ES2936341T3 - Ensayo universal de coagulación basado en un chip de microfluidos - Google Patents

Abstract

Se ha desarrollado un dispositivo de ensayo microfluídico basado en un chip para medir las propiedades físicas de un analito (en particular, sangre entera o derivados de sangre entera). Las tecnologías se pueden aplicar para medir los tiempos de coagulación de sangre entera o derivados de la sangre, determinar los efectos de los fármacos anticoagulantes en la cinética de la coagulación/coagulación, así como evaluar el efecto de los agentes anticoagulantes de reversión. Estas tecnologías pueden utilizarse adicionalmente para optimizar la dosificación de fármacos anticoagulantes y/o sus agentes de reversión. El ensayo es independiente de la presencia de anticoagulante; la coagulación se activa mediante la exposición de la muestra de sangre en el dispositivo a una superficie de vidrio (u otro material con carga negativa, como el silicio oxidado), que activa la vía intrínseca y puede acelerarse aún más mediante la aplicación de un flujo de cizallamiento a través de la superficie de los materiales activadores. La ausencia de agentes activadores químicos y el microambiente altamente controlado y reproducible produce un ensayo de coagulación universal en el punto de atención. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Ensayo universal de coagulación basado en un chip de microfluidos

Referencia cruzada a la solicitud relacionada

La presente solicitud reivindica el beneficio y la prioridad de la Solicitud Provisional de los Estados Unidos número 62/048,183, presentada el 9 de septiembre de 2014.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un dispositivo de ensayo de coagulación universal basado en un chip microfluídico en el punto de atención y a un lector que puede utilizarse para medir el estado de coagulación global de pacientes sanos normales, con problemas de coagulación, anticoagulados, y con anticoagulantes revertidos.

Antecedente de la invención

La coagulación (coagulación) es el procedimiento por el cual la sangre cambia un líquido a un gel. Potencialmente da como resultado hemostasia, el cese de la pérdida de sangre de un vaso dañado, seguido de reparación. El mecanismo de la coagulación implica la activación, adhesión, y agregación de las plaquetas junto con la conversión del fibrinógeno en fibrina, la cual se deposita y madura en una red robusta. Los trastornos de la coagulación son estados de enfermedad los cuales pueden provocar hemorragias o una coagulación obstructiva (trombosis).

La coagulación comienza muy rápidamente después de que una lesión en el vaso sanguíneo haya dañado el endotelio que recubre el vaso. La exposición de la sangre al espacio bajo el endotelio inicia dos categorías de procedimientos: cambios en las plaquetas, y la exposición del factor de tejido subendotelial al Factor VII plasmático, el cual en última instancia conduce a la formación de fibrina. Las plaquetas forman inmediatamente un tapón en el lugar de la lesión; esto se denomina hemostasia primaria. La hemostasia secundaria se produce de manera simultánea: factores de coagulación adicionales o factores de coagulación más allá del Factor VII, responden en una cascada compleja para formar filamentos de fibrina, los cuales refuerzan el tapón de plaqueta.

La cascada de coagulación de la hemostasia secundaria tiene dos vías las cuales conducen a la formación de fibrina. Esta es la vía de activación por contacto (también conocida como vía intrínseca), y la vía del factor de tejido (también conocida como vía extrínseca). Anteriormente se pensaba que la cascada de coagulación consistía en dos vías de igual importancia unidas a una vía común. Actualmente se sabe que la vía primaria para el inicio de la coagulación de la sangre es la vía del factor de tejido. Las vías son una serie de reacciones, en las cuales un zimógeno (precursor enzimático inactivo) de una proteasa de serina y su cofactor glicoproteico se activan para convertirse en componentes activos que luego catalizan la siguiente reacción en la cascada, lo que finalmente resulta en la fibrina reticulada. Los factores de coagulación se indican en general con números romanos, con una “a” minúscula añadida para indicar una forma activa.

Los factores de coagulación son en general proteasas de serina las cuales actúan escindiendo las proteínas posteriores. Existen algunas excepciones. Por ejemplo, el FVIII y el FV son glicoproteínas, y el Factor XIII es una transglutaminasa. Los factores de coagulación circulan como zimógenos inactivos. La cascada de coagulación se divide de manera convencional en tres vías. Tanto la vía del factor de tejido como la vía de activación por contacto activan la “vía final común” del factor X, la trombina y la fibrina.

Vía del factor de tejido (extrínseca)

La principal función de la vía del factor de tejido es generar una “explosión de trombina”, un procedimiento por el cual la trombina, el constituyente más importante de la cascada de coagulación en términos de sus funciones de activación por retroalimentación, se libera muy rápidamente. El FVIIa circula en mayor cantidad que cualquier otro factor de coagulación activado. El procedimiento incluye las siguientes etapas:

Después del daño al vaso sanguíneo, el FVII sale de la circulación y entra en contacto con el factor (FT) de tejido expresado en las células portadoras del factor de tejido (fibroblastos estromales y leucocitos), formando un complejo activado (TF-FVIIa).

El TF-FVIIa activa el FIX y el FX.

El FVII es activado a su vez por la trombina, el FXIa, el FXII y el FXa.

La activación del FX (para formar el FXa) mediante el TF-FVIIa es inhibida casi inmediatamente por el inhibidor de la vía del factor de tejido (TFPI).

El FXa y su cofactor FVa forman el complejo de protrombinasa, el cual activa la protrombina a trombina.

A continuación, la trombina activa otros componentes de la cascada de coagulación, incluidos el FV y el FVIII (los cuales activan el FXI, el cual, a su vez, activa el FIX), y activa y libera el FVIII de su unión al vWF.

El FVIIIa es el cofactor del FIXa, y juntos forman el complejo de “tenasa”, el cual activa el FX; y así continúa el ciclo. (“Tenasa” es una contracción de “ten” y el sufijo “-asa” utilizado para las enzimas)

Vía de activación por contacto (intrínseca)

La vía de activación por contacto comienza con la formación del complejo primario sobre el colágeno por el cininógeno de alto peso molecular (HMWK), la precalicreína, y el FXII (factor de Hageman). La precalicreína se convierte en calicreína y el FXII en FXIIa. El FXIIa convierte el FXI en FXIa. El factor XIa activa el FIX, el cual con su cofactor FVIIIa forma el complejo de tenasa, el cual activa el FX a FXa. La función menor que tiene la vía de activación por contacto en el inicio de la formación de coágulos puede ilustrarse por el hecho de que los pacientes con deficiencias graves de FXII, HMWK, y precalicreína no presentan un trastorno hemorrágico. En cambio, el sistema de activación por contacto parece estar más implicado en la inflamación.

Ensayos de coagulación

Para las pruebas de coagulación se utilizan varias técnicas, incluidas las pruebas basadas en coágulos, los ensayos cromogénicos o de color, las mediciones químicas directas, y las de ELISAs. De estas técnicas, las más utilizadas son los ensayos cromogénicos y los basados en coágulos. Mientras que los ensayos de coagulación proporcionan una evaluación global de la función de coagulación, las pruebas cromogénicas están diseñadas para medir el nivel o la función de factores específicos.

Los ensayos basados en coágulos se utilizan a menudo para la evaluación de pacientes con sospecha de anomalías hemorrágicas y para monitorizar la terapia anticoagulante. La mayoría de estas pruebas utilizan plasma citratado, el cual requiere decenas de minutos para su preparación y típicamente, requieren de horas a días para recibir los resultados en un entorno hospitalario. El punto final de la mayoría de los ensayos de coagulación es la formación de coágulos de fibrina.

El tiempo (PT) de protrombina se realiza añadiendo al plasma un reactivo de tromboplastina que contiene el factor de tejido (el cual puede ser de origen recombinante o derivado de un extracto de cerebro, pulmón, o placenta) y calcio, y midiendo el tiempo de coagulación. El PT varía con el reactivo y el coagulómetro, pero típicamente varía entre 10 y 14 segundos. El PT se prolonga con deficiencias de los factores VII, X, y V, protrombina o fibrinógeno, y por anticuerpos dirigidos contra estos factores. Esta prueba también es anormal en pacientes con inhibidores de la reacción fibrinógeno a fibrina, que incluyen dosis elevadas de heparina y la presencia de productos de degradación de la fibrina. Típicamente, los reactivos de PT contienen un exceso de fosfolípidos de modo que los inhibidores no específicos (es decir, los anticoagulantes lúpicos), los cuales reaccionan con los fosfolípidos aniónicos, no prolonguen el tiempo de coagulación. El PT se utiliza con mayor frecuencia para monitorizar el tratamiento con warfarina. Las mediciones de PT no son comparables entre dispositivos o centros y la mayoría de las clínicas de warfarina desarrollan su propio intervalo normal de pacientes, el cual es intransferible y altamente específico de los reactivos exactos presentes en el ensayo específico utilizado.

El ensayo de Tiempo de Tromboplastina Parcial activado (aPTT) se realiza añadiendo primero un activador de superficie (por ejemplo, caolín, celita, ácido elágico o sílice) y fosfolípido diluido (por ejemplo, cefalina) al plasma citratado. En el punto de atención, el aPTT también puede medirse en sangre total utilizando típicamente agentes activadores químicos similares. El fosfolípido en este ensayo se denomina tromboplastina parcial porque el factor de tejido está ausente. Después de la incubación para permitir la activación óptima de los factores de contacto (factor XII, factor XI, precalicreína, y cininógeno de alto peso molecular), se añade luego calcio, y se mide el tiempo de coagulación. Las mediciones del aPTT no son comparables entre dispositivos u hospitales y la mayoría de los laboratorios clínicos desarrollan su propio intervalo normal de pacientes, el cual es intransferible y altamente específico de los reactivos exactos presentes en el ensayo específico utilizado.

Aunque el tiempo de coagulación varía de acuerdo con el reactivo y el coagulómetro utilizados, el aPTT varía típicamente entre 22 y 40 segundos. El aPTT puede prolongarse con deficiencias de factores de contacto; factores IX, VIII, X, o V; protrombina; o fibrinógeno. Los inhibidores específicos del factor, así como los inhibidores no específicos, también pueden prolongar el aPTT. Los productos de degradación de la fibrina y los anticoagulantes (por ejemplo, heparina, inhibidores directos de la trombina, o warfarina) también prolongan el aPTT, aunque éste es menos sensible a la warfarina que el PT.

El tiempo de coagulación de la trombina (TCT) se realiza añadiendo un exceso de trombina al plasma. El TCT se prolonga en pacientes con niveles bajos de fibrinógeno o disfibrinogenemia y en aquellos con niveles elevados de productos de degradación de la fibrina. Estas anomalías se observan comúnmente con la coagulación intravascular diseminada. El TCT también se prolonga por la heparina y los inhibidores directos de la trombina.

El tiempo de coagulación activado (ACT) es una prueba de coagulación de la sangre total que se realiza en el punto de atención y se utiliza para monitorizar a terapia con dosis altas de heparina o el tratamiento con bivalirudina. La dosis de heparina o bivalirudina necesaria en estos entornos está más allá del intervalo que puede medirse con el aPTT. Típicamente, la sangre total se recoge en un tubo o cartucho que contiene un activador de la coagulación (por ejemplo, celita, caolín, o partículas de vidrio) y una barra de agitación magnética, y luego se mide el tiempo que tarda la sangre en coagular. El valor de referencia para el ACT varía entre 70 y 180 segundos. El intervalo deseable para la anticoagulación depende de la indicación y del procedimiento de prueba utilizado. El ACT no se correlaciona bien con otras pruebas de coagulación.

Para el tiempo de coagulación de la ecarina (ECT), se utiliza el veneno de la serpiente Echis carinatus para convertir la protrombina en meizotrombina, un producto intermedio de la protrombina que es sensible a la inhibición por los inhibidores directos de la trombina. El ECT no puede utilizarse para detectar estados de coagulación alterada y sólo es útil para la monitorización terapéutica de fármacos. Este ensayo es insensible a la heparina ya que el impedimento estérico evita que el complejo heparina-antitrombina inhiba la meizotrombina. Dado que la ecarina también activa la protrombina no carboxilada que se encuentra en el plasma de los pacientes tratados con warfarina, los niveles de inhibidores directos de la trombina se pueden ensayar incluso con tratamiento con warfarina concomitante. Aunque el ECT se ha utilizado en la investigación preclínica, la prueba aún no se ha estandarizado y no está ampliamente disponible.

Los ensayos antifactor Xa se utilizan para medir los niveles de heparina y heparina de bajo peso molecular (LMWH). Estos son ensayos cromogénicos que utilizan un sustrato del factor Xa al cual se ha unido un cromóforo. El factor Xa escinde el sustrato cromogénico, liberando un compuesto coloreado que puede ser detectado con un espectrofotómetro y que es directamente proporcional a la cantidad de factor Xa presente. Cuando se añade una cantidad conocida de factor Xa al plasma que contiene heparina (o LMWH), la heparina mejora la inhibición del factor Xa por la antitrombina, lo que hace que haya menos factor Xa disponible para escindir el sustrato. Al correlacionar este resultado con una curva estándar producida con cantidades conocidas de heparina, se puede calcular la concentración de heparina en el plasma. El uso de ensayos anti-Xa requiere conocer qué anticoagulante está tomando el paciente con el fin de utilizar el calibrador adecuado y no puede utilizarse para monitorizar terapias anticoagulantes anti-IIa.

Los fármacos anticoagulantes de uso clínico incluyen la warfarina, las heparinas (heparina no fraccionada y LMWH), y los inhibidores directos de la trombina (bivalirudina, hirudina y argatroban).

La warfarina es eficaz para la prevención primaria y secundaria del tromboembolismo venoso; para la prevención de eventos cardioembólicos en pacientes con fibrilación auricular o válvulas cardíacas protésicas; para la prevención del ictus, el infarto recurrente, o la muerte cardiovascular en pacientes con infarto agudo de miocardio; y para la prevención primaria del infarto agudo de miocardio en varones de alto riesgo. Debido a la variabilidad en la respuesta anticoagulante a la warfarina, la cual refleja variaciones genéticas en el metabolismo y factores ambientales, tales como los medicamentos, la dieta, y las enfermedades concomitantes, se requiere una monitorización regular de la coagulación y un ajuste de la dosis para mantener el índice Internacional Normalizado (INR) dentro del intervalo terapéutico. Las heparinas son anticoagulantes indirectos que activan la antitrombina y favorecen su capacidad para inactivar la trombina y el factor Xa. Para catalizar la inhibición de la trombina, la heparina se une tanto a la antitrombina a través de una secuencia de pentasacáridos de alta afinidad como a la trombina. En cambio, para favorecer la inhibición del factor Xa, la heparina sólo necesita unirse a la antitrombina a través de su secuencia de pentasacáridos. Las moléculas de heparina que contienen <18 unidades de sacáridos son demasiado cortas para unirse tanto a la trombina como a la antitrombina y, por tanto, no pueden catalizar la inhibición de la trombina. Sin embargo, estos fragmentos de heparina más cortos pueden catalizar la inhibición del factor Xa, siempre que contengan la secuencia de pentasacáridos. La respuesta anticoagulante a la heparina es impredecible debido a la unión no específica variable a las células endoteliales, los monocitos, y las proteínas plasmáticas. Debido a esta respuesta anticoagulante variable, la monitorización de la coagulación se realiza de manera rutinaria cuando se suministra la heparina en dosis mayores a las profilácticas. El aPTT es la prueba más utilizada para monitorizar la heparina. Desafortunadamente, los reactivos de aPTT varían en su capacidad de respuesta a la heparina, y el intervalo terapéutico de aPTT difiere, dependiendo de la sensibilidad del reactivo y del coagulómetro utilizado para la prueba. El aPTT ha demostrado ser más difícil de estandarizar que el PT, y el intervalo terapéutico comúnmente citado de 1,5 a 2,5 veces el valor de control a menudo conduce a la administración sistemática de dosis de heparina subterapéuticas. La evidencia que respalda el concepto de un intervalo terapéutico de aPTT que prediga la eficacia y la seguridad (con respecto a la hemorragia) son algo tenues. Aproximadamente el 25 % de los pacientes requieren dosis de heparina de >35000 U/d para obtener un aPTT terapéutico y se denominan resistentes a la heparina. La mayoría de estos pacientes tienen niveles terapéuticos de heparina cuando se miden con el ensayo anti-Xa, y la discrepancia entre las 2 pruebas es el resultado de altas concentraciones de procoagulantes, tales como el fibrinógeno y el factor VIII, los cuales acortan el aPTT. Aunque la respuesta del aPTT es lineal con niveles de heparina dentro del intervalo terapéutico, el aPTT se vuelve inmensurable con dosis más altas de heparina. Por lo tanto, una prueba menos sensible de la anticoagulación global, tal como el ACT se utiliza para monitorizar el nivel de anticoagulación en pacientes sometidos a intervenciones coronarias percutáneas o cirugía de bypass aortocoronario.

La LMWH se deriva a partir de la heparina no fraccionada mediante despolimerización química o enzimática. La LMWH ha ido sustituyendo gradualmente a la heparina en la mayoría de las indicaciones. La LMWH es típicamente administrada en dosis fijas cuando se administra con fines profilácticos o en dosis ajustadas al peso cuando se administra para el tratamiento. Las dificultades en la monitorización de la LMWH mediante los niveles de anti-factor Xa incluyen poca comparabilidad entre los ensayos cromogénicos anti-Xa disponibles en el mercado, las diferencias en las proporciones de anti-Xa a anti-IIa entre los diversos preparados de LMWH, y la importancia del momento de la toma de muestras de sangre en relación con la dosificación. Aunque el aPTT puede prolongarse con dosis altas de LMWH, este ensayo no se utiliza para la monitorización. Hasta la fecha no se dispone de ningún ensayo clínico en el punto de atención para la monitorización de los millones de pacientes a los que se administra LMWH.

Los inhibidores directos de la trombina se unen directamente a la trombina y bloquean la interacción de la trombina con sus sustratos. En Norteamérica se han autorizado tres inhibidores directos de la trombina parenterales para indicaciones limitadas. La hirudina y el argatroban están aprobados para el tratamiento de pacientes con trombocitopenia inducida por heparina, mientras que la bivalirudina está autorizada como alternativa a la heparina en pacientes sometidos a intervención coronaria percutánea (PCI). La hirudina y el argatroban requieren una monitorización rutinaria. El TCT es demasiado sensible a pequeñas cantidades de hirudina y argatroban para ser utilizado con este fin. Aunque el ACT se ha utilizado para monitorizar las dosis más altas de inhibidores directos de la trombina requeridas en entornos intervencionistas, no proporciona una respuesta lineal óptima a concentraciones elevadas. El aPTT se recomienda para la monitorización terapéutica; sin embargo, cada inhibidor directo de la trombina tiene su propia respuesta a la dosis, y la sensibilidad de la prueba a los niveles del fármaco varía entre los reactivos de aPTT. Cuando la terapia con hirudina se monitoriza con el aPTT, la dosis se ajusta para mantener un aPTT que sea de 1,5 a 2,5 veces el control, mientras que, para el argatroban, el aPTT objetivo es de 1,5 a 3 veces el control (pero sin exceder los 100 segundos). El aPTT parece menos útil en pacientes que requieren dosis más altas de inhibidor directo de la trombina en procedimientos de bypass cardiopulmonar ya que esta prueba se vuelve menos sensible a concentraciones crecientes del fármaco. El ECT parece ser útil tanto para concentraciones bajas como altas de inhibidores directos de la trombina y está menos afectado por sustancias interferentes que el aPTT. Sin embargo, como como se indicó anteriormente, no está disponible de manera rutinaria. La capacidad de respuesta del INR a diferentes concentraciones de fármacos difiere con el reactivo de ensayo y con el tipo de inhibidor directo de la trombina. Esta característica complica la transición de los pacientes con trombocitopenia inducida por heparina de argatroban a antagonistas de la vitamina K.

Como queda claro a partir de lo anterior, la coagulación, y la inhibición de la coagulación, es un procedimiento complejo. El tipo de anticoagulante puede dar resultados engañosos y peligrosos si se determina utilizando un ensayo de coagulación incorrecto. Esto crea un escenario potencialmente desastroso cuando un paciente anticoagulado llega a un servicio de urgencias sin información sobre los medicamentos que está tomando, así como sobre la afección que se está tratando. A veces es imposible esperar a más diagnósticos para determinar el anticoagulante o el trastorno causante de la hemorragia prolongada. La necesidad de una prueba rápida, precisa, y universal para la coagulación, especialmente una prueba en el punto de atención (“POC”), es bien conocida; las opciones, sin embargo, son extremadamente limitadas.

Es por tanto un objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento rápido, preciso y universal para medir el tiempo de coagulación de acuerdo con la reivindicación 1 independiente.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar una prueba de coagulación en el punto de atención.

Aún otro objeto de la presente invención es proporcionar una prueba que sea precisa, reproducible, fácil de operar, y que requiera una cantidad muy pequeña de muestra.

Un sistema conocido para determinar la coagulación en sangre utilizando reactivos precargados en una cámara microfluídica que coopera con una plataforma de chip microfluídico se divulga en el documento US2010248278.

El documento US2011244595 divulga un chip microfluídico para realizar pruebas de coagulación de la sangre para mezclar dos tipos de reactivos, para tratamientos médicos en un entorno hospitalario que comprende un canal (300) microfluídico. El diámetro interno de los canales microfluídicos es lo suficientemente pequeño como para producir una fuerza capilar que impulse la sangre en una entrada (304) y un reactivo en otra entrada (305) para fluir a lo largo de una dirección longitudinal. La sangre es impulsada de manera automática a pasar a través de la porción capilar para absorber el reactivo en una porción (302) de interconexión, y fluye hacia una salida (306).

Sumario de la invención

El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 independiente hace uso de un dispositivo de ensayo basado en chip para medir las propiedades físicas de un analito (en particular, sangre total o derivados de sangre total). Las tecnologías pueden aplicarse, en particular, para medir los tiempos de coagulación de la sangre total o de derivados de sangre, para determinar los efectos de los fármacos anticoagulantes en la cinética de la coagulación, así como para evaluar el efecto de los agentes anticoagulantes reversibles. Estas tecnologías pueden utilizarse de manera adicional para optimizar la dosificación de los fármacos anticoagulantes y/o sus agentes de reversión. El ensayo es independiente de la presencia de anticoagulantes, ya que la coagulación se activa mediante la exposición de la muestra de sangre en el dispositivo a una superficie de vidrio (u otro material cargado negativamente, tal como el silicio oxidado), la cual activa la vía intrínseca y puede acelerarse aún más mediante la aplicación de flujo cortante a través de la superficie de materiales activadores. La ausencia de agentes activadores químicos y el microentorno altamente controlado y reproducible permiten realizar un ensayo universal de coagulación en el punto de atención.

La muestra se manipula en un sistema microfluídico. El volumen de la muestra introducida en la cámara de pruebas está en el intervalo de nano, micro, o mililitros (preferentemente de 1 a 10 microlitros). La muestra se introduce en el pocillo de recogida directamente a partir de una muestra de sangre o del individuo (tal como, de un pinchazo en el dedo). La muestra, tal como la sangre o el plasma, puede recogerse y transferirse al microdispositivo calentado inmediatamente después de la recogida mediante una jeringa en un tubo de punta roja sin aditivos o en un tubo capilar. La coagulación en las muestras, preferentemente por duplicado, se inicia mediante la exposición de la sangre o el plasma a la superficie de vidrio dentro del dispositivo y la muestra expuesta a los medios para el análisis de la coagulación. A continuación, la muestra de sangre se extrae del pocillo de recogida en la cámara de pruebas, ya sea de manera pasiva por acción de capilaridad o con una bomba, la cual induce la transparencia y expone la muestra de sangre a la superficie de materiales activadores, a la vez que entrega una cantidad geométricamente controlada de la muestra de sangre en la cámara de pruebas. El sistema microfluídico, junto con los electrodos integrados, las estructuras de calentador u otras partes de sensores o actuadores, está diseñado para ser desechable. El sistema microfluídico se inserta en una carcasa analítica reutilizable (denominada en la presente memoria “ lector”) que forma parte de un instrumento de análisis, el cual conecta el sistema microfluídico y proporciona interfaces fluídicas, eléctricas, ópticas y térmicas para medir la coagulación y transmitir el tiempo y las características de la medición a un lector, monitor, o registrador externo.

La coagulación se evalúa mediante un cambio en la viscosidad, la transmisión óptica, la impedancia eléctrica, y/o la presión. En la realización preferente, la coagulación se detecta a través de la medición de la impedancia de la sangre a través de electrodos integrados y/o a través de la medición de la transmisión óptica utilizando LEDs infrarrojos (IR) y fotodiodos, respectivamente. Una estructura integrada de calentador/enfriador térmico resistivo, tal como una bomba de calor de estado sólido o un enfriador Peltier, mantiene la muestra de sangre a una temperatura definida, preferentemente a aproximadamente 37 °C (temperatura corporal), y garantiza la repetibilidad y comparabilidad de las mediciones. A medida que el fibrinógeno se convierte en fibrina, la absorbancia de IR aumenta hasta alcanzar un pico de una manera medible. La determinación del tiempo de coagulación de la sangre total se realiza en o alrededor del pico de absorbancia de IR. Después de finalizar las mediciones, el chip microfluídico que contiene la muestra de sangre se retira del lector y se desecha.

El desarrollo de la coagulación se puede monitorizar midiendo la impedancia eléctrica. El desarrollo de la fibrina aumenta la impedancia eléctrica hasta alcanzar un pico de una manera medible. Sobre o alrededor del pico de impedancia eléctrica, se realiza la determinación del tiempo de coagulación de la sangre total. El tiempo de coagulación de la sangre total puede medirse mediante absorción de IR e impedancia eléctrica medidas sola o de manera simultánea como base de comparación. Las curvas de impedancia eléctrica y absorción de IR son esencialmente coincidentes, y proporcionan confirmación mediante modos de medición independientes.

El sistema microfluídico puede fabricarse a través de la aplicación de microtecnologías y el procesamiento y unión de obleas de silicio, vidrio u otros materiales adecuados. El sistema microfluídico también puede fabricarse a través de medios alternativos, por ejemplo, a través de la aplicación de tecnologías de litografía blanda o a través de la generación de partes de lector (hechas, por ejemplo, de plástico o de un material diferente adecuado, sustancialmente opaco a los IR) los pueden utilizarse solos o en combinación con chips con micropatrones para formar un sistema microfluídico. El sistema microfluídico consiste típicamente en una entrada, una salida y una o más cámaras que están conectadas a través de canales, cuyo intervalo en longitud está a partir de decenas de micrómetros a milímetros, con alturas y profundidades en el intervalo de decenas de micrómetros a cientos de micrómetros.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un esquema de la cascada de coagulación.

La Figura 2B es una vista en sección transversal del dispositivo microfluídico en el cual se pipetea sangre en una cámara y, luego, se inserta el chip en el embalaje.

La Figura 2A es una vista en sección transversal de un ejemplo del dispositivo microfluídico en el que se puede introducir la sangre a través del lado de la cámara; el “cazo” sobresale del lector, similar a la medición de la glucosa en sangre.

La Figura 3A es una vista de la versión abierta de los dos dispositivos de cámara de muestras.

La Figura 3B es una vista de la versión cerrada de los dos dispositivos de cámara de muestras. Las Figuras 4A-4H son vistas de las cámaras que muestran las cámaras, los canales de conexión, las almohadillas de contacto eléctrico, y los termistores.

La Figura 5 es una vista en perspectiva a partir de la parte superior de la parte inferior del lector en versión cerrada.

La Figura 6 es una vista en sección transversal del lado de la parte inferior del lector en versión cerrada. La Figura 7 es una vista en sección transversal en perspectiva de la parte superior del lector en versión cerrada que muestra el dispositivo de ensayo de la muestra en su lugar.

La Figura 8 es una vista en sección transversal en perspectiva a partir de la parte superior de la parte superior del lector en versión cerrada.

La Figura 9A es una vista en sección transversal en perspectiva a partir de la parte superior de la parte inferior del lector en versión abierta.

La Figura 9B es una vista en sección transversal en perspectiva a partir del lado de la parte inferior del lector en versión abierta.

La Figura 10A es una vista en sección transversal en perspectiva a partir del lado y la parte inferior de la parte superior del lector en versión abierta.

La Figura 10B es una vista en sección transversal en perspectiva a partir del lado y la parte superior de la parte superior del lector en versión abierta.

La Figura 11 es un esquema del sistema, que muestra una caja que contiene las cámaras de ensayo desechables de un solo uso, el lector, y las conexiones a un procesador de ordenador y a un monitor. Las Figuras 12A-12F son gráficos de la impedancia (12A, 12C, y 12E) y la transmisión infrarroja (12B, 12D, 12F) a lo largo del tiempo en minutos para el control sin anticoagulante, 300 ng de edoxaban anticoagulante/ml de sangre, y 300 ng de edoxaban y ciraparantag (PER977; un agente anticoagulante reversible)/ml de sangre, respectivamente.

Descripción detallada de la invención

I. Definiciones

Microfluídicos

La microfluídica es un campo altamente interdisciplinario, que se basa en la ingeniería, la física, la química, la bioquímica, la micro/nanotecnología, y la biotecnología. En un sistema microfluídico se manipulan típicamente pequeños volúmenes de líquido, que van desde femto a mililitros. Los procedimientos de fabricación de un sistema microfluídico permiten típicamente la integración de sensores y/o actuadores, de modo que los líquidos puedan transportarse, manipularse y analizarse de manera eficaz dentro del sistema microfluídico. Las interfaces entre el sistema microfluídico y su entorno permiten implementar mecanismos externos de transporte, manipulación y análisis. Micro-/Nanotecnologías

Las micro/nanotecnologías se utilizan típicamente para fabricar microsistemas, que incluyen sistemas microfluídicos. Las micro/nanotecnologías permiten típicamente la generación de estructuras con dimensiones en el intervalo micro o nanométrico. Tales tecnologías pueden ser en base a tecnologías de procesamiento de obleas de silicio, desarrolladas originalmente para la fabricación de circuitos electrónicos integrados.

Acción capilar

Una forma conveniente de cargar una muestra líquida en un sistema microfluídico es por acción capilar. Un puerto de recogida de muestra se humedece con la muestra y ésta se introduce de manera eficaz en los estrechos canales hidrofílicos y cámaras del sistema microfluídico mediante fuerzas capilares.

Anticoagulante

Un anticoagulante es una sustancia que interfiere con la capacidad de coagulación de la sangre. Administrado como fármaco terapéutico, un anticoagulante puede, por ejemplo, ayudar a reducir o evitar la aparición de émbolos o trombos potencialmente peligrosos para la salud y/o la vida.

Agente anticoagulante reversible

Un agente anticoagulante reversible puede administrarse como fármaco terapéutico con el fin de revertir de manera parcial o totalmente el efecto de un anticoagulante. El restablecimiento de la capacidad de coagulación de la sangre puede salvar vidas; por ejemplo, un paciente que toma un anticoagulante y sufre una lesión grave puede ser tratado con un reactivo reversible para restablecer la capacidad de coagulación de la sangre y evitar una pérdida excesiva de sangre.

“Dispositivos” “abiertos” y “cerrados”

Un dispositivo “abierto” tiene un canal hacia el exterior a partir de una cámara interior, permitiendo el acceso directo de la sangre a la cámara. Un dispositivo “cerrado” no tiene canales exteriores, y se llena antes de sellarse al exterior, excepto por los pequeños orificios asociados con los sensores, electrodos, LEDs, y otros elementos utilizados para evaluar la coagulación dentro de la cámara. La “versión abierta” del sistema microfluídico está diseñada de modo que el chip pueda ser insertado primero en su embalaje, calentarse, pero seguir siendo accesible (abierto). Se puede cargar una muestra en el sistema a través de la humectación del puerto lateral, con el chip residiendo ya en su embalaje. La muestra se introducirá en el chip por las fuerzas capilares.

La “versión cerrada” del sistema microfluídico no será accesible al usuario una vez colocado en su embalaje. Una muestra tiene que ser cargada en el sistema antes de colocar el chip en su embalaje, a través de la humectación de o pipeteando uno de los puertos del lado posterior.

II. Dispositivo

El chip microfluídico y su lector se muestran en las Figuras 2-10, con el sistema que incluye ambas partes reflejado en la Figura 11. Como se indica en las Figuras 2A y 2B, los chips 10 microfluídicos se fabrican a través del grabado húmedo anisotrópico de obleas de silicio y posteriormente la oxidación térmica, grabado húmedo isotrópico de obleas de PYREX® (un vidrio de borosilicato transparente de baja expansión térmica), deposición por pulverización catódica de películas metálicas finas en ambas obleas a través de plantillas, unión anódica de obleas de silicio y PYREX®, y posteriormente separación de chips individuales mediante corte en dados de obleas.

Los chips microfluídicos pueden fabricarse por medios alternativos, utilizando cualquier procedimiento que sea adecuado para generar estructuras microfluídicas y cualquier material cargado negativamente que sea adecuado para activar la cascada de coagulación de la sangre.

Las dimensiones de la sección transversal y las geometrías de las cámaras 12a y 12b y el canal 14 que conecta las cámaras pueden modificarse, y el número de cámaras puede variar. La relación superficie/volumen influirá globalmente en el tiempo de coagulación. El acceso a las cámaras es directo (“cerrado”, Figura 2B), previo al sellado del dispositivo de cámara, o a través de un canal 16 lateral que permite el acceso desde el exterior de las microcámaras.

Como se muestra mediante las Figuras 3A y 3B, los chips están diseñados para permitir:

- Calentamiento a través de la resistencia del lado posterior o estructura de calentador eléctrica (en el lado inferior de las cámaras 12a y 12b)

- Medición de la temperatura para el control del calentamiento a través del termistor 18 del lado superior (exterior)

- Detección de coágulos a través de las mediciones de la presión atmosférica

- Detección de la coagulación a través de la medición de la impedancia a través de la muestra de sangre a través de electrodos 20a incrustados y almohadillas 20b de contacto

- Detección de la coagulación a través de las mediciones ópticas

Como se muestra en las Figuras 4A-4H, las estructuras 22 de resistencia se depositan en la parte posterior de una oblea 24 de silicio (para formar estructuras 32 de calentamiento resistivas, Figuras 4G, 4H), en el lado 26 frontal de la oblea de silicio (para formar electrodos 20a, 20b para mediciones de impedancia y termistores 18, respectivamente, en el suelo de cada cámara), y en el lado frontal de la oblea PYREX® (para formar termistores 18 en la parte superior de una o ambas cámaras 12a, 12b). El calentador y el termistor pueden ser externos al “chip” e integrarse en la estructura del lector. Si las paredes de la cavidad en la cual se coloca el chip tienen una masa significativamente mayor que la del chip, son altamente conductoras térmicamente, y forman un entorno casi completo, luego la cavidad se aproxima a un “cuerpo negro” y el chip debe alcanzar el equilibrio térmico con la cavidad. Si el chip está en contacto con la cavidad, o estrechamente espaciado, la constante de tiempo de equilibrio puede ser muy corta. Esto puede establecerse mediante la medición del pirómetro durante el desarrollo. Esto debería reducir la complejidad de la parte desechable del sistema, y el coste. El canal 14 de conexión y el puerto 36 de entrada pueden grabarse utilizando hidróxido de potasio (KOH) en la oblea 26 de silicio.

El dispositivo de las Figuras 2B, 3B (denominado “dispositivo cerrado”) tiene dos puertos 28a, 28b de entrada grabados a través de la parte 30 de silicio. Se puede pipetear una muestra en uno de los puertos 28a, 28b antes de insertar el dispositivo 10 en un embalaje sellado. El dispositivo de las Figuras 2A, 3A tiene un puerto 28b de entrada grabado a través de la parte de silicio y un puerto 16 de entrada lateral, realizado como canal grabado en el PYREX® (denominado “dispositivo abierto”). En los casos de un sustrato de silicio, la estructura de onda de superficie puede integrarse directamente en el diseño microfluídico mediante técnicas de microfabricación bien conocidas. Un chip de dispositivo abierto (Figuras 2A, 3A) puede insertarse primero en un embalaje sellado y/o en un lector, con el borde con el puerto lateral sobresaliendo del lector. La humectación del puerto 16 lateral dará como resultado que la muestra se introduzca en la cámara 12a por acción de capilaridad.

El sistema combinado de control del calentador/enfriador y el termistor pueden ser externos al “chip”, y pueden estar integrados en la estructura del lector. Si las paredes de la cavidad, en la cual se coloca el chip tienen una masa significativamente mayor que la del chip, son altamente conductoras térmicamente, y forman un entorno casi completo, luego la cavidad se aproxima a un “cuerpo negro” y el chip debe alcanzar el equilibrio térmico con la cavidad. Si el chip está en contacto con la cavidad, la constante de tiempo de equilibrio puede ser muy corta. Esto puede establecerse mediante la medición del pirómetro durante el desarrollo. Esto reduciría la complejidad de la parte desechable del sistema y (se espera) el coste.

Los paquetes de chips o “ lectores”, como se muestra en las Figuras 5-10, proporcionan interfaces eléctricas, ópticas y fluídicas al chip. Un lector consiste en una parte inferior (Figuras 5, 6, 9A, 9B) y una parte superior (Figuras 7, 8, 10A, 10B) que se fabrican mediante impresión 3D de alta precisión, moldeo, mecanizado, u otros procedimientos de fabricación. Ambas piezas se unen y presionan entre sí mediante el bloqueo de pasadores de metal que encajan en los orificios 56. El lector puede incluir medios de visualización, almacenamiento de información, y capacidad de comunicación.

Las Figuras 5 y 6 muestran la parte 50 de lector inferior para el chip de dispositivo cerrado a partir de dos ángulos diferentes. Los canales 52a, 52b, situados en el rebaje 54, en el interior del lector conectan las cámaras 2 y 1, respectivamente, a los puertos de entrada del chip. En un lado del lector, una válvula solenoide (no se muestra) puede fijarse al lector en los extremos 58 del canal para controlar la conexión entre el canal del lector y un conector de tubo de púas que se enrosca en la parte inferior del lector. En el lado opuesto, se puede fijar un sensor de presión (no se muestra) al lector en los orificios 60 para monitorizar la presión aplicada al canal del lector y al puerto de entrada del chip. Cada puerto 62a, 62b de entrada está controlado/monitorizado por su propia válvula solenoide/sensor de presión asegurado en los orificios 70a, 70b, 70c y 70d. La parte inferior del lector presenta un rebaje 54 para el chip microfluídico. Los pequeños orificios 64a, 64b verticales sostienen los pasadores pogo para entrar en contacto con la estructura de calentador en la parte inferior del chip. Un orificio 66 en el centro de la parte de lector aloja un chip IR LED en un lector de lata de metal, el cual pasa a lo largo de la trayectoria 68 de la luz.

Los componentes IR pueden moldearse o integrarse en forma de “chipstrato”.

Aunque se muestra como una medición óptica de un solo punto, podría utilizarse una medición óptica multipunto.

Las Figuras 7 y 8 muestran la parte 80 de lector superior para el chip de dispositivo cerrado a partir de dos ángulos diferentes. El orificio 82 grande (por ejemplo, de 5 mm) en el centro sostiene un chip fotodiodo IR (no se muestra) en un lector de lata de metal que dirige la luz a través del orificio 86. Tres pequeños orificios 84 verticales (por ejemplo, de menos de un mm) alojan tres pasadores pogo (no se muestra) para poner en contacto tres electrodos para mediciones de impedancia (un electrodo de tierra común para ambas cámaras y un contraelectrodo en cada cámara), de modo que se puedan llevar a cabo mediciones de impedancia en ambas cámaras. Otros dos orificios 88 verticales sostienen pasadores pogo para entrar en contacto con el termistor en la parte superior del chip. Otras realizaciones de estos dispositivos son conocidos y fácilmente disponibles para la misma función. El IR LED y el fotodiodo se colocan de modo que interroguen la región central de 1 mm de diámetro de una cámara.

El propio lector de chips está fijado a la cubierta de una caja 100 de proyecto que contiene los circuitos electrónicos, válvulas, y bombas necesarios para realizar mediciones automatizadas, como se muestra en la Figura 11. La caja 100 de proyecto está conectada a un PC 102 donde las mediciones son controladas por un programa LabView y un procesador 110, y los resultados se muestran en el monitor 104.

Las Figuras 9A y 9B muestran la parte 120 de lector inferior para el chip de dispositivo abierto a partir de dos ángulos diferentes. Los orificios para pasadores 122 de espiga se utilizan para asegurar el dispositivo. Los canales 124 del interior del lector conectan las cámaras 2 y 1, respectivamente, a los puertos de entrada del chip. En un lado del lector, una válvula solenoide (no se muestra) puede fijarse al lector en los extremos del canal para controlar la conexión entre el canal del lector y un conector de tubo de púas que se enrosca en la parte inferior del lector. En el lado opuesto, un sensor de presión (no se muestra) puede ser fijado al lector en los orificios 126a, 126b para monitorizar la presión aplicada al canal del lector y al puerto de entrada del chip. Cada puerto de entrada está controlado/monitorizado por su propia válvula solenoide/sensor de presión asegurado en los orificios. La parte inferior del lector presenta un rebaje 128 para el chip microfluídico. Un orificio 130 en el centro de la parte de lector sostiene un chip IR LED en un lector de lata de metal.

Las Figuras 10A y 10B muestran la parte 140 de lector superior para el chip de dispositivo abierto a partir de dos ángulos diferentes. El orificio 142 grande (por ejemplo, de 5 mm) en el centro sostiene un chip fotodiodo IR (no se muestra) en un lector de lata de metal que dirige la luz a través del orificio 144. Tres pequeños orificios 146 verticales (por ejemplo, de menos de un mm) alojan tres pasadores pogo (no se muestra) para poner en contacto tres electrodos para mediciones de impedancia (un electrodo de tierra común para ambas cámaras y un contraelectrodo en cada cámara), de modo que se puedan llevar a cabo mediciones de impedancia en ambas cámaras. Otros dos orificios 148 verticales sostienen pasadores pogo para entrar en contacto con el termistor en la parte superior del chip. El IR LED y el fotodiodo se colocan de modo que interroguen la región central de 1 mm de diámetro de una cámara.

Aunque se describe con referencia a la interrogación de ambas cámaras con un haz, es posible interrogar ambas cámaras utilizando haces separados. Se muestra un haz sólo con fines de ilustración.

El lector de chips se fija a la placa de cubierta de una caja de proyecto como se ha descrito anteriormente utilizando orificios 150 para tornillos, como se muestra en la Figura 11.

A. Superficies para la activación de la coagulación de la sangre

El sistema microfluídico se fabrica de modo que la muestra de sangre o plasma introducida esté en contacto con una superficie de vidrio, la parte superior del chip microfluídico y/o la superficie de la parte inferior del chip microfluídico, formada por un material, tal como PYREX® o silicio oxidado térmicamente, tal como SiO2 amorfo, óxido de silicio, y nitruro de silicio. El vidrio sirve para activar la cascada de coagulación sin necesidad de utilizar reactivos químicos o biológicos adicionales. La activación se logra a través del mero contacto de la muestra con la superficie de vidrio o a través del movimiento activo (por ejemplo, a través de un pulso de presión de aire aplicado externamente) de la muestra a lo largo de las superficies de vidrio dentro del sistema microfluídico.

El sistema microfluídico se fabrica de modo que la muestra de sangre o plasma introducida esté en contacto con superficies de vidrio (u otras superficies cargadas negativamente), las cuales sirven para activar la cascada de coagulación sin necesidad de utilizar reactivos químicos o biológicos adicionales. Las superficies de vidrio se generan a través del uso de obleas de vidrio y obleas de silicio oxidado, respectivamente, para la fabricación de sistemas microfluídicos. De manera alternativa, las superficies de vidrio pueden realizarse a través del uso de chips de vidrio que se integran en las partes de lector que forman un sistema microfluídico, a través de la deposición de vidrio en las superficies internas del sistema microfluídico (por ejemplo, a través del uso de productos de vidrio enroscables) o a través de la integración de pequeños objetos con superficies de vidrio (por ejemplo, microesferas de vidrio) dentro del sistema microfluídico. Además, las superficies de vidrio pueden introducirse por la oxidación de las superficies de silicio.

B. Características eléctricas de las películas finas de metal depositadas

Las películas finas de metal depositadas pueden estar formadas por capas de adherencia de cromo (de aproximadamente 20 nm de espesor) y capas superiores de oro (de aproximadamente 50 nm de espesor para los electrodos internos para las mediciones de impedancia, 100 nm de espesor para los termistores y 150 nm de espesor para las estructuras de calentador). Se utilizaron pasadores pogo con resorte en el lector de plástico para realizar contactos eléctricos con todos los electrodos de película fina en el chip microfluídico. Las resistencias típicas entre dos pasadores conectados a cualquiera de los extremos de una estructura de prueba de película de metal, con una longitud aproximada de 2 mm y un ancho de 1 mm, son de 1,8 Ohm, con pasadores en contacto con películas de metal para estructuras de calentador, 2,7 Ohm, en contacto con películas de metal para termistores, y 22 Ohm, en contacto con películas de metal para electrodos internos para mediciones de impedancia. La resistencia notablemente superior entre los pasadores de electrodo interno se deben probablemente a una capa de oro más fina y, posiblemente, a la degradación de los contactos durante la unión anódica a aproximadamente 300 °C. Las estructuras de calentador y los termistores se depositan después de la unión anódica.

Para la medición de los coeficientes de temperatura de las resistencias de las películas finas de metal depositadas, se utilizó un chip que presentaba estructuras de resistor/termistor en lugar de electrodos de circuito abierto para las mediciones de impedancia. El chip se insertó en su lector y se calentó dentro de un horno. Se midieron las resistencias eléctricas del calentador, el termistor y las resistencias del electrodo interno a diferentes temperaturas y se calcularon los coeficientes de temperatura de las resistencias a:

película fina del calentador: a = 0,0016 K1

termistores de película fina: a = 0,00115 K-1

película fina de electrodo interno: a = 0,000108 K-1

C. Electrodos internos para el posicionamiento de la muestra

Aparte de las mediciones de impedancia, los electrodos integrados también pueden utilizarse para detectar la presencia del analito, tal como la fibrina, en el sistema microfluídico y/o para el seguimiento del movimiento del analito, por ejemplo, debido a pulsos de presión de aire aplicados externamente. Tal detección y seguimiento pueden utilizarse para iniciar el procedimiento de análisis una vez que el analito se añade al sistema microfluídico, para posicionar el analito en una ubicación específica dentro del sistema microfluídico, y para moverlo repetidamente hacia delante y hacia atrás entre ubicaciones definidas, respectivamente.

Aunque se ejemplifica con referencia a dos cámaras y dos electrodos, se pueden utilizar múltiples electrodos para confirmar el llenado de múltiples cámaras, en el lugar de medición de la coagulación o en un punto anterior a la cámara donde se mide la coagulación, tal como más cerca de la entrada. El movimiento repetido de sangre total o plasma de sangre a lo largo de las superficies de vidrio puede aplicarse para aumentar la activación de la sangre, acelerar la coagulación de la sangre y/o disminuir los tiempos de medición.

D. Integración de estructuras de filtro

Se pueden integrar estructuras mecánicas de filtrado en el chip microfluídico, de modo que sólo llegue plasma de sangre a las cámaras de análisis. Los filtros pueden realizarse como un conjunto de micropilares o como microcanales grabados en silicio o vidrio. De este modo, el plasma (sin utilizar un anticoagulante, tal como el citrato de sodio o el EDTA) puede ser producido in situ y testeado muy rápidamente del mismo modo que la sangre total, sin que los glóbulos rojos interfieran en el análisis. Los conjuntos de micropilares pueden disponerse en patrones desplazados para inhibir el tránsito de glóbulos rojos, a la vez que minimizan la probabilidad de “taponar” una fracción excesiva de la sección transversal disponible del canal.

E. Medios para la detección de coagulación

Se puede aplicar una variedad de modalidades para determinar los tiempos de coagulación de la sangre.

Viscosidad

La viscosidad de la sangre puede servir como medida para caracterizar los tiempos de coagulación. Se pueden aplicar dos principios generales para obtener una medida directa o indirecta de la viscosidad. La muestra puede moverse a través de un canal de geometría conocida. La viscosidad puede medirse siguiendo la tasa de penetración a través de un canal “ largo”, ya sea ópticamente o mediante imágenes o “puntos de control” de haces múltiples, o eléctricamente mediante sensores de impedancia de electrodos múltiples. La viscosidad puede medirse indirectamente, por ejemplo a través de la medición de la distancia que la muestra ha recorrido dentro de un canal durante un intervalo de tiempo específico, el volumen de muestra que se ha desplazado durante un tiempo específico interno, o el cambio en la fuerza impulsadora durante un intervalo de tiempo específico (por ejemplo, si la muestra se mueve por un volumen presurizado de aire atrapado, el cambio en la presión del aire puede servir como una medida indirecta para el desplazamiento del volumen de muestra). De manera alternativa, se pueden mover objetos a través de la muestra de sangre, por ejemplo, impulsados a través de las fuerzas electrostáticas o magnéticas. El seguimiento del movimiento del objeto puede proporcionar una medida indirecta de la viscosidad de la muestra.

La viscosidad del analito puede ser detectada a través del movimiento del analito dentro del sistema microfluídico a través de un volumen de aire presurizado y atrapado. El aire puede presurizarse, por ejemplo, a través de bombas eléctricas de aire conectadas al sistema microfluídico. El aire presurizado puede ser atrapado a través del cierre de válvulas solenoides conectadas al sistema microfluídico. La disminución de la presión del aire atrapado en un puerto de entrada del chip indica el movimiento del analito. El conocimiento de la geometría del sistema microfluídico y de la magnitud de la presión aplicada permite calcular la viscosidad del analito y detectar cambios de viscosidad (por ejemplo, un aumento de la viscosidad debido a la coagulación en el caso de la sangre).

La detección de coágulos mediante la monitorización de la viscosidad implica la medición de la presión diferencial a través de una entrada y una salida en el chip, conectadas a puertos fluídicos en el lector (hecho hermético al aire/fluido utilizando sellos de junta tórica).

La viscosidad del analito puede ser detectada a través del movimiento del analito dentro del sistema microfluídico a través de un volumen de aire presurizado y atrapado. El aire puede presurizarse, por ejemplo, a través de bombas eléctricas de aire conectadas al sistema microfluídico. El aire presurizado puede ser atrapado a través del cierre de válvulas solenoides conectadas al sistema microfluídico. La disminución de la presión del aire atrapado en un puerto de entrada del chip indica el movimiento del analito. El conocimiento de la geometría del sistema microfluídico y de la magnitud de la presión aplicada permite calcular la viscosidad del analito y detectar cambios de viscosidad (por ejemplo, un aumento de la viscosidad debido a la coagulación en el caso de la sangre).

Impedancia

La coagulación de una muestra puede estar relacionada con su impedancia eléctrica, o su resistencia compleja cuando se aplica una corriente eléctrica o una tensión. La impedancia eléctrica es el resultado de las resistencias óhmicas, así como de los componentes capacitivos de la muestra. La impedancia eléctrica puede, por ejemplo, medirse a través de electrodos integrados directamente en el chip microfluídico o integrados en el lector que forma, junto con otras partes, un sistema microfluídico. Los electrodos pueden estar parcialmente en contacto directo con la muestra o separados de ella sólo a través de un fino aislante (con un espesor que varía entre nanómetros a cientos de micrómetros).

Los electrodos y las líneas conductoras pueden formarse como películas de metal finas con patrón que se depositan sobre los sustratos que forman el sistema microfluídico. Los electrodos y las líneas conductoras también pueden realizarse a través de la integración de láminas o películas de metal con patrón que se insertan y se intercalan entre las partes de lector. Si se utilizan obleas semiconductoras para fabricar chips microfluídicos, el propio material semiconductor puede contener electrodos integrados fabricados por difusión, implantación, grabado, micromecanizado, o cualquier combinación de técnicas adecuadas similares a las técnicas utilizadas en la producción de circuitos integrados u otros microdispositivos. Los electrodos integrados pueden utilizarse para medir directamente las propiedades eléctricas del analito (por ejemplo, resistencia, capacitancia, impedancia). También se pueden utilizar circuitos electrónicos adecuados para traducir los cambios del analito (y los cambios relacionados en las propiedades eléctricas) en tensiones eléctricas, corrientes, frecuencias u otros parámetros adecuados que se pueden medir. Las partes también pueden insertarse durante la construcción mediante impresión 3D, o integrarse directamente. Por ejemplo, un elemento de calentamiento de resistencia se fabricaría mediante un canal dopado en un sustrato semiconductor (por ejemplo, por implantación de haces de iones).

La detección de coágulos mediante la monitorización de la impedancia se lleva a cabo insertando el chip en el lector, haciendo contacto entre las almohadillas de oro (conectadas a los electrodos del chip) y los pasadores Pogo en el lector, a partir de los cuales se lee la señal eléctrica mediante un medidor LCR, por ejemplo, o cualquier otro sistema de medición adecuado.

Para la detección de la coagulación a través de la medición de impedancias, se carga una muestra en el chip, se inserta el chip en su lector, y los pasadores pogo que se conectan a los electrodos de impedancia internos conectados a través de un clip Kelvin conducen a un medidor LCR QuadTech 1920. La magnitud y la fase de la impedancia compleja de la muestra de sangre se registraron en intervalos de 15 segundos. Las mediciones a 100 Hz, 1 kHz, 10 kHz, y 100 kHz mostraron picos o mesetas característicos de la magnitud, la fase o ambas. Los picos o mesetas indicaban una medida del tiempo de coagulación.

Con referencia a las Figuras 3A-3B, para las mediciones de impedancia, el medidor LCR externo aplica una tensión CA (20 mV RMS) entre los dos electrodos 20b, 20a a cada lado de la cámara 12a, y mide la corriente eléctrica entre los electrodos. A continuación, se computan la magnitud y la fase de la impedancia y se calcula la coagulación.

Propiedades ópticas

Las propiedades ópticas de la muestra pueden relacionarse con los eventos de coagulación. La luz con longitud de onda en el intervalo de 500 nm a 10,000 nm (preferentemente 1,300 nm) se puede utilizar para iluminar la muestra a través del lector microfluídico y chips. Para el seguimiento de la coagulación se pueden utilizar los siguientes parámetros: luz transmitida, reflejada y dispersa. Si se utiliza una fuente de luz coherente, se puede utilizar la polarización como parámetro adicional.

La detección de coágulos por transmisión IR se realiza insertando el chip en el lector y midiendo la transmisión infrarroja a través del espesor del chip (a través del vidrio, la cámara de llenado de fluido, y el silicio subyacente). Esto se consigue a través de la colocación de una fuente IR (LED) encima del chip y un detector fotodiodo alineado inmediatamente debajo.

Para la detección óptica de coágulos, el IR LED y el fotodiodo se insertan en sus partes de lector como se ha descrito anteriormente. Se pipetea una muestra de sangre en el chip y éste se coloca en el lector. La muestra se ilumina continuamente con luz IR a 1,300 nm. A intervalos de tiempo de típicamente 100 ms, se registró la caída de tensión a través de una resistencia de 1 MOhm causada por la fotocorriente del fotodiodo. Las tensiones típicamente miden varios voltios. La coagulación de la muestra hizo que la luz transmitida y la fotocorriente variaran a lo largo del tiempo. Los picos característicos de la curva de luz transmitida indicaban una medición del tiempo de coagulación.

La medición de la iluminación continua se presenta como una simple ilustración. Pueden utilizarse técnicas de medición más sofisticadas. Por ejemplo, si el emisor IR se iluminara durante el 50 % de su duración, a una tasa de repetición de 1 kHz, y se utilizara un detector síncrono para preparar la salida del fotodetector, seguido de un periodo de integración de 1 segundo, la relación señal/ruido en el ejemplo anterior podría mejorarse hasta treinta veces. Además, el procesamiento activo de la señal permitiría procesar señales mucho más pequeñas, permitiendo una terminación de impedancia relativamente baja del fotodetector, disminuyendo el ruido intrínseco, y cancelando la deriva. La sensibilidad al ruido eléctrico ambiental se reduciría sustancialmente.

Propiedades acústicas

La medición de la propagación del sonido en la muestra o a lo largo de la superficie de la muestra puede servir como medida adicional de la coagulación. Pueden utilizarse transductores de ultrasonidos externos para medir el tiempo que tardan los ultrasonidos en atravesar la muestra. Además, pueden utilizarse dispositivos de ondas acústicas de superficie para medir las propiedades acústicas de la muestra y detectar la coagulación.

MI. Procedimientos de fabricación de dispositivos

Además de procedimientos estándar, tales como la fotolitografía, pueden aplicarse tecnologías especiales, tales como la unión anódica o el grabado húmedo anisotrópico con hidróxido de potasio de obleas de silicio para formar microsistemas. Además de la litografía estándar de luz ultravioleta, se pueden utilizar técnicas, tales como la microablación o erosión de escritura directa con láser, la litografía de haz de electrones, o el fresado de haz de iones focalizados para definir estructuras de tamaño micro o nanométrico. La litografía blanda es una forma relacionada de fabricar sistemas microfluídicos y es en base a la generación de microestructuras o -patrones, por ejemplo, a través de técnicas fotolitográficas estándar, y el posterior uso de estos patrones en procedimientos de moldeo/colado. Los materiales elastoméricos, tales como el polidimetilsiloxano (PDMS) son típicamente utilizados para la generación de sistemas microfluídicos mediante litografía blanda. Las películas estructuradas generadas mediante litografía blanda pueden fijarse entre sí o a cualquier otro sustrato estructurado o no estructurado para formar sistemas microfluídicos complejos. Además, otras tecnologías, tales como el taladrado, el fresado, el moldeado, o la impresión 3D, pueden utilizarse solas o en combinación con otras micro/nanotecnologías para fabricar microsistemas.

IV. Recogida de la muestra

Recogida de sangre

En la mayoría de los casos, los individuos que van a someterse a la prueba se presentarán en una clínica o un hospital, posiblemente con un estado desconocido en cuanto al tratamiento con anticoagulantes. La sangre puede obtenerse mediante el uso de una jeringa, una lanceta, o directamente de una línea que contiene sangre. Debido al uso de la vía de coagulación alternativa en la cual la coagulación se activa utilizando una superficie de tipo vidrio, la sangre puede contener anticoagulantes, tales como warfarina, heparina, heparina de bajo peso molecular, inhibidores del factor IIa, inhibidores del factor Xa, y otros inhibidores del factor o factor de sangre alterada.

La warfarina y las moléculas relacionadas que contienen 4-hidroxicumarina disminuyen la coagulación de la sangre al inhibir la epóxido reductasa de vitamina K, una enzima que recicla la vitamina K¹ oxidada a su forma reducida después de haber participado en la carboxilación de varias proteínas de la coagulación de la sangre, principalmente la protrombina y el factor VII. La warfarina no antagoniza la acción de la vitamina K¹ , sino que antagoniza el reciclaje de la vitamina K¹ , agotando la vitamina K activa. Por lo tanto, la acción farmacológica siempre puede ser revertida por la vitamina K fresca. Cuando se administran, estos fármacos no anticoagulan la sangre inmediatamente. En cambio, el inicio de su efecto requiere aproximadamente un día antes de que los factores de coagulación activos restantes hayan tenido tiempo de desaparecer de manera natural en el metabolismo, y la duración de la acción de una dosis única de warfarina es de 2 a 5 días. La reversión del efecto de la warfarina cuando se interrumpe o se administra vitamina K¹ , requiere un tiempo similar.

La heparina es un compuesto que se produce en el hígado y otros tejidos que inhibe la coagulación de la sangre. Un polisacárido que contiene azufre se utiliza como anticoagulante en el tratamiento de la trombosis. La heparina de bajo peso molecular, un producto más altamente procesado, es útil ya que no requiere monitorización mediante el parámetro de coagulación aPTT (tiene niveles de plasma más predecibles) y tiene menos efectos secundarios. Sin embargo, en situaciones de hemorragia de emergencia, la capacidad de monitorizar la LMWH es una significativa necesidad clínica no satisfecha, ya que no se acepta clínicamente ningún ensayo de punto de atención para la monitorización del anticoagulante LMWH.

Los fármacos, tales como el rivaroxabán, el apixabán y el edoxabán actúan inhibiendo directamente el factor Xa (a diferencia de las heparinas y el fondaparinux, los cuales actúan a través de la activación de la antitrombina).

Otro tipo de anticoagulante es el inhibidor directo de la trombina. Los miembros actuales de esta clase incluyen los fármacos bivalentes hirudina, lepirudina y bivalirudina; y los fármacos monovalentes argatroban y dabigatrán.

La muestra puede ser testeada como sangre o como plasma. El plasma puede prepararse por filtración o centrifugación. Además, se puede añadir un área de superficie de vidrio adicional a uno o más de los canales microfluídicos mediante la introducción de microesferas de vidrio en el canal utilizando, por ejemplo, un chip de doble profundidad o un embalaje de microesferas en el canal.

Otras muestras biológicas

El dispositivo puede utilizarse con otros tipos de muestras que se activan con la exposición al vidrio.

V. Procedimientos de uso

Las muestras se recogen y se administran en el dispositivo. Los medios para determinar la coagulación se inician cuando se coloca la muestra en el dispositivo. Los resultados se comparan con los resultados estándar para muestras no coaguladas, típicamente a partir de una mezcla de plasma o de sangre, o por referencia al tiempo de coagulación al inicio del tratamiento, como en el caso de que a un individuo se le administre un anticoagulante, o un terapéutico para neutralizar el anticoagulante y restaurar una coagulación de la sangre más normal.

La presente invención se comprenderá mejor haciendo referencia a los siguientes ejemplos no limitativos.

Ejemplo 1. Demostración de calentamiento en chip

Se utilizó un chip para demostrar el efecto de la estructura de calentador integrado (o calentador/enfriador integrado; preferentemente una bomba de calor de estado sólido o “enfriador Peltier”). Se aplicó una tensión CC de 12 V a la resistencia del calentador situada en la parte posterior de la parte de silicio del chip microfluídico. Las resistencias de los termistores se midieron en el interior de cada cámara (termistores internos, en la superficie frontal de silicio) y en la parte superior de cada cámara (termistores externos, en la parte superior de la PYREX®) antes de aplicar una tensión de calentador y durante el calentamiento. El aumento de las temperaturas locales debido al calentamiento se calculó utilizando las resistencias medidas y los coeficientes de temperatura de las resistencias, como se ha indicado anteriormente. La temperatura ambiente era de aproximadamente 27 °C. Los aumentos promedios de la temperatura local después de aproximadamente 2 minutos de calentamiento no regulado fueron:

■ termistores externos: AT = 20,3 K

■termistores internos: AT = 23,8 K.

Ejemplo 2: Medición de la coagulación de la sangre

Materiales y procedimientos

Se extrajo sangre de un paciente utilizando dispositivos de punción disponibles en el mercado. se obtuvieron 10 pl de sangre y se pipetearon en un tubo Eppendorf. Se utilizó solución salina como una solución de tampón. La muestra de sangre se mezcló en el tubo Eppendorf a través del pipeteo arriba y abajo cinco veces con uno de los siguientes reactivos:

1 pl de solución de tampón (denominada control simulado),

1 pl de solución de tampón que contiene el anticoagulante edoxaban a una concentración de 300 ng/ml,

1 pl de solución de tampón que contiene el anticoagulante edoxaban y el agente anticoagulante reversible PER977, ambos a una concentración de 300 ng/ml.

El edoxaban es un anticoagulante disponible en el mercado. El PER977 (ciraparantag) es un fármaco en investigación que está diseñado para revertir el efecto del edoxabán. Inmediatamente después de la mezcla, se pipetearon 2,5 j l de cada muestra de sangre en un chip de dispositivo cerrado. El chip se insertó en su lector, y se registraron inmediatamente tanto las mediciones de luz IR como las de impedancia a temperatura ambiente (aproximadamente 27 °C). Se omitió el calentamiento de la muestra de sangre.

Los resultados se obtuvieron tanto por IR como por impedancia de viscosidad.

Resultados

Como es evidente a partir de las Figuras 12A-12F, las mediciones de IR (Figuras 12B, 12D, y 12F) y de impedancia (12A, 12C, y 12E) se correlacionan bien entre sí. Ambas mediciones muestran para el control simulado un pico característico de alrededor de 2 minutos que es indicativo del tiempo de coagulación de la muestra. La adición del anticoagulante edoxaban desplaza este pico a aproximadamente 4 minutos. Además del pico, las curvas de edoxaban muestran un mínimo local característico de alrededor de 12 minutos. La adición del agente anticoagulante reversible PER977 a una muestra de sangre que contiene edoxabán desplaza el pico de cada curva a los 2 minutos y suprime la aparición de un mínimo local de alrededor de 12 minutos. Estas mediciones indican el efecto retardante de la coagulación del edoxabán y la reversión de este efecto a través de la administración adicional de PER977.

Las modificaciones y variaciones de los dispositivos, sistemas y procedimientos de uso de estos serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción detallada anterior y se pretende que entren dentro del ámbito de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para medir el tiempo de coagulación que comprende introducir una muestra de sangre o plasma en un chip (10) microfluídico, comprendiendo el chip (10) microfluídico:

a) una entrada (16) en comunicación con uno o más microcanales (14), en los que el canal varía en longitud de decenas de micrómetros a milímetros, con altura y profundidad en el intervalo de decenas de micrómetros a cientos de micrómetros;

b) el uno o más microcanales (14) que comprenden al menos una superficie cargada aniónicamente la cual activa la coagulación, en el que la superficie cargada aniónicamente no incluye agentes químicos que activen la coagulación; y en el que la muestra de sangre o plasma introducida está en contacto con dicha superficie cargada aniónicamente la cual sirve para activar la cascada de coagulación sin el uso de reactivos de coagulación químicos o biológicos adicionales;

c) comprendiendo cada microcanal (14) una cámara (12a, 12b) de prueba en la cual pueden medirse los cambios en la viscosidad, impedancia, propiedades acústicas, o propiedades ópticas; y

d) una salida (28b) en comunicación con uno o más microcanales (14),

en el que el chip microfluídico se inserta en un lector (50,80), comprendiendo el lector (50, 80):

(i) un detector el cual determina los cambios en la viscosidad, impedancia, propiedades acústicas o propiedades ópticas en la muestra en la cámara de prueba para medir el tiempo de coagulación;

(ii) un elemento de control de la temperatura, y en el que el detector está configurado para emitir el tiempo de coagulación medido, determinado a partir del cambio en la viscosidad, impedancia, propiedades acústicas, o propiedades ópticas, a un monitor, pantalla o almacenamiento de información.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el chip (10) microfluídico está comprendido por un único microcanal.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en el que el cambio en las propiedades ópticas de la muestra se mide midiendo la transmisión de luz IR a través de la cámara de prueba del chip (10) microfluídico.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el detector comprende un IR LED y un fotodiodo para medir los cambios en las propiedades ópticas de la muestra.

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la transmisión a través de la muestra se mide en un tiempo determinado hasta el tiempo máximo de coagulación, preferentemente en el que la medición se realiza con luz entre 500 y 10,000 nm, preferentemente 1300 nm.

6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la temperatura de la muestra introducida en el microchip insertado en el lector se mantiene a la temperatura corporal.

7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la superficie cargada aniónicamente es vidrio y/o silicio oxidado.