ES2942176T3 - Sales de ácidos grasos de glicopirronio y métodos para su elaboración - Google Patents

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Abstract

Se han desarrollado nuevas sales de ácidos grasos de glicopirronio. Las condiciones de reacción bifásicas permiten las reacciones de intercambio de contraiones deseadas entre el bromuro de glicopirronio y las sales de ácidos grasos de metales alcalinos y metales alcalinotérreos en métodos para formar sales de ácidos grasos de glicopirronio. En realizaciones preferidas, un exceso de ácido graso libre en la mezcla de reacción estabiliza la sal de ácido graso de glicopirronio y reduce la formación de la impureza, Ácido A. En algunas realizaciones preferidas, se añaden entre 0,2 y 1,2 equivalentes molares de exceso de ácido graso libre. a la mezcla de reacción. En otra realización, se añaden a la mezcla de reacción aproximadamente 1,2 equivalentes molares de exceso de ácido graso libre. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Sales de ácidos grasos de glicopirronio y métodos para su elaboración
Referencia a solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica una o más invenciones que se divulgaron en el Número de Solicitud Provisional 62/175,737, presentada el 15 de junio de 2015, titulado "GLYCOPYRRONIUM FATTY ACID SALTS AND METHODS OF MAKING SAME". Por la presente se reivindica el beneficio bajo 35 USC §119(e) de la solicitud provisional de los Estados Unidos.
Campo de la invención
La invención pertenece al campo de las sales de glicopirronio. Más específicamente, la invención se refiere a nuevas sales de ácidos grasos de glicopirronio lipófilas.
Antecedentes de la invención
El glicopirrolato (también conocido como bromuro de glicopirronio) es una sal de bromuro con un contraión de amonio cuaternario con el nombre químico de bromuro de 3-[ciclopentil(hidroxi)fenilacetoxi]-1,1 -dimetil pirrolidinio, una fórmula molecular de C19H28BrNO3 y un peso molecular de 398,34. Su estructura química se muestra en la Tabla 2 más abajo.
El cloruro de trospio es una sal de amonio cuaternario con el nombre químico de cloruro de 3 (2 hidroxi-2,2 difenilacetoxi)espiro[biciclo[3.2.1] octano-8,1' pirrolidin]-1'-io. La fórmula molecular del cloruro de trospio es C25H3qCINO3 y su peso molecular es 427,97. La estructura química del cloruro de trospio es:
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Los fármacos antimuscarínicos de amonio cuaternario (QAAM) son particularmente útiles debido a su capacidad para antagonizar la acetilcolina endógena durante períodos de producción excesiva de acetilcolina o efecto prolongado de acetilcolina por razones fisiológicas y farmacológicas. Estos compuestos comparten la propiedad de que no logran penetrar apreciablemente en el sistema nervioso central (SNC), y el glicopirrolato y el cloruro de trospio han sido particularmente útiles en el tratamiento de pacientes que necesitan un efecto anticolinérgico periférico sobre los receptores antimuscarínicos.
La misma propiedad bioquímica que es ventajosa para prevenir la distribución en el SNC, también limita la absorción intestinal, lo que requiere que las formulaciones actualmente disponibles de estos medicamentos se tomen en ausencia de alimentos, y da como resultado una biodisponibilidad incompleta y variable en los pacientes.
El documento WO 2014/091384 A1 describe la preparación de sales de ácidos grasos de glicopirronio.US 8,343,467 B2 describe compuestos como etanol y PEG que se usan para solubilizar compuestos hidrófobos no miscibles con agua. Langguth y otros, Arzneimittel Forschung. Drug Research, 1987, Vol 37, No. 12, págs. 1362-1366 describe alquilsulfonatos y alquilsulfatos de cloruro de trospio, y su preparación a partir de cloruro de trospio en una mezcla de agua y cloroformo.
Resumen de la invención
Las condiciones de reacción bifásicas permiten las deseadas reacciones de intercambio de contraiones entre el bromuro de glicopirronio y las sales de metal alcalino y alcalinotérreo de ácidos grasos. La separación favorable de la molécula de glicopirronio en la fase orgánica (junto con los ácidos grasos) y la separación del bromuro en la fase acuosa utilizan preferentemente agua y metil tetrahidrofurano. Si bien las sales de ácidos grasos de glicopirronio son inestables con respecto a la hidrólisis en las condiciones de reacción y se aíslan como productos oleosos, un exceso del ácido graso en la mezcla de reacción estabiliza la sal de ácido graso de glicopirronio y reduce la formación de la impureza del subproducto de la hidrólisis, Ácido A.
Los métodos de fabricar las sales de ácidos grasos de glicopirronio incluyen preferentemente el uso de un exceso molar del ácido graso. En algunas modalidades, se añade a la mezcla de reacción al menos 0,2 equivalentes molares de ácido graso libre en exceso para formar una sal de ácido graso de glicopirronio. En algunas modalidades preferidas, se añaden a la mezcla de reacción entre 0,2 y 1,2 equivalentes molares de ácido graso libre en exceso. En otra modalidad preferida, se añaden a la mezcla de reacción al menos 0,6 equivalentes molares de ácido graso libre en exceso. En otra modalidad preferida, se añaden a la mezcla entre 0,6 y 1,2 equivalentes molares de ácido graso libre en exceso para formar una sal de ácido graso de glicopirronio. En otra modalidad, se añaden a la mezcla de reacción aproximadamente 1,2 equivalentes molares de ácido graso libre en exceso. En otra modalidad, se añaden a la mezcla de reacción al menos 1,1 equivalentes molares de ácido graso libre en exceso.
Dado que el exceso de ácidos grasos libres estabiliza las formulaciones descritas en la presente descripción, esto puede dar como resultado una mayor biodisponibilidad de la molécula de glicopirronio.
Breve descripción de las figuras
Figura 1 muestra la Curva de Calibración de HPLC para bromuro de glicopirronio por Pico de Bromuro.
Figura 2 muestra la Curva de Calibración de HPLC para bromuro de glicopirronio por Pico de "Glicopirronio". Figura 3 muestra los Resultados de HPLC de una reacción de intercambio de bromuro de glicopirronio con estearato de potasio.
Figura 4 muestra los Resultados de HPLC de una reacción de intercambio de bromuro de glicopirronio con palmitato de potasio.
Figura 5 muestra la metilación de la base de glicopirrolato con carbonato de dimetilo.
Figura 6 muestra la curva de calibración de HPLC para la base de glicopirrolato.
Figura 7 muestra datos de HPLC para estearato de glicopirronio EE-008-008.
Figura 8 muestra datos de HPLC para estearato de glicopirronio EE-008-001-3B.
Figura 9 muestra datos de cromatografía de gases para la muestra de estearato de glicopirronio EE-008-008. Figura 10 muestra datos de cromatografía de gases para la muestra de estearato de glicopirronio EE-008-001-3B.
Figura 11 muestra datos de RMN para todo el espectro de la muestra de estearato de glicopirronio EE-008-008. Figura 12A muestra datos de RMN para una porción del espectro de la Figura 11.
Figura 12B muestra datos de RMN para una porción del espectro de la Figura 11.
Figura 12C muestra datos de RMN para una porción del espectro de la Figura 11.
Figura 13A muestra datos de RMN para todo el espectro del subproducto Ácido A.
Figura 13B muestra datos de RMN para una porción del espectro de la Figura 13A.
Figura 13C muestra datos de RMN para una porción del espectro de la Figura 13A.
Figura 14A muestra datos de RMN para el subproducto de hidrólisis de glicopirronio, aminoalcohol cuaternario (QAA), agua residual en DMSO-d6, s a 4,7 ppm.
Figura 14B muestra datos de RMN para una porción del espectro de 14A.
Figura 14C muestra datos de RMN de carbono para el aminoalcohol cuaternario.
Figura 14D muestra datos de RMN de carbono para una porción del espectro de la Figura 14C.
Figura 15A muestra datos de HPLC para laurato de glicopirronio.
Figura 15B muestra una vista ampliada de los datos de la Figura 15A, junto con el informe del por ciento de área. Figura 15C muestra los datos de HPLC para otra ejecución de la muestra de laurato de glicopirronio.
Figura 15D muestra una vista ampliada de los datos de la Figura 15C, junto con el informe del por ciento de área. Figura 16A muestra datos de HPLc para palmitato de glicopirronio.
Figura 16B muestra una vista ampliada de los datos de la Figura 16A, junto con el informe del por ciento de área. Figura 16C muestra los datos de HPLC para otra ejecución de la muestra de palmitato de glicopirronio.
Figura 16D muestra una vista ampliada de los datos de la Figura 16C, junto con el informe del por ciento de área. Figura 17A muestra datos de HPLc para linoleato de glicopirronio.
Figura 17B muestra una vista ampliada de los datos de la Figura 17A, junto con el informe del por ciento de área. Figura 17C muestra los datos de HPLC para otra ejecución de la muestra de linoleato de glicopirronio.
Figura 17D muestra una vista ampliada de los datos de la Figura 17C, junto con el informe del por ciento de área. Figura 18 muestra datos de RMN para bromuro de glicopirronio, agua residual en DMSO-d6 a 3,33 ppm, singlete.
Figura 19 muestra datos de RMN para laurato de glicopirronio.
Figura 20 muestra datos de RMN para palmitato de glicopirronio.
Figura 21 muestra datos de RMN para linoleato de glicopirronio.
Figura 22 muestra la concentración de glicopirronio frente al área del pico de glicopirronio.
Figura 23 muestra un cromatograma en blanco.
Figura 24 muestra un cromatograma de solución de resolución.
Figura 25 muestra datos de cromatografía iónica para un estándar de bromuro.
Figura 26 muestra datos de cromatografía iónica para bromuro en estearato de glicopirronio.
Figura 27 muestra datos de cromatografía iónica para potasio en estearato de glicopirronio.
Figura 28 muestra un cromatograma de cromatografía de gases estándar para ácido esteárico.
Figura 29 muestra un cromatograma de cromatografía de gases de muestra para el análisis de ácido esteárico en estearato de glicopirrolato.
Descripción detallada de la invención
Las composiciones de antagonistas de los receptores muscarínicos anticolinérgicos de amonio cuaternario actualmente disponibles se presentan como una sal, con el catión de amonio cuaternario y un anión no orgánico.
Patente de U.S. No. 8,097,633, titulada "Uses for Quaternary Ammonium Anticholinergic Muscarinic Receptor Antagonists in Patients Being Treated for Cognitive Impairment or Acute Delirium", emitida el 17 de enero de 2012, y Publicación de patente U.S. 2012/0088785, titulada "New Uses for Quaternary Ammonium Anticholinergic Muscarinic Receptor Antagonists in Patients Being Treated for Cognitive Impairment or Acute Delirium", publicada el 12 de abril de 2012, describen métodos para tratar los efectos adversos de los inhibidores de la acetilcolinesterasa mediante el uso antagonistas de los receptores muscarínicos anticolinérgicos de amonio cuaternario tales como glicopirrolato o trospio.
Patente U.S. 8,969,402, titulada "Combined Acetylcholinesterase Inhibitor and Quaternary Ammonium Antimuscarinic Therapy to Alter Progression of Cognitive Diseases", emitida el 3 de marzo de 2015, y la publicación de patente US No. 2013/0172398, titulada "Combined Acetylcholinesterase Inhibitor and Quaternary Ammonium Antimuscarinic Therapy to Alter Progression of Cognitive Diseases", publicada el 4 de julio de 2013, describen como suministrar antagonistas de los receptores muscarínicos anticolinérgicos de amonio cuaternario en combinación con inhibidores de la acetilcolinesterasa para tratar el deterioro cognitivo o el delirio agudo. Esta terapia da como resultado una modificación de un trastorno o enfermedad cognitiva, específicamente una ralentización en la progresión de la enfermedad. También se describen nuevas formulaciones para antagonistas de los receptores muscarínicos anticolinérgicos de amonio cuaternario.
En las modalidades preferidas de la presente invención, un antagonista del receptor muscarínico anticolinérgico de amonio cuaternario incluye una sal que comprende un anión lipófilo orgánico como componente aniónico de la sal. En algunas modalidades preferidas, el anión lipófilo del antagonista del receptor muscarínico anticolinérgico de amonio cuaternario incluye preferentemente un ácido graso que incluye al menos ocho moléculas de carbono. En algunas modalidades preferidas, el antagonista del receptor muscarínico anticolinérgico de amonio cuaternario es glicopirrolato o trospio.
Los fármacos antimuscarínicos de amonio cuaternario (QAAM) son particularmente útiles debido a su capacidad para antagonizar la acetilcolina endógena durante períodos de producción excesiva de acetilcolina o efecto prolongado de acetilcolina por razones fisiológicas y farmacológicas. Estos compuestos comparten la propiedad de que no penetran apreciablemente en el sistema nervioso central (SNC), y el bromuro de glicopirronio y el cloruro de trospio han sido particularmente útiles en el tratamiento de pacientes que necesitan un efecto anticolinérgico periférico sobre los receptores antimuscarínicos.
La misma propiedad bioquímica que es ventajosa para prevenir la distribución en el SNC, también limita la absorción intestinal, lo que requiere que las formulaciones actualmente disponibles de estos medicamentos se tomen en ausencia de alimentos, y da como resultado una biodisponibilidad incompleta y variable en los pacientes.
Mejorar la biodisponibilidad oral de glicopirrolato, trospio y otros QAAM permite suministrar el medicamento sin tener en cuenta los alimentos y posiblemente sin tener en cuenta otros medicamentos. También disminuiría la variabilidad entre sujetos en el efecto del medicamento y reduciría el efecto de los cambios en la motilidad gastrointestinal sobre la absorción del fármaco, porque el grado de variabilidad entre pacientes es directamente proporcional al tiempo que lleva absorber un medicamento. También puede haber una mejora en la adherencia del paciente a la toma del medicamento al poder tomarlo cerca de los alimentos.
Un QAAM se produce con un anión lipofílico como componente aniónico de una sal. El análisis de actividad estructural (SAR) sugiere que un anión lipófilo óptimo sería un ácido graso de al menos 8 moléculas de carbono, de modo que la cola hidrófoba de las moléculas sirve para proporcionar una mayor solubilidad en lípidos para contrarrestar la carga positiva de la molécula QAAM catiónica ionizada. En algunas modalidades preferidas, las sales apropiadas provienen de una familia de ácidos grasos de cadena media y larga que incluyen, entre otros: ácido araquídico, ácido esteárico, ácido palmítico, ácido oleico, ácido erúcico, ácido linoleico, ácido araquidónico, ácido láurico, ácido cáprico, ácido linolénico o ácido mirístico.
La sal del QAAM (catión) y el ácido graso (anión) se pueden producir a través de reacciones de química orgánica denominadas "intercambio de iones", "intercambio de contraiones" o "metátesis de sal". En tal reacción, el compuesto QAAM como la sal elemental corriente (bromhidrato de glicopirrolato, cloruro de trospio) se coloca en una solución bifásica con la sal elemental de un ácido graso omega-3 tales como el ácido a-linolénico. La solución se somete a variaciones de temperatura, pH y agitación para producir una sal que se extrae selectivamente en la fase orgánica. Los extractos se concentran a presión reducida para eliminar el solvente y la sal se aísla, se identifica cualitativa y cuantitativamente y luego se suministra estequiométricamente a los animales. Los ensayos cuantitativos de suero y/u orina se usan para fabricar comparaciones con la sal elemental del QAAM, tanto en presencia como en ausencia de alimentos. La suministración intravenosa de QAAM (ejemplo: glicopirrolato) con análisis cuantitativo de suero y/u orina puede usarse como estándar de referencia para una biodisponibilidad del 100 %, y tanto el compuesto nativo como la sal sintetizada se comparan con esto para establecer su biodisponibilidad relativa en presencia y ausencia de alimentos y otros medicamentos comúnmente coadministrados.
Además de los estudios de biodisponibilidad mencionados anteriormente, sería necesario realizar estudios de calidad durante el proceso para asegurarse de que no haya hidrólisis de la molécula QAAM en el proceso.
Los ácidos grasos sintetizados/sal de QAAM son útiles como producto individual para el tratamiento de varias enfermedades que involucran una actividad excesiva de acetilcolina en humanos y animales, ya sea que se produzcan por un proceso patológico o por el uso de un medicamento (incluidos, entre otros: vejiga hiperactiva, sialorrea, diarrea, bradicardia, hiperhidrosis, secreción gástrica hiperactiva, síndrome de dumping, broncoespasmo, rinitis vasomotora). La biodisponibilidad mejorada de QAAM debería ser capaz de mejorar los síntomas sin causar una toxicidad anticolinérgica significativa en el sistema nervioso central. La biodisponibilidad mejorada permite suministrar sin tener en cuenta los alimentos, y también puede permitir que se mejore la absorción transdérmica hasta el nivel en que serían prácticas las formulaciones transdérmicas de este producto. Esto también podría usarse en combinación con fármacos inhibidores de la acetilcolinesterasa o cualquier otro fármaco que aumente el tono de la acetilcolina.
Las condiciones de reacción bifásicas permiten las reacciones de intercambio deseadas entre el bromuro de glicopirronio y las sales de ácidos grasos de metales alcalinos y metales alcalinotérreos para producir sales de ácidos grasos de glicopirronio. La separación favorable de la molécula de glicopirronio en la fase orgánica (junto con los ácidos grasos) y la separación del bromuro en la fase acuosa utilizan agua y metil tetrahidrofurano. Si bien las sales de ácidos grasos de glicopirronio son moderadamente inestables con respecto a la hidrólisis en las condiciones de reacción y se aíslan como productos oleosos, un exceso de ácido graso en la mezcla de reacción estabiliza la sal de ácido graso de glicopirronio y reduce la formación de subproductos de hidrólisis, Ácido A y el degradante de amonio cuaternario (QAA).
La mezcla de sal de ácido graso de glicopirronio y exceso de ácido graso libre puede aislarse entre sí para producir un producto consistente y bien definido. Las sales de ácidos grasos de glicopirronio descritas en la presente descripción ofrecen potencialmente el aumento deseado en la biodisponibilidad de glicopirronio. Dado que el exceso de ácidos grasos libres estabiliza las formulaciones descritas en la presente descripción, esto puede dar como resultado una mayor biodisponibilidad de la molécula de glicopirronio.
Se desarrollaron procesos sintéticos prácticos y escalables para la preparación de sales de ácidos grasos de glicopirronio lipófilos. Inicialmente, la preparación de las sales de ácidos grasos de glicopirronio lipófilas a partir de bromuro de glicopirronio y sales de potasio de ácido graso se realizó en disolventes orgánicos (condiciones anhidras) o condiciones bifásicas (agua/orgánico) ya que esto proporciona la oportunidad de un rápido éxito en la identificación de un procedimiento preparativo adecuado. La solubilidad de los materiales y productos de partida afectó a estas opciones y, en última instancia, limitó el enfoque a los sistemas bifásicos (solvente/agua). La preparación de las sales de ácidos grasos de glicopirronio lipófilas utilizó principalmente ácido láurico, ácido palmítico, ácido linoleico y ácido esteárico (estearato de potasio). Los procesos utilizaron diferentes sales, incluyendo sales de Na, K y Ca de ácidos grasos. En otras modalidades, se usan sales de Mg o Ba de ácidos grasos.
La evaluación incluyó varias etapas. La primera etapa fue la selección y evaluación de las opciones de preparación de sales lipófilas que utilizan ácido láurico. El desarrollo del proceso posterior y el desarrollo del método analítico se realizaron mediante el uso de preparaciones mediante el uso de ácido esteárico. Luego, se crearon al menos 5 g de una sal de ácido graso de glicopirronio lipófila que utiliza ácido esteárico. Se sintetizaron tres muestras adicionales y diferentes de al menos 3 g de sales de glicopirronio lipófilas con ácidos grasos adicionales (ácido palmítico, ácido láurico, ácido linoleico y ácido esteárico- véase la Tabla 23B más abajo). A continuación, se caracterizaron las cuatro muestras resultantes.
También se desarrollaron métodos analíticos para las sales de ácidos grasos de glicopirronio. Estos métodos evalúan de forma adecuada y precisa la calidad de las futuras muestras de desarrollo de sales de ácidos grasos de glicopirronio. También se ha desarrollado un proceso más refinado para la síntesis general de sales de ácidos grasos de glicopirronio.
Algunas de las aplicaciones del método analítico incluyen, entre otras, una evaluación de la eficacia del intercambio de sales, para garantizar que las reacciones alcancen una conversión >95 % mediante la determinación de un número y una cantidad óptimos de lavados acuosos para eliminar las sales de bromuro inorgánico ( subproductos), la determinación de la cantidad óptima ácido graso libre en exceso (al evaluar un intervalo adecuado de equivalentes molares) necesaria para estabilizar el ingrediente farmacéutico activo (API) y la mejora del aislamiento y purificación del producto de reacción (por ejemplo a través de la precipitación con combinaciones adecuadas de solvente/antisolvente) al evaluar la pureza de los productos de reacción. En algunas modalidades preferidas, el número óptimo de lavados acuosos es de 3-4 lavados. En otras modalidades, el número preferido de lavados es de al menos tres lavados.
El desarrollo del método analítico también incluye preferentemente métodos para la cuantificación de materiales de partida, productos y degradantes cromóforos, métodos para la cuantificación de materiales de partida y degradantes débilmente cromóforos o no cromóforos (ácidos grasos y sales derivadas, degradantes de dimetilhidroxipirrolidinio), métodos para la cuantificación del ion bromuro en el material de partida y el producto, y métodos para la cuantificación del ion potasio (o sodio) en el producto. Individualmente, ninguno de estos métodos por sí solo sería suficiente para evaluar la eficacia del proceso de intercambio de sal y la pureza de los productos derivados, pero en conjunto, la combinación de estos métodos analíticos ortogonales logra ambos objetivos.
Algunas abreviaturas usadas en esta solicitud se muestran en la Tabla 1 y las estructuras químicas se muestran en la Tabla 2.
Tabla 1
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Tabla 2
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En la Tabla 3A, más abajo, se muestra una estructura química general para las sales de ácidos grasos de glicopirronio lipófilas diana 1.
Tabla 3A
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Las estructuras químicas para algunos ejemplos preferidos de sales de ácidos grasos de glicopirronio se enumeran aquí.
R = C 11 H 23 (ácido láurico)
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R = C17H35 (ácido esteárico)
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R = C17H33 (ácido oleico)
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R = C15H31 (ácido palmítico)
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R = CgH 19 (ácido cáprico)
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R = C19H31 (ácido araquidonico)
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R = C19H39 (ácido araquidico)
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R = C21H41 (ácido erucico)
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R = C17H31 (ácido linoleico)
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R = C13H27 (ácido mirístico)
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Había dos materiales de partida preferidos (bromuro de glicopirronio 2 y base de glicopirrolato 3), como se muestra en la Tabla 3B a más abajo.
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Síntesis de sales de Glicopirronio
Se desarrolló una síntesis práctica y escalable de sales de glicopirronio de ácidos grasos. La estructura química general de la sal de glicopirronio de ácidos grasos se muestra como compuesto 1 en la Tabla 3A. Se consideraron tres enfoques diferentes, a partir de bromuro de glicopirronio (compuesto 2 en la Tabla 3B, también conocido como "glicopirrolato") o de un precursor sintético, designado en la presente descripción como base de glicopirronio (compuesto 3 en la Tabla 3B). Los tres enfoques fueron a) metátesis de sal mediante el uso de resinas de intercambio iónico, a partir de bromuro de glicopirronio (compuesto 2 en la Tabla 3B), b) metátesis de sal directa, a partir de bromuro de glicopirronio (compuesto 2 en la Tabla 3B), y c) síntesis a través de carbonatos de metilo de glicopirronio, mediante el uso de base de glicopirrolato (compuesto 3 en la Tabla 3B) como material de partida. La adición de al menos 0,2 equivalentes molares de ácidos grasos libres en exceso a una preparación con sales de ácidos grasos y bromuro de glicopirronio en un sistema de agua/Me-THF estabilizó la mezcla de reacción y permitió la formación de sales de ácidos grasos de glicopirronio.
"Ácido graso libre", tal como se define en la presente descripción, es un ácido graso en su forma libre, que es diferente del ácido graso en su forma ionizada (forma de sal).
En modalidades preferidas, se añade a la mezcla de reacción al menos 0,2 equivalentes molares de ácido graso libre en exceso para formar una sal de ácido graso de glicopirronio. En algunas modalidades preferidas, se añaden a la mezcla de reacción entre 0,2 y 1,2 equivalentes molares de ácido graso libre en exceso. En otra modalidad preferida, se añaden a la mezcla de reacción al menos 0,6 equivalentes molares de ácido graso libre en exceso. En otra modalidad preferida, se añaden a la mezcla entre 0,6 y 1,2 equivalentes molares de ácido graso libre en exceso para formar una sal de ácido graso de glicopirronio. En otra modalidad, se añaden a la mezcla de reacción aproximadamente 1,2 equivalentes molares de ácido graso libre en exceso. En otra modalidad, se añaden a la mezcla de reacción al menos 1,1 equivalentes molares de ácido graso libre en exceso.
En modalidades preferidas, las mezclas de sales de ácidos grasos de glicopirronio aisladas tienen un enriquecimiento del ácido graso (con relación a el glicopirronio) en comparación con la relación de entrada. En las modalidades mediante el uso de 1,2 equivalentes molares de ácido graso libre en exceso, los productos aislados tienen preferentemente una relación de entrada de FA:GP superior a 2,2:1. En algunas de estas modalidades, la relación está aproximadamente entre 2,25:1 y 3,00:1. En algunas de estas modalidades, la relación está aproximadamente entre 2,29:1 y 2,87:1.
En un ejemplo, una mezcla de reacción de bromuro de glicopirronio con laurato de potasio se estabiliza con respecto a la formación del subproducto (Ácido A) al añadir un exceso de ácido láurico libre. Algunos ácidos grasos preferidos incluyen, entre otros, ácido araquídico, ácido esteárico, ácido palmítico, ácido oleico, ácido erúcico, ácido linoleico, ácido araquidónico, ácido láurico, ácido cáprico, ácido linolénico o ácido mirístico. Algunas sales preferidas para la sal de ácido graso incluyen, entre otras, sales de Na, K o Ca. En otras modalidades, puede usarse sales de Mg o Ba.
Como se describió en la presente descripción, el exceso de ácido graso libre es con relación al bromuro de glicopirronio y la sal de ácido graso usada. Por ejemplo, para una reacción de ácido láurico con potasio, es usado el exceso de ácido láurico libre con relación al bromuro de glicopirronio y el laurato de potasio.
El exceso de ácido graso libre estabiliza la mezcla de reacción. Los mayores excesos de ácido graso libre (0,6-1,2 de exceso molar) mejoraron las separaciones de fase, mejoraron la estabilidad de las soluciones de extracto orgánico y mejoraron la estabilidad de los productos aislados.
Existe el potencial de aislar una mezcla de sal de ácido graso de glicopirronio y exceso de ácido graso libre para garantizar un producto consistente y bien definido.
Intercambio iónico
Desde el principio, el enfoque de síntesis mediante el uso resinas de intercambio iónico fue un desafío debido a la conocida inestabilidad hidrolítica del bromuro de glicopirronio a valores de pH superiores a pH 5,6 (ver, por ejemplo Gupta, VD, "Estabilidad de las formas farmacéuticas líquidas orales de glicopirrolato preparadas con el uso de polvo", International Journal of Pharmaceutical Compounding, 2003, 7(5), 386-388) y la complejidad y costo de la tecnología requerida. Si bien las soluciones acuosas de bromuro de glicopirronio son razonablemente estables a temperatura ambiente con un pH de 5,6 e inferior, se esperaría que el bromuro de glicopirronio se hidrolizara rápidamente en el enlace éster a los valores de pH requeridos en un proceso de intercambio de sal que emplea resinas.
A partir del bromuro de glicopirronio comercialmente disponible (estructura 2 en la Tabla 3B), las sales de ácidos grasos correspondientes (estructura 1 en la Tabla 3A) pueden obtenerse en principio mediante el uso de resinas de intercambio iónico aniónico. La Tabla 4 proporciona un diagrama de flujo de intercambio iónico, que muestra un esquema de cómo se puede lograr esto.
Tabla 4
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)
Sin embargo, el enfoque de intercambio iónico mediante el uso de resinas requiere experiencia más allá de las metodologías de síntesis estándar. Además de la selección de una resina adecuada, es necesario elegir cuidadosamente una serie de parámetros para maximizar la eficacia de este proceso. Los factores que afectan las isotermas de adsorción-desorción en el intercambio iónico incluyen, entre otros, la relación relativa de sustrato a resina, el sistema solvente (eluyente), la temperatura y la concentración del sustrato. Las interacciones hidrófobas entre la resina y la cadena principal del ácido graso también pueden jugar un papel importante en la eficiencia de unión (además de la atracción electrostática de los grupos polares). Por esta razón, la elección de la resina en sí misma puede ser una consideración importante (ver, por ejemplo,Ihara, Y. "Adsorption of Fatty Acid Sodium Salts on Ion Exchange Resins", Journal of Applied Polymer Science, 1986, 32(6), 5665-5667). En Ihara, la resina débilmente básica con grupos fenilo hidrófobos en el polímero (IRA94) mostró un mejor desempeño que la resina menos hidrófoba (IRA68). La eficiencia de adsorción de las sales de sodio de ácido graso aumentó drásticamente, al pasar de sales de ácidos grasos C-6 a C-12.
Un desafío adicional con la metodología de intercambio iónico es la inestabilidad del glicopirrolato a pH elevado en soluciones acuosas debido a la hidrólisis del éster. Este compuesto es razonablemente estable a temperatura ambiente a pH 5,6 e inferior (Gupta, 2003), pero se espera que sea susceptible a la hidrólisis del éster en las condiciones de procesamiento (ya que los valores de pH serán sustancialmente superiores a pH 5,6).
Los otros dos enfoques se evaluaron para la preparación de sales de ácidos grasos de glicopirronio lipófilas.
El ácido láurico se seleccionó como ácido graso modelo para el trabajo inicial. La reacción de intercambio de bromuro de glicopirronio con laurato de potasio se examinó en varios sistemas de solventes.
El mejor sistema solvente fue agua/metil tetrahidrofurano (Me-THF) que proporcionó el producto deseado, laurato de glicopirronio. Desafortunadamente, el producto oleoso aislado era inestable y se descompuso en el subproducto Ácido A. Los productos de descomposición del intento de metilación de la base de glicopirrolato con carbonato de dimetilo, que incluyen el Ácido A y el éster metílico del Ácido A, se muestran en la Tabla 5.
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El estearato de potasio y el palmitato de potasio también se investigaron en el sistema Me-THF/agua en un intento por mejorar la estabilidad de las sales objetivo y obtener los materiales objetivo en forma sólida. Estas reacciones fallaron para proporcionar producto(s) sólido(s) y mostraron una hidrólisis parcial a Ácido A durante el proceso. Metátesis Salina Directa (intercambio de contraiones)
La reacción de bromuro de glicopirronio con sales de ácidos grasos se realizó en solventes orgánicos (condiciones anhidras) y condiciones bifásicas (agua/orgánico). Las reacciones en solventes orgánicos no dieron como resultado la formación de ningún producto, mientras que mediante el uso de condiciones bifásicas se proporcionó los productos deseados en la mezcla de reacción.
La química general de este proceso se muestra más abajo:
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Se desarrolló con éxito una metátesis de sal directa ("intercambio de iones") entre el bromuro de glicopirronio y la sal de sodio o potasio de ácidos grasos representativos mediante el uso de un proceso extractivo. En este proceso, la sal inorgánica soluble en agua derivada del intercambio de bromuro con la base conjugada de carboxilato del ácido graso se reparte en la fase acuosa y se elimina del medio de reacción para impulsar el proceso de intercambio. A continuación, se evaluó un intercambio directo de contraiones entre bromuro de glicopirronio y sales de ácidos grasos adecuadas. La fuerza impulsora de una reacción típica de metátesis salina es la generación de una sal insoluble que precipita fuera de la solución. En el caso de las sales de ácidos grasos, los materiales de partida más probables serían las correspondientes sales de plata. Por ejemplo, ver Publicación de patente US 2011/0306650, publicada el 15 de diciembre de 2011, que describe la preparación de cloruro de glicopirronio mediante la reacción de bromuro de glicopirronio con acetato de plata para producir acetato de glicopirronio (el bromuro de plata precipita fuera). Luego, la sal de acetato se hace reaccionar con HCl para producir el cloruro de glicopirronio (junto con ácido acético). El sulfato de glicopirronio se produce de manera similar por metátesis de sal mediante el uso de sulfato de plata. Dichos materiales de partida no eran convenientes debido a la preocupación por los residuos de metales pesados en la sustancia farmacológica, ya que se esperaba que fueran difíciles de eliminar por completo de las sales de ácidos grasos de glicopirronio deseadas y requerían consideraciones especiales de eliminación de desechos para las sales de plata precipitadas a gran escala ( preferentemente a través de recuperación de metal). No obstante, se consideró una elección de solvente adecuada en combinación con las sales de ácidos grasos de metales inocuos tales como sodio, potasio o calcio para evaluar el intercambio de contraiones a través de la precipitación de las sales de bromuro derivadas (bromuro de sodio, potasio o calcio). Alternativamente, la reacción de intercambio de contraiones podría impulsarse al extraer la sal inorgánica altamente soluble en la fase acuosa. Para seleccionar los solventes de reacción, se determinó la solubilidad del bromuro de glicopirronio (GPBr-estructura 2 en la Tabla 3B) en varios solventes mediante el uso de curvas de calibración de HPLC (véanse las Figuras 1 y 2). Los resultados de la solubilidad del bromuro de glicopirronio en varios solventes a temperatura ambiente se resumen en la Tabla 6 más abajo. El experimento se realizó con 50 mg de bromuro de glicopirronio y 1 mL de solvente en la mayoría de los casos. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas y luego se filtró para dar un filtrado claro. El filtrado se diluyó con acetonitrilo y se comprobó por HPLC.
Tabla 6
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Se prepararon tres sales de ácido láurico (Na, K y Ca) como sales modelo. Estas sales se prepararon al seguir el procedimiento de Zacharie y otros. ("A Simple and Efficient Large-Scale Synthesis of Metal Salts of Medium-Chain Fatty Acids", Organic Process Research & Development 2009, 13, 581-583).
Preparación de Laurato de Sodio
Se disolvió ácido láurico (50,08 g, 1,0 eq.) en etanol (500 mL, 10 vol., 95 % desnaturalizado) a temperatura ambiente y se hizo reaccionar con NaHCO3 (18,9 g, 0,9 eq.) en etanol (500 mL, 10 vol., 95 % desnaturalizado) a temperatura de reflujo. La mezcla de reacción (suspensión) se agitó a temperatura de reflujo (~77 °C) durante la noche. Algunos sólidos precipitaron durante la noche (frente a la solución informada en la bibliografía) y la mezcla se diluyó con etanol adicional (~1,5 l). La solución se decantó y se enfrió a temperatura ambiente durante cuatro horas (el producto sólido precipitó a ~55 °C). La suspensión se filtró y el producto se lavó con MTBE (3 x 200 mL) para eliminar el exceso de ácido láurico libre sin reaccionar. La torta húmeda blanca se secó al aire durante el fin de semana y en un horno de vacío a 50 ± 5 °C durante la noche para proporcionar 27,2 g (54,4 % de rendimiento) de un sólido blanco. Si bien el rendimiento fue menor que en la literatura de la técnica anterior, el procedimiento podría optimizarse para un mejor rendimiento. Algunos métodos para mejorar el rendimiento incluyen, entre otros, la optimización de la concentración durante el proceso de cristalización o mediante el uso de un antisolvente para disminuir la solubilidad del producto y mejorar el rendimiento.
Preparación de Laurato de Potasio
El segundo experimento se realizó con 25 g (1,0 eq.) de ácido láurico y 11,25 g de KHCO3 (0,9 eq.) en etanol (250 mL) a reflujo. El producto se cristalizó en etanol/MTBE (1/1) para proporcionar 22,1 g (82,5 % de rendimiento) de laurato de potasio después de secar al aire durante el fin de semana y en un horno de vacío a 50 ± 5 °C durante la noche.
Para seleccionar los solventes de reacción y sus volúmenes optimizados, se verificó la solubilidad del laurato de potasio en varios solventes al añadir solvente para disolver los sólidos bajo sonicación. Se cargó un vial con laurato de potasio (~100 mg) y luego se añadió el solvente gota a gota bajo sonicación. El laurato de potasio no pudo disolverse con la mayoría de los solventes (200 vol.). Los resultados de la solubilidad del laurato de potasio en varios solventes se resumen en la Tabla 7 más abajo:
Tabla 7
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Preparación de Laurato de Calcio
El tercer experimento se realizó con 15,6 g (1,0 eq.) de ácido láurico y 2,6 g de Ca(OH)2 (0,9 eq.) en etanol (450 mL) a reflujo durante 4 horas. El producto precipitó a la temperatura de reflujo. La mezcla de reacción se diluyó adicionalmente con metanol (500 mL) a temperatura de reflujo. La suspensión se enfrió a temperatura ambiente y se filtró y luego se enjuagó con un lavado con MTBE. El sólido se secó al aire durante la noche y en un horno de vacío a 50 ± 5°C durante la noche para proporcionar 10,4 g de sólido blanco (67,7 % de rendimiento). El procedimiento podría optimizarse para aumentar el rendimiento. Algunos métodos para mejorar el rendimiento incluyen, entre otros, la optimización de la concentración durante el proceso de cristalización o mediante el uso de un antisolvente para disminuir la solubilidad del producto y mejorar el rendimiento.
Reacción en solventes Orgánicos
Metátesis de sal a través de se intentó la precipitación mediante el uso laurato de potasio, laurato de sodio, estearato de potasio y palmitato de potasio, en combinación con acetona, metanol y diclorometano como solventes. Se seleccionó el laurato de potasio como la sal de ácido graso modelo para este enfoque. El primer intento de reacción se llevó a cabo en acetona anhidra. Se cargó bromuro de glicopirronio (0,508 g, 1,0 eq.) en un matraz de 250 mL seguido de acetona (50 mL). Se añadió laurato de potasio (1,1 eq.) a la mezcla. La mezcla se agitó y se añadió acetona adicional (100 mL) en un intento de disolver los sólidos. Los sólidos no se disolvieron completamente. La mezcla se agitó toda la noche y después se concentró en un residuo. Es usado acetato de etilo (EtOAc, 100 mL) para extraer el residuo crudo. El extracto se concentró para proporcionar solo 48 mg (menos del 10 % en peso de recuperación ) de un residuo aceitoso. El análisis por HPLC del residuo mostró que estaban presentes varios picos. El análisis de RMN de protón mostró que se obtuvo una mezcla compleja.
La reacción no proporcionó el producto deseado, muy probablemente debido a la baja solubilidad tanto del bromuro de glicopirronio como del laurato de potasio.
Dado que ambos compuestos de partida son solubles en metanol, se intentó la siguiente reacción en metanol. Se cargó bromuro de glicopirronio (1,036 g, 1,0 eq.) en un vial de 20 mL seguido de metanol (5 mL) para disolver todos los sólidos. Se añadió a la mezcla una solución de laurato de potasio en metanol (0,691 g, 1,1 eq., 10 mL de metanol). La mezcla se agitó durante el fin de semana a temperatura ambiente y luego la solución se verificó por HPLC, lo que mostró que se formó un nuevo pico (RRT = 1,37) a ~ 47 % de AUC de HPLC. La solución se concentró para eliminar el metanol y luego se extrajo con EtOAc (3 x 100 mL). Los extractos de EtOAc se combinaron y concentraron hasta un residuo oleoso (0,8 g). El análisis de HPLC mostró que el nuevo pico estaba enriquecido al 61 % de AUC.
El análisis de RMN de protones mostró que se formó un pico de éster metílico a 3,77 ppm. La estructura propuesta para este subproducto es la siguiente:
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Subproducto proposite
El sólido (0,87 g) que quedaba después de la extracción con EtOAc se comprobó mediante HPLC, lo que mostró que el pico principal era "bromuro" con ~91 % AUC. Sin embargo, el análisis de RMN de protones sugirió que el sólido era una mezcla de al menos tres posibles compuestos enumerados en la Tabla 8 más abajo.
Tabla 8
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La sal de ácido graso de glicopirronio era inestable en la mezcla de reacción metanólica. Sin embargo, se confirmó que el material de partida, bromuro de glicopirronio (estructura 2 en la Tabla 3B), en ausencia de otros componentes, es estable en metanol.
Para explorar las reacciones de intercambio en condiciones anhidras, se probaron cuatro sales de ácidos grasos (laurato de potasio, laurato de sodio, estearato de potasio y palmitato de potasio) al suspender los reactivos en diclorometano (DCM) y agitar durante 90 horas a temperatura ambiente. Se esperaba que cualquier precipitación de bromuro de potasio (o bromuro de sodio) sirva para proporcionar un enriquecimiento del pico de glicopirronio con relación al pico de bromuro en el análisis HPLC de las soluciones de DCM filtradas. La mezcla de reacción (DCM, 1,0 mL) se filtró a través de un filtro de jeringa, se concentró y el residuo sólido resultante se disolvió en una fase móvil y se analizó por HPLC. Los resultados de HPLC de las reacciones de intercambio en un sistema DCM anhidro se muestran en la Tabla 9 más abajo.
Tabla 9
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La relación bromuro/glicopirronio indicó claramente que no había tenido lugar ningún enriquecimiento de glicopirronio con relación al bromuro. No se observó ningún producto deseado mediante el uso de condiciones anhidras (DCM) con laurato de potasio, laurato de sodio, estearato de potasio o palmitato de potasio.
Todos los intentos fracasaron debido a problemas de solubilidad (baja solubilidad del bromuro de glicopirronio en acetona), inestabilidad (reacción de transesterificación en metanol) y diferencia de solubilidad insuficiente (en diclorometano).
Reacción en condiciones Bifásicas
Un enfoque alternativo de manera que el proceso de intercambio se lleva a cabo en una mezcla bifásica de solventes tuvo más éxito. En la Tabla 10 se muestra un intercambio de contraiones mediante extracción selectiva.
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Se evaluaron seis solventes en el procedimiento extractivo: 2-metil tetrahidrofurano (MeTHF), metil ter-butil éter (MTBE), acetato de isopropilo (IPAc), metil isobutil cetona (MIBK), tolueno y diclorometano (DCM). Mediante el uso de laurato de sodio como sal de ácido graso modelo, se determinó que MeTHF era el mejor solvente, al proporcionar una fase orgánica que estaba altamente enriquecida en laurato de glicopirronio.
Experimentos adicionales mediante el uso de laurato de potasio, palmitato de potasio y estearato de potasio demostraron la generalidad de esta metodología. Los productos de reacción se caracterizaron por análisis de RMN de protones y se confirmó que eran consistentes con las sales de ácidos grasos. El análisis de HPLC mediante el uso de un método de desarrollo HPLC mostró enriquecimientos de hasta 96 % área/área después de 3 - 4 lavados acuosos de los extractos de MeTHF.
Se observó que una reacción secundaria de hidrólisis era un problema importante en el proceso de intercambio de contraiones al pH predominante (8,0 - 8,3). Este problema se resolvió mediante el uso de un exceso de ácido graso libre para "tamponar" el medio y minimizar la reacción de hidrólisis, y realizar el intercambio y procesamiento adicional de los materiales a temperatura ambiente.
Dado que ambos compuestos de partida son muy solubles en agua, se intentó la reacción en agua/Me-THF. Se cargó bromuro de glicopirronio (estructura 2 en la Tabla 3B) (1,0 eq.) en un vial de 20 mL seguido de agua (2 mL) para disolver todos los sólidos. La solución de bromuro de glicopirronio se transfirió a una solución de laurato de potasio en agua (1,1 eq., 5 mL de agua) en un vial de 20 mL. El vial de bromuro de glicopirronio se enjuagó con agua (3 x 1 mL) y el enjuague se transfirió al vial de reacción. El análisis de HPLC mostró que la relación de área del pico de "Bromuro" al pico de "Glicopirronio" era 20/80. Se añadió Me-THF (10 mL) a la solución de reacción. La mezcla se agitó durante una hora y luego se asentó para la separación de las fases. Ambas capas fueron revisadas por HPLC y se encontró que la relación de área del pico de "Bromuro" al pico de "Glicopirronio" era significativamente diferente entre las dos capas (XL-007-071-1 y XL-007-071-2, Tabla 11, más abajo). Luego, la mezcla de reacción se volvió a mezclar durante una hora y luego se asentó durante una hora para producir dos capas (XL-007-071-3 y XL-007-071-4). El análisis de HPLC mostró que la relación de los dos picos no cambió. Los resultados mostraron que había más "Bromuro" en la capa acuosa y el "Glicopirronio" se extrajo en la capa de Me-THF. La capa acuosa se eliminó, se reemplazó con agua fresca, se mezcló y luego se asentó para proporcionar dos capas (XL-007-071-5 y XL-007-071-6). El análisis de HPLC mostró que la capa de Me-THF contenía un 93% de área de "Glicopirronio". La capa de Me-THF se lavó con agua dos veces adicionales y el producto de la capa de Me-THF se enriqueció hasta el 96% del área (XL-007-071-10). Los resultados de HPLC para las capas acuosa y orgánica de la mezcla de reacción se muestran en la Tabla 11.
Tabla 11
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Se tomó una muestra alícuota de la capa de Me-THF lavada (XL-007-071-10) y se concentró en un aceite que se analizó por RMN de protones en diferentes solventes (CDCh, DMSO-d6, y D2O) para comparación con los materiales de partida. El espectro de RMN de protones fue consistente con el espectro esperado del producto deseado:
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0 -11H23
Para mejorar la solubilidad selectiva y la separación del bromuro y la sal de ácido graso entre las capas acuosa y solvente, la reacción de bromuro de glicopirronio (estructura 2 en la Tabla 3B) con laurato de sodio se examinó en los siguientes seis disolventes con agua: Tetrahidrofurano de metilo (Me-THF), Metil Ter- butil Éter (MTBE), Acetato de isopropilo (IPAc), 4-Metil-2-pentanona (MIBK), Tolueno y Diclorometano (DCM).
La reacción se realizó con bromuro de glicopirronio (100 mg, 1,0 eq.) y laurato de sodio (61 mg, 1,1 eq.) con 7 mL de agua y 7 mL de solvente orgánico a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se agitó por cuatro días y después se asentó. Ambas capas se comprobaron mediante HPLC y los resultados analíticos para el intercambio de laurato de sodio/bromuro de glicopirronio se resumen en la Tabla 12, más abajo:
Tabla 12
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[2]Las áreas de los picos de HPLC eran muy pequeñas.
De estos seis experimentos, Me-THF fue el mejor solvente para la partición y extracción selectiva del producto. Desafortunadamente, el producto de descomposición (Ácido A, RRT=0,74) se observó tanto en la capa orgánica como en la capa acuosa.
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Se seleccionó Me-THF para una investigación adicional en base a los resultados de la selección del solvente. La reacción mediante el uso de laurato de potasio y Me-THF se amplió a 4,89 g de bromuro de glicopirronio con laurato de potasio (3,07 g, 1,05 eq.) en 25 mL de agua y 53 mL de metil THF a temperatura ambiente. La mezcla se agitó durante una hora y se asentó para la separación de las fases. Se formaron tres capas y cada una se comprobó mediante HPLC y los resultados de la reacción de aumento de escala en agua/Me-THF se resumen en la Tabla 13. Se confirmó que se detectó un pico adicional (tR= 5,29 min, RRT = 0,74) y que este pico aumentó con el tiempo. Se confirmó que este pico era el subproducto, Ácido A, en comparación con una preparación separada y el aislamiento del Ácido A. El Ácido A, el producto de hidrólisis de la base de glicopirrolato (estructura 3 en la Tabla 3B) se aisló y caracterizó por HPLC y RMN. (1H y 13C).
Se eliminó la capa inferior (acuosa) y se lavaron las dos capas superiores con agua (3 x 20 mL). Se observó que solo se formaron dos capas después de la primera separación de las fases. La capa orgánica final (XL-007-080-4A) se concentró a 60 °C en un evaporador rotatorio para proporcionar un residuo que se volvió a disolver con metil THF (100 mL). Los sólidos insolubles (KBr y laurato de potasio) se filtraron y disolvieron con agua y luego se verificaron por HPLC (XL-007-080-P1). El filtrado se concentró en seco para proporcionar un aceite (6,12 g, XL-007-080-P2) y el análisis por HPLC mostró que el pico de bromuro se redujo al 1,34 % del área. El producto se secó en un horno de vacío a 50 °C durante el fin de semana. El análisis de r Mn del producto seco mostró cierta descomposición. El producto oleoso seco se disolvió con MTBE (100 mL) y se intentó la precipitación al añadir n-heptano, lo que dio como resultado dos capas líquidas. Ambas capas se revisaron por HPLC (Capa superior: XL-007-082-1 y capa inferior: XL-007-082-2) y mostraron altos niveles del subproducto, Ácido A.
Tabla 13
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Se confirmó que el producto oleoso aislado se había descompuesto parcialmente. Lo más probable es que esta descomposición sea consistente con una reacción de hidrólisis, que se facilita a temperatura elevada y pH elevado. El esquema de reacción de descomposición propuesto se muestra más abajo:
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La naturaleza de la mezcla de reacción, que incluía componentes con cromóforos fuertes y otros que tenían cromóforos débiles (a todos los efectos, etiquetados en la presente descripción como "UV inactivos") hizo que el análisis y la cuantificación precisos de todos los componentes en las mezclas fueran muy desafiantes. Por este motivo, se desarrollaron métodos analíticos ortogonales y complementarios para facilitar tanto el análisis en proceso de las reacciones como la evaluación tanto de la pureza como de la composición de los productos de reacción aislados.
El producto deseado, laurato de glicopirronio, se aisló mediante extracción con Me-THF a partir de una solución acuosa de bromuro de glicopirronio y laurato de potasio. Desafortunadamente, el producto aislado fue inestable durante el proceso de aislamiento y los niveles de Ácido A aumentaron con el tiempo. El producto aislado se degradó a 50 °C de ~94 % de área a 83-86 % de área durante un fin de semana. El propio bromuro de glicopirronio era estable en la solución diluyente de HPLC (ACN/agua) a temperatura ambiente durante dos semanas (mediante HPLC).
La preparación de laurato de glicopirronio se repitió a una escala de 5,0 g (GPBr). Los resultados de HPLC de la reacción en agua/ME-THF de aumento de escala repetida se resumen en la Tabla 14, más abajo. Se confirmó por HPLC que el producto de descomposición Ácido A se formó durante el tratamiento y aislamiento.
Tabla 14
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La solución de Me-THF se sometió a prueba de estrés a temperatura ambiente y a 50 °C durante el fin de semana con y sin la adición de un exceso de ácido láurico libre. Los resultados de la prueba de estrés se enumeran en la Tabla 15. Si bien las soluciones a temperatura ambiente mostraron mucha menos degradación que las muestras calentadas, la descomposición aún fue significativa. El intento de estabilizar el producto con exceso de ácido láurico libre dio como resultado que se observara menos descomposición que en las muestras correspondientes sin exceso de ácido láurico libre. Se observó que las soluciones de Me-THF se dividían en dos capas a 50 °C. Esto probablemente se debió a una disminución en el límite de solubilidad del agua en la mezcla tras el calentamiento. Sin exceso de ácido láurico libre, el producto se descompuso lentamente a temperatura ambiente desde un contenido de producto del 90,67 % del área hasta el 87,72 % en la solución de Me-THF. A 50 °C, el producto se descompuso significativamente, a solo el 57 % del área en la capa superior y ~50 % en la capa inferior. En presencia de exceso de ácido láurico libre a temperatura ambiente, el producto mostró solo una ligera descomposición (Exp.
2A), mientras que a 50 °C, el producto se descompuso, al dejar solo ~65-70 % del área, incluso con exceso de ácido láurico libre presente.
Tabla 15
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El producto deseado en Me-THF se degradó con el tiempo. El producto se degradó significativamente más rápido a 50 °C. Con la presencia de ácido láurico libre en exceso (aproximadamente 1,0 equivalente molar en exceso), la descomposición del producto fue más lenta, especialmente a temperatura ambiente.
Una extracción con Me-THF de la solución acuosa de bromuro de glicopirronio y laurato de potasio produjo el producto deseado pero el producto deseado era inestable durante el proceso de extracción a temperatura ambiente.
El producto de descomposición observado se confirmó mediante preparación independiente y aislamiento como el producto de hidrólisis (Ácido A). Se confirmó que el producto se descomponía significativamente más rápido a 50 °C.
El producto bruto aislado era oleoso y no precipitó en heptano y otros solventes (MTBE, IPAc y EtOAc).
Dado que el producto oleoso obtenido a partir del laurato de potasio era inestable, se probaron ácidos grasos con cadenas más largas en un intento de obtener productos sólidos con una estabilidad potencialmente mejorada.
Se prepararon estearato de potasio y palmitato de potasio y se probaron con bromuro de glicopirronio en el sistema Me-THF/agua.
Se usaron ácido esteárico y ácido palmítico como sales de potasio. Las preparaciones de estearato de potasio y palmitato de potasio se realizaron al seguir los procedimientos de Zacharie y otros ("A Simple and Efficient Large-Scale Synthesis of Metal Salts of Medium-Chain Fatty Acids", Organic Process Research & Development 2009, 13, 581-583), que se resumen más abajo.
Para la preparación de estearato de potasio, se disolvió ácido esteárico (25,0 g, 1,0 eq.) en etanol (500 mL, 20 vol., 95 % desnaturalizado) a 45 °C en un matraz de parte inferior redonda de 2 l. Se añadió KHCO3(7,88 g, 0,9 eq.) a la solución y luego la mezcla de reacción se calentó a reflujo (~77 °C). La reacción se agitó toda la noche (21 horas) a reflujo. Se añadió MTBE (500 mL) a la solución a 65 °C. Se produjo algo de espuma y fue necesario agitar vigorosamente para romper la espuma. A continuación, se añadió una segunda porción de MTBE (500 mL) a 50 °C y la suspensión resultante se enfrió a temperatura ambiente durante aproximadamente 3 horas. La suspensión se filtró y la torta húmeda se lavó con MTBE (3 x 125 mL). La torta húmeda blanca se secó en un horno al vacío a ~50 °C durante la noche para dar un producto sólido blanco (rendimiento cuantitativo, 25,4 g).
Para la preparación de palmitato de potasio, se disolvió ácido palmítico (15,0 g, 1,0 eq.) en etanol (200 mL, 95 % desnaturalizado) a 40 °C en un matraz de parte inferior redonda de 1 l. Se añadió KHCO sólido3(5,27 g, 0,9 eq.) a la solución y luego la mezcla de reacción se calentó a reflujo (~77 °C). La reacción se agitó toda la noche (20 horas) a reflujo. Se añadió MTBE (100 mL) a la solución a 65 °C y precipitó un producto sólido. Luego se añadió una segunda porción de MTBE (100 mL) y la suspensión resultante se enfrió a temperatura ambiente durante aproximadamente 3 horas. La suspensión se filtró y la torta húmeda se lavó con MTBE (3 x 100 mL). La torta húmeda blanca se secó en un horno al vacío a ~50 °C durante la noche para proporcionar un producto sólido blanco (14,7 g, 94,8 % de rendimiento).
Las reacciones de intercambio se realizaron al disolver la sal de ácido graso con bromuro de glicopirronio en Me-THF/agua, agitar durante 5,0 h a temperatura ambiente, luego separar las fases y lavar la fase orgánica con agua.
Los resultados analíticos de HPLC de las capas de Me-THF y de agua se muestran en las Figs. 3 (estearato de potasio) y 4 (palmitato de potasio). Las reacciones de intercambio con estearato de potasio y palmitato de potasio no proporcionaron los productos deseados libres de la impureza Ácido A. Después de la concentración de los extractos, ambas reacciones dieron residuos oleosos pegajosos que eran difíciles de aislar. Ninguno ofreció una ventaja sobre los resultados del laurato de potasio.
Estabilización de Reacciones de Intercambio Mediante la Adición de ácido graso libre en exceso.
En un intento de estabilizar el producto de laurato de glicopirronio y evitar la descomposición del glicopirronio en Ácido A, el sistema de reacción Me-THF/agua se probó con un exceso de ácido láurico libre (exceso de 1,1 equivalente molar con relación al bromuro de glicopirronio). Se realizaron dos experimentos con y sin exceso de ácido láurico libre al mezclar dos soluciones de bromuro de glicopirronio (1,04 g, 1,0 eq.) en agua (5 mL) y laurato de potasio (1,1 eq.) en agua (5 mL) con Me-THF (20 mL) con y sin exceso de ácido láurico (1,1 eq.) a temperatura ambiente durante la noche. Para cada reacción, ambas capas se comprobaron mediante HPLC con los resultados de la HPLC para la reacción de intercambio con exceso de ácido láurico libre resumidos en la Tabla 16 más abajo.
La reacción con exceso de ácido láurico libre no mostró formación del subproducto, Ácido A, después de mezclar durante la noche, pero el experimento sin exceso de ácido láurico libre tenía Ácido A en ambas capas.
Tabla 16
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La adición de 1,1 equivalentes molares de ácido láurico libre en exceso a una preparación con laurato de potasio y bromuro de glicopirronio en el sistema agua/Me-THF estabilizó la mezcla de reacción.
Las condiciones de reacción bifásicas permitieron las reacciones de intercambio deseadas entre el bromuro de glicopirronio y las sales de metal alcalino y alcalinotérreo de ácidos grasos. Se logró una separación favorable de la molécula de glicopirronio en la fase orgánica (junto con los ácidos grasos) y la distribución del bromuro en la fase acuosa con agua y metil tetrahidrofurano. Las sales de ácidos grasos de glicopirronio eran inestables con respecto a la hidrólisis en las condiciones de reacción y eran inestables como productos oleosos aislados. Se observó la formación de la impureza, Ácido A, con el tiempo. Un exceso de ácido graso libre en la mezcla de reacción estabilizó la sal de ácido graso de glicopirronio y redujo la formación de la impureza, Ácido A.
Reacción con Carbonatos de Metilo
En el estado de la técnica previo, la química del carbonato de dimetilo se ha empleado principalmente en la industria de los surfactantes y detergentes, así como también en la fabricación de líquidos iónicos con contraiones diferentes de los haluros.
La reacción de la base de glicopirrolato con carbonato de metilo y el tratamiento posterior con ácidos grasos falló para proporcionar algunos de los productos deseados y solo produjeron productos de descomposición a partir de la base de glicopirrolato.
Más abajo se muestra un ejemplo de la química involucrada en este proceso:
Ejemplo
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El enfoque de síntesis que procedió a través de carbonatos de metilo no tuvo éxito, debido a la inestabilidad de la base de glicopirrolato inicial (compuesto 3 en la Tabla 17) y sus productos de reacción de cuaternización (carbonatos de metilo de glicopirronio, compuesto 4 en la Tabla 17) bajo las condiciones de alta temperatura y presión requeridas. para una reacción de cuaternización exitosa con carbonato de dimetilo.
Dado que no se pudo lograr una síntesis limpia de la sal carbonatada de metilo de glicopirronio requerida, este enfoque se suspendió y los esfuerzos posteriores se centraron en una metátesis de sal directa mediante el uso de bromuro de glicopirronio.
Las aminas terciarias pueden alquilarse con carbonato de dimetilo para generar las correspondientes sales de carbonato de metilamonio cuaternario con rendimientos de buenos a altos. La reacción posterior con una fuente de protones conduce a una reacción de metátesis iónica limpia a través de descomposición del contraión carbonato de metilo en CO2 y metanol, que se eliminan fácilmente de la mezcla de reacción para producir productos de alta pureza.
Tabla 17
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,
Glm optiroleta b ase Sal carbonato de metilo de gllcopirronio
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Sales de ácidos grasos de gbcoplrronlo
La Tabla 17 muestra la secuencia de etapas para la síntesis de sales de glicopirronio de ácidos grasos a través de carbonatos de metilo a partir de la base de glicopirrolato.
La reacción de alquilación requiere altas temperaturas (típicamente 80 - 150 °C, al depender de la reactividad de la amina terciaria) y se ejecuta bajo presión, ya que el carbonato de dimetilo tiene un punto de ebullición de 90 °C. Se informa que las aminas terciarias heterocíclicas reaccionan más rápido y a temperaturas relativamente más bajas que las aminas terciarias alifáticas estéricamente saturadas. Por ejemplo, Mori y otros, Patente US No. 4,892,944, emitida el 9 de enero de 1990, informan que la N-metil pirrolidina (el motivo estructural más cercano a la base 3 de glicopirrolato) se puede cuaternizar a 120 °C para producir la sal de carbonato de metilo aislada correspondiente con un rendimiento del 97 % después de una reacción de 6 horas. Las aminas bicíclicas que llevan un átomo de nitrógeno en la cabeza de puente, que se sabe que son incluso más nucleófilas, reaccionan fácilmente a presión atmosférica en condiciones de reflujo (80 - 90 °C) para producir carbonatos de metilo con altos rendimientos. (ver Friesen y otros, publicación de patente US 2012/0321969, publicada el 20 de diciembre de 2012).
La reacción de cuaternización se evaluó en carbonato de dimetilo puro y en dos solventes no nucleofílicos, alcohol t­ amílico y dimetilacetamida, que se esperaba que no reaccionaran con la base de glicopirrolato de partida. La base de glicopirrolato, el compuesto 3, se fabricó a medida por Shanghai Chempartner (China) sobre la base de un procedimiento publicado (ver Allmendinger y otros, "Carry Over of Impurities: A Detailed Exemplification for Glycopyrrolate (NVA237)", Organic Process Research & Development 2012, 16, 1754 - 1769).
Se intentaron cuatro reacciones de base de glicopirrolato (estructura 3 en la Tabla 3B) con carbonato de dimetilo (mostrado en la Tabla 18). Para el procedimiento general, se cargó base de glicopirrolato (estructura 3 en la Tabla 3B) en una botella a presión Fisher-Porter seguida de carbonato de metilo y solvente. La solución se purgó con nitrógeno tres veces bajo un ligero vacío y luego se selló el reactor. La mezcla de reacción se agitó y se calentó con un baño de aceite. Las condiciones de reacción detalladas y los resultados se resumen en la Figura 5.
Tabla 18
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MeOH
Sales de ácidos graso s de gllcoplrronlo
En los cuatro experimentos (ver Figura 5), se observó que la base 3 de glicopirrolato se descomponía bajo las condiciones de reacción, y produce el derivado del ácido cidopentilmandélico ("Ácido A") y el éster metílico correspondiente (Tabla 5). Los resultados analíticos mostraron que no se observó ningún producto deseado en ninguna de las mezclas de reacción.
Debido a la inestabilidad de la base de glicopirrolato inicial, se abandonó el enfoque de metátesis de sal a través de la sal de carbonato de metilo de glicopirronio.
Preparación de Curvas de Calibración de HPLC para base de Glicopirrolato y Bromuro de Glicopirronio
Sobre la base de los informes de resultados analíticos de las materias primas, se configuró un método de HPLC y se prepararon tres curvas de calibración de HPLC para la base de glicopirrolato (estructura 3 en la Tabla 3B) así como también para bromuro de glicopirronio (estructura 2 en la Tabla 3B). Los datos se resumen en la Tabla 19 y Figuras.
1-2 y 6.
Tabla 19
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Análisis y Síntesis Adicionales
También se desarrollaron métodos analíticos para las sales de ácidos grasos de glicopirronio. Estos métodos evalúan de forma adecuada y precisa la calidad de las muestras de sal de ácido graso de glicopirronio. También se ha desarrollado un proceso más refinado para la síntesis general de sales de ácidos grasos de glicopirronio.
El análisis incluye tanto la mejora en la síntesis de las sales de ácidos grasos de glicopirronio como el desarrollo de métodos para analizar esas sales.
El proceso de síntesis se mejoró y simplificó al generar la sal de sodio o potasio requerida de los ácidos grasos in situ (a través del tratamiento de los ácidos grasos con hidróxido de sodio o potasio) en lugar de mediante el uso de sales de sodio o potasio de los ácidos grasos preparados en una etapa aparte. Se realizaron esfuerzos sustanciales para definir una cantidad adecuada de ácido graso libre en exceso que estabilizaría el producto al minimizar su hidrólisis, al mismo tiempo que facilitaba el proceso de extracción al minimizar la formación de emulsiones, que eran bastante severas en algunos casos. La mayor parte del trabajo de desarrollo en esta segunda fase del proyecto se realizó con ácido esteárico. Además, del ácido láurico, palmítico y esteárico, que son todos ácidos grasos saturados, el ácido linoleico (ácido graso insaturado C-18; con dobles enlaces cis,cis-9,12) también se convirtió con éxito en una sal de glicopirronio, y se demuestra adicionalmente la generalidad del método.
El desarrollo de métodos analíticos abordó el desafío derivado de la naturaleza de los componentes de la mezcla de reacción, que requería el uso de métodos analíticos complementarios para evaluar el proceso de metátesis de sal y la calidad del producto. Con los métodos que se han desarrollado, el proceso de metátesis de sal ahora se puede monitorear bien y la calidad de las sales de ácidos grasos obtenidas se puede evaluar de manera confiable. El proceso que se ha desarrollado puede optimizarse para permitir la producción a gran escala.
Algunas de las aplicaciones del método analítico incluyen, entre otras, la evaluación de la efectividad del intercambio de sal, para garantizar que las reacciones alcancen una conversión >95 % mediante la determinación del número y la cantidad óptimos de lavados acuosos para eliminar las sales de bromuro inorgánico (subproductos), la determinación de la cantidad óptima de ácido graso libre en exceso (al evaluar un intervalo adecuado de equivalentes molares) necesaria para estabilizar el ingrediente farmacéutico activo (API) y la mejora del aislamiento y purificación del producto de reacción (por ejemplo a través de la precipitación con combinaciones solvente/antisolvente) al evaluar la pureza de los productos de reacción. En algunas modalidades preferidas, el número óptimo de lavados acuosos es de 3-4 lavados. En otras modalidades, el número preferido de lavados es de al menos tres lavados.
El desarrollo del método analítico también incluye preferentemente métodos para la cuantificación de materiales de partida, productos y degradantes cromóforos, métodos para la cuantificación de materiales de partida y degradantes débilmente cromóforos o no cromóforos (ácidos grasos y sales derivadas, degradantes de dimetilhidroxipirrolidinio), métodos para la cuantificación del ion bromuro en el material de partida y el producto, y métodos para la cuantificación del ion potasio (o sodio) en el producto.
Las sales de ácidos grasos de glicopirronio (GPFA) se prepararon con éxito a partir de bromuro de glicopirronio y sales de ácidos grasos al utilizar un sistema bifásico (orgánico/acuoso) para dividir selectivamente las sales inorgánicas en la fase acuosa y aislar las sales orgánicas lipófilas (sales de ácidos grasos de glicopirronio) de la fase orgánica separada. Sin embargo, como se describió anteriormente, la mezcla de reacción era inestable a la hidrólisis y también las sales de ácidos grasos eran inestables en solución de metanol (formación de subproductos de transesterificación). Las sales de ácidos grasos de glicopirronio aisladas (GPFA) también demostraron ser intrínsecamente inestables con niveles crecientes del degradante, "Ácido A" (CAS 427-49-6, ácido a-ciclopentil-ahidroxi-benceno acético), que se forma con el tiempo. Un exceso de ácido graso libre estabilizó la mezcla de reacción y redujo significativamente la velocidad de la hidrólisis (al limitar la formación de "Ácido A"). También fue un desafío cuantificar con precisión todos los componentes de las mezclas de reacción para evaluar la eficiencia de la síntesis.
Experimentos adicionales exploraron el aislamiento de sales de ácidos grasos de glicopirronio (GPFA) con un exceso de ácidos grasos libres para confirmar la estabilidad mejorada de los productos aislados y también para desarrollar métodos analíticos adecuados para caracterizar los materiales aislados. Estos experimentos incluyeron la preparación de muestras para el desarrollo de métodos analíticos, el desarrollo de métodos analíticos para caracterizar los productos de ácido graso de glicopirronio, la definición de un procedimiento preparatorio adecuado y la caracterización de los productos aislados, y la preparación de un intervalo de muestras de GPFA. Estos esfuerzos tuvieron éxito y dieron como resultado un procedimiento preparatorio y métodos analíticos adecuados para analizar y caracterizar los productos aislados.
Los métodos analíticos desarrollados son lo suficientemente fiables y sencillos como para adaptarse a las sales individuales de glicopirronio de los ácidos grasos (con una modificación menor anticipada de las condiciones del método de GC para cada ácido graso utilizado).
Como se discutió anteriormente, solo un enfoque (intercambio de contraiones o metátesis de sal a través de una separación selectiva en un sistema bifásico de solvente acuoso/orgánico) demostró ser efectivo en la preparación de sales de ácidos grasos de glicopirronio. Intento de síntesis a partir de base de glicopirrolato a través de la cuaternización con carbonato de metilo a temperaturas elevadas y el tratamiento posterior de las sales de carbonato de metilamonio cuaternario esperadas con ácidos grasos no tuvo éxito debido a la descomposición de la base de glicopirrolato en las condiciones de metilación. El intercambio de sal en solventes orgánicos en condiciones anhidras falló debido a la poca solubilidad del bromuro de glicopirronio y la sal de ácido graso en los solventes orgánicos que se evaluaron (acetona y diclorometano). La inestabilidad hidrolítica observada de la molécula de glicopirronio impidió la consideración del intercambio iónico acuoso con resinas de intercambio iónico.
Incluso con el enfoque de separación bifásica selectiva, se observaron emulsiones severas y separación deficiente para la mayoría de los sistemas probados. La separación selectiva del bromuro en la fase acuosa y del glicopirronio en la fase orgánica no se logró fácilmente. Entre los sistemas de solventes evaluados (2-Me-THF, MTBE, IPAc, tolueno, MIBK y DCM), solo 2-Me-THF proporcionó una selectividad adecuada para la separación deseada. Además, se observó inestabilidad hidrolítica en el transcurso del tratamiento y aislamiento con la formación de "Ácido A" con el tiempo tanto en las soluciones extraídas como en los productos aislados. Las mezclas del ácido graso de glicopirronio aisladas variaron en consistencia desde aceites viscosos hasta pastas y sólidos cerosos duros.
Los experimentos de síntesis iniciales probaron ácido láurico (cadena C-12), ácido esteárico (cadena C-18) y ácido palmítico (cadena C-15). Los experimentos analizados y síntesis adicionales probaron ácido esteárico, ácido láurico, ácido palmítico y ácido linoleico (C-18 poliinsaturado, cis, ácido cis-9,12-octadecadienoico).
El método sintetizó sales de ácidos grasos de glicopirronio por reacción de bromuro de glicopirronio con una sal de ácido graso en una mezcla de reacción bifásica e incluyendo al menos 0,2 equivalentes molares de ácido graso libre en exceso en la mezcla de reacción. En modalidades preferidas, se añade a la mezcla de reacción al menos 0,2 equivalentes molares de ácido graso libre en exceso para formar una sal de ácido graso de glicopirronio. En algunas modalidades preferidas, se añaden a la mezcla de reacción entre 0,2 y 1,2 equivalentes molares de ácido graso libre en exceso. En otra modalidad preferida, se añaden a la mezcla de reacción al menos 0,6 equivalentes molares de ácido graso libre en exceso. En otra modalidad preferida, se añaden a la mezcla entre 0,6 y 1,2 equivalentes molares de ácido graso libre en exceso para formar una sal de ácido graso de glicopirronio. En otra modalidad, se añaden a la mezcla de reacción aproximadamente 1,2 equivalentes molares de ácido graso libre en exceso. En otra modalidad, se añaden a la mezcla de reacción al menos 1,1 equivalentes molares de ácido graso libre en exceso. Como se describió en la presente descripción, el exceso de ácido graso libre es con relación al bromuro de glicopirronio y la sal de ácido graso usada. Por ejemplo, para la reacción del ácido láurico, se usa un exceso de ácido láurico libre con relación al bromuro de glicopirronio y al laurato de potasio.
El exceso de ácido graso libre estabiliza la mezcla de reacción. Los mayores excesos de ácido graso libre (0,6-1,2 de exceso molar) mejoraron las separaciones de fase, mejoraron la estabilidad de las soluciones de extracto orgánico y mejoraron la estabilidad de los productos aislados.
En modalidades preferidas, la sal de sodio, potasio o calcio requerida de los ácidos grasos se genera in-situ a través del tratamiento de los ácidos grasos con un hidróxido metálico en lugar de mediante el uso de sodio, potasio o calcio. En esta etapa, se mezcla un ácido graso con el hidróxido metálico en la mezcla de reacción bifásica (preferentemente agua y 2-metil-tetrahidrofurano) hasta que todos los sólidos se disuelven para formar la sal de ácido graso. El hidróxido metálico es preferentemente un hidróxido metálico alcalino o un hidróxido metálico alcalinotérreo (por ejemplo, hidróxido de sodio, potasio o calcio).
El método también incluye preferentemente añadir bromuro de glicopirronio y mezclar hasta que los sólidos se disuelvan. La fase orgánica superior se retiene, mientras que la fase acuosa inferior de la mezcla de reacción se elimina. A continuación, la fase orgánica superior se lava con agua. Las etapas de retención de la fase orgánica superior y la de retirar la fase acuosa inferior se repiten preferentemente. En modalidades preferidas, estas dos etapas se repiten al menos 3 veces para aumentar la pureza de la sal de ácido graso de glicopirronio. En otras modalidades preferidas, estas dos etapas se repiten 3-4 veces.
La destilación al vacío se realiza preferentemente en la fase orgánica superior y se añade nuevo 2-metiltetrahidrofurano. La etapa de destilación al vacío se repite preferentemente al menos una vez (para un total de dos veces), para eliminar cantidades traza de agua residual, hasta que no se observe destilado. En modalidades preferidas, se añade un solvente de hidrocarburo no polar para precipitar los componentes insolubles, que se separan por filtración. Luego, el filtrado se destila adicionalmente a presión reducida para obtener un sólido. En modalidades preferidas, el solvente de hidrocarburo no polar es n-heptano o una mezcla de isómeros de heptano. En modalidades alternativas, podría ser usado n-hexano, isooctano o éter de petróleo en lugar de heptanos.
Se necesitaban métodos analíticos que fueran suficientes para caracterizar la composición y la pureza de los productos aislados y permitir un mayor desarrollo. Ningún método único era adecuado para todos los componentes y se requerían métodos complementarios (ortogonales) para caracterizar adecuadamente los productos aislados. El desarrollo de un método de análisis y pureza se vio obstaculizado por la falta de cromóforos para los componentes del ácido graso y cualquier degradante de 3-hidroxi-1, 1 -dimetil pirrolidinio. También hubo una falta de retención/separación entre el bromuro y el degradante de 3-hidroxi-1,1 -dimetil pirrolidinio por HPLC. Las desafiantes propiedades de solubilidad de las mezclas de glicopirrolato, la precipitación de la muestra, el taponamiento de la columna y la pérdida acelerada del rendimiento de la columna también obstaculizaron el desarrollo del método. En última instancia, estos desafíos se superaron mediante el desarrollo de los métodos que se describen más abajo para la caracterización de las sales de ácidos grasos de glicopirronio.
Con los desafíos encontrados, la preparación de las sales de ácidos grasos de glicopirronio objetivo no fue trivial y requirió inventiva para lograr la preparación de productos estables y bien caracterizados adecuados para mayor desarrollo como productos API.
Métodos para preparar sales de ácidos grasos de glicopirronio.
Las condiciones de reacción bifásicas permiten las reacciones de intercambio deseadas entre el bromuro de glicopirronio y las sales de ácidos grasos de sodio y potasio. Se logró una separación favorable de la molécula de glicopirronio en la fase orgánica (junto con los ácidos grasos) y la distribución del bromuro en la fase acuosa con agua y 2-metil tetrahidrofurano. Las sales de ácidos grasos de glicopirronio eran inestables a la hidrólisis en las condiciones de reacción y como productos oleosos aislados en ausencia de una cantidad en exceso de ácido graso libre. La formación de la impureza, "Ácido A", se observó con el tiempo. Un exceso de ácido graso libre en la mezcla de reacción estabilizó la sal de ácido graso de glicopirronio y redujo la formación de la impureza, "Ácido A". Una razón para la estabilización puede ser una agregación entre la sal de ácido graso de glicopirronio y el exceso de ácido graso libre, con la cadena de ácido graso hidrófobo al blindar el enlace éster y proteger a este del acceso del agua. Se logró el aislamiento de un producto bien definido, aunque desafiante.
El procedimiento preparatorio se definió además y los productos aislados se caracterizaron mediante el uso de métodos analíticos. Además, se prepararon un intervalo de muestras de ácido graso de glicopirronio, incluidos laurato de glicopirronio, estearato de glicopirronio, palmitato de glicopirronio y linoleato de glicopirronio.
Inicialmente, las sales de ácidos grasos de metal alcalino se prepararon y aislaron antes de su uso en la preparación de las mezclas de ácido graso de glicopirronio. Se prefiere un procedimiento de preparación más sencillo para las mezclas de ácido graso de glicopirronio sin aislamiento de sales metálicas de ácido graso. Dado que las sales metálicas de ácido graso, el exceso de ácido graso libre y el bromuro de glicopirronio se mezclaron en una mezcla de 2-Me-THF/agua, un procedimiento modificado preparó la sal metálica de ácido graso en solución. Las cantidades previstas de ácido graso e hidróxido metálico se disuelven fácilmente en una mezcla de agua y 2-Me-THF para proporcionar directamente la solución deseada de sal de ácido graso y exceso de ácido graso libre.
Este enfoque se detalla en el siguiente ejemplo. Se disolvieron ácido esteárico (6,26 g, 22 mmol, 2,2 eq.) e hidróxido de potasio (0,726 g, 11 mmol, 1,1 eq.) en una mezcla de agua (50 mL) y 2-Me-THF (50 mL). El exceso molar del ácido esteárico libre en este ejemplo fue de 1,2 equivalentes molares de ácido esteárico libre en exceso (con relación al bromuro de glicopirronio) y 1,1 equivalentes molares de ácido esteárico libre en exceso con relación al hidróxido de potasio, se supone que la pureza del hidróxido de potasio es 100 % (que rara vez es el caso). La agitación mecánica proporcionó una disolución completa durante aproximadamente 30 minutos. Sin agitar, la mezcla se asentó en dos fases claras con poca o ninguna emulsión restante después de aproximadamente 30 minutos. Se añadió bromuro de glicopirronio (3,98 g, 10 mmol, 1,0 eq.), se mezcló y se disolvió (disolución completa inmediata). Se detuvo la mezcla y se completó la separación de las fases en menos de 30 minutos. Se eliminó la fase acuosa inferior (pH=7) y se lavó la fase orgánica superior tres veces con 20 mL de agua. Cada separación de fase requirió menos de 1 hora. Después de retirar el último lavado con agua, la fase orgánica rica se concentró al vacío en una pasta blanda a 20-25 °C / 25-30 Torr. Se añadió 2-Me-THF (30 mL) y se repitió la concentración al vacío. Se añadió heptano (50 mL) que da como resultado una suspensión fina. La disolución en heptano confirmó la naturaleza lipófila del estearato de glicopirronio ya que tanto el bromuro de glicopirronio como el estearato de potasio son insolubles en heptano. Cuando la solución de heptano se enfrió en un baño de hielo, se formó una suspensión espesa pero se convirtió en una suspensión fina al volver a calentar a temperatura ambiente. Después de enfriar en un baño de hielo durante aproximadamente 30 minutos, la suspensión enfriada se filtró en un embudo de frita de vidrio pero la filtración fue muy lenta y el contenido se calentó a temperatura ambiente durante la filtración. Los sólidos aislados, que se confirmó que eran ácido esteárico, se secaron por succión bajo una capa de nitrógeno y los sólidos secos pesaron 0,9 g. El filtrado se concentró al vacío a 20-25 °C/25-30 Torr en una pasta oleosa. Se confirmó que el filtrado era estearato de glicopirronio y ácido esteárico libre en exceso.
Estas muestras se utilizaron para el desarrollo del método analítico. Durante el curso del desarrollo del método analítico, se observó que la muestra de estearato de glicopirronio (EE-008-001-3B) era significativamente más estable que las muestras anteriores preparadas durante la fase inicial de trabajo de factibilidad (velocidad mucho más lenta de formación de "Ácido A"). Sin embargo, aún se observó que la muestra se degradaba lentamente con el tiempo, y cuando se completó el tiempo de desarrollo del método (~ 4 meses), y la muestra se analizó con los métodos finales, se observó la formación de "Ácido A" (2,44% w/p, 9,29% AUC HPLC Ácido A con relación al contenido de glicopirronio).
Experimentos adicionales probaron variaciones en el ácido esteárico libre en exceso usado para preparar el estearato de glicopirronio. Estos experimentos usaron el mismo procedimiento general que se describe en el ejemplo de estearato de glicopirronio (EE-008-001-3B) anterior. Más específicamente, se probaron diferentes equivalentes molares de ácido esteárico, de 1,2 a 2,0 equivalentes molares (de 0,2 a 1,0 equivalentes molares en exceso), en incrementos de 0,2 equivalentes molares. Las diferentes variaciones de ácido graso libre en exceso probadas se muestran en la Tabla 20. Las muestras eran sólidos cerosos de mezclas de metil-THF/GPBr/ácido esteárico/estearato de potasio después de tres lavados con agua.
Tabla 20
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Las muestras A y B tenían divisiones de fase difíciles (muy lentas) para los lavados con agua después de la división de fase inicial de la mezcla de reacción. Por el contrario, todas las divisiones de fase para las muestras C, D y E se realizaron dentro de aproximadamente 1 hora. Por el contrario con la preparación anterior de EE-008-001-3B, con 2,2 equivalentes molares de ácido esteárico, no se observaron sólidos filtrables de la disolución final de heptano; sólo se observó cierta separación de una fase oleosa y ésta se mantuvo durante el aislamiento. Las muestras se analizaron y los resultados del análisis comparativo del aporte variable de ácido graso se resumen en la Tabla 21. La muestra EE-008-001-3B se incluyó para comparación.
Tabla 21
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Si bien se demostró una purga efectiva de bromuro y el potasio residual fue bajo, no hubo una tendencia clara en los resultados a través de las muestras para glicopirronio o estearato. Dado que mediante el uso de menos de 2,2 equivalentes molares de ácido esteárico (con relación a glicopirronio) no mostró ninguna ventaja, el siguiente experimento repitió las condiciones de EE-008-001-3B (2,2 eq. de ácido esteárico).
La muestra que resultó de la preparación repetida de estearato de glicopirronio mediante el uso de 2,2 eq. de ácido esteárico, EE-008-008, se analizó y se comparó con EE-008-001-3B. Los resultados se muestran en la Tabla 22.
Tabla 22
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Mientras que el nivel del degradante "Ácido A" era típicamente bajo en el producto recién aislado, esta impureza aumentó con el tiempo (aproximadamente 4 meses) en condiciones ambientales.
Para EE-008-008, la entrada fue 3,98 g (10 mmol) de bromuro de glicopirronio (con 22 mmol de ácido esteárico y 11 mmol de KOH). El resultado fue una mezcla de estearato de glicopirronio de 5,35 g. La recuperación de masa fue del 56,7%. La recuperación de glicopirronio fue del 54,2 % (por1H NMR) y 52,8% (mediante ensayo HPLC).
Los datos de HPLC para estearato de glicopirronio EE-008-008 se muestran en la Figura 7. Los datos de HPLC para estearato de glicopirronio EE-008-001-3B se muestran en la Figura 8. El pico más grande, es el pico 1 con 87,6482 por ciento de área en EE-008-001-3B y 96,0360 por ciento de área en EE-008-008, es estearato de glicopirronio. El pico de Ácido A se produce aproximadamente a los 17,6 minutos de tiempo de retención (pico 5 en la Figura 7 y pico 8 en la Figura 8).
Los datos de cromatografía de gases para la muestra de estearato de glicopirronio EE-008-008 se muestran en la Figura 9. Los datos de cromatografía de gases para la muestra de estearato de glicopirronio EE-008-001-3B se muestran en la Figura 10. El pico del extremo izquierdo en la Figura 9 y la Figura 10 es el solvente en la traza de la cromatografía de gases. Estos datos muestran la cantidad total de ácido esteárico (el pico a 19,827 en EE-008-008 y el pico a 19,836 en EE-008-001-3B) en las muestras. La cantidad total de ácido esteárico incluye el ácido esteárico en el estearato de glicopirronio, así como también cualquier ácido esteárico libre en exceso todavía presente en la muestra. La cantidad de ácido esteárico libre en exceso se puede calcular al determinar cuánto ácido esteárico se ha incorporado estequiométricamente en el estearato de glicopirronio.
Todos los desplazamientos químicos de RMN se proporcionan en ppm con relación al tetrametilsilano (TMS). Los datos de RMN para la muestra de estearato de glicopirronio EE-008-008 se muestran en la Figura 11 y las Figuras.
12A-12C.1 RMN H (400 MHz, CDCla) 0,88 (3H, t, CH3-), 1,20 - 1,70 (30H, m, 15 -CH2grupos de la cadena de ácido graso y 8H, m, 4 -CH2grupos del anillo de ciclopentilo), 2,0 - 2,25 (1H, m, -CH-CN+), 2,24 (2H, t, -CH2C=O), 2,7 - 2,9 (1H, m, -CH-CN+ y 1H, m, grupo CH del grupo ciclopentilo), 2,93, 3,11, 3,33, 3,37 (6h , 4 juegos de singletes, 2 -CH3-N+; diferencias de desplazamiento químico en la interfase cargada posiblemente debido a diferentes estados de agregación de la sal de ácido graso), 3,6 - 3,8 (2H, m, -CH2-N+), 3,8 - 4,0 (1H, m, -CH-N+), 4,1 - 4,3 (1H, m, -CH-N+), 5,40 - 5,55 (1H, m, -CH-OH, protón metino), 7,2 - 7,7 (5H, m, protones aromáticos/grupo fenilo).
Los datos de RMN para el subproducto Ácido A se muestran en las Figuras. 13A-13C.1 RMN H (400 MHz, CDCl3 ) 1,2 - 1,8 (8H, m, 4 CH2grupos del anillo de ciclopentilo), 2,9 - 3,0 (1H, m, grupo CH del anillo de ciclopentilo), 6,2 (1H, br s, OH/alcohol terciario), 7,2 - 7,7 (5H, m, protones aromáticos/grupo fenilo).
Los datos de RMN para el subproducto de hidrólisis de glicopirronio, aminoalcohol cuaternario (QAA) se muestran en las Figuras. 14A-14D.1 RMN H (400 MHz, D2O) 2,1 - 2,3 (1H, m, - CH-C-N+), 2,5 - 2,7 (1H, m, -CH-C-N+), 3,2 (3H, s, CH3-N+), 3,3 (3H, s, CH3-N+), 3,5 - 3,7 (2H, m, -CH2-N+), 3,7 - 3,9 (2H, m, -CH2-N+), 4,75 - 4,85 (1H, m, -CH-OH, protón metino).
Cuando el estearato de glicopirronio se hidroliza, da como resultado ácido A y QAA. QAA fue muy difícil de analizar mediante el uso de HPLC, porque no tiene un cromóforo fuerte y sale muy temprano en el análisis de HPLC.
La pérdida de sales de ácidos grasos de glicopirronio en los lavados acuosos fue superior a la deseada, pero el procedimiento es factible para preparar muestras. Algunos métodos para mejorar la recuperación de sal incluyen, entre otros, la realización de una extracción posterior, la salazón o la elección de solventes de extracción alternativos. Tanto la molécula de glicopirronio como el ácido esteárico se pierden en los lavados acuosos, pero la relación de ácido esteárico a glicopirronio en el producto aislado se enriquece en comparación con los niveles de entrada (2,2:1 como entrada, 2,35:1 aislado). La relación final puede ajustarse adicionalmente con ajustes en la entrada de ácido graso libres.
Hubo una purga efectiva de bromuro durante la preparación y el aislamiento. Más específicamente, el procedimiento de elaboración y aislamiento siempre proporcionó niveles muy bajos (<0,1 %) de bromuro. Esto puede permitir la optimización de los lavados para mejorar la recuperación de glicopirronio en el proceso mientras se mantiene el control del bromuro residual a niveles aceptables.
La muestra de estearato de glicopirronio resultante se caracterizó por HPLC y GC y fue consistente con los resultados de RMN. Los resultados confirmados por métodos analíticos complementarios separados validaron los resultados. La estabilidad de la muestra mejoró con respecto a los estudios iniciales. Las muestras aisladas con mayor exceso de ácido graso libre han mejorado la estabilidad con degradación observada solo después de meses en condiciones ambientales. El exceso de ácido graso libre parece actuar como un tampón, para ralentizar la degradación de las sales de ácidos grasos deseadas.
Preparación de sales de ácidos grasos de Glicopirronio
Como descripción más general para preparar sales de ácidos grasos de glicopirronio, la cantidad objetivo calculada de ácido graso (FA) se mezcla con agua (aproximadamente 8 mL/g de entrada de FA), 2-metil-tetrahidrofurano (2-Me-THF, aproximadamente 8 mL/g de entrada de FA) e hidróxido metálico tales como un hidróxido metálico alcalino o un hidróxido metálico alcalinotérreo (por ejemplo, hidróxido de potasio KOH, 1,1 equivalente molar). En modalidades preferidas, la cantidad objetivo calculada es de 2,2 equivalente molar (un exceso de 1,2 equivalentes molares). En otras modalidades, la cantidad calculada es superior o igual a 1,2 equivalente molar (exceso de 0,2 equivalentes molares). La mezcla se agita hasta que se disuelven todos los sólidos. Se añade bromuro de glicopirronio ("GPBr", 1,0 equivalente molar) y se mezcla hasta que se disuelven los sólidos. Se detiene la mezcla y se permite que las fases se separen. Se elimina la fase acuosa inferior (pH aproximadamente 7) y se retiene la fase orgánica superior. La fase orgánica superior se lava tres veces con agua (cada lavado ~ 3,2 mL/g de entrada de ácido graso). Se elimina cada fase acuosa inferior (pH ~ 7) y se retiene la fase orgánica superior.
La rica fase orgánica superior se concentra por destilación al vacío mediante el uso de un calentamiento mínimo (20­ 25 °C / 25-30 Torr) hasta obtener una pasta blanda. Se añade 2-Me-THF nuevo (aproximadamente 4,8 mL/g de entrada de FA) y se lleva a cabo la concentración al vacío (20-25 °C/25-30 Torr) hasta que no se observa más destilado.
Se añade heptano (aproximadamente 8 mL/g de entrada de ácido grasos) y la mezcla se agita hasta que se disuelven la mayoría de los sólidos. Parte del exceso de ácido graso libres puede permanecer como una suspensión fina que se pasa a través de un filtro para eliminar los sólidos restantes. La solución rica en heptano filtrada se concentra por destilación al vacío mediante el uso de un calentamiento mínimo (20-25 °C / 25-30 Torr) para obtener un sólido ceroso.
Se usaron ácidos grasos adicionales para preparar sales de ácidos grasos de glicopirronio mediante el uso de los métodos descritos en la presente descripción. Más específicamente, se usaron como materiales de partida ácido láurico (muestra PSG-008-002), ácido palmítico (muestra PSG-008-204) y ácido linoleico (muestra pSg -008-206), además del ácido esteárico (muestra EE-008-008) muestras discutidas anteriormente. Los resultados se muestran en las Tablas 23A y 23B. La recuperación máxima teórica se calculó como la recuperación total de ácido graso de glicopirronio y exceso de ácido graso libre.
Tabla 23A:
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Tabla 23B
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Los datos de HPLC para el estearato de glicopirronio se muestran en las Figuras. 7 y 8. Los datos de HPLC para el laurato de glicopirronio se muestran en las Figuras. 15A-15D. El pico 1 indica laurato de glicopirronio e incluye un % de área de 90,8652 y 90,8662, respectivamente, en las dos ejecuciones. El pico 7 indica el subproducto Ácido A, que incluye un área de 5,7508 % y un área de 5,758 % en las dos ejecuciones. Los otros picos menores son impurezas o artefactos no identificados.
Los datos de HPLC para palmitato de glicopirronio se muestran en las Figuras. 16A-16D. El pico 1 indica palmitato de glicopirronio e incluye un % de área de 91,2525 y 91,3890, respectivamente, en las dos ejecuciones. El pico 5 indica el subproducto Ácido A, que incluye un área de 4,1180 % y un área de 4,0100 %, respectivamente, en las dos ejecuciones. Los otros picos menores son impurezas o artefactos no identificados.
Los datos de HPLC para el linoleato de glicopirronio se muestran en las Figuras 17A-17D. El pico 1 indica linoleato de glicopirronio e incluye un % de área de 39,7889 y 39,5620, respectivamente para las dos ejecuciones. El pico 4 indica el subproducto Ácido A en la primera ejecución (Figs. 17A-17B) y el pico 5 indica el subproducto Ácido A en la segunda corrida (Figs. 17C-17D), e incluye un área de 2,4126 % y 2,4171 % de área, respectivamente para las dos corridas. Pico 15 (Figs. 17A-17B y el pico 17 (Figs. 17C y 17D) en realidad tenían el porcentaje de área más alto (55,1974 y 55,4318, respectivamente). Estos picos concuerdan con el exceso de ácido linoleico libre usado en la reacción, que se detectó en esta HPLC debido al cromóforo del doble enlace C=C conjugado. De los ácidos grasos probados, solo el ácido linoleico muestra una respuesta significativa con el detector UV. Los otros picos menores son impurezas o artefactos no identificados. Se puede realizar una evaluación más precisa de la cantidad de ácido linoleico libre mediante cromatografía de gases, con una pequeña optimización de los parámetros usados para el análisis de ácido esteárico.
Como herramienta de análisis, la HPLC solo pudo identificar el producto deseado (estearato de glicopirronio, laurato de glicopirronio, palmitato de glicopirronio y linoleato de glicopirronio) y el Ácido A en las muestras. Dada la complejidad de los reactivos y productos, se requirieron otros métodos para identificar los ácidos grasos (cromatografía de gases), los productos y subproductos deseados (RMN) y el bromuro y potasio residual (cromatografía iónica) en las muestras.
Todos los desplazamientos químicos de RMN se proporcionan en ppm con relación al tetrametilsilano (TMS). Los datos de RMN para el bromuro de glicopirronio se muestran en la Figura 18. 1 RMN H (400 MHz, DMSO-d6 ) 1,1 - 1,7 (8H, m, 4 CH2grupos del grupo ciclopentilo), 2,0 - 2,2 (1H, m, - CH-CN+), 2,6 - 2,8 (1H, m, -CH-CN+), 2,8 - 3,0 (1H, m, grupo CH del grupo ciclopentilo), 3,1 (3H, s, CH3-N+), 3,2 (3H, s, CH3-N+), 3,45 - 3,65 (2H, m, -CH2-N+), 3,65 -3,85 (1H, m, -CH-N+), 3,85 - 3,95 (1H, m, -CH-N+), 7,20 - 7,65 (5H, m, protones aromáticos/grupo fenilo). Los datos de RMN para el estearato de glicopirronio se analizan anteriormente y se muestran en las figuras 11 y 12A-12C. Los datos de RMN para el laurato de glicopirronio se muestran en la Figura 19. 1 RMN H (400 MHz, CDCl3) 0,87 (3H, t, CH3-), 1,20 - 1,70 (grupos 18H, m, 9 -CH2 de la cadena de ácido grasos y grupos 8h , m, 4 -CH2 del anillo de ciclopentilo), 2,1 - 2,25 (1H, m, -CH-C-N+), 2,23 (2H, t, -CH2C=O), 2,7 - 3,0 (1H, m, -CH-C-N+ y 1H, m, grupo CH del grupo ciclopentilo), 2,95, 3,10, 3,28, 3,30 (6H, 4 juegos de singletes, 2 -CH3-N+; diferencias de desplazamiento químico en la interfase cargada posiblemente debido a diferentes estados de agregación de la sal de ácido graso), 3.6 - 3,85 (2H, m , -CH2-N+ y 1H, m, -CH-N+), 3,95 - 4,1 (1H, m, -CH-N+), 5,4 - 5,5 (1H, m, -CH-OH, protón metino), 7,2 - 7,6 (5H, m, protones aromáticos/grupo fenilo).
Los datos de RMN para el palmitato de glicopirronio se muestran en la Figura 20. 1 RMN H (400 MHz, CDCl3) 0,88 (3H, t, CH3-), 1,20 - 1,70 (26h , m, 13 -CH2 grupos de la cadena de ácido graso y 8H, m, 4 -CH2 grupos del anillo de ciclopentilo), 2,0 - 2,2 (1H, m, -CH-C-N+), 2,25 (2H, t, -CH2C=O), 2,7 - 2,95 (1H, m, -CH-C-N+ y 1H, m, grupo CH del grupo ciclopentilo), 2,93, 3,11, 3,34, 3,37 (6H, 4 conjuntos de singletes, 2 -CH3-N+; diferencias de desplazamiento químico en la interfase cargada posiblemente debido a diferentes estados de agregación de la sal de ácido graso), 3.6 - 3,8 (2H, m , -CH2-N+), 3,8 - 4,0 (1H, m, -CH-N+), 4,1 - 4,25 (1H, m, -CH-N+), 5,40 - 5,55 (1H, m, -CH-OH, protón metino ), 7,2 - 7,6 (5H, m, protones aromáticos/grupo fenilo).
Los datos de RMN para el linoleato de glicopirronio se muestran en la Figura 21. 1 RMN H (400 MHz, CDCb) 0,88 (3H, t, CH3-), 1,20 - 1,70 (16H, m, 8 -CH2grupos de la cadena de ácido grasos y 8H, m, 4 -CH2grupos del anillo de ciclopentilo), 2,0 - 2,1 (4H, m, protones alílicos -CH2-C=C), 2,0 - 2,2 (1H, m, -CH-CN+), 2,2 (2H, t, -CH2C=O), 2,85 (2H, t, protones doblemente alílicos C=C-CH2-C=C), 2,7 - 2,9 (1H, m, -CH-CN+ y 1h , m, grupo CH del grupo ciclopentilo), 2,91, 3,09, 3,29, 3,31 (6H, 4 juegos de singletes, 2 -CH3-N+; diferencias de desplazamiento químico en la interfase cargada posiblemente debido a diferentes estados de agregación de la sal de ácido graso), 3,6 - 3,9 (2H, m, -CH2-N+y 1H, m, -CH-N+), 4,0 - 4,15 (1H, m, -CH-N+), 5,25 - 5,50 (2H, m, protones olefínicos), 5,35 - 5,50 (1H, m, -CH-OH, protón metino), 5,6 - 5,75 (2H, m, protones olefínicos), 7,2 - 7,6 (5H, m , protones aromáticos/grupo fenilo) El análisis de RMN se podría utilizar de forma eficaz para evaluar con precisión la relación molar de glicopirronio a la cantidad total del componente de ácido graso (es decir, anión de ácido graso unido estequiométricamente y ácido graso libre). Los resultados de H RMN de una comparación de1 para las muestras de sal de ácido graso de glicopirronio se muestran en la Tabla 24. Se observaron picos de interferencia en la región aromática de la muestra de ácido esteárico, pero los multipletes de glicopirronio eran nítidos sin interferencia.
Tabla 24
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El ensayo de HPLC de glicopirronio (contenido de % en peso de GP) es aplicable a una variedad de sales de ácidos grasos. Si bien el método de HPLC se desarrolló con estearato de glicopirronio, no se observaron picos que interfirieran ni otros problemas en el análisis de las sales de ácidos grasos de glicopirronio preparadas a partir de los ácidos láurico, palmítico y linoleico, lo que permitió la cuantificación del contenido de glicopirronio en estas mezclas. De manera similar, la RMN caracteriza de manera efectiva una variedad de sales de ácidos grasos mediante el uso de varios sustratos de ácido graso diferentes. Como en el caso del estearato de glicopirronio, el grupo metilo terminal de la cadena de ácido graso (3 H) proporcionó una integración adecuada para la comparación con los multipletes de glicopirronio (GP) (4 H total, 3,5 - 4,2 ppm) para el cálculo de la relación molar (GP:FA) presente en los materiales aislados de sales de ácidos grasos de glicopirronio preparadas a partir de los ácidos láurico, palmítico y linoleico.
Las muestras de sal de ácido graso de glicopirronio eran relativamente estables. El nivel del degradante "Ácido A" fue bajo en todas las muestras en el aislamiento inicial, pero solo se examinó la estabilidad a lo largo del tiempo (meses) para el estearato de glicopirronio. Para el estearato de glicopirronio, se observó degradación durante aproximadamente 4 meses en condiciones ambientales.
La recuperación de masa fue variable entre los diferentes ácidos grasos. La recuperación de masa varió de peor a mucho mejor entre las muestras de ácido graso de glicopirronio (Palmítico < Esteárico < Láurico < Linoleico). Esto destaca la oportunidad de una optimización adicional del procedimiento al mejorar aún más la retención de la actividad de la sal de glicopirronio y la recuperación en las sales de ácidos grasos de glicopirronio aisladas. Algunos métodos para mejorar la recuperación de sal incluyen, entre otros, la realización de una extracción posterior, la salazón o la elección de solventes de extracción alternativos.
Se requirió un secado prolongado para lograr un nivel bajo de n-heptano residual (secado hasta que el heptano no fuera detectable por RMN), particularmente con ácidos láurico y palmítico. Una optimización adicional de las condiciones de secado puede mejorar el proceso. Por ejemplo, el vacío y/o la temperatura de las condiciones de secado podrían ajustarse para mejorar el proceso y evitar la degradación.
Se observaron relaciones molares similares para ácido graso: glicopirronio (FA:GP) en los productos finales. Todas las mezclas de sales de ácidos grasos de glicopirronio aisladas mostraron cierto enriquecimiento del ácido graso (con relación al glicopirronio) en comparación con la relación de entrada. Todos los productos aislados tenían una relación de entrada de FA:GP superior a 2,2:1.
Los ácidos grasos disfrutan de un estado GRAS (Generalmente Considerado como Seguro), usados ampliamente en formulaciones de medicamentos y se encuentran en muchos alimentos que se consumen actualmente. Por lo tanto, no es probable que un gran exceso de ácido graso libre en los ácidos grasos de glicopirronio plantee un problema para el uso de los ácidos grasos de glicopirronio en el desarrollo de fármacos.
Los métodos preparativos y analíticos actuales pueden aplicarse a otros ácidos grasos, preferentemente ácidos grasos con al menos ocho moléculas de carbono. Algunos ejemplos incluyen, entre otros, ácido araquídico, ácido esteárico, ácido palmítico, ácido oleico, ácido erúcico, ácido araquidónico, ácido láurico, ácido cáprico, ácido linoleico, ácido linolénico o ácido mirístico para fabricar sales de ácidos grasos de glicopirronio.
Análisis de productos y degradantes
Los necesarios métodos analíticos debían ser suficientes para caracterizar la composición y la pureza y cumplir con los requisitos reglamentarios para permitir un mayor desarrollo. La falta de cromóforos para componentes del ácido graso y degradantes de 3-hidroxi-1,1 -dimetil pirrolidinio requirió el desarrollo de alternativas a HPLC/UV. La falta de retención/ separación de bromuro y 3-hidroxi-1,1 -dimetil pirrolidinio por HPLC requirió el desarrollo y uso de métodos complementarios separados para cuantificar estos componentes.
Las desafiantes propiedades de solubilidad de la mezcla de ingredientes farmacéuticos activos (precipitación de la muestra, taponamiento de la columna, pérdida acelerada del rendimiento de la columna) obstaculizaron el desarrollo del método, pero estos problemas finalmente se superaron. Ningún método único era adecuado para todos los componentes del análisis, por lo que se requerían y se desarrollaron con éxito métodos complementarios (ortogonales).
Se prepararon y analizaron muestras de una mezcla de productos crudos y cada uno de los subproductos claves de la hidrólisis junto con muestras de los materiales de partida para permitir el desarrollo de métodos. Las muestras preparadas se muestran en la Tabla 25.
Tabla 25
Figure imgf000030_0001
Preparación de muestras de subproductos (degradantes)
Se realizó la hidrólisis del bromuro de glicopirronio y el aislamiento de los subproductos. Una mezcla de 3,98 g (10 mmol, 1,0 eq.) de bromuro de glicopirronio, 0,80 g (20 mmol, 2,0 eq.) de hidróxido de sodio y 20 mL de agua se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La solución resultante se filtró a través de papel de filtro para eliminar las trazas de sólidos pegajosos y luego se acidificó mediante la adición gota a gota de 4,78 g (28,35 mmol, 2,835 equivalente) de 48 % Ac. ácido bromhídrico. Se formó una suspensión espesa blanca que luego se filtró y se lavó con ~5 mL de agua. Los sólidos blancos aislados se secaron al aire dando 2,025 g de "Ácido A" (CAS 427-49-6, ácido a-ciclopentil-a-hidroxi-benceno acético). La combinación filtrada y enjuagada se concentró al vacío a 40 °C/9 Torr para proporcionar 3,87 g de una pasta oleosa que contiene el Subproducto de Aminoalcohol Cuaternario (CAS 51052-74-5, bromuro de 3-hidroxi-1,1 -dimetil pirrolidinio) así como también NaBr en -relación 0,95/1 p/p.
Figure imgf000031_0001
Métodos de HPLC
Se desarrolló un método único de HPLC para analizar los productos de la reacción. La Tabla 26 muestra la evaluación de las condiciones del método de HPLC.
Tabla 26
Figure imgf000031_0002
Además de las evaluaciones enumeradas, se evaluó el método USP para glicopirrolato. Este método usó Kinetex C18, 4,6 x 100 mm, 2,6 |j, Fase Móvil A: 0,025 M KH2PO4 pH 2,5 con H3PO4 en H2O DI, y Fase Móvil B: CAN 100 %. Según el método de USP, el diluyente de fase móvil A y B fue 1:1, a una concentración de muestra de 0,5 mg/mL. La primera muestra de estearato de glicopirronio (EE-008-001-3b, sólidos cerosos de GPBr/ ácido esteárico/estearato de potasio, Tabla 25) parecía soluble en el diluyente de USP, pero se usó metanol para mantener la consistencia en todas las condiciones seleccionadas y todas las muestras se prepararon a 0,5 mg/mL en MeOH.
Con el Método USP, la línea de base no era buena (línea de base muy irregular). Además, se observaron numerosos picos pequeños en inyecciones repetidas. Se sospechó que la precipitación en la columna era la causa del problema, por lo que se comprobaron las mezclas de fase móvil en busca de precipitación. Se encontró que, en el extremo superior del gradiente (15 % de fase móvil A y 85 % de fase móvil B), KH2 PO4tampón precipitado. La mayoría de las columnas C18 retuvieron adecuadamente glicopirrolato (GP). Se encontró que la forma del pico (GP) era mejor con el pH más bajo (ácido fosfórico).
A partir de las condiciones evaluadas, Agilent, ZORBAX Eclipse XDB-C18, 4,6 x 150 mm, 5 jm, P/N: 993967-902 y el 0,1 % H3PO4 en H2El sistema solvente de O/acetonitrilo proporcionó el mejor rendimiento (línea de base y forma de pico). Sin embargo, el degradante "QAA" (que se muestra en la Tabla 2, elemento 8, muestra EE-008-001-4b) coeluyó con el pico de bromuro. A pesar de los grandes esfuerzos, no se pudo mejorar la retención y separación de los picos de bromuro y QAA.
El glicopirronio y el degradante "Ácido A" se separaron fácilmente de otros componentes y se cuantificaron mediante HPLC y se desarrolló un ensayo de por ciento en peso para el contenido de glicopirronio. Si bien se deseaba cuantificar directamente el contenido de QAA por HPLC, era necesario determinar el bromuro por un método separado (IC) y luego estimar el contenido de qAa por HPLC mediante el uso de un cálculo para restar el contenido de bromuro. Durante el transcurso del desarrollo del método de HPLC, se observó que no se observó "Ácido A" en la muestra EE-008-001-3b durante el primer mes de uso.
Un método analítico que se desarrolló fue un método para la cuantificación de materiales de partida, productos y degradantes cromóforos. El método usó HPLC con detección de fotodiodos en serie (PDA).
Se desarrolló un método de HPLC con estearato de glicopirronio, que proporciona un procedimiento para la determinación del análisis de estearato de glicopirronio o 3[(ciclopentilhidroxifenilacetoxi]-1, 1 -dimetil pirrolidinio (GP) y el perfil de impurezas por HPLC.
Las condiciones de funcionamiento de HPLC para Agilent, ZORBAX Eclipse XDB-C18, 4,6 x 150 mm, 5 pm, P/N: Columna 993967-902 se muestran en la Tabla 27 y el gradiente de fase móvil se muestra en la Tabla 28. 0,1 % de 0,25 mg/mL de GPBr, promedio S/N = 11,2. La linealidad del 25 % al 120 % de 0,25 mg/mL de GPBr es lineal. Coeficiente de correlación = 1,000.
Tabla 27
Figure imgf000032_0001
Tabla 28
Figure imgf000032_0003
La Figura 22 muestra la concentración de glicopirronio frente al área del pico de glicopirronio. La figura 23 muestra un cromatograma en blanco y la Figura 24 muestra un cromatograma de solución de resolución. La precisión del método se muestra en la Tabla 29.
Tabla 29
Figure imgf000032_0002
Cromatografía iónica para contenido de bromuro
Otro método cuantificó el ion bromuro residual en el producto mediante el uso de la cromatografía iónica (modo anión). El primer control grosero de la muestra de estearato de glicopirronio EE-008-001-3b (Tabla 10 p. 19) mostró <1 % p/p de bromuro (prueba de límite). Se llevó a cabo una secuencia completa de calibración y análisis. Todos los resultados indicaron una eliminación efectiva del bromuro. El método de ensayo de bromuro final puede comprobar y controlar el ion de bromuro residual hasta < 0,1 %.
Este método se desarrolló para proporcionar un procedimiento para la determinación de cantidades traza de ion bromuro residual en mezclas de estearato de glicopirronio/ ácido esteárico mediante el uso cromatografía iónica. El método analítico se aplica a la cuantificación del ion bromuro residual en mezclas de estearato de glicopirronio/ ácido esteárico. El método corresponde al límite de 0,1 % (1000 ppm) para el ion bromuro de una concentración de muestra de 0,5 mg/mL.
Los parámetros y condiciones de la cromatografía iónica se muestran en la Tabla 30.
Tabla 30
Figure imgf000033_0001
Los datos de cromatografía iónica para un estándar de bromuro se muestran en la Figura 25. Los datos de cromatografía iónica para bromuro en estearato de glicopirronio se muestran en la Figura 26. Los picos no marcados en la Figura 26 son las especies no cargadas con bromuro presentes en la matriz de la muestra (artefactos, comparado con la traza estándar de bromuro). Como se muestra en la Figura 26, queda muy poco bromuro en la muestra, lo que indica que la reacción tuvo éxito en producir el resultado deseado, estearato de glicopirronio.
Cromatografía Iónica para el Contenido de Potasio
Otro método más cuantificó el ion de potasio (o sodio) residual en el producto mediante el uso de cromatografía de iones (modo de cationes). Los desafíos clave fueron la solubilidad limitada de la muestra en un diluyente adecuado y la observación inicial de picos que interfieren cerca del tiempo de retención de potasio. Estos se resolvieron y el método puede detectar iones de potasio hasta un límite de cuantificación del nivel de 0,1 % para una muestra de API de 0,5 mg/mL.
Los datos de cromatografía iónica para potasio en estearato de glicopirronio se muestran en la Figura 27. El pico 1 muestra el potasio todavía presente en la muestra. Se desconoce el pico 2, pero también estaba presente en la muestra en blanco. Como se muestra en la Figura 27, queda muy poco potasio en la muestra, lo que indica que la reacción tuvo éxito en producir el resultado deseado, estearato de glicopirronio. La combinación de los resultados mostrados en las Figura 26 y 27, tomados en conjunto, también indican una reacción exitosa.
Cromatografía de Gases para el Contenido de Ácido graso
Otro método analítico que se desarrolló fue un método para la cuantificación de materiales de partida y degradantes débilmente cromóforos o no cromóforos (ácidos grasos y sales derivadas, degradantes de dimetilhidroxipirrolidinio). El método usó un método GC (FID) para determinar el contenido de ácido esteárico.
Se usó cromatografía de gases para determinar el contenido de ácido esteárico en estearato de glicopirronio. Se desarrolló un método de cromatografía de gases de inyección directa para el ensayo de % en peso de ácido esteárico. El estearato de glicopirronio se disuelve en THF y se acidifica con ácido acético glacial. El método es potencialmente aplicable a otros ácidos grasos (con modificaciones en el gradiente de temperatura). No se detectaron otros componentes de la mezcla de sales de ácidos grasos de glicopirronio (pero por lo tanto tampoco interfirieron). El análisis de la muestra dio los resultados que se muestran en la Tabla 31.
Tabla 31
Figure imgf000034_0001
Es algo difícil de separar el exceso de ácido graso libre de la sal. Para determinar cuánto exceso de ácido graso libre queda todavía en la mezcla, se puede restar la cantidad unida al glicopirronio (que se puede determinar mediante el uso de cálculos estequiométricos) para obtener el exceso. El sólido filtrable en la Tabla 31 representa lo que precipita y es predominantemente el ácido graso libre (ácido esteárico en la tabla). Este sólido filtrable, bastante puro (98,3 % en peso de ácido esteárico), se desecha. El producto deseado (estearato de glicopirronio) está en el sólido ceroso. Aunque parte del exceso se ha filtrado en el sólido filtrable, el ácido esteárico medido en el sólido ceroso es tanto el ácido esteárico que forma parte del estearato de glicopirronio como el ácido esteárico libre en exceso.
Mientras que las Figuras 9 y 10 y la Tabla 31 solo muestran resultados de cromatografía de gases para el contenido de ácido esteárico, la cromatografía de gases también podría usarse para cuantificar otros ácidos grasos, con modificaciones menores al método de cromatografía de gases. Algunos parámetros que podrían modificarse incluyen, entre otros, el tiempo de espera, la temperatura de inyección, la concentración para la inyección y el tiempo para aumentar la temperatura. Alternativamente, los resultados de RMN pueden usarse para cuantificar la cantidad de ácido graso. La cantidad de ácido graso unido se puede determinar mediante el uso de estequiometría. La longitud de los ácidos grasos particulares determina qué cantidad de la sal de ácido graso de glicopirronio es ácido graso y qué cantidad es glicopirronio. Las operaciones de cromatografía de gases se muestran en la Tabla 32.
Tabla 32
Figure imgf000034_0002
La Figura 28 muestra un cromatograma estándar y la Figura 29 muestra un cromatograma de muestra. El tiempo de retención aproximado para la ID del pico de ácido esteárico fue de 20,1 minutos.
Las mezclas complejas que resultaron de las reacciones químicas para fabricar las sales de ácidos grasos de glicopirronio de interés no se prestaban a un análisis sencillo. Por ejemplo, incluyeron una mezcla oleosa con ácidos grasos libres. La mayoría de los métodos cromatográficos usan la detección de un compuesto, pero los métodos individuales no pudieron capturar la información sobre todos los materiales (incluidos los materiales de partida, los degradantes y los productos finales). Por ejemplo, UV puede ver el material de partida y el producto final, pero no el QAA degradante. El producto final incluye un cromóforo, por lo que puede detectarse con UV, pero el producto de degradación sin el cromóforo no es detectable con métodos de detección UV. Debido a la naturaleza química de los componentes individuales, se necesitaban múltiples estrategias analíticas. Se usaron múltiples métodos, en tándem, para cuantificar el material de partida, el producto final y los productos de degradación. El análisis puede optimizarse para cada uno de los ácidos grasos usados en las reacciones.
Se desarrollaron procedimientos para sales de ácidos grasos de glicopirronio y estos procedimientos permitieron la preparación de sales de ácidos grasos de glicopirronio a partir de una variedad de ácidos grasos. El análisis de las sales de ácidos grasos incluyó varios procedimientos. Estos procedimientos incluyeron HPLC con detección de fotodiodos en serie, método GC (FID) para ácido esteárico, contenido de bromuro por cromatografía iónica (modo aniónico) y contenido de potasio por cromatografía iónica (modo catiónico). Además de estos métodos, el análisis por RMN (en d6-DMSO) resultó útil para la caracterización de los materiales aislados.
Si bien los ejemplos descritos en la presente descripción tratan predominantemente del bromuro de glicopirronio, otro antagonista del receptor muscarínico anticolinérgico de amonio cuaternario, por ejemplo, el cloruro de trospio, podría sustituir al bromuro de glicopirronio en la reacción para producir una sal de ácido graso de amonio cuaternario (por ejemplo, una sal de ácido graso de trospio).
En un método para fabricar una sal de este tipo, se hace reaccionar cloruro de trospio con una sal de ácido graso en una mezcla de reacción bifásica, y se añade a la mezcla de reacción al menos 0,2 equivalentes molares de ácido graso libre en exceso. El método preferentemente mezcla un ácido graso con agua, 2-metil-tetrahidrofurano (u otro solvente apropiado) y un hidróxido metálico seleccionado del grupo que consiste en un hidróxido metálico alcalino y un hidróxido metálico alcalinotérreo, hasta que todos los sólidos se disuelven para formar la sal de ácido grasos. Cualquiera de las etapas y variaciones descritos con respecto a las sales de ácidos grasos de glicopirronio podría usarse alternativamente para fabricar sales de ácidos grasos de trospio.
En consecuencia, debe entenderse que las modalidades de la invención que en la presente descripción se describen son meramente ilustrativas de la aplicación de los principios de la invención. La referencia en la presente descripción a los detalles de las modalidades ilustradas no pretende limitar el alcance de las reivindicaciones, que enumeran las características consideradas esenciales para la invención.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un método para sintetizar al menos un producto de sal de ácido graso de glicopirronio que comprende la etapa de mezclar bromuro de glicopirronio con una sal de ácido graso en una mezcla de reacción bifásica, en donde se añade a la mezcla de reacción al menos 0,2 equivalentes molares de ácido graso libre en exceso, y en donde la etapa de mezcla comprende la subetapa de:
i) mezclar un ácido graso con agua, 2-metil-tetrahidrofurano y un hidróxido metálico seleccionado del grupo que consiste en un hidróxido metálico alcalino y un hidróxido metálico alcalinotérreo, hasta que todos los sólidos se disuelven para formar la sal de ácido graso.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la etapa de mezcla comprende además las subetapas de:
ii) añadir bromuro de glicopirronio y mezclar hasta que se disuelvan los sólidos;
iii) retirar una fase acuosa inferior de la mezcla de reacción y retener una fase orgánica superior;
iv) lavar la fase orgánica superior con agua;
v) repetir las etapas iii) y iv) al menos una vez;
vi) realizar una destilación al vacío de la fase orgánica superior;
vii) añadir 2-metil-tetrahidrofurano nuevo;
viii) repetir la etapa vi) hasta que no se observe destilado;
ix) añadir un solvente de hidrocarburo no polar y filtrar la mezcla resultante para eliminar cualquier sólido en suspensión; y
x) realizar la destilación al vacío de un filtrado de la etapa ix) para obtener el producto.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde en la etapa v), las subetapas iii) y iv) se repiten al menos dos veces.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 2 o la reivindicación 3, en donde el solvente de hidrocarburo no polar se selecciona del grupo que consiste en n-heptano, una mezcla de isómeros de heptano, n-hexano, isooctano y éter de petróleo.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el producto se selecciona del grupo que consiste en un aceite, un sólido aceitoso y un sólido ceroso.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde un catión de la sal de ácido graso se selecciona del grupo que consiste en Na, K y Ca; o
en donde el ácido graso se selecciona del grupo que consiste en: ácido araquídico, ácido esteárico, ácido palmítico, ácido oleico, ácido erúcico, ácido linoleico, ácido araquidónico, ácido láurico, ácido cáprico, ácido linoleico, ácido a-linolénico, ácido Y-linolénico y ácido mirístico; o
en donde el ácido graso comprende al menos ocho moléculas de carbono.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde una mezcla de sales de ácidos grasos de glicopirronio aislada tiene un enriquecimiento del ácido graso con relación al glicopirronio en comparación con una relación de entrada.
8. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde se añade a la mezcla de reacción al menos 0,6 equivalentes molares de ácido graso libre en exceso; o
en donde se añade a la mezcla de reacción entre aproximadamente 0,6 equivalentes molares de ácido graso libre en exceso y 1,2 equivalentes molares de ácido graso libre en exceso.
9. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde se añade a la mezcla de reacción al menos 1,1 equivalentes molares de ácido graso libre en exceso.
10. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde se añaden a la mezcla de reacción aproximadamente 1,2 equivalentes molares de ácido graso libre en exceso.
11. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde una relación del ácido graso con relación al glicopirronio de una mezcla de sales de ácidos grasos de glicopirronio aislada está entre aproximadamente 2,25:1 y 3,00:1.
12. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde una relación del ácido graso con relación al glicopirronio de una mezcla de sales de ácidos grasos de glicopirronio aislada está entre aproximadamente 2,29:1 y 2,87:1.
13. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la mezcla de reacción bifásica comprende agua y 2-meti l-tetra hidrofurano.
14. El método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además la etapa de analizar el producto de sal de ácido graso de glicopirronio, que comprende las subetapas de:
i) realizar una cromatografía líquida de alta presión para cuantificar un componente de glicopirronio y un degradante de hidrólisis, Ácido A, presente en el producto en donde el Ácido A tiene la siguiente estructura
Figure imgf000037_0001
ii) realizar una cromatografía de gases para cuantificar un componente de ácido graso total en el producto;
iii) realizar una cromatografía iónica en modo aniónico para cuantificar un componente de bromuro en el producto;
iv) realizar una cromatografía iónica en modo catiónico para cuantificar un componente de potasio en el producto;
v) realizar cálculos estequiométricos al combinar los resultados de las subetapas i), ii), iii) y iv) para determinar una cantidad de ácido graso libre en exceso y una cantidad de aminoalcohol cuaternario degradante; y
vi) realizar una resonancia magnética nuclear para determinar una relación molar de glicopirronio a ácido graso total en el producto.
15. Un método para sintetizar sales de ácidos grasos de trospio que comprende la etapa de mezclar cloruro de trospio con una sal de ácido graso en una mezcla de reacción bifásica, en donde se añade a la mezcla de reacción al menos 0,2 equivalentes molares de ácido graso libre en exceso, y en donde la etapa de mezcla comprende la subetapa de:
i) mezclar un ácido graso con agua, 2-metil-tetrahidrofurano y un hidróxido metálico seleccionado del grupo que consiste en un hidróxido metálico alcalino y un hidróxido metálico alcalinotérreo, hasta que todos los sólidos se disuelven para formar la sal de ácido graso.
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