ES2936478T3 - Generación de moldes de ADN circular monocatenario para secuenciación de molécula individual - Google Patents

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Abstract

La invención es un nuevo método de secuenciación de ácidos nucleicos que implica la preparación y secuenciación de una biblioteca de ácidos nucleicos diana circulares monocatenarios. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Generación de moldes de ADN circular monocatenario para secuenciación de molécula individual
Campo de la invención
La invención se refiere al campo del análisis de ácido nucleico y más específicamente, a preparar moldes para la secuenciación de ácido nucleico.
Antecedentes de la invención
La secuenciación de ácido nucleico de molécula individual, incluyendo la secuenciación de nanoporos en general, requiere la creación de consenso debido a la alta tasa de error de la tecnología. Existen procedimientos de preparación de colecciones que producen moldes bicatenarios circulares que permiten que la secuencia diana se lea múltiples veces en una lectura de polimerasa larga individual. Véanse las patentes de EE. UU. n.os 7.302.146 y 8.153.375. Los ácidos nucleicos lineales se pueden convertir en una forma circular para amplificación y posterior detección y cuantificación, véase la patente de EE. UU. n.° RE44265. Cuando se secuencia en una plataforma usando la tecnología Single Molecule Real Time (SMRT) (Pacific Biosciences, Menlo Park, Cal.), la polimerasa lee la molécula de la colección produciendo una lectura contigua (lectura de polimerasa) que consiste en copias sentido y antisentido alternas de las moléculas de la colección. Pueden existir casos donde, debido a la aplicación técnica u otras restricciones, se lee solo una de las hebras de ADN de una molécula bicatenaria original. La invención es un procedimiento para producir y secuenciar una colección circular que contiene solo hebras sencillas de la secuencia diana. Los documentos Wo 201 2/003374 A2 y WO 2014/1 96863 A1 ya divulgan el uso de adaptadores ligables que actúan como "férulas" permitiendo la circularización de ácidos nucleicos para secuenciación. El procedimiento de la presente invención, sin embargo, tiene múltiples ventajas que se describen en detalle a continuación.
Sumario de la invención
En un modo de realización, la invención es un procedimiento de secuenciación por separado de cada hebra de un ácido nucleico diana bicatenario que comprende las etapas de: en una mezcla de reacción, unir un ácido nucleico diana bicatenario a un adaptador para formar un ácido nucleico diana adaptado en el que el adaptador comprende sitios de unión a cebador; amplificar el ácido nucleico diana adaptado con un par de cebadores complementarios a los sitios de unión a cebador formando de este modo un amplicón, en el que un cebador en el par de cebadores comprende un nucleótido modificado que afecta a la tasa de digestión por una exonucleasa; poner en contacto la mezcla de reacción con una exonucleasa eliminando de este modo de la mezcla de reacción la primera de las dos hebras complementarias del amplicón; circularizar la segunda de las dos hebras complementarias del amplicón para formar un círculo monocatenario; hibridar un cebador de secuenciación al círculo monocatenario; y extender el cebador secuenciando de este modo una hebra del ácido nucleico diana. El adaptador se puede unir por ligación, por ejemplo, por unión de extremos cohesivos del ácido nucleico diana y el adaptador. El adaptador puede comprender una parte bicatenaria y una parte monocatenaria que comprende dos porciones no hibridadas, al menos un código de barras y al menos un sitio de unión a cebador que se puede localizar en brazos iguales o separados del adaptador. El sitio de unión a cebador de secuenciación también puede estar en el adaptador. El nucleótido modificado puede ser un nucleótido terminal 5'-fosforilado con exonucleasa lambda. El nucleótido modificado puede comprender un grupo fosforotioato con exonucleasa T5 o T7. El procedimiento puede comprender además una segunda etapa de digestión con exonucleasas después de la etapa de circularización. La segunda exonucleasa puede ser una combinación de exonucleasa específica de doble hebra y una exonucleasa específica de hebra sencilla, por ejemplo, exonucleasa I, exonucleasa III, exonucleasa T5 y exonucleasa VII.
La circularización se puede producir por ligación, tal como ligación con férula o ligación de hebra sencilla. El procedimiento puede comprender además una etapa de enriquecimiento de diana, por ejemplo, por captura por medio de sondas específicas de diana unidas a un soporte sólido. El procedimiento puede comprender además poner en contacto la mezcla de reacción con un agente específico de daño de ADN seleccionado de glucosilasa y endonucleasa.
En algunos modos de realización, la invención es un procedimiento de preparación de una colección de ácidos nucleicos monocatenarios a partir de ácidos nucleicos diana bicatenarios en una muestra, comprendiendo el procedimiento las etapas de: en una mezcla de reacción, unir ácidos nucleicos diana bicatenarios a adaptadores para formar ácidos nucleicos diana adaptados en el que los adaptadores comprenden sitios de unión a cebador; amplificar los ácidos nucleicos diana adaptados con un par de cebadores complementarios a los sitios de unión a cebador formando de este modo amplicones, en el que un cebador en el par de cebadores comprende un nucleótido modificado que afecta a la tasa de digestión por una exonucleasa; poner en contacto la mezcla de reacción con una exonucleasa eliminando de este modo de la mezcla de reacción la primera de las dos hebras complementarias de los amplicones; circularizar la segunda de las dos hebras complementarias de los amplicones para formar círculos monocatenarios formando de este modo una colección de ácidos nucleicos diana circulares monocatenarios.
En algunos modos de realización, la invención es un procedimiento de secuenciación por separado de cada hebra de un ácido nucleico diana bicatenario que comprende las etapas de: en una mezcla de reacción, amplificar un ácido nucleico diana con un par de cebadores específicos de diana formando de este modo un amplicón, en el que un cebador en el par de cebadores comprende un nucleótido modificado que inhibe la digestión por una exonucleasa; poner en contacto la mezcla de reacción con una exonucleasa eliminando de este modo de la mezcla de reacción la primera de las dos hebras complementarias del amplicón; circularizar la segunda de las dos hebras complementarias del amplicón para formar un círculo monocatenario; hibridar un cebador de secuenciación al círculo monocatenario; extender el cebador secuenciando de este modo una hebra del ácido nucleico diana.
En algunos modos de realización, la invención es un procedimiento de preparación de una colección de ácidos nucleicos monocatenarios a partir de ácidos nucleicos diana bicatenarios en una muestra, comprendiendo el procedimiento las etapas de: en una mezcla de reacción, amplificar ácidos nucleicos diana con un par cebadores específicos de diana formando de este modo amplicones, en el que un cebador en el par de cebadores comprende un nucleótido modificado que afecta a la tasa de digestión por una exonucleasa; poner en contacto la mezcla de reacción con una exonucleasa eliminando de este modo de la mezcla de reacción la primera de las dos hebras complementarias de los amplicones; circularizar la segunda de las dos hebras complementarias de los amplicones para formar círculos monocatenarios formando de este modo una colección de ácidos nucleicos diana circulares monocatenarios.
En algunos modos de realización, la invención es un procedimiento de secuenciación preferentemente de una hebra de un ácido nucleico diana bicatenario que comprende las etapas de: en una mezcla de reacción, unir un ácido nucleico diana bicatenario a un adaptador para formar un ácido nucleico diana adaptado en el que el adaptador comprende sitios de unión a cebador; amplificar el ácido nucleico diana adaptado con un par de cebadores complementarios a los sitios de unión a cebador, comprendiendo el par una cantidad limitante de un cebador limitante y una cantidad en exceso de un cebador en exceso; circularizar los productos de extensión para formar círculos monocatenarios; hibridar un cebador de secuenciación a los círculos monocatenarios; extender el cebador secuenciando preferentemente de este modo una hebra del ácido nucleico diana. El cebador en exceso comprende un nucleótido modificado que afecta a la tasa de digestión por una exonucleasa y comprende además poner en contacto la mezcla de reacción con una exonucleasa eliminando de este modo de la mezcla de reacción el producto de extensión del cebador limitante. En algunos modos de realización, el cebador en exceso puede comprender un ligando para un resto de captura por afinidad para capturar y conservar el producto de extensión del cebador en exceso. En algunos modos de realización, el cebador limitante puede comprender un ligando para un resto de captura por afinidad para capturar y retirar el producto de extensión del cebador limitante.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra un flujo de trabajo del primer modo de realización del procedimiento de preparación de una colección de ácidos nucleicos monocatenarios circulares (procedimiento 1).
La figura 2 muestra un flujo de trabajo del segundo modo de realización del procedimiento de preparación de una colección de ácidos nucleicos monocatenarios circulares que incluye una etapa de PCR (procedimiento 2). La figura 3 es un diagrama del adaptador en forma de Y. (A) muestra un adaptador con porciones del sitio de unión a cebador (subrayado) divididas entre los brazos del adaptador. (B) muestra un adaptador con todo el sitio de unión a cebador (subrayado) presente en un brazo del adaptador. Las secuencias corresponden a SEQ ID NO. 5-8
La figura 4 muestra el resultado de secuenciación de las colecciones de control.
La figura 5 muestra el resultado de secuenciación de las colecciones preparadas usando el procedimiento 1. La figura 6 muestra el resultado de secuenciación de las colecciones preparadas usando el procedimiento 1 con un adaptador de nanoporos.
La figura 7 muestra el resultado de secuenciación de las colecciones preparadas usando el procedimiento 2 con exonucleasa T7.
La figura 8 muestra el resultado de secuenciación de las colecciones preparadas usando el procedimiento 2 con exonucleasa lambda.
Descripción detallada de la invención
Definiciones
Las siguientes definiciones ayudan en el entendimiento de la presente divulgación.
El término "muestra" se refiere a cualquier composición que contiene o se supone que contiene ácido nucleico diana. Esto incluye una muestra de tejido o líquido aislado de un individuo, por ejemplo: piel, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, líquido linfático, líquido sinovial, orina, lágrimas, glóbulos sanguíneos, órganos y tumores, y también para muestras de cultivos in vitro establecidos a partir de células extraídas de un individuo, incluyendo los tejidos incluidos en parafina fijados con formol (FFPET) y ácidos nucleicos aislados de los mismos. Una muestra también puede incluir material sin células, tal como una fracción sanguínea sin células que contiene ADN libre circulante (ADNlc) o ADN tumoral circulante (ADNtc).
El término "ácido nucleico" se refiere a polímeros de nucleótidos (por ejemplo, ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos, tanto naturales como no naturales), incluyendo ADN, ARN y sus subcategorías, tales como ADNc, ARNm, etc. Un ácido nucleico puede ser monocatenario o bicatenario y en general contendrá enlaces fosfodiéster 5'-3', aunque en algunos casos, los análogos nucleotídicos pueden tener otros enlaces. Los ácidos nucleicos pueden incluir bases naturales (adenosina, guanosina, citosina, uracilo y timidina), así como bases no naturales. Algunos ejemplos de bases no naturales incluyen las descritas en, por ejemplo, Seela et al., (1999) Helv. Chim. Acta 82:1640. Las bases no naturales pueden tener una función particular, por ejemplo, incrementar la estabilidad del dúplex de ácido nucleico, inhibir la digestión con nucleasas o bloquear la extensión del cebador o la polimerización de hebra.
Los términos "polinucleótido" y "oligonucleótido" se usan de manera intercambiable. Polinucleótido es un ácido nucleico monocatenario o bicatenario. Oligonucleótido es un término usado a veces para describir un polinucleótido más corto. Los oligonucleótidos se preparan por cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica, por ejemplo, por un procedimiento que implica síntesis química directa como se describe en Narang et al. (1979) Meth. Enzymol. 68:90-99; Brown et al. (1979) Meth. Enzymol. 68:109-151; Beaucage et al. (1981) Tetrahedron Lett. 22:1859-1862; Matteucci et al. (1981) J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191.
El término "cebador" se refiere a un oligonucleótido monocatenario que se hibrida con una secuencia en el ácido nucleico diana ("sitio de unión a cebador") y puede actuar como un punto de iniciación de la síntesis a lo largo de una hebra complementaria de ácido nucleico en condiciones adecuadas para dicha síntesis.
El término "adaptador" quiere decir una secuencia de nucleótidos que se puede añadir a otra secuencia para importar propiedades adicionales a esa secuencia. Un adaptador es típicamente un oligonucleótido que puede ser mono o bicatenario, o puede tener tanto una porción monocatenaria como una porción bicatenaria.
El término "ligación" se refiere a una reacción de condensación que une dos hebras de ácido nucleico en la que un grupo 5'-fosfato de una molécula reacciona con el grupo 3'-hidroxilo de otra molécula. La ligación es típicamente una reacción enzimática catalizada por una ligasa o una topoisomerasa. La ligación puede unir dos hebras individuales para crear una molécula monocatenaria. La ligación también puede unir dos hebras que pertenecen cada una a una molécula bicatenaria uniendo por tanto dos moléculas bicatenarias. La ligación también puede unir ambas hebras de una molécula bicatenaria a ambas hebras de otra molécula bicatenaria, uniendo por tanto dos moléculas bicatenarias. La ligación también puede unir dos extremos de una hebra dentro de una molécula bicatenaria reparando por tanto una muesca en la molécula bicatenaria.
El término "código de barras" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que se puede detectar e identificar. Los códigos de barras se pueden incorporar en diversos ácidos nucleicos. Los códigos de barras son suficientemente largos, por ejemplo, de 2, 5, 20 nucleótidos, de modo que en una muestra, los ácidos nucleicos que incorporan los códigos de barras se pueden distinguir o agrupar de acuerdo con los códigos de barras. El término "identificador múltiple" o "MID" se refiere a un código de barras que identifica una fuente de un ácido nucleico diana (por ejemplo, una muestra de la que se deriva el ácido nucleico). Todos o sustancialmente todos los ácidos nucleicos diana de la misma muestra compartirán el mismo MID. Los ácidos nucleicos diana de diferentes fuentes o muestras se pueden mezclar y secuenciar simultáneamente. Usando los MID, las lecturas de secuencia se pueden asignar a muestras individuales a partir de las que se originaron los ácidos nucleicos diana. El término "identificador molecular único" o "UID" se refiere a un código de barras que identifica un ácido nucleico al que se fija. Todos o sustancialmente todos los ácidos nucleicos diana de la misma muestra tendrán diferentes UID. Toda o sustancialmente toda la descendencia (por ejemplo, amplicones) derivada del mismo ácido nucleico diana original compartirá el mismo UID.
El término "cebador universal" y "sitio de unión de cebado universal" o "sitio de cebado universal" se refieren a un cebador y un sitio de unión a cebador presentes en (típicamente, a través de adición in vitro a) diferentes ácidos nucleicos diana. El sitio de cebado universal se añade a la pluralidad de ácidos nucleicos diana usando adaptadores o usando cebadores específicos de diana (no universales) que tienen el sitio de cebado universal en la porción 5'. El cebador universal se puede unir a y dirigir la extensión del cebador desde el sitio de cebado universal.
Más en general, el término "universal" se refiere a una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, cebador u otro oligonucleótido) que se puede añadir a cualquier ácido nucleico diana y realizar su función independientemente de la secuencia de ácido nucleico diana. La molécula universal puede realizar su función por hibridación al complemento, por ejemplo, un cebador universal a un sitio de unión a cebador universal o un oligonucleótido de circularización universal con una secuencia de cebador universal.
Como se usa en el presente documento, los términos "secuencia diana", "ácido nucleico diana" o "diana" se refieren a una porción de la secuencia de ácido nucleico en la muestra que se va a detectar o analizar. El término diana incluye todas las variantes de la secuencia diana, por ejemplo, una o más variantes mutantes y la variante natural.
El término "amplificación" se refiere a un procedimiento de preparación de copias adicionales del ácido nucleico diana. La amplificación puede tener más de un ciclo, por ejemplo, múltiples ciclos de amplificación exponencial. La amplificación puede tener un único ciclo (preparar una copia individual del ácido nucleico diana). La copia puede tener secuencias adicionales, por ejemplo, las presentes en los cebadores usados para la amplificación. La amplificación también puede producir copias de una única hebra (amplificación lineal) o preferentemente una hebra (PCR asimétrica).
El término "secuenciación" se refiere a cualquier procedimiento de determinación de la secuencia de nucleótidos en el ácido nucleico diana.
La secuenciación de molécula individual típicamente implica la creación de una secuencia consenso a partir de múltiples lecturas en parte para mitigar la alta tasa de error de la tecnología. En algunos procedimientos, el consenso se construye a partir de múltiples lecturas de la misma molécula molde, en particular, una molécula circular. Los procedimientos de preparación de colección de secuenciación convierten la colección de moléculas diana en una colección de moldes circulares. Un procedimiento de este tipo usa adaptadores de horquilla fijados en cualquier extremo de una molécula diana bicatenaria. Véanse las patentes de EE. UU. n.os 7.302.146 y 8.153.375. Durante la secuenciación, la polimerasa lee la molécula de la colección produciendo continuamente una lectura contigua que consiste en copias sentido y antisentido alternas de la molécula de la colección intercaladas con secuencias adaptadoras. Después de que la lectura de la polimerasa se divida en sublecturas, las sublecturas se usan para producir una secuencia consenso de alta exactitud, denominada secuencia consenso circular. En algunas aplicaciones, puede ser deseable leer cada hebra de una molécula bicatenaria por separado. La presente invención es un procedimiento para producir y secuenciar una colección que consiste en círculos monocatenarios, conteniendo cada uno un inserto de colección.
La presente invención comprende detectar un ácido nucleico diana en una muestra. En algunos modos de realización, la muestra se deriva de un sujeto o un paciente. En algunos modos de realización, la muestra puede comprender un fragmento de un tejido sólido o un tumor sólido derivado del sujeto o del paciente, por ejemplo, por biopsia. La muestra también puede comprender líquidos corporales (por ejemplo, orina, esputo, suero, plasma o linfa, saliva, esputo, sudor, lágrima, líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico, líquido sinovial, líquido pericárdico, líquido peritoneal, líquido pleural, líquido quístico, bilis, líquido gástrico, líquido intestinal y/o muestras fecales). La muestra puede comprender sangre completa o fracciones sanguíneas donde pueden estar presentes células tumorales. En algunos modos de realización, la muestra, especialmente una muestra líquida, puede comprender material sin células, tal como ADN o ARN sin células incluyendo ADN tumoral o ARN tumoral sin células. La presente invención es especialmente adecuada para analizar dianas raras y de baja cantidad. En algunos modos de realización, la muestra es una muestra sin células, por ejemplo, muestra derivada de sangre sin células donde está presente ADN tumoral o ARN tumoral sin células. En otros modos de realización, la muestra es una muestra cultivada, por ejemplo, un cultivo o sobrenadante de cultivo que contiene o se sospecha que contiene un agente infeccioso o ácidos nucleicos derivados del agente infeccioso. En algunos modos de realización, el agente infeccioso es una bacteria, un protozoo, un virus o un micoplasma.
Un ácido nucleico diana es el ácido nucleico de interés que puede estar presente en la muestra. En algunos modos de realización, el ácido nucleico diana es un gen o un fragmento génico. En otros modos de realización, el ácido nucleico diana contiene una variante genética, por ejemplo, un polimorfismo, incluyendo un polimorfismo o variante mononucleotídica (SNP o SNV), o un reordenamiento genético que da como resultado, por ejemplo, una fusión génica. En algunos modos de realización, el ácido nucleico diana comprende un biomarcador. En otros modos de realización, el ácido nucleico diana es característico de un organismo particular, por ejemplo, ayuda en la identificación del organismo patógeno o una característica del organismo patógeno, por ejemplo, sensibilidad a fármacos o resistencia a fármacos. Aún en otros modos de realización, el ácido nucleico diana es característico de un sujeto humano, por ejemplo, la secuencia de HLA o KIR que define el genotipo de HLA o KIR único del sujeto. Aún en otros modos de realización, todas las secuencias en la muestra son ácidos nucleicos diana, por ejemplo, en secuenciación genómica indiscriminada.
En un modo de realización de la invención, un ácido nucleico diana bicatenario se convierte en la configuración de molde de la invención. En algunos modos de realización, el ácido nucleico diana se produce en la naturaleza en una forma monocatenaria (por ejemplo, ARN, incluyendo ARNm, microARN, a Rn vírico; o ADN vírico monocatenario). El ácido nucleico diana monocatenario se convierte en la forma bicatenaria para permitir las otras etapas del procedimiento reivindicado.
Los ácidos nucleicos diana más largos se pueden fragmentar, aunque en algunas aplicaciones se pueden desear ácidos nucleicos diana más largos para lograr una lectura más larga. En algunos modos de realización, el ácido nucleico diana se fragmenta de forma natural, por ejemplo, ADN libre circulante (ADNlc) o ADN degradado químicamente tal como el que se encuentra en muestras conservadas. En otros modos de realización, el ácido nucleico diana se fragmenta in vitro, por ejemplo, por medios físicos tales como sonicación o por digestión con endonucleasas, por ejemplo, digestión de restricción.
En algunos modos de realización, la invención comprende una etapa de enriquecimiento de diana. El enriquecimiento puede ser capturando las secuencias diana por medio de una o más sondas específicas de dianas. Los ácidos nucleicos de la muestra se pueden desnaturalizar y poner en contacto con sondas específicas de diana monocatenarias. Las sondas pueden comprender un ligando para un resto de captura por afinidad de modo que después de que se formen los complejos de hibridación, se capturan proporcionando el resto de captura por afinidad. En algunos modos de realización, el resto de captura por afinidad es avidina o estreptavidina y el ligando es biotina. En algunos modos de realización, el resto se une a un soporte sólido. Como se describe con mayor detalle a continuación, el soporte sólido puede comprender partículas poliméricas esféricas superparamagnéticas tales como perlas magnéticas DYNABEADS™ o partículas de vidrio magnéticas.
En algunos modos de realización de la presente invención, se ligan moléculas adaptadoras al ácido nucleico diana. La ligación puede ser una ligación de extremo romo o una ligación de extremo cohesivo más eficaz. El ácido nucleico diana o los adaptadores se pueden volver de extremos romos por "reparación de extremo" que comprende relleno de hebra, es decir, extendiéndose un extremo 3' por una ADN polimerasa para eliminar una protuberancia en 5'. En algunos modos de realización, los adaptadores de extremos romos y el ácido nucleico diana se pueden volver cohesivos por adición de un nucleótido individual al extremo 3' del adaptador y un nucleótido complementario individual a los extremos 3' del ácido nucleico diana, por ejemplo, por una ADN polimerasa o una transferasa terminal. Aún en otros modos de realización, los adaptadores y el ácido nucleico diana pueden adquirir extremos cohesivos (protuberancias) por digestión con endonucleasas de restricción. La última opción es más ventajosa para secuencias diana conocidas que son conocidas por contener el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción. En algunos modos de realización, se pueden requerir otras etapas enzimáticas para lograr la ligación. En algunos modos de realización, se puede usar una polinucleótido cinasa para añadir 5'-fosfatos a las moléculas de ácido nucleico diana y moléculas adaptadoras.
En modos de realización donde se añaden adaptadores independientemente de la secuencia del ácido nucleico diana, por ejemplo, por ligación, los ácidos nucleicos diana de la muestra reciben la misma molécula adaptadora en cada extremo. Para distinguir las hebras del ácido nucleico diana adaptado resultante, el adaptador puede tener una estructura en Y, véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.os 8053192, 8182989 y 8822150. (Figura 3)
En algunos modos de realización, los adaptadores comprenden un sitio de unión a cebador, por ejemplo, un sitio de unión a cebador de amplificación o un sitio de unión a cebador de secuenciación. El sitio de unión a cebador puede ser contiguo en un adaptador, figura 3, panel (B). En algunos modos de realización, para incrementar la especificidad de secuenciación (es decir, solo se secuencian moléculas circularizadas), el sitio de unión a cebador de secuenciación puede ser discontinuo en los brazos del adaptador como se muestra en la figura 3, panel (A) de modo que el sitio de unión a cebador funcional se forma solo tras la circularización del ácido nucleico diana adaptado cuando los brazos del adaptador se unen entre sí en la molécula circular.
En algunos modos de realización, las moléculas adaptadoras son secuencias artificiales sintetizadas in vitro. En otros modos de realización, las moléculas adaptadoras son secuencias naturales sintetizadas in vitro. Aún en otros modos de realización, las moléculas adaptadoras son moléculas naturales aisladas.
En algunos modos de realización, la invención es un procedimiento que comprende una etapa de amplificación del ácido nucleico diana. La amplificación puede ser por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) exponencial, amplificación lineal de una única hebra o cualquier otro procedimiento que utilice cebadores oligonucleotídicos. Diversas condiciones de PCR se describen en PCR Strategies PCR Strategies (M. A. Innis, D. H. Gelfand, and J. J. Sninsky eds., 1995, Academic Press, San Diego, CA) en el capítulo 14; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky, and T. J. White eds., Academic Press, NY, 1990).
En algunos modos de realización, la amplificación utiliza un sitio de unión a cebador universal presente en el adaptador que se conjuga a la secuencia diana como se expone anteriormente. En otros modos de realización, se usa un cebador o par de cebadores específicos de gen (específicos de diana). En algunos modos de realización, los cebadores contienen un saliente en 5' que comprende secuencias adaptadoras, por ejemplo, códigos de barras o sitios de unión a cebador de secuenciación. El uso de dichos cebadores prescinde de la etapa de ligación del adaptador en el procedimiento de la presente invención.
En algunos modos de realización, la amplificación implica PCR asimétrica que genera exceso de una de las dos hebras como se describe, por ejemplo, en Gyllensten U.B. y Erlich H.A. (1988) Generation of single-stranded DNA by the polymerase chain reaction and its application to direct sequencing of the HLA-DQA locus, PNAS, 85:7652. En ese modo de realización, un par de cebadores consiste en un cebador en exceso presente en una cantidad en exceso y un cebador limitante presente en una cantidad limitante. La amplificación resultante comprende preferentemente la hebra que representa el producto de extensión del cebador en exceso. Si el procedimiento de la invención incluye una etapa de PCR asimétrica, los círculos monocatenarios resultantes comprenderían preferentemente una hebra que es el producto de extensión del cebador en exceso. Para enriquecer además la reacción para una hebra, se puede emplear la etapa de digestión con exonucleasas como se describe en el presente documento. Específicamente, el cebador en exceso puede comprender una modificación resistente a exonucleasa de modo que antes de la circularización, el producto de extensión del cebador limitante se podría eliminar por medio de digestión con exonucleasas. De forma alternativa, el cebador en exceso puede comprender un ligando para el resto de captura por afinidad de modo que el producto de extensión del cebador en exceso se puede capturar usando el resto de captura por afinidad y conservar para análisis adicional. Aún en otra alternativa, el cebador limitante puede comprender un ligando para el resto de captura por afinidad de modo que el producto de extensión del cebador limitante se puede capturar usando el resto de captura por afinidad y desechar mientras que el producto del cebador en exceso se conserva en la mezcla de reacción para análisis adicional.
En algunos modos de realización, la invención comprende la introducción de códigos de barras en los ácidos nucleicos diana. La secuenciación de moléculas individuales típicamente requiere códigos de barras moleculares tales como se describe, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. n.os 7.393.665, 8.168.385, 8.481.292, 8.685.678 y 8.722.368. Un código de barras molecular único es una secuencia artificial corta añadida a cada molécula en una muestra tal como la muestra de un paciente típicamente durante las primeras etapas de las manipulaciones in vitro. El código de barras marca la molécula y su descendencia. El código de barras molecular único (UID) tiene múltiples usos. Los códigos de barras permiten rastrear cada molécula de ácido nucleico individual en la muestra para evaluar, por ejemplo, la presencia y cantidad de moléculas de ADN tumoral circulante (ADNtc) en la sangre de un paciente para detectar y realizar un seguimiento del cáncer sin una biopsia. Véanse las solicitudes de patente de Ee . UU. n.os 14/209.807 y 14/774.518. Los códigos de barras moleculares únicos también se pueden usar para la corrección de errores de secuenciación. Toda la descendencia de una molécula diana individual se marca con el mismo código de barras y forma una familia con código de barras. Una variación en la secuencia no compartida por todos los miembros de la familia con código de barras se desecha como un artefacto y no como una mutación real. Los códigos de barras también se pueden usar para deduplicación posicional y cuantificación de diana, ya que toda la familia representa una molécula individual en la muestra original. Véase Id.
En algunos modos de realización de la presente invención, los adaptadores comprenden uno o más códigos de barras. Un código de barras puede ser un ID de muestra múltiple (MID) usado para identificar el origen de la muestra donde se mezclan (multiplexan) las muestras. El código de barras también puede servir como un UID usado para identificar cada molécula original y su descendencia. El código de barras también puede ser una combinación de un UID y un MID. En algunos modos de realización, se usa un código de barras individual como ambos UID y MID.
En algunos modos de realización, cada código de barras comprende una secuencia predefinida. En otros modos de realización, el código de barras comprende una secuencia aleatoria. Los códigos de barras pueden ser de 1­ 20 nucleótidos de largo.
En algunos modos de realización, el procedimiento comprende además una etapa de separación de las hebras del ácido nucleico diana adaptado. En algunos modos de realización, ambas hebras separadas se conservan para análisis posterior, por ejemplo, secuenciación. Las dos hebras se pueden separar por medios físicos, es decir, desnaturalización alcalina o desnaturalización por calor.
En algunos modos de realización, las hebras se separan enzimáticamente, por ejemplo, por degradación selectiva de una hebra por una nucleasa. En algunos modos de realización, la exonucleasa tiene una actividad 5' -> 3'. De forma ventajosa, una única hebra se puede hacer susceptible de digestión con exonucleasas mientras que la segunda hebra se protege de las exonucleasas, estando conferida cualquier propiedad por los nucleótidos modificados presentes en la hebra. En algunos modos de realización, el nucleótido modificado es un nucleótido terminal 5'-fosforilado y la exonucleasa es exonucleasa lambda que digiere la hebra 5'-fosforilada mientras que la hebra no fosforilada se conserva para etapas posteriores. En otros modos de realización, el nucleótido modificado comprende un grupo fosforotioato y la exonucleasa se selecciona de exonucleasa T5 y T7 que digiere la hebra no modificada mientras que la hebra modificada se conserva para etapas posteriores.
En otros modos de realización, se marca una hebra para retención por medio de captura por afinidad. Por ejemplo, uno de los cebadores de amplificación puede comprender un ligando de afinidad (por ejemplo, biotina) que permitirá que la hebra se capture por un resto de captura por afinidad (por ejemplo, por medio de estreptavidina) y se conserve mientras que la hebra complementaria se puede desechar. En algunos modos de realización, la captura por afinidad utiliza la molécula de afinidad (por ejemplo, estreptavidina) unida a un soporte sólido. El soporte sólido se puede suspender en una solución (por ejemplo, una perla de vidrio, una perla magnética, una perla de polímero u otra partícula similar), o un soporte en fase sólida (por ejemplo, una oblea de silicio, un portaobjetos de vidrio o similar). Los ejemplos de soportes en fase de solución incluyen partículas poliméricas esféricas superparamagnéticas tales como perlas magnéticas DYNABEADS™ o partículas de vidrio magnéticas tal como se describe en las patentes de EE. UU. 656568, 6274386, 7371830, 6870047, 6255477, 6746874 y 6258531.
En algunos modos de realización, la separación de hebras se potencia por diversos agentes seleccionados de la proteína de unión a hebra sencilla, por ejemplo, SSB bacteriano, a Dn de baja complejidad ADN Cot (ADN enriquecido para secuencias repetitivas), o agentes químicos tales como álcali, glicerol, urea, DMSO o formamida.
El procedimiento comprende además una etapa de circularizar un ácido nucleico monocatenario. La etapa de ligación utiliza una ligasa que puede catalizar una reacción entre un grupo 5'-fosfato y un 3'-OH de un ácido nucleico. En algunos modos de realización, la ligasa es una ADN o ARN ligasa que se puede ligar independientemente del molde tal como una ligasa vírica descrita, por ejemplo, en la pub. n.° WO2010094040. Además, se puede usar un reactivo no enzimático para formar el enlace fosforodiéster entre el 5'-fosfato del producto de extensión del cebador y el 3'-OH del adaptador como se describe, por ejemplo, en el documento US20140193860. En algunos modos de realización, la ligasa es una ARN o ADN ligasa monocatenaria termoestable tal como la ligasa Thermophage o sus derivados tales como Circligase™ y Circligase™ II (Epicentre Tech., Madison, Wis.). En algunos modos de realización, se usa una férula para permitir una ligasa de doble hebra, por ejemplo, actividad ligasa T4. Un oligonucleótido de férula es complementario a ambas hebras del adaptador dispuesto de cabeza a cola.
En algunos modos de realización, la invención comprende una etapa de digestión con exonucleasas que elimina ácidos nucleicos lineales (no circulares) de la mezcla de reacción y la enriquece de ácidos nucleicos circulares. Los ácidos nucleicos lineales pueden comprender hebras de ácido nucleico diana no circularizadas, cebadores y adaptadores no usados.
En algunos modos de realización, la exonucleasa es una exonucleasa específica de hebra sencilla, una exonucleasa específica de hebra doble o una combinación de las mismas. En algunos modos de realización, la exonucleasa tiene una actividad 3' -> 5'. La exonucleasa puede ser una o más de exonucleasa I, exonucleasa III y exonucleasa VII.
En algunos modos de realización, la invención es un procedimiento de preparación de una colección de ácidos nucleicos diana monocatenarios circulares listos para secuenciación como se describe en el presente documento y la colección producida por el procedimiento. Específicamente, la colección comprende una colección de hebras sencillas circulares derivadas de ácidos nucleicos presentes en una muestra. Las moléculas circulares monocatenarias de la colección comprenden secuencias diana unidas con secuencias adaptadoras.
En algunos modos de realización, la presente invención comprende la detección de ácidos nucleicos diana en una muestra por secuenciación de ácido nucleico. Múltiples ácidos nucleicos, incluyendo todos los ácidos nucleicos en una muestra, se pueden convertir en la configuración de molde de la invención y secuenciarse. En algunos modos de realización, la colección de moléculas circulares monocatenarias se puede someter a secuenciación de ácido nucleico.
En algunos modos de realización, el procedimiento comprende además una etapa de eliminar dianas dañadas o degradadas para mejorar la calidad y longitud de las lecturas de secuenciación. La etapa puede comprender poner en contacto la mezcla de reacción con una o más de uracil-ADN N-glucosilasa (UNG o UDG), nucleasa AP y Fpg (formamidopirimidina[fapi]-ADN glucosilasa), también conocida como 8-oxoguanina ADN glucosilasa para degradar dichos ácidos nucleicos diana dañados.
Como se describe anteriormente, el adaptador o el cebador específico de diana puede comprender un sitio de unión a cebador de secuenciación que puede iniciar una lectura de secuenciación de cada hebra.
La secuenciación se puede realizar por cualquier procedimiento conocido en la técnica. Especialmente ventajosa es la secuenciación de molécula individual de alto rendimiento que puede leer ácidos nucleicos diana circulares. Los ejemplos de dichas tecnologías incluyen la plataforma Pacific BioSciences que utiliza SMRT (Pacific Biosciences, Menlo Park, Cal.) o una plataforma que utiliza tecnología de nanoporos tal como las fabricadas por Oxford Nanopore Technologies (Oxford, Reino Unido) o Roche Sequencing Solutions (Roche Genia, Santa Clara, Cal.) y cualquier otra tecnología de secuenciación de ADN existente en la actualidad o futura que implique o no secuenciación por síntesis. La etapa de secuenciación puede utilizar cebadores de secuenciación específicos de plataforma. Los sitios de unión para estos cebadores se pueden introducir en el procedimiento de la invención como se describe en el presente documento, es decir, siendo una parte de segundos adaptadores o cebadores de amplificación.
Análisis y corrección de errores
En algunos modos de realización, la etapa de secuenciación implica análisis de secuencias incluyendo una etapa de alineación de secuencias. En algunos modos de realización, se usa la alineación para determinar una secuencia consenso a partir de una pluralidad de secuencias, por ejemplo, una pluralidad que tiene los mismos códigos de barras (UID). En algunos modos de realización, se usan códigos de barras (UID) para determinar un consenso a partir de una pluralidad de secuencias teniendo todas un código de barras (UID) idéntico. En otros modos de realización, los códigos de barras (UID) se usan para eliminar artefactos, es decir, variaciones existentes en algunas pero no todas las secuencias que tienen un código de barras (UID) idéntico. Dichos artefactos resultantes de errores de PCR o errores de secuenciación se pueden eliminar.
En algunos modos de realización, el número de cada secuencia en la muestra se puede cuantificar cuantificando números relativos de secuencias con cada código de barras (UID) en la muestra. Cada UID representa una molécula individual en la muestra original y contando diferentes UID asociados con cada variante de secuencia puede determinar la fracción de cada secuencia en la muestra original. Un experto en la técnica podrá determinar el número de lecturas de secuencia necesarias para determinar una secuencia consenso. En algunos modos de realización, se lee el número pertinente por UID ("profundidad de secuencia") necesario para un resultado cuantitativo exacto. En algunos modos de realización, la profundidad deseada es de 5-50 lecturas por UID.
Como se muestra en la figura 1, un modo de realización del procedimiento implica ligar un adaptador, tal como un adaptador en forma de Y, a una molécula diana o a una colección de moléculas diana. El adaptador puede contener códigos de barras tales como ID de muestra (SID) o ID molecular único (UID) y un sitio de unión a cebador de secuenciación. Además, el extremo 5' de la molécula adaptadora se fosforila para permitir una etapa de ligación. En la siguiente etapa, las hebras se separan y se mantienen en forma monocatenaria por medios físicos (temperatura) o químicos (alcalinos). El estado monocatenario se puede potenciar además por la presencia de agentes estabilizantes de hebra sencilla tales como la proteína de unión de hebra sencilla, por ejemplo, SSB bacteriano. Las hebras también se pueden separar retirando una hebra con una exonucleasa. En la siguiente etapa, las hebras sencillas se autoligan (circularizan) con la ayuda de una ligasa de hebra sencilla o un reactivo similar que puede unir el 5'-fosfato y un 3'-OH de las hebras sencillas. En algunos modos de realización, se usa una férula para permitir una ligasa de doble hebra, por ejemplo, actividad ligasa T4. Los subproductos no deseables tales como concatémeros lineales, adaptadores en exceso o ácidos nucleicos diana no obligatorios se retiran, por ejemplo, por digestión con exonucleasas a la que son susceptibles en virtud de tener extremos 5' y 3' libres. Se puede usar una combinación de exonucleasa VII y exonucleasa III. El ácido nucleico diana monocatenario circular resultante o una colección de ácidos nucleicos diana monocatenarios circulares se secuencia hibridando un cebador de secuenciación a un sitio de unión a cebador en la secuencia adaptadora.
Como se muestra en la figura 2, un modo de realización del procedimiento implica ligar un adaptador, tal como un adaptador en forma de Y, a una molécula diana o a una colección de moléculas diana. El adaptador puede contener códigos de barras tales como ID de muestra (SID) o ID molecular único (UID) y un sitio de unión a cebador. En la siguiente etapa, la molécula diana adaptada ligada o una colección de moléculas diana adaptadas se amplifica usando cebadores universales complementarios al sitio de unión a cebador. Los cebadores comprenden un extremo 5' fosforilado para permitir una etapa de ligación. En la siguiente etapa, las hebras se separan y se mantienen en forma monocatenaria por medios físicos (temperatura) o químicos (alcalinos). El estado monocatenario se puede potenciar además por la presencia de agentes estabilizantes de hebra sencilla tales como la proteína de unión de hebra sencilla, por ejemplo, SSB bacteriano. Las hebras también se pueden separar retirando una hebra con una exonucleasa. Uno de los cebadores puede comprender una modificación que evita la digestión por exonucleasas del cebador y el producto de extensión del cebador (es decir, la hebra de amplicón). Uno de los cebadores puede comprender, de forma alternativa, una modificación que permite la digestión con exonucleasas del cebador y la hebra de amplicón. En la siguiente etapa, las hebras sencillas restantes se autoligan (circularizan) con la ayuda de una ligasa de hebra sencilla o un reactivo similar que puede unir el 5'-fosfato y un 3'-OH de las hebras sencillas o con la ligasa de doble hebra asistida por un oligonucleótido de férula. Los subproductos no deseables tales como concatémeros lineales, adaptadores en exceso o ácidos nucleicos diana que carecen de adaptadores se retiran, por ejemplo, por digestión con exonucleasas a la que son susceptibles en virtud de tener extremos 5' y 3' libres. El ácido nucleico diana monocatenario circular resultante o una colección de ácidos nucleicos diana monocatenarios circulares se secuencia hibridando un cebador de secuenciación a un sitio de unión a cebador en la secuencia adaptadora.
Ejemplos
Ejemplo 1. Preparación y secuenciación de una colección no amplificada monocatenaria circular.
Se prepararon colecciones de secuenciación de acuerdo con el procedimiento mostrado en la figura 1 a partir de 500 ng o 1 ug de ADN genómico de E. coli. La colección incluyó el adaptador específico para la plataforma de secuenciación Pacific BioSciences RSII. El material resistente a exonucleasa (probablemente circular) se resolvió usando un ensayo Bioanalyzer RNA Pico. El rendimiento de colección final fue de un 10-20 % de la masa de ADN inicial.
Las colecciones resultantes se secuenciaron en la plataforma Pacific BioSciences RSII (Pacific BioSciences, Menlo Park, Cal.). Los resultados se muestran en la figura 4 y la figura 5.
Además de las colecciones circulares monocatenarias de acuerdo con la figura 1, se prepararon dos tipos de controles: 1) una colección bicatenaria convencional preparada usando adaptadores de horquilla; y 2) una colección preparada por el procedimiento de la figura 1 pero omitiendo la etapa de desnaturalización, reformando de este modo los moldes circulares bicatenarios similares al control 1. Se secuenciaron todas las colecciones en la plataforma Pacific Biosciences RSII. Como se esperaba, los controles comprendieron un ~80 % de ADN bicatenario y menos de un 1 % de ADN monocatenario (figura 4), mientras que un ~40 % de la colección preparada de acuerdo con el procedimiento de la invención comprendió solo una hebra. (Figura 5).
El experimento se repitió con la colección que incluía un adaptador específico para una plataforma de secuenciación basada en nanoporos (Roche Genia). La colección se secuenció en RSII indicando que un 30 % (con SSB) y un 61 % (sin SSB) fueron monocatenarios. Las colecciones de control contuvieron <1 % de ADN monocatenario. (Figura 6).
Ejemplo 2. Preparación y secuenciación de una colección amplificada por PCR monocatenaria circular.
Se prepararon colecciones de secuenciación de acuerdo con el procedimiento mostrado en la figura 2 a partir de 500 ng o 1 ug de ADN genómico de E. coli. La colección incluyó el adaptador específico para la plataforma de secuenciación Pacific BioSciences RSII. Se amplificaron ácidos nucleicos adaptados con uno de los pares de cebadores de la tabla 1.
Tabla 1.
Figure imgf000010_0001
/5fos/ - 5'-fosfato
SEQ ID NO: 2 incorporó cuatro nucleótidos fosfotioato para conferir resistencia a la exonucleasa T7 a la hebra resultante de la extensión del cebador. SEQ ID NO: 4 incorporó un 5'-fosfato para facilitar la digestión con la exonucleasa lambda en la hebra resultante de la extensión del cebador. Se trataron los productos de amplificación con exonucleasas T7 o bien lambda (dependiendo de los cebadores). El rendimiento de ADN se muestra en la tabla 2.
Tabla 2.
Figure imgf000010_0002
Las colecciones resultantes se secuenciaron en la plataforma RSII. Los resultados se muestran en la figura 7 (exonucleasa T7) y la figura 8 (exonucleasa lambda).
Los resultados combinados del ejemplo 1 y el ejemplo 2 se resumen en la tabla 3.
Tabla 3.
Figure imgf000011_0001

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento de secuenciación por separado de cada hebra de un ácido nucleico diana bicatenario que comprende las etapas de:
a) en una mezcla de reacción, unir un ácido nucleico diana bicatenario a un adaptador para formar un ácido nucleico diana adaptado en el que el adaptador comprende sitios de unión a cebador;
b) amplificar el ácido nucleico diana adaptado con un par de cebadores complementarios a los sitios de unión a cebador formando de este modo un amplicón, en el que un cebador en el par de cebadores comprende un nucleótido modificado que afecta a la tasa de digestión por una exonucleasa;
c) poner en contacto la mezcla de reacción con una exonucleasa eliminando de este modo de la mezcla de reacción la primera de las dos hebras complementarias del amplicón;
d) circularizar la segunda de las dos hebras complementarias del amplicón para formar un círculo monocatenario;
e) hibridar un cebador de secuenciación al círculo monocatenario;
f) extender el cebador secuenciando de este modo una hebra del ácido nucleico diana.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la unión al adaptador es por ligación.
3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la ligación es por unión de extremos cohesivos del ácido nucleico diana y el adaptador.
4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el adaptador comprende una parte bicatenaria y una parte monocatenaria que comprende dos porciones no hibridadas.
5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el adaptador comprende al menos un código de barras.
6. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el adaptador comprende al menos un sitio de unión a cebador.
7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el nucleótido modificado es un nucleótido terminal 5'-fosforilado y la exonucleasa es exonucleasa lambda.
8. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el nucleótido modificado comprende un grupo fosforotioato y la exonucleasa se selecciona de exonucleasa T5 y T7.
9. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además una segunda etapa de digestión con exonucleasas después de la etapa de circularización d).
10. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la circularización es por ligación con férula.
11. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el sitio de unión a cebador de secuenciación está en el adaptador.
12. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además antes de la etapa c), poner en contacto la mezcla de reacción con un agente específico de daño de ADN seleccionado de glucosilasa y endonucleasa.
13. Un procedimiento de preparación de una colección de ácidos nucleicos monocatenarios a partir de ácidos nucleicos diana bicatenarios en una muestra, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
a) en una mezcla de reacción, unir ácidos nucleicos diana bicatenarios a adaptadores para formar ácidos nucleicos diana adaptados en el que los adaptadores comprenden sitios de unión a cebador;
b) amplificar los ácidos nucleicos diana adaptados con un par de cebadores complementarios a los sitios de unión a cebador formando de este modo amplicones, en el que un cebador en el par de cebadores comprende un nucleótido modificado que afecta a la tasa de digestión por una exonucleasa;
c) poner en contacto la mezcla de reacción con una exonucleasa eliminando de este modo de la mezcla de reacción la primera de las dos hebras complementarias de los amplicones;
d) circularizar la segunda de las dos hebras complementarias de los amplicones para formar círculos monocatenarios formando de este modo una colección de ácidos nucleicos diana circulares monocatenarios.
14. Un procedimiento de secuenciación por separado de cada hebra de un ácido nucleico diana bicatenario que comprende las etapas de:
a) en una mezcla de reacción, amplificar un ácido nucleico diana con un par de cebadores específicos de diana formando de este modo un amplicón, en el que un cebador en el par de cebadores comprende un nucleótido modificado que inhibe la digestión por una exonucleasa;
b) poner en contacto la mezcla de reacción con una exonucleasa eliminando de este modo de la mezcla de reacción la primera de las dos hebras complementarias del amplicón;
c) circularizar la segunda de las dos hebras complementarias del amplicón para formar un círculo monocatenario;
d) hibridar un cebador de secuenciación al círculo monocatenario;
e) extender el cebador secuenciando de este modo una hebra del ácido nucleico diana.
15. Un procedimiento de preparación de una colección de ácidos nucleicos monocatenarios a partir de ácidos nucleicos diana bicatenarios en una muestra, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
a) en una mezcla de reacción, amplificar ácidos nucleicos diana con un par de cebadores específicos de diana formando de este modo amplicones, en el que un cebador en el par de cebadores comprende un nucleótido modificado que afecta a la tasa de digestión por una exonucleasa;
b) poner en contacto la mezcla de reacción con una exonucleasa eliminando de este modo de la mezcla de reacción la primera de las dos hebras complementarias de los amplicones;
c) circularizar la segunda de las dos hebras complementarias de los amplicones para formar círculos monocatenarios formando de este modo una colección de ácidos nucleicos diana circulares monocatenarios.
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