ES2938217T3 - Plantas de melón con mejor rendimiento de frutos - Google Patents

Abstract

Una planta de Cucumis melo o una parte de ella, la planta que produce más de 12 frutos, el fruto sin semilla. También se describen métodos para generarlos y reproducirlos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Plantas de melón con mejor rendimiento de frutos

La presente descripción, en algunos aspectos de la misma, se refiere a plantas de melón que tienen frutos pequeños sin semillas con mejor rendimiento de frutos y métodos para generarlas.

La partenocarpia, la producción de frutos sin semillas, se puede lograr en muchos cultivos mediante la adición de los reguladores del crecimiento vegetal auxina, citoquinina o giberelina. Se ha demostrado que la aplicación exógena de auxina o giberelina a las flores no fertilizadas en varias especies vegetales induce el cuajado de frutos sin polinización, lo que da como resultado la producción de frutos partenocárpicos. En las investigaciones anteriores que intentaban producir frutas sin semillas se han utilizado con cierto éxito la fitomejora tradicional y la aplicación exógena de hormonas. Sin embargo, la aplicación exógena de hormonas vegetales es un procedimiento que requiere mucha mano de obra y la fitomejora tradicional es un procedimiento a largo plazo. Además, al menos algunos de los intentos previos para producir ciertos frutos sin semillas han dado como resultado un bajo número de frutos sin semillas y/o frutos sin semillas relativamente pequeños en comparación con los frutos con semillas normales. En la mayoría de los casos, esto condujo a una reducción significativa de la producción en variedades de frutos pequeños.

Cucumis melo muestra una diversidad extrema en los rasgos frutales. El fruto del melón varía en tamaño, forma, color exterior, aroma y características de la pulpa, como el contenido de azúcar, la acidez y la pigmentación. Aún así, existe una demanda creciente de nuevos tipos de frutos por parte de los mercados alimentarios modernos. En el melón, el cuajado y el número de frutos es una característica gobernada principalmente por las hormonas. El cuajado se ve afectado por la comunicación hormonal que surge del éxito o fracaso del desarrollo del fruto desde la flor femenina anterior en la rama, aunque la cantidad general de frutos por planta es bastante constante. Típicamente, la mayoría de las variedades de melón producirán de 1 a 5 frutos por planta en el campo.

Existe desde hace mucho tiempo en la técnica una necesidad de medios y métodos eficaces y económicos para la producción de frutos sin semillas, en concreto con un buen rendimiento y calidad en comparación con los frutos sin semillas de la técnica anterior.

La técnica anterior incluye la solicitud de patente de los EE. UU. n.° 20120324597 y la solicitud de patente internacional WO 2011/018785.

La patente coreana KR 20040082448 se refiere a un método para preparar un encurtido al conservar un melón (Cucumis melo L.) en una solución de salmuera que contiene lactato de calcio. El encurtido de melón satisface las preferencias de los consumidores al mantener el sabor y el aroma muy próximos a productos alimenticios tales como pizza, hamburguesa, pollo frito o similares. CONSTITUCIÓN: Se le añade a un melón sal y del 0,1 al 0,5 % en peso de lactato de calcio, en función del peso del melón, para que la concentración final de sal sea del 20 al 30 %. El melón salado se lava, se corta en rodajas de un grosor predeterminado y se sazona con un líquido sazonador durante 2 a 3 días. El condimento líquido contiene del 5,50 al 14,30 % en peso de agua, del 24,50 al 33,30 % en peso de vinagre, del 14,50 al 23,30 % en peso de jarabe de almidón, del 40,00 al 60,70 % en peso de alta fructosa, del 4,50 al 13,30 % en peso de sorbitol, del 0,01 al 8,81 % en peso de glutamato monosódico, del 0,54 al 9,34 % en peso de ácido tartárico, del 0,90 al 9,70 % en peso de vitamina C, del 0,34 al 9,15 % en peso de ácido cítrico, del 0,40 al 9,20 % en peso de ácido málico y del 0,01 al 8,81 % en peso de pigmentos.

GALPAZ NAVOT ET AL, se refiere a «Genetic and chemical characterization of an EMS induced mutation in Cucumis melo CRTISO gene» ARCHIVES OF BIOCHEMISTRY AND BIOPHYSICS, (201308), vol. 539, núm. 2, doi: 10.1016/J.ABB.2013.08.006, ISSN 0003-9861, páginas 117-125.

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Compendio de la invención

La presente invención se refiere a una planta de Cucumis melo o una parte de la misma, en donde la planta tiene más de 12 frutos, en donde dicho fruto no tiene semillas, en donde ambos alelos del genoma de la planta tienen una mutación de pérdida de función en la SEQ ID n.° 7 que da como resultado un rasgo sin semillas.

La presente invención se refiere también a una planta de Cucumis melo que tiene una forma heterocigota de la SEQ ID n.° 7 en la que un alelo de la SEQ ID n.° 7 tiene una mutación de pérdida de función tal que tras la autopolinización, el 25 % de la F1 da más de 12 frutos, en donde dichos frutos no tienen semillas.

Preferiblemente, la planta porta más de 15 frutos o porta más de 20 frutos.

Preferiblemente, ambos alelos de dicha SEQ ID n.° 7 tienen una mutación F/I en la posición 97 de la misma.

La presente invención se refiere también a un esqueje de una planta de C. melo, en donde ambos alelos del genoma del esqueje tienen una mutación de pérdida de función en la SEQ ID n.° 7, de manera que la planta desarrollada a partir del esqueje porta más de 12 frutos, en donde dichos frutos no tienen semillas; o en el que el esqueje tiene una forma heterocigota de la SEQ ID n.° 7, de manera que tras la autopolinización de la planta desarrollada a partir del esqueje, el 25 % de la F1 porta más de 12 frutos, en donde dichos frutos no tienen semillas.

Preferiblemente, muchas semillas de C. melo que tienen una forma heterocigótica de la SEQ ID n.° 7 en las que un alelo de la SEQ ID n.° 7 tiene una mutación de pérdida de función que al plantarla provoca un fenotipo de cultivo mejorado de fruta en el 25 % de las plantas derivadas de las mismas y en donde dicho 25 % de las plantas portan más de 5 frutos, en donde dichos frutos no tienen semillas.

La presente invención también se refiere a un polinucleótido aislado que comprende la secuencia que se presenta en la SEQ ID n.29.

La presente invención también se refiere a un polipéptido aislado que comprende una secuencia como la presentada en la SEQ ID n.° 8.

La presente invención se refiere también a un método de selección asistida por marcadores de una planta de C. melo que tiene mejorada la producción de frutos o que tiene una progenie con una producción mejorada, en donde el método comprende usar oligonucleótidos que distinguen entre la forma mutada y no mutada de la SEQ ID n.° 7 para analizar la presencia de una mutación de pérdida de función en ambos alelos de la SEQ ID n.° 7, en donde la presencia de dicha mutación en ambos alelos de la SEQ ID n.° 7 es indicativa de que la planta o su descendencia producirá más de 5 frutos sin semillas.

Breve descripción de las diferentes vistas de los dibujos

Algunos aspectos de la descripción se describen en la presente memoria, solo a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos adjuntos. Con referencia específica ahora a los dibujos en detalle, se destaca que los detalles mostrados son a modo de ejemplo y con el propósito de ilustrar la explicación de aspectos de la descripción. A este respecto, la descripción junto con los dibujos hace evidente a los expertos en la técnica cómo se pueden poner en práctica los aspectos de la descripción.

En los dibujos:

La figura 1 es una fotografía de una planta 'superfructífera' ('sf') con frutos en el campo.

La figura 2 es una fotografía del interior de varios tipos de frutos 'sf'.

La figura 3 es una fotografía de todos los frutos de una sola planta representativa de 'sf'.

Las figuras 4A-C son gráficos de barras que ilustran el desempeño de campo de segregantes F² 'sf' y de tipo silvestre procedentes de cuatro cruces independientes. Las líneas continuas y discontinuas horizontales representan los valores medios de todos los tipos silvestres y 'sf' respectivamente. A: número medio de frutos; B: peso medio del fruto; C: peso medio de frutos por planta (rendimiento).

Las figuras 5A-B son gráficos de barras que ilustran la calidad de los segregantes F² 'sf' y de tipo silvestre del cruce CEZ x 'sf'. A: Grados Brix (TSS) promedio de 10 frutos CEZ, y de segregantes 'sf' y de tipo silvestre; B: Contenido medio de p-carotenos de 10 frutos de CEZ, y de segregantes 'sf' y de tipo silvestre.

La figura 6 es una fotografía de los productos de la digestión con ApoI de un producto de PCR de 213 pares de bases (pb) amplificado a partir del ADN de (de izquierda a derecha) 'sf', 'CEZ' y sus plantas F¹. El tamaño en pares de bases (pb) de los fragmentos de ADN aparece a la izquierda. El cebador directo TAGACATGAGCCGCATCTGA (SEQ ID n.23) y el cebador inverso GAACGTGGCAACAACAACAA (SEQ ID n.° 4) se utilizaron para la amplificación por PCR.

La figura 7 es un alineamiento del motivo de 'dedo de Zn' (ZF, del inglés Zn-finger) de 's f (MELO3C009603) que muestra el cambio de aminoácido de 'F97’ a 'I' (recuadro rojo). Los dos aminoácidos de cisteína e histidina del C²H² están en negrita. CHYCCRNFPTSQALGGHQNAH (SEQ ID n.2 5); CHYCCRNIPTSQALGGHQNAH (SEQ ID n.26).

Las figuras 8A-B son gráficos que ilustran la expresión de MELO3C009603 (gen sf ). Figura 8A: expresión digital obtenida por ARN-Seq de MELO3C009603 (gen sf ) en las masas de 'sf' y del tipo silvestre; figura 8B: análisis cualitativo por RT-PCR de la expresión relativa (gen APR1 como referencia) de MELO3C009603 en los tejidos que comprendían cada una de las masas.

La figura 9 es un diagrama de Venn que muestra todos los genes expresados diferencialmente (DEG, del inglés differentially expressedgenes) en las tres poblaciones segregantes y los que se solapan.

La figura 10A es un gráfico que ilustra la expresión digital obtenida por ARN-Seq de MELO3C021150 (gen de la nucela de la semilla) en masas isogénicas de 'sf' y de tipo silvestre (CEZ);

La figura 10B es un gráfico que ilustra la expresión relativa de MELO3C021150 en los tejidos que comprendían las masas isogénicas, analizadas por qRTPCR (gen APR1 como referencia).

Las figuras 11A-B proporcionan la secuencia del ADN complementario de tipo silvestre (FIG. 11 A: SEQ ID n.° 7) y la secuencia de aminoácidos mutada (FIG. 11B: SEQ ID n.° 8) de MELO3C009603 en las plantas mutadas. Figura 11A: el primer ATG está resaltado en amarillo y el codón de parada TAA está resaltado en rojo. El 'TTC' que codifica la 'F' en el tipo silvestre está en negrita y la T que está mutada a una 'A' en la 'sf' está coloreada en rojo; figura 11B: secuencia de la proteína del gen de 'sf'. El dominio de dedo de zinc está coloreado de azul, C² y H² de verde y el aminoácido mutado 'I' en rojo. El motivo QAALGH dentro del dominio ZF está subrayado.

Descripción de aspectos específicos de la descripción

La presente descripción, en algunos aspectos de la misma, se refiere a plantas de melón que tienen mayor producción de frutos y métodos para generarlas.

Antes de explicar en detalle al menos un aspecto de la descripción, debe entenderse que la descripción no está necesariamente limitada en su aplicación por los detalles expuestos en la siguiente descripción o ejemplificados mediante los ejemplos. La descripción admite otros aspectos o se puede poner en práctica o llevar a cabo de varias maneras.

Entre las cucurbitáceas, C. melo es una de las cucurbitáceas cultivadas más importantes. Se cultivan principalmente por sus frutos, que generalmente tienen una gran diversidad de tamaño (de 500 g a 5 kg), color de la pulpa (naranja, verde y blanco), color de la cáscara (verde, amarillo, blanco, naranja y gris), forma (redonda, ovalada y alargada), y dimensiones (de 5 a 25 cm de ancho; de 10 a 50 cm de largo).

Mientras intentaban crear variaciones novedosas de la planta de melón, los presentes inventores trataron semillas de melón CEZ (un melón de tipo 'charentais', desarrollado por ARO) con el mutágeno químico metanosulfonato de etilo (EMS) y seleccionaron las plantas de melón 'superfructíferas' (denominadas en la presente memoria plantas "sf") que habían aumentado el número de frutos y el rendimiento (figuras 1 y 3). La inspección de los frutos de estas plantas reveló que su fruto no tenía semillas, o tenía semillas pequeñas y vacías sin desarrollar (figura 2). El análisis por HPLC de los carotenoides del fruto mutado reveló un contenido similar de betacarotenos que la contraparte isogénica sin mutar, CEZ. Además, el contenido de sólidos solubles totales (TSS, del inglés total soluble solids) reveló que el fruto mutado tenía un contenido de azúcar similar en comparación con la contraparte isogénica sin mutar.

Las plantas de tipo silvestre de 'CEZ' desarrollarán un promedio de cuatro frutos por planta y solo se desarrollará un fruto en una rama, mientras que la 'sf' es capaz de producir varios frutos en cada rama. En las plantas de tipo silvestre, la fertilización satisfactoria de una flor femenina y el inicio del desarrollo del fruto suprimirán el desarrollo de otros frutos de otras flores femeninas de la misma rama. Este mecanismo de supresión está desactivado en la 'sf'. Los cruces recíprocos hechos con la 'sf' indicaron que su polen es completamente fértil, y que el fruto se desarrollará solo después de la fertilización, aunque el pequeño fruto de la 'sf' no contendrá semillas o serán semillas pequeñas y vacías. Por lo tanto, el aborto de semillas en la 'sf' no impide el desarrollo del fruto y no inhibe la producción de muchos otros frutos en la misma rama.

Se demostró que este incremento de la producción único está gobernado por un solo gen recesivo (MELO3C009603, que codifica una proteína con dedos de zinc de tipo Cys²His² (C²H²)) como se demostró mediante el análisis de segregación de 'sf' en cuatro poblaciones segregantes F2 independientes.

Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto de la presente descripción, se da a conocer una planta de C. melo o una parte de ella, en donde la planta produce más de 12 frutos, en donde dichos frutos no tienen semillas.

El término "planta", tal como se usa en la presente memoria, abarca plantas enteras, ancestros y progenie de las plantas, y partes de plantas, que incluyen semillas, frutos, brotes, tallos, raíces (que incluyen tubérculos), y células, tejidos y órganos vegetales. La planta puede estar en cualquier forma, entre ellas, tejido calloso, cultivo en suspensión, embriones, regiones meristemáticas, hojas, gametofitos, esporofitos, polen, óvulos y microsporas.

El término "melón", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a la especie Cucumis melo L. que incluye las subespecies agrestis (vars. conomon, makuwa, momordica y acidulous) y melo (vars. cantalupensis, reticulatus, adana, chandalok, ameri, inodorus, flexuosus, chate, tibish, dudaim y chito).

El término "cultivar" se usa en la presente memoria para indicar una planta que tiene un estado biológico distinto del estado "silvestre", en la que el estado "silvestre" indica el estado original no cultivado o natural de una planta o una muestra registrada. El término "cultivar" (para la variedad cultivada) incluye, entre otros, seminatural, semisilvestre, maleza, cultivar tradicional, variedad local, material de reproducción, material de investigación, línea de reproducción, población sintética, híbrido, plantel fundador/población de base, línea endogámica (progenitor del cultivar híbrido), población segregante, acervo genético/mutante y cultivar avanzado/mejorado. Los ejemplos de cultivares incluyen las variedades cultivadas que pertenecen a los grupos taxonómicos Cucumis melo variedad cantalupensis (los tipos de fruto Charentais y cantalupo italiano), Cucumis melo variedad reticulatis (los tipos de fruto Galia y Ananás), y Cucumis melo variedad inodorus (entre ellos, los tipos de fruto Piel de Sapo, Amarillo Canario, Melón Blanco y Melón Verde). Por lo tanto, una planta de la presente descripción es una planta de cualquier variedad de C. melo . El término "var." indica una varietas ("variedad", un nivel taxonómico por debajo del de la especie como se detalla anteriormente).

De acuerdo con un aspecto, la planta de este aspecto de la presente descripción tiene un mayor rendimiento de frutos que las plantas de tipo silvestre del mismo acervo genético cultivadas en las mismas condiciones (es decir, dan más de 10 frutos, 12 frutos, 15 frutos, 20 frutos, 25 frutos o incluso más de 30 frutos en un momento determinado). Por lo general, el peso promedio de cada uno de los frutos es de 350 g con un margen de 100 a 600 g, en función del acervo genético (figura 4B). La planta puede comprender al menos 2, al menos 3, al menos 5 frutos por rama en un momento determinado.

La mayor parte de los frutos en la planta se encuentran en la misma etapa de maduración, en función del grado de modo climatérico/no climatérico de maduración del fruto.

Se apreciará que el peso total de frutos (es decir, la cosecha) de dicha planta es mayor que el peso total de frutos de una planta de Cucumis melo de tipo silvestre.

Tal como se usa en la presente memoria, la frase "planta de Cucumis melo de tipo silvestre" se refiere a la planta de Cucumis melo que tiene un genoma natural sin mutar.

Los presentes inventores han demostrado que el contenido de azúcar y el contenido de p-carotenos de los melones de la planta de este aspecto de la presente descripción son similares a los de su contraparte no mutada (de tipo silvestre). Se apreciará que las contrapartes de tipo silvestre no tienen una mutación en otros genes que afectan el contenido de p-carotenos, tal como CRTISO, como se describe en la solicitud de patente de los EE. UU. n.° 20120324597. Por lo tanto, los melones de la planta de este aspecto de la presente descripción se pueden cultivar para que sean comestibles y de alta calidad en varios acervos genéticos. Son adecuados como productos frescos, como productos recién cortados o para procesamiento, tal como, por ejemplo, enlatado.

Según se mencionó, los melones de la planta de este aspecto de la presente descripción no tienen semillas.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "melón sin semillas" se refiere a un melón que no contiene semillas maduras fertilizadas. Aunque los melones de la presente descripción no contienen semillas maduras fertilizadas, los melones pueden contener ovarios no fertilizados, que son pequeños y de color blanco. Estos ovarios no fertilizados no se consideran semillas verdaderas. El contenido de semillas en el fruto se reduce en al menos un 80 % en comparación con el de un melón de tipo silvestre con los mismos acervo genético y condiciones de crecimiento.

De acuerdo con este aspecto de la presente descripción, el rasgo sin semillas está controlado por un determinante genético y es independiente del tratamiento exógeno con hormonas vegetales inductoras de la partenocarpia. Por lo tanto, el carácter sin semillas se obtiene por estenospermocarpia y no por partenocarpia.

De acuerdo con un aspecto, al menos el 80 % de los frutos de una planta determinada tienen un contenido de semillas reducido al menos en un 80 %, de al menos un 90 % a aproximadamente un 99 % o incluso en un 100 %.

De acuerdo con otro aspecto, al menos el 85 % de los frutos de una planta determinada tienen un contenido de semillas reducido al menos en un 80 %, de al menos un 90 % a aproximadamente un 99 % o incluso en un 100 %.

De acuerdo con otro aspecto, al menos el 90 % de los frutos de una planta determinada tienen un contenido de semillas reducido al menos en un 80 %, de al menos un 90 % a aproximadamente un 99 % o incluso en un 100 %.

De acuerdo con otro aspecto, al menos el 95 % de los frutos de una planta determinada tienen un contenido de semillas reducido al menos en un 80 %, de al menos un 90 % a aproximadamente un 99 % o incluso en un 100 %.

De acuerdo con otro aspecto, al menos el 99 % de los frutos de una planta determinada tienen un contenido de semillas reducido al menos en un 80 %, de al menos un 90 % a aproximadamente un 99 % o incluso en un 100 %.

Las plantas de melón de este aspecto de la presente descripción se caracterizan por tener ambos alelos del gen MELO3C009603 (secuencia de ADNc de tipo silvestre: SEQ ID n.° 7) que tienen una mutación de pérdida de función que da como resultado un rasgo mejorado de cultivo del fruto (y opcionalmente un rasgo sin semillas). El MELO3C009603 puede tener una sola mutación que provoque ambos rasgos, o dos mutaciones, una que conlleva el rasgo mejorado de cultivo del fruto y la otra que conlleva el rasgo sin semillas. De acuerdo con un aspecto concreto, la secuencia de aminoácidos mutada de MELO3C009603 se presenta en la SEQ ID n.° 8.

MELO3C009603 puede estar en forma homocigota o en forma heterocigota. Según este aspecto, la homocigosis es una situación en la que ambos alelos del locus MELO3C009603 se caracterizan por tener la misma secuencia de nucleótidos. La heterocigosis se refiere a diferentes estados del gen en el locus MELO3C009603.

El término "alelo", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquiera de una o más formas alternativas de un locus génico, en donde todos los alelos están relacionados con un rasgo o característica. En una célula u organismo diploide, los dos alelos de un gen dado ocupan los locus correspondientes en un par de cromosomas homólogos.

El término "gen", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a un factor heredado que determina una característica biológica de un organismo (es decir, una planta de melón), un "alelo" es cada uno de los genes del par de genes presente en la planta de melón (diploide).

Una planta se denomina "homocigótica" para un gen cuando contiene los mismos alelos de dicho gen, y "heterocigótica" para un gen cuando contiene dos alelos diferentes de dicho gen. El uso de letras mayúsculas indica un gen (de tipo) dominante y el uso de letras minúsculas denota un gen recesivo: "X,X", por lo tanto, denota un genotipo homocigótico dominante para el gen o la propiedad X; "X,x" y "x,X" indican genotipos heterocigóticos; y "x,x" indica un genotipo homocigótico recesivo. Como saben los especialistas, solo el genotipo recesivo homocigoto proporcionará generalmente el fenotipo recesivo correspondiente (es decir, hará que una planta muestre la propiedad o rasgo "x"), mientras que los genotipos dominantes heterocigotos y homocigotos generalmente proporcionarán el fenotipo dominante correspondiente (es decir, harán que una planta muestre la propiedad o rasgo "X"), a menos que otros genes y/o factores tales como alelos múltiples, supresores, codominancia, etc. (también) desempeñen una función en la determinación del fenotipo.

Una "mutación de pérdida de función" es una mutación en la secuencia de un gen, que hace que se reduzca o desaparezca por completo la función del producto del gen, generalmente una proteína. Una mutación de pérdida de función puede estar causada, por ejemplo, por el truncamiento del producto génico debido a una mutación de cambio de fase o terminadora, o por una alteración de uno o más aminoácidos. Un fenotipo asociado a un alelo con una mutación de pérdida de función suele ser recesivo, pero también puede ser dominante.

De acuerdo con un aspecto concreto, ambos alelos de MELO3C009603 llevan una mutación de A a T en la posición 3,450,971 en el scaffold 11 del genoma del melón, lo que lleva a un cambio de aminoácido F/I en la posición 97 de la proteína de MELO3C009603 predicha. Una secuencia polinucleotídica ejemplar de un MELO3C009603 mutado se presenta en la SEQ ID n.° 9. Una secuencia polipeptídica ejemplar de un MELO3C009603 mutado se presenta en la SEQ ID n.28.

Se apreciará que la presente descripción también contempla la generación del fruto de Cucumis melo mediante la toma de esquejes de plantas de melón 'sf' y la propagación vegetativa.

La propagación vegetativa puede efectuarse con los métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, cultivo de tejido vegetal in vitro, enraizamiento de brotes laterales o fusión de protoplastos. En un aspecto, un método de propagación vegetativa de una planta de la presente descripción comprende: a) recoger tejido de una planta de la presente descripción; b) cultivar dicho tejido para obtener brotes proliferantes; c) enraizar dichos brotes en proliferación para obtener plántulas enraizadas; y d) cultivar plantas a partir de dichas plántulas enraizadas.

Los esquejes según este aspecto de la presente descripción pueden incluir raíces, tallos, hojas, cotiledones, flores, frutos, embriones y polen. Preferiblemente, los esquejes comprenden tallos y meristemos apicales o de brotes laterales.

De acuerdo con un aspecto, las plantas de la presente descripción son de una variedad híbrida, es decir, se generan siguiendo el cruzamiento (es decir, el apareamiento) de dos plantas que no son isogénicas. El híbrido puede ser un híbrido de F¹ o una variedad de polinización abierta.

Un "híbrido de F¹", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a la progenie de primera generación del cruce de dos plantas que no son isogénicas.

El desarrollo de híbridos de melón de la presente descripción requiere el desarrollo de líneas parentales estables siempre que al menos uno de ellos sea heterocigoto para el gen sf. En los programas de mejora genética, los rasgos deseables de dos o más fuentes de germoplasma o acervos genéticos se combinan para desarrollar variedades superiores por mejora genética. Las líneas endogámicas o parentales deseables se desarrollan mediante la autopolinización continua y la selección de las mejores líneas de reproducción, a veces utilizando marcadores moleculares para acelerar el proceso de selección.

Una vez que se han identificado las líneas parentales que dan el mejor rendimiento híbrido, por ejemplo, ambas portadoras de la mutación en MELO3C009603, la semilla híbrida se puede producir indefinidamente, siempre que se mantenga la homogeneidad de los parentales. De acuerdo con un aspecto, las plantas de melón de la presente descripción son líneas de plantas parentales estables (que portan una mutación de pérdida de función en el gen MELO3C009603 en una forma heterocigota).

Tal y como se define en la presente memoria, la frase "líneas parentales estables" se refiere a líneas endogámicas de polinización abierta, estables para las plantas deseadas durante los ciclos de autopolinización y plantación. Típicamente, el 95 % del genoma está en forma homocigota en las líneas parentales de la presente descripción.

De acuerdo con otro aspecto, la presente descripción da a conocer un método para producir plántulas de melón híbrido ‘sf’ de la primera generación (F¹).

De acuerdo con un aspecto, la presente descripción da a conocer un método para producir plántulas híbridas 'sf' de la primera generación (y también semillas) que comprende cruzar (por ejemplo, por polinización) una primera planta de melón progenitora estable que no tiene semillas y tiene un cultivo mejorado de frutos (por ejemplo, homocigoto o heterocigoto para la mutación en MELO3C009603) con una segunda planta de melón parental heterocigota para 'sf' estable.

Se apreciará que el 25 o el 50 % de las semillas de melón híbridas de Fi son homocigotas para una mutación de MELO3C009603, dependiendo de si solo una o ambas líneas parentales son heterocigotos para 'sf'.

Según otro aspecto, la presente descripción también da a conocer un marcador de ADN que permite seleccionar plántulas ‘sf’ de Fi.

Así pues, de acuerdo con otro aspecto de la presente descripción, se da a conocer una planta de Cucumis melo que tiene un genoma MELO3C009603/melo3c009603 tal que al autofecundarse el 25 % de la Fi da más de 5 frutos, en donde dichos frutos no tienen semillas.

La presente descripción también se refiere a las semillas recogidas de estas plantas de melón híbrido de la Fi y a las plantas cultivadas a partir de estas semillas.

Una práctica frecuente en la fitomejora es utilizar el método de retrocruzamiento para desarrollar nuevas variedades mediante la conversión de un único rasgo.

La frase "conversión de un único rasgo" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a la incorporación de un nuevo gen único en una línea parental en la que se recuperan esencialmente todas las características morfológicas y fisiológicas deseadas de las líneas parentales además del gen único transferido.

El término "retrocruzamiento", tal como se usa en la presente memoria, se refiere al cruce repetido de una progenie híbrida con una de las plantas parentales de melón. La planta de melón progenitora que aporta el gen para la característica deseada se denomina progenitor no recurrente o donante. Esta terminología se refiere al hecho de que el progenitor no recurrente se usa una vez en el protocolo de retrocruzamiento y, por lo tanto, no se repite. La planta de melón progenitora a la que se transfiere el gen del progenitor no recurrente se conoce como progenitor recurrente, ya que se utiliza durante varias rondas en el protocolo de retrocruzamiento.

En un protocolo típico de retrocruzamiento, una planta de las variedades originales de interés (progenitor recurrente) se cruza con una planta seleccionada de segundas variedades (progenitor no recurrente) que porta el único gen de interés que se va a transferir. La progenie resultante de este cruce se vuelve a cruzar con el progenitor recurrente y el procedimiento se repite hasta que se obtiene una planta de melón en la que esencialmente todas las características morfológicas y fisiológicas deseadas del progenitor recurrente se recuperan en la planta convertida, además del único gen transferido del progenitor no recurrente.

Por lo tanto, se pueden crear líneas casi isogénicas (NIL, del inglés near-isogenic lines) mediante muchos retrocruzamientos para producir una colección de individuos que son casi idénticos en la composición genética, excepto por el rasgo o región genómica en cuestión, en este caso la mutación 'sf' en MELO3C009603.

Los métodos de retrocruzamiento se pueden usar con la presente descripción para mejorar o introducir una característica en las líneas progenitoras.

Se puede llevar a cabo la selección asistida por marcadores de plántulas de C. melo que producirán más de 5 frutos sin semillas (o partes de las mismas que sean capaces de producir una planta que produzca más de 5 frutos sin semillas). Esto es especialmente ventajoso para seleccionar esquejes o durante un procedimiento de retrocruzamiento. El método comprende analizar la presencia de la mutación A/T que conduce al cambio de aminoácido F/I en la posición 97 de la proteína predicha para MELO3C009603, en donde la presencia de la mutación es indicativa de que la planta producirá más de 5 frutos sin semillas o que una parte de ella producirá una planta que dará más de 5 frutos sin semillas.

Se conocen muchos métodos en la técnica para analizar mutaciones, que incluyen, por ejemplo, extensión de una única base (SBE), secuenciación de extensión de cebador específico de alelo (ASPE), secuenciación de ADN, secuenciación de ARN, análisis de micromatrices, PCR universal, extensión específica de alelo, hibridación, espectrometría de masas, ligación, ligación y extensión, análisis mediados por la endonucleasa Flap, polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP), electroforesis, alineamiento de secuencias, hibridación de oligonucleótidos específicos de alelo (ASO) y ADN polimórfico amplificado al azar (RAPD).

Por lo tanto, la presente descripción contempla oligonucleótidos (por ejemplo, cebadores) que pueden usarse para distinguir entre la forma mutada y la no mutada de MELO3C009603. Un conjunto ejemplar de cebadores se describe en el apartado de ejemplos, SEQ ID n.os 3 y 4.

Los presentes inventores contemplan tanto la mutagénesis química como las técnicas recombinantes para la generación de las plantas de melón de la presente descripción.

Por tanto, las plantas de melón de la presente descripción pueden generarse al exponer la planta de melón o parte de la misma a un mutágeno químico. Los ejemplos de mutágenos químicos incluyen, entre otros, ácido nitroso, agentes alquilantes tales como metanosulfonato de etilo (EMS), metanosulfonato de metilo (MMS), sulfato de dietilo (DES) y análogos de bases nitrogenadas tal como 5-bromodesoxiuridina (5BU). Un método de ejemplo para generar las plantas de melón de la presente descripción usando la mutagénesis química incluye sumergir las semillas de melón durante 12 h en agua seguido de 12 h más en EMS (por ejemplo, al 1 %). Las semillas tratadas (M¹) se plantan luego y se autopolinizan para preparar las familias M².

Tal como se mencionó, la planta de melón de la presente descripción también se puede generar con otras técnicas que incluyen, entre otras, (a) la eliminación del gen MELO3C009603; (b) inactivación transcripcional del gen MELO3C009603; (c) inactivación de los transcritos del gen MELO3C009603 mediada por ARN antisentido; (d) inactivación traduccional de transcritos del gen MELO3C009603; y (e) edición genómica del gen MELO3C009603.

Así pues, por ejemplo, pueden generarse y usarse construcciones de sustitución o de supresión de genes que incluyen secuencias homólogas con el gen MELO3C009603 para insertar una secuencia auxiliar en la secuencia codificante del gen que codifica la enzima, para así inactivar este gen.

Estas construcciones incluyen preferiblemente marcadores de selección positiva y negativa y, por lo tanto, pueden emplearse para seleccionar eventos de recombinación homóloga. Un experto en la materia puede diseñar fácilmente una construcción de sustitución/supresión que incluya genes de selección tanto positiva como negativa para seleccionar con eficacia las células vegetales transformadas que sufrieron un evento de recombinación homóloga con la construcción. Estas células pueden ser cultivadas luego para convertirse en plantas completas. Pueden usarse métodos estándares conocidos en la técnica para implementar el procedimiento de sustitución/supresión. Dichos métodos se presentan, por ejemplo, en las patentes de los EE. UU. n.os 5,487,992, 5,464,764, 5,387,742, 5,360,735, 5,347,075, 5,298,422, 5,288,846, 5,221,778, 5,175,385, 5,175,384, 5,175,383, 4,736,866 así como Burke y Olson, Methods in Enzymology, 194:251-270, 1991; Capecchi, Science 244:1288-1292, 1989; Davies et al., Nucleic Acids Research, 20 (11) 2693-2698, 1992; Dickinson et al., Human MolecularGenetics, 2(8):1299-1302, 1993; Duff y Lincoln, "Insertion of a pathogenic mutation into a yeast artificial chromosome containing the human APP gene and expresión in ES cells", Research Advances in Alzheimer’s Disease and Related Disorders, 1995; Huxley et al., Genomics, 9:742-750, 1991; Jakobovits et al., Nature, 362:255-261, 1993; Lamb et al., Nature Genetics, 5: 22-29, 1993; Pearson y Choi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90:10578-82; Rothstein, Methods in Enzymology, 194:281-301, 1991; Schedl et al., Nature, 362: 258-261, 1993; Strauss et al, Science, 259:1904-1907, 1993, solicitudes de patente internacional WO 94/23049, WO 93/14200, WO 94/06908 y W^o 94/28123, también dan a conocer información.

Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto concreto de la presente descripción, la planta de melón se genera mediante la introducción en ella de una construcción de ácido nucleico, en donde la construcción de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un agente polinucleotídico que regula al alza la expresión del MELO3C009603 que tiene una mutación productora de un rasgo de mejor rendimiento de cultivo (y opcionalmente un rasgo sin semillas) y un elemento regulador que actúa en cis capaz de dirigir la expresión del agente polinucleotídico en la planta.

Las construcciones útiles en los métodos de acuerdo con la presente descripción pueden construirse con tecnología de ADN recombinante bien conocida por los expertos en la técnica. Las construcciones génicas pueden insertarse en vectores, que pueden estar disponibles en el mercado, adecuados para la transformación en plantas y adecuados para la expresión del gen de interés en las células transformadas. La construcción genética puede ser un vector de expresión en el que la secuencia de ácido nucleico está operativamente unida a una o más secuencias reguladoras que permiten la expresión en las células vegetales.

El polinucleótido de acuerdo con este aspecto de la presente descripción puede codificar el MELO3C009603 que tiene, por ejemplo, una mutación F/I en la posición 97. La secuencia polipeptídica de un ejemplo de MELO3C009603 que tiene una mutación F/I en la posición 97 es típicamente homóloga en al menos un 90 %, al menos un 91 % homóloga, al menos 92 % homóloga, al menos un 93 % homóloga, al menos un 94 % homóloga, al menos un 95 % homóloga, al menos un 96 % homóloga, al menos un 97 % homóloga, al menos un 98 % homóloga, al menos un 99 % homóloga, o un 100 % homóloga a la secuencia presentada en la SEQ ID n.° 8. La secuencia de ácido nucleico de un polinucleótido ejemplar que codifica dicha proteína puede ser al menos un 90 % homóloga, al menos un 91 % homóloga, al menos un 92 % homóloga, al menos un 93 % homóloga, al menos un 94 % homóloga, al menos un 95 % homóloga, al menos un 96 % homóloga, al menos un 97 % homóloga, al menos un 98 % homóloga, al menos un 99 % homóloga, o un 100 % homóloga a la secuencia de ácido nucleico presentada en la SEQ ID n.° 9.

En un aspecto particular de la presente descripción, la secuencia reguladora es un promotor expresable en las plantas.

Tal y como se usa en la presente memoria, la frase "expresable en las plantas" se refiere a una secuencia promotora, incluidos los elementos reguladores adicionales agregados o contenidos en ella, que es al menos capaz de inducir, conferir, activar o mejorar la expresión en una célula, tejido u órgano de melón.

El promotor puede ser un promotor regulable, un promotor constitutivo o un promotor asociado a tejido.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "promotor regulable" se refiere a cualquier promotor cuya actividad se ve afectada por condiciones ambientales o de desarrollo específicas.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "promotor constitutivo" se refiere a cualquier promotor que dirige la producción de ARN en muchos o todos los tejidos de una planta transformante en la mayoría de los casos.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "promotor asociado a tejido" se refiere a cualquier promotor que dirija la síntesis de ARN a niveles más altos en determinados tipos de células y tejidos (p. ej., un promotor asociado a frutos).

Los ejemplos de promotores que se pueden usar para expresar una secuencia de ácido nucleico unida operativamente (es decir, un transgén) incluyen el promotor del virus del mosaico de la coliflor, CaMV, y el promotor del virus del mosaico del tabaco, TMV.

Otros promotores que se pueden usar en el contexto de la presente descripción incluyen los descritos en la patente de los EE. UU. n.° 20060168699 y por Hector G. Numez-Palenius et al. [Critical Reviews in Biotechnology, volumen 28, número 1 de marzo de 2008, páginas 13-55].

Las células vegetales pueden transformarse de manera estable o transitoria con las construcciones de ácido nucleico de la presente descripción. En la transformación estable, la molécula de ácido nucleico de la presente descripción se integra en el genoma de la planta y, como tal, representa un rasgo heredado y estable. En la transformación transitoria, la célula transformada expresa la molécula de ácido nucleico, pero no está integrada en el genoma y, como tal, representa un rasgo transitorio.

Existen varios métodos para introducir genes exógenos en las plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas (Potrykus, I., Annu. Rev. Plant. Physiol. Plant. Mol. Biol. (1991) 42:205-225; Shimamoto et al., Nature (1989) 338: 274-276).

Los principales métodos para provocar la integración estable del ADN exógeno en el ADN genómico de la planta incluyen dos estrategias principales:

(i) Transferencia de genes mediada por Agrobacterium: Klee et al. (1987) Annu. Rev. Plant Physiol. 38:467-486; Klee y Rogers en Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes, eds. Schell, J. y Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, California (1989), pág. 2-25; Gatenby, en Plant Biotechnology, eds. Kung, S. y Arntzen, C. J., Butterworth Publishers, Boston, Mass. (1989) pág. 93-112.

(ii) captación directa de ADN: Paszkowski et al., en Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes eds. Schell, J. y Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, California (1989), pág.

52-68; incluye los métodos para la captación directa de ADN en protoplastos, Toriyama, K. et al. (1988) Bio/Technology 6:1072-1074. Captación de ADN inducida por una breve descarga eléctrica en las células vegetales: Zhang et al. Plant Cell Rep (1988) 7: 379-384. Fromm et al. Nature (1986) 319: 791-793. inyección de ADN en las células o tejidos vegetales mediante bombardeo de partículas, Klein et al. Bio/Technology (1988) 6: 559-563; McCabe et al. Bio/Technology (1988) 6: 923-926; Sanford, Physiol. Plant. (1990) 79:206-209; mediante el uso de sistemas de micropipetas: Neuhaus y col., Theor. Appl. Genet. (1987) 75:30-36; Neuhaus y Spangenberg, Physiol. Plant. (1990) 79:213-217; transformación mediante fibra de vidrio o fibra de carburo de silicio de cultivos celulares, embriones o tejido calloso, patente de los EE. UU. n.° 5,464,765 o por la incubación directa de ADN con polen en germinación, De Wet et al. en ExperimentalManipulation of Ovule Tissue, eds. Chapman, G. P. y Mantell, S. H. y Daniels, W. Longman, Londres, (1985) pág. 197-209; y Ohta, Proc. Nati Acad. Sci. USA (1986) 83:715-719.

El sistema de Agrobacterium incluye el uso de vectores plasmídicos que contienen segmentos de ADN definidos que se integran en el ADN genómico de la planta. Los métodos de inoculación del tejido vegetal varían según la especie de planta y el sistema de administración de Agrobacterium. Una estrategia ampliamente utilizada es el procedimiento de disco de hoja que se puede realizar con cualquier explante de tejido que proporcione una buena fuente para el inicio de la diferenciación de toda la planta. Horsch et al. en Plant Molecular Biology Manual A5, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1988) p. 1-9. Una estrategia complementaria emplea el sistema de administración con Agrobacterium en combinación con la infiltración al vacío. El sistema de Agrobacterium es especialmente viable para la creación de plantas dicotiledóneas transgénicas.

Existen varios métodos de transferencia directa de ADN a las células vegetales. En la electroporación, los protoplastos se exponen brevemente a un campo eléctrico fuerte. En la microinyección, el ADN se inyecta por medios mecánicos directamente en las células con el uso de micropipetas muy pequeñas. En el bombardeo de micropartículas, el ADN se adsorbe en microproyectiles, tales como cristales de sulfato de magnesio o partículas de tungsteno, y los microproyectiles se aceleran físicamente hacia las células o los tejidos vegetales.

Después de la transformación estable, se hace la propagación de la planta. El método más frecuente de propagación de plantas es por semillas. La regeneración por propagación de semillas, sin embargo, tiene la deficiencia de que, debido a la heterocigosis, existe una falta de uniformidad en el cultivo, ya que las semillas son producidas por las plantas de acuerdo con las variaciones genéticas regidas por las reglas mendelianas. Básicamente, cada semilla es genéticamente diferente y cada una crecerá con sus propios rasgos específicos. Por lo tanto, se prefiere que la planta transformada se produzca de manera que la planta regenerada tenga los mismos rasgos y características que la planta transgénica original. Por lo tanto, se prefiere que la planta transformada se regenere por micropropagación, lo que proporciona una reproducción rápida y constante de las plantas transformadas.

La micropropagación es un procedimiento de cultivo de plantas de nueva generación a partir de una sola pieza de tejido que ha sido extirpada de una planta o cultivar original seleccionados. Este procedimiento permite la reproducción masiva de plantas que tienen el tejido preferido expresando la proteína de fusión. Las plantas de nueva generación que se producen son genéticamente idénticas y tienen todas las características de la planta original. La micropropagación permite la producción masiva de material vegetal de calidad en un corto período de tiempo y ofrece una rápida multiplicación de cultivares seleccionados para la preservación de las características de la planta transgénica original o transformada. Las ventajas de la clonación de plantas son la velocidad de multiplicación de las plantas, y la calidad y uniformidad de las plantas producidas.

La micropropagación es un procedimiento de múltiples etapas que requiere la alteración del medio de cultivo o las condiciones de crecimiento entre las etapas. Así, el procedimiento de micropropagación implica cuatro etapas básicas: etapa uno, cultivo inicial de tejidos; etapa dos, multiplicación del cultivo de tejidos; etapa tres, diferenciación y formación de plantas; y etapa cuatro, cultivo y fortalecimiento en el invernadero. Durante la etapa uno, con el cultivo inicial de tejidos se consolida el cultivo de tejidos y se certifica libre de contaminantes. Durante la etapa dos, el cultivo de tejidos inicial se multiplica hasta que se produce una cantidad suficiente de muestras de tejido para cumplir con los objetivos de producción. Durante la etapa tres, se dividen las muestras de tejido cultivadas en la etapa dos y se hacen crecer como plántulas independientes. En la etapa cuatro, las plántulas transformadas se transfieren a un invernadero para su fortalecimiento, en donde la tolerancia de las plantas a la luz se aumenta gradualmente para que puedan crecer en el entorno natural.

Aunque actualmente se prefiere la transformación estable, la presente descripción también contempla la transformación transitoria de células de hojas, de células meristemáticas o de la planta entera.

La transformación transitoria puede efectuarse mediante cualquiera de los métodos de transferencia directa de ADN descritos anteriormente o mediante la infección vírica mediante virus vegetales modificados.

Los virus que han demostrado ser útiles para la transformación de hospedadores vegetales incluyen CaMV, TMV y BV. La transformación de las plantas usando virus de plantas se describe en la patente de los EE. UU. n.° 4,855,237 (BGV), EP-A 67,553 (TMV), solicitud de patente japonesa publicada con n.° 63-14693 (TMV), EPA 194,809 (BV), EPA 278,667 (BV); y Gluzman, Y. et al., Communications in Molecular Biology: Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, págs. 172-189 (1988). Las partículas de pseudovirus para su uso en la expresión de ADN exógeno en muchos hospedadores, incluidas las plantas, se describen en la solicitud de patente internacional WO 87/06261.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "aproximadamente" se refiere a ±10 %.

Los términos "comprende", "que comprende", "incluye", "que incluye", "que tiene" y sus conjugados significan "que incluye pero no se limita a".

El término "que consiste en" significa "que incluye y se limita a".

El término "que consiste esencialmente en" significa que la composición, el método o la estructura pueden incluir otros ingredientes, pasos y/o partes, pero solo si los ingredientes, pasos y/o partes adicionales no alteran materialmente las características básicas y novedosas de la composición, método o estructura reivindicados.

Tal y como se usa en la presente memoria, la forma singular "un", "una", "la" y "el" incluyen referencias plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por ejemplo, el término "un compuesto" o "al menos un compuesto" puede incluir numerosos compuestos, incluidas sus mezclas.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término "método" se refiere a formas, medios, técnicas y procedimientos para llevar a cabo una tarea determinada, incluidos, entre otros, los modos, medios, técnicas y procedimientos conocidos o desarrollados fácilmente a partir de formas, medios, técnicas y procedimientos conocidos por profesionales de las artes químicas, farmacológicas, biológicas, bioquímicas y médicas.

Se aprecia que ciertas características de la descripción, que se describen, para mayor claridad, en el contexto de aspectos independientes, también se pueden dar a conocer en combinación en un solo aspecto. Por el contrario, varias características de la descripción, que son, por brevedad, descritas en el contexto de un solo aspecto, también pueden darse a conocer por separado o en cualquier subcombinación adecuada o como adecuado en cualquier otro aspecto descrito de la descripción. Ciertas características descritas en el contexto de varios aspectos no deben considerarse características esenciales de esos aspectos, a menos que el aspecto no funcione sin esos elementos.

Diversos aspectos y los aspectos de la presente descripción, tal como se delineó anteriormente en la presente memoria y como se reivindica en el apartado de reivindicaciones que viene a continuación, encuentran apoyo experimental en los siguientes ejemplos.

Ejemplos

Ahora se hace referencia a los siguientes ejemplos, que junto con las descripciones anteriores ilustran algunos aspectos de la descripción de manera no limitativa.

Generalmente, la nomenclatura utilizada en la presente memoria y los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente descripción incluyen técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas y de ADN recombinante. Tales técnicas se explican detalladamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual” Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology", volúmenes I-III, Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, Nueva York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, Nueva York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1998); las metodologías presentadas en las patentes de los EE. UU. n.os 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 y 5,272,057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook', volúmenes I-III, Cellis, J. E., ed. (1994); "Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" por Freshney, Wiley-Liss, N. Y. ^{(1994), tercera edición; "Current Protocols in Immunolog} y ^{, volúmenes I-III, Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds),} "Basic and Clinical Immunology (8.a edición), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell y Shiigi (eds), ""Selected ^{Methods in Cellular Immunolog}y ^{, W. H. Freeman and Co., Nueva York (1980); los inmunoensayos disponibles se} describen con detalle en la bibliografía científica y de patentes, véase, por ejemplo, las patentes de los EE. UU. n.os 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 y 5,281,521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D. y Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation", Hames, B. D. y Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Culture", Freshney, Rhode Island, ed. (1986); " Immobilized Cells and Enzymes", IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning", Perbal, B., (1984) y "Methods in Enzymology", vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications", Academic Press, San Diego, Ca (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laborartory Course Manual', CSHL Press (1996). A lo largo de este documento se dan a conocer otras referencias generales. Se cree que los procedimientos allí descritos son bien conocidos en la técnica y se dan a conocer para comodidad del lector.

Materiales y métodos

Material vegetal

Semillas de 'CEZ', un melón de tipo 'Charentais' (Cucumis melo subesp. melo grupo Cantalupensis), se sometieron a mutagénesis con EMS, las plantas M¹ se autopolinizaron, las familias M² se fenotiparon visualmente y los linajes mutantes se seleccionaron como se describió anteriormente (Tadmor et al., 2007). Las plantas se cultivaron en las condiciones convencionales en el campo y en el invernadero.

Análisis de los carotenoides de los frutos

Se recogieron 5 frutos maduros, se pelaron, se rebanaron, y se les cortó una rebanada central en cubos pequeños y se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido. Las muestras de los frutos congelados se molieron hasta obtener un polvo fino mediante un molino analítico A11 (Ika) en presencia de nitrógeno líquido. Los carotenoides se extrajeron de 0,5 g de tejido triturado en una mezcla de hexano:acetona:etanol (50:25:25, v/v/v) como se describe en Tadmor et al., (2005) y se analizaron, se identificaron y se cuantificaron con un aparato 2695 de HPLC de Waters (Milford, MA) equipado con un detector PDA 996 de Waters y el programa informático Millennium (Waters), como se ha descrito previamente (Tadmor et al., 2000).

Extracción de ARN

La extracción del ARN para el análisis por ARN-Seq se realizó de acuerdo con Portnoy et al 2011, como se describe a continuación. La extracción de ARN adicional para RT-PCR utilizó el mismo protocolo, reducido en 1/20, comenzando con aproximadamente 100 mg de tejido congelado en tubos de 1,5 ml.

Se pulverizaron a mano tejidos de la cáscara de frutos congelados (alrededor de 5 g de cáscara de frutos de 1,5 mm de grosor) con un mortero en nitrógeno líquido. El tejido pulverizado se mezcló bien por agitación vorticial en un tubo de 50 ml con 10 ml de tampón de extracción que contenía Tris-HCl a 0,2 M (pH 9,0), ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) a 0,2 M, NaCl a 0,4 M y SDS al 2 % (p/v), y se incubó a 65 °C durante 5 min. Luego se le añadió lauroilsarcosina sódica al 30 % (p/v) hasta una concentración final del 2 % (v/v), y la mezcla se agitó vorticialmente y se incubó a 65 °C durante 2 a 3 min. Se le añadió un volumen igual de fenol a la solución, se agitó vorticialmente y se centrifugó a 5000g durante 5 min. La fase acuosa se transfirió a un tubo nuevo de 50 ml en hielo, después de tres rondas de extracciones con cloroformo-alcohol isoamílico (24:1, v/v). Los ácidos nucleicos se precipitaron con 1/10 de volumen de acetato de sodio a 3 M (NaAc) (pH 5,3) y 2 volúmenes de EtOH al 95 % (v/v). El sedimento de ácido nucleico resultante se disolvió en 10 ml de LiCl a 2 M a 4 °C durante una noche. El ARN total se precipitó por centrifugación a 15 000g durante 10 min a 4 °C y se disolvió en 0,5 ml de agua con dietilpirocarbonato (DEPC). Después de volver a precipitar con 1/10 de volumen de NaAc a 3 M (pH 5,3) y 2 volúmenes de EtOH al 95 %, el sedimento se disolvió en 50 a 100 pl de agua DEPC. El ARN se trató adicionalmente con ADNasa I (Thermo Scientific) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después de la reacción con ADNasa, las muestras se limpiaron mediante extracción con cloroformo-alcohol isoamílico, se precipitaron con 1/10 de volumen de NaAc a 3 M y 2 volúmenes de EtOH al 95 %, se lavaron con EtOH al 70 %, se secaron al aire durante 5 min y se diluyeron en agua. La calidad del ARN se analizó con un espectrofotómetro ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE), electroforesis en gel de agarosa SB al 1 % y PCR con cebadores flanqueantes de intrones para verificar en el gel de agarosa si se observa la presencia de contaminación de ADN.

El ARN de las hojas se extrajo con triReagent (Sigma), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se aplicó ADNasaI (Thermo Scientific) de acuerdo con el protocolo del fabricante y se lavó mediante la adición de cloroformoalcohol isoamílico, se precipitó con isopropanol, se lavó con EtOH al 70 %, se dejó secar al aire durante 5 min y se disolvió en ddH²O. La concentración de ARN se determinó mediante NanoDrop.

ARN-Seq

Después del tratamiento con ADNasa, se comprobó la integridad de las muestras de ARN en un gel de agarosa al 1 %, se comprobó la pureza en el NanoDrop (proporción 260/280 de aproximadamente 2, 260/230 de aproximadamente 2,4), y se determinó la ausencia de contaminación del ADN mediante un análisis por PCR con los cebadores de intrones de EF1a.

F: AGGCTGATTGTGCTGTCCTT - SEQ ID n.21;

R: GATGGGAACGAAGGGAATTT - SEQ ID n.22.

Las muestras que contienen ADN contaminado deben producir amplicones de 391 pb, en lugar de un ADNc de 303 pb, cuando se fraccionan en un gel de agarosa. Las muestras que contenían aproximadamente 30 pg de ARN se precipitaron con dos volúmenes de EtOH y 1/10 de volumen de NaAc a 3 M y se almacenaron a (-20 °C). La construcción de bibliotecas específicas de cadena se realizó con TruSec RNA Samp Prep Kit FC-121-1031 (Illumina Inc) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se enviaron doce genotecas en hielo seco para la secuenciación con Illumina HiSeq2000. Cada genoteca se tipificó individualmente y todas las genotecas se secuenciaron en un carril de Illumina con un rendimiento promedio de 17 x 106 lecturas de 50 pb por genoteca. Las lecturas de Illumina se clasificaron en función de la genoteca y se retiraron los códigos de barras tipificadores. A las lecturas sin procesar se les recortaron las bases de baja calidad al final de la ARN-seq y las lecturas de baja calidad se retiraron con el kit de herramientas FASTX. Luego, las lecturas de alta calidad resultantes se mapearon sobre el genoma del melón con TopHat versión v2.0.10 (Kim et al., 2011) y se contaron con HTseq v0.5.3p3. Se utilizó el paquete DESeq (Anders, 2010) de Bioconductor en el entorno R para identificar los genes expresados diferencialmente entre las muestras 'sf' y 'de tipo silvestre'. Los genes con FDR < 0,05 se consideró que presentaban expresión diferencial. El análisis de SNP se llevó a cabo con las rutinas de detección de variantes del programa GATK Unified Genotyper (versión 2.5-2) (DePristo et al., 2011) y se filtró para lograr un conjunto de SNP de alta confianza.

RT-PCR

Se usó 1 pg de ARN para la síntesis de ADNc usando el 'sistema Verso' (Thermo Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La reacción se realizó en un sistema Eco RT-PCR (Illumina). Cada muestra contenía: 1 pl de ADNc, 0,2 pl de cada cebador (10 mM), 5 pl de la mezcla de reacción de la mezcla madre del FastSYBR green (Applied Biosystems) y 3,6 pl de ddH²O. La máquina se programó según lo especificado por el fabricante de la enzima. Cada análisis se realizó en relación con el gen de mantenimiento ARP1 y se analizó en el programa Eco versión 4.

Extracción del ADN

Los meristemos de plantas jóvenes (aproximadamente 1 g) se molieron en nitrógeno líquido a mano con un mortero. La solución de extracción del ADN se preparó mezclando el tampón de extracción (sorbitol a 0,35 M, Tris a 0,1 M, EDTA a 5 mM, pH 7, se le añade bisulfito de sodio a 0,02 M antes de usar) : el tampón de lisis nucleica (sorbitol a 0,35 M, Tris a 0,1 M, EDTA a 5 mM, pH 7, se le añade CTAB al 2 % antes de usar) : sarcosilo al 5 %, en una relación de 1:1:0,4. Todos los productos químicos fueron suministrados por Sigma. La solución de extracción del ADN se incubó a 65 °C. Se le añadieron 600 pl de la solución de extracción del ADN a 100 pg de tejido pesado en un tubo de 1,5 ml, se mezcló y se incubó a 65 °C durante 10 min. Se le añadieron 600 pl de cloroformo:isoamilalcohol (relación de 24:1), se mezclaron durante 5 min a 200 rpm, se centrifugaron a 15000g durante 10 min y se extrajo el sobrenadante a un tubo nuevo. Se le añadió isopropanol frío (2/3 del volumen de sobrenadante), se mezcló, se incubó durante 30 min durante toda la noche (-20 °C), se centrifugó a 20000g durante 10 min, se retiró la fase líquida, se lavó el sedimento con EtOH al 70 %, se precipitó nuevamente y se retiró el EtOH, el sedimento se secó al aire durante 5 min, se disolvió con 50-200 pl de agua, se le agregaron 2 pl de ARNasa, las muestras se incubaron a 37 °C durante 30 min, se centrifugaron a 15000g durante 3 min y se retiró el sobrenadante a un tubo nuevo. La concentración y la pureza del ADN se determinaron en el NanoDrop, la integridad del ADN se comprobó en un gel de agarosa al 0,8 %.

Resultados

Identificación de la superfructífera

Se realizó el fenotipado visual de 2000 familias M² derivadas de semillas mutagenizadas de la línea para mejora 'CEZ'. Cada familia M² estaba representada en el campo por 12 plantas. Una familia se segregó por un fenotipo único; 3 de las 12 plantas cultivadas en el campo produjeron más de 15 frutos por planta (figuras 1 y ² ) en comparación con las plantas de tipo silvestre que produjeron un promedio de 3 frutos. Cada una de los frutos de los mutantes pesaba aproximadamente 300 g, mientras que el fruto de tipo silvestre pesaba aproximadamente 900 g. Curiosamente, el fruto del mutante no tenía semillas o tenía las semillas vacías y muy pequeñas. Esta mutación se denomina en la presente memoria "superfructífera" (figura 3). Cuando se diluyó el fruto de una planta 'sf', el fruto permaneció pequeño.

Herencia del carácter superfructífero

Los esquejes de las plantas superfructíferas ('sf') se transfirieron al invernadero una vez que desarrollaron suficientes raíces. Las plantas 'sf' desarrolladas a partir de los esquejes no podían autopolinizarse. Sin embargo, su polen se usó para la polinización exitosa de las líneas 'CEZ', 'Noy Yizre'el', 'Ein Dor' y 'Piel De Sapo', y se obtuvieron semillas viables de la F¹. Estas semillas se sembraron y las plantas F¹ se autopolinizaron con éxito para producir semillas F². Se plantaron en el campo 150-200 plantas de cada una de las poblaciones de la F² , se dejaron crecer en las condiciones de producción comercial y las abejas las polinizaron al aire libre. Una vez que se generó el fruto, los presentes inventores pudieron distinguir visualmente entre fenotipos 'sf' y de tipo silvestre. En las cuatro poblaciones F², 'sf' se segregó como un único gen recesivo (tabla 1).

Tabla 1

Para estimar el rendimiento de 'sf', los presentes inventores midieron el número de frutos y el peso de todas las plantas 'sf', dividieron la suma de los frutos por el número de plantas para obtener un número medio de frutos por planta, dividieron la suma del peso de los frutos por el número de plantas para obtener un rendimiento medio por planta y dividieron la suma del peso de frutos por el número de frutos para obtener un peso medio de frutos. Se realizaron mediciones y cálculos similares para las plantas de tipo silvestre. En todos los acervos genéticos probados, los 'sf' llevaban significativamente más frutos (figura 4A), frutos significativamente más pequeños (figura 4B) y un rendimiento por planta significativamente mayor (figura 4C).

Para determinar el efecto de 'sf' sobre la calidad del fruto, los presentes inventores escogieron aleatoriamente 10 frutos maduros de CEZ y de CEZ x 'sf' de tipo silvestre y segregantes del fenotipo 'sf'. Se degustaron los frutos, se analizaron los sólidos solubles totales (TSS, del inglés total soluble solids) como un índice del contenido de azúcares, y se analizó por HPLC el contenido de p-carotenos. No se detectó ningún efecto de 'sf' sobre el sabor del fruto del melón, que está determinado principalmente por el contenido de azúcares. No se detectaron diferencias de calidad entre las 'sf', los segregantes de tipo silvestre o los 'CEZ', incluido el contenido de TSS o p-carotenos (figuras 5A-B).

Para identificar el gen que determina el fenotipo 'sf', se seleccionaron dos réplicas de 10 plantas que muestran el fenotipo 'sf' o de tipo silvestre en las poblaciones F² segregantes de 'sf' x NY y 'sf' x ED, el fenotipo 'sf' de la población F² segregante de 'sf' x CEZ y la línea originaria de 'sf', CEZ. De cada una de estas plantas se tomaron muestras de los meristemos apicales, tallos, flores femeninas y frutos jóvenes a la edad de 2-4 días después de la polinización. El ARN se extrajo de las masas de cada combinación de tejido x fenotipo. Se combinaron cantidades iguales de ARN de todos los tejidos para desarrollar dos réplicas de los fenotipos 'sf' y de tipo silvestre de las poblaciones F² (8 grupos) segregantes de 'sf' x NY y de 'sf' x ED, del fenotipo 'sf' de la población F² segregante de 'sf' x CEZ y la línea originaria de 'sf', CEZ (cuatro grupos). Se analizaron por ARN-Seq 12 genotecas con Illumina HiSeq 2000, lo que arrojó un promedio de 17 x 106 lecturas para cada genoteca. Los polimorfismos mononucleotídicos (SNP) identificados mediante la comparación de los datos de ARN-Seq de los grupos fenotípicos, derivados de poblaciones F² segregantes de 'sf' x NY y de 'sf' x ED, estaban dispersos por el genoma del melón, aunque la mayoría de ellos estaban ubicados en el scaffold 11. Los presentes inventores buscaron entonces los SNP que eran homocigotos en 'CEZ', llevaran el alelo alternativo en todos los fenotipos 'sf' y llevaran principalmente el alelo 'CEZ' en todos los fenotipos de tipo silvestre. Un solo SNP en MELO3C009603 que está ubicado en el scaffold 11 del cromosoma 4 se fijó en todo el material de 'sf' ('A') en comparación con 'CEZ' ('T') y era el alelo menor en todos los fenotipos de 'tipo silvestre'.

Se diseñaron cebadores para que la PCR amplifique un fragmento de 213 pb que tiene un sitio de restricción de ApoI en el alelo de tipo silvestre que está mutado en sf.

F TAGACATGAGCCGCATCTGA - SEQ ID n.23

R GAACGTGGCAACAACAACAA - SEC ID n.24

Cuando se digiere con ApoI el fragmento amplificado por PCR, se producen fragmentos de 140 pb y 73 pb en el tipo silvestre, un fragmento de 213 pb cuando se digiere un mutante homocigoto para 'sf', y las tres bandas en el heterocigoto (figura 6B). Este marcador mostró una cosegregación completa con el fenotipo 'sf' en cuatro poblaciones F² independientes compuestas por al menos 300 plantas cada una.

MELO3C009603 codifica una proteína con dedo de zinc (ZF) de tipo Cys² His². La transversión de T a 'A' hizo cambiar de TTC, que codifica el aminoácido altamente conservado fenilalanina de la posición 97 (F97), a ATC, que codifica la isoleucina (I) en el motivo ZF (figura 7).

Los datos de ARN-Seq indicaron que la expresión digital de MELO3C009603 es baja, solo 40-60 lecturas en cada masa y similar en ambas masas. Estas masas incluían una mezcla de varios tejidos. Se analizó la expresión relativa de MELO3C009603 en cada uno de estos tejidos usando la RT-PCR cuantitativa y se encontró que tiene la misma expresión baja en las hojas y una expresión muy baja similar en todos los demás tejidos analizados (figuras 8A-B).

El análisis de los datos de ARN-Seq para los genes expresados diferencialmente (DEG, del inglés differentially expressed genes) identificó 103 genes que mostraban un cambio de más del doble entre 'CEZ' y 'sf', la comparación isógena. Solo 55 genes, de estos 103, mostraron una diferencia significativa, mientras que al usar el valor de P ajustado de estos 55, solo 14 genes mostraban una expresión diferencial significativa entre las masas de 'sf y de 'tipo silvestre' en las tres poblaciones segregantes analizadas (figura 9 y tabla 2, que vienen a continuación en la presente memoria). De estos 14 genes, solo MELO3C021150, que codifica un homólogo de la proteína específica de la nucela de semillas, descendió en las 'sf' de las tres poblaciones analizadas y MELO3C003230, que codifica un posible homólogo de antocianina 5-ariloaciltransferasa, se indujo en las 'sf' de las poblaciones analizadas. Los otros doce genes muestran una dirección de cambio similar en 'CEZ x sf' y en 'ED x sf', pero en dirección opuesta en la población F² de 'NY x sf' (tabla 2, en la presente memoria a continuación). El análisis cuantitativo por RT-PCR de MELO3C021150 en diferentes órganos indicó que la expresión digital encontrada entre las masas es aportada por el tejido del fruto joven y que MELO3C021150 no se transcribe en ninguno de los otros tejidos (figura 10).

Referencias

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Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Una planta de Cucumis melo o una parte de ella, en donde la planta contiene más de 12 frutos,

en donde dichos frutos son sin semillas, en donde ambos alelos del genoma de la planta tienen una mutación de pérdida de función en la SEQ ID n.° 7 que da como resultado un rasgo sin semillas.

2. Una planta de Cucumis melo que tiene una forma heterocigota de la SEQ ID n.° 7 en la que un alelo de la SEQ ID n.° 7 tiene una mutación de pérdida de función de tal manera que, tras la autopolinización, el 25 % de la Fi da más de 12 frutos, en donde dichos frutos son sin semillas.

3. La planta de acuerdo con la reivindicación 1, que da más de 15 frutos o da más de 20 frutos.

4. La planta de acuerdo con la reivindicación 1, en la que ambos alelos de dicha SEQ ID n.° 7 tienen una mutación F/I en la posición 97 de la misma.

5. Un esqueje de una planta de C. melo de la planta de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde ambos alelos del genoma del esqueje tienen una mutación de pérdida de función en la SEQ ID n.° 7 de manera que la planta desarrollada a partir del esqueje da más de 12 frutos, en donde dichos frutos son sin semillas; o en el que el esqueje tiene una forma heterocigota de la SEQ ID n.° 7 de manera que tras la autopolinización de la planta desarrollada a partir del esqueje, el 25 % de la F¹ produce más de 12 frutos, en donde dichos frutos son sin semillas.

6. Una pluralidad de semillas de C. melo que tienen una forma heterocigótica de la SEQ ID n.° 7 en las que un alelo de la SEQ ID n.° 7 tiene una mutación de pérdida de función que, al plantar las mismas, provoca un fenotipo de cultivo de fruta mejorado en el 25 % de las plantas derivadas de las mismas, y en las que dicho 25 % de las plantas dan más de 5 frutos, en donde dichos frutos son sin semillas.

7. Un polinucleótido aislado que comprende la secuencia que se presenta en la SEQ ID n.° 9.

8. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia como la presentada en la SEQ ID n.° 8.

9. Un método de selección asistida por marcadores de una planta de C. melo que tiene un rendimiento mejorado de frutos o que tiene una progenie con un rendimiento mejorado, en donde el método comprende usar oligonucleótidos que distinguen entre las formas mutada y no mutada de la SEQ ID n.° 7 cuando se analiza la presencia de una mutación de pérdida de función en ambos alelos de la SEQ ID n.° 7, en donde la presencia de dicha mutación en ambos alelos de la SEQ ID n.° 7 es indicativa de que la planta o su descendencia producirá más de 5 frutos sin semillas.