ES2937659T3 - Plantas de pimiento resistentes a enfermedades - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a plantas de pimiento resistentes a la enfermedad del oidio así como a la infección por potyvirus, particularmente el virus Y de la patata (PVY). Específicamente, la presente invención se refiere a plantas de pimiento que comprenden un alelo de resistencia viral y un alelo de resistencia al oídio en configuración cis en el mismo cromosoma, de manera que los dos alelos de resistencia están en fase de acoplamiento. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Plantas de pimiento resistentes a enfermedades

Campo de la invención

La presente invención se refiere a plantas de pimiento resistentes a la enfermedad del mildiú polvoroso así como a la infección por Potyvirus, particularmente el virus Y de la patata (PVY). Específicamente, la presente invención se refiere a plantas de pimiento que comprenden un alelo de resistencia viral y un alelo de resistencia al mildiú polvoroso en configuración cis en el mismo cromosoma, de modo que los dos alelos de resistencia están en fase de acoplamiento.

Antecedentes de la invención

El mildiú polvoroso es una enfermedad de las plantas provocada por patógenos parásitos fúngicos. El mildiú polvoroso provocado por el hongo Leveillula taurica es una de las enfermedades más importantes del pimiento, principalmente del pimiento dulce, y afecta también a otros cultivos hortícolas. Desde principios de la década de 1990, se reporta que este patógeno provoca epidemias en invernaderos y campos abiertos, en la mayoría de las áreas de producción de pimiento. Mientras que la mayoría de las especies de hongos que provocan el mildiú polvoroso son ectoparásitos, el micelio de L. taurica crece intercelularmente dentro de los tejidos del huésped, lo que limita la eficacia de los fungicidas químicos. Uno de los síntomas más pronunciados de la enfermedad provocada por este parásito es el sombreado prematuro de las hojas, que afecta fuertemente la producción y calidad de los frutos, haciendo que una parte importante del fruto no sea comercializable.

Se encontraron varias fuentes de resistencia al mildiú polvoroso bajo condiciones naturales de infección en diferentes especies de pimientos (Capsicum), incluyendo Capsicum annuum, C. baccatum y C. chinense. Los análisis genéticos cuantitativos han demostrado que de tres a cinco factores genéticos con efectos epistáticos significativos están implicados en el fenotipo resistente en condiciones de infección severa (Daubeze et al., 1995. Plant Breed. 114:327-332; Murphy and Deshpande, 1997. Vegetable Sci. 24:127-131). Recientemente, se detectaron siete regiones genómicas que incluyen locus de rasgos cuantitativos aditivos (QTL) e interacciones epistáticas en C. annuum genitor H3 altamente resistente al mildiú polvoroso, que tiene frutos pequeños y picantes. Estos hallazgos, es decir, el complejo patrón de herencia de la resistencia junto con la observación de que la epidemia de mildiú polvoroso depende en gran medida de las condiciones ambientales, explican la alta variabilidad encontrada en la respuesta de las plantas de pimiento al patógeno (Lefebvre et al., 2003. Theor. Appl. Genet. 107:661-666).

La patente de Estados Unidos U.S. Patent No. 6,350,933 describe ácidos nucleicos y proteínas que confieren resistencia a la enfermedad del mildiú polvoroso. Los ácidos nucleicos se pueden usar para producir plantas transgénicas de varios tipos que son resistentes a las plagas. También se proporcionan anticuerpos contra las proteínas descritas en la invención.

La patente de Estados Unidos U.S. Patent No. 6,677,510 describe plantas resistentes al mildiú polvoroso, específicamente cultivares de cornejo (cornus florida) que son resistentes a la infestación con hongos del mildiú polvoroso, y materiales y métodos para identificar, caracterizar y/o producir plantas resistentes al mildiú polvoroso. También describe secuencias de polinucleótidos y patrones de secuencias de polinucleótidos, que están asociados con la resistencia al mildiú polvoroso, útiles para identificar y caracterizar plantas que tienen resistencia al mildiú polvoroso. Sin embargo, estos medios y métodos están dirigidos principalmente a las plantas ornamentales.

Los virus de plantas son un problema continuo en la industria agrícola. La infección viral en las plantas provoca una variedad de efectos indeseables que incluyen retraso en el crecimiento, morfología alterada, rendimiento reducido, calidad disminuida y mayor susceptibilidad al daño por otras plagas. Se han realizado intentos para controlar o prevenir la infección de un cultivo por un virus vegetal, pero los patógenos virales siguen siendo un problema significativo en la agricultura.

Los potyvirus comprenden aproximadamente el 30% de todos los virus de plantas conocidos, y los virus que pertenecen a este grupo provocan daños significativos a los cultivos agrícolas. La familia Potyviridae se caracteriza por un genoma de RNA sentido monocatenario con una proteína codificada por virus (VPg) unida covalentemente unida al extremo 5' y un tracto poli-A en 3'. El genoma tiene una longitud aproximada de 10 kb y se traduce como una poliproteína que posteriormente se escinde en polipéptidos más pequeños mediante proteasas codificadas por virus. El virus Y de la patata (en lo sucesivo PVY) es un miembro del grupo de virus de plantas potyvirus. El PVY es un virus de RNA monocatenario de sentido positivo que está rodeado por un monómero proteínico repetitivo, que se denomina proteína de cubierta (CP). El virus encapsidado tiene una morfología de varilla flexuosa, que es característica del grupo potyvirus. La mayoría de los potyvirus, incluyendo el PVY, son transmitidos de forma no persistente por pulgones. El rango de huéspedes de PVY incluye patata, tabaco, tomate y pimiento, y la facilidad de su transmisión por pulgones da como resultado un daño significativo a estos cultivos y una drástica reducción de su valor económico.

La infección por potyvirus requiere la interacción de los factores del huésped con las proteínas virales y el RNA para la replicación viral y la propagación sistémica. El "modelo negativo" de resistencia a virus de plantas predice que un gen de resistencia recesivo puede representar una proteína huésped defectuosa o eliminada que es esencial para la infección viral pero no es necesaria para la función normal de la célula vegetal. La resistencia recesiva es especialmente frecuente para los potyvirus, que comprenden aproximadamente el 40 % de todos los genes de resistencia conocidos. Se han caracterizado varios genes del huésped cuyas mutaciones alteran el ciclo de infección del virus de plantas, particularmente en Arabidopsis (Kang et al. Annu. Rev. Phytopathol. 43:581-621). El gen que codifica el factor de iniciación de la traducción eIF4E se ha identificado repetidamente en diversos huéspedes como un locus de resistencia heredado de forma recesiva que se produce de forma natural. Se ha demostrado que las mutaciones en este gen producen resistencia a los potyvirus en varias especies de plantas, incluyendo los pimientos. Las mutaciones se producen en el locus de p vrl, recientemente demostrado ser idéntico al locus de pvr2 (Ruffel et al., 2002. The Plant J. 32:1067-1075; Kang et al., 2005. The Plant J. 42:392-405).

Muchos de los genes implicados en la resistencia a virus, incluyendo el gen de resistencia a virus p v rl identificado en Capsicum, se han utilizado con éxito como marcadores efectivos y estables para identificar fuentes de resistencia en programas de mejoramiento de cultivos. Yeam et al. (2005. Theor. Appl. Genet. 112:178-186) reportaron la generación y el uso de marcadores moleculares que definen el loci para la selección de plantas Capsicum resistentes a potyvirus, utilizando secuencias polimórficas amplificadas escindidas (CAPS). Dichos marcadores de CAPS se desarrollaron para tres alelos de resistencia viral recesivos, p v rl, p v rl1 y p v rl2.

Alternativamente, los intentos se dirigen hacia el uso de técnicas de ingeniería genética para producir plantas resistentes a virus (por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos U.S. Patent Nos. 5,589,612; 5,939,603; 5,986,175; y 6,806,400).

A partir de ahora, están disponibles plantas de pimiento resistentes a los potyvirus, incluyendo variedades adecuadas para el crecimiento de cultivos comerciales. Sin embargo, el control químico todavía se usa ampliamente para combatir la infección viral.

En las últimas décadas, ha aumentado constantemente la conciencia sobre el efecto nocivo del uso extensivo de pesticidas en el medio ambiente. Los esfuerzos están dirigidos al desarrollo de una agricultura sostenible, incluyendo el mantenimiento de una producción de cultivos de alto rendimiento con una reducción significativa en el empleo de productos químicos peligrosos para el medio ambiente.

El control químico del hongo L. taurica, causante de la enfermedad del mildiú polvoroso en los cultivares de pimiento, implica altos costos y es peligroso para el medio ambiente.

Por lo tanto, existe una gran demanda y sería altamente ventajoso tener plantas de pimiento, aptas para el crecimiento a escala comercial, que sean resistentes a más de un patógeno.

Compendio de la invención

La presente invención se refiere a las plantas de pimiento (Capsicum) resistentes al mildiú polvoroso provocado por el hongo Leveillula taurica así como a la infección por al menos un potyvirus, particularmente el virus Y de la patata (PVY), en donde la resistencia a ambos patógenos se encuentra en fase de acoplamiento.

Según un aspecto, la presente invención proporciona una planta de pimiento Capsicum annuum que comprende dentro de su genoma al menos un alelo de resistencia al potyvirus y al menos un alelo de resistencia al mildiú polvoroso (PM), en el que los alelos de resistencia están presentes en configuración cis en el cromosoma 4, tal que dichos dos alelos de resistencia están en fase de acoplamiento.

La presente invención se basa en parte en el descubrimiento de que las plantas de pimiento que son resistentes al mildiú polvoroso son susceptibles a la infección por PVY y viceversa. Este fenómeno es el resultado de una estrecha unión entre el gen p v rl relacionado con la resistencia a PVY y un gen relacionado con la resistencia al mildiú polvoroso. La presente invención muestra ahora que el alelo de resistencia p v rl se encuentra en el mismo cromosoma que el alelo susceptible al mildiú polvoroso. La presente invención se basa además en la identificación de sucesos de recombinación en la región de estos genes estrechamente unidos, que conducen al acoplamiento de ambos alelos de resistencia en una configuración cis en el mismo cromosoma.

Según una realización, el al menos un alelo de resistencia al potyvirus y el al menos un alelo de resistencia al PM están localizados en el cromosoma 4.

Según ciertas realizaciones, la planta de pimiento es sustancialmente resistente a la enfermedad del PM provocada por el hongo L. taurica. Según las realizaciones actualmente preferidas, la planta de pimiento es resistente a la enfermedad del PM provocada por el hongo L. taurica así como a la infección por al menos un potyvirus. Según una realización, el potyvirus se selecciona del grupo que consiste en el virus Y de la patata (PVY); virus A de la patata (PVA); virus del grabado del tabaco (TEV); y virus del moteado del pimiento (PepMoV). Según ciertas realizaciones actualmente preferidas, el potyvirus es PVY.

Como se usa en la presente memoria, el término "sustancialmente resistente" con respecto al mildiú polvoroso se refiere a plantas que, tras la inoculación, no muestran, o muestran solo síntomas leves de la enfermedad. Los síntomas de la enfermedad incluyen manchas cloróticas en la superficie superior de la hoja y una esporulación como un polvo blanco en el área correspondiente de la superficie inferior de la hoja.

Con respecto al PVY, el término "sustancialmente resistente" se refiere a las plantas que tras la inoculación con el virus, no muestran, o solo muestran síntomas leves de la enfermedad. Los síntomas de la enfermedad se muestran como manchas verdes en las hojas, creando un patrón de "tipo mosaico".

Según otras realizaciones, la planta de pimiento es adecuada para el crecimiento comercial y tiene un fruto dulce comestible.

Según realizaciones adicionales, la planta de pimiento comprende dentro de su genoma una secuencia de DNA que se acopla con resistencia a un potyvirus, y una secuencia de DNA que se acopla con susceptibilidad al potyvirus, en donde dicha planta de pimiento es resistente al mildiú polvoroso. Según una realización, la secuencia de DNA que se acopla con resistencia o susceptibilidad al potyvirus se localiza dentro del gen p v rl (Acceso NCBI No. AY485129; Kang et al., 2005. Plant J. 42:392-405). Según otra realización, el potyvirus es PVY. Según otra realización más, la secuencia de DNA que se acopla con resistencia al potyvirus comprende una secuencia de polinucleótidos como se establece en SEQ ID NO:1. Según una realización actualmente preferida, la secuencia de DNA que se acopla con resistencia al potyvirus es una plantilla para la amplificación de un fragmento de DNA usando un primer cebador que tiene una secuencia de polinucleótidos como se establece en SEQ ID NO:2 y un segundo cebador que tiene una secuencia de polinucleótidos como se establece en SEQ ID NO:3. El fragmento de DNA resultante carece de un sitio de restricción para la enzima de restricción BseNI.

Según una realización adicional, la secuencia de DNA que se acopla con susceptibilidad al potyvirus es una plantilla para la amplificación de un fragmento de DNA usando un primer cebador que tiene una secuencia de polinucleótidos como se establece en SEQ ID NO:2 y un segundo cebador que tiene una secuencia de polinucleótidos como se establece en SEQ ID NO:3. El fragmento de DNA resultante contiene un sitio de restricción para la enzima de restricción BseNI.

Las plantas de la invención son preferiblemente no modificadas genéticamente (no-GMO); sin embargo, debe entenderse que la adición o eliminación de rasgos por transformación está incluida explícitamente dentro del alcance de la invención. El polen y los óvulos de las plantas de pimiento de la presente invención; las semillas producidas a partir de las mismas y las plantas cultivadas a partir de las semillas y los frutos producidos por estas plantas, también se incluyen dentro del alcance de la presente invención.

Las plantas de pimiento de la presente invención ventajosamente pueden comprender además rasgos agronómicos beneficiosos como son bien conocidas en la técnica, que incluyen pero no se limitan a una alta tasa de germinación, resistencia a herbicidas, resistencia a insectos, resistencia a al menos una enfermedad, resistencia a varios tipos de estrés no-biótico, esterilidad masculina y crecimiento vigoroso.

Según una realización, las plantas o la progenie o partes de las mismas se han transformado para incluir al menos un rasgo adicional de modo que su material genético contenga uno o más transgenes unidos operativamente a uno o más elementos reguladores. Las plantas de pimiento y partes de las mismas producidas a partir de las variedades transformadas también se incluyen dentro del alcance de la presente invención.

Las plantas de pimiento de la presente invención pueden ser líneas endogámicas genéticamente estables así como híbridos producidos mediante entrecruzamiento de dos cepas diferentes. Tal como se usa en la presente memoria, "líneas parentales" se refiere a líneas endogámicas de polinización abierta, estables para los rasgos deseados durante ciclos de autopolinización y plantación. Según ciertas realizaciones, las plantas de pimiento de la presente invención son capaces de producir un cultivo de valor comercial.

Según ciertas realizaciones, las plantas de pimiento que tienen resistencia dual según las enseñanzas de la presente invención son homocigóticas para el alelo de resistencia al potyvirus y para el alelo de resistencia al PM.

Según otras realizaciones determinadas, las plantas de pimiento que tienen resistencia dual según las enseñanzas de la presente invención son homocigotas para el alelo de resistencia al potyvirus y heterocigotas para el alelo de resistencia al PM.

Según otro aspecto más, la presente invención proporciona un cultivo de tejido regenerado a partir de las plantas de la presente invención y plantas regeneradas a partir de las mismas.

Según una realización, el cultivo de tejidos comprende células o protoplastos derivados de un tejido seleccionado del grupo que consiste, pero no se limita a, hojas, polen, embriones, raíces, puntas de raíces, anteras, flores, frutos y semillas. Según otra realización, una planta regenerada a partir del cultivo tisular comprende dentro de su genoma al menos un alelo de resistencia al potyvirus y al menos un alelo de resistencia al mildiú polvoroso (PM), presentes en posición cis en el mismo cromosoma de manera que los dos alelos de resistencia están en fase de acoplamiento. Según otro aspecto, la presente invención proporciona semillas de pimiento en las que las plantas que crecen a partir de las semillas comprenden dentro de sus genomas al menos un alelo de resistencia al potyvirus y al menos un alelo de resistencia al mildiú polvoroso (PM), en el que

Según otro aspecto, la presente invención proporciona semillas de pimiento, en donde dichos síntomas incluyen manchas cloróticas en la superficie superior de la hoja y esporulación como un polvo blanco en el área correspondiente de la superficie inferior de la hoja.

Según otro aspecto, la presente invención proporciona semillas de pimiento, en donde la inoculación de la planta cultivada a partir de dicha semilla con PVY da como resultado una aparición menor o nula de manchas verdes tipo mosaico en las hojas de dicha planta.

Según otro aspecto, la presente invención proporciona semillas de pimiento, que comprenden dentro de su genoma una secuencia de DNA que se acopla con resistencia a un potyvirus, y una secuencia de DNA que se acopla con susceptibilidad a potyvirus, en donde dicha planta de pimiento es resistente al mildiú polvoroso.

Según con otro aspecto, la presente invención proporciona semillas de pimiento, en donde la secuencia de DNA que se acopla con resistencia a potyvirus es una plantilla para la amplificación de un fragmento de DNA utilizando un primer cebador que tiene una secuencia de polinucleótidos como se establece en SEQ ID NO: 2 y un segundo cebador que tiene una secuencia de polinucleótidos como se establece en SEQ ID NO: 3, careciendo dicho fragmento de DNA de un sitio de restricción para la enzima de restricción SseNI.

Según otro aspecto, la presente invención proporciona semillas de pimiento, en donde la secuencia de DNA que se acopla con susceptibilidad a potyvirus es una plantilla para la amplificación de un fragmento de DNA usando un primer cebador que tiene una secuencia de polinucleótidos como se establece en SEQ ID NO: 2 y un segundo cebador que tiene una secuencia de polinucleótidos como se establece en SEQ ID NO: 3, conteniendo dicho fragmento de DNA un sitio de restricción para la enzima de restricción SseNI.

Según otro aspecto, la presente invención proporciona una planta de pimiento, o una parte de la misma, producida cultivando la semilla como se ha detallado anteriormente.

Según otro aspecto más, la presente invención proporciona un fruto de una planta de pimiento que comprende dentro de su genoma al menos un alelo de resistencia al potyvirus y al menos un alelo de resistencia al mildiú polvoroso (PM), presentes en configuración cis en el mismo cromosoma tal que los dos alelos de resistencia están en fase de acoplamiento, en donde los frutos son frutos dulces comestibles. Según ciertas realizaciones actualmente preferidas, el potyvirus es PVY.

Por lo tanto, según otro aspecto, la presente invención proporciona un método para caracterizar una planta de pimiento como resistente o susceptible a la infección por L. taurica, que comprende las etapas de:

a) aislar una muestra de DNA genómico de la planta;

b) amplificar un segmento de DNA usando un primer cebador que tiene una secuencia de polinucleótidos como se establece en SEQ ID NO: 2 y un segundo cebador que tiene una secuencia de polinucleótidos como se establece en SEQ ID NO: 3; y

c) someter el segmento de DNA amplificado a restricción con la enzima de restricción SseNI;

en donde la presencia del sitio de restricción de SseNI dentro de dicho segmento de DNA amplificado caracteriza la planta como resistente a la infección por L. taurica y la ausencia del sitio de SseNI caracteriza a la planta como susceptible a la infección por L. taurica. Otros objetivos, características y ventajas de la presente invención quedarán claros a partir de la descripción y los dibujos siguientes.

Breve descripción de las figuras

Con el fin de comprender la invención y ver cómo se puede implementar en la práctica, se describirán ahora, a modo de ejemplo no limitante únicamente, una pluralidad de realizaciones preferidas, con referencia a las figuras adjuntas, en las que:

La FIG. 1 es una representación fotográfica de la superficie inferior de la hoja de hojas obtenidas a partir de plantas de pimiento resistentes y de plantas susceptibles como realizaciones preferidas de la invención;

La FIG. 2 es una representación fotográfica de la segregación del gen pvr en plantas F2, usando los marcadores de DNA como se describe en la presente memoria. R-Planta homocigota resistente a pvr; S-Planta homocigota susceptible a pvr; H-planta heterocigota parcialmente resistente a pvr; M-pPBR322 DNA/Marcador Alu; y,

La FIG. 3 es una presentación esquemática de SEQ ID NO: 1, que es la secuencia de nucleótidos de un fragmento de DNA amplificado por los cebadores de SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3 de la presente invención, usando el gen pvr como plantilla. caracteriza la planta como resistente a la infección por L. taurica y la ausencia del sitio SseNI caracteriza la planta como susceptible a la infección por L. taurica. Otros objetivos, características y ventajas de la presente invención quedarán claros a partir de la descripción y los dibujos siguientes.

Breve descripción de las figuras

Con el fin de comprender la invención y ver cómo se puede implementar en la práctica, se describirán ahora, a modo de ejemplo no limitante únicamente, una pluralidad de realizaciones preferidas, con referencia a las figuras adjuntas, en las que:

La FIG. 1 es una representación fotográfica de la superficie inferior de la hoja de hojas obtenidas de plantas de pimiento resistentes y de plantas susceptibles como realizaciones preferidas de la invención;

La FIG. 2 es una representación fotográfica de la segregación del gen pvr en plantas F2, usando los marcadores de DNA como se describe en la presente memoria. R-Planta homocigota resistente a pvr; S-Planta homocigota susceptible a pvr; H-Planta heterocigota parcialmente resistente a pvr; M-pPBR322 ADN/Marcador Alu; y,

La FIG. 3 es una presentación esquemática de SEQ ID NO: 1, que es la secuencia de nucleótidos de un fragmento de DNA amplificado por los cebadores SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3 de la presente invención, usando el gen pvr como una plantilla.

Descripción detallada de la invención

Definiciones

Como se usa en la presente memoria, el término "planta de pimiento" se refiere a una planta del género Capsicum, específicamente a las plantas de Capsicum annuum.

Como se usa en la presente memoria, el término "mildiú polvoroso" se refiere a una enfermedad provocada por el hongo Leveillula taurica. Las plantas infectadas con el hongo mostrarán manchas como polvo blanco en las hojas. Las hojas inferiores son las más afectadas y, a medida que avanza la enfermedad, el mildiú se extiende hasta las hojas superiores. La progresión de la enfermedad también se asocia con manchas que se hacen más grandes y gruesas debido a la formación de un gran número de esporas. Las hojas infectadas con el hongo a menudo se desprenden de la planta, exponiendo los frutos a la luz solar lo que puede dañar los frutos.

Como se usa en la presente memoria, el término "potyvirus" se refiere a un virus que infecta plantas que pertenecen a la familia Potyviridae. Los miembros de la familia Potyviridae incluyen: virus Y de la patata (PVY), virus A de la patata (PVA), virus del grabado del tabaco (TEV) y virus del moteado de la pimienta (PepMoV). El término PVY se refiere al virus Y de la patata, que pertenece al grupo de virus de plantas potyvirus. El PVY es un virus de RNA monocatenario de sentido positivo que está rodeado por un monómero proteínico repetitivo, que se denomina proteína de cubierta (CP). El virus encapsidado tiene una morfología de varilla flexuosa, que es característica del grupo potyvirus. La mayoría de los potyvirus son transmitidos de forma no persistente por pulgones.

Como se usa en la presente memoria, el término "alelo(s)" significa una cualquiera de una o más formas alternativas de un gen en un locus particular, todos los cuales alelos se relacionan con un rasgo o característica en un locus específico. En una célula diploide de un organismo, los alelos de un gen dado están localizados en una ubicación específica, o locus (plural loci) en un cromosoma. Un alelo está presente en cada cromosoma del par de cromosomas homólogos. Una especie de planta diploide puede comprender una gran cantidad de alelos diferentes en un locus particular.

Como se usa en la presente memoria, el término "locus" (plural loci) significa un lugar o lugares específicos o un sitio en un cromosoma donde, por ejemplo, se encuentra un gen o marcador genético.

Como se usa en la presente memoria, los términos "en cis” se refieren a una condición genética en la que los alelos de dos loci diferentes aparecen juntos unidos en un cromosoma (homólogo). Por ejemplo, cuando el alelo de resistencia al PVY y el alelo de resistencia al PM se localizan en un cromosoma homólogo, estos alelos están "en cis”. Por el contrario, si el alelo de resistencia al PVY y el alelo de resistencia al PM están localizados en diferentes cromosomas homólogos de un par homólogo, se dice que están en "trans".

Una "recombinación" o un "suceso de recombinación", como se usa en la presente memoria, se refiere a un entrecruzamiento cromosómico o una variedad independiente. El término "recombinante" se refiere a una planta que tiene una nueva composición genética que surge como resultado de un suceso de recombinación.

Como se usa en la presente memoria, los alelos dominantes de genes unidos están presentes en el mismo cromosoma y se denominan "fase de acoplamiento". Por el contrario, en la unión de la "fase de repulsión", el alelo dominante de un gen está presente con el alelo recesivo del otro gen en el mismo cromosoma.

Como se usa en la presente memoria, el término acoplamiento es análogo a co-heredar o co-segregar en algunas de las realizaciones de la invención.

Como se usa en la presente memoria, los términos "alelo de resistencia al potyvirus" o "alelo de resistencia al PVY" se refieren a un alelo que, cuando está presente en el genoma, confiere resistencia o resistencia parcial a un potyvirus o al virus Y de la patata, respectivamente, en una planta de pimiento. Según ciertas realizaciones de la invención, el "alelo de resistencia al potyvirus" es el alelo de resistencia al gen p v rl (también conocido como pvr2). El término "gen pvr' como se usa en la presente memoria se refiere al acceso NCBI No. AY485129; Kang et al., 2005 Plant J. 42:392 405. Una planta o plantas son "resistentes" cuando no aparecen síntomas o solo síntomas leves de la enfermedad (es decir, solo unas pocas manchas verdes de tipo mosaico) después de la infección deliberada de la planta con el virus. Las plantas resistentes son homocigóticas para el alelo pvr.

El término "alelo de resistencia al PM", como se usa en la presente memoria, se refiere a un alelo que, cuando está presente en el genoma, confiere resistencia o resistencia parcial al mildiú polvoroso provocado por el hongo. L. taurica. La planta o plantas de pimiento resistentes a L. taurica se caracterizan como heterocigotos u homocigotos para el alelo de resistencia al PM. Fenotípicamente, las plantas resistentes heterocigotas muestran solo síntomas menores de enfermedades y las plantas resistentes homocigotas no muestran los síntomas típicos de manchas cloróticas en la superficie superior de la hoja y la esporulación como un polvo blanco en el área correspondiente de la superficie inferior de la hoja.

Como se usa en la presente memoria, el término "rasgo" se refiere a una característica o fenotipo. Por ejemplo, en el contexto de la presente invención, "resistencia" y "susceptibilidad" se refieren a los síntomas observados en una planta infectada con el hongo L. taurica o con un potyvirus como se describe en la presente memoria. Un rasgo se puede heredar de forma dominante o recesiva, o de forma dominante parcial o incompleta. Un rasgo puede ser monogénico (es decir, determinado por un solo locus) o poligénico (es decir, determinado por más de un locus) o también puede resultar de la interacción de uno o más genes con el medio ambiente. Un rasgo dominante da como resultado una manifestación fenotípica completa en estado heterocigoto u homocigoto; un rasgo recesivo se manifiesta solo cuando está presente en el estado homocigoto.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "homocigoto" significa una condición genética que existe cuando dos alelos idénticos residen en un locus específico, pero se colocan individualmente en los pares correspondientes de cromosomas homólogos en la célula de un organismo diploide. Por el contrario, como se usa en la presente memoria, el término "heterocigoto" significa una condición genética que existe cuando dos alelos diferentes residen en un locus específico, pero se colocan individualmente en los pares correspondientes de cromosomas homólogos en la célula de un organismo diploide.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "planta" incluye la planta completa o cualquier parte o derivado de la misma, tal como células vegetales, protoplastos vegetales, cultivos de tejidos de células vegetales a partir de los cuales se pueden regenerar plantas de pimiento, callos de plantas, embriones, polen, óvulos, frutos (por ejemplo, pimienta cosechada), flores, hojas, semillas, raíces, puntas de raíces y similares.

Las semillas de la planta de pimiento que comprenden dentro de su genoma al menos un alelo de resistencia al potyvirus y al menos un alelo de resistencia al mildiú polvoroso (PM), en donde dichos alelos de resistencia están presentes en configuración cis en el mismo cromosoma, tal que dichos dos alelos de resistencia están en fase de acoplamiento se pueden obtener con respecto a un depósito realizado bajo las regulaciones del tratado de Budapest, como se describe en la presente memoria.

Plantas de la invención y partes de las mismas

La presente invención se refiere a plantas de pimiento que son resistentes al mildiú polvoroso y a la infección por un potyvirus, en particular el virus Y de la patata, cada uno de los cuales se sabe que tiene efectos nocivos sobre el crecimiento de las plantas de pimiento, lo que da como resultado una reducción del rendimiento del cultivo y una pérdida económica significativa.

La presente invención da a conocer por primera vez que el alelo de resistencia al mildiú polvoroso está ligado al alelo de susceptibilidad al virus Y de la patata (PVY), en donde ambos alelos se localizan en el cromosoma 4 en el genoma de las plantas de pimiento. Según un aspecto, la presente invención proporciona una planta de pimiento que comprende dentro de su genoma al menos un alelo de resistencia al potyvirus y al menos un alelo de resistencia al mildiú polvoroso (PM), en donde los alelos de resistencia están presentes en configuración cis en el mismo cromosoma, de manera que dichos dos alelos de resistencia están en fase de acoplamiento.

Las plantas de la presente invención proceden de plantas de pimiento resistentes al PM y susceptibles al potyvirus y plantas de pimiento susceptibles al PM y resistentes al potyvirus, cruzadas para generar una población a partir de la cual se seleccionan plantas recombinantes, que comprenden ambos alelos de resistencia en el mismo cromosoma en cis. Las plantas progenitoras para producir las plantas de la presente invención se seleccionaron de una colección de germoplasma de material de cultivo patentado perteneciente a Hazera Genetics Ltd. (Israel), y material de cultivo proporcionado por The Horticultural Research Organisation, Volcani Center (Israel). La selección de plantas resistentes al PM o a un potyvirus se basó en la evaluación de la infección de la planta y la gravedad de la enfermedad, así como en ensayos moleculares.

La resistencia fenotípica al PM se basó en la infección de la planta con el hongo L. taurica. La gravedad de los síntomas de la enfermedad depende no solo de los antecedentes genéticos sino también de la edad de la planta y las condiciones ambientales. Por lo tanto, los síntomas de la enfermedad se midieron en réplicas en un momento de desarrollo específico. Las plantas que no desarrollaron ningún síntoma fueron designadas como "resistentes". La alta aparición de hongos en la planta definió a la planta como susceptible y "plantas moderadamente resistentes" donde aquellas plantas muestran un bajo nivel de aparición de hongos.

Por lo tanto, según ciertas realizaciones de la presente invención, la inoculación con L. taurica da como resultado una aparición menor o ninguna aparición de síntomas de la enfermedad del mildiú polvoroso en las hojas de la planta de pimiento.

La resistencia fenotípica al potyvirus PVY se confirmó cuando no se detectó la típica mancha verde de tipo mosaico en la hoja de la planta infectada. Por lo tanto, según la presente invención, la inoculación con PVY da como resultado una aparición menor o nula de manchas verdes tipo mosaico en las hojas de la planta de pimiento. También se utilizaron ensayos moleculares usando marcadores moleculares para discriminar entre la presencia y ausencia de los alelos de resistencia al PM y al PVY. Estos marcadores pueden utilizarse además en la selección asistida por marcadores, es decir, en la determinación de la composición alélica de la planta en el locus relacionado con la resistencia al PM y en el locus relacionado con la resistencia al potyvirus, y la selección de plantas que tengan el alelo resistente deseado en una configuración cis en el mismo cromosoma.

La resistencia al potyvirus se confirmó mediante análisis del DNA extraído de plantas candidatas para detectar la presencia del alelo de resistencia pvrl. Puede utilizarse cualquier método conocido en la técnica para identificar la presencia del alelo de resistencia p vrl o partes del mismo dentro de la muestra de DNA.

Según ciertas realizaciones, la presencia del alelo de resistencia pvrl se confirmó mediante la amplificación de un segmento de DNA utilizando un conjunto de cebadores y sometiendo el segmento de DNA resultante a restricción mediante enzimas de restricción. Según ciertas realizaciones actualmente preferidas, el segmento de DNA se amplificó utilizando un primer cebador que tiene una secuencia de polinucleótidos como se establece en SEQ ID NO: 2 y un segundo cebador que tiene una secuencia de polinucleótidos como se establece en SEQ ID NO: 3, y el segmento de DNA resultante se sometió a restricción por la enzima de restricción SseNI. La ausencia del sitio de restricción de SseNI dentro del segmento de DNA amplificado de aproximadamente 700 pares de bases (pb), que tiene la secuencia que se establece en SEQ ID NO:1 (FIG. 3), es indicativo de la presencia del alelo de resistencia p v r l.

La presencia del sitio de restricción de SseNI dentro del segmento de DNA amplificado es indicativo de la presencia de alelo de susceptibilidad p v r l. Se obtienen dos segmentos después de la restricción con SseNI, uno de aproximadamente 130 pb y otro de aproximadamente 580 pb. La resistencia al PM se confirmó mediante análisis del DNA extraído de plantas candidatas para detectar la presencia del alelo de susceptibilidad p v r l, como se ha descrito anteriormente en la presente memoria. Debe entenderse que se pueden desarrollar ensayos similares para identificar los alelos de resistencia/susceptibilidad al PM y potyvirus, usando técnicas de biología molecular de rutina como las conoce un experto en la materia. Por ejemplo, otros fragmentos del gen pvrl o el gen relacionado resistente al PM adyacente puede usarse para diseñar pares de cebadores o sondas de PCR para la hibridación de ácidos nucleicos y para desarrollar ensayos moleculares discriminatorios basados en la información de ácido nucleico de la región amplificada por dichos pares de cebadores o de la secuencia de ácido nucleico para que dichas sondas hibridan. El tipo exacto de ensayo desarrollado no es importante, siempre que pueda discriminar entre el alelo resistente al PM y el alelo de resistencia al potyvirus y la homocigosidad/heterocigosidad en el locus deseado.

Con el fin de realizar la selección asistida por marcadores en los métodos de la presente invención, las plantas de pimiento o partes de plantas en cuestión se someten, por ejemplo, primero a extracción de DNA, como se describe en la presente memoria en la sección de Ejemplos a continuación o mediante otras técnicas conocidas en la técnica. Una vez que se completa la extracción, se puede realizar un ensayo molecular, que incluye, pero no se limita a, un ensayo de secuencia polimórfica amplificada escindida (CAPS) (véase, por ejemplo, Akopyanz et al., 1992. Nucleic Acid Research 20:6221-6225; Konieczny y Ausubel, 1993. The Plant J. 4:403-410) o un ensayo de región amplificada de secuencia caracterizada (SCAR). Un ensayo SCAR implica amplificar el DNA en el locus (por ejemplo, el locus de resistencia al PVY) mediante PCR seguido de digestión con enzimas de restricción. Los polimorfismos entre las secuencias de ácidos nucleicos diferencian entre diferentes alelos (tales como, pero no limitado a, los alelos pvrl de resistencia y susceptibilidad) dando como resultado, por ejemplo, fragmentos de restricción de diferentes tamaños.

Los marcadores del CAPS se utilizaron para la selección indirecta de resistencia al potyvirus en Capsicum basado en la secuencia genómica, según Yeam et al., 2005 y Ruffel et al., 2002, incorporándose ambas referencias en la presente memoria en su totalidad. El examen de la segregación de plantas de pimiento F2 resultantes de un cruce entre una línea endogámica resistente al PM y susceptible al PVY con una línea endogámica resistente al PVY y susceptible al PM mostró que el gen pvrl y el gen relacionado con la resistencia al PM están localizados en el cromosoma 4, a una distancia de aproximadamente 2cm entre sí. Debido a que la resistencia al PM está en configuración trans con resistencia al PVY (el alelo resistente al PM está en el mismo cromosoma que el alelo susceptible al PVY), las plantas que son resistentes tanto al PM como al PVY son el resultado de sucesos de recombinación entre los dos genes resistentes.

Según ciertas realizaciones, las plantas de pimiento de la presente invención son sustancialmente resistentes a la infección por potyvirus, particularmente al PVY, así como a la infección por L. taurica. La máxima resistencia a los potyvirus se obtiene cuando las plantas son homocigóticas al alelo resistente p v r l. Esta observación está en línea con resultados previos que postulan que la resistencia del pimiento mediada por p vrl (Capsicum sp.) al virus Y de la patata (PVY) es recesiva (Ruffle et al., 2002, supra). Las plantas de pimiento que mostraban síntomas moderados de mildiú polvoroso eran típicamente heterocigotas para el alelo de resistencia al PM, mientras que las plantas resistentes eran homocigotas para este alelo. Por lo tanto, dado que ambos rasgos se localizan en el mismo cromosoma, según ciertas realizaciones, las plantas que comprenden el alelo resistente p v rl y el alelo resistente al PM en configuración cis son homocigóticos.

El desarrollo de una cepa de pimiento superior comercial requiere un esfuerzo de mejoramiento significativo. Las plantas de pimiento resistentes al potyvirus y/o al PM, que pueden usarse como fuente para generar las plantas de la presente invención, no son necesariamente útiles para la producción a escala comercial, ya que pueden tener rasgos indeseables tales como baja tasa de germinación, bajo vigor, bajo rendimiento de frutos, frutos pequeños, susceptibilidad a otras enfermedades, etc. Estos rasgos indeseables, también conocidos como "síntomas de arrastre genético", afectarán negativamente la aceptación comercial de líneas de plantas endogámicas o híbridas por parte de los cultivadores. Generalmente, la presencia de un nivel adverso de arrastre genético puede determinarse por la presencia de uno o más de estos síntomas a tal grado que la línea de plantas se vuelve comercialmente inaceptable.

La presente invención incluye cualquier parte de las plantas de la presente invención, que comprenden dentro de su genoma al menos un alelo de resistencia al potyvirus y al menos un alelo de resistencia al PM en configuración cis tal que los dos alelos de resistencia están en fase de acoplamiento, incluyendo polen, óvulos y cultivos tisulares regenerados a partir de estas plantas. El polen y los óvulos se usan en programas de mejoramiento, en general y como se describe en la presente invención. El cultivo de tejidos de pimiento puede usarse para la regeneración in vitro de una planta de pimiento como es bien conocido en la técnica.

Las plantas que comprenden dentro de su pedigrí una planta de pimiento que tiene en su genoma al menos un alelo de resistencia al potyvirus y al menos un alelo de resistencia al PM en configuración cis en el mismo cromosoma, también se incluyen dentro del alcance de la presente invención.

Según una realización de la presente invención, la planta de pimiento es homocigota para el alelo de resistencia al potyvirus y para el alelo de resistencia al PM. Según una realización adicional de la presente invención, la planta es homocigota para el alelo de resistencia al potyvirus y heterocigota para el alelo de resistencia al PM.

Según otra realización de la presente invención, la planta de pimiento se selecciona del grupo que consiste en una línea endogámica y un híbrido.

Según otra realización de la presente invención, la planta de pimiento de la reivindicación 1, que comprende además al menos un rasgo adicional seleccionado del grupo que consiste en alta tasa de germinación, resistencia a herbicidas, resistencia a insectos, resistencia a al menos una enfermedad, resistencia a varias tipos de estrés no biótico, esterilidad masculina y crecimiento vigoroso.

Según una realización adicional de la presente invención, el rasgo adicional antes mencionado se introduce mediante un método seleccionado del grupo que consiste en cultivo, conversión de rasgo único y transformación.

Según otras realizaciones, la presente invención proporciona semillas de pimiento en las que las plantas cultivadas a partir de las semillas comprenden dentro de su genoma al menos un alelo de resistencia al potyvirus y al menos un alelo de resistencia al PM en configuración cis en el mismo cromosoma, tal que los dos alelos de resistencia están estables en la fase de acoplamiento.

Por lo tanto, según realizaciones adicionales, la presente invención proporciona semillas como se define anteriormente, en las que al menos un alelo de resistencia al potyvirus y al menos un alelo de resistencia al PM se localizan en el cromosoma 4.

Según realizaciones adicionales, la presente invención proporciona semillas como se define anteriormente, en las que la planta que crece a partir de la semilla es sustancialmente resistente a la enfermedad de PM provocada por el hongo L. taurica.

Según realizaciones adicionales, la presente invención proporciona semillas como se define anteriormente, en las que la planta que crece a partir de la semilla es además resistente a la infección por al menos un potyvirus.

Según realizaciones adicionales, la presente invención proporciona semillas como se define anteriormente, en las que el potyvirus se selecciona del grupo que consiste en el virus Y de la patata (PVY), el virus A de la patata (PVA), el virus del grabado del tabaco (TEV) y el virus del moteado de la pimienta (PepMoV).

Según realizaciones adicionales, la presente invención proporciona semillas como se define anteriormente, en las que el potyvirus es PVY.

Según otras realizaciones, la presente invención proporciona semillas como se define anteriormente, en la que la inoculación de la planta cultivada a partir de dicha semilla con L. taurica da como resultado una aparición menor o ninguna aparición de síntomas de la enfermedad del mildiú polvoroso en las hojas de dicha planta.

Según otras realizaciones, la presente invención proporciona semillas como se define anteriormente, en las que dichos síntomas incluyen manchas cloróticas en la superficie superior de la hoja y esporulación como un polvo blanco en el área correspondiente de la superficie inferior de la hoja.

Según otras realizaciones, la presente invención proporciona semillas como se define anteriormente, en las que la inoculación de la planta cultivada a partir de dicha semilla con PVY da como resultado una aparición menor o nula de manchas verdes tipo mosaico en las hojas de dicha planta.

Según otras realizaciones, la presente invención proporciona semillas como se define anteriormente, que comprenden dentro de su genoma una secuencia de DNA que se acopla con la resistencia a un potyvirus, y una secuencia de DNA que se acopla con la susceptibilidad al potyvirus, en donde dicha planta de pimiento es resistente al mildiú polvoroso. Según otras realizaciones, la presente invención proporciona semillas como se define anteriormente, en las que la secuencia de DNA que se acopla con la resistencia al potyvirus es una plantilla para la amplificación de un fragmento de DNA usando un primer cebador que tiene una secuencia de polinucleótidos como se establece en SEQ ID NO: 2 y un segundo cebador que tiene una secuencia de polinucleótidos como se establece en SEQ ID NO: 3, careciendo dicho fragmento de DNA de un sitio de restricción para la enzima de restricción SseNI.

Según otras realizaciones, la presente invención proporciona semillas como se define anteriormente, en las que la secuencia de DNA que se acopla con la susceptibilidad al potyvirus es una plantilla para la amplificación de un fragmento de DNA usando un primer cebador que tiene una secuencia de polinucleótidos como se establece en SEQ ID NO: 2 y un segundo cebador que tiene una secuencia de polinucleótidos como se establece en SEQ ID NO: 3, conteniendo dicho fragmento de DNA un sitio de restricción para la enzima de restricción SseNI.

Según otras realizaciones, la presente invención proporciona una planta de pimiento, o una parte de la misma, producida mediante el cultivo de la semilla antes mencionada como se definió anteriormente. Según otras realizaciones de la presente invención, el pimiento cultivado a partir de la semilla antes mencionada es homocigoto para el alelo de resistencia al potyvirus y para el alelo de resistencia al PM.

Según otras realizaciones de la presente invención, el pimiento cultivado a partir de la semilla antes mencionada es homocigoto para el alelo de resistencia al potyvirus y heterocigoto para el alelo de resistencia al PM.

Según otras realizaciones de la presente invención, el pimiento cultivado a partir de la semilla antes mencionada se selecciona del grupo que consiste en una línea endogámica y un híbrido.

Según otras realizaciones, la presente invención proporciona el polen de la planta de pimiento cultivado a partir de la semilla antes mencionada.

Según otras realizaciones, la presente invención proporciona el óvulo de la planta cultivada a partir de la semilla antes mencionada.

Según otras realizaciones, la presente invención proporciona un fruto de una planta de pimiento que comprende dentro de su genoma al menos un alelo de resistencia al potyvirus y al menos un alelo de resistencia al mildiú polvoroso (PM), presentes en posición cis en el mismo cromosoma de manera que los dos alelos de resistencia se heredan conjuntamente, en donde el fruto es un fruto dulce comestible.

De acuerdo con otras realizaciones, la presente invención proporciona el fruto como se definió anteriormente, en donde el potyvirus se selecciona del grupo que consiste en el virus Y de la patata (PVY), el virus A de la patata (PVA), el virus del grabado del tabaco (TEV) y el virus del moteado de la pimienta (PepMoV).

Según otras realizaciones, la presente invención proporciona el fruto como se define anteriormente, en la que el potyvirus es PVY.

Según otras realizaciones, la presente invención proporciona un cultivo tisular de células regenerables o protoplastos obtenidos a partir de la planta de pimiento como se define anteriormente, o una parte de la misma.

Según otras realizaciones, la presente invención proporciona el cultivo tisular como se define anteriormente, en el que las células regenerables o protoplastos de dicho cultivo tisular se obtienen a partir de una parte de la planta seleccionada del grupo que consiste en hojas, polen, embriones, raíces, puntas de raíces, anteras, flores, frutos y semillas.

Según otras realizaciones, la presente invención proporciona los cultivos tisulares definidos anteriormente, en donde dicho cultivo tisular regenera una planta que comprende dentro de su genoma al menos un alelo de resistencia al potyvirus y al menos un alelo de resistencia al mildiú polvoroso (PM), presentes en configuración cis en el mismo cromosoma de tal manera que los dos alelos de resistencia están en fase de acoplamiento. Según aún otras realizaciones, la presente invención proporciona plantas de pimiento, en las que las plantas o la progenie o partes de la misma se han transformado de manera que su material genético contiene uno o más transgenes unidos operativamente a uno o más elementos reguladores. Las plantas de pimiento y partes de las mismas producidas a partir de las plantas transformadas también se incluyen dentro del alcance de la presente invención. Según una realización, el gen o genes transformados confieren una característica seleccionada del grupo que consiste en resistencia a herbicidas, resistencia a insectos, resistencia a enfermedades bacterianas, fúngicas o virales, esterilidad masculina y crecimiento vigoroso. No obstante, según otras realizaciones actualmente preferidas, las plantas de pimiento de la presente invención no están modificadas genéticamente.

Métodos para generar las plantas de pimiento de la presente invención

Según otro aspecto, la presente invención proporciona un método para producir una planta de pimiento que comprende dentro de su genoma al menos un alelo de resistencia al potyvirus y al menos un alelo de resistencia al mildiú polvoroso (PM) en el que los alelos están presentes en configuración cis en el mismo cromosoma, comprendiendo las etapas de:

a) proporcionar una primera planta de pimiento resistente a la infección por L. taurica y susceptible al virus Y de la patata (PVY) y una segunda planta de pimiento susceptible a la infección por L. taurica y resistente al PVY;

b) cruzar la primera y la segunda planta de pimiento de la etapa (a) para producir una progenie de planta de pimiento F1;

c) autofecundar la planta de pimiento F1 de la etapa (b) para producir una progenie de la planta de pimiento F2;

d) analizar la progenie de la etapa (c) para plantas resistentes a la infección con L. taurica comprendiendo dentro de su genoma un alelo resistente al PVY y un alelo de susceptibilidad al PVY; y

e) seleccionar al menos una planta que tenga las características de la etapa (d), que comprenda dentro de su genoma al menos un alelo de resistencia al potyvirus y al menos un alelo de resistencia al mildiú polvoroso (PM) en donde los alelos están presentes en configuración cis en el mismo cromosoma.

Según ciertas realizaciones, el método comprende además la autofecundación de la planta de la etapa (e) para obtener una progenie homocigótica para el alelo de resistencia al potyvirus y el alelo de resistencia al PM.

Según realizaciones adicionales, el método como se define anteriormente comprende además las etapas de:

a) aislar una muestra de DNA genómico de la planta F2;

b) amplificar un segmento de DNA usando un primer cebador que tiene una secuencia de polinucleótidos como se establece en SEQ ID NO: 2 y un segundo cebador que tiene una secuencia de polinucleótidos como se establece en SEQ ID NO: 3; y,

c) someter el segmento de DNA amplificado a restricción con la enzima de restricción SseNI;

en donde la ausencia de un sitio de restricción de SseNI dentro de dicho segmento de DNA amplificado caracteriza a la planta como resistente a la infección por potyvirus y la presencia del sitio de SseNI caracteriza a la planta como susceptible a la infección por potyvirus.

La planta de pimiento resistente a la infección por L. taurica y susceptible al virus Y de la patata (PVY) y la planta de pimiento susceptible a la infección por L. taurica y resistente al PVY puede identificarse infectando las plantas candidatas con el patógeno y examinando los síntomas de la enfermedad o usando marcadores moleculares, como se describe anteriormente en la presente memoria.

Las plantas proporcionadas en la etapa (a) pueden ser plantas de tipo nativo o cultivadas, o plantas modificadas tales como plantas mutagenizadas o transformadas. La progenie analizada en la etapa (d) de la que se seleccionan las plantas deseadas es preferiblemente una generación F2; sin embargo, las plantas recombinantes deseadas pueden ser de cualquier generación, incluyendo la generación F2, F3, etc.; generación de retrocruzamiento (BC1, BC2, etc.); etc. La progenie analizada depende del esquema del cruzamiento/selección deseado y de los alelos presentes en las plantas utilizadas. Los ensayos moleculares y/o los ensayos de inoculación pueden realizarse en diferentes generaciones; por lo tanto, las etapas (a) -(d) pueden repetirse varias veces, con el fin de identificar los recombinantes que comprenden los alelos deseados de resistencia al PM y resistencia al potyvirus en una configuración cis en el mismo cromosoma.

La selección de una planta recombinante que comprende un alelo de resistencia al PM y un alelo de resistencia al potyvirus en la configuración cis y la introgresión de esta única unidad mendeliana en otras plantas se puede lograr mediante una combinación de biología molecular, patología vegetal y técnicas tradicionales de cultivo. En un enfoque preferido, la presente invención usa técnicas de biología molecular para discriminar entre diferentes alelos en el loci del PM y del pvr para combinar los alelos deseables para la resistencia al mildiú polvoroso y al potyvirus, específicamente la resistencia al PVY en el genoma del pimiento cultivado. La presente invención facilita el cultivo de híbridos de pimiento con resistencia dual al PM y al potyvirus y proporciona los medios para combinar la resistencia al PM y al potyvirus con otros rasgos deseados, incluyendo la resistencia a enfermedades adicionales.

La presente invención también incluye plantas producidas por el método de la presente invención, partes de las mismas, cultivos tisulares derivados de las mismas y semillas producidas por las mismas.

La presente invención describe por primera vez que la resistencia al potyvirus, específicamente la resistencia al PVY, está estrechamente relacionada con la susceptibilidad a la infección por el hongo L. taurica que provoca la enfermedad del mildiú polvoroso en varias especies de plantas, incluyendo las plantas de pimiento. Por lo tanto, ahora se describe que, sorprendentemente, la resistencia a la infección por potyvirus en plantas de pimiento está en fase de repulsión ligada con la resistencia a la enfermedad del mildiu polvoriento.

En consecuencia, la presente invención ahora describe que es posible usar los marcadores genéticos conocidos hasta ahora para distinguir entre plantas resistentes y susceptibles al potyvirus, con el fin de asignar plantas resistentes a la infección por L. taurica. Por lo tanto, según otro aspecto, la presente invención proporciona un método para caracterizar una planta de pimiento como resistente o susceptible a la infección por L. taurica, que comprende las etapas de:

a) aislar una muestra de DNA genómico de la planta;

b) analizar la muestra de DNA para detectar la presencia de un segmento de DNA que comprende un polinucleótido que tiene la secuencia de ácido nucleico como se establece en SEQ ID NO: 1 o un fragmento del mismo; y

c) someter el segmento de DNA amplificado a restricción con la enzima de restricción SseNI;

en donde la presencia del sitio de restricción de SseNI dentro de dicho segmento de DNA amplificado caracteriza a la planta como resistente a la infección por L. taurica y la ausencia del SseNI caracteriza a la planta como susceptible a la infección por L. taurica. Lo anterior es un método sorprendentemente conveniente para cribar y seleccionar plantas de pimiento resistentes al mildiú polvoroso.

Los siguientes ejemplos se presentan para ilustrar más completamente ciertas realizaciones de la invención. Sin embargo, de ninguna manera deben interpretarse como limitantes del amplio alcance de la invención. Un experto en la técnica puede planear fácilmente muchas variaciones y modificaciones de los principios descritos en la presente memoria sin apartarse del espíritu y alcance de la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1: Evaluación de la resistencia usando ensayos biológicos

1. Evaluación de la resistencia a la infección por el hongo L. taurica.

La enfermedad del mildiú polvoroso es provocada por el hongo Leveillula taurica. Este hongo es un parásito obligatorio, es decir, solo puede propagarse en plantas vivas. El hongo infecta solamente las hojas de la planta. Por lo general, las hojas más viejas (inferiores) de la planta se infectan primero y después el hongo se propaga a la parte superior de la planta a las hojas jóvenes. El examen de plantas para la susceptibilidad/resistencia a L. taurica se realizó según el procedimiento que se describe a continuación.

Preparación del inóculo

Como se indicó anteriormente, el hongo L. taurica debe propagarse en un material vegetal vivo. Así, se mantiene un inóculo infectando plantas de pimiento susceptibles en un ciclo de dos semanas. En cada ciclo, 10-20 recipientes de 1 litro cada uno que contienen una plántula de pimiento susceptible (variedades internas de Hazera Genetic T-52, L-3 y L-4) se inoculan con esporas de hojas infectadas por dispersión aérea. Los recipientes con las plantas infectadas se mantienen en un ambiente semicontrolado en el que la temperatura se mantuvo por debajo de 32°C. Se mantienen tres ciclos posteriores para asegurar una cantidad suficiente de inóculo.

Inoculación de plantas examinadas

Las semillas de líneas obtenidas durante el programa de cultivo se siembran en bandejas Hishtil® (Hishtil, Israel) que contienen turba y vermiculita. Se siembran aproximadamente 20-70 semillas de cada línea examinada, de las cuales se inoculan aproximadamente 10-50 plantas. Las bandejas se mantienen en ambiente semicontrolado a una temperatura entre 17°C a 42°C. Justo antes de las inoculaciones, las plántulas se transfieren de las bandejas a recipientes de 1 litro. La inoculación tiene lugar aproximadamente 30-35 días después de la siembra, cuando las plántulas tienen 4-5 hojas verdaderas.

Evaluación de la respuesta de la planta

Los síntomas típicos del mildiú polvoroso aparecen aproximadamente 12-14 días después de la inoculación. Los síntomas (que aparecen solo en plantas susceptibles) incluyen manchas cloróticas en la superficie superior de la hoja y una esporulación como polvo blanco en el área correspondiente de la superficie inferior de la hoja. La respuesta de la planta generalmente se evalúa aproximadamente 19-23 días después de la inoculación, aunque el tiempo específico puede variar según la tasa del desarrollo de los síntomas. En cada experimento, se utilizan plantas con genotipos conocidos (es decir, plantas resistentes/susceptibles) como control. Las plantas examinadas se evalúan solo cuando las plantas de control muestran la respuesta esperada.

Una planta se define como susceptible cuando se observa una esporulación masiva acompañada de una rápida distribución de manchas cloróticas.

Una planta se define como resistente si no se observa esporulación y/o clorosis.

Una planta se define como parcialmente resistente si solo aparecen pequeños grupos locales de esporulación en la superficie inferior de la hoja y hay un bajo número de manchas cloróticas muy pequeñas. La FIG. 1 muestra la superficie inferior de las hojas obtenidas de plantas de pimiento resistentes (lado derecho) y plantas susceptibles (lado izquierdo). Como se muestra, las hojas obtenidas de la planta de pimiento susceptible expresan los síntomas típicos de la infección por mildiú polvoroso como se definió anteriormente, mientras que las hojas resistentes tienen el aspecto de hojas no infectadas.

2. Evaluación de la resistencia a la infección por el virus Y de la patata (PVY).

En la naturaleza, los síntomas de la infección con PVY incluyen acortamiento de los entrenudos del tallo, manchas en las hojas en forma de mosaico, malformación severa de las hojas superiores, defoliación y muerte temprana de la planta. Con el fin de evaluar la resistencia, solo se examinan las hojas para detectar la aparición de malformaciones y manchas de color verde oscuro de tipo mosaico. La evaluación se realizó según el procedimiento descrito a continuación.

Preparación del inóculo

Las plantas de pimiento infectadas con PVY se mantienen constantemente en un invernadero, a una temperatura de entre 18°C y 25°C, con un período de luz adicional de 8 horas (de 16:00 a 22:00) proporcionada por lámparas de mercurio (todo el año). El inóculo se prepara moliendo el material vegetal infectado en agua del grifo en una relación material vegetal:agua del grifo de 1:150 (generalmente, un (1) gramo de material vegetal infectado se muele en 150 ml de agua del grifo). La mezcla obtenida se utiliza para la inoculación.

Inoculación de plantas examinadas

Las semillas de líneas obtenidas durante el programa de cultivo se siembran en bandejas Hishtil® (Hishtil, Israel). Para cada línea examinada, se inoculan aproximadamente 30-60 plantas esparciendo la mezcla de inóculo obtenida como se ha descrito anteriormente sobre las hojas de las plantas. La inoculación tiene lugar aproximadamente 30-35 días después de la siembra, cuando las plántulas tienen 4-5 hojas verdaderas. Las líneas de plantas de pimiento susceptibles (Hazera L4, 1195) y las plantas de tabaco se utilizan como control positivo para el éxito del ensayo de inoculación.

Evaluación de la respuesta de la planta

Los síntomas típicos de la infección por PVY aparecen aproximadamente 3-4 semanas después de la inoculación. Las plantas susceptibles muestran una ligera malformación de las hojas y un patrón de tipo mosaico de manchas de color verde oscuro. Las plantas resistentes no muestran síntomas.

Ejemplo 2: Evaluación de la resistencia usando herramientas genéticas

Aislamiento de DNA

Soluciones:

Tampón de extracción:

Sorbitol 0,35M

Tris-base 0,1M

EDTA 5mM

pH ajustado a 7,5 con HCl concentrado.

Tampón de lisis nuclear:

10 ml de EDTA 0,5M pH 8,0

40 ml de NaCl 5,0 M

2 gr de CTAB

La solución se agita durante la noche y el pH se ajusta a 7,5 con HCl concentrado. A continuación, la solución se diluye con agua destilada hasta un volumen total de 90 ml.

Solución de sarcosilo:

5% de N-lauroilsarcosina

Solución de TE

Tris-HCl 10 mM pH 8,0

EDTA 1 mM

Tampón de almacenamiento

80 ml de etanol al 95%

20 ml de acetato de sodio 1M

El pH se ajusta a 7,5 con HCl concentrado.

Solución de octanol/cloroformo (1:24)

Se mezcla un volumen de octanol con 24 volúmenes de cloroformo.

Procedimiento de extracción de DNA

El DNA total se extrajo de tejido vegetal fresco (hoja, fruto verde, plántulas) utilizando el siguiente procedimiento: 1. La solución de extracción fresca se prepara mezclando 20 ml de tampón de extracción, 20 ml de tampón de lisis nuclear y 8 ml de solución de sarcosilo. Se añaden 0,38 mg de bisulfato de sodio y se mezclan bien con la solución.

2. Se muelen aproximadamente 3gr de tejido vegetal joven fresco con una pequeña cantidad de arena (Sigma S9887) y 1ml de solución de extracción. Se transfiere 1 ml de la mezcla a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y se incuba durante 15 min a 65°C.

3. A continuación, se añaden 600 pl de solución de octanol:cloroformo (1:24) a la mezcla de la etapa 2, se mezcla con vórtex y se centrifuga durante 5 min (12000 rpm).

4. La fase superior obtenida después de la centrifugación se transfiere a un tubo nuevo, sin perturbar el sedimento de restos celulares.

5. Se añaden 600 pl de isopropanol y se mezcla suavemente la solución invirtiendo el tubo hasta que se forman precipitados.

6. Las muestras se centrifugan durante 5 min (12000 rpm).

7. Se desecha la fase superior, se añaden 500 pl de tampón de almacenamiento y se repite la centrifugación (etapa 6).

8. La fase superior se desecha nuevamente y el sedimento se seca en una máquina SpeedVac.

9. El sedimento de DNA se eluye con 60 pl de solución de TE y se incuba durante 15 min a 65°C.

10. El DNA se puede almacenar a 4°C durante un período breve o en el congelador durante un período prolongado de almacenamiento.

Marcadores moleculares

La selección de plantas resistentes al mildiú polvoroso y/o al PVY también se basó en la configuración alélica de las plantas examinadas. Las plantas que son homocigotas recesivas al alelo p v rl son resistentes a PVY. En la naturaleza, estas plantas son susceptibles al mildiú polvoroso. Ahora se hace referencia a la FIG. 3 que presenta SEQ. ID NO: 1, que es la secuencia de nucleótidos de un fragmento de DNA amplificado a partir del gen p vrl. Los cebadores específicos, que están subrayados en la anteriormente mencionada FIG. 3, se diseñaron para amplificar el segmento de DNA de aproximadamente 700 pb desde dentro del gen p vrl, que es indicativo de los alelos presentes en el genoma de la planta examinada: cuando este segmento de DNA incluye un sitio de restricción para la enzima de restricción SseNI que tiene la secuencia ACTGGn (SEQ. ID NO:4) es indicativo de la presencia del alelo de susceptibilidad dominante. Someter el segmento de DNA a esta enzima de restricción da como resultado la escisión del DNA en dos fragmentos, uno de aproximadamente 130 pb y el otro de aproximadamente 580 pb. Cuando el sitio de restricción no está presente dentro del segmento de DNA, es indicativo de la presencia del alelo de resistencia recesivo. Por lo tanto, el ensayo molecular comprende aislar el DNA de la planta examinada; amplificar un segmento de DNA con cebadores específicos; someter el segmento de DNA amplificado a restricción con la enzima de restricción SseNI y analizar los productos de restricción.

El DNA se aisló de las plantas examinadas mediante el método descrito anteriormente en la presente memoria. Se amplificó un segmento de DNA mediante una reacción de PCR utilizando los siguientes cebadores: Directo: 5' TGAGGCAGATGATGAAGTTGA 3' (SEQ ID NO:2)

Inverso: 5' CAACCATAAATATACCCCGAG 3' (SEQ ID NO:3)

La PCR se llevó a cabo en un volumen de 25 gl que contenía 50 ng de DNA genómico, KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM, MgCl2 2 mM, cada dNTP 0,2 mM, cada cebador directo e inverso 0,4 gM y 1 unidad de Taq polimerasa (Fermentas). La PCR se realizó utilizando un termociclador de investigación MJ modelo PTC-100 (MJ Research, Ramsey, MN, EE. UU.). Las condiciones de ciclado fueron 95°C 3 min; 35 ciclos de (95°C 1 min, 60°C 1 min, 72°C 1 min) y 72°C 7 min.

Después de completar la reacción de PCR, el DNA amplificado se sometió a restricción mediante la enzima de restricción SseNI. Se digirieron alícuotas de 20 gl del producto de PCR con 5 unidades de la endonucleasa de restricción SseNI y 2,5 gl de tampón de reacción 10^X proporcionado por el fabricante (volumen total 25 gl) durante 3 h a 65°C (la temperatura recomendada por el fabricante).

Los productos de restricción se analizaron mediante electroforesis en gel. Se cargaron 20 gl de los productos de reacción en gel de agarosa al 2% en tampón TAE 1X y se corrieron durante 3 horas.

Ahora se hace referencia a la FIG. 2 que muestra la segregación del gen pvr en plantas F2. La presencia de un solo segmento de DNA en una longitud de 711 pb que tiene una secuencia de ácido nucleico como se establece en SEQ ID NO:1 (FIG. 3) es indicativo de una planta homocigota al alelo de resistencia al PVY (R). En plantas de tipo nativo, también indicará que la planta es homocigota al alelo de susceptibilidad al PM. La presencia de dos segmentos de DNA, una banda de una longitud de aproximadamente 130 pb (no mostrada) y la otra banda de una longitud de aproximadamente 580 pb es indicativa de una planta homocigota al alelo de susceptibilidad al PVY (S). En plantas de tipo nativo, también indicará que la planta es homocigótica al alelo de resistencia al PM. La presencia de los tres segmentos de DNA (en una longitud de 711 pb, 580 pb y 130 pb) es indicativa de una planta heterocigota (H).

Ejemplo 3: Producción de plantas de pimiento que tienen alelo de resistencia al PM y alelo de resistencia al PVY en configuración cis en el mismo cromosoma

El material de origen incluía: línea endogámica de pimiento 50-0259A-4 que es resistente al mildiú polvoroso (PM) y susceptible al PVY; y línea endogámica de pimiento 100/201C que es susceptible al PM y resistente al PVY. Estas líneas endogámicas se cruzaron para producir la población F². La población F² (122 plantas) más los progenitores resistentes y susceptibles y la progenie F¹ se sembraron en un invernadero en The Volcani Center (Bet Dagan, Israel) durante el invierno de 2005/06. Las plantas se identificaron como resistentes o susceptibles a la infección por PM mediante L. taurica como se describió anteriormente en la presente memoria. La evaluación de la infección y la patología se realizó dos veces en la etapa de fruto muy maduro. El progenitor resistente, homocigoto para el alelo de resistencia al PM, no desarrolló ningún síntoma, el progenitor susceptible tuvo una alta aparición de hongos mientras que las plantas de la progenie F¹ fue moderadamente resistente con un bajo nivel de aparición de hongos. Basado en el fenotipo de los progenitores y la progenie F¹ se concluyó que la resistencia se hereda como parcialmente dominante.

En la población F² , 19 plantas sin síntomas se clasificaron como altamente resistentes al mildiú polvoroso, 55 plantas con baja aparición de hongos en la hoja se clasificaron como moderadamente resistentes y 48 plantas con alta aparición de hongos en la hoja se determinaron que eran susceptibles al PM. Basándose en la segregación de un solo gen, se espera que el 25% de las plantas F² serán susceptibles. En la población F² descrita anteriormente, se demostró que un porcentaje significativamente mayor (39%) de las plantas eran susceptibles a un nivel similar al observado para el progenitor susceptible. Se obtuvieron resultados similares en una segunda población F² de los mismos progenitores. Estas segundas plantas F² se inocularon soplando los hongos de una hoja inoculada a una hoja adyacente no inoculada en Hazera Greenhouse (Mivhor, Israel) en marzo de 2006. La desviación de las proporciones de segregación mendelianas esperadas es un fenómeno bien conocido que se puede producir en regiones específicas del genoma en cruces específicos.

El DNA extraído de las plantas F² se analizó por PCR para el locus de resistencia de p v rl como se describió anteriormente. Las plantas F2 también se examinaron en cuanto a su resistencia al PM mediante la prueba de inoculación descrita anteriormente. Los resultados de segregación tanto de PM como p v rl mostraron que los 2 genes están localizados a 2cm de distancia entre sí. Debido a que, naturalmente, la resistencia al PM está en trans con la resistencia al PVY (el alelo de resistencia al PM está en el mismo cromosoma que el alelo susceptible al PVY), debe ocurrir un suceso de recombinación entre los 2 genes resistentes para obtener plantas que sean resistentes tanto al PM como al PVY.

Para este propósito se plantaron las plantas F³ de 5 plantas F² recombinantes. Estas plantas F² recombinantes son homocigotas resistentes para un gen (PM o PVY) y heterocigotas al segundo gen. Preferiblemente, el patrón del marcador biológico de la planta F2 es como el de una planta heterocigota para la resistencia al PVY, es decir, comprende un segmento de 711 pb, un segmento de 580 pb y un segmento de 130 pb; sin embargo, la planta es sustancialmente resistente al mildiú polvoroso, como lo confirma el ensayo biológico para la resistencia al PM. A partir de la progenie F3, se seleccionan las plantas que comprenden al menos un alelo de resistencia al PM y al menos un alelo de resistencia al PVY en configuración cis en el mismo cromosoma. La selección se basa en el ensayo biológico para la resistencia, así como en los ensayos moleculares descritos anteriormente.

La Tabla 1 resume los resultados de los ensayos fenotípicos y moleculares para una línea recombinante F3 (Rec-1), como un ejemplo adicional. Se analizó su resistencia al PVY de veintitrés plantas mediante un ensayo molecular, así como la resistencia al PM mediante un ensayo biológico.

Como se muestra en la Tabla 1, las plantas fueron homocigóticas para el alelo de resistencia pvr (R) y fueron sustancialmente resistentes al PM (R). Solo dos plantas fueron parcialmente resistentes a PM (H) o fueron heterocigotas para el marcador molecular resistente al PVR (H).

Tabla 1: Resultados de ensayos fenotípicos y moleculares para plantas recombinantes F3

Por lo tanto, mediante los métodos de cultivo y selección específicos de la presente invención, como se desee, se producen según se desee plantas de pimiento F3 recombinantes, resistentes al mildiú polvoroso y a la infección por PVY. Estas plantas, homocigóticas para el alelo de resistencia a pvr y para el alelo de resistencia al PM, muestran la segregación conjunta estable de ambos rasgos resistentes.

Las plantas que tienen dos cromosomas de un par de cromosomas que llevan la resistencia al PM y al PVY en configuración cis también son resistentes al PVY, como lo confirma el ensayo biológico de resistencia al PVY.

La descripción anterior de las realizaciones específicas revelará tan completamente la naturaleza general de la invención que otros puedan, mediante la aplicación de los conocimientos actuales, modificar y/o adaptar fácilmente para diversas aplicaciones dichas realizaciones específicas sin experimentación indebida y sin apartarse del concepto genérico, y, por lo tanto, dichas adaptaciones y modificaciones deberían y están destinadas a ser comprendidas dentro del significado y rango de equivalentes de las realizaciones descritas. Debe entenderse que la fraseología o terminología empleada en la presente memoria tiene fines de descripción y no de limitación. Los medios, materiales y etapas para llevar a cabo varias funciones descritas pueden tomar una variedad de formas alternativas sin apartarse de la invención.

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Una planta de pimiento Capsicum annuumque comprende dentro de su genoma al menos un alelo de resistencia al potyvirus y al menos un alelo de resistencia al mildiú polvoroso (PM), caracterizado por que dichos alelos de resistencia están presentes en configuración cis en el cromosoma 4, de manera que dichos dos alelos de resistencia están en fase de acoplamiento, como resultado de un suceso de recombinación entre los genes de resistencia al potyvirus y PM, y donde el alelo de resistencia al potyvirus es el alelo de resistencia del gen p vrl.

2. La planta de pimiento de la reivindicación 1, caracterizada por que la planta se selecciona del grupo que consiste en una línea endogámica y un híbrido.

3. La planta de pimiento de la reivindicación 1, caracterizada por que dicha planta de pimiento es sustancialmente resistente a la enfermedad del PM provocada por el hongo L. taurica, en el que dicha planta de pimiento es además resistente a la infección por al menos un potyvirus, dicho potyvirus se selecciona del grupo que consiste en el virus Y de la patata (PVY), virus A de la patata (PVA), virus del grabado del tabaco (TEV) y virus del moteado del pimiento ( PepMoV).

4. La planta de pimiento de la reivindicación 3, caracterizada por que la inoculación con L. taurica da como resultado una aparición menor o nula de los síntomas de la enfermedad del mildiú polvoroso en las hojas de dicha planta, dichos síntomas incluyen manchas cloróticas en la superficie superior de la hoja y esporulación como un polvo blanco en el área correspondiente de la superficie inferior de la hoja, caracterizado, además, por que la inoculación con PVY da como resultado una aparición menor o nula de manchas verdes tipo mosaico en las hojas de dicha planta.

5. La planta de pimiento de la reivindicación 1, que comprende dentro de su genoma una secuencia de DNA que se acopla con la resistencia a un potyvirus, y una secuencia de DNA que se acopla con la susceptibilidad al potyvirus, caracterizado por que dicha planta de pimiento es resistente al mildiú polvoroso.

6. La planta de pimiento de la reivindicación 5, caracterizada por que dicha secuencia de DNA que se acopla con la resistencia al potyvirus es una plantilla para la amplificación de un fragmento de DNA que utiliza un primer cebador que tiene una secuencia de polinucleótidos como se establece en SEQ ID NO: 2 y un segundo cebador que tiene una secuencia de polinucleótidos como se establece en SEQ ID NO: 3, careciendo dicho fragmento de DNA de un sitio de restricción para la enzima de restricción SseNI, caracterizado además, por que la secuencia de DNA que se acopla con la susceptibilidad al potyvirus es una plantilla para la amplificación de un fragmento de DNA que utiliza un primer cebador que tiene una secuencia de polinucleótidos como se establece en SEQ ID NO: 2 y un segundo cebador que tiene una secuencia de polinucleótidos como se establece en SEQ ID NO: 3, conteniendo dicho fragmento de DNA un sitio de restricción para la enzima de restricción SseNI.

7. La planta de pimiento de la reivindicación 1, caracterizada por que una cualquiera de las siguientes es cierta: dicha planta es homocigota para el alelo de resistencia al potyvirus y para el alelo de resistencia al PM, o dicha planta es homocigota para el alelo de resistencia al potyvirus y heterocigota para el alelo de resistencia al PM.

8. El polen, óvulo y fruto de la planta de pimiento de la reivindicación 1, que comprende dentro de su genoma al menos un alelo de resistencia al potyvirus y al menos un alelo al mildiú polvoroso como se define en la reivindicación 1.

9. La planta de la reivindicación 1, que comprende además al menos un rasgo adicional seleccionado del grupo que consiste en alta tasa de germinación, resistencia a herbicidas, resistencia a insectos, resistencia a al menos una enfermedad, resistencia a varios tipos de estrés no biótico, esterilidad masculina y vigoroso crecimiento, introducido dicho rasgo adicional por un método seleccionado del grupo que consiste en cultivo, conversión de rasgo único y transformación.

10. Una semilla de la planta de pimiento Capsicum annuum de la reivindicación 1, caracterizada por que una planta cultivada a partir de dicha semilla comprende dentro de su genoma al menos un alelo de resistencia al potyvirus y al menos un alelo de resistencia al mildiú polvoroso (PM), caracterizado por que dichos alelos de resistencia están presentes en configuración cis en el cromosoma 4, tal que dichos dos alelos de resistencia están en fase de acoplamiento.

11. Un cultivo tisular de células regenerables o protoplastos obtenido de la planta de pimiento de la reivindicación 1 o una parte de la misma, caracterizado por que las células regenerables o protoplastos de dicho cultivo tisular se obtienen a partir de una parte de la planta que comprende dentro de su genoma al menos un alelo de resistencia al potyvirus y al menos un alelo de resistencia al mildiú polvoroso como se define en la reivindicación 1, seleccionado del grupo que consiste en hojas, polen, embriones, raíces, puntas de raíces, anteras, flores, frutos y semillas.

12. El cultivo tisular de la reivindicación 11, caracterizado por que dicho cultivo tisular regenera una planta que comprende dentro de su genoma al menos un alelo de resistencia al potyvirus y al menos un alelo de resistencia al mildiú polvoroso (PM), presentes en configuración cis en el cromosoma 4 tal que los dos alelos de resistencia están en fase de acoplamiento.

13. Un método para caracterizar una planta de pimiento como resistente o susceptible a la infección por L. tauríca, que comprende las etapas de:

a) aislar una muestra de DNA genómico de la planta;

b) amplificar un segmento de DNA usando un primer cebador que tiene una secuencia de polinucleótidos como se establece en SEQ ID NO: 2 y un segundo cebador que tiene una secuencia de polinucleótidos como se establece en SEQ ID NO: 3; y,

c) someter el segmento de DNA amplificado a restricción con la enzima de restricción BseNI;

caracterizado por que la presencia del sitio de restricción de BseNI dentro de dicho segmento de DNA amplificado caracteriza a dicha planta como resistente a la infección por L. tauríca y la ausencia del sitio de BseNI caracteriza a dicha planta como susceptible a la infección por L. tauríca.