ES2938511T3

ES2938511T3 - Microscopía de iluminación estructurada con exploración de líneas

Info

Publication number: ES2938511T3
Application number: ES19743697T
Authority: ES
Inventors: Minghao Guo
Original assignee: Illumina Inc
Current assignee: Illumina Inc
Priority date: 2018-01-24
Filing date: 2019-01-22
Publication date: 2023-04-12
Anticipated expiration: 2039-01-22
Also published as: TW201940877A; AU2019211234B2; LT3628066T; EP3628066B1; BR112019027629A2; KR20200021472A; CN111094933A; DK3628066T3; FI3628066T3; US20190226992A1; BR112019027629B1; NL2020623B1; TWI697672B; TW202045923A; CA3066382C; MY198873A; US10928322B2; IL271090A; EP3628066A4; CN111094933B

Abstract

Se describen técnicas para reducir el número de ángulos necesarios en imágenes de iluminación estructurada de muestras biológicas mediante el uso de celdas de flujo estampadas, donde los nanopocillos de las celdas de flujo estampadas se disponen, por ejemplo, en una matriz cuadrada o asimétrica. En consecuencia, se reduce el número de imágenes necesarias para resolver detalles de las muestras biológicas. También se describen técnicas para combinar imágenes de iluminación estructurada con escaneo de línea usando las celdas de flujo estampadas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Microscopía de iluminación estructurada con exploración de líneas

Antecedentes

Numerosos avances recientes en el estudio de la biología se han beneficiado de métodos mejorados para el análisis y secuenciación de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el Proyecto Genoma Humano ha determinado la secuencia completa del genoma humano que, se espera, conducirá a descubrimientos adicionales en campos que varían del tratamiento de la enfermedad a los avances en la ciencia básica. Recientemente se han informado varias tecnologías de secuenciación de ADN nuevas que se basan en el análisis masivo en paralelo de moléculas individuales no amplificadas o amplificadas, ya sea en forma de matrices planas o en perlas.

La metodología usada para analizar la secuencia de los ácidos nucleicos en tales nuevas técnicas de secuenciación a menudo se basa en la detección de nucleótidos u oligonucleótidos fluorescentes. La microscopía de iluminación estructurada (SIM) describe una técnica de secuenciación de este tipo mediante la cual puede usarse luz estructurada espacialmente (es decir, con patrón) para obtener imágenes de una muestra para aumentar la resolución lateral del microscopio en un factor de dos o más. Durante la obtención de imágenes de la muestra, las imágenes de la muestra pueden adquirirse en diversas fases de patrón (por ejemplo, a 0°, 120° y 240 o), repitiéndose el procedimiento girando la orientación de patrón alrededor del eje óptico (por ejemplo, en 60° y 120°). Las imágenes capturadas (por ejemplo, nueve imágenes, una imagen para cada ángulo de orientación en cada fase de patrón) pueden ensamblarse en una única imagen que tiene un ancho de banda de frecuencias espaciales extendido. La única imagen puede retransformarse en espacio real para generar una imagen que tiene una resolución más alta que la que normalmente el microscopio puede resolver.

En implementaciones típicas de sistemas de SIM, un haz de luz polarizada linealmente se dirige a través de una rejilla de difracción óptica que difracta el haz en dos o más órdenes separados que pueden proyectarse en la muestra de la que se han obtenido imágenes como un patrón de franjas de interferencia sinusoidal. En estas implementaciones, la orientación del patrón de rejilla de difracción óptica proyectado se controla girando la rejilla de difracción óptica alrededor del eje óptico, mientras que la fase del patrón se ajusta moviendo la rejilla de difracción óptica lateralmente a través del eje. En tales sistemas, la rejilla de difracción óptica está montada en una platina de traslación, que a su vez está montada en una platina de rotación. Adicionalmente, tales sistemas usan un polarizador lineal para polarizar la luz emitida por la fuente de luz antes de recibirse en la rejilla.

La figura 1A ilustra un ejemplo de una muestra 100 y un patrón 102 de rejilla de difracción óptica proyectado sobre la muestra 100. Aunque la muestra 100 puede comprender frecuencias espaciales más altas que no pueden resolverse, el patrón 102 de rejilla de difracción óptica superpuesto que tiene una frecuencia espacial más baja conocida en la muestra 100 da como resultado franjas de Moiré. Esto mueve de manera eficaz las frecuencias espaciales más altas que no pueden resolverse a frecuencias espaciales más bajas que pueden resolverse mediante un microscopio. Tal como se describió anteriormente, capturar imágenes de una muestra 100 con diferentes orientaciones/ángulos y fases del patrón 102 de rejilla de difracción óptica en relación con la muestra 100, da como resultado imágenes que pueden combinarse en una única imagen que se retransforma en espacio real para generar una imagen que tiene una mayor resolución.

El documento WO 2013/064843 A1 describe un soporte para un portamuestra de microscopio que comprende una rejilla de difracción para formar un patrón de iluminación en el mismo. Las rejillas descritas son cuadradas o triangulares. El documento US 2015/260978 A1 se enfoca en microscopía de alta resolución por medio de iluminación estructurada a grandes distancias de trabajo, en donde una serie de imágenes de una muestra se capturan en una pluralidad de posiciones relativas diferentes de la muestra con respecto al patrón de iluminación proyectado sobre la muestra.

Resumen

Los ejemplos de sistemas y métodos descritos en el presente documento se refieren a técnicas para reducir el número de imágenes y dimensiones necesarias para resolver muestras fluorescentes usando SIM a través de celdas de flujo particularmente con patrón, y el aprovechamiento del movimiento del haz de luz en relación con las muestras fluorescentes para lograr una implementación de SIM que pueda usarse con técnicas de exploración de líneas.

Según una implementación, un método de obtención de imágenes de una muestra biológica comprende dirigir la luz a través de una rejilla de difracción óptica estacionaria, en donde la luz comprende luz en al menos dos longitudes de onda emitidas desde dos fuentes de láser respectivas de manera pulsada, y proyectar un patrón de rejilla de difracción óptica generado por la luz que se dirige a través de la rejilla de difracción óptica estacionaria en la muestra biológica. El método comprende además someter a exploración de líneas la muestra biológica y mover la muestra biológica en relación con el patrón de rejilla de difracción óptica. Aún más, el método comprende reconstruir una imagen de alta resolución representativa de la muestra biológica. La muestra biológica está contenida en una pluralidad de nanopocillos alargados de una celda de flujo con patrón.

En algunos ejemplos, la luz comprende luz en longitudes de onda de color rojo y verde emitida a partir de dos fuentes de láser respectivas. En algunos ejemplos, la exploración de líneas de la muestra biológica comprende capturar una imagen de una porción de la muestra biológica tras la excitación de las dos fuentes de láser dando como resultado la iluminación de la muestra biológica.

En algunas implementaciones, el movimiento de la muestra biológica en relación con el patrón de rejilla de difracción óptica o el movimiento de la luz en relación con el patrón de rejilla de difracción óptica genera una pluralidad de desplazamientos de fase del patrón de rejilla de difracción óptica.

En algunas implementaciones, la pluralidad de desplazamientos de fase comprende al menos tres desplazamientos de fase del patrón de rejilla de difracción óptica.

En algunas implementaciones, el patrón de rejilla de difracción óptica comprende una pluralidad de franjas longitudinales orientadas al menos de manera sustancialmente perpendicular a la pluralidad de nanopocillos alargados. La información representativa de la muestra biológica a lo largo de un primer eje de la celda de flujo puede resolverse de acuerdo con un aumento de resolución basado en una frecuencia espacial creada por una combinación de la pluralidad de nanopocillos alargados que comprende la celda de flujo y el patrón de rejilla de difracción óptica. La información representativa de la muestra biológica a lo largo de un segundo eje que es al menos sustancialmente perpendicular al primer eje puede resolverse de acuerdo con una resolución no aumentada.

En algunos ejemplos, el patrón de rejilla de difracción óptica comprende una pluralidad de franjas longitudinales orientadas al menos sustancialmente en paralelo a la pluralidad de nanopocillos alargados. La exploración de líneas puede realizarse a lo largo de una dirección alineada con la pluralidad de nanopocillos alargados.

En algunas implementaciones, la exploración de líneas de la muestra biológica comprende una exploración de líneas de integración de retardo de la muestra biológica.

Según otra implementación, un sistema comprende al menos dos fuentes de láser que emiten haces de luz en al menos dos longitudes de onda, respectivamente, de una manera pulsada, y una rejilla de difracción óptica estacionaria adaptada para generar un patrón de rejilla de difracción óptica al pasar los haces de luz emitidos a través de la rejilla de difracción óptica estacionaria. Además, el sistema comprende un conjunto de exploración de líneas para: mover una muestra biológica en relación con el patrón de rejilla de difracción óptica; capturar una pluralidad de imágenes representativas de porciones de la muestra biológica; y reconstruir una imagen de alta resolución representativa de la muestra biológica basándose en la pluralidad de imágenes. El sistema comprende además una celda de flujo con patrón que incluye una pluralidad de nanopocillos alargados que contienen la muestra biológica.

En algunos ejemplos, el conjunto de exploración de líneas comprende al menos dos cámaras, teniendo cada una al menos un sensor de imágenes adaptado para detectar la muestra biológica fluorescente. El movimiento de la muestra biológica en relación con el patrón de rejilla de difracción óptica o el movimiento de las al menos dos fuentes de láser puede generar una pluralidad de desplazamientos de fase del patrón de rejilla de difracción óptica. La pluralidad de desplazamientos de fase puede comprender al menos tres desplazamientos de fase del patrón de rejilla de difracción óptica. El patrón de rejilla de difracción óptica comprende una pluralidad de franjas longitudinales orientadas en relación con la pluralidad de nanopocillos alargados.

En algunos ejemplos, el conjunto de exploración de líneas captura la pluralidad de imágenes representativas de las porciones de la muestra biológica a lo largo de una dirección alineada con la pluralidad de nanopocillos alargados. En algunos ejemplos, el conjunto de exploración de líneas captura cada una de la pluralidad de imágenes representativas de las porciones de la muestra biológica tras la excitación de las al menos dos fuentes de láser dando como resultado fluorescencia de la muestra biológica.

Debe tenerse en cuenta que todas las combinaciones de los conceptos anteriores y conceptos adicionales descritos en mayor detalle a continuación (siempre que tales conceptos no sean mutuamente contradictorios) se contemplan como parte del objeto de la invención descrito en el presente documento. En particular, todas las combinaciones del objeto reivindicado que aparecen al final de esta descripción se contemplan como parte del objeto de la invención descrito en la presente memoria.

Otras características y aspectos de la tecnología descrita resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, tomada junto con los dibujos adjuntos, que ilustran, a modo de ejemplo, las características según las implementaciones de la tecnología descrita. El resumen no pretende limitar el alcance de cualquiera de las invenciones descritas en el presente documento, que se definen por las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

La presente descripción, según una o más de diversas implementaciones, se describe en detalle con referencia a las siguientes figuras. Las figuras se proporcionan únicamente con fines ilustrativos y simplemente representan implementaciones típicas o de ejemplo.

La figura 1A ilustra un ejemplo de iluminación estructurada que se usa para reducir el patrón de frecuencias de una muestra permitiendo una mayor resolución.

La figura 1B ilustra, en un ejemplo, el número de ángulos necesarios para resolver una muestra para la obtención de imágenes.

La figura 2 ilustra un ejemplo de un sistema de obtención de imágenes por iluminación estructurada.

La figura 3A ilustra un ejemplo no reivindicado de un patrón de celda de flujo hexagonal.

La figura 3B ilustra un ejemplo no reivindicado de un patrón de celda de flujo de matriz cuadrada, cuyo uso da como resultado una obtención de imágenes por iluminación estructurada de dimensionalidad reducida.

La figura 3C ilustra un ejemplo de un patrón de celda de flujo de matriz asimétrica según la invención, cuyo uso da como resultado una obtención de imágenes por iluminación estructurada de dimensionalidad reducida.

La figura 4 es un diagrama de flujo que ilustra operaciones de ejemplo que pueden implementarse para la obtención de imágenes por iluminación estructurada de dimensionalidad reducida.

La figura 5 ilustra un ejemplo de un sistema de obtención de imágenes por exploración de líneas.

Las figuras 6A-6C ilustran, en un ejemplo, desplazamiento de fase de un patrón de iluminación estructurada en una dimensión.

La figura 6D ilustra un ejemplo de una celda de flujo con patrón asimétrico que tiene diferentes porciones que se superponen simultáneamente con patrones de iluminación estructurada con cambio de fase. La figura 7 ilustra un ejemplo de una operación de exploración de líneas usando una celda de flujo con patrón convencional.

La figura 8 ilustra un ejemplo de un sistema de obtención de imágenes por exploración de líneas que usa un patrón de iluminación estructurada estacionaria.

La figura 9 ilustra un ejemplo de una operación de exploración de líneas que usa un patrón de iluminación estructurada estacionaria que modula un haz de luz de iluminación.

La figura 10 es un diagrama de flujo que ilustra ejemplos de operaciones que pueden implementarse para la obtención de imágenes por iluminación estructurada de dimensionalidad reducida usada junto con la obtención de imágenes por exploración de líneas.

La figura 11 ilustra un ejemplo de componente informático que puede usarse para implementar diversas características de implementaciones descritas en la presente descripción.

Las figuras no son exhaustivas y no limitan la presente descripción a la forma precisa descrita.

Descripción detallada

Tal como se usa en el presente documento para referirse a la luz difractada emitida por una rejilla de difracción, el término “orden” o “ número de orden” pretende significar el número de longitudes de onda enteras que representan la diferencia de longitud de trayectoria de la luz de las hendiduras adyacentes de la rejilla de difracción para la interferencia constructiva. El término “orden cero” o “ máximo de orden cero” pretende referirse a la franja brillante central emitida por una rejilla de difracción en donde no hay difracción. El término “primer orden” pretende referirse a las dos franjas brillantes emitidas a cada lado de la franja de orden cero, donde la diferencia de longitud de trayectoria es ±1 longitudes de onda.

Tal como se usa en el presente documento para referirse a una muestra, el término “ punto” o “característica” pretende significar un punto o zona en un patrón que puede distinguirse de otros puntos o zonas según la ubicación relativa. Un punto individual puede incluir una o más moléculas de un tipo particular. Por ejemplo, un punto puede incluir una única molécula de ácido nucleico diana que tiene una secuencia particular o un punto puede incluir varias moléculas de ácido nucleico que tienen la misma secuencia (y/o secuencia complementaria, de la misma).

Tal como se usa en el presente documento, el término “tesela” se refiere generalmente a una o más imágenes de la misma región de una muestra, donde cada una de las una o más imágenes representa un canal de color respectivo. Una tesela puede formar un subconjunto de datos de obtención de imágenes de un conjunto de datos de obtención de imágenes de un ciclo de obtención de imágenes.

Tal como se usa en el presente documento, el término “plano x-y” pretende significar una zona bidimensional definida por ejes de línea recta x e y en un sistema de coordenadas cartesianas. Cuando se usa en referencia a un detector y un objeto observado por el detector, la zona puede especificarse adicionalmente como ortogonal a la dirección de observación entre el detector y el objeto que va a detectarse. Cuando se usa en el presente documento para referirse a un elemento de exploración de líneas, el término “dirección y” se refiere a la dirección de exploración.

Tal como se usa en el presente documento, el término “coordenada z” pretende significar información que especifica la ubicación de un punto, línea o zona a lo largo de un eje que es ortogonal a un plano x-y. En implementaciones particulares, el eje z es ortogonal a una zona de un objeto que se observa mediante un detector. Por ejemplo, la dirección de enfoque para un sistema óptico puede especificarse a lo largo del eje z.

Tal como se usa en el presente documento, el término “explorar una línea” pretende significar detectar una sección transversal bidimensional en un plano x-y de un objeto, siendo la sección transversal rectangular u oblonga, y provocar un movimiento relativo entre la sección transversal y el objeto. Por ejemplo, en el caso de la obtención de imágenes de fluorescencia, puede excitarse específicamente una zona de un objeto que tiene forma rectangular u oblonga (en la exclusión de otras zonas) y/o puede adquirirse específicamente la emisión de la zona (en la exclusión de otras zonas) en un punto de tiempo dado en la exploración.

Las implementaciones descritas en el presente documento se refieren a celdas de flujo configuradas para tener patrones cuadrados o asimétricos. Recordar que la SIM se basa en luz espacialmente estructurada (es decir, con patrón) para obtener imágenes de una muestra para aumentar la resolución lateral del microscopio en un factor de dos o más. También recordar que tradicionalmente, las imágenes de la muestra en múltiples fases de patrón y múltiples orientaciones/ángulos se usan para lograr el aumento deseado en la resolución lateral.

La figura 1B ilustra generalmente, en un ejemplo, la región observable del espacio recíproco producido por un objetivo de microscopio (que es análogo a su patrón de difracción) y cómo está limitada en los bordes por las frecuencias espaciales más altas que el objetivo puede transmitir (2NA/A (gráfico 120). Tal como se ilustra, un punto central representa el componente de orden cero. Los componentes de difracción de orden cero y de primer orden que representan un patrón de líneas paralelas se ilustran en el gráfico 122. Si las separaciones de patrón se encuentran en los límites de resolución, los puntos de primer orden se producen en el borde del campo observable (en el contorno inactivado). Debido al mezclado de frecuencias, las regiones observables también contienen, además de la imagen normal de frecuencias espaciales (círculo central), dos nuevas imágenes de frecuencia de desfase (gráfico 124) que están centradas en el borde del campo original. Estas imágenes de desfase contienen frecuencias espaciales más altas que no son observables usando microscopios convencionales. Tal como se ilustra en el gráfico 126, un conjunto de imágenes preparadas a partir de tres fases en orientaciones de 120°, en última instancia después del procesamiento, producen una imagen real que contiene dos veces la resolución espacial como puede observarse en microscopía de fluorescencia de campo amplio.

Sin embargo, al configurar las celdas de flujo para tener patrones cuadrados o asimétricos (en lugar de patrones hexagonales, por ejemplo), se necesitan menos imágenes para lograr el mismo aumento en la resolución lateral. Es decir, las celdas de flujo que tienen patrones cuadrados o asimétricos de nanopocillos permiten que el eje/ejes de una celda de flujo que tiene un paso más estrecho (es decir, la distancia entre los nanopocillos inmediatamente adyacentes) y que implica una mayor resolución, para alinearse con el eje/ejes cuya resolución va a aumentarse. En un ejemplo de una celda de flujo con patrón cuadrado, sólo se necesita una mayor resolución con respecto a dos ejes. Por tanto, sólo se necesitan seis imágenes (una imagen en cada uno de dos ángulos a través de tres fases). En el caso de una celda de flujo con patrón asimétrico, sólo se necesitan tres imágenes de una muestra para lograr una mayor resolución (una imagen en un ángulo en tres fases).

Al reducir el número de ángulos necesarios para resolver una muestra en el grado deseado, se reduce el número de imágenes necesarias para completar la obtención de imágenes de la muestra. Por ejemplo, en el contexto de la química de 4 colorantes, un sistema puede necesitar adquirir 36 imágenes con el fin de generar 4 imágenes para la llamada de base (explicada a continuación). También puede reducirse la cantidad de espacio de almacenamiento (por ejemplo, disco) necesaria para almacenar o almacenar en caché las imágenes capturadas. Además, también puede reducirse el procesamiento y/o la potencia computacional necesarios para ensamblar las imágenes en una única imagen, y luego retransformar/reconstruir esa única imagen en una que tenga la resolución deseada.

Aún más, las implementaciones convencionales de SIM son incompatibles con los sistemas de secuenciación que utilizan técnicas de exploración de líneas para obtener imágenes de una muestra. La exploración de líneas puede referirse a usar una línea de píxeles que obtiene una imagen de una celda de flujo línea por línea para construir una imagen continua (en oposición a una cámara o sensor con una matriz bidimensional de píxeles que capturan una imagen fija de un objeto completo, por ejemplo, una celda de flujo). Un tipo particular de exploración de líneas que se presta a sistemas de secuenciación es la exploración de líneas de integración de retardo (TDI).

Con implementaciones SIM de múltiples ángulos, se necesita un campo de visión fijo para adquirir cada una de las combinaciones de imágenes en ángulo/fase. Sin embargo, cuando se toman imágenes con respecto a sólo un único ángulo, como es el caso en implementaciones descritas en el presente documento, donde se usa una celda de flujo con patrón asimétrico como sustrato de muestra, puede usarse exploración de líneas de TDI para capturar imágenes de la muestra que cubre las tres fases de patrones de SIM. Es decir, un patrón de SIM puede moverse en relación con la celda de flujo con patrón asimétrico para generar las tres fases necesarias para resolver la muestra en la celda de flujo con mayor resolución a lo largo de sólo un eje.

En algunas implementaciones, la exploración de líneas de TDI puede usarse junto con técnicas de SIM para obtener imágenes de una muestra usando una cámara o sensor de exploración de líneas de TDI para capturar una imagen a lo largo de una celda de flujo (denominada “ hilera” ). Es decir, la exploración de líneas de TDI puede realizarse en una celda de flujo con patrón con un patrón de SIM en una primera fase. El patrón de SIM puede desplazarse a una segunda fase, y se puede repetir la exploración de líneas de TDI. El patrón de SIM puede desplazarse a una tercera frase, y la exploración de líneas de ^tDⁱpuede repetirse nuevamente. De esta manera, se capturan imágenes de la muestra en cada fase de patrón.

Alternativamente, diferentes porciones de la celda de flujo pueden formar un patrón con diferentes fases del patrón de SIM. Por ejemplo, en una primera porción de la celda de flujo, el patrón de SIM puede ubicarse en una primera posición, en una segunda porción de la celda de flujo, el patrón de SIM puede desplazarse a una segunda posición, y en una tercera porción de la celda de flujo, el patrón de SIM puede desplazarse a una tercera posición. Por tanto, a medida que la cámara o el sensor captura la hilera, las imágenes de la muestra a través de cada una de las tres fases de patrón de SIM se capturan en una única exploración de líneas de TDI.

En todavía otras implementaciones, en lugar de desplazar el patrón de SIM en relación con la muestra/celda de flujo, la muestra/celda de flujo se mueve mientras el patrón de SIM permanece estacionario. Se entiende que la muestra está ubicada/colocada en la celda de flujo, lo que da como resultado que la muestra forme un patrón según los nanopocillos que componen la celda de flujo. Cuando se implementa la exploración de líneas de TDI, tal como se indicó anteriormente, la muestra/celda de flujo ya está en movimiento. Por tanto, este movimiento de la muestra/celda de flujo puede aprovecharse para evitar tener que desplazar el patrón de SIM. Es decir, el movimiento de la muestra/celda de flujo en relación con el patrón de SIM estacionario (dada la orientación apropiada) genera las fases requeridas necesarias para resolver la muestra.

Antes de describir diversas implementaciones de los sistemas y métodos descritos en el presente documento con detalle, es útil describir un ejemplo de entorno con el que pueda implementarse la tecnología descrita en el presente documento. Uno de tales ejemplos de entorno es el de un sistema 200 de obtención de imágenes por iluminación estructurada, ilustrado en la figura 2, que ilumina una muestra con luz estructurada espacialmente. Por ejemplo, el sistema 200 puede ser un sistema de microscopía de fluorescencia de iluminación estructurada que utiliza luz de excitación estructurada espacialmente para obtener imágenes de una muestra biológica.

En el ejemplo de la figura 2, un emisor 250 de luz está configurado para emitir un haz de luz que está colimado por la lente 251 de colimación. La luz colimada se estructura (con patrón) mediante el conjunto 255 óptico de estructuración de luz y se dirige por el espejo 260 dicroico a través de la lente 242 de objetivo a una muestra de un recipiente 210 de muestra, que está posicionado en una platina 270. En el caso de una muestra fluorescente, la muestra emite fluorescencia en respuesta a la luz de excitación estructurada, y la luz resultante se recoge por la lente 242 de objetivo y se dirige a un sensor de imágenes del sistema 240 de cámara para detectar fluorescencia.

El conjunto 255 óptico de estructuración de luz en diversas implementaciones, que se describe adicionalmente a continuación, incluye una o más rejillas de difracción óptica para generar un patrón sinusoidal de luz difractada (por ejemplo, franjas) que se proyecta sobre muestras de un recipiente 210 de muestra. Las rejillas de difracción pueden ser rejillas unidimensionales o bidimensionales transmisoras, reflectantes o de fase. Tal como se describe adicionalmente a continuación con referencia a implementaciones particulares, en el sistema 200 las rejillas de difracción no implican necesariamente una platina de rotación. En algunas implementaciones, las rejillas de difracción pueden fijarse (por ejemplo, no girarse o no moverse linealmente) durante el funcionamiento del sistema de obtención de imágenes. Por ejemplo, en una implementación particular, que se describe adicionalmente a continuación, las rejillas de difracción pueden incluir dos rejillas de difracción transmisoras unidimensionales fijas orientadas sustancialmente o exactamente/perfectamente perpendiculares entre sí (por ejemplo, una rejilla de difracción horizontal y una rejilla de difracción vertical).

Durante cada ciclo de obtención de imágenes, el sistema 200 utiliza el conjunto 255 óptico de estructuración de luz para adquirir una pluralidad de imágenes en diversas fases, desplazadas lateralmente a lo largo del plano de muestra (por ejemplo, a lo largo del plano x-y), con este procedimiento repetido una o más veces girando la orientación del patrón alrededor del eje óptico (es decir, con respecto al plano x-y de la muestra). Las imágenes capturadas pueden entonces reconstruirse espacialmente para generar una imagen de mayor resolución (por ejemplo, una imagen que tiene aproximadamente dos veces la resolución espacial lateral de imágenes individuales).

En el sistema 200, el emisor 250 de luz puede ser un emisor de luz incoherente (por ejemplo, emitir haces de luz emitidos por uno o más diodos de excitación), o un emisor de luz coherente tal como un emisor de salida de luz emitida mediante uno o más láseres o diodos láser. Tal como se ilustra en el ejemplo del sistema 200, el emisor 250 de luz incluye una fibra 252 óptica para guiar un haz óptico a la salida. Sin embargo, pueden usarse otras configuraciones de un emisor 250 de luz. En implementaciones que utilizan iluminación estructurada en un sistema de obtención de imágenes multicanal (por ejemplo, un microscopio de fluorescencia multicanal que utiliza múltiples longitudes de onda de luz), la fibra 252 óptica puede acoplarse ópticamente a una pluralidad de diferentes fuentes de luz (no mostradas), emitiendo cada fuente de luz, luz de una longitud de onda diferente. Aunque el sistema 200 se ilustra como que tiene un único emisor 250 de luz, en algunas implementaciones pueden incluirse múltiples emisores 250 de luz. Por ejemplo, pueden incluirse múltiples emisores de luz en el caso de un sistema de obtención de imágenes por iluminación estructurada que utiliza múltiples brazos, que se analiza adicionalmente a continuación. Por ejemplo, puede emitirse luz correspondiente a diferentes longitudes de onda, tales como de color azul, verde, rojo u otros colores. En algunos ejemplos, puede usarse un emisor/fuente de luz. En algunos ejemplos, pueden usarse dos o más emisores/fuentes de luz.

En algunas implementaciones, el sistema 200 puede incluir una lente 256 de tubo que puede incluir un elemento de lente para articular a lo largo del eje z para ajustar la forma y trayectoria de haz estructurado. Por ejemplo, un componente de la lente de tubo puede articularse para tener en cuenta un intervalo de grosores de muestra (por ejemplo, un grosor de cubreobjeto diferente) de la muestra en el recipiente 210.

En el ejemplo del sistema 200, el módulo o dispositivo 290 de suministro de fluido dirige el flujo de reactivos (por ejemplo, nucleótidos marcados por fluorescencia, tampones, enzimas, reactivos de escisión, etc.) al (y a través del) recipiente 210 de muestra y la válvula 220 de desechos. El recipiente 210 de muestra puede incluir uno o más sustratos sobre los que se proporcionan las muestras. Por ejemplo, en el caso de un sistema para analizar un gran número de secuencias de ácido nucleico diferentes, el recipiente 210 de muestra puede incluir uno o más sustratos en donde los ácidos nucleicos que van a secuenciarse están enlazados, unidos o asociados. El sustrato puede incluir cualquier sustrato o matriz inerte en donde puedan unirse ácidos nucleicos, tales como, por ejemplo, superficies de vidrio, superficies de plástico, látex, dextrano, superficies de poliestireno, superficies de polipropileno, geles de poliacrilamida, superficies de oro y obleas de silicio. En algunas aplicaciones, el sustrato está dentro de un canal u otra zona en una pluralidad de ubicaciones formadas en una matriz o alineamiento a través del recipiente 210 de muestra. El sistema 200 también puede incluir un accionador 230 de estación de temperatura y un calentador/enfriador 235 que puede regular opcionalmente la temperatura de las condiciones de los fluidos dentro del recipiente 210 de muestra.

En implementaciones particulares, el recipiente 210 de muestra puede implementarse como una celda de flujo con patrón que incluye una placa de cubierta translúcida, un sustrato y un líquido contenido entre los mismos, y una muestra biológica puede ubicarse en una superficie interior de la placa de cubierta translúcida o una superficie interna del sustrato. La celda de flujo puede incluir un gran número (por ejemplo, miles, millones o miles de millones o más) de pocillos o regiones que forman un patrón en una matriz definida (por ejemplo, una matriz hexagonal, matriz rectangular, etc.) en el sustrato. Cada región puede formar un agrupamiento (por ejemplo, un agrupamiento monoclonal) de una muestra biológica tal como ADN, ARN u otro material genómico que puede secuenciarse, por ejemplo, usando secuenciación por síntesis. La celda de flujo puede dividirse adicionalmente en varios carriles separados (por ejemplo, ocho carriles), incluyendo cada carril una matriz hexagonal de agrupamientos.

El recipiente 210 de muestra puede montarse en una platina 270 de muestra para proporcionar movimiento y alineación del recipiente 210 de muestra con respecto a la lente 242 de objetivo. La platina de muestra puede tener uno o más accionadores para permitir que se mueva en cualquiera de tres dimensiones. Por ejemplo, en términos del sistema de coordenadas cartesianas, se pueden proporcionar accionadores para permitir que la platina se mueva en las direcciones X, Y y Z con respecto a la lente de objetivo. Esto puede permitir que una o más ubicaciones de muestras en el recipiente 210 de muestra se coloquen en alineación óptica con la lente 242 de objetivo. El movimiento de la platina 270 de muestra en relación con la lente 242 de objetivo puede lograrse moviendo la propia platina de muestra, la lente de objetivo, algún otro componente del sistema de obtención de imágenes o cualquier combinación de lo anterior. Otras implementaciones también pueden incluir mover todo el sistema de obtención de imágenes a través de una muestra estacionaria. Alternativamente, el recipiente 210 de muestra puede fijarse durante la obtención de imágenes.

En algunas implementaciones, un componente 275 de enfoque (eje z) puede incluirse para controlar la colocación de los componentes ópticos en relación con el recipiente 210 de muestra en la dirección de enfoque (normalmente denominado eje z, o dirección z). El componente 275 de enfoque puede incluir uno o más accionadores acoplados físicamente a la platina óptica o la platina de muestra, o ambas, para mover el recipiente 210 de muestra en la platina 270 de muestra en relación con los componentes ópticos (por ejemplo, la lente 242 de objetivo) para proporcionar un enfoque adecuado para la operación de obtención de imágenes. Por ejemplo, el accionador puede estar físicamente acoplado a la platina respectiva tal como, por ejemplo, mediante unión mecánica, magnética, fluida u otra unión o contacto directa o indirectamente a o con la platina. El uno o más accionadores pueden configurarse para mover la platina en la dirección z mientras se mantiene la platina de muestra en el mismo plano (por ejemplo, manteniendo un nivel u posición horizontal, sustancial o perfectamente perpendicular al eje óptico). Puede apreciarse que no puede lograrse una perpendicularidad, paralelismo u otra orientación perfectos según algunos ejemplos o implementaciones debido, por ejemplo, a tolerancias de fabricación, limitaciones operativas, etc. Sin embargo, para los propósitos de las tecnologías descritas en el presente documento, se entiende que sustancialmente perpendicular, paralelo u otra orientación significa una orientación suficiente para lograr una resolución deseada u otro efecto relevante tal como se describe y/o contempla en el presente documento. Los uno o más accionadores también se pueden configurar para inclinar la platina. Esto puede hacerse, por ejemplo, de modo que el recipiente 210 de muestra pueda nivelarse dinámicamente para tener en cuenta cualquier pendiente en sus superficies.

La luz estructurada que emana de una muestra de prueba en una ubicación de muestra de la que se están obteniendo ^{imágenes puede dirigirse a través de un espejo}260 ^{dicroico a uno o más detectores de un sistema 240 de cámara.}En algunas implementaciones, puede incluirse un conjunto 265 de conmutación de filtro con uno o más filtros de emisión, donde pueden usarse el uno o más filtros de emisión para pasar a través de longitudes de onda de emisión particulares y bloquear (o reflejar) otras longitudes de onda. Por ejemplo, el uno o más filtros de emisión pueden usarse para conmutar entre canales diferentes del sistema de obtención de imágenes. En una implementación particular, los filtros de emisión pueden implementarse como espejos dicroicos que dirigen la luz de emisión de diferentes longitudes de onda a diferentes sensores de imágenes del sistema 240 de cámara.

El sistema 240 de cámara puede incluir uno o más sensores de imágenes para monitorizar y seguir la obtención de imágenes (por ejemplo, secuenciación) del recipiente 210 de muestra. El sistema 240 de cámara puede implementarse, por ejemplo, como una cámara de sensor de imágenes de dispositivo de carga acoplada (CCD), pero pueden usarse otras tecnologías de sensores de imágenes (por ejemplo, sensor de píxeles activo). Los datos de salida (por ejemplo, imágenes) del sistema 240 de cámara pueden comunicarse a un módulo de análisis en tiempo real (no mostrado) que puede implementarse como una aplicación de software que, tal como se describe adicionalmente a continuación, puede reconstruir las imágenes capturadas durante cada ciclo de obtención de imágenes para crear una imagen que tiene una mayor resolución espacial. Tal como se describirá a continuación, el sistema 240 de cámara también puede implementarse como una cámara de CCD de TDI para efectuar técnicas de exploración de líneas.

^{Aunque no se ilustra, puede proporcionarse un controlador para controlar el funcionamiento del sistema}200 ^deobtención de imágenes por iluminación estructurada, incluyendo sincronizar los diversos componentes ópticos del sistema 200. El controlador puede implementarse para controlar aspectos del funcionamiento del sistema, tales como, por ejemplo, configuración del conjunto 255 óptico de estructuración de luz (por ejemplo, selección y/o traslación lineal de rejillas de difracción), movimiento de la lente 256 de tubo, enfoque, movimiento de platina y operaciones de obtención de imágenes. En diversas implementaciones, el controlador puede implementarse usando hardware, algoritmos (por ejemplo, instrucciones ejecutables por máquina) o una combinación de lo anterior. Por ejemplo, en algunas implementaciones, el controlador puede incluir una o más CPU o procesadores con memoria asociada. Como otro ejemplo, el controlador puede comprender hardware u otros circuitos para controlar el funcionamiento, tal como un procesador informático y un medio legible por ordenador no transitorio con instrucciones legibles a máquina almacenadas en el mismo. Por ejemplo, este circuito puede incluir uno o más de los siguientes: field programmable gate array (serie de puertas programables en campo - FPGA), application specific integrated circuit (circuito integrado de aplicación específica - ASIC), programmable logic device (dispositivo lógico programable - PLD), complex programmable logic device (dispositivo lógico programable complejo - CPLD), una programmable logic array (serie lógica programable - PLA), una programmable array logic (lógica de serie programable - PAL) u otro dispositivo de procesamiento o circuito similar. Como otro ejemplo más, el controlador puede comprender una combinación de este circuito con uno o más procesadores.

La figura 3A ilustra un ejemplo de configuración de una celda 300 de flujo con patrón, incluida en el presente documento para fines de comparación. En este ejemplo, la celda 300 de flujo tiene un patrón con una matriz hexagonal (véase 304) de puntos o características 302 ordenados de los que pueden obtenerse imágenes simultáneamente durante una ejecución de obtención de imágenes. Para facilitar la ilustración, la celda 300 de flujo se ilustra con decenas a cientos de puntos 302. Sin embargo, tal como puede apreciarse por un experto en la técnica, la celda 300 de flujo puede tener miles, millones o miles de millones de puntos 302 de los que se obtienen imágenes. Además, en algunos casos, la celda 300 de flujo puede ser una muestra de múltiples planos que comprende múltiples planos (sustancial o perfectamente perpendiculares a la dirección de enfoque) de los puntos 302 que se muestrean durante una ejecución de obtención de imágenes. En una implementación particular, la celda 300 de flujo puede tener un patrón con millones o miles de millones de pocillos que se dividen en carriles. En esta implementación particular, cada pocillo de la celda de flujo puede contener material biológico que se secuencia usando secuenciación por síntesis.

Tal como se mencionó anteriormente, en algunos ejemplos para resolver una muestra usando una celda 300 de flujo con patrón, se necesitan al menos nueve imágenes para lograr la resolución requerida. Esto se debe a que la matriz hexagonal de nanopocillos en la celda 300 de flujo con patrón es un patrón de alta frecuencia, donde el paso entre los nanopocillos es estrecho y no puede resolverse. En particular, en este ejemplo hay dos factores que pueden determinar cuántas imágenes son necesarias para resolver de manera suficiente una muestra.

El primer factor es el número de copias de la banda de paso óptico que se desea. Haciendo referencia de nuevo a la figura 1B, el gráfico 122 muestra la banda de paso normal sin el uso de SIM. El gráfico 124 ilustra un ejemplo en donde se crea una copia de la banda de paso óptico. Esto puede mejorar la resolución en una dimensión, mientras que el gráfico 126/gráfico 306 (figura 3A) ilustra un ejemplo donde se crean tres copias de la banda de paso óptico, lo que da como resultado una mejora de resolución bastante uniforme en dos dimensiones.

El segundo factor es el número de imágenes usadas para desmodular fases para cada banda de paso óptico. Aunque teóricamente, sólo se necesitan dos imágenes (para obtener las partes reales e imaginarias), se usan normalmente tres imágenes para obtener un mejor promedio de ruido.

Debe entenderse que cuando se traslada una imagen de frecuencia espacial al espacio de Fourier (el análisis de datos sin procesar generados por un microscopio en el plano focal trasero del objetivo se basa en el análisis de Fourier), la transformada de Fourier contiene 3 componentes o ejes. Es decir, la difracción de la luz en el plano focal trasero del objetivo crea una barrera de difracción que dicta una resolución máxima de aproximadamente 200 nm en la dimensión lateral (x, y) y 500 nm en la dimensión axial (z), dependiendo de la apertura numérica del objetivo y la longitud de onda promedio de iluminación. Por consiguiente, cuando se usa la matriz hexagonal de nanopocillos en las imágenes de la celda 300 de flujo con patrón se toman en tres ángulos usando SIM. Como también se comentó anteriormente, con el fin de obtener la resolución requerida, deben tomarse imágenes en tres fases en cada uno de los tres ángulos, donde se necesitan las tres fases para asegurar que se observan todas las partes en la zona de obtención de imágenes (es decir, para cubrir una longitud de onda completa del patrón de SIM), dando como resultado de ese modo nueve imágenes. Esto da como resultado una mayor resolución en los tres ejes 308.

Sin embargo, en un ejemplo, usando otro tipo de celda de flujo con patrón, por ejemplo, una celda 310 de flujo, donde los nanopocillos 312 forman un patrón en una matriz cuadrada (véase 314), sólo se necesitan dos ángulos para lograr una mayor resolución, estando alineada la mayor resolución a lo largo de los ejes de la matriz cuadrada. El gráfico 316 ilustra un ejemplo de esto, donde sólo se crean y necesitan dos copias de la banda de paso óptico para lograr el aumento de resolución requerido. Dicho de otro modo, una celda de flujo con patrón cuadrado, tal como la celda 310 de flujo puede resolverse alineando el patrón de SIM o la franja con aquellas direcciones en donde se desea un aumento en la resolución, en este caso, a lo largo de los dos ejes (x e y) de la matriz cuadrada. Puede apreciarse que a lo largo de cualquier trayectoria diagonal entre los nanopocillos 312 vecinos, habrá alguna mejora de resolución de modo que los nanopocillos diagonalmente vecinos podrán resolverse entre sí. Sin embargo, entre los nanopocillos 312 a lo largo de los ejes x e y, el paso (P^x, P^y) es lo suficientemente estrecho como para que la resolución necesite potenciarse usando SIM, es decir, la frecuencia espacial en los ejes x e y es demasiado alta para ser resuelta.

Mediante el uso de una celda de flujo con patrón cuadrado, tal como la celda 310 de flujo, el requisito de dimensionalidad de los sistemas de secuenciación convencionales usando SIM puede reducirse en una dimensión, donde la resolución se aumenta sólo en dos ejes 318. Es decir, en lugar de capturar nueve imágenes que cubren tres ángulos sobre tres fases, sólo se necesitan seis imágenes que cubren dos ángulos sobre tres fases, cada una con el fin de resolver adecuadamente una muestra contenida dentro de la celda 310 de flujo. Esto es ventajoso a pesar de una reducción en la densidad de empaquetamiento de la celda 310 de flujo. Por ejemplo, la reducción en la densidad de empaquetamiento puede ser sólo del 11 % sobre una matriz hexagonal que tiene el mismo paso. Sin embargo, la implementación de SIM según diversos ejemplos puede dar como resultado un aumento de densidad de empaquetamiento de, por ejemplo, el 356 % para una matriz con patrón cuadrado con un paso de 350 nm, sobre una matriz hexagonal no SIM con un paso de 700 nm.

Mediante el uso de todavía otro tipo de celda de flujo con patrón, en este ejemplo una celda de flujo con patrón asimétrico, el requisito de dimensionalidad de los sistemas de secuenciación convencionales usando SIM puede reducirse en aún una dimensión más. La figura 3C ilustra una celda 320 de flujo con patrón cuyos nanopocillos forman un patrón asimétrico. En esta implementación, cada nanopocillo 322 está conformado o configurado para formar una estructura alargada. Tal como se utiliza en el presente documento, el término estructura alargada se refiere a una forma donde la dimensión a lo largo de un primer eje es mayor que las dimensiones a lo largo de un segundo eje. En este ejemplo, el eje x es más estrecho que la longitud o altura del nanopocillo 322 a lo largo de otro eje (en este ejemplo, el eje y). Debe entenderse que aunque la implementación ilustrada en la figura 3C usa nanopocillos elípticos, pueden usarse otros tipos de nanopocillos alargados, por ejemplo, rectángulos. Puede usarse cualquier forma alargada de nanopocillo que dé como resultado un patrón mediante el cual la muestra a lo largo de sólo un eje esté asociada con un aumento de resolución usando SIM. En algunas implementaciones, la dimensión de las características con patrón es tal que la anchura de franja w es al menos sustancialmente igual o ligeramente mayor que lo que puede ser un diámetro de una característica circular, una longitud de un lado de una característica cuadrada, una longitud del lado más largo o lado más corto de una característica rectangular, un diámetro de una característica elíptica a lo largo de su eje mayor o eje menor, o la dimensión más larga de una característica de forma irregular a lo largo de un eje de la característica (por ejemplo, eje x o y). En algunas implementaciones, los nanopocillos pueden conformarse alternativamente como cuadrados o círculos, pero con separación asimétrica entre los mismos.

De esta manera, la muestra puede resolverse a lo largo de una dirección o eje, es decir, el eje y, mientras que a lo largo de otra dirección o eje, es decir, el eje x, se usa la SIM para aumentar la resolución para resolver la muestra. Es decir, a lo largo del eje x, el paso, P^x, de la celda 320 de flujo con patrón asimétrico es estrecha o angosta, implicando un aumento de la resolución, mientras que a lo largo del eje y, el paso, P^y, de la celda 320 de flujo con patrón asimétrico es mayor. Por consiguiente, la resolución se aumenta en sólo una dirección/a lo largo de un eje 318, y sólo se capturan tres imágenes para resolver adecuadamente una muestra contenida dentro de los nanopocillos de la celda 320 de flujo. Por tanto, tal como se ilustra en el gráfico 352, sólo se crea y necesita una copia de la banda de paso ópti aumentar la resolución.

La figura 4 es un diagrama de flujo que ilustra ejemplos de operaciones que pueden realizarse en un sistema de secuenciación, tal como el sistema 200 de obtención de imágenes por iluminación estructurada de la figura 2, para secuenciar una muestra usando una celda de flujo con patrón cuadrado o asimétrico. En la operación 400, puede encenderse una fuente de luz correspondiente a un primer patrón de rejilla de difracción óptica orientado en una primera fase. En la operación 410, el patrón de rejilla de difracción óptica en una primera orientación se proyecta sobre una muestra y se captura una imagen. Es decir, haciendo referencia de nuevo a la figura 2, el emisor 250 de luz puede emitir un haz de luz que se colima por la lente 251 de colimación. La luz colimada se estructura (con patrón) mediante el conjunto 255 óptico de estructuración de luz y se dirige por el espejo 260 dicroico a través de la lente 242 de objetivo a una muestra de un recipiente 210 de muestra, que está posicionado en una platina 270. En esta implementación, el recipiente 210 de muestra comprende una celda de flujo con patrón que tiene un patrón cuadrado o asimétrico, tal como las celdas 310 o 320 de flujo, respectivamente (figuras 3B y 3C). En el caso de una muestra fluorescente, la muestra contenida en la celda de flujo con patrón cuadrado o asimétrico emite fluorescencia en respuesta a la luz de excitación estructurada, y la luz resultante se recoge por la lente 242 de objetivo y se dirige a un sensor de imágenes del sistema 240 de cámara para detectar fluorescencia.

En la operación 420, puede realizarse una verificación para determinar si se necesita un desplazamiento de fase adicional. Si es así, en la operación 430, la rejilla de difracción óptica se somete a un desplazamiento de fase y la operación vuelve a la operación 410, donde el patrón de rejilla de difracción óptica (fase desplazada) se proyecta sobre la muestra, y se captura una imagen. Tal como se describió anteriormente, se realizan generalmente tres desplazamientos de fase para capturar una zona de obtención de imágenes completa, en esta implementación, toda la zona de la celda de flujo con patrón cuadrado.

Si no se necesita ningún desplazamiento de fase adicional, en la operación 440, puede realizarse una verificación para determinar si se necesita un ángulo adicional, y el ángulo de la rejilla de difracción óptica cambia en la operación 450. La operación vuelve a la operación 410, donde el patrón de rejilla de difracción óptica (después de cambiar los ángulos) se proyecta sobre la muestra, y se captura una imagen. La operación pasa a la operación 420, donde si se necesita un desplazamiento de fase adicional en 420, la rejilla de difracción óptica se somete a un desplazamiento de fase en la operación 430. Nuevamente, la operación vuelve a la operación 410, donde el patrón de rejilla de difracción óptica (en un nuevo ángulo y una nueva fase) se proyecta sobre la muestra, y se captura una imagen. Nuevamente, en esta implementación, se necesitan imágenes sobre tres fases para capturar la zona completa de la celda de flujo con patrón cuadrado. Debe entenderse que el controlador mencionado anteriormente usado para controlar aspectos del funcionamiento del sistema del sistema 200 de obtención de imágenes por iluminación estructurada puede configurarse con instrucciones para realizar las funciones descritas anteriormente, por ejemplo, comprobar si se necesitan desplazamientos u orientaciones de fase adicionales del patrón de rejilla de difracción óptica para obtener imágenes del tipo particular de celda de flujo que va a usarse.

En el caso de una celda de flujo con patrón cuadrado, por ejemplo, la celda 310 de flujo (figura 3), se necesitan imágenes en dos ángulos para aumentar la resolución a lo largo de los dos ejes de la celda 310 de flujo. Por consiguiente, después de capturar imágenes con el patrón de rejilla de difracción óptica proyectado en dos orientaciones correspondientes a los dos ángulos (sobre tres desplazamientos de fase del patrón de rejilla de difracción óptica), se reconstruye una imagen de alta resolución en la operación 460 (combinando las seis imágenes totales y retransformándolas en espacio real). Esta reconstrucción de imagen de alta resolución puede realizarse dentro del sistema, o en algunos ejemplos, la reconstrucción puede realizarse usando una entidad de procesamiento independiente.

En una implementación en donde la celda de flujo con patrón es una celda de flujo asimétrica, el método descrito anteriormente no necesita implicar ángulos cambiantes. Nuevamente, con una celda de flujo asimétrica, la SIM se usa para aumentar la resolución a lo largo de sólo un eje. Por consiguiente, la rejilla de difracción óptica sólo necesita someterse a un desplazamiento de fase tres veces, permitiendo que las imágenes se capturen para los tres desplazamientos de fase. Por consiguiente, una vez que no se necesitan otros desplazamientos de fase en la operación 420, el método pasa a la operación 460, donde una imagen de alta resolución puede reconstruirse utilizando sólo las tres imágenes capturadas.

Tal como se indicó anteriormente, cuando se usan celdas de flujo con patrón particular que pueden aprovechar las implementaciones de SIM de dimensionalidad reducida, las técnicas de exploración de líneas, tales como la exploración de líneas de TDI, pueden usarse para obtener imágenes de muestras contenidas en las celdas de flujo con patrón. La figura 5 es un diagrama de bloques que ilustra un ejemplo de sistema 500 de obtención de imágenes por exploración de líneas de dos canales que puede usarse para obtener imágenes de una muestra en diversas implementaciones.

Como en el caso del sistema 200 de obtención de imágenes por iluminación estructurada de la figura 2, el sistema 500 de obtención de imágenes por exploración de líneas puede usarse para la secuenciación de ácidos nucleicos, donde los ácidos nucleicos están unidos en ubicaciones fijas en una matriz (es decir, los pocillos de una celda de flujo, tal como la celda 320 de flujo) y pueden obtenerse imágenes de la matriz de manera repetida. En tales implementaciones, el sistema 500 de obtención de imágenes por exploración de líneas puede obtener imágenes en dos canales de color diferentes, que pueden usarse para distinguir un tipo de base de nucleótido particular de otro. Más particularmente, el sistema 500 de obtención de imágenes por exploración de líneas puede implementar un procedimiento denominado “ llamada de base” , que generalmente se refiere a un procedimiento de determinación de una llamada de base (por ejemplo, adenina (A), citosina (C), guanina (G) o timina (T) para una ubicación puntual dada de una imagen en un ciclo de obtención de imágenes. Durante la llamada de base de dos canales, los datos de imagen extraídos de dos imágenes pueden usarse para determinar la presencia de uno de los cuatro tipos de base codificando la identidad de base como una combinación de las intensidades de las dos imágenes. Para un punto o ubicación dados en cada una de las dos imágenes, la identidad de base puede determinarse basándose en si la combinación de identidades de señal está [encendida, encendida], [encendida, apagada], [apagada, encendida] o [apagada, apagada].

Con referencia de nuevo a un sistema 500 de obtención de imágenes por exploración de líneas, el sistema incluye un módulo 510 de generación de línea LGC con dos fuentes 511 y 512 de luz dispuestas en el mismo. Las fuentes 511 y 512 de luz pueden ser fuentes de luz coherente tales como diodos láser que emiten haces de láser. La fuente 511 de luz puede emitir luz en una primera longitud de onda (por ejemplo, una longitud de onda de color rojo), y la fuente 512 de luz puede emitir luz en una segunda longitud de onda (por ejemplo, una longitud de onda de color verde). Los haces de luz emitidos desde las fuentes 511 y 512 de láser pueden dirigirse a través de una lente o lentes 513 de conformación de haz. En algunas implementaciones, puede usarse una única lente de conformación de luz para conformar los haces de luz emitidos desde ambas fuentes de luz. En otras implementaciones, puede usarse una lente de conformación de haz independiente para cada haz de luz. En algunos ejemplos, la lente de conformación de haz es una lente Powell, de modo que los haces de luz se conforman en patrones de línea. Las lentes de conformación de haz de LGC 510 u otro sistema de obtención de imágenes de componentes ópticos se configuran para conformar la luz emitida por las fuentes 511 y 512 de luz para dar patrones de línea (por ejemplo, usando una o más lentes Powel, u otras lentes de conformación de haz, componentes difrangentes o de dispersión). Por ejemplo, en algunas implementaciones, la luz emitida por las fuentes 511 y 512 de luz puede enviarse a través de una rejilla de difracción óptica para generar un patrón de rejilla de difracción óptica (patrón de SIM) que puede proyectarse sobre una muestra.

El LGC 510 puede incluir además un espejo 514 y un espejo 515 semirreflectante configurados para dirigir los haces de luz a través de un único puerto de interfaz a un módulo 530 óptico de emisión (EOM). Los haces de luz pueden pasar a través de un elemento 516 obturador. El EOM 530 puede incluir un objetivo 535 y una platina z 536 que mueve el objetivo 535 longitudinalmente más cerca o más lejos de una diana 550. Por ejemplo, la diana 550 (por ejemplo, una celda de flujo con patrón) puede incluir una capa 552 de líquido y una placa 551 de cubierta translúcida, y una muestra biológica puede ubicarse en una superficie interior de la placa de cubierta translúcida, así como una superficie interior de la capa de sustrato ubicada debajo de la capa de líquido. La platina z puede entonces mover el objetivo para enfocar los haces de luz sobre la superficie interior de la celda de flujo (por ejemplo, enfocado en la muestra biológica). La muestra biológica puede ser ADN, ARN, proteínas u otros materiales biológicos que respondan a la secuenciación óptica como es conocido en la técnica.

El EOM 530 puede incluir un espejo 533 semirreflectante para reflejar un haz de luz de seguimiento de enfoque emitido desde un módulo 540 de seguimiento de enfoque (FTM) sobre la diana 550, y después reflejar la luz devuelta desde la diana 550 de vuelta al FTM 540. El FTM 540 puede incluir un sensor óptico de seguimiento de enfoque para detectar características del haz de luz de seguimiento de enfoque devuelto y generar una señal de retroalimentación para optimizar el enfoque del objetivo 535 en la diana 550.

El EOM 530 también puede incluir un espejo 534 semirreflectante para dirigir la luz a través del objetivo 535, mientras que permite que pase a través la luz devuelta desde la diana 550. En algunas implementaciones, el EOM 530 puede incluir una lente 532 de tubo. La luz transmitida a través de la lente 532 de tubo puede pasar a través del elemento 531 de filtro y al conjunto 520 de cámara. El conjunto 520 de cámara puede incluir uno o más sensores 521 ópticos, por ejemplo, sensores de exploración de líneas de TDI, para detectar la luz emitida desde la muestra biológica en respuesta a los haces de luz incidente (por ejemplo, fluorescencia en respuesta a luz roja y verde recibida de las fuentes 511 y 512 de luz). En un ejemplo, un LGC (tal como se describió anteriormente) puede proyectar luz a través de una rejilla de difracción para generar un patrón de franjas lineal.

Los datos de salida de los sensores del conjunto 520 de cámara pueden comunicarse a un circuito 525 de análisis en tiempo real. El circuito 525 de análisis en tiempo real, en diversas implementaciones, ejecuta instrucciones legibles por ordenador para analizar los datos de imagen (por ejemplo, puntuación de calidad de imagen, llamada de base, etc.), informar o visualizar las características del haz (por ejemplo, enfoque, forma, intensidad, potencia, brillo, posición) en una interfaz gráfica de usuario (GUI), etc. Estas operaciones pueden realizarse en tiempo real durante ciclos de obtención de imágenes para minimizar el tiempo de análisis descendente y proporcionar retroalimentación y solución de problemas en tiempo real durante una ejecución de obtención de imágenes. En implementaciones, el circuito 525 de análisis en tiempo real puede ser un dispositivo informático (por ejemplo, dispositivo 1100 informático) que está acoplado en comunicación y controla el sistema 500 de obtención de imágenes. En las implementaciones descritas más adelante, el circuito 525 de análisis en tiempo real puede ejecutar adicionalmente instrucciones legibles por ordenador para corregir la distorsión en los datos de imagen de salida recibidos desde el conjunto 520 de cámara.

Las figuras 6A-6C representan un ejemplo de representación de la exploración de líneas de TDI de una celda de flujo con patrón asimétrico, donde la SIM se usa para aumentar la resolución a lo largo de un eje de la celda de flujo. En particular, la figura 6 A ilustra una celda 620 de flujo con patrón asimétrico (que puede ser una implementación de una celda 320 de flujo con patrón asimétrico (figura 3C) en donde se superpone un patrón 630 de SIM. La exploración de líneas de TDI puede realizarse a lo largo del eje y, para capturar imágenes fila por fila de la celda 620 de flujo con patrón asimétrico. Las imágenes capturadas en la figura 6A se capturan con el patrón 630 de SIM en una primera fase.

A modo de ejemplo, el sistema 500 de obtención de imágenes por exploración de líneas puede usar un LGC 510 en coordinación con la óptica del sistema para someter a exploración de líneas la muestra (superpuesta con un patrón de SIM, es decir, un patrón de rejilla de difracción óptica) con luz que tiene longitudes de onda dentro del espectro de color rojo y para someter a exploración de líneas la muestra con luz que tiene longitudes de onda dentro del espectro de color verde. En respuesta a la exploración de líneas, los tintes fluorescentes situados en los diferentes puntos de la muestra pueden emitir fluorescencia y la luz resultante puede recogerse por la lente 535 de objetivo y dirigirse a un sensor de imágenes del conjunto 520 de cámara para detectar la fluorescencia. Por ejemplo, la fluorescencia de cada punto puede ser detectada por unos pocos píxeles del conjunto 520 de cámara. Los datos de imagen emitidos desde el conjunto 520 de cámara pueden comunicarse entonces al circuito 525 de análisis en tiempo real para su procesamiento, por ejemplo, para combinar las imágenes para formar una hilera.

La figura 6B ilustra una celda 620 de flujo con patrón asimétrico superpuesta con el patrón 630 de SIM. Sin embargo, en la figura 6B, el patrón 630 de SIM se ha sometido a desplazamiento de fase a lo largo del eje x (en alineación con el eje que necesita un aumento de resolución para resolver la muestra). Tal como se describió anteriormente, el sistema 500 de obtención de imágenes por exploración de líneas puede usar un LGC 510 en coordinación con la óptica del sistema para someter a exploración de líneas la muestra (superpuesta con un patrón 630 de SIM con desplazamiento de fase). Las imágenes pueden capturarse y emitirse desde el conjunto 520 de cámara y comunicarse de nuevo al circuito 525 de análisis en tiempo real para su procesamiento.

La figura 6C ilustra una celda 620 de flujo con patrón asimétrico superpuesta con el patrón 630 de SIM. En la figura 6C, el patrón 630 de SIM se ha sometido a desplazamiento de fase a una tercera fase a lo largo del eje x (en alineación con el eje que necesita un aumento de resolución para resolver la muestra). De nuevo, el sistema 500 de obtención de imágenes por exploración de líneas puede usar un LGC 510 en coordinación con la óptica del sistema para someter a exploración de líneas la muestra (superpuesta con un patrón 630 de SIM con desplazamiento de fase). Las imágenes pueden capturarse y emitirse desde el conjunto 520 de cámara y comunicarse de nuevo al circuito 525 de análisis en tiempo real para su procesamiento. Las imágenes capturadas de acuerdo con cada desplazamiento de fase/fase pueden combinarse mediante el circuito 525 de análisis en tiempo real en una única imagen y retransformarse en espacio real para generar una imagen que tenga una resolución más alta, en este ejemplo, a lo largo del eje x.

En otra implementación, tal como se ilustra en la figura 6D, diferentes porciones de la celda 620 de flujo pueden superponerse con un patrón 630 de SIM en sus diferentes fases. Es decir, un patrón de SIM en una primera fase 630A se superpone a lo largo de una porción inferior de la celda 620 de flujo, el mismo patrón de SIM en una segunda fase 630B se superpone a lo largo de una porción media de la celda 620 de flujo, y nuevamente, el mismo patrón de SIM en una tercera fase 630C se superpone a lo largo de una porción superior de la celda 620 de flujo. Por consiguiente, el sistema 500 de obtención de imágenes por exploración de líneas somete a exploración de líneas la celda 620 de flujo superpuesta con las diferentes fases de un patrón de SIM, (630A-630B), de modo que el sistema 500 de obtención de imágenes por exploración de líneas puede obtener imágenes de todo el flujo, según cada fase requerida del patrón de SIM, en una sola ejecución. En algunas implementaciones, el sistema 500 de obtención de imágenes por exploración de líneas puede modificarse para tener múltiples LGC y múltiples cámaras o sensores/conjuntos de cámara, por ejemplo, tres, cada uno de los cuales genera y emite luz a través de tres rejillas de difracción ópticas (la misma pero orientada en diferentes fases) para generar las tres fases del patrón de SIM. De esta manera, cada cámara o sensor/conjunto de cámara puede capturar una imagen de la celda 620 de flujo junto con una fase de patrón de SIM diferente simultáneamente.

Tal como se comentó anteriormente, en todavía otras implementaciones, puede moverse una muestra/celda de flujo mientras el patrón de SIM permanece estacionario. Cuando se implementa la exploración de líneas de TDI, la muestra/celda de flujo ya está en movimiento. Por tanto, este movimiento de la muestra/celda de flujo puede aprovecharse para evitar tener que desplazar el patrón de SIM. Es decir, el movimiento de la muestra/celda de flujo en relación con el patrón de SIM estacionario genera las fases requeridas necesarias para resolver la muestra.

La figura 7 ilustra otro ejemplo de celda 720 de flujo con patrón, similar a la celda 300 de flujo con patrón de matriz hexagonal (figura 3A). En un sistema de obtención de imágenes por iluminación estructurada convencional, la celda 720 de flujo puede someterse a exploración de líneas, por ejemplo, en la dirección del eje y. La intensidad de un haz de luz emitido por un LGC, por ejemplo, el LGC 510 (figura 5) sobre la muestra en la celda 720 de flujo se muestra como ancho y homogéneo a lo largo del eje x (no mostrado, pero sustancial o exactamente perpendicular a la dirección de exploración de líneas). Sin embargo, a lo largo del eje y, la intensidad del haz de luz es estrecha. A medida que el haz de láser se mueve en relación con la celda 720 de flujo, se capturan imágenes de fluorescencia por una cámara o sensor de exploración de líneas, por ejemplo, el conjunto 520 de cámara (figura 5) en la zona correspondiente iluminada por el haz de luz.

Sin embargo, aprovechando el hecho de que la muestra/celda 720 de flujo ya está en movimiento, y porque sólo se necesita una SIM dimensional para resolver muestras en un celda de flujo con patrón asimétrico, por ejemplo, la celda 320 de flujo (figura 3C), la rejilla de difracción óptica que produce el patrón de SIM puede mantenerse quieto. Es decir, las múltiples fases requeridas (por ejemplo, tres) necesarias para resolver adecuadamente la muestra. Por consiguiente, no se necesitan platinas móviles u otros elementos necesarios para mover, por ejemplo, una rotación o traslación de la rejilla de difracción óptica, en un sistema de obtención de imágenes por exploración de líneas convencional en esta implementación.

La figura 8 ilustra un ejemplo de sistema 800 de obtención de imágenes por exploración de líneas que usa una rejilla de difracción óptica estacionaria. Debe observarse que, para facilitar la explicación, la figura 8 es una ilustración simplificada en donde no se muestran todas las características/elementos. Sin embargo, el sistema 800 de exploración de líneas puede ser una implementación del sistema 500 de obtención de imágenes por exploración de líneas que usa una rejilla de difracción óptica estacionaria para mantener quieto el patrón de rejilla de difracción de difracción óptica/patrón de SIM resultante.

En el ejemplo de la figura 8, un emisor de luz, por ejemplo, un láser 802, está configurado para emitir un haz de luz que está colimado por la lente 804 de colimación. En una implementación, el láser 802 emite luz en la longitud de onda de color verde. La luz colimada es dirigida por el filtro 806 dicroico a través de una rejilla 812 de difracción óptica estacionaria a la lente 830 de objetivo a través de otro filtro 828 dicroico a una muestra de un recipiente 832 de muestra. En esta implementación, el recipiente 830 de muestra es una celda de flujo con patrón asimétrico, tal como la celda 320 de flujo (figura 3C).

Un segundo emisor de luz, por ejemplo, láser 808, emite luz (en la longitud de onda de color rojo, por ejemplo) a través de la rejilla 812 de difracción óptica estacionaria a la lente 830 de objetivo, también a través del filtro 828 dicroico, y sobre la muestra del recipiente 832 de muestra. El recipiente 832 de muestra está colocado en una platina 840 que puede mover el recipiente 832 de muestra en relación con los haces de luz de los láseres 802 y 808. En el caso de una muestra fluorescente, la muestra emite fluorescencia en respuesta a la luz de excitación estructurada (haces de láser desde los láseres 802 y 808), y la luz resultante se recoge por la lente 828 de objetivo y se dirige a un sensor de imágenes de las cámaras 814 y 820.

El filtro 806 dicroico se usa para pasar el haz de luz verde del láser 802 para pasar a través de la rejilla 812 de difracción óptica estacionaria, mientras refleja el haz de luz roja desde el láser 808 hacia la rejilla 812 de difracción óptica estacionaria. El filtro 828 dicroico funciona de manera similar ya que permite que los haces de luz roja y verde de los láseres 802 y 808 se reflejen a la lente 830 de objetivo, mientras que permite que la cámara 814 y 820 capturen respectivamente imágenes que emitieron fluorescencia con la luz verde y roja. El filtro 816 dicroico dirige las emisiones de luz verde de la muestra que ha emitido fluorescencia a la cámara 814, mientras que el filtro 822 dicroico dirige las emisiones de luz roja de la muestra que ha emitido fluorescencia a la cámara 820. Las lentes 818 y 824 son lentes de colimación para las cámaras 814 y 820, respectivamente. El espejo 826 dicroico dirige las emisiones de luz verde y roja de la muestra que ha emitido fluorescencia a las cámaras apropiadas.

En el sistema 800 de exploración de líneas, la rejilla 812 de difracción óptica es estacionaria. Es decir, tal como se comentó previamente, mediante el uso de celdas de flujo con patrón asimétrico junto con la SIM, sólo se necesita una dimensión de iluminación estructurada, y pueden lograrse múltiples fases moviendo el haz a lo largo de la celda de flujo. Dicho de otro modo, el movimiento del haz de láser en relación con la muestra/celda de flujo o el movimiento de la muestra/celda de flujo en relación con el haz de láser, que da como resultado el movimiento relativo entre la muestra y los patrones de excitación de franjas, es todo lo que se necesita para generar las diferentes fases.

La figura 9 ilustra una celda 920 de flujo con patrón que puede someterse a exploración de líneas con un sistema de obtención de imágenes por exploración de líneas, tal como el sistema 800 de exploración de líneas. Un patrón de rejilla de difracción óptica puede proyectarse sobre la celda 920 de flujo, mientras que la celda 920 de flujo se mueve de acuerdo con las técnicas de obtención de imágenes por exploración de líneas. El movimiento de la celda 920 de flujo en relación con el patrón de rejilla de difracción óptica estacionaria crea los desplazamientos de fase necesarios y las imágenes capturadas durante la exploración de líneas, una vez combinadas y retransformadas en espacio real aumentan la resolución, como se comentó previamente.

En particular, el haz de luz se mueve en la dirección del eje y. De nuevo, la intensidad del haz de luz es homogénea a lo largo del eje x (no mostrado), pero la intensidad a lo largo del eje y se modula debido al paso a través de una rejilla de difracción óptica estacionaria, por ejemplo, la rejilla 812 de difracción óptica estacionaria (figura 8). A medida que el haz de luz se mueve en relación con la celda 920 de flujo, se desplaza el patrón de rejilla de difracción óptica. De hecho, pueden generarse más de tres, o incluso docenas de desplazamientos de fase. Como resultado, al mover la muestra/celda 920 de flujo en lugar de la rejilla de difracción óptica, puede lograrse un aumento en la resolución a lo largo del eje de la exploración de líneas. En algunas implementaciones, tal como se describió anteriormente, la resolución en esta dirección puede aumentarse al menos dos veces sobre las superficies tanto con características aleatorias como con patrones periódicos. Debe entenderse que, debido a que la resolución puede aumentarse, por ejemplo, en al menos dos veces, la densidad de los nanopocillos en la celda 920 de flujo puede aumentarse en un factor de dos o más.

La figura 10 es un diagrama de flujo que ilustra un ejemplo de operaciones que pueden realizarse en un sistema de obtención de imágenes por exploración de líneas, tal como el sistema 500 de obtención de imágenes por exploración de líneas (figura 5) o el sistema 800 de obtención de imágenes por exploración de líneas (figura 8), para secuenciar una muestra usando un celda de flujo con patrón asimétrico. En la operación 1000, pueden encenderse los haces de luz de las fuentes de láser, por ejemplo, las fuentes 802 y 808 de láser, que se emiten a través de una rejilla de difracción óptica estacionaria, por ejemplo, una rejilla 812 de difracción óptica estacionaria, correspondiente a una primera orientación del patrón de rejilla de difracción óptica. En la operación 1010, el patrón de rejilla de difracción óptica se proyecta sobre una muestra, y en la operación 1020, la muestra se somete a exploración de líneas. La exploración de líneas puede realizarse tal como se describió previamente con respecto al sistema 800 de obtención de imágenes por exploración de líneas (figura 8). En la operación 1030, la muestra se mueve de acuerdo con las técnicas de exploración de líneas mencionadas anteriormente o la luz dirigida puede moverse como también se describió anteriormente para lograr el movimiento relativo entre la muestra y el patrón de rejilla de difracción óptica.

Las operaciones 1020 y 1030 pueden repetirse tantas veces como sea necesario para capturar imágenes representativas de toda la muestra. Nuevamente, como resultado de que la muestra se mueva en relación con el patrón de rejilla de difracción óptica estacionaria, las imágenes de la muestra y el patrón de rejilla de difracción óptica pueden capturarse a través de los desplazamientos de fase requeridos necesarios para aumentar la resolución. En la operación 1040, puede reconstruirse una imagen de alta resolución.

Debe observarse que para evitar el desenfoque por movimiento entre el patrón de rejilla de difracción óptica y la muestra durante la exploración de líneas, las fuentes de láser pueden funcionar de manera pulsada. Es decir, las fuentes de láser, por ejemplo, las fuentes 802 y 808 de láser pueden pulsarse de modo que, a cada excitación, pueda capturarse una imagen de exploración de líneas. En algunas implementaciones, la orientación del patrón de rejilla de difracción óptica con respecto a la muestra/celda de flujo puede desplazarse 90° En otras implementaciones, tal como se ilustra en las figuras 6A-6C, si la orientación del patrón de rejilla de difracción óptica es tal que la muestra no se mueve a través de zonas de luz y oscuridad (como puede ser el caso si la orientación del patrón de rejilla de difracción óptica estaba desplazada 90 o), la pulsación de las fuentes de láser puede no ser necesaria porque el movimiento de la muestra en relación con el patrón de rejilla de difracción óptica se mueve a través de la misma intensidad de franja.

La figura 11 ilustra un ejemplo de componente informático que puede usarse para implementar diversas características del sistema y los métodos descritos en el presente documento, tales como las características y las funcionalidades mencionadas anteriormente de uno o más aspectos de los métodos ilustrados en las figuras 4 y 10 implementados en los sistemas 200, 500 y/o 800 y descritos en el presente documento. Por ejemplo, el componente informático puede implementarse como un circuito 525 de análisis en tiempo real.

Tal como se usa en el presente documento, el término circuito podría describir una unidad dada de funcionalidad que puede realizarse según una o más implementaciones de la presente solicitud. Tal como se usa en el presente documento, un circuito podría implementarse utilizando cualquier forma de hardware o una combinación de hardware y software. Por ejemplo, para constituir un circuito podrían implementarse uno o más procesadores, controladores, ASIC, PLA, PAL, CPLD, FPGA, componentes lógicos, rutinas de software u otros mecanismos. En la implementación, los diversos circuitos descritos en el presente documento podrían implementarse como circuitos discretos o las funciones y características descritas pueden compartirse en parte o en su totalidad entre uno o más circuitos. Dicho de otro modo, un experto en la técnica después de leer esta descripción, puede apreciar que las diversas características y funcionalidades descritas en el presente documento pueden implementarse en cualquier aplicación dada y pueden implementarse en uno o más circuitos independientes o compartidos en diversas combinaciones y permutaciones. Aunque pueden describirse o reivindicarse individualmente diversas características o elementos de funcionalidad como módulos independientes, un experto en la técnica entenderá que estas características y funcionalidades pueden compartirse entre uno o más elementos de software y hardware comunes, y tal descripción no requiere o implica que se usen componentes de hardware o software independientes para implementar tales características o funcionalidades.

Cuando los componentes o circuitos de la solicitud se implementan en su totalidad o en parte usando software, en una implementación, estos elementos de software pueden implementarse para funcionar con un módulo informático o de procesamiento capaz de llevar a cabo la funcionalidad descrita con respecto a la misma. Un ejemplo de componente informático de este tipo se muestra en la figura 13. Se describen diversas implementaciones en cuanto a este ejemplo de componente 1000 informático. Después de leer esta descripción, resultará evidente para un experto en la técnica relevante cómo implementar la solicitud usando otros módulos o arquitecturas informáticos.

Con referencia ahora a la figura 13, el componente 1000 informático puede representar, por ejemplo, capacidades de computación o procesamiento encontradas dentro de los ordenadores de sobremesa, portátiles, pequeños portátiles y tabletas; dispositivos informáticos portátiles (tabletas, PDA, teléfonos inteligentes, teléfonos móviles, PC de bolsillo, etc.); centrales, superordenadores, estaciones de trabajo o servidores; o cualquier otro tipo de dispositivos informáticos de propósito especial o de propósito general como puede ser deseable o apropiado para una aplicación o entorno dado. El componente 1000 informático también puede representar capacidades informáticas incrustadas dentro o disponibles de otro modo para un dispositivo dado. Por ejemplo, un componente informático podría encontrarse en otros dispositivos electrónicos tales como, por ejemplo, cámaras digitales, sistemas de navegación, teléfonos móviles, dispositivos informáticos portátiles, módems, enrutadores, WAP, terminales y otros dispositivos electrónicos que podrían incluir alguna forma de capacidad de procesamiento.

El componente 1000 informático puede incluir, por ejemplo, uno o más procesadores, controladores, módulos de control u otros dispositivos de procesamiento, tales como un procesador 1004. El procesador 1004 podría implementarse usando un motor de procesamiento de propósito general o de propósito especial, tal como, por ejemplo, un microprocesador, controlador u otra lógica de control. En el ejemplo ilustrado, el procesador 1004 está conectado a un bus 1002, aunque puede usarse cualquier medio de comunicación para facilitar la interacción con otros componentes del componente 1000 informático o para comunicarse externamente.

El componente 1000 informático también podría incluir uno o más módulos de memoria, simplemente denominados en el presente documento como memoria 1008 principal. Por ejemplo, preferiblemente, podría usarse una memoria de acceso aleatorio (RAM) u otra memoria dinámica para almacenar información e instrucciones que se ejecutarán por el procesador 1004. La memoria 1008 principal también podría usarse para almacenar variables temporales u otra información intermedia durante la ejecución de instrucciones que se ejecutarán por el procesador 1004. El componente 1000 informático podría incluir igualmente una memoria de solo lectura (“ ROM” ) u otro dispositivo de almacenamiento estático acoplado al bus 1002 para almacenar información estática e instrucciones para el procesador 1004.

El componente 1000 informático también podría incluir una o más formas de mecanismo 1010 de almacenamiento de información, que podría incluir, por ejemplo, una unidad 1012 de medios y una interfaz 1020 de unidad de almacenamiento. La unidad 1012 de medios podría incluir una unidad u otro mecanismo para soportar medios 1014 de almacenamiento fijos o extraíbles. Por ejemplo, podría proporcionarse una unidad de disco duro, una unidad de estado sólido, una unidad de cinta magnética, una unidad de disco óptico, una unidad de CD o DVD (R o RW) u otra unidad de medios extraíble o fija. Por consiguiente, los medios 1014 de almacenamiento podrían incluir, por ejemplo, un disco duro, una unidad de estado sólido, una cinta magnética, cartucho, disco óptico, un CD, DVD o Blu-ray, u otro medio fijo o extraíble que se lee, se escribe o al que se accede por medio de la unidad 1012 de medios. Tal como ilustran estos ejemplos, los medios 1014 de almacenamiento pueden incluir un medio de almacenamiento utilizable por ordenador que tiene almacenado en el mismo software o datos informáticos.

En ejemplos alternativos, el mecanismo 1010 de almacenamiento de información podría incluir otros instrumentos similares para permitir que los programas informáticos u otras instrucciones o datos sean cargados en el componente 1000 informático. Tales instrumentos podrían incluir, por ejemplo, una unidad 1022 de almacenamiento fija o extraíble y una interfaz 1020. Los ejemplos de tales unidades 1022 de almacenamiento e interfaces 1020 pueden incluir un cartucho de programa y una interfaz de cartucho, una memoria extraíble (por ejemplo, una memoria flash u otro módulo de memoria extraíble) y una ranura de memoria, una ranura y tarjeta PCMCIA, y otras unidades 1022 de almacenamiento fijas o extraíbles e interfaces 1020 que permiten que el software y los datos se transfieran desde la unidad 1022 de almacenamiento al componente 1000 informático.

El componente 1000 informático también podría incluir una interfaz 1024 de comunicaciones. La interfaz 1024 de comunicaciones podría usarse para permitir que el software y los datos se transfieran entre el componente 1000 informático y los dispositivos externos. Los ejemplos de interfaz 1024 de comunicaciones podrían incluir un módem o módem por software, una interfaz de red (tal como una Ethernet, tarjeta de interfaz de red, WiMedia, IEEE 802. XX u otra interfaz), un puerto de comunicaciones (tal como, por ejemplo, un puerto USB, puerto IR, puerto RS232, interfaz Bluetooth® u otro puerto) u otra interfaz de comunicaciones. El software y los datos transferidos a través de la interfaz 1024 de comunicaciones podría transportarse normalmente en señales, que pueden ser electrónicas, electromagnéticas (que incluyen las ópticas) u otras señales capaces de intercambiarse por una interfaz 1024 de comunicaciones dada. Estas señales podrían proporcionarse a la interfaz 1024 de comunicaciones a través de un canal 1028. Este canal 1028 podría llevar señales y podría implementarse usando un medio de comunicación por cable o inalámbrico. Algunos ejemplos de un canal podrían incluir una línea telefónica, un enlace celular, un enlace de RF, un enlace óptico, una interfaz de red, una red de área local o amplia, y otros canales de comunicaciones por cable o inalámbricos.

En este documento, los términos “ medio legible por ordenador” , “ medio utilizable por ordenador” y “ medio de programa informático” se usan para referirse generalmente a medios no transitorios, volátiles o no volátiles, tales como, por ejemplo, la memoria 1008, la unidad 1022 de almacenamiento y los medios 1014. Estas y otras diversas formas de medios de programa informático o medios utilizables por ordenador pueden estar involucradas en transportar una o más secuencias de una o más instrucciones a un dispositivo de procesamiento para su ejecución. Tales instrucciones incorporadas en el medio, generalmente se denominan “código de programa informático” o un “producto de programa informático” (que pueden agruparse en forma de programas informáticos u otros agrupamientos). Cuando se ejecutan, tales instrucciones podrían permitir que el módulo 1000 informático realice características o funciones de la presente solicitud tal como se comenta en el presente documento.

Aunque lo descrito anteriormente en cuanto a diversos ejemplos e implementaciones, debe entenderse que las diversas características, aspectos y funcionalidades descritos en una o más de las implementaciones individuales no están limitados en su aplicabilidad a la implementación particular con el que se describen, sino que pueden aplicarse, solos o en diversas combinaciones, a una o más de las otras implementaciones de la solicitud, ya sea que se describan o no tales implementaciones y si tales características se presentan como una parte de una implementación descrita o no. Por tanto, la amplitud y el alcance de la presente solicitud no deberían estar limitados por ninguna de las implementaciones descritas anteriormente.

Debe tenerse en cuenta que todas las combinaciones de los conceptos anteriores (siempre que tales conceptos no sean mutuamente contradictorios) se contemplan como parte del objeto de la invención descrita en la presente memoria. En particular, todas las combinaciones del objeto reivindicado que aparecen al final de esta descripción se contemplan como parte del objeto de la invención descrito en la presente memoria.

Los términos “sustancialmente” y “aproximadamente” usados a lo largo de esta descripción, incluyendo las reivindicaciones, se usan para describir y considerar pequeñas fluctuaciones, tales como las debidas a variaciones en el procesamiento. Por ejemplo, pueden referirse a menor o igual al ± 5 %, tal como menor o igual al ± 2 %, tal como menor o igual al ± 1 %, tal como menor o igual al ± 0,5 %, tal como menor o igual al ± 0,2 %, tal como menor o igual al ± 0,1 %, tal como menor o igual al ± 0,05 %.

En la medida en que sea aplicable, los términos “primero” , “segundo” , “tercero” , etc. en el presente documento, se emplean simplemente para mostrar los objetos respectivos descritos por estos términos como entidades independientes y no pretenden connotar un sentido de orden cronológico, a menos que se indique explícitamente lo contrario en el presente documento.

Los términos y expresiones utilizados en este documento, y variaciones de los mismos, a menos que se indique expresamente lo contrario, deben interpretarse como abiertos, en oposición a limitantes. Como ejemplos de lo anterior: la expresión “que incluye” debe leerse como que significa “que incluye, sin limitación” o similar; el término “ejemplo” se usa para proporcionar ejemplos de casos del artículo en discusión, no una lista exhaustiva o limitativa de los mismos; los términos “un/uno” o “ una” deben leerse como “al menos uno/a” , “uno/a o más” o similares; y adjetivos tales como “convencional” , “ tradicional” , “ normal” , “común” , “conocido” y términos de significado similar no deben interpretarse como limitativos del artículo descrito a un período de tiempo dado o a un artículo disponible como de un tiempo dado, sino que en su lugar deben leerse como que abarcan tecnologías convencionales, tradicionales, normales o comunes que pueden estar disponibles o ser conocidas ahora o en cualquier momento en el futuro. Del mismo modo, cuando este documento se refiere a tecnologías que pueden resultar evidentes o conocidas por un experto en la técnica, tales tecnologías abarcan aquellas evidentes o conocidas por el experto en la técnica ahora o en cualquier momento en el futuro.

La presencia de palabras y expresiones ampliadas tales como “uno/una o más” , “ al menos” , “pero sin limitación” u otras expresiones similares en algunos casos no se leerán con el significado de que se prevé o se requiere el caso más estrecho en casos en donde tales expresiones ampliadas puedan estar ausentes.

De manera adicional, las diversas implementaciones expuestas en el presente documento se describen en cuanto a los ejemplos de diagramas de bloques, diagramas de flujo y otras ilustraciones. Como resultará evidente para un experto en la técnica después de leer este documento, las implementaciones ilustradas y sus diversas alternativas pueden implementarse sin confinamiento a los ejemplos ilustrados. Por ejemplo, los diagramas de bloques y su descripción adjunta no deben interpretarse como que requieren una arquitectura o configuración particular.

Aunque se han descrito anteriormente diversas implementaciones de la presente descripción, debe entenderse que se han presentado sólo a modo de ejemplo y no de limitación. Asimismo, los diversos diagramas pueden representar un ejemplo de arquitectura u otra configuración para la descripción, lo que se hace para ayudar a comprender las características y las funcionalidades que pueden incluirse en la descripción. La descripción no está restringida al ejemplo ilustrado de las arquitecturas o configuraciones, pero las características deseadas pueden implementarse usando una diversidad de arquitecturas y configuraciones alternativas. De hecho, resultará evidente para un experto en la técnica cómo pueden implementarse particiones y configuraciones funcionales, lógicas o físicas alternativas para implementar las características deseadas de la presente documento descripción. Además, una multitud de diferentes nombres de componente constituyentes distintos de los representados en el presente documento pueden aplicarse a las diversas divisiones. De manera adicional, con respecto a los diagramas de flujo, las descripciones operativas y las reivindicaciones del método, el orden en donde se presentan las etapas en el presente documento no obligan a que se implementen diversas implementaciones para realizar la funcionalidad mencionada en el mismo orden a menos que el contexto indique lo contrario.

Claims

REIVINDICACIONES

i. Un método de obtención de imágenes de una muestra biológica, que comprende:

dirigir la luz a través de una rejilla (812) de difracción óptica estacionaria, en donde la luz comprende luz en al menos dos longitudes de onda emitidas desde dos fuentes (802, 808) de láser respectivas de manera (1000) pulsada;

proyectar un patrón de rejilla de difracción óptica generado por la luz que se dirige a través de la rejilla de difracción óptica estacionaria sobre la muestra (1010) biológica;

someter a exploración de líneas la muestra (1020) biológica;

mover la muestra biológica en relación con el patrón (1030) de rejilla de difracción óptica; y reconstruir una imagen de alta resolución representativa de la muestra (1040) biológica;

en donde la muestra biológica está contenida en una pluralidad de nanopocillos (322) alargados de una celda de flujo (320) con patrón.
2. El método según la reivindicación 1, en donde la exploración de líneas de la muestra (1020) biológica comprende capturar una imagen de una porción de la muestra biológica tras la excitación de las dos fuentes (802, 808) de láser dando como resultado la iluminación de la muestra biológica.
3. El método según la reivindicación 1 o 2, en donde el movimiento de la muestra biológica en relación con el patrón de rejilla de difracción óptica genera una pluralidad de desplazamientos de fase del patrón de rejilla de difracción óptica.
4. El método según la reivindicación 3, en donde la pluralidad de desplazamientos de fase comprende al menos tres desplazamientos de fase del patrón de rejilla de difracción óptica.
5. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el patrón de rejilla de difracción óptica comprende una pluralidad de franjas longitudinales orientadas al menos de manera sustancialmente perpendicular a la pluralidad de nanopocillos (322) alargados.
6. El procedimiento según la reivindicación 5, en donde la información representativa de la muestra biológica a lo largo de un primer eje de la celda (320) de flujo se resuelve de acuerdo con un aumento de resolución basado en una frecuencia espacial creada por una combinación de la pluralidad de nanopocillos (322) alargados y el patrón de rejilla de difracción óptica.
7. El método según la reivindicación 6, en donde la información representativa de la muestra biológica a lo largo de un segundo eje que es al menos sustancialmente perpendicular al primer eje se resuelve de acuerdo con una resolución no aumentada.
8. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el patrón de rejilla de difracción óptica comprende una pluralidad de franjas longitudinales orientadas al menos sustancialmente en paralelo a la pluralidad de nanopocillos (322) alargados.
9. El método según la reivindicación 8, en donde la exploración (1020) de líneas se realiza a lo largo de una dirección alineada con la pluralidad de nanopocillos (322) alargados.
10. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde la exploración (1020) de líneas de la muestra biológica comprende una exploración de líneas de integración de retardo de la muestra biológica.
11. Un sistema (800), que comprende:

al menos dos fuentes (802, 808) de láser que emiten haces de luz en al menos dos longitudes de onda de manera pulsada, respectivamente;

una rejilla (812) de difracción óptica estacionaria adaptada para generar un patrón de rejilla de difracción óptica al pasar los haces de luz emitidos a través de la rejilla (812) de difracción óptica estacionaria; y

un conjunto de exploración de líneas para:

mover una muestra biológica en relación con el patrón (1030) de rejilla de difracción óptica; capturar una pluralidad de imágenes representativas de porciones de la muestra biológica; y

reconstruir una imagen de alta resolución representativa de la muestra biológica basándose en la pluralidad de imágenes (1040);

una celda (320) de flujo con patrón que incluye una pluralidad de nanopocillos (322) alargados que contienen la muestra biológica.
12. El sistema (800) según la reivindicación 11, en donde el conjunto de exploración de líneas comprende al menos dos cámaras (812, 820), teniendo cada una al menos un sensor de imágenes adaptado para detectar la muestra biológica fluorescente.
13. El sistema (800) según la reivindicación 12, en donde el movimiento de la muestra biológica en relación con el patrón de rejilla de difracción óptica genera una pluralidad de desplazamientos de fase del patrón de rejilla de difracción óptica, en donde la pluralidad de desplazamientos de fase comprende preferiblemente al menos tres desplazamientos de fase del patrón de rejilla de difracción óptica.
14. El sistema (800) según la reivindicación 11, en donde el patrón de rejilla de difracción óptica comprende una pluralidad de franjas longitudinales orientadas en relación con la pluralidad de nanopocillos (322) alargados, en donde el conjunto de exploración de líneas captura preferiblemente la pluralidad de imágenes representativas de las porciones de la muestra biológica a lo largo de una dirección alineada con la pluralidad de nanopocillos (322) alargados.
15. El sistema (800) según cualquiera de las reivindicaciones 11-14, en donde el conjunto de exploración de líneas captura cada una de la pluralidad de imágenes representativas de las porciones de la muestra biológica tras la excitación de las al menos dos fuentes (802, 808) de láser dando como resultado fluorescencia de la muestra biológica.