ES2938347T3 - Formulación antidiarreica que evita la resistencia antimicrobiana - Google Patents

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Abstract

Una formulación oral de bromelina eficaz para tratar y prevenir la diarrea causada por microbios patógenos. Esta formulación no mata los microbios patógenos y, por lo tanto, no facilita la proliferación de organismos resistentes a los antimicrobianos. La invención consiste en formular una suspensión oral acuosa de bromelina, carboximetilcelulosa sódica Blanose, ácido cítrico anhidro, aceite de lecitina Epikuron 135F y ácido etilendinitrilotetraacético, sal disódica dihidratada ("EDTA"). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Formulación antidiarreica que evita la resistencia antimicrobiana
Antecedentes
La diarrea es un problema en cerdos y personas. La diarrea en los lechones es uno de los problemas más comunes en la cría de cerdos y afecta a cientos de millones de los 1600 millones de lechones que nacen en todo el mundo cada año. Puede dar como resultado un aumento de peso reducido, un alto coste del tratamiento y una mortalidad frecuente. Los lechones con problemas de salud a una edad temprana tienden a permanecer en desventaja de peso y rendimiento en la edad adulta. Por lo tanto, la diarrea no solo tiene un impacto perjudicial en la salud de los lechones, sino también en la rentabilidad de la granja.
La diarrea es también un problema importante en los seres humanos. Es la segunda causa de muerte en el mundo en desarrollo, mata a más de 1.5 millones de niños al año y es una de las causas fundamentales de desnutrición. Se estima que cada año ocurren alrededor de 4 mil millones de casos de diarrea entre niños menores de cinco años. La diarrea también es un problema significativo para los viajeros a las áreas en desarrollo, que afecta a 40 millones de personas anualmente y es un problema principal para el personal militar durante las operaciones.
Hay muchas causas diferentes de diarrea. La Escherichia coli enterotoxigénica (ETEC) es una de las causas más comunes de diarrea en lechones no destetados y recién destetados. Otros patógenos importantes incluyen el rotavirus y la coccidiosis causada por el protozoo Isospora suis y afecta principalmente a lechones en las tres primeras semanas de vida. Se observa una alta mortalidad por coccidiosis en coinfecciones con ETEC.
La ETEC también es una de las causas más comunes de diarrea en niños pequeños en países en desarrollo y está asociada con un mayor riesgo de muerte que otros patógenos causantes de diarrea. Las ETEC también son la causa más frecuente de diarrea en viajeros a las áreas en desarrollo con tasas de episodios de hasta el 70 % en algunos casos. Otros patógenos importantes que afectan a los niños menores de cinco años en los países en desarrollo incluyen rotavirus, Cryptosporidium, Shigella, Aeromonas, Vibrio cholerae O1 y Campylobacter. E. coli enteroagregativa (EAEC), Shigella, Campylobacter, Salmonella, Aeromonas, Plesiomonas y Vibrios no coléricos son otras causas importantes de la diarrea del viajero.
Estos mismos patógenos anteriores también causan diarrea en los EE. UU., así como la E. coli enterohemorrágica (EHEC, o E. coli productora de toxina Shiga, STEC), Listeria, Yersinia, Cyclospora, Giardia, calcivirus y otros virus entéricos. El Clostridium difficile es la principal causa de infecciones intrahospitalarias. Colectivamente, estos agentes son responsables de más de 200 millones de casos de diarrea en los EE. UU. cada año. En muchos casos, un agente infeccioso no siempre es el responsable. Por ejemplo, en pacientes afectados por el VIH y pacientes con cáncer, puede resultar diarrea como un efecto secundario crónico de la quimioterapia. La diarrea también puede ser el resultado de desequilibrios hormonales inducidos por tumores endocrinos, diabetes o inflamación crónica, como en pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal.
Todos los patógenos causantes de diarrea difieren notablemente en los síndromes clínicos que inducen, los mecanismos de patogenia, la virulencia y la epidemiología. Algunos patógenos, como la ETEC, no son invasivos e inducen diarrea al adherirse mediante factores de adherencia específicos a los receptores de enterocitos en el intestino delgado y mediante la producción de enterotoxinas. Otros patógenos, como Shigella, son invasivos y alteran la función de barrera intestinal e inducen diarrea al inducir inflamación o pérdida de superficie de absorción e hipoabsorción. Esta diversidad plantea una tarea enorme para los investigadores que intentan diseñar una profilaxis o un tratamiento simple y eficaz contra todas las causas de diarrea.
A pesar de la diversidad de patógenos y la multitud de factores que inducen la diarrea, las toxinas bacterianas o los mediadores inflamatorios inducen la causa más común de diarrea. Las toxinas suelen desencadenar moléculas de señalización como AMP cíclico, GMP cíclico o Ca2+ intracelular, que, a su vez, activan canales de iones cloro (Cl-) del intestino que conducen a un aumento en la secreción de Cl- y consecuentemente secreción de fluidos. Cuando el grado de secreción de fluido aumenta más allá de la capacidad del colon para reabsorber agua y electrolitos perdidos en el intestino delgado, se produce diarrea que puede provocar una deshidratación grave y, finalmente, la muerte. Los agentes quimioterapéuticos y los agentes inflamatorios también inducen diarrea al activar estas moléculas de señalización. Véase la Figura 1. Se esperaría que los agentes que se dirigen a estas vías de señalización de nucleótidos cíclicos o calcio fueran agentes antisecretores y, por tanto, fármacos antidiarreicos de amplio espectro eficaces.
La ingestión de bacterias patógenas como Escherichia coli puede causar diarrea en seres humanos y diarrea en cerdos. La diarrea es una preocupación particular en la cría de cerdos moderna, que a menudo implica condiciones de crecimiento densas o abarrotadas.
Los antibióticos son un medio eficaz para tratar la diarrea en seres humanos y la diarrea en cerdos. En la ganadería, los antibióticos también se pueden agregar de forma rutinaria a los alimentos para animales para prevenir la diarrea de manera profiláctica. Sin embargo, el uso regular y generalizado de antibióticos ha permitido la proliferación de cepas de bacterias patógenas resistentes a los antibióticos.
Así, existe la necesidad en la técnica de una forma de tratar y prevenir la diarrea en seres humanos y la diarrea en cerdos sin fomentar la proliferación adicional de cepas de bacterias patógenas resistentes a los antibióticos.
En el documento CN 1548154 se describe el tratamiento de la diarrea en mamíferos mediante bromelaína usando composiciones que pueden comprender ácido cítrico y carboximetilcelulosa, entre otros.
En el documento WO 2008/049437 se describe el uso de composiciones que comprenden lignina y, opcionalmente, bromelaína como activadores del crecimiento en lechones.
El autor encontró una manera. Esta solución no mata las bacterias patógenas; así, no es un «antibiótico» en el sentido convencional de la palabra, y no favorece selectivamente la proliferación de bacterias resistentes a los antibióticos. Más bien, esta solución simplemente evita que las bacterias patógenas se adhieran al revestimiento del tubo digestivo. Al no poder adherirse al revestimiento del tubo digestivo, las bacterias patógenas pasan intactas a través del tubo digestivo del animal huésped y se eliminan en las heces del animal huésped. Esta solución también funciona contra otros microbios que causan diarrea, como virus y parásitos. Lo hace bloqueando la invasión y las vías secretoras en las células intestinales, y no matando o dirigiéndose al microbio que causa la diarrea. Esta solución no es tóxica y no produce metabolitos o residuos tóxicos; así, es adecuada para su uso en seres humanos y en animales destinados al consumo humano, como cerdos, ganado vacuno y aves de corral, y en acuicultura (por ejemplo, peces y mariscos de piscifactoría). También es útil para animales de compañía tales como perros y gatos, peces ornamentales, etc. Se usa el término «veterinario» en las reivindicaciones adjuntas para abarcar animales para alimentación, animales de compañía y peces. Además, se puede sintetizar usando técnicas de síntesis de polipéptidos industriales habituales, como la síntesis de resina Fmoc, pero alternativamente también se puede fabricar a partir de ciertos extractos botánicos.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 es un diagrama de varias causas posibles de diarrea.
La Figura 2 es un diagrama de tres posibles mecanismos de acción de la fórmula de la invención.
La Figura 3 representa el número de lechones posdestete con diarrea a lo largo del tiempo después de una sola administración de la fórmula de la invención, en comparación con los lechones no tratados.
La Figura 4 representa la puntuación clínica total de los lechones después del destete a lo largo del tiempo después de una sola administración de la fórmula de la invención, en comparación con los lechones no tratados.
Descripción detallada
La invención está definida por las reivindicaciones. Básicamente se refiere a una formulación veterinaria oral que comprende una cantidad eficaz antidiarreica de bromelaína y un emulsionante que comprende lecitina en una cantidad eficaz para mejorar la solubilidad de dicha bromelaína en agua, y además comprende ácido cítrico. En una realización particular, consiste en formular una suspensión oral acuosa de bromelaína, carboximetilcelulosa sódica BLANOSE®, ácido cítrico anhidro, aceite de lecitina EPIKURON® 135F y ácido etilendinitrilotetraacético, sal disódica dihidratada («EDTA»). Por ejemplo, en la Tabla 1 se muestra una formulación adecuada.
Tabla 1
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Esta formulación produce un polvo suelto. Puede suspenderse en 2 ml de agua para administración oral a lechones lactantes para prevenir la E. coli u otra diarrea inducida por microbios («diarreas»). La cantidad usada se puede aumentar cuando se administra a animales más grandes o a seres humanos. Ahora se proporcionan más detalles sobre cada uno de estos componentes.
Bromelaína
La bromelaína es el nombre colectivo de un extracto proteolítico bruto obtenido de la planta de la piña (Ananas comosus). Se conocen dos formas de bromelaína; bromelaína de fruta obtenida a partir de piña fresca, y bromelaína de tallo obtenida a partir del tallo de la planta. La principal fuente comercial de bromelaína es la bromelaína de tallo, y los términos «bromelaína» y «bromelaína de tallo» se usan indistintamente.
La bromelaína se prepara a partir de los tallos después de cosechar la fruta. El tallo se pela, se tritura y se prensa para obtener un jugo que contiene los componentes solubles de la bromelaína. El procesamiento adicional incluye la concentración, la filtración y el secado del jugo prensado para obtener un polvo seco final de color blanco amarillento o tostado. El extracto de bromelaína resultante es una mezcla de enzimas digestivas de proteínas, llamadas enzimas proteolíticas o proteasas, y otras diversas sustancias en cantidades más pequeñas, como peroxidasas, fosfatasas ácidas, ciertos inhibidores de proteasas y calcio.
La enzima proteolítica principal en la bromelaína es una proteasa llamada bromelaína de tallo, CAS 37189-34-7 (EC 3.4.22.32), mientras que la proteasa principal en el extracto de bromelaína de la fruta se llama bromelaína de la fruta (EC 3.4.22.33). Estas enzimas proteasas se refieren como sulfhidrilo proteasas, ya que se requiere un grupo sulfhidrilo libre de una cadena lateral de cisteína para actuar. La bromelaína de tallo tiene una amplia especificidad para la escisión de proteínas y tiene una fuerte preferencia por Z-Arg-Arg-|-NHMec entre los sustratos de moléculas pequeñas. La bromelaína de la fruta tiene una fuerte preferencia por Bz-Phe-Val-Arg-|-NHMec.
A menos que se indique lo contrario (p. ej., «bromelaína de la fruta»), se usa el término «bromelaína» en la presente memoria para hacer referencia al extracto bruto de los tallos de la piña y «proteasa de bromelaína del tallo» para describir la proteasa principal.
Las piñas tienen una larga tradición como planta medicinal entre los nativos de América del Sur y Central. El primer aislamiento de bromelaína fue registrado por el químico venezolano Vicente Marcano en 1891 a partir del fruto de la piña. En 1892, Russell Henry Chittenden, asistido por Elliott P. Joslin y Frank Sherman Meara, investigó la sustancia a fondo y la llamó «bromelaína». Más tarde, se introdujo el término «bromelaína», y originalmente el término se aplicó a cualquier proteasa de cualquier miembro de la familia de plantas Bromeliaceae.
La bromelaína tiene una larga historia de uso medicinal popular y moderno y continúa siendo explorada como un posible agente curativo en la medicina alternativa. También es ampliamente aceptado como medicamento fitoterapéutico. La bromelaína se introdujo por primera vez como suplemento terapéutico en 1957. Primero, la investigación sobre la bromelaína se llevó a cabo en Hawái, pero más recientemente se ha llevado a cabo en países de Asia, Europa y América Latina. Recientemente, investigadores en Alemania se han interesado mucho en la investigación de la bromelaína. Actualmente, la bromelaína es el decimotercero medicamento herbario más usado en Alemania.
Algunos de los beneficios terapéuticos de la bromelaína son la inhibición reversible de la agregación plaquetaria, la inhibición reversible de la angina de pecho, la inhibición reversible de la bronquitis y la sinusitis, el tratamiento de traumatismos quirúrgicos, la tromboflebitis y la pielonefritis. También se puede usar después de una cirugía o lesión para reducir la hinchazón (inflamación), especialmente de la nariz y los senos paranasales. También se usa para prevenir el dolor muscular después del ejercicio intenso. También se ha informado que la bromelaína interfiere en el crecimiento de las células tumorales y retarda la coagulación de la sangre. Ver www.nlm.nih.gov/medlineplus/druginfo/natural/895.html. La bromelaína también se usa para la alergia al polen, el tratamiento de una afección intestinal que incluya hinchazón y úlceras (colitis ulcerosa), la eliminación de tejido muerto y dañado después de las quemaduras (desbridamiento), la prevención de la acumulación de agua en los pulmones (edema pulmonar), la relajación de los músculos, la estimulación contracciones musculares, mejorando la absorción de antibióticos, previniendo el cáncer, acortando el trabajo de parto y ayudando al organismo a deshacerse de la grasa. En la preparación de alimentos, la bromelaína se usa como ablandador de carne y para clarificar la cerveza.
La terapia enzimática sistémica (que consiste en combinaciones de enzimas proteolíticas como bromelaína, tripsina, quimiotripsina y papaína) se ha investigado en Europa para el tratamiento de pacientes con cáncer de mama, colorrectal y plasmocitoma. En ratones con colitis experimental, seis meses de bromelaína dietética del tallo de la piña o del jugo fresco redujeron la gravedad de la inflamación del colon y redujeron el número de lesiones cancerosas en el colon.
Los suplementos de bromelaína, cuando se toman con otros medicamentos (amoxicilina, antibióticos, medicamentos anticoagulantes/antiplaquetarios) pueden aumentar el riesgo asociado con la frecuencia cardíaca, la coagulación de la sangre y el sangrado después de la cirugía.
Las actividades antimetastásica y antiinflamatoria de la bromelaína son aparentemente independientes de su actividad proteolítica. Aunque no se conocen bien, los diversos efectos biológicos de la bromelaína parecen depender de su capacidad para atravesar la barrera de la membrana, una propiedad muy inusual de este compuesto.
Como posible agente antiinflamatorio, la bromelaína puede ser útil para tratar la artritis, pero no ha sido confirmada en estudios humanos para este uso, ni está autorizada con una declaración de propiedades saludables para tal efecto por parte de la Administración de Alimentos y Medicamentos o la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria. A partir de la Base de datos integral de medicamentos naturales se sugiere que la bromelaína, cuando se usa junto con la tripsina (una proteasa diferente) y la rutina (una sustancia que se encuentra en el trigo sarraceno) es tan eficaz como algunos analgésicos recetados en el tratamiento de la artrosis. Un producto (WOBENZYME™) que combina bromelaína con tripsina y rutina está disponible comercialmente y parece reducir el dolor y mejorar la capacidad funcional de la rodilla en personas con artrosis. Sin embargo, los Institutos Nacionales de Salud señalan que «no hay suficiente evidencia científica para determinar si la bromelaína es eficaz o no para cualquiera de sus otros usos». Ver id. La bromelaína también está disponible en algunos países como producto bajo el nombre ANANASE™.
No se ha demostrado científicamente que la bromelaína sea eficaz contra ninguna otra enfermedad y no ha sido autorizada por la Administración de Alimentos y Medicamentos para el tratamiento de ningún otro trastorno.
La bromelaína se produce en Tailandia, Taiwán y otras partes tropicales del mundo donde se cultiva la piña.
La bromelaína se ha mostrado prometedora como fármaco antidiarreico eficaz de amplio espectro, ya que se dirige a la causa subyacente de la diarrea, las vías inflamatorias y secretoras. La bromelaína tiene un triple mecanismo de acción. Consulte la Figura 2. En primer lugar, evita que las bacterias se adhieran al intestino delgado, lo que previene su colonización. En segundo lugar, previene y revierte la acción de las toxinas bacterianas y los mediadores inflamatorios, la causa subyacente de la secreción excesiva de fluidos y la diarrea. Lo hace al bloquear la enterotoxina y las vías de señalización intracelular de AMP cíclico, GMP cíclico y Ca2+ inducidas por mediadores inflamatorios que inducen la secreción de fluido intestinal y la diarrea secretora. En tercer lugar, la bromelaína también inhibe la inflamación al reducir la producción y la acción de las citocinas proinflamatorias, incluidos TNFa, IFNy e IL-6 al prevenir la activación de las vías de la cinasa de la proteína activada por mitógeno (MAP) ERK-2, JNK y p38. Estas vías y las citocinas proinflamatorias desempeñan una función clave en la disfunción de la barrera intestinal inducida por Shigella, Salmonella y Clostridium difficile, y en la inflamación crónica, como en pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal (EII).
Debido a que la bromelaína actúa sobre los mecanismos subyacentes de la diarrea, a diferencia de los antibióticos y las vacunas que solo se dirigen a tipos específicos de patógenos, la bromelaína será eficaz contra una variedad de causas diferentes de diarrea. Además, dado que la bromelaína no es un antibiótico y no se dirige a los patógenos, no debería contribuir al creciente problema de la resistencia a los antibióticos, un grave problema de salud mundial.
El uso de la formulación de la invención previene la inflamación en el destete, mejora la salud del intestino y aumenta el consumo de alimento. El destete es un periodo crítico en la vida de un lechón. Debe hacer frente a la separación de la cerda, la transición de la leche altamente digerible a un alimento sólido menos digerible y más complejo, un nuevo entorno, el movimiento y la separación de los compañeros de camada, y la exposición a cerdos desconocidos. Estos factores estresantes pueden conducir a una ingesta reducida de alimento y un crecimiento reducido de los lechones.
Asimismo, los sistemas inmunitario y digestivo de los cerdos recién destetados todavía están madurando, lo que hace que los lechones sean más susceptibles a los desafíos antigénicos (nutricionales o microbianos), que pueden provocar respuestas inflamatorias. La inflamación induce un impacto negativo en las capacidades digestivas y de absorción del intestino y en la salud del intestino en general, lo que crea una oportunidad para que un animal se vuelva más susceptible a los patógenos. Un animal cuyo consumo reducido de alimento sea deficiente en el momento de la exposición al patógeno enfermará.
La ausencia de alimento en el estómago de un lechón da como resultado un desequilibrio microbiano, lo que lleva a una mayor incidencia de enfermedades. Así, esta breve fase de destete en la vida de un cerdo puede tener consecuencias de gran alcance, afectando negativamente todo el periodo de crianza del cerdo.
La actividad antiinflamatoria de la bromelaína reduce la inflamación del intestino y protege a los lechones de enfermedades, además de aumentar la ingesta de alimentos durante el periodo posterior al destete.
Carboximetilcelulosa de sodio BLANOSE®
La celulosa para uso industrial se obtiene principalmente a partir de pulpa de madera y algodón. El proceso kraft se usa para separar la celulosa de la lignina, otro componente principal de la materia vegetal. La celulosa no tiene sabor, es inodora, es hidrofílica con un ángulo de contacto de 20-30, es insoluble en agua y en la mayoría de los solventes orgánicos, es quiral y es biodegradable. Puede descomponerse químicamente en sus unidades de glucosa tratándola con ácidos concentrados a alta temperatura.
La celulosa deriva de unidades D-glucosa, que se condensan a través de enlaces glucosídicos p(1^ 4 ) . Este elemento de enlace contrasta con el de los enlaces glucosídicos a (1 ^4 ) presentes en el almidón, el glucógeno y otros carbohidratos. La celulosa es un polímero de cadena lineal: a diferencia del almidón, no se enrolla ni se ramifica, y la molécula adopta una conformación similar a una varilla extendida y bastante rígida, ayudada por la conformación ecuatorial de los residuos de glucosa. Los múltiples grupos hidroxilo en la glucosa de una cadena forman enlaces de hidrógeno con átomos de oxígeno en la misma cadena o en una vecina manteniendo las cadenas firmemente juntas una al lado de la otra y formando «microfibrillas» con alta resistencia a la tracción. Esto confiere resistencia a la tracción en las paredes celulares, donde las microfibrillas de celulosa se entrelazan en una «matriz» de polisacáridos.
En comparación con el almidón, la celulosa también es mucho más cristalina. Mientras que el almidón experimenta una transición de cristalino a amorfo cuando se calienta a más de (60-70) °C en agua (como en la cocción), la celulosa requiere una temperatura de 320 °C y una presión de 25 MPa para volverse amorfa en agua.
Se conocen varias estructuras cristalinas diferentes de celulosa, correspondientes a la ubicación de los enlaces de hidrógeno entre las hebras y dentro de estas. La celulosa natural es celulosa I, con estructuras la e lp. La celulosa producida por bacterias y algas está enriquecida en la mientras que la celulosa de las plantas superiores consiste principalmente en Ip. La celulosa en fibras de celulosa regenerada es celulosa II. La conversión de celulosa I en celulosa II es irreversible, lo que sugiere que la celulosa I es metaestable y la celulosa II es estable. Con varios tratamientos químicos es posible producir las estructuras de celulosa III y celulosa IV. Muchas propiedades de la celulosa dependen de la longitud de su cadena o del grado de polimerización, el número de unidades de glucosa que componen una molécula de polímero. La celulosa de pulpa de madera tiene longitudes de cadena típicas de entre 300 y 1700 unidades; el algodón y otras fibras vegetales, así como la celulosa bacteriana, tienen longitudes de cadena entre 800 y 10000 unidades. Las moléculas con una longitud de cadena muy pequeña resultantes de la descomposición de la celulosa se conocen como celodextrinas; a diferencia de la celulosa de cadena larga, las celodextrinas suelen ser solubles en agua y solventes orgánicos.
La metilcelulosa es un compuesto químico derivado de la celulosa. Es un polvo blanco hidrofílico en forma pura y se disuelve en agua fría (pero no en caliente), formando una solución o gel transparente y viscoso. Se vende con diversos nombres comerciales y se usa como espesante y emulsionante en varios productos alimenticios y cosméticos, y también como tratamiento del estreñimiento. Al igual que la celulosa, no es digerible, no es tóxica y no es un alérgeno.
La metilcelulosa no se produce de forma natural y se produce sintéticamente calentando la celulosa con una solución cáustica (por ejemplo, una solución de hidróxido de sodio) y tratándola con cloruro de metilo. En la reacción de sustitución que sigue, los restos hidroxilo (grupos funcionales -OH) se reemplazan por metóxido (grupos -OCH3).
Se pueden preparar diferentes tipos de metilcelulosa dependiendo del número de grupos hidroxilo sustituidos. La celulosa es un polímero que consiste en numerosas moléculas de glucosa unidas, cada una de las cuales expone tres grupos hidroxilo. El grado de sustitución (GS) de una forma determinada de metilcelulosa se define como el número medio de grupos hidroxilo sustituidos por glucosa. El máximo teórico es, así, un GS de 3.0, sin embargo, los valores más típicos son 1.3-2.6. Diferentes preparaciones de metilcelulosa también pueden diferir en la longitud media de sus cadenas principales de polímero.
La metilcelulosa tiene una temperatura de solución crítica (LCST, por sus siglas en inglés) más baja entre 40 °C y 50 °C. A temperaturas por debajo de la LCST es fácilmente soluble en agua; por encima de la LCST, no es soluble, lo que tiene el efecto paradójico de que calentar una solución saturada de metilcelulosa la volverá sólida, porque la metilcelulosa precipitará. La temperatura a la que esto ocurre depende del valor de GS, dando valores de GS más altos una solubilidad más baja y temperaturas de precipitación más bajas porque los grupos hidroxilo polares están enmascarados. Preparar una solución de metilcelulosa con agua fría es difícil: cuando el polvo entra en contacto con el agua se forma una capa de gel a su alrededor, lo que ralentiza drásticamente la difusión del agua en el polvo, por lo que el interior permanece seco.
La carboximetilcelulosa (CMC) o goma de celulosa es un derivado de la celulosa con grupos carboximetilo (-CH2-COOH) unidos a algunos de los grupos hidroxilo de los monómeros de glucopiranosa que forman la cadena principal de la celulosa. A menudo se usa como su sal de sodio, carboximetilcelulosa de sodio.
La CMC se usa en la ciencia de los alimentos como modificador de la viscosidad o espesante y para estabilizar emulsiones en varios productos, incluido el helado. También es un componente de muchos productos no alimentarios, como lubricantes personales, pasta de dientes, laxantes, pastillas para adelgazar, pinturas a base de agua, detergentes, aprestos textiles y varios productos de papel. Se usa principalmente porque tiene una alta viscosidad, no es tóxica y, en general, se considera hipoalergénica, ya que la principal fuente de fibra es la pulpa de madera blanda o la borra de algodón. La CMC se usa ampliamente en productos alimenticios sin gluten y reducidos en grasa. La CMC también se usa en productos farmacéuticos como agente espesante.
La carboximetilcelulosa sódica, también conocida como croscarmelosa sódica, es una carboximetilcelulosa sódica reticulada internamente. Se usa como superdisgregante en formulaciones farmacéuticas.
En la fórmula ejemplar en la Tabla 1 se usa carboximetilcelulosa sódica de calidad alimentaria de la marca BLANOSE® comercialmente disponible de Ashland Chemical Co., Covington KY, EE. UU. La carboximetilcelulosa sódica de calidad alimentaria y farmacéutica está disponible de otros proveedores, por ejemplo, Sigma-Aldrich Inc. y Spectrum Chemical, Inc. Se pueden usar otros agentes gelificantes además de carboximetilcelulosa sódica o en lugar de esta.
Ácido cítrico anhidro
El ácido cítrico es un producto químico básico, comercialmente disponible de una amplia variedad de proveedores. Se usa principalmente como acidificante, aromatizante y quelante.
El ácido cítrico es un ácido orgánico débil con la fórmula C6H8O7. Es un conservante natural y también se usa para agregar un sabor ácido o agrio a alimentos y bebidas. En bioquímica, la base conjugada del ácido cítrico, el citrato, es importante como compuesto intermedio en el ciclo del ácido cítrico, que ocurre en el metabolismo de todos los organismos aeróbicos. Consiste en 3 grupos carboxilo (R-COOH).
A temperatura ambiente, el ácido cítrico es un polvo cristalino blanco. Puede existir en forma anhidra (sin agua) o como monohidrato. La forma anhidra cristaliza en agua caliente, mientras que el monohidrato se forma cuando el ácido cítrico cristaliza en agua fría. El monohidrato se puede convertir en la forma anhidra calentándolo por encima de 78 °C.
El uso dominante del ácido cítrico es como saborizante y conservante en alimentos y bebidas, especialmente refrescos. Las propiedades amortiguadoras de los citratos se usan para controlar el pH en productos farmacéuticos. En la presente memoria se prefiere que el ácido cítrico usado se ajuste a los requisitos de pureza para el ácido cítrico como aditivo alimentario definidos por el Codex de productos químicos alimentarios publicado por la Farmacopea de los Estados Unidos.
Sin ánimo de apoyar ninguna teoría, se considera que el ácido cítrico en la formulación de la invención funciona como un agente emulsionante para evitar que el aceite de lecitina lipofílica se separe de la bromelaína hidrofílica. Es más, el ácido cítrico es un excelente agente quelante que une metales. Por ejemplo, se usa para eliminar la cal de calderas y evaporadores. Se puede usar para ablandar el agua, lo que lo hace útil en jabones y detergentes para ropa. Al quelar los metales en agua dura, permite que estos limpiadores produzcan espuma y funcionen mejor sin necesidad de ablandar el agua. La actividad de quelación es importante en la fórmula de la invención porque los iones metálicos pueden interferir con la actividad biológica de la bromelaína.
Aceite de lecitina EPIKURON® 135F
La lecitina tiene propiedades emulsionantes y lubricantes, y es un tensioactivo. La lecitina comercial, tal como la usan los fabricantes de alimentos, es una mezcla de fosfolípidos en aceite. La lecitina se puede obtener desgomando con agua el aceite extraído de las semillas. Es una mezcla de varios fosfolípidos, y la composición depende del origen de la lecitina. Una fuente principal de lecitina es el aceite de soja. Se pueden usar otras fuentes de lecitina (p. ej., aceite de girasol) para evitar problemas de alergia a la soja. Los principales fosfolípidos de la lecitina de soja y girasol son la fosfatidilcolina, el fosfatidilinositol, la fosfatidiletanolamina y el ácido fosfatídico. A menudo se abrevian como PC, PI, PE y PA, respectivamente (todos por sus siglas en inglés). Los fosfolípidos purificados son producidos comercialmente por empresas.
Para modificar el rendimiento de la lecitina y hacerla adecuada para el producto al que se agrega, puede hidrolizarse enzimáticamente. En las lecitinas hidrolizadas, una parte de los fosfolípidos tienen un ácido graso eliminado por la fosfolipasa. Estos fosfolípidos se denominan lisofosfolípidos. La fosfolipasa más usada es la fosfolipasa A2, que elimina el ácido graso en la posición C2 del glicerol. Las lecitinas también pueden modificarse mediante un procedimiento llamado fraccionamiento. Durante este procedimiento, la lecitina se mezcla con un alcohol, generalmente etanol. Algunos fosfolípidos, como la fosfatidilcolina, tienen buena solubilidad en etanol, mientras que la mayoría de los demás fosfolípidos no se disuelven bien en etanol. El etanol se separa del lodo de lecitina, después de lo cual el etanol se elimina por evaporación para obtener una fracción de lecitina enriquecida con fosfatidilcolina.
Los suplementos dietéticos de lecitina derivados de soja se componen de 19-21 % de fosfatidilcolina, 8-20 % de fosfatidiletanolamina, 20-21 % de fosfátidos de inositol, 33-35 % de aceite de soja, 2-5 % de esteroles, 5 % de carbohidratos/libres, 1 % de humedad, y 5-11 % de otros fosfátidos. La lecitina se usa para aplicaciones en alimentación humana, alimento animal, productos farmacéuticos, pinturas y otras aplicaciones industriales. En la industria farmacéutica, la lecitina actúa como un agente humectante, estabilizador y portador de enriquecimiento de colina, ayuda en las emulsiones y encapsulaciones, y es un buen agente dispersante. La lecitina está autorizada por la Administración de Medicamentos y Alimentos de los Estados Unidos para el consumo humano con el estado «por lo general reconocido como seguro». La lecitina también está permitida por la Unión Europea como aditivo alimentario (designado E322). En la fórmula ejemplar de la Tabla 1 se usa lecitina como emulsionante. Como emulsionante, la lecitina ofrece varias ventajas. En alimento para animales, enriquece el contenido de grasas y proteínas y mejora la granulación. Los estudios de investigación muestran que la lecitina derivada de la soja tiene efectos significativos en la reducción del colesterol y los triglicéridos séricos, al tiempo que aumenta los niveles de HDL («colesterol bueno») en la sangre de las ratas. Puede ser totalmente metabolizada por los seres humanos, por lo que es bien tolerada por los seres humanos y no es tóxica cuando se ingiere. (Por el contrario, algunos otros emulsionantes solo se pueden excretar a través de los riñones). Sin embargo, se pueden usar otros emulsionantes además de la lecitina o en lugar de esta.
Sal disódica dihidratada del ácido etilendinitrilotetraacético («EDTA», por sus siglas en inglés)
El ácido etilendiaminotetraacético, ampliamente abreviado como EDTA, es un agente quelante. Es un sólido incoloro, soluble en agua. Su base conjugada es el etilendiaminotetraacetato.
Su utilidad surge por su función como agente quelante, es decir, su capacidad para secuestrar iones metálicos como Ca2+ y Fe3+. La actividad quelante es ventajosa para la presente formulación porque el ion metálico (p. ej., el ion metálico comúnmente presente en el agua del grifo usada en la ganadería) puede interferir con la actividad de la bromelaína o inhibirla.
Después de unirse con EDTA, los iones metálicos permanecen en solución, pero exhiben una reactividad disminuida. El EDTA se produce en forma de varias sales, en particular, EDTA disódico y EDTA cálcico-disódico.
En la industria, el EDTA se usa principalmente para secuestrar iones metálicos en solución acuosa. En la industria textil, su uso evita que las impurezas de iones metálicos modifiquen los colores de los productos teñidos. El EDTA inhibe la capacidad de los iones metálicos, especialmente Mn2+, de catalizar la desproporción del peróxido de hidrógeno. De manera similar, se agrega EDTA a algunos alimentos como conservante o estabilizador para evitar la decoloración oxidativa catalítica, que es catalizada por iones metálicos. En los refrescos que contienen ácido ascórbico y benzoato de sodio, el EDTA mitiga la formación de benceno (un carcinógeno).
El EDTA se usa para unir iones metálicos en la práctica de la terapia de quelación, por ejemplo, para tratar el envenenamiento por mercurio y plomo. Se usa de manera similar para eliminar el exceso de hierro del organismo. Esta terapia se usa para tratar la complicación de las transfusiones de sangre repetidas, como se aplicaría para tratar la talasemia. La FDA de EE. UU. autorizó el uso de EDTA para el envenenamiento por plomo el 16 de julio de 1953, bajo la marca Versenate, que se permitió a la compañía farmacéutica Riker. Algunos médicos alternativos creen que el EDTA actúa como un poderoso antioxidante para evitar que los radicales libres dañen las paredes de los vasos sanguíneos, lo que reduce la ateroesclerosis. La FDA de EE. UU. no lo ha autorizado para el tratamiento de la ateroesclerosis.
Sin ánimo de apoyar ninguna teoría, el EDTA también puede servir en la formulación de la invención como conservante, tal vez para mejorar la acción conservante del ácido cítrico.
Además de EDTA o en lugar de este, se pueden usar otros agentes quelantes. Por ejemplo, se podría usar un ligando quelante que se una a un ion metálico, pero que también tenga una mayor biodegradabilidad y un menor contenido de nitrógeno que el EDTA.
Por ejemplo, se puede usar ácido iminodisuccínico (IDS, por sus siglas en inglés). Usado comercialmente desde 1998, el ácido iminodisuccínico (IDS) se biodegrada aproximadamente un 80 % después de solo 7 días. El IDS se une al calcio excepcionalmente bien y forma compuestos estables con otros iones de metales pesados. Además de tener una menor toxicidad después de la quelación que el EDTA, la producción de IDS es respetuosa con el medio ambiente. Asimismo, el IDS se degrada mediante el uso de la IDS-epimerasa y la C-N liasa que se encuentran en Agrobacterium tumefaciens (BY6) que se puede cosechar a gran escala. Asimismo, las reacciones catalizadas por ambas enzimas no requieren ningún cofactor y, así, se pueden aplicar directamente.
De manera similar, se puede usar poli(ácido aspártico). El poli(ácido aspártico), disponible comercialmente como BAYPURE™ DS 100, se produce de manera respetuosa con el medio ambiente. El poli(ácido aspártico), como el ácido iminodisuccínico, se une al calcio y otros iones de metales pesados. Tiene un valor de 7.2 meq/g más alto que el del EDTA, que solo tiene 6.0 meq/g. Si bien tiene una mayor capacidad teórica, en las aplicaciones prácticas muestra una baja eficiencia en soluciones de menor concentración de iones. El DS tiene muchas aplicaciones prácticas incluidas inhibidores de corrosión, aditivos para aguas residuales y polímeros agrícolas. Un detergente para ropa a base de BAYPURE™ DS 100 fue el primer detergente para ropa en el mundo en lograr la etiqueta ecológica «flor europea».
De manera similar, se puede usar ácido etilendiamino-N, N'-disuccínico (EDDS, por sus siglas en inglés). Como isómero estructural del EDTA, el ácido etilendiamino-N, N'-disuccínico puede existir en forma de tres isómeros: (S, S), (R, S)/(S, R) y (R, R), pero solo el isómero (S, S) es fácilmente biodegradable. El EDDS muestra una tasa de biodegradación sorprendentemente alta del 83 % en 20 días. Las tasas de biodegradación también varían según los diferentes iones metálicos quelados. Por ejemplo, los complejos de plomo y zinc con EDDS tienen relativamente la misma estabilidad, pero el complejo de plomo se biodegrada más eficazmente que el complejo de zinc. A partir de 2002, el EDDS ha sido comercialmente importante en Europa a gran escala con un aumento de la tasa de demanda estimado de aproximadamente el 15 % cada año.
De manera similar, se puede usar ácido metilglicinodiacético (MGDA). Disponible comercialmente de BASF GmbH, el ácido metilglicinodiacético (MGDA) se produce a partir de glicina. El MGDA tiene una alta tasa de biodegradación >68 %, pero a diferencia de muchos otros agentes quelantes, puede degradarse sin la ayuda de bacterias adaptadas. Asimismo, a diferencia del EDDS o IDS, el MGDA puede soportar temperaturas más altas mientras mantiene una alta estabilidad y todo el intervalo de pH. Como resultado, la fuerza quelante del MGDA es más fuerte que la de muchos agentes quelantes comerciales.
De manera similar, se puede usar ácido L-glutámico, ácido N, N-diacético, sal tetrasódica (GLDA). Dichos quelatos a base de aminopolicarboxilato se usan para controlar los iones metálicos en sistemas a base de agua.
Ejemplos
Se probó la formulación de la invención en cerdos criados en tres tipos diferentes de entornos y tres climas diferentes, en condiciones reales de cría comercial, evaluando dos grupos de edad diferentes de cerdos: lactantes (no destetados) y destetados.
• Ensayo 1 (España): Con la formulación de la invención se redujo la incidencia, la gravedad y la duración de la diarrea posdestete en lechones. Con la formulación de la invención también se redujo la necesidad de antibióticos y mejoraron los índices de conversión alimenticia (FCR, por sus siglas en inglés).
• Prueba 2 (Francia): Con la formulación de la invención se mejoró el aumento de peso diario medio y mejoraron los índices de conversión alimenticia en comparación con los antibióticos en el alimento.
• Prueba 3 (Filipinas): Con la formulación de la invención se redujeron las muertes de lechones en lechones lactantes en comparación con los antibióticos.
• Prueba 4 (Australia): Con la formulación de la invención se redujeron las muertes de lechones en lechones lactantes en comparación con los antibióticos.
Ejemplo 1. España (lechones recién destetados)
Objetivo: El objetivo de este estudio fue comparar si una sola dosis oral de la formulación de la invención (4 ml) al destete podría reducir la diarrea en una porcicultura comercial con antecedentes de E. coli.
Esquema del estudio: Este estudio fue un ensayo sobre el terreno aleatorizado y con ocultación en que se compararon dos grupos paralelos de lechones. Se usaron dos grupos de prueba (n = 72 por grupo): 1) la formulación de la presente memoria y 2) sin tratamiento. El día del destete (día 0), los lechones de cada camada se asignaron aleatoriamente a dos grupos de tratamiento diferentes, se pesaron y luego se les dio un número de identificación (ID) único. Luego se administró una dosis única de la formulación de la invención a un grupo de lechones que luego se transportaron a los corrales de destete. El otro grupo de lechones no se trató, pero se manejó de manera idéntica.
Parámetros clínicos: Los lechones se supervisaron diariamente en cuanto a diarrea y signos de cualquier otra enfermedad. Una vez que los lechones mostraron signos de diarrea, se registraron sus números de identificación, la consistencia fecal y el estado general de los lechones mediante un sistema de puntuación (Tabla 2).
Tabla 2. Puntuación de la consistencia fecal y estado general del lechón.
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La clasificación de los animales como sanos, indispuestos o moribundos se basó en la puntuación clínica total (Tabla 3). La puntuación clínica total es la suma de la puntuación de consistencia fecal más la puntuación del estado general de cada cerdo. Esta puntuación da una indicación general de la salud de los lechones. Algunos lechones pueden tener diarrea, pero aún parecer saludables, mientras que otros lechones pueden tener diarrea leve, pero estar moribundos. Con la formulación de la presente memoria se redujo significativamente la puntuación clínica de los lechones y, por lo tanto, mejoró su estado de salud general en comparación con los cerdos no tratados.
Tabla 3. Clasificación de los lechones por su puntuación clínica total
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Tratamientos con antibióticos: Se registraron todos los tratamientos con antibióticos administrados durante el estudio (identificación del animal, fecha, producto, dosis y vía de administración).
Peso de los lechones: Los lechones se pesaron individualmente el día 0 (al destete), el día 7 y el día 14. Se calculó la ganancia de peso diaria media (GMD).
Consumo de alimento: También se evaluó el consumo de alimento por corral para determinar las tasas de conversión alimenticia (FCR). La FCR es igual al consumo de alimento dividido por el peso del cerdo.
Análisis de datos: Para evaluar la incidencia de la diarrea, puntuación clínica o morbilidad (estado general consistencia fecal), tasa de tratamiento y tasa de mortalidad, el procedimiento estadístico usado fue un modelo lineal mixto con errores de Poisson y binomial. Habitación/sexo fueron como efectos aleatorios y Tratamiento como efecto fijo. Los análisis se realizaron con GenStat para Windows. (2007). 10a Ed. VSN International Ltd., Hemel Hempstead, Reino Unido. Para el peso corporal y la ganancia de peso diaria media los procedimientos estadísticos usados fueron modelos lineales mixtos con errores normales. El error tipo 1 fue <0.05.
Resultados
Parámetros clínicos
• Una dosis única de la formulación de la invención administrada al destete redujo significativamente la incidencia de diarrea (del día 0 al día 19 después del destete) en un 40 % en comparación con los cerdos no tratados (Figura 3) (p < 0.05). Esta dosis única protegió a los lechones durante 19 días, lo que indica una larga duración del efecto. La causa de la diarrea en esta granja fue E. coli.
• Durante la duración del estudio, la puntuación total de diarrea (suma de todas las puntuaciones de diarrea) en el grupo de lechones tratados con la formulación de la invención fue de 98, en comparación con 253 en el grupo no tratado.
• Con la formulación de la invención se mejoró significativamente la salud general de los lechones o tuvieron una puntuación clínica reducida, por lo tanto, una enfermedad menos grave, en comparación con los lechones no tratados (Figura 4) (p < 0.05).
• Con la formulación de la invención se redujo significativamente el número de cerdos enfermos en un 58 % (n = 16) en comparación con los cerdos no tratados (n = 38) (p < 0.05).
• Con la formulación de la invención se redujo la necesidad de la cantidad de tratamientos con antibióticos en un 55 % (15 tratamientos) frente a los controles (33 tratamientos).
• Hubo igual número de muertes (todas las causas) en el grupo tratado con la formulación (4) de la invención y en el grupo (3) no tratado.
Rendimiento del cerdo
• La ganancia de peso diaria media en los lechones tratados con la formulación de la invención en las dos semanas posteriores al destete fue un 22 % mayor que en los lechones no tratados (50 g ± 7.1 g frente a 39 g ± 7.0 g, respectivamente). A los 42 días después del destete, los lechones tratados con la formulación de la invención pesaban 0.2 kg (1.6 %) más que los lechones de control, pero este aumento no fue significativo.
• En las 2 primeras semanas después del destete, los lechones tratados con la formulación de la invención tuvieron una tasa de conversión alimenticia significativamente mejor del 8,4 % que los lechones no tratados (2.84 ± 1.22 frente a 3.1 ± 1.20, respectivamente). En general (del día 0 al 42), con la formulación de la invención se tuvo una mejora del 2.7 % en los índices de conversión alimenticia (1.46 ± 0.06 frente a 1.50 ± 0.06).
Aunque la mejor FCR general de la formulación de la invención en comparación con el grupo sin tratar es modesta (0.04 % o 2.7 %), debe tenerse en cuenta que cada 0.01 de mejora en la FCR reducirá el coste del alimento entre 0.28 $ y 0.30 $ por cerdo (basado en cifras de 2008: el coste del alimento ha aumentado significativamente, por lo que los beneficios actuales serán mayores). También se ha calculado que una mejora del 0.1 % en la FCR del criador puede mejorar la rentabilidad de una unidad de 200 cerdas en aproximadamente 6000 $ por año. Una mejora del 5 % en FCR tiene un posible valor de 28 millones de dólares para la industria porcina australiana (http://www.australianpork.com.au).
El mejor rendimiento en FCR es importante, ya que el coste del alimento es el coste principal para la producción de cerdo, y generalmente representa más del 60 al 80 por ciento de todos los gastos de producción. Cada mejora en FCR reducirá los costes de alimentación y mejorará la rentabilidad.
Conclusión
Una dosis única de la formulación de la invención administrada al destete reduce la incidencia, la duración y la gravedad de la diarrea. Con la formulación de la invención también se reduce la necesidad de tratamientos con antibióticos y mejora el crecimiento de los lechones. Por lo tanto, con la formulación de la invención se mejora el estado de salud y el rendimiento de los lechones y, por lo tanto, la productividad de la granja.
Ejemplo 2. Francia (lechones destetados)
Antecedentes: Los antibióticos como aditivos en los alimentos para promover el crecimiento ahora están prohibidos en Europa; sin embargo, se permite la adición de antibióticos prescritos al alimento bajo supervisión veterinaria para la profilaxis y el tratamiento de afecciones agudas, como la diarrea.
Objetivo: El objetivo de este estudio fue comparar los índices de conversión alimenticia de lechones a los que se les administró una dosis única de la formulación de la presente memoria con colistina en el alimento, un antibiótico.
Esquema del estudio: Este estudio fue un ensayo sobre el terreno aleatorizado, controlado y con ocultación en que se compararon tres grupos paralelos de lechones (n = 89 por grupo): 1) colistina; 2) la formulación de la presente memoria; y 3) sin tratamiento. En este estudio, se aleatorizan camadas enteras para recibir diferentes tratamientos, por lo que las camadas se tratan por camadas completas.
El destete en esta granja ocurre en 2 etapas. En la etapa 1, los lechones se destetan retirando a la cerda (en el día -5). Luego, el día 0, los lechones se trasladan a su corral de destete.
En el día -5, a los lechones del Grupo 1 se les administró colistina (9 kg de premezcla de antibiótico por tonelada de alimento) en el alimento de preiniciación durante 14 días (del día -5 al día 9). A los otros dos grupos se les administró alimento previo al inicio solo. El día 0 (5 días después del destete), cuando los lechones se trasladaron a sus corrales de destete, los lechones del Grupo 2 recibieron una dosis única de la formulación de la invención. Los lechones del grupo 3 no fueron tratados.
Análisis: Según el Estudio 1
Resultados
Rendimiento del cerdo
• Los lechones tratados con la formulación de la invención tuvieron un aumento de peso diario medio significativamente mayor durante todas las fases del estudio en comparación con los lechones que recibieron colistina (P < 0.05, Tabla 4). Los lechones tratados con colistina en su alimento tuvieron el menor aumento de peso de todos los grupos, incluido un menor aumento de peso que en los cerdos no tratados (P < 0.05).
Tabla 4. Ganancia media diaria de peso (g) de todos los grupos
Figure imgf000011_0002
• En general (a los 150 días de edad), la ganancia de peso total media de los lechones a los que se administró la formulación de la invención fue un 2 % (o 1.71 kg) más alta que la de los cerdos de control y un 3.9 % (o 3.25 kg) más alta que la de los lechones a los que se administró colistina en el alimento (P < 0.05).
• El consumo de alimento se determinó solo para la fase previa al inicio (d-5 a d9). Los lechones tratados con la formulación de la invención tuvieron un mayor consumo de alimento durante el periodo de destete en comparación con los lechones que recibieron colistina en el alimento (Tabla 5).
Tabla 5. Consumo de alimento (g) durante la fase previa al inicio
Figure imgf000011_0001
• La tasa de conversión alimenticia (FCR) se determinó solo para la fase previa al inicio (d-5 a d9). Los lechones tratados con la formulación de la invención sola tuvieron mejor FCR (1.82) (P < 0.009) que todos los demás grupos (Tabla 5). Los lechones tratados con la formulación de la invención tuvieron una mejora del 33 % con respecto a los lechones tratados con colistina (2.71). A pesar de que los lechones tratados con la formulación de la invención tenían un menor consumo de alimento que los cerdos no tratados (Tabla 5), aún tenían una mejora del 7 % en FCR con respecto a los cerdos no tratados (1.96) (Tabla 6). Estos resultados de rendimiento muestran que la formulación de la invención tiene una ventaja significativa sobre la colistina en el alimento.
Tabla 6. Tasa de conversión alimenticia durante la fase previa al inicio por grupo
Figure imgf000012_0001
El efecto negativo de la colistina en la FCR puede deberse a su efecto adverso sobre la flora intestinal y, así, un efecto negativo sobre el estado de salud y la nutrición del intestino de los cerdos.
Conclusión: La formulación de la invención mejoró las ganancias de peso de los lechones y mejoró las tasas de conversión alimenticia.
Ejemplo 3. Filipinas (lechones no destetados o lechones lactantes)
Antecedentes: Esta granja en Filipinas tiene una alta tasa de mortalidad debido a la diarrea.
Objetivo: El objetivo de este estudio fue comparar la eficacia de la formulación de la invención con antibióticos en lechones no destetados.
Resumen del estudio: Este estudio fue un ensayo sobre el terreno aleatorio en que se compararon dos grupos de lechones. Dado que la tasa de mortalidad en esta granja es muy alta, no hay un control negativo (grupo no medicado). Los grupos de prueba (n = 38 por grupo) fueron 1) la formulación de la invención (2 dosis) y 2) antibióticos (administrados por vía oral cada 3 días). Los lechones recibieron la formulación de la invención a los 3 días de edad. Se administró una dosis de seguimiento a los 6 días de edad.
Resultados
Parámetros clínicos
• Hubo pocas muertes por diarrea en este estudio. Pero hubo muertes significativamente más bajas del 5 % (por todas las causas) en el grupo tratado con la formulación de la invención. La tasa de mortalidad fue del 21 % en los lechones que recibieron antibióticos (P < 0.05).
Parámetros de rendimiento
• Al destete, los lechones que recibieron la formulación de la invención pesaron 0.1 kg más que los lechones tratados con antibióticos. Dado que no hubo controles negativos en este estudio, se desconoce si la formulación de la invención había producido un aumento de peso con respecto a los cerdos no tratados, como se observó en otros ensayos sobre el terreno.
Ejemplo 4. Australia (lechones no destetados o lechones lactantes)
Objetivo: El objetivo de este estudio fue investigar la eficacia de la formulación de la invención (2 ml) en la reducción de la mortalidad y morbilidad de los lechones en una granja australiana con antecedentes de diarrea previa al destete (lechón).
Resumen del estudio: El estudio se realizó en una pocilga comercial ubicada en el norte de Victoria, Australia. Esta granja tiene un historial de problemas con la diarrea previa al destete que generalmente ocurre a los 3-4 días después del nacimiento. Las muestras fecales obtenidas de la granja en el mes anterior al estudio indicaron que la diarrea se debió a una infección combinada de E. coli (K99, genes de la toxina STa) y rotavirus. Los enfoques actuales, como las vacunas y los antibióticos, no han logrado controlar adecuadamente el problema.
Este estudio fue un ensayo sobre el terreno aleatorizado, con ocultación, comparativo con placebo en que se compararon dos grupos paralelos de lechones. Ni al agricultor ni a los trabajadores agrícolas se les hacen saber los tratamientos asignados.
A 21 camadas (233 lechones) se les administró la formulación de la invención (2 ml) a los 2 días de edad (Grupo 1), mientras que 23 camadas (229 lechones) recibieron un placebo (Grupo 2).
Cada grupo contenía camadas de primerizas iguales (o madres primerizas).
Se permitió que continuaran las rutinas de manejo habituales de la granja, incluidos los medicamentos habituales, como vacunas para cerdas, antibióticos y coccidiostáticos, así como el intercambio de lechones, donde los lechones pequeños o los de mal estado de salud pueden trasladarse a otra cerda.
El ensayo fue realizado por veterinarios independientes e investigadores del Centro de Especialistas en Cerdos del Departamento de Desarrollo Económico, Empleos, T ransporte y Recursos de Victoria. El análisis estadístico apropiado lo determinó y aplicó un especialista en biometría independiente.
En el ensayo se investigó la incidencia de muerte y diarrea, la morbilidad (o el estado clínico de los lechones), así como las ganancias de peso y la ganancia de peso diaria media (GMD) entre los 2 y los 21 días de edad. Los lechones se supervisaron diariamente en cuanto a diarrea y signos de cualquier otra enfermedad. Una vez que los lechones mostraron signos de diarrea, se registraron sus números de identificación, la consistencia fecal y el estado general de los lechones usando el sistema de puntuación descrito en la Tabla 2.
Cualquier lechón que se encontrara fuertemente deprimido fue sacrificado por razones humanitarias. Los lechones sacrificados o encontrados muertos durante el ensayo fueron sometidos a necropsia dentro de las 12 horas posteriores a la muerte.
Análisis de los datos
Hubo 21-23 repeticiones de los dos tratamientos puestos aleatoriamente en un cobertizo.
Una camada de lechones en un corral es la unidad experimental.
El análisis estadístico apropiado lo determinó y aplicó un especialista en biometría independiente.
Las puntuaciones medias máximas de diarrea y las puntuaciones de morbilidad por corral se analizaron en un análisis de varianza (ANOVA) de una vía después del loge 0.05 transformado para estabilizar varianzas. La GMD para todos los lechones no fue adecuado para ANOVA porque los residuos no se distribuyeron normalmente ni fueron homogéneos en el intervalo de valores ajustados; así que se usó la prueba no paramétrica (distribución libre) de Kruskal-Wallis.
Las mortalidades y las incidencias de diarrea y morbilidad se analizaron mediante regresión binaria exacta, adecuada para tamaños de celda pequeños. Se usaron pruebas de significancia de dos colas.
Los ANOVA y la prueba de Kruskal Wallis se realizaron usando R versión 2.7.2 (2008). La Fundación R para la Computación Estadística. La regresión binaria exacta se realizó con StatExact (Cytel Statistical Software, Cytel Software Corporation, MA, EE. UU.).
Resultados
Parámetros clínicos
El estudio se diseñó como un estudio profiláctico, en el que la formulación de la invención se iba a administrar a los lechones antes del inicio previsto de la diarrea. Sin embargo, antes de la administración del producto, la diarrea era evidente en 59 de 462 lechones (el 12.8 %). A pesar de que la diarrea comenzó antes de lo esperado, todos los lechones se incluyeron en el estudio y no hubo exclusiones.
En la tabla 7 se muestra el número de mortalidades predestete en ambos grupos por todas las causas. La formulación de la invención redujo significativamente la mortalidad de los lechones en un 47.8 % (p < 0.02). De los lechones tratados con la formulación de la invención, 19 de 233 lechones (8.2 %) murieron en comparación con 36 de 229 lechones (15.7 %) que murieron en el grupo de control.
Tabla 7. Mortalidad predestete (por todas las causas)
Figure imgf000013_0001
La principal causa de muerte de los lechones en este estudio (81.8 %) se diagnosticó como diarrea y retraso del desarrollo según los resultados de la autopsia.
Etiología
Se recogieron muestras de 24 lechones de menos de 7 días de edad. En este estudio no se identificó ningún patógeno predominante. Veintitrés muestras fecales se sometieron a cultivo (aerobios y anaerobios) para aislar posibles causas bacterianas de la diarrea (E. co liy clostridios). Un lechón tratado con la formulación de la invención dio positivo por E. coli no hemolítica (STa positivo), y se obtuvieron dos aislamientos de E. coli hemolíticas (K88) de dos lechones del grupo Control. Uno de estos lechones de Control tenía una coinfección con E. coli no hemolítica (K88). No se aisló Clostridia spp. 9 de 21 muestras fecales (el 42.8 %) dieron positivo o débilmente positivo mediante ELISA para rotavirus (IDEXX Rota-Corona-K99, IDEXX Montpellier SAS, Francia). Sin embargo, ninguna de las 7 muestras fue positiva en el RTPCR de rotavirus, ni hubo lesiones intestinales indicativas de infecciones por rotavirus.
Una alta proporción de 26/53 (49%) de los lechones a los que se les realizó la autopsia tenían el estómago vacío, lo que sugiere que la diarrea / retraso del desarrollo presente en esta granja podría atribuirse a una ingesta inadecuada de calostro y leche en los lechones, lo que lleva a una ingesta nutricional subóptima en los lechones y escasa protección lactogénica.
Morbilidad
La formulación de la presente invención también redujo la morbilidad grave o las enfermedades posiblemente mortales (puntuación 4). De los lechones que tenían una enfermedad posiblemente mortal o que se consideraban moribundos, 36 de los 38 lechones de control murieron, en comparación con 19 de los 28 lechones que estaban moribundos en el grupo tratado con la formulación de la invención.
Parámetros de rendimiento
En la Tabla 8 se muestra la media aritmética y el intervalo de las ganancias de peso (desde el día de tratamiento, el Día 2 hasta el Día 21) y la ganancia de peso diaria media (GMD) para ambos grupos.
Tabla 8. Ganancias de peso y GMD desde el Día 2 hasta el destete a los 21 días.
Figure imgf000014_0001
La formulación de la invención aumentó la ganancia de peso y la ganancia de peso diaria media en un 5.7 % (o 224 g por lechón) y un 5.6 %. Pero estas ganancias no fueron estadísticamente significativas (p = 0.49) a nivel de camada (pero fueron significativas a nivel de lechón individual, p < 0.04).
Discusión y conclusión
Los resultados de este estudio sugieren que la formulación de la presente invención se puede usar para reducir la mortalidad antes del destete en granjas que tienen problemas de diarrea / retraso del crecimiento de etiología no específica.
El retraso del crecimiento y la falta de crecimiento son una de las principales causas de muerte entre los lechones en la primera semana de vida. Los lechones que no ingieren calostro en las primeras 24 horas después del nacimiento corren el riesgo de morir prematuramente como resultado de aplastamiento por parte de la cerda o exposición debido a una ingesta calórica inadecuada. A diferencia de los bebés humanos, no se transfieren anticuerpos a los lechones a través de la placenta de la cerda. Entonces, sin anticuerpos maternos, el lechón es altamente susceptible a la infección. Si sobreviven los primeros días, pero continúan teniendo una ingesta inadecuada de leche, es más probable que los lechones sucumban a enfermedades infecciosas debido a la baja inmunidad lactogénica (de anticuerpos de la leche y factores inmunitarios en la leche de la cerda) en comparación con sus compañeros de camada más robustos. Aquellos que no logran mantener una ingesta adecuada de leche, ya sea por una producción deficiente de leche por parte de la cerda o por un bajo consumo por parte del lechón, tienen más probabilidades de sucumbir a una muerte prematura debido a la incapacidad de competir con sus compañeros de camada o a una enfermedad infecciosa más adelante en la vida.
En este estudio, la formulación de la invención redujo a la mitad la tasa de mortalidad antes del destete entre lechones lactantes en una granja comercial. Parecería que su modo de acción consistía en mejorar el vigor y, por lo tanto, la capacidad de supervivencia de los lechones moribundos en la primera semana de vida. Esto se demuestra por la menor proporción (45.2 %) de lechones tratados con la formulación de la invención que fueron clasificados como clínicamente moribundos que murieron o tuvieron que ser sacrificados, en comparación con el 76.6 % en el grupo de control en la misma categoría clínica.
Los lechones tratados con la formulación de la invención crecieron un 5.7 % más rápido que los lechones del grupo de control. Aunque esta diferencia de aumento de peso no fue significativa, esto equivale a una diferencia de aproximadamente 225 g en el peso vivo al destete. El peso al destete se asocia positivamente con el posterior crecimiento y supervivencia de los lechones.
Resumen
Dada la descripción de la invención en la presente memoria, se pueden hacer fácilmente ciertas variantes y alternativas. Por ejemplo, la formulación de la Tabla 1 proporciona una dosificación adecuada para el tratamiento profiláctico de un lechón lactante para prevenir la diarrea. El uso para tratar (en lugar de prevenir) la diarrea puede requerir una dosis diferente; el operario podría obtener fácilmente la dosis apropiada. De manera similar, el uso para tratar un cerdo adulto maduro o un ser humano puede requerir una dosis mayor; el operario podría obtener fácilmente la dosis apropiada.
Se puede proporcionar la formulación de la invención como una solución oral, por ejemplo, como un polvo granulado que requiere reconstitución con agua. Para prevenir la diarrea posterior al destete, la formulación de la invención puede administrarse en una sola dosis oral de 4 ml (0.24 g) el día del destete (1 -2 días antes de la aparición esperada de la diarrea). Para prevenir la diarrea previa al destete, se puede administrar una dosis oral única de 2 ml (0.12 g) a los 2-5 días de edad, según el periodo de problemas de la granja en particular. Es posible que se requiera una dosis repetida 3-7 días después. Como tratamiento, la formulación de la presente invención puede administrarse (ya sean 2 ml o 4 ml) inmediatamente cuando se presenten los síntomas de la enfermedad.
Se puede proporcionar la formulación de la invención como un aditivo para alimento, por ejemplo, preparado como un polvo granulado que se puede añadir al alimento para cerdos. Para asegurar una dispersión completa del producto, primero debe mezclarse con una cantidad adecuada de ingredientes del alimento antes de incorporarlo a la mezcla final. La formulación de la invención puede administrarse como una premezcla únicamente o la premezcla puede incorporarse a la mezcla final. La dosis recomendada es de 40 mg de la formulación de la invención por kilo de peso corporal administrado diariamente durante 14 días consecutivos.
También se puede administrar la formulación de la invención en agua a través de sistemas de bebida. Alternativamente, se puede usar bromelaína para hacer una solución oral equivalente, formulada con excipientes y que requiera reconstitución en líquido. Para prevenir la diarrea posterior al destete, se puede administrar como una sola dosis oral (125 mg) el día del destete (1-2 días antes del inicio esperado de la diarrea). Para prevenir la diarrea previa al destete, se puede administrar una dosis oral única de 62.5 mg a los 2-5 días de edad, según el periodo problemático de una granja en particular. Es posible que se requiera una dosis repetida de 3 a 7 días después. Como tratamiento, se puede administrar (ya sean 62.5 mg o 125 mg) inmediatamente cuando se presenten los síntomas de la enfermedad.
Alternativamente, se puede usar bromelaína para hacer un aditivo alimentario equivalente, por ejemplo, como un polvo que se puede agregar al alimento para cerdos. Para asegurar una dispersión completa del producto, primero debe mezclarse con una cantidad adecuada de ingredientes del alimento antes de incorporarlo a la mezcla final. Puede alimentarse solo como premezcla o incorporar la premezcla en la mezcla final. La dosis recomendada es de 20 mg de bromelaína por kilo de peso corporal administrados diariamente durante 14 días consecutivos.
Alternativamente, la formulación de la presente invención se puede proporcionar como tabletas y cápsulas, y otras formas farmacéuticas apropiadas para seres humanos.
El experto en la materia puede ajustar la formulación de la presente invención para diferentes indicaciones. Por ejemplo, puede usarse para la prevención y el tratamiento de la diarrea en animales de producción (bovinos, porcinos, etc.) y diarrea en seres humanos. También se puede usar para mejorar el estado de salud del intestino al reducir la inflamación. Alternativamente, se puede formular para promover una mayor ingesta de alimento en los animales de producción, promoviendo, así, ganancias de peso y eficacia de conversión alimenticia. Puede usarse para reducir el requerimiento de antibióticos en la alimentación animal y para la administración en dosis única a seres humanos. También se puede usar para mejorar la enfermedad inflamatoria intestinal en seres humanos.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Una formulación veterinaria oral que comprende una cantidad eficaz antidiarreica de bromelaína, en donde la formulación comprende un emulsionante en una cantidad eficaz para mejorar la solubilidad de dicha bromelaína en agua,
en donde el emulsionante comprende lecitina, y
en donde la formulación comprende además ácido cítrico.
2. La formulación veterinaria oral de la reivindicación 1, que comprende además carboximetilcelulosa sódica y EDTA, en donde la formulación es una suspensión acuosa.
3. La formulación veterinaria oral de la reivindicación 1, en donde la formulación comprende 53.1-74.7 % en peso de bromelaína, 22-36 % en peso de carboximetilcelulosa sódica, 4-12.7 % en peso de ácido cítrico anhidro 3-7.9 % en peso de aceite de lecitina y 0.7-1.6 % en peso de EDTA, y en donde la formulación es un polvo suelto.
4. La formulación veterinaria oral de la reivindicación 1 o 3, en donde la formulación comprende 62.5-88.4 mg de bromelaína, 25.9-42.4 mg de carboximetilcelulosa sódica, 4.7-14.96 mg de ácido cítrico anhidro, 3.5-9.3 mg de aceite de lecitina y 0.8-1.9 mg de EDTA por dosis unitaria, y en donde la formulación es un polvo suelto.
5. Una formulación veterinaria oral que comprende la formulación veterinaria oral según la reivindicación 3 o 4 suspendida en agua.
6. La formulación veterinaria oral según cualquiera de las reivindicaciones 3-5 para usar en un método para reducir la probabilidad de diarrea en lechones, comprendiendo el método administrar al lechón una dosis única de una cantidad terapéuticamente eficaz de la formulación veterinaria oral.
7. La formulación veterinaria oral según cualquiera de las reivindicaciones 3-5 para usar en un método para el tratamiento de la diarrea en una población de lechones, comprendiendo el método administrar a cada lechón en la población de lechones, una dosis única de una cantidad terapéuticamente eficaz de la formulación veterinaria oral.
8. Una formulación veterinaria oral para usar en un método para tratar la diarrea en un lechón, en donde la formulación veterinaria oral comprende una cantidad eficaz antidiarreica de bromelaína y un emulsionante en una cantidad eficaz para mejorar la solubilidad de dicha bromelaína en agua, en donde el emulsionante comprende lecitina, y en donde la formulación comprende además ácido cítrico, y en donde el lechón está destetado o no destetado.
9. La formulación veterinaria oral para el uso según la reivindicación 8, que comprende además carboximetilcelulosa sódica y EDTA, en donde la formulación es una suspensión acuosa.
10. La formulación veterinaria oral para el uso según la reivindicación 8, en donde la formulación comprende 53.1-74.7 % en peso de bromelaína, 22-36 % en peso de carboximetilcelulosa sódica, 4-12.7 % en peso de ácido cítrico anhidro, 3­ 7.9 % en peso de aceite de lecitina y 0.7-1.6 % en peso de EDTA, y en donde la formulación es un polvo suelto.
11. La formulación veterinaria oral para el uso según la reivindicación 8 o 10, en donde la formulación comprende 62.5-88.4 mg de bromelaína, 25.9-42.4 mg de carboximetilcelulosa sódica, 4.7-14.96 mg de ácido cítrico anhidro, 3.5­ 9.3 mg de aceite de lecitina y 0.8-1.9 mg de EDTA por dosis unitaria, y en donde la formulación es un polvo suelto.
12. Una formulación veterinaria oral para usar en un método para tratar la diarrea en un lechón, en donde la formulación veterinaria oral comprende una cantidad eficaz antidiarreica de bromelaína y un emulsionante en una cantidad eficaz para mejorar la solubilidad de dicha bromelaína en agua, y en donde el lechón está no destetado o destetado, y en donde la formulación comprende la formulación veterinaria oral según la reivindicación 11 o 12 suspendida en agua.
13. La formulación veterinaria oral para el uso según cualquiera de las reivindicaciones 10-12, en donde el método comprende administrar al lechón una dosis única de una cantidad terapéuticamente eficaz de la formulación veterinaria oral.
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