ES2936842T3 - Composiciones probióticas y prebióticas - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a productos y composiciones que pueden ser beneficiosos en la cría de animales. Dichos productos y composiciones comprenden microorganismos, tales como bacterias, y bacterias probióticas en particular. Por tanto, en el presente documento se proporcionan cepas microbianas, así como criterios de selección que permitirán al lector experto encontrar otras cepas útiles en la presente invención. Las cepas, así como las composiciones que las comprenden, pueden administrarse a animales, en particular animales de granja tales como cerdos. La administración puede ocurrir en los primeros días de vida. Mediante la administración de los productos o composiciones de la invención, el crecimiento animal puede. promoverse y se puede aumentar el peso de los animales. Las infecciones también pueden prevenirse o tratarse mediante dichos compuestos o composiciones. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones probióticas y prebióticas

Campo técnico

La presente invención se refiere al campo de la biotecnología, en particular a los probióticos y a las composiciones que comprenden probióticos que pueden ser útiles en el tratamiento de humanos y/o animales.

Antecedentes de la técnica

Los animales recién nacidos, y en particular los de explotación (intensiva), son propensos a las infecciones bacterianas y de otro tipo, tales como las infecciones víricas. Estas infecciones pueden conducir a diarrea asociada con pérdida de peso y, en casos graves, incluso la muerte del recién nacido. Por ejemplo, hace varios años se han descrito casos de diarrea en lechones recién nacidos en explotaciones porcinas de diferentes situaciones geográficas en España. Se cree que dicha diarrea es un síntoma en estos animales, mientras que el factor causante de dicho síntoma es a veces difícil de localizar. En muchos casos de diarrea en cerdos recién nacidos, por ejemplo, es posible aislar cepas bacterianas posiblemente desfavorables/indeseables, tales como Escherichia coli, sola o en combinación con Clostridium perfringens o Clostridium difficile, pero la diarrea se detecta habitualmente justo después del nacimiento y los procedimientos rutinarios de tratamiento y profilaxis no suelen ser eficaces. En otros casos, la diarrea está provocada, por ejemplo, por infecciones víricas, tales como infecciones provocadas por rotavirus, coronavirus, norovirus, adenovirus y/o astrovirus.

Sin querer restringirse a ninguna teoría en particular, se cree que la disbiosis (también denominada disbacteriosis) puede ser un factor causante. La disbiosis se refiere a una afección con desequilibrios microbianos sobre o dentro del cuerpo. En los animales de granja, los cerdos en particular, la disbiosis puede estar provocada por el uso indiscriminado de antibióticos durante el mantenimiento de las cerdas, produciendo alteraciones en la flora intestinal de los lechones recién nacidos.

En vista de estas desventajas del uso de antibióticos, se recomienda reducir el uso de antibióticos en la crianza de animales. Por otra parte, se necesitarían entonces métodos alternativos de tratamiento de los animales recién nacidos para sustituir a los antibióticos de uso común.

Dado que la UE recomienda desde 2005 reducir el uso de antibióticos como promotores del crecimiento en la cría de cerdos (modificado por el Reglamento (CE) n.° 378/2005 de 4 de marzo de 2005), los criadores de animales anhelan alternativas que puedan mejorar el estado de salud general de los animales (de granja), especialmente en los primeros días de vida. Los presentes inventores aportan una solución a este problema, y dicha solución se describe a continuación. La presente invención resuelve así varios problemas provocados por los métodos del estado de la técnica, y los efectos ventajosos se detallarán a continuación.

El documento WO 2014049023 se refiere a composiciones probióticas y prebióticas. El documento KR20050023475 se refiere a una cepa probiótica de E. faecalis tolerante al ácido. El documento EP 1997499 se refiere a organismos de la leche de mamíferos, composiciones que contienen los mismos y su uso para tratar la mastitis.

Breve descripción de la invención

La invención se define en las reivindicaciones.

En un primer aspecto, la invención se refiere a una composición que comprende al menos la cepa depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo con el número de depósito CECT 8700 (AqSynRMH69).

Además, la invención se refiere a una composición que comprende una mezcla de microorganismos para su uso según la reivindicación 11, en la que los microorganismos pertenecen a las especies Lactobacillus plantarum y Lactobacillus reuteri, y que incluyen opcionalmente al menos un microorganismo que pertenece a los géneros Lactobacillus (preferiblemente con la excepción de microorganismos que pertenecen a las especies Lactobacillus fermentum y Lactobacillus mucosae, siendo preferiblemente estos microorganismos CECT 8347 (AqSynJ12) y CECT 8349 (AqSynJ55), respectivamente) Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus, Streptococcus, Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Sporolactobacillus, Tetragenococcus, Vagococcus y/o Weisella. Lactobacillus fermentum CECT 8347 (AqSynJ12) y Lactobacillus mucosae CECT 8349 (AqSynJ55) se depositaron por Aquilón CYL S.L. en la CECT (Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), Universidad de Valencia, Parc Científic Universitat de Valéncia, Catedrático Agustín Escardino, 9, 46980 Paterna (Valencia, España)) el 16 de mayo de 2013.

En una realización preferida, la composición de la invención comprende dos bacterias del ácido láctico que son CECT 8700 (AqSynRMH69) y CECT 8350 (AqSynJ59), que se depositaron en la CECT (Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), Universidad de Valencia, Parc Científic Universitat de Valéncia, Catedrático Agustín Escardino, 9, 46980 Paterna (Valencia, España)) por Aquilón CYL S.L.

En una realización, en la composición de la invención, cada cepa cumple al menos la siguiente condición a., y preferiblemente ambas condiciones a. y b., y más preferiblemente todas las condiciones a., b. y c.:

a. muestra una actividad antimicrobiana evidenciada mediante al menos una de las siguientes zonas de inhibición: (i) 10 mm o más, por ejemplo 13 mm o más, para Salmonella, (ii) 9 mm o más, preferiblemente 10 mm o más, para Listeria monocytogenes, (iii) 9 mm o más, preferiblemente 10 mm o más, para Staphyloccocus aureus, (iv) 10 mm o más, por ejemplo 18 mm o más, para Escherichia coli;

b. es capaz de retener esencialmente la misma viabilidad durante 3 horas de incubación a pH=3,5, o, alternativamente a pH=2,5;

c. es capaz de retener esencialmente la misma viabilidad durante 4 horas de incubación en presencia del 0,45% de extracto biliar, preferiblemente a pH=8.

Los “organismos viables” pueden definirse como organismos y cualquiera de etapas vivas de la vida de los mismos. Por consiguiente, una cepa que es “capaz de retener esencialmente la misma viabilidad” puede significar una cepa que es capaz de sobrevivir y mantenerse viva en determinadas condiciones, por ejemplo, que el 50% o más de las UfC, tales como el 50%, o el 60%, o el 70%, o el 75%, o el 80%, o el 95%, el 99% o más, tales como el 100% de las UFC están vivas (viables) después de ser expuestas a determinadas condiciones (por ejemplo, 3 horas de incubación a pH=3,5, o, alternativamente a pH=2,5, y/o 4 horas de incubación en presencia del 0,45% de extracto biliar, preferiblemente a pH=8).

La composición de la invención en cualquiera de sus variantes es para su uso en el tratamiento o prevención de la diarrea provocada por una infección vírica. Además, la composición de la invención en cualquiera de sus variantes, para su uso en un método para tratar a un humano o a un animal puede usarse para aumentar el peso de un mamífero recién nacido (preferiblemente un lechón). La composición puede administrarse al mamífero, preferiblemente a un mamífero recién nacido, preferiblemente a un animal recién nacido y más preferiblemente a un lechón.

La divulgación también proporciona un microorganismo, preferiblemente una bacteria, y más preferiblemente una bacteria del ácido láctico. El microorganismo proporcionado por la invención es la cepa CECT 8700 (AqSynRMH69), que se depositó en la CECT (Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), Universidad de Valencia, Parc Científic Universitat de Valéncia, Catedrático Agustín Escardino, 9, 46980 Patema (Valencia, España)) por AQUILON CYL S.L. el 10 de septiembre de 2014.

Los números AqSyn entre paréntesis, que pueden usarse como sinónimos para cada una de las cepas, se asignaron a las cepas por los presentes inventores.

Preferiblemente, la composición de la invención comprende la cepa CECT 8700 (AqSynRMH69) y al menos una cepa adicional. Preferiblemente, la al menos una cepa adicional se selecciona de cepas que pertenecen a los géneros Lactobacillus (preferiblemente con la excepción de microorganismos que pertenecen a las especies Lactobacillus fermentum y Lactobacillus mucosae, siendo preferiblemente estos microorganismos la CECT 8347 (AqSynJ12) y la CECT 8349 (AqSynJ55), respectivamente), Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus, Streptococcus, Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Sporolactobacillus, Tetragenococcus, Vagococcus y/o Weisella.

En una realización preferida, la composición comprende o, alternativamente, consiste en al menos las siguientes cepas: CECT 8700 (AqSynRMH69) y CECT 8350 (AqSynJ59). Opcionalmente, la composición puede comprender cepas adicionales. Preferiblemente, la composición no comprende ninguna cepa adicional. Por consiguiente, la composición preferida comprende microorganismos que consisten en CECT 8700 (AqSynRMH69) y CECT 8350 (AqSynJ59) (es decir, la composición comprende los siguientes microorganismos CECT 8700 (AqSynRMH69) y CECT 8350 (AqSynJ59) y puede comprender componentes adicionales que no sean microorganismos).

Preferiblemente, los microorganismos comprendidos en la composición de la invención son resistentes a los antibióticos, tal como se describe con más detalle a continuación.

En ambos casos, “comprende” puede entenderse opcionalmente en el sentido de que están presentes cepas bacterianas adicionales, o de que no están presentes cepas bacterianas adicionales. Incluso si no están presentes cepas bacterianas adicionales, “comprende” puede significar opcionalmente que están presentes otros componentes adicionales, es decir, cualquier componente distinto de las bacterias.

La cepa CECT 8350 (AqSynJ59) se depositó en la CECT (Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), Universidad de Valencia, Parc Científic Universitat de Valéncia, Catedrático Agustín Escardino, 9, 46980 Paterna (Valencia, España)) por AQUILON CYL S.L el 16 de mayo de 2013.

Los términos “tratamiento” o “terapia” engloban los métodos tanto profilácticos como curativos de tratar una enfermedad, ya que ambos están dirigidos al mantenimiento o restablecimiento de la salud. Independientemente del origen del dolor, malestar o incapacidad, su alivio, mediante la administración de un agente apropiado, debe interpretarse como terapia o uso terapéutico en el contexto de la presente solicitud.

La afección se selecciona de diarreas debidas a infecciones víricas, tales como infecciones por rotavirus, infecciones por coronavirus, infecciones por norovirus, infecciones por adenovirus y/o infecciones por astrovirus, preferiblemente infecciones por rotavirus y/o infecciones por coronavirus. También es posible administrar la composición a animales que padezcan diarrea, aunque no se haya demostrado (todavía) que una infección vírica sea el factor causante de dicha diarrea. La composición de la invención también puede administrarse antes de que el animal tenga diarrea y/o infección, con el fin de prevenir la diarrea y/o la infección.

Breve descripción de las figuras

Fig. 1: Zonas de inhibición, ejemplo ilustrativo.

Fig. 2: % de camadas que presentan diarrea.

Fig. 3: % de camadas tratadas.

Divulgación detallada de la invención

La siguiente descripción detallada divulga variantes específicas y/o preferidas de las características individuales de la invención. La presente invención también contempla como realizaciones particularmente preferidas aquellas realizaciones que se generan combinando dos o más de las variantes específicas y/o preferidas descritas para dos o más de las características de la presente invención.

A menos que se especifique expresamente lo contrario, el término “que comprende” se usa en el contexto del presente documento para indicar que pueden estar presentes opcionalmente miembros adicionales además de los miembros de la lista introducida por “que comprende”. Sin embargo, se contempla como una realización específica de la presente invención que el término “que comprende” abarque la posibilidad de que no estén presentes miembros adicionales, es decir, a los efectos de esta realización, “que comprende” debe entenderse en el sentido de “que consiste en”.

A menos que se especifique expresamente lo contrario, todas las indicaciones de cantidades relativas en la presente solicitud se hacen sobre una base peso/peso. Se pretende que las indicaciones de cantidades relativas de un componente caracterizado por un término genérico se refieran a la cantidad total de todas las variantes o miembros específicos cubiertos por dicho término genérico. Si se especifica que un determinado componente definido por un término genérico está presente en una determinada cantidad relativa, y si este componente se caracteriza además por ser una variante o miembro específico cubierto por el término genérico, se entiende que no están presentes adicionalmente otras variantes o miembros cubiertos por el término genérico de manera que la cantidad relativa total de componentes cubiertos por el término genérico supere la cantidad relativa especificada; más preferiblemente no están presentes en absoluto otras variantes o miembros cubiertos por el término genérico.

Tal como se usa en el presente documento, el término “aproximadamente” significa el valor indicado ± 1% de su valor, o el término “aproximadamente” significa el valor indicado ± 2% de su valor, o el término “aproximadamente” significa el valor indicado ± 5% de su valor, el término “aproximadamente” significa el valor indicado ± 10% de su valor, o el término “aproximadamente” significa el valor indicado ± 20% de su valor, o el término “aproximadamente” significa el valor indicado ± 30% de su valor; preferiblemente, el término “aproximadamente” significa exactamente el valor indicado (± 0%).

La presente invención integra el concepto de probióticos y prebióticos, proporcionando así simbióticos. Los inventores abren una nueva ventana terapéutica de bacterias y composiciones que tienen un efecto inmunomodulador. Los microorganismos o composiciones de la invención pueden administrarse en una etapa temprana de la vida de un animal, tal como un lechón. Por tanto, la invención se refiere a productos y a composiciones que pueden ser beneficiosos en la crianza de animales. La observación realmente importante, tal como se evidencia mediante los ejemplos, es que el tratamiento probiótico es al menos igual de eficaz, y muy probablemente mejor (en comparación con el tratamiento antibiótico convencional), en cuanto a productividad al tratamiento con antibióticos. La contribución de los inventores tiene un enorme impacto económico, tanto por el coste global del tratamiento como por la presión legal y el impacto medioambiental.

Los microorganismos, preferiblemente bacterias, que pueden usarse según la invención son microorganismos con efectos beneficiosos. Son preferiblemente bacterias del ácido láctico. Según la presente invención pueden usarse incluso especies de microorganismos no bacterianas, siempre que cumplan los criterios de selección a. a c. a continuación. Por ejemplo, se sabe que algunas levaduras también pueden tener propiedades probióticas.

Aunque los parámetros funcionales descritos en el presente documento son los criterios de selección más importantes, en lo que respecta a las especies de los microorganismos, se prefieren las bacterias del ácido láctico. Las bacterias del ácido láctico (BAL) comprenden un clado de bacterias Gram positivas, tolerantes a los ácidos, que están asociadas por sus características metabólicas y fisiológicas comunes. Estas bacterias, que se encuentran de manera natural en las plantas en descomposición y en los productos lácteos, así como en las heces de los animales, producen ácido láctico como principal producto metabólico final de la fermentación de los hidratos de carbono. Las bacterias del ácido láctico son generalmente reconocidas como seguras (estatus GRAS), debido a su omnipresencia en los alimentos y a su contribución a la microflora saludable de las superficies mucosas de los mamíferos. Las bacterias del ácido láctico se seleccionan preferiblemente entre los géneros Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus, Streptococcus, Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Sporolactobacillus, Tetragenococcus, Vagococcus y Weisella. Pueden preferirse Lactobacillus y/o Enterococcus. Se prefiere Lactobacillus. En una realización de la presente invención, los microorganismos que pertenecen a las especies Lactobacillus fermentum y Lactobacillus mucosae pueden no estar presentes en la composición de la presente invención. En particular, en una realización de la presente invención, los microorganismos que pertenecen a Lactobacillus fermentum CECT 8347 (AqSynJ12) y Lactobacillus mucosae CECT 8349 (AqSynJ55) pueden no estar presentes en la composición de la presente invención.

En el presente documento, las bacterias preferidas son preferiblemente Gram positivas y catalasa negativas. Puede comprobarse si una bacteria es Gram positiva según las tecnologías convencionales conocidas en la técnica. La tinción de Gram consiste en la tinción consecutiva con diferentes “colorantes” (tinciones) y el lavado de la muestra para comprobar si es positiva o negativa. Si una bacteria es catalasa negativa se comprueba de la siguiente manera: la prueba de la catalasa consiste en añadir peróxido de hidrógeno a una muestra de cultivo o a un tubo de agar inclinado. Si las bacterias en cuestión producen catalasa, convertirán el peróxido de hidrógeno y se desprenderá gas oxígeno. La evolución del gas hace que se formen burbujas y estas burbujas son indicativas de una prueba positiva (bacteria catalasa positiva).

En el presente documento, las bacterias del ácido láctico preferidas son preferiblemente capaces de crecer en medio MRS (Man Rogosa Sharpe), y más preferiblemente en agar MRS acidificado tal como se describe a continuación. El medio MRS se creó para favorecer el crecimiento de bacterias del ácido láctico, especialmente Lactobacillus sp. Se cree que desfavorece el crecimiento de la gran mayoría de bacterias Gram negativas. Sin embargo, otras bacterias distintas de las bacterias del ácido láctico pueden crecer eventualmente en MRS, por lo que es recomendable o incluso necesario comprobar que las colonias pertenecen a bacterias Gram positivas y son catalasa negativas.

En el presente documento, las bacterias del ácido láctico preferidas pueden ser posiblemente bacterias probióticas. La definición más comúnmente aceptada de “probiótico” fue dada en 1998 por Füller, que lo describió como “un suplemento alimenticio microbiano vivo que afecta beneficiosamente al animal huésped mejorando su equilibrio microbiano intestinal”. En general, los probióticos son microorganismos vivos. Se cree que diferentes probióticos tienen diferentes acciones en el intestino, y por lo tanto diferentes probióticos pueden actuar juntos para proporcionar un efecto beneficioso. Otras fuentes definen los probióticos como aquellos microorganismos para los que ya se ha demostrado un beneficio para la salud humana o animal. Los criterios de selección de los probióticos se publican en: “Report of a Joint FAO/WHO Expert Consultation on Evaluation of Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food Including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria”, Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación y Organización Mundial de la Salud, 2001, Córdoba, Argentina. Las ventajas del uso de bacterias vivas han sido ampliamente descritas.

En los últimos años se ha introducido el concepto de “prebióticos”; los prebióticos son componentes alimentarios no digeribles que aumentan el crecimiento de microorganismos específicos en el tubo gastrointestinal. Los “simbióticos” son composiciones que comprenden al menos un probiótico y al menos un prebiótico. Se entiende que tales composiciones fomentan el crecimiento de bacterias beneficiosas (por ejemplo, los probióticos). Como ejemplo ilustrativo, los productos lácteos fermentados se consideran a menudo como simbióticos porque contienen bacterias vivas y la fuente alimentaria que necesitan. Aunque los beneficios asociados a los prebióticos y probióticos son favorables, los investigadores son cautos a la hora de sacar conclusiones generales porque los beneficios varían, dependiendo del tipo y cantidad de prebiótico y probiótico consumido, así como de las combinaciones específicas de probióticos específicos con prebióticos específicos. Por tanto, los potentes simbióticos se basan en una combinación de cepas específicas de bacterias probióticas con prebióticos cuidadosamente seleccionados. Pueden suponer un importante beneficio para la salud del mamífero.

Se han sugerido probióticos, prebióticos y simbióticos específicos para su uso en humanos, y los criterios de selección de probióticos se divulgan, por ejemplo, en el “Report of a Joint FAO/WHO Expert Consultation on Evaluation of Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food Including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria”, Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación y Organización Mundial de la Salud, 2001, Córdoba, Argentina.

La presente invención usa microorganismos, bacterias en particular, que tienen un potencial de mostrar un beneficio para la salud en animales, animales de granja en particular. Preferiblemente, el animal es un animal doméstico, domesticado o un animal que no es doméstico ni domesticado (es decir, salvaje) pero que pertenece a la misma especie o género que un animal doméstico. Un cerdo salvaje, por ejemplo, estaría incluido en esta definición, ya que pertenece a la misma especie que un cerdo doméstico. Algunos ejemplos de animales domésticos que pueden tratarse incluyen, sin limitación, perros, gatos y otros animales de compañía, caballos, ganado vacuno, pollos y otras aves de corral, cerdos, ovejas y cabras. Preferiblemente, el animal es un animal de granja, y los animales de granja incluyen, sin limitación, caballos, ganado vacuno, pollos y otras aves de corral, cerdos, ovejas y cabras. Más preferiblemente, el animal pertenece al suborden Suina. El suborden Suina (también conocido como suiformes) es un linaje de mamíferos que incluye los cerdos y los pecaríes de las familias Suidae y Tayassuidae. Puede preferirse particularmente el cerdo, o bien salvaje o bien doméstico.

Las cepas que son adecuadas para la presente invención (es decir, que pueden estar comprendidas en la composición de la presente invención) pueden identificarse tal como sigue:

Primera etapa para llegar a las cepas de la invención: aislamiento de cepas individuales

En una primera etapa, se aísla una muestra que contiene microorganismos (preferiblemente bacterias). Puede ser adecuada cualquier fuente de microorganismos, que en sentido amplio puede ser cualquier muestra no estéril de la naturaleza. La fuente puede proceder de animales (domésticos), tales como de animales jóvenes en los primeros 30 días de vida, o de sus madres. Alternativamente, la fuente puede ser de animales salvajes (por ejemplo, jabalíes), tales como muestras recogidas de jabalíes capturados. Las fuentes adecuadas incluyen el calostro de animales madre (por ejemplo, cerdas), muestras de meconio de animales recién nacidos (por ejemplo, lechones), lavados de la pared intestinal de animales domésticos o salvajes o bacterias del ácido láctico intestinales naturales. Los microorganismos (por ejemplo, bacterias) contenidos en las muestras pueden hacerse crecer en medios de crecimiento bien conocidos en la técnica por ser adecuados para el crecimiento de microorganismos intestinales, por ejemplo, el medio MRS. Los microorganismos pueden sembrarse en estrías, lo que permitirá aislar colonias individuales. Las colonias individuales pueden recogerse y las cepas respectivas pueden seguir propagándose en un medio de crecimiento adecuado (por ejemplo, el mismo que se usó inicialmente).

Las cepas de estas colonias individuales se analizan opcionalmente mediante tinción de Gram por métodos conocidos en la técnica (y se seleccionan si son Gram positivas) y/o se analizan para detectar la presencia de actividad catalasa tal como se describió anteriormente (y se seleccionan si son catalasa negativas).

Segunda etapa para llegar a las cepas de la invención: pruebas in vitro

Con el fin de seleccionarse como útil para la presente invención, una cepa de microorganismo, procedente preferiblemente de la primera etapa descrita anteriormente, debe cumplir al menos uno de los criterios siguientes, que se enumeran en primer lugar en este documento y se detallan a continuación:

a. Actividad contra bacterias no deseadas;

b. Tolerancia a los ácidos;

c. Tolerancia a las sales biliares;

Los puntos a. a c. representan la prioridad; es decir, lo más deseado es que se cumpla el criterio a., lo segundo más deseado es que se cumplan los criterios a. y b., y lo más preferido es que se cumplan todos los criterios a. a c.. Los criterios de selección se detallan a continuación.

a. Actividad contra bacterias no deseadas

Se realiza un cribado in vitro contra bacterias no deseadas. “No deseadas” son bacterias seleccionadas de las siguientes una o más: Salmonella sp., Listeria monocytogenes, Staphyloccocus aureus y Escherichia coli. Preferiblemente, la especie de Salmonella es Salmonella enterica, más preferiblemente Salmonella enterica serotipo Typhimurium.

La actividad contra las bacterias no deseadas se someterse a prueba mediante la prueba de mancha en el césped(spot-on-lawn), que se describe a continuación. Se aplican cultivos líquidos de una noche (MRS) de cada cepa que va a someterse a prueba como manchas individuales de 10 |il sobre agar MRS y se incuban a 30°C durante 24 h en condiciones anaerobias. Tras la incubación, las placas se cubren con 7 ml de agar BHI semisólido (0,7%) inoculado con una de las bacterias no deseadas (1%; 1 ml de cultivo de una noche en 100 ml de medio). Se cubren placas separadas que contengan una cepa particular que va a someterse a prueba con una de las especies de bacterias no deseadas, respectivamente. Cada una de tales pruebas se realiza por triplicado. Después de incubación durante 24 horas a o cerca de la temperatura óptima de crecimiento de la bacteria no deseada (temperatura óptima de crecimiento conocida en la técnica para cada una de las bacterias no deseadas mencionadas en el presente documento), se examinan las muestras para comprobar si hay indicios de inhibición. Para ello, se comprueba en primer lugar si existe una zona de inhibición. En caso afirmativo, se mide ópticamente el diámetro de la zona de inhibición. En los casos en que la zona de inhibición no parece exactamente circular, la medición de la zona de inhibición se realiza con la regla de medir el diámetro más corto de la zona de inhibición. Por último, se determina la media aritmética del experimento por triplicado y se comprueba si se cumple el siguiente criterio.

CRITERIO: Para que una cepa sea seleccionada como positiva, debe cumplirse al menos una de las siguientes condiciones [(i), (ii), (iii), (iv)]:

(i) Para Salmonella, zona de inhibición de 10 mm o más, por ejemplo de 13 mm o más.

(ii) Para Listeria monocytogenes, zona de inhibición de 9 mm o más, por ejemplo de 10 mm o más.

(iii) Para Staphylococcus aureus, zona de inhibición de 9 mm o más, por ejemplo de 10 mm o más.

(iv) Para Escherichia coli, zona de inhibición de 10 mm o más, por ejemplo de 18 mm o más.

9 mm o más incluye 10 mm o más, 11 mm o más, 12 mm o más, 13 mm o más, 14 mm o más, 15 mm o más, 16 mm o más, 17 mm o más, 18 mm o más, 19 mm o más, 20 mm o más, 21 mm o más, 22 mm o más, 23 mm o más, 24 mm o más, 25 mm o más, 26 mm o más, 27 mm o más, 28 mm o más, 29 mm o más, 30 mm o más, 31 mm o más, 32 mm o más, 33 mm o más, 34 mm o más, 35 mm o más.

10 mm o más incluye 11 mm o más, 12 mm o más, 13 mm o más, 14 mm o más, 15 mm o más, 16 mm o más, 17 mm o más, 18 mm o más, 19 mm o más, 20 mm o más, 21 mm o más, 22 mm o más, 23 mm o más, 24 mm o más, 25 mm o más 26 mm o más, 27 mm o más, 28 mm o más, 29 mm o más, 30 mm o más, 35 mm o más.

13 mm o más incluye 14 mm o más, 15 mm o más, 16 mm o más, 17 mm o más, 18 mm o más, 19 mm o más, 20 mm o más, 25 mm o más, 30 mm o más.

18 mm o más incluye 19 mm o más, 20 mm o más, 21 mm o más, 22 mm o más, 23 mm o más, 24 mm o más, 25 mm o más, 26 mm o más, 27 mm o más, 28 mm o más, 29 mm o más, 30 mm o más, 35 mm o más.

Una composición que comprenda varias cepas también puede someterse a prueba en relación con los criterios anteriores, y tal composición, con el fin de seleccionarse como adecuada para cualquiera de los usos descritos en el presente documento, debe cumplir al menos uno, y más preferiblemente todos los criterios [(i), (ii), (iii), (iv)]. También cabe esperar que una composición de este tipo pueda prepararse adecuadamente combinando cepas individuales de microorganismos de las que cada una cumpla al menos uno de los criterios (i), (ii), (iii), (iv); pero debe comprobarse experimentalmente si éste es realmente el caso.

Como alternativa, puede usarse el ensayo de difusión en pocillos de agar para determinar las zonas de inhibición. Este procedimiento elimina cualquier rastro de ácido láctico que pudiera producirse en el caldo MRS bajo en glucosa neutralizando los sobrenadantes libres de células. Los cultivos en fase estacionaria de las especies que van a someterse a prueba, hechos crecer en condiciones anaerobias, se recogen por centrifugación (5000 g/20 min/4°C), y el pH del sobrenadante libre de células se ajusta a 6,5 con NaOH 1 M. Los sobrenadantes se esterilizan por filtración (0,20 mm; Millipore Ltd., Hertfordshire, Inglaterra). El sobrenadante libre de células (30 |il) se añade a pocillos de 7 mm de diámetro cortados en placas de agar inoculadas con [aproximadamente] 105 unidades formadoras de colonias (UFC)/ml de la bacteria no deseada enumerada en (i), (ii), (iii), (iv). A continuación, las placas de agar se incuban a 30°C durante 24 horas. Se mide el diámetro de las zonas de inhibición alrededor de los pocillos, y los criterios de selección son los indicados en los incisos (i), (ii), (iii) y (iv) anteriores, de los cuales debe cumplirse al menos uno para que una cepa se seleccione como positiva.

A título informativo: los ensayos anteriores se basan en lo descrito por Kawai et al., 2004. Applied and Environmental Microbiology 70(5): 2906-2911; Dortu et al. 2008. Letters in Applied Microbiology, 47: 581-586; Hata et al., 2009. International Journal of Food Microbiology, 137: 94-99, Awaisheh 2009. Food Pathogens and Disease 6 (9): 1125­ 1132.).

b. Tolerancia a los ácidos

Puede considerarse que el ácido imita el jugo gástrico, y la tolerancia al mismo puede someterse a prueba tal como sigue. Se suspenden 100 |il de una suspensión inicial en MRS de 6-8 * 108 UFC/ml de cada cepa en MRS acidificado (pH=3,5, o, alternativamente pH=2,5) acidificado tras la adición de la cantidad adecuada de HCl 12 N) y se incuban a 37°C con agitación a 110 rpm. Las muestras se analizan por recuento de colonias (UFC/ml) a las horas 0, 3 y 6. Puede usarse cualquier otro método conocido por el experto para someter a prueba la tolerancia al ácido. CRITERIO: la cepa debe poder retener esencialmente la misma viabilidad (al menos el 50%, o al menos el 55%, o al menos el 60%, o al menos el 70%, o al menos el 75%, o al menos el 80%, o al menos el 95% de UFC después de la prueba en comparación con antes, más preferiblemente al menos el 50% de UFC después de la prueba en comparación con antes) durante 3 horas de incubación en dicho medio. Como referencia: un protocolo similar se describe brevemente en Huang et al., International Journal of Food Microbiology 91: 253-260).

c. Tolerancia a las sales biliares

Simulación de las condiciones naturales del intestino delgado de los mamíferos.

Se somete a prueba la tolerancia a las sales biliares del siguiente modo: se suspenden 100 |il de una suspensión inicial en MRS de 6-8 * 108 UFC/ml de una cepa bacteriana en una disolución simulada de intestino delgado (por ejemplo, MRS a pH=8 (pH ajustado al añadir NaOH) y el 0,45% de extracto biliar (extracto biliar, porcino. B8631-100G. SIGMA-ALDRICH)) y se incuban a 37°C con agitación a 110 rpm. Las muestras se analizaron por recuento de colonias (UFC/ml) a las horas 1, 2 y 4. Puede usarse cualquier otro método conocido por el experto para someter a prueba la tolerancia a las sales biliares.

CRITERIO: ninguna pérdida de viabilidad (o esencialmente ninguna pérdida de viabilidad, es decir, preferiblemente el 50% o más de UFC, tal como el 50%, o el 60%, o el 70%, o el 75%, o el 80%, o el 95% o más de UFC) después de la exposición a jugos simulados de intestino delgado (el 0,45% de sales biliares, opcionalmente a pH=8) durante 4 horas. Un protocolo similar se describe brevemente en Huang et al., International Journal of Food Microbiology 91: 253- 260.

Opcionalmente, las cepas que se hayan identificado como positivas según los criterios a. a c. anteriores también pueden someterse a pruebas para determinar su adherencia a superficies epiteliales y su persistencia en el tubo gastrointestinal animal (por ejemplo, porcino). Se cree que las cepas con buenas propiedades de adherencia obtendrán mejores resultados.

Opcionalmente, las cepas que se han identificado como positivas según los criterios a. a c. anteriores se someten a pruebas adicionalmente para determinar su perfil de resistencia a los antibióticos, por ejemplo, mediante la prueba de concentración mínima de antibióticos (pruebas de microplaca VetMIC) y/o se realiza una prueba de resistencia genotípica mediante la realización de una PCR para diferentes genes de resistencia (Egervarn et al., 2010. Antonie van Leeuwenhoek 97: 189-200). Se cree que las bacterias sin resistencia a los antibióticos (ausencia o inactividad/pérdida de función de los genes de resistencia) son las más adecuadas para su aplicación en animales de granja.

En una realización preferida, al menos una cepa, y preferiblemente todas las cepas comprendidas en la composición cumplen todos los criterios a. a c. tal como se describió anteriormente. Además, con respecto al criterio a., la al menos una cepa, y preferiblemente todas las cepas comprendidas en la composición, tienen todas las siguientes actividades antimicrobianas, tal como se evidencia mediante las zonas de inhibición determinadas por el ensayo de mancha en el césped: (i) zona de inhibición de 10 mm o más para Salmonella, (ii) zona de inhibición de 9 mm o más para Listeria monocytogenes, (iii) zona de inhibición de 9 mm o más para Staphyloccocus aureus, (iv) zona de inhibición de 10 mm o más para Escherichia coli.

La presente invención proporciona una composición que comprende al menos la cepa depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), Universidad de Valencia, Parc Científic Universitat de Valéncia, Catedrático Agustin Escardino, 9, 46980 Paterna (Valencia, España)) por AQUILON CYL S.L., con el número de depósito CECT 8700 (AqSynRMH69) el 10 de septiembre de 2014. La composición de la invención puede comprender además al menos una cepa de microorganismos, tal como al menos una, o al menos dos, o al menos tres, o al menos cuatro, o al menos cinco, o al menos seis, o al menos siete, o al menos ocho, y así sucesivamente, en la que cada cepa adicional tiene al menos una de las siguientes actividades antimicrobianas, tal como se evidencia mediante las zonas de inhibición determinadas por el ensayo de mancha en el césped: (i) zona de inhibición de 10 mm o más para Salmonella, (ii) zona de inhibición de 9 mm o más para Listeria monocytogenes, (iii) zona de inhibición de 9 mm o más para Staphyloccocus aureus, (iv) zona de inhibición de 10 mm o más para Escherichia coli.

Esta al menos una cepa adicional comprendida en la composición puede seleccionarse preferiblemente de las cepas que pertenecen al grupo que consiste en los géneros Lactobacillus (preferiblemente con la excepción de Lactobacillus fermentum (preferiblemente CECT 8347 (AqSynJ12)) y Lactobacillus mucosae (preferiblemente CECT 8349 (AqSynJ55)), Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus, Streptococcus, Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Sporolactobacillus, Tetragenococcus, Vagococcus y/o Weisella.

Por ejemplo, la composición comprende o, alternativamente, consiste en CECT 8700 (AqSynRMH69) y al menos una, y preferiblemente una, cepa adicional seleccionada del grupo que consiste en: CECT 8163 (AqSyn04); CECT 8165 (AqSyn06); CECT 8164 (AqSyn09); CECT 8166 (AqSyn10), CECT 8347 (AqSynJ12); CECT 8348 (AqSynJ17); CECT 8349 (AqSynJ55) y CECT 8350 (AqSynJ59).

Se depositaron CECT 8163 (AqSyn04); CECT 8165 (AqSyn06); CECT 8164 (AqSyn09); CECT 8166 (AqSyn10), CECT 8347 (AqSynJ12); CECT 8348 (AqSynJ17); CECT 8349 (AqSynJ55) y CECT 8350 (AqSynJ59) en la CECT (Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), Universidad de Valencia, Parc Científic Universitat de Valéncia, Catedrático Agustín Escardino, 9, 46980 Paterna (Valencia, España)) por AQUILON CYL S.L. Se depositaron CECT 8163 (AqSyn04); CECT 8165 (AqSyn06); CECT 8164 (AqSyn09) y CECT 8166 (AqSyn10) el 20 de junio de 2012. Se depositaron CECT 8347 (AqSynJ12); CECT 8348 (AqSynJ17); CECT 8349 (AqSynJ55) y CECT 8350 (AqSynJ59) el 16 de mayo de 2013.

CECT 8700 (AqSynRMH69): Lactobacillus reuteri

CECT 8163 (AqSyn04): Lactobacillus reuteri

CECT 8165 (AqSyn06): Lactobacillus reuteri

CECT 8164 (AqSyn09): Enterococcus faecium

CECT 8166 (AqSyn10): Enterococcus faecium

CECT 8347 (AqSynJ12): Lactobacillus fermentum

CECT 8348 (AqSynJ17): Lactobacillus reuteri

CECT 8349 (AqSynJ55): Lactobacillus mucosae

CECT 8350 (AqSynJ59): Lactobacillus plantarum

Por ejemplo, en una realización preferida, la composición de la invención que comprende la cepa depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo con el número de depósito CECT 8700 (AqSynRMH69) comprende además la cepa depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo con el número de depósito CECT 8350 (AqSynJ59). La composición puede no comprender ninguna cepa adicional.

En una realización más preferida, la composición comprende dos cepas de microorganismos. Preferiblemente, una de las cepas es CECT 8700 (AqSynRMH69). Incluso más preferiblemente, la composición de la invención comprende o, alternativamente, consiste en dos microorganismos, tales como dos cepas. Preferiblemente, los dos microorganismos son la cepa depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo con el número de depósito CECT 8700 (AqSynRMH69) y la cepa depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo con el número de depósito CECT 8350 (AqSynJ59). En esta realización, la composición puede comprender además otros componentes que no sean microorganismos, es decir, la composición puede comprender componentes adicionales (tales como los que se describen a continuación), pero preferiblemente la composición no comprende cepas adicionales además de CECT 8350 (AqSynJ59) y CECT 8700 (AqSynRMH69).

Por consiguiente, la composición de la invención puede comprender una mezcla de microorganismos, en la que los microorganismos pertenecen a las especies Lactobacillus plantarum y Lactobacillus reuteri. Opcionalmente, la composición de la invención puede incluir además al menos un microorganismo que pertenece a los géneros Lactobacillus (preferiblemente con la excepción de Lactobacillus fermentum CECT 8347 (AqSynJ12)) y Lactobacillus mucosae CECT 8349 (AqSynJ55)), Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus, Streptococcus, Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Sporolactobacillus, Tetragenococcus, Vagococcus y/o Weisella. Opcionalmente, la composición de la invención puede incluir además al menos un microorganismo que pertenece a los géneros Lactobacillus (preferiblemente con la excepción de microorganismos que pertenecen a las especies Lactobacillus fermentum y Lactobacillus mucosae) Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus, Streptococcus, Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Sporolactobacillus, Tetragenococcus, Vagococcus y/o Weisella.

En una realización preferida, la composición de la invención comprende una mezcla de microorganismos, en la que la mezcla consiste en al menos una cepa de Lactobacillus plantarum y al menos una cepa de Lactobacillus reuteri. En una realización más preferida, la composición de la invención comprende una mezcla de microorganismos, en la que la mezcla consiste en una cepa de Lactobacillus plantarum y una cepa de Lactobacillus reuteri. Una cepa preferida de Lactobacillus plantarum es la CECT 8350 (AqSynJ59). Una cepa preferida de Lactobacillus reuteri es la CECT 8700 (AqSynRMH69). En una realización aún más preferida, la composición de la invención comprende una mezcla de microorganismos, en la que la mezcla consiste en CECT 8350 (AqSynJ59) y CECT 8700 (AqSynRMH69). Se cree que las diferentes cepas pueden tener diferentes acciones en el intestino y, por tanto, diferentes cepas pueden actuar juntas para proporcionar un efecto beneficioso.

En una realización de la presente invención, al menos una de las cepas comprendidas en la composición de la invención, tal como una, y/o dos, y/o tres, y/o cuatro, y/o cinco, y/o seis, y/o siete, y/u ocho de las cepas comprendidas en la composición, y preferiblemente todas las cepas comprendidas en la composición, están libres de resistencia a los antibióticos, es decir, no son capaces de sobrevivir después de la exposición al tratamiento antibiótico convencional apropiado.

Por ejemplo, en una realización, la composición comprende o, alternativamente, consiste en CECT 8700 (AqSynRMH69) y CECT 8350 (AqSynJ59) libres de resistencia a los antibióticos.

Con el fin de distinguir las cepas resistentes de las susceptibles, la Comisión Técnica de Aditivos y Productos o Sustancias utilizados en los Piensos para Animales (FEEDAP) de la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) define valores de corte microbiológicos. Los valores de corte microbiológicos se establecen estudiando la distribución de las CMI de los antimicrobianos elegidos en poblaciones bacterianas pertenecientes a una única unidad taxonómica (especie o género). La parte de la población que se desvía claramente de las poblaciones susceptibles normales se clasifica como resistente. Los valores de corte microbiológicos que pueden usarse para evaluar las resistencias a los antibióticos de las cepas de la presente invención son los definidos en “Guidance on the assessment of bacterial susceptibility to antimicrobials of human and veterinary importance", Panel EFSA sobre Aditivos y Productos o Sustancias utilizados en los Piensos para Animales (Fe e Da P), Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA), Parma, Italia. EFSA Journal 2012;10(6):2740.

Puede realizarse una prueba in vitro de concentración inhibitoria mínima (CIM) para evaluar las resistencias a los antibióticos de todas las cepas propuestas. Los antibióticos evaluados pueden ser los siguientes: ampicilina, vancomicina, gentamicina, kanamicina, estreptomicina, eritromicina, clindamicina, tetraciclina y cloranfenicol.

El otro componente (u otros componentes) que puede estar presente en la composición de la invención no está limitado en modo alguno. En un aspecto preferido, al menos un compuesto prebiótico está comprendido en la composición de la invención, es decir, como otro componente. En un concepto muy amplio, los prebióticos son todas aquellas fuentes alimentarias que pueden ser metabolizadas por los probióticos. Preferiblemente, los prebióticos no son digeribles o son poco digeribles por un mamífero. Por tanto, tras la ingesta por el mamífero, los prebióticos no digeribles pueden atravesar el intestino delgado y entrar en el intestino grueso para estimular el crecimiento de los probióticos en este compartimento. Por tanto, los prebióticos pueden servir como fuente alimentaria para los probióticos. Se cree que los prebióticos, muchos de los cuales son hidratos de carbono no digeribles, promueven el crecimiento de los probióticos dentro del intestino. Los prebióticos se encuentran de manera natural, por ejemplo, en las cebollas, los cereales integrales, los plátanos, el ajo, la miel, los puerros, las alcachofas, los alimentos y bebidas enriquecidos, así como en los suplementos alimenticios. Los prebióticos se conocen bien en la técnica y cuando se usan en la presente invención no hay ninguna limitación particular del prebiótico como tal. Sin embargo, en las realizaciones preferidas, el al menos un producto prebiótico de la composición se selecciona de los siguientes compuestos y composiciones: hidratos de carbono no digeribles, betaglucanos, manano-oligosacáridos, inulina, oligofructosa, galactooligosacáridos (GOS), lactulosa, lactosacarosa, galactotriosa, fructooligosacárido (FOS), celobiosa, celodextrinas, ciclodextrinas, maltitol, lactitol, glucosilsacarosa, vitamina E o una variante de la misma (en la que las variantes se seleccionan de alfa, beta, gamma, delta tocoferoles, tocotrienoles y tocomonoenoles). Opcionalmente, pueden preferirse manano-oligosacáridos y/o inulina. Opcionalmente, pueden preferirse mananooligosacáridos, beta-glucanos y/o inulina.

Por ejemplo, la composición de la presente invención puede comprender además espesantes y/o alimentos/nutrientes complementarios. Por ejemplo, la composición de la presente invención puede comprender uno o más espesantes (agentes espesantes, es decir, sustancias que pueden aumentar la viscosidad de un líquido sin cambiar sustancialmente sus otras propiedades, y que pueden mejorar la suspensión de otros componentes o emulsiones, lo que aumenta la estabilidad del producto), tales como polisacáridos (pectina, gomas vegetales y/o almidón) o proteínas. Por ejemplo, la composición de la presente invención comprende además gomas vegetales tales como alginina, goma garrofín, goma xantana y/o goma guar, preferiblemente goma xantana y/o goma guar. Por ejemplo, la composición puede comprender gomas vegetales tales como goma xantana y goma guar en una cantidad de aproximadamente el 0,1 - 0,5%, preferiblemente de aproximadamente el 0,3% p/v (0,3 gramos de espesante (por ejemplo, gomas vegetales tales como goma xantana y goma guar) en 100 ml).

Además, la composición de la presente invención puede comprender alimentos (nutrientes) complementarios, tales como por ejemplo productos lácteos, azúcares, etc. La composición puede comprender leche desnatada en polvo en una cantidad de aproximadamente el 0,5 - 2% p/v, preferiblemente de aproximadamente el 1% p/v. La composición puede comprender además azúcar (preferiblemente sacarosa) en una cantidad de aproximadamente el 0,1% p/v al 1% p/v, preferiblemente de aproximadamente el 0,5% p/v.

Además, la composición de la presente invención puede comprender además una disolución de infusión, tal como agua salina (agua con NaCl). Por ejemplo, la composición puede comprender agua con aproximadamente el 0,9% p/v de NaCl como disolución de infusión.

En una realización, la composición de la presente invención comprende o, alternativamente, consiste en lo siguiente:

Con respecto a las composiciones de la invención, que pueden comprender diferentes cepas, es posible cualquier razón de mezclado. La razón de mezclado se indica en unidades formadoras de colonias (UFC), que se determinan adecuadamente antes de mezclar las cepas individuales. En una realización, las razones de las cepas pueden o no ser iguales, tales como 1:(0,1-1) para una composición que comprende dos cepas, 1:(0,1-10):(0,1-10) para una composición que comprende tres cepas, 1:(0,1-10):(0,1-10):(0,1-10) para una composición que comprende cuatro cepas, y así sucesivamente. Por ejemplo, la razón en una composición que comprende dos cepas puede ser de desde 1:2 hasta 2:1. En otra realización, las razones de las cepas son aproximadamente o sustancialmente iguales, tal como 1:1 para una composición que comprende dos cepas, 1:1:1 para una composición que comprende tres cepas, 1:1:1:1 para una composición que comprende cuatro cepas, y así sucesivamente. La composición puede prepararse mezclando la cantidad bacteriana respectiva (tal como se determina mediante recuento de colonias) de cada cepa que va a incorporarse a la composición. Las cepas que van a incorporarse pueden suministrarse como reservas de cepas individuales, cada una de ellas, por ejemplo, en forma de liofilizado. En caso de que las diferentes reservas tengan diferentes concentraciones (UFC/g), se usan cantidades adecuadas (g) de cada una de ellas, de modo que la composición deseada tenga las UFC deseadas de cada una de las cepas. A continuación se muestran algunos ejemplos.

En una realización preferida, cuando la composición comprende o, alternativamente consiste en dos cepas, las razones de las cepas son aproximadamente o sustancialmente iguales, tal como 1:1. Por ejemplo, la composición de la presente invención puede comprender o, alternativamente consistir en, la cepa AqSynJ59-Lactobacillus plantarum y la cepa AqSynRMH69-Lactobacillus reuteri en una razón 1:1, tal como por ejemplo más de o aproximadamente 5 * 108 UFC de cada una de las cepas anteriores (por ejemplo, un total de más de o aproximadamente 109 UFC en la composición).

La presente divulgación también proporciona el uso de la composición de la invención en un método de tratamiento de un humano y/o un animal. Por tanto, la composición de la invención puede usarse en un método de tratamiento terapéutico (después de la manifestación clínica de la enfermedad (por ejemplo, diarrea)) y/o tratamiento profiláctico (antes de la manifestación clínica de la enfermedad (por ejemplo, diarrea)). Puede preferirse el tratamiento de un animal, un mamífero y/o un animal doméstico en particular. Preferiblemente, el animal es un animal no humano, y más preferiblemente es del suborden Suina (el suborden Suina (también conocido como suiformes) es un linaje de mamíferos que incluye los cerdos y los pecaríes de las familias Suidae y Tayassuidae). Puede preferirse particularmente el cerdo, o bien salvaje o bien doméstico. Esto también incluye cerdos que viven en condiciones semisalvajes, es decir, razas de cerdos domésticos que viven la mayor parte del año al aire libre y buscan su propio alimento. La composición puede ser una composición que comprenda al menos una de las cepas depositadas descritas anteriormente. En otra realización, la composición de la invención puede administrarse a un humano.

La composición de la invención puede usarse en un método para tratar a un humano o a un animal, tal como se describió anteriormente. Este método para tratar a un humano o a un animal puede ser un método para aumentar el peso de un mamífero recién nacido, preferiblemente un lechón. Además, el método para tratar a un humano o a un animal puede ser un método para promover el crecimiento de un mamífero recién nacido, preferiblemente un lechón. Además, el método para tratar a un humano o a un animal puede ser un método para tratar o prevenir la diarrea en un mamífero recién nacido, preferiblemente un lechón. La diarrea puede estar provocada por una infección vírica. Además, la composición de la presente invención puede administrarse antes de que se detecte cualquier síntoma, con el fin de prevenir una afección en un humano y/o un animal, tal como por ejemplo diarrea y/o una infección, por ejemplo una infección bacteriana y/o una infección vírica.

La composición de la invención puede usarse preferiblemente en un método para tratar a un animal.

Preferiblemente, el animal es un animal de granja, y los animales de granja incluyen, sin limitación, caballos, ganado vacuno, pollos y otras aves de corral, cerdos, ovejas, cabras. Más preferiblemente, el animal es del suborden Suina, incluso más preferiblemente un lechón. Este método para tratar a un animal puede ser un método para aumentar el peso de un mamífero recién nacido, preferiblemente un lechón. Además y/o alternativamente, el método para tratar a un animal puede ser un método para promover el crecimiento de un mamífero recién nacido, preferiblemente un lechón. Además y/o alternativamente, el método para tratar a un animal puede ser un método para tratar o prevenir la diarrea en un mamífero recién nacido, preferiblemente un lechón. La diarrea está provocada por una infección vírica. Además, la composición de la presente invención puede administrarse antes de que se detecte cualquier síntoma, con el fin de prevenir una afección en un animal, tal como por ejemplo diarrea y/o una infección, como una infección bacteriana y/o vírica.

La composición de la presente invención puede administrarse de manera beneficiosa a un mamífero recién nacido, preferiblemente un lechón, aunque no se haya producido (todavía) ninguna manifestación clínica de la enfermedad (por ejemplo, diarrea). Por ejemplo, la composición de la presente invención puede administrarse de manera beneficiosa a mamíferos recién nacidos sanos, preferiblemente lechones.

La composición de la presente invención puede administrarse a mamíferos recién nacidos, preferiblemente lechones que:

- presentan manifestaciones clínicas de diarrea.

- no presentan (todavía) manifestaciones clínicas de diarrea, pero están infectados por bacterias y/o virus que pueden provocar diarrea.

- están sanos.

Preferiblemente, el humano y/o el animal que están tratándose con la composición de la presente invención no están sometidos a ningún otro tratamiento; preferiblemente, el humano y/o el animal no están tratándose con antibióticos. Los antibióticos son medicamentos usados para tratar y/o prevenir infecciones tales como infecciones bacterianas. En una realización preferida, la composición de la invención se administra a humanos y/o animales recién nacidos (preferiblemente lechones) en una fase temprana después del nacimiento, concretamente dentro de los primeros 30 días después del nacimiento, preferiblemente dentro de los primeros 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 ó 2 días después del nacimiento y más preferiblemente dentro de los primeros 2 días (48 horas) después del nacimiento o dentro del primer día (24 horas) después del nacimiento. Preferiblemente se administra al menos tres veces, tal como dos veces o una vez. Preferiblemente, la composición de la invención se administra al menos una vez (tal como una vez) dentro de las primeras 48 horas después del nacimiento. Preferiblemente, la composición de la invención se administra una vez dentro de las primeras 48 horas después del nacimiento, incluso más preferiblemente dentro de las primeras 24 horas después del nacimiento, tal como justo (inmediatamente) después del nacimiento. La composición de la invención puede administrarse dos veces; una dentro del primer día después del nacimiento y la segunda dentro del segundo día después del nacimiento.

Tal como se describió anteriormente, al menos una (tal como una), tal como al menos dos (tal como dos), tal como al menos tres, tal como cuatro o más de cuatro cepas diferentes de microorganismos, (siendo más preferiblemente dos), preferiblemente bacterias y más preferiblemente bacterias del ácido láctico, seleccionadas según al menos uno, y preferiblemente los tres criterios a. a c. tal como se describió anteriormente, están comprendidas en la composición de la invención. En el caso de la composición para su uso en un método para tratar a un humano y/o a un animal, tal como se describió anteriormente, cada microorganismo, preferiblemente bacterias y más preferiblemente bacteria del ácido láctico, debe cumplir al menos uno de los criterios a. a c. (actividad contra bacterias no deseadas; tolerancia a los ácidos; tolerancia a las sales biliares), tal como se describió anteriormente. Con respecto al criterio a., la zona de inhibición mínima mencionada anteriormente se observa preferiblemente para todas las bacterias no deseadas (i) a (iv). Preferiblemente, los microorganismos, preferiblemente bacterias y más preferiblemente bacterias del ácido láctico comprendidas en la composición de la presente invención deben cumplir una pluralidad (tal como a. y b.) y preferiblemente todos los criterios (a. a c.) anteriores. Además, preferiblemente, al menos una (tal como una), tal como al menos dos (tal como dos), tal como al menos tres, tal como cuatro o más de cuatro cepas diferentes de microorganismos, (siendo más preferiblemente dos), preferiblemente bacterias y más preferiblemente bacterias del ácido láctico comprendidas en la composición de la invención (adecuada para su uso en un método para tratar a un humano y/o un animal) están libres de resistencia a los antibióticos, es decir, no son capaces de sobrevivir después de la exposición al tratamiento antibiótico convencional apropiado. En dicho método para tratar a un humano y/o a un animal puede usarse o bien una composición probiótica o bien una composición simbiótica (es decir, una que comprenda al menos un compuesto prebiótico).

La composición de la invención comprende preferiblemente microorganismos vivos, preferiblemente bacterias. Los presentes inventores han descubierto que la administración de la composición de la invención en cualquiera de sus variantes en el momento adecuado (es decir, en una fase temprana después del nacimiento, tal como se describió anteriormente) tiene un efecto drástico en la forma en que un humano o animal recién nacido (preferiblemente un lechón) puede gestionar la disbiosis de diferentes etiologías. Por ejemplo, para que la composición tenga mejores efectos en el tratamiento de un humano y/o animal, por ejemplo en el tratamiento o prevención de la diarrea, los inventores han descubierto que la composición debe administrarse preferiblemente en una fase temprana después del nacimiento, por ejemplo dentro de los primeros 30 días después del nacimiento (más preferiblemente dentro de los primeros 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 ó 2 días después del nacimiento y más preferiblemente dentro de los primeros 2 días después del nacimiento o dentro del primer día (24 horas) después del nacimiento. Incluso más preferiblemente, la composición de la invención se administra dentro de los dos primeros días después del nacimiento, tal como por ejemplo una vez dentro de las primeras 48 horas después del nacimiento, y/o tal como por ejemplo en el primer día después del nacimiento (24 horas) y/o en el segundo día después del nacimiento. La composición puede (opcionalmente además) administrarse el tercer día después del nacimiento. Preferiblemente, la composición de la invención se administra una vez dentro de las primeras 48 horas después del nacimiento, incluso más preferiblemente dentro de las primeras 24 horas después del nacimiento, como justo después del nacimiento. De manera opcional, especialmente si se observan diarrea y/o síntomas de infección en el animal y/o humano, se administra una segunda dosis de la composición probiótica 24 horas después de la primera dosis.

Cualquier vía de administración es adecuada, pero puede preferirse la administración oral. Lo más habitual es administrar una dosis a cada animal directamente en la boca para asegurarse de que el animal traga la dosis. Alternativamente, la composición también puede proporcionarse como suplemento alimenticio, es decir, añadirse al alimento diario del animal.

La composición puede estar en cualquier forma, tal como en forma liofilizada, líquida o nebulizada. Si, por ejemplo, se usan bacterias liofilizadas para elaborar la composición, entonces dicha composición preliminar de bacterias liofilizadas puede rehidratarse, por ejemplo, con solución salina isotónica estéril o con agua estéril o con medio de cultivo estéril, de modo que pueda obtenerse una composición final con la concentración total deseada (UFC/ml). Para facilitar su uso, la composición puede presentarse en forma dosificada. Por ejemplo, cada dosis puede comprender 107 o más, 108 o más, 109 o más, 1010 o más, 1011 o más unidades formadoras de colonias (UFC) de microorganismos (preferiblemente bacterias); puede preferirse una dosis de 109 o más. Una dosis puede tener un volumen en el intervalo de 0,1 a 100 ml, preferiblemente de 0,2 a 50 ml, más preferiblemente de 0,5 a 20 ml, más preferiblemente de 1,0 a 10 ml, más preferiblemente de 1,5 a 5 ml, e incluso más preferiblemente (sustancialmente) 2 ml. Una dosis de 2 ml con 109 o más UFC puede ser particularmente preferida. En el caso de que la composición comprenda dos cepas, la dosis de 2 ml comprenderá preferiblemente 5108 UFC de cada cepa (es decir, un total de 109 UFC por dosis).

Puede administrarse cualquier número de dosis y el experto puede elegir la duración del tratamiento en función según las necesidades en la granja respectiva. En una realización particular, el número total de dosis administradas a un animal es de 10 o menos, tal como cualquier número seleccionado de los siguientes: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o cualquier intervalo que combine uno cualquiera de estos números (excepto 10) con uno cualquiera de estos números, siempre que el segundo número sea superior (por ejemplo, de 1 a 3 dosis).

Por ejemplo, se administra al menos una dosis única a un animal en las primeras 48 horas después del nacimiento. Por ejemplo, se administra una dosis única a un animal dentro de las primeras 48 horas después del nacimiento. Por ejemplo, se administra una dosis única a un animal justo después del nacimiento (dentro de las primeras 24 horas después del nacimiento). De manera opcional, preferiblemente si el animal muestra síntomas de diarrea y/o infección, se administra una segunda dosis al animal 24 horas después de la primera dosis. Opcionalmente, puede administrarse posteriormente una tercera dosis 24 horas después de la segunda dosis, y así sucesivamente.

Puede preferirse un total de dos dosis por animal. En una realización preferida, se administra una primera dosis en las primeras 24 horas después del nacimiento (día 1 después del nacimiento) y una segunda dosis en las siguientes 24 horas (día 2 después del nacimiento). Opcionalmente, éstas son las dos únicas dosis. En otra opción, se administran dosis adicionales en lo sucesivo, tal como una tercera dosis en el tercer día después del nacimiento, y/o una cuarta dosis en el cuarto día después del nacimiento y así sucesivamente.

Preferiblemente, las dosis comprenden, cada una, al menos dos cepas. Preferiblemente, las dos cepas son CECT 8700 (AqSynRMH69) y CECT 8350 (AqSynJ59), y se administran en dosis de 2 ml, que comprenden 5108 UFC de cada cepa (es decir, las cepas están en una razón indicada en unidades formadoras de colonias (UFC) de 1:1), dentro de las primeras 48 horas después del nacimiento, tal como dentro de las primeras 24 horas después del nacimiento, preferiblemente justo después del nacimiento. Opcionalmente, puede administrarse una segunda dosis y/o tercera dosis dentro de las primeras 48 horas después del nacimiento y/o el tercer día después del nacimiento. Por ejemplo, puede administrarse una dosis justo después del nacimiento (en las primeras 24 horas) y, opcionalmente, una segunda dosis 24 horas después de la primera dosis, es decir, durante el segundo día después del nacimiento, especialmente si se observan síntomas de diarrea y/o infección. Opcionalmente, puede administrarse una tercera dosis el tercer día después del nacimiento. Se administran preferiblemente a mamíferos, preferiblemente a lechones recién nacidos.

Preferiblemente, las dosis comprenden, cada una, al menos dos cepas. Preferiblemente, las dos cepas son CECT 8700 (AqSynRMH69) y CECT 8350 (AqSynJ59), y se administran en dosis de 2 ml, que comprenden 5108 UFC de cada cepa (es decir, las cepas están en una razón indicada en unidades formadoras de colonias (UFC) de 1:1), el primer día y el segundo día después del nacimiento. Opcionalmente, puede administrarse una tercera dosis el tercer día después del nacimiento. Se administran preferiblemente a mamíferos, preferiblemente a lechones recién nacidos.

La composición de la invención es particularmente adecuada para tratar o prevenir una afección en un humano y/o un animal, preferiblemente un mamífero recién nacido, tal como se describió anteriormente, tal como la diarrea, una infección vírica o una disbiosis. La infección puede ser o incluir una infección del tubo digestivo. La infección puede estar provocada por cualquier virus, tal como rotavirus, coronavirus, norovirus, adenovirus y/o astrovirus, preferiblemente por rotavirus y/o coronavirus.

También es posible administrar la composición a animales que padezcan diarrea o que corran el riesgo de padecer diarrea, aunque no se haya demostrado (todavía) que una infección vírica sea el factor causante de dicha diarrea. Se consideran animales que corren el riesgo de padecer diarrea aquellos animales que viven (o han nacido) en instalaciones en las que se ha observado diarrea durante los últimos 12 meses, 6 meses, 3 meses o 1 mes.

La composición de la invención también puede administrarse antes de que el humano y/o el animal presente cualquier síntoma de diarrea y/o de cualquier infección, con el fin de prevenir la diarrea y/o la infección.

El experto puede detectar síntomas de diarrea y/o de cualquier infección en un humano y/o animal. Por ejemplo, los síntomas pueden ser diarrea acuosa, heces acuosas/delgadas (pastosas), dolor, signos sistémicos leves tales como pirexia, anorexia y/o letargo, debilidad, empeoramiento/deterioro del estado general del cuerpo, adelgazamiento, etc. Cualquier otro síntoma indicativo de un comportamiento anómalo puede ser indicativo de diarrea y/o infección. La composición de la invención también puede administrarse si el humano y/o el animal no presentan síntomas de diarrea y/o de infección, es decir, a humanos y/o animales sanos.

En una realización preferida, la composición de la invención comprende o, alternativamente, consiste en CECT 8700 (AqSynRMH69) y CeCT 8350 (AqSynJ59), y se administran en dosis de 2 ml que comprenden 5108 UFC de cada cepa a un animal recién nacido, preferiblemente un lechón recién nacido, dos veces, una en el primer día después del nacimiento y la otra en el segundo día después del nacimiento (por ejemplo 24 horas después de la administración de la primera dosis). La composición puede usarse en un método de tratamiento de lechones recién nacidos, en particular en un método de tratamiento y/o prevención de la diarrea provocada por una infección vírica. La composición también puede administrarse a lechones recién nacidos sanos (es decir, lechones sin síntomas de diarrea y/o infección). Además, la composición también puede usarse en un método para aumentar el peso y/o promover el crecimiento de un animal recién nacido, preferiblemente un lechón recién nacido.

Los resultados del inventor confirman el efecto ventajoso del uso de los productos y composiciones de la invención. Tal como se muestra en los siguientes ejemplos de prueba de concepto, el porcentaje de mortalidad fue claramente inferior al de otras semanas en las que sólo se administró antibiótico de manera rutinaria (véanse los ejemplos). Por tanto, preferiblemente la composición de la invención se administra a animales que no se tratan al mismo tiempo con antibiótico(s).

La presente invención también proporciona un microorganismo, la cepa CECT 8700 (AqSynRMH69). Se cree que esta cepa tiene propiedades probióticas y, por tanto, puede denominarse probiótica en el presente documento. La cepa se aisló por los presentes inventores según los criterios de selección mencionados anteriormente. CECT se refiere a la Colección Española de Cultivos Tipo, mientras que los números AqSyn entre paréntesis, que pueden utilizarse como sinónimos para cada una de las cepas, se asignaron a las cepas por los presentes inventores. La bacteria se sometió a prueba y se encontró que cumplía al menos uno de los criterios a. a c. anteriores.

A la hora de encontrar cepas adicionales con propiedades beneficiosas según la presente invención, puede ser suficiente que cualquiera de dichas cepas, para seleccionarse como adecuada para la presente invención, cumpla al menos uno de los criterios a. a c. anteriores. La invención también proporciona una composición que comprende al menos una, tal como una, preferiblemente al menos dos, tal como dos, más preferiblemente al menos tres, tal como tres, más preferiblemente al menos cuatro, tal como cuatro, alternativamente al menos cinco, tal como cinco, alternativamente al menos seis, tal como seis, alternativamente al menos siete, tal como siete, alternativamente al menos ocho, tal como ocho, de estas cepas. Se cree que las diferentes cepas tienen diferentes acciones en el intestino y, por tanto, diferentes cepas pueden actuar juntas para proporcionar un efecto beneficioso.

Ejemplos

EJEMPLO 1

Material y métodos

Medio MRS: se preparó la receta del medio MRS según la receta obtenida de la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT; www.cect.org) tal como sigue: peptona 10,0 g, extracto de carne de vacuno 10,0 g, extracto de levadura 5,0 g, glucosa 20,0 g, citrato de amonio 2,00 g, acetato de sodio 5,00 g, MgSO4.7H2O 0,20 g, MnSO4.H2O 0,05 g, K2HPO42,00 g, [agar en polvo (sólo para medios sólidos) 15 g,] agua destilada 1 l.

Se preparó la receta del medio BHI (infusión de cerebro y corazón) según la receta obtenida de la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT; www.cect.org) tal como sigue: sólidos de infusión de cerebro de ternero 12,5 g, sólidos de infusión de corazón de ternera 5,0 g, peptona proteosa 10,0 g, glucosa 2,0 g, NaCl 5,0 g, Hna2PO42,5 g, agua destilada 1 l, [agar en polvo (sólo para medios sólidos) 15 g].

Tratamiento antibiótico: normalmente, cada granja porcina trata a los lechones recién nacidos con antibióticos y posiblemente con un suplemento de hierro. Generalmente, cada granja porcina tiene un tratamiento “convencional” diferente para sus animales (habitualmente inyectan una dosis de antibióticos y un suplemento de hierro al nacer). En los experimentos a continuación, se usó el tratamiento convencional de la granja correspondiente. Generalmente, los antibióticos también se usan de manera esporádica por diarreas, cojeras, síntomas respiratorios y muchos otros hechos cotidianos sin un protocolo completo establecido en lechones.

Ejemplo 1 A: origen de las cepas

Se aislaron y se identificaron las cepas bacterianas tal como sigue.

Se realizó el aislamiento de las cepas bacterianas CECT 8350 (AqSynJ59) y CECT 8700 (AqSynRMH69) a partir de lavados de la pared intestinal del intestino de lechones.

Se cultivaron las muestras de manera aeróbica y anaerobia en placas de agar De Man, Rogosa, Sharpe (MRS) durante 24 horas a 37°C, y se aislaron colonias Gram positivas y catalasa negativas de diferentes morfologías. Todas las colonias pertenecían a cepas bacterianas. Cada cepa aislada se amplificó mediante PCR usando cebadores de PCR dirigidos a la región espaciadora ARNr 16S/23S, tal como se describe en Berthier y Ehrlich, 1998. FEMS Microbiology Letters 161: 97-106.

Después de la amplificación y la electroforesis, se purificaron y se secuenciaron las bandas claramente diferenciadas. Mediante secuenciación se asignaron las cepas a las especies bacterianas.

0.1 Caracterización y selección de las cepas

0. Lactobacillus plantarum (AqSynJ59)

2. Lactobacillus reuteri (AqSynRMH69)

Las pruebas in vitro según los criterios a. a c. descritos anteriormente en el apartado “pruebas in vitro de selección” revelaron dos cepas con propiedades especialmente beneficiosas.

0. Inhibición contra diferentes patógenos: las cepas seleccionadas muestran una actividad antimicrobiana evidenciada mediante al menos una de las siguientes zonas de inhibición: 10 mm o más para Salmonella, 9 mm o más para Listeria monocytogenes, 9 mm o más para Staphyloccocus aureus y 10 mm o más para Escherichia coli.

A continuación se indican los resultados de AqSynJ59 y AqSynRMH69.

Tal como puede observarse en la tabla anterior, las cepas seleccionadas de intestino de lechón cumplen los criterios de selección a. a c. tal como se describió anteriormente.

b. Resistencia al pH: ambas cepas son capaces de retener esencialmente la misma viabilidad durante 3 horas de incubación a pH=3,5.

c. Resistencia a las sales biliares. Ambas cepas son capaces de retener esencialmente la misma viabilidad durante 4 horas de incubación en presencia del 0,45% de extracto biliar.

Además, las cepas identificadas anteriormente están libres de resistencia a los antibióticos.

Se realizó una prueba in vitro de concentración inhibitoria mínima (CIM) para evaluar las resistencias a los antibióticos de las cepas anteriores (AqSynJ59 y AqSynRMH69). Los antibióticos evaluados fueron los siguientes: ampicilina, vancomicina, gentamicina, kanamicina, estreptomicina, clindamicina, tetraciclina y cloranfenicol.

Los valores de corte microbiológicos que se usaron para evaluar las resistencias a los antibióticos de las cepas de la presente invención son los definidos en la “Guidance on the assessment of bacterial susceptibility to antimicrobials of human and veterinary importance”, Panel EFSA sobre Aditivos y Productos o Sustancias utilizados en los Piensos para Animales (FEEDAP), Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA), Parma, Italia. EFSA Journal 2012; 10(6):2740.

Resistencia a los antibióticos de los valores de corte de la EFSA en comparación con los resultados de la CMI de cada bacteria:

*: Sensible

**: Resistente

LSM = El medio de prueba de susceptibilidad de LAB que consistía en una mezcla de caldo IST (laboratorios Oxoid) (90%) y caldo MRS (10%) ajustado a pH 6,7.

Ambas cepas pueden considerarse no resistentes a los antibióticos recomendados por la EFSA, por lo que pueden usarse como aditivos para piensos para “producir alimentos”.

Ejemplo 1B: preparación de una composición probiótica según la invención

Las cepas CECT 8350 (AqSynJ59) y CECT 8700 (AqSynRMH69), que cumplen los criterios a. a c., descritos en la descripción y evidenciados anteriormente, se incluyeron en una composición probiótica y se sometieron a prueba en un ensayo de campo.

Cada una de las cepas AqSynJ59 y AqSynRMH69 se hizo crecer en el cultivo de caldo MRS por fermentación, se recogió y se liofilizó. La viabilidad del producto final se comprobó mediante recuento de colonias.

Se preparó una composición que contenía estas dos cepas. Se preparó la siguiente composición:

Composición: (5 * 108 UFC de cada cepa en 2 ml)

Todas las cepas se utilizaron en forma liofilizada.

Se preparó la composición mezclando la misma cantidad bacteriana (tal como se determina mediante recuento de colonias (valores respectivos en g indicados anteriormente) de cada cepa que va a incorporarse a la composición y la composición así obtenida se rehidrató con solución salina isotónica, de modo que se obtuvo una composición final que contenía 109 UFC (total de todas las cepas contenidas en la misma) en una dosis de 2 ml.

Ejemplo 1C: prueba de campo

Se detectó diarrea en lechones recién nacidos en una granja porcina del norte de España en la que se sometió a prueba el producto de las dos cepas.

La unidad de producción básica de la granja es la “unidad de nacimiento”. Cada unidad de nacimiento se compone de 24 camadas. En el experimento, 12 de las camadas se gestionaron en las condiciones de granja convencionales (grupo de control, que requieren el uso de antibióticos y composiciones nutritivas para tratar a los lechones de una camada que han mostrado signos de diarrea). Las otras 12 camadas se trataron únicamente con la composición probiótica de Aquilón, sin uso adicional de antibióticos en caso de diarrea (a todos los lechones se les administró por vía oral una dosis de la composición (2 ml), tal como se describió anteriormente, el primer día después del nacimiento (justo después del nacimiento). Se administró una segunda dosis (2 ml) de la composición el segundo día después del nacimiento (después de 24 horas de la administración de la primera dosis) sólo a aquellos animales del grupo que mostraron síntomas de diarrea). Los animales que recibieron la composición probiótica no recibieron antibióticos en ningún momento (aunque sí recibieron un tratamiento consistente en la adición de nutrientes a la dieta igual que los animales gestionados de manera convencional (grupo de control) en caso de que mostraran síntomas de diarrea). Los animales se controlaron desde su nacimiento hasta el día 20 de vida.

La composición probiótica usada en este ensayo fue una mezcla de dos cepas de Lactobacillus, AqSynJ59: Lactobacillus plantarum y AqSynRMH69: Lactobacillus reuteri, que contenía 109 ^u F^c por dosis de 2 ml (5 * 108 UFC de cada cepa), tal como se describió anteriormente.

El tratamiento del grupo de control fue con antibióticos, concretamente una inyección i.m. de amoxicilina en una dosis de 5 mg por kg, inyectada durante la observación de los síntomas. Los lechones diarreicos de este grupo de control recibían este tratamiento una vez al día durante los días que presentaban diarrea, mientras que los animales diarreicos del grupo que recibía la composición probiótica de Aquilón (tal como se describió anteriormente) no se trataron con antibióticos en ningún momento.

Diseño experimental

A. Número de recién nacidos vivos por camada

B. Muertes después del nacimiento

C. Diarreas: se contabilizan por camada, con los siguientes criterios de puntuación:

0. -Menos de <25% animales infectados: no hay signos aparentes de animales sucios en la zona perianal, y no se observan heces blandas en el suelo o paredes.

1. -Algunas diarreas: se observa ocasionalmente algún animal sucio en la camada, algunas heces blandas en el suelo.

2. -La mayoría de los animales (>75%) presentan diarreas y estado físico alterado, animales sucios y heces blandas en el suelo.

D. Tratamientos: lechones por camada y días que reciben tratamiento (antibióticos, nutrientes, carbón, rehidratación, etc.).

Resumen de los resultados

•Indice de tratamiento por camada= camadas tratadas das tratados12

Conclusiones:

La composición sometida a prueba es mejor que la práctica convencional para prevenir y tratar la diarrea de los lechones:

a) Sustituyó en su totalidad la necesidad de antibióticos

b) Redujo la necesidad de tratamientos accesorios no antibióticos

c) Redujo la incidencia de diarrea en general

d) Redujo la incidencia de diarrea grave

e) Redujo la incidencia de muertes provocadas por diarrea

f) Mejoró el peso promedio al destete

g) Redujo de manera muy significativa el impacto económico de las epidemias de diarrea en condiciones de gestión convencionales en una granja comercial (más kg por animales, menos muertes, menos coste de tratamiento, menos impacto ambiental, menos tiempo de manejo).

EJEMPLO 2

Los materiales y el método del ejemplo 2, así como el origen de las cepas, son los mismos que los descritos anteriormente en el ejemplo 1 (“Materiales y métodos” y “Ejemplo 1 A: origen de las cepas”).

Ejemplo 2 A: preparación de una composición probiótica según la invención

Las cepas CECT 8350 (AqSynJ59) y CECT 8700 (AqSynRMH69) que cumplen los criterios a. a c., tal como se describen en la descripción y tal como se evidencian anteriormente (en el “Ejemplo 1 A: origen de las cepas”), se incluyeron en una composición probiótica y se sometieron a prueba en un ensayo de campo.

Cada una de las cepas AqSynJ59 y AqSynRMH69 se hizo crecer en el cultivo de caldo MRS por fermentación, se recogió y se liofilizó. La viabilidad del producto final se comprobó mediante recuento de colonias.

Se preparó una composición que contenía estas dos cepas. Se preparó la siguiente composición (“AQ1202-PigLife” o “PigLife” o “AQ1202”):

Pienso complementario:

El producto (que recibe el nombre de “AQ1202-PigLife”, también denominado “PigLife” o “AQ1202”) consiste en una mezcla liofilizada de dos bacterias del ácido láctico y diferentes sustancias de pienso para definir una suspensión oral para lechones recién nacidos. El producto se mezcló en las instalaciones de Aquilón y se envasó en viales de 100 ml. Este preparado está destinado a ser eluido en 100 ml de disolución de infusión justo antes de su uso.

Se preparó la composición mezclando la misma cantidad bacteriana (tal como se determina mediante recuento de colonias (valores respectivos en UFC indicados anteriormente) de cada cepa que va a incorporarse a la composición y la composición así obtenida se rehidrató con solución salina isotónica, de modo que se obtuvo una composición final que contenía 109 UFC (total de todas las cepas contenidas en la misma) en una dosis de 2 ml.

Ejemplo 2 B: prueba de campo

El objetivo de este ejemplo es evaluar el uso de una composición probiótica según la invención en lechones después del nacimiento, cuando los lechones son particularmente vulnerables a la disbiosis y la diarrea.

El producto de dos cepas (“AQ1202-PigLife” o “PigLife”) se sometió a prueba en granjas comerciales (5 en total) con brotes epidémicos esporádicos de diarrea de etiologías variadas (conocidas o desconocidas). Las granjas comerciales estaban situadas en diferentes lugares de España (Aragón, Castilla y León, Cataluña). Todas ellas albergan sistemas de explotaciones intensivas de porcino, incluyendo programas de inseminación, manejo de cerdas gestantes, parideras y unidades de destete. Algunas de ellas incluyen establos de transición para los animales antes de su traslado a la unidad de engorde. Los experimentos se realizaron al amparo de una licencia oficial que cubre el uso de un aditivo zootécnico experimental en ensayos de campo.

Grupos de animales:

• Grupo de tratamiento probiótico (AQ1202-PigLife)

• Grupo de control (sin tratamiento - sin manipulación)

Después del parto (primer día de vida), todos los lechones del grupo de tratamiento recibieron por vía oral una dosis de 2 ml de la composición probiótica AQ1202-PigLife (AQ1202). Los datos se registraron desde el parto hasta el día 20.

Se evaluó lo siguiente:

• Evaluación de los parámetros zootécnicos

o Número de lechones nacidos: total nacidos y nacidos vivos (lechones destetados por mortalidad) o Peso de los lechones (cuando sea posible)

o Evaluación de las heces

■ 0: Heces normales

■ 1: Diarrea leve; aparecen algunos casos de diarrea en la camada

■ 2: Diarrea grave; la mayoría de los lechones afectados con diarrea o Evaluación del tratamiento: registro de las camadas y cerdas tratadas.

Granjas 1 a 4

En la granja 3, se observaron dos lotes de partos de camadas diferentes:

Experimento 1: octubre de 2014 (granja 3.1)

Experimento 2: mayo de 2015 (granja 3.2)

En estos estudios se registraron los datos de 135 camadas de control y 104 tratadas con PigLife.

Se observó un total de 1710 lechones de control y 1136 tratados desde el parto hasta el día 20.

En las granjas 1 a 4, se encontró que la diarrea respondía a los antibióticos, es decir, diarrea de origen bacteriano. - Mortalidad (%) (mortalidad general, incluyendo diarrea y lechones aplastados)

- Diarrea (véase también la figura 2)

•una sola camada con una diarrea de dos días de duración

- Tratamientos

Granja 1

Se trataron las camadas afectadas con amoxicilina lincomicina, tratamiento etiológico (madres) y tiamulina colistina (colimutina, SP Veterinaria) disolución para infusión oral, tratamiento sintomático en los lechones.

Granja 2

El antibiótico usado fue enrofloxacina para las madres (se liberará a los lechones a través de la leche), los lechones o para ambos. Se administraron rehidratación oral y carbón mineral a los lechones afectados.

Granja 3

En los casos de diarrea dentro de las camadas, los lechones afectados se trataron con enrofloxacina (Alsir, Norvet). Las madres se trataron con marbofloxacina (Marbocyl, Vétoquinol). Colimicina disolución de infusión para lechones sintomáticos.

Granja 4

Las cerdas de camadas que presentaban diarrea se trataron con enrofloxacina. El tratamiento podía durar tres días si era necesario. Como profilaxis, se aplicó una dosis de ceftiofur (Naxcel, Zoetis) a todos los lechones de esta granja en el primer día de vida.

Las dosis administradas fueron tal como sigue:

Amoxicilina: 15 mg/kg, inyección intramuscular (i.m.)

Lincomicina: 5-10 mg/kg en agua potable

Enrofloxacina: 2,5 mg/kg, inyección intramuscular

Marbofloxacina: 2 mg/kg, inyección intramuscular

Colimicina: 0,5 g/litro (agua potable)

Ceftiofur: 5mg/kg, inyección intramuscular

Colimutina: 0,156 mg de colistimetato de sodio 12,35 mg de hidrogenofumarato de tiamulina/kg; 0,1 ml/kg inyección intramuscular.

Los resultados se muestran en la tabla a continuación y en la figura 3:

•Una sola camada tratada una vez

Conclusiones de las granjas 1 a 4

La composición probiótica según la invención (AQ1202) reduce la mortalidad en granjas con episodios persistentes de diarrea (provocada por infección bacteriana en el caso de las granjas 1-4), tal como puede verse en la tabla anterior y en la figura 2. La administración de esta composición reduce la necesidad de tratamientos, incluyendo antibióticos. La tabla anterior y la figura 3 muestran el porcentaje reducido de camadas tratadas (incluyendo el tratamiento con antibióticos) que tomaban la composición probiótica según la invención (AQ1202).

Granja 5

En la granja 5, la diarrea no tenía un origen bacteriano. La diarrea no respondió al tratamiento antibiótico. Finalmente, se diagnosticó una infección por rotavirus, que fue la causa de la diarrea de los lechones recién nacidos, según el diagnóstico comunicado por el ganadero.

Este experimento se llevó a cabo en una granja porcina comercial situada en Aragón (España) con una población de 750 cerdas reproductoras.

Desde principios de enero de 2014, la granja se vio afectada por episodios persistentes de diarrea de lechones recién nacidos, alcanzando tasas del 95% de las camadas afectadas en mayo de ese año. Las tasas de mortalidad fueron aumentando hasta afectar a más del 35% de los lechones nacidos vivos. Hubo un gran uso de tratamiento antibiótico contra Enterobacteriaceae y Clostridium durante más de 6 meses con escasos resultados.

Una vez descartadas la gastroenteritis transmisible y la diarrea epidémica de los cerdos (diarrea epidémica porcina, Coronavirus) como etiología de la diarrea, el diagnóstico clínico fue Rotavirus porcino. Por consiguiente, la diarrea en la granja 5 fue provocada por una infección vírica, por Rotavirus porcino.

La infección por rotavirus se confirmó mediante diagnóstico por PCR por un laboratorio de diagnóstico externo (laboratorio GSP, Cataluña, España). Debido a las altas tasas de diarrea observadas en la piara y al escaso éxito de los primeros tratamientos, el ganadero decidió administrar sistemáticamente el producto (la composición según la presente invención, AQ1202) a todos los lechones, de mayo a diciembre de 2014.

Desde que se introdujo el tratamiento, la mortalidad se redujo al 5% y la incidencia de la diarrea se redujo al 20% de las camadas.

Los resultados se muestran a continuación.

Tratamientos:

En caso de diarrea:

• CARBOVET (el producto Carbovet® es un carbón vegetal termoestructurado (no activado) fabricado a partir de roble francés especialmente seleccionado.

• SUEROMIN (rehidratación intraperitoneal con infusión hipertónica; composición: glucosa 25 g, fructosa 25 g, cloruro 2,62 g, sodio 1,57 g, potasio 80 mg, magnesio 20 mg, calcio 40 mg; excipiente c.s.p. 1000 ml) A todos los animales:

• AQ1202-PigLife

1/5-30/6: 1-2 dosis por lechón

1/7-31/12: 3 dosis por lechón

• Hierro: una dosis (aproximadamente 150 mg, intramuscular) por lechón, en uno cualquiera de los días 3 a 8 de vida.

En este estudio de mayo a diciembre de 2014 (véase la tabla a continuación), se informó de la observación de 983 camadas (de mayo a diciembre de 2014). Todos los lechones de cada camada se trataron con AQ1202 - PigLife (la composición según la invención).

Mes Número de camadas Porcentaje de lechones Media de los Porcentaje de camadas informadas destetados tratamientos** tratadas* Mayo 115 76,6 3,08 92,2

Junio 129 81,3 2,15 85,3

Julio 177 82,7 1,06 68,9 Agosto 144 78 0,87 47,9 Septiembre 152 75,7 0,87 48,7 Octubre 143 82,7 0,36 19,6 Noviembre 51 81,7 0,06 3,9 Diciembre 72 81,9 0 0

* Carbovet y/o Sueromin

** Un tratamiento = 1 dosis de Carbovet y/o Sueromin

Carbovet: 10 g/animal, vía oral

Sueromin: desde 20 hasta 80 ml/kg por vía intraperitoneal o subcutánea

La composición probiótica se administró a todos los lechones de las camadas. El porcentaje de camadas tratadas, que está directamente relacionado con la observación de diarrea en los animales, se disminuyó desde el 95% hasta el 5% durante la aplicación continua de la composición probiótica según la presente invención (AQ1202 - PigLife). Se administraron Carbovet y Sueromin (tratamientos sintomáticos) sólo a los animales débiles y diarreicos. Se observó una tendencia al alza en el porcentaje de lechones destetados. El ganadero observó hasta aproximadamente un 0,7% más de lechones destetados por camada desde que se administró la composición probiótica.

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

   i. Composición que comprende al menos la cepa depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo con el número de depósito CECT 8700 (AqSynRMH69) para su uso en un método para tratar o prevenir la diarrea provocada por una infección vírica en un animal y/o un humano.
2. 2. Composición para su uso según la reivindicación 1, que comprende además al menos una cepa de microorganismos, en la que cada cepa adicional tiene al menos una de las siguientes actividades antimicrobianas, tal como se evidencia mediante las zonas de inhibición determinadas por el ensayo de mancha en el césped: (i) zona de inhibición de 10 mm o más para Salmonella, ii) zona de inhibición de 9 mm o más para Listeria monocytogenes, iii) zona de inhibición de 9 mm o más para Staphyloccocus aureus, iv) zona de inhibición de 10 mm o más para Escherichia coli.
3. 3. Composición para su uso según la reivindicación 2, en la que la al menos una cepa adicional se selecciona de cepas que pertenecen a los géneros Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus, Streptococcus, Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Sporolactobacillus, Tetragenococcus, Vagococcus y/o Weisella.
4. 4. Composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la composición comprende además la cepa depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo con el número de depósito CECT 8350 (AqSynJ59).
5. 5. Composición para su uso según la reivindicación 4, en la que la composición comprende dos cepas de microorganismos, y en la que los dos microorganismos son la cepa depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo con el número de depósito CECT 8700 (AqSynRMH69) y la cepa depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo con el número de depósito CECT 8350 (AqSynJ59).
6. 6. Composición para su uso según la reivindicación 5, en la que ambas cepas están presentes en una razón (indicada en unidades formadoras de colonias (UFC)) de desde 2:1 hasta 1:2 en la composición.
7. 7. Composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que al menos una cepa, y preferiblemente todas las cepas comprendidas en la composición están libres de resistencia a los antibióticos.
8. 8. Composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que al menos una cepa, y preferiblemente todas las cepas comprendidas en la composición son capaces de retener esencialmente la misma viabilidad durante 3 horas de incubación a pH 3,5, en la que una cepa es capaz de retener esencialmente la misma viabilidad si hay al menos un 50% de UFC después de la incubación durante 3 h a pH 3,5 en comparación con las UFC antes de la incubación.
9. 9. Composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que al menos una cepa, y preferiblemente todas las cepas comprendidas en la composición son capaces de retener esencialmente la misma viabilidad durante 4 horas de incubación en presencia del 0,45% de extracto biliar, en la que una cepa es capaz de retener esencialmente la misma viabilidad si hay al menos un 50% de UFC después de la incubación durante 4 h en presencia del 0,45% de extracto biliar en comparación con las UFC antes de la incubación.
10. 10. Composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que al menos una cepa, y preferiblemente todas las cepas comprendidas en la composición tienen todas las actividades antimicrobianas siguientes, tal como se evidencia mediante las zonas de inhibición determinadas por el ensayo de mancha en el césped: (i) zona de inhibición de 10 mm o más para Salmonella, (ii) zona de inhibición de 9 mm o más para Listeria monocytogenes, (iii) zona de inhibición de 9 mm o más para Staphyloccocus aureus, (iv) zona de inhibición de 10 mm o más para Escherichia coli.
11. 11. Composición que comprende una mezcla de microorganismos, en la que los microorganismos pertenecen a las especies Lactobacillus plantarum y Lactobacillus reuteri, y que incluyen opcionalmente al menos un microorganismo que pertenece a los géneros Lactobacillus (con la excepción de los microorganismos Lactobacillus fermentum CECT 8347 (AqSynJ12) y Lactobacillus mucosae CECT 8349 (AqSynJ55)) Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus, Streptococcus, Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Sporolactobacillus, Tetragenococcus, Vagococcus y/o Weisella, para su uso en un método para tratar o prevenir la diarrea provocada por una infección vírica en un animal y/o un humano, en la que los microorganismos tienen al menos una de las siguientes actividades antimicrobianas, tal como se evidencia mediante las zonas de inhibición determinadas por el ensayo de mancha en el césped: (i) zona de inhibición de 10 mm o más para Salmonella, (ii) zona de inhibición de 9 mm o más para Listeria monocytogenes, (iii) zona de inhibición de 9 mm o más para Staphyloccocus aureus, (iv) zona de inhibición de 10 mm o más para Escherichia coli y en la que la composición se administra al menos en una dosis dentro de las primeras 48 horas después del nacimiento.
12. 12. Cepa depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo con el número de depósito CECT 8700 (AqSynRMH69).
13. 13. Composición que comprende al menos la cepa definida en la reivindicación 12.
14. 14. Composición según la reivindicación 13, que comprende además la cepa depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo con enúmero de depósito CECT 8350 (AqSynJ59).