ES2937018T3 - Lactobacillus reuteri - Google Patents

Abstract

Una cepa de Lactobacillus reuteri de un nuevo clado filogenético tiene propiedades inmunoestimuladoras únicas y un rendimiento ecológico mejorado en el intestino humano. Se puede administrar un sustrato para la cepa, como la rafinosa, al mismo tiempo que la cepa o por separado. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Lactobacillus reuteri

Campo de la invención

La invención se refiere a Lactobacillus reuteri de un ciado filogenético novedoso con propiedades inmunoestimuladoras únicas y un rendimiento ecológico mejorado en el intestino humano.

Antecedentes de la invención

La microbiota intestinal es un determinante fundamental de la salud humana al contribuir directamente a las patologías, que influyen en la predisposición del hospedador a la enfermedad. Ahora hay pruebas sustanciales de que el estilo de vida moderno y la industrialización han supuesto una disminución de la diversidad bacteriana de la microbiota intestinal, probablemente debido a una combinación de factores tales como el uso de antibióticos, prácticas clínicas modernas, condiciones sanitarias y cambio en los hábitos alimentarios (Blaser y Falkow 2009; Segata, 2015). El aumento de la incidencia de las ENT (enfermedades no transmisibles) en todas partes del mundo está relacionado con estilos de vida prósperos y se cree que es el resultado, al menos en parte, de la pérdida de diversidad microbiana (Haahtela et al., 2015; Hanski et al., 2012; Rook, 2013). Se desconocen los mecanismos de estas conexiones y la mayor parte de la atención se ha centrado en microbios patógenos en conceptos tales como la "hipótesis de la higiene" (Jarchum et al., 2011). Se ha propuesto una hipótesis alternativa, y quizás más plausible, que afirma que durante la evolución humana, los microbios han pasado a desempeñar un papel esencial en la regulación de nuestro sistema inmunitario. Los microbios implicados no son infecciosos, sino microbios simbióticos y respetuosos que componen nuestro microbioma humano. Estos se adquieren por exposición a otros seres humanos o animales y a la microbiota de nuestro entorno natural. Los investigadores coinciden ahora en que una serie de cambios en el estilo de vida, como el aumento de los nacimientos por cesarotomía (cesárea), la disminución de la lactancia materna, el menor tamaño de las familias y menor tiempo al aire libre, son causas subyacentes de la menor exposición a microbios respetuosos, mientras que una alimentación alterada y los antibióticos tienen efectos adversos sobre la composición del microbioma.

Por lo tanto, existe la necesidad de mejorar la diversidad bacteriana de la microbiota intestinal.

Se ha demostrado que L. reuteri es una de las bacterias verdaderamente autóctonas del tubo GI humano (Sinkiewicz, 2010). Coloniza de manera natural una amplia gama de vertebrados, incluyendo seres humanos, cerdos, hámsteres, ratones, ratas, perros, ovejas, ganado y diferentes especies de aves (incluyendo pollos), y también se ha descubierto en el aparato genitourinario humano y en la leche materna. (Mitsuoka, 1992).

En la actualidad, la prevalencia de L. reuteri es muy baja en las poblaciones humanas occidentales, donde la especie solo se encuentra ocasionalmente (Walter J, 2008) Existen indicios de que la prevalencia de L. reuteri en muestras fecales humanas era mayor a mediados del siglo pasado. Gerhard Reuter y Tomonari Mitsuoka, quienes en las décadas de 1960 y 1970 estudiaron intensamente la biota de Lactobacillus del tubo digestivo humano, informaron que L. reuteri era entonces uno de los lactobacilos dominantes y se detectaba regularmente (Mitsuoka T., 1992; Reuter G., 2001). La baja prevalencia en seres humanos en estudios más recientes, sugiere una reducción del tamaño de la población de L. reuteri durante los últimos 50 años.

El término un "clado" (del griego antiguo: KÁa8o ,^ klados, "rama"), también conocido como grupo monofilético, se define como un grupo de organismos que consiste en un antepasado común y todos sus descendientes lineales, y representa una sola "rama" en el "árbol de la vida".

El antepasado común puede ser un individuo, una población, una especie (extinguida o existente), y así sucesivamente hasta un reino y más allá. Los clados están anidados, uno dentro de otro, ya que cada rama a su vez se divide en ramas más pequeñas. Estas divisiones reflejan la historia evolutiva a medida que las poblaciones divergían y evolucionaban de forma independiente.

La especie L. reuteri representa el grupo L. reuteri en el clado heterofermentativo de los lactobacilos (Duar et. al.

2017b). Se creía que L. reuteri estaba bien caracterizada genética y fisiológicamente, y se conocen bien los rasgos metabólicos que contribuyen a su aptitud ecológica en los ecosistemas cerealistas e intestinales (Zhao y Ganzle, 2018).

Las cepas de L. reuteri de origen humano, pertenecen a dos clados distintos de ASML (análisis de secuencias multilocus), denominados clado II y VI. El clado II contiene la mayoría de las cepas aisladas intestinales humanas y se agrupa con cepas aisladas de rumiantes, mientras que las cepas humanas del clado VI están estrechamente relacionadas con cepas aisladas de pollos (Oh, et al. 2010).

Sumario de la invención

La invención proporciona una cepa de Lactobacillus reuteri que tiene una identidad de secuencia del 97,5 % o mayor, con la secuencia de ADN de la cepa de Lactobacillus reuteri que tiene el número de registro NCIMB 42835. La cepa 42835 es una Lactobacillus reuteri de un clado filogenético novedoso con propiedades inmunoestimuladoras únicas y un rendimiento ecológico mejorado en el intestino humano.

Un experto en la materia apreciaría que las cepas pueden identificarse mediante análisis de homología de secuencias de ADN con la cepa NCIMB 42835. Las cepas que tienen una identidad de secuencia cercana con la cepa NCIMB 42835 sin diferencias funcionales medibles o fenotípicas demostrables, están dentro del alcance de la invención. Una cepa con una identidad de secuencia (homología) del 97 % o mayor, del 97,5 % o mayor, del 97,75 % o mayor, del 98 % o mayor, del 98,25 % o mayor, del 98,5 % o mayor, del 98,75 % o mayor, del 99 % o mayor, del 99,25 % o mayor, del 99,5 % o mayor, del 99,75 % o mayor, estando la secuencia de ADN de NCIMB 42835 dentro del alcance de la invención. La homología de secuencia puede determinarse utilizando el programa "BLAST" del algoritmo de homología en línea, disponible públicamente en http: //www.ncbi.nlm.nih,gov/BLAST/. En una realización, la cepa es un simbionte humano.

La invención proporciona la cepa de Lactobacillus reuteri que tiene el número de registro NCIMB 42835 o mutantes o variantes de la misma.

El mutante puede ser un mutante genéticamente modificado.

La variante puede ser una variante de origen natural.

La cepa puede estar en forma de cultivo biológicamente puro.

También se proporciona una cepa aislada de Lactobacillus reuteri (NCIMB 42835).

La cepa puede ser un probiótico.

En un caso, la cepa está en forma de células viables.

En otro caso, la cepa está en forma de células no viables.

La cepa de Lactobacillus reuteri NCIMB 42835 puede estar presente en la formulación en una cantidad de más de 106 ufc, normalmente de 107 a 1010, normalmente de 108 a 109 ufc por dosis. En un caso, la cepa de Lactobacillus reuteri NCIMB 42835 está presente en la formulación en una cantidad de aproximadamente 1 x109 ufc por dosis. La viabilidad bacteriana refleja la cantidad de bacterias cultivables dentro de una muestra, es decir, el número de bacterias que conservan la capacidad de reproducirse cuando se cultivan en condiciones óptimas (células viables). Dicho de otra manera, la viabilidad refleja el número de células bacterianas individuales que conservan la capacidad de replicarse en colonias bacterianas más grandes (unidades formadoras de colonias (UFC)).

La viabilidad se determina habitualmente mediante métodos de recuento en placa, mediante los cuales, se diluye una muestra bacteriana y después se incuba en una placa de agar que contiene los nutrientes necesarios para el crecimiento. A continuación, se calcula la viabilidad a partir del número de colonias bacterianas identificadas en una placa. Dichos métodos se resumen en Modern Food Biology 2005 7.a edición, James Monroe Jay, Martin J. Loessner, David A. Golden, Springer Science, Nueva York.

Si bien el recuento de placas da una buena indicación de la viabilidad, no abarca todas las células bacterianas vivas de la muestra. (Kell, Douglas B., et al. "Viability and activity in readily culturable bacteria: a review and discussion of the practical issues. "Antonie van Leeuwenhoek73.2 (1998): 169-187).

Las muestras también contendrán células "viables pero no cultivables" (VPNC) que permanecen metabólicamente activas pero han perdido la capacidad de replicarse en el momento del análisis mediante recuento en placa y, por tanto, a pesar de estar vivas, no formarán UFC. Finalmente, las muestras también contendrán células muertas. Estos dos grupos se pueden agrupar como "células no viables". Por lo tanto, células no viables son lo contrario de células viables, es decir, todas aquellas células que han perdido la capacidad de replicarse cuando se someten a ensayo.

Todas las muestras que contienen células viables también contendrán células no viables, por lo tanto, la definición de cultivo celular viable se aclara usando mediciones de UFC.

Todas las muestras no viables contendrán al menos células VPNC y posiblemente pequeñas cantidades de células viables. Los límites de detección de nivel inferior estándar de la industria de 103 UFC/g de células viables, permiten la variabilidad intrínseca del proceso causada por la presencia de un determinado número de células VPNC/viables en muestras no viables.

En algunas realizaciones, tales como, aunque no de forma limitativa, productos alimentarios o medicamentos estériles especiales, puede ser preferible una forma no replicante de una cepa probiótica. Por ejemplo, al menos un 95 %, preferentemente al menos un 97 %, más preferentemente al menos un 99 % de la cepa de Lactobacillus reuteri, puede ser no replicante en la composición.

En un caso, la cepa es significativamente inmunomoduladora después del consumo oral en seres humanos.

En una realización, la cepa está en forma de caldo bacteriano.

En otra realización, la cepa está en forma de polvo liofilizado.

La invención también proporciona una formulación que comprende una cepa de la invención.

La formulación puede comprender además otro material probiótico.

La formulación puede comprender además un material prebiótico.

La formulación puede comprender además un transportador ingerible.

En un caso, el transportador ingerible es un transportador farmacéuticamente aceptable, como una cápsula, un comprimido o un polvo.

En otro caso, el transportador ingerible es un producto alimentario tal como leche acidificada, yogur, yogur congelado, leche en polvo, concentrado de leche, helado, queso para untar, aderezos o bebidas.

En algunas realizaciones, la formulación comprende además una proteína y/o un péptido, en particular, proteínas y/o péptidos que son ricos en glutamina/glutamato, un lípido, un hidrato de carbono, una vitamina, un mineral y/o un oligoelemento.

En un caso, la cepa está presente en una cantidad de más de 106 ufc por gramo de la formulación.

La formulación puede comprender además un adyuvante.

La formulación puede comprender además un componente bacteriano.

La formulación puede comprender además una entidad farmacológica.

La formulación puede comprender además un compuesto biológico.

La invención también proporciona un alimento que comprende una cepa o una formulación de la invención.

También se proporciona un medicamento que comprende una cepa o una formulación de la invención.

En una realización, la formulación comprende además un hidrato de carbono.

La formulación puede comprender un oligosacárido que puede no ser digerible.

En un caso, el oligosacárido comprende rafinosa.

También se describe un método para mejorar la microbiota de un individuo que es miembro la sociedad humana industrializada, que comprende la etapa de administrar una cepa de Lactobacillus reuteri que está aislada de un individuo que no es miembro de la sociedad humana industrializada.

La microbiota puede ser la microbiota intestinal.

La cepa puede ser una cepa como se define en el presente documento.

La cepa puede ser un componente de una formulación como se define en el presente documento.

El método puede comprender administrar un sustrato de hidrato de carbono a la cepa. El sustrato puede comprender un oligosacárido que puede no ser digerible. En un caso, el oligosacárido comprende rafinosa.

El sustrato puede administrarse al mismo tiempo o por separado de la cepa.

Se apreciará que las cepas de la invención pueden administrarse a animales (incluidos los seres humanos) en una forma ingerible por vía oral en una preparación convencional, tal como cápsulas, microcápsulas, comprimidos, gránulos, polvo, trociscos, píldoras, supositorios, suspensiones y jarabes. Pueden prepararse formulaciones adecuadas mediante métodos habitualmente empleados usando aditivos orgánicos e inorgánicos convencionales. La cantidad de principio activo en la composición médica puede estar a un nivel que ejerza el efecto terapéutico deseado.

La formulación también puede incluir un componente bacteriano, una entidad farmacológica o un compuesto biológico.

Además, una vacuna que comprende las cepas de la invención, puede prepararse usando cualquier método conocido adecuado y puede incluir un transportador o adyuvante farmacéuticamente aceptable.

La invención también incluye mutantes y variantes de las cepas depositadas. A lo largo de la memoria descriptiva, los términos mutante, variante y mutante genéticamente modificada incluyen una cepa cuyas propiedades genéticas y/o fenotípicas están alteradas en comparación con la cepa original. Una variante de origen natural incluye las alteraciones espontáneas de las propiedades diana aisladas selectivamente. La alteración deliberada de las propiedades de la cepa parental se realiza mediante tecnologías de manipulación genética convencionales (in vitro), tales como alteración génica, transferencia conjugativa, etc. La modificación genética incluye la introducción de secuencias de ADN exógenas y/o endógenas en el genoma de una cepa, por ejemplo, mediante inserción en el genoma de la cepa bacteriana a través de vectores, incluyendo ADN plasmídico o bacteriófagos.

Las mutaciones naturales o inducidas incluyen al menos alteraciones de una sola base, tales como deleción, inserción, transversión u otras modificaciones de ADN que pueden dar lugar a la alteración de la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de ADN.

Los términos mutante, variante y mutante genéticamente modificado también incluyen una cepa que ha experimentado alteraciones genéticas que se acumulan en un genoma a un ritmo que es constante en la naturaleza para todos los microorganismos y/o alteraciones genéticas que se producen por mutación espontánea y/o adquisición de genes y/o pérdida de genes que no se logra mediante la manipulación deliberada (in vitro) del genoma, sino que se logra a través de la selección natural de variantes y/o mutantes que proporcionan una ventaja selectiva para favorecer la supervivencia de la bacteria cuando se expone a presiones ambientales, tales como antibióticos. Se puede crear un mutante mediante la inserción deliberada (in vitro) de genes específicos en el genoma que no altere fundamentalmente la funcionalidad bioquímica del organismo pero cuyos productos puedan usarse para la identificación o selección de la bacteria, por ejemplo resistencia a los antibióticos.

Breve descripción de los dibujos

La invención se entenderá más claramente a partir de la siguiente descripción de la misma dada a modo de ejemplo únicamente con referencia a los dibujos adjuntos en los que;-La figura 1 es una ilustración de un árbol filogenético genomas nuevos y publicados de Lactobacillus reuteri (n = 54) derivados de múltiples hospedadores. El árbol filogenético se construyó basándose en las alineaciones de todos los genes comunes (n = 639). Genealogía deducida mediante ClonalFrame a partir de datos de ASML (método bayesiano con exclusión de regiones recombinantes);

la figura 2 ilustra las diferencias en la microbiota intestinal de habitantes de zonas rurales de Papúa Nueva Guinea y de residentes en Estados Unidos;

la figura 3 ilustra la presencia de 47 unidades taxonómicas operativas (UTO) a nivel de especie en el intestino de habitantes de zonas rurales de Papúa Nueva Guinea que están ausentes en la microbiota intestinal de los norteamericanos, entre los que se encuentra L. reuteri. La figura destaca la presencia de altos niveles de L. reuteri en la microbiota intestinal de habitantes de zonas rurales de Papúa Nueva Guinea, mientras que L. reuteri no aparece en la microbiota intestinal de residentes en Estados Unidos;

la figura 4 ilustra el perfil de inducción de TNF-a en CMSP después de estimulación in vitro con una concentración de L. reuteri DSM 20016, L. reuteri ATCC PTA 6475, L. reuteri DSM 17938, L. reuteri Cepa 2 y L. reuteri NCIMB 42835;

la figura 5 ilustra el perfil de inducción de TNF-a en CMSP después de estimulación in vitro con concentraciones en aumento de L. reuteri DSM 20016, L. reuteri ATCC PTA 6475, L. reuteri DSM 17938, L. reuteri Cepa 2 y L. reuteri NCIMB 42835;

La figura 6 ilustra el perfil de inducción de IL-10 en CMSP después de estimulación in vitro con una concentración de L. reuteri DSM 20016, L. reuteri ATCC PTA 6475, L. reuteri DSM 17938, L. reuteri Cepa 2 y L. reuteri NCIMB 42835;

la figura 7 ilustra el perfil de inducción de IL-6 en CMSP después de estimulación in vitro con una concentración de L. reuteri DSM 2O0I 6, L. reuteri ATCC PTA 6475, L. reuteri DSM 17938, L. reuteri Cepa 2 y L. reuteri NCIMB 42835;

La figura 8 es un gráfico de análisis de componentes principales (ACP) de la respuesta de citocinas de una dosis de cepas de Lactobacillus reuteri en el ensayo con CMSP;

La figura 9 es un gráfico de análisis de componentes principales (ACP) de la respuesta de citocinas de tres dosis de cepas de Lactobacillus reuteri en el ensayo con CMSP;

La figura 10 ilustra curvas de crecimiento de L. reuteri NCIMB 42835 utilizando rafinosa o glucosa como único hidrato de carbono en medio de crecimiento MRS basal (3 % (m/v)) y se demuestra la preferencia de L. reuteri NCIMB 42835 por la rafinosa sobre la glucosa como sustrato de crecimiento en MRS-B. El análisis estadístico de los valores de DO600 se realizó mediante GraphPad Prism 5.0 con ANOVA bifactorial y se consideró que un valor de p (probabilidad) < 0,05 era significativo. ***: p < 0,001; **: p < 0,01; *: p < 0,05;

La figura 11 ilustra los números de células de Lactobacillus reuteri en muestras fecales determinados mediante siembra en placa cuantitativa después de una administración en una sola dosis de aproximadamente 1010 células de L. reuteri el día 4. Los días se refieren al tiempo transcurrido tras el cambio de alimentación a una alimentación no occidental (diseñada). Los datos se presentan como media ± EE de log10 de UFC. Dentro del mismo día, los números de células de cada tratamiento marcados con letras diferentes son significativamente diferentes en función del ANOVA bifactorial con medidas repetidas siendo p < 0,10; y

la figura 12 ilustra los números de células de Lactobacillus reuteri en muestras fecales determinados mediante siembra en placa cuantitativa. (A) números de células de L. reuteri NCIMB 42835 y (B) números de células de L. reuteri DSM 20016. Los datos se presentan como media ± EE de log 10 de UFC. Dentro del mismo día, los números de células entre la alimentación no occidental diseñada y la alimentación habitual marcada con *, son significativamente diferentes según la prueba de la t para datos emparejados, siendo p < 0,10.

Descripción detallada de la invención

Se realizó un depósito de la cepa 1 de Lactobacillus reuteri en el edificio Ferguson de la National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB), Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA, Escocia, RU el 29 de septiembre de 2017 y se le asignó el número de registro NCIMB 42835.

Ejemplos

Se describen los siguientes ejemplos adicionales y se muestran realizaciones dentro del alcance de la invención. Un nuevo clado filogenético

L. reuteri se detectó regularmente en seres humanos en estudios realizados alrededor de 1960, pero se encuentra muy raramente en seres humanos contemporáneos, lo que sugiere una disminución reciente de la población de L. reuteri en occidentales (Walter et al., 2011). L. reuteri es un auténtico simbionte de vertebrados que ha evolucionado a un alto nivel de especificidad con sus respectivas especies hospedadoras, lo que apunta a una estrecha relación mantenida a lo largo de la evolución (Oh et. al., 2010; Frese et al., 2011; Duar et al., 2017; Frese et al., 2013). Cabe destacar que, L. reuteri ejerce beneficios sustanciales sobre las funciones inmunitarias y el desarrollo del hospedador, como se demuestra en diversas publicaciones de gran repercusión (Zelante et al. 2013; Buffington et al.

2016; Lamas et al. 2016; He et al. 2017). Sin embargo, hay menos de 20 genomas de cepas occidentales de L. reuteri cepas disponibles en bases de datos internacionales. La mayoría de las cepas aisladas de seres humanos se agrupan en un linaje filogenético (linaje II) (Oh et. al., 2010). La estructura poblacional de este linaje se caracteriza por un nivel de diversidad muy bajo, mostrando < 50 polimorfismos mononucleotídicos (SNP, Single Nucleotide Polymorphisms) sobre los genomas disponibles en comparación con otras especies (figura 1). En conjunto, estos hallazgos sugieren una disminución reciente de la población de L. reuteri en occidentales.

La figura 2 ilustra la microbiota intestinal de habitantes de zonas rurales de Papúa Nueva Guinea. Ahora hay pruebas sustanciales de que el estilo de vida moderno y la industrialización han supuesto una disminución sustancial de la diversidad bacteriana de la microbiota intestinal, probablemente debido a una combinación de factores tales como el uso de antibióticos, prácticas clínicas modernas, condiciones sanitarias y cambio en los hábitos alimentarios (Blaser y Falkow 2009; Segata, 2015). La figura 2a muestra que la microbiota intestinal es significativamente diferente entre los habitantes de Papúa Nueva Guinea y los norteamericanos. La figura 2b muestra la mayor diversidad en la microbiota fecal de individuos de tribus rurales de Papúa Nueva Guinea. La figura 3 ilustra que 47 UTO de tipo especie son completamente indetectables en la microbiota intestinal de los norteamericanos. Este trabajo confirma la premisa general del "agotamiento del microbioma" en la sociedad occidental. Curiosamente, una especie detectable en cada individuo de Papúa Nueva Guinea por secuenciación de ARNr 16S pero no en un solo de E.E.U.U. es Lactobacillus reuteri (figura 3). Las enfermedades occidentales no contagiosas, tales como el autismo y la EII, están prácticamente ausentes en Papúa Nueva Guinea. Hemos investigado cepas aisladas de L. reuteri que se obtuvieron de muestras fecales de habitantes de zonas rurales de Papúa Nueva Guinea y hemos identificado una nueva cepa de L. reuteri que difiere significativamente de las cepas de L. reuteri aisladas de humanos occidentales. Nunca antes se habían aislado o caracterizado cepas de L. reuteri procedentes de miembros de tribus de Papúa Nueva Guinea.

El análisis genómico y la comparación de las cepas de L. reuteri aisladas de la población rural de Papúa Nueva Guinea con las cepas de L. reuteri de humanos occidentales, indica que la secuencia del genoma de L. reuteri NCIMB 42835 es >2,5 % diferente a la de cualquier L. reuteri conocida en seres humanos según la identidad nucleotídica promedio (ANI, Average Nucleotide Identity) (Tabla 1). En particular, L. reuteri NCIMB 42835 no se encuentra dentro de ninguno de los nexos filogenéticos establecidos en el árbol filogenético de L. reuteri (figura 1). Por tanto, L. reuteri NCIMB 42835 representa un clado recién identificado.

En cambio, la cepa 2 de L. reuteri, que también se aisló de habitantes de zonas rurales de Papúa Nueva Guinea, pertenece al clado VI.

T l 1

Identidad nucleotídica promedio (ANI; por debajo de la diagonal) y similitud del gen de ARNr 16S (por encima de la diagonal) entre cepas de L. reuteri - Tabla 2.

T l 2

Método: Se aplicó la canalización Roary para identificar genes comunes basándose en ensamblajes anotados de genomas nuevos y publicados de L. reuteri (n = 54). Los valores de identidad de secuencia nucleotídica promedio (ANI) entre 7 cepas diferentes se calcularon basándose en estos genes comunes concatenados, en el servicio en línea JSpeciesWS (http://iespec¡es.r¡bohost.com/¡speciesws/#analyse/) con algoritmo BLAST. Para obtener secuencias completas del gen de ARNr 16S, el ensamblaje de cada cepa se alineó con la secuencia del gen de ARNr 16S de DSM 20016T usando BLAST, y esos fragmentos de secuencia alineados se ensamblaron además manualmente. Los valores de similitud entre los genes de ARNr 16S se calcularon utilizando BLAST.

NCIMB 42835 induce diferentes respuestas de citocinas en células inmunitarias humanas

Hemos complementado estas comparaciones genómicas con datos funcionales sobre los efectos de cepas de L. reuteri en la producción de citocinas por células inmunitarias humanas (CMSP). El análisis muestra que las cepas del mismo linaje filogenético muestran respuestas similares, lo que indica que la historia evolutiva de las cepas de L. reuteri influye en sus interacciones con el hospedador de acuerdo con hallazgos previos (Spinler et al., 2014). Los hallazgos demuestran además claras diferencias entre NCIMB 42835 y las cepas de las otras dos subpoblaciones de L. reuteri.probiótica procedente de ser humano.

Estudios de neonatos nacidos en zonas del mundo en desarrollo con una carga microbiana muy alta, como Papúa Nueva Guinea (PNG), muestran grandes diferencias en la función inmunitaria neonatal en comparación con los recién nacidos de regiones muy desarrolladas, como Australia (Lisciandro et al., 2012a; 2012b). Al final de la gestación, las células presentadoras de antígeno de los recién nacidos de PNG ya muestran una expresión inicial mucho más alta de marcadores de activación (HLA-DR y CD86) e inhibición (transcritos 3 y 4 similares a inmunoglobulina) en comparación con los recién nacidos australianos. Sin embargo, en la activación, las células presentadoras de antígeno de sangre del cordón umbilical de PNG están relativamente inactivas, con activación y procesamiento de antígenos reducidos y provocan una respuesta atenuada de linfocitos T en comparación con los neonatos australianos. Aunque existen muchas diferencias ambientales entre estos entornos, la carga microbiana es una de las más llamativas, y las respuestas más tolerogénicas de los recién nacidos en PNG podrían proteger contra el desarrollo de respuestas inflamatorias dañinas en los primeros años de vida. A este respecto, es importante recalcar que se ha demostrado que las cepas de L. reuteri son inmunomoduladoras e inducen a los linfocitos T reguladores en estudios con roedores (Liu et al., 2013; 2017).

Estos y otros experimentos de la naturaleza respaldan firmemente el papel del entorno materno prenatal en la programación inmunitaria temprana y plantean la difícil cuestión de cómo aprovecharlo para mejorar la salud inmunitaria en el contexto de la creciente propensión mundial a la alergia y a otras enfermedades inflamatorias crónicas.

Los estudios que examinan diferentes cepas han demostrado que los efectos clínicos son específicos de la cepa (Wickens et al., 2008). Esto significa que intervenciones tales como la suplementación con la nueva L reuteri NCIMB 42835 de nativos de Papúa Nueva Guinea en un microbioma occidental agotado, puede tener respuestas inmunitarias asociadas a la salud (Abrahamson et al., 2012; Van Nimwegen et al 2011; Bisgard et al., 2011).

Lactobacillus reuteri DSM 20016 es la cepa tipo de Lactobacillus reuteri, y Lactobacillus reuteri ATCC PTA 6475 es una cepa disponible en el comercio y ambas se aislaron de sujetos occidentales y pertenecen al clado Humano II (figura 1). Lactobacillus reuteri DSM 17938 es una cepa disponible en el comercio que se aisló de la leche materna de una madre indígena peruana y esta cepa se incluye en el clado VI de aves de corral/ser humano. Aislamos una nueva cepa de sujetos nativos de Papúa Nueva Guinea, Lactobacillus reuteri NCIMB 42835, que llevan un estilo de vida no industrializado. El objetivo de este estudio era determinar si estas cepas tenían un perfil de citocinas diferente cuando se incubaban con CMSP de voluntarios sanos in vitro.

Aislamiento de CMSP

Se extrajo sangre entera venosa periférica de 3 donantes sanos (varones entre 30 y 45 años) en tubos estériles con EDTA, se mezcló varias veces por inversión y se diluyó 1/1 con PBS estéril. En un nuevo tubo cónico estéril de 50 ml, se dividieron partes alícuotas de 20 ml de Ficoll para cada donante. Para cada donante, se colocaron 25 ml de la sangre entera diluida con EDTA sobre el Ficoll divido en partes alícuotas en la etapa 2. Los tubos se centrifugaron a 800 g durante 30 minutos a 4 °C con el freno desactivado. Se recogió la capa leucoplaquetaria blanca (capa de CMSP) debajo del plasma y las células se lavaron dos veces con PBS estéril. Las CMSP se resuspendieron en RPMI reciente y tibio con FBS al 10 % penicilina/estreptomicina al 1 % y se contaron con un contador de células automático. El número de células de cada donante se ajustó a 1 *106 por ml y se dividió en partes alícuotas en placas de 24 pocillos.

Preparación de cepas

Cepas de L. reuteri congeladas y liofilizadas se centrifugaron brevemente y se resuspendieron con 10 ml de RPMI tibio en condiciones estériles para obtener la concentración madre. Se prepararon las concentraciones superior, media e inferior (100:1) dosis superior: se añadió 1 ml de concentración madre a 4,5 ml de RPMI completo. (50:1) dosis media: la dosis superior se diluyó 1:1 con RPMI completo. Para hacer la dosis inferior (10:1): la dosis superior se diluyó 1:9.

Incubación y controles

Una suspensión de CMSP de 5x105 células en 500 pl se dividió en partes alícuotas en 24 pocillos. Las CMSP se incubaron con 50 pl de cepa durante 24 horas, en una incubadora humidificada con CO2 al 5 % (37 °C, aire al 95 % aire, humedad al 100 %). Los sobrenadantes se recogieron y centrifugaron para sedimentar las células y los medios acondicionados sin células y limpios, se llevaron a un Eppendorf nuevo y se conservaron inmediatamente a -80 °C. Los controles se representan como: CMSP Vehículo (cepa crioprotectora).

Inmunoensayos múltiples basados en Luminex

Las muestras se diluyeron 1/100 en diluyente de ensayo inmediatamente antes del ensayo. Para cada pocillo, se dispensaron 50 pl de muestras estándar o diluidas en los pocillos 50 pl.

Los analitos a medir eran 3 citocinas, IL-10, TNF-a, IL-6. La placa se incubó de acuerdo con el protocolo del fabricante y se leyó en un analizador Luminex MAGPIX.

Lactobacillus reuteri NCIMB 42835 indujo más TNF-a, IL-10, IL-6 de las CMSP que todas las demás L. reuteri (figuras 1, 3, 4). Al analizar la inducción de TNF-a en las CMSP después de las 3 dosis de L. reuteri NCIMB 42835, se observa un perfil único que muestra una inducción dependiente de la dosis de esta citocina (figura 2).

El análisis de componentes principales (ACP) es un análisis de componentes principales de datos para visualizar la estructura subyacente de los datos donde hay mayor varianza y separación entre ellos. Con el ACP en todos los datos de citocinas de una dosis o de 3 dosis de las cepas de L. reuteri se descubrió que NCIMB 42835 es el punto más a la derecha del gráfico, por lo que muestra la mayor inducción de citocinas. Es la más alejada de las dos cepas occidentales y también está claramente separada de las otras dos cepas no occidentales, que parecen estar a mitad de camino entre las cepas occidentales y NCIMB 42835 figuras 5, 6). Los datos de citoquinas concuerdan con los datos filogenéticos que muestran que NCIMB 42835 es una cepa aislada único con un efecto específico de cepa en citocinas clave en células humanas.

Uso preferencial de determinados hidratos de carbono por L. reuteri NCIMB 42835

Los hidratos de carbono, como la rafinosa, están presentes en cantidades muy bajas en la alimentación occidental, mientras que son abundantes en la alimentación de los habitantes de Papúa Nueva Guinea, una población que consume una alimentación basada predominantemente en plantas. Como se ha mencionado anteriormente, L. reuteri está muy adaptada y la pérdida de sustratos de crecimiento importantes y de rasgos importantes en cepas aisladas occidentales puede explicar la disminución de la población de L. reuteri en occidentales. El uso de rafinosa para favorecer el crecimiento de L. reuteri en el intestino no se ha indicado anteriormente. La figura 10 muestra un mayor crecimiento para L. reuteri NCIMB 42835 sobre rafinosa en comparación con glucosa.

Estos resultados demuestran que la rafinosa es un excelente sustrato de crecimiento para las cepas no occidentales de L. reuteri, con un crecimiento superior al de las cepas occidentales. El uso de rafinosa junto con una L. reuteri no occidental podría ayudar a favorecer el restablecimiento de esta cepa beneficiosa en la microbiota intestinal de las sociedades occidentales.

L. reuteri NCIMB 42835 muestra mayor persistencia que L. reuteri DSM20016T (cepa tipo) en el intestino humano y se beneficia de una alimentación rica en rafinosa.

Para determinar si L. reuteri NCIMB 42835 muestra una adaptación en el intestino humano y a la rafinosa alimentaria, el laboratorio Walter está llevando a cabo un estudio en seres humanos que evalúa el rendimiento de la cepa en el intestino humano. El objetivo de este estudio es demostrar que una especie bacteriana dominante en el microbioma no occidentalizado puede "reintroducirse" en el intestino de canadienses que toman una alimentación diseñada para promover el crecimiento de la bacteria.

Ensayo clínico en seres humanos. Los participantes se inscribieron en el campus de la Universidad de Alberta y se obtuvo su consentimiento informado. En un diseño de ensayo clínico de tres grupos, se comparó el efecto de dos cepas de L. reuteri (NCIMB 42835 y DSM 20016T) con un grupo de placebo. El impacto de una alimentación no occidental se sometió a ensayo como un diseño cruzado en todos los grupos del estudio. Mujeres premenopáusicas, no gestantes y no lactantes y hombres sanos, de 18 a 45 años, con un iMc entre 20-29,9 kg/m2, y sin antecedentes recientes (<3 meses) de uso de antibióticos (N= 30). Los participantes se estratificaron según el sexo y se asignaron al azar a 1 de los 3 grupos. Los grupos 1 y 2 recibirán las cepas de L. reuteri proporcionadas en agua para consumo directo, con describen Duar et al. (Duar et al., 2017). Ambas cepas se proporcionaron a una dosis de aproximadamente 1010 células viables, que es una dosis en la que los seres humanos toleran fácilmente L. reuteri (Duar et al., 2017). El grupo tres recibirá un placebo (2 g de maltodextrina diluida en agua), que se sabe que no afecta al microbioma. Todos los grupos recibieron una sola dosis del probiótico o placebo el día 4 y el día 39 de la intervención. Se solicitará a los participantes que mantengan su alimentación habitual durante el período de selección de una semana. Después de una semana, la mitad de los sujetos por grupo se asignaron a seguir la 'alimentación no occidental' (o alimentación diseñada), mientras que la mitad siguió consumiendo su alimentación habitual durante tres semanas (alimentación habitual). Después de un periodo de reposo de 2 semanas, los participantes cambiaron de alimentación, durante el segundo período de 3 semanas del estudio. Los participantes asistieron a un total de 12 visitas clínicas a lo largo del estudio. La visita inicial tuvo lugar el día anterior al comienzo de cada período de alimentación (días 0 y 35); durante estas visitas, se recogieron datos antropométricos, composición corporal medida mediante análisis de impedancia bioeléctrica (AIB), mediciones de presión arterial, muestras de sangre y heces, y los participantes rellenaron cuestionarios sobre estrés percibido y tolerancia GI. Los días 4 y 39 del estudio, los participantes recibieron la cepa L. reuteri o placebo según el grupo al que se habían asignado. Además de las visitas programadas, se solicitó a los participantes que proporcionaran muestras de heces aproximadamente cada dos días durante cada período de alimentación.

Alimentación. El laboratorio Walter, en colaboración con otros laboratorios de la Universidad de Alberta, diseñó una intervención alimentaria que se asemejaba a la de las personas que siguen un estilo de vida agrario, seleccionado específicamente al mismo tiempo productos alimentarios que proporcionan sustratos no digeribles para L. reuteri. Mientras que una alimentación occidental clásica se caracteriza por un alto consumo de carnes rojas y procesadas, huevos, cereales y azúcares refinados, la alimentación de las personas nativas de Papúa Nueva Guinea es comparativamente más rica en alimentos de origen vegetal, fibra e hidratos de carbono, y más baja en grasas y fuentes de proteína de origen animal (Martínez et al, 2015). Específicamente, la rafinosa es común en la alimentación de Papúa Nueva Guinea, pero poco frecuente en la alimentación occidental, y se espera que favorezca el crecimiento de L. reuteri en el intestino humano (véanse nuestros datos preliminares). Aunque estaban asignados al período de alimentación no occidental (diseñada) del estudio, los participantes recibieron desayunos, almuerzos, cenas y refrigerios totalmente preparados y preenvasados, compuestos por productos alimentarios que se asemejan a las cantidades y tipo de fuentes de hidratos de carbono consumidos por los individuos de una sociedad agraria (p.

ej., ñame, batata y mandioca). Además, la alimentación era conservadora en la cantidad de proteína animal suministrada (frecuencia de una vez al día o menor) haciendo hincapié en fuentes de proteína de origen vegetal como judías y guisantes partidos.

Producción de cepas de L. reuteri para el consumo. Se prepararon cepas de L. reuteri para su consumo en el laboratorio Walter en condiciones de calidad alimentaria, y el número de células se estableció antes de la recogida y la dosis se estandarizó según lo descrito por Duar et al. (2017) a aproximadamente 109 células por ml y se proporcionó a los sujetos en agua de manantial.

Determinación del número de células de L. reuteri en muestras fecales.

Se recogieron muestras fecales cada 2 días (dos veces antes y durante dos semanas después del consumo de L. reuteri o del placebo). Cuantificación absoluta de las cepas de L. reuteri en muestras fecales mediante cultivo bacteriano utilizando agar LRIM. Este agar ha demostrado ser suficientemente selectivo para aislar cuantitativamente L. reuteri de muestras fecales humanas (Duar et al., 2017).

Hallazgos preliminares:

Como se muestra en la figura 11, la cepa NCIMB 42835 alcanza más de 10 veces el número de células en comparación con DSM 20016T dos días después de la administración. Los números descienden después pero se mantienen más altos NCIMB 42835. Además, el cambio de alimentación a una alimentación no occidental rica en alimentos de origen vegetal (alimentación diseñada) conduce a una mayor persistencia a los 8 días después de la administración (figuras 12 A+B). Estos hallazgos muestran que la cepa NCIMB 42835 muestra adaptaciones al intestino humano y se beneficia de una dieta que reproduce la de una población humana agraria no industrializada. Dado que el estilo de vida moderno está asociado a un aumento sustancial de las enfermedades crónicas, corregir el agotamiento del microbioma inducido por el estilo de vida tiene un enorme potencial terapéutico. Cuando cepas aisladas de L. reuteri, originarias de zonas rurales de Papúa Nueva Guinea, vuelven a introducirse en el intestino de personas que viven en sociedades industrializadas, probablemente ejercerán beneficios para la salud y podrían ayudar a prevenir enfermedades occidentales no transmisibles como el autismo. En la invención, este importante simbionte (una especie con una relación evolutiva prolongada que produce un beneficio mutuo) se aísla de individuos no industriales y demuestra propiedades únicas. La introducción en la alimentación de seres humanos industrializados u occidentales, que incluye su uso como probiótico con y sin la administración paralela de sustratos como la rafinosa, no se había propuesto antes.

Se espera que haya ventajas particulares para mejorar la microbiota de lactantes, niños pequeños, mujeres gestantes o madres después del parto.

Se apreciará que las cepas de la invención pueden administrarse a animales (incluidos los seres humanos) en una forma ingerible por vía oral en una preparación convencional, tal como cápsulas, microcápsulas, comprimidos, gránulos, polvo, trociscos, píldoras, supositorios, suspensiones y jarabes.

Pueden prepararse formulaciones adecuadas mediante métodos habitualmente empleados usando aditivos orgánicos e inorgánicos convencionales. La cantidad de principio activo en la composición médica puede estar a un nivel que ejerza el efecto terapéutico deseado.

La formulación también puede incluir un componente bacteriano, una entidad farmacológica o un compuesto biológico.

Además, una vacuna que comprende las cepas de la invención, puede prepararse usando cualquier método conocido adecuado y puede incluir un transportador o adyuvante farmacéuticamente aceptable.

El sistema inmunitario humano desempeña un papel importante en la etiología y patología de una amplia gama de enfermedades humanas. La capacidad de respuesta hiper e hipoinmunitaria da como resultado, o es un componente de, la mayoría de los cuadros clínicos. Una familia de entidades biológicas, denominadas citocinas, es particularmente importante para el control de procesos inmunitarios. Las perturbaciones de estas delicadas redes de citocinas se asocian cada vez más a muchas enfermedades. Estas enfermedades incluyen, pero sin limitación, trastornos inflamatorios, inmunodeficiencia, enfermedad intestinal inflamatoria, síndrome del intestino irritable, cáncer (particularmente los del sistema gastrointestinal e inmunitario), enfermedad diarreica, diarrea asociada a antibióticos, diarrea pediátrica, apendicitis, trastornos autoinmunitarios, enfermedad de Alzheimer, artritis reumatoide, celiaquía, diabetes mellitus, trasplante de órgano, infecciones bacterianas, infecciones víricas, infecciones fúngicas, enfermedad periodontal, enfermedad urogenital, enfermedad de transmisión sexual, infección por VIH, replicación del VIH, diarrea asociada al VIH, traumatismo asociado a la cirugía, enfermedad metastásica inducida por cirugía, septicemia, pérdida de peso, anorexia, control de la fiebre, caquexia, cicatrización de heridas, úlceras, función de barrera intestinal, alergia, asma, trastornos respiratorios, trastornos circulatorios, cardiopatía coronaria, anemia, trastornos del sistema de coagulación sanguínea, nefropatía, trastornos del sistema nervioso central, enfermedad hepática, isquemia, trastornos nutricionales, osteoporosis, trastornos endocrinos, trastornos epidérmicos, psoriasis y acné vulgar. Los efectos sobre la producción de citocinas, son específicos para la cepa probiótica examinada. Por tanto, pueden seleccionarse cepas probióticas específicas para normalizar un desequilibrio de citocinas exclusivo particular para un tipo de enfermedad específico. La personalización de las terapias específicas de la enfermedad puede realizarse usando una sola cepa o mutantes o variantes de la misma o una selección de estas cepas.

La microbiota entérica es importante para el desarrollo y el funcionamiento adecuado del sistema inmunitario intestinal. En ausencia de una microbiota entérica, el sistema inmunitario intestinal está subdesarrollado, como se demostró en modelos animales axénicos, y ciertos parámetros funcionales están disminuidos, tales como la capacidad fagocítica de los macrófagos y la producción de inmunoglobulinas. La importancia de la microbiota intestinal en la estimulación de respuestas inmunitarias no dañinas es cada vez más evidente. El aumento de la incidencia y la gravedad de las alergias en el mundo occidental se ha relacionado con un aumento de la higiene y la salubridad, concomitante con una disminución del número y variedad de exposiciones infecciosas a las que se enfrenta el hospedador. Esta falta de estimulación inmunitaria puede permitir que el hospedador reaccione contra agentes no patógenos, pero antigénicos, dando lugar a alergia o a autoinmunidad. El consumo deliberado de una serie de bacterias inmunomoduladoras no patógenas proporcionaría al hospedador los estímulos educativos necesarios y apropiados para el correcto desarrollo y control de la función inmunitaria.

Prebióticos

La introducción de organismos probióticos se realiza mediante la ingestión del microorganismo en un vehículo adecuado. Sería ventajoso proporcionar un medio que promueva el crecimiento de estas cepas probióticas en el intestino grueso. La adición de uno o más oligosacáridos, polisacáridos u otros prebióticos aumenta el crecimiento de bacterias del ácido láctico en el tubo gastrointestinal. Por prebiótico se entiende cualquier componente alimentario no viable que es fermentado específicamente en el colon por bacterias endógenas consideradas de valor positivo, p. ej., bifidobacterias, lactobacilos. Para L. reuteri, el prebiótico más prometedor para su uso combinado es la rafinosa y sustratos relacionados con la rafinosa, como AlphaGOS. La administración combinada de una cepa probiótica con uno o más compuestos prebióticos puede mejorar el crecimiento del probiótico administrado in vivo, dando como resultado un beneficio para la salud más apreciable, y se denomina simbiótico.

Otros principios activos

Se apreciará que las cepas probióticas pueden administrarse profilácticamente o como método de tratamiento, bien solas o con otros materiales probióticos y/o prebióticos como se ha descrito anteriormente. Además, las bacterias pueden utilizarse como parte de un régimen profiláctico o de tratamiento con otros materiales activos, como los utilizados para tratar la inflamación u otros trastornos, especialmente los que tienen una implicación inmunológica. Dichas combinaciones pueden administrarse en una única formulación o como formulaciones distintas administradas en el mismo momento o en momentos diferentes y utilizando la misma vía de administración o vías diferentes.

Composiciones farmacéuticas

Una composición farmacéutica es una composición que comprende o consiste en una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente farmacéuticamente activo. Preferentemente incluye un vehículo, diluyente o excipientes farmacéuticamente aceptables, (incluidas combinaciones de los mismos). Los vehículos o diluyentes aceptables para uso terapéutico son bien conocidos en la técnica farmacéutica y se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences. La elección del vehículo, excipiente o diluyente farmacéutico, puede seleccionarse con respecto a la vía de administración prevista y a la práctica farmacéutica estándar. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender como, o además de, el vehículo, excipiente o diluyente, cualquier aglutinante(s), lubricante(s), agente(s) de suspensión, agente(s) de recubrimiento, agente(s) solubilizante(s), propulsor(es) que sea adecuado.

Los ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, agua, soluciones salinas, alcohol, silicona, ceras, vaselina, aceites vegetales, polietilenglicoles, propilenglicol, liposomas, azúcares, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, tensioactivos, ácido silícico, parafina viscosa, aceite perfumado, monoglicéridos y diglicéridos de ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos petroetéreos, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona y similares.

Cuando sea apropiado, las composiciones farmacéuticas pueden administrarse mediante uno cualquiera o más de: inhalación, en forma de supositorio u óvulo vaginal, por vía tópica en forma de loción, solución, crema, pomada o polvo para espolvorear, mediante el uso de un parche cutáneo, por vía oral en forma de comprimidos que contienen excipientes, tales como almidón o lactosa, o en cápsulas u óvulos, solos o en mezcla con excipientes, o en forma de elixires, soluciones o suspensiones que contienen agentes aromatizantes o colorantes, o pueden inyectarse por vía parenteral, por ejemplo, intracavernosa, intravenosa, intramuscular o subcutánea. Para administración parenteral, las composiciones pueden usarse mejor en forma de una solución acuosa estéril que puede contener otras sustancias, por ejemplo, suficientes sales o monosacáridos para hacer que la solución sea isotónica con la sangre. Para la administración bucal o sublingual, las composiciones pueden administrarse en forma de comprimidos o pastillas para chupar que pueden formularse de forma convencional.

La administración intranasal puede realizarse usando un pulverizador nasal, una solución de lavado nasal o aplicación directa dentro de la nariz.

La administración al pulmón puede ser en forma de polvo seco, inhalado con un dispositivo inhalador. En algunos casos, la formulación está en forma de un aerosol. El aerosol puede ser una solución, suspensión, pulverización, vaho, vapor, gotículas, partículas o un polvo seco, por ejemplo, utilizando un inhalador de dosis medida que incluya un propulsor de HFA (hidrofluroalcano), un inhalador de dosis medida con un propulsor que no sea de HFA, un nebulizador, un envase presurizado, de un pulverizador continuo.

Puede haber diferentes requisitos de composición/formulación dependiendo de los diferentes sistemas de suministro. A modo de ejemplo, la composición farmacéutica de la presente invención puede formularse para suministrarse usando una minibomba o por vía mucosa, por ejemplo, en forma de pulverizador o aerosol nasal para inhalación o solución ingerible, o por vía parenteral en la que la composición está formulada en forma inyectable, para su suministro, por ejemplo, por vía intravenosa, intramuscular o subcutánea. Como alternativa, la formulación puede diseñarse para su suministro por ambas vías.

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Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Cepa de Lactobacillus reuteri que tiene el número de registro NCIMB 42835.

2. Una cepa de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la cepa está en forma de un cultivo biológicamente puro, un caldo bacteriano o un polvo liofilizado.

3. Una cepa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde la cepa es un simbionte humano.

4. Una cepa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en forma de células viables y/o no viables.

5. Una formulación que comprende una cepa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Una formulación de acuerdo con la reivindicación 5, que comprende además un sustrato para la cepa.

7. Una formulación de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el sustrato es un hidrato de carbono.

8. Una formulación de acuerdo con la reivindicación 6 o 7, en donde el sustrato es un oligosacárido que puede no ser digerible.

9. Una formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en donde el sustrato comprende rafinosa.

10. Una formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, que comprende además un material prebiótico y/u otro material probiótico.

11. Una formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, que comprende además un transportador ingerible.

12. Una formulación de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el transportador ingerible es un transportador farmacéuticamente aceptable, tal como una cápsula, un comprimido o un polvo.

13. Una formulación de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el transportador ingerible es un producto alimentario tal como leche acidificada, yogur, yogur congelado, leche en polvo, concentrado de leche, helado, queso para untar, aderezo o bebida.

14. La cepa de Lactobacillus reuteri que tiene el número de registro NCIMB 42835, para su uso en la mejora de la microbiota de un individuo que requiere una microbiota mejorada.

15. Cepa de Lactobacillus reuteri que tiene el número de registro NCIMB 42835, para su uso de acuerdo con la reivindicación 14, en donde el individuo es un lactante, un niño pequeño, una mujer gestante o una madre después del parto.