ES2939013T3

ES2939013T3 - Agentes que se unen específicamente al motivo RGD de la cadherina 17 humana, la cadherina 5 humana, la cadherina 6 humana y la cadherina 20 humana

Info

Publication number: ES2939013T3
Application number: ES15716831T
Authority: ES
Inventors: Alvarez José Ignacio Casal; Conde Rubén Alvaro Bartolome
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Priority date: 2015-04-20
Filing date: 2015-04-20
Publication date: 2023-04-18
Anticipated expiration: 2035-04-20
Also published as: US10829560B2; EP3286218B1; AU2015392603B2; EP3286218A1; CA2980495A1; AU2015392603A1; WO2016169581A1; US20190048090A1; JP2018513141A

Abstract

La descripción se refiere a agentes que se unen específicamente a la cadherina 17 humana (CDH17) y/o a la cadherina 5 humana (CDH5) y/o a la cadherina 6 humana (CDH6) y/o a la cadherina 20 humana (CDH20). La divulgación también se relaciona con el uso de estos agentes en terapia, métodos para diagnóstico y/o pronóstico y/o estratificación de un cáncer en un sujeto, y composiciones farmacéuticas que comprenden dichos agentes. La divulgación también se refiere a marcadores de cáncer y marcadores de metástasis. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Agentes que se unen específicamente al motivo RGD de la cadherina 17 humana, la cadherina 5 humana, la cadherina 6 humana y la cadherina 20 humana

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de las terapias contra el cáncer. En particular, la invención se refiere a agentes que se unen específicamente a la cadherina-17 humana, la cadherina-5 humana, la cadherina-6 humana y/o la cadherina-20 humana, así como a métodos y usos de dichos agentes.

Antecedentes de la invención

La cadherina 17 (CDH17), también conocida como cadherina de hígado-intestino (cadherina LI), es una cadherina no canónica de dominios 7D. Su secuencia está formada por 7 dominios extracelulares y un dominio citoplásmico muy corto. CDH17 está presente en el hígado fetal y el tubo gastrointestinal, presentando una expresión elevada durante la embriogénesis. El gen se silencia en el hígado y el intestino sanos de los adultos. Sin embargo, CDH17 se vuelve a expresar en el cáncer gástrico, el carcinoma de esófago, el cáncer de páncreas y el hepatocarcinoma. En los tumores primarios de cáncer de colon, tumores poco diferenciados, así como en los ganglios linfáticos, CDH17 se expresa en niveles bajos.

Más del 90 % de las muestras de tumores de pacientes con cáncer colorrectal muestran expresión de cadherina-17 (CDH17). Existe una asociación significativa entre la alta expresión de CDH17 con la metástasis hepática y la baja supervivencia de los pacientes. La expresión de CDH17 aumenta en pacientes con metástasis y se correlaciona con un mal pronóstico, lo que sugiere una asociación entre la expresión de CDH17 y la colonización hepática final durante las últimas fases de la metástasis.

La expresión de CDH17 aumentó en células de cáncer de colon KM12SM altamente metastásicas. Un análisis proteómico exhaustivo de las proteínas de la membrana celular en estas células detectó solo 5 subunidades de integrina: a2, a6, av, p1 y p4. No se ha descrito la expresión de otras integrinas en células epiteliales de cáncer de colon, excepto algunas construcciones de integrina p6. CDH17 formaba parte de un gran complejo proteico que contenía, entre otras proteínas, integrinas a2p1 y a6p4 en células de cáncer colorrectal. Aunque la integrina a6p4 estaba presente en el complejo, solo la interacción con a2p1 desencadenó la ruta de señalización de las integrinas y provocó la activación de la cinasa de adhesión focal (FAK), de Ras, de ERK1/2 y de la ciclina D1 aumentando la adhesión y proliferación celular. Se ha descrito que la integrina a2 participa en la activación dependiente de colágeno tipo IV de la cinasa de adhesión focal (FAK) y participa en la metástasis hepática selectiva.

Lin et al. (2014, PLoS One 9:e85296) describieron que la genosupresión de CDH17 inhibía la proliferación celular, la migración, la adhesión y la formación de colonias, y también indujo una detención del ciclo celular y la apoptosis en las células de CG humanas AGS. Sus resultados demostraron la capacidad de CDH17 para regular la actividad de la ruta Ras/Raf/MEK/ERK para la proliferación celular en CG y sugieren que CDH17 puede servir como una diana terapéutica atractiva para futuros trabajos de investigación.

Wang et al. (2014, PLoS One 8:e72386) investigaron el potencial terapéutico de un anticuerpo monoclonal (Lic5) que se dirige al antígeno CDH17 en CHC. Los experimentos in vitro demostraron que Lic5 podía reducir notablemente la expresión de CDH17 de una manera dependiente de la dosis, suprimir la señalización de la catenina p e inducir escisiones de las enzimas apoptóticas caspasa 8 y 9 en células de CHC. El tratamiento de animales en el modelo de xenoinjerto de CHC subcutáneo demostró, de manera similar, una inhibición significativa del crecimiento tumoral usando el anticuerpo Lic5 solo o en combinación con un régimen de quimioterapia convencional.

Bartolomé RA et al (2014, Journal of Biological Chemistry, vol. 289, n.° 50, pág. 34801-34814) investigaron el papel de péptidos de RGD en la inhibición de la adhesión de dos líneas celulares al dominio 6 de CDH17 recombinante. El estudio demostró que el motivo de unión RGD de la cadherinas constituye un interruptor para la activación de la ruta de las integrinas y muestra una nueva capacidad de CDH17 como ligando de integrinas. Este motivo podría ser una diana para evitar la diseminación metastásica en tumores que sobreexpresan CDH17 y otras cadherinas que contienen RGD.

Dada la cantidad limitada de terapias dirigidas para tumores que expresan CDH17, todavía existe la necesidad en la técnica de proporcionar agentes que reconozcan específicamente a CDH17 que sean adecuados para el diagnóstico, el pronóstico y/o el tratamiento de un cáncer concomitante con células que expresan CDH17.

Breve descripción de la invención

Los autores de la presente invención han descubierto que la cadherina de 7D humana, CDH17, contiene un sitio RGD con capacidad para actuar como un nuevo ligando para la unión a integrinas. Esta conclusión se obtuvo a partir de las siguientes observaciones: i) la interacción de CDH17 con la integrina a2p1 precisaba la presencia del sitio de unión a RGD (Ejemplo 2), ii) la capacidad del motivo RGD para unirse específicamente a la integrina a2p1 en células de cáncer de colon fue respaldada por distintos ensayos de unión y adhesión celular, incluidos experimentos de ARNip (Ejemplo 3), iii) el ectodominio CDH17-RGD fue capaz de unirse a las células de cáncer de colon y de activar a la integrina p1 cuando se añadía exógenamente (Ejemplo 3) y iv) después de la inoculación in vivo, las células tumorales que expresan CDH17 RAD mutante mostraron un retraso considerable en el crecimiento tumoral y la colonización del hígado (Ejemplo 6). Resumiendo, RGD funciona como un interruptor que regula la activación de la integrina en las células metastásicas del cáncer de colon. Además, los inventores han generado una serie de agentes que se unen específicamente al motivo RGD de CDH17, así como péptidos que compiten con CDH17 por la interacción con la integrina a2p1. También han observado que también hay motivos RGD en otras cadherinas, tales como CDH5 y CDH6, y basándose en esta observación también han generado agentes que se unen específicamente a los motivos RGD de estas cadherinas.

Por tanto, en un aspecto, la invención se refiere a un agente que se une específicamente a un epítopo que comprende los restos 603 a 605 de la cadherina 17 (CDH17) humana y/o a un epítopo que comprende los restos 236 a 238 o los restos 299 a 301 de la cadherina 5 (CDH5) humana, y/ o a un epítopo que comprende los restos 83 a 85 de la cadherina 6 (CDH6) humana y/o a un epítopo que comprende los restos 89 a 91 de la cadherina 20 (CDH20) humana, en donde dicho agente se selecciona del grupo que consiste en:

i) un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de dicho anticuerpo que comprende

- dentro de la cadena pesada, una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 3 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4, y dentro de la cadena ligera, una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 8, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 9 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 10, o una variante funcionalmente equivalente de dichas CDR, en donde dicha variante funcionalmente equivalente tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos correspondientes mostradas en la SEQ ID NO: 2, 3, 4, 8, 9 o 10 y mantiene la capacidad de la secuencia de aminoácidos correspondiente mostrada en la SEQ ID NO: 2, 3, 4, 8, 9 o 10 de unirse a su antígeno afín y de inhibir la activación de la integrina p1 cuando forma parte de dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo

o

- dentro de la cadena pesada, una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 5 [CDR-H1], una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 6 [CDR-H2] y una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 7 [CDR-H3], y dentro de la cadena ligera, una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 11, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 12 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 13, o una variante funcionalmente equivalente de dichas CDR, en donde dicha variante funcionalmente equivalente tiene al menos el 90 % de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos correspondientes mostradas en la SEQ ID NO: 5, 6, 7, 11, 12 o 13 y mantiene la capacidad de la secuencia de aminoácidos correspondiente mostrada en la SEQ ID NO: 5, 6, 7, 11, 12 o 13 de unirse a su antígeno afín y de inhibir la activación de la integrina p1 cuando forma parte de dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo

y

ii) un anticuerpo producido por la línea celular de hibridoma con la referencia PA383-25.4.1, depositada el 9 de abril de 2015 en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH o un fragmento de unión a antígeno de dicho anticuerpo, en donde el fragmento de unión a antígeno se selecciona del grupo que consiste en Fv, Fab, F(ab')²y Fab'.

En otro aspecto, la invención se refiere a una construcción de anticuerpo que comprende el fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la invención, en donde la construcción de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en scFv, scFv-Fc, minicuerpo, (scFv)2 y diacuerpo.

En otro aspecto, la invención se refiere a un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en:

a) un ácido nucleico que codifica el agente de acuerdo con la invención o la construcción de anticuerpo de acuerdo con la invención, y

b) un ácido nucleico complementario de un ácido nucleico como se define en a)

o un casete de expresión que comprende dicho ácido nucleico, o un vector que comprende dicho ácido nucleico o dicho casete de expresión, o una célula que comprende dicho ácido nucleico, o dicho casete de expresión o dicho vector.

En otro aspecto, la invención se refiere a la línea celular de hibridoma con la referencia PA383-25.4.1, depositada el 9 de abril de 2015 por el Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH.

En otro aspecto, la invención se refiere a un agente de acuerdo con la invención, o una construcción de anticuerpo de acuerdo con la invención, para su uso como medicamento.

En otro aspecto, la invención se refiere a un agente de acuerdo con la invención, o una construcción de anticuerpo de acuerdo con la invención, para su uso en el tratamiento del cáncer.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para diagnosticar y/o pronosticar y/o estratificar un cáncer en un sujeto, que comprende:

i) poner en contacto el agente o la construcción de anticuerpo de acuerdo con la invención con una muestra biológica de dicho sujeto;

ii) separar dicho agente o construcción de anticuerpo no unida a la muestra;

iii) detectar y/o cuantificar el nivel de dicho agente o construcción de anticuerpo unida a CDH17 y/o CDH5 y/o CDH6 y/o CDH20 en dicha muestra biológica;

iv) comparar el nivel de dicho agente o construcción de anticuerpo unida a CDH17 y/o CDH5 y/o CDH6 y/o CDH20 detectado en la etapa (iii) con el de un valor de referencia; y

v) correlacionar el resultado obtenido con la presencia y/o el resultado clínico y/o el estadio de dicho cáncer.

En otro aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de acuerdo con la invención, o a una construcción de anticuerpo de acuerdo con la invención, junto con un excipiente o transportador farmacéuticamente aceptable.

Breve descripción de los dibujos

FIGURA 1. El análisis de secuencias de la familia de proteínas de las cadherinas revela un motivo RGD en varias cadherinas. (A) Estructura de cinco cadherinas que contienen motivos RGD (derecha) y las secuencias flanqueantes de tales motivos (izquierda). (B) CDH16, CDH6, CDH20 no se detectaron y CDH5 apenas se detectó en células KM12SM y RKO mediante transferencia de Western (CDH5, CDH16) o ensayos de amplificación por PCR (CDH6, CDH20). Como controles los positivos inventores utilizaron líneas celulares de cáncer de mama (MCF7), de carcinoma de células claras de riñón (786-O) y de melanoma SK-MEL-103 y A375.

FIGURA 2. La presencia de RGD de CDH17 es necesaria para el aumento de la adhesión y la proliferación celulares. (A, B) Las células RKO y KM12SM se transfectaron con vectores que codifican a CDH17 de tipo silvestre (CDH17 ts), una forma mutante (CDH17 RAD) o vectores vacíos (simulado). Los transfectantes se analizaron por transferencia de western (A) o por citometría de flujo (B) para evaluar la expresión de CDH17 en el lisado completo y en la membrana celular, respectivamente. (C) Las RKO transfectantes se sometieron a ensayos de agregación celular. Se muestran imágenes representativas y una cuantificación de células formando agregados. (D) Los transfectantes se sometieron a ensayos de adhesión celular en colágeno tipo IV o Matrigel. La adhesión se potenció significativamente por la sobreexpresión de CDH17 de tipo silvestre o disminuyó por el silenciamiento de CDH17 endógena (**, p <0,01; ***, p<0,001). (E) Los transfectantes de KM12SM se sometieron a ensayos de adhesión celular en Matrigel. La adhesión celular se inhibió significativamente mediante el silenciamiento de las proteínas indicadas, *** p < 0,001). (F) RKO y KM12SM se transfectaron con los ARNip para las subunidades de integrina indicadas o con un ARNip de control. Después de 48 h, los transfectantes se lisaron y los extractos se analizaron mediante inmunotransferencia para evaluar la interferencia en la expresión. Se usó anti-RhoGDI como control de carga. (G) Los transfectantes se incubaron en suero al 0,5 % durante 48 h y se sometieron a ensayos de MTT. La proliferación celular aumentó significativamente por la sobreexpresión de CDH17 ts (**, p<0,01).

FIGURA 3. El motivo RGD de CDH17 es un ligando de la integrina a2p1. (A) Unión de la integrina a2p1 a CDH17 DOM6 ts inmovilizado. Las células KM12SM se lisaron y cargaron en una columna de 1 ml de CDH17 DOM6 ts acoplada a agarosa. Después de un lavado extenso, la columna se eluyó con péptido RGDS. Las fracciones (1 ml) se precipitaron y se sometieron a transferencia de western utilizando anticuerpos anti-a2 y anti-integrina p1. La elución de RGDS comenzó en la fracción número 7. (B) Las células RKO transfectadas con vectores que codifican CDH17 ts, CDH17 RAD o vectores vacíos (simulado) se lisaron, se sometieron a inmunoprecipitación con anticuerpos anti-integrina a2 o anti-CDH17 y se analizaron por transferencia de western con los anticuerpos indicados. (C) Expresión de la integrina av en células RKO y KM12SM, detectada por transferencia de western (izquierda) y ensayos de inmunoprecipitación con anticuerpos anti-integrina av, anti-CDH17 o de control, que muestra la falta de asociación entre esta subunidad de integrina y CDH17 (derecha). (D) Geles de poliacrilamida teñidos con azul de coomasie que muestran la expresión del ectodominio purificado (Ecd, izquierda) o del dominio 6 purificado (DOM6, derecha) de CDH17 tanto de tipo silvestre (ts) como mutante que carece del motivo RGD (RAD). (E) Ensayos de unión solubles utilizando el ectodominio de CDH17 como ligando. La citometría de flujo demostró que después de la incubación con el ectodominio de tipo silvestre, este fragmento de proteína estaba unido a la superficie celular. En cada panel se indica la intensidad de fluorescencia media. (F) Ensayos de unión solubles utilizando el ectodominio de CDH17 como ligando en células silenciadas para las subunidades de integrina indicadas. La intensidad de fluorescencia media se indica tanto para Ecd de CDH17 ts como para RAD.

FIGURA 4. El motivo RGD de CDH17 es capaz de mediar en la adhesión celular. (A) Se sometieron células RKO y KM12SM a ensayos de adhesión celular en placas recubiertas con distintas concentraciones de CDH17-DOM6 ts o CDH17-DOM6 RAD en presencia de MnCl2 1 mM. La adhesión aumentó significativamente en las placas recubiertas con CDH17-DOM6 ts en comparación con las placas no recubiertas o recubiertas con CDH17-DOM6-RAD (**, p<0,01). (B) Se realizaron ensayos de adhesión celular a CDH17 DOM6 ts en presencia de péptidos RGDS, RADS o anticuerpos bloqueantes de la integrina anti-p1. La adhesión inhibió significativamente por la adición de péptidos o anticuerpos (*, p <0,05; **, p <0,01; ***, p<0,001). (C) Ensayos de adhesión celular a CDH17 DOM6 ts con células silenciadas para las subunidades de integrina indicadas. La adhesión se inhibió significativamente por el silenciamiento de las subunidades de integrina indicadas (**, p <0,01; ***, p<0,001). FIGURA 5. RGD mejora la activación de la integrina p1 y la adhesión celular a Matrigel. (A) Se transfectaron células RKO y KM12SM con vectores que codifican CDH17 ts o RAD o con vectores vacíos (simulado) y se sometieron a ensayos de citometría de flujo con el anticuerpo HUTS21, que reconoce a la integrina p1 en una conformación de alta afinidad, o con un anticuerpo de control. Dentro de cada panel, se muestra la intensidad de fluorescencia media. (B) Las células RKO y KM12SM se expusieron a CDH17 DOM6 (2 pg/ml) o Ecd (10 pg/ml) (ts o RAD) o medio durante 45 min y se sometieron a ensayos de citometría de flujo con el anticuerpo HUTS21 o un anticuerpo de control como en A. (C) Se expusieron las células RKO y KM12SM a péptidos de 9 aminoácidos (0,5 pg/ml) cuyas secuencias incluyen el motivo RGD y los aminoácidos flanqueantes pertenecientes a CDH5, CDH16 y CDH17, durante 45 min y se sometieron a citometría de flujo como en A. (D) Después de la incubación con CDH17 DOM6 o Ecd (ts o RAD), las células se recogieron y se sometieron a ensayos de adhesión celular a Matrigel. La adhesión se potenció significativamente con la incubación con CDH17 DOM6 ts o Ecd RAD (**, p<0,01; ***, p<0,001).

FIGURA 6. El motivo RGD es fundamental para el crecimiento tumoral y la diseminación metastásica. (A) Se inocularon por vía intraesplénica ratones desnudos suizos con células RKO o KM12SM transfectadas con vectores que codifican CDH17 ts, CDH17 RAD o vectores vacíos (simulado). La GAPDH humana se amplificó mediante RT-PCR a partir de ARN aislado de los hígados 24 horas después de la inoculación. Se usó como control la amplificación de la actina p murina. (B) Los mismos transfectantes se inocularon por vía subcutánea. (Arriba) Imagen representativa de tumores desarrollados después de 10 días. (Abajo) El peso tumoral después de 10 días aumentó significativamente en las células que expresaban CDH17 ts (*, p<0,05).

FIGURA 7. La expresión de CDH17 propicia la adhesión y proliferación celular en células de cáncer de páncreas. (A) Análisis inmunohistoquímico de la expresión de CDH17 en muestras de cáncer de páncreas humano (n=48), que muestra imágenes representativas de tinción fuerte, moderada o negativa y el porcentaje en cada clasificación. (B) Se transfectaron BxPc3, Capan-1 y PANC-1 con vectores que codifican CDH17 ts, CDH17 RAD o vectores vacíos (simulado). Los transfectantes se lisaron y los extractos se sometieron a análisis de transferencia western para confirmar la sobreexpresión de CDH17. (C) Los transfectantes se sometieron a ensayos de adhesión celular a Matrigel. La adhesión se potenció significativamente por la sobreexpresión de CDH17 ts (**, p<0,01; ***, p<0,001). (D) Los transfectantes se incubaron en suero al 0,5 % durante 24 h y se sometieron a ensayos de MTT. La proliferación celular aumentó significativamente por la sobreexpresión de CDH17 ts (**, p <0,01; ***, p<0,001). Como un control, se sometió a ensayos de MTT una fracción de las células en el tiempo 0.

FIGURA 8. Modelos propuestos para la interacción entre CDH17 y la integrina a2p1. (A, B) Tanto CDH17 de una célula contigua (A) como el ectodominio de CDH17 soluble (B) pueden modular la unión de la integrina a2p1 al colágeno tipo IV. (C) Se recolectó el medio acondicionado de 24 h de KM12SM, se concentró, se resolvió por SDS-PAGE, y se digirió "en el gel" con tripsina. Los espectros de masas se adquirieron en un espectrómetro de masas LTQ-Orbitrap Velos y los archivos se buscaron en la base de datos SwissProt utilizando el motor de búsqueda MASCOT. Los péptidos asignados a CDH17 están señalados en rojo en la secuencia de CDH17 (derecha). Todos los péptidos detectados pertenecen al ectodominio (dominios 1 a 7) de CDH17 (izquierda). El análisis proteómico detectó el 32 % del ectodominio.

FIGURA 9. Prueba de distintos anticuerpos en cuanto a su capacidad para inhibir la activación de la integrina p1. La inhibición de la activación de la integrina p1 inducida por el péptido de RGD de CDH17 mediante distintos anticuerpos (anticuerpos comerciales contra el dominio 6 de CDH17, sobrenadantes de anticuerpos monoclonales contra los péptidos RGD de CDH17 y suero contra el péptido RGD) se probó en células RKO.

FIGURA 10. Se probaron los mismos anticuerpos que en la Fig. 10 en cuanto a su capacidad para detener la proliferación celular. Inhibición del crecimiento celular por diferentes anticuerpos (comerciales, anticuerpos contra el dominio 6 de CDH17, sobrenadantes de anticuerpos monoclonales contra el dominio 6 de CDH17 y suero contra el péptido RGD) en células KM12SM.

FIGURA 11. Pruebas iniciales de distintos clones de hibridoma anti péptido RGD en cuanto a su capacidad para inhibir la activación de la integrina p1 inducida por el péptido de RGD de CDH17 en células RKO.

FIGURA 12. Segunda prueba de distintos clones de hibridoma anti péptido RGD en cuanto a su capacidad para inhibir la activación de la integrina p1 inducida por el péptido de RGD de CDH17 en células RKO.

FIGURA 13. Prueba final de los anticuerpos monoclonales purificados sobre la activación de la integrina p1. El AcM 25.4.1 mostró la capacidad de inhibir completamente (el 100 %) la activación de la integrina p1, seguido de 6.6.1 (90 %), 12.4.1 (70 %) y 6.5.2 (<60 %).

FIGURA 14. Prueba final de los anticuerpos monoclonales purificados sobre la adhesión celular. Los resultados obtenidos con los AcM sobre la adhesión celular siguieron el mismo orden, pero inverso, a la activación de la integrina p1. El AcM 25.4.1 provocó la mayor inhibición de la adhesión celular, seguido por los otros tres AcM en el mismo orden.

FIGURA 15. Prueba final de los anticuerpos monoclonales purificados sobre la proliferación celular. El AcM 12.4.1 fue el más eficaz para disminuir la proliferación celular, seguido de 6.5.2, 25.4.1 y 6.6.1.

FIGURA 16. Los motivos RGD de la cadherina (excepto de CDH16) estimularon la activación de la integrina p1. FIGURA 17. Los anticuerpos monoclonales contra el motivo RGD de CDH17 inhibieron la activación de la integrina p1 inducida por péptidos de RGD de CDH5 y por péptidos de RGD de CDH17 más cortos.

FIGURA 18. Expresión de CDH5 en líneas celulares de melanoma y cáncer de mama.

Descripción detallada de la invención

Definiciones

Como se usa en el presente documento, el término "agente" o la expresión "agente de unión" se usan indistintamente y se refieren a una molécula con capacidad de unirse específicamente a su diana afín y que muestra poca o ninguna unión a otras moléculas. En general, se considera que un agente tiene una alta afinidad por su diana afín mientras que tiene una baja afinidad por otras moléculas. En el contexto de la presente divulgación, el agente puede ser un agente de inmunoglobulina o un agente que no es de inmunoglobulina.

Como se usa en el presente documento, la expresión "agente de inmunoglobulina" se refiere a un agente de unión polipeptídico que tiene una estructura basada en un dominio o pliegue de inmunoglobulina. Las proteínas que tienen el dominio o pliegue de inmunoglobulina incluyen receptores de antígenos de superficie celular, correceptores y moléculas coestimulantes del sistema inmunitario, moléculas implicadas en la presentación de antígenos a los linfocitos, moléculas de adhesión celular, determinados receptores de citocinas y proteínas musculares intracelulares. En concreto, la presente divulgación se refiere a agentes de inmunoglobulina seleccionados de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno de dicho anticuerpo.

El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, se refiere a una glucoproteína que presenta actividad de unión específica para una proteína en particular, lo que se denomina "antígeno". El término "anticuerpo" comprende anticuerpos monoclonales completos o anticuerpos policlonales, o fragmentos de los mismos, e incluye anticuerpos humanos, anticuerpos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos y anticuerpos de origen no humano, tales como anticuerpos murinos, anticuerpos de camélido y nuevo receptor de antígeno de inmunoglobulina (IgNAR, del inglés immunoglobulin new antigen receptor). Los "anticuerpos monoclonales son poblaciones homogéneas de anticuerpos altamente específicos dirigidas contra un único sitio o "determinante" antigénico. Los "anticuerpos policlonales" incluyen poblaciones heterogéneas de anticuerpos dirigidos contra distintos determinantes antigénicos. Los anticuerpos pueden ser de cualquier isotipo. La elección del isotipo estará guiada normalmente por las funciones efectoras deseadas, tales como la inducción de ADCC. Los isotipos ilustrativos son IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.

Es bien sabido que la unidad estructural básica de un anticuerpo comprende un tetrámero. Cada tetrámero está constituido por dos parejas idénticas de cadenas polipeptídicas, cada una de las cuales está compuesta por una cadena ligera (25 KDa) y por una cadena pesada (50-75 KDa). La región aminoterminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100-110 o más aminoácidos, que está implicada en el reconocimiento de los antígenos. La región carboxiloterminal de cada cadena comprende la región constante que participa en la función efectora. Las regiones variables de cada pareja de cadenas ligeras y pesadas forman el sitio de unión del anticuerpo. Por lo tanto, un anticuerpo intacto tiene dos sitios de unión. Las cadenas ligeras se clasifican como k o A. Las cadenas pesadas se clasifican como y, m, a, 8 y £, y definen el isotipo del anticuerpo como, respectivamente, IgG, IgM, IgA, IgD o IgE.

Las regiones variables de cada pareja de cadenas ligeras y pesadas forman el sitio de unión del anticuerpo. Se caracterizan por una misma estructura general constituida por regiones relativamente preservadas llamadas regiones marco conservadas (FR) unidas por tres regiones hipervariables llamadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR). La expresión "región determinante de la complementariedad" o "CDR", como se usa en el presente documento, se refiere a la región dentro de un anticuerpo donde esta proteína complementa la forma de un antígeno. Por tanto, las CDR determinan la afinidad de la proteína (aproximadamente, la fuerza de unión) y la especificidad por antígenos específicos. Las CDR de las dos cadenas de cada pareja se alinean mediante las regiones marco conservadas, adquiriendo la función de unirse a un epítopo específico. En consecuencia, tanto la cadena pesada como la cadena ligera se caracterizan por tres CDR, respectivamente, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 y CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3.

Por "anticuerpo humanizado" se entiende un anticuerpo obtenido de un anticuerpo no humano, normalmente un anticuerpo murino, que conserva las propiedades de unión a antígeno del anticuerpo precursor, pero que es menos inmunogénico en seres humanos. Esto puede lograrse mediante diversos métodos, que incluyen (a) injertado de los dominios variables no humanos completos en regiones constantes humanas para generar anticuerpos quiméricos; (b) injertado de solo las regiones determinantes de complementariedad (CDR) no humanas en regiones marco conservadas y constantes humanas con o sin retención de restos estructurales críticos; o (c) trasplante de los dominios variables no humanos completos, pero "vistiéndolos" con una sección de tipo humano mediante el reemplazo de restos superficiales. Se han descrito en la técnica métodos para humanizar anticuerpos no humanos. Preferentemente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más restos de aminoácido introducidos en él procedentes de una fuente que es no humana. Estos restos de aminoácido no humanos se citan a menudo como restos "importados", que se toman normalmente de un dominio variable "importado". Además, es importante que los anticuerpos estén humanizados y conserven una alta afinidad por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para conseguir este objetivo, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un procedimiento de análisis de las secuencias precursoras y diversos productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias precursoras y humanizadas. Un paso adicional en este enfoque, para fabricar un anticuerpo más similar a los humanos, es preparar los denominados anticuerpos primatizados, es decir, un anticuerpo recombinante que ha sido genomodificado para contener los dominios pesados y ligeros variables de un anticuerpo de mono (u otro primate), en particular, un anticuerpo de macaco cangrejero, y que contiene secuencias de dominio constante humano, preferentemente el dominio constante gamma 1 o gamma 4 de inmunoglobulina humana (o variante de PE).

Por "anticuerpo humano" se entiende un anticuerpo que contiene cadenas ligeras y pesadas completamente humanas, así como regiones constantes, producido mediante cualquiera de los métodos convencionales conocidos.

Por "anticuerpo murino" se entiende un anticuerpo que contiene cadenas ligeras y pesadas completamente murinas, así como regiones constantes, producido mediante cualquiera de los métodos convencionales conocidos.

El término "hibridoma". como se usa en el presente documento, se refiere a la línea celular híbrida mediante la fusión de un linfocito B productor de anticuerpos específico con una célula de mieloma (cáncer de linfocitos B) que se selecciona por su capacidad para crecer en cultivo de tejidos y por la ausencia de síntesis de cadenas de anticuerpos. Los anticuerpos producidos por el hibridoma son habitualmente de una única especificidad y, por tanto, son anticuerpos monoclonales (a diferencia de los anticuerpos policlonales).

La expresión "fragmento de anticuerpo", como se usa en el presente documento, se refiere a un fragmento de un anticuerpo tal como, por ejemplo, Fragmentos Fv, Fab, F(ab')2 y Fab'. Se han desarrollado diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, estos fragmentos se obtuvieron mediante digestión proteolítica de anticuerpos intactos pero, más recientemente, estos fragmentos se pueden producir directamente mediante células hospedadoras recombinantes. La digestión con papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, llamados fragmentos "Fab", cada uno con un solo sitio de unión a antígeno y un fragmento "Fc" residual, cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizar con facilidad. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')²que tiene dos sitios de unión a antígeno y sigue siendo capaz de entrecruzarse con el antígeno. "Fv" es el fragmento mínimo de anticuerpo que contiene un sitio completo de reconocimiento y unión al antígeno. Esta región consiste en un dímero de una cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera en asociación estrecha, no covalente. Es en esta configuración en las que las tres regiones hipervariables de cada dominio variable interaccionan para definir un sitio de unión a antígeno en la superficie del dímero V^h-V^l. En conjunto, las seis CDR confieren al anticuerpo especificidad de unión al antígeno. Sin embargo, incluso un dominio variable único (o la mitad de un Fv que comprende solamente tres CDR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque con una afinidad menor que el sitio de unión completo. El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab en la adición de unos pocos restos en el extremo carboxilo del dominio CH1 de cadena pesada incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo.

La expresión "construcción de anticuerpo", como se usa en el presente documento, se refiere a construcciones basadas en dominios de unión de anticuerpos que normalmente se generan mediante técnicas de ingeniería genética. Los ejemplos de construcciones de anticuerpos incluyen scFv, scFv-Fc, minicuerpo, (scFv)²y diacuerpo. Estas y otras construcciones de anticuerpo se revisan en Cuesta et al., 2010 (Trends Biotechnol. 28:355-62) y se incluyen en el presente documento como referencia.

La expresión "anticuerpo de cadena pesada", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo que consiste únicamente en dos cadenas pesadas y carece de las dos cadenas ligeras que normalmente se encuentran en los anticuerpos. Los ejemplos de anticuerpos de cadena pesada incluyen el nuevo receptor de antígeno de inmunoglobulina (IgNAR) de peces cartilaginosos, tales como tiburones, y el anticuerpo de camélido expresado en camélidos, tales como dromedarios, camellos, llamas y alpacas. Los IgNAR tienen cinco dominios constantes (CH) por cadena en lugar de los tres habituales, varios enlaces disulfuro en posiciones inusuales, y la CDR3 forma un bucle extendido que cubre el sitio que se une a una cadena ligera en otros anticuerpos. Las cadenas pesadas de los anticuerpos de camélido han perdido uno de sus dominios constantes (CH1) y han experimentado modificaciones en el dominio variable (VH), ambos elementos estructurales necesarios para la unión de las cadenas ligeras.

Como se usa en el presente documento, la expresión "agente no de inmunoglobulina" se refiere a agentes de unión distintos de las inmunoglobulinas que se basan en distintas naturalezas moleculares, topologías o armazones. El término armazón pretende describir un marco proteico que puede portar aminoácidos alterados o inserciones de secuencias que confieren a variantes de proteínas distintas funciones, habitualmente para la unión a dianas específicas. Los ejemplos de tales agentes que no son de inmunoglobulina son bien conocidos en la técnica e incluyen, entre otros, aptámeros peptídicos, aptámeros de ácido nucleico, DARPin, aficuerpos y anticalinas. Los DARPin, aficuerpos, anticalinas y otros armazones proteicos se revisan en Binz et al., 2005 (Nat. Biotech. 23:1257-68) y se incluyen en el presente documento como referencia. La expresión "aptámero peptídico" se refiere a un dominio peptídico variable corto que se une en ambos extremos a un armazón proteico y que se une a una molécula diana específica. La longitud de bucle variable se compone normalmente de diez a veinte aminoácidos, y el armazón puede ser cualquier proteína que tenga buenas propiedades de solubilidad y compactación. Actualmente, la proteína bacteriana Tiorredoxina A es la proteína armazón más utilizada, estando el bucle variable insertado dentro del sitio activo reductor, que es un bucle de Cys-Gly-Pro-Cys (SEQ ID NO: 30) en la proteína silvestre, pudiendo las dos cadenas laterales de las Cys formar un puente disulfuro. La expresión "aptámero de ácido nucleico" o "aptámero de ADN", como se usa en el presente documento, se refiere a una cadena corta de ADN que se ha genomanipulado a través de rondas repetidas de selección para unirse a dianas moleculares específicas.

La expresión "ácido nucleico", como se usa en el presente documento, se refiere a polímeros formados por la repetición de monómeros llamados nucleótidos unidos por enlaces fosfodiéster. La expresión incluye tanto ADN como ARN.

La expresión "péptido lineal", como se usa en el presente documento, se refiere a un péptido que comprende entre 3 y 20 aminoácidos, que tiene extremos libres amino- y carboxiloterminales y que es lineal.

La expresión "péptido cíclico", como se usa en el presente documento, se refiere a un péptido que comprende entre 3 y 20 aminoácidos, y que está limitado por la ciclación en la cadena principal o en una cadena lateral del péptido.

La expresión "péptido ramificado", como se usa en el presente documento, se refiere a un péptido que comprende entre 3 y 20 aminoácidos, y al menos un enlace isopeptídico. Un "enlace isopeptídico" es un enlace amida que no está presente en la cadena principal de un péptido y, por lo tanto, forma una cadena peptídica "ramificada" adicional.

El término ''idéntico" o la expresión "porcentaje de identidad" en el contexto de dos o más secuencias de CDR, péptidos o polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o que tienen un porcentaje especificado de restos de aminoácido que son iguales, cuando se comparan y alinean (introduciendo huecos, en caso necesario) para lograr una correspondencia máxima, sin tener en cuenta ninguna sustitución de aminoácidos conservativa como parte de la identidad de secuencia. El porcentaje de identidad puede medirse usando programas informáticos o algoritmos de comparación de secuencias o mediante inspección visual. Se conocen diversos algoritmos y programas informáticos que pueden usarse para obtener alineamientos de secuencias de aminoácidos o nucleótidos. Un ejemplo no limitante de un algoritmo de alineamiento de secuencias de este tipo es el algoritmo incorporado en los programas NBLAST y XBLAST (Altschul et al., 1991, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402). En determinadas realizaciones, se puede utilizar Gapped BLAST. BLAST-2, WU-BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 (Genentech, South San Francisco, California) o Megalign (DNASTAR) son programas informáticos disponibles públicamente adicionales que pueden usarse para alinear secuencias. En determinadas realizaciones, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se determina usando el programa GAP en el programa informático GCG (por ejemplo, usando una matriz NWSgapdna.CMP y una ponderación por hueco de 40, 50, 60, 70 o 90 y una ponderación por longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6). En determinadas realizaciones alternativas, puede usarse el programa GAP del paquete informático GCG para determinar el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos (por ejemplo, usando o bien una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250 y una ponderación por hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y una ponderación por longitud de 1, 2, 3, 4, 5). Alternativamente, en determinadas realizaciones, el porcentaje de identidad entre secuencias de nucleótidos o aminoácidos se determina usando el algoritmo de Myers y Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989)). Por ejemplo, puede determinarse el porcentaje de identidad usando el programa ALIGN (versión 2.0) y usando una PAM120 con tabla de restos, una penalización por longitud de hueco de 12 y una penalización por hueco de 4. Un experto en la materia puede determinar los parámetros adecuados para un alineamiento máximo mediante un programa informático de alineamiento concreto. En determinadas realizaciones, se usan los parámetros por defecto del programa informático de alineamiento. En determinadas realizaciones, el porcentaje de identidad "X" de una primera secuencia de aminoácidos respecto de una segunda secuencia de aminoácidos se calcula como 100 x (Y/Z), en que Y es el número de restos de aminoácido puntuados como coincidencias idénticas en el alineamiento de las secuencias primera y segunda (alineadas mediante inspección visual o un programa de alineamiento de secuencias particular) y Z es el número total de restos en la segunda secuencia. Si la segunda secuencia es más larga que la primera secuencia, entonces el porcentaje de identidad puede determinarse solo en la región de solapamiento entre dichas primera y segunda secuencias. En este caso, se puede usar la misma fórmula que anteriormente pero usando como valor Z la longitud de la región en donde se solapan la primera y la segunda secuencias, teniendo dicha región una longitud que es sustancialmente la misma que la longitud de la primera secuencia.

Como un ejemplo no limitante, si algún polinucleótido en particular tiene un determinado porcentaje de identidad de secuencia (por ejemplo, es al menos el 70 % idéntico, al menos el 75 % idéntico, al menos el 80 % idéntico, al menos el 85 % idéntico, al menos el 90 % idéntico y, en algunas realizaciones, al menos el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntico) a una secuencia de referencia puede, en determinadas realizaciones, determinarse usando el programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wl 53711). Bestfit usa el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482 489 (1981), para hallar el mejor segmento de homología entre dos secuencias. Cuando se usa Bestfit o cualquier otro programa de alineamiento de secuencias para determinar si una secuencia particular es, por ejemplo, el 95 % idéntica a una secuencia de referencia de acuerdo con la presente invención, se ajustan los parámetros de tal forma que se calcula el porcentaje de identidad a lo largo de la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de referencia y que se permiten huecos en la homología de hasta el 5 % del número total de aminoácidos en la secuencia de referencia.

En algunas realizaciones, dos secuencias de CDR, péptidos o polipéptidos de la invención son sustancialmente idénticas, lo que significa que tienen al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 % y en algunas realizaciones al menos el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % de identidad de restos de aminoácidos, cuando se comparan y alinean para obtener una correspondencia máxima, medida usando un algoritmo de comparación de secuencias o por inspección visual. La identidad puede existir a lo largo de una región de las secuencias que es de al menos de aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 10, aproximadamente 20, aproximadamente 40-60 restos de longitud o cualquier valor integral intermedio y puede ser a lo largo de una región con una longitud superior a 60-80 restos, por ejemplo, al menos aproximadamente 90-100 restos y en algunas realizaciones, las secuencias son sustancialmente idénticas a lo largo de la longitud completa de las secuencias que se están comparando.

El término "epítopo", también conocido como determinante antigénico, se refiere a una parte de un antígeno que es reconocida por el sistema inmunitario, específicamente por anticuerpos, linfocitos B o linfocitos T, aunque en el contexto de la presente divulgación, este concepto también se extiende al reconocimiento por parte de agentes de unión que no son de inmunoglobulina. Por ejemplo, el epítopo es la porción específica del antígeno a la que se une un anticuerpo.

El término "cadherina 17" o "CDH-17" o "CDH17", como se usa en el presente documento, se refiere a una proteína que consiste en una región extracelular, que contiene 7 dominios de cadherina, y una región transmembranaria pero que carece del dominio citoplasmático conservado, que está presente en el tracto gastrointestinal y los conductos pancreáticos. También se conoce como transportador asociado a péptidos del intestino HPT-1, cadherina hígadointestino y cadherina LI. CDH-17 humana se representa con el número de referencia UniProt Q12864 (versión 131, 11 de marzo de 2015).

El término "cadherina 5" o "CDH-5" o "CDH5", como se usa en el presente documento, se refiere a una glucoproteína de adhesión célula-célula dependiente de calcio compuesta por cinco repeticiones de cadherina extracelulares, una región transmembranaria y una cola citoplásmica altamente conservada que desempeña un papel en las uniones intercelulares. También se conoce como cadherina tipo 2, cadherina vascular endotelial, cadherina VE y CD144. CDH-5 humana se representa con el número de referencia UniProt P33151 (versión 138, 11 de marzo de 2015).

El término "cadherina 6" o "CDH-6" o "CDH6", como se usa en el presente documento, se refiere a una glucoproteína de adhesión célula-célula dependiente de calcio, compuesta por cinco repeticiones de cadherina extracelulares, una región transmembranaria y una cola citoplasmática altamente conservada. También se conoce como cadherina renal o cadherina K. CDH-6 humana se representa con el número de referencia UniProt P55285 (versión 133, 11 de marzo de 2015).

El término "cadherina 20" o "CDH-20" o "CDH20", como se usa en el presente documento, se refiere a una glucoproteína de adhesión célula-célula dependiente de calcio, compuesta por cinco repeticiones de cadherina extracelulares, una región transmembranaria y una cola citoplásmica, que carece de una secuencia de reconocimiento de adhesión celular HAV específica de las cadherinas clásicas. CDH-20 humana se representa con el número de referencia UniProt Q9HBT6 (versión 113, 31 de marzo de 2015).

Como se usa en el presente documento, la expresión "cáncer en donde participan células que expresan CDH17 y/o CDH5 y/o CDH6 y/o CDH20 " se refiere a un cáncer en el que están implicadas directa o indirectamente células que expresan CDH17 y/o CDH5 y/o CDH6 y/o CDH20. La implicación de este tipo de células es independiente de que ^cD^h17 y/o CDH5 y/o CDH6 y/o CDH20 sean o no responsables del cáncer. Por ejemplo, CDH17 y/o CDH5 y/o CDH6 y/o CDH20 pueden expresarse de forma, localización o distribución alteradas, o en cantidad alterada, por ejemplo un valor más alto, con respecto a las condiciones fisiológicas normales o de referencia o valores de referencia. Como tal, la expresión "cáncer en donde participan células que expresan CDH17 y/o CDH5 y/o CDH6 y/o CDH20" es sustancialmente equivalente a "cáncer concomitante con células que expresan CDH17 y/o CDH5 y/o CDH6 y/o CDH20", o "cáncer en donde están implicadas directa o indirectamente células que expresan CDH17 y/o CDH5 y/o CDH6 y/o CDH20 ". Los ejemplos de cánceres en donde participan células que expresan CDH17 y/o CDH5 y/o CDH6 y/o CDH20 incluyen, sin limitación, melanoma, cáncer de mama y cánceres gastrointestinales, tal como cáncer de colon, cáncer de páncreas, cáncer de hígado, cáncer gástrico y carcinoma de esófago.

A medida que progresan los cánceres, pueden hacer metástasis. El término "metástasis" o la expresión "enfermedad metastásica", como se usa en el presente documento, se refiere a la diseminación de un cáncer o enfermedad de un órgano o parte a otro que no está directamente relacionado con él. Cuando las células tumorales metastatizan, el nuevo tumor se denomina tumor secundario o metastásico y sus células son similares a las del tumor original.

El término "marcador" o las expresiones "marcador tumoral" o "marcador de cáncer", como se usa en el presente documento, se refiere a un biomarcador que se encuentra en un líquido biológico, tal como sangre u orina, o en tejidos corporales, tales como tejido tumoral, que puede estar elevado en el cáncer.

El término "tratamiento" o "terapia" pueden usarse indistintamente y se refieren a la intervención clínica en un intento de prevenir, curar, retrasar, reducir la gravedad de o mejorar uno o más síntomas de la enfermedad o trastorno, o enfermedad o trastorno recurrente, o para prolongar la supervivencia de un paciente más allá de lo esperado en ausencia de tal tratamiento.

El término "muestra" o la expresión "muestra biológica" pretenden referirse a material biológico aislado de un sujeto. La muestra biológica puede contener cualquier material biológico adecuado para detectar el biomarcador deseado y puede comprender material celular y/o no celular del sujeto. La muestra se puede aislar de cualquier tejido o líquido biológico adecuado tal como, por ejemplo, tejido tumoral, sangre, saliva, plasma, suero, orina, líquido cefalorraquídeo (LCR), heces, un hisopado bucal o bucofaríngeo, una muestra quirúrgica y una muestra obtenida de una biopsia.

El término "sujeto", como se usa en el presente documento, se refiere a todos los animales clasificados como mamíferos e incluye, sin limitación, animales domésticos y de granja, primates y seres humanos, por ejemplo, seres humanos, primates no humanos, vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, perros, gatos o roedores. Preferentemente, el sujeto es un ser humano masculino o femenino de cualquier edad o raza.

El término "determinar", como se usa en el presente documento, se relaciona con la determinación de cualquier parámetro que pueda ser útil en el diagnóstico, el pronóstico o la estratificación de un cáncer en un sujeto. Como entenderán los expertos en la materia, la determinación de un parámetro, aunque se prefiere que lo sea no es necesario que sea correcta para el 100 % de los sujetos a diagnosticar o evaluar. El término, sin embargo, precisa que una parte estadísticamente significativa de sujetos pueda identificarse como presentando un parámetro dado.

El experto en la materia puede determinar sin dificultad si una cuestión es estadísticamente significativa utilizando diversas herramientas de evaluación estadística muy conocidas, por ejemplo, determinación de intervalos de confianza, determinación del valor de p, prueba de la t de Student, prueba de Mann-Whitney, etc. Los detalles se encuentran en Dowdy y Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, Nueva York 1983. Los intervalos de confianza preferidos son de al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 % o al menos el 95 %. Los valores de p son, preferentemente, 0,05, 0,01, 0,005 o inferior.

1. Agentes de unión

En un primer aspecto, la invención se refiere a un agente que se une específicamente a un epítopo que comprende los restos 603 a 605 de la cadherina 17 (CDH17) humana, denominado en lo sucesivo en el presente documento "e] primer agente de unión de la invención", en donde dicho agente se selecciona del grupo que consiste en:

- dentro de la cadena pesada, una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 3 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4, y dentro de la cadena ligera, una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 8, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 9 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 10, o una variante funcionalmente equivalente de dichas CDR, en donde dicha variante funcionalmente equivalente tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos correspondientes mostradas en la SEQ ID NO: 2, 3, 4, 8, 9 o 10 y mantiene la capacidad de la secuencia de aminoácidos correspondiente mostrada en la SEQ ID NO: 2, 3, 4, 8, 9 o 10 de unirse a su antígeno afín y de inhibir la activación de la integrina p1 cuando forma parte de dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo,

o

- dentro de la cadena pesada, una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 5 [CDR-H1], una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 6 [CDR-H2] y una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 7 [CDR-H3], y dentro de la cadena ligera, una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 11, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 12 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 13, o una variante funcionalmente equivalente de dichas CDR, en donde dicha variante funcionalmente equivalente tiene al menos el 90 % de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos correspondientes mostradas en la SEQ ID NO: 5, 6, 7, 11, 12 o 13 y mantiene la capacidad de la secuencia de aminoácidos correspondiente mostrada en la SEQ ID NO: 5, 6, 7, 11, 12 o 13 de unirse a su antígeno afín y de inhibir la activación de la integrina p1 cuando forma parte de dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo,

y

ii) un anticuerpo producido por la línea celular de hibridoma con la referencia PA383-25.4.1, depositada el 9 de abril de 2015 en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH o un fragmento de unión a antígeno de dicho anticuerpo, en donde el fragmento de unión a antígeno se selecciona del grupo que consiste en Fv, Fab, F(ab^')2y Fab'.

El epítopo al que se une el agente comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 14 (LRGDT). Esta secuencia corresponde a los restos 602 a 606 de CDH17 humana. Se entenderá que el epítopo al que se une el agente puede comprender al menos 3 restos, o al menos 4 restos, o al menos 5 restos, o al menos 6 restos, o al menos 7 restos, o al menos 8 restos, o al menos 9 restos, o al menos 10 restos o más restos de la secuencia de aminoácidos correspondiente de CDH17 en el extremo N, o en el extremo C, o en ambos extremos N y C de la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 14 (LRGDT). El epítopo al que se une el agente comprende o consiste en la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 1 (VSLRGDTRG).

En un segundo aspecto, la invención se refiere a un agente que se une específicamente a un epítopo que comprende los restos 236 a 238 y/o los restos 299 a 301 de la cadherina 5 (CDH5) humana, denominado en lo sucesivo en el presente documento "el segundo agente de unión de la invención", en donde dicho agente se selecciona del grupo que consiste en:

o

y

La invención contempla agentes de acuerdo con el segundo agente de unión de la invención que se unen específicamente a un epítopo que comprende los restos 236 a 238 de CDH-5 humana únicamente, o que se unen específicamente a los restos 299 a 301 de CDH5 humana únicamente, o que se unen específicamente a ambos epítopos, no necesariamente de manera simultánea.

En un tercer aspecto, la invención se refiere a un agente que se une específicamente a un epítopo que comprende los restos 83 a 85 de la cadherina 6 (CDH6) humana, denominado en lo sucesivo en el presente documento "el tercer agente de unión de la invención", en donde dicho agente se selecciona del grupo que consiste en:

o

y

En un cuarto aspecto, la invención se refiere a un agente que se une específicamente a un epítopo que comprende los restos 89 a 91 de la cadherina 20 (CDH20) humana, denominado en lo sucesivo en el presente documento "e] cuarto agente de unión de la invención", en donde dicho agente se selecciona del grupo que consiste en:

o

y

La invención también contempla agentes de unión según el primer o segundo agentes de unión de la invención que pueden unirse específicamente a un epítopo que comprende los restos 603 a 605 de CDH17 humana y a un epítopo que comprende los restos 236 a 238 y/o restos 299 a 301 de CDH5 humana. También se contemplan los agentes de unión de acuerdo con el primer o tercer agentes de unión de la invención que pueden unirse específicamente a un epítopo que comprende los restos 603 a 605 de CDH17 humana y a un epítopo que comprende los restos 83 a 85 de CDH6 humana. También se contemplan los agentes de unión de acuerdo con el primer o cuarto agentes de unión de la invención que pueden unirse específicamente a un epítopo que comprende los restos 603 a 605 de CDH17 humana y a un epítopo que comprende los restos 89 a 91 de CDH20 humana. También se contemplan los agentes de unión de acuerdo con el segundo o tercer agentes de unión de la invención que pueden unirse específicamente a un epítopo que comprende los restos 236 a 238 y/o los restos 299 a 301 de CDH5 humana y a un epítopo que comprende los restos 83 a 85 de CDH6 humana. También se contemplan los agentes de unión de acuerdo con el segundo o cuarto agentes de unión de la invención que pueden unirse específicamente a un epítopo que comprende los restos 236 a 238 y/o los restos 299 a 301 de CDH5 humana y a un epítopo que comprende los restos 89 a 91 de CDH20 humana. También se contemplan los agentes de unión de acuerdo con el tercer o cuarto agente de unión de la invención que pueden unirse específicamente a un epítopo que comprende los restos 83 a 85 de CDH6 humana y a un epítopo que comprende los restos 89 a 91 de CDH20 humana.

También se contemplan los agentes de unión de acuerdo con el primer, el segundo y el tercer agentes de unión de la invención que pueden unirse específicamente a un epítopo que comprende los restos 603 a 605 de CDH17 humana, y a un epítopo que comprende los restos 236 a 238 y/o los restos 299 a 301 de CDH5 humana, y a un epítopo que comprende los restos 83 a 85 de CDH6 humana. También se contemplan los agentes de unión de acuerdo con el primer, el segundo y el cuarto agentes de unión de la invención que pueden unirse específicamente a un epítopo que comprende los restos 603 a 605 de CDH17 humana, y a un epítopo que comprende los restos 236 a 238 y/o los restos 299 a 301 de CDH5 humana, y a un epítopo que comprende los restos 89 a 91 de CDH20 humana. También se contemplan los agentes de unión de acuerdo con el primer, el tercer y el cuarto agentes de unión de la invención que pueden unirse específicamente a un epítopo que comprende los restos 603 a 605 de CDH17 humana, y a un epítopo que comprende los restos 83 a 85 de CDH6 humana, y a un epítopo que comprende los restos 89 a 91 de CDH20 humana. También se contemplan los agentes de unión de acuerdo con el segundo, el tercer y el cuarto agentes de unión de la invención que pueden unirse específicamente a un epítopo que comprende los restos 236 a 238 y/o los restos 299 a 301 de CDH5 humana, y a un epítopo que comprende los restos 83 a 85 de CDH6 humana, y a un epítopo que comprende los restos 89 a 91 de CDH20 humana.

También se contemplan los agentes de unión de acuerdo con el primer, el segundo, el tercer y el cuarto agentes de unión de la invención que pueden unirse específicamente a un epítopo que comprende los restos 603 a 605 de CDH17 humana, y a un epítopo que comprende los restos 236 a 238 y/o los restos 299 a 301 de CDH5 humana, y a un epítopo que comprende los restos 83 a 85 de CDH6 humana, y a un epítopo que comprende los restos 89 a 91 de CDH20 humana.

También se entenderá que el primer, segundo, tercer y cuarto agentes de unión de la invención no necesitan unirse a todos los epítopos que reconocen simultáneamente.

El agente de unión de la invención es un agente de inmunoglobulina seleccionado de un anticuerpo y un fragmento de unión a antígeno de dicho anticuerpo. En una realización preferida, dicho fragmento de unión de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un Fv, Fab, F(ab^')2y Fab'.

En otro aspecto particular del primer, segundo, tercer o cuarto agentes de unión de la invención, dicho anticuerpo o dicho fragmento de unión a antígeno comprende o consiste en, dentro de la cadena pesada:

- una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 [CDR-H1], una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 3 [CDR-H2] y una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4 [CDR-H3], o una variante funcionalmente equivalente de dichas CDR, en donde dicha variante funcionalmente equivalente tiene al menos el 90 % de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos correspondientes mostradas en la SEQ ID NO: 2, 3 o 4, y mantiene la capacidad de la secuencia de aminoácidos correspondiente mostrada en la SEQ ID NO: 2, 3 o 4 de unirse a su antígeno afín y de inhibir la activación de la integrina p1 cuando forma parte de dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo o

- una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 5 [CDR-H1], una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 6 [CDR-H2] y una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 7 [CDR-H3], o una variante funcionalmente equivalente de dichas CDR, en donde dicha variante funcionalmente equivalente tiene al menos el 90 % de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos correspondientes mostradas en la SEQ ID NO: 5, 6 o 7, y mantiene la capacidad de la secuencia de aminoácidos correspondiente mostrada en la SEQ ID NO: 5, 6 o 7 de unirse a su antígeno afín y de inhibir la activación de la integrina p1 cuando forma parte de dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo.

En una realización preferida, dicho anticuerpo o el dicho fragmento de unión a antígeno comprende o consiste en:

i) dentro de la cadena pesada, una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 3 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4, y dentro de la cadena ligera, una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 8, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 9 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 10, o una variante funcionalmente equivalente de dichas CDR, en donde dicha variante funcionalmente equivalente tiene al menos el 90 % de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos correspondientes mostradas en la SEQ ID NO: 2, 3, 4, 8, 9 o 10 y mantiene la capacidad de la secuencia de aminoácidos correspondiente mostrada en la SEQ ID NO: 2, 3, 4, 8, 9 o 10 de unirse a su antígeno afín y de inhibir la activación de la integrina p1 cuando forma parte de dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo, o

ii) dentro de la cadena pesada, una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 5 [CDR-H1], una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 6 [CDR-H2] y una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 7 [CDR-H3], y dentro de la cadena ligera, una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 11, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 12 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 13, o una variante funcionalmente equivalente de dichas CDR, en donde dicha variante funcionalmente equivalente tiene al menos el 90 % de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos correspondientes mostradas en la SEQ ID NO: 5, 6, 7, 11, 12 o 13 y mantiene la capacidad de la secuencia de aminoácidos correspondiente mostrada en la SEQ ID NO: 5, 6, 7, 11, 12 o 13 de unirse a su antígeno afín y de inhibir la activación de la integrina p1 cuando forma parte de dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo.

Será inmediatamente evidente para el experto en la materia que estos dos conjuntos de CDR pertenecen a los anticuerpos secuenciados en el Ejemplo 10, que también son parte de la presente invención.

El experto en la materia entenderá que las secuencias de aminoácidos de las CDR del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con el primer, el segundo y el tercer agente de unión de la invención pueden incluir una o más sustituciones de aminoácidos de manera que, aunque la secuencia primaria del polipéptido esté alterada, se mantiene la capacidad del anticuerpo para unirse a un epítopo que comprende los restos 603 a 605 de CDH17 humana y/o a un epítopo que comprende los restos 236 a 238 y/o los restos 299 a 301 de CDH5 humana y/o a un epítopo que comprende los restos 83 a 85 de CDH6 humana, y/o a un epítopo que comprende los restos 89 a 91 de CDH20 humana. Dicha sustitución puede ser una sustitución conservativa, lo que en general indica que un aminoácido se sustituye por otro aminoácido que tiene propiedades similares. Por ejemplo, la sustitución del ácido glutámico (aminoácido cargado negativamente) por ácido aspártico sería una sustitución conservativa de aminoácidos.

La presente invención también contempla variantes funcionalmente equivalentes de las secuencias de las CDR de las SEQ ID NO: 2 a 13, que están dentro del alcance de la invención. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "variante funcionalmente equivalente de una secuencia de CDR" se refiere a una variante de una secuencia de una secuencia de CDR particular que tiene una identidad de secuencia sustancialmente similar con ella y mantiene sustancialmente su capacidad para unirse a su antígeno afín y de inhibir la activación de la integrina p1 cuando forma parte de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo como los descritos en el presente documento. Por ejemplo, una variante funcionalmente equivalente de una secuencia de CDR puede ser una secuencia polipeptídica derivada de dicha secuencia que comprende la adición, deleción o sustitución de uno o más aminoácidos.

Las variantes funcionalmente equivalentes de una secuencia de CDR de acuerdo con la invención incluyen secuencias de CDR que tienen al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos correspondientes que se muestran en una de las SEQ ID NO: de 2 a 13. También se contempla que las variantes funcionalmente equivalentes de una secuencia de CDR comprendan adiciones que consisten en al menos 1 aminoácido, o al menos 2 aminoácidos, o al menos 3 aminoácidos, o al menos 4 aminoácidos, 0 al menos 5 aminoácidos, o al menos 6 aminoácidos, o al menos 7 aminoácidos, o al menos 8 aminoácidos, o al menos 9 aminoácidos, o al menos 10 aminoácidos o más aminoácidos en el extremo N o en el extremo C, o tanto en el extremo N como en el extremo C de la secuencia de aminoácidos correspondiente mostrada en una de las SEQ ID NO: de 2 a 13. Asimismo, también se contempla que las variantes comprendan deleciones que consisten en al menos 1 aminoácido, o al menos 2 aminoácidos, o al menos 3 aminoácidos, o al menos 4 aminoácidos, o al menos 5 aminoácidos, o al menos 6 aminoácidos, o al menos 7 aminoácidos, o al menos 8 aminoácidos, o al menos 9 aminoácidos, o al menos 10 aminoácidos o más aminoácidos en el extremo N o en el extremo C, o tanto en el extremo N como en el extremo C de la secuencia de aminoácidos correspondiente mostrada en una de las SEQ ID NO: de 2 a 13.

Las variantes funcionalmente equivalentes de una secuencia de CDR de acuerdo con la invención mantendrán preferentemente al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 %, al menos el 100 %, al menos el 105 %, al menos el 110 %, al menos el 115 %, al menos el 120 %, al menos el 125 %, al menos el 130 %, al menos el 135 %, al menos el 140 %, al menos el 145 %, al menos el 150 %, al menos el 200 % o más de la capacidad de la secuencia de aminoácidos correspondiente mostrada en una de las SEQ ID NO: 2 a 13 de unirse a su antígeno afín y de inhibir la activación de la integrina p1 cuando forma parte de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo como los de la invención. La capacidad de unirse a su antígeno afín puede determinarse como un valor de afinidad, avidez, especificidad y/o selectividad del anticuerpo o fragmento de anticuerpo para su antígeno afín.

La capacidad de los agentes de unión de acuerdo con la invención, y en particular del anticuerpo o fragmento de anticuerpo como se describe en el presente documento, para unirse a un epítopo que comprende los restos 603 a 605 de CDH17 humana, y/o a un epítopo que comprende los restos 236 a 238 y/o los restos 299 a 301 de CDH5 humana, y/o a un epítopo que comprende los restos 83 a 85 de CDH6 humana, puede determinarse mediante una serie de ensayos que son bien conocidos en la técnica. Preferentemente, la capacidad de unión de los agentes de unión se determina por inmunoprecipitación o por un ensayo de unión in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA), ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), resonancia de plasmón superficial o por técnicas inmunofluorescentes tales como inmunohistoquímica (IHQ), microscopía de fluorescencia o citometría de flujo. La afinidad del agente de unión de la invención por un epítopo que comprende los restos 603 a 605 de CDH17 humana y/o un epítopo que comprende los restos 236 a 238, y/o los restos 299 a 301 de CDH5 humana y/o un epítopo que comprende los restos 83 a 85 de CDH6 humana, y/o a un epítopo que comprende los restos 89 a 91 de CDH20 humana es de al menos 10-6M, al menos 10-7 M, al menos 10-8 M, al menos 10-9 M, al menos 10-10 M, al menos 10-11, al menos 10-12 M, o más.

En otra realización particular del primer, segundo, tercer o cuarto agentes de unión de la invención, dicho agente es el anticuerpo producido por la línea celular de hibridoma con referencia PA383-25.4.1, depositada el 9 de abril de 2015 en el Leibniz Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) GmbH o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

En una realización preferida, el fragmento de unión a antígeno del anticuerpo producido por la línea celular de hibridoma con referencia PA383-25.4.1, depositada el 9 abril de 2015 en el Leibniz Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) GmbH se selecciona del grupo formado por un Fv, Fab, F(ab')²y Fab'.

En otra realización particular del primer, segundo, tercer o cuarto agentes de unión de la invención, dicho anticuerpo o dicho fragmento de unión a antígeno está humanizado.

En otra realización particular del primer, segundo, tercer o cuarto agentes de unión de la invención, dicho anticuerpo o dicho fragmento de unión a antígeno es humano.

En otra realización particular del primer, segundo, tercer o cuarto agentes de unión de la invención, dicho anticuerpo o dicho fragmento de unión a antígeno es murino.

En otra realización particular del primer, segundo, tercer o cuarto agentes de unión de la invención, dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es un nuevo receptor de antígeno de inmunoglobulina (IgNAR).

En otra realización particular del primer, segundo, tercer o cuarto agentes de unión de la invención, dicho anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno es un anticuerpo de camello.

En otro aspecto del primer, segundo, tercer o cuarto agentes de unión de la divulgación, el agente es un agente que no es de inmunoglobulina seleccionado del grupo que consiste en un aptámero peptídico, un aptámero de ácido nucleico, una DARPin, un aficuerpo y una anticalina.

En un aspecto, el agente que no es de inmunoglobulina es un aptámero peptídico. En otro aspecto, el agente que no es de inmunoglobulina es un aptámero de ácido nucleico. En otro aspecto, el agente que no es de inmunoglobulina es un DARPin. En otro aspecto, el agente que no es de inmunoglobulina es un aficuerpo. En otra divulgación, el agente que no es de inmunoglobulina es una anticalina.

Será inmediatamente evidente para el experto en la materia que los fragmentos de unión a antígeno descritos en el presente documento pueden modificarse mediante ingeniería genética para producir construcciones con una avidez y/o funcionalidad modificadas. Existen numerosos enfoques en la técnica para obtener construcciones de anticuerpos, tales como las destacadas en Cuesta et al. (citado anteriormente).

Por tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a una construcción de anticuerpo, en lo sucesivo en el presente documento denominado la construcción de anticuerpo de la invención, que comprende el fragmento de unión a antígeno de acuerdo con los fragmentos de anticuerpo descritos en relación con el primer, segundo, tercer o cuarto agentes de unión de la invención, en donde la construcción de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en scFv, scFv-Fc, minicuerpo, (scFv)²y diacuerpo.

En una realización particular, la construcción de anticuerpo es un scFv. En otra realización particular, la construcción de anticuerpo es un scFv-Fc. En otra realización particular, la construcción del anticuerpo es un minicuerpo. En otra realización particular, la construcción de anticuerpo es un (scFv)². En otra realización particular, la construcción de anticuerpo es un diacuerpo.

En otra realización particular, la construcción de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en scFv, scFv-Fc, minicuerpo, (scFv)²y diacuerpo, comprende el fragmento de unión a antígeno del anticuerpo producido por la línea celular de hibridoma con referencia PA383-25.4.1, depositada el 9 de abril de 2015 en el Leibniz Institut DSMZ -Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) GmbH.

También se contemplan la modificación (o modificaciones) de la secuencia de aminoácidos de los agentes de unión y las construcciones de anticuerpo descritas en el presente documento en posiciones distintas de las CDR o los sitios de unión. Por ejemplo, puede ser conveniente mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del agente de unión. Se preparan variantes de la secuencia de aminoácidos del agente de unión introduciendo los cambios de nucleótidos apropiados en el ácido nucleico del anticuerpo, o mediante síntesis peptídica. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones de y/o inserciones en y/o sustituciones de, restos dentro de las secuencias de aminoácido del agente de unión. Puede realizarse cualquier combinación de deleción, inserción y/o sustitución, siempre que el agente de unión final posea las características deseadas. Los cambios de aminoácido pueden alterar además los procesos postraduccionales de la molécula, tales como el cambio del número o la posición de los sitios de glucosilación. Las inserciones en secuencias de aminoácidos incluyen fusiones amino- y/o carboxiloterminales con un intervalo de longitudes de un resto a polipéptidos que contienen cien o más restos, así como inserciones intrasecuencia de restos de aminoácidos individuales o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un péptido con un resto metionilo aminoterminal o la cadena polipeptídica del anticuerpo fusionada a un polipéptido citotóxico. Otras variantes de inserción de la molécula incluyen la fusión con el extremo N o C de una enzima o un polipéptido que aumenta su semivida en suero.

En la realización particular del agente de unión que es un anticuerpo, otro tipo de variante de aminoácido del anticuerpo altera su patrón de glucosilación original. Por alteración se entiende la deleción de una o más fracciones de carbohidrato encontradas en la molécula y/o la adición de uno o más sitios de glucosilación que no estén presentes en ella. Normalmente, la glucosilación de polipéptidos está unida a N o unida a O. Unido en N se refiere a la unión de la fracción de carbohidrato con la cadena lateral de un resto de asparagina. Las secuencias tripeptídicas de asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en que X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del resto de carbohidrato con la cadena lateral de asparagina. Por tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido crea un sitio de glucosilación potencial. Glucosilación unida a O se refiere a la unión de uno de los monosacáridos o derivados de monosacárido N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa con un hidroxiaminoácido, más frecuentemente serina o treonina, aunque también pueden usarse 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina. Se realiza convenientemente la adición de sitios de glucosilación en el anticuerpo, modificando la secuencia de aminoácidos de tal manera que contenga una o más de las secuencias tripeptídicas descritas anteriormente (para sitios de glucosilación unidos en N). La modificación también puede realizarse mediante la adición de, o sustitución por, uno o más restos de serina o treonina en la secuencia del anticuerpo original (para sitios de glucosilación unidos en O). Las moléculas de ácido nucleico que codifican las variantes de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo se preparan mediante una diversidad de métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen el aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencias de aminoácidos de origen natural) o la preparación mediante mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida al sitio), mutagénesis por PCR, y mutagénesis de casete de una variante preparada anteriormente o de una versión no variante del anticuerpo.

Además, puede ser conveniente modificar los anticuerpos descritos en el presente documento para mejorar su función efectora, por ejemplo, para potenciar la ADCC y/o la CDC del anticuerpo. Esto se puede lograr introduciendo una o más sustituciones de aminoácidos en una región Fc en un anticuerpo. Los grupos glucosilo añadidos a la cadena principal de aminoácidos de las glucoproteínas, por ejemplo, los anticuerpos, están formados por varios monosacáridos o derivados de monosacárido dando como resultado una composición que puede ser distinta en el mismo anticuerpo producido en células procedentes distintos mamíferos o tejidos. Además, se ha demostrado que la composición distinta de los grupos glucosilo puede afectar la potencia en la mediación de la citotoxicidad mediada por células dependiente de antígeno (ADCC) y/o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) del anticuerpo. Por lo tanto, es posible mejorar esas propiedades mediante el estudio del patrón de glucosilación de anticuerpos de distintas fuentes.

Otras modificaciones adecuadas para los anticuerpos descritos en el presente documento incluyen la introducción de un resto o restos de cisteína en la región Fc, permitiendo así la formación de enlaces disulfuro intercatenarios en esta región para mejorar la capacidad de internalización y/o aumentar la destrucción celular mediada por el complemento y la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).

Para aumentar la semivida sérica del agente de unión, se puede incorporar un epítopo de unión al receptor de rescate en el agente. Como se usa en el presente documento, la expresión "epítopo de unión al receptor de rescate" se refiere a un epítopo de la región Fc de una molécula de IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, o IgG4) que es responsable de aumentar la semivida en suero in vivo de la molécula de IgG.

En otro aspecto, la invención se refiere a un ácido nucleico, en lo sucesivo en el presente documento denominado "e] ácido nucleico de la invención", seleccionado entre el grupo que consiste en:

a) un ácido nucleico que codifica el agente de acuerdo con el primer, segundo y tercer agentes de unión de la invención, o la construcción de anticuerpo de acuerdo con la invención, y

b) un ácido nucleico complementario de un ácido nucleico como se define en a).

Dicho ácido nucleico de la invención puede contener una secuencia reguladora unida operativamente para la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica el agente de unión o la construcción de anticuerpo de la invención, formando así una construcción génica, en lo sucesivo en el presente documento denominado "la construcción génica de la invención". Como se usa en el presente documento, la expresión "unido operativamente" significa que el agente de unión o construcción de anticuerpo codificada por la secuencia de ácido nucleico de la invención se expresa en el marco de lectura correcto bajo el control de las secuencias reguladoras o de control de la expresión. Por lo tanto, en otro aspecto, la invención proporciona un casete de expresión, en lo sucesivo en el presente documento denominado "casete de expresión de la invención", que comprende la construcción génica de la invención unida operativamente a una secuencia de control de la expresión. La construcción génica de la invención puede obtenerse mediante el uso de técnicas extensamente conocidas en la técnica anterior.

Las secuencias de control son secuencias que controlan y regulan la transcripción y, cuando corresponda, la traducción de dicho anticuerpo, e incluyen secuencias promotoras, secuencias codificantes de reguladores transcripcionales, secuencias de unión al ribosoma (RBS, del inglés ribosome binding sequences) y/o secuencias de terminación de la transcripción. El casete de expresión de la presente invención puede incluir adicionalmente un potenciador, que puede estar adyacente o distante de la secuencia promotora y puede actuar aumentando la transcripción de la misma. En una realización particular, dicha secuencia de control de la expresión es funcional en células y organismos procariotas, tales como bacterias, etc. Mientras que en otra realización particular, dicha secuencia de control de la expresión es funcional en células y organismos eucariotas, por ejemplo, células de insecto, células vegetales, células de mamífero, etc.

En esta metodología se puede utilizar cualquier promotor disponible. En una realización preferida de la presente invención, el promotor usado en la construcción de ácido nucleico de la presente invención es activo en la población celular específica que se va a transfectar. Los ejemplos ilustrativos y no limitantes de promotores ubicuos que pueden estar presentes en el casete de expresión de la invención incluyen el promotor del citomegalovirus humano (hCMV), el promotor de SV40, el promotor EF1-alfa y el promotor de la ubiquitina C. Los ejemplos ilustrativos, no limitantes, de promotores específicos de tipo de célula y/o promotores específicos de tejido tales como de la albúmina incluyen que sean específicos para el hígado, promotores específicos para tejidos linfoides, etc.

Ventajosamente, el casete de expresión de la invención comprende además un marcador o gen que codifica un motivo o fenotipo que permite seleccionar la célula hospedadora transformada con dicho casete de expresión. Los ejemplos ilustrativos de dichos marcadores que podrían estar presentes en el casete de expresión de la invención incluyen genes de resistencia a antibióticos, genes de resistencia a compuestos tóxicos y, en general, todos los que permitan seleccionar las células transformadas genéticamente.

Las construcciones génicas de la invención o el casete de expresión de la invención pueden insertarse en vectores apropiados. Por tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a un vector, tal como un vector de expresión, en lo sucesivo en el presente documento denominado "el vector de la invención", que comprende dichas construcciones génicas o dichos casetes de expresión de la invención. La elección del vector depende de la célula hospedadora en la que se introducirá posteriormente. Como ejemplo, el vector en el que se insertan dichas secuencias de ácido nucleico puede ser un plásmido o un vector que, cuando se introduce en la célula hospedadora, se integre o no en el genoma de dicha célula. La obtención de este vector se puede realizar por métodos convencionales conocidos por el experto en la materia. En una realización particular, dicho vector recombinante es un vector útil para transfectar células animales.

Dicho vector se puede utilizar para transformar, transfectar o infectar células susceptibles de ser transformadas, transfectadas o infectadas mediante dicho vector. Dichas células pueden ser procariotas o eucariotas. Por lo tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a una célula, en lo sucesivo en el presente documento denominado "la célula de la invención", que comprende el ácido nucleico o el casete de expresión o el vector de acuerdo con la invención. Para obtener la célula de la invención, la célula puede necesitar ser transformada, transfectada o infectada con el vector de la invención. Dicha célula transformada, transfectada o infectada comprende, por lo tanto, un ácido nucleico de la invención, una construcción génica de la invención o un casete de expresión o vector de la invención.

Las células transformadas, transfectadas o infectadas pueden obtenerse mediante métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia. Las células adecuadas para realizar la invención incluyen, sin limitación, células de mamífero, vegetales, de insecto, fúngicas y bacterianas. Las células bacterianas incluyen, sin limitación, células de bacterias grampositivas tales como especies del género Bacillus, Streptomyces y Staphylococcus y células bacterianas gramnegativas tales como células del género Escherichia y Pseudomonas. Las células fúngicas incluyen preferentemente células de levadura tales como Saccharomyces, Pichia pastoris y Hansenula polymorpha. Las células de insecto incluyen, sin limitación, células de Drosophila y células Sf9. Las células vegetales incluyen, entre otras, células plantas de cultivo tales como cereales, medicinales, ornamentales o bulbos. Las células de mamífero adecuadas para la presente invención incluyen líneas celulares epiteliales, líneas celulares de osteosarcoma, líneas celulares de neuroblastoma, carcinoma epiteliales, gliocitos, líneas celulares hepáticas, células CHO, células COS, células BHK, células HeLa, células 911, células AT1080, células A549, células HEK 293 y 293T, células PER.C6, células CCE humanas NTERA-2, células D3 de la línea de CMEr, células madre embrionarias humanas tales como HS293, hMSC y BGV01, SHEF1, SHEF2 y HS181, células NIH3T3, células REH y MCF-7.

En otro aspecto, la invención se refiere a la línea celular de hibridoma con la referencia PA383-25.4.1, depositada el 9 de abril de 2015 en el Leibniz Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) GmbH, en lo sucesivo en el presente documento denominado "la línea celular de hibridoma de la invención".

En otros aspectos no cubiertos por la invención reivindicada, se divulga un método para producir dicho anticuerpo de la invención, que comprende cultivar la célula o la línea celular de hibridoma de la invención en condiciones que permitan la producción del agente de unión de la invención. Las condiciones para optimizar el cultivo de dicha célula dependerán de la célula utilizada. Si se desea, el método para producir el anticuerpo de la invención incluye además el aislamiento y la purificación de dicho agente de unión.

2. Péptidos (aspectos no cubiertos por la invención reivindicada)

En otro aspecto, se divulga un péptido, denominado en lo sucesivo en el presente documento "el péptido de la divulgación", que comprende la secuencia RGD seleccionada del grupo que consiste en LRGDT (SEQ ID NO: 14), LRGDS (SEQ ID NO: 15), LRGDY (SEQ ID NO: 16), DRGDG (SEQ ID NO: 17) o una variante del mismo que tiene al menos el 70 % de identidad de secuencia con dichas secuencias.

El experto en la materia apreciará de inmediato que la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 14 corresponde a los restos 602 a 606 de CDH17 humana, la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 15 corresponde a los restos 235 a 239 de CDH5 humana, la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 16 corresponde a los restos 298 a 302 de CDH5 humana, la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 17 corresponde a los restos 82 a 86 de CDH6 humana así como a los restos 88 a 92 de CDH20 humana.

La presente divulgación también contempla variantes de los péptidos que comprenden las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 14 a 17 que tengan al menos el 70 % de identidad de secuencia con dichas secuencias. Por tanto, las variantes del péptido de la invención incluyen péptidos con secuencias que tienen al menos aproximadamente el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos correspondientes que se muestran en una de las SEQ ID NO: 14 a 17.

Se contempla también que una variante de los péptidos que se muestran en la SEQ ID NO: 14 a 17 que tiene al menos el 70 % de identidad de secuencia con dichas secuencias comprende adiciones que consisten en al menos 1 aminoácido, o al menos 2 aminoácidos, o al menos 3 aminoácidos, o al menos 4 aminoácidos, o al menos 5 aminoácidos, o al menos 6 aminoácidos, o al menos 7 aminoácidos, o al menos 8 aminoácidos, o al menos 9 aminoácidos, o al menos 10 aminoácidos ácidos o más aminoácidos de la secuencia correspondiente de CDH17, CDH5 o CDH6 ubicadas en el extremo N, o en el extremo C, o en ambos extremos N y C de la secuencia de aminoácidos mostrada en una de las SEQ ID NO: 14 a 17.

En un aspecto particular, el péptido divulgado se selecciona del grupo que consiste en SLRGDTR (SEQ ID NO: 32), GLRGDSG (SEQ ID NO: 33), ILRGDYQ (SEQ ID NO: 34), QDRGDGS (SEQ ID NO: 35) y MDRGDGS (SEQ ID NO: 36). En un aspecto, el péptido divulgado se selecciona del grupo que consiste en VSLRGDTRG (SEQ ID NO: 1), QGLRGDSGT (SEQ ID NO: 37), SILRGDYQD (SEQ ID NO: 19), DQDRGDGSL (SEQ ID NO: 38) y DMDRGDGSI (SEQ ID NO: 39).

En un aspecto particular, dicho péptido es un péptido lineal. En otro aspecto particular, dicho péptido es un péptido cíclico. En otro aspecto particular, dicho péptido es un péptido ramificado.

3. Usos terapéuticos

Los autores de la presente invención han demostrado que el motivo RGD presente en CDH17 induce la activación de integrinas y el crecimiento tumoral, como se muestra en los Ejemplos 1 a 6. Estos resultados se utilizaron como señuelo para la generación de anticuerpos de unión específica al motivo RGD de CDH17 con capacidad de inhibir la activación de la integrina p1 (Ejemplos 8 y 10). Por tanto, estos anticuerpos tienen un efecto terapéutico potencial en cánceres que expresan CDH17, disminuyendo el crecimiento tumoral y la metástasis (Ejemplo 6).

Dado que también hay otros motivos RGD presentes en otras cadherinas, tales como CDH5 y CDH6, esta observación también se puede extrapolar a estas cadherinas, como se muestra en el Ejemplo 11.

Por tanto, este motivo podría ser la diana para evitar la diseminación de los tumores que expresan estas cadherinas. Por tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a:

i) un agente de acuerdo con la invención, o

ii) una construcción de anticuerpo de acuerdo con la invención para su uso como medicamento, denominado en lo sucesivo en el presente documento "el primer uso médico de la invención".

En otro aspecto, la invención se refiere a:

i) un agente de acuerdo con la invención, o

ii) una construcción de anticuerpo de acuerdo con la invención para su uso en el tratamiento del cáncer, denominado en lo sucesivo en el presente documento "el segundo uso médico de la invención".

Este aspecto puede reformularse como el uso de un agente de acuerdo con la invención, o una construcción de anticuerpo de acuerdo con la invención, o un péptido de acuerdo con la divulgación, o un polipéptido que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 14, con la condición de que dicho polipéptido no sea CDH17 humana, o un polipéptido que comprenda la secuencia de la SEQ ID NO 15 y/o la secuencia de la SEQ ID NO 16, con la condición de que dicho polipéptido no sea CDH5 humana, o un polipéptido que comprenda la secuencia de la SEQ ID NO: 17, con la condición de que dicho polipéptido no sea CDH6 humana ni CDH20 humana, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer (aspecto no cubierto por la invención reivindicada). Alternativamente, este aspecto también puede reformularse como un método para tratar un cáncer en un sujeto que lo necesite que comprende la administración de un agente de acuerdo con la invención, o una construcción de anticuerpo de acuerdo con la invención, o un péptido de acuerdo con la divulgación, o un polipéptido que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 14, con la condición de que dicho polipéptido no sea CDH17 humana, o un polipéptido que comprenda la secuencia de la SEQ ID NO 15 y/o la secuencia de la SEQ ID NO 16, con la condición de que dicho polipéptido no sea CDH5 humana, o un polipéptido que comprenda la secuencia de la SEQ ID NO: 17, con la condición de que dicho polipéptido no sea CDH6 humana ni CDH20 humana, a dicho objeto (aspecto no cubierto por la invención reivindicada).

Los términos y expresiones "agente", "construcción de anticuerpo" y "péptido" se han descrito en detalle anteriormente, y sus definiciones y realizaciones particulares y preferidas se incluyen en el presente documento como referencia.

En un aspecto particular del primer y el segundo usos médicos divulgados, el polipéptido que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 14, con la condición de que dicho polipéptido no sea CDH17 humana, es el dominio 6 de CDH17 (aspecto no cubierto por la invención reivindicada). En otro aspecto particular el polipéptido que comprende la secuencia de la SEQ ID NO 15, con la condición de que dicho polipéptido no sea CDH5 humana, es un polipéptido que comprende o consiste en el dominio 2 de CHD5 (aspecto no cubierto por la invención reivindicada). En otro aspecto particular el polipéptido que comprende la secuencia de la SEQ ID NO 16, con la condición de que dicho polipéptido no sea CDH5 humana, es un polipéptido que comprende o consiste en el dominio 3 de CHD5. En otro aspecto particular el polipéptido que comprende la secuencia de la SEQ ID NO 15 y la secuencia de la SEQ ID NO 16, con la condición de que dicho polipéptido no sea CDH5 humana, es un polipéptido que comprende o consiste en los dominios 2 y 3 de CHD5 (aspecto no cubierto por la invención reivindicada). En otro aspecto particular el polipéptido que comprende la secuencia de la SEQ ID NO 17, con la condición de que dicho polipéptido no sea CDH6 humana, es un polipéptido que comprende o consiste en el dominio 1 de c DH6 (aspecto no cubierto por la invención reivindicada). En otro aspecto particular el polipéptido que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 17, con la condición de que dicho polipéptido no sea CDH20 humana, es un polipéptido que comprende o consiste en el dominio 1 de CDH20 (aspecto no cubierto por la invención reivindicada).

En una realización particular del segundo uso médico de la invención, el cáncer es un cáncer en donde participan células que expresan CDH17 y/o CDH5 y/o CDH6 y/o CDH20.

En una realización preferida, dicho cáncer en donde participan células que expresan CDH17 y/o CDH5 y/o CDH6 y/o CDH20 se selecciona de melanoma, cáncer de mama y un cáncer gastrointestinal. En una realización más preferida, dicho cáncer gastrointestinal se selecciona del grupo que consiste en cáncer de colon, cáncer de páncreas, cáncer de hígado, cáncer gástrico y carcinoma de esófago.

En una realización más preferida, dicho cáncer gastrointestinal es cáncer de colon. En una realización más preferida, dicho cáncer gastrointestinal es cáncer de páncreas. En una realización más preferida, dicho cáncer gastrointestinal es cáncer de hígado. En una realización más preferida, dicho cáncer gastrointestinal es cáncer gástrico. En una realización más preferida, dicho cáncer gastrointestinal es cáncer de esófago.

En otra realización preferida, dicho cáncer en donde participan células que expresan CDH17 y/o CDH5 y/o CDH6 y/o CDH20 es metastásico.

Como apreciará el experto en la materia, estas aplicaciones terapéuticas comprenderán la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de la construcción de anticuerpo, o péptido divulgado, o el polipéptido que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 14, con la condición de que dicho polipéptido no sea CDH17 humana, un polipéptido que comprende la secuencia de la SEQ ID NO 15, y/o la secuencia de la SEQ ID NO 16, con la condición de que dicho polipéptido no sea CDH5 humana o un polipéptido que comprenda la secuencia de la SEQ ID NO: 17, con la condición de que dicho polipéptido no sea CDH6 humana ni CDH20 humana.

La expresión ''cantidad terapéuticamente eficaz", como se usa en el presente documento, se refiere a la cantidad del agente, construcción de anticuerpo o péptido divulgado, o el polipéptido que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 14, con la condición de que dicho polipéptido no sea CDH17 humana, un polipéptido que comprende la secuencia de la SEQ ID NO 15 y/o la secuencia de la SEQ ID NO 16, con la condición de que dicho polipéptido no sea CDH5 humana, o un polipéptido que comprenda la secuencia de la SEQ ID NO: 17, con la condición de que dicho polipéptido no sea CDH6 humana ni CDH20 humana, que se precisa para lograr una prevención, cura, retraso, reducción de la gravedad o mejora apreciable de uno o más síntomas de la enfermedad o afección en la que participan células que expresan CDH17 y/o CDH5 y/o CDH6 y/o CDH20. El experto en la materia será capaz de determinar cantidades terapéuticamente eficaces de estas moléculas sin excesiva experimentación por medio de técnicas convencionales bien conocidas en la materia, como las usados en el Ejemplo 6.

Sin pretender quedar ligado a teoría alguna, se supone que el agente, construcción de anticuerpo o péptido divulgado, o el polipéptido que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 14, con la condición de que dicho polipéptido no sea CDH17 humana, un polipéptido que comprende la secuencia de la SEQ ID NO 15 y/o la secuencia de la SEQ ID NO 16, con la condición de que dicho polipéptido no sea CDH5 humana, o un polipéptido que comprenda la secuencia de la SEQ ID NO: 17, con la condición de que dicho polipéptido no sea CDH6 humana ni CDH20 humana, ejercen su actividad terapéutica al prevenir la interacción de los motivos RGD presentes en CDH17 y/o CDH5 y/o CDH6 y/o CDH20 con la integrina a2p1, ya sea uniéndose directamente a los motivos RGD o saturando el sitio de unión de la integrina a2p1 con ligandos solubles. Además, otros mecanismos pueden estar implicados en el efecto terapéutico de estos compuestos, que dependerían de la naturaleza particular del compuesto, los que pueden incluir la activación de la ADCC y/o la CDC.

4. Métodos

4.1. Métodos de diagnóstico

En otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para diagnosticar un cáncer en un sujeto, denominado en lo sucesivo en el presente documento "el método de diagnóstico de la invención", que comprende:

ii) separar dicho agente o construcción de anticuerpo no unida a la muestra;

iv) comparar la presencia y/o la cantidad de dicho agente o construcción de anticuerpo unido a CDH17 y/o CDH5 y/o CDH6 y/o CDH20 detectada en la etapa ii) con la de un valor de referencia; y

v) correlacionar el resultado obtenido con la presencia de dicho cáncer.

Los términos y expresiones "agente", "construcción de anticuerpo" y "cáncer" se han descrito en detalle anteriormente, y sus definiciones y realizaciones particulares y preferidas se incluyen en el presente documento como referencia.

Diagnóstico, como se usa en el presente documento, se refiere tanto al procedimiento de intentar determinar y/o identificar una posible enfermedad en un sujeto, es decir, el procedimiento de diagnóstico, como al dictamen alcanzado mediante este procedimiento, es decir, la opinión diagnóstica. Como tal, también se puede considerar como un intento de clasificación de la afección de un individuo en categorías separadas y distintas que permiten tomar decisiones médicas sobre el tratamiento. Como entenderán los expertos en la materia, el diagnóstico de un cáncer, aunque se prefiere que lo sea, no es necesario que sea correcto para el 100 % de los sujetos a diagnosticar o evaluar. El término, sin embargo, precisa que una parte estadísticamente significativa de sujetos pueda identificarse como que padece cáncer de hígado. El experto en la materia puede determinar sin dificultad si una cuestión es estadísticamente significativa utilizando diversas herramientas de evaluación estadística muy conocidas, por ejemplo, determinación de intervalos de confianza, determinación del valor de p, prueba de la t de Student, prueba de Mann-Whitney, etc. Los detalles se encuentran en Dowdy y Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, Nueva York 1983. Los intervalos de confianza preferidos son de al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 % o al menos el 95 %. Los valores de p son, preferentemente, 0,05, 0,01, 0,005 o inferior.

En una primera etapa, el método de diagnóstico de la invención comprende poner en contacto el agente o la construcción de anticuerpo de acuerdo con la invención con una muestra biológica de dicho sujeto.

En una realización particular, la muestra biológica es una muestra tumoral o una muestra que contiene células tumorales. En una realización preferida, dicha muestra tumoral o muestra que contiene células tumorales contiene CDH17 y/o CDH5 y/o CDH6 y/o CDH20.

El agente o la construcción de anticuerpo de acuerdo con la invención se aplica a la muestra en un tampón adecuado para permitir la unión del agente o construcción de anticuerpo a las moléculas de CDH17 y/o CDH5 y/o CDH6 y/o CDH20 que puedan estar presentes en la muestra. Los ejemplos no limitantes de tampones adecuados para permitir la unión del agente o construcción de anticuerpo de la invención incluyen PBS, TBS, tampón fosfato y tampón citrato. La cantidad de agente o construcción de anticuerpo de la invención necesaria para detectar moléculas de CDH17 y/o CDH5 y/o CDH6 y/o CDH20 presentes en la muestra dependerá del tamaño de la muestra y de la cantidad de CDH17 y/o CDH5 y/o CDH6 y/o CDH20 presente en la misma, y pueden determinarse fácilmente mediante procedimientos de optimización comunes en la técnica. Como una indicación, la concentración del agente o construcción de anticuerpo es de al menos 1 fM, al menos 10 fM, al menos 100 fM, al menos a la 1 pM, al menos a la 10 pM, al menos a la 100 pM, al menos 1 nM, al menos 10 nM, al menos 100 nM, al menos 1 ^jM, al menos 10 ^jM, al menos 100 ^jM o más. Preferentemente, la concentración del agente o construcción de anticuerpo está entre 100 fM y 1 j M, más preferentemente entre 1 pM y 100 nM, muy preferentemente entre 100 pM y 1 nM.

El agente o construcción de anticuerpo se incuba con la muestra a una temperatura adecuada y durante un tiempo suficiente para permitir la unión del agente o construcción de anticuerpo a las moléculas de CDH17 y/o CDH5 y/o CDH6 y/o CDH20 que puedan estar presentes en la muestra. La temperatura está preferentemente entre 20 °C y 37 °C. Por ejemplo, el agente o la construcción de anticuerpo se incuba con la muestra durante al menos 5 min, al menos 10 minutos, al menos 15 minutos, al menos 20 minutos, al menos 30 minutos, al menos 60 minutos, al menos 120 min o más.

Una vez que el agente de la construcción de anticuerpo de la invención se une a las moléculas CDH17 y/o CDH5 y/o CDH6 y/o CDH20 que pueden estar presentes en la muestra, en una asegunda etapa, el método de diagnóstico de la invención comprende separar dicho agente o construcción de anticuerpo no unido a la muestra. Esta etapa puede llevarse a cabo por cualquier método adecuado para este fin. Por ejemplo, se pueden realizar en la muestra lavados secuenciales con un tampón adecuado.

En una tercera etapa, el método de diagnóstico de la invención comprende detectar y/o cuantificar el nivel de dicho agente o construcción de anticuerpo unida a CDH17 y/o CDH5 y/o CDH6 y/o CDH20 en dicha muestra biológica. Dado que el agente o construcción de anticuerpo de la invención no es en sí misma una molécula detectable, la etapa de detección es una etapa de detección indirecta a través de una segunda molécula detectable que se une específicamente al agente o construcción de anticuerpo. La detección del agente o construcción de anticuerpo unida a CDH17 y/o CDH5 y/o CDH6 y/o CDH20 se puede llevar a cabo con prácticamente cualquier anticuerpo o reactivo conocido por unirse con alta afinidad al agente o construcción de anticuerpo de la invención. Sin embargo, es preferible usar un anticuerpo específico para el agente o la construcción de anticuerpo, por ejemplo, sueros policlonales, sobrenadantes de hibridoma o anticuerpos monoclonales y fragmentos de los mismos. El anticuerpo o reactivo específico para el agente o construcción de anticuerpo de la invención se marca adecuadamente con un reactivo detectable. La expresión "reactivo detectable" se refiere a un reactivo con capacidad para ser detectado ya sea directa o indirectamente. Los ejemplos de reactivos detectables adecuados para la invención incluyen, sin limitación, radionúclidos, fluoróforos y proteínas fluorescentes o bioluminiscentes, y enzimas, que se conocen bien en la técnica. Este reactivo puede detectarse por, por ejemplo, fluorimetría o colorimetría utilizando aparatos adecuados para el tipo de reactivos y el tipo de muestra, que son conocidos por los expertos.

En una realización particular, la detección y/o cuantificación de CDH17 y/o CDH5 y/o CDH6 y/o CDH20 se lleva a cabo mediante un inmunoensayo. En una realización preferida, el inmunoensayo es un inmunoensayo enzimático quimioluminiscente, más preferentemente un inmunoensayo enzimático quimioluminiscente en fase sólida. Los inmunoensayos adecuados incluyen, sin limitación, transferencia de Western, inmunoprecipitación, ensayo inmunoabsorbente, ligado a enzimas (ELISA), inmunoturbidimetría, resonancia de plasmón superficial (SPR, por su siglas del inglés surface plasmon resonance), radioinmunoensayo (RlA), inmunoensayo enzimático quimioluminiscente y ensayo de inmunología múltiple.

Como resultado de la tercera etapa, se obtiene un valor del nivel del agente o construcción de anticuerpo unida a CDH17 y/o CDH5 y/o CDH6 y/o CDH20 presente en la muestra.

En una cuarta etapa, el método de diagnóstico de la invención comprende comparar el nivel de dicho agente o construcción de anticuerpo unida a CDH17 y/o CDH5 y/o CDH6 y/o CDH20 detectado en la etapa (iii) con el de un valor de referencia.

La expresión "valor de referencia" se refiere a un criterio predeterminado utilizado como referencia para evaluar los valores o datos obtenidos a partir de las muestras recogidas de un sujeto. El valor de referencia o nivel de referencia puede ser un valor absoluto, un valor relativo, un valor que tiene un límite superior y/o inferior, un intervalo de valores, un valor promedio, un valor de mediana, un valor medio o un valor que se compara con un valor de control o basal particular. El valor de referencia de acuerdo con el método de diagnóstico de la invención se puede obtener a partir de los valores del nivel de agente o construcción de anticuerpo unida a CDH17 y/o CDH5 y/o CDH6 y/o CDH20 presente en una muestra obtenida de uno o más sujetos sanos o de sujetos que no padecen dicho cáncer.

En el contexto de la invención, el nivel de agente o construcción de anticuerpo unida a CDH17 y/o CDH5 y/o CDH6 y/o CDH20 se considera "aumentado" cuando el nivel de dicho agente o construcción de anticuerpo unido a CDH17 y/o CDH5 y/o CDH6 y /o CDH20 en una muestra es superior a un valor de referencia. El nivel de un agente o construcción de anticuerpo unida a CDH17 y/o CDH5 y/o CDH6 y/o CDH20 se considera superior a su valor de referencia cuando es al menos del 1,5 %, al menos el 2 %, al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 15 %, al menos el 20 %, al menos el 25 %, al menos el 30 %, al menos el 35 %, al menos el 40 %, al menos el 45 %, al menos el 50 %, al menos el 55 %, al menos el 60 %, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 100 %, al menos el 110 %, al menos el 120 %, al menos el 130 %, al menos el 140 %, al menos el 150 %, o mayor que su valor de referencia.

Asimismo, el nivel de un agente o construcción de anticuerpo unida a CDH17 y/o CDH5 y/o CDH6 y/o CDH20 se considera "disminuido" cuando el nivel de dicho agente o construcción de anticuerpo unido a CDH17 y/o CDH5 y/o CDH6 y /o CDH20 en una muestra es menor a un valor de referencia. El nivel de dicho agente o construcción de anticuerpo unida a CDH17 y/o CDH5 y/o CDH6 y/o CDH20 se considera menor a su valor de referencia cuando es al menos del 5 %, al menos el 10 %, al menos el 15 %, al menos el 20 %, al menos el 25 %, al menos el 30 %, al menos el 35 %, al menos el 40 %, al menos el 45 %, al menos el 50 %, al menos el 55 %, al menos el 60 %, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 100 %, al menos el 110 %, al menos el 120 %, al menos el 130 %, al menos el 140 %, al menos el 150 %, o menor que su valor de referencia.

En una última etapa, el método de diagnóstico de la invención comprende correlacionar el resultado obtenido con la presencia de dicho cáncer.

En una realización particular, un nivel aumentado de un agente o construcción de anticuerpo unida a CDH17 y/o CDH5 y/o CDH6 y/o CDH20 cuando se compara con su valor de referencia es indicativo de la presencia de dicho cáncer y/o de metástasis en dicho cáncer.

En otra realización particular, la muestra biológica es una muestra de sangre, suero o plasma.

4.2. Métodos de pronóstico

En otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para el pronóstico de un cáncer en un sujeto, en lo sucesivo en el presente documento "el método de pronóstico de la invención", que comprende:

ii) separar dicho agente o construcción de anticuerpo no unida a la muestra;

v) correlacionar el resultado obtenido con el resultado clínico de dicho cáncer.

Este aspecto pone en práctica las etapas (i) a (v) del método de diagnóstico de la invención y así, sus definiciones y realizaciones particulares se aplican igualmente al método de pronóstico de la invención.

El término "pronóstico", como se usa en el presente documento, se refiere a la determinación de la probabilidad de que un paciente con cáncer tenga un resultado clínico particular, ya sea positivo o negativo. En la presente invención, se entiende por "resultado clínico" el curso esperado de una enfermedad. Indica la predicción del médico sobre cómo progresará la enfermedad de un sujeto y si hay posibilidades de recuperación, invalidez o mortalidad. Los métodos de pronóstico de la presente invención se pueden usar clínicamente para tomar decisiones de tratamiento eligiendo las modalidades de tratamiento más apropiadas para cualquier paciente en particular. Como entenderán los expertos en la materia, el pronóstico de un cáncer, aunque se prefiere que lo sea, no es necesario que sea correcto para el 100 % de los sujetos a diagnosticar o evaluar. El término, sin embargo, precisa que una parte estadísticamente significativa de sujetos pueda identificarse como que padece cáncer de hígado. El experto en la materia puede determinar sin dificultad si una cuestión es estadísticamente significativa utilizando diversas herramientas de evaluación estadística muy conocidas, por ejemplo, determinación de intervalos de confianza, determinación del valor de p, prueba de la t de Student, prueba de Mann-Whitney, etc. Los detalles se encuentran en Dowdy y Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, Nueva York 1983. Los intervalos de confianza preferidos son de al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 % o al menos el 95 %. Los valores de p son, preferentemente, 0,05, 0,01, 0,005 o inferior.

La expresión "valor de referencia" se refiere a un criterio predeterminado utilizado como referencia para evaluar los valores o datos obtenidos a partir de las muestras recogidas de un sujeto. El valor de referencia o nivel de referencia puede ser un valor absoluto, un valor relativo, un valor que tiene un límite superior y/o inferior, un intervalo de valores, un valor promedio, un valor de mediana, un valor medio o un valor que se compara con un valor de control o basal particular. El valor de referencia de acuerdo con el método de pronóstico de la invención se puede obtener a partir de los valores del nivel del agente o construcción de anticuerpo unida a CDH17 y/o CDH5 y/o CDH6 y/o CDH20 presente en una muestra o agrupación de muestras obtenidas de sujetos que padecen dicho cáncer que se han clasificado como que tienen un resultado clínico positivo o un resultado clínico negativo.

4.3. Métodos de estratificación

En otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para estratificar un cáncer en un sujeto, en lo sucesivo en el presente documento denominado "el método de estratificación del cáncer de la invención", que comprende:

ii) separar dicho agente o construcción de anticuerpo no unida a la muestra;

v) correlacionar el resultado obtenido con el estadio de dicho cáncer.

Este aspecto pone en práctica las etapas (i) a (v) del método de diagnóstico de la invención y así, sus definiciones y particularidades se aplican igualmente al método de estratificación del cáncer de la invención.

El término "estratificar", como se usa en el presente documento, se refiere a la determinación de la medida en que un cáncer se ha desarrollado por diseminación. Un cáncer se puede clasificar de acuerdo con la Agrupación general de estadios en los siguientes estadios:

i) Estadio 0: carcinoma in situ.

ii) Estadio I: cánceres que están localizados en una parte del cuerpo.

iii) Estadio II: cánceres que están localmente avanzados.

iv) Estadio III: cánceres que también están localmente avanzados. La designación de un cáncer como de Estadio II o Estadio III puede depender del tipo específico de cáncer.

v) Estadio IV: cánceres que a menudo han metastatizado, se han diseminado a otros órganos o por todo el cuerpo.

Como entenderán los expertos en la materia, el pronóstico de un cáncer, aunque se prefiere que lo sea, no es necesario que sea correcto para el 100 % de los sujetos a diagnosticar o evaluar. El término, sin embargo, precisa que una parte estadísticamente significativa de sujetos pueda identificarse como que padece cáncer de hígado. El experto en la materia puede determinar sin dificultad si una cuestión es estadísticamente significativa utilizando diversas herramientas de evaluación estadística muy conocidas, por ejemplo, determinación de intervalos de confianza, determinación del valor de p, prueba de la t de Student, prueba de Mann-Whitney, etc. Los detalles se encuentran en Dowdy y Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, Nueva York 1983. Los intervalos de confianza preferidos son de al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 % o al menos el 95 %. Los valores de p son, preferentemente, 0,05, 0,01, 0,005 o inferior.

La expresión "valor de referencia" se refiere a un criterio predeterminado utilizado como referencia para evaluar los valores o datos obtenidos a partir de las muestras recogidas de un sujeto. El valor de referencia o nivel de referencia puede ser un valor absoluto, un valor relativo, un valor que tiene un límite superior y/o inferior, un intervalo de valores, un valor promedio, un valor de mediana, un valor medio o un valor que se compara con un valor de control o basal particular. El valor de referencia de acuerdo con el método de estratificación del cáncer de la invención se puede obtener a partir de los valores del nivel del agente o construcción de anticuerpo unida a CDH17 y/o CDH5 y/o CDH6 y/o CDH20 presente en una muestra o agrupación de muestras obtenido de sujetos que padecen dicho cáncer que se ha clasificado como de Estadio 0, Estadio I, Estadio II, Estadio III o Estadio IV. El experto en la materia apreciará que se pueden utilizar distintos valores de referencia correspondientes a los distintos estadios.

5. Composiciones farmacéuticas

En otro aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica, en lo sucesivo en el presente documento denominado "la composición farmacéutica de la invención", que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de

i) un agente de acuerdo con la invención, o

ii) una construcción de anticuerpo de acuerdo con la invención junto con un excipiente o transportador farmacéuticamente aceptable.

Los términos y expresiones "agente", "construcción de anticuerpo", "péptido" y "polipéptido que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 14 a 17 con la condición de que dicho polipéptido no sea CDH17 humana, CDH5 humana, CDH6 humana ni CDH20 humana, respectivamente" se han descrito en detalle anteriormente, y sus definiciones y realizaciones particulares y preferidas se incluyen en el presente documento como referencia.

En un aspecto particular no cubierto por la invención reivindicada, la composición farmacéutica divulgada comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del agente, construcción de anticuerpo o péptido divulgado, o de un polipéptido que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 14, con la condición de que dicho polipéptido no sea CDH17 humana, un polipéptido que comprende la secuencia de la SEQ ID NO 15 y/o la secuencia de la ^sE^qID NO 16, con la condición de que dicho polipéptido no sea CDH5 humana o un polipéptido que comprenda la secuencia de la SEQ ID NO: 17, con la condición de que dicho polipéptido no sea CDH6 humana ni CDH20 humana, junto con un excipiente, transportador, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable, para la administración a un sujeto. Dicha composición farmacéutica se puede usar para destruir, o inducir la apoptosis, de células que expresan CDH17 y/o CDH5 y/o CDH6 y/o CDH20 tras la administración a un sujeto que tiene un cáncer en donde participan células que expresan CDH17 y/o CDH5 y/o CDH6 y/o CDH20.

La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se ha descrito en detalle en el contexto de los usos médicos de la invención y su definición y realizaciones particulares se incorporan en el presente documento como referencia.

La expresión "transportador farmacéuticamente aceptable", como se usa en el presente documento, pretende incluir todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y agentes de retraso de la absorción, compatibles con la administración farmacéutica. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conoce en la técnica. Excepto en el caso de que algún agente o medio convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso de los mismos en las composiciones. Los transportadores, excipientes o estabilizantes aceptables son no tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenos, tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 restos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos, tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG).

El agente, construcción de anticuerpo o péptido divulgado, o el polipéptido que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 14, con la condición de que dicho polipéptido no sea CDH17 humana, un polipéptido que comprende la secuencia de la SEQ ID NO 15 y/o la secuencia de la SEQ ID NO 16, con la condición de que dicho polipéptido no sea CDH5 humana, o un polipéptido que comprenda la secuencia de la SEQ ID NO: 17, con la condición de que dicho polipéptido no sea CDH6 humana ni CDH20 humana, puede estar en la misma formulación o puede administrarse en distintas formulaciones. La administración puede ser simultánea o secuencial y puede ser eficaz en cualquier orden.

En un aspecto, el agente, construcción de anticuerpo o péptido divulgado, o el polipéptido que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 14, con la condición de que dicho polipéptido no sea CDH17 humana, un polipéptido que comprende la secuencia de la SEQ ID NO 15 y/o la secuencia de la SEQ ID NO 16, con la condición de que dicho polipéptido no sea CDH5 humana, o un polipéptido que comprenda la secuencia de la SEQ ID NO: 17, con la condición de que dicho polipéptido no sea CDH6 humana ni CDH20 humana, se prepara con transportadores que protegerán dicho compuesto frente a una eliminación rápida del cuerpo, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de administración microencapsulados. Pueden utilizarse polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Los métodos para preparar tales formulaciones serán evidentes para los expertos en la materia. Estas pueden prepararse de acuerdo con métodos muy conocidos por los expertos en la materia.

En otra realización particular, la vía de administración de la composición farmacéutica de la invención es intratumoral o parenteral.

El término "parenteral". como se usa en el presente documento, incluye técnicas de administración intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, rectal o vaginal. Generalmente se prefiere la forma intravenosa de administración parenteral. Además, la composición farmacéutica de la invención puede administrarse adecuadamente mediante infusión de pulsos, por ejemplo, con dosis decrecientes. Preferentemente, la dosificación se administra mediante inyecciones, muy preferentemente inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es corta o crónica.

En una realización preferida, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden adaptarse para la administración parenteral, tales como soluciones estériles, suspensiones o productos liofilizados en la forma farmacéutica unitaria apropiada. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles (cuando son hidrosolubles) y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, los vehículos adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, CremophorEM (BASF, Parsippany, N.J.) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición ha de ser estéril y debe ser fluida hasta el punto de que pueda inyectarse fácilmente. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento, y debe preservarse de la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El transportador puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, un poliol farmacéuticamente aceptable como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido, y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partículas requerido en el caso de una dispersión y mediante el uso de tensioactivos. Se puede lograr la prevención de la acción de microorganismos mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, se preferirá incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol y cloruro de sodio en la composición. Puede lograrse la absorción prolongada de las composiciones inyectables incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y/o gelatina. Las formulaciones mencionadas se prepararán usando métodos convencionales tales como los descritos o mencionados en la Farmacopea Española o de Estados Unidos y en textos de referencia similares.

Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando el compuesto activo (por ejemplo, el agente, la construcción de anticuerpo, el péptido o polipéptido) en la cantidad necesaria en un disolvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes necesarios de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son el secado al vacío y la liofilización, que producen un polvo del principio activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución de los mismos previamente esterilizada por filtración.

Es especialmente ventajoso formular las composiciones farmacéuticas, en forma de unidad de dosificación para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. La forma farmacéutica unitaria, como se usa en el presente documento, se refiere a unidades físicamente individuales adecuadas como dosis unitarias para el sujeto a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de principio activo (por ejemplo, el agente, la construcción de anticuerpo, péptido o polipéptido) calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico necesario. La especificación para las formas de dosificación unitaria de la invención está dictada por y depende directamente de las características singulares del compuesto activo y del efecto terapéutico particular a lograr, y de las limitaciones inherentes en la técnica de composición de tal compuesto activo para el tratamiento de los individuos.

Generalmente, una cantidad eficaz administrada de un anticuerpo de la invención dependerá de la eficacia relativa del compuesto elegido, de la gravedad del trastorno que se está tratando y del peso del afectado. Sin embargo, los compuestos activos normalmente se administrarán una o más veces al día, por ejemplo, 1, 2, 3 o 4 veces al día, con dosis diarias totales típicas en el intervalo de 0,001 a 1000 mg/kg de peso corporal/día, preferentemente de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100mg/kg de peso corporal/día, muy preferentemente de aproximadamente 0,05 a 10 mg/kg de peso corporal/día.

Las composiciones farmacéuticas pueden incluirse en un recipiente, envase o dispensador junto con instrucciones para su administración.

6. Usos (aspectos no cubiertos por la invención reivindicada)

Otro aspecto de la divulgación se refiere al uso de un epítopo que comprende los restos 603 a 605 de la cadherina 17 (CDH17) humana, y/o un epítopo que comprende los restos 236 a 238 o los restos 299 a 301 de la cadherina 5 (CDH5) humana, y/o un epítopo que comprende los restos 83 a 85 de la cadherina 6 (CDH6) humana y/o un epítopo que comprende los restos 89 a 91 de la cadherina 20 (CDH20) humana, como marcador de un cáncer en donde participan células expresan CDH17 y/o CDH5 y/o CDH6 y/o CDH20,

En un aspecto particular, dicho cáncer en donde participan células que expresan CDH17 y/o CDH5 y/o CDH6 y/o CDH20 es melanoma, cáncer de mama o un cáncer gastrointestinal.

En un aspecto, dicho cáncer gastrointestinal se selecciona del grupo que consiste en cáncer de colon, cáncer de páncreas, cáncer de hígado, cáncer gástrico y carcinoma de esófago.

Otro aspecto, la divulgación se refiere al uso de un epítopo que comprende los restos 603 a 605 de la cadherina 17 (CDH17) humana, y/o un epítopo que comprende los restos 236 a 238 o los restos 299 a 301 de la cadherina 5 (CDH5) humana, y/o un epítopo que comprende los restos 83 a 85 de la cadherina 6 (CDH6) humana y/o un epítopo que comprende los restos 89 a 91 de la cadherina 20 (CDH20) humana, como marcador metastásico de un cáncer en donde participan células expresan CDH17 y/o CD^h5 y/o CDH6 y/o CDH20,

Diversas realizaciones de la invención se ilustrarán mediante los siguientes ejemplos, que deben tomarse para ilustrar, pero no para limitar, la invención descrita en el presente documento.

Ejemplos

Materiales y métodos

Líneas celulares, anticuerpos y péptidos

Las células de cáncer de colon humano KM12SM se adquirieron directamente del laboratorio del Dr. Fidler (MD Anderson Cancer Center. EE. UU.). Las células de cáncer de colon humano RKO y líneas celulares de cáncer de páncreas, BxPc3, Capan-1 y PANC1 se adquirieron de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC). La línea celular de carcinoma de células claras de riñón 786-O la proporcionó amablemente M.J. Calzada (Hospital de la Princesa, Madrid, España). Los inventores también utilizaron como control la línea celular de carcinoma de mama MCF7, líneas celulares de melanoma SK-MEL-103 y A375. Todas las líneas celulares se usaron dentro de los 6 meses posteriores a la adquisición y se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (Invitrogen) que contenía suero fetal de ternera (SFT) al 10 % (Invitrogen) y antibióticos a 37 °C en una atmósfera humidificada con CO2 al 5 %.

Los anticuerpos anti-CDH6, anti-CDH5, anti-FAK, anti-RhoGDI, anti-integrinas a2, p1, a6, p4 y av se adquirieron en Santa Cruz Biotechnology. Los anti-pFAK, ERK1/2, pERK1/2 y de bloqueo anti-integrina p1 (Lia 1/2.1) eran de Cell Signaling. El anti-integrina p1 específico para la conformación de alta afinidad (HUTS-21) era de BD Biosciences. Los anticuerpos anti-CDH17 (H-167 y C-17) se adquirieron en Santa Cruz Biotechnology. El de cadherina LI (H-167) es un anticuerpo policlonal de conejo generado contra el mapeo de los aminoácidos 666-832 en el extremo C de la cadherina LI de origen humano. El de cadherina LI (C17) es un anticuerpo policlonal de cabra purificado por afinidad producido contra un mapeo de péptidos en el extremo C de la cadherina LI de origen humano. El anti-CDH17 (n.° 141713) era de R&D Systems y se obtuvo después de la inmunización con el dominio extracelular completo de la proteína. Los anticuerpos policlonales y monoclonales anti Dominio 6 de CDH17 se obtuvieron como se describe a continuación. El péptido sintético RGDS se adquirió en Sigma. Los péptidos RADS (SEQ ID NO: 18), SILRGDYQD (CDH5) (SEQ ID NO: 19), RAIRRGDTEG (CDH16) (SEQ ID NO: 20) y VSLRGDTRG (CDH17) (SEQ ID NO: 1) se sintetizaron usando química de fase sólida con un instrumento Focus XC (AAPPtec).

Los dominios 6 recombinantes de CHD7 (ts y mutante) se produjeron en Escherichia coli y se purificaron de acuerdo con procedimientos convencionales.

Clonación y mutagénesis de CDH17, purificación de proteínas y transfecciones

El ARNm de CDH17 de la línea celular de cáncer colorrectal humano Caco2 se transcribió inversamente con el kit Superscript III First Strand Synthesis (Invitrogen) y el ADNc se amplificó mediante RT-PCR usando los cebadores: 5'-AGCTCGAGGATCTGAGTTGATCAATCTGCTTAGTG-3' (SEQ ID NO: 21) y 5'-CGGGTACCATGAGATGGTTGTTGCTGAAAT (SEQ ID NO: 22).

AG-3' con la polimerasa Advantage 2 (Clontech). El producto de la PCR se digirió con Xhol y Kpnl y se clonó en pcDNA3.1. La mutagénesis de CDH17 para cambiar el motivo 603-RGD-605 a RAD se realizó con el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuickChange Lightning (Agilent Technologies), utilizando los cebadores: 5'-GGACATAAGCTATTCACTGAGGGCAGACACAAGAGGTTGG-3' (SEQ ID NO: 23) y 5'-CCAACCTCTTGTGTCTGCCCTCAGTGAATAGCTTATGTCC-3' (SEQ ID NO: 24). La presencia de la mutación se confirmó mediante secuenciación de ADN. Las células se transfectaron transitoriamente con CDH17 de tipo silvestre (ts) o CDH17 RAD en pcDNA3.1 utilizando JetPrime (Polyplus Transfection). Después de 48 h, una fracción de los transfectantes se lisó y analizó mediante transferencia de western para evaluar la expresión de CDH17. El ARNip de control y el ARNip contra CDH17 (SASI_Hs01_00166354) eran de Sigma-Aldrich.

Los ectodominios recombinantes de CDH17 (ts y mutante RAD) se expresaron con el sistema de baculovirus en células de insecto de acuerdo con procedimientos convencionales. Los dominios 6 recombinantes (ts y mutante) se produjeron en E. coli y se purificaron de acuerdo con procedimientos convencionales.

PCR de transcripción inversa"

Para la amplificación de CDH6 y CDH20, las células se lisaron en reactivo Trizol (Ambion). El ARN se extrajo y se transcribió inversamente usando transcriptasa inversa MoMLV (Promega). La amplificación de CDH6 se realizó mediante PCR usando los cebadores 5'-GTCATCACCGACCAGGAAAC-3' (SEQ ID NO: 25) y 5'-TGCAGGGTCTGAATCAACTG-3' (SEQ ID NO: 26). Para CDH20, los cebadores fueron 5'-AGAGGAGCTGGGTTTGGAA-3' (SEQ ID NO: 27) y 5'-GCATCTGTGGCTGTCACTTG-3' (SEQ ID NO: 28). El perfil de PCR fue de 33 ciclos de 30 s a 94 °C, 30 s a 56 °C y 45 s a 72 °C con ADN polimerasa Taq (Invitrogen).

Ensayos de adhesión celular y de unión solubles

Para la adhesión celular, se recubrieron con Matrigel (4 |jl/ml) (BD Biosciences) o colágeno tipo IV (5 |jg/ml) (Sigma-Aldrich) placas de 96 pocillos en tampón de recubrimiento (NaHCO3 0,1 M pH 8,8) durante 20 h y se incubaron con medio de adhesión (b Sa al 0,4 % en DMEM sin suero) durante 2 h para bloquear la unión inespecífica. Las células se privaron de suero durante 5 h, se marcaron con BCECF-AM (Invitrogen), se desprendieron con EDTA 2 mM en PBS, se resuspendieron en DMEM sin suero y se añadieron 7x104 células en 100 j l a las placas por triplicado y luego se incubaron durante 25 min. Las células no adherentes se eliminaron mediante tres lavados con DMEM. Las células unidas se cuantificaron usando un analizador de fluorescencia (POLARstar Galaxy).

Para los ensayos de unión solubles, se desprendieron las células, se incubaron durante 40 min con ectodominio de CDH17 (10 jg/m l) a 37 °C en medio HBSS sin Ca2+, de Mg2+ y Mn2+ (Life Technologies), se lavaron, se incubaron con anticuerpos anti-CDH17 a 4 °C, se lavaron otra vez, se incubaron con los anticuerpos secundarios y se analizaron mediante citometría de flujo. Para las adhesiones celulares al Dominio 6 de CDH17 (2-10 jg/ml), los ensayos de adhesión en placas de microtitulación de 96 pocillos se realizaron como se indicó anteriormente, pero en un medio que contenía MnCl2 1 mM y las células se lavaron suavemente, utilizando una pipeta multicanal. Para los ensayos de bloqueo, las células se preincubaron con anti-integrina p1 (5 ug/ml) durante 10 min antes de la adhesión.

Cromatografía de afinidad para la integrina o2p1

Un mg de Dominio 6 ts de CDH17 purificado se acopló a una columna HiTrap NHS de 1 ml (GE Healthcare). Se cargaron extractos de células KM12SM (20 mg) en la columna, se incubó durante 10 min y se lavó con 10 ml de tampón de lisis a un caudal de 0,4 ml/min utilizando un sistema ÁKTA. La elución se realizó con 5 ml de péptido RGDS 1,5 mM (SEQ ID NO: 29).

Separación celular

Se incubaron perlas magnéticas recubiertas con proteína G (Invitrogen) con 10 ug de anti-integrina a2 durante 1 h a 4 °C. Se resuspendieron 4 x 105 células RKO, genosuprimidas o no, para la integrina a2, en BSA al 0,5 % en PBS y se incubaron durante 40 min a 4 °C con las perlas recubiertas. Las células se separaron magnéticamente y cada población se sometió a análisis de transferencia de western utilizando anticuerpos anti-integrina a2 para evaluar la eficacia del aislamiento.

Citometría de flujo

Las células se desprendieron con EDTA 2 mM en PBS, se incubaron a 4 °C con los anticuerpos primarios (10 ug/ml) durante 30 min, se lavaron e incubaron con anticuerpos secundarios marcados con Alexa 488 (anti-IgG de ratón o anti-IgG de conejo, Dako). La fluorescencia se analizó en un citofluorómetro Coulter Epics XL. Las intensidades de fluorescencia medias de los anticuerpos indicados se muestran dentro de cada panel. Como referencia, anticuerpos de control irrelevantes (anti-cadherina 11, Santa Cruz Biotechnologies) arrojaron una intensidad de fluorescencia media de 0,3.

Un volumen de 50 j l que contiene 2,5x105 células KM12SM se mezclaron con 50 j l del sobrenadante sin diluir de cada clon de hibridoma y se incubaron a TA durante 30 min. Después de la incubación, las células se lavaron dos veces con 200 j l de PBS-SFB al 3 %, se centrifugaron (4 °C, a 1000 xg durante 10 min) y se incubaron en oscuridad a 37 °C durante 30 min en presencia de 50 j l de una dilución 1/2000 de Alexa Fluor®488 cabra anti-IgG de ratón (H+L) (Molecular Probes, Life Technologies). Las células se lavaron y mantuvieron en la oscuridad hasta el análisis de citometría de flujo. Se incluyó un control interno para controlar la unión inespecífica, en que las células se incubaron con suero de ratón BALB/c normal (1:100) y se analizaron usando los mismos reactivos secundarios y procedimientos.

El análisis de citometría de flujo se realizó utilizando el analizador de células FACSCalibur™ (BD). Para la adquisición, almacenamiento y análisis de datos se utilizó el paquete informático Cell-Quest. Se adquirieron al menos 10.000 sucesos por muestra y las células se identificaron en función de sus propiedades específicas de dispersión de luz directa (FSC) y lateral (SSC). La intensidad de fluorescencia relativa (FL-1) de las células marcadas de cada ensayo se determinó como el porcentaje de células fluorescentes positivas utilizando un único gráfico de histograma. Se estableció un marcador en la distribución del histograma del control interno como límite de unión no específica.

Ensayos de agregación celular

Se desprendieron 105 con EDTA 2 mM en PBS, se resuspendieron en 100 j l de DMEM y se permitió que se agregaran durante 30 min a 37 °C con agitación constante a 30 rpm. Las células totales y las células que formaban agregados se contaron al microscopio en 5 campos distintos.

Ensayos de proliferación

Se sembraron células KM12SM o RKO a 1x104 células/pocillo en placas de 96 pocillos y se incubaron durante 24-48 h a 37 °C en DMEM con suero al 0,5 %, seguido de 1 h de incubación con bromuro de tretrazolio azul de tizolilo (MTT) (0,6 mg/ml) (Sigma-Aldrich). La proliferación celular se determinó mediante la absorbancia a 560 nm y la comparación con las células de control recolectadas en el tiempo 0.

Transferencia de western e inmunoprecipitación

Las células se privaron de alimento durante 4 h y se les permitió unirse a placas recubiertas con dominio 6 de CDH17 durante 45 min. Después, las células se desprendieron, lavaron y lisaron con Igepal al 1%, NaCl 100 mM, MgCl2 2 mM, glicerol al 10 % en Tris-HCl 50 mM que contenía inhibidores de proteasas y fosfatasas. Los extractos proteicos se separaron en geles de SDS-PAGE, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y luego se incubaron con anticuerpos primarios (1 pg/ml) seguido de incubación con HRP-anti-IgG de ratón (Thermo Scientific) o HRP-anti-IgG de conejo (Sigma-Aldrich). Las proteínas reactivas se visualizaron con SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo Scientific). Los análisis densitométricos se llevaron a cabo utilizando Quantity One (Bio-Rad). Para la inmunoprecipitación, las células se lisaron y se incubaron 500 pg de lisado celular con los anticuerpos indicados (5 pg/ml). Los inmunocomplejos se capturaron añadiendo 50 pl de perlas de proteína G-sepharose (Sigma-Aldrich). Después de lavar, las muestras se resuspendieron en tampón de carga, se hirvió durante 5 min, se centrifugó y posteriormente se cargó en geles de SDS-PAGE al 10 % para análisis de transferencia de western.

Inmunohistoquímica

Para el estudio se utilizó un total de 48 pacientes con diagnóstico y tratados de cáncer de páncreas en la Fundación Jiménez Díaz (Madrid, España) entre 2003 y 2013. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes, según lo requerido y aprobado por el Comité de Ética de Investigación del Hospital Fundación Jiménez Díaz (Madrid). Las muestras se fijaron y tiñeron como se describió anteriormente.

Ensayos in vivo

Se realizaron ensayos in vivo utilizando ratones lampiños suizos (Charles River). El Comité de ética del Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC, Madrid, España) aprobó los protocolos utilizados para el trabajo experimental con ratones. Los ensayos de migración dirigida al hígado se realizaron como se describió anteriormente. Brevemente, 106 células, KM12SM o RKO, transfectadas con vectores que codifican CDH17 ts, RAD o vectores vacíos (simulado) se inocularon por vía intraesplénica en ratones (n = 3), que se sacrificaron después de 24 horas. Se aisló ARN del hígado de los ratones usando TRIzol y se retrotranscribió. El ADNc se sometió a 30 ciclos de PCR con ADN polimerasa Taq para amplificar al GAPDH humana, un gen constitutivo. Como control de carga, se realizó la amplificación de la actina p murina. Para los xenoinjertos, se indujeron tumores mediante inyección subcutánea de 5x106 células, KM12SM o RKO, en PBS con glucosa al 0,1 % en ratones lampiños (n = 3). Después de 10 días, los ratones se sacrificaron y los tumores se extirparon y pesaron.

Análisis estadísticos

Los datos se analizaron mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Tukey-Kramer. En ambos análisis el nivel de significación mínimo aceptable fue p<0,05.

Inmunización y preparación de anticuerpos monoclonales de ratón

Se inmunizaron cuatro ratones Balb/c hembra tres veces por vía intraperitoneal (i.p.) usando como antígeno de CDH17 un péptido CDH17 conjugado con OVA (VSLRGDTRG) (SEQ ID NO: 1). En primer lugar, 50 pg de péptido-OVA emulsionado en adyuvante completo de Freund, y las dos siguientes inyecciones con 25 pg de péptido-OVA emulsionado en adyuvante incompleto de Freund. El período entre cada inmunización fue de 15 días. A los 5 días de la tercera inmunización, se realizó una extracción de sangre para determinar mediante ELISA indirecto el título de anticuerpos antipéptido en los ratones. Los inventores realizaron también una evaluación de sueros policlonales del CIB de ratones inmunizados en el ensayo de activación de integrina beta 1, usando un anticuerpo que reconoce la forma de alta afinidad de esta integrina y midiendo en el citómetro de flujo (ver más abajo).

Diez días después de la primera extracción de sangre, el animal (N.° 3) se seleccionó como donante de esplenocitos y recibió una inyección de 25 pg de péptido-OVA (i.p.). Tres días más tarde, se extirpó el bazo, tomando una muestra de sangre para suero, como control positivo en ensayos posteriores. Para la fusión se eligió la línea celular de mieloma de ratón SP2/O-Ag-14. El procedimiento de fusión se llevó a cabo de acuerdo con los procedimientos descritos por Galfre y Milstein, y como agente de fusión se utilizó polietilenglicol (PEG 4000): Se utilizó una relación de mieloma/esplenocitos de 1. Después de la fusión, las células se sembraron en placas de 96 pocillos en selectivo completo ^hA^t(hipoxantina-aminopterina-timidina) a una densidad de 2 x 105 células/pocillo. A partir del quinto o sexto día después de la fusión, se pudieron observar clones de hibridomas que secretan posibles anticuerpos antipéptido CDH17. La selección de los clones productores se realizó de acuerdo a:

• ELISA indirecto contra la proteína CDH17 expresada en E. coli

• ELISA indirecto contra el péptido VSLRGD^tR^g(SEQ ID NO: 1) acoplado a BSA

• citometría de flujo directa contra células KM12SM

• citometría de flujo en ensayo de inhibición

ELISA indirecto contra el péptido de RGD de CDH17 acoplado a BSA

Se recubrieron placas de microtitulación de 96 pocilios Maxisorp (Nunc) mediante la adición de 50 pl/pocillo de una solución de péptido de RGD de CDH17 (VS^lR^gDTRG) 1 pg/ml (SEQ ID NO: 1) acoplado a BSA en tampón de carbonato (50 mmol/l, pH 9,6) e incubación durante una noche a 4 °C. Las placas recubiertas se lavaron tres veces con tampón de lavado (PBS con Tween-20 al 0,05 % (v/v)) y luego se añadieron 150 pl de BSA al 2 % en PBS a cada pocillo para reducir la unión no específica. La placa se lavó tres veces con tampón de lavado y se añadieron 50 pl de sobrenadante sin diluir de cada clon a los pocillos recubiertos. Las placas se incubaron a 37 °C durante 2 h y se lavaron tres veces con tampón de lavado. A continuación, se añadieron a cada pocillo 50 pl de una dilución 1/2000 de anti-IgG de ratón en cabra conjugado con HRP (Southern Biotechnology) y las placas se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente. Finalmente, las placas se lavaron 5 veces con tampón de lavado y se añadieron 100 pl/pocillo de solución de sustrato TMB (Sigma Aldrich). El desarrollo de color se detuvo después de 10 min mediante la adición de 50 pl/pocillo de H²SO⁴(2 N). Se midió la absorbancia a 450 nm.

Determinación del estado de conformación de alta afinidad de la integrina ¡51.

Se desprendieron células RKO con EDTA 2 mm en PBS, se lavaron con PBS, se resuspendieron en DMEM y se incubaron con un péptido de 9 aminoácidos conteniendo el motivo RGD y las secuencias flanqueantes de la cadherina 5 (SEQ ID NO: 37 para el motivo RGD del dominio 2 (CDH5A), y SEQ ID NO: 19 para el motivo RGD del dominio 3 (CDH5B)), de cadherina 6 (SEQ ID NO: 38), de cadherina 17 (VSLRGDTRG) (SEQ ID NO: 1), de cadherina 20 (SEQ ID NO: 39) y de cadherina 16 (SEQ ID NO: 31, RAIRGDTEG) durante 25 min a 37 °C en presencia de sueros inmunes o suero de control (diluidos 1:50). Después de la incubación, las células se sometieron a ensayos de citometría de flujo usando anticuerpos anti-integrina p1 en conformación de alta afinidad (Huts21, BD Pharmingen) y anticuerpos anti-IgG de ratón acoplados a Alexa 488 (Abcam). La fluorescencia se analizó en un citofluorómetro Coulter Epics XL. Las intensidades de fluorescencia medias de los anticuerpos indicados se muestran dentro de cada panel. Como referencia, los anticuerpos de control irrelevantes dieron una intensidad de fluorescencia media de 0,3.

Alternativamente, las células RKO se privaron de alimento durante 4 h, se desprendieron con EDTA 2 mM en PBS y se incubaron en DMEM sin suero con 1 pg/ml de los siguientes péptidos: péptidos de 9 aa que incluían los motivos RGD y las secuencias flanqueantes correspondientes a la cadherina 17 (SEQ ID NO: 1) y los dos motivos presentes en la cadherina 5 (SEQ ID No : 37 para el motivo RGD del dominio 2 (CDH5A), y SEQ ID: 19 para el motivo RGD del dominio 3 (CDH5B)), y péptidos de 7 aa o 5 aa con 2 aa o 1 aa respectivamente en cada lado del motivo RGD correspondientes a la secuencia de CDH17, SLRGDTR (SEQ ID NO: 32) y LRGDT (SEQ ID NO: 14), respectivamente. Simultáneamente, las células se incubaron con los anticuerpos monoclonales anti-RGD de CDH17 indicados (10 pg/ml). Después de 40 min, las células se lavaron y se sometieron a ensayos de citometría de flujo utilizando el anticuerpo HUTS21, que se une a la integrina p1 en la conformación de alta afinidad. Los datos se recogieron en un citómetro FACScalibur™ (BD) y se representaron como % de la activación de integrina p1 inducida por el péptido de RGD de CDH17 RGD de 9 aa (SEQ ID NO: 1).

Clonación de dominios variables de anticuerpos a partir de hibridoma

Se cultivaron células de hibridoma anti-cadherina 17_dominio RGD de los clones PA383-12.4.1, PA383-25.4.1, PA383-6.6.1 y PA383-6.5.2 como monocapas a 37 °C y CO²5 % en medio RPMI-1640 con L-glutamina y bicarbonato sódico (R0883, Sigma Aldrich), complementado con suero fetal bovino al 10 % (F7524, Sigma Aldrich), penicilina 50 U/ml y estreptomicina 50 pg/ml (P4458, Sigma Aldrich). Las células de hibridoma se recolectaron para la extracción de ARNm y se determinó el isotipo de cada anticuerpo monoclonal (AcM) secretado a partir de los sobrenadantes utilizando el kit IsoQuick™ Kit for Mouse Monoclonal Isotyping (ISOQ5, Sigma Aldrich).

Se extrajo ARN total de cada hibridoma a partir de 3x107 usando el reactivo TRIZOL (15596-026, Life Technologies) y cloroformo (1.02445.1000, Merck), seguido de centrifugación, para separar la fase acuosa. A continuación, se aisló el ARNm mediante precipitación con etanol al 70 % (1.00983.1000, Merck) y se purificó con el kit RNeasy Mini (74104, QIAGEN) siguiendo las instrucciones del fabricante. La concentración y la pureza de los ARNm purificados se evaluaron con el espectrofotómetro Nanodrop ND 2000 (Thermo Scientific), mostrando relaciones válidas de 260/280 y 260/230. La integridad del ARNm purificado de cada hibridoma se confirmó mediante análisis con el sistema de electroforesis automatizado Experion™ (Bio-Rad).

Se añadieron aproximadamente 5 pg de ARNm obtenido de cada hibridoma a un tubo de PCR que contenía 1 pl de cebadores oligo(dT)²⁰(18418-020, Life Technologies), 1 pl de dNTP (R0192, Thermo Scientific) y se añadió agua ultrapura para alcanzar un volumen de reacción intermedio de 13 pl. Después de 5 min de desnaturalización a 65 °C, se añadieron a cada tubo 4 pl de tampón de primera cadena 5X, 1 pl de DTT 0,1 M, 1 pl de inhibidor de ribonucleasas RNaseOUT (10777-019, Life Technologies) y 1 pl de transcriptasa inversa superscript™ III (18080-093, Life Technologies) para la transcripción inversa, alcanzando un volumen de reacción final de 20 pl, seguido de 1 ciclo de 5 min a 25 °C, 60 min a 50 °C y 15 min a 70 °C. Finalmente, se añadió al tubo 1 pl de ribonucleasa H (18021-014, Life Technologies) y la reacción se incubó 20 min a 37 °C. Se analizó un microlitro de cada reacción mediante electroforesis en gel de agarosa.

Se utilizaron satisfactoriamente varias ADN polimerasas Taq comerciales (Life Technologies) para las amplificaciones de VH y VL. Para la amplificación de VL a partir de hibridomas, se eligieron cebadores de A o k de acuerdo con el isotipo (Krebber et al., 1997. Immunol Methods 201:35-55). Las reacciones de PCR se realizaron en volúmenes de 20 |jl, conteniendo 1 j l de reacción de ADNc, mezclas de cebadores de 0,8 j l de VL_Back y 0,8 j l de VL_For para la amplificación de VL o mezclas de cebadores de 0,8 j l de VH_Back y 0,8 j l de VH_For para la amplificación de VH, 2 j l de dNTP (2 mM), 0,5 j l de MgCl2 (25 mM), 4 j l de betaína y 2 j l de tampón de reacción 10X suministrados por los fabricantes.

Después de 3 min de desnaturalización a 94 °C, se añadieron 0,15 j l de ADN polimerasa KOD (2,5 unidades/jl) (71085-3, Novagen), seguido de 32 ciclos de 30 s a 94 °C, 30 s a 50 °C, 1 min a 72 °C y 1 ciclo de 7 min a 72 °C. Se analizó un microlitro de cada reacción de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa. No fue posible la amplificación de VH y VL a partir del hibridoma PA383-25.4.1.

Los productos de PCR de longitud completa de VL y VH se purificaron mediante electroforesis en gel de agarosa preparativa en combinación con el kit GeneJET™ Gel Extraction (K0691, Thermo Scientific), siguiendo las instrucciones del fabricante.

Los fragmentos VL y VH purificados del gel se clonaron por separado en pGEM®-T Easy Vector System II (A1380, Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante y se transformaron en células E. coli JM109™ competentes (A1380, Promega). El análisis de colonias se realizó por reacción de PCR.

Las colonias positivas para PCR se cultivaron y crecieron en medio de caldo luria (1551, Pronadisa) que contenía ampicilina (A9518, Sigma Aldrich) seguido de extracción de ADN plasmídico utilizando el kit GeneJET™ Plasmid Miniprep (K0503, Thermo Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las secuencias de ácido nucleico se determinaron mediante secuenciación utilizando el sistema ABI Prism Big DyeTM Terminator y el analizador de ADN multicapilar ABI 3730 (Applied Biosystems). Se utilizó el programa FinchTV de Geospiza para ver y analizar secuencias de ADN en Windows.

Expresión de CDH5 en líneas celulares de melanoma y cáncer de mama

Las líneas celulares humanas indicadas de cáncer de mama (MCF7, SKBR3, MDA-MB-231, MDA-MB-468) o melanoma (MeWo, Mel57, SK-MEL-28, SK-MEL-103, SK-MEL-147, A373, BLM), así como melanocitos inmortalizados (Mel STV), se lisaron, y se resolvieron 50 jg de los extractos mediante PAGE-SDS y se sometieron a transferencia de western utilizando anticuerpos anti-CDH5. Las mismas transferencias se sometieron a resondeo y se incubaron con anticuerpos anti-Tubulina a para evaluar la cantidad total de proteína.

Ejemplo 1: La secuencia de CDH17 humana contiene un motivo RGD

Después de revisar la secuencia de 31 genes de cadherina humana, se descubrió un motivo RGD en un dominio extracelular de CDH17 y CDH16. Otras cadherinas que contenían motivos RGD fueron cadherina VE (CDH5), cadherina K de riñón fetal (CDH6) y CDH20. Todas ellas están clasificadas como cadherinas atípicas Tipo II. El motivo RGD estaba presente en el dominio 6 de CDH17 y el dominio 5 de CDH16 (Fig. 1A). El análisis de ortólogos de CDH17 mostró que el motivo RGD en CDH17 estaba presente exclusivamente en algunos mamíferos (datos no mostrados). Por ejemplo, CDH17 de ratón no contiene motivo RGD. Las secuencias flanqueantes de RGD (Fig. 1A) son distintas de otras secuencias de consenso informadas para ligandos de integrina como la fibronectina. Para descartar cadherinas adicionales en sus células de cáncer de colon, los inventores probaron la expresión de otras cadherinas con RGD ya sea por transferencia de western o PCR. Las células RKO y KM12SM no expresaron CDH6, CDH16 o CDH20. CDH5 apenas se detectó en células KM12SM pero no en células RKO (Fig. 1B). Como controles positivos se utilizaron células de cáncer de mama, riñón y melanoma.

La estructura de CDH17 es desconocida, pero se predice que el motivo RGD está expuesto utilizando dos enfoques bioinformáticos distintos. Según Jpred 3 (Cole et al., 2008, Nucl Acids Res 36:W197-201), el dominio 6 de CDH17 coincidió más significativamente con la estructura conocida del dominio 2 de CDH1. La alineamiento de ambos dominios demostraron que el motivo RGD coincidía con los restos WRD expuestos (372-374) en CDH1. Por consiguiente, el programa informático NetSurfP (Petersen et al., 2009, BMC Struct Biol 9:51), que calcula la accesibilidad superficial de los restos de proteínas, predijo una exposición del motivo RGD en CDH17. Estas predicciones sugieren la accesibilidad del motivo RGD para las interacciones proteína-proteína.

Ejemplo 2: La mutación de RGD en CDH17 reduce la adhesión y la proliferación en células de cáncer colorrectal, pero no afecta la agregación

Para examinar el efecto del motivo RGD sobre las células de cáncer colorrectal, se utilizaron vectores que codifican a CDH17 de tipo silvestre (CDH17-ts) o un mutante RAD (CDH17-RAD) para transfectar células de cáncer colorrectal humano KM12SM y RKO. Las células RKO poco diferenciadas son células no metastásicas que no expresan CDH17, mientras que KM12SM son células de cáncer de colon altamente metastásico que expresan CDH17. Después de la transfección, CDH17 de tipo silvestre y mutante RAD se sobreexpresaron en ambas líneas celulares a niveles similares, según lo detectado por transferencia de western y citometría de flujo (Fig. 2A, B). En primer lugar, los inventores probaron la agregación de células que expresan CDH17. Las RKO transfectantes con CDH17 mostraron un aumento significativo en la agregación celular con respecto a las células simuladas después del desprendimiento (Fig. 2C). Este aumento fue independiente de RGD, ya que los transfectantes con CDH17 RAD mostraron el mismo aumento en la agregación. Este resultado sugiere una capacidad de agregación homotípica para CDH17, como se describe para otras cadherinas.

Después, los inventores evaluaron la capacidad de los transfectantes para la adhesión celular a Matrigel o Colágeno Tipo IV. La sobreexpresión de CDH17-ts en ambas líneas celulares aumentó la adhesión a ambos tipos de matriz extracelular (Fig. 2D). Por lo contrario, los transfectantes con CDH17-RAD mostraron una adhesión basal, como los transfectantes simulados, lo que sugiere que el motivo RGD era necesario para aumentar la adhesión celular. Además, el silenciamiento de CDH17 redujo significativamente la adhesión de las células KM12SM (Fig. 2D). La adhesión celular precisaba a la integrina a2p1 pero no a la integrina a6p4, como se demostró mediante el uso de ARNip contra cada subunidad de integrina en ensayos de adhesión con células KM12SM (Fig. 2E, F). Finalmente, las células que expresan CDH17-ts mostraron un aumento significativo en la proliferación, mientras que el mutante CDH17-RAD no pudo aumentar la proliferación celular (Fig. 2G). En conjunto, estos datos indican que la presencia del motivo RGD aumentó la adhesión y proliferación celular en células de cáncer de colon a través de la integrina a2p1, pero no afecta la agregación homotípica.

Ejemplo 3: El motivo de unión RGD de CDH17 es un ligando para la integrina a2pi

Anteriormente, los inventores demostraron que CDH17 y la integrina a2p1 coinmunoprecipitaban juntas. Para probar una interacción directa, decidieron purificar la integrina a2p1 usando cromatografía de afinidad basada en el acoplamiento del dominio 6 ts de CDH17 ts a Sepharose. Los lisados de KM12SM se cargaron en la columna de afinidad, se lavaron exhaustivamente y la columna se eluyó con un péptido RGDS. Ambas subunidades de integrina a2p1 se detectaron mediante transferencia de western en las fracciones eluidas, confirmando la unión de la integrina a CDH17 y el papel del motivo RGD en esa unión (Fig. 3A). Para confirmar que esta asociación era dependiente de RGD, se coinmunoprecipitó CDH17 con la integrina a2p1 en células RKO, después de la transfección con CDH17-ts. Por lo contrario, en RKO, CDH17-RAD transfectado, no se detectó después de la inmunoprecipitación con la integrina a2 y viceversa (Fig. 3B). La integrina a2p1 se asoció con FAK cuando estaba presente CDH17-RGD ts, pero no el caso de la mutación RAD. Por lo tanto, para iniciar la señalización, la unión del motivo RGD fue fundamental para la asociación integrina-FAK. Para descartar la integrina av, los inventores llevaron a cabo más coinmunoprecipitaciones. No detectaron la integrina av en los coinmunoprecipitados de CDH17, y viceversa (Fig. 3C).

Para evaluar si CDH17 exógena podía ser un ligando de integrinas los inventores utilizaron: i) el ectodominio de CDH17 recombinante purificado expresado en baculovirus y ii) el dominio 6 de CDH17 recombinante (571-665) expresado en E. coli. Además, prepararon mutantes RAD del ectodominio y el dominio 6 (Fig. 3D). Después de la incubación, el ectodominio de CDH17 se unió a la superficie celular (Fig. 3E). Sin embargo, la forma mutante RAD del ectodominio de CDH17 no pudo unirse a las células. Para confirmar que esta unión era específica para la integrina a2p1, los inventores silenciaron la expresión de las integrinas a2p1 y a6p4 usando ARNip (Fig. 2D). En ambos tipos de células, RKO y KM12SM, el silenciamiento de las subunidades de la integrina a2p1 inhibió la unión del ectodominio de CDH17-RGD. Sin embargo, el silenciamiento de las subunidades de integrina a6p4 no afectó la capacidad del ectodominio de CDH17 para unirse a la superficie celular (Fig. 3F).

Después, los inventores probaron el dominio 6 recombinante como ligando en ensayos de adhesión celular. Encontraron que 2 y 10 pg/ml eran las dosis óptimas en RKO y KM12SM, respectivamente, para estimular la adhesión celular en las placas recubiertas con el dominio 6 (Fig. 4A). Además, hubo un claro efecto dependiente de la dosis del péptido RGDS para inhibir la adhesión celular al dominio 6 ts de CDH17 en ambas líneas celulares. La competencia comenzó a 1 pM y fue similar a la obtenida con un anticuerpo bloqueante anti-integrina p1 (Fig. 4B). Por lo contrario, el péptido RADS no inhibió la adhesión celular (Fig. 4B). Este resultado sugiere que el dominio 6 de CDH17 participa en la adhesión celular de una manera dependiente de RGD. De nuevo, para confirmar que la unión era dependiente de integrina, los inventores silenciaron la expresión de las cuatro subunidades de integrina. Solo el silenciamiento de la integrina a2p1 inhibió significativamente la adhesión celular al dominio 6 de CDH17 (Fig. 4C).

Ejemplo 4: Papel del motivo RGD en la activación de la integrina pi

Para evaluar el papel del motivo RGD en la activación de la integrina, los inventores transfectaron ambas líneas celulares con vectores que contenían CDH17 ts y el mutante RAD. La expresión de la integrina a2p1 no se vio afectada por la alteración de los niveles de expresión de CDH17 en las células de cáncer colorrectal. Sin embargo, CDH17-ts aumentó la conformación de alta afinidad de la integrina p1 en células RKO y KM12SM, como se muestra al utilizar el anticuerpo HUTS21, que reconoce específicamente esta conformación (Fig. 5A). Por lo contrario, las células transfectadas con CDH17-RAD mostraron cantidades similares de integrina p1 de conformación de alta afinidad que las células simuladas (Fig. 5A). Por lo tanto, el motivo RGD en CDH17 provocó el cambio a la conformación de alta afinidad necesaria para la activación de la integrina p1. De la misma manera, la preincubación con el ectodominio o el dominio 6 ts de CDH17 potenció la cantidad de integrina p1 en la conformación de alta afinidad, mientras que la incubación con los mutantes RAD no tuvo efecto (Fig. 5B). Además, los inventores probaron el efecto de las secuencias flanqueantes de RGD en la activación de integrinas. Además del péptido CDH17, los inventores probaron las secuencias flanqueantes de RGD de CDH16 y CDH5. La exposición al péptido CDH17 aumentó la integrina p1 de conformación de alta afinidad en ambas líneas celulares (Fig. 5C). Se observó un efecto similar cuando las células se expusieron al péptido RGD de CDH5 (Fig. 5C). Por lo contrario, RGD de CDH16 no tuvo efecto sobre la activación de la integrina p1 (Fig. 5C). Estos resultados confirman la importancia de las secuencias flanqueantes de RGD sobre la activación de la integrina p1.

Finalmente, los inventores evaluaron si el cambio a la conformación de alta afinidad de la integrina p1 aumentaba la capacidad de adhesión de las células. El ectodominio y el dominio 6 ts de CDH17 provocaron un aumento significativo de la adhesión celular a Matrigel, mientras que el mutante RAD apenas aumentó los niveles basales (Fig. 5D).

Ejemplo 5: El motivo RGD de CDH17 es fundamental para el crecimiento tumoral y la metástasis

Los inventores llevaron a cabo inoculaciones subcutáneas e intraesplénicas de ratones lampiños suizos con células RKO y KM12 que contenían CDH17 ts o RAD mutante por triplicado. Los ratones se sacrificaron 24 h después de la inyección intraesplénica de células y se recolectaron los hígados para extracción de ADN y el análisis por PCR (Fig. 6A). El ADN hepático de los ratones inoculados con células con CDH17-RGD fue positivo por PCR utilizando cebadores de GAPDH humana. Por lo contrario, los ratones inoculados con células con mutante CDH17-RAD mostraron una amplificación de ADN insignificante en el hígado. Después de la inoculación subcutánea, las células con CDH17 ts desarrollaron tumores considerables. Por lo contrario, las células que contenían mutantes RAD mostraron tumores muy pequeños, similares a control simulado (Fig. 6B). El peso del tumor corroboró estas diferencias entre las células con CDH17-RGD y RAD (Fig. 6B). Estos resultados respaldan un papel crucial para el motivo RGD en el crecimiento tumoral y la diseminación metastásica en el cáncer de colon.

Ejemplo 6: El motivo RGD de CDH17 es importante en las células de cáncer de páncreas

Se ha informado la sobreexpresión de CDH17 en algunos tumores pancreáticos. En este caso, en un conjunto de muestras de 48 pacientes de cáncer de páncreas, los inventores detectaron la expresión de CDH17 en el 60,4 % de los tumores por inmunohistoquímica. Entre los tumores positivos para CDH17, el 62,1 % presentó una tinción intensa, lo que indica sobreexpresión de CDH17 (Fig. 7A). Para saber si sus hallazgos podían extenderse al cáncer de páncreas, los inventores utilizaron líneas celulares de cáncer de páncreas BxPC3, PANC-1 y CAPAN. Las células PANC-1 y CAPAN mostraron expresión de CDH17, pero BxPC3 no (Fig. 7B). Después de la transfección con vectores de CDH17-ts y de mutante CDH17-RAD, observaron claras diferencias en la capacidad de adhesión. Cuando CDH17-ts provocó un claro aumento en las tres líneas celulares, el mutante RAD no logró aumentar la adhesión por encima de los niveles basales (Fig. 7C). Además, la proliferación celular aumentó en los transfectantes con CDH17-RGD, pero no en células transfectadas con CDH17-RAD (Fig. 7D). Estos resultados respaldan una extensión de sus hallazgos a otros cánceres que expresan CDH17, como el cáncer de páncreas.

Discusión de los Ejemplos 1 a 6

Hemos encontrado que la cadherina 7D humana, CDH17, contiene un sitio RGD con capacidad para actuar como un nuevo ligando para la unión a integrinas. Esta conclusión se obtuvo a partir de las siguientes observaciones: i) la interacción de CDH17 con la integrina a2p1 precisaba la presencia del sitio de unión a RGD, ii) la capacidad del motivo RGD para unirse específicamente a la integrina a2p1 en células de cáncer de colon fue respaldada por distintos ensayos de unión y adhesión celular, incluidos experimentos de ARNip, iii) el ectodominio CDH17-RGD fue capaz de unirse a las células de cáncer de colon y de activar a la integrina p1 cuando se añadía exógenamente y iv) después de la inoculación in vivo, las células tumorales que expresan CDH17 RAD mutante mostraron un retraso considerable en el crecimiento tumoral y la colonización del hígado. Resumiendo, RGD funciona como un interruptor que regula la activación de la integrina en las células metastásicas del cáncer de colon.

Otra cuestión importante es si la interacción cadherina/integrina tiene lugar en "cis" o "trans". El modelo "trans" precisaría la presencia de CDH17 en la superficie de una célula contigua (Fig. 8A) o la presencia de ectodominios solubles de CDH17 (Fig. 8B) para facilitar el contacto en la interfase de las subunidades a2 y p1, que es el sitio de reconocimiento del ligando. Los datos de los inventores sugieren que una interacción en "trans" es más probable, ya que la incubación con ectodominio recombinante soluble seguida de la activación de la integrina imitaría la interacción con la forma soluble de CDH17 tras el desprendimiento de esta molécula de la membrana de la superficie celular. Adicionalmente, el cocultivo de células que expresan solo CDH17 con células que expresan solo integrina a2 refleja una interacción en "trans" entre dos células. Aun así, no se puede descartar totalmente una interacción en "cis".

Otras cadherinas, como CDH5 (que contiene dos motivos RGD), CDH6 o CDH20, también contienen sitios de unión a RGD y podrían desempeñar un papel importante en la metástasis del cáncer en otros tipos de cáncer, donde se sobreexpresan. En este caso, los inventores proporcionan pruebas de que RGD de CDH5, pero no CDH16, también activa a la integrina a2p1. Así, las secuencias flanqueantes del motivo RGD de la cadherina influyen fuertemente en la capacidad de unión a las integrinas y confieren especificidad a la interacción. De acuerdo con esta hipótesis, estudios recientes señalan un papel de estas cadherinas en el cáncer y el daño vascular. CDH5 y CDH6 parecen estimular la progresión del cáncer, la formación de trombos y la lesión vascular debido a la inducción de la agregación plaquetaria, respectivamente. Algunos estudios informaron una regulación al alza de CDH5 en tumores de mama humanos invasivos y en un modelo de cáncer de mama, y la inducción de CDH5 fue responsable del mimetismo vasculogénico en melanomas agresivos. En plaquetas, un estudio anterior reveló un papel para CDH6 como un nuevo ligando para la integrina allbp3, siendo esta unión la responsable de la agregación plaquetaria y la formación de trombos. Esta interacción podría desempeñar un papel en los signos de trombosis que se producen en pacientes en estadio metastásico y la contribución de las plaquetas a la metástasis tumoral. Se precisan experimentos adicionales para aclarar la capacidad de unión a integrinas como mecanismo general de las cadherinas que contienen RGD para el estímulo de la metástasis.

CDH17, como otras cadherinas, es una diana para el desprendimiento de ectodominios debido a la presencia de actividad de proteasa elevada en el microambiente tumoral. Las observaciones anteriores confirmaron el desprendimiento de CDH17 en el medio acondicionado de células KM12SM. La forma soluble secretada de CDH17 contenía el dominio RGD. Este "desprendimiento" en las células metastásicas convierte a CDH17 en un biomarcador candidato para la detección en líquidos corporales (suero o plasma) de pacientes con cáncer de colon. Después, CDH17 podría ser útil para la estratificación de los pacientes y la terapia dirigida.

Ejemplo 7: Efecto de la secuencia de CDH17 utilizada para la inmunización en la capacidad de inhibición de la activación de la integrina p1

Los inventores probaron distintos anticuerpos en cuanto a su capacidad para inhibir la activación de la integrina p1. Los anticuerpos comerciales (H167, C-17 o 141713) contra los dominios extracelulares completos o el dominio de péptido C de CDH17 no pudieron inhibir la activación de la integrina p1 (Fig. 9). Además, cuando los inventores probaron anticuerpos policlonales o monoclonales contra el dominio 6 de CDH17, estos anticuerpos fueron capaces de inhibir la activación de la integrina p1 solo en un grado muy limitado (<50 %). El incremento en el estado de activación de la integrina p1 conduce a un incremento de la proliferación celular en células de cáncer de colon (Bartolomé et al. 2014, Oncogene 33:1658-1669). Para probar si los anticuerpos generados contra el motivo RGD de la Cadherina 17 podían inhibir la proliferación celular, sometieron a las células de cáncer de colon a ensayos de proliferación celular en presencia o ausencia de estos anticuerpos. Como se esperaba, los anticuerpos fueron capaces de inhibir la proliferación celular, lo que indica que el bloqueo del motivo RGD en las Cadherina 17 conduce a una proliferación celular deficiente. Estos anticuerpos comerciales o los anticuerpos contra el dominio 6 de CDH17 tampoco tuvieron ningún efecto significativo sobre la proliferación o adhesión celular (Fig. 10).

Sin embargo, los sueros policlonales (n.° 1, 2, 3) de ratones inmunizados con el péptido VSLRGDTRG (SEQ ID NO: 1) inhibieron la activación de la integrina p1 casi el 100 %. El suero del ratón n.° 3 inhibió completamente la activación de CDH17 inducida por péptido. Los sueros 1 y 2 también produjeron una inhibición casi completa (Fig. 9). Esta inhibición implica la detención de la proliferación celular. En este sentido, estos sueros policlonales provocaron una inhibición completa de la proliferación cuando se probaron en un ensayo de MTT a una dilución de 1:50, y casi completa a una dilución de 1:200 en el caso del suero n.° 3 (Fig. 10). Estos resultados indican que solo una respuesta inmunitaria altamente enfocada hacia un péptido purificado que contiene el motivo RGD de CDH17 puede inducir anticuerpos eficaces para una respuesta inmunitaria bloqueante.

Ejemplo 8: Desarrollo de anticuerpos monoclonales con capacidad de inhibición de la activación de la integrina p1

Se seleccionó el ratón n.° 3 para el desarrollo de hibridomas. Se llevó a cabo una prueba inicial con sobrenadantes de hibridomas obtenidos después de la fusión de células productoras de anticuerpos para CDH17 (Fig. 11). El clon n.° 6 pudo inhibir casi el 100 % de la activación de la integrina p1. Este clon junto con los clones 12, 19 y 25 se seleccionaron para una selección y aislamiento adicionales de anticuerpos monoclonales. Se llevó a cabo una segunda prueba con estos clones después de la primera etapa de clonación (Fig. 12). Para la clonación final se seleccionaron los clones 6.5, 6.6, 12.4 y 25.4.

Después de la segunda etapa de clonación por dilución limitante, se seleccionaron los clones 6.5.1, 6.5.2, 6.6.1,6.6.2, 12.4.1 y 25.4.1 para la caracterización final (Tabla 1). Las células de hibridoma se cultivaron de acuerdo con procedimientos convencionales en RPMI-1640 con medio con L-glutamina y bicarbonato de sodio, complementado con suero fetal bovino al 10 % y antibióticos. Se recogieron sobrenadantes de cultivo y los anticuerpos monoclonales (AcM) se purificaron mediante Proteína G y se dializaron frente a PBS para su uso posterior. Se probaron los AcM en cuanto a su efecto sobre la activación de la integrina p1, la proliferación celular y la adhesión celular. El AcM 25.4.1 mostró la capacidad de inhibir completamente (100 %) la activación de la integrina p1, seguido de 6.6.1 (90 %), 12.4.1 (70 %) y 6.5.2 (<60 %) (fig. 13).

Al analizar la adhesión celular, como se esperaba, los resultados obtenidos con los AcM siguieron el mismo orden, pero inverso, a la activación de la integrina p1. El AcM 25.4.1 provocó la mayor inhibición de la adhesión celular, seguido por los otros tres AcM en el mismo orden. Fueron mucho más eficaces que los anticuerpos anti-CDH17 comerciales y los anticuerpos de control (Fig. 14).

En cuanto a la proliferación celular, el AcM 12.4.1 fue el más eficaz para disminuir la proliferación celular, seguido de 6.5.2, 25.4.1 y 6.6.1 (Fig. 15).

Resumiendo, 25.4.1 parece ser particularmente útil para la inhibición de la activación de la integrina p1 y la adhesión celular. Por lo contrario, 12.4.1 parece particularmente útil para bloquear la proliferación celular.

Tabla 1. Sumario de los resultados obtenidos con los AcM anti-péptido de RGD de CDH17.

Ejemplo 9: Secuenciación e identificación de los CDR

Las regiones determinantes de complementariedad (o especificidad) (las CDR) de los hibridomas obtenidos de ratón se identificaron para los clones PA383-12.4.1, PA383-6.6.1 y PA383-6.5.2 siguiendo el conjunto de reglas de los esquemas de numeración de Kabat y Chothia. Las secuencias resultantes son las siguientes:

CDR de V^l, hibridoma PA383-12.4.1:

CDR de V^h, hibridoma PA383-12.4.1:

CDR de Vl, hibridomas PA383-6.6.1 y PA383-6.5.2:

CDR de Vh, hibridomas PA383-6.6.1 y PA383-6.5.2:

Dado que no fue posible la amplificación de VH y VL a partir del hibridoma PA383-25.4.1, este cultivo celular se depositó con la referencia PA383-25.4.1 el 9 de abril de 2015 en el Leibniz Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH a efectos del procedimiento de patentes de acuerdo con el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos.

Ejemplo 10: Los motivos RGD de la cadherina (excepto de CDH16) estimularon la activación de la integrina p1.

El tratamiento con péptidos de 9 aa conteniendo el motivo RGD y las secuencias flanqueantes de la cadherina 5 (SEQ ID NO: 37 para el motivo RGD del dominio 2 (CDH5A), y SEQ ID: 19 para el motivo RGD del dominio 3 (CDH5B), la cadherina 6 (SEQ ID NO: 38), la cadherina 17 (SEQ ⁱD NO: 1) y la cadherina 20 (SEQ ID NO: 39), pero no de la cadherina 16 (SEQ ID NO: 31, RAIRGDTEG), indujeron el cambio conformacional de la integrina p1 a una conformación de alta afinidad, detectado por el anticuerpo Huts21 para p1 en un citómetro de flujo en células MDA-MB-468 (una línea celular de cáncer de mama), BLM (una línea celular de melanoma) y células RKO (una línea celular de cáncer de colon) (Fig. 16).

Ejemplo 11: Los anticuerpos monoclonales contra el motivo RGD de CDH17 inhibieron la activación de la integrina p1 inducida por péptidos de RGD de CDH5 y por péptidos de RGD de CDH17 más cortos.

Las células de cáncer de colon RKO se trataron con los péptidos de RGD de 9 aa de CDH17 (SEQ ID NO: 1), CDH5A (SEQ ID NO: 37) o CDH5B (SEQ ID NO: 19), o formas más cortas de péptidos de RGD de CDH17 de solo 7 aa o 5 aa y simultáneamente con los anticuerpos indicados, y se sometieron a ensayos de citometría de flujo como anteriormente. Los datos se mostraron en relación con la activación de la integrina inducida por el péptido de RGD de CDH17 de 9 aa (SEQ ID NO: 1) (tomado como el 100 %), el péptido de 7 aa: SLRGDTR (SEQ ID NO: 32), el péptido de 5 aa: LRGDT (SEQ ID NO: 14) (Fig. 17). Estos datos demuestran i) que los péptidos de 7 y 5 aa de CDH17 pueden inducir de manera eficaz la activación de la integrina, ii) los AcM 12.4.1 y 25.4.1 son más eficaces para bloquear estos péptidos cortos, iii) los péptidos que contienen ambos RGD de CDH5 pueden para activar la integrina beta1 y iv) 12.4.1 y 25.4.1 son eficaces con la región B (dominio 3) y 6.6.1 con la región A (dominio 2). Este resultado confirma la utilidad de los AcM anti-CDH17 frente a otras cadherinas.

Ejemplo 12: Expresión de CDH5 en líneas celulares de melanoma y cáncer de mama.

Se analizaron diversas líneas celulares de cáncer de mama y melanoma que se sabe que están clasificadas como metastásicas esporádicas o altamente metastásicas para determinar su expresión de CDH5. Los resultados mostrados en la Figura 18 reflejan que 4 de las 7 líneas celulares de melanoma y todas las líneas celulares de cáncer de mama probadas fueron positivas para la expresión de CDH5.

Depósito de material biológico de acuerdo con el Tratado de Budapest

El hibridoma PA383-25.4.1 se depositó con la referencia PA383-25.4.1 el 9 de abril de 2015 en el Leibniz Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH a efectos del procedimiento de patentes de acuerdo con el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un agente que se une específicamente a un epítopo que comprende los restos 603 a 605 de la cadherina 17 (CDH17) humana, y/o a un epítopo que comprende los restos 236 a 238 o los restos 299 a 301 de la cadherina 5 (CDH5) humana, y/o a un epítopo que comprende los restos 83 a 85 de la cadherina 6 (CDH6) humana y/o a un epítopo que comprende los restos 89 a 91 de la cadherina 20 (CDH20) humana, en donde dicho agente se selecciona del grupo que consiste en:

(i) un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de dicho anticuerpo que comprende

- dentro de la cadena pesada, una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 3, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4, y dentro de la cadena ligera, una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 8, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 9, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 10, o una variante funcionalmente equivalente de dichas CDR, en donde dicha variante funcionalmente equivalente tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos correspondientes mostradas en la SEQ ID NO: 2, 3, 4, 8, 9 o 10 y mantiene la capacidad de la secuencia de aminoácidos correspondiente mostrada en la SEQ ID NO: 2, 3, 4, 8, 9 o 10 de unirse a su antígeno afín y de inhibir la activación de la integrina p1 cuando forma parte de dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo.

o

- dentro de la cadena pesada, una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 5 [CDR-H1], una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 6 [CDR-H2] y una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 7 [CDR-H3], y dentro de la cadena ligera, una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 11, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 12, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 13, o una variante funcionalmente equivalente de dichas CDR, en donde dicha variante funcionalmente equivalente tiene al menos el 90 % de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos correspondientes mostradas en la SEQ ID NO: 5, 6, 7, 11, 12 o 13 y mantiene la capacidad de la secuencia de aminoácidos correspondiente mostrada en la SEQ ID NO: 5, 6, 7, 11, 12 o 13 de unirse a su antígeno afín y de inhibir la activación de la integrina p1 cuando forma parte de dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo

y

(ii) un anticuerpo producido por la línea celular de hibridoma con la referencia PA383-25.4.1, depositada el 9 de abril de 2015 en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH o un fragmento de unión a antígeno de dicho anticuerpo, en donde el fragmento de unión a antígeno se selecciona del grupo que consiste en Fv, Fab, F(ab^')2y Fab'.

2. Un fragmento de unión a antígeno del anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 seleccionado del grupo que consiste en Fv, Fab, F(ab^')2y Fab'.

3. El agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde dicho anticuerpo o dicho fragmento de unión a antígeno está humanizado.

4. Una construcción de anticuerpo que comprende el fragmento de unión a antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la construcción de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en scFv, scFv-Fc, minicuerpo, (scFv)²y diacuerpo.

5. Un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en:

a) un ácido nucleico que codifica el agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o la construcción de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 4, y

b) un ácido nucleico complementario de un ácido nucleico como se define en a)

6. La línea celular de hibridoma con la referencia PA383-25.4.1, depositada el 9 de abril de 2015 en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH.

7. Un:

- agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o

- una construcción de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 4,

para su uso como medicamento.

8. Un:

- agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o

- una construcción de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 4,

para su uso en el tratamiento del cáncer.

9. Un método in vitro para diagnosticar y/o pronosticar y/o estratificar un cáncer en un sujeto, que comprende: i) poner en contacto el agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o la construcción de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 4 con una muestra biológica de dicho sujeto;

ii) separar dicho agente o construcción de anticuerpo no unida a la muestra;

10. El agente, o la construcción de anticuerpo para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, o el método in vitro para el diagnóstico y/o el pronóstico y/o la estratificación de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el cáncer es un cáncer en donde participan células que expresan CDH17 y/o CDH5 y/o CDH6 y/o CDH20.

11. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de

- el agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o

- la construcción de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 4,

junto con un excipiente o transportador farmacéuticamente aceptable.

12. El agente, o la construcción de anticuerpo para su uso, o el método in vitro para el diagnóstico y/o el pronóstico y/o la estratificación de acuerdo con la reivindicación 10, en donde dicho cáncer en donde participan células que expresan CDH17 y/o CDH5 y/o CDH6 y/o CDH20 es melanoma, cáncer de mama o un cáncer gastrointestinal.

13. El agente, o la construcción de anticuerpo para su uso, o el método in vitro para el diagnóstico y/o el pronóstico y/o la estratificación o el uso de acuerdo con la reivindicación 12, en donde dicho cáncer gastrointestinal se selecciona del grupo que consiste en cáncer de colon, cáncer de páncreas, cáncer de hígado, cáncer gástrico y carcinoma de esófago.

14. El agente, o la construcción de anticuerpo para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones reivindicación 8 o 10 o 12-13, o el método in vitro para el diagnóstico y/o el pronóstico y/o la estratificación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9-10 o 12-13, en donde dicho cáncer es metastásico.