ES2939769T3 - Procedimiento para la hidrólisis de biomasa - Google Patents

Abstract

La presente invención está dirigida a un proceso novedoso y ventajoso para la hidrólisis de biomasa que permite una hidrolización completa también de biomasa recalcitrante como la paja de caña de azúcar y el bagazo de caña de azúcar. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento para la hidrólisis de biomasa

La presente invención está dirigida a un procedimiento novedoso y ventajoso para la hidrólisis de biomasa que permite una hidrolización completa también de la biomasa recalcitrante, tal como la paja de caña de azúcar y el bagazo de caña de azúcar.

La biomasa procedente de cultivos, tal como la remolacha azucarera, la caña de azúcar, el maíz, la paja y otros materiales que contienen sacáridos o polisacáridos y proteínas, son fuentes valiosas no solo de sacáridos refinados, tales como los azúcares monoméricos o diméricos, sino también de otros componentes, tales como aminoácidos, proteínas y minerales.

Existen procedimientos dentro del estado de la técnica para hidrolizar y separar y refinar cada componente, tal como azúcares de remolacha azucarera y de caña de azúcar. En tales procedimientos, sin embargo, otros componentes valiosos, tales como los compuestos de la pared celular y las proteínas, se descartan después de la extracción y el refinado de los azúcares monoméricos y diméricos, tales como la sacarosa. Dentro de un procedimiento bien consolidado, el azúcar se elimina de, p. ej., remolacha azucarera o caña de azúcar mediante la extracción de la remolacha o la caña de azúcar en rodajas con agua caliente en un procedimiento continuo a contracorriente. Por lo general, tales procedimientos requieren la adición de otros agentes, tales como CaO en una cantidad de aproximadamente 1 a 3 kg de CaO cada 100 kg de biomasa. Los productos de este procedimiento son la solución de azúcares, llamada jugo en bruto, y la denominada pulpa de remolacha o bagazo de caña de azúcar. El jugo en bruto se purifica adicionalmente y se filtra, y posteriormente se concentra para producir un jugo espeso (del 65 al 70% de contenido de materia seca) o, después de la cristalización, para producir azúcar refinada. Las condiciones elevadas de temperatura y pH durante este procedimiento provocan la destrucción de una cantidad crucial de monosacáridos contenidos en la solución. Además, se produce amoníaco debido a la descomposición de los compuestos nitrogenados. Además, lo denominado pulpa de remolacha o bagazo de caña de azúcar todavía contiene no sólo la mayoría de las proteínas de la remolacha azucarera o de la caña de azúcar, sino también la mayoría de los polisacáridos, tales como celulosa, hemicelulosa y pectina.

Un procedimiento favorable que utiliza enzimas para la hidrólisis de pulpa de remolacha se describe en la patente europea EP 2256208 A1, aunque el producto resultante todavía contiene componentes sólidos de la remolacha azucarera.

La solicitud de patente internacional WO 2014/144565 se refiere a un procedimiento para la hidrólisis de biomasa, en donde la biomasa se pone en contacto con un catalizador enzimático para hidrolizar la biomasa a azúcares, seguido de una separación de la fase sólida y líquida y una segunda hidrolización de la fase sólida restante para producir más azúcares, en donde la temperatura durante la hidrólisis oscila entre 20 y 100 °C.

La solicitud de patente internacional WO 2014/100685 se refiere a un procedimiento para producir azúcares a partir de biomasa que comprende las etapas de poner en contacto la biomasa con hidrolasas, seguido de una separación sólido-líquido e incubación de la fase sólida con hidrolasas para producir más azúcares. La temperatura durante la hidrólisis oscila entre 15 y 100 °C.

La patente europea EP 2548965 se refiere a un procedimiento para la hidrólisis de celulosa que comprende las etapas de poner en contacto la celulosa con una celulasa, seguida de una separación sólido-líquido y adición de agua a la fase sólida que luego se somete a una segunda hidrólisis. La temperatura durante la reacción oscila entre 40 y 60 °C.

La solicitud de patente internacional WO 2014/075694 se refiere a un procedimiento para procesar montones de frutas huecas en azúcares fermentables que comprende las etapas de poner en contacto la materia prima con una hidrólisis primaria, seguida de una separación de sólido-líquido y someter la fase sólida a una hidrólisis secundaria.

Debido a su obstinación, la industria se enfrenta a obstáculos aún mayores cuando se utiliza paja de caña de azúcar o bagazo de caña de azúcar como materia prima para obtener azúcares monoméricos y diméricos y otros componentes valiosos. Esta obstinación está causada por una baja accesibilidad de la celulosa debido a que las fibras de celulosa están incluidas en lignina y otras sustancias poliméricas. Dentro de los procedimientos conocidos en el estado actual de la técnica, la licuefacción rara vez supera el 60% en peso del material de biomasa inicial.

Por lo tanto, existe la necesidad de un procedimiento mejorado para la hidrólisis de biomasa en el que no solo se pueda obtener una gran cantidad de azúcares monoméricos y diméricos, sino que también pueda minimizar el impacto de la inhibición de los procedimientos posteriores de hidrólisis y/o fermentación debido a la formación de compuestos inhibidores de las enzimas hidrolíticas y/o de los microorganismos. Además, existe la necesidad de un procedimiento económico y eficiente desde el punto de vista energético.

Por lo tanto, el objeto subyacente de la presente invención es dar a conocer un procedimiento para hidrolizar biomasa que no presente ninguna de las desventajas de los procedimientos conocidos en el estado de la técnica.

En un primer aspecto, la invención da a conocer así pues un procedimiento para hidrolizar biomasa que comprende las etapas de

a) Poner en contacto la biomasa con una composición enzimática que contenga al menos una enzima seleccionada de la clase de las hidrolasas en un recipiente durante 3 a 60 h y a una temperatura de 45 a 65 °C;

b) Separar una fase sólida y una líquida;

c) Conversión enzimática de la fase sólida;

d) Combinar al menos parte de la fase sólida convertida de la etapa (c) con la fase líquida de la etapa (b)

en el que se añade al menos un organismo de fermentación a la fase líquida antes o durante la etapa (d) del procedimiento, en el que la temperatura durante la adición del al menos un organismo de fermentación se selecciona entre 25 y 45 °C; y en donde del 10 al 100 % en peso de la fase sólida convertida se usa para alimentar la fase líquida de acuerdo con la etapa (d).

El término "biomasa", tal y como se usa en la presente invención, se refiere a cualquier tipo de biomasa conocida por un experto en la técnica como adecuada para el procedimiento de la invención. Particularmente preferida es la biomasa de origen vegetal. Dentro de una realización preferida adicional, el contenido inicial de materia seca de la biomasa se selecciona del 10 al 100 % en peso, más preferiblemente del 35 al 95 % en peso y particularmente preferida del 40 al 80 % en peso. El término "materia seca" (m. s.) se refiere a la proporción de masa por biomasa determinada después de que el agua y otros compuestos volátiles se hayan retirado del tejido fresco usando un medidor por IR en equilibrio. Por lo tanto, se prefiere particularmente seleccionar una biomasa en la que su materia seca contenga al menos un 25 % en peso de sacáridos, tales como azúcares monoméricos, azúcares diméricos y oligosacáridos y/o polisacáridos, más preferiblemente al menos un 40 % en peso, particularmente preferido al menos un 60 % en peso, más preferiblemente al menos un 80 % en peso de sacáridos tales como azúcares monoméricos, azúcares diméricos y oligosacáridos y/o polisacáridos. Además, cualquier mezcla de biomasas adecuadas quedará incluida dentro del término "biomasa".

La biomasa particularmente preferida se selecciona de "biomasa de remolacha azucarera" y/o "biomasa de caña de azúcar" y/o "biomasa de lignocelulosa". El término "biomasa de remolacha azucarera" se refiere al tejido de raíz completo y sin procesar de Beta vulgarís, incluida la cáscara externa y la pulpa interna. El tejido seco de Beta vulgaris contiene un 80 % en peso de sacarosa soluble, mientras que la pulpa de remolacha contiene aproximadamente un 7 % de pectina, 7 % de celulosa y 7 % de hemicelulosa, 17 % de arabinosa, 20 % de glucosa y 3,5 % de fructosa y 10 % de proteínas, todos relativos a la materia seca (m. s.) de la biomasa. El término "biomasa de remolacha azucarera" comprende además pulpa de remolacha azucarera (chips de remolacha azucarera).

El término "biomasa de caña de azúcar" se refiere a los tallos completos y sin procesar de Saccharum sp., entre ellos la cáscara exterior y la pulpa interna. El tejido seco de Saccharum sp. contiene un 80 % en peso de sacarosa soluble, mientras que el bagazo de caña seco se compone de aproximadamente un 70 % de azúcares poliméricos, entre ellos un 45 % de celulosa, un 23 % de lignina y un 25 % de hemicelulosa principalmente en forma de xilano, todos en relación con la materia seca (m. s.) de la biomasa. El término "biomasa de caña de azúcar" comprende además la torta prensada de caña de azúcar (bagazo). Se prefieren particularmente el bagazo de caña de azúcar y la paja de caña de azúcar.

El término "biomasa lignocelulósica" se refiere a los residuos, desechos y/o subproductos de la silvicultura y la agricultura, la industria papelera y de procesamiento de alimentos y los desechos municipales. En concreto, el término "biomasa lignocelulósica", tal como se utiliza en la presente invención, incluye paja y/o espelta de granos (como el trigo, el centeno, la cebada, la avena), paja de maíz, rastrojos y/o husos, hierbas como Sericea lespedeza, pasto varilla (Panicum virgatum), pasto de Napier (Miscanthus; junco chino), pasto del Sudán (Sorghum sudananse, Sorghum drummondi), Arundo donax, cortezas, madera, residuos de madera, virutas de madera y/o astillas de madera, pulpa de fruta, paja de arroz, hojas de platanero, racimos de frutos huecos y residuos de pita.

Otras biomasas adecuadas para el procedimiento son estiércol de establos, materiales herbáceos, posos del café y desechos de almazaras, como torta prensada de colza y aguas residuales de molinos, material para la fabricación de papel y aguas residuales de las fábricas de papel, papel usado, restos de verduras y frutas.

Dentro de una realización preferida del procedimiento de la presente invención, la biomasa se selecciona de biomasa que contiene celulosa, hemicelulosa y/o lignina.

Dentro de una realización particularmente preferida del procedimiento de la presente invención, la biomasa se selecciona de remolacha azucarera, pulpa de remolacha azucarera, caña de azúcar, bagazo de caña de azúcar, paja de caña de azúcar, paja de trigo, maíz, madera, semillas oleaginosas y mezclas de las mismas.

Dentro de otra realización particularmente preferida del procedimiento de la presente invención, la biomasa es biomasa lignocelulósica procedente de residuos agrícolas, tales como paja de trigo, bagazo de caña de azúcar, hojas y tallos de caña de azúcar, paja de caña de azúcar, paja de maíz, rastrojos y mezclas de los mismos.

El término "hidrólisis", tal y como se usa en la presente invención, debe entenderse como la despolimerización de un polímero mediante una reacción de hidrólisis. La reacción de hidrólisis debe entenderse como la ruptura de enlaces químicos mediante la adición de agua. Una forma de realizar técnicamente la hidrólisis es agregar enzimas de tipo hidrolasa a la biomasa.

Preferiblemente debido al procedimiento para la hidrólisis de biomasa de acuerdo con la presente invención, los sacáridos se obtienen a partir del material de biomasa, en donde es particularmente preferido que al menos el 50 % en peso de los sacáridos obtenidos estén en forma de azúcares monoméricos y diméricos, preferiblemente al menos el 65 % en peso, más preferiblemente al menos el 75 % en peso, también se prefiere al menos el 85 % en peso y lo más preferiblemente el 99 % en peso, todo con respecto a la materia seca (m. s.) de la biomasa. Además, es posible obtener aminoácidos, oligopéptidos, oligosacáridos y/o proteínas a partir del material de biomasa cuando se aplica el procedimiento para la hidrólisis de biomasa de acuerdo con la presente invención.

Preferiblemente, la biomasa se lava antes de someterla al tratamiento enzimático y el agua de lavado se elimina antes de ningún procesamiento adicional. Además, se prefiere proporcionar la biomasa en forma de partículas, p. ej., cortando, moliendo, pulverizando, cizallando, dispersando por cizallamiento, troceando, dispersando y/o mezclando la biomasa antes de la etapa (a). Dentro de una realización adicional, la biomasa podría someterse a un procedimiento de pretratamiento antes de la etapa (a) del procedimiento de la invención.

Los métodos adecuados para el pretratamiento de la biomasa incluyen cualquier tipo de método de pretratamiento mecánico, biológico, químico y/o físico conocido por un experto en la materia. Dentro de una realización preferida, el método de pretratamiento se selecciona de los métodos de desmenuzamiento mecánico, tratamiento con ácidos y/o álcalis, oxidación húmeda, hidrotermólisis con pH controlado y/o explosión de vapor.

La "explosión de vapor" según la presente invención comprende preferiblemente un tratamiento hidrotérmico presurizado a una temperatura de 60 a 350 °C, preferiblemente de 80 a 300 °C, particularmente preferido de 100 a 250 °C y lo más preferido de 110 a 220 °C, del material que contiene lignocelulosa en ausencia o presencia de catálisis ácida (tal como H²SO⁴ , HCl, H³ PO⁴) o básica/alcalina (es decir, NH⁴OH, NaOH, KOH, cal), que se agregan, si están presentes, en concentraciones del 0,01 al 15 % (peso/peso), preferiblemente del 0,05 al 12,5 % (peso/peso), más preferiblemente del 0,1 al 10 % (peso/peso) y lo más preferido del 0,25 al 7,5 %. En una realización preferida de la presente invención, la presión se selecciona preferiblemente de 1 a 100 bar, preferiblemente de 2 a 50 bar, también preferiblemente de 3 a 25 bar y lo más preferiblemente de 5 a 15 bar. Los tiempos de reacción durante la explosión de vapor deben seleccionarse de 10 s a 2 h, preferiblemente de 1 min a 1,5 h, y lo más preferiblemente de 5 min a 1 h para garantizar una transformación eficiente de los componentes de la biomasa en la preparación para la hidrólisis enzimática. Dentro de una realización particularmente preferida, se lleva a cabo un pretratamiento de "desmenuzamiento mecánico" del material que contiene lignocelulosa antes o durante el pretratamiento de explosión de vapor, en el que el desmenuzamiento mecánico se selecciona del grupo que consiste en procesamiento mecánico, pulverización, troceado, aplastamiento, cortado, irradiación, molienda y combinaciones de los mismos.

El "pretratamiento con ácido" según la presente invención constituye preferiblemente un tratamiento continuo con ácido diluido y/o suave, tal como el tratamiento con ácido sulfúrico, u otros ácidos orgánicos, tal como el ácido acético, el ácido cítrico, el ácido tartárico, el ácido succínico, el cloruro de hidrógeno o mezclas de los mismos. También se pueden usar otros ácidos. Un "tratamiento con ácido suave" según la presente invención debe entenderse como que se lleva a cabo a un pH de 0,1 a 5, preferiblemente a un pH de 2 a 3 (con respecto al material que contiene lignocelulosa). En una realización preferida, el ácido se agrega en concentraciones del 0,01 al 15 % en peso (peso/peso), preferiblemente del 0,05 al 12,5 % en peso (peso/peso), más preferiblemente del 0,1 al 10 % en peso (peso/peso) y lo más preferido del 0,25 al 7,5 % en peso. El ácido es preferiblemente ácido sulfúrico. El ácido puede ponerse en contacto con la biomasa a una temperatura en el margen de 120 a 280 °C, preferiblemente de 135 a 225 °C y lo más preferiblemente de 150 a 200 °C durante un período de 1 a 60 min, preferiblemente de 2 a 30 min y lo más preferido de 5 a 15 min. La adición de ácidos fuertes, tales como ácido sulfúrico, se puede aplicar en realizaciones particularmente preferidas para eliminar la hemicelulosa.

El "pretratamiento químico" según la presente invención también se refiere al tratamiento de la biomasa con H²O² , ozono, ácidos de Lewis, FeCl³, Al²(SO⁴)³ en alcoholes acuosos, glicerol, dioxano, fenol, etilenglicol, NaOH, Na²CO³ y/o amoníaco. Las concentraciones, la temperatura y la duración preferidas se eligen de forma análoga a las condiciones mencionadas anteriormente con respecto al pretratamiento con ácido.

El "pretratamiento de oxidación en húmedo" según la presente invención implica el uso de oxidantes, tales como oxidantes a base de sulfito.

El término "trituración mecánica" se refiere a cualquier tratamiento mecánico que promueva la separación y/o liberación de celulosa, hemicelulosa y/o lignina desde la biomasa.

El desmenuzamiento mecánico se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en procesamiento mecánico, pulverización, troceado, aplastamiento, cortado, irradiación, molienda, tal como molienda en seco, molienda en húmedo y molienda vibratoria con bolas, y combinaciones de las mismas.

"Pretratamiento biológico" según la presente invención se refiere a cualquier pretratamiento biológico que promueva la separación y/o liberación de celulosa, hemicelulosa y/o lignina desde la biomasa. Las técnicas de pretratamiento biológico pueden implicar la aplicación de microorganismos que solubilicen la lignina, tal como los actinomicetos (p.

ej., cepas de Streptomyces) o los hongos lignícolas de la pudrición blanca.

Los métodos de pretratamiento adecuados para el procedimiento de la presente invención deben llevarse a cabo dentro de dispositivos adecuados conocidos por un experto en la materia. Un dispositivo adecuado para llevar a cabo un pretratamiento químico puede ser cualquier tipo de recipiente, tal como un reactor discontinuo. Un dispositivo adecuado para llevar a cabo una explosión de vapor puede ser cualquier tipo de recipiente, tal como un reactor discontinuo, pero también puede llevarse a cabo dentro de un reactor con hélice, preferiblemente un reactor con hélice continuo.

Por lo tanto, se prefiere particularmente que el método de pretratamiento se seleccione de métodos que no impliquen la adición de ningún ácido ni álcali, ya que el uso de estas sustancias conducirá a la formación de compuestos inhibidores de enzimas y/o microorganismos utilizados durante la hidrólisis y/o fermentación.

El contenido de materia seca de la biomasa pretratada se selecciona preferiblemente del 20 al 60 % en peso, se prefiere particularmente del 35 al 50 % en peso, en donde lo más preferido es que la biomasa haya sido pretratada mediante un método que no implique la adición de ácidos ni álcalis.

Sin embargo, es una ventaja particular del procedimiento para la hidrólisis de biomasa que la aplicación de partículas de biomasa relativamente grandes y/o sin tratar también logre todavía unos resultados favorables. El tamaño de las partículas de biomasa es preferiblemente tal que al menos el 90% en peso de las partículas tienen una longitud máxima de 200 mm, más preferiblemente 100 mm, incluso más preferiblemente 50 mm y lo más preferiblemente 25 mm. Se prefiere además que el tamaño de las partículas de biomasa sea preferiblemente tal que al menos el 95% en peso de las partículas tenga una longitud máxima de 200 mm, más preferiblemente de 100 mm, incluso más preferiblemente de 50 mm y lo más preferiblemente de 25 mm.

Dentro de la etapa (a) del procedimiento para la hidrólisis de biomasa, la biomasa se pone en contacto con una composición enzimática que contiene al menos una enzima seleccionada de la clase de las hidrolasas.

El término "poner en contacto", tal como se usa dentro del procedimiento para la hidrólisis de biomasa, comprende cualquier tipo de contacto de la biomasa con una composición enzimática conocida por un experto en la técnica como adecuada para el procedimiento de la invención. Dentro de una realización preferida, el "contacto" de la biomasa con la composición enzimática se lleva a cabo añadiendo la composición enzimática a la biomasa. Además, se prefiere particularmente que la adición de la composición enzimática vaya seguida o se lleve a cabo simultáneamente con una mezcla de la composición enzimática y la biomasa.

El término "composición enzimática", tal como se usa dentro de la presente invención del procedimiento para la hidrólisis de biomasa, se refiere a cualquier composición que comprende al menos una enzima seleccionada de la clase de las hidrolasas. La al menos una enzima seleccionada de la clase de las hidrolasas asciende preferiblemente a entre el 1 y el 99,99 % en peso (con respecto al peso de la composición enzimática), más preferiblemente entre el 5 y el 99 % en peso, particularmente preferido entre el 10 y el 95 % en peso y lo más preferiblemente del 20 al 90 % en peso, y puede contener además al menos una enzima seleccionada de la clase de las liasas. Dentro de las realizaciones de la presente invención, en las que la composición enzimática contiene al menos una enzima seleccionada de la clase de las liasas, la al menos una enzima seleccionada de la clase de las hidrolasas asciende preferiblemente a del 0,01 al 50 % en peso (con respecto al peso de la composición enzimática), preferiblemente del 0,05 al 20 % en peso, más preferiblemente del 0,08 al 5 % en peso y lo más preferiblemente del 0,1 al 1 % en peso.

Dentro de una realización preferida del procedimiento de la presente invención para la hidrólisis de biomasa, la composición enzimática contiene celulasas, hemicelulasas y/o pectinasas.

Dentro de una realización particularmente preferida del procedimiento para la hidrólisis de biomasa, la composición enzimática contiene al menos una celobiohidrolasa (EC 3.2.1.-) y al menos una endo-1,4-p-glucanasa (EC 3.2.1.4).

Dentro de una realización particularmente preferida del procedimiento para la hidrólisis de biomasa, la composición enzimática contiene al menos una celobiohidrolasa (EC 3.2.1.-), al menos una endo-1,4-p-glucanasa (EC 3.2.1.4), al menos una p-glucosidasa (EC 3.2.1.4), al menos una glucósido hidrolasa 61 (GH61 y CBM33), al menos una endoxilanasa (EC 3.2.1.8) y al menos una p-xilosidasa (EC 3.2.1.37).

Dentro de una realización particularmente preferida, la composición enzimática definida anteriormente contiene además una o más enzimas seleccionadas de p-glucanasa (EC 3.2.1.-), acetilxilano esterasa (EC 3.1.1.72), acetilgalactano esterasa (3.1.1.6), a-arabinopiranosidasa (3.2.1.-), a-galactosidasa (EC 3.2.1.22), p-galactosidasa (EC 3.2.1.23), a-glucuronidasas (EC 3.2.1.139), p-manasa (EC 3.2.1.78), pectina metilesterasa (EC 3.1.1.11), pectina acetilesterasa (EC 3.1.1.-), ramnogalacturonasa (EC 3.2.1.-; GH28), ramnogalacturonano acetilesterasa (EC 3.1.1.86), ramnogalacturonano endoliasa (EC 4.2.2.23) , ramnogalacturonano liasa (EC 4.2.2.-) y p-manosidasas (EC 3.2.1.25), poligalacturonasas (EC 3.2.1.15, 67, 82; GH28) y pectina/pectato liasas (E^c 4.2.2.2, 6, 9, 10).

Los términos "celulasas", "hemicelulasas" y "pectinasas", tal como se utilizan en la presente invención del procedimiento para la hidrólisis de biomasa, se refieren a cualquier mezcla de enzimas que interviene en la degradación hidrolítica (despolimerización) de celulosa, hemicelulosa y/o pectina poliméricas a azúcares monoméricos. Tal y como se usa en la presente memoria, los términos "celulasas", "hemicelulasas" y "pectinasas" se refieren tanto a mezclas naturales como no naturales que incluyen una pluralidad de enzimas producidas por un organismo, por ejemplo, un hongo filamentoso. Las "celulasas", "hemicelulasas" y "pectinasas" se obtienen preferiblemente de hongos, tales como los miembros de las subdivisiones Eumycota y Oomicota, que incluyen, pero sin limitarse a ellos, los siguientes géneros: Aspergillus, Acremonium, Aureobasidium, Beauvería, Cephalosporium, Ceriporiopsis, Chaetomium, Chrysosporium, Claviceps, Cochiobolus, Cryptococcus, Cyathus, Endothia, Endothia mucor, Fusarium, Gilocladium, Humicola, Magnaporthe, Myceliophthora, Myrothecium, Mucor, Neurospora, Phanerochaete, Podospora, Paecilomyces, Pyricularia, Rhizomucor, Rhizopus, Schizophylum, Stagonospora, Talaromyces, Trichoderma, Thermomyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichophyton y Trametes. En una implementación preferida, el hongo filamentoso es una especie de Trichoderma.

En una realización preferida de la composición enzimática, las celulasas y/o pectinasas son de origen fúngico. En una realización particularmente preferida de la composición enzimática, esta fuente fúngica es Trichoderma reesei.

El término "mezcla de enzimas" se refiere preferiblemente a una mezcla de enzimas secretadas por una única o más fuentes microbianas. En algunas realizaciones, las enzimas para uso en estas una o varias mezclas de enzimas se pueden preparar a partir de una o más cepas de hongos filamentosos de origen natural o modificadas genéticamente. Las cepas preferidas se enumeran más arriba. La proporción deseada de componentes enzimáticos dentro de la(s) mezcla(s) final(es) puede lograrse alterando la cantidad relativa de enzima en la mezcla final, p. ej., mediante la suplementación de enzima(s) purificada(s) o parcialmente purificada(s). En algunas realizaciones, la una o varias mezclas finales pueden complementarse con una o más actividades enzimáticas que no se expresan endógenamente, o que los hongos filamentosos expresan a un nivel relativamente bajo, para mejorar la degradación del sustrato celulósico a azúcares fermentables. La una o varias enzimas suplementarias pueden añadirse como suplemento a la(s) mezcla(s) final(es) y las enzimas pueden ser un componente de un caldo de fermentación completo independiente, o pueden purificarse, o recuperarse y/o purificarse mínimamente.

Tal y como se usa dentro del procedimiento para la hidrólisis de biomasa, el término "celulasa" se refiere a cualquier enzima capaz de hidrolizar polímeros de celulosa a oligómeros más pequeños y/o glucosa. Las celulasas preferidas dentro de la composición enzimática incluyen celobiohidrolasas (CBH) (Ec 3.2.1.-), endo-1,4-p-glucanasas (EG) (EC 3.2.1.4), p-glucosidasa (EC 3.2.1.4), celobiosa hidrolasa (EC 3.2.1.21), glucósido hidrolasa 61 (GH61 y CBM33), expansina, hinchadina, destensina y proteínas CIP (EC 3.1.1.-; CE15).

Tal como se utiliza en el procedimiento de hidrólisis de biomasa, el término "hemicelulasa" se refiere a cualquier enzima capaz de degradar o favorecer la degradación de la hemicelulosa. Las hemicelulasas preferidas dentro de la composición enzimática incluyen p-glucanasas (EC 3.2.1.-), endoxilanasas (EC 3.2.1.8), p-xilosidasas (EC 3.2.1.37), acetilxilano esterasa (EC 3.1.1.72), acetilgalactano esterasa (3.1.1.6), acetilmanano esterasa, feruloílo esterasa (EC 3.1.1.73), glucuronoílo esterasa (EC 3.1.1.-), a-L-arabinofuranosidasa (EC 3.2.1.55), a-arabinopiranosidasa (3.2.1.-), a-galactosidasa (EC 3.2.1.22), p-galactosidasa (EC 3.2.1.23), a-glucuronidasas (EC 3.2.1.139), p-manasa (EC 3.2.1.78), p-manosidasas (EC 3.2.1.25), manano 1,4-manobiosidasa (EC 3.2.1.100), arabinogalactano endo-p-1,4-galactanasa (EC 3.2.1.89), endo-p-1,3-galactanasa (EC 3.2.1.90), galactano endo-p-1,3-galactanasa (EC 3.2.1.181), glucuronoarabinoxilano endo-1,4-p-xilanasa (EC 3.2.1.136), a-L-fucosidasa (EC 3.2.1.51), coniferina p-glucosidasa (EC 3.2.1.126), xiloglucano hidrolasas (EC 3.2.1.150, 151, 155), xilano a-1,2-glucuronosidasa (EC 3.2.1.131), endoxilogalacturonano hidrolasa (EC 3.2.1.-; GH28), a-amilasa (EC 3.2.1.1), glucano 1,4-a-glucosidasa (EC 3.2.1.3), galactano 1,3-galactosidasa (GH43), -1,4,-endogalactanasa (EC 3.5.1.89; GH53), a-ramnosidasa (EC 3.2.1.40), pramnosidasa (EC 3.2.1.43), lignina peroxidasa (EC 1.11.1.14), Mn peroxidasa (EC 1.11.1.13), arilalcohol oxidasa (EC 1.1.3.7), glioxal oxidasa (Ec 1.1.3.), carbohidrato oxidasas (EC 1.1.3.4, 9, 10), lacasa (Ec 1.10.3.2) y celobiosa deshidrogenasa (EC 1.1.99.18).

Tal como se utiliza dentro del procedimiento de hidrólisis de biomasa, el término "pectinasa" se refiere a cualquier enzima capaz de degradar o favorecer la degradación de la pectina. Las pectinasas preferidas dentro de la composición enzimática incluyen poligalacturonasas (EC 3.2.1.15, 67, 82; GH28), pectina/pectato liasas (EC 4.2.2.2, 6, 9, 10), pectina metilesterasa (EC 3.1.1.11), pectina acetilesterasa (EC 3.1.1.-), ramnogalacturonasa (EC 3.2.1.-; GH28), ramnogalacturonano acetilesterasa (EC 3.1.1.86), ramnogalacturonano endoliasa (EC 4.2.2.23), ramnogalacturonano liasa (EC 4.2.2.-), ramnogalacturonano galacturonohidrolasa (EC 3.2.1.-), xilogalacturonano hidrolasa (EC 3.2.1.-), pectina metilesterasa (EC 3.1.1.11), p-arabinofuranosidasa (EC 3.2.1.55), p-1,4-galactanasa (EC 3.2.1.89), p-1,3-galactanasa (EC 3.2.1.90), p-galactosidasa (EC 3.2.1.23), a-galactosidasa (EC 3.2.1.22), feruloílo acetilesterasa (EC 3.1.1.-), a-fucosidasa (EC 3.2.1.51), (p-fucosidasa) (EC 3.2.1.38), p-apiosidasa (EC 3.2.1.-), aramnosidasa (E^c 3.2.1.40), p-ramnosidasa (EC 3.2.1.43), a-arabinopiranosidasa (EC 3.2.1.-), p-glucuronidasa (EC 3.2.1.31), a-glucuronidasa (EC 3.2.1.139), p-xilosidasa (EC 3.2.1.37) y a-xilosidasa (EC 3.2.1.x).

Las enzimas a las que se hace referencia en la presente invención del procedimiento para la hidrólisis de biomasa se clasifican según las nomenclaturas que se basan en la Clasificación y Nomenclatura de Enzimas de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular (http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/) o en la base de datos Carbohydrate-Active EnZYmes (http://www.cazy.org/).

El término "actividad" de una enzima, tal como se utiliza en la presente invención del procedimiento para la hidrólisis de biomasa, se refiere a la actividad catalítica de la enzima en las condiciones apropiadas en las que la enzima sirve como catalizador proteico, que convierte sustratos poliméricos o artificiales específicos en productos oligoméricos o monoméricos específicos. En este contexto, el término "condiciones apropiadas" es bien conocido y aplicable por un experto en la materia.

El "contacto" según la etapa (a) del procedimiento de la invención puede llevarse a cabo mediante cualquier medio conocido por un experto en la materia como adecuado para el propósito de la invención. Por tanto, se prefiere que la mezcla de enzimas se añada a la biomasa mientras se agita la biomasa dentro del recipiente. La una o varias enzimas también pueden inmovilizarse sobre un material portador.

Las enzimas pueden emplearse en diferentes proporciones relativas en una mezcla dada. Por lo tanto, se prefiere particularmente emplear la composición enzimática con una relación E/S (relación de enzima por sustrato) del 0,05 al 1,5 % en peso, preferiblemente del 0,1 al 0,75 % en peso.

Se prefiere además que el procedimiento de la presente invención, particularmente la etapa de hidrólisis, no implique el uso de sustancias ácidas y/o alcalinas, ya que el uso de estas sustancias conducirá a la formación de compuestos inhibidores de enzimas y/o microorganismos utilizados durante la hidrólisis y/o fermentación. Además, el uno o varios ácidos y/o álcalis no solo hidrolizarán los enlaces glucosídicos, sino que también reaccionarán con las moléculas de glucosa y xilosa ya presentes en el hidrolizado para formar compuestos no deseados, tales como hidroximetilfurfural y furfural.

Además, grandes cantidades de ácidos, especialmente de ácido clorhídrico, pueden incluso impedir el uso de equipos de acero inoxidable, tales como recipientes, reactores y tuberías, y requerir el uso de una gran cantidad de sustancias neutralizantes que nuevamente aumentarán la cantidad de sales indeseables dentro del hidrolizado.

En una realización preferida, la etapa (a) del procedimiento para la hidrólisis de biomasa se lleva a cabo durante un tiempo suficiente para hidrolizar al menos el 20 % en peso, preferiblemente al menos el 30 % en peso, más preferiblemente al menos el 50 % en peso y lo más preferido al menos el 60 % en peso de la biomasa. Dentro de una realización preferida adicional del procedimiento de la presente invención, la etapa (a) se lleva a cabo durante un tiempo suficiente para hidrolizar del 10 al 100 % en peso, preferiblemente del 20 al 90 % en peso, incluso más preferiblemente del 30 al 85,0% en peso y lo más preferiblemente del 40 al 75 % en peso de la celulosa de la biomasa. Dentro de la presente invención, el término "hidrolizar" debe entenderse como la conversión hidrolítica de componentes poliméricos insolubles de la biomasa en compuestos monoméricos, diméricos y/u oligoméricos solubles mediante procedimientos químicos, físicos y/o enzimáticos, tales como la hidrólisis.

La etapa (a) del procedimiento para la hidrólisis de la biomasa también se puede llevar a cabo generalmente durante 1 min a 112 h, durante 30 min a 100 h, durante 1 h a 96 h, durante 4 h a 85 h o de 12 h a 72 h.

Dentro de una realización preferida adicional, la etapa (a) del procedimiento para la hidrólisis de biomasa se lleva a cabo hasta que el contenido de sólidos insolubles restantes sea inferior al 40 % en peso, preferiblemente inferior al 30 % en peso, incluso más preferiblemente inferior al 20 % en peso y lo más preferiblemente inferior al 15 % en peso. En una realización preferida adicional, la etapa (a) del procedimiento para la hidrólisis de biomasa se lleva a cabo hasta que el contenido de sólidos insolubles remanentes es del 5 al 40 % en peso, preferiblemente del 8 al 30 % en peso y lo más preferiblemente del 10 al 25 % en peso.

Dentro de otra realización preferida de la presente invención del procedimiento para la hidrólisis de biomasa, la etapa (a) se lleva a cabo hasta licuar la biomasa al menos al 50 %, preferiblemente al menos al 60 % y lo más preferiblemente al menos al 80 %, en donde una licuefacción de 60 al 90 % es particularmente preferida.

La temperatura de reacción durante la etapa (a) de dicho procedimiento puede seleccionarse generalmente entre 25 y 80 °C, más preferiblemente entre 30 y 75 °C y particularmente preferible entre 35 y 65 °C. En una realización, la etapa (a) del procedimiento para la hidrólisis de biomasa se lleva a cabo durante 3 a 60 h, en donde la temperatura es de 45 a 65 °C.

Dentro de otra realización preferida, el pH durante la etapa (a) se selecciona preferiblemente de 4 a 6, se prefiere particularmente de 4,5 a 5,5.

Los niveles de dosificación y las condiciones operativas apropiados serán evidentes para los expertos en la técnica, especialmente a la luz de la descripción detallada dada a conocer en la presente memoria. Los niveles de dosificación óptimos de todo el caldo de fermentación variarán considerablemente según el sustrato y las tecnologías de pretratamiento utilizadas. La composición enzimática se añade preferiblemente a la biomasa en una cantidad del 0,1 al 24 % en peso de la materia seca de la biomasa, más preferiblemente del 0,25 al 12 % en peso de la materia seca de la biomasa, siendo particularmente preferido del 0,5 al 6 % en peso de la materia seca de la biomasa y lo más preferiblemente del 0,1 al 0,6 % en peso de la materia seca de la biomasa. La concentración total de enzimas (proteínas) se determinó por el método de Bradford con seroalbúmina bovina como estándar de referencia (Bradford, M., 1976).

La etapa (a) del procedimiento de hidrólisis de biomasa se lleva a cabo dentro de cualquier tipo de recipiente conocido por el experto en la materia como adecuado para el procedimiento de la invención, preferiblemente dentro de un reactor. Los reactores adecuados están dentro del conocimiento de un experto en la técnica. Los recipientes/reactores preferibles incluyen, entre otros, recipientes/reactores que comprenden un medio de agitación y/o un medio para bombear o recircular el contenido de biomasa dentro del reactor. Otros medios preferidos de los reactores preferidos incluyen, entre otros, medios para controlar la temperatura y/o el pH y regular la temperatura y/o el pH.

Después de la etapa (a) del procedimiento de la invención, una fase sólida y una líquida se separan de acuerdo con la etapa (b) del procedimiento de la invención. La separación de la fase sólida y líquida puede llevarse a cabo mediante cualquier medio conocido por un experto en la materia como adecuado para el propósito de la invención y preferiblemente se lleva a cabo mediante filtración, centrifugación, decantación o prensado, p. ej., por una prensa de tornillo.

La temperatura de la fase líquida es preferiblemente la misma que la temperatura durante el contacto según la etapa (a) del procedimiento de la invención. Dentro de una realización particularmente preferida, la temperatura de la fase líquida se selecciona de 25 a 60 °C, más preferiblemente de 30 a 55 °C. En caso de que la temperatura de la fase líquida separada esté por debajo de la temperatura durante el contacto según la etapa (a), la fase líquida se enfría preferiblemente mediante el transporte de la fase líquida a través de un intercambiador de calor después de la separación de la fase sólida según la etapa (b) del procedimiento de la invención.

De acuerdo con la etapa (c) del procedimiento de la invención, se lleva a cabo una conversión enzimática de la fase sólida separada. Es posible convertir la fase sólida mediante la utilización de las enzimas todavía presentes en el material. Esto es particularmente preferido en el caso de que las enzimas añadidas durante la etapa (a) del procedimiento sean aptas para la inmovilización sobre las partículas sólidas todavía presentes dentro de la fase sólida. Sin embargo, también es posible añadir otras enzimas durante la etapa (c). En caso de que se agreguen enzimas, es posible agregar las mismas enzimas u otras diferentes en comparación con la etapa (a).

Dentro de una realización particularmente preferida, la temperatura durante la etapa (c) se selecciona preferiblemente de 25 a 80 °C, más preferiblemente de 30 a 75 °C y lo más preferiblemente de 35 a 65 °C.

Dentro de otra realización preferida, el pH durante la etapa (c) se selecciona preferiblemente de 4 a 6, se prefiere particularmente de 4,5 a 5,5.

Dentro de otra realización preferida, la etapa (c) se lleva a cabo preferiblemente durante al menos 30 min, más preferiblemente durante al menos 60 min, incluso más preferiblemente durante al menos 90 min y lo más preferiblemente durante al menos 120 min antes de combinar al menos parte de la fase sólida según la etapa (d) con la fase líquida. Por lo tanto, es particularmente preferido que la etapa (c) se lleve a cabo durante 1 min a 112 h, más preferiblemente durante 30 min a 100 h, particularmente preferido durante 1 h a 96 h, aún más preferido durante 4 h a 85 h, también particularmente preferido de 12 h a 72 h.

Dentro de una realización particularmente preferida, se añade a la fase sólida al menos una enzima seleccionada de la clase de las hidrolasas. El término "hidrolasas" se define tal como se ha descrito antes. Está dentro del alcance de la presente invención agregar las mismas hidrolasas u otras diferentes dentro de la etapa (a) y la etapa (c).

Dentro de una realización preferida adicional, se añade una cantidad de líquido, preferiblemente H2O, a la fase sólida antes o durante la etapa (c). La cantidad se elige preferiblemente para garantizar un contenido final de materia seca de la fase sólida del 15 al 35 %, preferiblemente del 18 al 30 % y lo más preferiblemente del 20 al 25 %.

Con respecto a la conversión enzimática según la etapa (c), es posible además elegir las mismas o diferentes condiciones, parámetros y concentraciones como se definió anteriormente con respecto a la etapa (a) del procedimiento. Las mismas definiciones se aplican en consecuencia.

En otra realización preferida del procedimiento de la presente invención, se lleva a cabo una separación sólido-líquido después de la etapa (c). De este modo, solo la fase líquida separada se usaría para alimentar la fase sólida convertida de la etapa (d). La separación sólido-líquido se lleva a cabo preferiblemente mediante el uso de una prensa con filtro.

De acuerdo con la etapa (d) del procedimiento de la invención, al menos parte de la fase sólida convertida de la etapa (c) se combina con la fase líquida de la etapa (b). Por lo tanto, el término "fase sólida convertida" debe entenderse como la fase sólida separada según la etapa (b) que ya ha sufrido una conversión enzimática de al menos 1 min, preferiblemente al menos 30 min, más preferiblemente al menos 1 h, particularmente preferido al menos 4 h, también se prefiere al menos 6 h y lo más preferido al menos 12 h. Por lo tanto, se prefiere particularmente que la conversión enzimática se haya llevado a cabo durante un período de tiempo de 4 h a 108 h, preferiblemente de 6 h a 96 h y lo más preferiblemente de 12 a 72 h.

La "combinación" según la etapa (d) se lleva a cabo con la alimentación del 10 al 100 % en peso, preferiblemente del 20 al 100 % en peso, más preferiblemente del 50 al 100 % en peso, de la "fase sólida convertida" a la fase líquida según la etapa (d). Sin embargo, también está dentro del alcance de la presente invención que la combinación se lleve a cabo alimentando la fase sólida convertida con la fase líquida o mediante una combinación simultánea de ambas fases.

Por tanto, se prefiere alimentar la fase líquida con la fase sólida convertida de forma continua o mediante una única adición. Si la fase sólida convertida se alimenta continuamente, al menos el 10 % en peso de la fase sólida convertida se usa para alimentar la fase líquida por hora, preferiblemente al menos el 20 % en peso, más preferiblemente al menos el 30 % en peso. Por lo tanto, también se prefiere que se alimente la fase líquida por hora con del 10 al 50 % en peso, preferiblemente del 15 al 45 % en peso, de la fase sólida convertida. Si con la "fase sólida convertida" de la etapa (c) se alimenta a la etapa (d) de manera continua, la alimentación puede comenzar inmediatamente después de la etapa (c) del procedimiento de la invención o comenzar dentro de un período de tiempo de 1 segundo a 144 h, preferiblemente de 1 min a 122 h, más preferiblemente de 1 h a 96 h, más preferiblemente de 6 h a 72 h y lo más preferiblemente de 12 h a 48 h. Se prefiere particularmente alimentar del 15 al 45 % en peso de la fase sólida convertida por hora y comenzar la alimentación después de 12 a 48 h después de la etapa (c).

Así, la alimentación se realiza mediante cualquier medio conocido por el experto en la materia como adecuado al procedimiento de la invención, tal como el bombeo de una parte de dicha biomasa a través de una tubería.

El término "volumen de reacción" se refiere por lo tanto al volumen total de biomasa y composición enzimática presente en el recipiente.

En una realización particularmente preferida, la alimentación según la etapa (d) se lleva a cabo preferiblemente mediante la implementación de un intercambiador de calor. Al implementar un intercambiador de calor, no solo es posible recuperar y reciclar la energía térmica del procedimiento de conversión enzimática, sino que el material así tratado también se enfriará hasta una temperatura más favorable para la fermentación posterior opcional. El término "intercambiador de calor" es bien conocido por un experto en la materia y comprende cualquier dispositivo conocido por un experto en la materia como adecuado para el propósito de la invención.

En una realización preferida del procedimiento para la hidrólisis de biomasa, las etapas (a) a (d) se repiten al menos una vez para asegurar el máximo rendimiento posible de los compuestos deseables de la biomasa. Dentro de una realización particularmente preferida, las etapas (a) a (d) se repiten de 2 a 100000 veces, preferiblemente de 10 a 70 000 veces, más preferiblemente de 15 a 50000 veces y lo más preferiblemente de 17 a 10000 veces. Está dentro del alcance de la presente invención que se lleve a cabo una etapa de limpieza de un recipiente y/o cualquier otra parte del sistema en cualquier momento entre las etapas (a) a (d) o después de ellas. La limpieza puede llevarse a cabo mediante cualquier medio conocido por un experto en la materia como adecuado para el propósito de la invención y también puede incluir el recambio de una o más partes del sistema.

En otro procedimiento particularmente preferido, las etapas (a) a (d) se llevan a cabo al menos parcialmente de forma simultánea y/o continua.

En una realización particularmente preferida del procedimiento de la invención, la composición enzimática añadida a la biomasa se añade en una cantidad del 0,1 al 3 % en peso de materia seca de la biomasa y la etapa (b) del procedimiento se inicia después de 5 a 100 h. En otra realización particularmente preferida del procedimiento, la composición enzimática añadida a la biomasa está en una cantidad del 0,25 al 2 % en peso de materia seca de la biomasa y la etapa (b) del procedimiento se inicia después de 10 a 72 h.

Se agrega al menos un organismo para la fermentación a la fase líquida antes o durante la etapa (d) del procedimiento, mientras que, dentro de una realización particularmente preferida, el organismo para la fermentación se agrega a la fase líquida antes o durante la etapa (d) del procedimiento.

La temperatura durante la adición del al menos un organismo para la fermentación se selecciona entre 25 y 45 °C.

El organismo para la fermentación es particularmente preferido entre las levaduras mesófilas tales como todas las especies del género Saccharomyces, especialmente Saccharomyces bayanus, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces bulderi, Saccharomyces cariocanus, Saccharomyces cariocus, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces chevalieri, Saccharomyces dairenensis, Saccharomyces ellipsoideus, Saccharomyces eubayanus, Saccharomyces exiguus, Saccharomyces florentinus, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces martiniae, Saccharomyces monacensis, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces paradoxus , Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces spencerorum, Saccharomyces turicensis, Saccharomyces unisporus, Saccharomyces uvarum, Saccharomyces zonatus, así como Arxula adeninovorans, Ashbya gossypii, Hansenula polymorpha, Debaramyces hansenii, Hortea werneckii, Kluyeveromyces lactis, Schwanniomyces occidentalis, Thrichosporon domesticum, Thrichosporon montevideense, Xanthophyllomyces dendrohous, Yarowia lypolytica, Zygosaccharomyces bailii, Zygosaccharomyces rouxii, Schizosaccharomyces pombe, Pichia stipitis, Pichia segobiensis, Candida shehatae, Candida tropicalis, Candida boidinii, Candida tenuis, Pachysolen tannophilus, Hansenula polymorpha, Candida famata, Candida parapsilosis, Candida rugosa, Candida sonorensis, Candida maltosa, Issatchenkia terrícola, Kloeckera apis, Pichia barkeri, Pichia cactophila, Pichia deserticola, Pichia norvegensis, Pichia membranefaciens, Pichia mexicana y Torulaspora delbrueckii, Rhodosporidium toruloides, Rhodotorula glutinis, Lipomyces starkeyi, Lipomyces lipofer, Cryptococcus albidus y mezclas de los mismos.

En una realización alternativa del procedimiento de la invención, el al menos un organismo para la fermentación se selecciona de microorganismos termófilos. Ejemplos de levaduras termófilas adecuadas para el procedimiento de la invención son Candida bovina, Candida picachoensis, Candida emberorum, Candida pintolopesii, Candida thermophila, Kluyveromyces marxianus, Kluyveromyces fragilis, Kazachstania telluris, Issatchenkia orientalis y Lachancea thermotolerans. Las bacterias termófilas preferidas incluyen Clostridium thermocellum, Clostridium termohidrosulfuricum, Clostridium thermosaccharolyticum, Thermoanaerobium brockii, Thermobacteroides acetoetilicus, Thermoanaerobacter etanolicus, Clostridium thermoaceticum, Clostridium thermoautotrophicum, Acetogenium kivui, Desulfotomaculum nigrificans y Desulvovibrio thermophilus, Thermoanaerobacter tengcongensis, Bacillus stearerothermophilus y Thermoanaerobacter mathranii.

Se prefiere especialmente el uso de las siguientes levaduras mesófilas: Saccharomyces cerevisiae, Pichia stipitis, Pachysolen tannophilus, Candida shehatae.

En una realización alternativa del procedimiento de la invención, el al menos un organismo de fermentación se selecciona de hongos. Ejemplos de hongos adecuados para el procedimiento de la invención son Aspergillus sp., Trichoderma sp., Penicillium sp., Acremonium sp., Rhizopus sp. y Talaromyces sp.

En una realización alternativa del procedimiento de la invención, el al menos un organismo para la fermentación se selecciona de bacterias. Ejemplos de bacterias adecuadas para el procedimiento de la invención son Clostridium acetobutylicum, Lactobacillus brevis, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus casei, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus lactis, Lactococcus lactis, Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus sp., Zymomonas mobilis, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis.

En una realización preferida, se añaden minerales como cobre, zinc, magnesio, calcio, hierro y compuestos con nitrógeno, tal como nitrato, aminoácidos, amoníaco, antes, durante o después de la adición del al menos un organismo para la fermentación.

Los compuestos orgánicos valiosos resultantes de la fermentación bacteriana del hidrolizado comprenden, entre otros, ácidos orgánicos (tal como ácido acético, ácido láctico, ácido succínico, ácido itacónico, ácido fumárico, ácido propiónico y ácido glucurónico), aminoácidos (tal como ácido glutámico leucina, lisina, treonina, ácido aspártico, fenilalanina, cisteína), caprolactamas (tal como a-aminocaprolactama), antibióticos (tal como bleomicina, virginiamicina, lincomicina, monensina, blasticidina, tetraciclina), vitaminas (tal como vitamina B2, B12 y C), enzimas, nucleótidos/nucleósidos (tal como NADH, ATP, cAMP, FAD, coenzima A), biogás, biopolímeros (tal como polihidroxibutirato, poliamidas/fibroínas), proteínas, polisacáridos (tal como xantano, dextrano), aminoglucanos (tal como el ácido hialurónico), así como disolventes orgánicos y biocombustibles (tal como acetona, etanol, butanol, propanodiol).

Los compuestos orgánicos valiosos resultantes de la fermentación del hidrolizado con levaduras comprenden, entre otros, disolventes orgánicos (p. ej., etanol, propanol), nucleótidos (p. ej., ARN), biotensioactivos (p. ej., lípidos de soforosa), enzimas y biopolímeros (p. ej., espidroínas).

Los compuestos orgánicos valiosos resultantes de la fermentación fúngica del hidrolizado comprenden ácidos orgánicos (tal como ácido cítrico, ácido fumárico, ácido itacónico), antibióticos (tal como penicilina, cefalosporina), enzimas y polisacáridos (tal como quitina).

En otra realización preferida de este proceso, el compuesto orgánico se selecciona de alcoholes, ácidos orgánicos, biopolímeros, antibióticos, aminoácidos, caprolactamas, polisacáridos, solventes orgánicos, biocombustibles, aminoglucanos, nucleótidos/nucleósidos, vitaminas, biotensioactivos, enzimas y mezclas de los mismos.

Es una gran ventaja del procedimiento de la presente invención que el procedimiento puede llevarse a cabo como un proceso continuo mientras que, particularmente preferido, al menos dos ciclos del procedimiento [ciclo v1n1, ciclo v2n1] se inician en paralelo o separados por un intervalo. La variable "v" indica así el ciclo individual, la variable "n" indica la repetición del ciclo. Por ejemplo, un procedimiento de acuerdo con la invención que involucra tres ciclos y se ejecuta durante 100 repeticiones (cada ciclo) se definiría usando variables de v1n1, v2n1, v3n1 a v1n100, v2n100 y v3n100, en donde, p. ej., la repetición 35a del segundo ciclo estaría indicada por v2n35.

Se prefiere particularmente que los ciclos comiencen tras un intervalo de al menos 15 min, preferiblemente al menos 60 min, más preferiblemente al menos 6 h, particularmente preferido al menos 12 h, también preferiblemente al menos 24 h y lo más preferiblemente al menos 48 h, en donde se prefieren particularmente un intervalo de 1 h a 96 h, preferiblemente de 5 h a 72 h, también preferiblemente de 6 h a 48 h o de 10 h a 24 h. Por lo tanto, cada ciclo del procedimiento subsiguiente [v2, v3, etc.] utiliza la fase sólida convertida enzimáticamente de la fase anterior [a partir de v1 ] tal como se muestra en la figura 1. En caso de que el procedimiento de la invención se lleve a cabo en 2 ciclos, en donde los ciclos se inician preferiblemente con un intervalo de 24 a 72 h, preferiblemente de 36 a 48 h, en caso de que el procedimiento de la invención se lleve a cabo en 4 ciclos, los ciclos se inician preferiblemente con un intervalo de 12 a 72 h, preferiblemente de 18 a 24 h.

Si el procedimiento de hidrólisis de biomasa según la presente invención se lleva a cabo en más de un ciclo, es particularmente ventajoso que las etapas (a) y (c) se lleven a cabo simultáneamente durante al menos el 50 % de la duración de la etapa (a), preferiblemente del 50 al 95 %, particularmente preferido del 60 al 90 % y lo más preferiblemente del 70 al 85 %. Se prefiere igualmente que las etapas (a) y (c) se lleven a cabo simultáneamente durante el 100% del tiempo.

Si el procedimiento de hidrólisis de biomasa según la presente invención se lleva a cabo en más de un ciclo, es particularmente ventajoso que las etapas (a) y (d) se lleven a cabo simultáneamente durante al menos el 50% del tiempo que dure la etapa (a), preferiblemente del 50 al 95 %, particularmente preferido del 60 al 90 % y lo más preferiblemente del 70 al 85 %. Se prefiere igualmente que las etapas (a) y (d) se lleven a cabo simultáneamente durante el 100% de su duración.

Por lo tanto, es posible llevar a cabo cada ciclo bajo las mismas o diferentes condiciones, tales como, entre otras, el contenido de materia seca de la biomasa, la composición enzimática utilizada, la temperatura de cada una de las etapas, etc.

En los siguientes procedimientos se describe que no deben entenderse como limitantes de la invención en ningún aspecto.

Procedimiento 1

Particularmente preferido es un procedimiento para la hidrólisis de paja y/o bagazo de caña de azúcar que comprende las etapas de

a) Poner en contacto la biomasa con una composición enzimática que contenga al menos una celobiohidrolasa (EC 3.2.1.-) y al menos una endo-1,4-p-glucanasa (EC 3.2.1.4) en un recipiente durante un período de tiempo de 4 h a 85 h, también particularmente preferido de 12 h a 72 h;

b) Separar una fase sólida y una líquida;

c) Conversión enzimática de la fase sólida durante un período de tiempo de 4 h a 85 h, también particularmente preferido de 12 h a 72 h;

d) Alimentación de la fase líquida de la etapa (b) con al menos parte de la fase sólida convertida de la etapa (c) en el que al menos una enzima seleccionada de celobiohidrolasa (EC 3.2.1.-) y al menos una endo-1,4-p-glucanasa (EC 3.2.1.4) se añade durante la etapa (c), y en el que la alimentación según la etapa (d) se lleva a cabo continuamente con una tasa de alimentación del 10 al 20 % en peso por hora.

Procedimiento 2

Se prefiere particularmente un procedimiento para la hidrólisis de paja y/o bagazo de caña de azúcar que comprende las etapas de

(a) Poner en contacto la biomasa con una composición enzimática que contenga al menos una celobiohidrolasa (EC 3.2.1.-), al menos una endo-1,4-p-glucanasa (EC 3.2.1.4), al menos una p-glucosidasa (EC 3.2.1.4), al menos una glucósido hidrolasa 61 (GH61 y CBM33), al menos una endoxilanasa (EC 3.2.1.8) y al menos una pxilosidasa (EC 3.2.1.37) en un recipiente durante un período de tiempo de 4 h a 85 h, también particularmente preferido de 12 h a 72 h;

b) Separar una fase sólida y una líquida;

c) Conversión enzimática de la fase sólida durante un período de tiempo de 4 h a 85 h, también particularmente preferido de 12 h a 72 h;

d) Alimentación de la fase líquida de la etapa (b) con al menos parte de la fase sólida convertida de la etapa (c) en el que al menos una enzima de la composición enzimática definida en la etapa (a) anterior se añade durante la etapa (c) y en el que la alimentación según la etapa (d) se lleva a cabo de forma continua con una tasa de alimentación del 10 al 20 % en peso por hora.

Procedimiento 3

Se prefiere particularmente un procedimiento para la hidrólisis de paja y/o bagazo de caña de azúcar como se define anteriormente con respecto a la realización 2 particularmente preferida, en donde la composición enzimática definida anteriormente contiene además una o más enzimas seleccionadas de p-glucanasa (EC 3.2.1.-), acetilxilano esterasa (EC 3.1.1.72), acetilgalactano esterasa (3.1.1.6), a-arabinopiranosidasa (3.2.1.-), a-galactosidasa (EC 3.2.1.22), p-galactosidasa (EC 3.2.1.23), a-glucuronidasas (Ec 3.2.1.139), p-manasa (EC 3.2.1.78), pectina metilesterasa (EC 3.1.1.11), pectina acetilesterasa (EC 3.1.1.-), ramnogalacturonasa (EC 3.2.1.-; GH28), ramnogalacturonano acetilesterasa (EC 3.1.1.86), ramnogalacturonano endoliasa (EC 4.2.2.23), ramnogalacturonano liasa (EC 4.2.2.-) y p-manosidasas (EC 3.2.1.25), poligalacturonasas (EC 3.2.1.15, 67, 82; GH28) y pectina/pectato liasas (EC 4.2.2.2, 6, 9, 10).

Procedimiento 4

Se prefiere particularmente un procedimiento para la hidrólisis de paja y/o bagazo de caña de azúcar como se definió anteriormente con respecto a cualquiera de las realizaciones 1 a 3 particularmente preferidas, en donde la etapa (d) se lleva a cabo combinando la fase sólida convertida de la etapa (c) con el líquido fase de la etapa (b) dentro de un lote.

Procedimiento 5

Se prefiere particularmente un procedimiento para la hidrólisis de paja y/o bagazo de caña de azúcar como se define anteriormente con respecto a cualquiera de las realizaciones particularmente preferidas 1 a 4 que ejecutan de 2 a 4 ciclos (v1, v2, v3, v4) de 10 a 100 repeticiones (n1 a n100), en donde la etapa (a) y/o (c) se lleva(n) a cabo de 45 a 55 °C, pH de 4,5 a 5,5, durante 72 a 108 h a unas rpm de 40 a 60. La composición enzimática se añade preferiblemente con una E/S (relación de enzima por sustrato) del 0,1 al 0,75 %.

Por lo tanto, se prefiere particularmente comenzar cada ciclo con un intervalo de 36 a 72 h. Además se prefiere particularmente implementar un intercambiador de calor entre las etapas (c) y (d) para enfriar la fase sólida postsacarificada combinada y la biomasa presacarificada a una temperatura de fermentación adecuada de 25 a 40 °C. La fermentación se prefiere particularmente que se realice a un pH de 4,5 a 5,5, a unas rpm de 150 a 250 durante un período de tiempo de 12 a 72 h, en donde el organismo para la fermentación se añade preferiblemente en una cantidad de cultivo seminal del 7,5 al 12,5 % (peso/peso).

Procedimiento 6

Se prefiere particularmente un procedimiento para la hidrólisis de paja y/o bagazo de caña de azúcar como se define anteriormente con respecto a cualquiera de las realizaciones 1 a 5 particularmente preferidas, en donde la composición enzimática se agrega en forma de una mezcla producida por un organismo, por ejemplo, un hongo filamentoso. El hongo es preferiblemente una especie del género Trichoderma, particularmente preferido Trichoderma reesei. Por tanto, se prefiere añadir además una o más enzimas seleccionadas de p-glucanasa (EC 3.2.1.-), acetilxilano esterasa (EC 3.1.1.72), acetilgalactano esterasa (3.1.1.6), a-arabinopiranosidasa (3.2.1.-), a-galactosidasa (EC 3.2.1.22), pgalactosidasa (EC 3.2.1.23), a-glucuronidasas (EC 3.2.1.139), p-manasa (EC 3.2.1.78), pectina metilesterasa (EC 3.1.1.11), pectina acetilesterasa (EC 3.1.1.-), ramnogalacturonasa (EC 3.2.1.-; GH28), ramnogalacturonano acetilesterasa (EC 3.1.1.86), ramnogalacturonano endoliasa (EC 4.2.2.23), ramnogalacturonano liasa (EC 4.2.2.-) y pmanosidasas (EC 3.2.1.25), poligalacturonasas (EC 3.2.1.15, 67, 82; Gh 28) y pectina/pectato liasas (Ec 4.2.2.2, 6, 9, 10), celobiohidrolasa (EC 3.2.1.-), endo-1,4-p-glucanasa (EC 3.2.1.4), p-glucosidasa (Ec 3.2.1.4), glucósido hidrolasa 61 (GH61 y CBM33), endoxilanasas (EC 3.2.1.8), p-xilosidasas (EC 3.2.1.37), celobiohidrolasa (EC 3.2.1.-) y endo-1,4-p-glucanasa (EC 3.2.1.4).

Ejemplos y figuras

La presente invención se describe ahora mediante el siguiente ejemplo y figuras. El ejemplo y las figuras son solo para fines ilustrativos y no deben entenderse como limitantes de la invención.

En la figura 1 se muestra un diagrama de flujo que representa el procedimiento de la invención llevado a cabo en el ejemplo 1.

En la figura 2 se muestra una comparación de los rendimientos de la glucosa de un procedimiento convencional y el procedimiento de acuerdo con la presente invención.

En la figura 3 se muestra la escala de tiempo de un plan de ocupación de equipos que implementan un procedimiento con 4 ciclos y 50 repeticiones.

Ejemplo 1:

Procedimiento continuo de dos ciclos paralelos [ciclo v1, ciclo v2] que utilizan la biomasa de bagazo de caña de azúcar pretratada en combinación con la adición de organismos fermentadores. El esquema se muestra en la figura 1.

El contacto de la biomasa de bagazo de caña de azúcar pretratada con vapor según la etapa (a) [ciclo v1] se realizó en un sistema reactor de tanque agitado con un dispositivo de control de temperatura y pH (ciclo de "resacarificación" v1n1) en un contenido de materia seca del 20 % en peso. Se le añadió a la biomasa una composición enzimática que contiene el 91,3 % en peso de Celluclast® (celulasa de Trichoderma reesei ATCC 26921, C2730 Sigma) y el 8,7% en peso de glucosidasa (49291 Sigma) con una proporción de enzima a sólido del 0,5 % en peso. La conversión enzimática se realizó a 50 °C, pH 5,0, durante 48 h con agitación a 50 rpm. Después de la etapa (a), se realizó una separación sólido-líquido con una centrífuga decantadora para recuperar la fase líquida que contenía los azúcares [ciclo v1n1].

Después de 48 h, se inició un lote paralelo [ciclo v2] durante 48 h adicionales en las mismas condiciones que las descritas para el [ciclo v1] (ciclo de "presacarificación" v2n1).

La fase sólida obtenida dentro del [ciclo v1n1] contenía lignina y la celulosa restante, y se sometió a una conversión enzimática adicional de acuerdo con la etapa (c) [ciclo v1n1] (ciclo de "postsacarificación" v1n1). La conversión enzimática adicional también se llevó a cabo en un sistema reactor de tanque agitado con un dispositivo de control de temperatura y pH. Después de agregar una composición enzimática como se definió antes con respecto a la etapa (a) con una proporción de enzima a sólido del 0,5 % y agua para lograr un contenido sólido del 20 % (p/p), se realizó la conversión enzimática durante 48 h más a 50 °C, pH 5,0 y 50 rpm. Después de la conversión, la fase sólida convertida se transfirió a través de un dispositivo de intercambio de calor (en el que la temperatura se enfrió a 32 °C) a la fase líquida del lote paralelo [ciclo v2n1].

Se añadió un organismo para la fermentación a la fase líquida [ciclo v2n1] y a la fase sólida convertida [ciclo v1 n1] en un sistema de biorreactor de tanque agitado con un dispositivo de control de temperatura y pH (= recipiente de cultivo) ("Fermentación"). Por lo tanto, se añadió un cultivo seminal al 10 % (peso/peso) de una cepa de levadura de Saccharomyces cerevisiae (DSM n.° 1333). Se eligieron las condiciones de 32 °C y pH 5,0 en condiciones anaeróbicas a 200 rpm durante 64 h.

La fase sólida [ciclo v2n1] se trató en las mismas condiciones que las descritas para el [ciclo v1n1] (ciclo de "postsacarificación" v2n1).

Podría probarse con el ejemplo que el procedimiento de la invención conduce a una hidrolización/sacarificación del 97,7 % de la biomasa de bagazo de caña de azúcar pretratada y puede estar implícito en los procedimientos paralelos que se garantice una conversión eficiente y continua. Los resultados se muestran en la figura 2. Se puede ver en la figura 2 que el rendimiento de etanol mejoró significativamente en comparación con un procedimiento estándar según el estado de la técnica (sin postsacarificación de la fase sólida según la etapa (c), pero por lo demás con las mismas condiciones del procedimiento).

También se pudo demostrar que el concepto del procedimiento de la invención es adecuado para llevarlo a cabo de una manera parcialmente paralela y continua.

Ejemplo 2:

Procedimiento continuo a escala industrial de cuatro ciclos paralelos [ciclo v1, ciclo v2, ciclo v3 y ciclo v4] con 49 repeticiones y uso de la biomasa pretratada de bagazo de caña de azúcar en combinación con la adición de organismos fermentadores. El esquema se muestra en la figura 3. Las condiciones del procedimiento se han elegido como se definió anteriormente con respecto al ejemplo 2, si no se indica lo contrario conforme al presente documento.

Cada ciclo se llevó a cabo mediante el uso de 3 recipientes diferentes (recipiente de presacarificación v1 pre, recipiente de postsacarificación v1post, recipiente de fermentación v1fer).

Escala de tiempo por etapa del procedimiento:

La presacarificación (etapa (a) y la postsacarificación (etapa (c)) se dividen en las siguientes subetapas del procedimiento:

• Llenado del recipiente de reacción: 6 h

• Reacción: 48 h

• Vaciado del recipiente de reacción: 6 h

• CIP (limpieza in situ) del recipiente de reacción: 4 h

Fermentación (incluida en la etapa (d) del procedimiento):

• Llenado del recipiente de reacción: 14 h

• Reacción: 48 h

• Vaciado del recipiente de reacción: 6 h

• CIP del recipiente de reacción: 4 h

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para la hidrólisis de biomasa que comprende las etapas de

a) poner en contacto la biomasa con una composición enzimática que contiene al menos una enzima seleccionada de la clase de las hidrolasas en un recipiente durante de 3 a 60 h y a una temperatura de 45 a 65 °C;

b) separar una fase sólida y una líquida;

c) conversión enzimática de la fase sólida;

d) combinar al menos parte de la fase sólida convertida de la etapa (c) con la fase líquida de la etapa (b); en donde se añade al menos un organismo para la fermentación a la fase líquida antes o durante la etapa (d) del procedimiento, en el que la temperatura durante la adición del al menos un organismo para la fermentación se selecciona entre 25 y 45 °C; y

en donde del 10 al 100 % en peso de la fase sólida convertida se agrega a la fase líquida de acuerdo con la etapa (d).

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la combinación de la etapa (d) se realiza por alimentación.

3. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se añade una cantidad de líquido a la fase sólida antes o durante la etapa (c).

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se añade a la fase sólida al menos una enzima seleccionada de la clase de las hidrolasas.

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que del 10 al 100 % en peso de la fase sólida agrega a la fase líquida según la etapa (d) por hora.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en donde la etapa (c) se lleva a cabo durante al menos 30 min antes de alimentar al menos parte de la fase sólida según la etapa (d).

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la combinación según la etapa (d) se lleva a cabo con la implantación de un intercambiador de calor.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las etapas (a) a (d) se llevan a cabo al menos parcialmente de forma simultánea y/o continua.

9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la composición enzimática contiene al menos una celobiohidrolasa (EC 3.2.1.-) y al menos una endo-1,4-p-glucanasa (EC 3.2.1.4).

10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la biomasa se selecciona de remolacha azucarera, caña de azúcar, paja de caña de azúcar, pulpa de remolacha azucarera, bagazo de caña de azúcar, paja, semilla de cereales, madera, semillas oleaginosas y mezclas de las mismas.

11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el contenido de materia seca de la biomasa se selecciona del 5 al 30 % en peso.