ES2940686T3 - Fabricación de formulaciones de cacahuete para la desensibilización oral - Google Patents

Abstract

La presente solicitud se refiere a un método para gestionar el proceso de desarrollo y fabricación de una formulación terapéuticamente eficaz. Las proteínas de maní se caracterizan a partir de harina de maní y formulaciones encapsuladas hechas con harina de maní para inmunoterapia oral de alergias al maní. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Fabricación de formulaciones de cacahuete para la desensibilización oral

Referencia cruzada

Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de los EE. UU. N° 61/784.964, presentada el 14 de marzo de 2013.

Esta solicitud está relacionada con la solicitud provisional de los EE. UU. N° 61/784.863, presentada el 14 de marzo de 2013, con el título "Formulaciones de cacahuete y usos de las mismas" (número de expediente del abogado 43567-702.101).

Antecedentes de la invención

Las alergias afectan a los seres humanos y a los animales de compañía, y algunas reacciones alérgicas (por ejemplo, a insectos, alimentos, látex y medicamentos) pueden ser tan graves que pueden suponer un riesgo para la vida.

Las reacciones alérgicas se producen cuando el sistema inmunitario de un sujeto responde a un alérgeno. Normalmente, no hay reacción alérgica la primera vez que un sujeto se expone a un alérgeno en particular. Sin embargo, es la respuesta inicial a un alérgeno lo que prepara el sistema para reacciones alérgicas posteriores. En particular, el alérgeno es absorbido por células presentadoras de antígenos (APC; por ejemplo, macrófagos y células dendríticas) que degradan el alérgeno y luego muestran fragmentos de alérgeno a las células T. Las células T, en particular las células T "auxiliares" CD4+, responden secretando una colección de citocinas que tienen efectos sobre otras células del sistema inmunitario. El perfil de citocinas secretadas por las células T CD4+ que responden determina si las exposiciones posteriores al alérgeno inducirán reacciones alérgicas. Dos clases de células T CD4+ (Thl y Th2; linfocitos T de tipo auxiliar) influyen en el tipo de respuesta inmunitaria que se genera contra un alérgeno. La respuesta inmunitaria de tipo Thl implica la estimulación de la inmunidad celular frente a alérgenos y agentes infecciosos y se caracteriza por la secreción de IL-2, IL-6, IL-12, IFN-gamma y TNF-beta por las células auxiliares T CD4+ y la producción de anticuerpos IgG. La exposición de las células T CD4+ a los alérgenos también puede activar las células para que se conviertan en células Th2, que secretan IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13. La producción de IL-4 estimula la maduración de las células B que producen anticuerpos IgE específicos para el alérgeno. Estos anticuerpos IgE específicos de alérgeno se unen a los receptores de mastocitos y basófilos, donde inician una respuesta inmunitaria rápida a la siguiente exposición al alérgeno. Cuando el sujeto se encuentra con el alérgeno por segunda vez, el alérgeno se une rápidamente a estas moléculas de IgE asociadas a la superficie, lo que da como resultado la liberación de histaminas.y otras sustancias que desencadenan reacciones alérgicas. Se sabe que los sujetos con altos niveles de anticuerpos IgE son particularmente propensos a las alergias.

Yonghua Zhuang et al, "Redefining the major peanut allergens", Immunologic Research, vol. 55, núm. 1-3, páginas 125 - 134: tiene como objetivo identificar las proteínas que son los alérgenos más activos en el cacahuete. Yonghua Zhuang et al concluyeron que Ara h 2 y Ara h 6 son los principales alérgenos del cacahuete.

Fung Irene et al, " Relating microarray component testing and reported food allergy and food-triggered atopic dermatitis: a real-world analysis", Annals of Allergy, Asthma & Immunology, vol. 110, núm. 3, páginas 173 -177: tiene como objetivo caracterizar las asociaciones entre los resultados de un sistema de micromatrices automatizado y la alergia alimentaria autoinformada y la dermatitis atópica desencadenada por alimentos. El sistema automatizado de micromatrices analizó los componentes de la leche (Bos d 4, Bos d 5, Bos d 8, Bos d lactoferrina), huevo (Gal d 1, Gal d 2, Gal d 3, Gal d 5) y cacahuete (Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3 y Ara h 6). Fung et al concluyeron que una gran diversidad de componentes de alérgenos alimentarios se relaciona bien con el historial autoinformado de alergia alimentaria y dermatitis atópica asociada a alimentos.

Singh, H. et al. (2011) se relaciona con un estudio de varias condiciones de RP-HPLC para detectar alérgenos de cacahuete. Pingalí, K et al. (2011) se relaciona con un estudio de los efectos del orden de mezcla de Cab-O-Sil y estearato de magnesio y microcapas durante la mezcla en las propiedades de la mezcla y la tableta.

Koppleman, SJ et al. (1999) se relaciona con un estudio de cambios conformacionales inducidos por calor de Ara h1. lehmann, K et al. (2006) se relaciona con un estudio de la estructura y estabilidad de los alérgenos de cacahuete tipo albúmina 2S y las implicaciones para la gravedad de las reacciones alérgicas al cacahuete. O'Connell R. (2012) se relaciona con los usos de tamices en la industria farmacéutica y la demanda de contaminación reducida.

Fu, TJ (2013) se relaciona con el impacto del procesamiento térmico en la detección ELISA de alérgenos de cacahuete. Sampson, H. A. et al (2011) se relaciona con un desafío alimentario oral de fase II, aleatorizado, doble ciego, de grupos paralelos y controlado con placebo ensayo de Xolair (omalizumab) en la alergia al cacahuete.

El documento WO 2012/123759 A1 se refiere a la inmunoterapia oral para la desensibilización de pacientes que son hipersensibles al alérgeno del cacahuete.

Podczek, F. et al (1999) se refiere al llenado de gránulos en cápsulas de gelatina dura.

Tan, S. B. y Newton,J. M. (1990) se refiere a la fluidez del polvo como una indicación del rendimiento de llenado de la cápsula.

Careri, M. et al (2007) se relaciona con el uso de biomarcadores de péptidos específicos para la confirmación cuantitativa de proteínas de cacahuete alergénicas ocultas Ara h 2 y Ara h 3/4 para el control de alimentos mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem.

Bernard, H. et al (2007) se relaciona con la identificación de una nueva isoforma Ara h 6 natural y de su producto proteolítico como alérgenos principales en el cacahuete.

Koppleman, S. J. et al (2010) se relaciona con la digestión de alérgenos de cacahuete Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3 y Ara h 6: un estudio comparativo in vitro y caracterización parcial de péptidos resistentes a la digestión.

Sumario de la invención

La invención proporciona un método para preparar una formulación en cápsula adecuada para la desensibilización de la alergia al cacahuete que comprende,

(a) mezclar harina de cacahuete con diluyente, deslizante y lubricante;

(b) descargar el material mezclado;

(c) pasar el material mezclado a través de un tamiz de malla; y

(d) encapsular el polvo mezclado;

en donde:

- la cápsula comprende 0,5 mg, 1 mg, 10 mg, 100 mg, 475 mg o 1000 mg de proteína de cacahuete;

- la cápsula se puede abrir y el contenido se puede mezclar con alimentos para enmascarar el sabor inmediatamente antes de la administración;

- la harina de cacahuete comprende las proteínas de cacahuete Ara h1, Ara h2 y Ara h6, y - se controla la proporción de Ara h1, Ara h2 y Ara h6.

En cualquiera de dichos métodos, la harina de cacahuete comprende proteínas de cacahuete controladas. Las proteínas de cacahuete comprenden Ara h1, Ara h2 y Ara h6. La concentración de Ara h1, Ara h2 y Ara h6 puede caracterizarse por RP-HPLC. En otra realización, la concentración de Ara h1, Ara h2 y Ara h6 es al menos una cantidad de un estándar de referencia.

Una formulación encapsulada producida por cualquiera de los métodos descritos en este documento puede ser estable durante al menos aproximadamente 3, 6, 9, 12, 18, 24, 36 o más meses.

En una realización, la formulación encapsulada es estable a una temperatura de aproximadamente 2°C a aproximadamente 8°C o de aproximadamente 20°C a aproximadamente 30°C.

En otra realización, la formulación encapsulada es estable a una temperatura de alrededor de 20 °C, alrededor de 21 °C, alrededor de 22,5 °C, alrededor de 23 °C, alrededor de 24 °C, alrededor de 25 °C, alrededor de 26 °C, alrededor de 27,5 °C. °C, alrededor de 28 °C, alrededor de 29 °C o alrededor de 30 °C.

Un tamaño de cápsula que puede usarse para contener las formulaciones producidas por los métodos descritos en el presente documento puede ser, por ejemplo, tamaño 3, 00 o 000. En una realización, la cápsula comprende hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC).

Los métodos descritos en el presente documento pueden comprender además el almacenamiento de una formulación en un recipiente. Se puede usar cualquier recipiente adecuado para almacenar las formulaciones encapsuladas descritas en el presente documento. En una realización, el recipiente puede ser, por ejemplo, una botella. Una botella puede ser, por ejemplo, una botella de color ámbar para minimizar la exposición de las formulaciones encapsuladas a la luz ultravioleta. En otra realización, el recipiente comprende además un paquete desecante para controlar el contenido de humedad del recipiente.

Breve descripción de los dibujos

Las características novedosas de la invención se exponen con particularidad en las reivindicaciones adjuntas. Se obtendrá una mejor comprensión de las características y ventajas de la presente invención con referencia a la siguiente descripción detallada que establece realizaciones ilustrativas, en las que se utilizan los principios de la invención, y cuyos dibujos adjuntos:

Figura 1: Extracto de harina de cacahuete a 214 nm utilizando HPLC de fase inversa. También se muestran los estándares USDA Ara h, junto con una solución de BSA de 1 mg/mL. Los extractos son los siguientes: panel superior: extracto de harina de cacahuete, pH 8,2; segundo panel: pico Ara h1; tercer panel: pico Ara h2; cuarto panel: pico Ara h6; panel inferior: solución de BSA de 1 mg/ml.

Figura 2: Resultados cromatográficos del análisis RP-HPLC de 112FA02411 (GMP).

Figura 3: Resultados cromatográficos del análisis RP-HPLC de 112FA02411 (no GMP).

Figura 4: Resultados cromatográficos del análisis RP-HPLC de 111FA36211 (no GMP).

Figura 5: Tinción de proteína total de proteínas Ara h agrupadas y purificadas con RP-HPLC.

Figura 6: Inmunotransferencias de proteínas Ara h agrupadas y purificadas por RP-HPLC.

Figura 7: Diagrama de flujo del proceso de mezcla para cápsulas de dosis baja (0,5 mg y 1 mg).

Figura 8: Proceso de mezcla para las cápsulas de dosis alta (al menos 10 mg).

Figura 9: Resultados del cromatograma del análisis RP-HL^p C de 112FA02411 (GMP).

Descripción detallada de la invención

En el presente documento se describen sistemas y métodos que aíslan proteínas de harina de cacahuete, que pueden usarse para fabricar composiciones farmacéuticas para el tratamiento de alergias al cacahuete. Los sistemas y métodos utilizan cromatografía líquida de alta presión ((HPLC, fase) para capturar Ara h1, Ara h2 y Ara h6 de la harina de cacahuete.

Durante la última década, se ha aprendido mucho sobre los alérgenos del cacahuete. Los cacahuetes se asocian comúnmente con reacciones graves, incluida la anafilaxia potencialmente letal. El estándar actual de atención en el manejo de la alergia alimentaria es la evitación dietética del alimento y la educación del sujeto/familia en el manejo agudo de una reacción alérgica. La carga de la evitación y el miedo constante a la exposición accidental impacta negativamente en la calidad de vida relacionada con la salud tanto de los sujetos como de sus familias. Las encuestas de calidad de vida indican que las familias con niños que tienen alergias a los alimentos tienen un impacto significativo en la preparación de los alimentos, las actividades sociales, la búsqueda de cuidado infantil adecuado, la asistencia a la escuela y el nivel de estrés entre otras cosas.

Actualmente, el único tratamiento para la alergia al cacahuate es una dieta sin cacahuate y acceso fácil a la epinefrina autoinyectable. Sin embargo, las dietas de evitación estricta pueden complicarse debido a la dificultad para interpretar las etiquetas y por la presencia de alérgenos no declarados u ocultos en los alimentos preparados comercialmente. Desafortunadamente, las ingestiones accidentales son comunes, con hasta el 50% de los sujetos alérgicos a los alimentos que tienen una reacción alérgica durante un período de dos años. Las reacciones alérgicas al cacahuete pueden ser graves y potencialmente letales; y las alergias al cacahuete y/o a las nueces representan la gran mayoría de las anafilaxias fatales inducidas por alimentos. Esta combinación de dietas estrictas de evitación, la alta incidencia de exposiciones accidentales y el riesgo de reacciones graves o incluso letales con exposiciones accidentales añade una tremenda carga y estrés a los sujetos y sus familias. Para complicar aún más las cosas, solo alrededor del 20% de los niños superarán la alergia al cacahuete, lo que significa que la mayoría de las personas con alergia al cacahuete la tendrán por el resto de sus vidas. Si juntamos la creciente prevalencia y el aumento del consumo de cacahuete en los países occidentales con el hecho de que solo aproximadamente 1 de cada 5 superará su alergia, que las reacciones alérgicas tienen el potencial de ser graves o incluso letales, y que las exposiciones accidentales son comunes, el desarrollo de un tratamiento eficaz para la alergia al cacahuete se vuelve aún más imperativo.

La inmunoterapia específica para la alergia alimentaria, en particular la alergia al cacahuete, en las formas de inmunoterapia oral (OIT) e inmunoterapia sublingual (SLIT) se ha estudiado en los últimos años y ha demostrado una seguridad alentadora y eficacia en los resultados de los primeros ensayos clínicos, incluidos los cambios inmunológicos beneficiosos. La OIT ha mostrado evidencia de inducir la desensibilización en la mayoría de los sujetos con cambios inmunológicos a lo largo del tiempo que indican una progresión hacia la tolerancia clínica.

OIT de cacahuete: en Jones et al., (J Allergy CLin Immunol 2009; 124: 292-300), los niños alérgicos al cacahuete se sometieron a un protocolo de OIT que consiste en un día de escalada de dosis inicial, acumulación quincenal (hasta 2 g) y fase de mantenimiento diario seguida de un OFC. Después de tolerar menos de 50 mg de proteína de cacahuate durante un desafío alimentario oral (OFC) al inicio del estudio, 27 de los 29 sujetos ingirieron 3,9 g de proteína de cacahuete al finalizar el protocolo OIT.

Recientemente, el Dr. Wesley Burks. (Conferencia Nacional de la Academia Estadounidense de Alergia, Asma e Inmunología. Orlando, Florida, 6 de marzo de 2012) presentó un trabajo que muestra que 10 niños con PA (alergia al cacahuete) completaron un protocolo de OIT y se sometieron a un desafío alimentario oral (OFC) 4 semanas después del cese de la ingesta oral de cacahuete para evaluar el desarrollo de "falta de respuesta sostenida" clínica. Tres de cada 10 sujetos aprobaron la OFC; los autores consideraron estos sujetos como tolerantes clínicamente. En el transcurso del tratamiento, los niveles de IgE de cacahuete inferiores a 85 kU/L en un punto de tiempo de 3 meses después de la OIT predijeron que los sujetos se volverían inmunotolerantes. Un estudio multicéntrico, doble ciego, aleatorizado y controlado con placebo informado por Varshney, et al., examinó a veintiocho sujetos. Tres sujetos se retiraron temprano en el estudio debido a los efectos secundarios alérgicos. Después de completar la dosis superior, se realizó un desafío alimentario doble ciego controlado con placebo, en el que todos los sujetos restantes de OIT de cacahuete (n=16) ingirieron la dosis acumulada máxima de 5000 mg (aproximadamente 20 cacahuetes), mientras que los sujetos que recibieron placebo (n=9) solo pudieron tolerar una dosis acumulada media de 280 mg (rango, 0-1900 mg; p < 0,001) . En contraste con el grupo de placebo, el grupo de OIT con cacahuete mostró reducciones en el tamaño de la prueba de punción cutánea (P < 0,001) y aumentos en la IgG4 específica para cacahuete (P < 0,001). Los sujetos con OIT para cacahuete tuvieron aumentos iniciales en la IgE específica para cacahuete (P < 0,01), pero no mostraron cambios significativos desde el inicio en el momento del desafío alimentario oral.

Definiciones

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende un experto en la materia a la que pertenecen las invenciones descritas en el presente documento.

El término "animal", como se usa en el presente documento, se refiere tanto a seres humanos como a animales no humanos, incluidos, por ejemplo, mamíferos, aves, reptiles, anfibios y peces. Preferiblemente, el animal no humano es un mamífero (por ejemplo, un roedor, un ratón, una rata, un conejo, un mono, un perro, un gato, un primate o un cerdo). Un animal puede ser un animal transgénico.

El término "antígeno", como se usa aquí, se refiere a una molécula que provoca la producción de una respuesta de anticuerpos (es decir, una respuesta humoral) y/o una reacción específica de antígeno con células T (es decir, una respuesta celular) en un animal.

El término "alérgeno", como se usa en este documento, se refiere a un subconjunto de antígenos que provocan la producción de IgE además de otros isotipos de anticuerpos. Los términos "alérgeno", "alérgeno natural" y "alérgeno de tipo salvaje" pueden usarse indistintamente. Los alérgenos para el propósito de la presente invención son alérgenos de proteínas.

La frase "reacción alérgica", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una respuesta inmunitaria mediada por IgE con síntomas clínicos que afectan principalmente a la piel (por ejemplo, urticaria, angiodema, prurito), respiratorios (por ejemplo, sibilancias, tos, edema laríngeo, rinorrea, ojos llorosos/picazón), gastrointestinales (por ejemplo, vómitos, dolor abdominal, diarrea) y cardiovasculares (es decir, si se produce una reacción sistémica). Para los fines de la presente invención, una reacción asmática se considera una forma de reacción alérgica.

La frase "alérgeno anafiláctico", como se usa en el presente documento, se refiere a un subconjunto de alérgenos que se reconoce que presentan un riesgo de reacción anafiláctica en individuos alérgicos cuando se encuentran en su estado natural, en condiciones naturales. Por ejemplo, los alérgenos del polen, los alérgenos de los ácaros, los alérgenos de la caspa o excreciones de animales (por ejemplo, saliva, orina) y los alérgenos de hongos no se consideran alérgenos anafilácticos. Por otro lado, los alérgenos alimentarios, los alérgenos de insectos y los alérgenos del caucho (por ejemplo, del látex) generalmente se consideran alérgenos anafilácticos. Los alérgenos alimentarios son alérgenos anafilácticos. En particular, legumbres (cacahuete), alérgenos de frutos secos (por ejemplo, de nueces, almendras, pecanas, anacardos, avellanas, pistachos, piñones, nueces de Brasil), alérgenos lácteos (por ejemplo, de huevo, leche), alérgenos de semillas (por ejemplo, de sésamo, amapola, mostaza), soja, trigo y alérgenos de mariscos (por ejemplo, de pescado, camarones, cangrejo, langosta, almejas, mejillones, ostras, vieiras, cangrejos de río) son alérgenos alimentarios anafilácticos. Los alérgenos anafilácticos particularmente interesantes son aquellos a los que las reacciones suelen ser tan graves como para crear un riesgo de muerte.

La frase "anafilaxia" o "reacción anafiláctica", como se usa en el presente documento, se refiere a un subconjunto de reacciones alérgicas caracterizadas por la desgranulación de los mastocitos secundaria a la reticulación del receptor de IgE de alta afinidad en los mastocitos y basófilos inducida por un alérgeno anafiláctico con la posterior liberación del mediador y la producción de respuestas patológicas sistémicas graves en los órganos diana, por ejemplo, las vías respiratorias, el tracto digestivo de la piel y el sistema cardiovascular. Como se conoce en la técnica, la gravedad de una reacción anafiláctica puede controlarse, por ejemplo, analizando las reacciones cutáneas, hinchazón alrededor de los ojos y la boca, vómitos y/o diarrea, seguidos de reacciones respiratorias como sibilancias y respiración dificultosa. Las reacciones anafilácticas más graves pueden provocar la pérdida del conocimiento y/o la muerte.

La frase "célula presentadora de antígenos" o "APC", tal como se usa en el presente documento, refiere a células que procesan y presentan antígenos a las células T para provocar una respuesta específica de antígeno, por ejemplo, macrófagos y células dendríticas.

Cuando dos entidades están "asociadas" entre sí como se describe en el presente documento, están vinculadas por una relación directa o indirecta. interacción covalente o no covalente. Preferiblemente, la asociación es covalente. Las interacciones no covalentes deseables incluyen, por ejemplo, enlaces de hidrógeno, interacciones de van der Walls, interacciones hidrofóbicas, interacciones magnéticas, etc.

La frase "disminución de la reacción anafiláctica", como se usa en el presente documento, se refiere a una disminución de los síntomas clínicos después del tratamiento de los síntomas asociados con la exposición a un alérgeno anafiláctico, que puede implicar la exposición a través de la piel, las vías respiratorias, el tubo digestivo y la superficie de las mucosas (por ejemplo, oculares, nasales y auditivas) o una inyección subcutánea (por ejemplo, a través de una picadura de abeja).

El término "epítopo", como se usa en el presente documento, se refiere a un sitio de unión que incluye un motivo de aminoácidos de entre aproximadamente seis y quince aminoácidos que pueden unirse a una inmunoglobulina (por ejemplo, IgE, IgG, etc.) o reconocerse por un receptor de células T cuando se presenta por un APC junto con el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). Un epítopo lineal es aquel en el que los aminoácidos se reconocen en el contexto de una secuencia lineal simple. Un epítopo conformacional es aquel en el que los aminoácidos se reconocen en el contexto de una estructura tridimensional particular. Un "fragmento" de alérgeno es cualquier parte o porción del alérgeno que es más pequeña que el alérgeno natural intacto. En el contexto de la invención, el alérgeno es una proteína y el fragmento es un péptido. La frase "epítopo inmunodominante", como se usa en el presente documento, se refiere a un epítopo que se une al anticuerpo en un gran porcentaje de la población sensibilizada o donde el título del anticuerpo es alto, en relación con el porcentaje o el título de reacción de anticuerpos a otros epítopos presentes en el mismo antígeno. Un epítopo inmunodominante se une al anticuerpo en más del 50 % de la población sensible, más preferiblemente en más del 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 99 %.

La frase "secuencias inmunoestimuladoras" o "ISS", como se usa en el presente documento, se relaciona con oligodesoxinucleótidos de origen bacteriano, viral o de invertebrados que son captados por APC y los activan para expresar ciertos receptores de membrana (por ejemplo., B7-1 y B7-2) y secretan varias citocinas (por ejemplo, IL-I, IL-6, IL-12, TNF). Estos oligodesoxinucleótidos contienen motivos CpG no metilados y cuando se inyectan en animales junto con un antígeno, parecen sesgar la respuesta inmunitaria hacia una respuesta de tipo Thl. Véase, por ejemplo, Yamamoto et al., Microbial. inmunol. 36:983, 1992; Krieg y col., Nature 374:546, 1995; Pisetsky, Immunity 5:303, 1996; y Zimmerman et al., J. Immunol. 160:3627, 1998.

Como se usa en el presente documento, los términos "que comprende", "que incluye" y "tal como" se usan en su sentido abierto y no limitativo.

El término "alrededor" se usa como sinónimo del término "aproximadamente". Como lo entiende alguien con conocimientos ordinarios en la materia, el límite exacto de "alrededor" dependerá del componente de la composición. Ilustrativamente, el uso del término "alrededor" indica que los valores ligeramente fuera de los valores citados, es decir, más o menos 0,1% a 10%, que también son efectivos y seguros. El uso del término "alrededor" indica que los valores ligeramente fuera de los valores citados, es decir, más o menos 0.1% a 5%, que también son efectivos y seguros. El uso del término "alrededor" indica que los valores ligeramente fuera de los citados valores, es decir, más o menos 0,1% a 2%, que también son efectivos y seguros.

"Aislado" (usado indistintamente con "sustancialmente puro") cuando se aplica a polipéptidos significa un polipéptido o una porción del mismo, que se ha separado de otras proteínas con las que se presenta de forma natural. Normalmente, el polipéptido también se separa sustancialmente (es decir, desde al menos alrededor del 70% hasta alrededor del 99%) de sustancias tales como anticuerpos o matrices de gel (poliacrilamida) que se utilizan para purificarlo.

Formulaciones

Las formulaciones descritas en el presente documento incluyen uno o más ingredientes activos. Los ingredientes activos pueden aislarse de harina de cacahuete que puede obtenerse de cualquier fuente como, por ejemplo, Golden Peanut Company. La harina de cacahuete puede ser de aproximadamente un 10% a aproximadamente un 15%, o aproximadamente un 12% de harina de cacahuete desgrasada molida a partir de cacahuetes ligeramente tostados. En algunos casos, la harina de cacahuete puede ser liberada por un proveedor después de un análisis estándar de contenido y microbiología, y puede permanecer estable durante 9 a 12 meses en refrigeración. La harina de cacahuete se puede formular, encapsular y probar antes de la administración a un sujeto.

Para el análisis de la harina de cacahuete, la sustancia a granel (BS) y la formulación final, se ha desarrollado un ensayo HPLC de fase inversa (RP-HPLC) que separa tres alérgenos de la proteína de la harina de cacahuete: Ara h1, Ara h2 y Ara h6. Este ensayo constituye la base para las pruebas de identidad y contenido en el momento de la liberación y durante la estabilidad. El ensayo de HPLC de fase inversa se puede utilizar como ensayo de identificación y para monitorear la consistencia y la estabilidad de lote a lote de los alérgenos de cacahuete aceptables para la producción de la formulación de alérgeno de cacahuete caracterizado.

También se puede realizar una caracterización adicional de los alérgenos de proteína mediante ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) y análisis de gel.

Los cacahuetes y la harina de cacahuete son alimentos comunes y aditivos que se encuentran en muchas formulaciones de alimentos. El uso clínico previsto para el alérgeno de cacahuete caracterizado identificado por los presentes inventores se encuentra en cantidades relativamente pequeñas (0,5 a 4000 mg/dosis) en comparación con las cantidades contenidas en los alimentos y puede administrarse por la misma vía que por productos que contienen cacahuete ingeridos por vía oral.

Las formulaciones descritas en el presente documento pueden probarse en un estudio multicéntrico controlado con placebo para demostrar la seguridad y eficacia del alérgeno de cacahuete caracterizado en sujetos de aproximadamente 4 a aproximadamente 26 años de edad con reacciones clínicas de moderadas a graves a la ingestión de cacahuete. Se pueden excluir los sujetos con condiciones de salud concomitantes significativas, asma no controlado o ingreso previo a una unidad de cuidados intensivos debido a anafilaxia. Medicamentos antialérgicos estándar (por ejemplo, antihistamínicos, corticosteroides orales, etc.) se pueden permitir en el mantenimiento y mientras se aumenta la dosis con el alérgeno de cacahuete caracterizado (CPA).

Una formulación que comprende alérgeno de cacahuete caracterizado (CPNA), incluye proteína de cacahuete (que comprende proteínas alérgenas de cacahuete Ara h1, Ara h2 y Ara h6) formulada con uno o más diluyentes, uno o más deslizantes, uno o más lubricantes y, opcionalmente, uno o más agentes de relleno, en dosis graduadas, que comprenden cápsulas que contienen alrededor de 0,5 mg, aproximadamente 1 mg, aproximadamente 10 mg, aproximadamente 100 mg o aproximadamente 1000 mg cada uno de proteína de cacahuete. Cada cápsula se puede abrir y el contenido se puede mezclar con alimentos para enmascarar el sabor inmediatamente antes de la administración.

Un ingrediente farmacéutico activo se obtiene inicialmente como cacahuete crudo, Arachis hypogaea, un miembro de la familia de las leguminosas. Los cacahuetes crudos se pueden obtener de múltiples fuentes agrícolas, donde los cacahuetes crudos sin cáscara se procesan en un 12 % de harina de cacahuete tostada desgrasada (PF). La PF puede incluir un certificado de análisis (CofA) para procesamiento adicional bajo condiciones cGMP.

La formulación, el llenado y las pruebas de las cápsulas de CPNA se pueden realizar en un sitio de fabricación por contrato cGMp . En condiciones de fabricación cGMP, la harina de proteína (PF), que se compone de aproximadamente un 50 % de proteína de cacahuete p/p, se mezcla con uno o más diluyentes, uno o más deslizantes y uno o más lubricantes.

En el contexto de la invención, una composición comprende uno o más diluyentes. "Diluyentes" para uso en la formulación incluyen, pero no se limitan a, ácido algínico y sales del mismo; derivados de celulosa tales como carboximetilcelulosa, metilcelulosa (por ejemplo, Methocel®), hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa (por ejemplo, Klucel®), etilcelulosa (por ejemplo, Ethocel®), celulosa microcristalina (por ejemplo, Avicel®); celulosa microcristalina silicificada; dextrosa microcristalina; amilosa; silicato de magnesio y aluminio; ácidos polisacáridos; bentonitas; gelatina; copolímero de polivinilpirrolidona/acetato de vinilo; crosspovidona; povidona; almidón; almidón pregelatinizado; tragacanto, dextrina, un azúcar, como sacarosa (por ejemplo, Dipac®), glucosa, dextrosa, melaza, manitol, sorbitol, xilitol (por ejemplo, Xylitab®), lactosa (por ejemplo, lactosa monohidrato, lactosa anhidra, etc.); fosfato dicálcico; una goma natural o sintética como acacia, tragacanto, goma ghatti, mucílago de cáscaras de isapol, polivinilpirrolidona (por ejemplo, Polyvidone® CL, Kollidon® CL, Polyplasdone® XL-I 0), arabogalactano de alerce, Veegum®, polietilenglicol, ceras, alginato de sodio, un almidón, por ejemplo, un almidón natural como almidón de maíz o almidón de patata, un almidón pregelatinizado como Colorcon (Starch 1500), National 1551 o Amijel®, o glicolato de almidón de sodio tal como Promogel® o Explotab®; un almidón reticulado tal como glicolato de almidón sódico; un polímero reticulado como crospovidona; una polivinilpirrolidona reticulada; alginato tal como ácido algínico o una sal de ácido algínico tal como alginato de sodio; una arcilla como Veegum® HV (silicato de magnesio y aluminio); una goma tal como agar, guar, algarroba, karaya, pectina o tragacanto; glicolato de almidón de sodio; bentonita; una esponja natural; un tensioactivo; una resina tal como una resina de intercambio catiónico; pulpa de cítricos; lauril sulfato de sodio; lauril sulfato de sodio en almidón combinado; y combinaciones de los mismos. En una realización, la formulación comprende celulosa microcristalina o almidón 1500. En otra realización, la formulación comprende celulosa microcristalina y almidón 1500.

Los deslizantes adecuados (agentes antiaglomerantes) para usar en las formas de dosificación sólidas descritas en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, silicio coloidal dióxido (Cab-O-Sil), talco (por ejemplo, Ultra Talc 4000) y combinaciones de los mismos. En una realización, la composición comprende Cab-O-Sil.

Los lubricantes adecuados para usar en las formas de dosificación sólidas descritas en este documento incluyen, entre otros, ácido esteárico, hidróxido de calcio, talco, almidón de maíz, estearil fumerato de sodio, sales de metales alcalinos y alcalinotérreos, como aluminio, calcio, magnesio, zinc, ácido esteárico, estearatos de sodio, estearato de magnesio, estearato de zinc, ceras, Stearowet®, ácido bórico, benzoato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio, leucina, un polietilenglicol o un metoxypolietilenglicol tal como Carbowax™, PEG 4000, PEG 5000, PEG 6000, propilenglicol, oleato de sodio, behenato de glicerilo, palmitostearato de glicerilo, benzoato de glicerilo, lauril sulfato de magnesio o sodio, y combinaciones de los mismos. En una realización, la composición comprende estearato de magnesio. En otra realización, la composición comprende estearil fumerato de sodio.

En algunas realizaciones, una formulación puede comprender además uno o más agentes de relleno. Los "agentes de relleno" incluyen compuestos tales como lactosa, carbonato de calcio, fosfato de calcio, fosfato de calcio dibásico, sulfato de calcio, celulosa microcristalina, celulosa en polvo, dextrosa, dextratos, dextrano, almidones, almidón pregelatinizado, sacarosa, xilitol, lactitol, manitol, sorbitol, cloruro de sodio, polietilenglicol y combinaciones de los mismos.

Los ingredientes descritos en el presente documento pueden mezclarse según, por ejemplo, los procesos ilustrados en las Figuras 7 y 8. Las formulaciones mixtas pueden encapsularse posteriormente como 0,5, 1, 10, 100 mg, 475 mg y 1000 mg de proteína de cacahuete en tamaño 3, 00 o 000. Cápsulas de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC). Los estudios de compatibilidad pueden evaluar combinaciones de la harina de cacahuete con uno o más de los excipientes, que pueden tener, en algunos casos, reconocimiento GRAS. El diluyente brinda la oportunidad de formular las dosis bajas y altas para contener el volumen adecuado para la dispersión desde la cápsula abierta. El deslizante y el lubricante agregan fluidez a la PF de modo que la cápsula se vacíe de harina de forma fácil por el sujeto o médico en el momento de la administración. Para ensayos clínicos, las cápsulas se pueden envasar a granel en un medio de recipientes como, por ejemplo, botellas. En algunos casos, los medios de recipientes pueden tratarse para evitar (parcial o totalmente) la exposición a la luz. Por ejemplo, un medio de recipiente puede ser de color ámbar. Un medio de recipiente también puede, en algunos casos, contener un desecante para evitar (parcial o totalmente) la exposición a la humedad durante el envío y el almacenamiento. En el momento del uso, la(s) cápsula(s) que contiene(n) CPNA se puede(n) abrir y el contenido se puede mezclar inmediatamente con alimentos que enmascaran el sabor antes de la administración.

Para estandarizar la entrega de alérgenos de proteína de cacahuete, se ha desarrollado una formulación de alérgeno de cacahuete caracterizado (CPNA) fabricado con cGMP. El contenido de proteína de la formulación es crítico desde dos aspectos. En primer lugar, la proteína total administrada debe ser constante entre los lotes y, en segundo lugar, debe controlarse la proporción de alérgenos individuales críticos.

El contenido de proteína total de la sustancia a granel y la liberación de la formulación final se pueden cuantificar utilizando los métodos de determinación de proteína descritos en el presente documento que abordan los problemas actuales de la industria: a saber, antes de la presente solicitud se establecen las cantidades absolutas o relativas de alérgenos de proteína de cacahuete individuales en la harina de cacahuete es más problemática y no ha sido controlada.

La proteína de cacahuete se compone de varios alérgenos de proteína individuales típicamente detectables por gel de poliacrilamida electroforesis e inmunotransferencia utilizando antisueros policlonales específicos de alérgenos de seres humanos alérgicos o animales inmunizados. De estas proteínas, con base en inmunotransferencia, la reactividad contra extractos crudos de cacahuete por sueros humanos de humanos alérgicos, y la liberación de histamina in vitro de basófilos sensibilizados, Ara h1, Ara h2 y Ara h6 se han identificado como alérgenos de proteína de cacahuete alergénicos, con Ara h2 y Ara h6 contribuyendo con la mayor parte de la actividad alergénica del extracto de cacahuete crudo.

Antes de la presente solicitud, las proteínas alergénicas del cacahuete normalmente se fraccionaban a partir de extractos de cacahuete brutos mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) o electroforesis en gel de poliacrilamida. Estas técnicas pueden presentar una visión relativa del espectro de las proteínas Ara, pero no brindan la resolución y la sensibilidad necesarias para comparar la expresión de alérgenos de cacahuete individuales entre lotes de harina de cacahuete, ni los posibles cambios en la estructura de la proteína a lo largo del tiempo. Para hacer frente a estas limitaciones, los presentes inventores han desarrollado un método de HPLC de fase inversa (RP-HPLC) para mejorar la resolución y permitir la separación física de los alérgenos del cacahuete Ara h1, Ara h2 y Ara h6.

Se desarrolló un ensayo para la determinación y caracterización de proteínas alergénicas Ara h1, 2 y 6 en harina de cacahuete tostado. Se modificó un procedimiento de extracción simple de una sola etapa utilizando tampón Tris a pH 8,2, seguido de centrifugación y filtración. Las muestras se preparan a 100 mg/ml y se extraen a 60 °C durante 3 horas. El filtrado limpio final es adecuado para el análisis directo por HPLC.

La separación por HPLC utiliza una separación de fase inversa utilizando una columna de sílice de 300 A de poro ancho con una fase estacionaria de butilo ligada. Puede emplearse un gradiente binario basado en ácido trifluoroacético al 0,1% y acetonitrilo. La fase móvil puede ser compatible con la espectrometría de masas. La detección puede lograrse con un detector UV a 214 nm, ya que la sensibilidad puede reducirse con la detección a 280 nm

La especificidad del método puede determinarse comparando los tiempos de retención y los patrones máximos del extracto de cacahuete entero con las proteínas Ara h. Los picos principales de la proteína Ara h, en algunos casos, pueden no resolverse como entidades discretas, sino que pueden aparecer como conjuntos de muchas proteínas similares. Por lo tanto, los alérgenos Ara h1, Ara h2 y Ara h6 pueden aparecer como grupos de picos dentro de una región de tiempo de retención. En consecuencia, la cantidad relativa de una proteína Ara h particular se determina luego como el porcentaje del área total dentro de una región de elución definida. Se evalúa la resolución cromatográfica de las diversas regiones, y el método puede ser útil para la comparación de diferencias sutiles en estos patrones regionales para diferentes lotes y fuentes de proteínas de harina de cacahuete y la estabilidad de la formulación.

En la Figura 1 se muestra un ejemplo representativo de una serie cromatográfica a 214 nm que compara el extracto crudo (panel superior) con perfiles de proteínas Ara h1, Ara h2 y Ara h6 purificadas y BSA.

La precalificación del método RP-HPLC se puede evaluar comparando tres preparaciones independientes de un solo lote de harina de cacahuete, comparando los resultados de ensayos repetidos realizados por dos analistas diferentes en dos días diferentes, o comparando los resultados de preparaciones independientes de diferentes lotes. de harina de cacahuete en el mismo día o en días diferentes.

La precisión se puede estimar realizando la extracción de una sola muestra por triplicado y analizando los resultados de acuerdo con el método propuesto (ver, por ejemplo, la Tabla 1). Se llevan a cabo extracciones por triplicado y determinaciones de un solo lote de harina de cacahuete; los valores informados son el porcentaje de área de cada especie de Ara h. La integración de los picos se puede realizar utilizando eventos de integración forzada en un sistema de datos (por ejemplo, ChemStation) o integración manual. La precisión para estas preparaciones independientes por triplicado de un solo lote de harina de cacahuete puede oscilar entre aproximadamente el 1,1 % de desviación estándar relativa (RSD) para Ara h6 y aproximadamente el 18,3 % para Ara h1. El mayor (% RSD) para Ara h1 puede estar asociado con la integración del hombro de Ara h1 del grupo más grande posterior.

Tabla 1: Precisión del método RP-HPLC

Un segundo método de precisión compara los resultados obtenidos por dos analistas diferentes que realizan el ensayo en dos días diferentes. Cada valor presentado representa el promedio de inyecciones duplicadas. La Tabla 2 proporciona resultados ejemplares de una comparación de los valores porcentuales del área y el contenido de proteína extraíble de tres lotes de harina de cacahuete, por dos analistas diferentes en días diferentes. La comparación de los resultados cuantitativos obtenidos de estos ensayos arroja valores de Ara h que concuerdan entre 86% y 107%; el contenido total de proteína puede estar concordar dentro del 95% -102%. El porcentaje del acierto entre los dos analistas también se puede presentar.

Tabla 2: Precisión del método RP-HPLC

El análisis de varios lotes de PF puede usarse para demostrar que la expresión de Ara h1, Ara h2 y Ara h6 es consistente, tanto individualmente como entre sí en lotes de harina de cacahuete. Este ensayo también puede formar la base para las pruebas de identidad y contenido en el momento de la liberación y durante la determinación de la estabilidad.

El ensayo fue realizado y analizado por un segundo fabricante de cGMP. Los perfiles de HPLC (ver, por ejemplo, Figura 2, Figura 3 y Figura 4), la proteína total y el porcentaje de cada alérgeno dentro de la proteína total (ver, por ejemplo, la Tabla 3) son generalmente consistentes entre los ensayos realizados por ambos laboratorios usando los mismos lotes de harina de cacahuete (permite unir los datos).

Estudios de confirmación de RP-HPLC

Para confirmar que el perfil pico de RP-HPLC realmente separa e identifica Ara h1, Ara h2 y Ara h6, el material aislado de cada pico puede caracterizarse aún más mediante electroforesis en gel de poliacrilamida SDS usando, por ejemplo, un 4-20 Novex Tris-HCl pregel fundido (ver, por ejemplo, la figura 5). Se pueden transferir geles adicionales a difluoruro de polivinilideno (PVDF), procesados para inmunotransferencia y pueden reaccionar con antisueros de pollo Ara h1, Ara h2 o Ara h6 y desarrollados con IgG anti-pollo de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante usando, por ejemplo, un método de ensayo descrito por de Jong et al. (EMBO J., 1988; 7(3): 745-750). Cabe señalar que, si bien los extractos pueden derivarse de la harina de cacahuete tostada, los antisueros pueden generarse contra las proteínas Ara h purificadas a partir de extractos de cacahuete crudo. Los antisueros reaccionan tanto con las proteínas Ara h de control derivadas del cacahuete crudo como con las proteínas Ara h aisladas obtenidas de extractos de cacahuete tostado (ver, por ejemplo, Figura 6).

Las inmunotransferencias muestran que el material aislado de cada uno de los tres picos principales de HPLC era reactivo con los antisueros específicos de proteína de cacahuete apropiados, y que el peso molecular de las proteínas inmunorreactivas correspondía a los pesos moleculares de proteínas informados en la literatura (Koppelman et al. 2010). Se determinó que las proteínas Ara h extraídas de la harina de cacahuete no son sensibles al calentamiento a 60°C. Se pueden realizar experimentos confirmatorios adicionales; estos ensayos pueden usarse para establecer el ensayo indicador de estabilidad más adecuado que proporciona la mayor sensibilidad a los cambios que ocurren durante el almacenamiento a largo plazo. Sin embargo, los primeros datos de inmunotransferencia descritos en el presente indican que el método RP-HPLC informado rastreará las proteínas de cacahuete individuales entre los lotes de harina de cachuete.

Fuente y prueba de la harina de cacahuete

La harina de cacahuete (PF) para uso en una formulación descrita en el presente documento puede obtenerse de cualquier productor confiable que incluye, entre otros, Golden Peanut Company (GPC), que fabrica harina de cacahuete y aceite de cacahuete (un subproducto del desgrasado de los cacahuetes tostados).

Una instalación de fabricación de GPC puede ser auditada por un organismo de certificación de seguridad alimentaria reconocido internacionalmente. (por ejemplo, Intertek Labtest (UK) Limited). La auditoría puede centrarse en el cumplimiento de la Norma Mundial de Seguridad Alimentaria del British Retail Consortium Food Standard (BRC). La Norma Mundial de BRC es un programa de certificación de calidad y seguridad global líder, utilizado en todo el mundo por más de 17.000 proveedores certificados en 90 países a través de una red de más de 80 organismos de certificación acreditados y reconocidos por BRC. La Norma Mundial de BRC es ampliamente utilizada por proveedores y minoristas globales. Facilita la estandarización de calidad, seguridad, criterios operativos y del cumplimiento de las obligaciones legales de los fabricantes. También ayudan a brindar protección al consumidor. No hubo hallazgos de no conformidad importantes o críticos durante la auditoría más reciente.

La PF puede ser aproximadamente un 12 % de harina de cacahuete desgrasada molida a partir de cacahuetes ligeramente tostados. La PF puede ser realizada por el proveedor luego de un análisis estándar de contenido y microbiología, y se identifica como estable durante 9 meses en refrigeración.

Pruebas de liberación de materia prima entrante para PF

La materia prima de PF puede someterse a pruebas de apariencia, identificación, contenido de proteína total y contenido de humedad antes de su liberación para la producción de cGMP (véase, por ejemplo, la Tabla 4). La PF se puede almacenar en condiciones controladas a 2-8 °C.

T l 4: Pr m ri rim r PF

Excipientes de formulación

La Tabla 5 proporciona excipientes ejemplares que pueden usarse en una formulación descrita en el presente documento. Otros excipientes que pueden usarse en una formulación descrita en el presente documento se proporcionan en otra parte de la descripción.

La forma de dosificación prevista a modo de ejemplo incluye, por ejemplo, una cápsula a base de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC); la concentración de la forma de dosificación puede ser de alrededor de 0,5 mg, alrededor de 1 mg. aproximadamente 10 mg, aproximadamente 100 mg, aproximadamente 475 mg o aproximadamente 1000 mg de proteína de cacahuete. La propia proteína de cacahuete, en algunos casos, puede ser un material cohesivo sin propiedades de fluidez inherentes propicias para los procesos de fabricación farmacéutica convencionales. Por lo tanto, los ingredientes farmacéuticos inactivos (excipientes) pueden agregarse a la formulación para que la flor de cacahuete se desarrolle en una forma adecuada. forma de dosificación farmacéutica con características de flujo para mejorar tanto la fabricación como la entrega de la forma de dosificación.

Se pueden realizar estudios de compatibilidad para evaluar combinaciones de harina de cacahuete con categorías de excipientes ejemplares (diluyente, deslizante y lubricante). Los excipientes pueden tener reconocimiento GRAS o demostrar que son seguros en formulaciones farmacéuticas. El diluyente brinda la oportunidad de formular las dosis bajas y altas para contener el volumen adecuado para la dispersión desde la cápsula abierta. El deslizante y el lubricante añaden fluidez a la PF de modo que el sujeto vacíe fácilmente la cápsula de harina.

Según la Tabla 5, cada uno de los excipientes considerados se designa como USP, NF o USP-NF.

Tabla 5: Excipientes bajo consideración

Formulación del Alérgeno de Cacahuete Caracterizado

La harina de cacahuete (que contiene proteínas alergénicas del cacahuete Ara h1, Ara h2 y Ara h6) puede formularse con un agente de carga y de fluidez en dosis graduadas, que comprende cápsulas que contienen 0,5 mg, 1 mg, 10 mg, 100 mg y 1000 mg cada una de proteína de cacahuete.

Cápsulas de dosis baja (0,5 mg y 1 mg)

La Figura 7 y la Tabla 6 describen el proceso de mezcla propuesto para las cápsulas de dosis baja, que incluyen las cápsulas de proteína de cacahuete de 0,5 mg y de proteína de cacahuete de 1 mg.

Un método para hacer una formulación de cápsulas de dosis baja comprende, (a) mezclar harina de cacahuete y diluyente en una primera mezcla; (b) agregar aproximadamente 45% de diluyente en una segunda mezcla; (c) agregar el diluyente y/o lubricante restante en una tercera mezcla; (d) agregar un deslizante en una mezcla final; y (e) encapsular el polvo combinado en una cápsula. En una realización, el diluyente del paso (a) comprende almidón, lactosa o celulosa microcristalina (Avicel®), o fosfato dicálcico. En otra realización, el diluyente del paso (b) y/o (c) comprende almidón, lactosa o celulosa microcristalina (Avicel®), o fosfato dicálcico. En otra realización, el deslizante del paso (d) deslizante del paso (d) comprende dióxido de silicio coloidal (Cab-O-Sil), talco (por ejemplo, Ultra Talc 4000) o combinaciones de los mismos. En otra realización, el deslizanter del paso (d) comprende Cab-O-Sil. En otra realización, el lubricante del paso (d) comprende estearato de magnesio. En otra realización, el método comprende además muestrear el material mezclado una o más veces antes de la encapsulación. En otra realización, la dosis comprende 0,5 o 1,0 mg de proteína de cacahuete. En una realización, el método comprende opcionalmente muestrear el material mezclado del paso (d). En una realización, el paso (d) comprende agregar un deslizante o un lubricante. En otra realización, el paso (d) comprende agregar un deslizante y un lubricante.

T l : P r iv r r l i m 1 m

Cápsulas de dosis alta (10 mg, 100 mg y 475 mg)

La Figura 8 y la Tabla 7 describen el proceso de mezcla propuesto para las cápsulas de dosis alta, que incluyen las cápsulas de proteína de cacahuete de 10 mg, proteína de cacahuete de 100 mg y proteína de cacahuete de 475 mg.

Un método para hacer una formulación de cápsulas de dosis alta comprende, (a) mezclar harina de cacahuete y diluyente en una primera mezcla; (b) descargar el material mezclado; (c) pasar el material mezclado a través de un tamiz de malla y mezclar el material tamizado en una segunda mezcla; (d) agregar un deslizante y/o lubricante en una tercera mezcla; (e) encapsular el polvo mezclado. En una realización, el método comprende opcionalmente tomar muestras del material mezclado del paso (d) una o más veces antes de la encapsulación. En otra realización más, el diluyente del paso (a) comprende almidón, lactosa o celulosa microcristalina (Avicel®), o fosfato dicálcico. En otra realización, la criba de malla del paso (c) comprime una pantalla de malla #20. En otra realización, el deslizante del paso (d) deslizante del paso (d) comprende dióxido de silicio coloidal (Cab-O-Sil), talco (por ejemplo, Ultra Talc 4000) o combinaciones de los mismos. En otra realización, el deslizante del paso (d) comprende Cab-O-Sil. En otra realización, el lubricante del paso (d) comprende estearato de magnesio. En una realización, el paso (d) comprende agregar un deslizante o un lubricante. En otra realización, el paso (d) comprende agregar un deslizante y un lubricante.

T l 7: P r iv r r l i l 1 m 1 m 47 m

continuación

Control de la sustancia a granel

Las especificaciones propuestas a modo de ejemplo para la sustancia a granel formulada se resumen en la Tabla 8.

T l : E ifi i n r r ni r n l

Pruebas de estabilidad a granel

La formulación se puede llenar en cápsulas dentro de las 24 horas posteriores a la mezcla.

Formulación

Descripción general de la química y la composición de fabricación

La harina de cacahuete (que contiene las proteínas alergénicas del cacahuete Ara h1, Ara h2 y Ara h6) se puede formular con un agente de carga y fluidez en dosis graduadas, que comprende cápsulas que comprenden aproximadamente 0,5 mg, aproximadamente 1 mg, aproximadamente 10 mg, aproximadamente 100 mg, aproximadamente 475 mg, o alrededor de 1000 mg cada uno de proteína de cacahuete con uno o más diluyentes, uno o más deslizantes, uno o más lubricantes. Opcionalmente se pueden añadir uno o más agentes de relleno. Cada cápsula se puede abrir y el contenido se puede mezclar con alimentos para enmascarar el sabor inmediatamente antes de la administración.

Las cápsulas no animales que cumplen con los estándares farmacéuticos globales se pueden usar para las formulaciones descritas en el presente documento. En una realización no limitante, se pueden usar cápsulas de HPMC de Capsugel.

En otra realización no limitante, las cápsulas se pueden codificar por colores para distinguir las diferentes dosis. También se pueden producir cápsulas de placebo codificadas por colores coincidentes.

T l : F rm ifi i n m l r

La composición final de excipientes de la formulación se puede determinar después de completar el estudio de compatibilidad en curso con los diferentes excipientes (ver Tabla 5).

Proceso de producción

El método/equipo de encapsulación se puede determinar con base en evaluaciones de variación de peso de llenado en lotes de desarrollo. Los controles durante el proceso pueden incluir controles de peso periódicos. Control de la Formulación

Las especificaciones de liberación ejemplares de las formulaciones se presentan en la Tabla 10.

T l 1 : E ifi i n r r l f rm l i n

continuación

Apariencia

Las evaluaciones de apariencia se pueden realizar en la sustancia a granel (por ejemplo, la formulación durante uno o más pasos de preparación y/o de la mezcla final antes de la encapsulación) y la formulación. La evaluación de la apariencia puede incluir, por ejemplo, consiste en inspeccionar visualmente el contenedor contra un fondo blanco iluminado por una luz de espectro completo.

Uniformidad de contenido

La uniformidad del contenido (CU) de las cápsulas se puede realizar de acuerdo con los estándares de la USP. La uniformidad del contenido puede basarse en un ensayo de combustión del contenido de nitrógeno proteico total. La intención es identificar un instrumento de combustión con la sensibilidad para permitir el ensayo de cápsulas individuales en todas las dosis.

Masa entregable

La masa entregable de la cápsula se puede evaluar pesando las cápsulas y vaciando el contenido y pesando las cápsulas vacías. Entonces se puede calcular el % de la cantidad entregada.

Contenido de humedad

El contenido de humedad puede afectar la estabilidad de las proteínas, y comprender los cambios en el contenido de humedad a lo largo del tiempo es útil para comprender los cambios en la formulación que, en algunos casos, pueden conducir a una vida útil más corta. Para cápsulas rellenas de harina de cacahuete, el contenido de humedad se puede medir mediante determinaciones de pérdida por secado (LOD) de acuerdo con la USP. Las condiciones para las LOD se pueden determinar con base en los requisitos de los excipientes y los requisitos para la harina de cacahuete.

Identidad (RP-HPLC)

Puede usarse RP-HPLC para confirmar la identidad de la PF, BS y la formulación final. Las muestras pueden analizarse de acuerdo con los métodos descritos con más detalle en la solicitud relacionada con título "Formulaciones de cacahuete y usos de las mismas", presentada el mismo día del presente (número del expediente del abogado 43567-702.101), y los cromatogramas resultantes pueden compararse con el cromatograma de ejemplo provisto en el método de prueba (ver, por ejemplo, Figura 9).

Se puede confirmar una identificación positiva de la harina de cacahuete si el cromatograma de la muestra coincide con el cromatograma provisto en el método. Si no se confirma una indicación positiva, se puede descartar una gran cantidad de harina de cacahuete como subestándar. La ausencia de sustancia activa en los placebos puede confirmarse demostrando que no eluyen picos entre 12 y 35 minutos en la cromatografía. Proteína total extraíble

Se puede utilizar un enfoque similar para la determinación de la proteína extraíble total en la harina de cacahuate para la determinación de la proteína extraíble total en las formulaciones de cápsulas. El enfoque puede ser evaluado para todas las fortalezas. Brevemente, el contenido de la cápsula se puede vaciar, pesar y analizar mediante RP-HPLC. El análisis cromatográfico de harina de cacahuete las muestras extraídas mediante este procedimiento producen una "huella digital" cromatográfica que es exclusiva de los extractos de harina de cacahuete. La región de las muestras que eluyen entre aproximadamente 12 minutos y 35 minutos puede integrarse. El área total integrada puede cuantificarse frente a un estándar BSA. El contenido de proteína extraíble total puede calcularse entonces usando la siguiente ecuación.

Mg^g preetini = — X Í ítü ^Muestra v

Muestra Wt

dónde:

R^u= Área máxima de proteína Ara h total o Área máxima de especie Ara h en la muestra de trabajo;

R^s= Área máxima promedio de BSA en todos los estándares de trabajo CSTD = Concentración estándar de trabajo de BSA (mg/ml);

Muestra V= Volumen total de diluyente de la muestra de trabajo (10,0 ml); y

Muestra Wt= Peso de la muestra de harina de cacahuete (g).

Proporciones aparentes de proteína Ara hi, Ara h2 y Ara h6.

El análisis cromatográfico de las muestras extraídas mediante el método RP-HPLC puede producir una "huella digital" cromatográfica que es exclusiva de los extractos de harina de cacahuete y las proporciones relativas de las regiones correspondientes a Ara h1, Ara h2 y Ara h6 (véase, por ejemplo, la Figura 1). El contenido de proteína de cada una de estas regiones (mg/g) puede cuantificarse según la ecuación proporcionada anteriormente. Luego se calcula el porcentaje relativo de contenido de proteína total para cada región de acuerdo con la ecuación a continuación.

Contenido de proteínas

El contenido de proteína en cápsulas llenas puede determinarse de la misma manera que el de la harina de cacahuete (AOCS Método Oficial Ba 4e-93). Dado que las determinaciones precisas del contenido de proteína pueden depender del contenido de nitrógeno de la muestra, no se pueden usar excipientes que contengan nitrógeno en la formulación. El método se basa en el método Dumas y se basa en la combustión de la proteína cruda en oxígeno puro y la medición del gas nitrógeno que se desprende. El método que se puede utilizar puede ser el método oficial AOCS Ba 4e-93. La definición del método AOC^s y el alcance se proporciona a continuación.

Brevemente, este método describe un método de combustión genérico para la determinación de proteína cruda. Una combustión a alta temperatura en oxígeno puro libera nitrógeno, que se mide mediante detección de conductividad térmica y luego se convierte en proteína equivalente mediante un factor numérico apropiado. Este es un método alternativo al método Kjeldahl del catalizador de mercurio y tiene dos ventajas: 1) se necesita menos tiempo para la determinación de nitrógeno y 2) productos químicos peligrosos y tóxicos no se utilizan.

Pruebas de estabilidad

Las formulaciones se pueden almacenar a 2-8°C. Para evaluar la estabilidad acelerada y a largo plazo, las formulaciones pueden probarse de acuerdo con la frecuencia y las especificaciones descritas en la Tabla 11 y la Tabla 12. Las pruebas de apariencia/color, humedad, identidad y resistencia se pueden realizar en todos los puntos de tiempo, y la carga biológica se puede realizar anualmente a los 12, 24 y 36 meses.

T l 11A: E m r l r l ili r n f rm l i n

Las Tablas 11B - 11F proporcionan datos obtenidos al probar la estabilidad de varias formulaciones a 5°C.

Tabla 11B

continuación

Tabla 11C

Tabla 11D

Tabla 11E

Tabla 11F

Las Tablas 11G - 11K proporcionan datos obtenidos al probar la estabilidad de varias formulaciones a 25°C.

Tabla 11G

Tabla 11H

Tabla 111

Tabla 11J

Tabla 11K

continuación

T l 12A: E ifi i n l r l ili r n f rm l i n

Las tablas 12B - 12K proporcionan datos obtenidos al evaluar la estabilidad y las características de varias formulaciones en 5°C y 25°C en varios puntos de tiempo.

Tabla 12B

continuación

Tabla 12C

continuación

Tabla 12D

continuación

Tabla 12E

continuación

Tabla 12F

________ ________

continuación

Tabla 12G

Tabla 12H

Tabla 121

continuación



 Placebo

El placebo puede consistir en la mezcla definida de excipientes sin la PF. El placebo se puede llenar en las mismas cápsulas codificadas por colores que la formulación activa.

T l 1 : E ifi i n li r i n l

Métodos de uso

Las composiciones farmacéuticas preparadas usando los métodos descritos en este documento se pueden usar para comparar varios lotes de proteínas de cacahuete para determinar la consistencia del producto.

Los cacahuetes y la harina de cacahuete son alimentos comunes y aditivos que se encuentran en muchos productos alimenticios. El uso clínico previsto para el alérgeno de cacahuete caracterizado (CPA) se encuentra en cantidades relativamente pequeñas (0,5 a 4000 mg/dosis) en comparación con cantidades contenidas en los alimentos y se entregarán a través de la misma ruta que los productos que contienen cacahuete ingeridos por vía oral.

Actualmente, los estudios preclínicos que exploran modalidades de tratamiento en modelos animales de alergia alimentaria son limitados. El modelo principal para la inducción de la alergia al cacahuete en ratones es exponer a los ratones por sonda oral a las proteínas del cacahuete en la forma de mantequilla de cacahuete, cacahuete tostado molido o proteínas de cacahuete purificadas, en combinación con la toxina del cólera. Después de 3 a 6 exposiciones semanales, los ratones son desafiados a demostrar una respuesta alérgica. Los ratones pueden ser desafiados por inyección intraperitoneal con dosis subletales de una formulación descrita en el presente documento y calificada para la gravedad de la reacción. La intención es demostrar que los principales desencadenantes de la anafilaxia son las proteínas Ara h específicas, en lugar de una combinación de todas las proteínas del cacahuete. En un protocolo de inmunoterapia, los ratones se tratan con extracto de cacahuete entero, extracto sin proteínas Ara h o proteínas Ara h puras solas. Tras el desafío posterior al tratamiento, se pueden evaluar los cambios en la temperatura corporal, calificación de síntomas y la proteasa de mastocitos de ratón. Los ratones que están insensibilizados a mayores desafíos pueden tratarse con un extracto completo o la combinación de proteínas Ara h.

Los requisitos celulares que subyacen a la anafilaxia inducida por cacahuete pueden determinarse explorados en ratones C57BL/6 de tipo salvaje, deficientes en células B, deficientes en CD40L, deficientes en mastocitos o deficientes en la cadena a de FcsRI sensibilizados a proteínas de cacahuete. Después de la provocación intraperitoneal con una formulación descrita en el presente documento, la anafilaxia se evalúa mediante la medición de inmunoglobulinas específicas de antígeno (Igs), puntaje general de síntomas, temperatura corporal, permeabilidad vascular, liberación de mastocitos mediadores y reacciones anafilácticas. Los ratones deficientes en células B, mastocitos y CD40L pueden sensibilizarse a las proteínas del cacahuete como se muestra por la producción de IgE y citocinas asociadas a Th2. Los ratones deficientes e en FceRI pueden experimentar anafilaxia, aunque algo menos severa que los animales de tipo salvaje.

En un modelo de esófago-gastroenteropatía inducido por la alimentación a largo plazo de cacahuete a ratones sensibilizados descrito por Mondoulet et al., 2012, la inmunoterapia epicutánea con una formulación descrita en este documento puede disminuir la gravedad de las lesiones gastrointestinales. (Mondoulet et al., 2012).

Los datos obtenidos de estos modelos, que pueden demostrar una o más de las características de las reacciones alérgicas a los alimentos para humanos, y se deben considerar con respecto a la variabilidad de la alergia a los alimentos para humanos.

El método puede, en algunos casos, comprender además administrar una composición descrita en el presente documento a un sujeto, en donde la composición comprende al menos las concentraciones de Ara h1, Ara h2 y Ara h6 del estándar de referencia.

El método puede usarse para comparar lotes de harina de cacahuete y, en algunos casos, excluir la harina de cacahuete de uso en una composición o método descrito en el presente documento donde la muestra no contiene al menos la cantidad estándar de referencia de Ara h1, Ara h2 y Ara h6.

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un método para preparar una formulación en cápsula adecuada para la desensibilización de la alergia al cacahuete que comprende,

(a) mezclar harina de cacahuete con diluyente, deslizante y lubricante;

(b) descargar el material mezclado;

(c) pasar el material mezclado a través de un tamiz de malla; y

(d) encapsular el polvo mezclado;

donde:

- la cápsula contiene 0,5 mg, 1 mg, 10 mg, 100 mg, 475 mg o 1000 mg de proteína de cacahuate;

- la cápsula se puede abrir y el contenido se puede mezclar con alimentos para enmascarar el sabor inmediatamente antes de la administración;

- la harina de cacahuate comprende las proteínas de cacahuate Ara h1, Ara h2 y Ara h6, y - se controla la proporción de Ara h1, Ara h2 y Ara h6.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la cápsula comprende 10 o 100 mg de proteína de cacahuete.

3. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el tamaño de la cápsula es 3, 00 o 000.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la cápsula comprende hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC).

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la cápsula está codificada por colores para distinguir las diferentes dosis.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el diluyente es celulosa microcristalina.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el deslizante es dióxido de silicio coloidal.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el lubricante es estearato de magnesio.

9. Una formulación en cápsula obtenida por el método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

10. El uso de una cápsula según la reivindicación 9 en la preparación de un recipiente que comprende cápsulas adecuadas para la desensibilización de la alergia al cacahuete.

11. El uso de la reivindicación 10, en donde el recipiente es una botella.

12. El uso de la reivindicación 11, en donde la botella está coloreada.

13. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en donde el recipiente comprende además un paquete desecante para controlar el contenido de humedad del recipiente.