ES2940313T3 - Apolipoproteína f como biomarcador para la enfermedad de hígado graso no alcohólico - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a métodos para diagnosticar, pronosticar o controlar o estadificar la progresión de la enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA) usando biomarcadores. La invención también se refiere a un método de puntuación para determinar la gravedad de la NAFLD ya un método para tratar la NAFLD. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Apolipoproteína f como biomarcador para la enfermedad de hígado graso no alcohólico

Campo de la invención

La invención se refiere a métodos para diagnosticar, pronosticar, controlar o estadificar la progresión de la esteatosis hepática no alcohólica (NAFLD, del inglés non-alcoholic fatty liver disease) mediante biomarcadores. La invención también se refiere a un método de puntuación para determinar la intensidad de la NAFLD.

Antecedentes de la invención

La NAFLD es el trastorno hepático más común en el mundo occidental. Abarca un espectro de enfermedad hepática progresiva que va desde el esteatosis hepática no alcohólica (NAFL, del inglés non-alcoholic fatty liver) hasta la esteatohepatitis no alcohólica (NASH, del inglés non-alcoholic steatohepatitis) que puede desarrollarse con fibrosis hepática y cirrosis. La enfermedad está asociada con la obesidad y aproximadamente 1 de cada 3 personas en los EE. UU. y el Reino Unido tienen algún grado de NAFLD y, en promedio, 1 de cada 5 personas en todo el mundo. La NAFLD está infradiagnosticada ya que los pacientes suelen estar asintomáticos incluso antes del desarrollo de la enfermedad hepática terminal (ESLD, del inglés endstage liver disease).

Las principales etapas de la NAFLD comprenden esteatosis no alcohólica (NAFL), esteatohepatitis no alcohólica (NASH), fibrosis hepática (fibrosis en el hígado) y cirrosis.

La "esteatosis no alcohólica" o "NAFL" también se conoce como esteatosis simple. Es donde hay una acumulación de grasa (triglicéridos) y de otros lípidos en los hepatocitos del hígado. El metabolismo desordenado de los ácidos grasos conduce a la esteatosis y se puede provocar por varios factores, tales como la resistencia a la insulina en la diabetes, falta de ejercicio y exceso de ingesta de alimentos donde hay un desequilibrio entre la ingesta calórica y la combustión.

La "esteatohepatitis no alcohólica" o "NASH" es una etapa más agresiva de la NAFLD donde hay inflamación hepática acompañada de esteatosis. En el Reino Unido y Europa, 1 de cada 20 personas padece NASH. Alrededor del 20 % de los pacientes que se someten a trasplantes de hígado son pacientes con NASH. Los casos de NASH están aumentando en la población general, incluso en niños y adolescentes.

La "fibrosis hepática" se puede utilizar indistintamente con "fibrosis en el hígado". La fibrosis hepática es una respuesta de cicatrización de heridas caracterizada por la acumulación excesiva de tejido cicatricial (es decir, matriz extracelular) en el hígado. La fibrosis hepática puede observarse o no en la NASH y consiste en la sustitución de los elementos estructurales normales de los tejidos por cantidades excesivas de tejido cicatricial no funcional. La fibrosis hepática se puede provocar por varios factores, que incluyen esteatosis hepática, alcohol y virus. La fibrosis hepática generalmente se estadifica según la intensidad mediante varios métodos de estadificación tales como Ishak, Metavir, Knodell y también el método de Kleiner-Brunt para la NAFLD.

La "cirrosis hepática" o "cirrosis" es la forma más intensa de cicatrización hepática y, a diferencia de la fibrosis hepática, es nodular y provoca daños irreversibles en la estructura del hígado. La cirrosis es la causa de más de 6000 muertes cada año en el Reino Unido y de aproximadamente 27.000 en los EE. UU., por lo que es la novena causa principal de muerte. La cirrosis es un factor de riesgo importante para el carcinoma hepatocelular (HCC, del inglés hepatocellular carcinoma) y, en este estadio del cáncer de hígado, el único enfoque curativo es el trasplante de hígado. Es imprescindible diagnosticar la fibrosis en las primeras etapas de la cicatrización hepática reversible para poder evitar los daños hepáticos irreversibles de la cirrosis.

El patrón de referencia para evaluar la fibrosis hepática y la NAFLD es la biopsia hepática y este procedimiento invasivo tiene una serie de desventajas bien conocidas: incomodidad para el paciente (dolor y sangrado); puede ser poco fiable debido a que la fibrosis no es homogénea en todo el hígado; la tasa de falsos negativos puede llegar al 20 %; una tasa de mortalidad asociada de 1 en 10.000; variabilidad interobservador y alto coste. La ecografía se puede utilizar para diagnosticar la NAFLD, aunque la sensibilidad de este enfoque es baja en pacientes clínicamente obesos que son los sujetos más propensos a tener NAFLD. La ecografía tampoco puede distinguir la NASH y la fibrosis dentro de la NAFLD y tiene baja sensibilidad para la esteatosis (Poynard et al., 2005, Comparative Hepatology, 4, 10; Yao et al., 2001, J Ultrasound Med, 20, 465; Schwenzer et al., 2009, J Hepatol, 51, 433). De manera similar a la biopsia, la evaluación ecográfica de la NAFLD depende del operador con una variación interobservador (Strauss et al., 2007, Am J Roentgenol; 189, W320). La resonancia magnética nuclear (RMN) es un método prometedor para diagnosticar la fibrosis hepática (Banerjee et al., 2014, J Hepatol, 60, 69) que funciona para la mayoría de los pacientes aunque no se puede utilizar para un número muy pequeño de pacientes que son claustrofóbicos, incapaces de quedarse quietos, incapaces de caber en el escáner de RMN y para pacientes con dispositivos médicos internos tales como marcapasos. La elastografía transitoria (FibroScan) evalúa la rigidez del hígado y aunque este método es prometedor para la fibrosis hepática, es difícil de realizar en pacientes obesos que constituyen la mayoría de los pacientes con NAFLD (Petta et al., 2011, Aliment PharmacolTher, 33, 1350).

Como consecuencia, hay una necesidad de mejorar, métodos mínimamente invasivos para determinar los estadios de la NAFLD en pacientes.

Miller et al. (2014, Journal of gastroenterology and hepatology, 29(10), 1839-1847) describe la identificación de biomarcadores séricos de la esteatohepatitis no alcohólica.

Ponyard et al. (2006, BMC Gastroenterology, 6(1), 34) describe el valor diagnóstico de los biomarcadores séricos para la predicción de la esteatohepatitis no alcohólica en pacientes con NAFLD.

Bell et al. (2010, Hepatology, 51(1), 111-120) describe la proteómica sérica y el descubrimiento de biomarcadores en pacientes con estadios variables de NAFLD.

Chunming et al. (2015, Turkish Journal of Gastroenterology, 26(5), 408-416) describe el desarrollo de una puntuación clínica para la predicción de la esteatohepatitis no alcohólica en pacientes con NAFLD.

Kosone et al. (2007, American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology, 293(1), G204-G210) divulga que el factor de crecimiento de hepatocitos mejora la esteatosis hepática inducida por una dieta rica en grasas.

Sumario de la invención

Los inventores han identificado biomarcadores de proteínas que aumentan o disminuyen en pacientes que se encuentran en diferentes estadios de la NAFLD, tal como la NAFL, la NASH con/sin fibrosis o la cirrosis.

La invención proporciona un método para diagnosticar, pronosticar, controlar o estadificar la progresión de la esteatosis hepática no alcohólica (NAFLD) en un individuo, comprendiendo el método detectar y cuantificar el biomarcador apolipoproteína F en una muestra biológica obtenida del individuo, comparar el nivel del biomarcador con una muestra de control o una muestra/nivel de referencia y determinar si el nivel del biomarcador es indicativo de la progresión de la NAFLD y, por lo tanto, diagnosticar, pronosticar, controlar o estadificar la progresión de la NAFLD, en donde un nivel decreciente de la apolipoproteína F, en comparación con una muestra de control o una muestra/nivel de referencia, indica una intensidad creciente de la NAFLD a medida que avanza a través de los estadios, y en donde la muestra biológica es sangre, suero o plasma.

La invención proporciona además un método de puntuación para determinar la intensidad de la NAFLD, comprendiendo el método detectar y cuantificar el biomarcador apolipoproteína F en una muestra biológica obtenida del individuo, comparar el nivel del biomarcador con una muestra de control o una muestra/nivel de referencia para obtener una puntuación, en donde un nivel decreciente de la apolipoproteína F, en comparación con una muestra de control o una muestra/nivel de referencia, indica una intensidad creciente de la NAFLD a medida que avanza a través de los estadios, y en donde la muestra biológica es sangre, suero o plasma.

A continuación, la invención se describirá con mayor detalle, a modo de ejemplo y no de limitación, y con referencia a los dibujos adjuntos. Muchas modificaciones y variaciones equivalentes serán evidentes para los expertos en la materia cuando se les proporcione esta divulgación. Por consiguiente, las realizaciones ilustrativas expuestas de la invención se consideran como ilustrativas y no limitantes. Pueden realizarse diversos cambios de las realizaciones descritas sin desviarse del alcance de la invención como se define en las reivindicaciones.

La presente invención incluye la combinación de los aspectos y características preferidas descritas, excepto cuando dicha combinación sea claramente inaceptable o se indique expresamente que tenga que evitarse. Como se utilizan en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "uno/una", "el" y "la" incluyen las referencias en plural a menos que el contenido indique claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "un biomarcador" incluye dos o más de dichos biomarcadores.

Descripción de las figuras

Figura 1 - Regiones ampliadas de geles 2D-PAGE representativos que muestran la disminución en la expresión de biomarcadores en los estadios de la NAFLD. Se muestran tres nuevos biomarcadores como ejemplo y la posición relativa de la proteína identificada está rodeada por un círculo. Los estadios de la NAFLD de izquierda a derecha son esteatosis (NAFL), NASH sin fibrosis (F0) y NASH con fibrosis avanzada (F3). (a) apolipoproteína D, (b) apolipoproteína M, (c) cininógeno-1.

Figura 2 - Datos de densitometría de la transferencia Western para biomarcadores novedosos utilizando muestras de suero de pacientes con una intensidad cada vez mayor de la NAFLD, (a) apolipoproteína D; este biomarcador es elevado en controles sanos y coherentemente más bajo en todos los estadios de la NAFLD, lo que sugiere que sería útil como un biomarcador temprano de la NAFLD. (b) apolipoproteína M; el biomarcador muestra una ligera disminución desde la esteatosis (NAFL) hasta la NASH F0 pero reduce notablemente su expresión en la NASH F3, lo que sugiere que es más útil para determinar la fibrosis hepática. (c) cininógeno-1; una disminución constante en todos los estadios de la NAFLD. (d) apolipoproteína F; una disminución constante en todos los estadios de la NAFLD.

Figura 3 - Datos de cuantificación relativa por espectrometría de masas a partir del uso de marcadores de masa en tándem (TMT; 10-plexado) para nuevos biomarcadores de la NAFLD utilizando muestras de suero de individuos sanos (control) y de pacientes con esteatosis (NAFL) y NASH (con puntuaciones de Kleiner-Brunt de F0, F1 y F3). (3a) La apolipoproteína F (APO-F) muestra una disminución en su concentración a medida que aumenta la intensidad de la NAFLD. (3b) La adiponectina disminuye en su concentración desde el control a la esteatosis (NAFL) y a la NASH, pero es constante en todos los estadios de fibrosis de NASH, lo que sugiere que es un buen biomarcador de la NAFLD. (3c) La ficolina-2 muestra cierta disminución en la NAFLD con sus niveles más bajos en el estadio de fibrosis F3. (3d) La trombospondina-1 aumenta desde el control hasta la esteatosis (NAFL) y en todos los estadios de la NAFLD.

Figura 4 - Datos de cuantificación por espectrometría de masas basados en la monitorización de reacciones paralelas (PRM) para posibles biomarcadores seleccionados. (4a) Concentración absoluta de la APO-F utilizando tres péptidos trípticos diferentes en su secuencia. Se utilizó un digerido de las muestras de suero (100 ng) para cuantificar la APO-F utilizando el método LC-MS IGNIS. (4b-i) Cuantificación relativa de biomarcadores usando PRM para (4b) ficolina-2, (4c) trombospondina-1, (4d) adiponectina, (4e) proteína de unión a Fc de IgG, (4f) cistatina-C, (4g) proteína de unión a lipopolisacáridos, (4h) alfa-1 glucoproteína 2 ácida, (4i) alfa-2-glucoproteína rica en leucina y (4j) apolipoproteína D. Todas las muestras se analizaron en dos réplicas técnicas.

Descripción detallada

Los presentes inventores han identificado biomarcadores particulares que se pueden utilizar solos o en combinación en el diagnóstico, pronóstico, control o estadificación de la progresión de la esteatosis hepática no alcohólica (NAFLD). En particular, estos biomarcadores se pueden utilizar en la estadificación de la NAFLD, para evaluar a un individuo que tiene esteatosis hepática no alcohólica (NAFL), esteatohepatitis no alcohólica (NASH), fibrosis hepática y/o cirrosis, asociadas con la NAFLD. Los biomarcadores identificados se pueden utilizar para puntuar la intensidad de la NAFLD. Estos marcadores también son útiles en métodos que comprenden el diagnóstico, el control o la estadificación de la NAFLD, y posteriormente el tratamiento del individuo, para tratar la NAFLD.

La presente divulgación está dirigida al análisis de uno o más biomarcadores en una muestra tomada de un individuo. De acuerdo con la invención, la muestra es una muestra de sangre, una muestra de suero o una muestra de plasma, aunque la presente divulgación también se relaciona al uso de células, lisados celulares, orina, líquido amniótico y otros líquidos biológicos. Una muestra de sangre puede ser capilar, venosa o arterial o una muestra de plasma o suero. La muestra puede ser una muestra pura o extraída de una gota de sangre seca u otro medio sólido. La recogida de muestras se puede realizar con tubos (incluidos los tubos al vacío) o la muestra se puede transferir a un medio sólido, tal como gotas de sangre seca (con sangre capilar) en papel de filtro, membranas de celulosa o similares. En el caso de las gotas de sangre seca (DBS, del inglés dried blood spots), estas se pueden tomar de un paciente mediante un pinchazo en su dedo con una lanceta y la transferencia de una o más gotas de sangre capilar a un papel de filtro, membrana de celulosa o medio de soporte de muestras equivalente que permite un manejo y un transporte de la muestra más fácil, además de preferirse más por el paciente en comparación con la venopunción. La sangre capilar también podría recogerse en tubos especializados tales como el Microtainer, el Microvette, el Monovette, el Minivette o el Multivette.

Normalmente el individuo es un sujeto humano. El individuo puede mostrar uno o más síntomas de la NAFLD y/o puede haber sido previamente diagnosticado con la NAFLD, donde los presentes métodos se utilizan en el control o en la estadificación de la NAFLD. Es posible que se hayan utilizado previamente parámetros adicionales o que se utilicen en combinación con los métodos descritos en el presente documento para ayudar en la evaluación de la NAFLD. Dichos parámetros incluyen la edad del paciente, el género del paciente, el peso del paciente, la altura del paciente, el índice de masa corporal (IMC), la evidencia de pérdida/ganancia de peso rápida, los hábitos alimenticios, el consumo de alcohol, los antecedentes médicos, el historial de actividad/ejercicio del paciente, el origen étnico y los antecedentes de enfermedades (incluidos antecedentes de diabetes, incluida la diabetes tipo II, la enfermedad cardiovascular, obesidad, la cirugía de derivación gástrica, el síndrome de ovario poliquístico, la apnea del sueño, el hipotiroidismo, el hipopituitarismo y el síndrome metabólico que generalmente incluye al menos tres de los siguientes factores: aumento de la circunferencia de la cintura, hipertrigliceridemia, hipertensión, glucosa en ayunas elevada y un nivel bajo de lipoproteínas de alta densidad (HDL)).

Se pueden detectar y cuantificar uno o más biomarcadores de acuerdo con la presente divulgación, siendo normalmente al menos un biomarcador seleccionado de apolipoproteína F, proteína de unión a lipopolisacáridos, ficolina-2, apolipoproteína D, cininógeno-1, apolipoproteína M, trombospondina-1, proteína de unión a Fc de IgG, cistatina-C, alfa-1-glucoproteína 2 ácida y alfa-2-glucoproteína rica en leucina. De acuerdo con la presente invención, al menos se detecta y cuantifica la apolipoproteína F.

Los biomarcadores y su número de registro en la base de datos en Uniprot se enumeran a continuación. Las secuencias de proteínas que se divulgan en el presente documento se refieren a la secuencia de Uniprot a 31 de julio de 2016. Por lo tanto, a continuación se muestra una lista de los presentes biomarcadores con sus números de registro (entre paréntesis) y nombres alternativos (en cursiva):

apolipoproteína-F (Q13790) Apo-F, proteína inhibidora de la transferencia de lípidos, LTIP;

apolipoproteína-M (O95445) Apo-M, ApoM, Proteína G3a;

apolipoproteína-D (P05090) Apo-D, ApoD;

cininógeno-1 (P01042) Inhibidor de la alfa-2-tiol proteinasa, factor de Fitzgerald, cininógeno de alto peso molecular, HMWK, factor de Williams-Fitzgerald-Flaujeac

El cininógeno-1 se escinde en las siguientes 6 cadenas: 1) Cadena pesada de cininógeno-1,2) Cinina T; Nombre(s) alternativo(s): Ile-Ser-Bradicinina, 3) Bradicinina; Nombre(s) alternativo(s): calidina I, 4) lisil-bradicinina, Nombre(s) alternativo(s): calidina II, 5) Cadena ligera de cininógeno-1, 6) factor promotor del crecimiento de bajo peso molecular;

ficolina-2 (Q15485) proteína de unión a elastina de 37 kDa, proteína 2 que contiene el dominio de colágeno/fibrinógeno, EBP-37, ficolina-B, ficolina-p, hucolina, L-ficolina, lectina sérica p35;

trombospondina-1 (P07996);

proteína de unión a Fc de IgG (Q9Y6R7) antígeno de proteína de unión a Fcy, FcyBP

cistatina-c (P01034) Cistatina-3, resto y, polipéptido básico neuroendocrino, Post-Y-globulina;

proteína de unión a lipopolisacáridos (P18428) LBP;

alfa-1-glucoproteína 2 ácida (P19652) AGP 2, orosomucoide-2, OMD 2; y

alfa-2-glucoproteína rica en leucina (P02750) LRG.

Los inventores han identificado que los niveles de algunas de estas proteínas disminuyen al aumentar la intensidad de la NAFLD. En particular, la apolipoproteína F, la alfa-1 glucoproteína 2 ácida, la ficolina-2 y la alfa-2-glucoproteína rica en leucina muestran niveles decrecientes de proteína a medida que aumenta la intensidad de la NAFLD. Por el contrario, los niveles de cistatina C, proteína de unión a lipopolisacáridos, proteína de unión a Fc de IgG y trombospondina-1 muestran niveles crecientes a medida que aumenta la intensidad de la NAFLD.

El uno o más marcadores descritos anteriormente pueden seleccionarse de apolipoproteína F, apolipoproteína D, cininógeno-1, ficolina-2, apolipoproteína M y trombospondina-1. Un biomarcador particularmente preferido es la apolipoproteína F, que se detecta y cuantifica de acuerdo con la invención.

La apolipoproteína F muestra una disminución en su concentración a medida que aumenta la intensidad de la NAFLD. Por consiguiente, controlar los cambios en el nivel de esta proteína en un individuo proporciona una indicación del progreso de la NAFLD a través de los estadios.

La apolipoproteína D muestra niveles elevados en controles sanos y niveles más bajos en todos los estadios de la NAFLD. Por consiguiente, este marcador se puede utilizar como un biomarcador temprano de la NAFLD. Un nivel decreciente de apolipoproteína D, en comparación con una muestra de control o una muestra/nivel de referencia, indica una intensidad creciente de la NAFLD. La apolipoproteína M muestra una ligera disminución desde la esteatosis (NAFL) hasta la NASH F0, pero reduce su expresión en la NASH F3. Por consiguiente, la apolipoproteína M es útil para determinar el progreso hacia la fibrosis hepática. El cininógeno-1 muestra una disminución constante en todas las etapas de la NAFLD.

La ficolina-2 muestra una disminución en los estadios de la NAFLD, mostrando sus niveles más bajos en el estadio de fibrosis F3.

La trombospondina-1 aumenta desde los niveles de control hasta la esteatosis (NAFL) y en todos los estadios de la NAFLD.

El al menos un biomarcador puede comprender apolipoproteína F, proteína de unión a lipopolisacáridos y/o ficolina-2. El al menos un biomarcador puede comprender apolipoproteína F, proteína de unión a lipopolisacáridos, ficolina-2 y/o apolipoproteína D.

La divulgación proporciona el análisis de al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o al menos cinco o más biomarcadores y, por lo tanto, diagnostica, pronostica, controla o estadifica la progresión de la NAFLD. Por lo tanto, los biomarcadores identificados anteriormente se usan preferentemente en combinación con uno o más biomarcadores adicionales.

Por ejemplo, se puede utilizar una combinación de marcadores para proporcionar una estadificación más precisa de la NAFLD. Dichos biomarcadores pueden seleccionarse de la apolipoproteína F, proteína de unión a lipopolisacáridos, ficolina-2, apolipoproteína D, cininógeno-1, apolipoproteína M, trombospondina-1, proteína de unión a Fc de IgG, cistatina-c, alfa-1-glucoproteína 2 ácida y alfa-2-glucoproteína rica en leucina. Una combinación de marcadores utilizada de acuerdo con la invención comprende preferentemente el biomarcador apolipoproteína F y uno o más biomarcadores adicionales seleccionados de proteína de unión a lipopolisacárido, ficolina-2, apolipoproteína D, cininógeno-1, apolipoproteína M, trombospondina-1, proteína de unión a Fc de IgG, cistatina-c, alfa-1-glucoproteína 2 ácida y alfa-2-glucoproteína rica en leucina. Una combinación preferida comprende apolipoproteína F y uno o más, tal como dos, tres o cuatro biomarcadores adicionales seleccionados de proteína de unión a lipopolisacáridos, ficolina-2, apolipoproteína D, alfa-1-glucoproteína 2 ácida y trombospondina-1.

Las combinaciones adicionales de marcadores que pueden utilizarse incluyen (i) uno o más biomarcadores seleccionados de apolipoproteína F, proteína de unión a lipopolisacáridos y ficolina-2, en combinación con uno o más biomarcadores seleccionados de apolipoproteína D, alfa-1-glucoproteína 2 ácida y trombospondina-1; y (ii) uno o más biomarcadores seleccionados de apolipoproteína F, proteína de unión a lipopolisacáridos y ficolina-2, en combinación con uno o más biomarcadores seleccionados de apolipoproteína D, alfa-1-glucoproteína 2 ácida y trombospondina-1. De manera alternativa, se pueden combinar biomarcadores adicionales con uno o más biomarcadores.

El método puede comprender el análisis de al menos la apolipoproteína F y la proteína de unión a lipopolisacáridos; la apolipoproteína F y la ficolina-2; la apolipoproteína F y la apolipoproteína D; la proteína de unión a lipopolisacáridos y la ficolina-2; la proteína de unión a lipopolisacáridos y la apolipoproteína D; la apolipoproteína D y la ficolina-2; la apolipoproteína F, la proteína de unión a lipopolisacáridos y la ficolina-2; o la apolipoproteína F, la apolipoproteína D, la proteína de unión a lipopolisacáridos y la ficolina-2.

Los presentes métodos pueden utilizarse en el diagnóstico de la NAFLD, o en el pronóstico de la NAFLD, por ejemplo, para establecer la intensidad de la enfermedad. Los presentes métodos se pueden utilizar en la estadificación de la NAFLD y, en particular, en la estadificación del individuo como enfermo de esteatosis hepática no alcohólica (NAFL), también conocida como esteatosis. Un biomarcador preferido para la estadificación temprana de la NAFLD y la estadificación como NAFL es la apolipoproteína D. Los métodos también pueden utilizarse para estadificar la NAFLD como esteatohepatitis no alcohólica (ⁿA^s H). Un biomarcador preferido para la estadificación de la intensidad de la NAFLD y de la estadificación como NASH es la apolipoproteína M. Los métodos también se pueden utilizar para estadificar al individuo como que padece fibrosis hepática, incluida la intensidad de la fibrosis.

Además del análisis de uno o más biomarcadores como se ha divulgado anteriormente, la divulgación también proporciona el análisis de uno o más biomarcadores adicionales. El uno o más biomarcadores adicionales pueden seleccionarse de los biomarcadores adicionales identificados como se describe a continuación.

El uno o más biomarcadores adicionales pueden comprender queratina de tipo I citoesquelética 18, número de registro entre paréntesis; nombres alternativos en cursiva: (P05783) proteína del gen 46 inductor de la proliferación celular, citoqueratina -18, CK-18, queratina-18, K18 y/o adiponectina (Q15848) proteína relacionada con el complemento de adipocitos de 30 kDa, proteína de 30 kDa relacionada con el complemento de adipocitos, ACRP30, proteína que contiene los dominios de adipocitos, C1q y colágeno, proteína del gen transcrito 1 más abundante del tejido adiposo, apM-1, proteína de unión a la gelatina.

La adiponectina es un biomarcador adicional particularmente preferido. Los resultados descritos en el presente documento muestran que la concentración de adiponectina disminuye desde el control hasta la esteatosis (NAFL) y hasta la NASH, pero es constante en los estadios de fibrosis de la NASH. Por consiguiente, este es un marcador temprano útil para la NAFL y para la progresión a NASH. Un nivel decreciente de adiponectina, en comparación con una muestra de control o una muestra/nivel de referencia, por lo tanto indica una intensidad creciente de la NAFLD a medida que avanza hasta el estadio de esteatohepatitis no alcohólica.

Por consiguiente, un método puede comprender el análisis de al menos la apolipoproteína F y la adiponectina; la proteína de unión a lipopolisacáridos y la adiponectina; la ficolina-2 y la adiponectina; la apolipoproteína D y la adiponectina; la apolipoproteína F, la apolipoproteína D y la adiponectina; la apolipoproteína F, la proteína de unión a lipopolisacáridos y la adiponectina; la apolipoproteína F, la ficolina-2 y la adiponectina; la proteína de unión a lipopolisacáridos, la ficolina-2 y la adiponectina; la apolipoproteína D, la proteína de unión a lipopolisacáridos y la adiponectina; la apolipoproteína D, la ficolina-2 y la adiponectina; o la apolipoproteína F, la proteína de unión a lipopolisacáridos, la ficolina-2 y la adiponectina.

También se pueden evaluar los productos de escisión de una o más proteínas. Las proteínas adecuadas para el análisis de los productos de escisión incluyen cininógeno-1, queratina de tipo I citoesquelética 18 y angiotensinógeno. Normalmente, la cantidad de productos de escisión de estos péptidos aumenta con la intensidad de la NAFLD, de modo que el control de los niveles de los productos de escisión se puede utilizar como parte de los métodos descritos en el presente documento.

Los métodos presentes también se pueden utilizar para seguir el progreso de la NAFLD, por ejemplo, en un paciente diagnosticado de NAFLD. El método se puede repetir a intervalos adecuados, tales como una vez al mes, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses, una vez cada seis meses, una vez al año, una vez cada dos años o una vez cada tres años para seguir el progreso de la NAFLD y, en particular, para seguir los cambios en el biomarcador o biomarcadores asociados con la progresión a un estadio diferente de la NAFLD. Dicho control también se puede utilizar en la evaluación de la eficacia de la terapia para dichos pacientes.

El uno o más biomarcadores se pueden evaluar mediante cualquier técnica adecuada, incluida, por ejemplo, los inmunoensayos. Los métodos pueden utilizar espectrometría de masas para evaluar el uno o más biomarcadores.

El uno o más biomarcadores se pueden cuantificar mediante enfoques sin anticuerpos, tales como, pero sin limitación, monitorización de reacciones en paralelo (PRM), monitorización de reacciones seleccionadas (SRM), monitorización de reacciones múltiples (MRM) o fragmentación de múltiples etapas en MRM al cubo (MRM3) mediante espectrometría de masas.

La muestra biológica (ya sea sangre capilar/venosa/arterial, suero o plasma) se digiere con una proteasa tal como, pero sin limitación, tripsina, quimotripsina, Arg-C, Asp-N, clostripaína, elastasa, Glu-C, Lys-C, Lys-N, pepsina, proteína endopeptidasa y proteasa de Staphylococcus, pero en aspectos específicos la enzima es la tripsina. En el caso de la tripsina, ésta también incluye tripsina inmovilizada para una digestión de mayor rendimiento, tal como Flash Digest de Perfinity Biosciences (también llamado SMART Digest de Thermo Scientific). Se conocen las propiedades de escisión de estas enzimas (por ejemplo, la tripsina se escinde después de la lisina, K o arginina, R) y así los péptidos resultantes se determinan de manera manual o mediante un programa informático (tal como Skyline, PinPoint, etc.) para digerir las proteínas por ordenador. Por lo general, se excluyen los péptidos de menos de 7 aminoácidos, ya que es poco probable que sean únicos. Normalmente, se excluyen los péptidos de más de 25 aminoácidos, ya que es probable que los péptidos sintéticos como patrones sean caros. Aunque los péptidos entre 7 y 25 aminoácidos normalmente se seleccionan para el análisis, los péptidos de menos de 7 aminoácidos y más de 25 aminoácidos no deben excluirse por completo. Cuando se utiliza tripsina, normalmente se seleccionan péptidos sin escisiones detectadas, pero los péptidos con una o más escisiones detectadas se pueden considerar para cualquier enzima. Por lo general, se seleccionan péptidos que no están modificados (por ejemplo, glucosilados, fosforilados, etc.) y la metionina, M, se evita ya que este aminoácido puede estar oxidado o no y estas modificaciones cambiarían la masa del péptido. Los péptidos modificados no deben excluirse por completo si la masa de la modificación (por ejemplo, glucosilación, fosforilación, oxidación, carbamidometilación, etc.) se conoce.

Las bases de datos en línea tales como, pero sin limitación, PeptideAtlas y la base de datos Global Proteome Machine (gpmdb), ayudan a determinar los péptidos comúnmente observados para las proteínas de interés. Se puede utilizar MRMaid para ayudar a diseñar ensayos para la cuantificación dirigida basada en espectrometría de masas sugiriendo péptidos e iones MS2 a controlar a partir de espectros experimentales de la base de datos PRIDE. Se utiliza Protein BLAST para comprobar la singularidad del péptido seleccionado. Si un péptido no es único, entonces se seleccionaría otro péptido dentro de la secuencia del biomarcador.

Antes de la espectrometría de masas, los péptidos digeridos se pueden fraccionar utilizando el enriquecimiento de fosfopéptidos, el enriquecimiento de glucopéptidos, el fraccionamiento de fase inversa de pH elevado o similares. Los péptidos se pueden separar mediante cromatografía líquida de fase inversa, cromatografía líquida de interacción hidrófila (HILIC), cromatografía de intercambio iónico, enfoque isoeléctrico o similar, pero en aspectos específicos la separación se realiza mediante cromatografía líquida de fase inversa con una columna de carbono-18 (C-18). En el caso de biomarcadores muy poco abundantes, las muestras se pueden fraccionar mediante el fraccionamiento de fase inversa basado en el pH, los biomarcadores podrían enriquecerse mediante inmunoprecipitación o podrían agotarse las proteínas muy abundantes (mediante inmunoprecipitación o métodos de afinidad de colorantes tales como Cibacron-blue para el agotamiento de la albúmina en muestras de suero y/o plasma).

Se realiza SRM/MRM mediante un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo. El primer cuadrupolo filtra el péptido preseleccionado (ion MS1) de la proteína de interés, el segundo cuadrupolo fragmenta este péptido y el tercer cuadrupolo filtra un fragmento o fragmentos (iones MS2) del péptido para la detección. La PRM se realiza mediante un espectrómetro de masas híbrido cuadrupolo-Orbitrap, tal como un Thermo Q Exactive y sus variantes o un Thermo Fusion y sus variantes. En la PMR, el cuadrupolo filtra el péptido preseleccionado (ion MS1) de la proteína de interés, la célula de disociación por colisión de mayor energía (HCD, del inglés higher-energy collisional dissociation) fragmenta este péptido y el Orbitrap es capaz de detectar todos los fragmentos (iones MS2) del péptido debido a su elevada resolución. Se realiza m Rm 3 mediante un espectrómetro de masas QTRAP. En la MRM3, el primer cuadrupolo filtra el péptido preseleccionado (ion MS1) de la proteína de interés, el segundo cuadrupolo fragmenta este péptido, a continuación, los iones fragmentados (iones MS2) quedan atrapados después de ser aislados en la trampa de iones lineal seguido de excitación para realizar una segunda etapa de fragmentación con iones MS3 para dar un nivel más elevado de sensibilidad. En aspectos específicos, la técnica incluye cualquier espectrómetro de masas en tándem capaz de MS/MS con ionización de la muestra realizada mediante ionización por electropulverización (ESI, del inglés electrosprayionization), pero también puede realizarse mediante otros métodos de ionización.

El área bajo la curva (ABC) de los iones fragmentados se puede utilizar para cuantificar relativamente los niveles de las proteínas. Se pueden usar cantidades conocidas de péptidos pesados puros sintéticos marcados con la misma secuencia que los péptidos preseleccionados para establecer una curva de calibración que ayude a determinar la concentración absoluta de las proteínas. Con más detalle, la detección de estos péptidos puede llevarse a cabo mediante SRM, MRM, MRM3, PRM o similar donde un espectrómetro de masas filtra el péptido preseleccionado (ion MS1), fragmenta el péptido y se detectan los fragmentos peptídicos (iones MS2). El a Bc para estos iones MS2 se utilizan para cuantificar los biomarcadores. Para la cuantificación absoluta, se utilizan cantidades conocidas de péptidos sintéticos que pueden marcarse e manera isotópica. La síntesis se realiza normalmente desde el extremo C hasta el extremo N del péptido. El ciclo de síntesis comprende: a) Carga del aminoácido carboxiterminal a la fase de soporte sólido (resina de poliestireno). Este aminoácido está protegido en el extremo N para evitar reacciones no deseadas; b) Eliminación del grupo de protección aminoterminal (PG) de este aminoácido; c) Activación del extremo C del siguiente aminoácido (el extremo N lleva un grupo de protección); d) Reacción de acoplamiento de estos dos aminoácidos; e) Reinicio del ciclo en b) o escisión del péptido completo de la resina. Los péptidos pueden ser brutos o tener una pureza de al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos el 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 98 %. Los péptidos pueden ser péptidos sintéticos, péptidos IGNIS, péptidos PEPotec, péptidos AQUA, péptidos SpikeTide, péptidos con marcador epitópico distintivo de proteína (QPrEST), péptidos sintetizados en fase sólida asistidos por microondas, péptidos distintivos concatenados codificados por genes QconCAT o similares. Tanto la detección como el enriquecimiento de los péptidos endógenos en la muestra biológica se pueden lograr con anticuerpos antipéptidos, captura convencional de isótopos estables con anticuerpos antipéptidos (SISCAPA) o similares donde el anticuerpo antipéptido se genera contra el péptido preseleccionado. Además de los péptidos marcados de manera isotópica, la cuantificación de los biomarcadores también se puede lograr mediante la cuantificación basada en espectrometría de masas sin marcadores (con el programa informático Progenesis LC-MS, el programa informático Skyline o similares) o mediante el marcaje de las proteínas en las muestras biológicas utilizando marcadores de isótopos tales como marcadores de masa en tándem (TMT, del inglés tándem mass tags), marcadores isobáricos para la cuantificación relativa y absoluta (iTRAQ, del inglés sobaric tags forrelative and absolute quantitation), marcadores de afinidad codificadas por isótopos (ICAT, del inglés isotope-coded affinity tags) o similares.

La cuantificación absoluta se puede llevar a cabo con el kit de cuantificación de péptidos personalizado HeavyPeptide IGNIS Prime de Life Technologies con la digestión de péptidos IGNIS Prime utilizando tripsina o tripsina inmovilizada tal como Flash Digest de Perfinity Biosciences (también llamado SMART Digest de Thermo Scientific).

Con la apolipoproteína F (APO-F) como ejemplo, se describe el flujo de trabajo para la selección de péptidos y esto puede seguirse para cualquiera de los biomarcadores enumerados. El precursor sin procesar de a PO-F tiene 326 aminoácidos. Los aminoácidos 1 a 35 son para un péptido señal, los aminoácidos 36 a 164 son para un propéptido y los aminoácidos son para la APO-F funcional. La digestión informática de la secuencia de APO-F funcional muestra cuatro péptidos que se encuentran entre los criterios de 7 a 25 aminoácidos: SLPTEDCENEK (m/z 661,2825, 2+ o m/z 441,1907, 3+), SGVQQLIQYYQDQK (m/z 849,4283, 2+ o m/z 566,6213, 3+), DANISQPETTK (m/z 602,2962, 2+, m/z 401,8666, 3+), SYDLDPGAGSLEI (m/z 668,8170, 2+, m/z 446,2138, 3+). Todos estos péptidos pueden seleccionarse mediante espectrometría de masas utilizando SRM, MRM, PRM, MRM3 o similares mediante la selección de los iones EM1 que se muestran antes entre paréntesis. En el caso de DANISQPETTK, la segunda treonina, T, en su secuencia está O-glucosilada y, por lo tanto, normalmente no se elegiría como un péptido adecuado. Sin embargo, no se debe descartar DANISQPETTK si la proteína está desglucosilada.

Además de la detección de los propios biomarcadores, los métodos pueden estar dirigidos a la detección de fragmentos de los biomarcadores particulares. Por ejemplo, algunas proteínas como la queratina de tipo I esquelética 18 y el cininógeno-1 se escinden, con el nivel de escisión aumentando en la NAFLD. Por consiguiente, para estas proteínas, el control de los productos de escisión proporciona un marcador de la NAFLD y/o del estadio de la enfermedad. Los productos de escisión pueden detectarse mediante métodos de espectrometría de masas. Cuando se detectan productos de escisión, es posible que no se lleve a cabo la etapa inicial de digestión con proteasa.

En el caso de la queratina de tipo I citoesquelética 18, esta proteína se escinde mediante una caspasa entre los aminoácidos 397 y 398 de la secuencia completa sin procesar (es decir, entre los aminoácidos 396 y 397 de la queratina de tipo I citoesquelética 18 funcional después de que se elimine la metionina iniciadora) y esta escisión aumenta con la NAFLD. El péptido tríptico LLEDGEDFNLGD^a L^d SSNSMQTIQK cubre esta región de escisión y puede ser objeto de espectrometría de masas utilizando SRM, MRM, PRM, MRM3 o similar. Se sabe que los tres aminoácidos de serina (S) en la secuencia están fosforilados y que la metionina (M) podría oxidarse, por lo que la m/z de este péptido debe calcularse si estos cuatro aminoácidos están modificados y no modificados. Los niveles de este péptido disminuyen con el aumento de la intensidad de la NAFLD. Además, el péptido tríptico escindido LLEDGEDFNLGDALD puede ser objeto de espectrometría de masas utilizando SRM, MRM, ^p R^m , MRM3 o similar mediante la selección de un péptido de m/z 818,3729, 2+ o m/z 545,9177, 3+. Los niveles de este péptido aumentan con el aumento de la intensidad de la NAFLD. El péptido tríptico escindido SSNSMQTIQK también puede ser objeto de espectrometría de masas utilizando SRM, MRM, PRM, MRM3 o similar y también aumenta con el aumento de la intensidad de la NAFLD aunque, como antes, la m/z de este péptido debe calcularse si los aminoácidos serina (S) y metionina (M) están modificados y no modificados.

Se encontró que el cininógeno-1 es un nuevo biomarcador para la NAFLD. El cininógeno-1 se escinde en las siguientes 6 cadenas, todas las cuales pueden ser posibles biomarcadores de la NAFLD: cadena pesada del cininógeno-1, T-cinina, bradicinina, lisil-bradicinina, cadena ligera del cininógeno-1 y factor promotor del crecimiento de bajo peso molecular. La T-cinina (secuencia ISLMKRPPGFSPFR; m/z 816,9558, 2+; m/z 544,9729, 3+), la bradicinina (secuencia RPPGFSPFR; m/z 530,7880, 2+; m/z 354,1944, 3+) y la lisil-bradicinina (secuencia KRPPGFSPFR; m/z 594,8355, 2+; m/z 396,8927, 3+) son péptidos cortos que pueden ser objeto de espectrometría de masas utilizando SRM, MRM, PRM, MRM3 o similar. Estas secuencias se seleccionan sin predigerir la muestra con tripsina u otras enzimas. La bradicinina se libera del cininógeno mediante la calicreína plasmática. La hidroxilación de la segunda prolina (P) en las secuencias anteriores (RPP[+16]GFSPFR; m/z 538,7854, 2+; m/z 359,5236, 3+) se produce antes de la liberación de la bradicinina, que además debería tenerse en cuenta para la selección del ion MS1.

De manera similar a la queratina de tipo I citoesquelética 18 y al cininógeno-1, se pueden seleccionar péptidos para otras proteínas que se escinden con esteatosis hepática y/o fibrosis que cubren las regiones de escisión y están a ambos lados de la región de escisión. Por ejemplo, la alfa 2 macroglobulina y el complemento C3 escindido/inalterado son proteínas con una región de escisión de tioéster dependiente de la fibrosis.

La hemoglobina A1c (HbA1c, hemoglobina glucosilada) es un componente de la hemoglobina que se une a la glucosa y los niveles elevados indican un control deficiente de la glucosa durante 6 a 8 semanas en diabéticos. La diabetes de tipo II es un factor de riesgo en la NAFLD y, por lo tanto, los niveles de HbAlc también se pueden medir además de los biomarcadores divulgados en el presente documento. En la HbA1c, la glucosa está unida a la valina (V) aminoterminal de la cadena p de la hemoglobina. La cadena p de la hemoglobina sin procesar tiene una longitud de 147 aminoácidos y el primer aminoácido es una metionina iniciadora que se elimina. Los aminoácidos restantes del 2 al 147 forman la cadena p funcional de la hemoglobina. El aminoácido valina (V) en la posición 2 es el sitio de glucosilación para la HbAlc. Generalmente, la HbAlc se mide en el hospital mediante HPLC, pero también podría analizarse mediante espectrometría de masas dirigida utilizando SRM, ^m R^m , PRM, MRM3 o similar. Si las proteínas de una muestra biológica de un paciente diabético o con NAFLD se digieren con tripsina, el péptido aminoterminal de la cadena p de la hemoglobina tiene la secuencia VHLTPEEK (m/z 476,7585, 2+; m/z 318.1748, 3+) que puede ser objeto de espectrometría de masas. La presencia de este péptido en m/z 476,7585 (2+) o m/z 318,1748 (3+) indicaría que la cadena p de la hemoglobina no está glucosilada en la valina (V) aminoterminal, mientras que la ausencia de este péptido sugeriría la glucosilación de la cadena p de la hemoglobina en la valina (V) aminoterminal. El péptido glucosilado tendrá una masa adicional de glucosa (con pérdida de una molécula de agua) con la secuencia V[+162,1]HLTPEEK (m/z 557,7850, 2+; m/z 372,1924, 3+). Esto se puede utilizar para evaluar el control de la glucosa en un paciente y para controlar la diabetes de tipo II, que es un factor de riesgo importante para la NAFLD. Este enfoque también se puede utilizar para comprobar otros sitios de glucosilación en las cadenas a y p de la hemoglobina, así como en otras proteínas.

El angiotensinógeno también es un biomarcador de la fibrosis. Las siguientes hormonas peptídicas proceden del angiotensinógeno: angiotensina-1 (DRVYIHPFHL; m/z 648,8460, 2+; m/z 432,8998, 3+), angiotensina 1-9 (DRVYIHPFH; m/z 592,3040, 2+; m/z 395,2051, 3+), angiotensina-2 (DRVYIHPF; m/z 523,7745, 2+; m/z 349,5188, 3+), angiotensina 1-7 (DRVYIHP; m/z 450,2403, 2+; m/z 300,4960, 3+), angiotensina 1-5 (DRVYI; m/z 333,1845, 2+; m/z 222,4588, 3+; no única y demasiado corta), angiotensina 1-4 (d Rv Y; m/z 276,6425, 2+; m/z 184,7641, 3+; no única y demasiado corta), angiotensina-3 (RVYIHPF; m/z 466,2611,2+; m/z 311,1765, 3+) y angiotensina-4 (VYIHPF; m/z 388,2105, 2+; m/z 259,1428, 3+). La angiotensina-2 es un activador de células estrelladas del hígado conocido en la fibrosis hepática. Estos péptidos pueden ser objeto de espectrometría de masas utilizando SRM, MRM, PRM, MRM3 o similar. Estas secuencias deben seleccionarse sin predigerir la muestra con tripsina u otras enzimas.

Dado que los péptidos del cininógeno-1 y el angiotensinógeno se liberan de manera natural a partir de su procesamiento, se pueden detectar sin necesidad de escisión con enzimas (por ejemplo, tripsina, quimotripsina, etc.). Los péptidos se pueden detectar a partir de la muestra biológica mediante la eliminación de proteínas de mayor peso molecular mediante cromatografía, filtros de corte de peso molecular, exclusión por tamaño o similar y después seleccionar el péptido mediante espectrometría de masas.

Los métodos de detección también pueden comprender el uso de un agente en donde el agente detecta de manera específica proteínas o péptidos de interés. El agente podría ser un anticuerpo o un equivalente funcional del mismo que se une a proteínas o péptidos bajo análisis (es decir, un anticuerpo antipéptido). Estos anticuerpos pueden utilizarse para realizar un inmunoensayo tal como, pero sin limitación, ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo, transferencia por puntos de proteínas, transferencia Western, turbidimetría, nefelometría y similares. El kit puede comprender además al menos una diana específica para detectar otro gen o producto génico útil como indicador de pronóstico.

Los biomarcadores también pueden detectarse mediante un inmunoensayo adecuado con agentes que se unen de manera específica al marcador de interés. Dichos agentes de unión incluyen inmunoglobulinas y equivalentes funcionales de inmunoglobulinas que se unen de manera específica a los biomarcadores de interés. Los términos "inmunoglobulina" y "anticuerpo" se utilizan indistintamente y en su sentido más amplio en el presente documento. Por lo tanto, abarcan anticuerpos monoclonales inalterados, anticuerpos policlonales, presentación en fagos de anticuerpos (APD), anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) formados por al menos dos anticuerpos inalterados, y fragmentos de anticuerpo, siempre que presenten la actividad biológica deseada. La APD implica ingeniería genética de bacteriófagos y múltiples rondas de propagación de fagos y selección guiada por antígenos.

Además de utilizar anticuerpos para detectar los biomarcadores, también se pueden utilizar anticuerpos para enriquecer los biomarcadores en la muestra biológica para ayudar con otros métodos de detección/cuantificación. Esto incluye técnicas tales como la inmunoprecipitación con proteína A, proteína G, proteína A/G o perlas de estreptavidina/avidina para anticuerpos biotinilados. Mediante inmunoprecipitación, los anticuerpos contra los biomarcadores diana podrían reticularse opcionalmente en las perlas utilizando un reticulante como el suberato de disuccinmidilo (DSS) para evitar la presencia del anticuerpo en la elución. De manera alternativa, se puede utilizar el inmunoensayo espectrométrico de masas (MSIA) para el análisis de espectrometría de masas cadena abajo de biomarcadores asociados a la NAFLD usando ^s RM, MRM, MRM3, PRM o similares. Las puntas del MSIA pueden tener proteína A, proteína G o proteína A/G para la captura de anticuerpos contra el biomarcador diana. Las puntas del MSIA pueden tener estreptavidina o avidina para la captura de anticuerpos biotinilados contra el biomarcador diana. El MSIA es particularmente útil para biomarcadores muy poco abundantes que normalmente no pueden detectarse sin enriquecimiento (tal como la queratina de tipo I citoesquelética 18).

También se describen métodos para detectar la presencia y/o medir el nivel de uno o más biomarcadores de interés en una muestra biológica, con un anticuerpo específico para el biomarcador de interés. En concreto, el método para detectar la presencia del biomarcador de interés en una muestra biológica puede comprender la etapa de poner en contacto la muestra con un anticuerpo monoclonal y detectar la unión del anticuerpo con el biomarcador en la muestra. De manera más específica, el anticuerpo puede marcarse para producir una señal detectable utilizando compuestos que incluyen, pero sin limitación, un radiomarcador, una enzima, un cromóforo y un fluoróforo.

La detección de unión específica de un anticuerpo específico para la proteína de interés, o un equivalente funcional del mismo, en comparación con un control adecuado, es una indicación de que el biomarcador está presente en la muestra. Los controles adecuados incluyen una muestra que se sabe que no contiene las proteínas de interés y una muestra puesta en contacto con un anticuerpo no específico para la proteína codificada, por ejemplo, un anticuerpo antiidiotipo. Se conocen en la materia una variedad de métodos para detectar interacciones específicas de anticuerpo y antígeno y se pueden utilizar en el método, incluidos, pero sin limitación, métodos inmunohistológicos convencionales, inmunoprecipitación, un inmunoensayo enzimático y un radioinmunoensayo. En general, el anticuerpo específico se marcará de forma detectable, ya sea directa o indirectamente. Los marcadores directos incluyen radioisótopos; enzimas cuyos productos son detectables (por ejemplo, luciferasa, 3-galactosidasa y similares); marcadores fluorescentes (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina y similares); metales emisores de fluorescencia (por ejemplo, 112Eu u otros de la serie de lantánidos, unidos al anticuerpo a través de grupos quelantes de metales tales como e Dt A); compuestos quimioluminiscentes (por ejemplo, luminol, isoluminol, sales de acridinio y similares); compuestos bioluminiscentes (por ejemplo, luciferina, aecuorina (proteína verde fluorescente) y similares). El anticuerpo puede estar unido (acoplado) a un soporte insoluble, tal como una placa de poliestireno o una perla. Los marcadores indirectos incluyen segundos anticuerpos específicos para anticuerpos específicos para la proteína codificada ("primer anticuerpo específico"), en donde el segundo anticuerpo está marcado como se describió anteriormente; y miembros de pares de unión específicos, por ejemplo, biotina y avidina, y similares. La muestra biológica puede ponerse en contacto e inmovilizarse en un soporte sólido o vehículo, tal como papel de filtro, membrana de nitrocelulosa o membrana de celulosa, que es capaz de inmovilizar células, partículas celulares o proteínas solubles. A continuación, el soporte puede lavarse con tampones o disolventes adecuados (tales como acetona para disolver la membrana de celulosa y precipitar las proteínas en la muestra biológica), seguido de la digestión de las proteínas en la muestra a péptidos mediante enzimas y a continuación detectar y cuantificar los biomarcadores mediante espectrometría de masas o poner en contacto con un primer anticuerpo específico marcado de forma detectable. Los métodos de detección son conocidos en materia y se elegirán según sea apropiado para la señal emitida por el marcador detectable. La detección generalmente se logra en comparación con los controles adecuados y los patrones adecuados.

Los métodos de detección también pueden comprender el uso de un agente para detectar cambios en las modificaciones postraduccionales de los biomarcadores en la NAFLD y a través de los estadios de la NAFLD. Estas modificaciones postraduccionales pueden incluir N-glucosilación, O-glucosilación y fosforilación.

También se describe un método para determinar el pronóstico de la NAFLD/fibrosis, que comprende: (a) determinar el nivel de una proteína seleccionada de apolipoproteína F, proteína de unión a lipopolisacáridos, ficolina-2, apolipoproteína D, cininógeno-1, apolipoproteína M, trombospondina-1, proteína de unión a Fc de IgG, cistatina-c, alfa-1-glucoproteína 2 ácida y alfa-2-glucoproteína rica en leucina en una muestra biológica obtenida de un paciente; y (b) comparar dicho nivel de (a) con un nivel de control de dicha proteína para determinar un diagnóstico positivo o negativo de dicha esteatosis hepática o fibrosis.

Métodos de terapia

También se describe un método para tratar la NAFLD. El método comprende diagnosticar la NAFLD en un individuo, detectar y cuantificar uno o más biomarcadores en una muestra biológica obtenida del individuo, en donde el uno o más biomarcadores se seleccionan de apolipoproteína F, proteína de unión a lipopolisacáridos, ficolina-2, apolipoproteína D, cininógeno-1, apolipoproteína M, trombospondina-1, proteína de unión a Fc de IgG, cistatina-c, alfa-1-glucoproteína 2 ácida y alfa-2-glucoproteína rica en leucina, administrar un agente al individuo o llevar a cabo un régimen de tratamiento en el individuo y, por lo tanto, tratar la NAFLD.

Normalmente el individuo tiene NAFLD, es decir, se le ha diagnosticado con NAFLD, o se sospecha que padece NAFLD, es decir, muestra los síntomas de la NAFLD. Como se utiliza en el presente documento, el término "tratar" incluye cualquiera de los siguientes: la prevención de la enfermedad o de uno o más síntomas asociados con la enfermedad; una reducción o prevención del desarrollo o progresión de la enfermedad o de los síntomas; y la reducción o eliminación de una enfermedad o síntomas existentes. Los tratamientos de la NAFLD/NASH tienen como objetivo reducir la morbilidad y la mortalidad relacionadas con el hígado y por todas las causas (de manera específica las cardiovasculares). La selección de un enfoque de tratamiento necesita la evaluación de la intensidad de la hepatopatía. Las estrategias de tratamiento que se pueden utilizar incluyen (i) intervención en el estilo de vida u otro régimen de pérdida de peso, con el objetivo de una pérdida de peso de >7; y (ii) tratamientos que optimizan los factores de riesgo cardiovascular, incluido el control de la glucosa en diabéticos, control de la tensión arterial o tratamiento hipolipemiante.

Los agentes que se pueden administrar para el tratamiento incluyen inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (ACE-I, del inglés angiotensin converting enzymeinhibitors)/bloqueadores del receptor de la angiotensina (ARB, del inglés angiotensin receptor blockers), que tienen posibles efectos antifibróticos, y metformina que puede reducir el riesgo de cáncer de hígado. La liraglutida es otro agente que puede utilizarse para el tratamiento, que parece mejorar la NASH más allá de su efecto sobre la pérdida de peso (estudio LEAN, Armstrong et al. Lancet 2015). También se pueden utilizar agentes terapéuticos específicos para el hígado (tales como los que se encuentran en ensayos clínicos de fase 3) dirigidos a pacientes con NASH y fibrosis más avanzada (F2-3). Los ejemplos incluyen ácido obeticólico, un derivado de ácido biliar sintético (Intercept pharmaceuticals), elafibranor, un agonista de PPAR a/d (Genfit). Actualmente hay una serie de otros fármacos candidatos en diversas etapas de desarrollo que pueden utilizarse. Una estrategia de tratamiento adicional que puede utilizarse en un individuo diagnosticado con NAFLD es la intervención quirúrgica. Por ejemplo, la cirugía bariátrica (gastrectomía vertial o la derivación gástrica en Y de Rouxen) en pacientes con obesidad mórbida.

Las vías específicas, las dosis y los métodos de administración de los agentes terapéuticos descritos en el presente documento se pueden determinar de manera rutinaria por el médico. Estos se analizan con más detalle a continuación.

Agente

Los agentes para utilizar en los métodos de tratamiento descritos en el presente documento pueden formularse en composiciones farmacéuticas. Estas composiciones pueden comprender, además del/de los principio/s terapéuticamente activo/s, un excipiente, portador, diluyente, tampón, estabilizador farmacéuticamente aceptable u otros materiales bien conocidos por los expertos en la materia. Dichos materiales no deben ser tóxicos y no deben interferir con la eficacia del principio activo. El portador o diluyente farmacéutico puede ser, por ejemplo, una solución isotónica.

Kits

También se divulga un kit que comprende medios (por ejemplo, reactivos) para detectar y cuantificar uno o más biomarcadores descritos en el presente documento en una muestra biológica de un individuo e instrucciones para el uso del kit de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento. El kit también puede incluir detalles sobre en qué individuos se puede llevar a cabo el método. Normalmente, el kit contiene uno o más agentes, (por ejemplo, un anticuerpo) que se unen de manera específica a los biomarcadores en cuestión. De manera adicional, el kit puede comprender medios para la medición de otros parámetros clínicos o de laboratorio. Los procedimientos que utilizan estos kits pueden ser realizados por laboratorios clínicos, laboratorios experimentales, médicos o particulares.

De manera adicional, el kit puede comprender uno o más de otros reactivos o instrumentos que permitan llevar a cabo el método. Dichos reactivos o instrumentos pueden incluir uno o más de los siguientes: tampón(es) adecuado(s) (soluciones acuosas), péptidos marcados de manera isotópica o no marcados, patrones de curva de calibración de péptidos, reactivos de desarrollo, enzimas, marcadores, superficies de reacción, medios de detección, muestras de control, patrones, instrucciones, información de interpretación, medios para aislar un biomarcador en cuestión de una muestra, medios para obtener una muestra del individuo (tal como un recipiente o un instrumento que comprende una aguja) o un soporte que comprende pocillos sobre los que se pueden realizar reacciones cuantitativas.

Otros biomarcadores identificados

Como se describe en los ejemplos, además de los biomarcadores preferidos descritos anteriormente identificados inicialmente mediante 2D-PAGE y espectrometría de masas, y después caracterizados con más detalle para su expresión en la NAFLD (apolipoproteína F, cininógeno-1, apolipoproteína D, apolipoproteína M, ficolina-2, alfa-1 glucoproteína 2 ácida, alfa-2-glucoproteína rica en leucina, proteína de unión a lipopolisacáridos, trombospondina-1, proteína de unión a Fc de IgG y cistatina-c), se identificaron inicialmente otros biomarcadores para la NAFLD mediante 2D-PAGE y espectrometría de masas. Estos biomarcadores adicionales se enumeran a continuación.

Por lo tanto, también se describe un método de diagnóstico, pronostico, control o estadificación de la progresión de la esteatosis hepática no alcohólica (NAFLD) en un individuo en función de la detección y cuantificación de uno o más de los siguientes biomarcadores adicionales en una muestra biológica obtenida del individuo, de este modo, se diagnostica, pronostica, sigue o estadifica la progresión de la NAFLD. La divulgación describe además un método para diagnosticar, pronosticar, controlar o estadificar la progresión de la esteatosis hepática no alcohólica (NAFLD) en un individuo, comprendiendo el método detectar y cuantificar uno o más biomarcadores en una muestra biológica obtenida del individuo, en donde el uno o más biomarcadores se seleccionan de apolipoproteína F, proteína de unión a lipopolisacáridos, ficolina-2, apolipoproteína D, cininógeno-1, apolipoproteína M, trombospondina-1, proteína de unión a Fc de IgG, cistatina-c, alfa-1-glucoproteína 2 ácida y alfa-2-glucoproteína rica en leucina, y además detectar y cuantificar uno o más de los siguientes marcadores adicionales, de este modo, se diagnostica, pronostica, controla o estadifica la progresión de la NAFLD.

Mediante la utilización de 2D-PAGE, se identificaron los siguientes biomarcadores adicionales para la NAFLD además de los biomarcadores preferidos apolipoproteína F, cininógeno-1, apolipoproteína D y apolipoproteína M: Las proteínas identificadas en características que aumentan con la intensidad de la NAFLD incluyeron antitrombina-III, alfa-1-antitripsina, región C de la cadena y-1 de Ig, factor B del complemento, alfa-2-macroglobulina, factor H del complemento, subcomponente C1r del complemento, C4-A del complemento, cadena pesada H4 del inhibidor inter-atripsina, apolipoproteína A-IV y albúmina sérica. Las proteínas identificadas en las características que disminuyen con la intensidad de la NAFLD incluyeron apolipoproteína C2, apolipoproteína C4, apolipoproteína M, apolipoproteína C­ III, apolipoproteína A-IV, clusterina, proteína APOC4-APOC2, haptoglobina, seroalbúmina, zinc-a-2-glucoproteína, cadena ligera de trombina, transtiretina, glutatión peroxidasa 3, alfa-1-antitripsina, alfa-1-antiquimotripsina, cininógeno-1 de bajo peso molecular, C3 del complemento, C4-A del complemento, cadena a de la proteína de unión a C4b, cadena ligera del factor I del complemento, subcomponente C1r del complemento, región C de la cadena a-1 de Ig, región C de la cadena k de Ig, región C de la cadena y-1 de Ig, región C de la cadena y-2 de Ig, cadena pesada H3 del inhibidor inter-a-tripsina, protrombina, factor de elongación putativo 1-a similar a 3, proteína de unión a la vitamina D, beta-2-glucoproteína 1 y alfa-2-HS-glucoproteína.

Se observó que tres características proteínicas aumentaban en intensidad desde la NAFL hasta la NASH F0/F1 y después disminuían en intensidad en la NASH F3 y las proteínas identificadas en estas características incluyen el subcomponente C1 del complemento, C3 del complemento, haptoglobina, apolipoproteína A-IV, seroalbúmina, región C de la cadena ^k de Ig y apolipoproteína A-I. Se identificaron algunas proteínas en características que aumentaban y disminuían en la NAFLD, lo que podría deberse a una modificación postraduccional o a la expresión diferencial de diferentes fragmentos de la proteína y estas proteínas incluían la alfa-1-antitripsina, región C de la cadena y-1 de Ig, subcomponente C1r del complemento, C4-A del complemento, apolipoproteína A-IV y albúmina sérica.

Mediante la utilización de la espectrometría de masas y la TMT, se identificaron los siguientes biomarcadores adicionales para la NAFLD además de los biomarcadores preferidos ficolina-2, alfa-1 glucoproteína 2 ácida, alfa-2-glucoproteína rica en leucina, proteína de unión a lipopolisacáridos, trombospondina-1, proteína de unión a Fc de IgG y cistatina-c: Las proteínas identificadas que aumentan con la intensidad de la NAFLD incluyen cistatina-C (P01034), fosfatidilinositol-glucano fosfolipasa D específica (P80108), proteína 3 similar al dominio Rap/Ran-GAP activadora de la GTPasa (Q5VVW2), región DEE de la cadena ^k V-I de Ig (P01597), ficolina-3 (O75636), alfa-2-HS-glucoproteína (P02765), proteína similar al factor de crecimiento de hepatocitos (P26927), anhidrasa carbónica 1 (P00915), región WAH de la cadena pesada V-II de Ig (P01824), región Mev de la cadena ^k V-I de Ig (P01612), properdina (P27918), región HAH de la cadena k V-III de Ig (P18135), subunidad p de la hemoglobina (P68871), factor de von Willebrand (P04275), subunidad a de la hemoglobina (P69905), región Ni de la cadena ^k V-I de Ig (P01613), región EU de la cadena ^k V-I de Ig(P01598), región C de la cadena a-1 de Ig (P01876), SPARC (P09486), fibronectina (P02751), proteína básica plaquetaria (P02775) y factor plaquetario 4 (P02776). Las proteínas identificadas que disminuyen con la intensidad de la NAFLD incluyeron la proteína de la zona de embarazo (P20742), apolipoproteína(a) (P08519), cadena A del factor de coagulación XIII (P00488), proteína de unión a galectina-3 (Q08380), adiponectina (Q15848), actina citoplasmática 1 (P60709), apolipoproteína A-II (P02652), alfa-2-antiplasmina (P08697), inhibidor de la peptidasa 16 (Q6UXB8), zinc-alfa-2-glucoproteína (P25311), alfa-1 glucoproteína 2 ácida (P19652), factor de coagulación XI (P03951), componente P de amiloide sérico (P02743), inhibidor de la proteasa dependiente de la proteína Z (Q9UK55), antígeno de diferenciación de monocitos CD14 (P08571), subunidad lábil ácida del complejo de proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina (P35858) y apolipoproteína L1 (014791).

T ambién se pueden analizar uno o más de los siguientes biomarcadores además de los biomarcadores/combinaciones de biomarcadores de los métodos descritos en el presente documento: afamina, alanina aminotransferasa (ALT), alfa-1B-glucoproteína, alfa-1-macroglobulina, alfafetoproteína (AFP), angiotensina 2, angiotensinógeno, apolipoproteína A-1, apolipoproteína C1, apolipoproteína C2, apolipoproteína E, receptor 1 de la asialoglucoproteína, receptor 2 de la asialoglucoproteína, aspartato aminotransferasa (AST), beta 2 microglobulina, bilirrubina, biotinidasa, colesterol en la sangre, glucemia (en ayunas y/o posprandial), triglicéridos en sangre, nitrógeno ureíco en sangre (BUN), bradicinina, proteína reactiva con C (CRp), carboxipeptidasa N2, cadena p de la proteína de unión a C4b, proteína similar al antígeno CD5 (CD5L), ceruloplasmina, proteína 1 similar a la quitinasa-3, colágenopeptidasa, C3 del complemento (incluido C3dg y su escisión en el sitio del tioéster entre los aminoácidos 1010 a 1013), proteína 1 relacionada con el factor H del complemento, factor de crecimiento del tejido conjuntivo, colágeno IV, colágeno VI, colágeno XIV, colagenasa de tipo IV de 72 kDa, globulina de unión a corticosteroides, creatinina, dickkopf-1, molécula de adhesión de células epiteliales, cadena y de fibrinógeno, proteína 5 que contiene el dominio de fibronectina de tipo III, ficolina-1, recuento sanguíneo completo, galactosilhidroxilisil-glucosiltransferasa, gamma-glutamil transpeptidasa, gelatinasa B, gelsolina, glipicano-3, proteína de la membrana de Golgi 1, haptoglobina (incluida la cadena p a pH 5,46-5,49 con polisacáridos que son principalmente biantenarios, mono o disialilados con apenas estructuras tri o tetraantenarias/sialiladas y menos ácido siálico y más estructuras monosialiladas que las otras isoformas de haptoglobina de menor pH), proteína relacionada con la haptoglobina, hemoglobina A1 c, hemopexina, lipoproteína de alta densidad (HDL), ácido hialurónico, cadena J de inmunoglobulina, inhibidor de la inter-a-tripsina (HI, H2, H5, H6), molécula 1 de adhesión intercelular, irisina, subunidad de laminina a/p/Y (incluido el fragmento PI de laminina), lecitina colesterol acil-transferasa, pruebas de función hepática, lipoproteína de baja densidad (LDL), lisilhidroxilasa, lisiloxidasa, metaloproteinasas de matriz (MMP-1 a M^m P-28), inhibidores de las metaloproteinasas (TIMP1, TIMP2, TIMP3 y TIMP4), proteína 4 asociada a microfibrillas, monoamina oxidasa, N-acetil-p-d-glucosaminidasa, osteopontina, peroxirredoxina-2, fosfatidilcolina-esterol aciltransferasa, factor procedente del epitelio pigmentario, recuento de plaquetas, factor de crecimiento procedente de plaquetas, procolágeno de tipo I (incluido el propéptido aminoterminal y el propéptido carboxiterminal), procolágeno de tipo III (incluido el procolágeno inalterado, el propéptido aminoterminal, el propéptido carboxiterminal, el propéptido Col 1-3 completo), dominio globular del propéptido Col-1), prolilhidroxilasa, 14-3-3 proteína 9/8, proteína a Mb P, protrombina (índice/tiempo de protrombina/relación INR), resistina, proteína 4 de unión al retinol, proteína 4 similar a la sal, suero paraoxonasa/arilesterasa 1, globulina de unión a hormonas sexuales, SNC73, talina-1, tenascina, trombospondina-2, trombospondina-3, trombospondina-4, trombospondina-5, transferrina, factor de crecimiento transformante a (TGF-a), factor de crecimiento transformante p-1 (TGF p-1), tropomiosina (1-4), factor de necrosis tumoral (TNF a), colágeno de tipo IV (incluido el dominio de reticulación carboxiterminal del fragmento NC1 PIVP y el dominio 7S/colágeno 7S), colágeno de tipo VI, ondulina, molécula de adhesión de células vasculares y/o vitronectina.

Ejemplos

Proteínas expresadas de manera diferencial establecidas cuando se compara plasma de pacientes con diferentes estadios de NAFLD

Los inventores han descubierto que varias proteínas se expresan de manera diferencial en muestras de suero humano de pacientes con NAFLD. Se compararon los siguientes grupos: NAFL, NASH sin fibrosis F0, NASH con fibrosis leve F1 y NASH con fibrosis avanzada F3. Este descubrimiento se logró mediante la comparación de estas muestras de suero utilizando dos métodos proteómicos: Electroforesis bidimensional en gel de poliacrilamida (2D-PAGE, del inglés two dimensional polyacrylamide gel electrophoresis) y espectrometría de masas basada en TMT.

Ejemplo 1 - Electroforesis bidimensional en gel de poliacrilamida (2D-PAGE)

Para identificar biomarcadores de la NAFLD, las muestras de suero se analizaron mediante dos enfoques proteómicos basados en 2D-PAGE. Se analizaron los siguientes estadios de la NAFLD: NAFL, NASH sin fibrosis F0, NASH con fibrosis leve F1 y NASH con fibrosis avanzada F3.

En el primer enfoque, se agotaron doce proteínas séricas muy abundantes de todas las muestras de NAFLD mediante inmunoprecipitación utilizando la columna giratoria de agotamiento de proteínas abundantes Top 12 (Thermo Scientific, Loughborough, Reino Unido) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las 12 proteínas que se agotaron fueron alfa 1-glucoproteína ácida, alfa 1 -antitripsina, alfa 2-macroglobina, albúmina, apolipoproteína A-I, apolipoproteína A-II, fibrinógeno, haptoglobina, IgA, IgG, IgM y transferrina. Se separaron cincuenta miligramos de proteínas séricas agotadas mediante carga utilizando un gradiente no lineal de pH 3 a 11 de 7 cm en la primera dimensión del gel seguido del peso molecular (tamaño) en la segunda dimensión utilizando un gradiente de SDS-PAGE del 4 al 12 % (p/v). Se realizaron electroforesis, tinción fluorescente y escaneo de geles según lo descrito por Gangadharan et al., (2007), Clin Chem, 53, 1792.

En el segundo enfoque, se separaron dos miligramos de proteínas séricas no agotadas mediante carga utilizando un gradiente no lineal de pH 3 a 5,6 en la primera dimensión seguido del peso molecular (tamaño) en la segunda dimensión utilizando un gradiente de SDS-PAGE del 9 al 16 % (p/v). Se realizaron electroforesis, tinción fluorescente y escaneo de geles según lo descrito por Gangadharan et al., (2012), PLoS ONE, 7, e39603; Gangadharan et al., (2011), Nature Protocol Exchange, doi:10.1038/protex.2011.261 y Gangadharan et al., (2011), J Proteome Res, 10, 2643.

Ejemplo 2 - Análisis de imagen diferencial e identificación de proteínas

La matriz bidimensional de puntos generada se comparó entre los diferentes estadios de la NAFLD mediante análisis de imágenes asistido por computadora. Las imágenes escaneadas de todos los geles 2D-PAGE se analizaron mediante un análisis de imágenes asistido por computadora utilizando el programa informático Progenesis SameSpots (Nonlinear Dynamics Limited, Newcastle, Reino Unido). Las imágenes se procesaron en un flujo de trabajo lineal automatizado, que incluía alineación de gel, detección de puntos, separación de puntos y análisis estadístico. La detección de puntos produjo un conjunto de datos completo ya que todos los geles contenían la misma cantidad de puntos, cada uno emparejado con su punto correspondiente en todos los geles. No hubo valores perdidos, lo que permitió aplicar un análisis estadístico válido. Solo se consideraron estadísticamente significativos los cambios expresados de manera diferencial que fueron 1,5 veces o más diferentes y que también tuvieran un valor p de ANOVA <0,05 para un 95 % de confianza. Todos los cambios que se muestran en la lista se visualizaron y confirmaron en todos los geles. Se observaron un total de 15 características expresadas de manera diferencial mediante los geles de pH 3 a 11 con suero empobrecido. Se observaron un total de 38 características expresadas de manera diferencial mediante los geles de pH 3 a 5,6 con suero no empobrecido. En general, se identificaron 11 proteínas con características que aumentaban con la intensidad de la NAFLD y 35 proteínas con características que disminuían con la intensidad de la NAFLD (es decir, un total de 46 proteínas). En la figura 1 se muestran ejemplos de características expresadas de manera diferencial. Estas características expresadas de manera diferencial se eliminaron de los geles, las proteínas de los fragmentos de gel se digirieron con tripsina y los péptidos se analizaron mediante espectrometría de masas para identificar los biomarcadores de manera esencial como lo describe Gangadharan et al., (2007), Clin. Chem., 53, 1792 y Gangadharan et al., (2012), PLoS ONE, 7, e39603.

Las proteínas en las muestras de suero de la NAFLD se separaron mediante SDS-PAGE seguida de transferencia Western con anticuerpos contra los nuevos biomarcadores. Se demostró que la apolipoproteína F y el cininógeno-1 disminuyen en todos los estadios de la NAFLD. La apolipoproteína D fue mayor en los controles sanos en comparación con todos los estadios de la NAFLD, lo que sugiere que tiene el potencial de ser un marcador temprano de la NAFLD y es capaz de diferenciar los controles sanos de los pacientes con NAFLD. Los niveles de apolipoproteína M parecían ser coherentes en los controles sanos y en todos los estadios de la NAFLD, excepto NASH F3, lo que sugiere que se trata de un biomarcador de la fibrosis avanzada. Las transferencias de Western para estos cuatro biomarcadores de la NAFLD se muestran en la figura 2 y estos cuatro biomarcadores se consideraron como biomarcadores particularmente preferidos de la lista original de 46 proteínas identificadas al principio mediante 2D-PAGE.

Ejemplo 3 - Espectrometría de masas basada en TMT

Se analizaron dos muestras de suero de cada una de los siguientes cinco estadios: 1) individuos sanos, 2) NAFL, 3) NASH sin fibrosis F0, 4) NASH con fibrosis leve F1 y 5) NASH con fibrosis avanzada F3. Las proteínas de estas diez muestras se digirieron con tripsina y los péptidos trípticos se marcaron con un marcador de masa en tándem (TMT) marcado con isótopos isobáricos de acuerdo con el protocolo del fabricante (Life Technologies). Las diez muestras con péptidos marcados con TMT se mezclaron y analizaron mediante LC-MS/MS usando el espectrómetro de masas Dionex Ultimate 3000 UHPLC y Thermo Q Exactive híbrido cuadrupolo-Orbitrap. Con este método se observaron un total de 54 proteínas séricas expresadas de manera diferencial. En la figura 3 se muestran ejemplos de proteínas expresadas de manera diferencial basadas en datos de TMT de cuantificación relativa.

Las 54 proteínas expresadas de manera diferencial fueron objetivo de la PRM, con tres péptidos para cada proteína siempre que fue posible, utilizando digestiones trípticas de las muestras de suero. Esta verificación de validación ayudó a identificar cuáles de los 54 posibles biomarcadores de la NAFLD eran los más prometedores. De las 54 proteínas, se encontró que 8 proteínas no identificadas previamente en el ejemplo 2 eran biomarcadores particularmente prometedores (dando así un total de 12 biomarcadores particularmente prometedores, incluidos los 4 enumerados en el ejemplo 2). De la lista de 8 proteínas, la ficolina-2, la adiponectina, la alfa-1-glucoproteína 2 ácida y la alfa-2-glucoproteína rica en leucina mostraron una disminución en los estadios de la NAFLD mientras que la proteína de unión a lipopolisacáridos, la trombospondina-1, la proteína de unión a IgG Fc y la cistatina-c mostraron un aumento en los estadios de la NAFLD. Los datos de la PRM para estos 8 biomarcadores de la NAFLD junto con la apolipoproteína D se muestran en la figura 4.

Ejemplo 4 - Escala de puntuación de la NAFLD y/o la fibrosis

Se puede formular una escala de puntuación para la NAFLD y/o la fibrosis para cada uno de los nuevos biomarcadores. La concentración promedio de estos biomarcadores en sangre capilar, sangre venosa, sangre arterial, suero, plasma u otro líquido corporal se determina en los diversos estadios de la NAFLD y/o de la fibrosis hepática. En la NAFLD, la escala de Kleiner-Brunt de 0 a 4 se utiliza actualmente para evaluar la fibrosis hepática en la clínica, donde 0 representa la ausencia de fibrosis, 1 a 3 representan los estadios intermedios de la fibrosis en intensidad creciente de leve a moderada/intensa y 4 es cirrosis (Kleiner, (2005), Hepatology, 41, 1313). La fibrosis también se puede estadificar en otras escalas similares de 0 a 4 (tal como Metavir, Knodell) o de 0 a 6, donde 0 representa ausencia de fibrosis, 1 a 5 representan los estadios intermedios de la fibrosis en intensidad creciente de leve a moderada/intensa y 6 es cirrosis (Ishak, (1995), J Hepatol, 22, 696). Mediante la determinación de los intervalos de concentración de los nuevos biomarcadores en estos estadios, se puede asignar un algoritmo de puntuación matemática similar al de Kleiner-Brunt o similar para ayudar a proporcionar información sobre la estadificación y el pronóstico. Los resultados aditivos de las puntuaciones de más de uno de los nuevos biomarcadores pueden dar una indicación más fiable del grado de fibrosis en lugar de examinar los biomarcadores individuales. El método de puntuación puede no seguir necesariamente las puntuaciones existentes, tales como Kleiner-Brunt, Ishak, Metavir, Knodell o similar y puede ser una nueva escala de puntuación para ayudar a determinar el estadio de la NAFLD y/o de la fibrosis y determinar si es necesario un tratamiento.

Ejemplo 5 - Cuantificación mediante espectrometría de masas

Se puede utilizar un enfoque sin anticuerpos mediante espectrometría de masas para determinar el estadio de la NAFLD y/o de la fibrosis mediante la detección y/o cuantificación de uno o más biomarcadores de interés. Las proteínas de la muestra biológica (sangre capilar, sangre venosa, sangre arterial, suero, plasma u otro líquido corporal) normalmente se desnaturalizan con urea o similares. Las proteínas se pueden reducir opcionalmente (con ditiotreitol, tris(2-carboxietil)fosfina, beta mercaptoetanol o similar) y alquilar (con yodoacetamida o similar) y estas etapas normalmente se llevan a cabo antes de la digestión aunque pueden llevarse a cabo después de la digestión. Las proteínas se digieren con una enzima como la tripsina, quimotripsina o similares. En el caso de la tripsina, ésta también incluye tripsina inmovilizada para una digestión de mayor rendimiento, tal como Flash Digest de Perfinity Biosciences (también llamado SMART Digest de Thermo Scientific). La digestión de proteínas se puede llevar a cabo mediante digestión en solución, preparación de muestras asistida por filtro (FASP), digestión en gel (donde la muestra se ejecuta en un gel SDS-PAGE, opcionalmente se tiñe y se extirpa para la digestión o se vierte en un bloque de gel de poliacrilamida antes de la digestión), digestión de enzimas inmovilizadas (tal como Flash Digest de Perfinity Biosciences o SMART Digest de Thermo Fisher Scientific) o similares. Los patrones de péptidos marcados con isótopos se pueden agregar a la muestra biológica antes o después de la digestión y estos incluyen péptidos sintéticos, péptidos IGNIS, péptidos PEPotec, péptidos AQUA, péptidos SpikeTide, péptidos con marcador epitópico distintivo de proteína (QPrEST), péptidos sintetizados en fase sólida asistidos por microondas, péptidos distintivos concatenados codificados por genes QconCAT o similares.

Se conocen los sitios de división de proteínas para diferentes enzimas, tal como la tripsina, por lo que los biomarcadores se digieren de manera informática de forma manual o utilizando un programa informático (tal como Skyline, PinPoint o similar) para ayudar a determinar los péptidos adecuados para la cuantificación dirigida. Normalmente, los péptidos seleccionados tienen más de 7 aminoácidos, menos de 25 aminoácidos, no están modificados (tal como glucosilación, fosforilación o similares) y no contienen metionina, aunque los péptidos fuera de este criterio no deben excluirse por completo. Las bases de datos en línea tales como, pero sin limitación, PeptideAtlas y la base de datos Global Proteome Machine (gpmdb), ayudan a determinar los péptidos comúnmente observados para las proteínas de interés. Se puede utilizar MRMaid para ayudar a diseñar ensayos para la cuantificación dirigida basada en espectrometría de masas sugiriendo péptidos e iones MS2 a controlar a partir de espectros experimentales de la base de datos PRIDE. Se utiliza Protein BLAST para comprobar la singularidad del péptido seleccionado. Si se encuentra que un péptido no es único, entonces se seleccionaría otro péptido dentro de la secuencia del biomarcador.

Antes de la espectrometría de masas, los péptidos digeridos se pueden fraccionar utilizando el enriquecimiento de fosfopéptidos, el enriquecimiento de glucopéptidos, el fraccionamiento de fase inversa de pH elevado o similares. Los péptidos se pueden separar mediante cromatografía líquida de fase inversa, cromatografía líquida de interacción hidrófila (HILIC), cromatografía de intercambio iónico, enfoque isoeléctrico o similar.

La SRM/MRM se realiza mediante un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo que tiene tres cuadrupolos que incluyen instrumentos como el Thermo TSQ Quantiva, Waters Xevo TQ-S, Agilent 6495, Bruker EVOQ, ABSciex 3500, Shimadzu 8050 o similar. La PRM se realiza mediante un espectrómetro de masas híbrido cuadrupolo-Orbitrap, tal como un Thermo Q Exactive y sus variantes o un Thermo Fusion y sus variantes. La MRM3 se realiza mediante un espectrómetro de masas QTRAP tal como el ABSciex QTRAP 6500.

El área bajo la curva (ABC) de los iones fragmentados se puede utilizar para cuantificar relativamente los niveles de las proteínas de interés. Se pueden utilizar cantidades conocidas de péptidos pesados puros sintéticos marcados, tal como péptidos AQUA o similares, con la misma secuencia que los péptidos preseleccionados para establecer una curva de calibración que ayude a determinar la concentración absoluta de las proteínas. Como alternativa, se puede llevar a cabo una cuantificación absoluta utilizando el kit de cuantificación de péptidos personalizado HeavyPeptide IGNIS Prime de Life Technologies.

Los inventores también proponen que cualquier biomarcador que se escinda o tenga una región de interés podría ser objeto de espectrometría de masas con patrones peptídicos que cubran estas regiones de escisión o regiones de interés para utilizar en un ensayo de espectrometría de masas.

Ejemplo 6 - Inmunoensayo

Se puede realizar un inmunoensayo para evaluar los niveles de biomarcadores, tal como el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo, transferencia por puntos de proteínas, transferencia Western, turbidimetría, nefelometría y similares.

En el caso de un ELISA, el ensayo se puede realizar en una placa de 96 pocillos. Una opción es utilizar el ELISA de unión de un sitio no competitivo. En este ensayo, se prepara la sangre capilar, sangre venosa, sangre arterial, suero, plasma u otro líquido corporal junto con concentraciones conocidas de antígeno en un tampón tal como un tampón de bicarbonato, se añade a la placa de 96 pocillos y se incuba durante un período determinado, tal como durante la noche a 4 °C. A continuación, los pocillos se lavan con una solución tal como solución salina tamponada con fosfato (PBS) y Tween (PBS-T), o similar, seguido de bloqueo con una solución de PBS que contiene albúmina de suero bovino o similar. Después de un período de incubación (tal como 37 °C durante 1 hora), se añade un anticuerpo primario dirigido contra el antígeno (en este ejemplo, el biomarcador de interés), la placa se incuba durante un período (tal como 37 °C durante 1 hora) y después se lava con PBS-T o similar. Un anticuerpo secundario conjugado (tal como la peroxidasa de rábano picante), dirigida contra el origen animal del anticuerpo primario, se añade a continuación y la placa se incuba durante un período (tal como 37 °C durante 1 hora) seguido de lavados con PBS-T o similar. Por último, se añade un sustrato (por ejemplo, sustrato de peroxidasa tal como ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenztiazolin-6-sulfónico, ABTS) a cada pocillo y se lee la absorbencia en un lector de placas (por ejemplo, a 405 nm después de 30 minutos para ABTS).

De manera alternativa, se puede utilizar un ELISA de tipo sándwich. En este tipo de ensayo, se une un anticuerpo al fondo de un pocillo de la placa. El antígeno, en este caso la proteína del biomarcador, se añade y los productos no unidos se eliminan mediante lavado. A continuación, se añade un segundo anticuerpo marcado que se une al antígeno. Se cuantifica la cantidad de anticuerpo secundario unido, generalmente de manera colorimétrica. Además de los nuevos biomarcadores, los inventores proponen que cualquier biomarcador que se escinda o tenga una región de interés podría generar anticuerpos que se dirijan a estas regiones de escisión o regiones de interés para utilizar en un inmunoensayo.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un método para diagnosticar, pronosticar, controlar o estadificar la progresión de la esteatosis hepática no alcohólica (NAFLD) en un individuo, comprendiendo el método detectar y cuantificar el biomarcador apolipoproteína F en una muestra biológica obtenida del individuo, comparar el nivel del biomarcador con una muestra de control o una muestra/nivel de referencia y determinar si el nivel del biomarcador es indicativo de progresión de la NAFLD y, por lo tanto, diagnosticar, pronosticar, controlar o estadificar la progresión de la NAFLD, en donde un nivel decreciente de la apolipoproteína F, en comparación con una muestra de control o una muestra/nivel de referencia, indica una intensidad creciente de la NAFLD a medida que avanza a través de los estadios, y en donde la muestra biológica es sangre, suero o plasma.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el método comprende la estadificación de la progresión de la NAFLD, en donde la NAFLD se estadifica como esteatosis hepática no alcohólica, esteatohepatitis no alcohólica, fibrosis hepática o cirrosis.

3. El método de la reivindicación 2, en donde la NAFLD se estadifica como esteatosis hepática no alcohólica.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el biomarcador son los aminoácidos 165 a 326 de la apolipoproteína F.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende detectar y cuantificar el biomarcador apolipoproteína F y uno o más, dos o más, o tres o más biomarcadores seleccionados de la proteína de unión a lipopolisacáridos, ficolina-2, apolipoproteína D, cininógeno-1, apolipoproteína M, trombospondina-1, proteína de unión a Fc de IgG, cistatina-c, alfa-1-glucoproteína 2 ácida y alfa-2-glucoproteína rica en leucina.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende detectar y cuantificar el biomarcador apolipoproteína F y uno, dos o los tres biomarcadores proteína de unión a lipopolisacáridos, ficolina-2 y apolipoproteína D.

7. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 y 6, que comprende además detectar y cuantificar uno o más biomarcadores seleccionados de alfa-1-glucoproteína 2 ácida y trombospondina-1.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende además detectar y cuantificar: (i) el biomarcador adiponectina;

(ii) el biomarcador queratina de tipo I citoesquelética 18 y opcionalmente su escisión entre los aminoácidos 397/398; y/o

(iii) productos de escisión de una proteína, seleccionada de cininógeno-1, queratina de tipo I citoesquelética 18 y angiotensinógeno.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende detectar y cuantificar el biomarcador apolipoproteína F y uno o más biomarcadores seleccionados de la proteína de unión a lipopolisacáridos, ficolina-2, adiponectina, apolipoproteína D, alfa-1-glucoproteína 2 ácida y trombospondina-1.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 5, 6 o 9, en donde

un nivel decreciente de ficolina-2, en comparación con una muestra de control o una muestra/nivel de referencia, indica una intensidad creciente de la NAFLD;

un nivel decreciente de apolipoproteína D, en comparación con una muestra de control o una muestra/nivel de referencia, indica una intensidad creciente de la NAFLD;

y/o

un nivel creciente de la proteína de unión a lipopolisacáridos, en comparación con una muestra de control o una muestra/nivel de referencia, indica una intensidad creciente de la NAFLD.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el individuo ya está diagnosticado de NAFLD.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la muestra se analiza mediante:

(i) un método de espectrometría de masas, opcionalmente en donde el método de espectrometría de masas: (a) es la monitorización de reacciones paralelas (PRM), monitorización de reacciones seleccionadas (SRM), monitorización de reacciones múltiples (MRM) o fragmentación de múltiples etapas en MRM al cubo (MRM3); y/o

(b) detecta péptidos procedentes de uno o más biomarcadores seleccionados de la apolipoproteína F, proteína de unión a lipopolisacáridos, ficolina-2, adiponectina, apolipoproteína D, cininógeno-1, apolipoproteína M, trombospondina-1, proteína de unión a Fc de IgG, cistatina-c, alfa-1 glucoproteína 2 ácida, alfa-2-glucoproteína rica en leucina y queratina de tipo I citoesquelética 18; o

(ii) un inmunoensayo, opcionalmente en donde el inmunoensayo es ELISA, un radioinmunoensayo, transferencia por puntos de proteínas, transferencia Western, turbidimetría o nefelometría.

13. El método de la reivindicación 12, en donde la muestra se analiza mediante un método de espectrometría de masas y detecta uno o más de los péptidos SLPTEDCENEK, SGVQQLIQYYQDQK, DANISQPETTK y/o SYDLDPGAGSLEI procedentes de la apolipoproteína F.

14. Un método de puntuación para determinar la intensidad de la NAFLD, comprendiendo el método detectar y cuantificar el biomarcador apolipoproteína F en una muestra biológica obtenida del individuo, comparar el nivel del biomarcador con una muestra de control o una muestra/nivel de referencia para obtener una puntuación, en donde un nivel decreciente de la apolipoproteína F, en comparación con una muestra de control o una muestra/nivel de referencia, indica una intensidad creciente de la NAFLD a medida que avanza a través de los estadios, y en donde la muestra biológica es sangre, suero o plasma.

15. El método de la reivindicación 14, que comprende detectar y cuantificar el biomarcador apolipoproteína F y uno o más biomarcadores seleccionados de la proteína de unión a lipopolisacáridos, ficolina-2, apolipoproteína D, cininógeno-1, apolipoproteína M, trombospondina-1, proteína de unión a Fc de IgG, cistatina-c, alfa-1-glucoproteína 2 ácida y alfa-2-glucoproteína rica en leucina, en donde el nivel de dichos biomarcadores se compara con una muestra de control o una muestra/nivel de referencia para obtener una puntuación.