sondas de hibridación para identificar el locus genético del mismo gen en aquellas especies. Cualquiera y todas tales variaciones de ácido nucleico y polimorfismos o variaciones de aminoácidos resultantes que son el resultado de una variación alélica natural y no altera la actividad funcional del gen de interés, se contemplan en el presente documento.
[0043] El término «identidad» en referencia a las secuencias puede hacer referencia a, por ejemplo, el número de posiciones con nucleótidos o aminoácidos idénticos dividido por el número de nucleótidos o aminoácidos en la secuencia más corta de las dos, en donde la alineación de las dos secuencias se puede determinar según el algoritmo de Wilbur y Lipman (Wilbur y Lipman). La identidad de secuencia o la similitud de secuencia de dos secuencias de aminoácidos, o la identidad de secuencia entre las dos secuencias de nucleótidos se pueden determinar utilizando el programa informático Vector NTI (Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA). Cuando se dice que las secuencias de ARN son similares, o tienen un grado de identidad u homología de secuencia con las secuencias de ADN, la timidina (T) en la secuencia de ADN se considera igual al uracilo (U) en la secuencia de ARN. De este modo, se contemplan en el presente documento secuencias de ARN y pueden derivarse de las secuencias de ADN, considerando la timidina (T) en la secuencia de ADN igual al uracilo (U) en las secuencias de ARN.
[0044] Los polinucleótidos de la divulgación incluyen secuencias que se degeneran como resultado del código genético, por ejemplo, el uso del codones optimizados para un huésped específico. Tal como se utiliza en el presente documento, «optimizado» hace referencia a un polinucleótido que se modifica genéticamente para aumentar su expresión en una especie determinada. Para proporcionar los polinucleótidos optimizados que codifican los polipéptidos de NDV-F, VP2 de IBDV o gD de ILTV, se puede modificar la secuencia de ADN de estos genes para 1) comprender codones preferidos por genes altamente expresados en una especie particular; 2) comprender un contenido de A+T o G+C en una composición de bases de nucleótidos a aquella encontrada de manera sustancial en dicha especie; 3) formar una secuencia de iniciación de dicha especie; o 4) eliminar las secuencias que causan desestabilización, poliadenilación inadecuada, degradación y terminación de ARN o que forman horquillas de estructura secundaria o sitios de empalme de ARN. Se puede lograr la expresión aumentada de proteína F de NDV, VP2 de IBDV o gD de ILTV en dichas especies utilizando la frecuencia de distribución del uso de codones en eucariotas y procariotas, o en una especie particular. El término «frecuencia del uso de codones preferidos» hace referencia a la preferencia mostrada por una célula huésped específica en el uso de codones de nucleótidos para especificar un aminoácido dado. Existen 20 aminoácidos naturales, la mayoría de los cuales son especificados por más de un codón. Por tanto, todas las secuencias de nucleótidos degeneradas se incluyen en la divulgación siempre y cuando la secuencia de aminoácidos del polipéptido de NDV-F, VP2 de IBDV o gD de ILTV codificado por la secuencia de nucleótidos no se altere de manera funcional.
[0045] La expresión satisfactoria de los polinucleótidos heterólogos por el virus infeccioso recombinante/modificado requiere dos condiciones. Primero, los polinucleótidos heterólogos deben insertarse o introducirse en una región del genoma del virus para que el virus modificado permanezca visible. La segunda condición para la expresión de los polinucleótidos heterólogos insertados es la presencia de una secuencia reguladora que permita la expresión del gen en el fondo víral (por ejemplo, promotor, potenciador, sitios de empalme donante y aceptor e intrón, secuencias de consenso de inicio de traducción de Kozak, señales de poliadenilación, elementos de secuencia no traducidos).
[0046] El sitio de inserción puede ser cualquiera región no esencial del genoma de HVT que incluye, pero no se limita a, la región entre el codón STOP de ORF UL55 y la unión de UL con la región de repetición adyacente (región intergénica 1, el locus de IG1, US5,980,906), el locus de IG2 (región intergénica 2), el locus de IG3 (región intergénica 3), el locus de UL43, el locus de US10, el locus de US2, el locus de SORF3/US2 (véase la FIGURA 2).
[0047] En general, es ventajoso emplear un promotor fuerte funcional en las células eucariotas. Los promotores incluyen, pero no se limitan a, un promotor de citomegalovirus humano (CMV) (hCMV) inmediatamente temprano (IE), promotor IE de ratón CMV (mCMV), promotor IE de cobaya CMV (gpCMV), un promotor de SV40, promotores de Virus de Pseudorrabia, tal como el promotor de glicoproteína X, Virus del Herpes Simple 1, tal como el promotor alfa 4, promotores de los Virus de la Enfermedad de Marek (que incluyen MDV-1, MDV-2 y HVT), tales como aquellos que impulsan la expresión de glicoproteínas gC, gB, gE, o gI, promotor de HHV3gB p (promotor de la glicoproteína B del virus de herpes humano de tipo 3), promotores del Virus de Laringotraqueítis Infecciosa, tales como los de los genes de las glicoproteínas gB, gE, gI, gD, gC u otros promotores de herpesvirus.
[0048] En el presente documento se describe un vector de HVT recombinante que comprende un primer polinucleótido heterólogo que codifica y expresa el antígeno o el polipéptido VP2 de IBDv y un segundo polinucleótido que codifica y expresa el antígeno o el polipéptido de NDV-F. En el presente documento se describe el antígeno o el polipéptido de NDV-F que tiene como mínimo el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene la secuencia como la establecida en la SEQ ID NO: 5. En el presente documento se describe el antígeno o el polipéptido VP2 de IBDV que tiene como mínimo el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene la secuencia como la establecida en la SEQ ID NO: 2. En el presente documento se describe el polinucleótido que codifica el polipéptido de NDV-F unido de manera operativa al promotor de SV40 que tiene la secuencia como la establecida en la SEQ ID NO: 7 y la expresión del antígeno o el polipéptido de NDV-F se regula mediante el promotor de SV40. En el presente documento se describe la expresión del antígeno o el polipéptido de NDV-F que se regula mediante la señal poliA de SV40 que tiene la secuencia como la establecida en la SEQ ID NO: 8, o la señal sintética de poliA que tiene la secuencia como la establecida en la SEQ ID NO: 9. En el presente documento se describe la expresión del antígeno o el polipéptido VP2 de IBDV que se regula mediante el promotor de mCMV-IE que tiene la secuencia como la establecida en la SEQ ID NO: 6, y la señal de poliA de SV40 que tiene la secuencia como la establecida en la SEQ ID NO: 8, o la señal sintética de poliA que tiene la secuencia como la establecida en la SEQ ID NO: 9.
[0049] En el presente documento se describe un vector de HVT recombinante que comprende un primer polinucleótido heterólogo que codifica y expresa el antígeno o el polipéptido VP2 de IBDv y un segundo polinucleótido que codifica y expresa el antígeno o el polipéptido de NDF-F y que, además, comprende una secuencia que regula la expresión del segundo polinucleótido. Las secuencias reguladoras o enlazadores pueden ser un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES), una secuencia de ARN derivada del virus de encefalomiocarditis (EMCV), o una secuencia que codifica un péptido (P2A) del teschovirus-1 porcino autoescindible o del virus de la fiebre aftosa (FMDV).
[0050] En el presente documento se describe el vector de HVT recombinante que comprende un primer polinucleótido que codifica el antígeno VP2 de IBDV y un segundo polinucleótido que codifica el antígeno de NDV-F y comprende, además, el IRES que tiene la secuencia como la establecida en la SEQ ID NO: 10. En el presente documento se describe el HVT recombinante que comprende un primer polinucleótido que codifica el antígeno VP2 de IBDV y un segundo polinucleótido que codifica el antígeno de NDV-F y comprende, además, el polinucleótido que codifica P2A que tiene la secuencia como la establecida en la SEQ ID NO: 11.
[0051] En el presente documento se describe un vector de HVT recombinante que comprende un primer polinucleótido heterólogo que codifica y expresa el antígeno o el polipéptido F de NDV y un segundo polinucleótido que codifica y expresa el antígeno o el polipéptido gD de ILTV y que, además, comprende una secuencia que regula la expresión del segundo polinucleótido. Las secuencias reguladoras o los enlazadores pueden ser un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES), una secuencia de ARN derivada del virus de encefalomiocarditis (EMCV), o una secuencia que codifica un péptido (P2A) del teschovirus-1 porcino autoescindible o del virus de la enfermedad de fiebre aftosa (FMDV). En el presente documento se describe el antígeno o el polipéptido gD de ILTV que tiene como mínimo el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene la secuencia como la establecida en la SEQ ID NO: 17. En el presente documento se describe el antígeno o el polipéptido F de NDV que tiene como mínimo el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene la secuencia como la establecida en las SEQ ID NO: 5 o 22. En el presente documento se describe el vector de HVT recombinante que comprende un primer polinucleótido que codifica el antígeno F de NDV y un segundo polinucleótido que codifica el antígeno gD de ILTV y que comprende, además, el IRES que tiene la secuencia como la establecida en la SEQ ID NO: 10.
[0052] En el presente documento se describe un vector de HVT recombinante que comprende un primer polinucleótido heterólogo que codifica y expresa el antígeno o el polipéptido F de NDV y un segundo polinucleótido que codifica y expresa el antígeno o el polipéptido gD de ILTV. En el presente documento se describe el antígeno o el polipéptido gD de ILTV que tiene como mínimo el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene la secuencia como la establecida en la SEQ ID NO: 17. En el presente documento se describe el antígeno o el polipéptido F de NDV que tiene como mínimo el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene la secuencia como la establecida en las SEQ ID NO: 5 o 22. En el presente documento se describe el polinucleótido que codifica el polipéptido F de NDV que está unido de manera operativa al promotor de SV40 y la expresión del antígeno o el polipéptido F de NDV está regulada por el promotor de SV40. En el presente documento se describe el polinucleótido que codifica el polipéptido gD de ILTV que está unido de manera operativa al promotor HHV3gB y la expresión del antígeno o el polipéptido gD de ILTV está regulada por el promotor HHV3gB. En el presente documento se describe el promotor HHV3gB que se encuentra en la dirección inversa. En el presente documento se describen las expresiones del antígeno F de NDV y del antígeno gD de ILTV que están reguladas por el promotor de SV40 y el promotor HHV3gB inverso y se encuentran en direcciones opuestas.
[0053] En el presente documento se describe un vector de HVT recombinante que comprende un primer polinucleótido heterólogo que codifica y expresa el antígeno o el polipéptido VP2 de IBDv y un segundo polinucleótido que codifica y expresa el antígeno o el polipéptido gD de ILTV. En el presente documento se describe el antígeno o el polipéptido gD de ILTV que tiene como mínimo el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene la secuencia como la establecida en la SEQ ID NO: 17. En el presente documento se describe el antígeno o el polipéptido VP2de IBDV que tiene como mínimo el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene la secuencia como la establecida en la SEQ ID NO: 2. En el presente documento se describe el vector de HVT recombinante que comprende un primer polinucleótido que codifica el antígeno VP2 de IBDV y un segundo polinucleótido que codifica el antígeno gD de ILTV y que comprende, además, el IRES que tiene la secuencia como la establecida en la SEQ ID NO: 10.
[0054] En el presente documento se describe un vector de HVT recombinante que comprende un polinucleótido heterólogo que codifica y expresa el antígeno o el polipéptido gD de ILTV. En el presente documento se describe el antígeno o el polipéptido gD de ILTV que tiene como mínimo el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene la secuencia como la establecida en la SEQ ID NO: 17. En el presente documento se describe el polinucleótido que codifica el polipéptido gD de ILTV unido de manera operativa al promotor de SV40 y la expresión del antígeno o el polipéptido gD de ILTV está regulada por el promotor de SV40.
[0055] En el presente documento se describe que los polinucleótidos que codifican el antígeno VP2 de IBDV y/o el antígeno NDV-F y/o el antígeno gD de ILTV pueden insertarse en una o más regiones de locus seleccionadas entre el grupo que consiste en IG1, IG2, US10, US2, SORF3-US2 y gD del genoma de HVT. En el presente documento se describe que los polinucleótidos que codifican el antígeno VP2 de IBDV y/o el antígeno de n Dv -F y/o el antígeno gD de ILTV se insertan en el mismo locus, tal como IG1 del genoma de HVT.
[0056] En el presente documento se describe una composición farmacéutica o una vacuna que comprenden uno o más vectores de HVT recombinantes de la presente invención y un portador, excipiente, vehículo o adyuvante farmacéutica o veterinariamente aceptables. El vector de HVT puede comprender dos polinucleótidos heterólogos, y en donde el primer polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido seleccionado entre el grupo que consiste en un antígeno VP2 del Virus de la Enfermedad Infecciosa de la Bolsa (IBDV), un antígeno de la glicoproteína D (gD) del Virus de la Laringotraqueítis Infecciosa (ILTV) y un antígeno del Virus de la Enfermedad de Newcastle F (NDV-F), y en donde el segundo polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido seleccionado entre el grupo que consiste en un antígeno VP2 del Virus de Enfermedad Infecciosa de la Bolsa (IBDV), un antígeno de la glicoproteína D (gD) del Virus de la Laringotraqueítis Infecciosa (ILTV) y un antígeno del Virus de Enfermedad de Newcastle F (NDV- F).
[0057] En el presente documento se describe una composición o una vacuna que comprende un vector viral de HVT que comprende: i) un primer polinucleótido heterólogo que codifica y expresa un antígeno de VP2 de IBDV o un antígeno de NDV-F; ii) un segundo polinucleótido que codifica y expresa un antígeno de NDV-F y un antígeno de VP2 de IBDV; y iii) opcionalmente un portador, excipiente, vehículo o adyuvante farmacéutica o veterinariamente aceptable. En el presente documento se describe una composición o una vacuna que comprende un vector viral de HVT que comprende: i) un primer polinucleótido heterólogo que codifica y expresa un antígeno VP2 de IBDV o un antígeno gD de ILTV; ii) un segundo polinucleótido que codifica y expresa un antígeno gD de ILTV o un VP2 de IBDV; y iii) opcionalmente un portador, excipiente, vehículo o adyuvante farmacéutica o veterinariamente aceptable. En el presente documento se describe una composición o una vacuna que comprende un vector viral de hVt que comprende: i) un primer polinucleótido heterólogo que codifica y expresa un antígeno de NDV-F o un antígeno gD de ILTV; ii) un segundo polinucleótido que codifica y expresa un antígeno gD de ILTV o un NDV- F; y iii) opcionalmente un portador, excipiente, vehículo o adyuvante farmacéutica o veterinariamente aceptable. En el presente documento se describe una composición o una vacuna que comprende un vector viral de HVT que comprende un polinucleótido heterólogo que codifica y expresa un antígeno gD de ILTV y, opcionalmente, un portador, excipiente, vehículo o adyuvante farmacéutica o veterinariamente aceptable. En el presente documento se describe una composición o una vacuna que comprende un HVT que comprende un polinucleótido que tiene como mínimo un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con un polinucleótido que tiene la secuencia como la establecida en las SEQ ID NO: 1, 3, 4, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 21, 25, 26 o 27. En el presente documento se muestra que la inserción de dos o más polinucleótidos heterólogos en un locus confiere mejor protección y eficacia que la inserción en múltiples loci. En una realización de la presente invención, se muestra que la expresión de más de un polinucleótido heterólogo a partir de un ARNm único a través de un IRES o P2A proporciona mejor protección y eficacia contra enfermedades aviarias. En otra realización adicional, los datos experimentales proporcionados por la presente invención dan a conocer que las construcciones que comprenden los elementos de IRES proporcionan mejor protección que las construcciones que comprenden los elementos de P2A.
[0058] Los portadores o adyuvantes o vehículos o excipientes farmacéutica o veterinariamente aceptables se conocen bien por un experto en la materia. Por ejemplo, un portador o adyuvante o vehículo o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable puede ser un diluyente de vacuna contra la enfermedad de Marek utilizado para vacunas contra MD. Otro portador o adyuvante o vehículo o excipientes farmacéutica o veterinariamente aceptables que pueden utilizarse para la presente invención incluyen, pero no se limitan a, solución de NaCl al 0,9 % (por ejemplo, salina) o un tampón de fosfato, poli-(L-glutamato), el diluyente de la Inyección de Lactato de Ringer (cloruro de sodio, lactato de sodio, cloruro de potasio y cloruro de calcio) o polivinilpirrolidona. El portador o vehículo o adyuvante o excipientes farmacéutica o veterinariamente aceptables pueden ser cualquier compuesto o una combinación de compuestos que facilitan la administración del vector (o la proteína expresada a partir de un vector de la invención in vitro) o que facilitan la transfección o la infección y/o mejoran la conservación del vector (o la proteína). En la descripción general del presente documento se describen las dosis y los volúmenes de dosis y se pueden determinar por un experto a partir de esta divulgación al leerla en conjunto con el conocimiento de la técnica, sin gran experimentación.
[0059] Opcionalmente, se pueden añadir otros compuestos como portadores o adyuvantes o vehículos o excipientes farmacéutica o veterinariamente aceptables, que incluyen, pero no se limitan a, alumbre; oligonucleótidos CpG (ODN), en particular ODN 2006, 2007, 2059 o 2135 (Pontarollo R.A. et al., Vet. Immunol. Immunopath, 2002, 84: 43­ 59; Wernette C.M. et al., Vet. Immunol. Immunopath, 2002, 84: 223-236; Mutwiri G. et al., Vet. Immunol. Immunopath, 2003, 91: 89-103); poliA-poliU, bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDA) ("Vaccine Design The Subunit and Adjuvant Approach", editado por Michael F. Powell y Mark J. Newman, Pharmaceutical Biotechnology, 6: p.03, página 157); N,N-dioctadecil-N',N'-bis(2-hidroxietil)propanodiamina (tal como AVRIDINE®) (Ibid, p. 148); carbómero, quitosano (véanse la Patente de EE. UU. Número de Serie 5,980,912).
[0060] Las composiciones y las vacunas farmacéuticas descritas en el presente documento pueden comprender o consistir esencialmente en uno o más adyuvantes. Los adyuvantes adecuados para su uso en la práctica de la presente invención son (1) polímeros de ácido acrílico o metacrílico, polímeros de anhídrido maleico y derivados de alquenilo, (2) secuencias inmunoestimulantes (ISS), tales como secuencias de oligodesoxirribonucleótidos que tienen una o más unidades CpG no metiladas (Klinman et al., 1996; WO98/16247), (3) una emulsión de aceite en agua, tal como la emulsión SPT descrita en la página 147 de "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" publicado por M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995, y la emulsión MF59 descrita en la página 183 del mismo trabajo, (4) lípidos catiónicos que contienen una sal de amonio cuaternario, por ejemplo, DDA, (5) citocinas, (6) hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio, (7) saponina o (8) cualquier combinación o mezcla de los mismos.
[0061] En el presente documento se describe el adyuvante que puede incluir TS6 TS7, TS8 y TS9 (US7,371,395), LR2, LR3 y LR4 (US7,691,368), TSAP (US20110129494), TRIGEN™ (Newport Labs), ARNdc sintéticos (por ejemplo, adyuvantes de poli-IC, poli-ICLC [HILTO- NOL®]), y MONTANIDE™ (W/O, W/O/W, O/W, IMS y Gel; todos fabricados por SEPPIC).
[0062] En el presente documento se describe la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una vacuna o una composición para la liberación de vectores de HVT recombinantes en una célula diana. La determinación de la cantidad terapéuticamente eficaz es una experimentación rutinaria para un experto en la materia.
[0063] En el presente documento se describe un procedimiento para la inducción de una respuesta inmune en un animal contra uno o más antígenos o una respuesta protectora en un animal contra uno o más patógenos aviares, cuyo procedimiento comprende la inoculación del animal como mínimo una vez con la vacuna o la composición farmacéutica de la presente invención. En el presente documento se describe un procedimiento para la inducción de una respuesta inmunológica en un animal a uno o más antígenos o una respuesta protectora en un animal contra uno o más patógenos aviares en un régimen de administración de sensibilización-refuerzo, que comprende como mínimo una administración de sensibilización y como mínimo una administración de refuerzo utilizando como mínimo un polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno común. La composición inmunológica o vacuna utilizadas en la administración de sensibilización puede ser la misma, puede ser distinta en su naturaleza de aquellas utilizadas como refuerzo.
[0064] Los patógenos aviares pueden ser Virus de la Enfermedad de Newcastle (NDV), Virus de la Enfermedad Infecciosa de la Bolsa (es decir, IBDV o virus de la Enfermedad de Gumboro), Virus de la Enfermedad de Marek (MDV), Virus de Laringotraqueítis Infecciosa (ILTV), virus de encefalomielitis aviar, reovirus aviar, paramixovirus aviar, metapneumovirus aviar, virus de la gripe aviar, adenovirus aviar, virus de la viruela aviar, coronavirus aviar, rotavirus aviar, parvovirus aviar, astrovirus aviar y virus de la anemia de pollo, coccidiosis (Eimeria sp.), Campylobacter sp., Salmonella sp., Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, Pasteurella sp., Avibacterium sp., E. coli o Clostridium sp.
[0065] Normalmente, se lleva a cabo una administración de la vacuna en aves en el día uno de nacimiento mediante la vía subcutánea o intramuscular o in ovo a los 17-19 días de edad del embrión. Una segunda administración se puede realizar dentro de 0-30 días después de la primera administración.
[0066] Se puede utilizar una variedad de vías de administración en los pollos de un día de edad, tales como vía subcutánea o intramuscular, intradérmica o transdérmica. La vacunación in ovo se puede realizar en el saco amniótico y/o el embrión. Se pueden utilizar los dispositivos de administración in ovo y por vía SC disponibles comercialmente para la vacunación.
[0067] La composición o la vacuna pueden contener una dosis desde aproximadamente 102 hasta aproximadamente 1020, desde aproximadamente 103 hasta aproximadamente 1018, desde aproximadamente 104 hasta aproximadamente 1016, desde aproximadamente 105 hasta aproximadamente 1012 de VLPs (partículas similares a virus) producidas in vitro o in vivo a partir de un vector viral, un plásmido o baculovirus. Se puede valorar al vector viral basándose en cualquier procedimiento de valoración de virus que incluye, pero no se limita a FFA (Ensayo de Formación de Foco) o UFF (Unidad Formadora de Foco), TCID50 (Dosis Infecciosa 50% en Cultivo Tisular), UFP (Unidades Formadoras de Placas) y FAID50 (Dosis Infecciosa 50% de Anticuerpos Fluorescentes), y las VLPs producidas in vitro pueden valorarse mediante el ensayo de hemaglutinación, ELISA y microscopía electrónica. Se pueden aplicar otros procedimientos dependiendo del tipo de VLP.
[0068] La composición o la vacuna pueden contener desde aproximadamente 1020 hasta aproximadamente 1070 de TCID50 o UFP/dosis, desde aproximadamente 1020 hasta aproximadamente 1070 de TCID50 o UFP/dosis y desde aproximadamente 1020 hasta aproximadamente 1065 de TCID50 o UFP/dosis.
[0069] Los volúmenes de la dosis pueden oscilar entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 10 ml, entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 5 ml.
EJEMPLOS
[0070] Las construcciones de insertos de ADN, plásmidos y vectores virales recombinantes se llevaron a cabo utilizando las técnicas de biología molecular descritas por J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4a edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 2014).
Ejemplo 1 Construcción de vectores de HVT recombinantes que expresan dos genes
Ejemplo 1.1 Construcciones de vHVT309 recombinante que expresan IBDV-VP2 y NDV-F
[0071] El objetivo del estudio es construir un HVT recombinante en el que se integra en el sitio intergénico 1 (IG1) un casete de expresión que contiene un promotor de citomegalovirus de ratón (mCMV), un gen que codifica una proteína viral 2 (VP2) del virus de enfermedad infecciosa de la bolsa, cola de poli A de virus de simio 40 (poli A de SV40), promotor de virus simio 40 (promotor de SV40), un gen que codifica una proteína de fusión del virus de enfermedad de Newcastle (NDV-F) y cola sintética de poli A (cola sintética de poli A).
[0072] El virus original utilizado en la construcción es vHVT13 (un vector de HVT que expresa el gen de VP2 de IBDV, ingrediente activo de la Vacuna VAXXITEK® de Merial (HVT+IBD), también conocido como vHVT17 en el documento US 5,980,906). El vector de vHVT13 contiene un casete de expresión compuesto por el promotor IE de mCMV (SEQ ID NO: 6), gen de VP2 de IBDV (SEQ ID NO: 1 que codifica SEQ ID NO: 2), y cola de poli A de SV40 (SEQ ID NO: 8) insertado en el sitio de inserción IG1. Una Proteína de Fusión del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV-F) que corresponde a la secuencia de genotipo VIId se sintetizó químicamente y se optimizaron los codones (GenScript). El sitio de escisión de la proteína F de este gen sintético se alteró para coincidir con la secuencia del sitio de escisión F lentogénico y la secuencia del gen de NDV-F resultante tiene un 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de NDV-F depositada en el GenBank (AY337464). El promotor IE de CMV de ratón se utilizó para IBD-VP2, y el promotor de SV40 se utilizó para NDV-F. El locus de inserción es el sitio intergénico 1 (IG1) en HVT (Figura 2). El plásmido donante pFSV40VP2 (un plásmido de inserción que contiene la poli A de VP2/SV40 y un brazo flanqueante del promotor IG1+SV40 NDV-F+poli A sintética) se construyó tal como se describe a continuación. Se utilizaron células de fibroblastos de embrión de pollo (CEF) para la recombinación in vitro.
Construcción de plásmido donante
[0073] El ADN sintético en pUC57 que contiene el gen de VP2 de IBDV (SEQ ID NO: 1 que codifica SEQ ID NO: 2), cola de poli A de SV40 (SEQ ID NO: 8), promotor de SV40 (SEQ ID NO: 7), gen de NDV-F (SEQ ID NO: 3 que codifica SEQ ID NO: 5), y cola sintética de poli A (SEQ ID NO: 9) se sintetizó mediante GeneScript (Figura 3). El plásmido, pFSV40VP2, se transformó utilizando el kit Top10 Oneshot (cat#C404002, Invitrogen) y se desarrolló un cultivo a gran escala y se realizó la extracción del plásmido utilizando el kit de preparación Qiagens Maxi. La expresión transitoria de preparación maxi se verificó utilizando un Reactivo de Transfección de Fugene en Células de Fibroblastos del Embrión de Pollo (CEF) y sueros policlonales de pollo contra NDV.
Generación de recombinante
[0074] Se siguió un procedimiento de recombinación homóloga estándar mediante la electroporación conjunta de células CEF secundarias utilizando el plásmido pFSV40VP2 y ADN viral aislado de la Vacuna vHVT13. La electroporación conjunta se llevó a cabo utilizando 1x107 de CEF secundarias en 300 pl de Opti-MEM y se sometieron a descargas eléctricas de 150 voltios con capacitancia de 950 en una cubeta de electroporación de 2 mm. Las células transfectadas se sembraron en una placa de 96 pocillos y se incubaron durante 4 días. Las células cultivadas en la placa de 96 pocillos se duplicaron a continuación en dos placas de 96 pocillos y se incubaron durante 3 días más. Se utilizó un conjunto de placas de 96 pocillos para IFA utilizando sueros policlonales de pollo contra NDV-F para identificar los pocillos positivos que contenían recombinantes y se utilizó otro conjunto de placas de 96 pocillos para la recuperación de las células infectadas de los pocillos positivos.
[0075] Los procedimientos de purificación viral recombinante se llevaron a cabo primero mediante la duplicación de placas de 96 pocillos y la selección por IFA de los pocillos que contenían la mayoría de las placas positivas en IFA con la cantidad mínima de las placas negativas en IFA. A continuación, se recogieron los pocillos que coincidían con aquellos criterios y se ajustaron a 1 ml en DMEM+2 % de FBS. A partir de la solución madre de 1 ml, se extrajeron 5-20 ul y se mezclaron con 1x107 de CEF en 10 ml de DMEM+2% de FBS y se alicuotaron en una nueva placa de 96 pocillos para disponer de placas de virus individuales por pocillo. Las placas de 96 pocillos se duplicaron después de 5 días de incubación y los pocillos que contenían las placas se analizaron para la presencia de recombinante doble y la ausencia del virus original de vHVT13 mediante IFA y PCR. De nuevo las placas que parecían tener más virus recombinante, mediante la comparación de los resultados de las bandas de pCr , se recogieron y se ajustaron a 1 ml y se alicuotaron en nuevas placas de 96 pocillos. Después de dos rondas de purificación de células infectadas con virus, se aisló el virus recombinante que expresa la proteína de NDV-F y se analizó la pureza del virus recombinante mediante IFA y PCR para confirmar la ausencia de virus original.
Análisis de recombinante mediante PCR
[0076] Se extrajo ADN de una solución madre de virus mediante la extracción con fenol/cloroformo, precipitación en etanol y se volvió a suspender en 20 mM de HEPES. Se diseñaron específicamente cebadores de PCR (Tabla 1) para identificar el gen de IBDV-VP2 y NDV-F VIId, los promotores, las poli A, así como la pureza del virus recombinante del virus original de Vaxxitek. Las localizaciones de los sitios de unión a cebador se muestran en la Figura 4. La PCR se realizó utilizando 200 pg de plantilla de ADN conjuntamente con los pares de cebadores específicos indicados en la Tabla 1. Las condiciones de ciclos de PCR son los siguientes: 94 °C - 2 minutos; 30 ciclos de 94 °C - 30 segundos, 60 °C - 45 segundos, 68 °C - 3 minutos (5 minutos para el conjunto de cebadores de MB080+MB081); 68 °C - 5 minutos (7 minutos para el conjunto de cebadores de MB080+MB081).
Tabla 1 Ban P R r iliz n n n r específicos
Figure imgf000013_0001
Análisis de expresión
[0077] Para la prueba de inmunofluorescencia, el material recombinante se diluyó a 1:100 en un medio. Se añadieron aproximadamente 50 pl del virus diluido a 20 ml de DMEM+2% de FBS con 2x107 de CEF y, a continuación, se alicuotaron en placas de 96 pocillos (100 pl/pocillo). Las placas se incubaron durante 4 días a 37°C+5 % de CO2 hasta que las placas virales eran visibles. Las placas se fijaron con acetona a 95 % enfriada en hielo durante tres minutos, se dejaron secar con aire durante diez minutos y se lavaron tres veces con agua. La tinción dual con inmunofluorescencia se llevó a cabo para la placa #1 utilizando los antisueros de pollo contra el virus de la Enfermedad de Newcastle (NDV Pab) (lote # C0117A, Charles Rivers Laboratories) a 1:500 y el anticuerpo monoclonal L78 de HVT (HVT Mab) (Lee et al. 1983, J. Immunol. 130 (2) 1003-6; lote de Merial) a 1:3000 y la placa se incubó a 37 °C durante 1 hora. La inmunofluorescencia dual se llevó a cabo para la placa #2 utilizando antisueros de pollo contra el virus de la Enfermedad Infecciosa de la Bolsa (IBDV Pab) a 1:500 (lote # G0117, Charles Rivers Laboratories) y el anticuerpo monoclonal L78 de HVT (HVT Mab) (Merial) a 1:3000 y la placa se incubó a 37 °C durante 1 hora. Después de una hora de incubación, las placas se lavaron tres veces con PBS. A ambas placas #1 y #2 se añadieron IgG anti-pollo marcada con FITC (cat# F8888, Sigma) a 1:500 y de asno anti-ratón con Alexa Fluor marcada con TRITC (cat# A10037, Invitrogen) a 1:300. De nuevo las placas se incubaron a 37 °C durante 1 hora. Después de una hora de incubación, las células se enjuagaron tres veces con PBS y se visualizaron con un microscopio fluorescente utilizando un filtro de isotiocianato de fluoresceína (FITC) y un filtro de isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC).
RESULTADOS
[0078] A las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del plásmido donante pFSV40VP2 se les asignan las SEQ ID NO tal como se muestra en la Figura 1.
Generación Recombinante y Análisis de Expresión
[0079] El ADN genómico del virus de vHVT13 se sometió a electroporación conjunta con el plásmido donante pFSV40VP2 para generar el recombinante utilizando la técnica de recombinación homóloga. El virus recombinante se separó del virus original de Vaxxitek mediante la selección de pocillos positivos a la inmunofluorescencia y el cribado de PCR en múltiples rondas de purificación de placas. Un virus recombinante purificado en placas que expresa la proteína de VED-F, denominada vHVT309, se escaló desde matraces de cultivo tisular hasta frascos con forma cilíndrica de 5 x 850cm2. Después de aproximadamente 72 horas después de la infección, se recogieron las CEF infectadas. Las alícuotas se congelaron en nitrógeno líquido, cada alícuota contenía 10 % de FBS y 10 % de DMSO. Se llevaron a cabo las valoraciones por triplicado sobre las CEF y se obtuvo un título de 1,5x105 ufp/ml para vHVT309.
[0080] Se llevó a cabo la tinción dual con inmunofluorescencia utilizando anti-sueros de pollo (Pab) a 1:500 y el anticuerpo monoclonal L78 de HVT (Mab) a 1:3000 seguido de una IgG anti-pollo marcada con FITC a 1:500 y de asno anti-ratón con Alexa Fluor marcada con TRITC a 1:300. La placa #1 compara la expresión del virus de la Enfermedad de Newcastle con HVT y la placa #2 compara la expresión del virus de la Enfermedad Infecciosa de la Bolsa con HVT. Se descubrió que todas las placas positivas para HVT TRITC de vHVT309 expresaban las proteínas de NDV-F y IBDV-VP2.
Análisis por PCR de vHVT309
[0081] La pureza del virus recombinante se verificó mediante PCR utilizando pares de cebadores que son específicos para los bazos flanqueantes de HVT, los promotores, los genes de NDV-F y IBDV-VP2 y las colas de poli A. Los resultados de PCR demuestran que el virus recombinante vHVT309 contiene el casete de expresión prentedido y la solución madre del virus está libre de cantidades detectables del virus original de Vaxxitek (Tabla 1 y Figura 5).
CONCLUSIÓN
[0082] Basándose en las pruebas de PCR y el análisis de inmunofluorescencia, vHVT309 es un virus recombinante que contiene un gen de IBDV-VP2 bajo el control del promotor de mCMV y un gen de NDV-F bajo el control de un promotor de SV40. El vHVT309 generado de nuevo está libre de cualquier virus original vHVT13 detectable.
Ejemplo 1.2 Construcciones de vHVT310 recombinante que expresa IBDV-VP2 y NDV-F
[0083] El objetivo del estudio es construir un HVT recombinante en el que se integra en el sitio intergénico 1 (IG1) (Figura 2) un casete de expresión que contiene un promotor de citomegalovirus de ratón (mCMV), un gen que codifica una proteína viral 2 (VP2) del virus de enfermedad infecciosa de la bolsa, sitio interno de entrada al ribosoma (IREs ), un gen que codifica una proteína de fusión del virus de la Enfermedad de Newcastle (NDV-F) y cola de poli A del virus simio 40 (cola de poli A de SV40).
[0084] El virus original utilizado en la construcción es vHVT13. Una Proteína de Fusión del virus de enfermedad de Newcastle (NDV-F) que corresponde a la secuencia de genotipo VIId se sintetizó químicamente y se optimizaron los codones (GenScript). El sitio de escisión de la proteína F de este gen sintético se alteró para coincidir con la secuencia del sitio de escisión F lentogénico y la secuencia del gen de NDV-F resultante tiene un 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de NDV-F depositada en el GenBank (AY337464). Se utilizó el promotor IE de CMV de ratón para IBD-VP2 (en el virus original de Vaxxitek). El IRES, una secuencia de ARN derivada del virus de encefalomiocarditis (EMCV), que permite el inicio de la traducción dentro de un ARNm inmediatamente en dirección 3' desde donde se encuentra el IRES, se insertó en el extremo del gen de VP2 para iniciar la traducción de un gen de NDV-F en dirección 3'. Esta fue la primera vez que se utilizó IRES en un vector de HVT.
[0085] El locus de inserción es un sitio intergénico 1 (IG1) en HVT (Figura 2). El plásmido donante pFIRESVP2 (un plásmido de inserción que contiene el gen de VP2 IRES+NDV-F y poli A de SV40/brazo flanqueante de IG1) se construyó tal como se describe a continuación. Se utilizaron células de fibroblastos de embrión de pollo (CEF) para la recombinación in vitro.
Construcción de plásmido donante:
[0086] El ADN sintético en pUC57 que contenía el gen de VP2 de IBDV (SEQ ID NO: 1 que codifica SEQ ID NO: 2), IRES (SEQ ID NO: 10), gen de NDV-F (SEQ ID NO: 3 que codifica SEQ ID NO: 5) y cola de poli A de SV40 (SEQ ID NO: 8) se sintetizó mediante GeneScript (Figura 6). El plásmido, pFIRESVP2, se transformó utilizando el kit Top10 Oneshot (cat#C404002, Invitrogen) y se desarrolló un cultivo a gran escala y se realizó la extracción de plásmido utilizando el equipo de preparación Qiagens Maxi.
Generación recombinante
[0087] Se siguió el procedimiento de recombinación homóloga, tal como se describe en el Ejemplo 1.1, para generar el vHVT310 recombinante.
Análisis de recombinante mediante PCR
[0088] Se siguió el procedimiento de Análisis mediante PCR, tal como se describe en el Ejemplo 1.1, para llevar a cabo la verificación de vHVT310.
Análisis de expresión
[0089] El análisis de expresión descrito en el Ejemplo 1.1 se llevó a cabo para analizar la expresión de vHVT310. RESULTADOS
[0090] A las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de plásmido donante pFIRESVP2 se les asignó SEQ ID NO tal como se muestra en la Figura 1.
Generación Recombinante y Análisis de Expresión
[0091] El ADN genómico del virus de Vaxxitek se sometió a electroporación conjunta con el plásmido donante pFIRESVP2 para generar el virus recombinante utilizando la técnica de recombinación homóloga. El virus recombinante se separó del virus original de vHVT13 mediante la selección de pocillos positivos a inmunofluorescencia y cribado de PCR en múltiples rondas de purificación de placas. Un virus recombinante purificado en placas que expresa la proteína de NDV-F, denominado vHVT310, se escaló a partir de matraces de cultivo tisular hasta botellas de cultivo rotatorias de 5 x 850 cm2 Después de aproximadamente 72 horas después de la infección, se recogieron las CEF infectadas. Las alícuotas se congelaron en nitrógeno líquido, cada alícuota contenía 10 % de FBS y 10 % de DMSO. Se llevaron a cabo las valoraciones por triplicado sobre los CEF y se obtuvo un título de 2,0 x 106 ufp/ml para vHVT310.
[0092] Se llevó a cabo la tinción dual con inmunofluorescencia utilizando anti-sueros de pollo (Pab) a 1:500 y el anticuerpo monoclonal de HVT L78 (Mab) a 1:3000 seguido de una IgG anti-pollo marcada con FITC a 1:500 y de asno anti-ratón con Alexa Fluor marcada con TRITC a 1:300. La placa #1 compara la expresión del virus de la Enfermedad de Newcastle con HVT y la placa #2 compara la expresión del virus de la Enfermedad Infecciosa de la Bolsa con HVT. Se encontró que todas las placas positivas para HVT TRITC de vHVT310 examinadas expresaban las proteínas de NDV-F y IBDV-VP2.
Análisis mediante PCR de vHVT310
[0093] La pureza del virus recombinante se verificó mediante PCR utilizando los pares de cebadores que son específicas para los brazos flanqueantes de HVT, el promotor, los genes de NDV-F y IBDV-VP2 y la cola de poli A. Los resultados de PCR demuestran que el virus recombinante de vHVT310 contiene el casete de expresión pretendido y la solución madre del virus está libre de cantidades detectables del virus original de Vaxxitek (Tabla 2 y Figuras 7- 8).
Tabla 2 Band P R r iliz n l n n res específicos
Figure imgf000015_0001
CONCLUSION
[0094] Basándose en las pruebas de PCR y el análisis de inmunofluorescencia, vHVT310 es un virus recombinante que contiene un gen de IBDV- VP2 y NDV-F bajo el control del promotor de mCMV, donde la traducción del gen de NDV-F se inicia mediante IRES del EMCV. El vHVT310 recombinante generado de nuevo está libre de cualquier virus original de vHVT13 detectable.
Ejemplo 1.3 Construcción de vHVT311 recombinante que expresa IBDV-VP2 y NDV-F
[0095] El objetivo del estudio es construir un HVT recombinante en el que un casete de expresión que contiene un promotor de citomegalovirus de ratón (CMVm), un gen que codifica una proteína viral 2 (VP2) del virus de enfermedad infecciosa de la bolsa, péptido 2A (P2A) de teschovirus-1 porcino autoescindible, un gen que codifica una proteína de fusión del virus de la Enfermedad de Newcastle (NDV-F) y cola de poli A del virus simio 40 (poli A de SV40) se integra en el sitio intergénico 1 (IG1) (Figura 2).
[0096] El virus original utilizado en la construcción es vHVT13 (un vector de HVT que expresa el gen de VP2 de IBDV, Vacuna VAXXITEK® de Merial (HVT+IBD)). El polinucleótido que corresponde a la secuencia de la Proteína de Fusión del virus de la enfermedad de Newcastle del genotipo VIId de tipo salvaje (NDV-F) se sintetizó químicamente (GenScript). El sitio de escisión de la proteína F de este gen sintético se alteró para coincidir con la secuencia del sitio de escisión F lentogénico y la secuencia del gen de NDV-F resultante tiene un 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de NDV-F depositada en el GenBank (AY337464). Se utilizó el promotor IE de CMV de ratón para IBD-VP2 (en el virus original de Vaxxitek). Un péptido 2A (P2A) de teschovirus-1 porcino autoescindible, que permite la «escisión» de traducción conjunta de los genes en la dirección 5' y en la dirección 3, VP2 y F, respectivamente, a partir de un promotor único de CMVm, se insertó en el extremo del gen de VP2. Esto es la primera vez que P2A se utilizó en vectores de HVT.
[0097] El locus de inserción es un sitio intergénico 1 (IG1) en HVT (Figura 2). El plásmido donante pFP2AVP2 (un plásmido de inserción que contiene el VP2 P2A+NDV-F y poli A de SV40/brazo flanqueante de IG1) se construyó tal como se describe a continuación. Se utilizaron células de fibroblastos de embrión de pollo (CEF) para la recombinación in vitro.
Construcción del plásmido donante
[0098] El ADN sintético en pUC57 que contenía el gen de VP2 de IBDV (SEQ ID NO: 1 que codifica SEQ ID NO: 2), ADN que codifica P2A (SEQ ID NO: 11), gen de NDV-F (SEQ ID NO: 4 que codifica SEQ ID NO: 5) y cola de poli A de SV40 (SEQ ID NO: 8) se sintetizó mediante GeneScript (Figura 9). El plásmido, pFP2AVP2 se transformó utilizando el kit Top10 Oneshot (cat#C404002, Invitrogen) y se desarrolló un cultivo a escala grande y se realizó la extracción de plásmido utilizando el kit de preparación Qiagens Maxi.
Generación de recombinante
[0099] Se siguió el procedimiento de recombinación homóloga tal como se describe en el Ejemplo 1.1 para generar el vHVT311 recombinante.
Análisis de recombinante mediante PCR
[0100] Se llevó a cabo el procedimiento de análisis mediante PCR tal como se describe en el Ejemplo 1.1 para la verificación de vHVT311.
Análisis de expresión
[0101] Se llevó a cabo el análisis de expresión descrito en el Ejemplo 1.1 para analizar la expresión de vHVT311. RESULTADOS
[0102] A las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del plásmido donante pFP2AVP2 se les asignaron SEQ ID NO tal como se muestra en la Figura 1.
Generación de Recombinante y Análisis de Expresión
[0103] El ADN genómico del virus de Vaxxitek se sometió a electroporación conjunta con el plásmido donante pFP2AVP2 para generar el virus recombinante utilizando la técnica de recombinación homóloga. El virus recombinante se separó del virus original de Vaxxitek mediante la selección de pocillos positivos a inmunofluorescencia y el cribado de PCR en múltiples rondas de purificación de placas. Un virus recombinante purificado en placas que expresa la proteína de NDV-F, denominado vHVT311, se escaló a partir de matraces de cultivo tisular hasta botellas de cultivo rotatorias de 5 x 850 cm2 Después de aproximadamente 72 horas después de la infección, se recogieron las CEF infectadas. Las alícuotas se congelaron en nitrógeno líquido, cada alícuota contenía 10 % de FBS y 10 % de DMSO. Se llevaron a cabo las valoraciones por triplicado sobre los CEF y se obtuvo un título de 2,5 x 106 ufp/ml para vHVT311.
[0104] Se llevó a cabo una tinción dual con inmunofluorescencia utilizando anti-sueros de pollo (Pab) a 1:500 y un anticuerpo monoclonal (Mab) a 1:3000 seguido de una IgG anti-pollo marcada con FITC a 1:500 y de asno anti-ratón con Alexa Fluor marcada con TRITC a 1:300. La placa #1 compara la expresión del virus de la Enfermedad de Newcastle con HVT y la placa #2 compara la expresión del virus de la Enfermedad Infecciosa de la Bolsa con el virus de la Enfermedad de Newcastle. Se encontró que todas las placas examinadas positivas para HVT TRITC de vHVT311 expresaban NDV-F y se encontró que todas las placas positivas para NDV TRITC expresaban las proteínas de IBDV-VP2.
Análisis mediante PCR de vHVT311
[0105] La pureza del virus recombinante se verificó mediante PCR utilizando los pares de cebadores que son específicos para los brazos flanqueantes de HVT, el promotor, los genes de NDV-F y IBDV-VP2 y la cola de poli A. Los resultados de PCR demuestran que el virus recombinante de vHVT311 contiene el casete de expresión pretendido y la solución madre del virus está libre de cantidades detectables del virus original de Vaxxitek (Tabla 3 y Figuras 10-11).
Tabla 3 Bandas de PCR esperadas utilizando los conjuntos de cebadores específicos
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CONCLUSIÓN
[0106] Basándose en las pruebas de PCR y el análisis de inmunofluorescencia, vHVT311 es un virus recombinante que contiene un gen de iBdV- VP2 y NDV-F bajo el control del promotor de mCMV, en el que la escisión mediada por el péptido 2A da lugar a a la expresión conjunta de las proteínas VP2 y F. El vHVT311 recombinante generado de nuevo está libre de cualquier virus original de vHVT13 detectable.
Ejemplo 1.4 Construcción de vHVT317 recombinante que expresa IBDV-VP2 y ILTV-gD.
[0107] El objetivo del estudio es construir un HVT recombinante en el que un casete de expresión que contiene un promotor de citomegalovirus de ratón (CMVm), un gen que codifica una proteína viral 2 (VP2) del virus de la enfermedad infecciosa de la bolsa, sitio interno de entrada al ribosoma (IRES), un gen que codifica una proteína de la glicoproteína D de Laringotraqueítis Infecciosa (ILTV-gD) y cola de poli A del virus simio 40 (poli A de SV40) se integra en el sitio intergénico 1 (IG1) (Figura 2).
[0108] El virus original utilizado en la construcción es vHVT13. Se utilizó en la construcción una secuencia de la glicoproteína D del virus de la Laringotraqueítis Infecciosa (gD de ILTV) que se sintetizó químicamente (GenScript). Se utilizó el promotor IE de CMV de ratón para IBD-VP2 (en el virus original de vHVT13). Una secuencia de ARN (IRES) derivada del virus de encefalomiocarditis (EMCV), que permite el inicio de la traducción dentro de un ARNm inmediatamente en la dirección 3 desde donde se encuentra el IRES, se insertó en el extremo del gen de VP2 para iniciar la traducción de un gen de ILTV-gD en la dirección 3.
[0109] El locus de inserción es un sitio intergénico 1 (IG1) en HVT (Figura 2). El plásmido donante pVP2IRESgD (un plásmido de inserción que contiene el gen de VP2 IRES+ILTV-gD y poli A de SV40/brazo flanqueante de IG1) se construyó tal como se describe a continuación. Se utilizaron células de fibroblastos de embrión de pollo (CEF) para la recombinación in vitro.
Construcción de plásmido donante
[0110] El ADN sintético en pUC57 que contenía el gen de VP2 de IBDV (SEQ ID NO: 1 que codifica SEQ ID NO: 2), IRES (SEQ ID NO: 10), gen de ILTV-gD (SEQ ID NO: 16 que codifica SEQ ID NO: 17) y cola de poli A de SV40 (SEQ ID NO: 8) se sintetizó mediante GenScript. El plásmido pFIRESVP2 se transformó en células competentes dcm-/dam-(New England Biolabs, cat# C2925I), a continuación, se digirió con HindIII/SalI. El fragmento de 5kb se extrajo con gel. Un ADN sintético en pUC57 que contenía un IRES parcial, ILTV-gD de tipo salvaje y cola de poli A de SV40 se sintetizó mediante GenScript. El plásmido Sal-Fse gD-IRES se digirió con HindIII/SalI. El fragmento de 1,9 kb se extrajo con gel. Los dos fragmentos se ligaron y se transformaron utilizando el kit de Top10 Oneshot (cat#C404002, Invitrogen). Las colonias se cribaron mediante HindIII/SbfI para el patrón correcto. El plásmido donante final se verificó por secuencia y se denominó pVP2IRESgD (véase la Figura 12).
Generación de recombinante
[0111] Se siguió el procedimiento de recombinación homóloga tal como se describe en el Ejemplo 1.1 para generar el vHVT317 recombinante.
Análisis de recombinante mediante PCR
[0112] Se llevó a cabo el procedimiento de Análisis mediante PCR tal como se describe en el Ejemplo 1.1 para la verificación de vHVT317.
Análisis de expresión
[0113] Se llevó a cabo el análisis de expresión descrito en el Ejemplo 1.1 para analizar la expresión de vHVT317. RESULTADOS
[0114] A las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del plásmido donante pVP2IRESgD se le asignaron las SEQ ID NO tal como se muestra en la Figura 1.
Generación de Recombinante y Análisis de Expresión
[0115] Se llevó a cabo una tinción dual con inmunofluorescencia utilizando anti-sueros de pollo (anticuerpo policlonal) a 1:500 y un anticuerpo monoclonal (Mab) a 1:3000 seguido de una IgG anti-pollo marcada con FITC a 1:500 y de asno anti-ratón con Alexa Fluor marcada con TRITC a 1:300. Se encontró que todas las placas examinadas de vHVT317 expresaban las proteínas de IBDV-VP2 en comparación con las placas positivas a HVT y se encontró que todas las placas expresaban las proteínas de ILTV-gD cuando se comparaban con las placas positivas para IBDV.
Análisis mediante PCR de vHVT317
[0116] La pureza del virus recombinante se verificó mediante PCR utilizando los pares de cebadores que son específicos para los brazos flanqueantes de HVT, el promotor, los genes de ILTV-gD y IBDV-VP2 y la cola de poli A. Los resultados de PCR demuestran que el virus recombinante de vHVT317 contiene el casete de expresión pretendido y la solución madre del virus está libre de cantidades detectables del virus original de Vaxxitek (Tabla 4 y Figuras 13-14).
Tabla 4 Bandas de PCR esperadas utilizando los conjuntos de cebadores específicos
Figure imgf000018_0001
CONCLUSIÓN
[0117] Basándose en las pruebas de PCR y el análisis de inmunofluorescencia, vHVT317 es un virus recombinante que contiene un gen de IBDV-VP2 y ILTV-gD bajo el control del promotor de mCMV, donde la traducción del gen de ILTV-gD se inicia mediante IRES de EMCV. El vHVT317 recombinante generado de nuevo está libre de cualquier virus original de vHVT13 detectable.
Ejemplo 1.5 Construcción de vHVT313 recombinante que expresa IBDV-VP2 y NDV-F
[0118] El objetivo del estudio es construir un HVT recombinante en el que un casete de expresión que contiene un promotor de citomegalovirus de ratón (mCMV), un gen que codifica una proteína viral 2 (VP2) del virus de enfermedad infecciosa de la bolsa, cola de poli A de virus simio 40 (poli A de SV40), promotor de virus simio 40 (promotor de SV40), un gen que codifica una proteína de fusión del virus de enfermedad de Newcastle de tipo salvaje (NDV-F) y cola sintética de poli A (cola de poli A sint.) se integra en el sitio intergénico 1 (IG1) (Figura 2).
[0119] El virus original utilizado en la construcción es vHVT13. Una Proteína de Fusión del virus de enfermedad de Newcastle (NDV-F) que corresponde a la secuencia de tipo salvaje del genotipo VIId se sintetizó químicamente (GenScript). El sitio de escisión de la proteína F de este gen sintético se alteró para coincidir con la secuencia del sitio de escisión F lentogénico y la secuencia del gen de NDV-F resultante tiene el 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de NDV-F depositada en el GenBank (AY337464). Se utilizaron el promotor IE de CMV de ratón para IBD-VP2 (en el virus original de Vaxxitek) y el promotor de SV40 para NDV-F.
[0120] El locus de inserción es un sitio intergénico 1 (IG1) (Figura 2). El plásmido donante pFwtSV40VP2 (un plásmido de inserción que contienen VP2/poli A de SV40 y un brazo flanqueante de IG1 promotor de SV40 NDV-F poli A sintética) se construyó tal como se describe a continuación. Se utilizaron células de fibroblastos de embrión de pollo (CEF) para la recombinación in vitro.
Construcción de plásmido donante
[0121] El ADN sintético en pUC57 que contiene el gen de VP2 de IBDV (SEQ ID NO: 1 que codifica SEQ ID NO: 2), cola de poli A de SV40 (SEQ ID NO: 8), promotor de SV40 (SEQ ID NO: 7), gen de NDV-F (SEQ ID NO: 4 que codifica SEQ ID NO: 5) y cola sintética de poli A (SEQ ID NO: 9) se sintetizó mediante GeneScript.
[0122] A continuación, se digirió el plásmido pFSV40VP2 con SbfI/AvrII y el fragmento de 5,6 kb se extrajo con gel. Se digirió también un plásmido pHM103NDVFwtsyn con SbfI/AvrII y el fragmento de 1,9 kb se extrajo con gel. A continuación, los fragmentos se ligaron y se transformaron utilizando el kit de Top10 Oneshot (cat#C404002, Invitrogen). Las colonias se cribaron con PstI para el patrón correcto. La expresión transitoria de la maxipreparación se verificó utilizando un Reactivo de Transfección de Fugene en Células de Fibroblastos del Embrión de Pollo (CEF) y sueros policlonales de pollo contra NDV. El plásmido donante final se verificó por secuencia y se denominó pFwtSV40VP2 (véase la Figura 15).
Generación de recombinante
[0123] Se siguió el procedimiento de recombinación homóloga tal como se describe en el Ejemplo 1.1 para generar vHVT313 recombinante.
Análisis de recombinante mediante PCR
[0124] Se llevó a cabo el procedimiento de análisis mediante PCR tal como se describe en el Ejemplo 1.1 para la verificación de vHVT313.
Análisis de expresión
[0125] Se llevó a cabo el análisis de expresión descrito en el Ejemplo 1.1 para analizar la expresión de vHVT313. RESULTADOS
[0126] A las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del plásmido donante pFwtSV40VP2 se les asignaron las SEQ ID NO tal como se muestra en la Figura 1.
Generación de Recombinante y Análisis de Expresión
[0127] Se llevó a cabo una tinción dual con inmunofluorescencia utilizando anti-sueros de pollo (Pab) y un anticuerpo monoclonal anti-HVT (Mab) seguido de una IgG anti-pollo marcada con FITC y de asno anti-ratón con Alexa Fluor marcada con TRITC. Se encontró que todas las placas examinadas positivas para TRITC de vHVT313 expresaban las proteínas de NDV-F y IBDV-VP2.
Análisis mediante PCR de vHVT313
[0128] La pureza del virus recombinante se verificó mediante PCR utilizando los pares de cebadores que son específicos para los brazos flanqueantes de HVT, los promotores, los genes de NDV-F y IBDV-VP2 y las colas de poli A. Los resultados de PCR demuestran que el virus recombinante de vHVT313 contiene el casete de expresión pretendido y la solución madre del virus está libre de cantidades detectables del virus original de Vaxxitek (Tabla 5 y Figuras 16-17).
Tabla 5 Bandas de PCR esperadas utilizando los conjuntos de cebadores específicos
Figure imgf000019_0001
CONCLUSIÓN
[0129] Basándose en las pruebas de PCR y el análisis de inmunofluorescencia, vHVT313 es un virus recombinante que contiene un gen de IBDV-VP2 bajo el control del promotor de mCMV y un gen de tipo salvaje de NDV-F bajo el control de un promotor de SV40. El vHVT313 generado de nuevo está libre de cualquier virus original de Vaxxitek detectable.
Ejemplo 1.6 Construcción de vHVT316 recombinante que expresa IBDV-VP2 y NDV-F
[0130] El objetivo del estudio es construir un HVT recombinante en el que se integra en el locus de IG1 (Figura 2)un casete de expresión que contiene un promotor de citomegalovirus de ratón (mCMV), un gen que codifica una proteína viral 2 (VP2) del virus de enfermedad infecciosa de la bolsa, sitio interno de entrada al ribosoma (IRES), un gen que codifica una proteína de fusión del virus de la Enfermedad de Newcastle de tipo salvaje (NDV-F) y cola de poli A del virus simio 40 (poli A de SV40).
[0131] El virus original utilizado en la construcción es vHVT13. Una Proteína de Fusión del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV-F) que corresponde a la secuencia de tipo salvaje de genotipo VIId se sintetizó químicamente (GenScript). El sitio de escisión de la proteína F de este gen sintético se alteró para coincidir con la secuencia del sitio de escisión F lentogénico y la secuencia del gen de NDV-F resultante tiene un 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de NDV-F depositada en el GenBank (AY337464). Se utilizó el promotor de CMV IE de ratón para IBD-VP2 (en el virus original de Vaxxitek). IRES se insertó en el extremo del gen de VP2 para iniciar la traducción de un gen de NDV-F en la dirección 3.
[0132] El locus de inserción es IG1 (Figura 2). El plásmido donante pVP2IRESFwt (un plásmido de inserción que contiene el gen de VP2 IRES NDV-F y poli A de SV40/brazo flanqueante de IG1) se construyó tal como se describe a continuación. Se utilizaron células de fibroblastos de embrión de pollo (CEF) para la recombinación in vitro.
Construcción de plásmido donante
[0133] Se sintetizó mediante GenScript ADN sintético en pUC57 que contenía el gen de VP2 de IBDV (SEQ ID NO: 1 que codifica SEQ ID NO: 2), IRES (SEQ ID NO: 10), gen de NDV- F (SEQ ID NO: 4 que codifica SEQ ID NO: 5) y cola de poli A de SV40 (SEQ ID NO: 8). El plásmido, pFIRESVP2, se transformó en células competentes dcm-/dam-(New England Biolabs, cat# C2925I), a continuación, se digirió con HindIII/SalI. El fragmento de 5kb se extrajo en gel. Se sintetizó mediante GenScript un ADN sintético en pUC57 que contenía un IRES parcial, NDV-F de tipo salvaje y cola de poli A de SV40. El plásmido, Sal-Hind-Fwt+, se digirió con HindIII/SalI. El fragmento de 2,2kb se extrajo en gel. Los dos fragmentos se ligaron y se transformaron utilizando el kit Top10 Oneshot (cat#C404002, Invitrogen). El plásmido donante final se verificó por secuencia y se denominó pVP2IRESFwt (véase la Figura 18). Generación de recombinante
[0134] Se siguió el procedimiento de recombinación homóloga tal como se describe en el Ejemplo 1.1 para generar vHVT316 recombinante.
Análisis de recombinante mediante PCR
[0135] Se llevó a cabo el procedimiento de Análisis mediante PCR tal como se describe en el Ejemplo 1.1 para la verificación de vHVT316.
Análisis de expresión
[0136] El análisis de expresión descrito en el Ejemplo 1.1 se llevó a cabo para analizar la expresión de vHVT316. RESULTADOS
[0137] A las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del plásmido donante pVP2IRESFwt se les asignaron las SEQ ID NO tal como se muestra en la Figura 1.
Generación de Recombinante y Análisis de Expresión
[0138] Se llevó a cabo la tinción dual con inmunofluorescencia utilizando anti-sueros de pollo (Pab) y un anticuerpo monoclonal (Mab) seguido de una IgG anti-pollo marcada con FITC y de asno anti-ratón Alex Fluor marcada con TRITC. Se descubrió que todas las placas examinadas de vHVT316 expresaban las proteínas de IBDV-VP2 en comparación con las placas positivas a HVT y se descubrió que todas las placas expresaban las proteínas IBDV-VP2 cuando se comparaban con las placas positivas para NDV.
Análisis de vHVT316 mediante PCR
[0139] La pureza del virus recombinante se verificó mediante PCR utilizando los pares de cebadores que son específicos para los brazos flanqueantes de HVT, el promotor, los genes de NDV-F y IBDV-VP2 y la cola de poli A. Los resultados de la PCR demuestran que el virus recombinante de vHVT316 contiene el casete de expresión pretendido y la solución madre del virus está libre de cantidades detectables del virus original de Vaxxitek (Tabla 6 y Figuras 19-20).
Tabla 6 Bandas de PCR esperadas utilizando los conjuntos de cebadores específicos
Figure imgf000020_0001
CONCLUSIÓN
[0140] Basándose en las pruebas de PCR y el análisis de inmunofluorescencia, vHVT316 es un virus recombinante que contiene un gen de IBDV-VP2 y NDV-F bajo el control del promotor de mCMV, donde la traducción del gen de NDV-F se inicia mediante IRES a partir de EMCV. El vHVT316 recombinante generado de nuevo está libre de cualquier virus original de Vaxxitek detectable.
Ejemplo 1.7 Construcción de vHVT407 recombinante que expresa IBDV-VP2 e ILTV-gD.
[0141] El objetivo del estudio es construir un HVT recombinante en el que un casete de expresión contiene un promotor de Sv 40, glicoproteína D de ILTV y poli A sintética en el sitio SORF3-US2 de vHVT13.
[0142] El virus original utilizado en la construcción es vHVT13. Se utilizó en la construcción una secuencia de la glicoproteína D del virus de la Laringotraqueítis Infecciosa (gD de ILTVD) que se sintetizó químicamente (GenScript). Se utilizó el promotor de SV40 para gD de ILTV. El locus de inserción es SORF3-US2 para gD de ILTV e IG1 para VP2 de IBDV de vVHT13 (Figura 2). Se construyó el plásmido donante US2SVgDwtsyn de HVT que contiene los brazos SORF3-US2, promotor de sV40 (SEQ ID NO: 7), gen que codifica gD de ILTV de tipo salvaje (SEQ ID NO: 16 que codifica SEQ ID NO: 17) y poliA sintética (SEQ ID NO: 9) (véase la Figura 22). Se utilizaron células de fibroblastos de embrión de pollo (CEF) para la recombinación in vitro.
Generación de recombinante
[0143] Se siguió el procedimiento de recombinación homóloga tal como se describe en el Ejemplo 1.1 para generar el vHVT407 recombinante.
Análisis de recombinante mediante PCR
[0144] Se llevó a cabo el procedimiento de Análisis mediante PCR tal como se describe en el Ejemplo 1.1 para la verificación de vHVT407.
Análisis de expresión
[0145] El análisis de expresión descrito en el Ejemplo 1.1 se llevó a cabo para analizar la expresión de vHVT407. RESULTADOS
[0146] A las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del plásmido donante US2SVgDwtsyn de HVT se le asignan las SEQ ID NO tal como se muestra en la Figura 1.
Generación de Recombinante y Análisis de Expresión
[0147] Se llevó a cabo la tinción dual con inmunofluorescencia utilizando anti-sueros de pollo (Pab) y un anticuerpo monoclonal (Mab) seguido de una IgG anti-pollo marcada con FITC y de asno anti-ratón con Alexa Fluor marcada con TRITC. Se descubrió que todas las placas examinadas de vHVT407 expresaban las proteínas de IBDV-VP2 y gD de ILTV.
Análisis mediante PCR de vHVT407
[0148] La pureza del virus recombinante se verificó mediante PCR utilizando los pares de cebadores que son específicas para los brazos flanqueantes de HVT, el promotor, los genes de gD de ILTv y de IBDV-VP2 y la cola de poli A. Los resultados de PCR demuestran que el virus recombinante de vHVT407 contiene el casete de expresión pretendido y la solución madre del virus está libre de cantidades detectables del virus original de vHVT13.
CONCLUSIÓN
[0149] Basándose en la prueba de PCR y el análisis de inmunofluorescencia, vHVT407 es un virus recombinante que contiene los genes de IBDV-VP2 e gD de ILTV. El vHVT407 recombinante generado de nuevo está libre de cualquier virus original de vHVT13 detectable.
Ejemplo 1.8 Construcción de vHVT308 recombinante que expresa NDV-F e ILTV-gD en direcciones opuestas.
[0150] El objetivo del estudio es construir un plásmido de inserción para el sitio de la región intergénica I que contendrá una cola de poli A sintética, F de NDV, promotor de SV40, promotor de HHV3gB, gD de ILTV y cola de poli A de SV40 para la recombinación homóloga en FC126 de HVT.
[0151] El virus original utilizado en la construcción es FC126 de HVT. Una Proteína de Fusión del virus sintético de la enfermedad de Newcastle (NDV-F) (SEQ ID NO: 21 que codifica SEQ ID NO: 22) que corresponde a la secuencia de genotipo V se sintetizó químicamente y se optimizó en codones (GenScript). El sitio de inserción de la proteína F de este gen sintético se alteró para coincidir con una secuencia del sitio de inserción de F lentogénica. Una glicoproteína D sintética de ILTV de tipo salvaje (SEQ ID NO: 16 que codifica SEQ ID NO: 17) se sintetizó químicamente. Se construyó el plásmido donante pHVTIG1gDCaFopt que contenía el promotor de HHV3gB (promotor de la glicoproteína B del virus herpes humano del Tipo 3) en la orientación reversa que impulsa ILTV-gD cola de poli A de SV40 y promotor de SV40 que impulsa proteína de fusión de Newcastle cola sintética de poli A (véase la Figura 23). Se utilizaron células de fibroblastos de embrión de pollo (CEF) para la recombinación in vitro.
Generación de recombinante
[0152] Se siguió el procedimiento de recombinación homóloga tal como se describe en el Ejemplo 1.1 para generar el vHVT308 recombinante. Se llevó a cabo un pase en serie a pre-MSV+13.
Análisis de recombinante mediante PCR
[0153] Se llevó a cabo el procedimiento de Análisis mediante PCR tal como se describe en el Ejemplo 1.1 para la verificación de vHVT308 recombinante.
Análisis de expresión
[0154] El análisis de expresión descrito en el Ejemplo 1.1 se llevó a cabo para analizar la expresión del vHVT308 recombinante.
RESULTADOS
[0155] A las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del plásmido donante pHVTIG1gDCaFopt se les asignó las SEQ ID NO tal como se muestra en la Figura 1.
Generación de Recombinante y Análisis de Expresión
[0156] Se llevó a cabo la tinción dual con inmunofluorescencia utilizando anti-sueros de pollo (Pab) y un anticuerpo monoclonal (Mab) seguido de una IgG anti-pollo marcada con FITC y de asno anti-ratón con Alexa Fluor marcada con TRITC. Se descubrió que todas las placas examinadas de vHVT308 expresaban las proteínas NDV-F e ILTV-gD.
Análisis mediante PCR de vHVT308
[0157] La pureza del virus recombinante se verificó mediante PCR utilizando los pares de cebadores que son específicos para los brazos flanqueantes de HVT, los promotores, los genes de NDV-F e ILTV-gD y las colas de poli A. Los resultados de PCR demuestran que el virus recombinante vHVT308 contiene el casete de expresión pretendido y la solución madre del virus está libre de cantidades detectables del virus original de HVT (Tabla 6.1 y Figuras 24 y 25).
Tabla 6.1 Bandas de PCR esperadas utilizando los conjuntos de cebadores específicos
Figure imgf000022_0001
[0158] Las reacciones de PCR con todos los pares de cebadores dieron como resultado los productos esperados de PCR y los patrones de bandas. Tal como se muestra anteriormente, no existen evidencias del virus original de HVT en vHVT308 y vHVT308 es estable en los pases de pre-MSV+13.
CONCLUSIÓN
[0159] Basándose en las pruebas de PCR y el análisis de inmunofluorescencia, vHVT308 es un virus recombinante de HVT que contiene un gen de NDV-F bajo el control de un promotor de SV40 y un gen de ILTV-gD bajo el control de un promotor de HHV3gB. vHVT308 está libre de cualquier virus original de HVT detectable.
Ejemplo 1.9 Construcción de vHVT322 recombinante que expresa NDV-F e ILTV-gD.
[0160] El objetivo del estudio es construir un HVT recombinante en el que un casete de expresión que contiene un promotor de mCMV, proteína de fusión del virus de la Enfermedad de Newcastle (NDV-F), sitio interno de entrada al ribosoma (IRES), glicoproteína D de Laringotraqueítis Infecciosa (ILTV-gD) y cola de poli A del virus de simio 40 (poli A de SV40) se recombinarán de manera homóloga con los brazos flanqueantes en la región intergénica 1 (IG1) de vHVT13 (HVT+IBD).
[0161] El virus original utilizado en la construcción es vHVT13. Una proteína de fusión del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV-F) que corresponde a la secuencia del genotipo VIId de tipo salvaje (SEQ ID NO: 4 que codifica SEQ ID NO: 5) se sintetizó químicamente (GenScript). El sitio de escisión de la proteína F de este gen sintético se alteró para coincidir con la secuencia del sitio de escisión F lentogénico y la secuencia del gen de NDV-F resultante tiene un 99 % de identidad de secuencia de nucleótidos y de aminoácidos con la secuencia de NDV-F depositada en GenBank (AY337464). Una glicoproteína D sintética de ILTV de tipo salvaje (SEQ ID NO: 16 que codifica SEQ ID NO: 17) se sintetizó químicamente. El plásmido donante _pFwtIRESgD contenía el brazo flanqueante izquierdo de IG1, promotor de mCMV (CMV IE de ratón), NDV-F, IRES, ILTV-gD, poli A de SV40 y el brazo flanqueante derecho de IG1 (véase la Figura 26). Se utilizaron células de fibroblastos de embrión de pollo (CEF) para la recombinación in vitro.
Generación de recombinante
[0162] Se siguió el procedimiento de recombinación homóloga tal como se describe en el Ejemplo 1.1 para generar el vHVT322 recombinante. Se llevó a cabo el pase en serie para pre-MSV+13.
Análisis de recombinante mediante PCR
[0163] Se llevó a cabo el procedimiento de análisis por PCR tal como se describe en el Ejemplo 1.1 para la verificación de vHVT322 recombinante.
Análisis de expresión
[0164] El análisis de expresión descrito en el Ejemplo 1.1 se llevó a cabo para analizar la expresión del vHVT322 recombinante.
RESULTADOS
[0165] A las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del plásmido donante pFwtIRESgD se les asignaron las SEQ ID NO tal como se muestra en la Figura 1.
Generación de Recombinante y Análisis de Expresión
[0166] Se llevó a cabo la tinción dual con inmunofluorescencia utilizando anti-sueros de pollo (Pab) y un anticuerpo monoclonal (Mab) seguido de una IgG anti-pollo marcada con FITC y de asno anti-ratón con Alexa Fluor marcada con TRITC. Se descubrió que todas las placas examinadas positivas a TRITC de vHVT322 expresaban las proteínas NDV-F e ILTV-gD.
Análisis mediante PCR de vHVT322
[0167] La pureza del virus recombinante se verificó mediante PCR utilizando los pares de cebadores que son específicos para los brazos flanqueantes de HVT, el promotor, los genes de NDV-F e ILTV-gD y la cola de poli A. Los resultados de PCR demuestran que el virus recombinante vHVT322 contiene el casete de expresión pretendido y la solución madre del virus está libre de cantidades detectables de vHVT13 original (Tabla 6.2 y las Figuras 27 y 28).
Tabla 6.2 Bandas de PCR esperadas utilizando los conjuntos de cebadores específicos
Figure imgf000023_0001
[0168] Las reacciones de PCR con todos los pares de cebadores dan como resultado los productos esperados de PCR y los patrones de bandas. Tal como se muestra anteriormente, no existen evidencias de virus vHVT13 original en vHVT322.
CONCLUSIÓN
[0169] Basándose en las pruebas de PCR y el análisis de inmunofluorescencia, vHVT322 es un virus recombinante de HVT que contiene un gen de NDV-F e ILTV-gD bajo el control de un promotor de mCMV. vHVT322 está libre de cualquier virus original vHVT13 detectable.
[0170] Ejemplo 1.10 Construcción de vHVT406 recombinante que expresa ILT-gDwt El objetivo del estudio es construir un HVT recombinante en el que el sitio SORF3-US2 contiene el promotor de SV40, gD de Laringotraqueítis Infecciosa y la cola sintética de poli A para la recombinación homóloga en FC126 de HVT.
[0171] El virus original utilizado en la construcción es FC126 de HVT. Una glicoproteína D de tipo salvaje (gDwt) del virus sintético de Laringotraqueítis Infecciosa (ILTV) se sintetizó químicamente. El plásmido donante pHVTUS2SVgDwtsyn contenía los brazos de SORf3 y US2 de FC126 de Hv T, promotor de sV40, gDwt de ILTV (SEQ ID NO: 16 que codifica SEQ ID NO: 17) y poli A sintética (véase la Figura 29). Se utilizaron células de fibroblastos de embrión de pollo (CEF) para la recombinación in vitro.
Generación de recombinante
[0172] Se siguió el procedimiento de recombinación homóloga tal como se describe en el Ejemplo 1.1 para generar el vHVT406 recombinante. Se llevó a cabo el pase en serie para pre-MSV+13 (x+12).
Análisis de recombinante mediante PCR
[0173] Se llevó a cabo el procedimiento de análisis mediante PCR tal como se describe en el Ejemplo 1.1 para la verificación de vHVT406 recombinante.
Análisis de expresión
[0174] El análisis de expresión descrito en el Ejemplo 1.1 se llevó a cabo para analizar la expresión del vHVT406 recombinante.
RESULTADOS
[0175] A las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del plásmido donante pHVTUS2SVgDwtsyn se les asignaron SEQ ID NO tal como se muestra en la Figura 1.
Generación de Recombinante y Análisis de Expresión
[0176] El ADN genómico del virus HVT se sometió a electroporación conjunta con el plásmido donante pHVTUS2SVgDwtsyn para generar el HVT recombinante utilizando la técnica de recombinación homóloga. El virus recombinante se separó del virus original de HVT mediante la selección de pocillos positivos a inmunofluorescencia y el cribado de PCR en múltiples rondas de purificación de placas. Un virus de HVT recombinante purificado en placas que expresa la proteína ILTV-gD se denominó vHVT406.
[0177] Las placas virales con vHVT406 recombinante se visualizaron utilizando tanto los filtros TRITC como FITC para la tinción dual. Los FITC mostraron la expresión de ILTV-gDwt y los TRITC mostraron la expresión de HVT. Debido a los pocillos pequeños de las placas de 96 pocillos, cada pocillo se contabilizó con las placas contadas primaro con el filtro de TRITC y, a continuación, se volvió a contar con el filtro de FITC. Las placas combinadas de 600+ se contaron entre los pases de pre-MSV y pre-MSV+13. Todas las placas eran positivas tanto a FITC como a TRITC en ambos pases.
Análisis mediante PCR de vHVT406
[0178] El Análisis mediante PCR de vHVT406 se llevó a cabo utilizando los cebadores de PCR enumerados en la Tabla 6.3 (véase la Figura 30). Tal como se muestra en la Figura 31, los tamaños de productos de PCR después de electroforesis en gel corresponden adecuadamente a los tamaños esperados y los patrones de bandas. No existen evidencias del virus original de FC126 de HVT en vHVT406.
Tabla 6.3 Bandas de PCR esperadas utilizando los conjuntos de cebadores específicos
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SB1SORF4 SB1US2R
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0,989
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CONCLUSION
[0179] Basándose en las pruebas de PCR y el análisis de inmunofluorescencia, vHVT406 es un virus recombinante de HVT que contiene un promotor de SV40, gen de ILTV-gDwt y cola sintética de poli A en el sitio SOrf3-US2. vHVT406 está libre de cualquier virus original de HVT detectable.
Ejemplo 1.11 Estudio de estabilidad in vitro de los vectores HVT
[0180] Los vectores HVT construidos anteriormente se sometieron a estimulación de estabilidad genómica/de expresión después de múltiples pases in vitro en células de fibroblastos de embrión de pollo (CEF). Los vectores de HVT que expresan dos genes eran estables después de múltiples pases. Al contrario del conocimiento común que HVT con múltiples inserciones son menos estables, los resultados demostraron de manera sorprendente que los vectores de HVT construidos en el presente documento son estables y expresan dos genes de manera eficaz.
Ejemplo 2 Eficacia en la enfermedad de Newcastle (ND) inducida en D28 por vHVT306, vHVT309, vHVT310 y vHVT311 en pollos SPF
[0181] El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia de cuatro construcciones recombinantes de HVT (vHVT306, vHVT309, vhVt 310 y vHVT311) que expresaban el gen de VP2 de IBDV y el gen de F de NDV administrados a los pollos SPF de un día de edad contra las estimulaciones de la enfermedad de Newcastle (cepa Texas GB) realizadas el día D28.
[0182] Las características de estas vacunas candidatas se describen en la Tabla 7 a continuación.
Tabla 7. Las características de los vectores utilizados en el estudio de estimulación.
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[0183] Se asignaron a 5 grupos los noventa cinco pollos de un día de edad libres de patógeno específico (SPF) tal como se muestra en la Tabla 8. Todas las aves de los grupos 1 a 4 (20 aves/grupo) se vacunaron por vía subcutánea (SC) con 0,2 ml de construcciones diferentes de HVT-IBD ND a la dosis indicada (véase Tabla 8). Se dejaron 15 aves del grupo 5 sin vacunación. Veintiocho días (D28) después de la vacunación, las aves en cada grupo se estimularon con la cepa Texas GB de NDV por vía intramuscular (IM) (1040 de dosis infecciosa del 50% de huevo (EID50) en 0,1 mL/ave). Se controlaron los signos clínicos de las aves durante 14 días después de la estimulación. Las aves que no mostraron ningún signo clínico de ND (incluyendo signos del sistema nervioso central o respiratorios y/o muerte) hasta 14 días después de la estimulación consideraron protegidos.
[0184] Los resultados de la protección se muestran en la Tabla 8. Todas las aves de control del grupo 5 murieron después de la estimulación. La protección en los grupos vacunados alcanzó como mínimo el 90 %.
Tabla 8 Eficacia en ND inducida por construcciones dobles diferentes de HVT-IBD ND en pollos SPF
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Ejemplo 3 Eficacia en IBD inducida por vHVT309, vHVT310, vHVT311 y vHVT407 contra estimulación con IBDV estándar en D35
[0185] El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia de tres construcciones recombinantes de HVT (vHVT309, vHVT310 y vHVT311) que expresaban el gen de VP2 de IBDV y el gen de F de NDV y una construcción (vHVT407) que expresaba el gen de VP2 de IBDV y el gen de gD de ILTV administradas a los pollos SPF de un día de edad contra la estimulación con IBDV estándar realizada el día D35.
[0186] Se asignaron a 4 grupos los pollos de un día de edad libres de patógeno específico (SPF) tal como se muestra en la Tabla 9. Todas las aves de los grupos 1 a 4 (20 aves/grupo) se vacunaron por vía subcutánea (SC) con 0,2 ml de construcciones diferentes de HVT-IBD ND o HVT-IBD ILT a una dosis indicada. Se dejaron 20 aves del grupo 5 sin vacunación. Treinta y cinco días después de la vacunación (D35), todas las aves se sometieron a estimulación con la cepa clásica STC del virus de la enfermedad infecciosa de la bolsa (IBDV) por vía intraocular (IO) (1020EID50 a 0,03 ml/ave). Cuatro días después de la estimulación (D39) todas las aves se sacrificaron y se les practicó necropsia para examinar las lesiones macroscópicas de la bolsa.
[0187] Los resultados de la protección se muestran en la Tabla 9. Todas las aves vacunadas (excepto dos aves vacunadas con vHVT311) estaban protegidas contra IBD, mientras que ninguna de las aves de control estaba protegida.
Tabla 9 Eficacia EN IBD inducida por las construcciones dobles diferentes de HVT-IBD ND o HVT-IBD ILT en pollos SPF después de la estimulación en D35 con la cepa de STC de IBDV
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Ejemplo 4 Eficacia en IBD inducida por vHVT309, vHVT310, vHVT311 y vHVT407 contra la estimulación con una variante de IBDV en el D35
[0188] El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia de tres construcciones recombinantes de HVT (vHVT309, vHVT310 y vHVT311) que expresaban el gen de VP2 de IBDV y el gen de F de NDV y una construcción (vHVT407) que expresaba el gen de VP2 de IBDV y el gen de gD de ILTV administradas a los pollos SPF de un día de edad contra una estimulación de variante de IBDV (Delaware E) realizada el día D35.
[0189] Se asignaron a 6 grupos los pollos de un día de edad libres de patógeno específico (SPF) tal como se muestra en la Tabla 10. Todas las aves de los grupos 1 a 4 (19-20 aves/grupo) se vacunaron por vía subcutánea (SC) con 0,2 ml de construcciones diferentes de HVT-IBD ND o HVT-IBD ILT a una dosis indicada. Las aves del grupo 5 (19 aves) y el grupo 6 (18 aves) se dejaron sin vacunación. El día D35 todas las aves de los grupos 1 a 5 se sometieron a estimulación con la variante de la cepa Delaware E del virus de la enfermedad infecciosa de la bolsa (IBDV) por vía intraocular (IO) (1030 EID50 a 0,03 ml/ave). Las aves del grupo 6 no se sometieron a estimulación. El día D46, se midieron el peso corporal y el peso de la bolsa de todas las aves. Se calcularon las proporciones en peso de B/C (proporción de peso de la bolsa/peso corporal x100) para todos los grupos.
[0190] Los resultados de la protección se muestran en la Tabla 10. Las aves vacunadas de los grupos 1 y 2 tuvieron una proporción media en peso de B/C similar a la de controles no sometidos a estimulación sin vacunación (grupo 6) y mayor a las de controles sometidos a estimulación sin vacunación (grupo 5). Las aves del grupo 3 no estaban protegidas y las aves del grupo 4 estaban parcialmente protegidas. De manera sorprendente, vHVT310 que contiene IRES proporcionó una mejor protección que vHVT311 que contiene P2A.
Tabla 10 Eficacia en IBD inducida por construcciones dobles diferentes de HVT-IBD ND o HVT-IBD ILT en pollos SPF des ués de estimulación en el D35 con la ce a de la variante E de IBDV
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Ejemplo 5 Eficacia en IBD inducida por vHVT306, vHVT309 y vHVT310 frente a una estimulación de vvIBDV el día D28 en pollos de engorde
[0191] El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia de tres construcciones recombinantes de HVT (vHVT306, vHVT309 y vHVT310) que expresaban el gen de VP2 de IBDV y el gen de F de NDV administradas a los pollos de engorde de un día de edad contra la estimulación de vvIBDV realizada el día D28.
[0192] Se asignaron a 5 grupos los pollos de engorde de setenta y un días de edad (línea JA957 de Hubbard) tal como se muestra en la Tabla 11. Todas las aves de los grupos 2 a 5 (aproximadamente 15 aves/grupo) se vacunaron por vía subcutánea (SC) con 0,2 ml de construcciones diferentes de HVT-IBD ND a una dosis indicada. Se dejaron diez aves del grupo 1 sin vacunación. Veintiocho días después de la vacunación (D28), todas las aves se sometieron a estimulación con la cepa muy virulenta 91-168 de IBDV (vvIBDV) por vía intraocular (IO) (1043 EID50 a 0,05 ml/ave). Diez días después de la estimulación (D38) todas las aves se sacrificaron y se les practicó necropsia para examinar las lesiones macroscópicas de la bolsa. La bolsa y el cuerpo se pesaron y se llevó a cabo una histopatología de la bolsa. Las lesiones histológicas de la bolsa se puntuaron de 0 a 5 de acuerdo con la siguiente escala: 0 - Sin lesión, bolsa normal; 1 -1 % a 25 % de los folículos muestran depleción linfoide (es decir, menos de 50 % de depleción en 1 folículo afectado), influjo de heterófilos en las lesiones; 2 - 26 % a 50 % de los folículos muestran una depleción linfoide casi completa (es decir, con más del 75 % de depleción en 1 folículo afectado), los folículos afectados muestran lesiones necróticas y se puede detectar influjo severo de heterófilos; 3 - 51 % a 75 % de los folículos muestran depleción linfoide; los folículos afectados muestran lesiones necróticas y se detecta un influjo severo de heterófilos; 4 - 76 % a 100 % de los folículos muestran depleción linfoide casi completa; se detectan hiperplasia y estructuras de quistes; los folículos afectados muestran lesiones necróticas y se detecta un influjo severo de heterófilos; y 5 - 100 % de los folículos muestran depleción linfoide casi completa; pérdida completa de estructura folicular; epitelio engrosado y plegado; fibrosis de tejido bolsal. Las aves se consideraron protegidas cuando no mostraban signos clínicos después de someterse a estimulación y cuando su puntuación histológica era < 2.
[0193] Durante la primera semana tuvieron lugar algunas muertes tempranas en este lote de pollos de engorde probablemente debido a colibacilosis. La dosis de las vacunas probadas era inferior a la esperada (2000 UFP). Los resultados de la protección se muestran en la Tabla 11. Se indujo protección mediante vacunación que muestra vHVT310 siendo superior a vHVT306 y vHVT309.
Tabla 11 Eficacia en IBD inducida por las construcciones dobles diferentes de HVT-IBD ND en pollos de engorde después de la estimulación en el día D28 con la cepa vvIBDV
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Ejemplo 6 Eficacia en EN inducida por vHVT306, vHVT309 y vHVT310 frente a una estimulación de NDV velogénica el día D42 en pollos de engorde
[0194] El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia de tres construcciones recombinantes de HVT (vHVT306, vHVT309 y vHVT310) que expresaban el gen de VP2 de IBDV y el gen de F de NDV administradas a los pollos de engorde de un día de edad contra la estimulación de NDV velogénica realizada el día D42.
[0195] Se asignaron a 4 grupos los pollos de engorde de un día de edad (línea JA957 de Hubbard) tal como se muestra en la Tabla 12. Todas las aves de los grupos 2 a 4 (16-20 aves/grupo) se vacunaron por vía subcutánea (SC) con 0,2 ml de construcciones diferentes de HVT-IBD ND a la dosis indicada. Se dejaron doce aves del grupo 1 sin vacunación. Cuarenta y dos días después de la vacunación (D42), todas las aves se sometieron a estimulación con la cepa Herts 33 de n Dv velogénica por vía intramuscular (IM) (1050 EID50 a 0,2 ml/ave). Se observaron los signos clínicos de todas las aves durante 14 días después de la estimulación. Las aves se consideraron protegidos si morían o no mostraban signos clínicos de ND.
[0196] Durante la primera semana tuvieron lugar algunas muertes tempranas en este lote de pollos de engorde probablemente debido a colibacilosis. La dosis de las vacunas probadas era inferior a la esperada (2000 UFP). Los resultados de la protección se muestran en la Tabla 12. Se indujeron las mejores protecciones mediante vacunación con vHVT309 y vHVT310, seguido de vHVT306.
Tabla 12 Eficacia en EN inducida por construcciones dobles diferentes de HVT-IBD ND en pollos de engorde des ués de la estimulación en el día D42 con la ce a de NDV velo énica
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Ejemplo 7 Eficacia en EN inducida por vHVT306, vHVT309 y vHVT310 frente a una estimulación de NDV velogénico en el día D42 en pollos de engorde
[0197] El objetivo del estudio fue volver a evaluar la eficacia de tres construcciones recombinantes de HVT (vHVT306, vhVt 309 y vHVT310) que expresaban el gen de VP2 de IBDV y el gen de F de NDV administradas a los pollos de engorde de un día de edad contra la estimulación de NDV velogénico realizada el día D42.
[0198] Se asignaron a 4 grupos los pollos de engorde de un día de edad (línea JA957 de Hubbard) tal como se muestra en la Tabla 13. Todas las aves de los grupos 2 a 4 (16-20 aves/grupo) se vacunaron por vía subcutánea (SC) con 0,2 ml de construcciones diferentes de HVT-IBD ND a 2000 UPF. Se dejaron diecinueve aves del grupo 1 sin vacunación. Cuarenta y dos días después de la vacunación (D42), todas las aves se sometieron a estimulación con la cepa Herts 33 de NDV velogénico por vía intramuscular (IM) (1050 EID50 a 0,2 ml/ave). Se controlaron los signos clínicos de todas las aves durante 14 días después de la estimulación. Las aves se consideraron protegidas si no murieron o no mostraron signos clínicos de ND.
[0199] Los resultados de la protección se muestran en la Tabla 13. En general, los niveles de protección eran superiores que en el estudio anterior (véase el ejemplo 6), pero siguen la misma tendencia: las mejores protecciones se indujeron mediante la vacunación con vHVT309 y vHVT310, seguido de vHVT306.
[0200] Los resultados mostraron que vHVT309 era más eficaz que vHVT306 frente a estimulaciones de ND en SPF, así como en pollos de engorde (Tablas 12 y13), lo que sugiere que la inserción de polinucleótidos heterólogos en un locus tiene menor impacto negativo en la capacidad general del virus que la inserción en múltiples locus.
Tabla 13 Eficacia en ND inducida por construcciones dobles diferentes de HVT-IBD ND en pollos de engorde después de la estimulación en el día D42 con la cepa de NDV velogénico
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Ejemplo 8 Eficacia en IBD inducida por vHVT306, vHVT309 y vHVT310 frente a una estimulación con IBDV estándar el día D14 en pollos SPF
[0201] El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia de tres construcciones recombinantes de HVT (vHVT306, vHVT309 y vHVT310) que expresaban el gen de VP2 de IBDV y el gen de F de NDV administradas a los pollos SPF de un día de edad contra la estimulación con IBDV estándar realizada el día D14.
[0202] Se asignaron a 4 grupos los pollos de un día de edad libres de patógeno específico (SPF) tal como se muestra en la Tabla 14. Todas las aves de los grupos 1 a 3 (21-22 aves/grupo) se vacunaron por vía subcutánea (SC) con 0,2 ml de construcciones diferentes de HVT-IBD ND a la dosis indicada. Se dejaron 22 aves del grupo 4 sin vacunación. Catorce días después de la vacunación (D14), todas las aves se sometieron a estimulación con la cepa clásica de STC del virus de la enfermedad infecciosa de la bolsa (IBDV) por vía intraocular (IO) (1014 EID50 a 0,03 ml/ave). Cuatro días después de la estimulación (D18) todas las aves se sacrificaron y se les practicó necropsia para examinar las lesiones macroscópicas de la bolsa.
[0203] Los resultados de la protección se muestran en la Tabla 14. Se indujeron niveles similares de protección frente a IBD mediante las 3 vacunas experimentales, mientras que todas las aves menos una de control estaban infectadas.
Tabla 14 Eficacia en IBD inducida por las construcciones dobles diferentes de HVT-IBD+ND en pollos SPF después de la estimulación en el día D14 con la cepa STC de IBDV
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Ejemplo 9 Eficacia en IBD inducida por vHVT306, vHVT309 y vHVT310 en pollos SPF después de una estimulación con la variante de IBD en el D14
[0204] El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia de tres construcciones recombinantes de HVT (vHVT306, vHVT309 y vHVT310) que expresaban el gen de VP2 de IBDV y el gen de F de NDV administradas a los pollos SPF de un día de edad contra la estimulación de la variante de IBDV realizada el día D14.
[0205] Se asignaron a 5 grupos los pollos de un día de edad libres de patógeno específico (SPF) tal como se muestra en la Tabla 15. Todas las aves de los grupos 1 a 3 (20 aves/grupo) se vacunaron por vía subcutánea (SC) con 0,2 ml de construcciones diferentes de HVT-IBD+ND a una dosis indicada. Las aves del grupo 4 y grupo 5 (19­ 20 aves/grupo) se dejaron sin vacunación. El día D14 todas las aves de los grupos 1 a 4 se sometieron a estimulación con la cepa variante Delaware E del virus de la enfermedad infecciosa de la bolsa (IBDV) por vía intraocular (IO) (1022 EID50 a 0,03 ml/ave). Las aves del grupo 5 no se sometieron a estimulación. El día D25, se midieron el peso corporal y el peso de la bolsa de todas las aves. Se calcularon las proporciones en peso de B/C (proporción de peso de la bolsa/peso corporal x100) para todos los grupos.
[0206] Los resultados de la protección se muestran en la Tabla 15. La protección parcial se indujo el día D14 mediante las 3 vacunas, siendo la protección superior para vHVT309 y vHVT310.
[0207] vHVT306 y vHVT309 recombinantes tienen dos casetes de expresión independientes (dos ARNm). Las construcciones que expresan dos genes a través de un IRES o P2A (por ejemplo, vHVT310, vHVT317, vHVT311, vHVT316, vHVT322) no solamente se encuentran en un sitio de inserción, sino que también los genes se expresan a partir de un único ARNm. Comparando todos los datos expuestos en las Tablas 11 a 19, se muestra que vHVT309 y vHVT310 recombinantes de un sitio de inserción son más eficaces que vHVT306 recombinante de dos sitos de inserción, indicando que los recombinantes de HVT que contienen más de un polinucleótido heterólogo en un locus de inserción son biológicamente más aptos que los recombinantes de HVT que contienen polinucleótidos heterólogos en múltiples locus de inserción. Además, de manera sorprendente, la expresión de más de un polinucleótido heterólogo a partir de un único ARNm expresado a través de un IRES tiene menor impacto negativo sobre la eficacia en IBD, particularmente en pollos de engorde (véanse los resultados en la Tabla 11).
Tabla 15 Eficacia en IBD inducida por construcciones dobles diferentes de HVT-IBD+ND en pollos SPF después de la estimulación en el día D14 con la cepa de IBDV de la variante E
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Ejemplo 10 Eficacia en IBD inducida por vHVT306, vHVT309 y vHVT310 frente a una estimulación con IBDV estándar en el día D28 en pollos SPF
[0208] El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia de tres construcciones recombinantes de HVT (vHVT306, vHVT309 y vHVT310) que expresaban el gen de VP2 de IBDV y el gen de F de NDV administradas a los pollos SPF de un día de edad contra la estimulación con IBDV estándar realizada el día D28.
[0209] Se asignaron a 4 grupos los pollos de un día de edad libres de patógeno específico (SPF) tal como se muestra en la Tabla 16. Todas las aves de los grupos 1 a 3 (20-22 aves/grupo) se vacunaron por vía subcutánea (SC) con 0,2 ml de construcciones diferentes de hVT-IBD+ND a la dosis indicada. Se dejaron 22 aves del grupo 4 sin vacunación. Veintiocho días después de la vacunación (en el D28), todas las aves se sometieron a estimulación con la cepa clásica de STC del virus de la enfermedad infecciosa de la bolsa (IBDV) por vía intraocular (IO) (1020 EID50 a 0,03 ml/ave). Cuatro días después de la estimulación (D32) todas las aves se sacrificaron y se les practicó necropsia para examinar las lesiones macroscópicas de la bolsa.
[0210] Los resultados de la protección se muestran en la Tabla 16. Se indujo la protección completa porvHVT310 mientras que solamente unas cuantas aves no estaban protegidas para las otras vacunas candidatas.
Tabla 16 Eficacia en IBD inducida por construcciones dobles diferentes de HVT-IBD ND en pollos SPF después de la estimulación en día D28 con la cepa STC de IBDV
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Ejemplo 11 Eficacia en IBD inducida por vHVT306, vHVT309 y vHVT310 en pollos SPF después de una estimulación con la variante de IBD el D28
[0211] El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia de tres construcciones recombinantes de HVT (vHVT306, vHVT309 y vHVT310) que expresaban el gen de VP2 de IBDV y el gen de F de NDV administradas a los pollos SPF de un día de edad contra la estimulación con la variante de IBDV realizada el día D28.
[0212] Se asignaron a 5 grupos los pollos de un día de edad libres de patógeno específico (SPF) tal como se muestra en la Tabla 17. Todas las aves de los grupos 1 a 3 (20 aves/grupo) se vacunaron por vía subcutánea (SC) con 0,2 ml de construcciones diferentes de HVT-IBD ND a una dosis indicada. Las aves del grupo 4 y grupo 5 (18­ 19 aves/grupo) se dejaron sin vacunación. El día D28 todas las aves de los grupos 1 a 4 se sometieron a estimulación con la cepa de variante Delaware E del virus de la enfermedad infecciosa de la bolsa (IBDV) por vía intraocular (IO) (1022 EID50 a 0,03 ml/ave). Las aves del grupo 5 no se sometieron a estimulación. El día D39, se midieron el peso corporal y el peso de la bolsa de todas las aves. Se calcularon las proporciones en peso de B/C (proporción de peso de la bolsa/peso corporal x100) para todos los grupos.
[0213] Los resultados de la protección se muestran en la Tabla 17. La proporción en peso de B/C para el grupo 5 (grupo no sometido a estimulación) no se pudo obtener dado que este grupo se infectó inesperadamente con la cepa STC de IBDV. La protección inducida por vHVT310 era superior a la inducida por vHVT306 y vHVT309.
Tabla 17 Eficacia en IBD inducida por las construcciones dobles diferentes de HVT-IBD ND en pollos SPF después de la estimulación en el día D28 con la cepa de la variante E de IBDV
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Ejemplo 12 Eficacia en la enfermedad de Newcastle (ND) inducida el día D21 y D28 mediante vHVT306, vHVT309 y vHVT310 en pollos SPF
[0214] El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia de tres construcciones recombinantes de HVT (vHVT309, vHVT310 y vHVT311) que expresaban el gen de VP2 de IBDV y el gen de F de NDV administradas a los pollos SPF de un día de edad contra las estimulaciones con enfermedad de Newcastle (cepa Texas GB) realizadas el día D21 y D28.
[0215] Se asignaron a 4 grupos los pollos de un día de edad libres de patógeno específico (SPF) tal como se muestra en la Tabla 18. Todas las aves de los grupos 1 a 3 (50 aves/grupo) se vacunaron por vía subcutánea (SC) con 0,2 ml de construcciones diferentes de HVT-IBD ND en una dosis indicada. Se dejaron 30 aves del grupo 4 sin vacunación. Veintiún días (D21) después de la vacunación, 20 aves de los grupos 1-3 y 15 aves del grupo 4 se sometieron a estimulación con la cepa Texas GB de NDV por vía intramuscular (IM) (1042 de dosis infectiva de huevo 50% (EID50) en 0,1 ml/ave). Veintiocho días (D28) después de la vacunación, 30 aves de los grupos 1-3 y 15 aves del grupo 4 se sometieron a estimulación con la cepa Texas GB de NDV por vía intramuscular (IM) (1043 de dosis infectiva de huevo 50% (EID50) en 0,1 ml/ave). Se observaron los signos clínicos de las aves durante 14 días después de la estimulación. Las aves que no mostraron ningún signo clínico de ND (incluyendo signos del sistema nervioso central o respiratorios y/o muerte) hasta 14 días después de la estimulación se consideraron protegidos.
[0216] Los resultados de la protección se muestran en la Tabla 18. Todas las aves de control del grupo 4 murieron después de la estimulación. La protección inducida por vHVT310 fue la mejor seguida por vHVT306 y vHVT309. Tabla 18 Eficacia en ND en los días D21 y D28 inducida por construcciones dobles diferentes de HVT-IBD ND en ollos SPF
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Ejemplo 13 Eficacia en la enfermedad de Marek (MD) inducida por vHVT306, vHVT309 y vHVT310 in pollos SPF [0217] El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia de tres construcciones recombinantes de HVT (vHVT309, vHVT310 y vHVT311) que expresaban el gen de VP2 de IBDV y el gen de F de NDV administradas a los pollos SPF de un día de edad contra las estimulaciones con la enfermedad de Marek (cepa GA, 2 lotes y 2 diluciones).
[0218] Se asignaron a 4 grupos los pollos de un día de edad libres de patógeno específico (SPF) tal como se muestra en la Tabla 19. Todas las aves de los grupos 1 a 3 (20 aves/grupo) se vacunaron por vía subcutánea (SC) con 0,2 ml de construcciones diferentes de HVT-IBD ND en una dosis indicada. Se dejaron 20 aves del grupo 4 sin vacunación. Cuatro días después de la vacunación (D4), 18-20 aves de los grupos 1-4 se sometieron a estimulación con dos diluciones (1:5 y 1:640) de dos lotes diferentes (#1 y #2) de la cepa GA22 de vMDV por vía SC. Se observaron los signos clínicos de las aves atribuibles a la enfermedad de Marek durante 45-50 días después la incubación. En los días D46-D50 todas las aves se sometieron a necropsia y se comprobaron las lesiones de la enfermedad de Marek. Las aves que no mostraron ningún signo clínico o lesiones de MD se consideraron protegidos.
[0219] Los resultados de la protección se muestran en la Tabla 19. La infectividad en las aves de control del grupo 4 variaba entre 75-90 %. En general, la protección inducida por vHVT310 fue la mejor seguida de cerca por vHVT306 y, a continuación, vHVT309.
Tabla 19 Eficacia en MD inducida por construcciones dobles diferentes de HVT-IBD ND en pollos SPF frente a 2 lotes diferentes de estimulación con GA22 diluida a 1:5 o 1:640
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Ejemplo 14 Eficacia en IBD inducida por vHVT306 y vHVT407 frente a una estimulación de IBDV clásico el día D21 en pollos SPF
[0220] El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia de dos construcciones recombinantes de HVT, una (vHVT306) que expresaba el gen de VP2 de IBDV y el gen de F de NDV y la otra (vHVT407) que expresaba el gen de VP2 de IBDV y el gen de gD de ILTV administradas a los pollos SPF de un día de edad contra una estimulación de IBDV clásico realizada el día D21.
[0221] Se asignaron a 3 grupos los pollos SPF de cuarenta y un días de edad (Leghorn blancos) tal como se muestra en la Tabla 20. Todas las aves de los grupos 2 y 3 (aproximadamente 15 aves/grupo) se vacunaron por vía subcutánea (SC) con 0,2 ml de construcciones de vHVT306 o vHVT407 a la dosis indicada. Se dejaron diez aves del grupo 1 sin vacunación. Veintiún días después de la vacunación (D21), todas las aves se sometieron a estimulación con la cepa clásica de IBDV Faragher 52/70 por vía intraocular (IO) (1020 EID50 a 0,05 ml/ave). Once días después de la estimulación (D32) todas las aves se sacrificaron y se les practicó necropsia para examinar las lesiones macroscópicas de la bolsa. La bolsa y el cuerpo se pesaron para calcular la proporción en peso de la bolsa en relación al cuerpo. Las aves se consideraron protegidas cuando no mostraron ningún signo clínico o lesión de la bolsa después de la estimulación.
[0222] Los resultados de la protección se muestran en la Tabla 20. Se indujo la protección completa de IBD mediante la vacunación con vHVT306 o vHVT407.
Tabla 20 Eficacia en IBD inducida por dos construcciones de HVT que expresan dos genes en pollos SPF después de la estimulación en el día D21 con la cepa de IBDV Faragher
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Ejemplo 15 Eficacia en ILT inducida por vHVT407 frente a una estimulación con ILTV el día D21 en pollos SPF [0223] El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia de dos construcciones recombinantes de vHVT407 que expresaban el gen de VP2 de IBDV y el gen de gD de ILTV administradas a los pollos SPF de un día de edad contra la estimulación con ILTV realizada el día D21.
[0224] Se asignaron a 2 grupos los veinticuatro pollos SPF de un día de edad (Leghorn blancos) tal como se muestra en la Tabla 21. Todas las aves (aproximadamente 12 aves/grupo) se vacunaron por vía subcutánea (SC) con 0,2 ml de construcción de vHVT13 (utilizada como control negativo) o vHVT407 en la dosis indicada. Veintiún días después de la vacunación (D21), todas las aves se sometieron a estimulación con la cepa de ILTV ILT-96-3 por vía intratraqueal (IT) (1036 EID50 a 0,5 ml/ave). Se observaron los signos clínicos de las aves durante 11 días después de la estimulación. Durante los días de estudio 25-29 y 32 se observaron los signos clínicos de todas las aves que incluían patrones de respiración, conjuntivitis, depresión y mortalidad. En el día del estudio 32 todas las aves restantes se sacrificaron. Las aves se consideraron protegidas cuando no mostraron signos clínicos de ILT, tales como insuficiencia respiratoria asociada a tos, estornudo, estertores, depresión, jadeo y/o exudados mucosos con sangre, incluyendo mortalidad.
[0225] Los resultados de la protección se muestran en la Tabla 21. Se indujo una protección importante de ILT mediante la vacunación con vHVT407 bajo estas condiciones de estimulación.
Tabla 21 Eficacia en ILT inducida por la construcción de vHVT407 en pollos SPF después de la estimulación en el día D21 con la cepa de ILTV IlT-96-3
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Ejemplo 16 Eficacia en ILT inducida por vHVT407, un HVT-ILT comercial y una vacuna comercial de origen de embrión de pollo (CEO) contra una estimulación con ILTV el día D21 en pollo de engorde.
[0226] El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia de la construcción recombinante de vHVT407 que expresaba el gen de VP2 de IBDV y el gen de gD de ILTV administrada a los pollos de engorde de un día de edad en comparación con una vacuna comercial de HVT-ILT (INNOVAX® ILT) contra una estimulación con ILTV realizada el día D21.
[0227] Se asignaron a 3 grupos los cuarenta y ocho pollos de engorde de un día de edad tal como se muestra en la Tabla 22. Todas las aves (aproximadamente 12 aves/grupo) de los grupos 1-3 se vacunaron por vía subcutánea (SC) con 0,2 ml de construcciones de vHVT13 (utilizada como un control negativo), vHVT407 o INNOVAX® ILT (utilizada como un control positivo) en la dosis indicada. Veintiún días después de la vacunación (D21), todas las aves se sometieron a estimulación con la cepa de ILTV ILT-96-3 por vía intratraqueal (IT) (1042 EID50 a 0,5 ml/ave). Se observaron los signos clínicos de las aves durante 12 días después de la estimulación. En los días de estudio 25­ 29 y 32-33 se observaron todas las aves y se puntuaron según los signos clínicos que incluían patrones de respiración, conjuntivitis, depresión y mortalidad. En el día del estudio 34 todas las aves restantes se sacrificaron. Las aves se consideraron protegidas cuando no mostraron signos clínicos de ILT, tales como dificultad respiratoria asociada a tos, estornudo, estertores, depresión, jadeo y/o exudados mucosos con sangre, incluyendo mortalidad.
[0228] Los resultados de la protección se muestran en la Tabla 22. La protección de ILT se indujo mediante la vacunación con vHVT407, que fue superior a la inducida por INNOVAX ILT.
Tabla 22 Eficacia en ILT inducida por las construcciones de vHVT407 e INNOVAX ILT en pollos de engorde después de la estimulación en el día D21 con la cepa de ILTV ILT-96-3
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Ejemplo 17 Eficacia en la enfermedad de Newcastle (ND) inducida los días D14, D21 y D32 mediante vHVT310 y vHVT316 en pollos SPF
[0229] El objetivo del estudio fue comparar la aparición de inmunidad contra ND de las dos construcciones recombinantes de HVT (vHVT310 y vHVT316) que expresaban el gen de VP2 de IBDV y el gen de F de NDV administradas a los pollos SPF de un día de edad contra las estimulaciones de la enfermedad de Newcastle (cepa Texas GB) realizadas los días D14, D21 y D32.
[0230] Se asignaron a 3 grupos los pollos de un día de edad libres de patógeno específico (SPF) tal como se muestra en la Tabla 23. Todas las aves de los grupos 1 a 2 (59-70 aves/grupo; véase la tabla) se vacunaron por vía subcutánea (SC) con 0,2 ml de construcciones diferentes de HVT-IBD ND en la dosis indicada. Se dejaron 45 aves del grupo 3 sin vacunación. En los días D14, D21 y D32, 15-30 aves (véase la tabla) de los grupos 1-3 se sometieron a estimulación con la cepa Texas GB de NDV por vía intramuscular (IM) (1040 EID50/ave) a 0,1 ml/ave). Se observaron los signos clínicos en las aves durante 14 días después de la estimulación. Las aves que no mostraron ningún signo clínico de ND (incluyendo signos del sistema nervioso central o respiratorios y/o muerte) hasta 14 días después de la estimulación se consideraron protegidas.
[0231] Los resultados de la protección se muestran en la Tabla 23. Todas las aves de control del grupo 3 murieron después de la estimulación. Los niveles de protección inducidos tanto por vHVT310 y vHVT316 fueron similares con una posible aparición más temprana de inmunidad inducida por vHVT316.
Tabla 23 Eficacia en ND los días D14, D21 y D32 inducida por construcciones dobles diferentes de HVT-IBD ND en pollos SPF
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Ejemplo 18 Eficacia en ILTV inducida por los vectores de HVT que expresaban gD de ILTV y VP2 de IBDV o que expresaban gD de ILTV y F de NDV
[0232] El objetivo del estudio es evaluar la eficacia de las construcciones recombinantes de HVT que expresan gD de IlTv y VP2 de IBDV (tal como vHVT317 y vHVT407) o que expresan genes de gD de ILTV y F de NdV (tales como vHVT308 y vHVT322) administradas a los pollos contra la estimulación de IL TV.
[0233] Los pollos se asignaron a diferentes grupos. Las aves se vacunaron por vía subcutánea (SC) con 0,2 mL de construcciones diferentes de HVT. Las aves de un grupo se dejaron sin vacunación. Las aves se sometieron a estimulación con ILTV por vía intratraqueal (IT) o por vía sinusal infraorbitaria. Se observan los signos clínicos de las aves durante 11-14 días después de la estimulación. Las aves que no muestran ningún signo clínico de ILTV (incluyendo dificultad para respirar asociada a tos, estornudo, estertores, depresión, jadeo y/o exudados mucosos con sangre y/o muerte) hasta 14 días después de la estimulación se consideran protegidas.
[0234] Los resultados muestran que los vectores de HVT proporcionan protección frente a la infección de IL TV. Ejemplo 19 Eficacia en IBD inducida por los vectores de HVT que expresan gD de ILTV y VP2 de IBDV
[0235] El objetivo del estudio es evaluar la eficacia de las construcciones recombinantes de HVT que expresan gD de ILTV y v P2 de IBDV (tales como vHVT317 y vHVT407) administradas a los pollos contra los desafíos de IBD.
[0236] Los pollos se asignaron a diferentes grupos. Las aves se vacunaron por vía subcutánea (SC) con 0,2 mL de construcciones diferentes de HVT. Las aves de un grupo se dejaron sin vacunación. Las aves se sometieron a estimulación con IBD por vía intraocular (IO). Se observan los signos clínicos de las aves durante un periodo de 4 a 10 días después de la estimulación. Las aves que no muestran ningún signo clínico de IBD (incluyendo depresión y/o muerte) y que no muestran lesiones de la bolsa y/o atrofia hasta 10 días después de la estimulación se consideran protegidos.
[0237] Los resultados muestran que los vectores de HVT proporcionan protección frente a la infección de IBD. Ejemplo 20 Eficacia en NDV inducida por los vectores de HVT que expresan gD de ILTV y F de NDV
[0238] El objetivo del estudio es evaluar la eficacia de las construcciones recombinantes de HVT que expresan genes de gD de ILTV y F de NDV (tales como vHVT308 y vHVT322) administradas a los pollos contra las estimulaciones de NDV.
[0239] Los pollos se asignaron a diferentes grupos. Las aves se vacunaron por vía subcutánea (SC) con 0,2 mL de construcciones diferentes de HVT. Las aves de un grupo se dejaron sin vacunación. Las aves se sometieron a estimulación con NDV por vía intramuscular (IM). Se observan los signos clínicos de las aves durante 14 días después de la estimulación. Las aves que no muestran ningún signo clínico de ND (incluyendo signos del sistema nervioso central o respiratorios y/o muerte) hasta 14 días después de la estimulación se consideran protegidos.
[0240] Los resultados muestran que los vectores de HVT proporcionan protección frente a la infección de NDV. Ejemplo 21 Eficacia en IBD inducida por vHVT316 y vHVT317 frente a una estimulación de IBDV estándar el día D28 en pollos SPF
[0241] El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia de dos construcciones recombinantes de HVT (vHVT316 y vHVT317) que expresan el gen de VP2 de IBDV y el gen de F de NDV (vHVT316) o el gen de VP2 de IBDV y el gen de gD de ILTV (vHVT317) administradas a los pollos SPF de un día de edad contra la estimulación de IBDV estándar realizada el día D28.
[0242] Se asignaron 3 grupos a los pollos de un día de edad libres de patógeno específico (SPF) tal como se muestra en la Tabla 24. Todas las aves de los grupos 1 y 2 (aproximadamente 15 aves/grupo) se vacunaron por vía subcutánea (SC) con 0,2 mL de vHVT316 y vHVT317 a la dosis indicada. Se dejaron 15 aves del grupo 3 sin vacunación. Veintiocho días después de la vacunación (D28), todas las aves se sometieron a estimulación con la cepa clásica STC del virus de la enfermedad infecciosa de la bolsa (IBDV) por vía intraocular (IO) (1020 EID50 a 0,03 ml/ave). Cuatro días después de la estimulación (D32) todas las aves se sacrificaron y se les practicó necropsia para examinar las lesiones macroscópicas de la bolsa.
[0243] Los resultados de la protección se muestran en la Tabla 24. Se indujo la protección de 100 % y 80 % mediante vHVT316 y vHVT317, respectivamente; sin embargo, la dosis administrada de vHVT317 era casi 3 veces inferior a la de vHVT316.
Tabla 24 Eficacia en IBD inducida por construcciones dobles de HVT-IBD+ND (vHVT316) o HVT-IBD+ILT (vHVT317) n ll PF l im l i n n l í D2 n l T IBDV
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Ejemplo 22 Eficacia en IBD inducida por vHVT310, vHVT316 y vHVT317 en pollos SPF después de una estimulación con la variante de IBD en el día D28
[0244] El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia de tres construcciones recombinantes de HVT (vHVT310, vHVT316 y vHVT317) que expresan el gen de VP2 de IBDV y el gen de F de NDV (vHVT310 y vHVT316) o el gen de VP2 de IBDV y el gen de gD de IL TV (vHVT317) administradas a los pollos SPF de un día de edad contra la estimulación de la variante de IBDV realizada el día D28.
[0245] Se asignaron a 5 grupos los pollos de un día de edad libres de patógeno específico (SPF) tal como se muestra en la Tabla 25. Todas las aves de los grupos 1 a 3 (15 aves/grupo) se vacunaron por vía subcutánea (SC) con 0,2 mL de vHVT310, vHVT316 y vHVT317 a la dosis indicada. Las aves del grupo 4 y grupo 5 (15 aves/grupo) se dejaron sin vacunación. El día D28 todas las aves de los grupos 1 a 4 se sometieron a estimulación con la variante de la cepa Delaware E del virus de la enfermedad infecciosa de la bolsa (IBDV) por vía intraocular (IO) (1030 EID50 en 0,03 ml/ave). Las aves del grupo 5 no se sometieron a estimulación. El día D39 se midió el peso corporal y el peso de la bolsa de todas las aves. Se calcularon las proporciones en peso de B/C (proporción de peso de la bolsa/peso corporal x100) para todos los grupos.
[0246] Los resultados de la protección se muestran en la Tabla 25. La protección se observó en todos los grupos vacunados. La protección con vHVT317 era ligeramente superior a la inducida mediante vHVT310 y vHVT316 a pesar de su dosis baja.
Tabla 25 Eficacia en IBD inducida por las construcciones diferentes de HVT con insertos dobles en pollos SPF después de la estimulación en el día D28 con la variante E de la cepa de IBDV
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Ejemplo 23 Eficacia en ILT inducida por vHVT317 frente a una estimulación de ILTV el día D28 en pollos SPF [0247] El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia de la construcción recombinante de vHVT317 que expresa el gen de VP2 de IBDV y el gen de gD de ILTV administrada a los pollos SPF de un día de edad contra una estimulación de ILTV realizada el día D28.
[0248] Se asignaron a 2 grupos los treinta y seis pollos SPF de un día de edad (Leghorn blancos) tal como se muestra en la Tabla 26. Todas las aves (aproximadamente 18 aves/grupo) se vacunaron por vía subcutánea (SC) con 0,2 ml de vHVT317 o se dejaron sin vacunación. Veintiocho días después de la vacunación (D28), todas las aves se sometieron a estimulación con la cepa de ILTV ILT-96-3 por vía intratraqueal (IT) (1030 EID50 en 0,2 ml/ave). Se observaron los signos clínicos en las aves y la mortalidad en los días D32, D36 y D39. Los signos clínicos incluían patrón de respiración, conjuntivitis, depresión y mortalidad. En el día del estudio 32 todas las aves restantes se sacrificaron. Se utilizó la evaluación de la protección utilizando 3 criterios diferentes: (1) Cualquier ave que muestra cualquier signo clínico durante tres días consecutivos o que muere después de la estimulación se considera ILT positivo; (2) Cualquier ave que muestra cualquier signo clínico moderado o grave en cualquier categoría durante cualquier día o que muere después de la estimulación se considera IL T positivo; y (3) Cualquier ave que muestra cualquier signo clínico moderado o grave en cualquier categoría durante dos días consecutivos o que muere después de la estimulación se considera IL T positivo.
[0249] Los resultados de la protección basados en los 3 criterios diferentes se muestran en la Tabla 26. La estimulación de IL T fue grave dado que mató (o las aves fueron sometidas a sacrificio cuando mostraron signos clínicos muy graves por razones éticas) al 86,7% de las aves no vacunados. Se indujeron los niveles altos de la protección de ILT mediante la vacunación con vHVT317 bajo estas condiciones de estimulación.
Tabla 26 Eficacia en IL T inducida por la construcción vHVT317 en pollos SPF después de la estimulación en el día D28 con la ce a de ILTV iLt -96-3
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Ejemplo 24 Eficacia en ILT inducida por vHVT317, un HVT-ILT comercial y una vacuna comercial de origen de embrión de pollo (CEO) contra una estimulación de ILTV en el día D21en pollos de engorde.
[0250] El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia de la construcción recombinante vHVT317 que expresa el gen de VP2 de IBDV y el gen de gD de ILTV administrada a los pollos de engorde de un día de edad en comparación con una vacuna comercial de HVT-ILT (INNOVAX® ILT, Merck Animal Health) contra una estimulación de ILTV realizada el día D28.
[0251] Se asignaron a 3 grupos los cincuenta y un pollos comerciales de engorde de un día de edad tal como se muestra en la Tabla 27. Todas las aves (17 aves/grupo) se vacunaron por vía subcutánea (SC) con 0,2 ml de vHVT317 o INNOVAX® ILT (utilizado como control positivo) a la dosis indicada o se dejaron sin vacunación. En el día D26, el número de aves por grupo se redujo hasta 15 y se pesó cada ave. Veintiocho días después de la vacunación (D28), todas las aves se sometieron a estimulación con la cepa de IL TV 63140 por vía infraorbitaria (1043 EID50 en 0,2 ml/ave). En los días del estudio 31 a 35 y el día del estudio 38 se observaron individualmente los signos clínicos de todas las aves. En el día del estudio 38 todas las aves restantes se pesaron individualmente y se sacrificaron. Se llevó a cabo la evaluación de la protección utilizando 3 criterios diferentes: (1) Cualquier ave que muestra cualquier signo clínico durante tres días consecutivos o que muere después de la estimulación se considera IL T positivo; (2) Cualquier ave que muestra cualquier signo clínico moderado o grave en cualquier categoría durante cualquier día o que muere después de la estimulación se considera IL T positivo; y (3) Cualquier ave que muestra cualquier signo clínico moderado o grave en cualquier categoría durante dos días consecutivos o que muere después de la estimulación se considera IL T positivo. También se comparó el peso corporal en los días D26 y D38.
[0252] Los resultados de la protección utilizando los 3 criterios se muestran en la Tabla 27. Todos los controles se consideraron no protegidos para los 3 criterios. Ambas vacunas probadas indujeron protección alta y similar frente a ILT. No existió diferencia importante entre el peso corporal en el día D26 (antes de la estimulación); sin embargo, después de la estimulación, los pesos corporales de las aves vacunadas fueron significativamente más altos (p<0,0001) que los de las aves no vacunadas, lo que indica la protección frente a la pérdida de peso.
Tabla 27 Eficacia en IL T inducida por las construcciones de vHVT317 e INNOVAX IL T (control positivo) en pollos de en orde des ués de la estimulación en el día D28 con la ce a 63140 de IL TV
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Ejemplo 25 Eficacia en IBD inducida por la administración in ovo de vHVT317 después de la estimulación con la variante de IBD en el día 28 de edad de los pollos.
[0253] El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia de vHVT317 que expresaba el gen de VP2 de IBDV y el gen de gD de ILTV administrada in ovo a embriones de 18-19 días de edad de pollos SPF contra una estimulación de la variante de IBDV realizada a los 28 días de edad (31 días después de la vacunación).
[0254] Se asignaron a 3 grupos los embriones de 18-19 días de edad de pollos libres de patógeno específico (SPF) tal como se muestra en la Tabla 28. Todas las aves de los grupos 1 y 2 (aproximadamente 30 huevos/grupo) se vacunaron por vía in ovo (SC) con 0,05 ml de vHVT317 a la dosis indicada. Se simuló la inoculación a los huevos embrionados del grupo 3 con 0,05 ml del diluyente de la vacuna de Marek. Al nacer, se conservaron 22 polluelos por grupo y, antes de la estimulación, los 3 grupos se redujeron a 20 aves. Treinta y un días después de la vacunación (a los 28 días de edad), las aves de los 3 grupos se sometieron a estimulación con la variante de la cepa Delaware E del virus de la enfermedad infecciosa de la bolsa (IBDV) por vía intraocular (IO) (dosis objetivo de 1030 EID50 en 0,03 ml/ave). Se simuló la estimulación en aves del grupo 5 con TPB (caldo de fosfato de triptosa, 0,03 ml/ave). Once días después de la estimulación se midió el peso corporal y el peso de la bolsa de todas las aves. Se calcularon las proporciones en peso de B/C (proporción de peso de la bolsa/peso corporal x100) para todos los grupos.
[0255] Los resultados de la protección se muestran en la Tabla 28. Se observó una atrofia clara de la bolsa en todas las aves no vacunadas sometidas a estimulación. Se observó la protección en los grupos vacunados con vHVT317 a las 2 dosis probadas.
Tabla 28 Eficacia en IBD inducida por vHVT317 administrada in ovo después de la estimulación a los 28 días de n l v ri n E l IBDV n l ll PF
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Ejemplo 26 Eficacia en IL T inducida por vHVT317 administrada por vía in ovo contra una estimulación de IL TV en el día D28 en pollos SPF
[0256] El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia de la construcción recombinante vHVT317 que expresaba el gen de VP2 de IBDV y el gen de gD de ILTV administrada por vía in ovo a los embriones de 18-19 días de edad contra una estimulación de ILTV realizada en el día D28 (a los 25 días de edad) en pollos SPF.
[0257] Se asignaron a 2 grupos los embriones de 18-19 días de edad de pollos libres de patógeno específico (SPF) tal como se muestra en la Tabla 29. Todas las aves del grupo 1 (aproximadamente 30 huevos/grupo) se vacunaron por vía in ovo (SC) con 0,05 ml de vHVT317 a la dosis indicada. Se simuló la inoculación a los huevos embrionados del grupo 2 con 0,05 ml del diluyente de la vacuna de Marek. Al nacer, se conservaron 22 polluelos por grupo y, un día antes de la estimulación, ambos grupos se redujeron a 20 aves. Veinticinco días después de la vacunación (en el D28), las aves de ambos grupos se sometieron a estimulación con la cepa de ILTV 63140 administrada en el seno infraorbitario (1047 EID50 a 0,2 ml/ave). Se observan los signos clínicos de las aves y la mortalidad desde el día D28 hasta D38. En el día del estudio 38 todas las aves restantes se sacrificaron. La eficacia frente a la estimulación de ILT se determinó mediante la ausencia de signos clínicos típicos de ILT, tales como: depresión, dificultada para respirar asociada con tos, estornudo, estertores, jadeo con cuello extendido, con o sin descarga de sangre y/o mucosa; disnea y respiración por la boca; inflamación de senos infraorbitarios, con o sin drenaje; y/o conjuntiva inflamada con cierre parcial o completo de los ojos. Cualquier mortalidad después de la estimulación, a excepción de traumatismo, o cualquier condición clara que excluye al ave del estudio, se consideró positiva a ILT.
[0258] Los resultados de la protección frente a ILT se muestran en la Tabla 29. Los resultados mostraron que la mayoría de las aves vacunadas con vHVT317 estaban protegidos.
Tabla 29 Eficacia en IL T inducida por vHVT317 administrada por vía in ovo después de una estimulación del seno infraorbitario en el día D28 con la ce a 63140 de IL TV en ollos SPF
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Ejemplo 29 Eficacia en EN inducida por vHVT309 y vHVT310 frente a una estimulación de NDV velogénico en el día D21 en pollos SPF
[0259] El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia de dos construcciones recombinantes de HVT (vHVT309 y vHVT310) que expresaban el gen de VP2 de IBDV y el gen de F de NDV administradas a los pollos SPF de un día de edad contra la estimulación de NDV velogénico realizada en el día D21.
[0260] Se asignaron a 3 grupos los pollos SPF de un día de edad (Leghorn blancos) tal como se muestra en la Tabla 30. Todas las aves de los grupos 2 y 3 se vacunaron por vía subcutánea (SC) con 0,2 ml de vHVT309 (14 aves; grupo 2) o vHVT310 (15 aves; grupo 3) a una dosis objetivo de 2000 UFP. Las aves del grupo 1 (5 aves) se dejaron sin vacunación. Dos aves del grupo 2 murieron el día D5 por razones desconocidas. Veintiún días después de la vacunación (en el D21), se recogió la sangre de 10 aves del grupo 3 para las pruebas serológicas; a continuación, todas las aves de los 3 grupos se sometieron a estimulación con la cepa Herts 33 de NDV velogénico por vía intramuscular (IM) (1050 EID50 en 0,2 ml/ave). Se observaron los signos clínicos de todas las aves durante 14 días después de la estimulación. Las aves se consideraron protegidas si no murieron o no mostraron signos clínicos de ND.
[0261] Los resultados de la protección se resumen en la Tabla 30. Todas las aves no vacunadas del grupo 1 murieron después de la estimulación; todas las aves vacunados estaban protegidos. La construcción de vHVT310 indujo anticuerpos significativos anti-NDV (una media de 3,7 ± 0,3 (desviación estándar) log 10 mediante ELISA (kit ID Screen Newcastle Disease Indirect de ID-VET) y una media de 3,9 ± 0,7 log2 mediante prueba HI) y anti-IBDV (media de 3,7 log10 ± 0,2 log10 mediante ELISA (kit ProFLOK IBD Plus ELISA de Zoetis) en los 10 sueros de aves G3 recogidos como muestra en el día D21.
Tabla 30 Eficacia en ND inducida por las construcciones dobles diferentes de HVT-IBD+ND en pollos de engorde l im l i n n l í D21 n l NDV v l ni
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Ejemplo 28 Eficacia en IBD inducida por vHVT309 y vHVT310 vHVT407 frente a una estimulación de IBDV clásico en el día D21 en pollos SPF
[0262] El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia de dos construcciones recombinantes de HVT (vHVT309 y vHVT310) que expresaban el gen de VP2 de IBDV y el gen de F de NDV administradas a los pollos SPF de un día de edad contra una estimulación clásica de IBDV realizada en el día D21.
[0263] Se asignaron a 3 grupos los pollos SPF de un día de edad (Leghorn blancos) tal como se muestra en la Tabla 31. Todas las aves de los grupos 2 y 3 (aproximadamente 15 aves/grupo) se vacunaron por vía subcutánea (SC) con 0,2 ml de la construcción vHVT309 (grupo 2) o vHVT310 (grupo 3) a una dosis diana de 2000 UFP. Se dejaron diez aves del grupo 1 sin vacunación. Se registraron dos muertes tempranas no específicas en el grupo 2. Veintiún días después de la vacunación (en el D21), todas las aves se sometieron a estimulación con la cepa clásica de IBDV Faragher 52/70 por vía intraocular (IO) (1020 EID50 en 0,05 ml/ave). Once días después de la estimulación (en el D32) todas las aves se sacrificaron y se les practicó necropsia para examinar las lesiones macroscópicas de la bolsa. La bolsa y el cuerpo se pesaron para calcular la proporción en peso de la bolsa en relación al cuerpo. A continuación, la bolsa se almacenó en formaldehído para el análisis histológico. Las lesiones histológicas de la bolsa se puntuaron de acuerdo con la escala presentada en la Tabla 32. La gravedad de la estimulación se validó si (1) como mínimo el 50 % de los controles de la estimulación murieron o mostraron signos característicos de la enfermedad, especialmente apatía/plumas erizadas durante más de 2 días o prostración, y (2) el 100 % de los controles de la estimulación supervivientes mostraron puntuaciones en las pruebas histológicas de la Bolsa de Fabricio < 3. La eficacia de las vacunas candidatas se demostró si como mínimo el 90 % de los pollos estaban protegidos. Los pollos se consideraron protegidos si (1) sobrevivían y no mostraban signos clínicos notables de la enfermedad, especialmente ninguna apatía/plumas erizadas durante más de 2 días o ausencia de prostración, y (2) mostraban una puntuación en las pruebas histológicas de la Bolsa o bolsa de Fabricio <3.
[0264] Los resultados de la protección se muestran en la Tabla 31. Todos los controles eran positivos a la infección por IBD. Se indujo la protección completa de IBD mediante la vacunación con vHVT309 o vHVT310.
Tabla 31 Eficacia en IBD inducida por dos construcciones de HVT que expresaban dos genes en pollos SPF des ués de la estimulación en el día D21 con la ce a Fara her de IBDV
Figure imgf000039_0001
Tabla 32 Escala de puntuación de lesiones histológicas de la bolsa o bolsa de Fabricio*
Puntuación Observaciones/lesiones histológicas
0 No hay lesión, bolsa normal
1 de 1 % a 25 % de los folículos muestran reducción linfática (es decir, menos del 50 % de reducción en 1 folículo afectado), influjo de heterófilos en lesiones 2 de 26 % a 50 % de los folículos muestran una reducción linfática casi completa (es decir, más del 75 % de reducción en 1 folículo afectado), los folículos afectados muestran necrosis y se puede detectar un influjo alto de heterófilos
3 de 51 % a 75% de los folículos muestran reducción linfática; los folículos afectados muestran lesiones necróticas y se detecta un influjo elevado de heterófilos 4 de 76 % a 100 % de los folículos muestran una reducción linfática casi completa; se detectan hiperplasia y estructuras de quistes; los folículos afectados muestran necrosis y se detecta un influjo elevado de heterófilos 5 el 100 % de los folículos muestran una reducción linfática casi completa; pérdida completa de estructura folicular, epitelio engrosado y plegado, fibrosis del tejido bolsal *obtenido del Estudio Monográfico Número 04/2013:0587 de la Farmacopea Europea "Avian Infectious Bolsal Disease vaccine (live)
Ejemplo 29 Impacto de la administración in ovo de vHVT317 sobre la capacidad de eclosionar de los pollos SPF
[0265] El objetivo del estudio fue evaluar la seguridad de vHVT317 en la capacidad de eclosionar cuando se administraba por vía in ovo.
[0266] Los resultados son una recopilación de datos de varios estudios que incluyen aquellos descritos en los ejemplos 23, 24, 25 y 26. Se inocularon huevos embrionados a los 18-19 días de incubación con vHVT317 a una dosis diana de 2000 o 3000 UFP o con un diluyente de la vacuna de enfermedad de Marek. Se evaluó el porcentaje de la capacidad de eclosionar para cada grupo. Los resultados se resumen en la Tabla 33 y muestran los niveles excelentes de la capacidad de eclosionar en huevos vacunados.
Tabla 33 Capacidad de eclosionar después de la administración in ovo de vHVT317
Figure imgf000040_0001
Ejemplo 30 Eficacia en ILT inducida por vHVT406 contra las estimulaciones de ILTV. Ejemplo 30.1 Eficacia en ILT inducida por vHVT406 frente a una estimulación de ILTV en el día D28
[0267] El objetivo del estudio es evaluar y comparar la eficacia de la construcción recombinante vHVT406 que expresa el gen de gD de ILTV y una vacuna de vectores de HVT-ILT comercial contra la estimulación de ILT.
[0268] Se asignaron doce (12) aves SPF de un día de edad a cada grupo. Las aves en los Grupos 1-2 se vacunaron Sq con 0,2 ml por ave. Después de la vacunación, todas las aves se colocaron en sus unidades respectivas. En el día 28 todas las aves se sometieron a estimulación por vía intratraqueal (IT) con el Virus de Laringotraqueítis Infecciosa (ILT), ILT-93-3 EP2. Se observaron los signos clínicos debido a la estimulación en todas las aves durante 11 días después de la estimulación. En el día 32 se recogieron hisopos de la tráquea y conjuntivales de todas las aves restantes. Los hisopos se procesaron para un análisis de q-PCR. En el día 39 todas las aves restantes se sacrificaron.
[0269] Los resultados se muestran en la Tabla 34 a continuación. Los resultados mostraron que todas las aves vacunadas con vHVT406 estaban protegidos. De manera sorprendente, los resultados mostraron también que se alcanzó buena protección (100 % de protección) en el grupo de vHVT406 cuando se utilizó la dosis baja (6.960 ufp/0,2 ml) en comparación con la dosis más alta (10.340 ufp/0,2 ml) utilizada para el producto comercial Innovax HVT-ILT.
T l 4 N m r Av P iiv ^ r ILT P r n P iiv r r
Figure imgf000040_0002
Ejemplo 30.2 Eficacia en ILT inducida por vHVT406 frente a una estimulación de ILTV en el día D21
[0270] El objetivo del estudio es evaluar y comparar la eficacia del vHVT406 y dos vacunas comerciales de vectores de HVT-ILT contra la estimulación de ILT.
[0271] Se asignaron doce (12) aves SPF de un día de edad a cada grupo. La asignación al azar también asignó las unidades de aislamiento en las que se colocaron las aves (12 aves por unidad, una unidad por grupo). Las aves en los Grupos 1-3 se vacunaron por vía SQ con 0,2 ml por ave. En el día 21, todas las aves en los Grupos 1-2 se sometieron a estimulación por vía intratraqueal (IT) con el Virus de Laringotraqueítis Infecciosa (ILT), ILT-96-3 EP2. Se observaron los signos clínicos debido a la estimulación en todas las aves durante 11 días después de la estimulación. En el día 25 se recogieron hisopos de la tráquea y conjuntivales de todas las aves restantes. Las muestras en hisopo se procesaron para un análisis de q-PCR. En el día 32 todas las aves restantes se sacrificaron.
[0272] Los resultados se muestran en la Tabla 35. Los resultados mostraron que todas las aves vacunadas con vHVT406, excepto una, estaban protegidas. De manera sorprendente, los resultados mostraron también que se alcanzó buena protección (91,7 % de protección) en el grupo de vHVT406 cuando se utilizó la dosis más baja (810 ufp/ 0,2 ml) en comparación con la dosis más alta (1590 ufp/ 0,2 ml) utilizada para el producto comercial Innovax HVT-ILT para alcanzar el mismo nivel de protección (91,7 %). Es más, vHVT406 proporcionó mejor protección (91,7 %) cuando se utilizó con una dosis más baja que el producto comercial Vectormune HVT-ILT que solamente proporcionó un 75 % de protección.

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Vector recombinante del herpesvirus de los pavos (HVT) que comprende dos polinucleótidos heterólogos, cada uno de los cuales codifica y expresa un antígeno de un patógeno aviar, en el que los dos antígenos son diferentes, en el que los dos polinucleótidos heterólogos se insertan en una región no esencial del genoma del HVT, en el que además los dos polinucleótidos heterólogos están unidos por un polinucleótido que codifica P2A.
2. Vector de HVT recombinante que comprende dos polinucleótidos heterólogos, cada uno de los cuales codifica y expresa un antígeno de un patógeno aviar, en el que los dos antígenos son diferentes, en el que los dos polinucleótidos heterólogos se insertan en una región no esencial del genoma del HVT, en el que además los dos polinucleótidos heterólogos están unidos por IRES.
3. Vector, según la reivindicación 1 o 2, en el que el vector de HVT comprende:
a) un primer polinucleótido heterólogo que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en un antígeno VP2 del virus de la enfermedad infecciosa de la bolsa (IBDV), un antígeno de glicoproteína D (gD) del virus de la laringotraqueítis infecciosa (ILTV) y un antígeno F del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV-F), y un segundo polinucleótido heterólogo que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en un antígeno VP2 del virus de la enfermedad infecciosa de la bursitis (IBDV), un antígeno de glicoproteína D (gD) del virus de la laringotraqueítis infecciosa (ILTV) y un antígeno F del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV-F); o
b) un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en un antígeno VP2 del virus de la enfermedad infecciosa de la bolsa (IBDV), un antígeno de la glicoproteína D (gD) del virus de la laringotraqueítis infecciosa (ILTV) y un antígeno F del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV-F).
4. Vector, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el vector de HVT comprende un primer polinucleótido heterólogo que codifica y expresa un antígeno VP2 de IBDV y un segundo polinucleótido heterólogo que codifica y expresa un antígeno de NDV-F.
5. Vector, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el vector de HVT comprende un primer polinucleótido heterólogo que codifica y expresa un antígeno VP2 de IBDV y un segundo polinucleótido heterólogo que codifica y expresa un antígeno gD de ILTV.
6. Vector, según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en el que el antígeno VP2 del virus de la enfermedad infecciosa de la bolsa (IBDV) tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, y/o en el que el polinucleótido que codifica el antígeno VP2 del virus de la enfermedad infecciosa de la bolsa (IBDV) tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:1.
7. Vector, según cualquiera de las reivindicaciones 3, 5 ó 6, en el que el antígeno de la glicoproteína D (gD) del virus de la laringotraqueítis infecciosa (ILTV) tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos tal como se establece en la SEQ ID NO: 17, y/o en el que el polinucleótido que codifica el antígeno de la glicoproteína D (gD) del virus de la laringotraqueítis infecciosa (ILTV) tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con la s Eq ID NO:16.
8. Vector, según cualquiera de las reivindicaciones 3, 4, 6 ó 7, en el que el antígeno F del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV-F) tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos tal como se establece en las SEQ ID NO: 5 o 22, y/o en el que el polinucleótido que codifica el antígeno F del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV-F) tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con las SEQ ID NO: 3, 4 o 21.
9. Vector, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el primer polinucleótido heterólogo está unido operativamente a un promotor seleccionado del grupo que consiste en un promotor IE de mCMV, un promotor de SV40, un promotor de HHV3gB y un promotor de HHV3gB inverso.
10. Vector, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que los polinucleótidos heterólogos están insertados en el locus IG1 y/o locus SORF-US2 del genoma de HVT.
11. Vector, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el vector de HVT comprende un primer polinucleótido heterólogo que codifica y expresa un antígeno VP2 del virus de la enfermedad infecciosa de la bolsa (IBDV), y un segundo polinucleótido heterólogo que codifica y expresa un antígeno F del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV-F); en el que el antígeno VP2 de IBDV tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 2 y el antígeno de NDV-F tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 5; en el que la región no esencial es el locus IG1 del genoma de HVT; y en el que el primer polinucleótido heterólogo está unido operativamente a un promotor IE de mCMV.
12. Vector, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el vector de HVT comprende un primer polinucleótido heterólogo que comprende un polinucleótido que codifica un antígeno VP2 del virus de la enfermedad infecciosa de la bolsa (IBDV), y un segundo polinucleótido heterólogo que comprende un antígeno de la glicoproteína D (gD) del virus de la laringotraqueítis infecciosa (ILTV); en el que el antígeno VP2 de IBDV tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos tal como se establece en la SEQ ID NO: 2 y el antígeno gD de ILTV tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos tal como se establece en la SEQ ID NO: 17; en el que la región no esencial es el locus IG1 del genoma de HVT; y en el que el primer polinucleótido heterólogo está unido operativamente a un promotor IE de mCMV.
13. Composición o vacuna que comprende uno o más vectores de HVT, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
14. Composición o vacuna, según la reivindicación 13, que comprende además un portador, excipiente, vehículo o adyuvante farmacéutica o veterinariamente aceptable.
15. Composición, vacuna o vector, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, para usar en un procedimiento de vacunación o inducción de una respuesta protectora en un animal contra uno o más patógenos aviares, que comprende al menos una administración de la composición o vector, donde el animal es aviar.
16. Composición, vacuna o vector para usar, según la reivindicación 15, donde el patógeno aviar se selecciona del grupo que consiste en Virus de la Enfermedad de Newcastle (NDV), Virus de la Enfermedad Infecciosa de la Bolsa (IBDV), Virus de la Enfermedad de Marek (MDV) y Virus de la Laringotraqueítis Infecciosa (ILTV).
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