ES2939809T3 - Biomarcadores novedosos y métodos de tratamiento del cáncer - Google Patents
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Abstract
Se describen biomarcadores para el tratamiento de condiciones patológicas asociadas con la ruta de PI3K, como el cáncer, y métodos para usar inhibidores de componentes aguas arriba de la ruta de PI3K, como inhibidores de PI3K-α o inhibidores de AKT. En particular, se describen biomarcadores para la selección de pacientes en el tratamiento del cáncer, así como métodos de tratamiento terapéutico, kits de diagnóstico y métodos de detección, en los que los cánceres que poseen una mutación en un componente aguas arriba de la vía PI3K (como el PIK3CA y/o el gen AKT), y un gen MAP3K1 de tipo salvaje y un gen MAP2K4, es más probable que respondan favorablemente al tratamiento con inhibidores de los componentes aguas arriba de la vía PI3K. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Biomarcadores novedosos y métodos de tratamiento del cáncer
Reivindicación de prioridad
Esta solicitud reivindica la prioridad respecto a la solicitud provisional estadounidense n.° 62/219.698, presentada el 17 de septiembre de 2015, que se incorpora por referencia en su totalidad.
Antecedentes
El cáncer de mama es uno de los cánceres más prevalentes en todo el mundo con más de 1.300.000 de casos diagnosticados y más de 450.000 muertes cada año. Uno de los mayores desafíos en el tratamiento del cáncer de mama es su heterogeneidad. El advenimiento de la secuenciación de ADN masiva ha proporcionado un panorama mutacional del cáncer de mama, y la combinación de tal secuenciación de ADN masiva con la variación del número de copias y los datos de expresión génica ha conducido a la clasificación del cáncer de mama en diez agrupaciones integradoras (Curtis C et al., Nature, 2012, 486, 346-352 y Dawson S-J et al., EMBO J, 2013, 32, 617-628). Se sabe que la ruta de señalización de PI3K/AKT/mTOR es un mediador crítico de la proliferación, la supervivencia, el metabolismo y la apoptosis de células cancerosas (Fruman y Rommel, Nature Reviews 2014, 13:140-156 ), y el análisis de las diez agrupaciones integradoras ha mostrado que la fosfoinosítido-3-cinasa, polipéptido alfa catalítico (PIK3CA), el gen que codifica la isoforma alfa de PI3K (PI3Ka), está frecuentemente mutado en varias de las agrupaciones positivas para el receptor de estrógenos (ER+). Globalmente, PIK3CA está mutado en el 45 % de los casos de cáncer de mama luminal A (Cancer Genome Atlas Network, Nature, 2012, 490, 61-70). Estos estudios, junto con una amplia variedad de otros estudios que implican el gen de PIK3CA en tumorigénesis (resumidos en el documento WO2014/114928), han conducido a un considerable esfuerzo de investigación para descubrir inhibidores de PI3K-a para el tratamiento del cáncer. Sin embargo, las tasas de respuesta en pacientes con cáncer han sido generalmente bajas y, hasta la fecha, no se ha aprobado ningún agente anticancerígeno que se dirija a la inhibición de PI3K-a.
Como principal efector de PI3K, se encuentra frecuentemente AKT en cáncer de mama como resultado de la señalización de receptores de factores de crecimiento en cáncer de mama. AKT se activa por los fosfolípidos PIP3 y PIP2 generados por la actividad de PI3K. PDK1 unida a la membrana se activa directamente por PIP3 y fosforila AKT en Thr308 ubicada en el bucle de activación. En cáncer de mama positivo para HER2, por ejemplo, se activa la ruta de PI3K dando como resultado una alta actividad de AKT, tal como se mide mediante la fosforilación de Thr308 y Thr473 (mediada por MTORC2). En cáncer de mama ER+, son prevalentes mutaciones activantes de PIK3CA, y esto anula la necesidad de activación de factores de crecimiento para mantener un alto nivel de PIP3 y PIP2 y, por tanto, actividad de la ruta mediada por AKT. Aunque no todos los efectos de señalización de la activación de PI3K deben atribuirse a la señalización de AKT, esta cinasa sigue siendo un nodo importante en la ruta y ha sido el foco de un intenso esfuerzo en el descubrimiento y desarrollo de fármacos. Se han desarrollado inhibidores de las isoformas de AKT AKT1, AKT2 y AKT3 y se encuentran actualmente en ensayos clínicos en cáncer de mama. Se han identificado mutaciones activantes en AKT1 en cáncer de mama luminal ER+. En más del 80 % de los casos mutados, el codón afectado es Glu17 con una frecuente mutación a lisina (mutación E17K). En cáncer de mama luminal ER+, la prevalencia de esta mutación es de alrededor del 3 %. Se cree que esta u otra mutaciones activantes conferirían sensibilidad a los inhibidores de AKT y esta hipótesis está sometiéndose a prueba en la actualidad en la práctica clínica.
Recientes estudios genómicos de pacientes con cáncer de mama han comenzado a revelar también un posible papel de proteína cinasas activadas por mitógenos (MAPK) en la promoción de la supervivencia o apoptosis celular en el cáncer, en particular por medio de mutaciones inactivantes en MAP3K1 y MAP2K4, dos MAPK aguas arriba de la ruta de muerte celular de JNK (Pham T et al., Genes & Cancer, 2013, 4, 419-426). Se encuentran mutaciones en MAP3K1 (13-20 %) y MAP2K4 (~8 %) en cánceres de mama luminales A, y se ha notificado la mutación simultánea de tanto PIK3CA como MAP3K1 en muestras clínicas en el 11,56 % de los mutantes de PIK3CA (Cancer Genome Atlas Network, Nature, 2012, 490, 61-70 y Ellis M et al., 2012, Nature, 486, 353-360).
El mecanismo por el cual la mutación simultánea de los genes de PIK3CA y MAP3K1/MAP2K4 actúa contribuyendo a la respuesta de los pacientes a inhibidores de los componentes aguas arriba de la ruta de PI3K (si los hay) sigue siendo desconocido. Además, se sabe muy poco sobre el papel (si lo hay) de las mutaciones simultáneas de los genes de AKT y MAP3K1/MAP2K4 en la respuesta de tales pacientes. Por tanto, sigue existiendo la necesidad de comprender la interacción entre las mutaciones genéticas de los componentes aguas arriba de la ruta de PI3K (tales como los genes de PIK3CA y AKT) y las mutaciones génicas de MAP3K1/MAP2K4 y su papel en la tumorigénesis, y la relevancia de cualquiera de tales interacciones en el tratamiento de pacientes con inhibidor(es) de los componentes aguas arriba de la ruta de PI3K, tales como inhibidores de PI3K-a o inhibidores de AKT.
Sumario Esta memoria descriptiva describe biomarcadores para el tratamiento de afecciones patológicas asociadas con la ruta de PI3K, tales como cáncer, y métodos de uso de inhibidor(es) de componentes aguas arriba de la ruta de PI3K, tales como inhibidores de PI3K (por ejemplo, inhibidores de PI3K-a) o inhibidores de AKT. En particular, la memoria descriptiva proporciona biomarcadores para la selección de pacientes en el tratamiento del cáncer, así como métodos de tratamiento terapéutico, kits de diagnóstico y métodos de detección.
En la presente se describe la identificación y caracterización de un vínculo entre el estado del gen que codifica componentes aguas arriba de la ruta de PI3K (tales como el gen de PIK3CA o el gen de AKT), el estado del gen que codifica MAP3K1 o MAP2K4, y la susceptibilidad al tratamiento con inhibidores de componentes aguas arriba de la ruta de PI3K. Esto, por tanto, proporciona oportunidades, métodos y herramientas para seleccionar pacientes para el tratamiento con inhibidores de componentes aguas arriba de la ruta de PI3K, en particular pacientes con cáncer, y/o evitar el tratamiento de pacientes con menos probabilidad de responder terapéuticamente al tratamiento, evitando así el tratamiento innecesario y cualquier efecto secundario que pueda estar asociado con tal tratamiento ineficaz.
La presente memoria descriptiva se refiere, en parte, a herramientas y métodos de selección de pacientes (incluida medicina personalizada). La selección se basa en si las células cancerosas que van a tratarse poseen componentes aguas arriba de tipo natural o mutantes de la ruta de PI3K (tales como gen de PIK3CA de tipo natural o mutante o gen de AKT de tipo natural o mutante), y genes de MAP3K1 o MAP2K4 de tipo natural o mutantes. El estado genético de los componentes aguas arriba de la ruta de PI3K (tales como PIK3CA o AkT) y el estado de los genes de MAP3K1 o MAP2K4 puede usarse, por tanto, como biomarcador de la susceptibilidad al tratamiento con inhibidores de componentes aguas arriba de la ruta de PI3K. En particular, esta memoria descriptiva describe el vínculo entre un gen de AKT o gen de PIK3CA positivo para la mutación y un gen de MAP3K1 o MAP2K4 positivo para la mutación, y la reducción resultante en la sensibilidad al tratamiento con inhibidor(es) de componentes aguas arriba de la ruta de PI3K, tales como inhibidores de PI3K-a o inhibidores de AKT. Alternativamente, esta memoria descriptiva describe el vínculo entre un gen de AKT o gen de PIK3CA positivo para la mutación y un gen de MAP3K1 y MAP2K4 de tipo natural, y el aumento resultante en la sensibilidad al tratamiento con inhibidor(es) de componentes aguas arriba de la ruta de PI3K, tales como inhibidores PI3K-a o inhibidores de AKT.
En un aspecto, se describe un método de tratamiento de un paciente que padece cáncer, incluyendo el método: (a) determinar, en una muestra que es representativa del cáncer y se aisló previamente del paciente, si el estado genético de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K es de tipo natural o mutante; (b) determinar si el gen de MAP3K1 en la muestra es de tipo natural o mutante; (c) determinar si el gen de MAP2K4 en la muestra es de tipo natural o mutante; y (d) administrar al paciente una cantidad eficaz de un inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K si: (i) se determinó que el estado genético del componente aguas arriba de la ruta de PI3K era mutante; (ii) se determinó que el gen de MAP3K1 era de tipo natural; y (iii) se determinó que el gen de MAP2K4 era de tipo natural.
En otro aspecto, se describe un método de tratamiento de un paciente que padece cáncer, incluyendo el método: (a) determinar si el gen de AKT en las células cancerosas del paciente es de tipo natural o mutante; (b) determinar si el gen de MAP3K1 en las células cancerosas del paciente es de tipo natural o mutante; (c) determinar si el gen de MAP2K4 en las células cancerosas del paciente es de tipo natural o mutante; (d) administrar al paciente una cantidad eficaz de un inhibidor de AKT si las células cancerosas albergan: (i) un gen de AKT mutante; (ii) un gen de MAP3K1 de tipo natural; y (iii) un gen de MAP2K4 de tipo natural.
En otro aspecto, se describe el uso de un inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K para el tratamiento del cáncer, en donde las células cancerosas albergan una mutación en un componente aguas arriba de la ruta de PI3K, un gen de MAP3K1 de tipo natural y un gen de MAP2K4 de tipo natural.
En otro aspecto, se describe un método para deseleccionar un paciente que padece cáncer del tratamiento, incluyendo el método: identificar un paciente candidato con un cáncer potencialmente susceptible al tratamiento con un inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K; y determinar si los genes de MAP3K1 y MAP2K4 en una muestra representativa del cáncer previamente aislada del paciente candidato son de tipo natural o mutantes; en donde el paciente se deselecciona del tratamiento con un inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K si las células cancerosas albergan un gen de MAP3K1 o MAP2K4 mutante.
En otro aspecto, se describe un método de tratamiento del cáncer en un paciente cuyo estado génico en células cancerosas de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K, y de MAP3K1 y MAP2K4, ya se ha determinado, comprendiendo el método administrar al paciente una cantidad eficaz de un inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K si las células cancerosas albergan una mutación en un componente aguas arriba de la ruta de PI3K, un gen de MAP3K1 de tipo natural y un gen de MAP2K4 de tipo natural.
Existe una clara necesidad de biomarcadores que enriquezcan o seleccionen pacientes cuyos cánceres responderán al tratamiento con inhibidor(es) de componentes aguas arriba de la ruta de PI3K, tales como inhibidores de PI3K-a o inhibidores de AKT. Los biomarcadores de selección de pacientes que identifican a los pacientes que tienen menos probabilidad de responder a un agente son también importantes en el tratamiento del cáncer, ya que reducen el tratamiento innecesario de pacientes con cánceres que no responden a los posibles efectos secundarios de tales agentes, y permiten que se seleccionen pacientes para el tratamiento que es más probable que se beneficien de los efectos terapéuticos.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra el estado mutacional de los genes de PIK3CA, MAP3K1 y MAP2K4 en líneas celulares de cáncer de mama.
La figura 2A muestra la inducción de niveles basales de pAKT (T308) tras la selección como diana por ARNip de ARNm de MAP3K1 en líneas celulares de cáncer de mama mutantes para PIK3CA. La figura 2B muestra la inducción de niveles basales de pAKT (T308) tras la alteración del gen de MAP3K1 y la resistencia parcial al compuesto A (inhibidor de PI3Ka y PI3K6), el tratamiento en líneas celulares mutantes (CR1.4 y CR2.5) en comparación con células MCF7 parentales (P.).
La figura 3 muestra los efectos del tratamiento con niveles crecientes de compuesto A, compuesto B (inhibidor de AKT) y GDC-0068 (inhibidor de AKT) sobre los niveles de MAP3K1, pJNK, pPRAS40, pS6 RP (S235/236) y vinculina en células MCF7 parentales (panel izquierdo) y células MCF7 CR2.5 deficientes en MAK3K1 (panel derecho).
La figura 4 muestra el transcurso temporal de la proliferacion de células MCF10A-H1047R parentales (A), MCF7 (C) y MCF10A-H1047R CR2.3 mutantes para MAP3K1 (B) y MCF7 CR1.4 tras el tratamiento con 500 nM con compuesto A y compuesto B.
La figura 5 muestra una comparación de CI50 para la proliferación de líneas celulares parentales frente a deficientes en MAP3K1 con compuesto A, compuesto B y un inhibidor de mTOR (AZD2014).
La figura 6 muestra el porcentaje de confluencia de líneas celulares parentales frente a deficientes en MAP3K1 tras 500 nM de compuesto A, compuesto B y tratamiento con DMSO durante 60 y 66 horas.
La figura 7A muestra el efecto del agotamiento de MAP3K1 en volumen (gráfico izquierdo) y apoptosis (gráfico derecho) en estructuras acinares de Matrigel 3D. Se trataron acinos MCF7 parentales (gris) y MCF7 CR2.5 (negro) y acinos MCF10A-H1047R parentales (gris) y MCF10A-H1047R CR2.9 (negro) con DMs O (-) o compuesto B (+) durante 15 días. La figura 7B muestra la cuantificación de la intensidad media de pS6 de células de la capa externa de acinos parentales MCF7 frente a MCF7 CR2.5 en ausencia (gris) o presencia (negro) de compuesto B 2 |j M.
La figura 8 muestra el volumen tumoral de implantes de xenoinjertos de MCF7 parental frente a MCF7 CR2.5 en dos puntos de tiempo (25 y 45 días).
Descripción detallada
Un biomarcador puede describirse como "una característica que se mide y evalúa objetivamente como indicador de procesos biológicos normales, procesos patógenos o respuestas farmacológicas a una intervención terapéutica". Un biomarcador es cualquier indicador identificable y medible asociado con una afección o enfermedad particular donde existe una correlación entre la presencia o el nivel del biomarcador y algún aspecto de la afección o enfermedad (incluida la presencia, el nivel o el nivel cambiante de, el tipo de, el estadio de, la susceptibilidad a la afección o enfermedad, o la sensibilidad a un fármaco usado para tratar la afección o enfermedad). La correlación puede ser cualitativa, cuantitativa o tanto cualitativa como cuantitativa. Normalmente, un biomarcador es un compuesto, fragmento de compuesto o grupo de compuestos. Tales compuestos pueden ser cualquier compuesto encontrado en o producido por un organismo, incluidas proteínas (y péptidos), ácidos nucleicos y otros compuestos.
Los biomarcadores pueden tener un poder predictivo y, como tales, pueden usarse para predecir o detectar la presencia, el nivel, el tipo o el estadio de afecciones o enfermedades particulares (incluida la presencia o el nivel de microorganismos o toxinas particulares), la susceptibilidad (incluida la susceptibilidad genética) a condiciones o enfermedades particulares, o la respuesta a tratamientos particulares (incluidos tratamientos farmacológicos). Se cree que los biomarcadores desempeñarán un papel cada vez más importante en el futuro del descubrimiento y desarrollo de fármacos, al mejorar la eficiencia de los programas de investigación y desarrollo. Pueden usarse biomarcadores como agentes de diagnóstico, monitores de la progresión de las enfermedades, monitores de tratamiento y factores de pronóstico de resultados clínicos. Por ejemplo, diversos proyectos de investigación de biomarcadores están intentando identificar marcadores de cánceres específicos y de enfermedades cardiovasculares e inmunológicas específicas. Se cree que el desarrollo de nuevos biomarcadores validados conducirá tanto a reducciones significativas en los costes de atención médica y desarrollo de fármacos como a mejoras significativas en el tratamiento de una amplia variedad de enfermedades y afecciones.
Con el fin de diseñar ensayos clínicos de manera óptima y obtener la mayor cantidad de información de estos ensayos, puede requerirse un biomarcador. El marcador puede medirse en células cancerosas y sustitutas, u otras muestras de pacientes en donde el marcador puede ser detectable. Idealmente, estos marcadores también se correlacionarán con la eficacia y, por tanto, podrían usarse en última instancia para la selección de pacientes.
Así, el problema técnico que subyace a este aspecto de la presente invención es la identificación de medios para la estratificación de pacientes para el tratamiento con inhibidor(es) de componentes corriente arriba de la ruta de PI3K, tales como inhibidores de PI3K-a o inhibidores de AKT. El problema técnico se soluciona mediante la provisión de los aspectos caracterizados en las reivindicaciones y/o la descripción en el presente documento.
Tal como se detalla en los ejemplos en el presente documento, se encontró que células que poseen una mutación en el gen de MAP3K1 o MAP2K4 son generalmente menos susceptibles a la inhibición del crecimiento mediante inhibidor(es) de componentes aguas arriba de la ruta de PI3K, tales como inhibidores de PI3K-a o inhibidores de AKT. La inhibición del crecimiento puede producirse como resultado de la inhibición de la proliferación celular y/o el aumento de la muerte celular.
La memoria descriptiva proporciona métodos de determinación de la sensibilidad de las células a inhibidor(es) de componentes aguas arriba de la ruta de PI3K, tales como inhibidores de PI3K-a o inhibidores de AKT. Los métodos comprenden determinar el estado de los genes de componentes aguas arriba de la ruta de PI3K (tales como el gen de PIK3CA o el gen de AKT) y el estado de los genes de MAP3K1 y MAP2K4 en dichas células. Las células se identifican como probablemente insensibles a un inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K si las células poseen una mutación en un componente aguas arriba (tal como un gen de PIK3CA o gen de AKT mutado) y las células poseen un gen de MAP3K1 o MAP2K4 mutado. Por tanto, se predice que los pacientes con mutaciones en el componente aguas arriba (tal como en el gen de PIK3CA o el gen de AKT) y un gen de MAP3K1 o MAP2K4 mutado son particularmente menos sensibles al tratamiento con un inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K, tal como un inhibidor de PI3K-a o inhibidor de AKT. Las células se identifican como probablemente sensibles a inhibidores de componentes aguas arriba de la ruta de PI3K si las células poseen una mutación en un componente aguas arriba (tal como un gen de PIK3CA o gen de AKT mutado) y las células poseen genes de MAP3K1 y MAP2K4 de tipo natural. Por tanto, se predice que los pacientes con una mutación en un componente aguas arriba de la ruta de PI3K (tal como el gen de PIK3CA o gen de AKT) y genes de MAP3K1 y MAP2K4 de tipo natural son particularmente sensibles al tratamiento con un inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K, tales como inhibidores de PI3K-a o inhibidores de AKT.
Se predice que pacientes con un gen de PIK3CA mutado y genes de MAP3K1 y MAP2K4 de tipo natural son sensibles al tratamiento con inhibidores de PI3K-a o inhibidores de AKT. Se predice que pacientes con un gen de AKT mutado y genes de MAP3K1 y MAP2K4 de tipo natural son sensibles al tratamiento con inhibidores de AKT.
Una célula, o población de células, es sensible a inhibidor(es) de componentes aguas arriba de la ruta de PI3K si el/los inhibidor(es) inhibe(n) el aumento del número de células en un ensayo de crecimiento celular (o bien a través de la inhibición de la proliferación celular y/o bien a través de un aumento de la muerte celular). Los métodos descritos en el presente documento son útiles para predecir qué células, o poblaciones de células, es más probable que sean sensibles a inhibidor(es) de componentes aguas arriba de la ruta de PI3K, tales como inhibidores de PI3K-a o inhibidores de AKT, mediante inhibición del crecimiento.
La presente divulgación se basa además, en parte, en métodos que pueden usarse para determinar la sensibilidad probable de un paciente a inhibidores de componentes aguas arriba de la ruta de PI3K, incluida la determinación de si administrar inhibidor(es) de componentes aguas arriba de la ruta de PI3K, tales como inhibidores de PI3K-a o inhibidores de AKT. Específicamente, los métodos de la presente invención incluyen la determinación del estado génico (por ejemplo, de tipo natural o mutado) de componentes aguas arriba de la ruta de PI3K (tales como un gen de PIK3CA o gen de a Kt ), y de los genes de MAP3K1 y MAP2K4, en célula(s) cancerosa(s) de un paciente. La presencia de una mutación en un componente aguas arriba (tal como un gen de PIK3CA o gen de AKT mutante) y un gen de MAP3K1 o MAP2K4 mutado indica que es menos probable que las células cancerosas respondan mediante inhibición del crecimiento cuando se ponen en contacto con inhibidor(es) de componentes aguas arriba de la ruta de PI3K. El estado génico (en células cancerosas) de los componentes aguas arriba (tales como un gen de PIK3CA o gen de AKT) y de genes de MAP3K1 y MAP2K4 puede usarse, por tanto, para seleccionar pacientes para el tratamiento con inhibidor(es) de dichos componentes aguas arriba, tales como inhibidores de PI3K-a o inhibidores de AKT.
Además, se da a conocer un método in vitro para la identificación de paciente(s) probablemente sensibles a inhibidor(es) de componentes aguas arriba de la ruta de PI3K. También se dan a conocer usos de cebadores o sondas de oligo- o polinucleótido capaces de detectar el estado de mutación de genes de PIK3CA, AKT, MAP3K1 y MAP2K4. También se dan a conocer usos de kits para la detección de mutaciones de PIK3CA, AKT, MAP3K1 y MAP2 K4.
También se dan a conocer métodos in vitro para determinar si un paciente que padece cáncer es probable que responda a un tratamiento farmacéutico con inhibidor(es) de componentes aguas arriba de la ruta de PI3K, tales como inhibidores de PI3K-a o inhibidores de AKT, comprendiendo dicho método las etapas de: (i) obtener una muestra representativa del cáncer que se recogió previamente de dicho paciente; (ii) determinar si un componente aguas arriba de la ruta de PI3K (tal como el gen de PIK3CA o gen de AKT) contiene una mutación en dicha muestra; y (iii) determinar si los genes de MAP3K1 o MAP2K4 contienen una mutación en dicha muestra. La ausencia de una mutación en el gen de MAP3K1 o MAP2K4 es indicativa de un aumento de la probabilidad de una respuesta al tratamiento con inhibidor(es) de componentes aguas arriba de la ruta de PI3K, tales como inhibidores de PI3K-a o inhibidores de AKT. Como prueba de biomarcadores génicos, la identificación de cánceres que contienen genes de MAP3K1 y MAP2K4 de tipo natural enriquecerá la respuesta a los inhibidor(es) de componentes aguas arriba de la ruta de PI3K, tales como inhibidores de PI3K-a o inhibidores de AKT. Los cánceres individuales que contienen genes de MAP3K1 y MAP2K4 de tipo natural tienen la mayor probabilidad
de responder a inhibidor(es) de componentes aguas arriba de la ruta de PI3K, tales como inhibidores de PI3K-a o inhibidores de AKT.
Un segundo método comprende las etapas de: (i) obtener una muestra representativa del cáncer que se recogió previamente de dicho paciente; (ii) determinar si el gen de PIK3CA contiene una mutación en dicha muestra; y (iii) determinar si los genes de MAP3K1 o MAP2K4 contienen una mutación en dicha muestra. Una mutación en el gen de PIK3CA y la ausencia de una mutación en el gen de MAP3K1 o MAP2K4 es indicativa de un aumento de la probabilidad de una respuesta al tratamiento con inhibidor(es) de componentes aguas arriba de la ruta de PI3K, tales como inhibidores de PI3K-a o inhibidores de AKT. Como prueba de biomarcadores génicos, la identificación de cánceres que contienen un gen de PIK3CA mutado y genes de MAP3K1 y MAP2K4 de tipo natural enriquecerá la respuesta a los inhibidor(es) de componentes aguas arriba de la ruta de PI3K, tales como inhibidores de PI3K-a o inhibidores de AKT. Los cánceres individuales que contienen un gen de PIK3CA mutado y genes de MAP3K1 y MAP2K4 de tipo natural tienen la mayor probabilidad de responder a inhibidor(es) de componentes aguas arriba de la ruta de PI3K, tales como inhibidores de PI3K-a o inhibidores de AKT.
Un método adicional de este tipo comprende las etapas de: (i) obtener una muestra representativa del cáncer que se recogió previamente de dicho paciente; (ii) determinar si el gen de AKT contiene una mutación en dicha muestra; y (iii) determinar si los genes de MAP3K1 o MAP2K4 contienen una mutación en dicha muestra. Una mutación en el gen de AKT y la ausencia de una mutación en el gen de MAP3K1 o MAP2K4 es indicativa de un aumento de la probabilidad de una respuesta al tratamiento con un inhibidor de AKT. Como prueba de biomarcadores génicos, la identificación de cánceres que contienen un gen de AKT mutado y genes de MAP3K1 y MAP2K4 de tipo natural enriquecerá la respuesta a un inhibidor de AKT. Los cánceres individuales que contienen un gen de AKT mutado y genes de MAP3K1 y MAP2K4 de tipo natural tienen la mayor probabilidad de responder a un inhibidor de AKT.
Una muestra "representativa del cáncer" puede ser la muestra que contiene células cancerosas reales aislada (por ejemplo de una biopsia o de una célula encontrada en la sangre), o puede ser una muestra que se ha procesado adicionalmente, por ejemplo una muestra de ácido nucleico amplificado por PCR de la muestra que contiene células cancerosas, o puede ser una muestra de ácido nucleico derivado del cáncer tal como ADN libre circulante encontrado en la sangre u otro fluido corporal del paciente.
Definiciones:
"Inhibidor de AKT" es cualquier compuesto o sustancia capaz de inhibir cualquiera de las isoformas de AKT, también conocida como proteína cinasa B. Los ejemplos de inhibidores de AKT incluyen MK-2206, ipatasertib (GDC-0068), afuresertib (GSK-2110183), 4-amino-W-[(1S)-1-(4-clorofenil)-3-hidroxi-propil]-1-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperidin-4-carboxamida, y los descritos en los documentos WO2006/046023, WO2006/046024 y WO2009/047563.
"Alelo" se refiere a una forma particular de un locus genético, que se distingue de otras formas por su secuencia de nucleótidos o aminoácidos particular.
Las "reacciones de amplificación" son reacciones de ácidos nucleicos que dan como resultado la amplificación específica de ácidos nucleicos diana con respecto a ácidos nucleicos no diana. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una reacción de amplificación bien conocida.
"Cáncer" se usa en el presente documento para referirse al crecimiento neoplásico que surge de la transformación celular a un fenotipo neoplásico. Tal transformación celular a menudo implica una mutación genética.
"Gen" es un segmento de ADN que contiene toda la información para la biosíntesis regulada de un producto de ARN, incluido un promotor, exones, intrones y otros elementos de secuencia que pueden estar ubicados dentro de las regiones flanqueantes en 5' o 3' (no dentro de las porciones transcritas del gen) que controlan la expresión.
El "estado génico" se refiere a si el gen es de tipo natural o no (es decir, mutante).
"Marcador" se refiere a una composición capaz de producir una señal detectable indicativa de la presencia del polinucleótido diana en una muestra de ensayo. Los marcadores adecuados incluyen radioisótopos, nucleótidos cromóforos, enzimas, sustratos, moléculas fluorescentes, restos quimioluminiscentes, partículas magnéticas, restos bioluminiscentes y similares. Como tal, un marcador es cualquier composición detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos o químicos.
"Variación no sinónima" se refiere a una variación (varianza) en o que se solapa con la secuencia codificante de un gen que da como resultado la producción de una secuencia polipeptídica distinta (alterada). Estas variaciones pueden afectar o no a la función de la proteína e incluyen variantes de cambio de sentido (que dan como resultado la sustitución de un aminoácido por otro), variantes sin sentido (que dan como resultado un polipéptido truncado debido a la generación de un codón de terminación prematuro) y variantes de inserción/deleción.
"Variación sinónima" se refiere a una variación (varianza) en la secuencia codificante de un gen que no afecta la secuencia del polipéptido codificado. Estas variaciones pueden afectar a la función de la proteína indirectamente (por ejemplo, alterando la expresión del gen), pero, en ausencia de evidencia en contrario, generalmente se supone que son inocuas.
"Ácido nucleico" se refiere a moléculas de ADN y ARN monocatenarias o bicatenarias que incluyen ácidos nucleicos naturales que se encuentran en la naturaleza y/o ácidos nucleicos artificiales modificados que tienen estructuras principales o bases modificadas, tal como se conoce en la técnica.
"Inhibidor de PI3K" es cualquier compuesto o sustancia capaz de inhibir una cualquiera de las isoformas de fosfoinosítido-3-cinasa (tales como los productos génicos de los genes de PIK3CA, PIK3CB, PIK3CD y PIK3CG). Los inhibidores de PI3K incluyen inhibidores de PI3K-a, PI3K-p y PI3K-6. Ejemplos de inhibidores de PI3K-p y PI3K-6 son (R)-8-(1-(3,5-difluorofenilamino)etil)-N,N-dimetil-2-morfolino-4-oxo-4H-cromeno-6- carboxamida e idelalisib.
"Inhibidor de PI3K-a" es cualquier compuesto o sustancia capaz de inhibir la isoterma alfa de fosfoinosítido-3-cinasa. Los ejemplos de inhibidores de PI3K-a incluyen BYL719, GDC0032, 1-(4-(5-(5-amino-6-(5-terc-butil-1,3,4-oxadiazol-2-il)pirazin-2-il)-1-etil-1H-1,2,4-triazol-3-il)piperidin-1-il)-3-hidroxipropan-1-ona, y los descritos en los documentos WO2009/080705, WO2010/029082, WO2011/000905 y WO2014/114928.
"Cebador" se refiere a una secuencia de oligonucleótidos de ADN monocatenario capaz de actuar como punto de iniciación para la síntesis de un producto de extensión del cebador que es complementario a la hebra de ácido nucleico que va a copiarse. La longitud y la secuencia del cebador deben ser tales que puedan cebar la síntesis de productos de extensión. Un cebador típico contiene al menos aproximadamente 7 nucleótidos de longitud de una secuencia sustancialmente complementaria a la secuencia diana, pero se prefieren cebadores algo más largos. Normalmente, los cebadores contienen aproximadamente 15-26 nucleótidos, pero también pueden emplearse cebadores más largos o más cortos.
"Sitio polimórfico" es una posición dentro de un locus en la que se encuentran al menos dos secuencias alternativas en una población.
"Polimorfismo" se refiere a la variación de secuencia observada en un individuo en un sitio polimórfico. Los polimorfismos incluyen sustituciones, inserciones, deleciones y microsatélites de nucleótidos y pueden dar como resultado, pero no necesariamente, diferencias detectables en la expresión génica o la función de la proteína. En ausencia de evidencia de un efecto sobre la expresión o la función de la proteína, los polimorfismos comunes, incluidas las variantes no sinónimas, generalmente se consideran incluidos en la definición de secuencia génica de tipo natural. Un catálogo de polimorfismos humanos y la notación asociada, incluidas validación, frecuencias observadas y asociación con enfermedades, se mantiene por el NCBI (dbSNP: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/proiects/SNP/). Téngase en cuenta que el término "polimorfismo", cuando se usa en el contexto de secuencias génicas, no debe confundirse con el término "polimorfismo" cuando se usa en el contexto de la forma en estado sólido de un compuesto, es decir, la naturaleza cristalina o amorfa de un compuesto. El experto en la técnica entenderá el significado pretendido por su contexto.
"Sonda" se refiere a oligonucleótidos específicos de secuencia monocatenarios que tienen una secuencia que es exactamente complementaria a la secuencia diana del alelo que va a detectarse.
La "respuesta" se define por las mediciones tomadas de acuerdo con los Criterios de Evaluación de la Respuesta en Tumores Sólidos (RECIST) que implican la clasificación de los pacientes en dos grupos principales: aquellos que muestran una respuesta parcial o enfermedad estable y aquellos que muestran signos de enfermedad progresiva.
"Supervivencia" abarca la supervivencia global de un paciente y la supervivencia sin progresión. La "supervivencia global" (OS) se define como el tiempo desde el inicio de la administración del fármaco hasta la muerte por cualquier causa. La "supervivencia sin progresión" (PFS) se define como el tiempo desde el inicio de la administración del fármaco hasta la primera aparición de enfermedad progresiva o muerte por cualquier causa.
"Componentes aguas arriba de la ruta de PI3K" se refiere a los componentes genéticos de la ruta de PI3K que están aguas arriba de mTOR (y no incluyen mTOR). Los componentes aguas arriba de la ruta de PI3K incluyen isoformas de PI3K (incluidos los genes de PIK3CA, PIK3CB, PIK3CD y PIK3CG), isoformas de AKT (incluidos los genes de AKT1, AKT2 y AKT3), PTEN, PDK1, SGK, INPP4B, INPP5D, PIK3R1 y PIK3R2, y en particular PIK3CA y AKT (tales como AKT1 y AKT2). Los inhibidores de componentes aguas arriba de la ruta de PI3K incluyen inhibidores de PI3K (tales como inhibidores de PI3K-a, PI3K-p y PI3K-6, por ejemplo inhibidores de PI3K-a) e inhibidores de AKT.
Métodos de selección para el tratamiento
Según un aspecto, se proporciona un método para seleccionar un tratamiento para un paciente que padece cáncer, comprendiendo el método proporcionar una muestra representativa del cáncer de un paciente; determinar si el estado genético de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K en la muestra representativa del paciente del cáncer es de tipo natural o mutante; determinar si los genes de MAP3K1 y MAP2K4 en la muestra del paciente son de tipo natural o
muíante; y seleccionar un paciente para el tratamiento con un inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K basándose en lo mismo.
Según otro aspecto, se proporciona un método para seleccionar un tratamiento para un paciente que padece cáncer, comprendiendo el método proporcionar una muestra representativa del cáncer de un paciente; determinar si el gen de PIK3CA o gen de AKT en la muestra representativa del paciente del cáncer es de tipo natural o mutante; determinar si los genes de MAP3K1 y MAP2K4 en la muestra del paciente son de tipo natural o mutante; y seleccionar un paciente para el tratamiento con un inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K, tal como un inhibidor de PI3K-a o inhibidor de AKT, basándose en lo mismo.
El método puede incluir o excluir la etapa de aislamiento de la muestra del paciente real. Por tanto, según un aspecto, se proporciona a método para seleccionar un tratamiento para un paciente que padece cáncer, comprendiendo el método determinar si el estado genético de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K en una muestra representativa del cáncer previamente aislada del paciente es de tipo natural o mutante; determinar si los genes de MAP3K1 y MAP2K4 en la muestra previamente aislada del paciente son de tipo natural o mutantes; y seleccionar un paciente para el tratamiento con un inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K, tal como un inhibidor de PI3K-a o inhibidor de AKT, basándose en lo mismo.
En otro aspecto, se proporciona un método para seleccionar un tratamiento para un paciente que padece cáncer, comprendiendo el método determinar si el gen de PIK3CA o el gen de AKT en una muestra representativa del cáncer previamente aislada del paciente es de tipo natural o mutante; determinar si los genes de MAP3K1 y MAP2K4 en la muestra previamente aislada del paciente son de tipo natural o mutantes; y seleccionar un paciente para el tratamiento con un inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K, tal como un inhibidor de PI3K-a o inhibidor de AKT, basándose en lo mismo.
En un aspecto, el método comprende la determinación del estado del gen de PIK3CA.
En otro aspecto, el paciente se selecciona para el tratamiento con un inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K, tal como un inhibidor de PI3K-a o inhibidor de AKT, si el ADN de la célula cancerosa tiene un gen de PIK3CA mutante y genes de MAP3K1 y MAP2K4 de tipo natural.
En otro aspecto, el método comprende la determinación del estado del gen de AKT.
En otro aspecto, el paciente se selecciona para el tratamiento con un inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K, tal como un inhibidor de AKT, si el ADN de la célula cancerosa tiene un gen de AKT mutante y genes de MAP3K1 y MAP2K4 de tipo natural.
En otro aspecto, un paciente no se selecciona para el tratamiento con un inhibidor de componentes aguas arriba de la ruta de PI3k , si el ADN de la célula cancerosa posee un gen de PIK3CA mutante o gen de AKT mutante, y un gen de MAP3K1 mutante o gen de MAP2K4 mutante.
Según otro aspecto, se proporciona un método para seleccionar un paciente para el tratamiento con un inhibidor de PI3K-a, comprendiendo el método determinar si el gen de PIK3CA en una muestra representativa del cáncer previamente aislada del paciente es de tipo natural o mutante; determinar si los genes de MAP3K1 y MAP2K4 en la muestra previamente aislada del paciente son de tipo natural o mutantes; y seleccionar un paciente para el tratamiento con un inhibidor de PI3K-a basándose en lo mismo.
Según otro aspecto, se proporciona un método para seleccionar un paciente para el tratamiento con un inhibidor de AKT, comprendiendo el método determinar si el gen de PIK3CA en una muestra representativa del cáncer previamente aislada del paciente es de tipo natural o mutante; determinar si los genes de MAP3K1 y MAP2K4 en la muestra previamente aislada del paciente son de tipo natural o mutantes; y seleccionar un paciente para el tratamiento con un inhibidor de AKT basándose en lo mismo.
Según otro aspecto, se proporciona un método para seleccionar un paciente para el tratamiento con un inhibidor de AKT, comprendiendo el método determinar si el gen de AKT en una muestra representativa del cáncer previamente aislada del paciente es de tipo natural o mutante; determinar si los genes de MAP3K1 y MAP2K4 en la muestra previamente aislada del paciente son de tipo natural o mutantes; y seleccionar un paciente para el tratamiento con un inhibidor de AKT basándose en lo mismo.
Según un aspecto adicional, se proporciona un método para seleccionar un paciente para el tratamiento con un inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K, tal como un inhibidor de PI3K-a o un inhibidor de AKT, comprendiendo el método determinar si el gen de PIK3CA o gen de AKT en una muestra representativa del cáncer previamente aislada del paciente es de tipo natural o mutante; determinar si el gen de MAP3K1 en la muestra previamente aislada del paciente es de tipo natural o mutante; y seleccionar un paciente para el tratamiento con el inhibidor basándose en lo mismo.
En un aspecto, el paciente se selecciona para el tratamiento con un inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K, tal como un inhibidor de PI3K-a o un inhibidor de AKT, si el ADN de la célula cancerosa tiene un gen de PIK3CA mutante o un gen de AKT mutante, y un gen de MAP3K1 de tipo natural. En otros aspectos, no se selecciona para el tratamiento con un inhibidor de PI3K-a si el ADN de la célula cancerosa tiene un gen de PIK3CA mutante o un gen de AKT mutante, y un gen de MAP3K1 mutante.
En otro aspecto, se proporciona un método para seleccionar un paciente para el tratamiento con un inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K, tal como un inhibidor de PI3K-a o un inhibidor de AKT, comprendiendo el método determinar si el gen de PIK3CA o gen de AKT en una muestra representativa del cáncer previamente aislada del paciente es de tipo natural o mutante; determinar si el gen de MAP2K4 en la muestra previamente aislada del paciente es de tipo natural o mutante; y seleccionar un paciente para el tratamiento con el inhibidor basándose en lo mismo.
En un aspecto, el paciente se selecciona para el tratamiento con un inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K, tal como un inhibidor de PI3K-a o un inhibidor de AKT, si el ADN de la célula cancerosa tiene un gen de PIK3CA mutante o un gen de AKT mutante, y un gen de MAP2K4 de tipo natural. En otros aspectos, un paciente no se selecciona para el tratamiento con un inhibidor de PI3K-a si el ADN de la célula cancerosa tiene un gen de PIK3CA mutante o un gen de AKT mutante, y un gen de MAP2K4 mutante.
Según otro aspecto, se proporciona un método para predecir la sensibilidad de un paciente a inhibidor(es) de componentes aguas arriba de la ruta de PI3K, tales como inhibidores de PI3K-a o inhibidores de AKT, comprendiendo el método determinar si el gen de PIK3CA o gen de AKT en las células cancerosas del paciente es de tipo natural o mutante; determinar si el gen de MAP3K1 y gen de MAP2K4 en las células cancerosas del paciente son de tipo natural o mutantes; y basándose en lo mismo, predecir la sensibilidad de un paciente al tratamiento con inhibidor(es) de componentes aguas arriba de la ruta de PI3K, tales como inhibidores de PI3K-a o inhibidores de AKT.
Según otro aspecto, se proporciona un método para determinar la probabilidad de eficacia del tratamiento con inhibidor(es) de componentes aguas arriba de la ruta de PI3K, tales como inhibidores de PI3K-a o inhibidores de AKT, en un paciente humano afectado de cáncer que comprende: determinar si el gen de PIK3CA o gen de AKT en las células cancerosas del paciente es de tipo natural o mutante; determinar si el gen de MAP3K1 y gen de MAP2K4 en la célula cancerosa del paciente son de tipo natural o mutantes; y basándose en lo mismo, predecir la sensibilidad del paciente al tratamiento con inhibidor(es) de componentes aguas arriba de la ruta de PI3K, tales como inhibidores de PI3K-a o inhibidores de AKT.
Según otro aspecto, se proporciona un método para deseleccionar un paciente para el tratamiento con un inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K, tal como un inhibidor de PI3K-a o un inhibidor de AKT, comprendiendo el método determinar si el gen de MAP3K1 y gen de MAP2K4 en una muestra que contiene células cancerosas previamente aislada del paciente son de tipo natural o mutantes, y en donde el paciente no se selecciona para el tratamiento con el inhibidor si el ADN de la célula cancerosa posee un gen de MAP3K1 mutante o gen de MAP2K4 mutante.
Métodos de tratamiento
Según otro aspecto, se proporciona un método de tratamiento del cáncer en un paciente cuyo estado génico en células cancerosas de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K, y de MAP3K1 y MAP2K4, ya se ha determinado, comprendiendo el método administrar al paciente una cantidad eficaz de un inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K si las células cancerosas poseen un gen mutante para un componente aguas arriba de la ruta de PI3K, y genes de MAP3K1 y MAP2K4 de tipo natural.
Según otro aspecto, se proporciona un método de tratamiento del cáncer en un paciente cuyo estado génico de PIK3CA o AKT, y estado génico de MAP3K1 y MAP2K4 en células cancerosas, ya se ha determinado, comprendiendo el método administrar al paciente una cantidad eficaz de un inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K, tal como un inhibidor de PI3K-a o un inhibidor de AKT, si las células cancerosas poseen un gen de PIK3CA mutante o un gen de AKT mutante, y genes de MAP3K1 y MAP2K4 de tipo natural.
En otro aspecto, se proporciona un método de tratamiento del cáncer en un paciente cuyo estado génico de PIK3CA, MAP3K1 y MAP2K4 en células cancerosas ya se ha determinado, comprendiendo el método administrar al paciente una cantidad eficaz de un inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K, tal como un inhibidor de PI3K-a o un inhibidor de AKT, si las células cancerosas poseen un gen de PIK3CA mutante, y genes de MAP3K1 y MAP2K4 de tipo natural.
En otro aspecto, se proporciona un método de tratamiento del cáncer en un paciente cuyo estado génico de AKT, MAP3K1 y MAP2K4 en células cancerosas ya se ha determinado, comprendiendo el método administrar al paciente una cantidad eficaz de un inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K, tal como un inhibidor de AKT, si las células cancerosas poseen a gen de AKT mutante, y genes de MAP3K1 y MAP2K4 de tipo natural.
En otro aspecto, se proporciona un método de tratamiento de un paciente que padece cáncer que comprende: determinar el estado mutante o de tipo natural del gen de PIK3CA o gen de AKT en las células cancerosas del paciente; determinar el estado mutante o de tipo natural de los genes de MAP3K1 y MAP2K4 en las células cancerosas del paciente; y
administrar al paciente una cantidad eficaz de un inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K, tal como un inhibidor de PI3K-a o un inhibidor de AKT, si las células cancerosas poseen un gen de PIK3CA mutante o gen de AKT mutante, y genes de MAP3K1 y MAP2K4 de tipo natural.
Según un aspecto adicional, se proporciona un método de tratamiento de un paciente que padece cáncer, que comprende proporcionar una muestra representativa del cáncer de un paciente; determinar si el estado genético de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K en las células cancerosas del paciente es de tipo natural o mutante; determinar si el gen de MAP3K1 y gen de MAP2K4 en las células cancerosas del paciente son de tipo natural o mutantes; y administrar al paciente una cantidad eficaz de un inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K, tal como un inhibidor de PI3K-a o un inhibidor de AKT, si las células cancerosas poseen una mutación en un componente aguas arriba de la ruta de PI3K, y genes de MAP3K1 y MAP2K4 de tipo natural.
Según un aspecto adicional, se proporciona un método de tratamiento de un paciente que padece cáncer que comprende proporcionar una muestra representativa del cáncer de un paciente; determinar si el gen de PIK3CA o gen de AKT en las células cancerosas del paciente son de tipo natural o mutantes; determinar si los genes de MAP3K1 y MAP2K4 en las células cancerosas del paciente son de tipo natural o mutantes; y administrar al paciente una cantidad eficaz de un inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K, tal como un inhibidor de PI3K-a o un inhibidor de AKT, si las células cancerosas poseen un gen de PIK3CA mutante o gen de AKT mutante, y genes de MAP3K1 y MAP2K4 de tipo natural.
En un aspecto adicional, se proporciona un método de tratamiento de un paciente que padece cáncer que comprende proporcionar una muestra representativa del cáncer de un paciente; determinar si el gen de PIK3CA en las células cancerosas del paciente es de tipo natural o mutante; determinar si los genes de MAP3K1 y MAP2K4 en las células cancerosas del paciente son de tipo natural o mutantes; y administrar al paciente una cantidad eficaz de un inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K, tal como un inhibidor de PI3K-a o un inhibidor de AKT, si las células cancerosas poseen un gen de PIK3CA mutante, y genes de MAP3K1 y MAP2K4 de tipo natural.
En un aspecto adicional, se proporciona un método de tratamiento de un paciente que padece cáncer que comprende proporcionar una muestra que contiene células cancerosas de un paciente; determinar si el gen de AKT en las células cancerosas del paciente es de tipo natural o mutante; determinar si los genes de MAP3K1 y MAP2K4 en las células cancerosas del paciente son de tipo natural o mutantes; y administrar al paciente una cantidad eficaz de un inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K, tal como un inhibidor de PI3K-a o un inhibidor de AKT, si las células cancerosas poseen un gen de AKT mutante, y genes de MAP3K1 y MAP2K4 de tipo natural.
Tal como se usan en la presente, los términos "eficaz" y "eficacia" incluyen tanto eficacia farmacológica como seguridad fisiológica. La eficacia farmacológica se refiere a la capacidad del tratamiento para dar como resultado un efecto biológico deseado en el paciente. La seguridad fisiológica se refiere al nivel de toxicidad, u otros efectos fisiológicos adversos a nivel celular, orgánico y/o del organismo (a menudo denominados efectos secundarios) que resultan de la administración del tratamiento. "Menos eficaz" significa que el tratamiento da como resultado un menor nivel terapéuticamente significativo de eficacia farmacológica y/o un nivel terapéuticamente mayor de efectos fisiológicos adversos.
Métodos de cribado
Según otro aspecto, se proporciona un método de cribado de pacientes para establecer la idoneidad para el tratamiento con un inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K que comprende determinar si el estado genético de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K en una muestra representativa del cáncer previamente aislada del paciente es de tipo natural o mutante; y determinar si los genes de MAP3K1 y MAP2K4 en la muestra previamente aislada del paciente son de tipo natural o mutantes.
Según otro aspecto, se proporciona un método de cribado de pacientes para establecer la idoneidad para el tratamiento con un inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K, tal como un inhibidor de PI3K-a o un inhibidor de AKT, que comprende determinar si el gen de PIK3CA o gen de AKT en una muestra representativa del cáncer previamente aislada del paciente es de tipo natural o mutante; y determinar si los genes de MAP3K1 y MAP2K4 en la muestra previamente aislada del paciente son de tipo natural o mutantes.
En un aspecto adicional, se proporciona un método de cribado de pacientes para establecer la idoneidad para el tratamiento con un inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K, tal como un inhibidor de PI3K-a o un inhibidor de AKT, que comprende determinar si el gen de PIK3CA en una muestra representativa del cáncer previamente aislada del paciente es de tipo natural o mutante; y determinar si los genes de MAP3K1 y MAP2K4 en la muestra previamente aislada del paciente son de tipo natural o mutantes.
En un aspecto adicional, se proporciona un método de cribado de pacientes para establecer la idoneidad para el tratamiento con un inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K, tal como un inhibidor de PI3K-a o un inhibidor de AKT, que comprende determinar si el gen de AKT en una muestra representativa del cáncer previamente aislada del paciente es de tipo natural o mutante; y determinar si los genes de MAP3K1 y MAP2K4 en la muestra previamente aislada del paciente son de tipo natural o mutantes.
Inhibidores y usos de los mismos
Según otro aspecto, se proporciona el uso de un inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K para tratar a un paciente con cáncer cuyas células cancerosas se ha identificado que poseen una mutación en un componente aguas arriba de la ruta de PI3K, y genes de MAP3K1 y MAP2K4 de tipo natural.
Según otro aspecto, se proporciona el uso de un inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K, tal como un inhibidor de PI3K-a o un inhibidor de AKT, para tratar a un paciente con cáncer cuyas células ca ncerosas se ha identificado que poseen un gen de PIK3CA mutante o un gen de AKT mutante, y genes de MAP3K1 y MAP2K4 de tipo natural.
En otro aspecto, se proporciona el uso de un inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K, tal como un inhibidor de PI3K a o un inhibidor de AKT, para tratar a un paciente con cáncer cuyas células cancerosas se ha identificado que poseen a gen de PIK3CA mutante, y genes de MAP3K1 y MAP2K4 de tipo natural.
En un aspecto adicional, se proporciona el uso de un inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K, tal como un inhibidor de PI3K-a o un inhibidor de AKT, para tratar a un paciente con cáncer cuyas células cancerosas se ha identificado que poseen un gen de AKT mutante, y genes de MAP3K1 y MAP2K4 de tipo natural.
Según otro aspecto, se proporciona un inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K para su uso en el tratamiento de cánceres con células cancerosas que se identifica que albergan una mutación en un componente aguas arriba de la ruta de PI3K, y genes de MAP3K1 y MAP2K4 de tipo natural.
Según otro aspecto, se proporciona un inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K, tal como un inhibidor de PI3K-a o un inhibidor de AKT, para su uso en el tratamiento de cánceres con células cancerosas que se identifica que albergan un gen de PIK3CA mutante, o un gen de AKT mutante y genes de MAP3K1 y MAP2K4 de tipo natural.
En un aspecto adicional, se proporciona un inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K, tal como un inhibidor de PI3K-a o un inhibidor de AKT, para su uso en el tratamiento de cánceres con células cancerosas que se identifica que albergan un gen de PIK3CA mutante, y genes de MAP3K1 y MAP2K4 de tipo natural.
En un aspecto adicional, se proporciona un inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K, tal como un inhibidor de PI3K-a o un inhibidor de AKT, para su uso en el tratamiento de cánceres con células cancerosas que se identifica que albergan un gen de AKT mutante, y genes de MAP3K1 y MAP2K4 de tipo natural.
En un aspecto adicional, se proporciona un inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K, tal como un inhibidor de PI3K-a o un inhibidor de AKT, para su uso en el tratamiento de cánceres con células cancerosas que s e identifica que albergan un gen de PIK3CA mutante, o un gen de AKT mutante y un gen de MAP3K1 de tipo natural.
En un aspecto adicional, se proporciona un inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K, tal como un inhibidor de PI3K-a o un inhibidor de AKT, para su uso en el tratamiento de cánceres con células cancerosas que se identifica que albergan un gen de PIK3CA mutante, o un gen de AKT mutante y un gen de MAP2K4 de tipo natural.
Según otro aspecto, se proporciona el uso de un inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K para la fabricación de un medicamento para su uso en el tratamiento de cánceres con células cancerosas que se identifica que albergan una mutación en un componente aguas arriba de la ruta de PI3K, y genes de MAP3K1 y MAP2K4 de tipo natural.
Según otro aspecto, se proporciona el uso de un inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K, tal como un inhibidor de PI3K-a o un inhibidor de AKT, para la fabricación de un medicamento para su uso en el tratamiento de cánceres con células cancerosas que se identifica que albergan un gen de PIK3CA mutante o un gen de AKT mutante, y genes de MAP3K1 y MAP2K4 de tipo natural.
En un aspecto adicional, se proporciona el uso de un inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K, tal como un inhibidor de PI3K-a o un inhibidor de AKT, para la fabricación de un medicamento para su uso en el tratamiento de cánceres con células cancerosas que se identifica que albergan un gen de PIK3CA mutante, y genes de MAP3K1 y MAP2K4 de tipo natural.
En un aspecto adicional, se proporciona el uso de un inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K, tal como un inhibidor de PI3K-a o un inhibidor de AKT, para la fabricación de un medicamento para su uso en el tratamiento de cánceres con células cancerosas que se identifica que albergan un gen de AKT mutante, y genes de MAP3K1 y MAP2K4 de tipo natural.
En un aspecto adicional, se proporciona el uso un inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K, tal como un inhibidor de PI3K-a o un inhibidor de AKT, para la fabricación de un medicamento para su uso en el tratamiento de
cánceres con células cancerosas que se identifica que albergan un gen de PIK3CA muíante, o un gen de AKT muíante y un gen de MAP3K1 de tipo natural.
En un aspecto adicional, se proporciona el uso de un inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K, tal como un inhibidor de PI3K-a o un inhibidor de AKT, para la fabricación de un medicamento para su uso en el tratamiento de cánceres con células cancerosas que se identifica que albergan un gen de PIK3CA mutante, o un gen de AKT mutante y un gen de MAP2K4 de tipo natural.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K para su uso en la prevención y el tratamiento del cáncer con células cancerosas que se identifica que albergan una mutación en un componente aguas arriba de la ruta de PI3K, y genes de MAP3K1 y MAP2K4 de tipo natural.
En todavía aspectos adicionales, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K, tal como un inhibidor de PI3K-a o un inhibidor de AKT, para su uso en la prevención y el tratamiento del cáncer con células cancerosas que se identifica que albergan un gen de PIK3CA mutante o un gen de AKT mutante, y genes de MAP3K1 y MAP2K4 de tipo natural.
Las composiciones farmacéuticas pueden adoptar la forma de disoluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, píldoras, gránulos, cápsulas, cápsulas que contienen líquidos, polvos, formulaciones de liberación sostenida, supositorios, aerosoles, pulverizaciones, suspensiones o cualquier otra forma adecuada para su uso.
La administración puede ser, por ejemplo, tópica (es decir, la composición farmacéutica se aplica directamente donde se desea su acción), entérica u oral (es decir, la composición farmacéutica se administra por medio del tracto digestivo) o parenteral (es decir, la composición farmacéutica sea administrada por otras vías distintas del tubo digestivo, tal como por inyección).
En un aspecto, el compuesto activo o la sal del mismo (un inhibidor de un componente corriente arriba de la ruta de PI3K, tal como un inhibidor de PI3K-a o un inhibidor de AKT) y, opcionalmente, otro agente terapéutico o profiláctico, se formulan de acuerdo con procedimientos de rutina como composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración intravenosa a seres humanos. Normalmente, el compuesto activo para administración intravenosa son disoluciones en tampón acuoso isotónico estéril. Cuando sea necesario, las composiciones también pueden incluir un agente solubilizante. Las composiciones para administración intravenosa pueden incluir opcionalmente un anestésico local tal como lignocaína para aliviar el dolor en el sitio de la inyección. En general, los componentes se suministran o bien por separado o bien se mezclan juntos en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, como un polvo seco liofilizado o un concentrado sin agua en un recipiente herméticamente cerrado, tal como una ampolla. Cuando el compuesto activo va a administrarse por infusión, puede dispensarse, por ejemplo, con una botella de infusión que contiene solución salina o agua estéril de calidad farmacéutica. Cuando el compuesto activo se administra por inyección, puede proporcionarse una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina para que los componentes se mezclen antes de la administración.
Las composiciones para administración oral pueden estar en forma de comprimidos, pastillas para chupar, suspensiones acuosas u oleosas, gránulos, polvos, emulsiones, cápsulas, jarabes o elixires, por ejemplo. Las composiciones administradas por vía oral pueden contener uno o más agentes opcionales, por ejemplo, agentes edulcorantes tales como fructosa, aspartamo o sacarina; agentes aromatizantes tales como menta, aceite de gaulteria o cereza; agentes colorantes; y agentes conservantes, para proporcionar una preparación farmacéuticamente apetecible. También puede usarse un material de retardo temporal tal como monoestearato de glicerol o estearato de glicerol. Las composiciones orales pueden incluir vehículos convencionales tales como manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio y similares. Tales vehículos son de calidad farmacéutica en aspectos particulares.
Las composiciones para su uso de acuerdo con la presente invención pueden formularse de manera convencional usando uno o más portadores o excipientes fisiológicamente aceptables. Por tanto, el compuesto activo y opcionalmente otro agente terapéutico o profiláctico y sus sales y solvatos fisiológicamente aceptables pueden formularse en composiciones farmacéuticas para administración por inhalación o insuflación (ya sea a través de la boca o la nariz) o administración oral, parenteral o mucosa (tal como bucal, vaginal, rectal, sublingual). En un aspecto, se usa administración parenteral local o sistémica.
Para la administración oral, las composiciones pueden adoptar la forma de, por ejemplo, comprimidos o cápsulas preparadas por medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables tales como agentes aglutinantes (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa); cargas (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina o hidrogenofosfato de calcio); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco o sílice); disgregantes (por ejemplo, fécula de patata o glicolato sódico de almidón); o agentes humectantes (por ejemplo, laurilsulfato de sodio). Los comprimidos pueden recubrirse mediante métodos bien conocidos en la técnica. Las preparaciones líquidas para administración oral pueden adoptar la forma de, por ejemplo, disoluciones, jarabes o suspensiones, o pueden presentarse como un producto seco para su reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes de su uso. Tales preparaciones líquidas pueden prepararse por medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables tales como agentes de suspensión (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa
o grasas comestibles hidrogenadas); agentes emulsionantes (por ejemplo, lecitina o goma arábiga); vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendras, ésteres oleosos, alcohol etílico o aceites vegetales fraccionados); y conservantes (por ejemplo, p-hidroxibenzoatos de metilo o propilo o ácido sórbico). Las preparaciones también pueden contener sales de tampón, agentes aromatizantes, colorantes y edulcorantes según sea apropiado.
En algunos aspectos, los compuestos o sales dados a conocer en el presente documento pueden administrarse como una composición farmacéutica en la que la composición farmacéutica comprende entre 0,1 y 1 mg, 1 y 10 mg, 10 y 50 mg, 50 y 100 mg, 100 y 500 mg o 500 mg y 5 g de dicho compuesto activo o sal del mismo.
Según un aspecto aún adicional, se proporciona un kit que comprende un inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K, tal como un inhibidor de PI3K-a o un inhibidor de AKT, en una forma farmacéutica unitaria adecuada; una prueba adecuada para proporcionar los resultados de un análisis para determinar si el paciente tiene un componente aguas arriba de tipo natural o mutante de la ruta de PI3K (tal como el gen de PIK3CA o gen de AKT); una prueba adecuada para proporcionar los resultados de un análisis para determinar si el paciente tiene genes de MAP3K1 y MAP2K4 de tipo natural o mutantes; medios de recipiente para contener el inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K, tal como un inhibidor de PI3K-a o un inhibidor de AKT, y el componente aguas arriba de la ruta de PI3K, pruebas de MAP3K1 y MAP2K4; y opcionalmente instrucciones para su uso.
Según un aspecto aún adicional, se proporciona un kit que comprende un inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K, tal como un inhibidor de PI3K-a o un inhibidor de AKT, en una forma farmacéutica unitaria adecuada; una prueba adecuada para proporcionar los resultados de un análisis para determinar si el paciente tiene un gen de PIK3CA de tipo natural o mutante; una prueba adecuada para proporcionar los resultados de un análisis para determinar si el paciente tiene genes de MAP3K1 y MAP2K4 de tipo natural o mutantes; medios de recipiente para contener el inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K, tal como un inhibidor de PI3K-a o un inhibidor de AKT, y las pruebas de PIK3CA, MAP3K1 y MAP2K4; y opcionalmente instrucciones para su uso.
En un aspecto aún adicional, se proporciona un kit que comprende un inhibidor de AKT en una forma farmacéutica unitaria adecuada; una prueba adecuada para proporcionar los resultados de un análisis para determinar si el paciente tiene un gen de AKT de tipo natural o mutante; una prueba adecuada para proporcionar los resultados de un análisis para determinar si el paciente tiene genes de MAP3K1 y MAP2K4 de tipo natural o mutantes; medios de recipiente para contener el inhibidor de AKT, y las pruebas de AKT, MAP3K1 y MAP2K4; y opcionalmente instrucciones para su uso.
Estado génico: de tipo natural o mutante
Para el fin de esta memoria descriptiva, el estado génico de tipo natural pretende indicar una expresión normal o apropiada del gen y una función normal de la proteína codificada. En cambio, un estado mutante pretende indicar una expresión génica anómala o inapropiada, o expresión de una proteína con función alterada, consecuente con los papeles conocidos de componentes aguas arriba mutantes de la ruta de PI3K (tales como PIK3CA o AKT) y de MAP3K1 y MAP2K4 en el cáncer (tal como se describe en el presente documento). Cualquiera de varias alteraciones genéticas o epigenéticas, incluidas pero sin limitarse a mutación, amplificación, deleción, transposición genómica o cambios en el perfil de metilación, puede dar como resultado un estado mutante. Sin embargo, si tales alteraciones dan como resultado, no obstante, una expresión apropiada de la proteína normal, o una variante funcionalmente equivalente, entonces el estado génico se considera de tipo natural. Los ejemplos de variantes que normalmente no darían como resultado un estado génico mutante funcional incluyen variantes codificantes sinónimas y polimorfismos comunes (sinónimos o no sinónimos). Tal como se comenta a continuación, el estado génico puede evaluarse mediante un ensayo funcional, o puede inferirse de la naturaleza de las variaciones detectadas a partir de una secuencia de referencia.
En ciertos aspectos, el estado de tipo natural o mutante del componente aguas arriba de la ruta de PI3K (tales como los genes de PIK3CA o AKT) y/o los genes de MAP3K1 y MAP2K4 se determina mediante la presencia o ausencia de variaciones de ácido nucleico no sinónimas en los genes. Las variaciones no sinónimas observadas correspondientes a polimorfismos comunes conocidos sin efectos funcionales anotados no contribuyen a un estado génico de mutante.
Otras variaciones en los genes de componentes aguas arriba de la ruta de PI3K (tales como el gen de PIK3CA o gen de AKT) y/o genes de MAP3K1/MAP2K4 que significan un estado mutante incluyen variaciones en el sitio de corte y empalme que disminuyen el reconocimiento de una unión de intrón/exón durante el procesamiento de pre-ARNm a ARNm. Esto puede dar como resultado la omisión de exones o la inclusión de una secuencia normalmente intrónica en ARNm sometido a corte y empalme (retención de intrones o utilización de uniones de corte y empalme crípticas). Esto, a su vez, puede dar como resultado la producción de una proteína aberrante con inserciones y/o deleciones en relación con la proteína normal. Por tanto, en otros aspectos, el gen tiene un estado mutante si hay una variante que altera la secuencia de reconocimiento de sitios de corte y empalme en una unión de intrón/exón.
Las mutaciones no sinónimas que agotan la actividad o la expresión proteica y/o las mutaciones de pérdida de función en los genes de componentes aguas arriba de la ruta de PI3K (tales como el gen de PIK3CA o el gen de AKT) y/o los genes de MAP3K1/MAP2K4 son particularmente relevantes para su uso en los aspectos descritos en el presente documento y proporcionan aspectos separados de la presente divulgación. En aspectos adicionales, tales mutaciones pueden ser
mutaciones mutaciones del marco de lectura, mutaciones del sitio de corte y empalme, mutaciones sin sentido y/o mutaciones de cambio de sentido.
Caracterización de mutaciones de PIK3CA
El documento WO2014/114928 describe una encuesta realizada en AstraZeneca sobre los cánceres de mama (basada en la base de datos COSMIC (Welcome Trust Sanger Institute, septiembre de 2011), en la que se identificaron >55 mutaciones diferentes en el gen de PIK3CA a partir de un conjunto de datos que cubría >5K tumores humanos. La mayoría de las mutaciones se producían a una frecuencia <1 %, 3 se producían a una frecuencia del 1-3 %, pero 4 mutaciones representaban ~88 % de las mutaciones de PIK3CA totales. Estas fueron mutaciones de cambio de sentido del dominio cinasa en el dominio cinasa C terminal, H1047R (55%) y H1047L (5%), y los residuos del dominio helicoidal, E545K (18%) y E542K (11%). Una lista más larga de otras mutaciones prevalentes en el cáncer de mama, aunque no pretende ser exhaustiva, abarca R38H, R38C, R88Q, N345K, C420R, E453Q, P539R, E542K, E545K, E545A, Q546K, Q546P, M1043I, M1043V, H1047R, H1047L, H1047Y. Por tanto, pueden construirse ensayos de diagnóstico que se centren en la detección de las mutaciones más comunes, permitiendo de ese modo la identificación de la mayoría de las mutaciones de PIK3CA. Por ejemplo, la prueba de mutación de PIK3CA Cobas (TM) de Roche Molecular Systems está diseñada para detectar 17 mutaciones en los exones 1, 4, 7, 9 y 20 del gen de PIK3CA (E542K, E545A, E545G, E545K, E545D, Q546K, Q546R, Q546E, Q546L, N345K, C420R, R88Q, H1047L, H1047R , H1047Y, G1049R y M1043I) en ADN aislado de muestras de tumores fijadas con formalina e incrustadas en parafina. Este kit es capaz de recoger hasta ~95 % de las mutaciones en cáncer de mama ER+ve. La distribución de mutaciones difiere entre otros tipos de tumores y la estrategia de diagnóstico puede adaptarse por consiguiente. Por ejemplo, en cáncer de endometrio, hay una distribución más uniforme de las mutaciones diseminadas por toda la secuencia codificante del gen de PIK3CA y con un mayor número de mutaciones en la región N terminal de la proteína (comunicado por Douglas A. Levine, M.D, TCGA 2nd Annual Symposium, 28 de noviembre de 2012), en comparación con los cánceres de mama.
Para PIK3CA, están disponibles secuencias de referencia para el gen (número de registro de GenBank: NG_012113), ARNm (número de registro de GenBank: NM_006218) y proteína (número de registro de GenBank: NP_006209 o registro de Swiss-Prot: P42336). Se muestran secuencias de referencia particulares en SEQ ID NO: 5, 10, 15 y 20, respectivamente. Las secuencias génicas de referencia (región genómica) incluyen 5000 bases de secuencia en el sentido de 5' y 2000 bases de secuencia en el sentido de 3'. Se conocen bien mutaciones dentro del gen de PIK3CA (base de datos COSMIC - Welcome Trust Sanger Institute), y el experto en la técnica será capaz de determinar el estado génico de PIK3CA, es decir, es un gen de PIK3CA particular es de tipo natural o mutante, basándose en la comparación de la secuencia de ADN o proteína con el tipo natural.
Resultará evidente que las secuencias de referencia del gen y del ARNm dadas a conocer para PIK3CA son una secuencia representativa cada una, y para los fines de la presente divulgación, la secuencia de referencia de la proteína preferida para fines comparativos solo se muestra en SEQ ID NO. 20. En individuos normales hay dos copias de cada gen, una copia materna y paterna, que tendrán probablemente algunas diferencias de secuencia, además dentro de una población existirán numerosas variantes alélicas de la secuencia del gen. Otras secuencias consideradas de tipo natural incluyen las que poseen uno o más cambios sinónimos en la secuencia de ácido nucleico (cambios que no alteran la secuencia proteica codificada), polimorfismos comunes no sinónimos (por ejemplo, polimorfismos de la línea germinal) que alteran la secuencia proteica pero no afectan a la función de la proteína, y cambios de secuencia intrónicos que no son en el sitio de corte y empalme.
Caracterización de mutaciones de AKT
Se han identificado mutaciones puntuales de cambio de sentido de AKT 1 en cánceres humanos incluido de mama (véanse las referencias 1-3 a continuación). Además de E17K, la mutación de AKT1 más común en cánceres humanos, se ha mostrado que varias otras mutaciones (L52R, C77F y Q79K) son funcionalmente transformantes (véanse las referencias 4, 5 a continuación). Dada la alta identidad de secuencia entre las proteínas AKT1 y AKT2 (base de datos Ensembl -EMBl-EBI/Wellcome Trust Sanger Institute), se cree que las mutaciones correspondientes en AKT2 son también transformantes.
Para AKT1, están disponibles secuencias de referencia para el gen (número de registro de GenBank: NG_012188), ARNm (número de registro de GenBank: NM_005163) y proteína (número de registro de GenBank: NP_005154 o registro de Swiss-Prot: P31749). Se muestran secuencias de referencia particulares en SEQ ID NO: 1, 6, 11 y 16, respectivamente. Para AKT2, están disponibles secuencias de referencia para el gen (número de registro de GenBank: NG_012038), ARNm (número de registro de GenBank: NM_001626) y proteína (número de registro de GenBank: NP_001617 o registro de Swiss-Prot: P31751). Se muestran secuencias de referencia particulares en SEQ ID NO: 2,7, 12 y 17, respectivamente. Se producen mutaciones dentro de AKT1 y AKT2 a frecuencias relativamente bajas (base de datos COSMIC - Welcome Trust Sanger Institute), y el experto en la técnica será capaz de determinar el estado génico de AKT1 y AKT2, es decir, si un gen de AKT 1 o AKT2 particular es de tipo natural o mutante, basándose en la comparación de la secuencia de ADN o proteína con el tipo natural.
Resultará evidente que las secuencias del gen, de ARNm y las secuencias de referencia de la proteína dadas a conocer para AKT1 y AKT2 son una secuencia representativa cada una, y para los fines de la presente divulgación, la secuencia
de referencia de la proteína preferida para fines comparativos solo se muestra en SEQ ID NO. 16 (para AKT1) y en SEQ ID NO. 17 (para AKT2). En individuos normales hay dos copias de cada gen, una copia materna y paterna, que tendrán probablemente algunas diferencias de secuencia, además dentro de una población existirán numerosas variantes alélicas de la secuencia del gen. Otras secuencias consideradas de tipo natural incluyen las que poseen uno o más cambios sinónimos en la secuencia de ácido nucleico (cambios que no alteran la secuencia proteica codificada), polimorfismos comunes no sinónimos (por ejemplo, polimorfismos de la línea germinal) que alteran la secuencia proteica pero no afectan a la función de la proteína, y cambios de secuencia intrónicos que no son en el sitio de corte y empalme.
1. Flatley, E. et al. PIK3CA-AKT pathway mutations in micropapillary breast carcinoma. Human Pathology (2013) 44, 1320-1327.
2. Stemke-Hale, K. et al. An integrative genomic and proteomic analysis of PIK3CA, PTEN and AKT mutations in breast cancer. Cancer Research (2008) 68, 6084-6091.
3. Troxell, M.L. et al. High prevalence of PIK3CA/AKT pathway mutations in papillary neoplasms of the breast. Modern Pathology (2010). 23, 27-37.
4. Yi, K. et al. Functional analysis of non-hotspot AKT 1 mutants found in human breast cancers identifies novel driver mutations: implications for personalized medicine Oncotarget (2012) 4, 29-34.
5. Carpten, J.D., et al. A transforming mutation in the pleckstrin homology domain of AKT1 in cancer. Nature (2007) 448, 439-444.
Caracterización de mutaciones de MAP3K1 ylo MAP2K4
Varios informes en la bibliografía (véanse las referencias 1-4 a continuación) identificaron mutaciones frecuentes en los genes de MAP3K1 y MAP2K4. Las mutaciones se distribuían en la secuencia codificante de cada gen sin enriquecimiento aparente en ningún dominio funcional. Este patrón es indicativo de la función del gen como gen supresor de tumores en el que las denominadas mutaciones de 'pérdida de función' (mutaciones de corte y empalme, sin sentido y del marco de lectura) anulan la expresión de la proteína funcional. Para MAP3K1, en el 19 % de los casos, las mutaciones conducen a un cambio no sinónimo en la secuencia codificante (Pham et al Genes and Cancer 2014, 4:410-426), pero en la mayoría de los casos las mutaciones son deleciones o inserciones del marco de lectura (el 59 % de las mutaciones). Ejemplos son mutaciones del marco de lectura tales como R273fs*27. I761fs*35 y mutaciones sin sentido tales como S431* y S1344*. Por tanto, pueden construirse ensayos de diagnóstico que se centren en la detección de mutaciones de pérdida de función, permitiendo de ese modo la identificación de mutaciones de MAP3K1 y MAP2K4. Para MAP3K1 y MAP2K4, están disponibles secuencias de referencia para el gen, el ARNm y la proteína (tabla 1). La SEQ ID NO. de secuencias de referencia particulares se muestran en la tabla 1 a continuación.
Tabla 1.
Se conocen bien las mutaciones dentro de MAP3K1 y MAP2K4 (base de datos COSMIC - Welcome Trust Sanger Institute), y el experto en la técnica será capaz de determinar el estado génico, es decir, si un gen de MAP3K1 o MAP2K4 particular es de tipo natural o mutante, basándose en la comparación de la secuencia de ADN o proteína con el tipo natural.
Resultará evidente que las secuencias de referencia del gen, del ARNm y de la proteína dadas a conocer para MAP3K1 y MAP2K4 son una secuencia representativa cada una, y para los fines de la presente divulgación, la secuencia de referencia de la proteína preferida para fines comparativos solo se muestra en SEQ ID NO. 19 (para MAP3K1) y en SEQ ID NO. 18 (para MAP2K4). En individuos normales hay dos copias de cada gen, una copia materna y paterna, que tendrán probablemente algunas diferencias de secuencia, además dentro de una población existirán numerosas variantes alélicas de la secuencia del gen. Otras secuencias consideradas de tipo natural incluyen las que poseen uno o más cambios sinónimos en la secuencia de ácido nucleico (cambios que no alteran la secuencia proteica codificada), polimorfismos comunes no sinónimos (por ejemplo, polimorfismos de la línea germinal) que alteran la secuencia proteica pero no afectan a la función de la proteína, y cambios de secuencia intrónicos que no son en el sitio de corte y empalme.
1. The Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular portraits of human breast tumours. Nature (2012) 490, 61-70.
2. Stephens, P.J. et al. The landscape of cáncer genes and mutational processes in breast cáncer. Nature (2012) 486, 400-404.
3. Ellis, M.J. et al. Whole-genome analysis informs breast cancer response to aromatase inhibition. Nature (2012) 486, 353-60.
4. Curtis, C. et al. The genomic and transcriptomic architecture of 2,000 breast tumours reveals novel subgroups.
Nature (2012) 486, 346-352.
Métodos para determinar la probabilidad de eficacia del tratamiento
Según otro aspecto, se proporciona un método para determinar la probabilidad de eficacia del tratamiento con un inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K, tal como un inhibidor de PI3K-a o inhibidor de AKT, en un paciente humano afectado de cáncer que comprende: detectar la presencia o ausencia de al menos una variación de ácido nucleico no sinónima en un componente aguas arriba de la ruta de PI3K (tal como el gen de PIK3CA o gen de AKT) de dicho paciente en relación con el tipo natural; detectar la presencia o ausencia de al menos una variación de ácido nucleico no sinónima en el gen de MAP3K1 y gen de MAP2K4 de dicho paciente en relación con los genes de tipo natural; en donde la presencia de al menos una variación de ácido nucleico no sinónima en el componente aguas arriba de la ruta de PI3K (tal como el gen de PIK3CA o gen de AKT) y la ausencia de al menos una variación de ácido nucleico no sinónima en tanto el gen de MAP3K1 como el gen de MAP2K4 indica que el tratamiento con un inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K, tal como un inhibidor de PI3K-a o inhibidor de AKT, es probable que sea eficaz.
Según otro aspecto, se proporciona un método para evaluar la susceptibilidad de un individuo al tratamiento con un inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K, tal como un inhibidor de PI3K-a o inhibidor de AKT, método que comprende:
(i) determinar el estado de mutación no sinónima de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K (tal como el gen de PIK3CA o gen de AKT) en ADN de células cancerosas del individuo;
(ii) determinar el estado de mutación no sinónima del gen de MAP3K1 y gen de MAP2K4 en ADN de células cancerosas del individuo; y
(iii) determinar la susceptibilidad probable del individuo al tratamiento con un inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K, tal como un inhibidor de PI3K-a o inhibidor de AKT, mediante la referencia al estado de mutación no sinónima del componente aguas arriba de la ruta de PI3K (tal como el gen de PIK3CA o gen de AKT), y el gen de MAP3K1 y gen de MAP2K4 en las células cancerosas.
Hay numerosas técnicas disponibles para el experto en la técnica para determinar el estado génico de PIK3CA. El estado génico puede determinarse mediante la determinación de la secuencia de ácido nucleico. Esto podría ser por medio de secuenciación directa del gen de longitud completa o análisis de sitios específicos dentro del gen, por ejemplo sitios comúnmente mutados.
Un medio alternativo para determinar si el gen de PIK3CA es o no de tipo natural o mutante es evaluar la función del gen transcrito. La mutación funcional de este gen de PIK3CA produce una proteína que tiene actividad lípido cinasa aumentada dando como resultado una señalización aguas abajo aumentada de la ruta en las células, incluida, pero sin limitarse a, la activación de Akt y S6 cinasa. Los ensayos para evaluar el estado funcional de variantes de PIK3CA, cuando se expresan en células, incluyen pero no se limitan a:
(i) aumento de la producción del producto de la actividad cinasa del gen de PIK3CA, fosfatidilinositol-trisfosfato (PI(3,4,5)P3);
(ii) aumento de los niveles de Akt o S6 cinasa fosforilada;
(iii) aumento de la formación de focos y colonias de células NIH-3T3 transfectadas con la variante de PIK3CA;
(Ikenoue T et al., Cancer Res., 200565, 4562-4567).
Un medio alternativo para obtener el perfil de muestras de ADN relevantes implica secuenciación masiva en paralelo (también conocida como secuenciación de última generación, o NGS). Pueden usarse métodos de secuenciación masiva en paralelo para determinar los genotipos de estos genes y se ejemplifican mediante, pero sin limitarse a, las plataformas de Illumina, Ion Torrent, Sequenom y Oxford Nanopore.
Muestras
La muestra del paciente que va a someterse a prueba para determinar el estado génico puede ser cualquier tejido canceroso o muestra que contenga células cancerosas obtenida u obtenible del individuo, o una muestra que contenga ácido nucleico canceroso, tal como el ADN libre circulante (ADNlc) que podría encontrarse en la sangre/plasma u otro
fluido corporal. La muestra de prueba es convenientemente una muestra de sangre, frotis bucal, biopsia u otro fluido corporal o tejido obtenido de un individuo. Los ejemplos particulares incluyen: células cancerosas circulantes, ADN circulante en el plasma o suero, células aisladas del líquido de ascitis de pacientes con cáncer de ovario, esputo pulmonar para pacientes con cánceres dentro del pulmón, un aspirado con aguja fina de un paciente con cáncer de mama, orina, sangre periférica sangre, un raspado celular, un folículo piloso, un disco de piel o una muestra bucal.
Se apreciará que la muestra de prueba puede ser igualmente una secuencia de ácido nucleico correspondiente a la secuencia en la muestra de prueba, es decir, que toda o una parte de la región en el ácido nucleico de la muestra puede amplificarse en primer lugar usando cualquier técnica conveniente, por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), antes del análisis. El ácido nucleico puede ser ADN genómico o ARN de células completas o fraccionado. En aspectos particulares, el ARN es ARN de células completas y se usa directamente como molde para marcar un ADNc de la primera hebra usando cebadores aleatorios o cebadores poliA. El ácido nucleico o la proteína en la muestra de prueba puede extraerse de la muestra de acuerdo con metodologías convencionales (véase Green & Sambrook, Eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2012, 4a edición, vol. 1-3, ISBN 9781936113422), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.).
Los métodos de diagnóstico de la invención pueden realizarse usando una muestra previamente tomada del individuo o paciente. Tales muestras pueden conservarse congeladas o fijadas e incrustadas en formalina-parafina u otros medios. Alternativamente, puede obtenerse y usarse una muestra fresca que contiene células cancerosas.
Los métodos dados a conocer en esta memoria descriptiva pueden aplicarse usando células de cualquier cáncer adecuado. En el presente documento se describen cánceres adecuados para el tratamiento.
Prevalencia de mutaciones
Se encuentran ampliamente mutaciones en PIK3CA en tumores clínicos, pero la prevalencia de las mutaciones en cada gen varía significativamente según el tipo de tejido tumoral. Por ejemplo, las mutaciones de PIK3CA son relativamente comunes en cáncer de mama pero relativamente raras en tumores de riñón (tabla 2).
Tabla 2: Prevalencia de mutaciones de PIK3CA en muestras clínicas. La fuente de información de PIK3CA es la base de datos COSMIC (versión v62). Los métodos de selección de pacientes de la divulgación pueden ser particularmente útiles en los segmentos de enfermedad (tejido) donde hay una alta incidencia de mutaciones de PIK3CA (por ejemplo mama, vías urinarias, endometrio, intestino grueso, cuello uterino, etc.).
Se encuentran ampliamente mutaciones en AKT1 y AKT2 en tumores clínicos, variando la prevalencia de las mutaciones según el tipo de tejido tumoral (tablas 3 y 4).
Tabla 3. Prevalencia de mutaciones de AKT1 en cohortes clínicas de cáncer. Los métodos de selección de pacientes de la divulgación pueden ser particularmente útiles en los segmentos de enfermedad (tejido) donde hay una alta incidencia de mutaciones de AKT1.
Tabla 4. Prevalencia de mutaciones de AKT2 en cohortes clínicas de cáncer. Los métodos de selección de pacientes de la divulgación pueden ser particularmente útiles en los segmentos de enfermedad (tejido) donde hay una alta incidencia de mutaciones de AKT2.
Se encuentran mutaciones en MAP3K1 en muchos tipos de cáncer incluidos cánceres de mama, de estómago y uterino (tabla 5). Aunque la prevalencia en todos los estudios de cáncer de mama combinados es de alrededor del 6 %, puede ser mayor en tipos específicos de cáncer de mama. Por ejemplo, el 75 % de las alteraciones observadas en cáncer de mama se encuentran en cáncer luminal A, negativo para HER2/ER+ donde la prevalencia de mutaciones de MAP3K1 puede estar entre el 11 % y el 16 %.
Tabla 5: Prevalencia de mutaciones de MAP3K1 en muestras clínicas. La fuente de información de MAP3K1 es la base de datos cBioPortal. Los métodos de selección de pacientes de la divulgación pueden ser particularmente útiles en los segmentos de enfermedad (tejido) donde hay una alta incidencia de mutaciones de MAP3K1.
Se encuentran mutaciones en MAP2K4 en muchos tipos de cáncer incluidos de mama, colon, páncreas y estómago (tabla 6). Aunque la prevalencia en todos los estudios de cáncer de mama combinados es de alrededor del 3 %, puede ser mayor en tipos específicos de cáncer de mama. Por ejemplo, el 75 % de las alteraciones observadas en cáncer de mama se encuentran en cáncer luminal A, negativo para HER2/ER+ donde la prevalencia de mutaciones de MAP2K4 puede estar entre el 8 % y el 10 %.
Tabla 6: Prevalencia de mutaciones de MAP2K4 en muestras clínicas. La fuente de información de MAP2K4 es la base de datos cBioPortal. Los métodos de selección de pacientes de la divulgación pueden ser particularmente útiles en los segmentos de enfermedad (tejido) donde hay una alta incidencia de mutaciones de MAP2K4.
Tal como resultará evidente para cualquier experto en la técnica, estos datos de frecuencia se refinan y actualizan continuamente a medida que surgen datos nuevos y más completos de los consorcios de obtención del perfil del genoma del cáncer humano tales como el TCGA (The Cancer Genome Atlas) y el ICGC (International Cancer Genome Consortium). Por tanto, pueden identificarse tipos de tumores adicionales con dependencia de PIK3CA o AKT y dependencia de MAP3K1 y/o MAP2K4 y ser eligibles para el tratamiento con inhibidores de componentes aguas arriba de la ruta de PI3K, tales como inhibidores de PI3K-a o inhibidores de AKT, tal como se describe en el presente documento.
Indicaciones relevantes
Cuando se indica el tratamiento del cáncer, debe entenderse que esto puede referirse a la prevención de metástasis y el tratamiento de metástasis, es decir, la propagación del cáncer. Por tanto, los métodos dados a conocer en el presente documento podrían usarse para tratar a un paciente que no tiene metástasis para evitar que se produzcan, o para alargar el período de tiempo antes de que se produzcan, y a un paciente que ya tiene metástasis para tratar las propias metástasis. Además, el tratamiento del cáncer puede referirse al tratamiento de un tumor o tumores primarios establecidos y al desarrollo de un tumor o tumores primarios.
Por tanto, en un aspecto, el tratamiento del cáncer se refiere a la prevención de las metástasis.
En otro aspecto, el tratamiento del cáncer se refiere al tratamiento de las metástasis.
En otro aspecto, el tratamiento del cáncer se refiere al tratamiento de un tumor o tumores primarios establecidos o al desarrollo de un tumor o tumores primarios.
En el presente documento, el tratamiento del cáncer puede referirse a la prevención del cáncer en sí.
En un aspecto, cuando se hace referencia al cáncer, puede hacerse referencia a tumores que son sensibles a la inhibición de componentes aguas arriba de la ruta de PI3K que están implicados en las etapas de transducción de señales que conducen a la proliferación, supervivencia, invasividad y capacidad migratoria de las células tumorales.
En un aspecto, el cáncer es uno que porta una mutación en un componente aguas arriba de la ruta de PI3K, tal como el gen de PIK3CA o AKT.
En un aspecto, el cáncer es uno que muestra dependencia de PIK3CA o dependencia de AKT, basándose en una mutación, amplificación u otra aberración.
En un aspecto, el cáncer se selecciona de cáncer de mama, cáncer gástrico, cáncer de esófago, cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de endometrio, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de vulva, mieloma múltiple, linfoma, leucemia, cáncer de vejiga, cáncer de cerebro, cáncer colorrectal, cáncer de vesícula biliar, cáncer del conducto biliar, cáncer de piel, cáncer pancreático, cáncer testicular, cáncer de tiroides, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de vulva, cáncer de pene y otros cánceres dependientes de PI3-cinasa.
En un aspecto, el cáncer es cáncer de mama.
En un aspecto, el cáncer es cáncer de mama positivo para el receptor de estrógenos.
En un aspecto, el cáncer es cáncer de mama luminal positivo para el receptor de estrógenos.
En un aspecto, el cáncer es cáncer de mama luminal A positivo para el receptor de estrógenos.
En un aspecto, el cáncer está en un estado metastásico.
En un aspecto, el cáncer está en un estado no metastásico.
Métodos para la detección de ácidos nucleicos
La detección de componentes aguas arriba mutantes de la ruta de PI3K (tales como PIK3CA o AKT) y de ácidos nucleicos de MAP3K1 o MAP2K4 mutantes puede emplearse, en el contexto de la presente invención, para predecir la respuesta al tratamiento farmacológico. Puesto que se producen mutaciones en estos genes al nivel del ADN, los métodos de la invención pueden basarse en la detección de mutaciones o variaciones en el ADN genómico, así como los propios transcritos y proteínas. Puede ser deseable confirmar mutaciones en el ADN genómico mediante el análisis de transcritos y/o polipéptidos, con el fin de garantizar que la mutación detectada se expresa de hecho en el sujeto.
Resultará evidente para el experto en la técnica que hay un gran número de procedimientos analíticos que pueden usarse para detectar la presencia o ausencia de nucleótidos variantes en una o más posiciones de un gen. En general, la detección de variación alélica requiere una técnica de discriminación de mutaciones, opcionalmente una reacción de amplificación (tal como una basada en la reacción en cadena de la polimerasa) y opcionalmente un sistema de generación de señales. Existe una multitud de técnicas de detección e mutaciones disponibles en la técnica y pueden usarse en combinación con un sistema de generación de señales, del cual hay numerosos disponibles en la técnica. Se revisan muchos métodos para la detección de variación alélica por Nollau et al., Clin. Chem., 1997, 43, 1114-1120; Anderson SM. Expert Rev Mol Diagn., 2011, 11, 635-642; Meyerson M. et al., Nat Rev Genet., 2010, 11, 685-696; y en libros de texto convencionales, por ejemplo "Laboratory Protocols for Mutation Detection", Ed. por U. Landegren, Oxford University Press, 1996 y "PCR", 2a edición por Newton & Graham, BIOS Scientific Publishers Limited, 1997.
Tal como se indicó anteriormente, la determinación de la presencia o ausencia de una variación particular o pluralidad de variaciones en el gen de PIK3CA en un paciente con cáncer puede realizarse de una variedad de modos. Tales pruebas se realizan comúnmente usando ADN o ARN recogido de muestras biológicas, por ejemplo, biopsias de tejido, orina, heces, esputo, sangre, células, raspados de tejido, aspirados de mama u otros materiales celulares, y pueden realizarse mediante una variedad de métodos incluidos, pero sin limitarse a, PCR, hibridación con sondas específicas de alelo, detección de mutaciones enzimáticas, escisión química de apareamientos erróneos, espectrometría de masas o secuenciación de ADN, incluida la minisecuenciación.
Las técnicas de detección de mutaciones adecuadas incluyen el sistema de mutación refractario a la amplificación (ARMS™), extensión lineal del sistema de mutación refractario a la amplificación (ALEX™), sistema de cebado de oligonucleótidos competitivo (COPS), Taqman, balizas moleculares, polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) y PCR basada en sitios de restricción y técnicas de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET).
El experto en la técnica será consciente de que pueden usarse técnicas similares a las descritas anteriormente para detectar mutaciones en los genes de AKT y/o MAP3K1/MAP2K4. En aspectos particulares, el método empleado para determinar el/los nucleótido(s) dentro de un gen biomarcador se selecciona de: amplificación específica de alelo (PCR específica de alelo), tal como el sistema de mutación refractario a la amplificación (ARMS), secuenciación, ensayo de discriminación alélica, hibridación, polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) o ensayo de ligamiento de oligonucleótidos (OLA).
En aspectos particulares, la hibridación con sondas específicas de alelo puede realizarse mediante: (1) oligonucleótidos específicos de alelo unidos a una fase sólida (por ejemplo, membranas de vidrio, silicio, nailon) con la muestra marcada en disolución, por ejemplo, como en muchas aplicaciones de chips de ADN; o (2) muestra unida (a menudo ADN clonado o ADN amplificado por PCR) y oligonucleótidos marcados en disolución (o bien específicos de alelo o bien cortos para permitir la secuenciación por hibridación). Las pruebas de diagnóstico pueden implicar un panel de variaciones, a menudo sobre un soporte sólido, lo que permite la determinación simultánea de más de una variación. Tales sondas de hibridación se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, Green & Sambrook, Eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2012, 4a edición, vol. 1-3, ISBN 9781936113422), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) y pueden abarcar dos o más sitios de variación.
Por tanto, en un aspecto, la detección de la presencia o ausencia de al menos una mutación proporciona la puesta en contacto del ácido nucleico de PIK3CA o AKT y/o el ácido nucleico de MAP3K1 y MAP2K4 que contiene un sitio de mutación supuesto con al menos una sonda de ácido nucleico. La sonda se hibrida preferentemente con una secuencia de ácido nucleico que incluye un sitio de variación y que contiene bases de nucleótidos complementarias en el sitio de variación en condiciones de hibridación selectivas. La hibridación puede detectarse con un marcador detectable usando marcadores conocidos por los expertos en la técnica. Tales marcadores incluyen, pero no se limitan a, marcadores radiactivos, fluorescentes, colorantes y enzimáticos.
En otro aspecto, la detección de la presencia o ausencia de al menos una mutación proporciona la puesta en contacto del ácido nucleico de PIK3CA o AKT y/o el ácido nucleico de MAP3K1 y MAP2K4 que contiene un sitio de mutación supuesto con al menos un cebador de ácido nucleico. El cebador se hibrida preferentemente con una secuencia de ácido nucleico que incluye un sitio de variación y que contiene bases de nucleótidos complementarias en el sitio de variación en condiciones de hibridación selectivas.
Los oligonucleótidos usados como cebadores para la amplificación específica pueden portar la base de nucleótido complementaria a la mutación de interés en el centro de la molécula (de modo que la amplificación depende de la hibridación diferencial; véase, por ejemplo, Gibbs, et al., 1989. Nucl. Acids Res., 17, 2437-248) o en el extremo 3'-terminal de un cebador donde, en condiciones apropiadas, el apareamiento erróneo puede impedir o reducir la extensión por la polimerasa (véase, por ejemplo, Prossner, 1993, Tibtech, 11238).
En aún otro aspecto, la detección de la presencia o ausencia de al menos una mutación comprende secuenciar al menos una secuencia de ácido nucleico y comparar la secuencia obtenida con la secuencia de ácido nucleico de tipo natural conocida.
Alternativamente, la presencia o ausencia de al menos una mutación comprende la determinación por espectrometría de masas de al menos una secuencia de ácido nucleico.
En un aspecto, la detección de la presencia o ausencia de al menos una variación de ácido nucleico comprende realizar una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La secuencia de ácido nucleico diana que contiene la variación hipotética se amplifica y se determina la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico amplificado. Determinar la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico amplificado comprende secuenciar al menos un segmento de ácido nucleico. Alternativamente, los productos de amplificación pueden analizarse usando cualquier método capaz de separar los productos de amplificación según su tamaño, incluida la electroforesis en gel automática y manual, y similares.
Se detectan mutaciones en el ácido nucleico genómico ventajosamente mediante técnicas basadas en el cambio de movilidad en fragmentos de ácido nucleico amplificados. Por ejemplo, Chen et al., Anal Biochem 1996, 239, 61-9, describen la detección de mutaciones de una sola base mediante un ensayo de cambio de movilidad competitivo. Además, están disponibles comercialmente ensayos basados en la técnica de Marcelino et al., BioTechniques 1999, 26, 1134-1148.
En un ejemplo particular, puede usarse análisis de heterodúplex capilar para detectar la presencia de mutaciones basándose en el cambio de movilidad de ácidos nucleicos dúplex en sistemas capilares como resultado de la presencia de apareamientos erróneos.
La generación de ácidos nucleicos para el análisis a partir de muestras generalmente requiere la amplificación de ácidos nucleicos. Muchos métodos de amplificación se basan en una reacción enzimática en cadena (tal como una reacción en cadena de la polimerasa, una reacción en cadena de la ligasa o una replicación de secuencia autosostenida) o en la replicación de todo o parte del vector en el que se ha clonado. Preferiblemente, la amplificación según la invención es una amplificación exponencial, tal como se muestra, por ejemplo, en la reacción en cadena de la polimerasa.
En la bibliografía se han descrito muchos métodos de amplificación de dianas y señales, por ejemplo, revisiones generales de estos métodos en Landegren, U. , et al., Science, 1988242, 229-237 y Lewis, R., Genetic Engineering News 1990, 10, 54-55. Estos métodos de amplificación pueden usarse en los métodos de la invención e incluyen reacción en cadena de la polimerasa (PCR), PCR in situ, reacción de amplificación de la ligasa (LAR), hibridación de la ligasa, replicasa de bacteriófago Qp, sistema de amplificación basado en transcripción (TAS), amplificación genómica con secuenciación de transcritos (GAWTS), amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA) e hibridación in situ. Pueden
prepararse cebadores adecuados para su uso en diversas técnicas de amplificación de acuerdo con métodos conocidos en la técnica.
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un método de amplificación de ácidos nucleicos descrito, entre otros, en las patentes estadounidenses n.os 4.683.195 y 4.683.202. La PCR consiste en ciclos repetidos de reacciones de extensión de cebadores generadas por ADN polimerasa. El ADN diana se desnaturaliza por calor y se hibridan dos oligonucleótidos, que agrupan la secuencia diana en hebras opuestas del ADN que va a amplificarse. Estos oligonucleótidos se convierten en cebadores para su uso con la ADN polimerasa. El ADN se copia mediante la extensión del cebador para hacer una segunda copia de ambas cadenas. Repitiendo el ciclo de desnaturalización por calor, hibridación de cebadores y extensión, el a Dn diana puede amplificarse un millón de veces o más en de aproximadamente dos a cuatro horas. La PCR es una herramienta de biología molecular que debe usarse junto con una técnica de detección para determinar los resultados de la amplificación. Una ventaja de la PCR es que aumenta la sensibilidad al amplificar la cantidad de ADN diana entre 1 millón y 1000 millones de veces en aproximadamente 4 horas. La PCR puede usarse para amplificar cualquier ácido nucleico conocido en un contexto de diagnóstico (Mok et al., Gynaecologic Oncology, 1994, 52: 247-252).
También puede usarse una técnica de amplificación específica de alelo tal como el sistema de mutación refractario a la amplificación (ARMS™) (Newton et al., Nucleic Acids Res., 1989, 17, 2503-2516) para detectar mutaciones de una sola base. En las condiciones apropiadas de amplificación por PCR, un apareamiento erróneo de una sola ase ubicado en el extremo 3' del cebador es suficiente para la amplificación preferente del alelo perfectamente coincidente (Newton et al., 1989, citado anteriormente), permitiendo la discriminación de especies estrechamente relacionadas. La base de un sistema de amplificación que usa los cebadores descritos anteriormente es que los oligonucleótidos con un residuo en 3' apareado de manera errónea no funcionarán como cebadores en la PCR en condiciones apropiadas. Este sistema de amplificación permite el genotipado únicamente mediante la inspección de mezclas de reacción tras la electroforesis en gel de agarosa.
El análisis de los productos de amplificación puede realizarse usando cualquier método capaz de separar los productos de amplificación según su tamaño, incluida la electroforesis en gel automática y manual, espectrometría de masas, y similares.
Los métodos de aislamiento, amplificación y análisis de ácidos nucleicos son rutinarios para un experto en la técnica y pueden encontrarse ejemplos de protocolos en, por ejemplo, Green & Sambrook, Eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2012, 4a edición, vol. 1-3, ISBN 9781936113422), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) Una fuente de protocolo particularmente útil para métodos usados en la amplificación por PCR es PCR (Basics: From Background to Bench) por M. J. McPherson, S. G. Mailer, R. Beynon, C. Howe, Springer Verlag; 1a edición (15 de octubre de 2000), ISBN: 0387916008.
La presente memoria descriptiva también describe kits predictivos y de diagnóstico que comprenden cebadores degenerados para amplificar un ácido nucleico diana en el gen de PIK3CA o gen de AKT, y/o el gen de MAP3K1 y gen de MAP2K4 e instrucciones que comprenden: protocolo de amplificación y análisis de los resultados. Alternativamente, el kit también puede comprender tampones, enzimas y recipientes para realizar la amplificación y el análisis de los productos de amplificación. El kit también puede ser un componente de un kit de cribado o diagnóstico que comprende otras herramientas tales como micromatrices de ADN u otros soportes. Preferiblemente, el kit también proporciona uno o más moldes de control, tales como ácidos nucleicos aislados de una muestra de tejido normal y/o una serie de muestras que representan diferentes variaciones en los genes de referencia.
En un aspecto, el kit proporciona dos o más pares de cebadores, cada par capaz de amplificar una región diferente del gen de referencia (PIK3CA o AKT, y/o MAP3K1 y MAP2K4) (cada región un sitio de posible variación) proporcionando de ese modo un kit para el análisis de la expresión de varias variaciones génicas en una muestra biológica en una reacción o varias reacciones paralelas.
Los cebadores en los kits pueden estar marcados, por ejemplo, marcados con fluorescencia, para facilitar la detección de los productos de amplificación y el consiguiente análisis de las variaciones de ácido nucleico. El kit también puede permitir que se detecte más de una variación en un análisis. Por tanto, un kit de combinación comprenderá cebadores capaces de amplificar diferentes segmentos del gen de referencia. Los cebadores pueden estar marcados diferencialmente, por ejemplo, usando diferentes marcadores fluorescentes, para diferenciar las variaciones.
También se da a conocer el uso de kits para la detección de mutaciones de PIK3CA o AKT y/o MAP3K1 y MAP2K4, incluidos, pero sin limitarse a, kits de detección de mutaciones de PIK3CA y kits de detección de mutaciones de AKT que se comercializan actualmente.
Para todos los aspectos anteriores, las formas mutantes de PIK3CA determinadas/identificadas están en todas las posiciones del gen.
Para todos los aspectos anteriores, usando tumores tales como cáncer de mama como ejemplo, las formas mutantes particulares de PIK3CA determinadas/identificadas son aquellas en las posiciones R38, R88, N345, C420, E453, P539, E542K, E545K, Q546, M1043, M1043 y H1047R.
Para todos los aspectos anteriores, usando tumores tales como cáncer de mama como ejemplo, las formas mutantes particulares de PIK3CA determinadas/identificadas son aquellas en las posiciones E542, E545 y H1047.
Para todos los aspectos anteriores, las formas mutantes de AKT determinadas/identificadas están en todas las posiciones del gen.
Para todos los aspectos anteriores, usando tumores tales como cáncer de mama como ejemplo, las formas mutantes particulares de AKT determinadas/identificadas son aquellas en las posiciones E17K, L52R, C77F y Q79K.
Para todos los aspectos anteriores, usando tumores tales como cáncer de mama como ejemplo, una forma mutante particular de AKT determinada/identificada está en las posiciones E17K.
Para todos los aspectos anteriores, las formas mutantes de MAP3K1 determinadas/identificadas están en todas las posiciones del gen.
Para todos los aspectos anteriores, las formas mutantes de MAP3K1 determinadas/identificadas son aquellas formas caracterizadas por una mutación que conduce a una detención prematura de la traducción.
Para todos los aspectos anteriores, las formas mutantes de MAP3K1 determinadas/identificadas son aquellas formas caracterizadas por mutaciones que conducen a pérdida de función.
Para todos los aspectos anteriores, las formas mutantes de MAP3K1 determinadas/identificadas son aquellas formas caracterizadas por una mutación que conduce a un cambio no sinónimo en la secuencia codificante.
Para todos los aspectos anteriores, las formas mutantes de MAP3K1 determinadas/identificadas son aquellas en las posiciones R273fs*27. I761fs*35, S431* y S1344*.
Para todos los aspectos anteriores, las formas mutantes de MAP2K4 determinadas/identificadas están en todas las posiciones del gen.
Para todos los aspectos anteriores, las formas mutantes de MAP2K4 determinadas/identificadas son aquellas formas caracterizadas por una mutación que conduce a una detención prematura de la traducción.
Para todos los aspectos anteriores, las formas mutantes de MAP2K4 determinadas/identificadas son aquellas formas caracterizadas por mutaciones que conducen a pérdida de función.
Para todos los aspectos anteriores, las formas mutantes de MAP2K4 determinadas/identificadas son aquellas formas caracterizadas por una mutación que conduce a un cambio no sinónimo en la secuencia codificante.
Para todos los aspectos anteriores, las formas mutantes de MAP2K4 determinadas/identificadas son aquellas en las posiciones R273fs*27. I761fs*35, S431* y S1344*.
A lo largo de esta memoria descriptiva, se hace referencia al estado genético de los componentes aguas arriba de la ruta de PI3K. Para evitar dudas, cuando se describa cualquier aspecto particular que abarque componentes aguas arriba de la ruta de PI3K, se proporcionan aspectos adicionales que abarcan el estado de los genes de PI3K (incluidos los genes de PIK3CA, PIK3CB, PIK3CD y PIK3CD), el estado de las isoformas de AKT (incluidos los genes de AKT1, AKT2 y AKT3), el estado del gen de PTEN, el estado del gen de PDK1, el estado del gen de SGK, el estado del gen de INPP4B, el estado del gen de INPP5D, el estado del gen de PIK3R1 y estado del gen de PIK3R2. Un aspecto adicional particular es cualquiera de los aspectos descritos en el presente documento, en el que solo se abarca el estado del gen de PIK3CA. Un aspecto adicional particular es además cualquiera de los aspectos descritos en el presente documento, en el que solo se abarca el estado del gen de AKT.
De manera similar, y también para evitar dudas, cuando se describe un aspecto particular que abarca tanto los genes de MAP3K1 como de MAP2K4, se proporciona un aspecto adicional que abarca el estado del gen de MAP3K1 solamente, y otro aspecto que abarca el estado del gen de MAP2K4 solamente.
Además, y también para evitar dudas, cuando se hace referencia dentro de esta memoria descriptiva al gen de AKT, entonces un aspecto adicional es el gen seleccionado de AKT1 y AKT2. Un aspecto todavía adicional, el gen es sólo el gen de AKT 1. En otro aspecto aún adicional, el gen es sólo el gen de AKT2.
Además, a lo largo de esta memoria descriptiva, se hace referencia a inhibidores de un componente corriente arriba de la ruta de PI3K. Para evitar dudas, cuando se describe un aspecto particular que abarca un inhibidor de un componente
aguas arriba de la ruta de PI3K, se proporcionan aspectos adicionales que abarcan inhibidores de isoformas de PI3K (tales como inhibidores de PI3K-a, PI3K-p y PI3K-6) y aspectos adicionales que abarcan inhibidores de isoformas de AKT (incluidos los inhibidores de AKT1, AKT2, AKT1/2 y AKT3).
En un aspecto todavía adicional, cuando se hace referencia a un inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K, dicho inhibidor se selecciona de un inhibidor de PI3K-a y un inhibidor de AKT.
De manera similar, cuando cualquier aspecto particular abarque la selección de un inhibidor de un inhibidor de PI3K-a y un inhibidor de AKT, se proporciona un aspecto adicional en el que dicho inhibidor es sólo un inhibidor de PI3K-a, y un aspecto adicional en el que dicho inhibidor es un sólo un inhibidor de AKT.
Además, y también para evitar dudas, siempre que en esta memoria descriptiva se haga referencia a un inhibidor de PI3K-a, entonces se proporciona un aspecto adicional en el que dicho inhibidor es 1-(4-(5-(5-amino-6- (5-terc-butil-1,3,4-oxadiazol-2-il)pirazin-2-il)-1 -etil-1H-1,2,4-triazol-3-il)piperidin-1-il) -3-hidroxipropan-1-ona (compuesto A).
Además, y para evitar dudas, cuando se hace referencia dentro de esta memoria descriptiva a un inhibidor de AKT, entonces un aspecto adicional es un inhibidor de una isoforma de AKT seleccionada de AKT1 y AKT2. En un aspecto adicional, el inhibidor es un inhibidor doble de las isoformas AKT1/2. En un aspecto todavía adicional, el inhibidor es un inhibidor de la isoforma AKT1 solamente. En un aspecto adicional, el inhibidor es un inhibidor de la isoforma AKT2 solamente.
Además, y también para evitar dudas, siempre que en esta memoria descriptiva se haga referencia a un inhibidor de AKT, entonces se proporciona un aspecto adicional en el que dicho inhibidor es 4-amino-W-[(1S)-1-(4-clorofenil)-3-hidroxipropil]-1-(7H—pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperidin-4-carboxamida (compuesto B).
Ejemplos
Abreviaturas usadas en los protocolos experimentales:
PIP2:
PI(4,5)P2, fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato
s.c.:
Por vía subcutánea
ATP:
Adenosín trifosfato
DMSO:
Dimetilsulfóxido
TRIS:
T ris(Hidroximetil)aminometano
CHAPS:
3-[(3-Colamidopropil)dimetilamonio]-1 -propanosulfonato
DTT:
Ditiotreitol
FBS:
Suero bovino fetal
DMEM:
Medio de Eagle modificado por Dulbecco
EDTA:
Ácido etilendiaminotetraacético
EGTA:
Ácido etilenglicoltetraacético
BSA:
Albúmina sérica bovina
PBS:
Solución salina tamponada con fosfato
HRP:
Peroxidasa del rábano
RPMI:
Medio Roswell Park Memorial Institute 1640
4NQO:
N-Óxido de 4-nitroquinolina
EMEM:
Medio esencial mínimo de Eagle
CO2:
Dióxido de carbono
PBST:
Solución salina tamponada con fosfato / Tween
Ac:
Anticuerpo
Reactivo MTS:
[3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio, sal interna; MTS] y un reactivo de acoplamiento de electrones (metosulfato de fenazina) PMS.
Ejemplo 1: Análisis de mutaciones de líneas celulares conocidas para el perfil doble muíante de PIK3CA-MAP3K1.
Con el fin de someter a prueba el impacto de la pérdida de función de MAP3K1 sobre la sensibilidad de células tumorales a inhibidores de la ruta de PI3K en un acervo mutante para PIK3CA, se llevó a cabo una encuesta exhaustiva de las mutaciones identificadas en muestras clínicas y las presentes en líneas celulares disponibles en el dominio público. Ninguna de estas líneas celulares tenía un perfil genético que coincidiera con el perfil doble mutante de PIK3CA-MAP3K1 deseado. Las únicas líneas celulares encontradas que contenían mutaciones de PIK3CA y MAP3K1 también contenían deleciones en otros genes, lo que confundiría posiblemente los resultados y daría lugar a la posibilidad de efectos inespecíficos no deseados (Figura 1).
Ejemplo 2: Generación de líneas celulares que contienen tanto mutaciones de PIK3CA como de MAP3K1 y análisis del efecto de la pérdida de expresión de MAP3K1 sobre la actividad de inhibidores de componentes aguas arriba de la ruta de PI3K.
En ausencia de líneas celulares disponibles, se generaron modelos de líneas celulares reproduciendo las mutaciones de PIK3CA y la inactivación de MAP3K1 mediante dos métodos: en primer lugar, mediante la inactivación transitoria de la expresión de MAP3K1 por medio de transfección de ARNip (Figura 2A); y en segundo lugar, induciendo de manera permanente inserciones o deleciones en el gen de MAP3K1 usando tecnología de edición génica precisa (Figura 2B).
Independientemente del enfoque, la inactivación de MAP3K1 en el contexto de líneas celulares mutantes para PIK3CA da como resultado niveles potenciados de pAKT (T308).
Método 1: Inactivación transitoria de la expresión de de MAP3K1 por medio de transfección de ARNip
Las células MCF7 se derivan de cáncer de mama humano. Se caracterizan por expresar receptor de estrógenos (ER) y carecer de expresión de HER2, un receptor de factor de crecimiento de la familia de EGFR. Por estos motivos, esta línea celular se considera un modelo aceptable para cáncer de mama luminal ER+/HER2-. Una segunda línea celular, T47D, tiene características similares. Además, las células MCF7 y T47D portan una mutación de "punto caliente" en el gen de PIK3CA y están entre las más sensibles a tanto la viabilidad como la inhibición de la ruta tras el tratamiento con compuestos selectivos para la isoterma PI3Ka. MCF7 porta la mutación c.1633G>A (p.E545K) y T47D porta la mutación c.3140A>G (p.H1047R).
Se sometieron a prueba varias fuentes de dúplex de ARNip comercialmente disponibles (Sigma, Dharmacon y QIAGEN) para determinar la inactivación eficaz de MAP3K1 monitorizando la expresión de la proteína de longitud completa mediante inmunotransferencia de tipo Western. Tras la selección de los dúplex de ARNip con mejor rendimiento, se trataron las células con el compuesto A inhibidor selectivo de PI3Ka con o sin la inactivación previa de MAP3K1 mediada por ARNip. Debido a la naturaleza transitoria del efecto de inactivación de ARNip, no eran viables ensayos de viabilidad celular.
Protocolo para la interferencia de ARN (iARN) y transfecciones de plásmidos.
Las células se transfectaron de manera transitoria usando Lipofectamine RNAiMax (Invitrogen) y FuGENE HD (Roche). Se transfectaron ARNip de MAP3K1 ON-TARGETplus y control negativo mezclado adquirido de Dharmacon hasta una concentración final de 40 nM. Las transfecciones de plásmidos se realizaron usando 10 ug de ADN mezclado con 15 ul de Fugene HD y se incubaron durante 24 y 48 h.
Protocolo para la medición de AKT fosforilado (T308) en células MCF7, T47D.
Se obtuvieron células MCF7 y T47D de bajo número de pases de AZ Cell Bank Collection y se cultivaron tal como se describió anteriormente (Avivar-Valderas et al., MCB, 31(17):3616-29, 2011). Horizon Discovery proporcionó MCF10A-PI3KaH1047R y de tipo natural.
Después del cultivo, se lisaron las células y se analizó la proteína mediante inmunotransferencia (IB) (Avivar-Valderas et al., MCB, 31(17):3616-29, 2011). Se sometieron las membranas a transferencia usando anticuerpos contra MAP3K1 (Santa Cruz) fosfo AKT (Thr308) (Cell Signaling Technology) y vinculina (Sigma). Se detectaron los anticuerpos unidos con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa del rábano (HRP) y ensayos de quimioluminiscencia (Avivar-Valderas et a l, MCB, 31(17):3616-29, 2011).
Método 2: Generación de inserciones o deleciones en el gen de MAP3K1
Con el fin de someter a prueba el efecto de la inactivación de MAP3K1 e imitar las mutaciones encontradas en tumores de mama humanos, se utilizó tecnología de edición génica precisa en AstraZeneca Suecia para generar inserciones o deleciones en el gen de MAP3K1 con el fin de inactivar su expresión. Tras la transfección de MCF7 y MCF10A-PI3KaH1047R con los constructos deseados, se seleccionaron células individuales mediante clasificación celular y se cultivaron como clones. Los clones mutantes de MCF7 fueron MCF7-CR1 y MCF7-CR2. Los clones mutantes generados en células MCF10A-PI3KaH1047R fueron MCF10A-H1047R-CR1 y MCF10A-H1047R-CR2.
Protocolo para la generación y validación de clones mutantes para MAP3K1.
Se diseñaron ARNg usando procedimientos descritos anteriormente (Doudna et al., Science 346, (6213):1258096, 2014; Ran et al., Cell 154, 1380-9, 2013; Tsai et al., Nature Biotechnology, 32, 569-576, 2014). Se subclonaron ARNg que seleccionan como diana el locus de MAP3K1 en el vector codificante gRNA-Cas9-GFP y se confirmó la secuencia posteriormente. Se transfectaron de manera transitoria las células usando FuGENE HD (Roche) y se clasificaron por fluorescencia verde (GFP). Se seleccionaron cultivos monoclonales mediante dilución limitante.
Se aisló ADN genómico a partir de clones expandidos usando el kit de QIAGEN. Se realizaron reacciones PCR para amplificar la región seleccionada como diana usando ADN polimerasa Fusion Flash (Fermentas). Se desnaturalizaron directamente 10 pl de productos de PCR (95 °C, 10 min), se hibridaron (-0,1 °C por 1 s) y se trataron con enzima Cell (Recombinetic). Se analizaron los productos digeridos usando electroforesis en gel de acrilamida al 10 %.
Secuenciación de Sanger de ADN genómico mutado: Los mismos productos de PCR usados para el ensayo Cell se clonaron con Topo (Life Technologies) y se aisló ADN de plásmido de al menos 5 clones individuales por muestra y se secuenció usando un cebador inverso M13.
Ejemplo 2A
Se examinó el efecto de la pérdida de expresión de MAP3K1 sobre la actividad farmacológica del compuesto A usando las líneas celulares generadas por medio de transfección de ARNip monitorizando el nivel de inhibición de lecturas de señalización aguas abajo de PI3Kalfa. Una lectura importante de la ruta es la fosforilación de AKT en la treonina 308. Esta fosforilación la lleva a cabo PDK1, activada ella misma por PIP3 generado por PI3K (fosfatidilinositol 3,4,5-trisfosfato). Lecturas adicionales de la ruta son fosforilación de PRAS40 (sustrato de AKT1 rico en prolina) en Thr246. Esta fosforilación permite la activación del complejo mTORC1 y la activación de p70S6K dando como resultado una fosforilación potenciada de la proteína ribosómica S6. Se monitorizó el impacto de la inhibición selectiva de PI3Kalfa por el compuesto A en MCF7 y t 47D, que se ha mostrado que es dependiente de esta isoforma para la activación de la ruta y la supervivencia (Fritsch et al., MCT, 10:1158/1535-7163, 2014). Se ha mostrado que las células MCF7 tienen un alto nivel basal de actividad de la ruta de PI3K atribuida a la mutación E545K de punto caliente activante.
El tratamiento con compuesto A 250 nM durante 24 horas condujo a una profunda reducción de la fosforilación de AKT en Thr308 en células de control previamente tratadas con un dúplex de ARNip de control inactivo sobre ARNm de MAP3K1 (Figura 2A). En cambio, la inactivación por ARNip de MAP3K1 condujo a un mayor nivel basal de la señal de pAKT-Thr308 (aumento de ~10 veces (MCF7) y ~2,3 veces (T47D) (Figura 2A).
Ejemplo 2B
La actividad de la ruta se evaluó también usando las líneas celulares deficientes en MAP3K1 seleccionadas generadas usando tecnología de edición génica precisa (clones de MCF7 CR1.4 y CR2.5). Tal como se observó anteriormente usando inactivación por ARNip de MAP3K1, la inactivación del gen condujo a pérdida de expresión de ARNm y proteína de MAP3K1. Tal como se observó anteriormente, la pérdida de MAP3K1 dio como resultado un aumento del nivel basal de pAKT en Thr308. Además, la inhibición de la señalización de PI3K usando el compuesto A fue menos pronunciada basándose en su efecto sobre pAKT en Thr308 evaluada mediante inmunotransferencia de tipo Western (Figura 2B).
Ejemplo 3: Ensayos de proliferación para determinar la tasa de crecimiento y sensibilidad al compuesto A y compuesto B de líneas celulares deficientes en MAP3K1 frente a parentales.
Siguiendo los protocolos y métodos descritos en el ejemplo 2, se comparó el impacto de la deleción de MAP3K1 sobre la sensibilidad al compuesta A con el compuesto B y el inhibidor de AKT de Genentech GDC-0068 usando líneas celulares mutantes para PIk 3c A.
Líneas celulares MCF7 de control (parental) y deficientes en MAP3K1 (CR2.5) cultivadas en medio de crecimiento completo y tratadas con compuesto A, compuesto B y GDC-0068 tal como se describió anteriormente. Tras la incubación durante la noche, se prepararon lisados celulares y se analizaron mediante inmunotransferencia de tipo Western usando anticuerpos específicos para proteínas fosforiladas en la ruta de PI3K (Figura 3).
Las transferencias de control de MAP3K1 y pJNK muestran respectivamente que la expresión proteica se altera eficazmente por medio de edición génica y que se refleja en la inactivación funcional de la ruta. Se usó anticuerpo frente a pPRAS40 como lectura de la actividad de AKT y muestra que la línea celular MCF7 CR2.5 tiene mayores niveles basales de pPRAS40 y además es resistente a la inhibición del compuesto A, compuesto B y GDC-0058. Se usó anticuerpo frente a pS6 RP como lectura distal de la actividad de PI3Ka y muestra que, mientras que el compuesto A, compuesto B y GDC-0068 pueden inhibir eficazmente la actividad de pS6 RP en células MCF7 parentales, las células deficientes en MAP3K1 (CR2.5) son resistentes a todos los tratamientos (Figura 3).
Estos datos sugieren que las mutaciones concomitantes de MAP3K1 y PIK3CA promueven la resistencia a inhibidores de la ruta de PI3Ka y que esto no es específico para inhibidores de Az (compuesto A y compuesto B), sino que es un fenómeno de resistencia general tal como se observa también con el inhibidor de AKT de Genentech GDC-0068.
Ejemplo 4: Ensayos de proliferación para determinar la tasa de crecimiento y sensibilidad al compuesto A y compuesto B de líneas celulares deficientes en MAP3K1 frente a parentales.
Usando los clones que se confirmó que tenían mutaciones perjudiciales en MAP3K1 y sin expresión de la proteína MAP3K1, se caracterizó el crecimiento en la monocapa y se usó tecnología Incucyte para medir la proliferación celular en cultivos de monocapa en medio de crecimiento convencional.
Protocolo para ensayos de proliferación usando la tecnología IncuCyte.
Se sembraron en placa células MCF7 y MCF10A en placas de 96 pocillos a una densidad de 2000 células por pocillo en medio RPMI que contiene FBS al 10 % o medio DMEM/F12 que contenía el 5 % de HS (suero de caballo) respectivamente. Tras la incubación a 37°C durante 16 horas, se añadieron concentraciones de compuesto A, compuesto B (de 30 pM a 117 nM) o AZD2014 (de 15 pM a 66 nM) a las placas de ensayo. Entonces se colocaron las placas en el IncuCyte y se programaron para escanear cada 6 h durante 3 días. Se normalizó el porcentaje relativo de datos de confluencia para células tratadas con DMSO de control y se ajustaron a una curva de regresión no lineal usando PRISM (Graphpad).
Los clones MCF7-CR1.4, MCF7-CR1.8 y MCF7-CR2.5 proliferaron dos veces más rápido que las células MCF7 parentales. De manera similar, los clones H1047R-CR2.3 y H1047R-CR2.7 proliferaron más rápido que las células Mc F10AH1047R parentales (curvas de proliferación no mostradas).
Se sometió a prueba el efecto de los inhibidores de la ruta de PI3K aguas arriba compuesto A (selectivo de PI3Kalfa, véase el documento WO2014/114928) y compuesto B (inhibidor alostérico de AKT1/2, véase el documento WO2009/047563) y el inhibidor de la ruta aguas abajo del complejo mTORC1/2 (AZD2014, véase el documento WO2008/023161) sobre la proliferación de H1047R-CR2.3 y MCF7-CR1.4 (Figuras 4, 5 y 6). Aunque compuesto B 500 nM pudo inhibir la proliferación de tanto células parentales MCF10A-H1047R como células parentales MCF7, no tuvo ningún efecto sobre el crecimiento de líneas celulares mutantes para MAP3K1 derivadas (Figura 4 y Figura 6). En relación con células parentales MCF10A-H1047R, la concentración de compuesto B requerida para lograr la mitad del efecto máximo sobre la proliferación (CI50) del clon H1047R-CR2.3 se estimó que había aumentado 10 veces (Figura 5). En células MCF7, se hicieron observaciones similares sobre la proliferación. Aunque compuesto B 500 nM fue capaz de reducir el crecimiento de células MCF7 parentales, no hubo efecto del compuesto B sobre la proliferación de MCF7-CR1.4 (Figuras 4C-D y Figura 6B). En este caso, la CI50 para la proliferación aumentó 3 veces (Figura 5).
También se sometió a prueba el efecto del compuesto A sobre la proliferación de ambos conjuntos de líneas celulares. Se encontró que el compuesto A tenía una mayor CI50 para la proliferación del clon H1047R-CR2.3 en comparación con la línea parental MCF10A-H1047R (Figuras 4A-B y Figura 5). Se observó un efecto similar en MCF7-CR1.4 en comparación con las células MCF7 parentales (Figuras 4C-D y Figura 5).
En cambio, no se observó ningún cambio significativo en la CI50 del inhibidor de mTORC1/2 AZD2014 en comparación con líneas celulares parentales y mutantes para MAP3K1 (Figura 5). AZD2014 fue igualmente eficaz en la reducción de la proliferación en acervos tanto parental como mutante.
Tomados conjuntamente, estos datos sugieren que la inactivación genética de MAP3K1 en el acervo de la mutación de PIK3CA reduce la inhibición de la proliferación de células cancerosas por el compuesto A y compuesto B, dos inhibidores de componentes aguas arriba de la ruta de PI3K. En cambio, la inhibición de la proliferación por un inhibidor de un componente aguas abajo, mTORC1/2, no se ve afectada por la inactivación de MAP3K1.
Ejemplo 5: Análisis del efecto de la activación o el agotamiento de MAP3K1 sobre inhibidores de la ruta de PI3K en cultivos de crecimiento 3D.
Se sabe que las células cancerosas que crecen en cultivo pueden mostrar una sensibilidad muy diferente a los inhibidores cuando se cultivan en formato tridimensional (3D). Las células epiteliales forman estructuras glandulares polarizadas bien organizadas bajo la influencia de la matriz extracelular (ECM). Se requiere unión a ECM para el control de la proliferación, diferenciación y supervivencia de células epiteliales normales. Matrigel 3D recapitula parcialmente el contexto tumoral humano in vivo al proporcionar a las células epiteliales un anclaje de integrinas apropiado. Esto es esencial para la expresión en receptores y proteínas de supervivencia que podrían determinar las decisiones sobre el destino celular y la sensibilidad a los fármacos. Finalmente, los estudios de formación de luces en cultivo 3D y de alargamiento de conductos durante el desarrollo de la glándula mamaria respaldan el papel clave de la anoikis en el aclaramiento luminal (Debnath et al., Nature Reviews Cancer, 5:675-688, 2005)). Dado que se ha notificado que MAP3K1 se activa en respuesta al estrés (incluida la anoikis) por medio de activación de la ruta de JNK, los cultivos de crecimiento 3D deben mostrar un efecto más claro de la inactivación o el agotamiento de MAP3K1 sobre el crecimiento y la supervivencia celulares y su impacto sobre la sensibilidad a los inhibidores de la ruta de PI3K.
Protocolo para el cultivo en Matrigel 3D.
Para cultivos 3D, se sembraron en placa las células en Matrigel reducida en factores de crecimiento comercialmente disponible (Mgel) (BD Biosciences, San Diego, CA) y se cultivaron (Avivar-Valderas et al., MCB, 31(17):3616-29, 2011). Antes de la fijación para el análisis de IF, se trataron los acinos con compuesto B 500 nM cada 3 días hasta el punto final (día 15). Se fijaron las estructuras acinares de MCF10A en Matrigel 3D el día 15 y se procesaron para la medición del tamaño y el análisis de microscopía IF (Avivar-Valderas et al., MCB, 31(17):3616-29, 2011)
Para ensayos de anoikis, se recogieron las células (Avivar-Valderas et al., MCB, 31(17):3616-29, 2011). Tras la cuantificación, se mantuvieron 5,105/ml de células en placas de unión ultra baja (Corning) con el medio de crecimiento apropiado en el tiempo indicado y/o se trataron con compuesto B.
Después de 15 días de morfogénesis, la inhibición de MAP3K1 por medio de edición génica (MCF7 CR2.) no aumentó sustancialmente el número de acinos, sin embargo, aumentó significativamente el volumen de acinos en comparación con acinos de control (MCF7 parental) (Figura 7A, panel izquierdo). Esto podría explicarse por un aumento de la proliferación celular o/y reducción de la muerte celular (anoikis en células privadas de ECM). Para someter a prueba esto último, se llevaron a cabo tinción con caspasa 3 (lectura de anoikis) y secciones ecuatoriales confocales para analizar la formación de luces (compartimento principal en el que tiene lugar la anoikis).
Además, el tratamiento con compuesto B redujo significativamente el volumen de acinos en cultivos de control (MCF7 parental) mientras que este efecto se revirtió parcialmente en acinos deficientes en MAP3K1 (Figura 7A, panel izquierdo). Por consiguiente, mientras que el compuesto B indujo un aumento significativo en el número de acontecimientos de caspasa 3 positivos para escisión en acinos de control MCF10A-H1047R, este aumento no fue significativo en acinos MCF10A-H1047R deficientes en MAP3K1 (Figura 7A, panel derecho).
Estos datos sugieren que el agotamiento de MAP3K1 reduce la muerte celular y atenúa la inducción de apoptosis mediada por inhibidores aguas arriba de la ruta de PI3K.
Para confirmar los datos in vitro 2 D previos que sugieren que la inhibición de MAP3K1 reduce la sensibilidad al compuesto B (Figura 3), se tiñeron acinos 3D con el marcador de la ruta de PI3Ka pS6 RP. Células unidas a ECM (ubicadas en el borde exterior) fueron positivas para pS6 RP en acinos parentales. Tal como se predijo, el número de células positivas para pS6 RP fue mayor en MCF7-CR2.5 (Figura 7B, barras grises). Finalmente, mientras que el tratamiento con compuesto B redujo fuertemente el número de células pS6 RP positivas en acinos parentales, este efecto se revirtió en acinos MCF7 CR2.5 (Figura 7B, barras negras).
Ejemplo 6: Análisis de xenoinjerto in vivo para comparar la tasa de crecimiento de líneas celulares deficientes en MAP3K1 frente a de control parentales.
Se han usado ensayos de cultivo de MCF7 y MCF10A-H1047R 3D para modelar acontecimientos carcinogénicos tempranos. Usando este enfoque, se ha observado que el agotamiento de MAP3K1 promueve el volumen de crecimiento tumoral y previene la apoptosis inducida por el compuesto. Aunque estos representan un enfoque más fisiológico que los ensayos in vitro 2D, se ha validado esto usando ensayos in vivo. La Figura 8 muestra la diferencia de volumen tumoral de MCF7 parental frente a MCF7 CR2.5 a los 25 y 45 días tras la implantación. Mientras que en el día 45 la diferencia no es significativa, en el día 25 las células deficientes en MAP3K1 tienen tumores más grandes que las parentales y sugiere que el clon CR2.5 toma más eficientemente y crece más rápido que las células de control parentales.
Método 3: Estudios in vivo.
Se cultivaron células MCF7 parentales y MAP3K1 MCF7 C2.5 mutantes en medio de crecimiento completo tal como se describió anteriormente. Una vez alcanzado un 80 % de confluencia, los cultivos se tripsinizaron, se contaron y se implantaron tal como se describió anteriormente (Kevin Hudson et al. MCT, 10.1158/1535-7163.MCT-15-0687). En resumen, se implantaron 5*106 células por vía subcutánea en el costado de ratones SCID con implantes de gránulos de estrógenos de 0,50 mg/21 días. Los tumores se midieron dos veces por semana una vez visibles y los animales se pesaron dos veces por semana a menos que se observara pérdida de peso. Cuando los tumores alcanzaron ~1,6 cm3 o cuando la condición del tumor/animal dicta que se terminó el experimento.
Los ejemplos descritos en el presente documento ilustran un vínculo entre el estado genético de componentes aguas arriba de la ruta de PI3K y el estado de los genes de MAP3K1/MAP2K4. En particular, se muestra que mutaciones en los genes de MAP3K1 o MAP2K4 conducen a una reducción en el efecto de inhibidores de componentes aguas arriba de la ruta de PI3K, tales como inhibidores de PI3K-a e inhibidores de AKT. Por el contrario, no se observa ningún efecto con los inhibidores de componentes aguas abajo de la ruta de PI3K, tales como mTOR. Por tanto, es ventajoso que en los pacientes que están considerándose para el tratamiento con un inhibidor de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K se determine el estado genético de sus genes de MAP3K1 y MAP2K4. Los pacientes que tienen genes de MAP3K1 y MAP2K4 de tipo natural se seleccionarían preferentemente para el tratamiento.
Claims (9)
1. 4-Amino-W-[(1 S)-1-(4-clorofenil)-3-hidroxi-propil]-1-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperidin-4-carboxamida para su uso en el tratamiento del cáncer en un paciente identificado:
(a) determinando, en una muestra que es representativa del cáncer y se aisló previamente del paciente, si el estado genético de un componente aguas arriba de la ruta de PI3K es de tipo natural o mutante;
(b) determinando si el gen de MAP3K1 en la muestra es de tipo natural o mutante; y
(c) determinando si el gen de MAP2K4 en la muestra es de tipo natural o mutante; y en donde:
(i) se determinó que el estado genético del componente aguas arriba de la ruta de PI3K era mutante;
(ii) se determinó que el gen de MAP3K1 era de tipo natural; y
(iii) se determinó que el gen de MAP2K4 era de tipo natural;
en donde el componente aguas arriba de la ruta de PI3K se selecciona de PIK3CA, PIK3CB, PIK3CD, PIK3CG, AKT1, AKT2, AKT3, PTEN, PDK1, SGK, INPP4B, INPP5D, PIK3R1 y PIK3R2.
2. Compuesto para su uso según la reivindicación 1, en donde el componente aguas arriba de la ruta de PI3K es AKT1, AKT2 y/o AKT3.
3. Compuesto para su uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el cáncer es cáncer de mama, cáncer gástrico, cáncer de esófago, cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de endometrio, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de vulva, mieloma múltiple, linfoma, leucemia, cáncer de vejiga, cáncer de cerebro, cáncer colorrectal, cáncer de vesícula biliar, cáncer del conducto biliar, cáncer de piel, cáncer pancreático, cáncer testicular, cáncer de tiroides, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de vulva, cáncer de pene u otro cáncer dependiente de PI3-cinasa.
4. Compuesto para su uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el cáncer es cáncer de mama.
5. 4-Amino-W-[(1 S)-1-(4-clorofenil)-3-hidroxi-propil]-1-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperidin-4-carboxamida para su uso en el tratamiento del cáncer en un paciente identificado:
(a) determinando si el gen de AKT en las células cancerosas del paciente es de tipo natural o mutante;
(b) determinando si el gen de MAP3K1 en las células cancerosas del paciente es de tipo natural o mutante;
(c) determinando si el gen de MAP2K4 en las células cancerosas del paciente es de tipo natural o mutante;
en donde se determina que las células cancerosas del paciente albergan:
(i) un gen de AKT mutante;
(ii) un gen de MAP3K1 de tipo natural; y
(iii) un gen de MAP2K4 de tipo natural.
6. 4-Amino-W-[(1 S)-1-(4-clorofenil)-3-hidroxi-propil]-1-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperidin-4-carboxamida para su uso en el tratamiento del cáncer, en donde se ha determinado que las células cancerosas albergan una mutación en un componente aguas arriba de la ruta de PI3K seleccionado de PIK3CA, PIK3CB, PIK3CD, PIK3CG, AKT1, AKT2, AKT3, PTEN, PDK1, SGK, INPP4B, INPP5D, PIK3R1 y PIK3R2, un gen de MAP3K1 de tipo natural y un gen de MAP2K4 de tipo natural.
7. Compuesto para su uso según la reivindicación 6, en donde el componente aguas arriba de la ruta de PI3K es AKT1, AKT2 y/o AKT3.
8. 4-Amino-W-[(1 S)-1-(4-clorofenil)-3-hidroxi-propil]-1-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperidin-4-carboxamida para su uso en el tratamiento del cáncer en un paciente, en donde ya se ha determinado que el estado génico de las células cancerosas en una muestra aislada del paciente alberga una mutación en un componente aguas arriba de la ruta de PI3K seleccionado de PIK3CA, PIK3CB, PIK3CD, PIK3CG, AKT1, AKT2, AKT3, PTEN, PDK1, SGK, INPP4B, INPP5D, PIK3R1 y PIK3R2, un gen de MAP3K1 de tipo natural y un gen de MAP2K4 de tipo natural.
9. Compuesto para su uso según la reivindicación 8, en donde el componente aguas arriba de la ruta de PI3K es AKT1, AKT2 y/o AKT3.
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