ES2938794T3 - Monitorización de micotoxinas y sus metabolitos en la sangre de cerdos o pollos de engorde - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un método de cribado múltiple para la detección de un gran número de micotoxinas y metabolitos en pollos y cerdos de engorde, método que comprende la recogida de sangre de cerdos y pollos de engorde como muestra de sangre seca, preparación de la muestra de sangre seca para análisis y análisis de la muestra de sangre seca preparada mediante un proceso de cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem de dos etapas LC-MS/MS. En un primer paso de LS-MS/MS, para una fase móvil determinada del proceso LC, el espectrómetro de masas funciona en modo de ionización por electropulverización negativa, y para otra fase móvil del proceso LC, el espectrómetro de masas funciona en modo de electropulverización positivo. modo de ionización por pulverización. Tal método puede utilizarse ventajosamente para la detección y evaluación de la exposición de cerdos o pollos de engorde a piensos contaminados con micotoxinas. También, (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Monitorización de micotoxinas y sus metabolitos en la sangre de cerdos o pollos de engorde

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método novedoso e inventivo para mejorar la productividad en el negocio agrícola. Más en particular, la presente invención se refiere a un método novedoso e inventivo para la biomonitorización de micotoxinas y sus metabolitos de fase I y fase II de una manera fácil y manejable mediante matrices animales accesibles, y más específicamente en la sangre de pollos de engorde o cerdos.

Antecedentes de la técnica anterior de la invención

La necesidad de aumentar el consumo de proteínas a través de la producción de carne de una manera sostenible a nivel mundial está directamente relacionada con la necesidad de reducir el coste total de producción. Sin duda, este sigue siendo el objetivo principal dentro de la industria de cerdos y pollos de engorde, teniendo el coste del pienso el mayor impacto. La alta e impredecible variabilidad de los costes de las materias primas (cereales, proteínas y grasas) y la carga de contaminación por toxinas cada vez mayor y compleja continúan teniendo un impacto negativo en la productividad.

Varios factores de estrés, tales como la manipulación, cambios ambientales repentinos, calor, programas de alimentación y cambios en la composición de la dieta, vacunación, desafíos de enfermedades, infecciones y la respuesta inmunitaria alterada están afectando la salud y la productividad de los animales. Los animales de cría modernos poseen una resistencia e inmunidad naturales limitadas contra este tipo de estrés, lo que a menudo conduce al estrés oxidativo, cuando el animal ya no es capaz de desintoxicarse a tiempo de las especies reactivas del oxígeno a nivel celular. El impacto de tales factores de estrés empeora y se amplifica en presencia de micotoxinas.

- Las micotoxinas disminuyen la función de órganos metabólicos clave como el hígado y los riñones.

- Las micotoxinas tienen un impacto negativo significativo en los mecanismos de defensa y el sistema inmunitario de las aves de corral y los cerdos.

- Por ejemplo, las fumonisinas y el deoxinivalenol (DON) predisponen al desarrollo de enteritis necrótica en pollos de engorde.

En el entorno actual, la presencia de micotoxinas es un riesgo inherente. Hay muchas posibilidades de que múltiples mohos micotoxigénicos tales como Aspergillus, Fusarium y Penicillium y las toxinas relacionadas se infiltren en los silos y el ensilado de maíz durante la cosecha y después del ensilaje. Una encuesta reciente destacó que el 99% de las muestras de cereales recolectadas contenían micotoxinas y más del 85% contenían múltiples micotoxinas.

Hasta el momento se han identificado más de 400 tipos de micotoxinas, también diversas en su química y efecto sobre los animales. Los piensos contaminados con micotoxinas causan un amplio espectro de problemas que van desde la reducción en el consumo de piensos y el rendimiento del crecimiento hasta la reproducción, salud e inmunidad comprometidas. Los síntomas suelen ser inespecíficos y le cuestan al sector agrícola miles de millones de dólares al año.

Las micotoxinas de los piensos de la dieta también pueden terminar en productos animales destinados al consumo humano, tales como la leche, los huevos y la carne, donde permanecen como moléculas tóxicas estables e inertes, pero se desconoce su destino una vez dentro del cuerpo humano.

En condiciones normales, es probable la contaminación por múltiples micotoxinas. Múltiples micotoxinas pueden tener un efecto negativo sinérgico o aditivo, aumentando el impacto negativo general sobre el rendimiento y la salud de los animales. Las micotoxinas de los hongos en los piensos combinadas con las toxinas bacterianas aumentan aún más los problemas de salud negativos.

Las micotoxinas también pueden presentarse en forma conjugada, ya sea soluble (micotoxinas enmascaradas o modificadas producidas por hongos y/o plantas) o incorporadas en/asociadas con/unidas a macromoléculas (micotoxinas unidas). Eso significa en la práctica que no solo las micotoxinas “originales” sino también sus metabolitos fúngicos y vegetales deben cuantificarse con precisión para una evaluación adecuada del riesgo de los piensos. Sin embargo, el muestreo de materias primas individuales (cereales/semillas) y/o piensos para el análisis de micotoxinas, aunque es un factor crítico, a menudo se pasa por alto debido al alto coste y al tiempo relativamente largo (de análisis) implicado. Además, el propio muestreo de las materias primas constituye una limitación importante debido a la existencia de lo que se conoce como puntos "calientes" y la aparición estimada de errores relevantes durante el procedimiento de muestreo es de ~88%. Además, el análisis de micotoxinas de las materias primas no garantiza necesariamente una representación real del pienso final que consume el animal, ya que pueden producirse más transformaciones de micotoxinas durante el almacenamiento. Además, los productores a menudo se valen de herramientas de análisis rápidas y a menudo (más) baratas para la detección de micotoxinas, como los dispositivos de flujo lateral (LFD) y los ELISA. Si bien la mayoría de los LFD proporcionan resultados cualitativos, algunas versiones más recientes de LFD y todos los ELISA proporcionan resultados cuantitativos. Sin embargo, ambos métodos están limitados por el hecho de que a) puede ocurrir una reactividad cruzada que a su vez puede invalidar los resultados y, por lo tanto, afectar a la reproducibilidad científica y que b) solo se puede detectar una micotoxina a la vez y que no todas los ensayos son adecuadas para diferentes tipos de piensos. Por lo tanto, este enfoque resulta insuficiente o poco rentable para una evaluación completa del riesgo de los piensos.

Más importante aún, inherentemente, el enfoque de evaluar el riesgo de los piensos de por sí no proporciona una representación real de la verdadera exposición de los animales a las micotoxinas. Solo enfoques metodológicos que tienen como objetivo/permiten a) la detección de varias micotoxinas y sus metabolitos de Fase I y Fase II b) con alta precisión analítica, c) en fluidos biológicos en animales y d) con un método práctico, manejable y fácil de tomar muestra y de transportar, pueden proporcionar tal información significativa. Es solo entonces cuando alguien puede obtener una representación real de las micotoxinas y sus metabolitos que entran sistémicamente y exponen al animal.

Por la presente se hace referencia a un trabajo de investigación titulado “Multi-mycotoxin analysis using dried blood spots and dried serum spots" ("Análisis de múltiples micotoxinas usando manchas de sangre seca y manchas de suero seco") por B. Osteresch, S. Viegas, B. Cramer y H-U Humpf en Anal. Bioanal. Chem (2017) 409:3369-3382; (Osteresch et al. 2017)

Este estudio describe un enfoque de múltiples micotoxinas para la biomonitorización y la cuantificación de 27 micotoxinas y metabolitos de micotoxinas importantes en muestras de sangre humana.

Para determinar manchas de sangre seca (DBS), se usa el método de detección de HPLC-MS/MS.

El estudio establece un enfoque validado de múltiples micotoxinas para la detección de 27 micotoxinas y metabolitos en manchas de sangre/suero secos basado en una preparación rápida de la muestra seguida de un análisis de HPLC-MS/MS sensible.

Sin embargo, este estudio se ocupa exclusivamente de la aplicación de la metodología a las aplicaciones humanas y la transferencia de la metodología propuesta a los animales no puede darse por sentada.

En un primer párrafo, en la introducción pág. 3370, se establece que las manchas de sangre seca (DBS) son adecuadas para estudios extensos de biomonitorización de contaminantes ambientales en seres humanos o animales. Más específicamente, se hace referencia al estudio n° 14 por Batterman S, Chernyak S, titulado "Performance and storage integrity of dried blood spots for PCB, BFR and pesticide measurements" ("Rendimiento e integridad en el almacenamiento de manchas de sangre seca para mediciones de PCB, BFR y plaguicidas"), Sci TotalEnviron. 2014;494-495:252-60. Este estudio investiga la idoneidad de los análisis de DBS para estudios de exposición de la población a tres grupos químicos: bifenilos policlorados (PCB), retardantes de llama bromados (BFR) y plaguicidas clorados.

La recogida de muestras de sangre completa en papel, conocida como mancha de sangre seca (DBS, por sus siglas en inglés Dried Blood Spot), se remonta a principios de la década de 1960 en la detección de trastornos metabólicos hereditarios en recién nacidos humanos. En los últimos cinco años, DBS-LC-MS/MS ha surgido como un método importante para el análisis cuantitativo de varias moléculas/analitos. El enfoque de DBS-LC-MS/MS se ha ampliado para diferentes tipos de analitos en el sector humano, tales como bifenilos policlorados (PCB), retardantes de llama bromados (BFR), plaguicidas (Batterman S y Chernyak S, 2014), hormonas (Thomas y Thevis, 2018) y drogas (Wickremsinhe et al. 2018). Sin embargo, el enfoque de DBS-LC-MS/MS aún no se ha adoptado en el sector veterinario y hasta la fecha no se conoce ninguna aplicación anterior para la detección de micotoxinas en animales de cría. Es necesario verificar y validar varios parámetros para su uso adecuado en una especie animal en particular, tales como la sensibilidad analítica debido al pequeño tamaño de la muestra, el conocimiento del metabolismo in vivo específico de la especie animal de las micotoxinas para determinar el biomarcador más apropiado, el impacto potencial de varias propiedades de la muestra de sangre en la cuantificación precisa, la calidad de la muestra, impacto del hematocrito en sangre, estabilidad del analito, variación analítica dentro del día, variación analítica entre días, etc.

En ese contexto, cabe señalar que este estudio de Batterman S, Chernyak S (2014) al que se hace referencia en la introducción de este documento de investigación se refiere a la detección de plaguicidas y otros contaminantes tóxicos ambientales mediante DBS en animales, pero no de por sí a las micotoxinas. La transferencia del concepto de DBS para la detección de contaminantes ambientales tales como plaguicidas y metales pesados a las micotoxinas, no es ni simple ni evidente u obvio.

En apoyo de lo anterior, cabe señalar que los PCB, los BFR y varias clases de productos químicos artificiales, como los plaguicidas, son estructuras típicamente "organosintéticas". Es decir, estructuras que no se encuentran de forma natural, ya que llevan uno o más átomos de cloro, bromo, flúor (u otros) de elementos que no se encuentran de forma natural dentro de estructuras de base orgánica.

Como resultado, no solo sus propiedades fisicoquímicas correspondientes, sino también su estabilidad en las DBS mediante la aplicación en tarjetas Find The Agent (FTA) basadas en papel, pueden ser totalmente diferentes a las de las micotoxinas, siendo estas últimas únicamente moléculas (orgánicas) naturales. De hecho, los autores Batterman y Chernyak describen que el método de DBS demostró ser estable a temperatura ambiente para plaguicidas y PCB, pero no para éteres de difenilo polibromados (PBDE).

Dicho de otra manera, es necesario realizar esfuerzos de investigación considerables para determinar:

- qué micotoxinas y sus metabolitos específicos (Fase I y Fase II) deben ser objetivo y biomonitorizados;

- para una especie animal específica y

- para una muestra biológica específica (orina, sangre, heces, excrementos, etc.).

ya que esto se refiere directamente a su ruta metabólica única para una especie animal específica.

Además, incluso si se dispone de respuestas satisfactorias a las preguntas anteriores, sigue existiendo la necesidad de medios y métodos fiables y rentables para detectar de forma cualitativa y cuantitativa la presencia de dichas micotoxinas y sus metabolitos en una muestra del animal seleccionado que se va a biomonitorizar.

Hasta el día de hoy, las micotoxinas se determinan en el campo de la producción animal solo en los piensos. El análisis de piensos proporciona solo una estimación aproximada del riesgo implicado en relación con la cantidad de micotoxinas a las que los animales podrían estar expuestos. Además, el análisis de piensos es propenso a errores metodológicos significativos debido a la presencia de puntos calientes y la dificultad de determinar las micotoxinas enmascaradas, conduciendo ambos a la subestimación del riesgo. Por lo tanto, aunque la evaluación del riesgo de los piensos sigue siendo una herramienta, su utilidad real, cuando se aplica de forma aislada, sigue siendo muy cuestionable, ya que carece de información vital con respecto a la verdadera exposición de los animales a las micotoxinas.

Además, los métodos rutinarios de biomonitorización de micotoxinas no incluyen metabolitos de micotoxinas de fase I y fase II. Esto puede subestimar significativamente la exposición a micotoxinas, especialmente para las micotoxinas altamente metabolizadas. También se necesitan esfuerzos de investigación adicionales para medir los metabolitos in vivo después de la exposición y para establecer qué metabolitos de micotoxinas deben priorizarse para su inclusión durante los esfuerzos de biomonitorización.

Como resultado, sigue existiendo una clara necesidad de un método fiable y rentable para determinar la verdadera exposición de los animales a las micotoxinas, en particular de los pollos de engorde y los cerdos.

Referencias:

(1) Batterman S, Chernyak S “Performance and storage integrity of dried blood spots for PCB, BFR and pesticide measurements”, Sci Total Environ. 2014;494-495:252-60

(2) Thomas A, Thevis M, “Analysis of insulin and insulin analogs from dried blood spots by means of liquid chromatography-high resolution mass spectrometry”. Drug Testing and Analysis .2018; doi.org/10.1002/dta.2518 (3) Lauwers, Marianne et al. 2019. "Multi LC-MS/MS and LC-HRMS Methods for Determination of 24 Mycotoxins Including Major Phase I and II Biomarker Metabolites in Biological Matrices from Pigs and Broiler Chickens". Toxins 11(3): 171.

(4) Osteresch, Bernd, Susana Viegas, Benedikt Cramer y Hans Ulrich Humpf. 2017. "Multi-Mycotoxin Analysis Using Dried Blood Spots and Dried Serum Spots". Analytical and Bioanalytical Chemistry 409(13): 3369-82. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28299415 (13 de febrero de 2020).

(5) Wickremsinhe, Enaksha R. et al. 2018. "Incorporating Dried Blood Spot LC-MS/MS Analysis for Clinical Development of a Novel Oncolytic Agent". Bioanalysis 10(5): 341-56.

En el artículo de referencia (3) anterior, se ha descrito un método para detectar hasta 24 micotoxinas, incluidos los principales metabolitos biomarcadores de fase I y II.

Este método comprende un procedimiento de tres etapas, que incluye:

1) primero someter una (primera parte de una) muestra de DBS a un procedimiento de LC-MS/MS, funcionando el espectrómetro de MS en modo positivo de electropulverización,

2) seguido de someter una (parte de una) muestra de DBS adicional a un procedimiento de LC-MS/MS, funcionando el espectrómetro de MS en modo negativo de electropulverización, y

3) finalmente someter una (parte de una) muestra de DBS además todavía a un procedimiento de LC-HRMS. En el método descrito en este artículo, se requiere el uso del procedimiento y aparato de HRMS para detectar, entre otros, los metabolitos de fase II.

Aunque este método puede ser adecuado para fines de investigación, el uso necesario de un espectrómetro de HRMS hace que este método no sea adecuado para su uso en aplicaciones de campo reales por las siguientes razones:

1) los archivos de datos sin procesar generados por un instrumento de LC-HRMS son muy grandes, lo que implica que, como resultado, el procesamiento de muestras lleva mucho tiempo, lo que no es práctico para su uso en la detección diaria

2) el análisis de HRMS requiere el uso de un espectrómetro de HRMS específico, que es un aparato diferente en comparación con un espectrómetro de MS (no HR o clásico); por lo tanto, con el fin de llevar a cabo el método descrito en este artículo, además de la cromatografía líquida-espectrómetro de masas en tándem, el operador necesita buscar y enviar la muestra a un aparato diferente, que, en vista de su alto coste y complicado procesamiento, no está fácilmente disponible;

3) el tiempo total de detección del procedimiento requerido para procesar una muestra de DBS en este procedimiento de tres etapas es bastante largo: el primer análisis en modo positivo de ESI en el instrumento de LC-MS/MS tarda alrededor de 16 minutos, el análisis posterior en modo negativo de ESI en el instrumento de LC-MS/MS tarda otros 12 min, y el análisis adicional en el instrumento de LC-HRMS, también en modo negativo de ESI, tarda otros 12 min; por lo tanto, en total se requiere un tiempo de procesamiento de al menos 40 min (16+12+12);

4) finalmente, el método como se describe solo permite la detección de 24 analitos, lo que para la biomonitorización de múltiples micotoxinas a menudo es insuficiente.

Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de un método de detección de biomonitorización de múltiples micotoxinas eficiente, adecuado para las condiciones de la vida real.

Objetivos de la invención

El objetivo de los autores de la invención es encontrar formas novedosas para evaluar la exposición sistémica de las micotoxinas de los piensos y sus intermediarios en los animales.

Los métodos rutinarios de biomonitorización de micotoxinas no incluyen metabolitos de micotoxinas de fase I y fase II y esto puede subestimar significativamente la exposición a micotoxinas, especialmente para micotoxinas altamente metabolizadas.

El objeto principal y el objetivo de la invención es proporcionar a) métodos adecuados y b) medios baratos, fáciles y manejables que se centren en la evaluación de la exposición de animales a micotoxinas.

En ese contexto, los principales objetivos de la invención son identificar nuevos biomarcadores de exposición y proporcionar herramientas analíticas adecuadas para la determinación y cuantificación precisas no solo de micotoxinas sino también de sus metabolitos relevantes in vivo después de exposición y establecer qué metabolitos de micotoxinas deben priorizarse para su inclusión durante los esfuerzos de biomonitorización para pollos o cerdos.

Otro objetivo de la invención es que dicho método y medio de biomonitorización puedan proporcionar datos más fiables relacionados con el impacto real en los animales a través del pienso contaminado y en combinación con una serie de factores de estrés bióticos y abióticos (descritos anteriormente) en el sitio, es decir, en condiciones reales de cría. Por lo tanto, se cree que la invención tiene un gran potencial para usar como una herramienta de diagnóstico con un impacto económico significativo en la cría industrial de animales.

Estos objetivos y ventajas se dan solo a modo de ejemplo ilustrativo, y dichos objetivos pueden ser un ejemplo de una o más realizaciones de la invención. Pueden aparecer o resultar evidentes para los expertos en la técnica otros objetivos y ventajas deseables logrados inherentemente por la invención descrita.

En vista de lo anterior, sigue existiendo la necesidad de un método de biomonitorización fiable y rentable para determinar la exposición de los animales a múltiples micotoxinas, en particular de pollos de engorde o cerdos.

Declaración de invención:

Los autores de la presente invención han realizado extensos estudios con el fin de resolver los problemas mencionados anteriormente.

Estos estudios han dado como resultado la invención tal como se describe a continuación.

Los autores de la invención han encontrado con éxito un método para biomonitorizar micotoxinas y sus metabolitos de fase I y fase II relevantes en la sangre de pollos de engorde o cerdos como se describe a continuación.

La invención se expone y caracteriza en la reivindicación principal, mientras que las reivindicaciones dependientes describen otras características y propiedades específicas para realizaciones preferidas de la invención.

De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona un método para la detección de las siguientes (10) micotoxinas y metabolitos en pollos de engorde o cerdos,

- Aflatoxina B1 (AFB1),

- Aflatoxina B2 (AFB2),

- Aflatoxina M1 (AFM1),

- Fumonisina (FBI),

- Fumonisina (FB2),

- Ocratoxina A (OTA),

- Deoxinivalenol (DON),

- Toxina T2 (T2),

- Toxina HT-2 (HT2),

- Zearalenona (ZEN),

comprendiendo dicho método:

- recoger la sangre de pollos de engorde o cerdos como una muestra de sangre seca;

- preparar la muestra de sangre seca para el análisis;

- analizar la muestra de sangre seca preparada por cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) en dos etapas:

a) detección en una etapa de LC-MS/MS,

- utilizando el procedimiento de LC de fase inversa como fase móvil una mezcla de ácido acético, acetonitrilo y agua, aumentando gradualmente la proporción de la solución de acetonitrilo frente a la solución de agua durante el procedimiento, y al final disminuyendo para reacondicionar la columna de LC,

- funcionando el espectrómetro de masas en modo de ionización negativa por electropulverización, y b) detección en otra etapa de LC-MS/MS,

- utilizando el procedimiento de LC de fase inversa como fase móvil, una mezcla de formiato de amonio, ácido fórmico, agua y metanol, aumentando gradualmente la proporción de la solución de metanol frente a la solución de agua durante el procedimiento, y al final disminuyendo para reacondicionar la columna de LC,

- funcionando el espectrómetro de masas en modo de ionización positiva por electropulverización. Por tanto, el método de la presente invención comprende un procedimiento de dos etapas, en el que en cada etapa una (parte de una) muestra de sangre seca debidamente preparada se somete a un procedimiento de cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS).

En un método preferido de la presente invención, se detectan simultáneamente las siguientes (8) micotoxinas y metabolitos adicionales:

- Éter metílico de alternariol (AME),

- Alternariol (AOH),

- Ácido tenuazónico (TEA),

- Beauvericina (BEA),

- Eniatina A, A1, B, B1 (ENNA, ENNA1, ENNB, ENNB1).

En un método preferido más de la presente invención, se detectan simultáneamente las siguientes (18) micotoxinas y metabolitos adicionales:

- desepoxi-deoxinivalenol (DOM1),

- 15-acetildeoxinivalenol (15ADON),

- 3-acetildeoxinivalenol (3ADON),

- Zearalanona (ZAN),

- a-Zearalenol (AZEL),

- a-Zearalanol (AZAL),

- p-Zearalanol (BZAL),

- p-Zearalenol (BZEL),

- DON-glucurónido (DON-GlcA),

- DON-sulfato (DON-S),

- ZEN-glucurónido (ZEN-GlcA),

- ZEN-sulfato (ZEN-S),

- a-zearalenol-glucurónido (A-ZEL-GlcA),

- p-zearalenol-glucurónido (B-ZEL-GlcA),

- Fumonisina B3 (FB3),

- Aflatoxina M2 (AFM2),

- Aflatoxina G 1 (AFG1),

- Aflatoxina G2 (AFG2).

De acuerdo con la última realización preferida de la presente invención, las 36 micotoxinas en total, incluidos algunos de sus metabolitos de fase I y fase II, se detectan simultáneamente en el método de dos análisis de la presente invención.

El término "detección" en el contexto de la presente invención debe entenderse, por un lado, como la determinación (cualitativa) de la presencia de ciertos compuestos y, al menos en lo que respecta a las micotoxinas y algunos de sus metabolitos de fase I, por otro lado el cálculo (cuantitativo) de la concentración de estos compuestos. Según una realización preferida de la invención, los compuestos objeto de la detección de acuerdo con el método de la presente invención son algunas micotoxinas específicas y algunos de sus metabolitos de fase I y fase II, como se define a continuación.

Descripción detallada de la invención

Recogida y preparación de la muestra de sangre seca (DBS)

Según una realización preferida de la invención, recoger la muestra de sangre seca comprende recoger una gota de sangre sobre un papel de filtro, seguido de secado a temperatura ambiente.

Según otra realización preferida de la invención, recoger la muestra de sangre seca comprende aislar la muestra de sangre seca del papel de filtro perforando un disco de papel del papel de filtro, preferiblemente redondo y de aproximadamente 8 mm de diámetro, utilizando un punzón de biopsia.

Según otra realización preferida de la invención, antes del análisis, la sangre de la muestra de sangre seca se prepara para el análisis, incluyendo dicha preparación la extracción de la muestra de sangre seca en un disolvente de extracción.

El disolvente de extracción comprende preferiblemente una mezcla de agua/acetonitrilo/acetona. Acto seguido, el disolvente de extracción se seca y se reconstituye en un disolvente de reconstitución, comprendiendo dicho disolvente de reconstitución preferiblemente una mezcla de agua/metanol/ácido fórmico.

Así, la muestra de sangre seca recogida se extrae en un disolvente de extracción, se seca, se reconstituye en un disolvente de reconstitución, después de lo cual la muestra de sangre seca reconstituida se puede analizar por cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem.

LC-MS/MS

La técnica analítica básica utilizada en el método de la presente invención es la cromatografía líquida con espectrometría de masas en tándem, en lo sucesivo abreviada como LC-MS/MS.

En lo sucesivo, la expresión cromatografía líquida se denomina LC.

En lo sucesivo, la expresión espectrometría de masas se denomina MS.

En lo sucesivo, la expresión espectrometría de masas en tándem se denomina MS/MS.

En lo sucesivo, la expresión espectrometría de masas de alta resolución se denomina HR-MS.

La expresión "cromatografía líquida (LC)" como se usa en el contexto de la presente invención debe entenderse como una técnica de laboratorio para la separación de una mezcla de compuestos. La mezcla se disuelve en un fluido llamado la fase móvil, que la lleva a través de una estructura que contiene otro material llamado la fase estacionaria. Los diversos constituyentes de la mezcla viajan a diferentes velocidades, lo que hace que se separen. La separación se basa en el reparto diferencial entre las fases móvil y estacionaria. Las diferencias sutiles en el coeficiente de reparto de un compuesto dan como resultado una retención diferencial en la fase estacionaria y, por lo tanto, afectan a la separación.

La cromatografía puede ser preparativa o analítica. El propósito de la cromatografía preparativa es separar los componentes de una mezcla para su uso posterior y, por lo tanto, es una forma de purificación. La cromatografía analítica se hace con cantidades más pequeñas de material y sirve para establecer la presencia o medir las proporciones relativas de analitos en una mezcla. Para los fines de la presente invención, se aplica la cromatografía analítica.

Las Tablas 4 y 5, incluidas adicionalmente en la presente memoria descriptiva, ilustran lo anterior: se establecen los tiempos de retención para los diversos componentes incluidos en la muestra de DBS sometida a la etapa del procedimiento de LC comprendido en el método de la presente invención.

La expresión "Espectrometría de masas (MS)" como se usa en el contexto de la presente invención debe entenderse como una técnica analítica que mide la relación masa-carga de los iones. Los resultados normalmente se presentan como un espectro de masas, un gráfico de intensidad en función de la relación masa-carga. En el presente caso, la espectrometría de masas se aplica a una mezcla orgánica bastante compleja.

Un espectro de masas es un gráfico de la señal de iones en función de la relación masa-carga. Los espectros se utilizan para determinar la firma elemental o isotópica de una muestra, las masas de partículas y moléculas, y para dilucidar la identidad química o estructura de moléculas y otros compuestos químicos.

En el procedimiento de MS tal como se aplica en la presente invención, se ioniza una muestra, que es la muestra de sangre seca recogida, extraída, secada y reconstituida como se describe a continuación. Esto hará que algunas de las moléculas de la muestra se rompan en fragmentos cargados o simplemente queden cargadas sin fragmentarse. Luego, estos iones se separan de acuerdo con su relación masa-carga, por ejemplo, acelerándolos y sometiéndolos a un campo eléctrico o magnético: los iones de la misma relación masa-carga sufrirán la misma cantidad de desviación. Los iones son detectados por un mecanismo capaz de detectar partículas cargadas, tal como un multiplicador de electrones. Los resultados se presentan como espectros de la intensidad de la señal de los iones detectados en función de la relación masa-carga. Las moléculas en la muestra de sangre seca después se identifican mediante un patrón característico para la micotoxina o moléculas de metabolitos de fase I enteras o mediante un patrón característico para los fragmentos de la micotoxina o moléculas de metabolitos.

LC-MS/MS

La expresión "cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC MS/MS)", como se usa en el contexto de la presente invención, debe entenderse como cromatografía líquida, seguida de espectrometría de masas. En tal caso la muestra de sangre seca, después de ser extraída en el disolvente de extracción, ser secada y reconstituida en el disolvente de reconstitución, se inyecta en la columna del aparato de cromatografía líquida; las diversas micotoxinas y metabolitos de fase I que salen de la columna de cromatografía líquida se someten entonces a un análisis de identificación y cuantificación mediante un aparato de espectrometría de masas, basado en un enfoque específico.

La cromatografía líquida con espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) es una poderosa técnica analítica que combina el poder de separación de la cromatografía líquida con la capacidad de análisis de masas altamente sensible y selectiva de la espectrometría de masas de triple cuadrupolo.

Una solución de muestra que contiene analitos de interés se bombea a través de una fase estacionaria (columna de LC) mediante una fase móvil que fluye a través a alta presión. La interacción química entre los componentes de la muestra, la fase estacionaria y la fase móvil afecta a las diferentes velocidades de migración a través de la columna de LC afectando a la separación. La amplia variedad de combinaciones de fase estacionaria y fase móvil permite personalizar una separación para adaptarse a muchas soluciones complejas.

Después de la elución de la columna de LC, el efluente se dirige al espectrómetro de masas. El espectrómetro de masas para un sistema de LC-MS/MS tiene una fuente de ionización donde el efluente de la columna de LC se nebuliza, desolvata e ioniza creando partículas cargadas. Estas partículas cargadas luego migran bajo alto vacío a través de una serie de analizadores de masas (cuadrupolo) mediante la aplicación de campos electromagnéticos. Un ion precursor de masa/carga específico (o ion original) es dirigido para pasar a través del primer cuadrupolo, excluyendo todas las partículas de otra relación masa/carga. En la celda de colisión, los iones de masa/carga seleccionados se fragmentan en iones producto (o iones hijos) por colisión con un gas inerte. El tercer cuadrupolo se utiliza para dirigir los fragmentos de iones productos específicos. Los iones producto aislados resultantes se cuantifican luego con un multiplicador de electrones. Esta transición de iones desde el precursor al ion producto (también conocido como MS2) es altamente específica para la estructura del compuesto de interés y por lo tanto proporciona un alto grado de selectividad.

La fuerza de esta técnica radica en el poder de separación de la LC para una amplia variedad de compuestos combinado con la capacidad de la MS para cuantificar compuestos con un alto grado de sensibilidad y selectividad basado en las transiciones únicas de masa/carga (m/z) de cada compuesto de interés.

36 micotoxinas originales y metabolitos de fase I y II

Como se ha expuesto anteriormente, una realización preferida de la presente invención se dirige a la detección de una o más de las 36 micotoxinas y sus principales metabolitos de fase I y II, expuestos en la siguiente lista. En esta lista, los diversos compuestos se agrupan en micotoxinas (originales), metabolitos de fase I y metabolitos de fase II. Además, los compuestos correspondientes detectables por el método de la técnica anterior, descritos en la referencia (3) mencionada anteriormente, también se incluyen en esta tabla. Finalmente, la tabla indica si por el método de la presente invención, el compuesto indicado es detectado por el espectrómetro de masas operando en modo de ionización por electropulverización (ESI-) positiva (+) o negativa (-).

Finalmente, la misma tabla indica si según el método de la presente invención, en comparación con el método de la técnica anterior descrito en el artículo de referencia (3), el compuesto indicado se detecta cuantitativa o cualitativamente.

Tabla I Lista de Micotoxinas detectadas en DBS por LC-MS/MS

Lista de la técnica anterior Lista según la invención Modo 23 Analitos 36 Analitos ESI-

Junto al nombre de cada micotoxina o metabolito de fase I o II, la tabla anterior comprende también el nombre en forma abreviada (tal como, p. ej., DON para deoxinivalenol). En la descripción que sigue, se puede hacer referencia a los componentes anteriores haciendo referencia a dicho nombre abreviado.

Por lo tanto, en comparación con la parte de LC-MS/MS de la técnica anterior descrita en el artículo mencionado anteriormente como (3), se pueden detectar tres micotoxinas originales adicionales mediante el método de la presente invención.

Además, al aplicar el método de la presente invención, se pueden detectar 10 metabolitos de fase II en el método de LC-MS/MS, sin necesidad de aplicar la técnica complicada de LC-HRMS, como era el caso de la técnica anterior descrita en artículo de referencia (3).

ESI modo positivo y negativo

En el método de la presente invención, el procedimiento general para analizar una muestra de DBS es el siguiente:

a) una primera parte de una muestra determinada se somete a una primera etapa de LC, siendo la fase móvil en el aparato de LC la mezcla que se indica en la Tabla 2 a continuación (fase A - agua fase B metanol) seguida de un procedimiento de MS, operando en modo positivo de ESI;

esto produce resultados para los analitos enumerados en la Tabla 4; (21 analitos);

b) a continuación, la parte restante de la misma muestra (o, alternativamente, una muestra idéntica separada) se somete a una segunda etapa de LC, siendo la fase móvil en el aparato de LC la mezcla que se indica en la Tabla 3 (fase A - agua fase B acetonitrilo) seguida de nuevo por un procedimiento de MS, operando en modo negativo de ESI;

esto produce resultados para los analitos enumerados en la Tabla 5; (15 analitos).

La secuencia expuesta anteriormente, por la cual en la primera etapa la MS funciona en modo positivo de ESI, y por la cual en la segunda etapa la MS funciona en modo negativo de ESI, puede invertirse. No hay requisito técnico para que el aparato de MS funcione en modo positivo o negativo en la primer etapa; cualquiera de estas dos etapas (ESI+, resp. ESI-) se puede aplicar primero, después de lo cual en la segunda etapa se usa el otro modo (ESI-, resp. ESI+). Por lo tanto, lo que se aplica en el método de la presente invención es la etapa 1 de LC/MS, seguida de la etapa 2 de LC/MS. En total, este procedimiento de 2 etapas tarda 23 minutos para un análisis y detección completos.

Tabla 2. Condiciones de UPLC para analitos determinados en manchas de sangre seca (DBS) utilizando el modo positivo de ESI.

Como se muestra en la tabla anterior, la proporción de la solución de metanol frente a la solución de agua aumenta gradualmente durante el procedimiento de LC. Al final, esta tendencia se invierte, aumentando nuevamente la proporción de la solución de agua frente a la solución de metanol para así reacondicionar la columna de LC.

En comparación con el procedimiento de la técnica anterior descrito en la referencia (3), los autores de la invención han logado reducir el tiempo total del procedimiento a solo 12 minutos (en comparación con el tiempo de procedimiento requerido de 16 minutos en la técnica anterior).

Tabla 3. Condiciones de UPLC para analitos determinados en DBS utilizando el modo negativo de ESI.

Como se muestra en la tabla anterior, la proporción de la solución de acetonitrilo frente a la solución de agua aumenta gradualmente durante el procedimiento de LC. Al final, esta tendencia se invierte, aumentando nuevamente la proporción de la solución de agua frente a la solución de acetonitrilo para así reacondicionar la columna de LC. En comparación con el procedimiento de la técnica anterior descrito en la referencia (3), los autores de la invención han logado reducir el tiempo total del procedimiento a solo 11 minutos (en comparación con el tiempo de procedimiento requerido de 12 minutos en la técnica anterior).

El término micotoxina “original” tal como se usa en la tabla anterior y a lo largo de la presente memoria descriptiva significa una micotoxina que se puede encontrar en el pienso (animal), esto para marcar la diferencia con un metabolito de dicha micotoxina que se puede formar en el animal (por ejemplo en el hígado).

MS/MS modo ESI+ y ESI-Tras la preparación de la muestra de DBS, se puede aplicar el procedimiento de dos etapas de LS-MS/MS real según la presente invención.

Las dos etapas siguientes son:

- en una sola etapa, analizar por LC-MS/MS, funcionando el espectrómetro de masas en modo de ionización negativa por electropulverización (ESI-), y usando como fase móvil una mezcla de ácido acético, agua y acetonitrilo, aumentando la proporción de acetonitrilo gradualmente durante el procedimiento de cromatografía líquida, una primera serie de micotoxinas y sus metabolitos de fase I y II:

- en otra etapa, analizar por LC-MS/MS, funcionando el aparato espectrómetro de masas en modo de ionización positiva por electropulverización, y usando como fase móvil, una mezcla de formiato de amonio, ácido fórmico, agua y metanol, aumentando gradualmente la proporción de metanol durante el procedimiento de cromatografía líquida, una serie adicional de micotoxinas y sus metabolitos de fase I y II. Así, contrariamente a la técnica anterior que comprende la detección de algunos metabolitos de fase II de micotoxinas por LC-HRMS, el método de la presente invención comprende la detección de dichos metabolitos de fase II de micotoxinas por el método habitual de LC-MS/MS.

Tabla 4.

Analitos determinados en DBS utilizando el modo positivo de ESI:

Tiempo de retención de LC, patrón interno, detección cuantitativa (Cuan) o cualitativa (Cual)

Tabla 5.

Analitos determinados en DBS utilizando el modo negativo de ESI:

Tiempo de retención de LC, patrón interno, detección cuantitativa (Cuan) o cualitativa (Cual)

Enriquecimiento

Según una realización preferida de la presente invención, el método comprende enriquecer con uno o más patrones internos la muestra de sangre seca recogida.

Según otra realización preferida de la presente invención, lo(s) patrón(patrones) interno(s) son, se seleccionan respectivamente de la siguiente lista de 8 compuestos:

- 13C15-deoxinivalenol,

- 13C17-aflatoxina B1,

- 13C20-ocratoxina A,

- 13C24-toxina T2,

- 13C34-fumonisina B1,

- 15N3-eniatina B,

- 13C615N-ácido tenuazónico,

- 13C18-zearalenona.

Uso práctico del método según la invención.

El método expuesto anteriormente, así como cualquiera de las realizaciones preferidas de dicho método, puede usarse para examinar y evaluar la exposición de cerdos y pollos de engorde a piensos contaminados con micotoxinas. Además, dicho método también es adecuado para evaluar la adición de agentes desintoxicantes de micotoxinas al pienso animal.

Otros aspectos y ventajas de la invención, así como sus realizaciones preferidas, aparecerán a partir de la siguiente descripción detallada.

Descripción más detallada de la invención

El término "monitorizar" tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, se entiende que significa determinar la exposición de los animales a las micotoxinas con el uso de los denominados biomarcadores de exposición.

El término "biomarcadores" tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva se entiende que significa moléculas que son una medida de la exposición del animal a las micotoxinas y sus metabolitos de fase I y fase II, y que se pueden encontrar en las matrices biológicas de los animales.

Se deben distinguir dos tipos de biomarcadores:

- directos (exposición) y

- biomarcadores indirectos (mecanismo/efecto).

Estos últimos son principalmente inespecíficos y están asociados con el efecto o el mecanismo de las micotoxinas. Los biomarcadores basados en el efecto son incluso menos específicos que los basados en el mecanismo. Un ejemplo típico es la alteración en el consumo de pienso tras la administración de deoxinivalenol. Los biomarcadores directos son específicos y están directamente relacionados con la exposición. Este tipo de biomarcador a menudo es la propia micotoxina o sus metabolitos de fase I y II. En la biomonitorización, los biomarcadores directos son los biomarcadores preferidos.

La detección de biomarcadores puede darse en matrices fácilmente accesibles del animal que se va a biomonitorizar, tales como sangre, orina o heces.

En el contexto de la presente invención, la detección de los biomarcadores directos o biomarcadores para la exposición, por ejemplo para micotoxinas rápidamente absorbidas, debe detectarse en la sangre.

Se pueden detectar las concentraciones máximas en la sangre y la concentración en la sangre está directamente relacionada con la exposición. Por lo tanto, el plasma es una buena matriz para medir las micotoxinas unas horas después de la exposición.

El momento en que el animal absorbe las micotoxinas varía sustancialmente entre las diversas micotoxinas y entre las especies animales. Los autores de la invención han determinado después de experimentos que el intervalo de tiempo óptimo para la detección de tales micotoxinas es recoger la muestra de sangre seca después de 30 minutos hasta dos horas después de la alimentación, preferiblemente aproximadamente 1 hora después de alimentar al animal. Los datos experimentales para este período de tiempo preferencial se describen en el siguiente artículo de los autores de la invención:

El artículo titulado "Biomarkers for Exposure as a tool for efficacy testing of a mycotoxin detoxifier in broiler chickens and pigs" (“Biomarcadores para la exposición como herramienta para el ensayo de eficacia de un desintoxicante de micotoxinas en pollos de engorde y cerdos”), por Marianne Lauwers, Siska Croubels, Ben Letor, Christos Gougoulias y Mathias Devreese, publicado el 28 de marzo de 2019 por Toxins 2019, 11, 187; doi:10.3390/toxins 11040187, www.mdpi.com/journal/toxins.

Micotoxinas y metabolitos de fase I y II:

El experto en la materia sabe que el pienso para animales puede comprender un número bastante alto de diferentes tipos de micotoxinas y los metabolitos relacionados.

Como primer paso, comprendido en el método de la presente invención, se debe hacer una selección de qué micotoxinas y metabolitos relacionados deben ser objeto de la operación de monitorización o evaluación.

Las micotoxinas objetivo del multimétodo de la presente invención comprenden los grupos regulados, es decir, aflatoxinas, ocratoxina A y varias micotoxinas Fusarium y dos grupos de micotoxinas no reguladas o emergentes, es decir, micotoxinas Alternaria y micotoxinas Fusarium seleccionadas (eniatinas y beauvericina).

La selección de las micotoxinas mencionadas anteriormente y sus metabolitos de fase I y II se ha basado en un estudio cuidadoso de la normativa actualmente vigente en la Unión Europea y los datos de presencia en el pienso animal. Las micotoxinas en los piensos reguladas por la EFSA (Agencia Europea de Seguridad Alimentaria) son AFB1, OTA, FB1+FB2, T2+HT2, ZEN y DON.

Las micotoxinas no reguladas son p. ej., ENN, BEA, AOH, AME y TEA.

Como resultado, en el método según la presente invención se detectan al menos las siguientes (10) micotoxinas y sus metabolitos:

- Aflatoxina B1 (AFB1),

- Aflatoxina B2 (AFB2),

- Aflatoxina M1 (AFM1),

- Fumonisina (FB1),

- Fumonisina (FB2),

- Ocratoxina A (OTA),

- Deoxinivalenol (DON),

- Toxina T2 (T2),

- Toxina HT-2 (HT2),

- Zearalenona (ZEN).

Según una realización preferida, el método de la presente invención comprende la detección de las siguientes (8) micotoxinas adicionales y sus metabolitos:

Éter metílico de alternariol (AME),

- Alternariol (AOH),

- Ácido tenuazónico (TEA),

- Beauvericina (BEA),

- Eniatina A, A1, B, B1 (ENNA, ENNA1, ENNB, ENNB1).

Según otra realización preferida, el método de la presente invención comprende la detección de las siguientes (18) micotoxinas adicionales y sus metabolitos:

- desepoxi-deoxinivalenol (DOM1),

- 15-acetildeoxinivalenol (15ADON),

- 3-acetildeoxinivalenol (3ADON),

- Zearalanona (ZAN),

- a-Zearalenol (AZEL),

- a-Zearalanol (AZAL),

- p-Zearalanol (BZAL),

- p-Zearalenol (BZEL),

- DON-glucurónido (DON-GlcA),

- DON-sulfato (DON-S),

- ZEN-glucurónido (ZEN-GlcA),

- ZEN-sulfato (ZEN-S),

- a-zearalenol-glucurónido (A-ZEL-GlcA),

- p-zearalenol-glucurónido (B-ZEL-GlcA),

- Fumonisina B3 (FB3),

- Aflatoxina M2 (AFM2),

- Aflatoxina G 1 (AFG1),

- Aflatoxina G2 (AFG2).

A continuación se describirán con más detalle las distintas etapas del método según la invención:

Producción de la muestra de sangre seca.

La presente invención se basa en el uso de muestras de sangre seca, dada su conveniencia en la producción y facilidad de conservación y transporte.

La muestra de sangre seca se produce extrayendo una gota de muestra de sangre, transfiriéndola a una tarjeta almacenadora (saver card) (tarjeta de papel), y preferiblemente seguido de perforación del disco central de 8 mm de la tarjeta.

La gota de sangre puede extraerse de cualquier parte del cerdo o del pollo de engorde, pero preferiblemente la sangre se extrae de la oreja del cerdo o de la pata del pollo de engorde.

Como siguiente paso, la gota de sangre se transfiere a una tarjeta almacenadora.

Como tarjeta almacenadora, se puede utilizar, p. ej. una tarjeta almacenadora de proteínas comercializada con la marca de producto "Whatman 903®”, disponible de Sigma-Aldrich.

Una zona de recogida de la muestra de la tarjeta almacenadora de proteína 903 contiene cinco círculos de 12,7 mm (media pulgada). Cada círculo contiene de 50 a 80 gl de muestra.

El volumen óptimo para cubrir un círculo completo en la tarjeta almacenadora se determinó que era 60 gl. En la tarjeta almacenadora, la gota de sangre se extiende sobre la tarjeta y llena un círculo de al menos 8 mm. Como siguiente paso, el disco central de 8 mm en la tarjeta almacenadora se perfora con un punzón de biopsia.

El papel almacenador así perforado que comprende (parte de) la gota de sangre, constituye la muestra de sangre seca denominada en lo sucesivo DBS.

Basado en los siguientes experimentos, parece que, independientemente de la cantidad específica de la gota de sangre extraída, se obtienen los mismos resultados en términos de cualificación y cuantificación de las micotoxinas.

Inserción de patrones internos (IS) en la DBS

En esta etapa del método según la presente invención, se añaden sustancias adecuadas para actuar como productos de patrón interno a la DBS.

Más en particular, de acuerdo con un modo de operación preferido de la presente invención, se puede usar una combinación de las siguientes sustancias como patrones internos y, con ese fin, se añaden a la DBS:

Las sustancias antes mencionadas son adecuadas para actuar como patrones internos en el método de la presente invención, ya que comprenden átomos de carbono que comprenden 13 neutrones o átomos de nitrógeno que comprenden 15 neutrones y, por lo tanto, son fácilmente detectables por el espectrómetro de masas y tienen características muy similares a las de los componentes de 12C y 14N.

Estas sustancias se utilizan como patrones internos en el aparato de LC-MS/MS y en el aparato de HRMS utilizado en la presente invención.

Dado que un patrón interno (en lo sucesivo denominado IS) marcado isotópicamente para cada micotoxina individual es demasiado caro y no está disponible comercialmente, se usó un IS marcado con [13C] o [15N] para cada grupo de micotoxinas, de la siguiente manera:

[13Ci5]-Deoxinivalenol se utilizó como IS para DON, DOM1 y 3/15ADON;

[13C24]- Toxina-T2 para T2 y HT2;

[13C17]-Aflatoxina B1 para AFB1, AFB2, AFG1, AFG2, AFM1 y AFM2;

[13C20]-Ocratoxina A para OTA;

[13C34]-Fumonisina B1 para FB1, FB2 y FB3;

[13C65N]-Ácido tenuazónico para TEA, AME y AOH;

[13C18]-Zearalenona para ZEN, AZAL, BZAL, AZEL, BZEL, ZAN, DON-GlcA, DON-S, ZEN-GlcA, ZEN-S, A-ZEL-GlcA y B-ZEL-GlcA;

[15N3]-Eniatina B para ENNA, ENNA1, ENNB, ENNB1 y BEA.

Por lo tanto, se obtuvo una corrección óptima para los efectos de matriz y pérdidas durante la preparación de la muestra, lo que se confirmó durante la validación del método.

Extracción de las micotoxinas en un disolvente

La siguiente etapa en el método según la invención es extraer las micotoxinas contenidas en la DBS, de una manera tan pura y completa como sea técnicamente posible. Expresado de otra manera, en esta etapa del método según la invención, el objetivo es aislar las micotoxinas en la DBS de la mayor cantidad posible de otros constituyentes de la sangre.

Con este fin, el método comprende poner la DBS en un tubo de ensayo, p. ej. hecho de vidrio, y añadir un disolvente de extracción adecuado.

Según un modo de operación preferido, como disolvente de extracción se puede utilizar una mezcla de agua/acetona/acetonitrilo, preferiblemente en los siguientes volúmenes respectivos: 30/35/35 v/v/v.

La cantidad de disolvente para usar puede variar ampliamente, pero preferiblemente se puede usar una cantidad en el intervalo de 0.1 hasta 10 ml, preferiblemente de 0.5 hasta 5 ml, más preferiblemente aproximadamente 1 ml. La muestra que comprende la DBS y el disolvente de extracción se someten a un tratamiento ultrasónico, preferiblemente durante un período de tiempo en el intervalo de 15 a 45 minutos, preferiblemente aproximadamente 30 minutos.

Una vez completada la etapa del baño ultrasónico, el disolvente se vierte en otro tubo de ensayo; el papel que queda de la tarjeta almacenadora se puede retirar.

Secado y reconstitución del disolvente

El objetivo de la presente etapa es preparar una muestra para inyección en el aparato de cromatografía líquida (LC). Esto implica que la muestra de DBS debe tratarse adicionalmente desde el punto de vista de la detectabilidad así como de la manera tanto cualitativa como cuantitativa de las micotoxinas en la muestra en el LC-MS/MS o LC-HRMS. Esto último se puede realizar, por un lado, mediante una selección adecuada del disolvente de reconstitución y, por otro lado, determinando la cantidad adecuada de dicho disolvente de reconstitución que se va a utilizar.

En esta etapa del método de la presente invención, el disolvente de extracción, que contiene las micotoxinas y los metabolitos relacionados para detectar, se seca, p. ej. bajo una corriente de nitrógeno suave a una temperatura adecuada, p. ej. entre 20 y 60°C, preferiblemente entre 30 y 50°C, más preferiblemente aproximadamente 40°C /-5°C. Tras el secado, el material seco se reconstituye en un disolvente adecuado para inyectar en el aparato de LC. Los autores de la invención han descubierto que con ese fin, según el método de la invención, se puede utilizar preferiblemente un disolvente que consiste en agua/metanol/ácido fórmico. Preferiblemente, el material seco se reconstituye en una cantidad apropiada de dicho disolvente, que es 60 gl (esta cantidad corresponde a la misma cantidad de DBS inicial, gota de sangre).

Al seleccionar la misma cantidad de sangre que la DBS original, la concentración de micotoxinas en la muestra que se va a analizar es la misma que en la gota de sangre original.

Apoyo experimental:

Los siguientes experimentos, realizados por los autores de la invención, ilustran lo anterior.

Se evaluaron tres disolventes de reconstitución diferentes (n = 3 por condición): agua/ACN/ácido acético (AA) (95/5/0.1, v/v/v); agua/metanol/ácido fórmico (60/40/0.1, v/v/v) y agua/metanol (15/85, v/v). Las dos primeras mezclas se han aplicado previamente para la detección de múltiples micotoxinas u OTA sola en DBS humana. Este último ha sido utilizado por los coautores de la invención Lauwers et al. en un método de LC-MS/MS para la determinación de múltiples micotoxinas en plasma de cerdo y pollo. Los mejores resultados se obtuvieron utilizando metanol en lugar de acetonitrilo en los disolventes de reconstitución (Figura 1). A continuación, se realizaron curvas de calibración con los dos disolventes de reconstitución que contenían metanol y se compararon la concentración más baja alcanzada para cada componente, así como la forma del pico. La mezcla de agua/metanol/ácido fórmico (60/40/0.1, v/v/v) mostró los mejores resultados para ambos parámetros y por lo tanto se eligió como el disolvente preferido. También se observaron los mismos hallazgos para las DBS obtenidas de pollos de engorde.

La figura anterior muestra la evaluación de las áreas de los picos de los analitos después del análisis por LC-MS/MS de DBS (60 gl), extractos que se volvieron a disolver en tres disolventes de reconstitución diferentes: agua/acetonitrilo (ACN)/ácido acético (AA) (95/5/0.1, v/v/v); agua/metanol (MeOH)/ácido fórmico (FA) (60/40/0.1, v/v/v) y agua/MeOH (15/85, v/v). La sangre completa se enriqueció en micotoxinas individuales a una concentración de 10 ngm l-1. La media (n = 3) de las áreas de los picos de LC-MS/MS desviación estándar (SD) se muestra en el gráfico.

Las siguientes micotoxinas fueron objeto de los experimentos:

Deoxinivalenol (DON), desepoxi-deoxinivalenol (DOM1), 3/15-acetil-deoxinivalenol (3/15ADON), aflatoxina B1 (AFB1), aflatoxina M1 (AFM1), eniatina A (ENNA), eniatina A1 (ENNA1), eniatina B (ENNB), eniatina B1 (ENNB1), beauvericina (BEA), fumonisina B1 (FB1), fumonisina B2 (FB2), ocratoxina A (OTA), zearalenona (ZEN), a-zearalenol (AZEL), pzearalenol (BZEL), a-zearalanol (AZAL), p-zearalanol (BZAL), zearalanona (ZAN), ácido tenuazónico (TEA), alternariol ^{(AOH), éter monometílico de alternariol (AME), toxina T2} (^t2).

LC (cromatografía líquida)

La siguiente etapa del método de la presente invención es la determinación cualitativa y cuantitativa de las diversas micotoxinas y metabolitos relacionados de fase I y II comprendidos en la muestra de sangre.

Esto se puede lograr sometiendo la muestra de DBS secada y reconstituida a una separación por cromatografía líquida. Como se ha expuesto anteriormente, dicho aparato comprende una columna que comprende una fase estacionaria y una fase móvil (líquida). En la columna de dicho aparato, las micotoxinas y los metabolitos relacionados se separan en función de su diferente afinidad, por un lado, por la fase estacionaria (o fija) de la columna y, por otro lado, por la fase móvil o líquida de dicha columna. Dadas tales diferencias de afinidad, el tiempo de permanencia y, por lo tanto, el tiempo de transferencia de las diversas micotoxinas y metabolitos relacionados a través de la columna del aparato será diferente, lo que dará como resultado una separación adecuada de las micotoxinas individuales.

Una columna adecuada para usar en el método de la presente invención comprende partículas de tecnología HSS (sílice de alta resistencia) disponibles de Waters® y su distribuidor en Benelux, LabMakelaar Benelux BV Knibbelweg 18 C, Zevenhuizen, Países Bajos, p. ej. la partícula de sílice de alta resistencia de 1.8 gm.

Según una realización preferida de la presente invención, la composición de la fase líquida que pasa a través de la columna del aparato de cromatografía líquida varía con el tiempo, según el momento de inyección de la fase líquida en la columna.

Las tablas 2 y 3 expuestas anteriormente ilustran el caudal de la fase móvil así como el programa de gradiente aplicado.

Las condiciones de UPLC para los analitos determinados mediante el modo negativo de ESI son las siguientes (véase la tabla 3):

al inicio de la operación, la fase móvil comprende predominantemente agua (p. ej., hasta 95%) y una pequeña proporción de acetonitrilo (p. ej., hasta 5%), y a medida que pasa el tiempo, la composición de la fase líquida cambia, de manera que la cantidad de agua disminuye gradualmente (p. ej., hasta aproximadamente 40%) y la cantidad de acetonitrilo aumenta gradualmente (p. ej., hasta aproximadamente 60 %).

A partir de entonces, la proporción de agua vuelve a aumentar sustancialmente, hasta 95%, para reacondicionar así la columna para un uso futuro.

Las condiciones de UPLC para los analitos determinados mediante el modo positivo de ESI son las siguientes (véase la tabla 2):

al inicio de la operación, la fase móvil comprende predominantemente agua (p. ej., hasta 95%) y una pequeña proporción de metanol (p. ej., hasta 5%), y a medida que pasa el tiempo, la composición de la fase líquida cambia, de modo que la cantidad de agua disminuye gradualmente (p. ej., hasta aproximadamente 1%) y la cantidad de metanol aumenta gradualmente (p. ej., hasta aproximadamente 99%).

A partir de entonces, la proporción de agua vuelve a aumentar sustancialmente, hasta 95%, para reacondicionar así la columna para un uso futuro.

Como resultado de lo anterior, las diversas micotoxinas y metabolitos relacionados individuales saldrán de la columna de cromatografía líquida uno tras otro; en dicha etapa, estos compuestos son adecuados para ser detectados en la etapa posterior de la presente invención, por el aparato de MS/MS.

Las tablas 4 y 5 expuestas anteriormente ilustran los diversos tiempos de retención de los componentes comprendidos en la muestra de DBS que se va a analizar.

Apoyo experimental:

Se probaron cuatro columnas de fase inversa diferentes (Hypersil Gold 50 mm x 2.1 mm, dp: 1.9, Thermo Scientific, Breda, Países Bajos; Zorbax Eclipse C18 50 mm x 2.1 mm, dp: 1.8, Agilent, Sint-Katelijne-Waver, Bélgica; Acquity BEH-C18 50 mm x 2.1 mm, dp: 1.7, Waters, Milford, MA, EE. UU.; y Acquity HSS-T3 100 mm x 2.1 mm, dp: 1.8, Waters, Milford, MA, EE. UU.) para lograr la separación cromatográfica de las micotoxinas seleccionadas. La mejor separación de todos los componentes se obtuvo en la columna HSS-T3.

La abreviatura HSS significa sílice de alta resistencia (por sus siglas en inglés High Strength Silica), el término T3 significa una cadena de alquilo C18 trifuncional.

La última columna está disponible como columna Acquity UPLC HSS T3 de Waters Corporation, 34 Maple Street, Milford, EE. UU.

Para más detalles sobre el aparato de cromatografía adecuado para usar en el método de la presente invención, se hace referencia al documento de referencia (3) identificado anteriormente, párrafo 4.5, página 23 de 30.

Detección de micotoxinas por MS-MS

Para la detección de las micotoxinas separadas por el aparato de LC, se utilizan el método y el aparato de MS-MS. Cuando se utiliza esta técnica, la detección se realiza en la molécula básica ("precursora") en una primera etapa, así como en algunos fragmentos de dicha molécula en una segunda etapa.

Para obtener más detalles sobre el aparato de MS-MS adecuado para usar en el método de la presente invención, se hace referencia al documento de referencia (3) identificado anteriormente, párrafo 4.6.1, página 23 de 30.

Validación del método:

Una vez completado el desarrollo del método según la presente invención, los autores de la invención han emprendido la tarea de validar el método según la presente invención con respecto a la DBS de cerdos y pollos de engorde. Con el fin de la validación se han preparado curvas de calibración, por un lado con respecto a la DBS de cerdos, por otro lado con respecto a la DBS de pollos de engorde, en ambos casos para cada una de las micotoxinas y sus metabolitos de fase I como se ha indicado anteriormente.

Para ese fin, se han realizado ensayos en tres días diferentes, así como dentro de un día, y se han calculado los valores medios basados en estos resultados.

Los resultados de estos ensayos se describen a continuación.

Se hace referencia por la presente al siguiente documento, párrafo 2.2, página 5 de 11: el artículo titulado "Biomarkers for Exposure as a tool for efficacy testing of a mycotoxin detoxifier in broiler chickens and pigs" por Marianne Lauwers, Siska Croubels, Siegrid de Baere, Milena Sevastiyanova, Eva Maria Romero Sierra, Ben Letor, Christos Gougoulias y Mathias Devreese, publicado el 18 de septiembre de 2019 por Toxins 2019, 11, 541: doi: 10.3390/toxins 11090541, www.mdpi.com/journal/toxins.

La linealidad expresada como coeficiente de correlación (r) y la bondad de ajuste (g) se muestra en la Tabla 1 para las DBS de cerdo y en la Tabla 2 para las DBS de pollo y es la media ± desviación estándar de tres curvas en tres días diferentes de análisis. El r variaba entre 0.991 y 0.999 para cerdos y entre 0.993 y 0.998 para pollos de engorde. El valor g variaba de 6% a 17% en cerdos y de 8% a 19% en DBS de pollos de engorde. La mayoría de las curvas de calibración se ajustaban a un modelo lineal con un factor de ponderación de 1/x, a excepción de las ENN y BEA, que se describen mejor mediante un modelo cuadrático con un factor de ponderación de 1/x. Para la mayoría de las micotoxinas, la linealidad variaba entre 0.5 y 200 ng-ml-1. Sin embargo, el límite de cuantificación (LOQ) y, por lo tanto, la concentración más baja en la curva de calibración se fijó en 1 ngm l-1 para ZEN, AZAL, BZEL, ZAN, DOM1 y AME en cerdos y para ZEN, AZAL, BZAL, ZAN, AOH, T2, ENNA y FB1 en pollos de engorde. En pollos de engorde, AZEL tenía un LOQ de 4 ngm l-1 y FB2 de 2 ngm l-1 y en cerdos AOH tenía un LOQ de 10 ngm l-1. Los resultados para los valores de LOQ y LOD correspondientes se encuentran en la Tabla 1 y la Tabla 3, respectivamente.

La precisión y exactitud dentro del día y entre días a una concentración de 10 y 100 ngml-1 cumplía los requisitos para todas las micotoxinas para ambas especies. Los resultados de los experimentos de precisión y exactitud dentro del día y entre días se pueden encontrar en las Tablas que se exponen a continuación, respectivamente.

Los resultados de supresión o potenciación de la señal (SSE) después de la extracción de las DBS de pollos de engorde y cerdos mostraron resultados aceptables (intervalo 60-112%) para la mayoría de los componentes. Además, en las DBS de cerdos, también se observaron buenas tasas de recuperación de extracción. Para algunos componentes, la SSE era más pronunciada y la recuperación de la extracción era bastante baja (<60%). Sin embargo, para todas las micotoxinas, se usaron un patrón interno (IS) adecuado y curvas de calibración coincidentes con la matriz, lo que produjo resultados de validación para la exactitud y precisión que se ajustaban a los criterios de aceptación. Los resultados para efectos de matriz y recuperación de extracción se muestran en las Tablas expuestas en dicha publicación.

En aras de la exhaustividad, se reproduce a continuación la tabla relativa a los resultados de los ensayos para sangre completa de cerdo:

Tabla

Los resultados de validación para la linealidad se muestran como la media ± desviación estándar de tres curvas en tres días diferentes de análisis (intervalo lineal, coeficiente de correlación (r) y coeficiente de bondad de ajuste (g)), límite de cuantificación (LOQ) y límite de detección (LOD) de 23 micotoxinas en manchas de sangre seca de sangre completa de cerdo.

Analito Linealidad (n = 3 Días diferentes) LOQ LOD Intervalo lineal r ± SD

(ng-ml-1) ng-ml-1 ng-ml-1 ZEN 1-200 0.999 ± 0.001 1.0 0.09

AZEL 0.5-200 0.998 ± 0.000 0.5 0.20

AZAL 1-200 0.998 ± 0.001 1.0 0.38

BZAL 0.5-200 0.997 ± 0.001 0.5 0.11

BZEL 1-200 0.994 ± 0.004 1.0 0.21

ZAN 1-200 0.996 ± 0.004 1.0 0.10

TEA 0.5-200 0.996 ± 0.003 0.5 0.04

AOH 10-200 0.994 ± 0.005 1.0 0.74

AME 1-200 0.993 ± 0.002 1.0 0.01

DON 0.5-200 0.994 ± 0.003 0.5 0.11

DOM1 1-200 0.997 ± 0.002 1.0 0.23 3/15ADON 0.5-200 0.994 ± 0.002 0.5 0.06

T2 0.5-200 0.996 ± 0.004 0.5 0.01

AFB1 0.5-200 0.994 ± 0.002 0.5 0.001 AFM1 0.5-200 0.991 ± 0.002 0.5 0.01

OTA 0.5-200 0.995 ± 0.003 0.5 0.01

ENN A1 0.5-200 0.997 ± 0.002 0.5 0.05

ENNA 0.5-100 0.998 ± 0.001 0.5 0.01

ENNB 0.5-100 0.999 ± 0.000 0.5 0.001 ENNB1 0.5-100 0.998 ± 0.001 0.5 0.001

BEA 0.5-200 0.997 ± 0.003 0.5 0.02

FB2 0.5-200 0.996 ± 0.002 0.5 0.35

FB1 1-200 0.994 ± 0.004 0.5 0.23

En aras de la exhaustividad, se reproduce a continuación la tabla relativa a los resultados de los ensayos para sangre completa de pollos de engorde:

Tabla

Los resultados de validación para la linealidad se muestran como la media ± desviación estándar de tres curvas en tres días diferentes de análisis (intervalo lineal, coeficiente de correlación (r) y coeficiente de bondad de ajuste (g)), límite de cuantificación (LOQ) y límite de detección (LOD) de 23 micotoxinas en manchas de sangre seca de sangre completa de pollos de engorde.

Analito Linealidad (n = 3 Días diferentes) LOQ LOD Intervalo lineal r ± SD g ± SD

(ng-ml-1) ng-ml-1 ng-ml-1 ZEN 1-200 0.997 ± 0.001 17 ± 3 1.0 0.12

AZEL 4-200 0.997 ± 0.0028 ± 3 4.0 1.10

AZAL 1-200 0.997 ± 0.002 16 ± 6 1.0 0.15

BZAL 1-200 0.996 ± 0.003 18 ± 2 1.0 0.27

BZEL 0.5-200 0.996 ± 0.003 16 ± 2 0.5 0.1

ZAN 1-200 0.997 ± 0.001 13 ± 5 1.0 0.21

TEA 0.5-200 0.998 ± 0.001 12 ± 6 0.5 0.001

AOH 1-200 0.996 ± 0.002 17 ± 3 1.0 0.02

AME 0.5-200 0.997 ± 0.001 17 ± 4 0.5 .001

DON 0.5-200 0.997 ± 0.000 15 ± 1 0.5 0.18 DOM1 0.5-200 0.998 ± 0.001 17 ± 1 0.5 0.16 3/15ADON 0.5-200 0.995 ± 0.003 16 ± 4 0.5 0.09

T2 1-200 0.998 ± 0.000 13 ± 5 1.0 0.03

AFB1 0.5-200 0.997 ± 0.001 15 ± 4 0.5 0.01

AFM1 0.5-200 0.997 ± 0.001 15 ± 2 0.5 0.01

OTA 0.5-200 0.998 ± 0.001 19 ± 1 0.5 0.05

ENN A1 0.5-200 0.993 ± 0.002 14 ± 5 0.5 0.04 ENNA 1-200 0.995 ± 0.003 16 ± 2 1.0 0.11

ENNB 0.5-200 0.994 ± 0.001 12 ± 1 0.5 0.07 ENNB1 0.5-200 0.998 ± 0.002 12 ± 3 0.5 0.001

BEA 0.5-200 0.996 ± 0.000 15 ± 4 0.5 0.07

FB2 1-200 0.997 ± 0.001 16 ± 3 1.0 0.96

FB1 2-200 0.995 ± 0.001 15 ± 3 2.0 1.87

Los autores de la presente invención han complementado los resultados anteriores con datos relativos a la linealidad, límite de cuantificación (LOQ) y límite de detección (LOD) que se evaluaron para los analitos que se añadieron al método de LC-MS/MS como se describe en esta referencia (2) y que se determinaron cuantitativamente, es decir, AFB2, AFG1 y AFG2.

Estos resultados se exponen en la tabla 7 a continuación:

Condiciones reales de cría

Las muestras de DBS de campo procedentes de pollos y cerdos provenientes de la producción de cría real, donde los animales se encuentran con piensos contaminados de forma natural, se analizaron utilizando el método de LC-MS/MS actualizado. Esta es una diferencia en comparación con el artículo descrito por Lauwers et al. (artículo de referencia 3] donde solo se analizaron muestras de DBS procedentes de un estudio toxicocinético con DON, ZEN y AFB1 en cerdos y OTA, AFB1 y DON en pollos de engorde.

Los resultados de este análisis de múltiples micotoxinas en una muestra real de DBS de pollo y cerdo demuestran la aplicabilidad del método de análisis de LC-MS/MS actualizado en modo positivo y negativo de ESI, respectivamente.

Ventajas de la presente invención:

Las ventajas del método según la presente invención:

En comparación con la monitorización de piensos para animales, la presente invención ofrece las siguientes ventajas:

1) La biomonitorización mide la exposición a nivel individual, mientras que el análisis de piensos muestra un riesgo general. La exposición a nivel individual tiene en cuenta la variación en el consumo de piensos y los parámetros ADME e integra la contaminación de todas las fuentes diferentes, lo que conduce a una estimación más precisa y un posible uso en estudios toxicocinéticos.

(ADME significa Absorción, distribución, metabolismo, excreción, todos estos parámetros toxicocinéticos que describen el efecto del cuerpo animal en las toxinas en cuestión);

2) Aunque el pienso es una matriz accesible, es difícil muestrear correctamente debido a la presencia de puntos calientes. La orina, las heces y, en particular, el plasma/sangre, por el contrario, son fáciles de muestrear correctamente y también permiten el muestreo secuencial;

3) Medición de la exposición completa: las micotoxinas modificadas pueden volver a convertirse a su forma original durante la digestión y contribuir así al efecto general de las toxinas. La biomonitorización incluye estos efectos y da así una estimación muy precisa del riesgo;

4) El uso de un aparato de LC-MS/MS es suficiente en comparación con el método de la técnica anterior, que requiere el uso adicional de un equipo de LC-HRMS;

5) Cribado amplio o biomonitorización de múltiples micotoxinas dirigido a 36 componentes en comparación con el método de la técnica anterior, limitado a 24 componentes.

Análisis de la biomonitorización como nueva herramienta para evaluar desintoxicantes de micotoxinas: Una forma común de contrarrestar el efecto nocivo de las micotoxinas consiste en añadir desintoxicantes de micotoxinas a los piensos para animales.

Un ejemplo de dicho desintoxicante es el producto comercializado por Innovad N.V., Cogels-Osylei 33, 2600 Antwerp, Bélgica, con la marca de producto Escent S®.

Un producto desintoxicante es un producto que disminuye los efectos asociados con las toxinas. Una posible manera de probar la eficacia de estos productos es haciendo ensayos de absorción in vivo. En estos ensayos se detecta la concentración de micotoxinas en matrices animales y se determina la diferencia de concentración con y sin desintoxicante. Esta diferencia es una medida de la eficacia del producto. Este tipo de ensayo da resultados precisos y en el futuro debería reemplazar los ensayos in vitro o ensayos in vivo basados en parámetros no específicos tales como el rendimiento del crecimiento y la conversión de piensos.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Método para la detección de las siguientes (10) micotoxinas y metabolitos en pollos de engorde o cerdos,

- Aflatoxina B1 (AFB1),

- Aflatoxina B2 (AFB2),

- Aflatoxina M1 (AFM1),

- Fumonisina (FB1),

- Fumonisina (FB2),

- Ocratoxina A (OTA),

- Deoxinivalenol (DON),

- Toxina T2 (T2),

- Toxina HT-2 (HT2),

- Zearalenona (ZEN),

comprendiendo dicho método:

- recoger la sangre de pollos de engorde o cerdos como una muestra de sangre seca;

- preparar la muestra de sangre seca para el análisis;

- analizar la muestra de sangre seca preparada por cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) en dos etapas:

a) detección en una etapa de LC-MS/MS,

- utilizando el procedimiento de LC de fase inversa como fase móvil una mezcla de ácido acético, acetonitrilo y agua, aumentando gradualmente la proporción de la solución de acetonitrilo frente a la solución de agua durante el procedimiento y al final disminuyendo para reacondicionar la columna de LC,

- funcionando el espectrómetro de masas en modo de ionización negativa por electropulverización, y

b) detección en otra etapa de LC-MS/MS,

- utilizando el procedimiento de LC de fase inversa como fase móvil una mezcla de formiato de amonio, ácido fórmico, agua y metanol, aumentando gradualmente la proporción de la solución de metanol frente a la solución de agua durante el procedimiento, y al final disminuyendo para reacondicionar la columna de LC,

- funcionando el espectrómetro de masas en modo de ionización positiva por electropulverización.

2. Método según la reivindicación 1, para la detección de las siguientes (8) micotoxinas y metabolitos adicionales:

- Éter metílico de alternariol (AME),

- Alternariol (AOH),

- Ácido tenuazónico (TEA),

- Beauvericina (BEA),

- Eniatina A, A1, B, B1 (ENNA, ENNA1, ENNB, ENNB1).

3. Método según la reivindicación 2, para la detección de las siguientes (18) micotoxinas y metabolitos adicionales:

- desepoxi-deoxinivalenol (DOM1),

- 15-acetildeoxinivalenol (15ADON),

- 3-acetildeoxinivalenol (3ADON),

- Zearalanona (ZAN),

- a-Zearalenol (AZEL),

- a-Zearalanol (AZAL),

- p-Zearalanol (BZAL),

- p-Zearalenol (BZEL),

- DON-glucurónido (DON-GlcA),

- DON-sulfato (DON-S),

- ZEN-glucurónido (ZEN-GlcA),

- ZEN-sulfato (ZEN-S),

- a-zearalenol-glucurónido (A-ZEL-GlcA),

- p-zearalenol-glucurónido (B-ZEL-GlcA),

- Fumonisina B3 (FB3),

- Aflatoxina M2 (AFM2),

- Aflatoxina G 1 (AFG1),

- Aflatoxina G2 (AFG2).

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde se detecta cualquiera de las siguientes (15) micotoxinas y metabolitos mediante el espectrómetro de masas funcionando en modo de ionización negativa por electropulverización:

- zearalenona (ZEN),

- zearalanona (ZAN),

- a-zearalenol (AZEL)

- a-zearalanol (AZAL),

- p-zearalanol (BZAL),

- p-zearalenol (BZEL),

- ácido tenuazónico (TEA),

- alternariol (AOH),

- éter metílico de alternariol (AME),

- sulfato de deoxinivalenol (DON-S),

- glucurónido de deoxinivalenol (DON-GlcA),

- sulfato de zearalenona (ZEN-S),

- glucurónido de zearalenona (ZEN-GlcA),

- a-ZEL-glucurónido (AZEL-GlcA),

- b-ZEL-glucurónido (BZEL-GlcA).

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde se detecta cualquiera de las siguientes (21) micotoxinas y metabolitos mediante el espectrómetro de masas funcionando en modo de ionización positiva por electropulverización:

- deoxinivalenol (DON),

- desepoxi-deoxinivalenol (DOM1),

- 3-acetildeoxinivalenol (3ADON),

- 15-acetildeoxinivalenol (15ADON),

- toxina T2 (T2),

- toxina HT-2 (HT2),

- aflatoxina B1 (AFB1),

- aflatoxina M1 (AFM1),

- ocratoxina A (OTA),

- eniatina A1 (ENNA1),

- eniatina A (ENNA),

- eniatina B (ENNB),

- eniatina B1 (ENNB1),

- beauvericina (BEA),

- fumonisina (FB1),

- fumonisina (FB2),

- aflatoxina B2 (AFB2),

- aflatoxina G1, (AFG1),

- aflatoxina G2 (AFG2),

- aflatoxina M2, (AFM2)

- fumonisina B3 (FB3).

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde

- en la etapa de LC-MS/MS, que usa como fase móvil una mezcla de una solución de ácido acético, acetonitrilo y agua, el tiempo total del procedimiento asciende a 11 min o menos, en donde la proporción de la solución de acetonitrilo frente a la solución de agua aumenta gradualmente de 5/95% a 60/40% en un período de tiempo máximo de 8 min, después disminuye a 5/95% durante un período de tiempo de 3 minutos para reacondicionar la columna de LC,

y/o,

- en la etapa de LC-MS/MS, que usa como fase móvil una mezcla de formiato de amonio, ácido fórmico, agua y metanol, el tiempo total del procedimiento asciende a 12 min o menos, en donde la proporción de la solución de metanol frente a la solución de agua aumenta gradualmente de 5/95% a 99/1% en un período de tiempo máximo de 9 min, después disminuye a 5/95% durante un período de tiempo de 3 minutos para reacondicionar la columna de LC.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde en el procedimiento de LC se utiliza una columna que comprende una fase estacionaria hidrofóbica que comprende sílice con cadenas de alquilo unidas covalentemente, preferiblemente sílice de alta resistencia con cadenas unidas de alquilo C18 trifuncionales.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende, antes del análisis, extraer las micotoxinas y los metabolitos de la muestra de sangre seca en un disolvente de extracción y someter el disolvente de extracción y la muestra de sangre seca a un tratamiento de baño ultrasónico.

9. Método según la reivindicación 8, por el cual el disolvente de extracción comprende una mezcla de ag u a/aceto n it ri lo/aceto n a.

10. Método según la reivindicación 8, que comprende secar el disolvente de extracción y reconstituir la masa seca en un disolvente de reconstitución.

11. Método según la reivindicación 10, por el cual el disolvente de reconstitución comprende una mezcla de agua/metanol/ácido fórmico.

12. Método según la reivindicación 1, que comprende además enriquecer la muestra de sangre seca recogida con uno o más patrones internos.

13. Método según la reivindicación 12, que comprende enriquecer la muestra de sangre seca recogida con uno o más patrones internos seleccionados de la siguiente lista:

- 13C15-deoxinivalenol,

- 13C17-aflatoxina B1,

- 13C17-aflatoxina M1,

- 13C20-ocratoxina A,

- 13C24-toxina T2,

- 13C34-fumonisina B1,

- 15N3-eniatina B,

- 13C615N- ácido tenuazónico,

- 13C18-zearalenona.

14. Uso del método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, para cribar y evaluar la exposición de cerdos o pollos de engorde a piensos contaminados con micotoxinas.

15. Uso del método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, para evaluar el impacto de la adición de agentes desintoxicantes de micotoxinas al pienso para animales.