ES2936262T3 - Procedimiento de cuantificación del contenido total de saponinas en una muestra, en particular, en una muestra compleja - Google Patents

Procedimiento de cuantificación del contenido total de saponinas en una muestra, en particular, en una muestra compleja Download PDF

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Abstract

(5) cuantificar el contenido de saponina de la muestra comparando la absorbancia de la solución de cromóforo medida en el paso (3) con el rango de absorbancias de las soluciones estándar producidas en el paso (4). también un método para determinar el contenido de saponinas esteroidales implementando una medida de absorbancia a 425 nm. Esta solicitud está especialmente destinada a los campos de la industria alimentaria, farmacéutica y cosmética, en particular la industria de la nutrición humana y animal. También se refiere a un método para determinar el contenido de saponinas esteroidales implementando una medida de absorbancia a 425 nm. Esta aplicación está especialmente destinada a los campos de la industria alimentaria, farmacéutica y cosmética en particular. de la industria de la nutrición humana y animal. También se relaciona con un método para determinar el contenido de saponinas esteroidales implementando una medición de absorbancia a 425 nm. Esta aplicación está especialmente destinada a los campos de la industria alimentaria, farmacéutica y cosmética en particular. de la industria de la nutrición humana y animal. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimiento de cuantificación del contenido total de saponinas en una muestra, en particular, en una muestra compleja
Campo técnico
La presente invención se refiere al campo de la determinación de saponinas. Más concretamente, se refiere a un procedimiento para la determinación directa del contenido total de saponinas triterpénicas y/o esteroides presentes en una muestra, especialmente compleja, por espectrofotometría; comprendiendo opcionalmente dicho procedimiento la determinación del contenido de saponinas triterpénicas por un lado y de saponinas esteroides por otro lado en dicha muestra. El procedimiento según la invención se implementa ventajosamente en los campos de la industria agroalimentaria, de la farmacia y de la cosmética, en particular, en la industria de la nutrición humana y animal para la determinación del contenido total de saponinas en una muestra compleja.
Estado de la técnica
Las saponinas son glucósidos ampliamente distribuidos en el mundo vegetal y se encuentran en ciertos organismos marinos. Se trata de moléculas complejas formadas por un esqueleto carbonado policíclico de carácter lipófilo denominado sapogenina asociado a una o varias cadenas de sacáridos de carácter hidrófilo. Las saponinas poseen varias propiedades tales como propiedades edulcorantes y de amargor (Grenby, 1991) (Kitagawa, 2002) (Heng et al., 2006), propiedades espumantes y emulsionantes (Martín y Briones, 1999), propiedades farmacológicas y medicinales (Attele, Wu, y Yuan, 1999), propiedades hemolíticas (Oda et al., 2005), así como actividades insecticidas, molusquicidas y antimicrobianas (Sparg, Light, y van Staden, 2004). Estas diferentes propiedades fisicoquímicas y biológicas se utilizan en muchos sectores de la industria tales como la alimentación, la cosmética, la agricultura y la farmacia (Güglü-Üstündag y Mazza, 2007). Existen dos familias principales de saponinas, las saponinas esteroides formadas por 27 átomos de carbono que se encuentran en una minoría de plantas y las saponinas triterpénicas compuestas por 30 átomos de carbono que se encuentran en la mayoría de las plantas con saponinas. Para asegurar la calidad de los extractos y de las materias primas utilizadas en la industria, es necesario desarrollar métodos analíticos rápidos, precisos, que permitan cuantificar el contenido total de saponinas pero también el contenido de saponinas esteroides, por un lado y de saponinas triterpénicas, por otro lado.
Se han desarrollado muchos métodos para detectar y medir las saponinas presentes en materias vegetales; los métodos clásicos usan la gravimetría (Tenon et al., 2017) y el índice de espuma (Ross and Miles, 1941). Sin embargo, la gravimetría, que consiste en extraer las saponinas con butanol, tiende a sobrestimar la cantidad presente debido a la afinidad de otros compuestos (polifenoles) con este mismo disolvente. Igualmente, el índice de espuma que mide la altura de la espuma se utiliza principalmente como elemento de caracterización.
Existen métodos cuantitativos que usan la cromatografía, tales como la cromatografía líquida, junto con diferentes detectores, como el ultravioleta (UV), la espectrometría de masas (MS), o incluso el evaporativo por dispersión de luz (DEDL) para medir el contenido de saponinas. Sin embargo, estos bancos cromatográficos que comprenden estos detectores son caros y no son adecuados para todas las saponinas. Además, estos métodos cromatográficos acoplados requieren el uso de patrones de saponinas que pueden no estar disponibles, falta de comercialización.
Otro método cuantitativo que usa la cromatografía es la cromatografía en capa fina (TLC) acoplada con un densitómetro. Sin embargo, estos métodos requieren etapas automatizadas para garantizar la solidez de la cuantificación. Entonces es necesario equiparse con módulos muy costosos. A este inconveniente se suman los de la cromatografía, que depende especialmente de las muestras que se debe analizar. De este modo, las condiciones de análisis deben modificarse en función de los tipos de muestras. Además, es necesario asegurarse de que no se produzca una retención completa de determinadas saponinas en el soporte de cromatografía utilizado, que impida la determinación total de saponinas.
La cuantificación de saponinas por espectrofotometría se ha vuelto popular por su sencillez, su velocidad y su coste relativamente bajo en comparación con los métodos cromatográficos. Consiste en revelar las saponinas utilizando un agente cromógeno en presencia de ácido y determinar el cromóforo formado de este modo utilizando un espectrómetro UV-visible por calibración.
El método habitualmente utilizado es el presentado por Hiai y sus colaboradores (Hiai et al., 1975). Este método utiliza una solución de vainillina sulfúrica que permite cuantificar inicialmente las saponinas triterpénicas de Panax ginseng a una longitud de onda de 544 nm transportada por las agliconas. Sin embargo, las condiciones utilizadas en este método conducen a la formación de compuestos que generan interferencias cercanas a las longitudes de onda de cuantificación. Por ejemplo, la sorbosa genera un interferente absorbente a 520 nm (Hiai et al., 1975; Nakajima, 1976). Estos interferentes, al provenir de la muestra vegetal o de los glucósidos presentes en las propias saponinas, entonces es necesario llevar a cabo una etapa de pretratamiento en la muestra destinada a eliminar los interferentes, por ejemplo realizando una etapa de purificación de saponinas antes de llevar a cabo la cuantificación. Numerosas solicitudes de patentes describen el uso de tales pretratamientos, especialmente, una etapa de purificación para cuantificar las saponinas con vainillina sulfúrica. Por ejemplo, el documento CN106404685A relata un método de determinación de saponinas triterpénicas encontradas en licores, utilizando el ácido clorhídrico para hidrolizar dichas saponinas antes de cuantificar las sapogeninas triterpénicas. Las porciones agliconas de las saponinas se denominan sapogeninas. Igualmente, el documento CN106596426A informa sobre un método de determinación de saponinas triterpénicas de Gynostemma pentaphyllum que utiliza una resina macroporosa como pretratamiento antes de cuantificar las saponinas a 555 nm. En otro ejemplo, el documento CN106483084A informa sobre un método de determinación de saponinas triterpénicas de Panacis quinquefolis que utiliza una extracción en fase sólida (SPE) como pretratamiento antes de cuantificar las saponinas a 560 nm. El documento "Effect of the extraction method on phytochemical composition and antioxydant activity of high dietary fibre powders obtained from asparagus by-products" de Fuentes-Alventosa et al. FOOD CHEMISt Ry , ELSEVIER LTD, NL, vol.116 n°2 páginas 484-490 también describe un procedimiento de determinación de saponinas totales, en el que la solución que se debe cuantificar se obtiene tras un pretratamiento de extracción en fase sólida (SPE); implementando dicho procedimiento una reacción de la solución que se debe cuantificar con p-anisaldehído y una mezcla de ácidos acético y sulfúrico, seguido de calentamiento a 95-100 °C durante 2 minutos y una medición de la absorbancia a 630 nm. Estos pretratamientos presentan muchos inconvenientes, entre ellos el aumento de tiempo, el coste de análisis y de desarrollo. Asimismo, las SPE y las resinas macroporosas requieren condiciones de elución especiales para eliminar los interferentes característicos de la muestra. Por ello, los métodos con pretratamiento son difíciles de trasladar a otras muestras cuya composición difiere, reduciendo considerablemente el campo de aplicación de dichos métodos. Asimismo, es necesario asegurarse de que no se produzca una retención completa de determinadas saponinas en el soporte utilizado, que impida la determinación total de saponinas.
Existe otro método espectrofotométrico habitualmente utilizado y desarrollado inicialmente por el equipo de Baccou y sus colaboradores (Baccou, Lambert y Sauvaire, 1977). Utiliza p-anisaldehído sulfúrico para revelar específicamente sapogeninas esteroides a 430 nm. Las pruebas realizadas con diferentes patrones de sapogeninas y saponinas esteroides mostraron que el cromóforo era específico para las sapogeninas esteroides. Las condiciones utilizadas en este método permiten evitar la formación de interferencias en las longitudes de onda de cuantificación. Tiene la ventaja de poder determinar directamente las sapogeninas esteroides en una muestra vegetal compleja sin realizar ningún tratamiento previo. No obstante, las condiciones utilizadas no permiten revelar las saponinas triterpénicas, reduciendo considerablemente el campo de aplicación de dicho método. La patente JPS60219556A (1985) describe el uso de panisaldehído sulfúrico para cuantificar las saponinas totales de Gynostemma pentaphyllum, esta planta contiene solo saponinas triterpénicas. Para poder revelar las saponinas triterpénicas, los autores utilizan una alta proporción de ácido sulfúrico en el medio de reacción, del orden del 75 % (volumen/volumen). A continuación, las saponinas triterpénicas se pueden cuantificar a una longitud de onda de 530 nm. Como afirman los autores de la patente, el método va acompañado de interferencias provenientes de la muestra que se debe analizar tales como los glucósidos. Por tanto, se realiza un pretratamiento mediante extracción en fase sólida (SPE) con un injerto C-18 antes de la cuantificación. Como se mencionó anteriormente, los pretratamientos de SPE tienen muchos inconvenientes. En particular, son dependientes del tipo de muestra que se debe analizar, reduciendo el campo de dicho método y aumentando considerablemente el tiempo y coste de análisis del método. Además, es necesario asegurarse de que no haya una retención completa de ciertas saponinas en el soporte sólido, que impida la determinación total de saponinas.
La patente CN 109 765 308 A (UNIV ZHEJIANG) 17 de mayo de 2019 (17-05-2019) describe en un "ejemplo comparativo" un procedimiento de determinación del contenido total de saponinas de una muestra, comprendiendo dicho procedimiento al menos las siguientes etapas, en este orden:
(1) realizar una reacción añadiendo a dicha muestra solubilizada en al menos un disolvente, vainillina y ácido sulfúrico, estando presente el ácido sulfúrico en una cantidad de aproximadamente el 57 % en volumen con respecto al volumen total de la mezcla de reacción;
(2) calentar la mezcla de reacción a una temperatura igual a 60 °C, para obtener un cromóforo en solución; (3) medir la absorbancia de la solución del cromóforo obtenido a una longitud de onda igual a 600 nm;
(4) realizar una gama de soluciones patrón de saponinas, en las condiciones de reacción de las etapas (1) y (2), y cuyas absorbancias después de la reacción cromógena se obtienen a la longitud de onda definida en la etapa (3); (5) cuantificar el contenido de saponinas de la muestra comparando la absorbancia de la solución de cromóforo medida en la etapa (3) con la gama de absorbancias de las soluciones patrón realizadas en la etapa (4).
A pesar de las diversas tecnologías e invenciones desarrollados en las últimas décadas, no existen métodos de cuantificación relativamente simples, rápidos y económicos, que permitan cuantificar directamente con precisión:
- cualquier tipo de saponinas (triterpénicas y/o esteroides) presentes en una muestra, especialmente compleja; - las saponinas triterpénicas, por un lado, y las saponinas esteroides, por otro lado, presentes en mezcla en una muestra, especialmente compleja.
Además, ningún método permite determinar fácil y directamente en un único análisis el contenido total de saponinas de una mezcla de los dos tipos de saponinas (triterpénicas y esteroides) contenido en una muestra dada, especialmente compleja.
Por lo tanto, claramente sigue existiendo la necesidad, especialmente, de un procedimiento simple, rápido y económico, que permita la cuantificación precisa del contenido total de saponinas contenidas en una muestra, en particular, compleja, ya sean triterpénicas, esteroides, o ya sea que la muestra contiene una mezcla de ambos tipos de saponinas. Además, también existe la necesidad de un procedimiento que permita prescindir de tratamientos previos de las muestras destinados a eliminar los interferentes, tales como extracciones en fase sólida (SPE) y extracciones líquido-líquido.
Exposición de la invención
Los inventores han desarrollado un procedimiento que permite resolver todos o parte de los problemas mencionados anteriormente.
La presente invención se define en la reivindicación 1 y se refiere especialmente a un procedimiento de determinación del contenido total de saponinas de una muestra, comprendiendo dicho procedimiento al menos las siguientes etapas, en este orden:
(1) realizar una reacción añadiendo a dicha muestra solubilizada en al menos un disolvente, p-anisaldehído y ácido sulfúrico, estando presente el ácido sulfúrico en una cantidad que varía del 40 % al 50 %, más preferentemente igual al 45 %, en volumen con respecto al volumen total de la mezcla de reacción;
(2) calentar la mezcla de reacción a una temperatura que varía de 45 °C a 75 °C, preferentemente que varía de 55 °C a 65 °C, más preferentemente igual a 60 °C, para obtener un cromóforo en solución;
(3) medir la absorbancia de la solución del cromóforo obtenido a una longitud de onda que varía de 580 a 610 nm, preferentemente de 590 a 605 nm, más preferentemente igual a 600 nm;
(4) realizar una gama de soluciones patrón de saponinas, en las condiciones de reacción de las etapas (1) y (2), es decir, con el mismo disolvente, las mismas cantidades de p-anisaldehído y de ácido sulfúrico, a la misma temperatura, los mismos tiempos de calentamiento a partir de soluciones de un patrón de saponina a diferentes concentraciones, y cuyas absorbancias después de la reacción cromógena se obtienen a la longitud de onda definida en la etapa (3), preferentemente las absorbancias varían de 0 a 1,5, preferentemente de 0 a 1;
(5) cuantificar el contenido de saponinas de la muestra comparando la absorbancia de la solución de cromóforo medida en la etapa (3) con la gama de absorbancias de las soluciones patrón realizadas en la etapa (4).
De manera sorprendente, los inventores han demostrado que dicho procedimiento según la invención permite la formación de un cromóforo idéntico y específico que tiene la misma gama particular de longitud de onda de absorción, para las saponinas triterpénicas y esteroides. La formación de este cromóforo permite de este modo determinar cualquier tipo de saponinas, ventajosamente con cualquier tipo de patrón en muestras especialmente complejas.
El procedimiento según la invención tiene así especialmente las siguientes ventajas:
- es simple, rápido y económico;
- Es preciso y permite obtener cantidades de saponinas equivalentes a las obtenidas por Cromatografía Líquida de Alta Presión (CLAP) acoplada a un Detector evaporativo por dispersión de luz (DEDL);
- se puede implementar en una muestra compleja, que no requiere, a diferencia de los procedimientos de la técnica anterior, una etapa previa de pretratamiento de la muestra destinada a eliminar los interferentes, como una extracción en fase sólida (SPE) o una extracción líquido-líquido por ejemplo. De este modo, permite superar los inconvenientes asociados a estas técnicas de extracción, entre ellos: condiciones dependientes del tipo de muestra que se debe analizar, posible retención de saponinas en el soporte utilizado (impidiendo la determinación total de saponinas), aumento del tiempo y del coste de análisis del procedimiento.
- permite la determinación directa del contenido total de cualquier tipo de saponinas, con cualquier tipo patrón, presentes en una muestra, especialmente compleja;
- permite determinar directamente el contenido total de saponinas de una mezcla de saponinas triterpénicas y esteroides presentes en una muestra, especialmente compleja;
- permite determinar el contenido de saponinas esteroides por un lado y de saponinas triterpénicas por otro lado presentes en mezcla en una muestra, especialmente compleja, cuando además comprende etapas de determinación del contenido de saponinas esteroides.
De este modo, una ventaja del procedimiento según la presente invención es que permite cuantificar específicamente las saponinas presentes en una muestra, en particular, en una muestra compleja.
En particular, otra ventaja del procedimiento según la presente invención es que permite cuantificar simultáneamente todas las saponinas esteroides y triterpénicas en las muestras, en particular, en muestras complejas. El procedimiento según la presente invención permite obtener niveles de respuesta similares para saponinas triterpénicas y esteroides a la misma longitud de onda de cuantificación, permitiendo así cuantificar estos dos grupos de saponinas en mezcla en todo tipo de muestras y, en particular, en una muestra compleja. Por supuesto, cuando solo un grupo de saponinas (triterpénicas o esteroides) está presente en la muestra, el procedimiento según la invención permite cuantificar este grupo de saponinas.
Ventajosamente, el procedimiento según la invención no incluye una etapa de extracción en fase sólida (SPE), ni etapa de extracción líquido-líquido de saponinas de la muestra. De este modo, permite superar los inconvenientes asociados a estas técnicas de extracción como se ha explicado anteriormente. Estas extracciones en fase sólida (SPE), bien conocidas por el experto en la materia, se implementan mediante un soporte sólido sobre el que se retiene una parte de los compuestos de la muestra. Estas extracciones líquido-líquido, bien conocidas por el experto en la materia, consisten en una extracción por transferencia entre dos fases líquidas.
Ventajosamente, el procedimiento de determinación del contenido total de saponinas de una muestra según la invención es tal que se implementa un procedimiento de determinación del contenido de saponinas esteroides de dicha muestra antes, después o simultáneamente a las etapas (1) a (5), comprendiendo dicho procedimiento de determinación del contenido de saponinas esteroides al menos las siguientes etapas, en este orden:
(i) realizar una reacción añadiendo a dicha muestra solubilizada en al menos un disolvente, p-anisaldehído y ácido sulfúrico, estando presente el ácido sulfúrico en una cantidad que varía del 5 % al 25 %, preferentemente del 10 % al 15 %, más preferentemente igual al 12,5 % en volumen con respecto al volumen total de la mezcla de reacción;
(ii) calentar la mezcla de reacción a una temperatura que varía de 45 °C a 80 °C, de manera preferente igual a 60 °C, para obtener un cromóforo en solución;
(iii) medir la absorbancia de la solución del cromóforo obtenida a una longitud de onda que varía de 400 a 450 nm, de manera preferente 425 nm;
(iv) realizar una gama de soluciones patrón de saponinas esteroides, en las condiciones de reacción de las etapas (i) y (ii), y cuyas absorbancias después de la reacción cromógena se obtienen a la longitud de onda definida en la etapa (iii), preferentemente las absorbancias varían de 0 a 1,5, preferentemente de 0 a 1;
(v) cuantificar el contenido de saponinas esteroides de la muestra comparando la absorbancia de la solución de cromóforo medida en la etapa (iii) con la gama de absorbancias de las soluciones patrón realizadas en la etapa (iv).
La implementación, en una muestra que comprende a la vez saponinas esteroides y triterpénicas, del procedimiento de determinación del contenido total de saponinas según la invención unido al procedimiento de determinación del contenido de saponinas esteroides permite cuantificar en dicha muestra el contenido total de saponinas, por un lado, el contenido de saponinas esteroides, por otro lado, y a continuación por diferencia, el contenido de saponinas triterpénicas.
En el procedimiento de determinación del contenido total de saponinas de una muestra, las saponinas se seleccionan del grupo que consiste en saponinas triterpénicas, saponinas esteroides y sus mezclas.
De este modo, cuando la muestra contiene saponinas esteroides y saponinas triterpénicas, el procedimiento de determinación del contenido total de saponinas de una muestra según la invención se caracteriza por que el contenido de saponinas triterpénicas se determina por la diferencia entre el contenido total de saponinas determinado según la invención y el contenido de saponinas esteroides determinado según la invención.
Ventajosamente, en particular, cuando al menos una parte de la muestra es sólida, muy particularmente cuando la muestra es sólida, el procedimiento de determinación del contenido total de saponinas según la invención comprende una etapa preliminar que comprende al menos una extracción de las saponinas de la muestra realizada antes de la etapa (1) y, si está presente, antes de la etapa (i); seleccionándose preferentemente dicha al menos una extracción de las saponinas de la muestra del grupo que consiste en extracciones bajo presión, extracciones por maceración, extracciones por microondas, extracciones por ultrasonidos, extracciones por reflujo, de manera preferente, dicha etapa previa es una extracción de las saponinas de la muestra por ultrasonidos.
El disolvente se selecciona preferentemente del grupo que consiste en disolventes acuosos, iónicos, orgánicos y sus mezclas, preferentemente del grupo que consiste en agua, metanol, etanol, acetonitrilo, acetato de etilo y sus mezclas, de manera preferente metanol.
Procedimiento de determinación del contenido total de saponinas
Reacción cromógena
El procedimiento de determinación del contenido total de saponinas según la presente invención implementa una reacción cromógena durante la cual las saponinas contenidas en la muestra que se debe cuantificar reaccionan con un agente denominado "agente cromógeno" para formar un cromóforo.
Se implementa el procedimiento de determinación del contenido total de saponinas de dicha muestra, en particular, según las etapas (1) a (5).
El agente cromógeno utilizado en la etapa (1) es p-anisaldehído, que reacciona en presencia de ácido sulfúrico. Por lo tanto, la reacción cromógena comprende la reacción de una muestra solubilizada en al menos un disolvente con p-anisaldehído y ácido sulfúrico y a continuación el calentamiento de dicha mezcla de reacción, revelándose el cromóforo durante la etapa de calentamiento.
Preferentemente, la muestra utilizada en la etapa (1) se solubiliza en un disolvente elegido del grupo que consiste en agua, alcoholes C1-C4 y sus mezclas, preferentemente metanol o etanol y de manera preferente metanol.
Generalmente, el p-anisaldehído utilizado se solubiliza en un disolvente, en particular, un alcohol C1-C4 de manera preferente metanol, y se utiliza ácido sulfúrico en forma de una solución acuosa.
Dentro del significado de la presente invención, la "mezcla de reacción" se define como que comprende todos los reactivos, en particular, la muestra solubilizada, el p-anisaldehído y el ácido sulfúrico en al menos un disolvente. Preferentemente, la mezcla de reacción se forma añadiendo la muestra solubilizada con p-anisaldehído y a continuación ácido sulfúrico, preferentemente dicho ácido sulfúrico disuelto en agua.
La mezcla de reacción de la etapa (1) comprende generalmente un disolvente elegido entre agua, alcoholes C1-C4 y sus mezclas, preferentemente elegido entre metanol y etanol y de manera preferente metanol.
Por "mezcla" se entiende una mezcla de varios alcoholes, una mezcla de un alcohol con agua o una mezcla de varios alcoholes con agua. Estas mezclas se pueden llevar a cabo en cualquier proporción.
La cantidad de p-anisaldehído añadida a la mezcla de reacción de la etapa (1) depende de la cantidad de muestra que se debe cuantificar. Está dentro de la competencia de los expertos en la materia determinar esta cantidad para que el p-anisaldehído no se convierta en un reactivo limitativo y no precipite.
Generalmente, la cantidad de p-anisaldehído utilizada en la etapa (1) varía del 0,1 % al 10 %, preferentemente del 2 % al 5 % y de manera preferente del 3 % en volumen con respecto al volumen total de la mezcla de reacción. El ácido sulfúrico, preferentemente en solución acuosa, está presente en una cantidad que varía del 40 % al 50 %, más preferentemente igual al 45 %, en volumen con respecto al volumen total de la mezcla de reacción.
De acuerdo con la etapa (2), la mezcla de reacción se lleva a continuación a una temperatura que varía de 45 °C a 75 °C, preferentemente de 55 °C a 65 °C y de manera preferente igual a 60 °C, para permitir la formación del cromóforo.
El tiempo necesario para la formación del cromóforo depende de varios parámetros, como las cantidades de ácido sulfúrico, de saponinas, la temperatura. Es competencia del experto en la materia determinar la duración de la reacción cromógena.
Generalmente la duración de la reacción cromógena varía de 1 a 60 minutos, preferentemente de 10 a 30 minutos, más preferentemente 20 minutos.
Generalmente, la mezcla de reacción que contiene el cromóforo se enfría o se deja enfriar antes de realizar la cuantificación de dicho cromóforo.
Medición-Cuantificación
La etapa de medición-cuantificación del procedimiento de determinación del contenido total de saponinas según la invención se realiza por espectrofotometría.
Se entiende por "espectrofotometría", cualquier análisis llevado a cabo por medio de un detector óptico que permita medir la intensidad de la señal (densidad óptica) relacionada con la presencia de saponinas. Como detector, se puede mencionar el espectrofotómetro evolution 60S comercializado por la empresa Thermo Fisher Scientific.
El análisis-cuantificación por espectrofotometría es posible porque la reacción química de las saponinas con el panisaldehído según la presente invención conduce a un producto de color, también denominado "cromóforo", y que la intensidad de la coloración es proporcional a la concentración del cromóforo que se debe cuantificar.
Además, la cantidad de cromóforo formada es proporcional a la cantidad de saponinas presentes en la solución.
Esta etapa de cuantificación se basa en la ley de Beer-Lambert según la cual la absorbancia A es proporcional a la concentración C según la fórmula:
[Mat 1]
A = £ x l x C
Donde:
A: la absorbancia de la solución, sin unidad;
£: el coeficiente de absorción ponderal en Lxg-1*cm-1;
I: la longitud del tanque atravesado por la luz en cm;
C: la concentración en masa en g.l-1.
La medición de la absorbancia mediante un espectrofotómetro permitirá determinar la concentración en masa de cromóforo en la composición en comparación con una gama de calibración, es decir una gama de soluciones patrón de dicho cromóforo realizadas en las mismas condiciones que la reacción cromógena de la muestra que se debe cuantificar, es decir, con las mismas cantidades de p-anisaldehído y de ácido sulfúrico.
De este modo, el procedimiento según la presente invención comprende una etapa de medición de la absorbancia de la solución del cromóforo obtenido, es decir, de la muestra que se debe cuantificar, y a continuación, una etapa de cuantificación del contenido de saponinas en la muestra que se debe cuantificar comparando la absorbancia medida para la muestra con una gama de absorbancias correspondientes a diferentes concentraciones del mismo cromóforo obtenido con soluciones patrón de saponinas de diferentes concentraciones.
La medición-cuantificación corresponde a las etapas (3) a (5) del procedimiento de determinación del contenido total de saponinas.
De acuerdo con la etapa (3) del procedimiento según la invención, la absorbancia de la solución del cromóforo obtenido (de la muestra que se debe cuantificar) se mide a una longitud de onda que varía de 580 a 610 nm, preferentemente de 585 a 605 nm, de 590 a 605 nm, de 590 a 600 nm y de manera preferente 600 nm.
De acuerdo con la etapa (4) del procedimiento según la invención, se produce una gama de soluciones patrón de saponinas con un patrón de saponinas. De hecho, es obvio para los expertos en la materia que los cromóforos de las soluciones patrón se obtienen en las mismas condiciones que la muestra, es decir, con el mismo disolvente, las mismas cantidades de p-anisaldehído y de ácido sulfúrico, a la misma temperatura, los mismos tiempos de calentamiento a partir de soluciones de un patrón de saponina a diferentes concentraciones.
Por "patrón de saponina" se entiende una saponina purificada o fracción de saponinas purificadas procedente del grupo triterpénico y/o esteroide, cuya pureza ha sido determinada.
A modo de ejemplo, se puede citar la escina IB como patrón preferente para cuantificar las saponinas triterpénicas y la protodioscina como patrón preferente para cuantificar las saponinas esteroides. Sin embargo, la escina IB y la protodioscina, como cualquier patrón de saponina, se pueden utilizar para cuantificar una muestra que comprende solo saponinas triterpénicas, solo saponinas esteroides o mezclas de saponinas triterpénicas y esteroides.
Los cromóforos de las soluciones patrón presentan absorbancias que varían de 0 a 1,5, preferentemente de 0 a 1 a la longitud de onda definida en la etapa (3), es decir, la longitud de onda de medida de la muestra que se debe cuantificar. Las soluciones patrón se definen para cubrir una gama de absorbancias según intervalos regulares.
Ventajosamente, los valores de absorbancia de los cromóforos se representan en una curva patrón para establecer una recta de calibración como patrón de saponinas.
Generalmente, la gama de soluciones patrón corresponde a varias soluciones, generalmente entre 5 y 10 soluciones de concentración que generalmente varían entre 25 x 10'3 g/l a 250 x 10'3 g/l (25 pg/ml a 250 pg/ml) en el volumen de reacción.
A continuación, de acuerdo con la etapa (5), el contenido de saponinas de la muestra se cuantifica comparando la absorbancia de la solución de cromóforo obtenida de la muestra que se debe cuantificar, es decir, medida en la etapa (3) con la gama de absorbancias de las soluciones patrón realizadas a la misma longitud de onda según la etapa (4).
Cuando el contenido de saponinas de la muestra que se debe cuantificar sea mayor o menor que la gama de contenidos de las soluciones patrón, entonces la absorbancia de la solución obtenida a partir de la muestra que se debe cuantificar no está comprendida en la gama que varía de 0 a 1,5. En este caso, una etapa de dilución o concentración de la muestra permitirá obtener una muestra de absorbancia en la gama que varía de 0 a 1,5.
Es competencia del experto en la materia adaptar la concentración de la muestra cuando la absorbancia de la solución obtenida de la muestra que se debe cuantificar no esté comprendida en la gama que varía de 0 a 1,5.
La determinación del contenido total de saponinas de la muestra se calcula a partir de la concentración de cromóforo de dicha solución. Si la muestra ha sido sometida a uno o varios tratamientos preliminares como una o varias extracciones, el rendimiento de extracción debe tenerse en cuenta en el cálculo del contenido total de saponinas. El procedimiento según la invención permite determinar el contenido total de saponinas en muestras que contienen el 0,1 y 100 % en peso de saponinas con respecto al peso total de la muestra.
Extracción
En particular, cuando al menos una parte de la muestra es sólida, muy particularmente cuando la muestra es sólida, la etapa de reacción cromógena del procedimiento según la invención puede estar precedida de una o varias etapas de extracción de las saponinas de la muestra. Para realizar esta etapa se pueden implementar todos los procedimientos convencionales de extracción de saponinas.
En particular, es preferible que la muestra que se debe cuantificar no incluya esteroles libres, ni triterpenos libres porque estos compuestos pueden dar lugar a la formación de sustancias interferentes que también absorben a una longitud de onda cercana a los 600 nm y cercana a los 425 nm.
Sin embargo, los esteroles y triterpenos libres son compuestos apolares que se pueden extraer fácilmente de la muestra implementando una denominada etapa de deslipidación. La etapa de deslipidación puede realizarse por cualquier medio capaz de eliminar los compuestos apolares.
Según una primera variante de la invención, la etapa de reacción cromógena está precedida por una deslipidación que comprende al menos una extracción de los compuestos apolares utilizando un disolvente apolar elegido especialmente del grupo que consiste en diclorometano, hexano, éter de petróleo, éter dietílico; realizándose opcionalmente dicha extracción en presencia de ultrasonidos. Preferentemente, la deslipidación comprende una etapa de extracción con diclorometano en presencia de ultrasonidos.
Según una segunda variante de la invención, en particular, cuando al menos una parte de la muestra es sólida, muy particularmente cuando la muestra es sólida, por ejemplo, en el caso de material vegetal seco, se lleva a cabo ventajosamente una extracción alcohólica o hidroalcohólica.
Ventajosamente, antes de la etapa (1) se lleva a cabo una etapa preliminar que comprende al menos una extracción de la muestra, seleccionándose preferentemente dicha al menos una extracción de las saponinas de la muestra del grupo que consiste en extracciones bajo presión, extracciones por maceración, extracciones por microondas, extracciones por ultrasonidos, extracciones por reflujo, de manera preferente, dicha etapa previa es una extracción de las saponinas de la muestra por ultrasonidos. Ventajosamente, la extracción se repite varias veces, preferentemente 2, 3, 4 o 5 veces y de manera preferente 3 veces.
Dicha extracción se lleva a cabo utilizando un disolvente que tiene afinidades con las saponinas, dicho disolvente se elige del grupo que consiste en disolventes líquidos, subcríticos o supercríticos.
El disolvente se selecciona preferentemente del grupo que consiste en disolventes acuosos, iónicos, orgánicos y sus mezclas, preferentemente del grupo que consiste en agua, metanol, etanol, acetonitrilo, acetato de etilo y sus mezclas, de manera preferente metanol.
Por supuesto, la implementación de una etapa de extracción y la elección del (de los) procedimiento(s) de extracción dependerán de la muestra que se debe cuantificar y, en particular, de la presencia en dicha muestra de compuestos susceptibles de crear interferencias en una longitud de onda en la gama de 580 a 610 nm y en la gama de 400 a 450 nm. Estas elecciones caen dentro de la competencia de un experto en la materia.
Más particularmente, dicho procedimiento de extracción comprende al menos las siguientes etapas:
- colocar la muestra en al menos un disolvente,
- proceder a al menos una extracción de dicha muestra,
- proceder a la filtración de la solución procedente de la etapa anterior para separar el retenido y el filtrado líquido, - recuperar el filtrado obtenido en la etapa anterior que comprende al menos un disolvente y al menos una saponina, - evaporar todo el disolvente para obtener un extracto seco,
- solubilizar el extracto seco procedente de la etapa anterior en un volumen conocido de un segundo disolvente,
- Centrifugar dicho extracto resubilizado y recoger el sobrenadante.
Dicho al menos un primer disolvente tiene afinidades con las saponinas, se elige preferentemente entre disolventes acuosos, iónicos, orgánicos y sus mezclas, más preferentemente del grupo que consiste en agua, metanol, etanol, acetonitrilo, acetato de etilo y sus mezclas, de manera preferente metanol.
Según un modo realización particular del procedimiento de la invención, el segundo disolvente, utilizado para volver a solubilizar el extracto seco, es un disolvente elegido entre agua, metanol, etanol y sus mezclas.
Se entiende por "muestra" o "muestra que se debe cuantificar", una muestra que contiene del 0,1 % al 100 % en peso de saponinas respecto al peso total de dicha muestra que se debe cuantificar.
Se entiende por "saponina", todas las saponinas, es decir, las saponinas triterpénicas o esteroides.
Por "muestra compleja", se entiende una muestra que no ha sido sometida a ningún tratamiento previo destinado a eliminar los interferentes, tales como las extracciones en fase sólida (SPE) y las extracciones líquido-líquido. En particular, por "muestra compleja", se entiende una muestra que comprende esencialmente una muestra vegetal, especialmente al menos una planta, una parte de una planta, una muestra compuesta esencialmente por un organismo marino, o incluso un alimento completo, especialmente para animales, en particular, para el ganado; preferentemente se trata de una muestra vegetal.
En particular, la muestra puede elegirse del grupo formado por una planta entera o una mezcla de plantas enteras, una parte o una mezcla de partes de una o varias planta(s) y/u organismo(s) marino(s), un extracto de una planta o de un organismo marino (entero o parte de organismo marino), una mezcla de extractos de una o varias planta(s) (entera(s) o parte de planta(s)) y/u organismo(s) marino(s) (entero(s) o parte de organismo(s) marino(s), una premezcla de uno o varios extracto(s) de una o varias planta(s) (entera(s) o parte de planta(s)) y/o de uno o varios organismo(s) marino(s) (entero(s) o parte de organismo(s) marino(s), una mezcla de una o varias partes de una o varias planta(s) (entera(s) o parte de planta(s)) y/o uno o varios organismo(s) marino(s) (entero(s) o parte de organismo(s) marino(s)) con uno o varios extracto(s) de una o varias planta(s) (entera(s) o parte de planta(s)) y/o uno o varios organismo(s) marino(s) (entero(s) o parte de organismo(s) marino(s)). Especialmente, una parte de una planta puede seleccionarse del grupo que consiste en semillas, hojas, frutos, tallos y raíces de dicha planta. En particular, la muestra puede seleccionarse del grupo que consiste en: una planta entera, una parte de una planta, un extracto de planta, un organismo marino, parte de organismo marino, un extracto de organismo marino y sus mezclas.
Ventajosamente, la muestra comprende al menos una parte de al menos una planta con saponinas.
Por "planta con saponinas", se entiende una planta que comprende al menos una saponina, preferentemente al menos una saponina esteroide o triterpénica. Preferentemente, dicha planta con saponinas se elige del grupo formado por Theaceae, las Chenopodiaceae, las Fabaceae, las Agavaceae y sus mezclas y, en particular, Camellia olefeira, Chenopodium quinoa, Trigonella foenum graecum, Yucca schidigera y sus mezclas.
Ventajosamente, la muestra comprende al menos una parte de al menos un organismo marino. Preferentemente, el organismo marino se elige del grupo formado por las Echinodermata, las Porifera, el zooplancton y sus mezclas, más preferentemente las Echinodermata, las Porifera y sus mezclas, en particular, pepinos de mar, estrellas de mar y esponjas de mar y sus mezclas.
Dependiendo de la naturaleza de la muestra, esta última puede sufrir un tratamiento preliminar antes de la implementación de la invención. Ventajosamente, la muestra se solubiliza en un disolvente elegido entre agua, alcoholes C1-C4 y sus mezclas, preferentemente elegido entre metanol y etanol y de manera preferente metanol.
Procedimiento de determinación del contenido de saponinas esteroides
Como ya se mencionó, un procedimiento de determinación del contenido de saponinas esteroides de dicha muestra puede implementarse antes, después o simultáneamente con dicho procedimiento de determinación del contenido total de saponinas, en particular, antes, después o simultáneamente a las etapas (1) a (5).
Ventajosamente, este procedimiento se implementa utilizando la misma muestra que el procedimiento de determinación del contenido total de saponinas.
Preferentemente, dicho procedimiento de determinación del contenido total de saponinas de una muestra según la invención comprende, antes, después o simultáneamente a las etapas (1) a (5), la implementación del procedimiento de determinación del contenido de saponinas esteroides de dicha muestra según la invención. En este caso, dicha muestra utilizada en las etapas (1) e (i) es idéntica.
Además, los mismos tratamientos preliminares de extracción se implementan en la muestra antes de la implementación del procedimiento de determinación del contenido total de saponinas y del procedimiento de determinación del contenido de saponinas esteroides. En particular, se lleva a cabo ventajosamente una etapa preliminar que comprende al menos una extracción de las saponinas de la muestra antes de la etapa (1) y/o antes de la etapa (i), preferentemente antes de las etapas (1) e (i).
Reacción cromógena
El procedimiento de determinación del contenido de saponinas esteroides según la presente invención también implementa una reacción cromógena y una etapa de medición-cuantificación por espectrofotometría.
El procedimiento de determinación del contenido de saponinas esteroides de dicha muestra se implementa según las etapas (i) a (v).
El agente cromógeno utilizado en la etapa (i) es p-anisaldehído, que reacciona en presencia de ácido sulfúrico.
La reacción cromógena incluye, por tanto, la reacción de una muestra solubilizada en al menos un disolvente, con panisaldehído y ácido sulfúrico y a continuación el calentamiento de dicha mezcla de reacción, revelándose el cromóforo durante la etapa de calentamiento.
Preferentemente, la muestra utilizada en la etapa (i) se solubiliza en un disolvente elegido del grupo que consiste en agua, alcoholes C1-C4 y sus mezclas, preferentemente etanol o metanol, de manera preferente etanol.
Generalmente, el p-anisaldehído utilizado se solubiliza en un disolvente, en particular, un alcohol C1-C4 de manera preferente etanol, y el ácido sulfúrico se utiliza en forma de una solución etanólica.
Dentro del significado de la presente invención, la "mezcla de reacción" se define como que comprende todos los reactivos, en particular, la muestra solubilizada, el p-anisaldehído y el ácido sulfúrico en al menos un disolvente.
La mezcla de reacción de la etapa (i) comprende generalmente un disolvente elegido entre agua, alcoholes C1-C4 y sus mezclas, preferentemente elegido entre metanol y etanol y de manera preferente etanol.
La cantidad de p-anisaldehído añadida a la mezcla de reacción de la etapa (i) depende de la cantidad de muestra que se debe cuantificar. Está dentro de la competencia de los expertos en la materia determinar esta cantidad para que el p-anisaldehído no se convierta en un reactivo limitativo y no precipite.
Generalmente, la cantidad de p-anisaldehído utilizada en la etapa (i) varía del 0,1 % al 2 %, y de manera preferente del 0,5 % en volumen con respecto al volumen total de la mezcla de reacción.
El ácido sulfúrico, preferentemente en solución etanólica, se añade en una cantidad que varía del 5 % al 25 %, de manera preferente del 10 % al 15 % y de preferentemente del 12,5 % en volumen con respecto al volumen total de la mezcla de reacción.
De acuerdo con la etapa (ii), la mezcla de reacción se lleva a continuación a una temperatura que varía de 45 °C a 80 °C, preferentemente igual a 60 °C para permitir la formación del cromóforo.
El tiempo necesario para la formación del cromóforo depende de varios parámetros, como las cantidades de ácido sulfúrico, de saponinas, la temperatura. Es competencia del experto en la materia determinar la duración de la reacción cromógena. Generalmente la duración de la reacción cromógena varía de 1 a 60 minutos, preferentemente de 10 a 30 minutos, más preferentemente 20 minutos.
Generalmente, la mezcla de reacción que contiene el cromóforo se enfría o se deja enfriar antes de realizar la cuantificación de dicho cromóforo.
Medición-Cuantificación
El procedimiento según la presente invención comprende una etapa de medición de la absorbancia de la solución del cromóforo obtenido, y a continuación una etapa de cuantificación de las saponinas en la muestra.
La medición-cuantificación corresponde a las etapas (iii) a (v) del procedimiento de determinación del contenido de saponinas esteroides.
De acuerdo con la etapa (iii) del procedimiento según la invención, la absorbancia de la solución del cromóforo obtenido se mide a una longitud de onda que varía de 400 a 450 nm, y de manera preferente 425 nm.
De acuerdo con la etapa (iv) del procedimiento según la invención, se realiza una gama de soluciones patrón de saponinas esteroides con un patrón de saponinas. Es obvio para los expertos en la materia que los cromóforos de las soluciones patrón se obtienen en las mismas condiciones que la muestra, es decir, con el mismo disolvente, las mismas cantidades de p-anisaldehído y de ácido sulfúrico, a la misma temperatura, los mismos tiempos de calentamiento a partir de soluciones de un patrón de saponina a diferentes concentraciones.
Los cromóforos de las soluciones patrón tienen absorbancias que varían de 0 a 1,5, preferentemente de 0 a 1 a la longitud de onda definida en la etapa (iii), es decir la longitud de onda de medición de la muestra que se debe cuantificar. Las soluciones patrón se definen para cubrir una gama de absorbancias según intervalos regulares. A continuación, de acuerdo con la etapa (v), el contenido de saponinas esteroides de la muestra se cuantifica comparando la absorbancia de la solución de cromóforo obtenida de la muestra que se debe cuantificar, es decir, medida en la etapa (iii) con la gama de absorbancias de las soluciones patrón realizadas a la misma longitud de onda según la etapa (iv).
La cuantificación del contenido de saponinas esteroides se lleva a cabo de acuerdo con el mismo protocolo que la cuantificación del contenido total de saponinas con referencia a una gama de soluciones patrón, preferentemente mediante un patrón de saponina esteroide.
Preferentemente, la cuantificación del contenido de saponinas esteroides se lleva a cabo con el mismo patrón de saponina que la cuantificación del contenido total de saponinas.
En consecuencia, cuando se implementa un procedimiento de determinación de saponinas esteroides, el procedimiento de determinación del contenido total de saponinas según la invención se lleva a cabo preferentemente con un patrón de saponinas esteroides.
Ventajosamente, cuando las saponinas en la muestra consisten en saponinas esteroides y triterpénicas, dicho procedimiento de determinación del contenido total de saponinas de una muestra según la invención comprende determinar el contenido de saponinas triterpénicas de dicha muestra por diferencia (cálculo de la diferencia) entre el contenido total de saponinas de dicha muestra determinado después de la etapa (5) y el contenido de saponinas esteroides de dicha muestra determinado al final de la etapa (v).
Los ejemplos que siguen ilustran la invención sin limitar el alcance de ello.
Ejemplos
Ejemplo 1: Determinación del contenido total de saponinas en una muestra de Camellia oleífera
Se sabe que la Camellia oleifera comprende esencialmente saponinas triterpénicas. En este ejemplo, la escina IB se utiliza como patrón de saponinas.
Establecimiento de una curva patrón con una saponina de referencia
Se preparan 5 soluciones patrón introduciendo en 5 tubos de ensayo un volumen de 100 pl de una solución patrón de escina IB en metanol, siendo las concentraciones de dichas soluciones patrón respectivamente 1 mg.mM , 2 mg.mM , 3 mg.mM , 4 mg.mM y 5 mg.mM . A cada una de estas 5 soluciones patrón se añaden 100 pl de una solución de p-anisaldehído solubilizada al 50 % en metanol (volumen/volumen), a continuación 2 ml de una solución acuosa de ácido sulfúrico al 50 % (v/v). La concentración de ácido sulfúrico de la solución es por lo tanto del 45 % en volumen con respecto al volumen total de la mezcla de reacción. Los 5 tubos de ensayo se tapan y se incuban en un baño de agua a 60 °C durante 20 minutos y a continuación se colocan en un baño de agua con hielo durante 10 minutos. Se obtienen así 5 soluciones cuyas concentraciones de escina IB en la mezcla de reacción están comprendidas entre 25 x 10'3 g/l y 250 x 10'3 g/l (25 |jg.mM a 250 |jg.mM ). La absorbancia específica de cada patrón se mide a 600 nm frente a un blanco realizado en las mismas condiciones. De este modo se obtiene una absorbancia para cada concentración de escina IB que se representa en función de la concentración para obtener la curva patrón que se presenta en la [Fig. 1].
La [Fig 1] corresponde a la recta de calibración de la escina IB: esta recta corresponde a la absorbancia en función de la concentración (en 10'3 g.M ), la ecuación de esta recta es: y = 0,0057x 0,0359 donde R2 = 0,9994.
Determinación del contenido total de saponinas en una muestra de Camellia oleifera
Una muestra de Camellia oleifera se solubiliza en diclorometano para obtener una solución a 20 mg.mM a continuación se extrae con ultrasonidos durante 5 minutos a una temperatura de 50 °C. A continuación, la solución se filtra al vacío a través de un embudo que contiene un disco de vidrio sinterizado de porosidad 3.
El residuo se solubiliza con 25 ml de metanol y a continuación se extrae con ultrasonidos durante 5 minutos a una temperatura de 50 °C. La solución se filtra al vacío a través de un embudo que contiene un disco de vidrio sinterizado de porosidad 3. Esta etapa de extracción se realiza 3 veces y los filtrados reunidos se secan en un evaporador rotatorio a presión reducida. El rendimiento de extracción obtenido es del 18 %.
Una cantidad de extracto se solubiliza en metanol para realizar una solución a 10 mg.ml-1. La solución se centrifuga a 10.000 g durante 10 minutos. Se añade un volumen de 100 pl del sobrenadante a un tubo de ensayo con 100 pl de una solución de p-anisaldehído solubilizada al 50 % en metanol (volumen/volumen). Se añade al tubo de ensayo un volumen de 2 ml de una solución acuosa de ácido sulfúrico al 50 % (volumen/volumen). La concentración de ácido sulfúrico de la solución es por lo tanto del 45 % en volumen con respecto al volumen total de la mezcla de reacción. El tubo de ensayo tapado se incuba en un baño de agua a 60 °C durante 20 minutos y a continuación se coloca en un baño de agua con hielo durante 10 minutos. La absorbancia específica de las saponinas se mide a 600 nm frente a un blanco realizado en las mismas condiciones. El valor obtenido representado en la recta de calibración de escina IB permite calcular una concentración de 0,31 mg.ml-1 es decir, 31 % (masa/masa) de escina IB en el extracto metanólico y 5,6 % (masa/masa) equivalente de escina IB en la muestra de Camellia oleífera.
Elementos de validación del método
El coeficiente de variación en repetibilidad (CVr) realizado sobre 6 mediciones es del 2 % y en precisión intermedia (CVR) realizado sobre 12 mediciones es del 3 %. La precisión del método se evalúa mediante el cálculo de recubrimiento por dopaje. El dopaje se realiza al 150 % sobre el extracto metanólico de Camellia oleífera. La tasa de recubrimiento medida de este modo es 100 ± 2 % donde:
[Mat 2]
Tasa de recubrimiento = contenido dopado
contenido no dopado contenido de adición x 100
Donde:
Contenido no dopado: cantidad de saponinas totales medidas en el extracto inicial
Contenido de adición: cantidad de saponina de referencia añadida en el extracto inicial (50 % del valor inicial)
Contenido dopado: cantidad de saponinas totales medidas en el extracto dopado (al 150 %)
Elemento de comparación
El procedimiento según la invención se comparó con un método desarrollado internamente sobre Cromatografía líquida a alta presión (CLAP) acoplada a un Detector evaporativo por dispersión de luz (DEDL) (CLAP-DEDL) así como por el método gravimétrico (Budan et al., 2013). En la muestra de Camellia oleífera, el contenido total de saponinas es del 5,6 % (masa/masa) frente al 5,4 % (masa/masa) del equivalente de escina IB en CLAP-DEDL. El método gravimétrico, que tiende a sobrestimar la cantidad de saponinas permite obtener un valor del 10,4 % (masa/masa) en la muestra.
La [Tabla 1] recoge los principales datos obtenidos para la medición del contenido total de saponinas en la muestra de Camellia oleifera.
Figure imgf000012_0001
Ejemplo 2 : Determinación del contenido total de saponinas en una muestra de Chenopodium quinoa
Se sabe que el Chenopodium quinoa comprende esencialmente saponinas triterpénicas. En este ejemplo, la escina IB se utiliza como patrón de saponinas.
Establecimiento de una curva patrón con una saponina de referencia
La curva patrón se realiza de acuerdo con la del ejemplo 1.
Determinación del contenido total de saponinas en una muestra de Chenopodium guinoa
Una muestra de Chenopodium guinoa se solubiliza en diclorometano para obtener una solución a 20 mg.ml-1 y a continuación se extrae con ultrasonidos durante 5 minutos a una temperatura de 50 °C. A continuación, la solución se filtra al vacío a través de un embudo que contiene un disco de vidrio sinterizado de porosidad 3.
El residuo se solubiliza con 25 ml de metanol y a continuación se extrae con ultrasonidos durante 5 minutos a una temperatura de 50 °C. La solución se filtra al vacío a través de un embudo que contiene un disco de vidrio sinterizado de porosidad 3. Esta etapa de extracción se realiza 3 veces y los filtrados reunidos se secan en un evaporador rotatorio a presión reducida. El rendimiento de extracción obtenido es del 45 %.
Una cantidad de extracto se solubiliza en metanol para realizar una solución de 10 mg.ml-1- La solución se centrifuga a 10.000 g durante 10 minutos. Se añade un volumen de 100 pl del sobrenadante a un tubo de ensayo con 100 pl de una solución de p-anisaldehído solubilizada al 50 % en metanol (volumen/volumen). Se añade al tubo de ensayo un volumen de 2 ml de una solución acuosa de ácido sulfúrico al 50 % (volumen/volumen). La concentración de ácido sulfúrico de la solución es por lo tanto del 45 % en volumen con respecto al volumen total de la mezcla de reacción. El tubo de ensayo tapado se incuba en un baño de agua a 60 °C durante 20 minutos y a continuación se coloca en un baño de agua con hielo durante 10 minutos. La absorbancia específica de las saponinas se mide a 600 nm frente a un blanco realizado en las mismas condiciones. El valor obtenido representado en la recta de calibración de escina IB permite calcular una concentración de 0,095 mg.ml-1 es decir, 9,5 % (masa/masa) de escina IB en el extracto metanólico y 4,3 % (masa/masa) de equivalente de escina IB en la muestra de Chenopodium guinoa.
Elementos de validación del método
El coeficiente de variación de la repetibilidad (CVr) realizado en 3 mediciones es del 1 %. Un dopaje realizado al 125 % sobre el extracto metanólico de Chenopodium guinoa proporciona una tasa de recubrimiento de 105 ± 3 % donde:
[Mat 2]
Tasa de recubrimiento = contenido dopado
contenido no dopado contenido de adición x 100
Donde:
Contenido no dopado: cantidad de saponinas totales medidas en el extracto inicial
Contenido de adición: cantidad de saponina de referencia añadida en el extracto inicial (25 % del valor inicial) Contenido dopado: cantidad de saponinas totales medidas en el extracto dopado (al 125 %)
Elemento de comparación
El procedimiento según la invención se comparó con un método desarrollado internamente sobre CLAP-DEDL. En la muestra de Chenopodium guinoa, el contenido total de saponinas es del 4,3 % (masa/masa), es también del 4,3 % (masa/masa) de equivalente de escina IB en CLAP-DEDL.
La [Tabla 2] recoge los principales datos obtenidos para la medición del contenido total de saponinas en la muestra de Chenopodium guinoa.
T l 2
Figure imgf000013_0001
Ejemplo 3 : Determinación del contenido total de saponinas en una muestra de Trigonella foenum graecum
Se sabe que la Trigonella foenum graecum comprende esencialmente saponinas esteroides. En este ejemplo, la protodioscina se utiliza como patrón de saponina.
Establecimiento de una curva patrón con una saponina de referencia
Se preparan 5 soluciones patrón introduciendo en 5 tubos de ensayo un volumen de 100 pl de una solución patrón de protodioscina en metanol, siendo las concentraciones de dichas soluciones patrón respectivamente las concentraciones de dichas soluciones patrón respectivamente 1 mg.ml-1, 2 mg.ml-1, 3 mg.ml-1, 4 mg.ml-1 y 5 mg.ml-1. A cada una de estas 5 soluciones patrón se añaden 100 pl de una solución de p-anisaldehído solubilizada al 50 % en metanol (volumen/volumen), a continuación 2 ml de una solución acuosa de ácido sulfúrico al 50 % (v/v). La concentración de ácido sulfúrico de la solución es por lo tanto del 45 % en volumen con respecto al volumen total de la mezcla de reacción. Los 5 tubos de ensayo se tapan y se incuban en un baño de agua a 60 °C durante 20 minutos y a continuación se colocan en un baño de agua con hielo durante 10 minutos. Se obtienen así 5 soluciones cuyas concentraciones de escina IB en la mezcla de reacción están comprendidas entre 25 x 10-3 g/l y 250 x 10-3 g/l (25 |jg.ml-1 a 250 |jg.ml-1). La absorbancia específica de cada patrón se mide a 600 nm frente a un blanco realizado en las mismas condiciones. De este modo se obtiene una absorbancia para cada concentración de protodioscina que se representa en función de la concentración para obtener la curva patrón que se presenta en la [Fig. 2].
La [Fig 2] corresponde a la recta de calibración de protodioscina: esta recta corresponde a la absorbancia en función de la concentración (en 10-3 g.l-1), esta recta tiene la ecuación y = 0,0071x - 0,0509 donde R2 = 0,9986.
Determinación del contenido total de saponinas en una muestra de Trigonella foenum graecum
Una muestra de Trigonella foenum graecum se solubiliza en diclorometano para obtener una solución a 20 mg.ml-1 y a continuación se extrae con ultrasonidos durante 5 minutos a una temperatura de 50 °C. A continuación, la solución se filtra al vacío a través de un embudo que contiene un disco de vidrio sinterizado de porosidad 3.
El residuo se solubiliza con 25 ml de metanol y a continuación se extrae con ultrasonidos durante 5 minutos a una temperatura de 50 °C. La solución se filtra al vacío a través de un embudo que contiene un disco de vidrio sinterizado de porosidad 3. Esta etapa de extracción se realiza 3 veces y los filtrados reunidos se secan en un evaporador rotatorio a presión reducida. El rendimiento de extracción obtenido es del 22 %.
Una cantidad de extracto se solubiliza en metanol para realizar una solución a 10 mg.ml-1. La solución se centrifuga a 10.000 g durante 10 minutos, se añade un volumen de 100 pl del sobrenadante a un tubo de ensayo con 100 pl de una solución de p-anisaldehído solubilizada al 50 % en metanol (volumen/volumen). Se añade al tubo de ensayo un volumen de 2 ml de una solución acuosa de ácido sulfúrico al 50 % (volumen/volumen). La concentración de ácido sulfúrico de la solución es por lo tanto del 45 % en volumen con respecto al volumen total de la mezcla de reacción. El tubo de ensayo tapado se incuba en un baño de agua a 60 °C durante 20 minutos y a continuación se coloca en un baño de agua con hielo durante 10 minutos. La absorbancia específica de las saponinas se mide a 600 nm frente a un blanco realizado en las mismas condiciones. El valor obtenido representado en la recta de calibración de protodioscina permite calcular una concentración de 0,29 mg.ml-1 es decir, del 29 % (masa/masa) en el extracto metanólico y del 6,4 % (masa/masa) de equivalente de protodioscina en la muestra de Trigonella foenum graecum.
Elementos de validación del método
El coeficiente de variación en repetibilidad (CVr) realizado sobre 6 mediciones es del 2 % y en precisión intermedia (CVR) realizado sobre 12 mediciones es del 3 %. Un dopaje realizado al 150 % sobre el extracto metanólico de Trigonella foenum graecum permite obtener una tasa de recubrimiento de 102 ± 2 % donde:
[Mat 2]
Tasa de recubrimiento = contenido dopado
contenido no dopado contenido de adición x 100
Donde:
Contenido no dopado: cantidad de saponinas totales medidas en el extracto inicial
Contenido de adición: cantidad de saponina de referencia añadida en el extracto inicial (50 % del valor inicial)
Contenido dopado: cantidad de saponinas totales medidas en el extracto dopado (al 150 %)
Elemento de comparación
El procedimiento según la invención se comparó con un método desarrollado internamente sobre CLAP-DEDL así como por el método gravimétrico (Budan et al., 2013). En la muestra de Trigonella foenum graecum, el contenido total de saponinas es del 6,4 % (masa/masa) frente al 6,2 % (masa/masa) de equivalente de protodioscina en CLAP-DEDL. El método gravimétrico, que tiende a sobrestimar la cantidad de saponinas permite obtener un valor del 11,2 % (masa/masa) en la muestra. La [Tabla 3] recoge los principales datos obtenidos para la medición del contenido total de saponinas en la muestra de Trigonella foenum graecum.
Figure imgf000014_0001
Ejemplo 4: Determinación del contenido total de saponinas en una muestra de Yucca schidigera Se sabe que el Yucca schidigera incluye saponinas esteroides. En este ejemplo, la protodioscina se utiliza como patrón de saponina.
Establecimiento de una curva patrón con una saponina de referencia
La curva patrón se realiza de acuerdo con la del ejemplo 3.
Determinación del contenido total de saponinas en una muestra de Yucca schidigera
Una muestra de Yucca schidigera se solubiliza en diclorometano para obtener una solución a 20 mg.ml-1 y a continuación se extrae con ultrasonido durante 5 minutos a una temperatura de 50 °C. A continuación, la solución se filtra al vacío a través de un embudo que contiene un disco de vidrio sinterizado de porosidad 3.
El residuo se solubiliza con 25 ml de metanol y a continuación se extrae con ultrasonidos durante 5 minutos a una temperatura de 50 °C. La solución se filtra al vacío a través de un embudo que contiene un disco de vidrio sinterizado de porosidad 3. Esta etapa de extracción se realiza 3 veces y los filtrados reunidos se secan en un evaporador rotatorio a presión reducida. El rendimiento de extracción obtenido es del 28 %.
Una cantidad de extracto se solubiliza en metanol para realizar una solución a 10 mg.ml-1. La solución se centrifuga a 10.000 g durante 10 minutos. Se añade un volumen de 100 pl del sobrenadante a un tubo de ensayo con 100 pl de una solución de p-anisaldehído solubilizada al 50 % en metanol (volumen/volumen). Se añade al tubo de ensayo un volumen de 2 ml de una solución acuosa de ácido sulfúrico al 50 % (volumen/volumen). La concentración de ácido sulfúrico de la solución es por lo tanto del 45 % en volumen con respecto al volumen total de la mezcla de reacción. El tubo de ensayo tapado se incuba en un baño de agua a 60 °C durante 20 minutos y a continuación se coloca en un baño de agua con hielo durante 10 minutos. La absorbancia específica de las saponinas se mide a 600 nm frente a un blanco realizado en las mismas condiciones. El valor obtenido representado en la recta de calibración de protodioscina permite calcular una concentración de 0,28 mg. ml-1 es decir, del 28 % (masa/masa) de protodioscina en el extracto metanólico y del 7,8 % (masa/masa) de equivalente de protodioscina en la muestra de Yucca schidigera. Elementos de validación del método
El coeficiente de variación de la repetibilidad (CVr) realizado en 3 mediciones es del 2 %. Un dopaje realizado al 125 % sobre el extracto metanólico de Yucca schidigera proporciona una tasa de recubrimiento de 100 ± 2 % donde:
[Mat 2]
Tasa de recubrimiento = contenido dopado
contenido no dopado contenido de adición x 100
Donde:
Contenido no dopado: cantidad de saponinas totales medidas en el extracto inicial
Contenido de adición: cantidad de saponina de referencia añadida en el extracto inicial (25 % del valor inicial) Contenido dopado: cantidad de saponinas totales medidas en el extracto dopado (al 125 %)
Elemento de comparación
El procedimiento según la invención se comparó con un método desarrollado internamente sobre CLAP-DEDL. En la muestra de Yucca schidigera, el contenido total de saponinas es del 7,8 % (masa/masa) frente al 8,4 % (masa/masa) de equivalente de protodioscina en CLAP-DEDL.
La [Tabla 4] recoge los principales datos obtenidos para la medición del contenido total de saponinas en la muestra de Yucca schidigera.
T l 4
Figure imgf000015_0001
Los ejemplos 1 a 4 demuestran que el procedimiento según la invención da un valor de saponinas muy cercano al valor desarrollado internamente sobre CLAP-DEDL. La implementación del procedimiento según la invención es también mucho más simple e implementa medios menos costosos que el método sobre CLAP-DEDL.
Ejemplo 5: Determinación del contenido total de saponinas en una mezcla que contiene saponinas esteroides y triterpénicas.
El procedimiento según la invención se implemento en muestras que comprenden una mezcla de un extracto de Camellia oleífera que contiene saponinas triterpénicas y de un extracto de Trigonella foenum graecum que contiene saponinas esteroides.
Estimación "teórica" del contenido total de saponinas
Se entiende por "estimación teórica" el contenido de saponinas obtenido sumando el contenido de saponinas del extracto de Camellia oleífera y del extracto de Trigonella foenum graecum obtenidos por separado.
El contenido de saponinas (triterpénicas) en el extracto de Camellia oleífera, por un lado, y el contenido de saponinas (esteroides) del extracto de Trigonella foenum graecum, por otro lado, se determinaron de acuerdo con el protocolo presentado en el Ejemplo 3 usando protodioscina como patrón de saponinas. Los contenidos de saponinas obtenidos son del 26 % en el extracto de Camellia oleifera y del 29 % en el extracto de Trigonella foenum graecum.
La [Tabla 5] presenta la determinación de los contenidos de saponinas totales en función de los porcentajes de cada uno de los extractos introducidos en tres muestras de mezclas.
T l
Figure imgf000016_0001
Determinación experimental del contenido total de saponinas
El contenido total de saponinas se determinó por el procedimiento según la presente invención para mezclas de extractos correspondientes a las siguientes proporciones: 80/20; 50/50 y 20/80 de Camellia oleifera / Trigonella fenum fenogreco (% m/m).
Establecimiento de una curva patrón con una saponina de referencia
El contenido total de saponinas de las muestras que contienen saponinas triterpénicas y esteroides, puede expresarse por cualquier patrón de saponinas procedente del grupo esteroide o triterpénico. En este ejemplo, la protodioscina se utiliza como patrón de saponinas para estimar el contenido total de saponinas de las diferentes muestras de mezcla.
La curva patrón se realiza de acuerdo con la del ejemplo 3.
Determinación del contenido total de saponinas en las diferentes muestras de mezclas
Para las diferentes muestras (que contienen extractos de Camellia oleifera y de Trigonella foenum graecum), una cantidad se solubiliza en metanol para realizar una solución a 10 mg.ml-1. La solución se centrifuga a 10.000 g durante 10 minutos. Se añade un volumen de 100 pl del sobrenadante a un tubo de ensayo con 100 pl de una solución de panisaldehído solubilizada al 50 % en metanol (volumen/volumen). Se añade al tubo de ensayo un volumen de 2 ml de una solución acuosa de ácido sulfúrico al 50 % (volumen/volumen). La concentración de ácido sulfúrico de la solución es por lo tanto del 45 % en volumen con respecto al volumen total de la mezcla de reacción. El tubo de ensayo tapado se incuba en un baño de agua a 60 °C durante 20 minutos y a continuación se coloca en un baño de agua con hielo durante 10 minutos. La absorbancia específica de las saponinas se mide a 600 nm frente a un blanco realizado en las mismas condiciones. El valor obtenido representado en la recta de calibración de protodioscina permite estimar el contenido total de saponinas en las diversas mezclas.
La [Tabla 6] presenta los valores denominados "experimentales", es decir, obtenidos para las diferentes muestras que contienen mezclas de extractos de Camellia oleifera y de Trigonella foenum graecum así como los denominados valores "teóricos" definidos anteriormente (véase [Tabla 5] anterior).
T l
Figure imgf000016_0002
continuación
Figure imgf000017_0001
Donde:
[Mat 3]
S — esgo rel , ativo = - C-o--n-t-e-n--id--o-- e-x-p-erim ental -con ten ido teóric-o
c-o-n-t-e--n-i-d-o-- t-e-ó ;-r-i-c-o-------------- x 100
Donde:
- Contenido experimental: cantidad total de saponinas determinada experimentalmente en las muestras de mezclas - Contenido teórico: cantidad total de saponinas calculada sumando el contenido de saponinas de los extractos de Camellia oleífera y de Trigonella foenum graecum.
El procedimiento según la invención permite determinar el contenido total de saponinas de las tres mezclas de extractos de Camellia oleífera y de Trigonella foenum graecum. Los valores obtenidos aplicando el procedimiento según la invención a una mezcla de extractos sólo están separados por un sesgo relativo del 3 % de los valores obtenidos aplicando el procedimiento según la invención a cada extracto que constituye dicha mezcla.
Ejemplo 6 : Determinación de los contenidos respectivos de saponinas triterpénicas y de saponinas esteroides en una muestra que contiene saponinas triterpénicas y esteroides
El procedimiento según la invención se aplicó a muestras de mezclas de extracto de Camellia oleífera y de extracto de Trigonella foenum graecum con el fin de determinar el contenido total de saponinas así como los respectivos contenidos de saponinas triterpénicas y de saponinas esteroides en estas muestras de mezclas. Estas determinaciones se realizan en tres etapas.
La primera etapa corresponde a la determinación del contenido total de saponinas en una mezcla que contiene saponinas esteroides y triterpénicas, esta etapa se describe en el ejemplo 5 anterior. Especialmente, implementa una etapa de medición de la absorbancia a 600 nm del producto obtenido al final de una reacción cromógena en la muestra. La segunda etapa corresponde a la determinación del contenido total de saponinas esteroides en una mezcla que contiene saponinas esteroides y triterpénicas. Especialmente, implementa una etapa de medición de la absorbancia a 425 nm del producto obtenido al final de una reacción cromógena en la muestra.
La tercera etapa permite, por diferencia, para determinar el contenido total de saponinas triterpénicas en una mezcla que contiene saponinas esteroides y triterpénicas.
Primera etapa: Determinación del contenido total de saponinas
Como ya se mencionó, la primera etapa corresponde al ejemplo 5 anterior, los valores obtenidos para las diferentes muestras se presentan en la [Tabla 6] anterior.
Segunda etapa: Determinación del contenido de saponinas esteroides
Para la segunda etapa, se utiliza un patrón de saponinas esteroides. Por el procedimiento según la invención, el contenido de saponinas esteroides se determinó para muestras de mezclas correspondientes a las siguientes proporciones: 80/20; 50/50 y 20/80 de Camellia oleifera / Trigonella fenum fenogreco (% m/m).
Establecimiento de una curva patrón con una saponina de referencia
El contenido de saponinas esteroides se expresa con un patrón que pertenece a los grupos de saponinas esteroides. En este ejemplo, la protodioscina se utiliza como patrón de las saponinas.
Se preparan 5 soluciones patrón introduciendo en 5 tubos de ensayo un volumen de 100 pl de una solución patrón de protodioscina en metanol, estando las concentraciones de dichas soluciones patrón comprendidas entre 0,2 y 1 mg.ml-1 A cada una de estas soluciones patrón se añaden 100 pl de una solución de p-anisaldehído solubilizada al 10 % en etanol (volumen/volumen), a continuación 2 ml de una solución de ácido sulfúrico etanólico al 12,5 % (v/v). La concentración de ácido sulfúrico de la solución es por lo tanto del 11 % en volumen con respecto al volumen total de la mezcla de reacción. Los tubos de ensayo se tapan y se incuban en un baño de agua a 60 °C durante 20 minutos y a continuación se colocan en un baño de agua con hielo durante 10 minutos. Se obtienen así 5 soluciones cuyas concentraciones de protodioscina en la mezcla de reacción están comprendidas entre 4 x 10-3 g.l-1 y 40 x 10-3 g-1 (4 jg .m l'1 a 40 jg .m l'1). La absorbancia específica de cada patrón esteroide se mide a 425 nm frente a un blanco realizado en las mismas condiciones. De este modo se obtiene una absorbancia para cada concentración de protodioscina que se representa en función de la concentración para obtener una curva patrón presentada en la [Fig. 3].
La ecuación de la recta representada en la [Fig. 3] es y = 0,0309x 0,0175
donde R2 = 0,9994
Determinación del contenido de saponinas esteroides en las diferentes muestras de mezclas
Para cada muestra de mezclas, una cantidad se solubiliza en metanol para realizar una solución a 10 mg.ml-1. La solución se centrifuga a 10.000 g durante 10 minutos. Se añade un volumen de 100 j l del sobrenadante a un tubo de ensayo con 100 j l de una solución de p-anisaldehído disuelta al 10 % en etanol (volumen/volumen). Se añade al tubo de ensayo un volumen de 2 ml de una solución de ácido sulfúrico etanólico al 12,5 % (v/v). La concentración de ácido sulfúrico en la solución es por tanto del 11 % en volumen con respecto al volumen total de la mezcla de reacción. El tubo de ensayo tapado se incuba en un baño de agua a 60 °C durante 20 minutos y a continuación se coloca en un baño de agua con hielo durante 10 minutos. La absorbancia específica de las saponinas esteroides se mide a 425 nm frente a un blanco realizado en las mismas condiciones. El valor obtenido representado en la recta de calibración de protodioscina permite estimar el contenido de saponinas esteroides en las diversas muestras de mezclas.
La [Tabla 7] presenta los valores de saponinas esteroides denominados "experimentales" obtenidos para las diferentes muestras de mezcla, así como los valores denominados "teóricos" que corresponden a los valores de saponinas esteroides presentados en la [Tabla 5 ].
T l 7
Figure imgf000018_0001
Donde:
[Mat 3]
S — esgo rel , ativo = - C-o--n-t-e-n--id--o-- e-x-p-erim ental -con ten ido teórico
c-o-n-t-e--n-i-d-o-- t-e-ó--r-i-c-o--------------- x 100
Donde:
- Contenido experimental: cantidad de saponinas esteroides determinadas experimentalmente en las muestras de mezclas;
- Contenido teórico: cantidad de saponinas esteroides determinada sobre la base del extracto que contiene esencialmente saponinas esteroides.
Tercera etapa: determinación del contenido de saponinas triterpénicas
El contenido de saponinas triterpénicas presentes en muestras de mezclas que contienen saponinas triterpénicas y esteroides se determina de la siguiente manera:
[Mat 5]
Contenido de saponinas triterpénicas
= Contenido total de saponinas — contenido de saponinas esteroides
Donde:
- El contenido total de saponinas corresponde al contenido total de saponinas determinado en la primera etapa anterior en mg/g
- El contenido de saponinas esteroides corresponde al contenido de saponinas esteroides determinado en la segunda etapa anterior en mg/g
La [Tabla 8] presenta los contenidos de saponinas triterpénicas calculados por diferencia entre los datos experimentales obtenidos en la primera etapa ([Tabla 6]) y los datos experimentales obtenidos en la segunda etapa ([Tabla 7]) y a continuación comparados con los valores teóricos establecidos en la [Tabla 5], 1 a columna en mg/g.
Figure imgf000019_0001
Donde:
[Mat 3]
S —
esgo rel , ativo = - C-o--n-t-e-n--id--o-- e-x-p- c-e
o-r
n-im ental -con ten ido teórico
t-e--n-i-d-o-- t-e-ó--r-i-c-o--------------- x 100
Donde:
- Contenido experimental: cantidad de saponinas triterpénicas determinadas experimentalmente en las muestras de mezclas en mg/g
- Contenido teórico: cantidad de saponinas triterpénicas determinada a partir del extracto que contiene esencialmente saponinas triterpénicas en mg/g.
Los valores de los contenidos de saponinas esteroides por un lado y de saponinas triterpénicas por otro lado obtenidos aplicando el procedimiento de acuerdo con la invención a una mezcla de extractos solo están separados respectivamente por un sesgo relativo del 1 % y del 8 % de los valores obtenidos aplicando el procedimiento según la invención a cada extracto que constituye dicha mezcla.
Ejemplo 7 : Determinación del contenido total de saponinas en una muestra líquida de Yucca schidigera La determinación del contenido total de saponinas se realiza directamente sin etapa previa de extracción.
Establecimiento de una curva patrón con una saponina de referencia
En este ejemplo, la protodioscina se utiliza como patrón de saponina.
La curva patrón se realiza de acuerdo con la del ejemplo 3.
Determinación del contenido total de saponinas en una muestra líquida de Yucca schidiaera
Una muestra líquida de Yucca schidigera se introduce en metanol para realizar una solución a 10 mg.ml-1. La solución se centrifuga a 10.000 g durante 10 minutos. Se añade un volumen de 100 pl del sobrenadante a un tubo de ensayo con 100 pl de una solución de p-anisaldehído solubilizada al 50 % en metanol (volumen/volumen). Se añade al tubo de ensayo un volumen de 2 ml de una solución acuosa de ácido sulfúrico al 50 % (volumen/volumen). La concentración de ácido sulfúrico de la solución es por lo tanto del 45 % en volumen con respecto al volumen total de la mezcla de reacción. El tubo de ensayo tapado se incuba en un baño de agua a 60 °C durante 20 minutos y a continuación se coloca en un baño de agua con hielo durante 10 minutos. La absorbancia específica de las saponinas se mide a 600 nm frente a un blanco realizado en las mismas condiciones. El valor obtenido representado en la recta de calibración de protodioscina permite calcular una concentración de 0,081 mg.mM es decir, del 8,1 % (masa/masa) de equivalente de protodioscina en la muestra líquida de Yucca schidigera.
Elementos de validación del método
El coeficiente de variación de la repetibilidad (CVr) realizado en 3 mediciones es del 1 %. Un dopaje realizado al 125% sobre la muestra de Yucca schidigera proporciona una tasa de recubrimiento de 97 ± 2 % donde:
[Mat 2]
Tasa de recubrimiento = contenido dopado
contenido no dopado contenido de adición x 100
Donde:
- Contenido no dopado: cantidad de saponinas totales medida en la muestra inicial,
- Contenido de adición: cantidad de saponina de referencia añadida en la muestra inicial (25 % del valor inicial) - Contenido dopado: cantidad de saponinas totales medidas en la muestra dopada (al 125 %).
Elemento de comparación
Este método se comparó con un método desarrollado internamente sobre CLAP-DEDL. En la muestra de Yucca schidigera, el contenido total de saponinas es del 8,1 % (masa/masa) frente al 7,2 % (masa/masa) de equivalente de protodioscina en CLAP-DEDL.
La [Tabla 9] recoge los principales datos obtenidos para el contenido total de saponinas en la muestra de Yucca schidigera.
T l
Figure imgf000020_0001
El procedimiento según la invención da un valor de saponinas muy cercano al valor desarrollado internamente sobre CLAP-DEDL. La implementación del procedimiento según la invención es también mucho más simple e implementa medios menos costosos que el método sobre CLAP-DEDL.
Ejemplos comparativos 8-variación de la concentración de ácido sulfúrico
El protocolo para establecer una curva patrón con una saponina de referencia del ejemplo 1 se reprodujo variando la concentración de ácido sulfúrico.
1. Ácido sulfúrico 25%, 30 % y 35 % vol/vol
Se preparó una solución patrón introduciendo en un tubo de ensayo un volumen de 100 pl de una solución patrón de escina IB a 5 mg.mM en metanol. A esta solución patrón se le añade p-anisaldehído para obtener una solución patrón al 3 % de p-anisaldehído y ácido sulfúrico para obtener una solución patrón al 25 % de ácido sulfúrico. El tubo de ensayo se tapa y se incuba en un baño de agua a 60 °C durante 20 minutos y a continuación se coloca en un baño de agua con hielo durante 10 minutos. El p-anisaldehído no es soluble en dicha solución patrón. El experimento se reprodujo disminuyendo la concentración de p-anisaldehído al 0,5 %, obteniéndose una solución límpida.
La [Fig.4] muestra el espectro de absorbancia de esta solución en el rango de longitud de onda de 400-800 nm: no se forma cromóforo. Por lo tanto, no es posible realizar una curva patrón a esta concentración de ácido sulfúrico.
El mismo protocolo se implementó con una solución similar pero que contenía el 30 % de ácido sulfúrico vol/vol o el 35 % de ácido sulfúrico vol/vol. Se obtuvieron los mismos resultados. De este modo, no se forma cromóforo en el rango de longitudes de onda de 400-800 nm.
2. Ácido sulfúrico 70 % vol/vol
Se preparó una solución patrón introduciendo en un tubo de ensayo un volumen de 100 pl de una solución patrón de escina IB a 1,25 mg.mM en metanol. A esta solución patrón se le añade p-anisaldehído para obtener una solución patrón al 3 % de p-anisaldehído y ácido sulfúrico para obtener una solución patrón al 70 % de ácido sulfúrico. El tubo de ensayo se tapa y se incuba en un baño de agua a 60 °C durante 20 minutos y a continuación se coloca en un baño de agua con hielo durante 10 minutos.
La [Fig.5] muestra el espectro de absorbancia de esta solución en el rango de longitudes de onda de 400-800 nm. Se observa el desarrollo de un cromóforo cuyo máximo de absorbancia se sitúa a 545 nm, es decir, fuera del intervalo de longitud de onda de medición de la absorbancia del procedimiento según la invención (580 a 610 nm).
3. Ácido sulfúrico 40 % vol/vol
Se preparó una solución patrón introduciendo en un tubo de ensayo un volumen de 100 pl de una solución patrón de escina IB a 5 mg.ml'1 en metanol. A esta solución patrón se le añade p-anisaldehído para obtener una solución patrón al 3 % de p-anisaldehído y ácido sulfúrico para obtener una solución patrón al 40 % de ácido sulfúrico. El tubo de ensayo se tapa y se incuba en un baño de agua a 60 °C durante 20 minutos y a continuación se coloca en un baño de agua con hielo durante 10 minutos.
La [Fig.6] muestra el espectro de absorbancia de esta solución en el rango de longitudes de onda de 400-800 nm. Se observa el desarrollo de un cromóforo cuyo máximo de absorbancia, se sitúa a 600 nm.
Una segunda solución patrón de escina IB a 2,5 mg.ml-1 en metanol se lleva a cabo en las mismas condiciones. La ecuación de la recta de calibración de la escina IB, establecida a partir de una calibración de estos 2 puntos (5 y 2,5 mg/ml), correspondiente a la absorbancia en función de la concentración (en 10-3 g.l-1) es: y = 0,11092x - 0,0306.
4. Ácido sulfúrico 45 % vol/vol
Se preparó una solución patrón introduciendo en un tubo de ensayo un volumen de 100 pl de una solución patrón de escina IB a 5 mg.ml-1 en metanol. A esta solución patrón se le añade p-anisaldehído para obtener una solución patrón al 3 % de p-anisaldehído y ácido sulfúrico para obtener una solución patrón al 45 % de ácido sulfúrico. El tubo de ensayo se tapa y se incuba en un baño de agua a 60 °C durante 20 minutos y a continuación se coloca en un baño de agua con hielo durante 10 minutos.
La [Fig.7] muestra el espectro de absorbancia de esta solución en el rango de longitudes de onda de 400-800 nm.
Se observa el desarrollo de un cromóforo cuyo máximo de absorbancia se sitúa a 600 nm.
Una segunda solución patrón de escina IB a 2,5 mg.ml'1 en metanol se lleva a cabo en las mismas condiciones. La ecuación de la recta de calibración de la escina IB, establecida a partir de una calibración de estos 2 puntos (5 y 2,5 mg/ml), correspondiente a la absorbancia en función de la concentración (en 10-3 g.l-1) es: y = 0,19128x - 0,0368.
5. Ácido sulfúrico 55 % vol/vol
Se preparó una solución patrón introduciendo en un tubo de ensayo un volumen de 100 pl de una solución patrón de escina IB a 2,5 mg.ml-1 en metanol. A esta solución patrón se le añade p-anisaldehído para obtener una solución patrón al 3 % de p-anisaldehído y ácido sulfúrico para obtener una solución patrón al 55 % de ácido sulfúrico. El tubo de ensayo se tapa y se incuba en un baño de agua a 60 °C durante 20 minutos y a continuación se coloca en un baño de agua con hielo durante 10 minutos.
La [Fig.8] muestra el espectro de absorbancia de esta solución en el rango de longitudes de onda de 400-800 nm. Se observa el desarrollo de un cromóforo cuyo máximo de absorbancia, se sitúa entre 585 y 600 nm.
Una segunda solución patrón de escina IB a 1,25 mg.ml-1 en metanol se lleva a cabo en las mismas condiciones. La ecuación de la recta de calibración de la escina IB, establecida a partir de una calibración de estos 2 puntos (2,5 y 1,25 mg/ml), correspondiente a la absorbancia en función de la concentración (en 10-3 g.l-1) es: y = 0,38856x - 0,0074.
Estos ejemplos comparativos muestran que la mezcla de reacción definida según la presente invención que comprende p-anisaldehído y ácido sulfúrico en una concentración que varía del 40 al 55 % vol/vol en presencia de saponinas permite la formación de un cromóforo cuyo máximo de absorbancia se sitúa entre 580 y 610 nm, en particular, a 600 nm.
Ejemplos 9-determinación del contenido total de saponinas de una muestra de Camellia Oleífera
Los espectros de absorbancia producidos en los Ejemplos 8.3 a 8.5 con soluciones que comprenden respectivamente el 40 %, el 45 % y el 55 % de ácido sulfúrico permitieron obtener 3 curvas patrón.
Entonces la determinación total de saponinas de un extracto de Camellia oleifera se lleva a cabo con 3 muestras de este extracto a diferentes concentraciones de ácido sulfúrico correspondientes al 40 %, 45 % y 55 % vol/vol. Estas determinaciones se llevan a cabo según el protocolo detallado en el apartado "Determinación del contenido total de saponinas en una muestra de Camellia oleifera" del ejemplo 1.
1. Extracto de ácido sulfúrico al 40 %
Una cantidad de extracto se solubiliza en metanol para realizar una solución de 10 mg.ml-1, se colocan 100 pl de esta solución en un tubo de ensayo. A esta solución patrón se le añade p-anisaldehído para obtener una solución patrón al 3 % de p-anisaldehído y ácido sulfúrico para obtener una solución patrón al 40 % de ácido sulfúrico. El tubo de ensayo tapado se incuba en un baño de agua a 60 °C durante 20 minutos y a continuación se coloca en un baño de agua con hielo durante 10 minutos. La absorbancia específica de las saponinas se mide a 600 nm. El valor obtenido representado en la recta de calibración de escina IB realizada en el ejemplo 8.3 permite determinar el porcentaje (masa/masa) equivalente de escina IB en la muestra de Camellia oleifera.
Este ensayo se reproduce dos veces, los resultados se ilustran en la tabla 10.
2. Extracto de ácido sulfúrico al 45 %
Una cantidad de extracto se solubiliza en metanol para realizar una solución de 10 mg.ml-1, se colocan 100 |jl de esta solución en un tubo de ensayo. A esta solución patrón se le añade p-anisaldehído para obtener una solución patrón al 3 % de p-anisaldehído y ácido sulfúrico para obtener una solución patrón al 45 % de ácido sulfúrico. El tubo de ensayo tapado se incuba en un baño de agua a 60 °C durante 20 minutos y a continuación se coloca en un baño de agua con hielo durante 10 minutos. La absorbancia específica de las saponinas se mide a 600 nm. El valor obtenido representado en la recta de calibración de escina IB realizada en el ejemplo 8.4 permite determinar el porcentaje (masa/masa) equivalente de escina IB en la muestra de Camellia oleífera.
Este ensayo se reproduce dos veces, los resultados se ilustran en la tabla 10.
3. Extracto de ácido sulfúrico al 55 %
Una cantidad de extracto se solubiliza en metanol para realizar una solución de 5 mg.ml-1, se colocan 100 j l de esta solución en un tubo de ensayo. A esta solución patrón se le añade p-anisaldehído para obtener una solución patrón al 3 % de p-anisaldehído y ácido sulfúrico para obtener una solución patrón al 55 % de ácido sulfúrico. El tubo de ensayo tapado se incuba en un baño de agua a 60 °C durante 20 minutos y a continuación se coloca en un baño de agua con hielo durante 10 minutos. La absorbancia específica de las saponinas se mide a 600 nm. El valor obtenido representado en la recta de calibración de escina IB realizada en el ejemplo 8.5 permite determinar el porcentaje (masa/masa) equivalente de escina IB en la muestra de Camellia oleífera.
Este ensayo se reproduce dos veces, los resultados se ilustran en la tabla 10.
T l 11
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________________________________________
El porcentaje de saponinas obtenido en el extracto de Camellia oleífera es similar para las diferentes cantidades de ácido sulfúrico. El procedimiento según la presente invención, que implementa especialmente una solución que comprende p-anisaldehído y ácido sulfúrico en una concentración que varía del 40 al 55 % vol/vol permite la determinación del contenido total de saponinas de una muestra a 600 nm.
Ejemplos comparativos 10-Variación de la temperatura
El ejemplo conforme retenido corresponde al ejemplo 9.2 - al 45 % de ácido sulfúrico - con la solución patrón 8.4 como referencia.
Para este ejemplo conforme, las absorbancias obtenidas a 600 nm para Camellia oleífera y escina son 0,51 (ejemplo 9.2) y 0,55 (ejemplo 8.2) respectivamente. Estas absorbancias son similares para las dos soluciones que contienen una cantidad idéntica de saponinas (3 mg/ml). Estos resultados muestran que no se forma interferencia a 600 nm en el extracto de Camellia oleífera con las condiciones cromógenas utilizadas.
Para el ejemplo comparativo 10
Se reproducen los ejemplos 8.4 y 9.2, sin embargo, después de introducir los diversos reactivos en el tubo de ensayo, se tapa y se incuba en baño maría a 90 °C durante 20 minutos.
Las absorbancias obtenidas a 600 nm para Camellia oleífera y escina son 1,28 y 1,05 respectivamente. La absorbancia del extracto de Camellia Oleífera es un 22 % superior con respecto a la solución de escina, lo que indica que se han formado interferencias en este extracto. En estas condiciones de reacción, la determinación no permite una cuantificación precisa de las saponinas.
El procedimiento según la presente invención, que implementa especialmente el calentamiento de la mezcla de reacción a una temperatura que varía entre 45 °C y 75 °C permite la determinación del contenido total de saponinas de una muestra entre 580 y 610 nm, en particular, a 600 nm.
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Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento de determinación del contenido total de saponinas de una muestra, comprendiendo dicho procedimiento al menos las siguientes etapas, en este orden:
(1) realizar una reacción añadiendo a dicha muestra solubilizada en al menos un disolvente, p-anisaldehído y ácido sulfúrico, estando presente el ácido sulfúrico en una cantidad que varía del 40 % al 50 %, más preferentemente igual al 45 %, en volumen con respecto al volumen total de la mezcla de reacción;
(2) calentar la mezcla de reacción a una temperatura que varía de 45 °C a 75 °C, preferentemente que varía de 55 °C a 65 °C, más preferentemente igual a 60 °C, para obtener un cromóforo en solución;
(3) medir la absorbancia de la solución del cromóforo obtenido a una longitud de onda que varía de 580 nm a 610 nm, preferentemente de 590 nm a 605 nm, más preferentemente igual a 600 nm;
(4) realizar una gama de soluciones patrón de saponinas, en las condiciones de reacción de las etapas (1) y (2), es decir, con el mismo disolvente, las mismas cantidades de p-anisaldehído y de ácido sulfúrico, a la misma temperatura, los mismos tiempos de calentamiento a partir de soluciones de un patrón de saponina a diferentes concentraciones, y cuyas absorbancias después de la reacción cromógena se obtienen a la longitud de onda definida en la etapa (3);
(5) cuantificar el contenido de saponinas de la muestra comparando la absorbancia de la solución de cromóforo medida en la etapa (3) con la gama de absorbancias de las soluciones patrón realizadas en la etapa (4).
2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que no incluye una etapa de extracción en fase sólida, ni etapa de extracción líquido-líquido de saponinas de la muestra.
3. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado por que la muestra utilizada en la etapa (1) se solubiliza en un disolvente elegido del grupo que consiste en agua, alcoholes C1-C4 y sus mezclas, preferentemente metanol o etanol y de manera preferente metanol.
4. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que la cantidad de panisaldehído añadido en la etapa (1) varía del 0,1 % al 10 %, preferentemente del 2 % al 5 %, más preferentemente el 3 % en volumen con respecto al volumen total de la mezcla de reacción.
5. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el tiempo de calentamiento de la mezcla de reacción varía de 1 minuto a 60 minutos, preferentemente de 10 minutos a 30 minutos, más preferentemente 20 minutos.
6. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado por que la muestra comprende al menos una parte de al menos una planta con saponinas, preferentemente elegida del grupo formado por Theaceae, las Chenopodiaceae, las Fabaceae, las Agavaceae y sus mezclas y, en particular, Camellia olefeira, Chenopodium quinoa, Trigonella foenum graecum, Yucca schidigera y sus mezclas.
7. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado por que la muestra comprende al menos una parte de al menos un organismo marino, preferentemente elegido del grupo formado por las Echinodermata y las Porifera y sus mezclas, en particular, pepinos de mar, estrellas de mar y esponjas de mar y sus mezclas.
8. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que las saponinas se seleccionan del grupo que consiste en saponinas triterpénicas, saponinas esteroides y sus mezclas.
9. Procedimiento de determinación del contenido total de saponinas de una muestra según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado por que se implementa un procedimiento de determinación del contenido de saponinas esteroides de dicha muestra antes, después o simultáneamente a las etapas (1) a (5), comprendiendo dicho procedimiento de determinación del contenido de saponinas esteroides al menos las siguientes etapas, en este orden:
(i) realizar una reacción añadiendo a dicha muestra solubilizada en al menos un disolvente, p-anisaldehído y ácido sulfúrico, estando presente el ácido sulfúrico en una cantidad que varía del 5 % al 25 %, preferentemente del 10 % al 15 %, más preferentemente igual al 12,5 % en volumen con respecto al volumen total de la mezcla de reacción; (ii) calentar la mezcla de reacción a una temperatura que varía de 45 °C a 80 °C, de manera preferente igual a 60 °C, para obtener un cromóforo en solución;
(iii) medir la absorbancia de la solución del cromóforo obtenido a una longitud de onda que varía de 400 nm a 450 nm, de manera preferente 425 nm:
(iv) realizar una gama de soluciones patrón de saponinas esteroides, en las condiciones de reacción de las etapas (i) y (ii), y cuyas absorbancias después de la reacción cromógena se obtienen a la longitud de onda definida en la etapa (iii);
(v) cuantificar el contenido de saponinas esteroides de la muestra comparando la absorbancia de la solución de cromóforo medida en la etapa (iii) con la gama de absorbancias de las soluciones patrón realizadas en la etapa (iv).
10. Procedimiento de determinación del contenido total de saponinas según la reivindicación 9 caracterizado por que la muestra de la etapa (i) se solubiliza en un disolvente elegido del grupo que consiste en agua, alcoholes C1-C4 y sus mezclas, preferentemente etanol o metanol, de manera preferente etanol.
11. Procedimiento de determinación del contenido total de saponinas según la reivindicación 9 o 10 caracterizado por que la cantidad de p-anisaldehído en la etapa (i) varía del 0,1 % al 2 %, de manera preferente del 0,5 %, en volumen con respecto al volumen total de la mezcla de reacción.
12. Procedimiento de determinación del contenido total de saponinas según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11 caracterizado por que el tiempo de calentamiento de la mezcla de reacción según la etapa (ii) varía de 1 minuto a 60 minutos, preferentemente de 10 minutos a 30 minutos, más preferentemente 20 minutos.
13. Procedimiento de determinación del contenido total de saponinas según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado por que se realiza una etapa preliminar que comprende al menos una extracción de las saponinas de la muestra antes de la etapa (1) y, si está presente, antes de la etapa (i); seleccionándose preferentemente dicha al menos una extracción de las saponinas de la muestra del grupo que consiste en extracciones bajo presión, extracciones por maceración, extracciones por microondas, extracciones por ultrasonidos, extracciones por reflujo, de manera preferente, dicha etapa previa es una extracción de las saponinas de la muestra por ultrasonidos.
14. Procedimiento según la reivindicación anterior caracterizado por que dicha al menos una extracción se lleva a cabo en presencia de un disolvente elegido del grupo que consiste en disolventes acuosos, iónicos, orgánicos y sus mezclas, preferentemente del grupo que consiste en agua, metanol, etanol, acetonitrilo, acetato de etilo y sus mezclas, de manera preferente metanol.
15. Procedimiento de determinación del contenido total de saponinas de una muestra según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14 caracterizado por que dicha muestra comprende saponinas esteroides y saponinas triterpénicas y por que el contenido de saponinas triterpénicas de dicha muestra se determina por diferencia entre el contenido total de saponinas de dicha muestra determinado al final de la etapa (5) y el contenido de saponinas esteroides determinado al final de la etapa (v).
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