ES2943259T3

ES2943259T3 - Genes de plaguicidas y métodos de uso

Info

Publication number: ES2943259T3
Application number: ES17768599T
Authority: ES
Inventors: Jessica Parks; Kira Roberts; Rebecca Thayer
Original assignee: AgBiome Inc
Current assignee: AgBiome Inc
Priority date: 2016-09-06
Filing date: 2017-09-06
Publication date: 2023-06-12
Anticipated expiration: 2037-09-06
Also published as: AU2017324875A1; PL3510159T3; PH12019500476A1; AU2017324875B2; MX2022000189A; CL2019000537A1; CL2020001025A1; CA3035896A1; EP3510159A1; CN110214189A; MA46187A; US20180066277A1; US10787679B2; MX2019002608A; KR20190045293A; BR112019004406A2; WO2018048915A1; EP4219528A2; US11453890B2; EP4219528A3

Abstract

Se proporcionan composiciones que tienen actividad pesticida y métodos para su uso. Las composiciones incluyen polipéptidos aislados y recombinantes que tienen actividad plaguicida, moléculas de ácido nucleico recombinantes y sintéticos que codifican los polipéptidos, construcciones de ADN y vectores que comprenden las moléculas de ácido nucleico, células huésped que comprenden los vectores y anticuerpos contra los polipéptidos. Las secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos pueden usarse en construcciones de ADN o casetes de expresión para la transformación y expresión en organismos de interés. Las composiciones y métodos proporcionados son útiles para producir organismos con mayor resistencia o tolerancia a plagas. También se proporcionan plantas y semillas transgénicas que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína plaguicida de la invención. Tales plantas son resistentes a los insectos y otras plagas. Se proporcionan métodos para producir los diversos polipéptidos descritos en el presente documento y para usar esos polipéptidos para controlar o eliminar una plaga. También se incluyen métodos y kits para detectar polipéptidos de la invención en una muestra. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Genes de plaguicidas y métodos de uso

Campo

La invención está dirigida a métodos y composiciones para controlar plagas, particularmente plagas de plantas.

Antecedentes

Las plagas, las enfermedades de las plantas y las malas hierbas pueden ser amenazas graves para los cultivos. Las pérdidas debidas a plagas y enfermedades se han estimado en el 37 % de la producción agrícola mundial, con un 13 % debido a insectos, bacterias y otros organismos.

Las toxinas son determinantes de virulencia que juegan un papel importante en la patogenicidad microbiana y/o la evasión de la respuesta inmune del huésped. Las toxinas de la bacteria gram-positiva Bacillus, particularmente Bacillus thuringensis, se han usado como proteínas insecticidas. Las estrategias actuales usan los genes que expresan estas toxinas para producir cultivos transgénicos. Los cultivos transgénicos que expresan toxinas proteicas insecticidas se usan para combatir el daño de los cultivos por parte de los insectos.

Si bien el uso de toxinas de Bacillus ha tenido éxito en el control de insectos, se ha desarrollado resistencia a las toxinas Bt en algunas plagas diana en muchas partes del mundo donde dichas toxinas se han usado de manera intensiva. Una forma de resolver este problema es sembrar cultivos Bt con hileras alternas de cultivos regulares no Bt (refugio). Un método alternativo para evitar o retrasar el desarrollo de la resistencia a los insectos es apilar genes de insecticidas con diferentes modos de acción contra insectos en plantas transgénicas. La estrategia actual de usar cultivos transgénicos que expresan toxinas de proteínas insecticidas está poniendo cada vez más énfasis en el descubrimiento de nuevas toxinas, más allá de las que ya se derivan de la bacteria Bacillus thuringiensis. Estas toxinas pueden resultar útiles como alternativas a las derivadas de B. thuringiensis para el despliegue en plantas transgénicas resistentes a insectos y plagas. Por lo tanto, se necesitan nuevas proteínas de toxinas.

Resumen

Se proporcionan composiciones que tienen actividad plaguicida y métodos para su uso. Las composiciones incluyen secuencias polipeptídicas aisladas y recombinantes que tienen actividad plaguicida, moléculas de ácido nucleico recombinantes y sintéticas que codifican los polipéptidos plaguicidas, construcciones de ADN que comprenden las moléculas de ácido nucleico, vectores que comprenden las moléculas de ácido nucleico, células huésped que comprenden los vectores y anticuerpos contra los polipéptidos plaguicida. Las secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos proporcionados en la presente memoria pueden usarse en construcciones de ADN o casetes de expresión para la transformación y expresión en organismos de interés, incluidos microorganismos y plantas.

Las composiciones y métodos proporcionados en la presente memoria son útiles para la producción de organismos con resistencia o tolerancia a plagas mejorada. Estos organismos y las composiciones que comprenden los organismos son deseables para fines agrícolas. También se proporcionan plantas y semillas transgénicas que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína plaguicida de la divulgación. Dichas plantas son resistentes a los insectos y otras plagas.

Se proporcionan métodos para producir los diversos polipéptidos divulgados en la presente memoria y para usar esos polipéptidos para controlar o eliminar una plaga. También se incluyen métodos y kits para detectar polipéptidos de la divulgación en una muestra.

Es decir, la presente invención se refiere a las siguientes realizaciones:

1. Un polipéptido recombinante que tiene actividad plaguicida, que comprende:

(a) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 186, en donde el polipéptido retiene la actividad plaguicida de la SEQ ID NO: 186; o,

(b) la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 186.

2. El polipéptido de la realización 1, que comprende además una secuencia de aminoácidos heteróloga.

3. Una composición que comprende el polipéptido de la realización 1 o 2.

4. Una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido que comprende:

(a) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 186, en donde el polipéptido retiene la actividad plaguicida de la SEQ ID NO: 186; o

(b) la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 186;

en donde dicha molécula de ácido nucleico recombinante está unida operativamente a un promotor heterólogo.

5. La molécula de ácido nucleico recombinante de la realización 4, en donde dicha molécula de ácido nucleico recombinante es una secuencia sintética diseñada para la expresión en una planta.

6. La molécula de ácido nucleico recombinante de la realización 4 ó 5, en donde dicho promotor heterólogo es capaz de dirigir la expresión en una célula de planta.

7. La molécula de ácido nucleico recombinante de una cualquiera de las realizaciones 4-6, en donde dicho promotor heterólogo es capaz de dirigir la expresión en una bacteria.

8. Una célula huésped que comprende la molécula de ácido nucleico recombinante de una cualquiera de las realizaciones 4-7.

9. La célula huésped de la realización 8, en donde dicha célula huésped es una célula huésped bacteriana. 10. Una construcción de ADN que comprende un promotor que dirige la expresión en una célula de planta unido operativamente a una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica

(a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada en la ^sE^qID NO: 186, en donde el polipéptido retiene la actividad plaguicida de la SEQ ID NO: 186; o

(b) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 186.

11. La construcción de ADN de la realización 10, en donde dicha secuencia de nucleótidos es una secuencia de ADN sintética diseñada para la expresión en una planta.

12. Un vector que comprende la construcción de ADN de la realización 10 u 11.

13. Una célula huésped que comprende la construcción de ADN de la realización 10 u 11 o el vector de la realización 12.

14. Una composición que comprende la célula huésped de una cualquiera de las realizaciones 8, 9 o 13.

15. La composición de la realización 14, en donde dicha composición se selecciona del grupo que consiste en un polvo, bolitas, gránulos, pulverización, emulsión, coloide y solución.

16. Un método para controlar una población de plagas que comprende poner en contacto dicha población de plagas con una cantidad efectiva de plaguicida de la composición de una cualquiera de las realizaciones 3 o 14 15.

17. Un método para producir un polipéptido con actividad plaguicida que comprende cultivar la célula huésped de una cualquiera de las realizaciones 8, 9 o 13 en condiciones en las que se expresa la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido.

18. Una planta que tiene incorporada de forma estable en su genoma una construcción de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que tiene actividad plaguicida, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica:

(a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 186; o

(b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada en la s Eq ID NO: 186, en donde el polipéptido retiene la actividad plaguicida de la SEQ ID NO: 186.

19. Una semilla transgénica de la planta de la realización 18, en donde la semilla transgénica comprende la construcción de ADN de la realización 18.

20. Un método para proteger una planta de una plaga de insectos, que comprende expresar en una planta o célula de la misma una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido plaguicida, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica:

(b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada en la ^sE^qID NO: 186, en donde el polipéptido retiene la actividad plaguicida de la SEQ ID NO: 186.

21. El método de la realización 20, en donde dicha planta produce un polipéptido plaguicida que tiene actividad plaguicida contra al menos una plaga de lepidópteros, una plaga de coleópteros o una plaga de hemípteros.

22. Un método para aumentar el rendimiento en una planta que comprende cultivar en un campo una planta o semilla de la misma que tiene incorporada de forma estable en su genoma una construcción de ADN que comprende un promotor que dirige la expresión en una planta unido operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido plaguicida, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica:

(b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 186, en donde el polipéptido retiene la actividad plaguicida de la SEQ ID NO: 186.

Descripción detallada

Las presentes invenciones se describirán ahora con más detalle a continuación. De hecho, estas invenciones se pueden realizar de muchas formas diferentes y no deben interpretarse como limitadas a las realizaciones establecidas en la presente memoria; más bien, estas realizaciones se proporcionan para que esta divulgación satisfaga los requisitos legales aplicables. Números similares se refieren a elementos similares en todas partes.

Muchas modificaciones y otras realizaciones de las invenciones expuestas en la presente memoria vendrán a la mente de un experto en la técnica a la que pertenecen estas invenciones que tienen el beneficio de las enseñanzas presentadas en las descripciones anteriores. Por lo tanto, debe entenderse que las invenciones no deben limitarse a las realizaciones específicas divulgadas y que las modificaciones y otras realizaciones están destinadas a estar incluidas dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Aunque en la presente memoria se emplean términos específicos, se usan únicamente en un sentido genérico y descriptivo y no con fines de limitación.

I. Polinucleótidos y polipéptidos

Se proporcionan composiciones y métodos para conferir actividad plaguicida a un organismo. El organismo modificado exhibe resistencia o tolerancia a plaguicidas. Se proporcionan proteínas plaguicidas recombinantes, o polipéptidos y fragmentos y variantes de las mismas que retienen la actividad plaguicida, e incluyen las mostradas en la SEQ ID NO: 186. Las proteínas plaguicidas son biológicamente activas (p. ej., plaguicidas) contra plagas que incluyen insectos, hongos, nematodos, y similares. Los nucleótidos que codifican los polipéptidos plaguicidas, incluyendo, por ejemplo, la SEQ ID NO: 186 o fragmentos activos o variantes de los mismos, pueden usarse para producir organismos transgénicos, tales como plantas y microorganismos. Las proteínas plaguicidas son biológicamente activas (por ejemplo, son plaguicidas) contra plagas que incluyen insectos, hongos, nematodos y similares. Los polinucleótidos que codifican los polipéptidos plaguicidas, incluyendo, por ejemplo, la SEQ ID NO: 186 o fragmentos activos o variantes de los mismos, pueden usarse para producir organismos transgénicos, tales como plantas y microorganismos. Los organismos transformados se caracterizan por genomas que comprenden al menos una construcción de ADN incorporada de manera estable que comprende una secuencia codificante para una proteína plaguicida descrita en la presente memoria. En algunas realizaciones, la secuencia codificante está unida operativamente a un promotor que dirige la expresión del polipéptido plaguicida codificado. Por consiguiente, se proporcionan microorganismos, células vegetales, tejidos vegetales, plantas, semillas y partes de plantas transformados. Un resumen de varios polipéptidos, variantes activas y fragmentos de los mismos, y los polinucleótidos que los codifican se muestran a continuación en la Tabla 1. Como se indica en la Tabla 1, se proporcionan varias formas de polipéptidos. Se proporcionan polipéptidos plaguicidas de longitud completa, así como versiones modificadas de la secuencia original de longitud completa (es decir, variantes). La Tabla 1 indica además las secuencias "CryBP1". Dichas secuencias (SEQ ID NO: 213 y 86) comprenden polipéptidos accesorios que pueden asociarse con algunos de los genes de toxina. En dichos casos, las secuencias de CryBP1 se pueden usar solas o en combinación con cualquiera de los polipéptidos plaguicidas proporcionados en la presente memoria. La Tabla 1 proporciona además polipéptidos C-terminales Split-Cry. Dicha secuencia comprende la secuencia de una proteína aguas abajo que tiene homología con el extremo C-terminal de la clase Cry de genes de toxinas y generalmente se encuentran después de un gen Cry que no es de longitud completa y carece de la región C-terminal esperada.

i. Clases de proteínas plaguicidas

Las proteínas plaguicidas proporcionadas en la presente memoria y las secuencias de nucleótidos que las codifican son útiles en métodos para combatir las plagas. Es decir, las composiciones y métodos de la divulgación encuentran uso en la agricultura para controlar o matar plagas, incluidas las plagas de muchas plantas de cultivo. Las proteínas plaguicidas proporcionadas en la presente memoria son proteínas de toxinas de bacterias y exhiben actividad contra ciertas plagas. Las proteínas plaguicidas son de varias clases de toxinas, incluidas las toxinas Cry, Cyt, BIN, Mtx. Véase, por ejemplo, la Tabla 1 para las clasificaciones de proteínas específicas de las diversas SEQ ID NO proporcionadas en la presente memoria. Además, a lo largo de esta divulgación se hace referencia a las entradas de la base de datos de Pfam. La base de datos de Pfam es una base de datos de familias de proteínas, cada una representada por múltiples alineaciones de secuencias y un perfil oculto de modelo de Markov. Finn et al. (2014) Nucl. Acid Res. Número de base de datos 42:D222-D230.

Bacillus thuringiensis (Bt) es una bacteria gram-positiva que produce proteínas insecticidas como inclusiones cristalinas durante su fase de crecimiento de esporulación. Las inclusiones proteináceas de Bacillus thuringiensis (Bt) se denominan proteínas cristalinas o 6-endotoxinas (o proteínas Cry), que son tóxicas para los miembros de la clase Insecta y otros invertebrados. De manera similar, las proteínas Cyt son proteínas de inclusión paraesporal de Bt que muestran actividad hemolítica (citolítica) o tienen una similitud de secuencia obvia con una proteína Cyt conocida. Estas toxinas son altamente específicas para su organismo diana, son inocuas para los seres humanos, los vertebrados y las plantas.

La estructura de las toxinas Cry revela cinco bloques de aminoácidos conservados, concentrados principalmente en el centro del dominio o en la unión entre los dominios. La toxina Cry consiste en tres dominios, cada uno con una función específica. El dominio I es un haz de siete hélices a en el que una hélice central está completamente rodeada por seis hélices exteriores. Este dominio está implicado en la formación de canales en la membrana. El dominio II aparece como una columna triangular de tres láminas p antiparalelas, que son similares a las regiones de unión a antígeno de las inmunoglobulinas. El dominio III contiene cadenas p antiparalelas en forma de sándwich p. La parte N-terminal de la proteína de la toxina es responsable de su toxicidad y especificidad y contiene cinco regiones conservadas. La parte C-terminal suele estar muy conservada y probablemente sea responsable de la formación de cristales. Véase, por ejemplo, la Patente de EE. UU. No. 8.878.007.

Las cepas de B. thuringiensis muestran un amplio rango de especificidad frente a diferentes órdenes de insectos (Lepidoptera, Diptera, Coleoptera, Hymenoptera, Homoptera, Phthiraptera o Mallophaga y Acari) y otros invertebrados (Nemathelminthes, Platyhelminthes y Sarocomatebrates). Las proteínas cry se han clasificado en grupos según su toxicidad para varios grupos de insectos e invertebrados. Generalmente, Cry I demuestra toxicidad para lepidópteros, Cry II para lepidópteros y dípteros, Cry III para coleópteros, Cry IV para dípteros y Cry V y Cry VI para nematodos. Las nuevas proteínas Cry pueden identificarse y asignarse a un grupo Cry en función de la identidad de aminoácidos. Véase, por ejemplo, Bravo, A. (1997) J. of Bacteriol. 179:2793-2801; Bravo et al. (2013) Microb. Biotechnol.. 6: 17-26.

Se han clasificado más de 750 secuencias diferentes del gen cry en 73 grupos (Cry1-Cry73), y se siguen descubriendo nuevos miembros de esta familia de genes (Crickmore et al. (2014) www.btnomenclature.info/). La familia de genes cry consiste en varias familias de proteínas no relacionadas filogenéticamente que pueden tener diferentes modos de acción: la familia de toxinas Cry de tres dominios, la familia de toxinas Cry mosquitocidas, la familia de toxinas similares a binarias y la familia de toxinas Cyt (Bravo et al., 2005). Algunas cepas de Bt producen toxinas insecticidas adicionales, las toxinas VIP. Véase también, Cohen et al. (2011) J. Mol. Biol. 413:4-814; Crickmore et al. (2014) Nomenclatura de toxinas de Bacillus thuringiensis, que se encuentra en la red mundial en lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/; Crickmore et al. (1988) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62: 807-813; Gill et al. (1992) Ann. Rev. Entomol. 37: 807-636; Goldbert et al. (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63:2716-2712; Knowles et al. (1992) Proc. R. Soc. Ser. B 248: 1-7; Konni et al. (1994) Microbiology 140: 1869-1880; Lailak et al. (2013) Biochem. Biophys. Res. Commun. 435: 216-221; López-Diaz et al. (2013) Environ. Microbiol. 15: 3030-3039; Perez et al. (2007) Cell Microbiol. 9: 2931-2937; Promdonkoy et al. (2003) Biochem. J. 374: 255-259; Rigden (2009) FEBS Lett. 583: 1555-1560; Schnepf et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62: 775-806; Soberon et al. (2013) Peptides 41: 87-93; Thiery et al. (1998) J. Am. Mosq. Control Assoc. 14: 472-476; Thomas et al. (1983) FEBS Lett. 154: 362-368; Wirth et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 10536-10540; Wirth et al (2005) Appl. Environ. Microbiol. 71: 185-189; y, Zhang et al. (2006) Biosci. Biotechnol. Biochem. 70: 2199-2204.

Cyt designa una proteína de inclusión de cristales paraesporales de Bacillus thuringiensis con actividad citolítica, o una proteína con similitud de secuencia con una proteína Cyt conocida. (Crickmore et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62: 807-813). El gen se denota por cyt. Estas proteínas son diferentes en estructura y actividad de las proteínas Cry (Gill et al. (1992) Annu. Rev. Entomol. 37: 615-636). Las toxinas Cyt se descubrieron por primera vez en B. thuringiensis subespecie israelensis (Goldberg et al. (1977) Mosq. News. 37: 355-358). Hay 3 familias de toxinas Cyt que incluyen 11 toxinas holotípicas en la nomenclatura actual (Crickmore et al. (2014) Nomenclatura de toxinas de Bacillus thuringiensis que se encuentra en la red mundial en lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/). La mayoría de los aislados de B. thuringiensis con genes cyt muestran actividad contra insectos dípteros (particularmente mosquitos y moscas negras), pero también hay genes cyt que se han descrito en cepas de B. thuringiensis dirigidos a insectos lepidópteros o coleópteros (Guerchicoff et al. (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63: 2716-2721).

La estructura de Cyt2A, resuelta por cristalografía de rayos X, muestra un único dominio donde dos capas externas de hélice a se envuelven alrededor de una lámina p mixta. Otras estructuras cristalinas disponibles de toxinas Cyt respaldan un modelo estructural a-p conservado con dos horquillas de hélice a que flanquean un núcleo de lámina p que contiene de siete a ocho cadenas p. (Cohen et al. (2011) J. Mol. Biol. 413: 804-814) Los estudios mutagénicos identificaron residuos de lámina p como críticos para la toxicidad, mientras que las mutaciones en los dominios helicoidales no afectaron la toxicidad (Adang et al.; Diversity of Bacillus thuringiensis Crystal Toxins and Mechanism of Action. En: T. S. Dhadialla y S. S. Gill, eds, Advances in Insect Physiology, Vol. 47, Oxford: Academic Press, 2014, p. 39-87.) El dominio representativo de la toxina Cyt es una 6-endotoxina, Bac_thur_toxin (Pfam PF01338).

Hay múltiples modelos propuestos para el modo de acción de las toxinas Cyt, y todavía es un área de investigación activa. Se ha mostrado que algunas proteínas Cyt (Cyt1A) requieren la presencia de proteínas accesorias para la cristalización. Las protoxinas Cyt1A y Cyt2A son procesadas por proteasas digestivas en los mismos sitios en los extremos N y C hasta un núcleo de toxina estable. Luego, las toxinas Cyt interactúan con los lípidos de membrana no saturados, tales como fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina y esfingomielina. Para las toxinas Cyt, se han propuesto como mecanismos no exclusivos la formación de poros y la interrupción de la membrana similar a un detergente; y generalmente se acepta que ambos pueden ocurrir dependiendo de la concentración de la toxina, con concentraciones más bajas que favorecen los poros oligoméricos y concentraciones más altas que conducen a la rotura de la membrana. (Butko (2003) Appl. Environ. Microbiol. 69: 2415-2422) En el modelo de formación de poros, la toxina Cyt se une a la membrana celular, induciendo la formación de canales selectivos de cationes en las vesículas de la membrana que conducen a la lisis coloidosmótica de la célula. (Knowles et al. (1989) FEBS Lett. 244: 259-262; Knowles et al. (1992) Proc. R. Soc. Ser. B 248: 1-7 y Promdonkoy et al. (2003) Biochem. J. 374: 255-259). En el modelo de detergente, hay una agregación no específica de la toxina en la superficie de la bicapa lipídica que conduce al desensamblaje de la membrana y la muerte celular. (Butko (2003) supra; Manceva et al. (2005) Biochem. 44: 589-597).

Múltiples estudios han mostrado una actividad sinérgica entre las toxinas Cyt y otras toxinas de B. thuringiensis, particularmente las toxinas Cry, Bin y Mtx. Incluso se ha mostrado que este sinergismo supera la resistencia de un insecto a la otra toxina. (Wirth 1997, Wirth 2005, Thiery 1998, Zhang 2006) Se propone que el efecto sinérgico de Cyt para las toxinas Cry implica la unión de Cyt1A al dominio II de las toxinas Cry en solución o en el plano de la membrana para promover la formación de un oligómero pre-poro de la toxina Cry. La formación de este oligómero es independiente de la oligomerización, unión o inserción de Cyt. (Lailak 2013, Perez 2007, Lopez-Diaz 2013).

Algunas cepas de B. thuringiensis y B. cereus producen varias proteínas plaguicidas no relacionadas con las proteínas Cry durante el crecimiento vegetativo (Estruch et al. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93: 5389-5394; Warren et al. (1994) WO 94/21795). Estas proteínas insecticidas vegetativas, o Vips, no forman proteínas cristalinas paraesporales y aparentemente son secretadas por la célula. Las Vips actualmente están excluidas de la nomenclatura de proteínas Cry porque no son proteínas formadoras de cristales. El término VIP es un nombre inapropiado en el sentido de que algunas proteínas Cry de B. thuringiensis también se producen durante el crecimiento vegetativo, así como durante las fases estacionaria y de esporulación, sobre todo Cry3Aa. Se ha informado que la ubicación de los genes Vip en el genoma de B. thuringiensis reside en plásmidos grandes que también codifican genes cry (Mesrati et al. (2005) FEMS Microbiol. Lett.244(2):353-8). Se puede encontrar un sitio web para la nomenclatura de las toxinas Bt en la red mundial en lifesci.sussex.ac.uk con la ruta "/home/Neil_Crickmore/Bt/" y en: "btnomenclature.info/". Véase también, Schnepf et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62(3):775-806.

Hasta la fecha, se han identificado cuatro categorías de Vips. Algunos genes Vip forman complejos proteicos binarios de dos componentes; un componente "A" suele ser la parte "activa" y un componente "B" suele ser la parte "de unión". (Pfam pfam.xfam.org/family/PF03495). Las proteínas Vip1 y Vip4 generalmente contienen dominios de proteína de toxina B binaria. Las proteínas Vip2 generalmente contienen dominios de proteína de toxina A binaria.

Las proteínas Vip1 y Vip2 son los dos componentes de una toxina binaria que presenta toxicidad para los coleópteros. Vip1Aa1 y Vip2Aa1 son muy activos contra los gusanos de la raíz del maíz, en particular Diabrotica virgifera y Diabrotica longicornis (Han et al. (1999) Nat. Struct. Biol. 6:932-936; Warren GW (1997) "Vegetative insecticidal proteins: novel proteins for control of corn pests " En: Carozzi NB, Koziel M (eds) Advances in insect control, the role of transgenic plants; Taylor y Francis Ltd, Londres, p. 109-21). El multímero Vip1 de 95 kDa que se une a la membrana proporciona una ruta para que la ADP-ribosilasa vip2 de 52 kDa entre en el citoplasma de las células diana del gusano de la raíz del maíz occidental (Warren (1997) supra). La ADP-ribosiltransferasa Vip2 dependiente de NAD probablemente modifica la actina monomérica en Arg177 para bloquear la polimerización, lo que lleva a la pérdida del citoesqueleto de actina y a la eventual muerte celular debido al rápido intercambio de subunidades dentro de los filamentos de actina in vivo (Carlier MF (1990) Adv. Biophys. 26:51-73).

Al igual que las toxinas Cry, las toxinas Vip3A activadas son proteínas formadoras de poros capaces de crear canales iónicos estables en la membrana (Lee et al. (2003) Appl. Environ. Microbiol. 69:4648-4657). Las proteínas Vip3 son activas contra varias de las principales plagas de lepidópteros (Rang et al. (2005) Appl. Environ. Microbiol.

71(10):6276-6281; Bhalla et al. (2005) FEMS Microbiol. Lett. 243:467-472; Estruch et al. (1998) WO 9844137; Estruch et al. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93: 5389-5394; Selvapandiyan et al. (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67:5855-5858; Yu et al. (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63:532-536). Vip3A es activa contra Agrotis ipsilon, Spodoptera frugiperda, Spodoptera exigua, Heliothis virescens y Helicoverpa zea (Warren et al. (1996) WO 96/10083; Estruch et al. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93: 5389-5394). Al igual que las toxinas Cry, las proteínas Vip3A deben ser activadas por proteasas antes del reconocimiento en la superficie del epitelio del intestino medio de proteínas de membrana específicas diferentes de las reconocidas por las toxinas Cry.

La familia MTX de proteínas de toxinas se caracteriza por la presencia de un dominio conservado, ETX_MTX2 (pfam 03318). Los miembros de esta familia comparten homología de secuencia con las toxinas mosquitocidas Mtx2 y Mtx3 de Bacillus sphaericus, así como con la toxina épsilon ETX de Clostridium perfringens (Cole et al. (2004) Nat. Struct. Mol. Biol. 11: 797-8; Thanabalu et al. (1996) Gene 170:85-9). Las proteínas similares a MTX son estructuralmente distintas de las toxinas Cry de tres dominios, ya que tienen una estructura alargada y predominantemente basada en láminas p. Sin embargo, al igual que las toxinas de tres dominios, se cree que las proteínas similares a MTX forman poros en las membranas de las células diana (Adang et al. (2014) supra). A diferencia de las proteínas Cry de tres dominios, las proteínas similares a MTX tienen una longitud mucho menor, con un rango de 267 aminoácidos (Cry23) a 340 aminoácidos (Cry15A).

Hasta la fecha, solo se han asignado nombres Cry a 15 proteínas que pertenecen a la familia de toxinas similares a MTX, lo que hace que esta sea una clase relativamente pequeña en comparación con la familia Cry de tres dominios (Crickmore et al. (2014) supra; Adang et al. (2014) supra). Los miembros de la familia de toxinas similares a MTX incluyen Cry 15, Cry23, Cry33, Cry38, Cry45, Cry46, Cry51, Cry60A, Cry60B y Cry64. Esta familia presenta un rango de actividad insecticida, incluida la actividad contra plagas de insectos de los órdenes de lepidópteros y coleópteros. Algunos miembros de esta familia pueden formar asociaciones binarias con otras proteínas, que pueden o no ser necesarias para la actividad insecticida.

Cry15 es una proteína de 34 kDA que se identificó en Bacillus thuringiensis serovar thompsoni HD542; ocurre naturalmente en un cristal junto con una proteína no relacionada de aproximadamente 40 kDa. El gen que codifica Cry15 y su proteína asociada están dispuestos juntos en un operón. Se ha mostrado que Cry15 sola tiene actividad contra plagas de insectos lepidópteros, incluidas Manduca sexta, Cydia pomonella y Pieris rapae, y se ha mostrado que la presencia de la proteína de 40 kDA aumenta la actividad de Cry15 sola contra C. pomonella (Brown K. y Whiteley H. (1992) J. Bacteriol. 174:549-557; Naimov et al. (2008) Appl. Environ. Microbiol. 74:7145-7151). Se necesitan más estudios para dilucidar la función de la proteína asociada de Cry15. De manera similar, Cry23 es una proteína de 29 kDA que ha mostrado tener actividad contra las plagas de coleópteros Tribolium castaneum y Popillia japonica junto con su proteína asociada Cry37 (Donovan et al. (2000), Patente de EE. UU. No. 6.063.756).

Se siguen identificando nuevos miembros de la familia similar a MTX. Recientemente, se identificó un gen de la toxina ETX_MTX en el genoma de la cepa Na205-3 de Bacillus thuringiensis serovar tolworthi. Se encontró que esta cepa era tóxica contra la plaga de lepidópteros Helicoverpa armigera, y también contenía homólogos de Cry1, Cry11, Vip1, Vip2 y Vip3 (Palma et al. (2014) Genome Announc. 2(2): e00187-14. Publicado en línea el 13 de marzo de 2014 en doi: 10.1128/genomeA.00187-14; PMCID: PMC3953196). Debido a que las proteínas similares a MTX tienen una estructura de dominio único en relación con las proteínas Cry de tres dominios, se cree que poseen un modo de acción único, lo que las convierte en una herramienta valiosa en el control de insectos y la lucha contra la resistencia de insectos.

Las células bacterianas producen un gran número de toxinas con diversa especificidad contra organismos huéspedes y no huéspedes. Se han identificado grandes familias de toxinas binarias en numerosas familias bacterianas, incluidas toxinas que tienen actividad contra plagas de insectos. (Poopathi y Abidha (2010) J. Physiol. Path. 1(3): 22-38). Lysinibacillus sphaericus (Ls), anteriormente Bacillus sphaericus, (Ahmed et al. (2007) Int. J. Syst. Evol. Microbiol.

57:1117-1125) es bien conocida como una cepa de biocontrol de insectos. Ls produce varias proteínas insecticidas, incluido el complejo binario muy potente BinA/BinB. Este complejo binario forma un cristal paraesporal en las células Ls y tiene una actividad fuerte y específica contra insectos dípteros, específicamente mosquitos. En algunas áreas, se ha informado de la resistencia de los insectos a las cepas mosquitocidas de Ls existentes. El descubrimiento de nuevas toxinas binarias con diferente especificidad de diana o la capacidad de superar la resistencia de los insectos tiene un interés significativo.

El complejo de proteína insecticida binaria Ls contiene dos polipéptidos principales, un polipéptido de 42 kDa y un polipéptido de 51 kDa, denominados BinA y BinB, respectivamente (Ahmed et al. (2007) supra). Los dos polipéptidos actúan sinérgicamente para conferir toxicidad a sus dianas. El modo de acción implica la unión de las proteínas a los receptores en el intestino medio de las larvas. En algunos casos, las proteínas se modifican por digestión con proteasas en el intestino de las larvas para producir formas activadas. Se cree que el componente BinB está implicado en la unión, mientras que el componente BinA confiere toxicidad (Nielsen-LeRoux et al. (2001) Appl. Environ. Microbiol.

67(11):5049-5054). Cuando se clona y se expresa por separado, el componente BinA es tóxico para las larvas de mosquito, mientras que el componente BinB no lo es. Sin embargo, la coadministración de las proteínas aumenta notablemente la toxicidad (Nielsen-LeRoux et al. (2001) supra).

Se ha descrito un pequeño número de homólogos de proteína Bin a partir de fuentes bacterianas. Priest et al. (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63(4):1195-1198 describen un esfuerzo de hibridación para identificar nuevas cepas de Ls, aunque la mayoría de los genes que identificaron codificaban proteínas idénticas a las proteínas BinA/BinB conocidas. La proteína BinA contiene un dominio conservado definido conocido como el dominio de la superfamilia Toxina 10. Este dominio de toxina se definió originalmente por su presencia en BinA y BinB. Las dos proteínas tienen el dominio, aunque la similitud de secuencia entre BinA y BinB está limitada en esta región (<40 %). La proteína Cry49Aa, que también tiene actividad insecticida, también tiene este dominio (descrito a continuación).

La toxina binaria Cry48Aa/Cry49Aa de Ls tiene la capacidad de matar las larvas de mosquito Culex quinquefasciatus. Estas proteínas pertenecen a una clase estructural de proteínas que tiene cierta similitud con el complejo de proteínas Cry de Bacillus thuringiensis (Bt), una conocida familia de proteínas insecticidas. También se sabe que la toxina binaria Cry34/Cry35 de Bt mata insectos, incluido el gusano de la raíz del maíz occidental, una plaga importante del maíz. Cry34, del que se han identificado varias variantes, es un polipéptido pequeño (14 kDa), mientras que Cry35 (también codificada por varias variantes) es un polipéptido de 44 kDa. Estas proteínas tienen cierta homología de secuencia con el grupo de proteínas BinA/BinB y se cree que están relacionadas evolutivamente (Ellis et al. (2002) Appl. Environ. Microbiol. 68(3):1137-1145).

Las proteínas fosfolipasa C específicas de fosfatidilinositol (PI-PLC; también fosfolipasa C de fosfatidilinositol) son miembros del grupo más amplio de proteínas fosfolipasa C. Muchas de estas proteínas juegan papeles importantes en la transducción de señales como parte de la fisiología celular normal. Varias toxinas bacterianas importantes también contienen dominios con similitud con estas proteínas (Titball, R.W. (1993) Microbiological Reviews. 57(2):347-366). Es importante destacar que estas proteínas están implicadas en la amplificación de la señal durante la intoxicación de las células de insectos por las proteínas Cry de Bt. Valaitis, A.P. (2008) Insect Biochemistry and Molecular Biology. 38: 611-618).

La clase de toxinas PI-PLC se presenta en aislados de Bacillus, comúnmente observadas en concurrencia con homólogos de otras clases de toxinas descritas, tales como las toxinas binarias. Esta clase de secuencias tiene homología con las fosfodiesterasas de fosfatidilinositol (también denominadas fosfolipasa C específicas de fosfatidilinositol - PI-PLC). La estructura cristalina y su sitio activo fueron resueltos para la PI-PLC de B. cereus por Heinz et al (Heinz, et. al., (1995) The EMBO Journal. 14(16): 3855-3863). Gassler et al investigaron las funciones de los residuos de aminoácidos del sitio activo de la PI-PLC B. cereus en la catálisis y la unión del sustrato usando mutagénesis dirigida al sitio, cinética y análisis de estructura cristalina (Gassler, et. al., (1997) Biochemistry. 36(42): 12802-13).

Estas proteínas de toxina PI-PLC contienen una fosfodiesterasa similar a PLC, dominio TIM beta/alfa-barril (IPR017946) y/o un dominio X específico de fosfolipasa C, fosfatidilinositol (IPR000909) (también conocido como el dominio de caja X de PI-PLC). También hemos visto proteínas con estos dominios en combinación con otros dominios típicos de toxinas de proteínas de Bacillus. Esta lista incluye más comúnmente un dominio de lectina (IPR000772), un dominio de unión a azúcar que puede estar presente en una o más copias y se cree que se une a las membranas celulares, así como la toxina de cristal insecticida (IPR008872) (también conocida como Toxina10 o P42), que es el dominio definitorio de la toxina binaria.

Anteriormente, las toxinas de esta clase PI-PLC se definieron en la Patente de EE. UU. No. 8.318.900 B2 SEQ ID NO 30 (ADN) y 79 (aminoácidos), en la Publicación de Patente de EE. UU. No. 20110263488A1 SEQ ID NO 8 (ADN) y 9 (aminoácidos), y en la Patente de EE. UU. No. 8.461.421B2 SEQ ID NO 3 (ADN) y 63 (aminoácidos).

En la presente memoria se proporcionan proteínas plaguicidas de estas clases de toxinas. Las proteínas plaguicidas se clasifican por su estructura, homología con toxinas conocidas y/o su especificidad plaguicida.

ii. Variantes y fragmentos de proteínas plaguicidas y polinucleótidos que codifican las mismas

Las proteínas o polipéptidos plaguicidas de la invención incluyen los mostrados en la SEQ ID NO: 186 y fragmentos y variantes de los mismos. Por "toxina plaguicida" o "proteína plaguicida" o "polipéptido plaguicida" se entiende una toxina o proteína o polipéptido que tiene actividad contra una o más plagas, incluidos insectos, hongos, nematodos y similares, de modo que la plaga muere o se controla.

Un polipéptido o proteína "aislado" o "purificado", o una porción biológicamente activa del mismo, está sustancialmente o esencialmente libre de componentes que normalmente acompañan o interactúan con el polipéptido o proteína tal como se encuentra en su entorno natural. Por lo tanto, un polipéptido o proteína aislado o purificado está sustancialmente libre de otro material celular o medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas recombinantes, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. Una proteína que está sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteína que tienen menos de aproximadamente el 30 %, 20 %, 10 %, 5 % o 1 % (en peso seco) de proteína contaminante. Cuando la proteína de la divulgación o la parte biológicamente activa de la misma se produce de forma recombinante, el medio de cultivo representa de forma óptima menos de aproximadamente el 30 %, 20 %, 10 %, 5 % o 1 % (en peso seco) de precursores químicos o productos químicos distintos de la proteína de interés.

El término "fragmento" se refiere a una porción de una secuencia polipeptídica de la divulgación. Los "fragmentos" o "porciones biológicamente activas" incluyen polipéptidos que comprenden un número suficiente de residuos de aminoácidos contiguos para retener la actividad biológica, es decir, tener actividad plaguicida. Los fragmentos de las proteínas plaguicidas incluyen aquellos que son más cortos que las secuencias de longitud completa, ya sea debido al uso de un sitio de inicio en 3' alternativo o debido al procesamiento que produce una proteína más corta que tiene actividad plaguicida. El procesamiento puede ocurrir en el organismo en el que se expresa la proteína, o en la plaga después de la ingestión de la proteína. En la Tabla 1 se pueden encontrar ejemplos de fragmentos de las proteínas. Una porción biológicamente activa de una proteína plaguicida puede ser un polipéptido que tiene, por ejemplo, una longitud de 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250 o más aminoácidos de una cualquiera de la SEQ ID NO: 186. Dichas porciones biológicamente activas pueden prepararse mediante técnicas recombinantes y evaluarse para determinar su actividad plaguicida. Como se usa aquí, un fragmento comprende al menos 8 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 186.

Los genes bacterianos, incluidos los que codifican las proteínas plaguicidas divulgadas en la presente memoria, poseen muy a menudo múltiples codones de inicio de metionina en las proximidades del inicio del marco de lectura abierto. A menudo, el inicio de la traducción en uno o más de estos codones de inicio conducirá a la generación de una proteína funcional. Estos codones de inicio pueden incluir codones ATG. Sin embargo, bacterias como Bacillus sp. también reconocen el codón GTG como codón de inicio, y las proteínas que inician la traducción en los codones GTG contienen una metionina en el primer aminoácido. En raras ocasiones, la traducción en los sistemas bacterianos puede iniciarse en un codón TTG, aunque en este caso el TTG codifica una metionina. Además, a menudo no se determina a priori cuáles de estos codones se usan de forma natural en la bacteria. Por tanto, se entiende que el uso de uno de los codones alternativos de metionina también puede conducir a la generación de proteínas plaguicidas. Estas proteínas plaguicidas están abarcadas en la presente divulgación y pueden usarse en los métodos descritos en la presente memoria. Se entenderá que, cuando se exprese en plantas, será necesario alterar el codón de inicio alternativo a ATG para una traducción adecuada.

En diversas realizaciones, las proteínas plaguicidas proporcionadas en la presente memoria incluyen secuencias de aminoácidos deducidas de las secuencias de nucleótidos de longitud completa y secuencias de aminoácidos que son más cortas que las secuencias de longitud completa debido al uso de un sitio de inicio en 3' alternativo. Por lo tanto, la secuencia de nucleótidos de la divulgación y/o los vectores, las células huésped y las plantas que comprenden la secuencia de nucleótidos de la divulgación (y los métodos para producir y usar la secuencia de nucleótidos de la divulgación) pueden comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un sitio de inicio alternativo.

Se reconoce que se pueden realizar modificaciones en los polipéptidos plaguicidas proporcionados en la presente memoria para crear proteínas variantes. Los cambios diseñados por el hombre pueden introducirse mediante la aplicación de técnicas de mutagénesis dirigida al sitio. Alternativamente, también pueden identificarse polinucleótidos y/o polipéptidos nativos, aún desconocidos o aún no identificados estructural y/o funcionalmente relacionados con las secuencias divulgadas en la presente memoria que se encuentran dentro del alcance de la presente divulgación. Se pueden realizar sustituciones de aminoácidos conservativas en regiones no conservadas que no alteran la función de las proteínas plaguicidas. Alternativamente, se pueden realizar modificaciones que mejoren la actividad de la toxina. La modificación de las toxinas Cry por intercambio de dominio III ha dado como resultado en algunos casos toxinas híbridas con toxicidades mejoradas contra ciertas especies de insectos. Por lo tanto, el intercambio de dominio III podría ser una estrategia efectiva para mejorar la toxicidad de las toxinas Cry o para crear nuevas toxinas híbridas con toxicidad contra plagas que no muestran susceptibilidad a las toxinas Cry parentales. La mutagénesis dirigida al sitio de las secuencias del bucle del dominio II puede dar como resultado nuevas toxinas con mayor actividad insecticida. Las regiones del bucle del dominio II son regiones de unión clave de las toxinas Cry iniciales que son dianas adecuadas para la mutagénesis y selección de toxinas Cry con propiedades insecticidas mejoradas. El dominio I de la toxina Cry puede modificarse para introducir sitios de escisión de proteasa para mejorar la actividad contra ciertas plagas. Las estrategias para barajar los tres dominios diferentes entre un gran número de genes cry y los métodos de cribado de bioensayos de alto rendimiento pueden proporcionar nuevas toxinas Cry con toxicidades mejoradas o novedosas.

Como se indica, los fragmentos y variantes de los polipéptidos divulgados en la presente memoria conservarán la actividad plaguicida. La actividad plaguicida comprende la capacidad de la composición para lograr un efecto observable que disminuya la aparición o la actividad de la plaga diana, incluyendo, por ejemplo, provocar la muerte de al menos una plaga o una reducción notable en el crecimiento, la alimentación o el desarrollo fisiológico normal de la plaga. Dichas disminuciones en número, crecimiento de plagas, alimentación o desarrollo normal pueden comprender cualquier disminución estadísticamente significativa, incluyendo, por ejemplo, una disminución de aproximadamente el 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 85%, 90%, 95% o más. La actividad plaguicida contra una o más de las diversas plagas proporcionadas en la presente memoria, incluyendo, por ejemplo, la actividad plaguicida contra Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthroptera, Nematodes, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera, etc., o cualquier otra plaga descrita en la presente memoria. Se reconoce que la actividad plaguicida puede ser diferente o mejorada con respecto a la actividad de la proteína nativa, o puede permanecer sin cambios, siempre que se retenga la actividad plaguicida. Los métodos para medir la actividad plaguicida se proporcionan en otra parte de la presente memoria. Véase también, Czapla y Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J.

252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; y La Pat. de EE. UU. No. 5.743.477.

Por "variantes" se entiende polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 91 %, aproximadamente un 92 %, aproximadamente un 93 %, aproximadamente un 94 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 96 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 % o aproximadamente un 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de la SEQ ID NO: 186 y retiene la actividad plaguicida. Tenga en cuenta que la Tabla 1 proporciona ejemplos no limitantes de polipéptidos variantes (y polinucleótidos que codifican los mismos) para cada una de las SEQ ID NO: 1-309. Una variante biológicamente activa de un polipéptido plaguicida de la divulgación puede diferir en tan pocos como aproximadamente 1-15 residuos de aminoácidos, tan pocos como aproximadamente 1-10, tal como aproximadamente 6-10, tan pocos como 5, tan pocos como 4, tan pocos como 3, tan pocos como 2 o tan pocos como 1 residuo de aminoácido. En realizaciones específicas, los polipéptidos pueden comprender un truncamiento N-terminal o C-terminal, que puede comprender al menos una deleción de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 aminoácidos o más de cualquiera del extremo N o C del polipéptido.

La Tabla 2 proporciona los dominios de proteína que se encuentran en las SEQ ID NO: 1-309 según los datos de PFAM. Tanto la descripción del dominio como las posiciones dentro de una SEQ ID NO dada se proporcionan en la Tabla 2. En realizaciones específicas, la variante activa que comprende las SEQ ID NO: 186 puede comprender al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 186 y además comprende al menos uno de los dominios conservados mostrados en la Tabla 2. Por ejemplo, en una realización, la variante activa comprenderá al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 186, y además comprende los aminoácidos nativos en las posiciones 60-267.

Tabla 2. Resumen de dominios PFAM en cada una de las SEQ ID NO: 1-309

También se proporcionan ácidos nucleicos recombinantes o sintéticos que codifican los polipéptidos plaguicidas divulgados en la presente memoria. De particular interés son las secuencias de ácido nucleico que han sido diseñadas para expresión en una planta de interés. Es decir, la secuencia de ácido nucleico puede optimizarse para aumentar la expresión en una planta huésped. Una proteína plaguicida de la divulgación se puede retrotraducir para producir un ácido nucleico que comprende codones optimizados para la expresión en un huésped particular, por ejemplo, una planta de cultivo. En otra realización, los polinucleótidos que codifican los polipéptidos proporcionados en la presente memoria pueden optimizarse para aumentar la expresión en la planta transformada. Es decir, los polinucleótidos se pueden sintetizar usando codones preferidos por plantas para mejorar la expresión. Véase, por ejemplo, Campbell y Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11 para una discusión sobre el uso de codones preferidos por el huésped. Hay métodos disponibles en la técnica para sintetizar genes preferidos de plantas. Véanse, por ejemplo, las Patentes de EE. UU. No. 5.380.831, y 5.436.391 y Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498. La expresión de dicha secuencia codificante por la planta transformada (p. ej., dicotiledónea o monocotiledónea) dará como resultado la producción de un polipéptido plaguicida y conferirá a la planta una mayor resistencia a una plaga. Las moléculas de ácido nucleico sintéticas y recombinantes que codifican las proteínas plaguicidas de la divulgación no incluyen la secuencia bacteriana de origen natural que codifica la proteína.

Un "polinucleótido recombinante" o "ácido nucleico recombinante" comprende una combinación de dos o más segmentos de ácido nucleico unidos químicamente que no se encuentran directamente unidos en la naturaleza. Por "unido directamente" se entiende que los dos segmentos de ácido nucleico están inmediatamente adyacentes y unidos entre sí por un enlace químico. En realizaciones específicas, el polinucleótido recombinante comprende un polinucleótido de interés o una variante o fragmento del mismo de manera que un segmento de ácido nucleico unido químicamente adicional se localiza en 5', 3' o en el interior del polinucleótido de interés. Alternativamente, el segmento de ácido nucleico unido químicamente del polinucleótido recombinante puede formarse mediante la deleción de una secuencia. El segmento de ácido nucleico unido químicamente adicional o la secuencia delecionada para unirse a los segmentos de ácido nucleico unidos puede tener cualquier longitud, incluyendo, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 o más nucleótidos. Diversos métodos para producir dichos polinucleótidos recombinantes incluyen la síntesis química o la manipulación de segmentos aislados de polinucleótidos mediante técnicas de ingeniería genética. En realizaciones específicas, el polinucleótido recombinante puede comprender una secuencia de ADN recombinante o una secuencia de ARN recombinante. Un "fragmento de un polinucleótido o ácido nucleico recombinante" comprende al menos uno de una combinación de dos o más segmentos de aminoácidos unidos químicamente que no se encuentran directamente unidos en la naturaleza.

Los fragmentos de un polinucleótido (ARN o ADN) pueden codificar fragmentos de proteínas que conservan la actividad. En realizaciones específicas, un fragmento de un polinucleótido recombinante o una construcción de polinucleótido recombinante comprende al menos una unión de los dos o más segmentos de ácido nucleico unidos químicamente o unidos operativamente que no se encuentran directamente unidos en la naturaleza. Un fragmento de un polinucleótido que codifica una porción biológicamente activa de un polipéptido que retiene la actividad plaguicida codificará al menos 25, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 90, 100, 110, 120, 125, 130, 140, 150, 160, 170, 175, 180, aminoácidos contiguos, o hasta el número total de aminoácidos presentes en un polipéptido de longitud completa como se muestra en la SEQ ID NO: 186. En realizaciones específicas, dichos fragmentos de polipéptido son fragmento activo, y en aún otras realizaciones, el fragmento de polipéptido comprende un fragmento de polipéptido recombinante. Tal y como se usa en la presente memoria, un fragmento de un polipéptido recombinante comprende al menos uno de una combinación de dos o más segmentos de aminoácidos unidos químicamente que no se encuentran directamente unidos en la naturaleza.

Por “variantes” se pretende significar secuencias sustancialmente similares. Para polinucleótidos, una variante comprende una deleción y/o adición de uno o más nucleótidos en uno o más sitios internos dentro del polinucleótido nativo y/o una sustitución de uno o más nucleótidos en uno o más sitios en el polinucleótido nativo. Tal y como se usa en la presente memoria, un polinucleótido o polipéptido "nativo" comprende una secuencia de nucleótidos o una secuencia de aminoácidos de origen natural, respectivamente.

Las variantes de un polinucleótido particular de la divulgación (es decir, el polinucleótido de referencia) también pueden evaluarse mediante la comparación del porcentaje de identidad de secuencia entre el polipéptido codificado por un polinucleótido variante y el polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. Así, por ejemplo, se divulga un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido con un porcentaje dado de identidad de secuencia con el polipéptido de la SEQ ID NO: 186. El porcentaje de identidad de secuencia entre dos polipéptidos cualquiera se puede calcular usando programas de alineamiento de secuencias y parámetros descritos en otra parte de la presente memoria. Cuando cualquier par dado de polinucleótidos de la divulgación se evalúa por comparación del porcentaje de identidad de secuencia compartida por los dos polipéptidos que codifican, el porcentaje de identidad de secuencia entre los dos polipéptidos codificados es al menos aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 186. En otras realizaciones, la variante del polinucleótido proporcionada en la presente memoria difiere de la secuencia nativa en al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más nucleótidos.

Los polinucleótidos y proteínas variantes también abarcan secuencias y proteínas derivadas de un procedimiento mutagénico y recombinogénico tal como la transposición aleatoria de ADN. Con dicho procedimiento, una o más proteínas plaguicidas diferentes divulgadas en la presente memoria (SEQ ID NO: 1-309) se manipula para crear una nueva proteína plaguicida que posea las propiedades deseadas. De esta manera, se generan bibliotecas de polinucleótidos recombinantes a partir de una población de polinucleótidos de secuencia relacionada que comprenden regiones de secuencia que tienen una identidad de secuencia sustancial y pueden recombinarse de forma homóloga in vitro o in vivo. Por ejemplo, usando este enfoque, los restos de secuencia que codifican un dominio de interés se pueden barajar entre las secuencias de plaguicidas proporcionadas en la presente memoria y otros genes de plaguicidas conocidos para obtener un nuevo gen que codifica una proteína con una propiedad de interés mejorada, tal como un aumento de Km en el caso de una enzima. Las estrategias para dicho barajado de ADN se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370: 389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391: 288-291; y Patentes de EE. UU. No. 5.605.793 y 5.837.458. Un ácido nucleico "barajado" es un ácido nucleico producido mediante un procedimiento de barajado tal como cualquier procedimiento de barajado mostrado en la presente memoria. Los ácidos nucleicos barajados se producen mediante la recombinación (física o virtual) de dos o más ácidos nucleicos (o cadenas de caracteres), por ejemplo, de forma artificial y, opcionalmente, recursiva. Generalmente, se usan una o más etapas de cribado en los procesos de barajado para identificar los ácidos nucleicos de interés; esta etapa de cribado se puede realizar antes o después de cualquier etapa de recombinación. En algunas realizaciones de barajado (pero no en todas), es deseable realizar múltiples rondas de recombinación antes de la selección para aumentar la diversidad del conjunto que se va a cribar. El proceso general de recombinación y selección se repite opcionalmente de forma recursiva. Dependiendo del contexto, barajar puede referirse a un proceso general de recombinación y selección o, alternativamente, puede referirse simplemente a las partes de recombinación del proceso general.

En una realización, se proporciona un método para obtener un polinucleótido que codifica un polipéptido mejorado que comprende actividad plaguicida, en donde el polipéptido mejorado tiene al menos una propiedad mejorada sobre una cualquiera de las SEQ ID NO: 1-309. Dichos métodos pueden comprender (a) recombinar una pluralidad de polinucleótidos parentales para producir una biblioteca de polinucleótidos recombinantes que codifican polipéptidos plaguicidas recombinantes; (b) cribar la biblioteca para identificar un polinucleótido recombinante que codifique un polipéptido plaguicida recombinante mejorado que tenga una propiedad potenciada mejorada sobre el polinucleótido parental; (c) recuperar el polinucleótido recombinante que codifica el polipéptido plaguicida recombinante mejorado identificado en (b); y (d) repetir las etapas (a), (b) y (c) usando el polinucleótido recombinante recuperado en la etapa (c) como uno de la pluralidad de polinucleótidos parentales en la etapa repetida (a).

iii. Comparaciones de secuencias

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "identidad" o "porcentaje de identidad" cuando se usa con respecto a un par particular de secuencias de aminoácidos alineadas, se refiere al porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácidos que se obtiene contando el número de concordancias idénticas en la alineación y dividiendo dicho número de concordancias idénticas por la longitud de las secuencias alineadas. Tal y como se usa en la presente memoria, el término "similitud" o "porcentaje de similitud" cuando se usa con respecto a un par particular de secuencias de aminoácidos alineadas, se refiere a la suma de las puntuaciones que se obtienen de una matriz de puntuación para cada par de aminoácidos en la alineación. dividido por la longitud de las secuencias alineadas.

A no ser que se afirme otra cosa, la identidad y la similitud se calcularán mediante los algoritmos de puntuación y alineación global de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48(3):443-453) implementado por el programa "needle", distribuido como parte del paquete de software EMBOSS (Rice,P. Longden, I. y Bleasby,A., EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, 2000, Trends in Genetics 16, (6) p276-277, versiones 6.3.1 disponibles en EMBnet en embnet.org/resource/emboss y emboss.sourceforge.net, entre otras fuentes) usando matrices de puntuación y penalizaciones por hueco predeterminadas (EBLOSUM62 para proteína y EDNAFULL para ADN). También se pueden usar programas equivalentes. Por "programa equivalente" se entiende cualquier programa de comparación de secuencias que, para cualquiera de las dos secuencias en cuestión, genera una alineación que tiene concordancias idénticas de residuos de nucleótidos y un porcentaje idéntico de identidad de secuencia cuando se compara con la alineación correspondiente generada por needle de EMBOSS versión 6.3.1.

En la técnica, se conocen algoritmos matemáticos adicionales y se pueden utilizar para la comparación de dos secuencias. Véase, por ejemplo, el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264, modificado como en Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Dicho algoritmo está incorporado en los programas BLAST de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403. Las búsquedas de nucleótidos BLASt se pueden realizar con el programa BLASTN (consulta de nucleótidos buscada contra secuencias de nucleótidos) para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a las moléculas de ácido nucleico similares a plaguicidas de la divulgación, o con el programa BLASTX (consulta de nucleótidos traducida buscada contra secuencias de proteínas) para obtener secuencias de proteínas homólogas a las moléculas de ácido nucleico plaguicidas de la divulgación. Las búsquedas de proteínas BLAST se pueden realizar con el programa BLASTP (consulta de proteínas buscadas contra secuencias de proteínas) para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas de proteínas plaguicidas de la divulgación, o con el programa TBLASTN (consulta de proteínas buscadas contra secuencias de nucleótidos traducidas) para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a las moléculas de proteína plaguicida de la divulgación. Para obtener alineaciones con huecos con fines de comparación, se puede utilizar Gapped BLAST (en BLAST 2.0) como se describe en Altschul et al. (1997) Nucleic. Acids Res.

25:3389. Alternativamente, puede usarse PSI-Blast para realizar una búsqueda iterativa que detecta relaciones distantes entre moléculas. Véase, Altschul et al. (1997) supra. Al utilizar los programas BLAST, Gapped BLAST y PSI-Blast, se pueden usar los parámetros por defecto de los respectivos programas (p. ej., BLASTX y BLASTN). La alineación también se puede realizar manualmente mediante inspección.

Dos secuencias están "alineadas de manera óptima" cuando se alinean para la puntuación de similitud usando una matriz de sustitución de aminoácidos definida (p. ej., BLOSUM62), penalización por existencia de huecos y penalización por extensión de huecos para llegar a la puntuación más alta posible para ese par de secuencias. Las matrices de sustitución de aminoácidos y su uso para cuantificar la similitud entre dos secuencias son bien conocidas en la técnica y se describen, p. ej., en Dayhoff et al. (1978) "A model of evolutionary change in proteins ". En "Atlas of Protein Sequence and Structure ", Vol. 5, Supl. 3 (ed. M. O. Dayhoff), p. 345-352. Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC. y Henikoff et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919. La matriz BLOSUM62 se usa a menudo como matriz de sustitución de puntuación predeterminada en los protocolos de alineación de secuencias. La penalización por existencia de huecos se impone por la introducción de un solo hueco de aminoácidos en una de las secuencias alineadas, y la penalización por extensión de huecos se impone por cada posición de aminoácido vacía adicional insertada en un hueco ya abierto. El alineamiento se define por las posiciones de aminoácidos de cada secuencia en las que comienza y termina el alineamiento y, opcionalmente, por la inserción de un hueco o múltiples huecos en una o ambas secuencias, para llegar a la puntuación más alta posible. Si bien la alineación y la puntuación óptimas se pueden lograr manualmente, el proceso se facilita mediante el uso de un algoritmo de alineación implementado por computadora, p. ej., gapped BLAST 2.0, descrito en Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res.

25:3389-3402 y puesto a disposición del público en el sitio web del Centro Nacional de Información Biotecnológica (www.ncbi.nlm.nih.gov). Las alineaciones óptimas, incluidas las alineaciones múltiples, se pueden preparar usando, p. ej., PSI-BLAST, disponible a través de www.ncbi.nlm.nih.gov y descrito por Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res.

25:3389-3402.

Con respecto a una secuencia de aminoácidos que está óptimamente alineada con una secuencia de referencia, un residuo de aminoácido "corresponde a" la posición en la secuencia de referencia con la que el residuo está emparejado en la alineación. La "posición" se indica mediante un número que identifica secuencialmente cada aminoácido en la secuencia de referencia en función de su posición relativa al extremo N. Por ejemplo, en la SEQ ID NO: 1, la posición 1 es M, la posición 2 es A, la posición 3 es I, etc. Cuando una secuencia de ensayo se alinea de manera óptima con la SEQ ID NO: 1, un residuo en la secuencia de ensayo que se alinea con el I en la posición 3 se dice que "corresponde a la posición 3" de la SEQ ID NO: 1. Debido a deleciones, inserciones, truncamientos, fusiones, etc., que deben tenerse en cuenta al determinar una alineación óptima, en general, el número de los residuos de aminoácidos en una secuencia de ensayo, determinado simplemente contando desde el N-terminal, no será necesariamente el mismo que el número de su posición correspondiente en la secuencia de referencia. Por ejemplo, en el caso de que haya una deleción en una secuencia de ensayo alineada, no habrá ningún aminoácido que corresponda a una posición en la secuencia de referencia en el sitio de la deleción. Cuando haya una inserción en una secuencia de referencia alineada, esa inserción no corresponderá a ninguna posición de aminoácido en la secuencia de referencia. En el caso de truncamientos o fusiones, puede haber cadenas de aminoácidos en la secuencia de referencia o alineada que no correspondan a ningún aminoácido en la secuencia correspondiente.

iv. Anticuerpos

También están englobados los anticuerpos contra los polipéptidos de la presente divulgación, o contra variantes o fragmentos de los mismos. Los métodos para producir anticuerpos son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y..; y Pat. de EE. UU. No. 4.196.265). Estos anticuerpos pueden usarse en kits para la detección y aislamiento de polipéptidos de toxinas. Por tanto, esta divulgación proporciona kits que comprenden anticuerpos que se unen específicamente a los polipéptidos descritos en la presente memoria, incluidos, por ejemplo, polipéptidos que tienen la secuencia de la Se Q ID NO: 186.

II. Plagas

Las composiciones y métodos proporcionados en la presente memoria son útiles contra una variedad de plagas. “Plagas” incluye, pero no se limita a, insectos, hongos, bacterias, nematodos, ácaros, protozoos patógenos, trematodos hepáticos parásitos de animales y similares. Las plagas de particular interés son las plagas de insectos, en particular las plagas de insectos que causan un daño significativo a las plantas agrícolas. Las plagas de insectos incluyen insectos seleccionados de los órdenes Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera o nematodos. En realizaciones no limitantes, la plaga de insectos comprende el gusano de la raíz del maíz occidental, Diabrotica virgifera virgifera; gusano cogollero, Spodoptera frugiperda; Escarabajo de patata de Colorado, Leptinotarsa decemlineata; Gusano cogollero del maíz, Helicoverpa zea (en América del Norte, la misma especie ataca al algodón y se llama gusano cogollero del algodón); barrenador europeo del maíz, Ostrinia nubilalis; Gusano cortador negro, Agrotis ipsilon; polilla espalda de diamante, Plutella xylostella; Oruga de leguminosas, Anticarsia gemmatalis; barrenador del maíz del sudoeste, Diatraea grandiosella; Gusano cogollero del algodón, Helicoverpa armigera (encontrado fuera de EE. UU. en el resto del mundo); Chinche apestosa verde del sur, Nezara viridula; Chinche apestosa verde, Chinavia halaris; Chinche apestosa marmolada marrón, Halyomorpha halys; y chinche parda, Euschistus servus, Euschistus heros (chinche apestosa marrón neotropical O chinche apestosa de la soja); Piezodorus guildinii (chinche apestosa de bandas rojas); Dichelops melacanthus (sin nombre común) y/o Dichelops furcatus (sin nombre común); un pulgón, tal como un pulgón de la soja. En otras realizaciones, la plaga comprende un nematodo que incluye, pero no se limita a, Meloidogyne hapla (nematodo del nudo de raíz del norte); Meloidogyne enterolobii, Meloidogyne arenaria (nematodo del nudo de raíz del maní); y Meloidogyne javanica.

El término "plagas de insectos" tal y como se usa en la presente memoria se refiere a insectos y otras plagas similares tales como, por ejemplo, las del orden Acari que incluyen, pero no se limitan a, ácaros y garrapatas. Las plagas de insectos de la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a, insectos del orden de los Lepidoptera, p. ej., Achoroia grisella, Acleris gloverana, Acleris variana, Adoxophyes orana, Agrotis ipsilon, Alabama argillacea, Alsophila pometaria, Amyelois transitella, Anagasta kuehniella, Anarsia lineatella, Anisota senatoria, Antheraea pernyi, Anticarsia gemmatalis, Archips sp., Argyrotaenia sp., Athetis mindara, Bombyx mori, Bucculatrix thurberiella, Cadra cautella, Choristoneura sp., Cochylls hospes, Colias eurytheme, Corcyra cephalonica, Cydia latiferreanus, Cydia pomonella, Datana integerrima, Dendrolimus sibericus, Desmiafeneralis, Diaphania hyalinata, Diaphania nitidalis, Diatraea grandiosella, Diatraea saccharalis, Ennomos subsignaria, Eoreuma loftini, Esphestia elutella, Erannis tilaria, Estigmene acrea, Eulia salubricola, Eupocoellia ambiguella, Eupoecilia ambiguella, Euproctis chrysorrhoea, Euxoa messoria, Galleria mellonella, Grapholita molesta, Harrisina americana, Helicoverpa subflexa, Helicoverpa zea, Heliothis virescens, Hemileuca oliviae, Homoeosoma electellum, Hyphantia cunea, Keiferia lycopersicella, Lambdina fiscellaria fiscellaria, Lambdina fiscellaria lugubrosa, Leucoma salicis, Lobesia botrana, Loxostege sticticalis, Lymantria dispar, Macalla thyrisalis, Malacosoma sp., Mamestra brassicae, Mamestra configurata, Manduca quinquemaculata, Manduca sexta, Maruca testulalis, Melanchra picta, Operophtera brumata, Orgyia sp., Ostrinia nubilalis, Paleacrita vernata, Papilio cresphontes, Pectinophora gossypiella, Phryganidia californica, Phyllonorycter blancardella, Pieris napi, Pieris rapae, Plathypena scabra, Platynota flouendana, Platynota stultana, Platyptilia carduidactyla, Plodia interpunctella, Plutella xylostella, Pontia protodice, Pseudaletia unipuncta, Pseudoplasia includens, Sabulodes aegrotata, Schizura concinna, Sitotroga cerealella, Spilonta ocellana, Spodoptera sp., Thaurnstopoea pityocampa, Tinsola bisselliella, Trichoplusia hi, Udea rubigalis, Xylomyges curiails e Yponomeuta padella.

Las plagas de insectos también incluyen insectos seleccionados de los órdenes Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera, Coleoptera.

Las plagas de insectos de la divulgación para los cultivos principales incluyen, pero no se limitan a: Maíz: Ostrinia nubilalis, barrenador europeo del maíz; Agrotis ipsilon, gusano cortador negro; Helicoverpa zeae, gusano cogollero del maíz; Spodoptera frugiperda, gusano cogollero; Diatraea grandiosella, barrenador del maíz del sudoeste; Elasmopalpus lignosellus, barrenador menor del tallo de maíz; Diatraea saccharalis, barrenador de la caña de azúcar; gusano de la raíz del maíz occidental, p. ej., Diabrotica virgifera virgifera; gusano de la raíz del maíz del norte, p. ej., Diabrotica longicornis barberi; gusano de la raíz del maíz del sur, p. ej., Diabrotica undecimpunctata howardi; Melanotus spp., gusanos de alambre; Cyclocephala borealis, chafer enmascarado del norte (gusano blanco); Cyclocephala immaculata, chafer enmascarado del sur (gusano blanco); Popillia japonica, escarabajo japonés; Chaetocnema pulicaria, escarabajo pulga del maíz; Sphenophorus maidis, picudo del maíz; Rhopalosiphum maidis, pulgón de la hoja de maíz; Anuraphis maidiradicis, pulgón de la raíz del maíz; Euschistus heros (chinche apestosa marrón neotropical O chinche apestosa de la soja); Piezodorus guildinii (chinche apestosa de bandas rojas); Dichelops melacanthus (sin nombre común); Dichelops furcatus (sin nombre común); Blissus leucopterus leucopterus, chinche; Melanoplus femurrubrum, saltamontes de patas rojas; Melanoplus sanguinipes, saltamontes migratorios; Hylemya platura, gusano de la semilla del maíz; Agromyza parvicornis, minador de la mancha del maíz; Anaphothrips obscrurus, trips de las gramíneas; Solenopsis milesta, hormiga ladrona; Tetranychus urticae, araña roja de dos manchas; Sorgo: Chilo partellus, barrenador del sorgo; Spodoptera frugiperda, gusano cogollero; Helicoverpa zea, gusano cogollero del maíz; Elasmopalpus lignosellus, barrenador menor del tallo de maíz; Feltia subterranea, gusano cortador granulado; Phyllophaga crinita, gusano blanco; Eleodes, Conoderus y Aeolus spp., gusanos de alambre; Oulema melanopus, escarabajo de la hoja de cereales; Chaetocnema pulicaria, escarabajo pulga del maíz; Sphenophorus maidis, picudo del maíz; Rhopalosiphum maidis; pulgón de la hoja de maíz; Sipha flava, pulgón amarillo de la caña de azúcar; chinche, p. ej., Blissus leucopterus leucopterus; Contarinia sorghicola, mosquito del sorgo; Tetranychus cinnabarinus, araña roja carmín; Tetranychus urticae, araña roja de dos manchas; Trigo: Pseudaletia unipunctata, gusano soldado; Spodoptera frugiperda, gusano cogollero; Elasmopalpus lignosellus, barrenador menor del tallo de maíz; Agrotis orthogonia, gusano cortador occidental pálido; Elasmopalpus lignosellus, barrenador menor del tallo de maíz; Oulema melanopus, escarabajo de la hoja de cereales; Hypera punctata, picudo del trébol; gusano de la raíz del maíz del sur, p. ej., Diabrotica undecimpunctata howardi; pulgón ruso del trigo; Schizaphis graminum, chinche verde; Macrosiphum avenae, pulgón inglés del grano; Melanoplus femurrubrum, saltamontes de patas rojas; Melanoplus differentialis, saltamontes diferencial; Melanoplus sanguinipes, saltamontes migratorios; Mayetiola destructor, mosca de Hesse; Sitodiplosis mosellana, mosquito del trigo; Meromyza americana, gusano del tallo del trigo; Hylemya coarctata, mosca del bulbo del trigo; Frankliniella fusca, trips del tabaco; Cephus cinctus, mosca de sierra del tallo del trigo; Aceria tulipae, ácaro del rizo del trigo; Girasol: Cylindrocupturus adspersus, picudo del tallo del girasol; Smicronyx fulus, picudo rojo de la semilla del girasol; Smicronyx sordidus, picudo gris de la semilla de girasol; Suleima helianthana, polilla del capullo del girasol; Homoeosoma electellum, polilla del girasol; Zygogramma exclamationis, escarabajo del girasol; Bothyrus gibbosus, escarabajo de la zanahoria; Neolasioptera murtfeldtiana, mosquito de la semilla de girasol; Algodón: Heliothis virescens, gusano cogollero del tabaco; Helicoverpa zea, gusano cogollero del algodón; Spodoptera exigua, gusano soldado de la remolacha; Pectinophora gossypiella, gusano cogollero rosado; picudo del algodonero, p. ej., Anthonomus grandis; Aphis gossypii, pulgón del algodón; Pseudatomoscelis seriatus, saltamontes del algodón; Trialeurodes abutilonea, mosca blanca de alas bandeadas; Lygus lineolaris, chinche ligus; Melanoplus femurrubrum, saltamontes de patas rojas; Melanoplus differentialis, saltamontes diferencial; Thrips tabaci, trips de la cebolla; Franklinkiella fusca, trips del tabaco; Tetranychus cinnabarinus, araña roja carmín; Tetranychus urticae, araña roja de dos manchas; Arroz: Diatraea saccharalis, barrenador de la caña de azúcar; Spodoptera frugiperda, gusano cogollero; Helicoverpa zea, gusano cogollero del maíz; Colaspis brunnea, uva colaspis; Lissorhoptrus oryzophilus, gorgojo del agua del arroz; Sitophilus oryzae, gorgojo del arroz; Nephotettix nigropictus, saltahojas del arroz; chinche, p. ej., Blissus leucopterus leucopterus; Acrosternum hilare, chinche apestosa verde; Soja: Pseudoplusia includens, gusano defoliador de soja; Anticarsia gemmatalis, oruga de las leguminosas; Plathypena scabra, gusano verde del trébol; Ostrinia nubilalis, barrenador europeo del maíz; Agrotis ipsilon, gusano cortador negro; Spodoptera exigua, gusano soldado de la remolacha; Heliothis virescens, gusano cogollero del tabaco; Helicoverpa zea, gusano cogollero del algodón; Epilachna varivestis, escarabajo mexicano del frijol; Myzus persicae, pulgón verde del melocotonero; Empoasca fabae, chicharrita de la patata; Acrosternum hilare, chinche apestosa verde; Melanoplus femurrubrum, saltamontes de patas rojas; Melanoplus differentialis, saltamontes diferencial; Hylemya platura, gusano de la semilla del maíz; Sericothrips variabilis, trips de la soja; Thrips tabaci, trips de la cebolla; Tetranychus turkestani, araña roja de la fresa; Tetranychus urticae, araña roja de dos manchas; Cebada: Ostrinia nubilalis, barrenador europeo del maíz; Agrotis ipsilon, gusano cortador negro; Schizaphis graminum, chinche verde; chinche, p. ej., Blissus leucopterus leucopterus; Acrosternum hilare, chinche apestosa verde; Euschistus servus, chinche apestosa marrón; Jylemya platura, gusano de semilla de maíz; Mayetiola destructor, mosca de Hesse; Petrobia latens, ácaro pardo del trigo; Colza oleaginosa: Vrevicoryne brassicae, pulgón de la col; Phyllotreta cruciferae, escarabajo pulga de las crucíferas; Phyllotreta striolata, escarabajo pulga rayado; Phyllotreta nemorum, escarabajo rayado del nabo; Meligethes aeneus, escarabajo de colza; y los escarabajos del polen Meligethes rufimanus, Meligethes nigrescens, Meligethes canadianus y Meligethes viridescens; Patata: Leptinotarsa decemlineata, escarabajo de la patata de Colorado.

Los métodos y composiciones proporcionados en la presente memoria pueden ser efectivos contra hemípteros tales como Lygus hesperus, Lygus lineolaris, Lygus pratensis, Lygus rugulipennis Popp, Lygus pabulinus, Calocoris norvegicus, Orthops compestris, Plesiocoris rugicollis, Cyrtopeltis modestus, Cyrtopeltis notatus, Spanagonicus albofasciatus, Diaphnocoris chlorinonis, Labopidicola allii, Pseudatomoscelis seriatus, Adelphocoris rapidus, Poecilocapsus lineatus, Blissus leucopterus, Nysius ericae, Nysius raphanus, Euschistus servus, Nezara viridula, Eurygaster, Coreidae, Pyrrhocoridae, Tinidae, Blostomatidae, Reduviidae y Cimicidae. Las plagas de interés también incluyen Araecerus fasciculatus, el gorgojo del grano de café; Acanthoscelides obtectus, picudo del frijol; Bruchus rufmanus, picudo del frijol; Bruchus pisorum, gorgojo del guisante; Zabrotes subfasciatus, picudo mexicano del frijol; Diabrotica balteata, escarabajo rayado del pepino; Cerotoma trifurcata, escarabajo de la hoja de frijol; Diabrotica virgifera, gusano de la raíz del maíz mexicano; Epitrix cucumeris, escarabajo pulga de la patata; Chaetocnema confinis, escarabajo pulga de la batata; Hypera postica, picudo de la alfalfa; Anthonomus quadrigibbus, manzano curculio; Sternchus paludatus, picudo del tallo del frijol; Hypera brunnipennis, picudo egipcio de la alfalfa; Sitophilus granaries, gorgojo granero; Craponius inaequalis, uva curculio; Sitophilus zeamais, picudo del maíz; Conotrachelus nenuphar, ciruela curculio; Euscepes postfaciatus, gorgojo de la batata de las Indias Occidentales; Maladera castanea, escarabajo de jardín asiático; Rhizotrogus majalis, chafer europeo; Macrodactylus subspinosus, chafer rosa; Tribolium confusum, escarabajo de la harina confuso; Tenebrio obscurus, gusano oscuro de la harina; Tribolium castaneum, escarabajo rojo de la harina; Tenebrio molitor, gusano amarillo de la harina.

Los nematodos incluyen nematodos pararitarios tales como nematodos del nudo de la raíz, quistes y lesiones, incluyendo Heterodera spp., Meloidogyne spp., y Globodera spp.; particularmente miembros de los nematodos del quiste, incluyendo, pero no limitados a, Heterodera glycines (nematodo del quiste de la soja); Heterodera schachtii (nematodo del quiste de la remolacha); Heterodera avenae (nematodo del quiste de los cereales); y Globodera rostochiensis y Globodera pailida (nematodos del quiste de la patata). Los nematodos de las lesiones incluyen Pratylenchus spp.

Las plagas de insectos se pueden ensayar para determinar la actividad plaguicida de las composiciones de la divulgación en etapas tempranas de desarrollo, p. ej., como larvas u otras formas inmaduras. Los insectos pueden criarse en oscuridad total a una temperatura de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 30 °C y de aproximadamente un 30 % a aproximadamente un 70 % de humedad relativa. Los bioensayos se pueden realizar como se describe en Czapla y Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83 (6): 2480-2485. Véase también la sección experimental de la presente memoria.

III. Casetes de expresión

Los polinucleótidos que codifican las proteínas plaguicidas proporcionadas en la presente memoria se pueden proporcionar en casetes de expresión para la expresión en un organismo de interés. El casete incluirá secuencias reguladoras en 5' y 3' unidas operativamente a un polinucleótido que codifica un polipéptido plaguicida proporcionado en la presente memoria que permite la expresión del polinucleótido. El casete puede contener adicionalmente al menos un gen o elemento genético adicional para ser cotransformado en el organismo. Cuando se incluyen genes o elementos adicionales, los componentes se unen operativamente. Alternativamente, el o los genes o elementos adicionales se pueden proporcionar en múltiples casetes de expresión. Dicho casete de expresión está provisto de una pluralidad de sitios de restricción y/o sitios de recombinación para que la inserción de los polinucleótidos esté bajo la regulación transcripcional de las regiones reguladoras. El casete de expresión puede contener adicionalmente un gen marcador seleccionable.

El casete de expresión incluirá en la dirección 5'-3' de la transcripción, una región de inicio de la transcripción y traducción (es decir, un promotor), un polinucleótido plaguicida de la divulgación y una región de terminación de la transcripción y traducción (es decir, región de terminación) funcional en el organismo de interés, es decir, una planta o bacteria. Los promotores de la divulgación son capaces de dirigir o impulsar la expresión de una secuencia codificante en una célula huésped. Las regiones reguladoras (es decir, promotores, regiones reguladoras de la transcripción y regiones de terminación de la traducción) pueden ser endógenas o heterólogas para la célula huésped o entre sí. Tal y como se usa en la presente memoria, "heterólogo" en referencia a una secuencia es una secuencia que se origina a partir de una especie foránea o, si es de la misma especie, se modifica sustancialmente de su forma nativa en composición y/o locus genómico por intervención humana deliberada. Tal y como se usa en la presente memoria, un gen quimérico comprende una secuencia codificante unida operativamente a una región de inicio de la transcripción que es heteróloga respecto a la secuencia codificante.

Las regiones de terminación convenientes están disponibles a partir del plásmido Ti de A. tumefaciens, tales como las regiones de terminación de octopina sintasa y nopalina sintasa. Véase también Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262: 141-144; Proudfoot (1991) Cell 64: 671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2: 1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91: 151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; y Joshi et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:9627-9639.

Las señales reguladoras adicionales incluyen, pero no se limitan a, sitios de inicio de inicio de la transcripción, operadores, activadores, potenciadores, otros elementos reguladores, sitios de unión a ribosomas, un codón de inicio, señales de terminación y similares. Véanse, por ejemplo, las Pat. de EE. UU. No. 5.039.523 y 4.853.331; EPO 0480762A2; Sambrook et al. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ed. Maniatis et al. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), de aquí en adelante "Sambrook 11"; Davis et al., eds. (1980) Advanced Bacterial Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory Press), Cold Spring Harbor, N.Y.., y las referencias allí citadas.

Al preparar el casete de expresión, los diversos fragmentos de ADN pueden manipularse para proporcionar las secuencias de ADN en la orientación adecuada y, según corresponda, en el marco de lectura adecuado. Con este fin, pueden emplearse adaptadores o conectores para unir los fragmentos de ADN o pueden estar implicadas otras manipulaciones para proporcionar sitios de restricción convenientes, eliminación de ADN superfluo, eliminación de sitios de restricción, o similares. Para este fin, pueden estar implicadas la mutagénesis in vitro, reparación de cebadores, restricción, hibridación, resustituciones, p. ej., transiciones y transversiones.

Se pueden usar varios promotores en la práctica de la divulgación. Los promotores se pueden seleccionar en función del resultado deseado. Los ácidos nucleicos se pueden combinar con promotores constitutivos, inducibles, preferidos de tejido u otros para la expresión en el organismo de interés. Véanse, por ejemplo, los promotores mostrados en WO 99/43838 y en las Patentes de EE. UU. No: 8.575.425; 7.790.846; 8.147.856; 8.586.832; 7.772,369; 7.534.939; 6.072.050; 5.659.026; 5.608.149; 5.608.144; 5.604.121; 5.569.597; 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463; 5.608.142; y 6,177,611.

Para la expresión en plantas, los promotores constitutivos también incluyen el promotor CaMV 35S (Odell et al. (1985) Nature 313: 810-812); actina de arroz (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2: 163-171); ubiquitina (Christensen et al. (1989) Planta Mol. Biol. 12:619-632 y Christensen et al. (1992) Planta Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3:2723-2730). Los promotores inducibles incluyen aquellos que dirigen la expresión de proteínas relacionadas con la patogénesis (proteínas PR), que se inducen después de la infección por un patógeno. Véase, por ejemplo, Redolfi et al. (1983) Neth. J. Plant Pathol. 89:245-254; Uknes et al. (1992) Plant Cell 4: 645-656; y Van Loon (1985) Planta Mol. Virol. 4:111-116; y WO 99/43819. También se pueden usar promotores que se expresan localmente en o cerca del sitio de infección por patógenos (Marineau et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9:335-342; Matton et al. (1989) Molecular Plant-Microbe Interactions 2:325-331; Somsisch et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2427-2430; Somsisch et al. (1988) Mol. Gen. Genet. 2:93-98; y Yang (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14972-14977; Chen et al. (1996) Plant J. 10: 955-966; Zhang et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2507-2511; Warner et al. (1993) Plant J. 3:191-201; Siebertz et al. (1989) Plant Cell 1: 961-968; Cordero et al. (1992) Physiol. Mol. Plant Path. 41:189-200; Patente de EE. UU. No. 5.750.386 (inducible por nematodos); y las referencias allí citadas).

Los promotores inducibles por heridas pueden usarse en las construcciones de la divulgación. Dichos promotores inducibles por heridas incluyen el promotor pin II (Ryan (1990) Ann. Rev. Phytopath. 28:425-449; Duan et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 494-498); wun1 y wun2 (Patente de EE. UU. No. 5.428.148); win1 y win2 (Stanford et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 215:200-208); sistemina (McGurl et al. (1992) Science 225: 1570-1573); WIP1 (Rohmeier et al. (1993) Planta Mol. Biol. 22:783-792; Eckelkamp et al. (1993) FEBS Letters 323:73-76); gen MPI (Corderok et al. (1994) Plant J. 6(2): 141-150).

Los promotores preferidos de tejido para su uso en la divulgación incluyen los mostrados en Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2):255-265; Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792-803; Hansen et al. (1997) Mol. Gen Genet.

254(3):337-343; Russel et al. (1997) Transgenic Res. 6(2):157-168; Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 112(3):1331-1341; Van Camp et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):525-535; Canevascini et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):513-524; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181-196; Orozco et al. (1993) Plant Mol Biol. 23(6):1129-1138; Matsuoka et al. (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590; y Guevara-Garcia et al. (1993) Plant J. 4(3):495-505.

Los promotores preferidos de las hojas incluyen los mostrados en Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2):255-265; Kwon et al. (1994) Plant Physiol. 105:357-67; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Gotor et al. (1993) Plant J. 3:509-18; Orozco et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23(6):1129-1138; y Matsuoka et al. (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590.

Los promotores preferidos de la raíz son conocidos e incluyen aquellos en Hire et al. (1992) Plant Mol. Biol. 20(2):207-218 (gen de glutamina sintetasa específico de raíz de soja); Keller y Baumgartner (1991) Plant Cell 3(10): 1051-1061 (elemento de control específico de la raíz); Sanger et al. (1990) Plant Mol. Biol. 14(3):433-443 (gen de la manopina sintasa (MAS) de Agrobacterium tumefaciens); y Miao et al. (1991) Plant Cell 3(1): 11-22 (glutamina sintetasa citosólica (GS)); Bogusz et al. (1990) Plant Cell 2(7): 633-641; Leach y Aoyagi (1991) Plant Science (Limerick) 79(1):69-76 (rolC y rolD); Teeri et al. (1989) EMBO J. 8(2):343-350; Kuster et al. (1995) Plant Mol. Biol. 29(4):759-772 (el promotor del gen VfENOD-GRP3); y, Capana et al. (1994) Plant Mol. Biol. 25(4):681-691 (promotor rolB). Véanse también las Patentes de EE. UU. No. 5.837.876; 5.750.386; 5.633.363; 5.459.252; 5.401.836; 5.110.732; y 5.023.179.

Los promotores "preferidos de semillas" incluyen tanto promotores "específicos de semillas" (aquellos promotores activos durante el desarrollo de semillas tales como los promotores de proteínas de almacenamiento de semillas), así como promotores de "germinación de semillas" (aquellos promotores activos durante la germinación de semillas). Véase Thompson et al. (1989) BioEssays 10:108. Los promotores preferidos de semillas incluyen, pero no se limitan a, Cim1 (mensaje inducido por citoquinina); cZ19B1 (zeína de 19 kDa de maíz); milps (mio-inositol-1-fosfato sintasa) (véase WO 00/11177 y la Patente de EE. UU. No. 6.225.529). La gamma-zeína es un promotor específico del endospermo. La globulina 1 (Glb-1) es un promotor específico de embrión representativo. Para las dicotiledóneas, los promotores específicos de semillas incluyen, pero no se limitan a, p-faseolina de judía, napina, p-conglicinina, lectina de soja, cruciferina y similares. Para las monocotiledóneas, los promotores específicos de semillas incluyen, pero no se limitan a, zeína de 15 kDa de maíz, zeína de 22 kDa, zeína de 27 kDa, gamma-zeína, waxy, shrunken 1, shrunken 2, Globulina 1, etc. Véase también WO 00/12733, donde se divulgan los promotores preferidos de semillas de los genes end1 y end2.

Para la expresión en un huésped bacteriano, los promotores que funcionan en bacterias son bien conocidos en la técnica. Dichos promotores incluyen cualquiera de los promotores de genes de proteínas cristalinas conocidos, incluidos los promotores de cualquiera de las proteínas plaguicidas de la divulgación, y promotores específicos para factores sigma de B. thuringiensis. Alternativamente, los promotores de genes que codifican proteínas cristalinas recombinantes o mutagenizados pueden manipularse mediante ingeniería recombinante y usarse para promover la expresión de los nuevos segmentos de genes divulgados en la presente memoria.

El casete de expresión también puede comprender un gen marcador seleccionable para la selección de células transformadas. Los genes marcadores seleccionables se utilizan para la selección de células o tejidos transformados. Los genes marcadores incluyen genes que codifican resistencia a antibióticos, tales como los que codifican neomicina fosfotransferasa II (NEO) e higromicina fosfotransferasa (HPT), así como genes que confieren resistencia a compuestos herbicidas, tales como glufosinato de amonio, bromoxinilo, imidazolinonas y 2,4-diclorofenoxiacetato. (2,4-D). Se conocen marcadores seleccionables adicionales y se puede usar cualquiera de ellos. Véase, por ejemplo, la solicitud Provisional de EE. UU. 62/094.697, presentada el 19 de diciembre, 2014, y la Solicitud Provisional de EE. UU. 62/189.505, presentada el 7 de julio, 2015, que divulga secuencias de resistencia al glufosinato que pueden emplearse como marcadores seleccionables. Véase, por ejemplo, PCT/US2015/066648, presentada el 18 de diciembre, 2015, que divulga secuencias de resistencia al glufosinato que pueden emplearse como marcadores seleccionables.

IV. Métodos, Células Huéspedes y Células Vegetales

Como se indica, las construcciones de ADN que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas plaguicidas o variantes activas o fragmentos de las mismas pueden usarse para transformar plantas de interés u otros organismos de interés. Los métodos de transformación implican la introducción de una construcción de nucleótidos en una planta. Por "introducir" se pretende introducir la construcción de nucleótidos en la planta u otra célula huésped de tal manera que la construcción obtenga acceso al interior de una célula de la planta o de la célula huésped. Los métodos de la divulgación no requieren un método particular para introducir una construcción de nucleótidos en una planta o célula huésped, solo que la construcción de nucleótidos obtenga acceso al interior de al menos una célula de la planta o del organismo huésped. Los métodos para introducir construcciones de nucleótidos en plantas y otras células huésped son conocidos en la técnica, incluidos, pero no limitados a, métodos de transformación estable, métodos de transformación transitoria y métodos mediados por virus.

Los métodos dan como resultado organismos transformados, tales como una planta, incluidas plantas completas, así como órganos de plantas (p. ej., hojas, tallos, raíces, etc.), semillas, células vegetales, propágulos, embriones y progenie de los mismos. Las células vegetales pueden ser diferenciadas o no diferenciadas (p. ej., callos, células en cultivo en suspensión, protoplastos, células de hojas, células de raíz, células de floema, polen).

"Plantas transgénicas" o "plantas transformadas" o plantas o células o tejidos "transformados de forma estable" se refiere a plantas que han incorporado o integrado un polinucleótido que codifica al menos un polipéptido plaguicida de la divulgación. Se reconoce que también se pueden incorporar a la célula vegetal otras secuencias de ácido nucleico exógenas o endógenas o fragmentos de ADN. La transformación mediada por Agrobacterium y biolística siguen siendo los dos enfoques predominantemente empleados. Sin embargo, la transformación se puede realizar mediante infección, transfección, microinyección, electroporación, microproyección, biolística o bombardeo de partículas, electroporación, fibras de sílice/carbono, mediada por ultrasonido, mediada por PEG, coprecipitación con fosfato de calcio, técnica de policatión DMSO, procedimiento de dextrano DEAE, mediada por Agro y virus (caulimorivirus, geminivirus, virus de plantas de ARN), mediada por liposomas y similares.

Los protocolos de transformación, así como los protocolos para introducir secuencias de polipéptidos o polinucleótidos en plantas pueden variar dependiendo del tipo de planta o célula vegetal, es decir, monocotiledónea o dicotiledónea, objetivo de la transformación. Los métodos para la transformación son conocidos en la técnica e incluyen los mostrados en las Patentes de EE. UU. Nos: 8.575.425; 7.692.068; 8.802.934; 7.541.517. Véase también, Rakoczy-Trojanowska, M. (2002) Cell Mol Biol Lett. 7:849-858; Jones et al. (2005) Plant Methods 1:5; Rivera et al. (2012) Physics of Life Reviews 9: 308-345; Bartlett et al. (2008) Plant Methods 4:1-12; Bates, G. W. (1999) Methods in Molecular Biology 111:359-366; Binns y Thomashow (1988) Annual Reviews in Microbiology 42: 575-606; Christou, P. (1992) The Plant Journal 2: 275-281; Christou, P. (1995) Euphytica 85:13-27; Tzfira et al. (2004) TRENDS in Genetics 20:375-383; Yao et al. (2006) Journal of Experimental Botany 57:3737-3746; Zupan y Zambryski (1995) Plant Physiology 107: 1041 -1047; Jones et al. (2005) Plant Methods 1:5.

La transformación puede dar como resultado una incorporación estable o transitoria del ácido nucleico en la célula. “Transformación estable” pretende significar que la construcción de nucleótidos introducida en una célula huésped se integra en el genoma de la célula huésped y es capaz de ser heredada por la progenie de la misma. “Transformación transitoria" pretende significar que un polinucleótido se introduce en la célula huésped y no se integra en el genoma de la célula huésped.

Los métodos para la transformación de cloroplastos son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530; Svab y Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917; Svab y Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606. El método se basa en el suministro con pistola de partículas de ADN que contiene un marcador seleccionable y el direccionamiento del ADN al genoma del plástido a través de la recombinación homóloga. Además, la transformación de plástidos se puede lograr mediante la transactivación de un transgén silencioso transmitido por plástidos mediante la expresión preferida de tejido de una ARN polimerasa codificada en el núcleo y dirigida por plástidos. Dicho sistema ha sido reportado en McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301-7305.

Las células que se han transformado se pueden cultivar en plantas de acuerdo con formas convencionales. Véase, por ejemplo, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5: 81-84. A continuación, estas plantas pueden cultivarse y polinizarse con la misma cepa transformada o con cepas diferentes, e identificarse el híbrido resultante que tiene expresión constitutiva de la característica fenotípica deseada. Se pueden cultivar dos o más generaciones para garantizar que la expresión de la característica fenotípica deseada se mantenga y se herede de manera estable y luego se cosechen las semillas para garantizar que se haya logrado la expresión de la característica fenotípica deseada. De esta manera, la presente divulgación proporciona semillas transformadas (también denominadas "semillas transgénicas") que tienen una construcción de nucleótidos de la divulgación, por ejemplo, un casete de expresión de la divulgación, incorporada de forma estable en su genoma.

En realizaciones específicas, las secuencias proporcionadas en la presente memoria pueden dirigirse a un sitio específico dentro del genoma de la célula huésped o célula vegetal. Dichos métodos incluyen, pero no se limitan a, meganucleasas diseñadas contra la secuencia genómica de la planta de interés (D'Halluin et al. 2013 Plant Biotechnol J); CRISPR-Cas9, TALEN y otras tecnologías para la edición precisa de genomas (Feng, et al. Cell Research 23: 1229-1232, 2013, Podevin, et al. Trends Biotechnology, publicación en línea, 2013, Wei et al., J Gen Genomics, 2013, Zhang et al (2013) WO 2013/026740); recombinación específica del sitio Cre-lox (Dale et al. (1995) Plant J 7: 649-659; Lyznik, et al. (2007) Transgenic Plant J 1:1-9; recombinación FLP-FRT (Li et al. (2009) Plant Physiol 151: 1087-1095); integración mediada por Bxb1 (Yau et al. Plant J (2011) 701: 147-166); integración mediada por dedos de zinc (Wright et al. (2005) Plant J 44: 693-705); Cai et al. (2009) Plant Mol Biol 69: 699-709); y recombinación homóloga (Lieberman-Lazarovich y Levy (2011) Methods Mol Biol 701: 51 -65); Puchta (2002) Plant Mol Biol 48: 173-182).

La secuencia proporcionada en la presente memoria puede usarse para la transformación de cualquier especie de planta, incluyendo, pero no limitadas a, monocotiledóneas y dicotiledóneas. Los ejemplos de plantas de interés incluyen, pero no se limitan a, maíz, sorgo, trigo, girasol, tomate, crucíferas, pimientos, patata, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada y colza, Brassica sp., alfalfa, centeno, mijo, cártamo, maní, batata, mandioca, café, coco, piña, cítricos, cacao, té, plátano, aguacate, higo, guayaba, mango, olivo, papaya, marañón, macadamia, almendra, avena, hortalizas, ornamentales y coníferas.

Las verduras incluyen, pero no se limitan a, tomates, lechuga, judías verdes, habas, guisantes y miembros del género Curcumis, tales como pepino, melón y melón almizclero. Los ornamentales incluyen, pero no se limitan a, azalea, hortensia, hibisco, rosas, tulipanes, narcisos, petunias, clavel, flor de pascua y crisantemo. Preferiblemente, las plantas de la presente divulgación son plantas de cultivo (por ejemplo, maíz, sorgo, trigo, girasol, tomate, crucíferas, pimientos, patata, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada, colza, etc.).

Tal y como se usa en la presente memoria, el término planta incluye células vegetales, protoplastos vegetales, cultivos de tejidos de células vegetales a partir de los cuales se pueden regenerar plantas, callos de plantas, grupos de plantas y células vegetales que están intactas en plantas o partes de plantas, tales como embriones, polen, óvulos, semillas, hojas, flores, ramas, frutos, granos, mazorcas, zuros, cáscaras, tallos, raíces, puntas de raíces, anteras y similares. Se entiende por grano la semilla madura producida por cultivadores comerciales con fines distintos al cultivo o la reproducción de la especie. La progenie, las variantes y los mutantes de las plantas regeneradas también se incluyen dentro del alcance de la divulgación, siempre que estas partes comprendan los polinucleótidos introducidos. Además, se proporciona un producto o subproducto vegetal procesado que retiene las secuencias divulgadas en la presente memoria, que incluye, por ejemplo, harina de soja.

En otra realización, los genes que codifican las proteínas plaguicidas pueden usarse para transformar organismos patógenos de insectos. Dichos organismos incluyen baculovirus, hongos, protozoos, bacterias y nematodos. Se pueden seleccionar héspedes de microorganismos que se sabe que ocupan la "fitosfera" (filoplano, filosfera, rizosfera y/o rizoplano) de uno o más cultivos de interés. Estos microorganismos se seleccionan para que sean capaces de competir con éxito en el entorno particular con los microorganismos de tipo salvaje, proporcionen un mantenimiento y una expresión estables del gen que expresa la proteína plaguicida y, deseablemente, proporcionen una protección mejorada del plaguicida frente a la degradación ambiental e inactivación.

Dichos microorganismos incluyen arqueas, bacterias, algas y hongos. De particular interés son microorganismos tales como bacterias, p. ej., Bacillus, Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc y Alcaligenes. Los hongos incluyen levaduras, p. ej., Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula y Aureobasidium. De particular interés son especies bacterianas de fitosfera tales como Pseudomonas syringae, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobacteria, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus, Clavibacter xyli y Azotobacter vinlandir y especies de levadura de fitosfera tales como Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces rosues, S. odorus, Kluyveromyces veronae, Aureobasidium pollulans, Bacillus thuringiensis, Escherichia coli, Bacillus subtilis y similares.

Los procariotas ilustrativos, tanto gram-negativos como gram-positivos, incluyen Enterobacteriaceae, tales como Escherichia, Erwinia, Shigella, Salmonella y Proteus; Bacillaceae; Rhizobiceae, tales como Rhizobium; Spirillaceae, tales como fotobacterias, Zymomonas, Serratia, Aeromonas, Vibrio, Desulfovibrio, Spirillum; Lactobacillaceae; Pseudomonadaceae, tales como Pseudomonas y Acetobacter; Azotobacteraceae y Nitrobacteraceae. Los hongos incluyen Phycomycetes y Ascomycetes, p. ej., levaduras, tales como Saccharomyces y Schizosaccharomyces; y levadura Basidiomycetes, tales como Rhodotorula, Aureobasidium, Sporobolomyces y similares.

Los genes que codifican proteínas plaguicidas pueden introducirse por medio de electrotransformación, transformación inducida por PEG, choque térmico, transducción, conjugación y similares. Específicamente, los genes que codifican las proteínas plaguicidas se pueden clonar en un vector lanzadera, por ejemplo, pHT3101 (Lerecius et al. (1989) FEMS Microbiol. Letts. 60: 211-218. El vector lanzadera pHT3101 que contiene la secuencia codificante para el gen de la proteína plaguicida particular puede, por ejemplo, transformarse en el Bacillus colonizador de raíces por medio de electroporación (Lerecius et al. (1989) FEMS Microbiol. Letts. 60: 211-218).

Los sistemas de expresión se pueden diseñar para que las proteínas plaguicidas se secreten fuera del citoplasma de las bacterias gram-negativas fusionando un péptido señal apropiado al extremo amino terminal de la proteína plaguicida. Los péptidos señal reconocidos por E. coli incluyen la proteína OmpA (Ghrayeb et al. (1984) EMBO J, 3: 2437-2442).

Las proteínas plaguicidas y variantes activas de las mismas pueden fermentarse en un huésped bacteriano y las bacterias resultantes pueden procesarse y usarse como un aerosol microbiano de la misma manera que las cepas de Bacillus thuringiensis se han usado como aerosoles insecticidas. En el caso de una o unas proteínas plaguicidas que se secretan por Bacillus, la señal de secreción se elimina o muta usando procedimientos conocidos en la técnica. Dichas mutaciones y/o deleciones evitan la secreción de la o las proteínas plaguicidas en el medio de crecimiento durante el proceso de fermentación. Las proteínas plaguicidas se retienen dentro de la célula y luego las células se procesan para producir las proteínas plaguicidas encapsuladas.

Alternativamente, las proteínas plaguicidas se producen introduciendo genes heterólogos en un huésped celular. La expresión del gen heterólogo da lugar, directa o indirectamente, a la producción intracelular y el mantenimiento del plaguicida. Estas células luego se tratan en condiciones que prolongan la actividad de la toxina producida en la célula cuando la célula se aplica al entorno de la o las plagas diana. El producto resultante retiene la toxicidad de la toxina. Estas proteínas plaguicidas encapsuladas de forma natural pueden formularse luego de acuerdo con técnicas convencionales para su aplicación al entorno que alberga una plaga diana, p. ej., suelo, agua y follaje de las plantas. Véase, por ejemplo, la Patente de EE. UU. No. 6.468.523 y la Publicación de EE. UU. No. 20050138685, y las referencias citadas en las mismas. En la presente divulgación, un microorganismo transformado (que incluye organismos completos, células, espora(s), proteína(s) plaguicida(s), componente(s) plaguicida(s), componente(s) que afectan a las plagas, mutante(s), células vivas o muertas y componentes celulares, incluidas mezclas de células vivas y muertas y componentes celulares, e incluidas células rotas y componentes celulares) o una proteína plaguicida aislada puede formularse con un vehículo aceptable en una o unas composiciones plaguicidas o agrícolas que son, por ejemplo, una suspensión, una solución, una emulsión, un polvo para espolvorear, un gránulo dispersable, un polvo humectable y un concentrado emulsionable, un aerosol, un gránulo impregnado, un adyuvante, una pasta que se puede recubrir y también encapsulados, por ejemplo, en sustancias poliméricas .

Las composiciones agrícolas pueden comprender un polipéptido, un polipéptido recombinogénico o una variante o fragmento del mismo, como se describe en la presente memoria. La composición agrícola divulgada en la presente memoria se puede aplicar al entorno de una planta o un área de cultivo, o se puede aplicar a la planta, parte de la planta, célula vegetal o semilla.

Dichas composiciones divulgadas anteriormente pueden obtenerse mediante la adición de un agente tensioactivo, un vehículo inerte, un conservante, un humectante, un estimulante de la alimentación, un atrayente, un agente encapsulante, un aglutinante, un emulsionante, un tinte, un protector UV, un tampón, un agente de flujo o fertilizantes, donantes de micronutrientes u otras preparaciones que influyan en el crecimiento de las plantas. Uno o más agroquímicos que incluyen, pero no se limitan a, herbicidas, insecticidas, fungicidas, bactericidas, nematicidas, molusquicidas, acaracidas, reguladores del crecimiento de las plantas, ayudas para la cosecha y fertilizantes, pueden combinarse con vehículos, tensioactivos o adyuvantes empleados habitualmente en la técnica de formulación u otros componentes para facilitar la manipulación y aplicación del producto para plagas dianas particulares. Los vehículos y adyuvantes adecuados pueden ser sólidos o líquidos y corresponden a las sustancias normalmente empleadas en la tecnología de formulación, p. ej., sustancias minerales naturales o regeneradas, disolventes, dispersantes, agentes humectantes, agentes de pegajosidad, aglutinantes o fertilizantes. Los ingredientes activos de la presente divulgación normalmente se aplican en forma de composiciones y se pueden aplicar al área de cultivo, planta o semilla a tratar. Por ejemplo, las composiciones de la presente divulgación se pueden aplicar al grano en preparación para o durante el almacenamiento en un silo o silo de grano, etc. Las composiciones de la presente divulgación se pueden aplicar simultáneamente o en sucesión con otros compuestos. Los métodos para aplicar un ingrediente activo de la presente divulgación o una composición agroquímica de la presente divulgación que contiene al menos una de las proteínas plaguicidas producidas por las cepas bacterianas de la presente divulgación, incluyen, pero no se limitan a, aplicación foliar, recubrimiento de semillas, y aplicación al suelo. El número de aplicaciones y la tasa de aplicación dependen de la intensidad de la infestación por la plaga correspondiente.

Los agentes tensioactivos adecuados incluyen, pero no se limitan a, compuestos aniónicos tales como un carboxilato de, por ejemplo, un metal; un carboxilato de un ácido graso de cadena larga; un N-acilsarcosinato; mono o diésteres de ácido fosfórico con etoxilatos de alcoholes grasos o sales de dichos ésteres; sulfatos de alcoholes grasos tales como dodecilsulfato de sodio, octadecilosulfato de sodio o cetilsulfato de sodio; sulfatos de alcoholes grasos etoxilados; sulfatos de alquilfenol etoxilados; sulfonatos de lignina; sulfonatos de petróleo; sulfonatos de alquilarilo tales como sulfonatos de alquilbenceno o sulfonatos de alquilnaftaleno inferior, p. ej., sulfonato de butilnaftaleno; sales de condensados de naftaleno-formaldehído sulfonados; sales de condensados de fenol-formaldehído sulfonados; sulfonatos más complejos tales como los sulfonatos de amida, p. ej., el producto de condensación sulfonado de ácido oleico y N-metil taurina; o los sulfosuccinatos de dialquilo, p. ej., el sulfonato de sodio o el succinato de dioctilo. Los agentes no iónicos incluyen productos de condensación de ésteres de ácidos grasos, alcoholes grasos, amidas de ácidos grasos o fenoles grasos sustituidos con alquilo o alquenilo con óxido de etileno, ésteres grasos de éteres de alcoholes polihídricos, p. ej., ésteres de ácidos grasos de sorbitán, productos de condensación de dichos ésteres con óxido de etileno, p. ej., ésteres de ácidos grasos de sorbitán de polioxietileno, copolímeros en bloque de óxido de etileno y óxido de propileno, glicoles acetilénicos tales como 2,4,7,9-tetraetil-5-decin-4,7-diol o glicoles acetilénicos etoxilados . Los ejemplos de un agente tensioactivo catiónico incluyen, por ejemplo, una mono, di o poliamina alifática tal como un acetato, naftenato u oleato; o amina que contiene oxígeno tal como un óxido de amina de polioxietilen alquilamina; una amina unida a amida preparada por la condensación de un ácido carboxílico con una di o poliamina; o una sal de amonio cuaternario.

Los ejemplos de materiales inertes incluyen, pero no se limitan a, minerales inorgánicos tales como caolín, filosilicatos, carbonatos, sulfatos, fosfatos o materiales botánicos tales como corcho, mazorcas de maíz en polvo, cáscaras de cacahuete, cáscaras de arroz y cáscaras de nuez.

Las composiciones de la presente divulgación pueden estar en una forma adecuada para aplicación directa o como un concentrado de composición primaria que requiere dilución con una cantidad adecuada de agua u otro diluyente antes de la aplicación. La concentración del plaguicida variará dependiendo de la naturaleza de la formulación particular, específicamente, si es un concentrado o si se va a usar directamente. La composición contiene del 1 al 98 % de un vehículo inerte sólido o líquido y del 0 al 50 % o del 0,1 al 50 % de un tensioactivo. Estas composiciones se administrarán a la tasa indicada en la etiqueta para el producto comercial, por ejemplo, aproximadamente 4,53 g-2.267,96 g (0,01 lb-5,0 lb) g por 0,40 hectáreas (un acre) cuando está en forma seca y aproximadamente 0,047 l-4,73 l (0,01 pts.-10 pts.) por 0,40 hectáreas (un acre) cuando está en forma líquida.

En una realización adicional, las composiciones, así como los microorganismos transformados y las proteínas plaguicidas, proporcionadas en la presente memoria pueden tratarse antes de la formulación para prolongar la actividad plaguicida cuando se aplican al entorno de una plaga diana, siempre que el pretratamiento no sea perjudicial para la actividad plaguicida. Dicho tratamiento puede ser por medios químicos y/o físicos siempre que el tratamiento no afecte negativamente a las propiedades de la o las composiciones. Los ejemplos de reactivos químicos incluyen, pero no se limitan a, agentes halogenantes; aldehídos tales como formaldehído y glutaraldehído; antiinfecciosos, tales como cloruro de zephiran; alcoholes, tales como isopropanol y etanol; y fijadores histológicos, tales como el fijador de Bouin y el fijador de Helly (véase, por ejemplo, Humason (1967) Animal Tissue Techniques (W.H. Freeman and Co.).

En un aspecto, las plagas se pueden matar o reducir en número en un área determinada mediante la aplicación de las proteínas plaguicidas proporcionadas en la presente memoria al área. Alternativamente, las proteínas plaguicidas se pueden aplicar profilácticamente a un área ambiental para prevenir la infestación por una plaga susceptible. Preferiblemente, la plaga ingiere, o se pone en contacto con, una cantidad del polipéptido efectiva como plaguicida. Por "cantidad efectiva como plaguicida" se entiende una cantidad del plaguicida que es capaz de provocar la muerte de al menos una plaga, o reducir notablemente el crecimiento, la alimentación o el desarrollo fisiológico normal de la plaga. Esta cantidad variará dependiendo de factores tales como, por ejemplo, las plagas diana específicas que se controlarán, el entorno específico, la ubicación, la planta, el cultivo o el sitio agrícola que se tratará, las condiciones ambientales y el método, tasa, concentración, estabilidad y cantidad de aplicación de la composición polipeptídica eficaz como plaguicida. Las formulaciones o composiciones también pueden variar con respecto a las condiciones climáticas, las consideraciones ambientales y/o la frecuencia de aplicación y/o la gravedad de la infestación de plagas.

Los ingredientes activos normalmente se aplican en forma de composiciones y se pueden aplicar al área de cultivo, planta o semilla a tratar. Por lo tanto, se proporcionan métodos para proporcionar a una planta, célula vegetal, semilla, parte de planta o área de cultivo, una cantidad eficaz de la composición agrícola que comprende el polipéptido, polipéptido recombinogénico o una variante activa o fragmento del mismo. Por "cantidad efectiva" se entiende una cantidad de una proteína o composición que tiene actividad plaguicida que es suficiente para matar o controlar la plaga o dar como resultado una reducción notable en el crecimiento, la alimentación o el desarrollo fisiológico normal de la plaga. Dichas disminuciones en número, crecimiento, alimentación o desarrollo normal de la plaga pueden comprender cualquier disminución estadísticamente significativa, incluida, por ejemplo, una disminución de aproximadamente el 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 85 %, 90 %, 95 % o más. Por ejemplo, las composiciones se pueden aplicar al grano en preparación para o durante el almacenamiento en un silo o silo de grano, etc. Las composiciones se pueden aplicar simultáneamente o en sucesión con otros compuestos. Los métodos para aplicar un ingrediente activo o una composición agroquímica que comprende al menos uno de los polipéptidos, polipéptidos recombinogénicos o variantes o fragmentos de los mismos como se divulga en la presente memoria incluyen, pero no se limitan a, aplicación foliar, recubrimiento de semillas y aplicación al suelo.

Se proporcionan métodos para aumentar el rendimiento de las plantas. Los métodos comprenden proporcionar una planta o célula vegetal que exprese un polinucleótido que codifica la secuencia polipeptídica plaguicida divulgada en la presente memoria y cultivar la planta o una semilla de la misma en un campo infestado con (o susceptible de infestación por) una plaga contra la cual dicho polipéptido tiene actividad plaguicida. En algunas realizaciones, el polipéptido tiene actividad plaguicida contra una plaga de lepidópteros, coleópteros, dípteros, hemípteros o nematodos, y dicho campo está infestado con una plaga de lepidópteros, hemípteros, coleópteros, dípteros o nematodos. Tal y como se define en la presente memoria, el "rendimiento" de la planta se refiere a la calidad y/o cantidad de biomasa producida por la planta. Por "biomasa" se entiende cualquier producto vegetal medido. Un aumento en la producción de biomasa es cualquier mejora en el rendimiento del producto vegetal medido. El aumento del rendimiento de las plantas tiene varias aplicaciones comerciales. Por ejemplo, el aumento de la biomasa foliar de las plantas puede aumentar el rendimiento de las hortalizas de hoja para el consumo humano o animal. Además, el aumento de la biomasa foliar se puede usar para aumentar la producción de productos farmacéuticos o industriales derivados de plantas. Un aumento en el rendimiento puede comprender cualquier aumento estadísticamente significativo que incluye, pero no se limita a, al menos un aumento del 1 %, al menos un aumento del 3 %, al menos un aumento del 5 %, al menos un aumento del 10 %, al menos un aumento del 20 %, al menos un 30%, al menos un 50%, al menos un 70%, al menos un 100% o un aumento mayor en el rendimiento en comparación con una planta que no expresa la secuencia plaguicida. En métodos específicos, el rendimiento de la planta aumenta como resultado de la mejora de la resistencia a plagas de una planta que expresa una proteína plaguicida divulgada en la presente memoria. La expresión de la proteína plaguicida da como resultado una capacidad reducida de una plaga para infestar o alimentarse.

Las plantas también pueden tratarse con una o más composiciones químicas, incluyendo uno o más herbicidas, insecticidas o fungicidas.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no a modo de limitación.

Ejemplo 1: descubrimiento de nuevos genes mediante secuenciación y análisis de ADN

Los cultivos microbianos se hicieron crecer en cultivo líquido en medios de laboratorio estándar. Los cultivos se hicieron crecer hasta la saturación (16 a 24 horas) antes de la preparación del ADN. El ADN se extrajo de las células bacterianas mediante lisis con detergente, seguido de unión a una matriz de sílice y lavado con un tampón de etanol. El ADN purificado se eluyó de la matriz de sílice con un tampón acuoso ligeramente alcalino.

El ADN para la secuenciación se analizó en cuanto a pureza y concentración mediante espectrofotometría. Las bibliotecas de secuenciación se prepararon con el kit de preparación de bibliotecas Nextera X^tde acuerdo con el protocolo del fabricante. Los datos de la secuencia se generaron en un HiSeq 2000 de acuerdo con el protocolo de la Guía del usuario del sistema Illumina HiSeq 2000.

Las lecturas de secuenciación se ensamblaron en borradores de genomas usando el paquete de software CLC Bio Assembly Cell. Después del ensamblaje, las llamadas de genes se realizaron mediante varios métodos y las secuencias de genes resultantes se interrogaron para identificar nuevos homólogos de genes de plaguicidas. Se identificaron nuevos genes mediante BLAST, por composición de dominios y por alineación por pares frente a un conjunto diana de genes de plaguicidas. Un resumen de dichas secuencias se muestra en la Tabla 1.

Los genes identificados en la búsqueda de homología se amplificaron a partir de ADN bacteriano mediante PCR y se clonaron en vectores de expresión bacterianos que contenían etiquetas de purificación en marco fusionadas. Los genes clonados se expresaron en E. coli y se purificaron mediante cromatografía en columna. Las proteínas purificadas se evaluaron en estudios de bioensayos de dieta de insectos para identificar proteínas activas.

Ejemplo 2. Expresión Heteróloga en E. Coli

Cada marco de lectura abierto mostrado en las SEQ ID NO: 1-309 (o una variante activa o fragmento del mismo) se clona en un vector de expresión de E. coli que contiene una proteína de unión a maltosa (pMBP). El vector de expresión se transforma en BL21*RIPL. Se inocula un cultivo de LB suplementado con carbenicilina con una única colonia y se cultiva toda la noche a 37 °C usando el 0,5 % del cultivo de toda la noche, se inocula un cultivo fresco y se cultiva hasta la fase logarítmica a 37 °C. El cultivo se induce usando IPTG 250 mM durante 18 horas a 16 °C. Las células se sedimentan y se resuspenden en Tris 10 mM pH 7,4 y NaCl 150 mM suplementado con inhibidores de proteasa. La expresión de la proteína se evalúa por SDS-PAGE.

Ejemplo 3. Actividad plaguicida contra coleópteros y lepidópteros

Expresión de proteínas: Cada secuencia mostrada en las SEQ ID NO: 1-309 (o una variante activa o fragmento de la misma) se expresa en E. coli como se describe en el Ejemplo 2. Se inoculan 400 mL de LB y se cultivan hasta una DO600 de 0,6. El cultivo se induce con IPTG 0,25 mM toda la noche a 16 °C. Las células se centrifugan y el sedimento celular se resuspende en 5 mL de tampón. La resuspensión se sonica durante 2 min en hielo.

Bioensayo: Se adquieren huevos de gusano cogollero (FAW), gusano de la mazorca de maíz (CEW), barrenador europeo del maíz (ECB), barrenador sudoccidental del maíz (SWCB) y polilla de espalda de diamante (DBM) de un insectario comercial (Benzon Research Inc., Carlisle, PA). Los huevos FAW, CEW, ECB y BCW se incuban hasta el punto en que se produce la eclosión dentro de las 12 horas posteriores a la configuración del ensayo. SWCB y DBM se introducen en el ensayo como larvas recién nacidas. Los ensayos se llevan a cabo en bandejas de 24 pocillos que contienen dieta de lepidópteros multiespecie (SOUTHLAND PRODUCTS INCORPORATED, Lake Village, AR). Las muestras del lisado sonicado se aplican a la superficie de la dieta (superposición de la dieta) y se dejan evaporar y penetrar en la dieta. Para CEW, ^fA^w, BCW, ECB y SWCB, se añaden 125 pl de lisado sonicado a la superficie de la dieta y se secan. Para DBM, se añadieron a la superficie de la dieta 50 pl de una dilución 1:2 de lisado sonicado. Las placas de bioensayo se sellan con una película de sellado de placas ventilada con orificios. Las placas se incuban a 26 °C al 65 % de H^ren un ciclo día:noche de 16:8 en un Percival durante 5 días. Los ensayos se evalúan en cuanto al nivel de mortalidad, inhibición del crecimiento e inhibición de la alimentación.

Para el bioensayo del gusano de la raíz del maíz occidental, la construcción/lisado de proteína se evalúa en un bioensayo de insectos dispensando un volumen de 60 pl en la superficie superior de la dieta en pocillos de una placa de 24 pocillos (Cellstar, 24 pocillos, Greiner Bio One) y se dejó secar. Cada pocillo contiene 500 pl de dieta (Marrone et al., 1985). Se introducen de quince a veinte larvas neonatas en cada pocillo usando un pincel de punta fina y se cubre la placa con una membrana (Viewseal, Greiner Bio One). El bioensayo se almacena a temperatura ambiente y se puntúa para la mortalidad y/o la inhibición del crecimiento/alimentación en el día 4.

Para el escarabajo de la patata de Colorado (CPB), se extrae un disco de hoja con sacabocados de corcho No. 8 de la hoja de patata y se sumerge en la construcción de proteína/lisado hasta que esté completamente húmedo y se coloca en la parte superior del disco de filtro (Millipore, filtro de fibra de vidrio, 13 mm). Se añaden sesenta pl de dH2O

a cada disco de filtro y se colocan en cada pocillo de una placa de 24 pocillos (Cellstar, 24 pocillos, Greiner Bio One).

El disco de la hoja se deja secar y se introducen de cinco a siete larvas de primer estadio en cada pocillo usando un pincel de punta fina. La placa se cubre con una membrana (Viewseal, Greiner Bio One) y se perfora un pequeño orificio en cada pocillo de la membrana. La construcción se evalúa con cuatro replicados y se puntúa en cuanto a mortalidad y daño foliar en el día 3.

Ejemplo 4. Actividad plaguicida contra hemípteros

Expresión de proteínas: Cada una de las secuencias mostradas en las SEQ ID NO: 1-309 (o una variante activa o fragmento de la misma) se expresa en E. coli como se describe en el Ejemplo 2. Se inoculan 400 mL de LB y se cultivan hasta una DO600 de 0,6. El cultivo se induce con IPTG 0,25 mM toda la noche a 16 °C. Las células se centrifugan y el sedimento celular se vuelve a suspender en 5 mL de tampón. La resuspensión se sonica durante

2 min en hielo.

Los SGSB de segundo estadio se obtienen de un insectario comercial (Benzon Research Inc., Carlisle, PA). En el bioensayo, se emplea una relación del 50 % v/v de muestra de lisado sonicada al 20 % de sacarosa. El parafilm estirado se usa como membrana de alimentación para exponer el SGSB a la mezcla de dieta/muestra. Las placas se incuban a 25 °C:21 °C, ciclo día:noche 16:8 al 65 % de HR durante 5 días. La mortalidad se puntúa para cada muestra.

Ejemplo 5. Transformación de Soja

Las construcciones de ADN que comprenden cada una de las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,

15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 46 ,47 , 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96 ,97 , 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105,

106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121 , 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146 , 147, 148, 149, 150, 151 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196 , 19 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 218, 219 220,221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 243, 244, 245,246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 266, 267, 268, 269, 270,271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288,

289, 290, 291,292, 293, 294, 295,296, 297, 298, 299, 300, 301,302, 303, 304, 305, 306, 307, 308 y/o 309, o variantes

activas o fragmentos de cualquiera de las mismas, unidas operativamente a un promotor activo en una planta se clonan en vectores de transformación y se introducen en Agrobacterium como se describe en la Solicitud Provisional de EE. UU. No. 62/094.782, presentada el 19 de diciembre de 2015.

Cuatro días antes de la inoculación, se sembraron en estrías varias asas de siembra de Agrobacterium en una placa nueva de medio YEP* suplementado con los antibióticos apropiados** (espectinomicina, cloranfenicol y kanamicina).

Las bacterias se cultivan durante dos días en la oscuridad a 28 °C. Después de dos días, se transfieren varias asas de siembra de bacterias a 3 ml de medio líquido YEP con antibióticos en un matraz Erlenmeyer de 125 ml. Los matraces se colocan en un agitador rotatorio a 250 RPM a 28 °C toda la noche. Un día antes de la inoculación, se transfirieron 2-3 ml del cultivo de toda la noche a 125 ml de YEP con antibióticos en un matraz Erlenmeyer de 500 ml.

Los matraces se colocan en un agitador rotatorio a 250 RPM a 28 °C toda la noche.

Antes de la inoculación, la DO del cultivo bacteriano se comprueba a DO 620. Una DO de 0,8-1,0 indica que el cultivo está en fase logarítmica. El cultivo se centrifuga a 4.000 RPM durante 10 minutos en tubos Oakridge. El sobrenadante se desecha y el sedimento se resuspende en un volumen de Medio de Infección de Soja (SI) para lograr la DO deseada. Los cultivos se mantienen con mezclado periódico hasta que se necesitan para la inoculación.

Dos o tres días antes de la inoculación, las semillas de soja se esterilizan superficialmente usando cloro gaseoso. En una campana extractara, se coloca una placa de Petri con semillas en una campana de cristal sin tapa. Se añaden lentamente 1,75 ml de HCl 12 N a 100 ml de lejía en un matraz Erlenmeyer de 250 ml dentro de la campana de cristal.

La tapa se coloca inmediatamente encima de la campana de cristal. Las semillas se dejan esterilizar durante

14-16 horas (toda la noche). Se retira la tapa de la campana de cristal y se vuelve a colocar la tapa de la placa de

Petri. A continuación, se abre la placa de Petri con la superficie esterilizada en un flujo laminar durante unos 30 minutos para dispersar el cloro gaseoso remanente.

Las semillas se embeben con agua DI estéril o medio de infección de soja (SI) durante 1-2 días. De veinte a 30 semillas se cubren con líquido en una placa de Petri de 100x25 mm y se incuban en la oscuridad a 24 °C. Después de la imbibición, las semillas que no germinan se desechan.

Los explantes cotiledonares se procesan en una placa de papel estéril con papel de filtro estéril humedecido usando medio SI empleando los métodos de la Patente de EE. UU. No. 7.473.822.

Típicamente, se inoculan de 16 a 20 cotiledones por tratamiento. El medio SI usado para mantener los explantes se desecha y se reemplaza con 25 ml de cultivo de Agrobacterium (DO 620 = 0,8-20). Después de sumergir todos los explantes, la inoculación se lleva a cabo durante 30 minutos con agitación periódica de la placa. Después de 30 minutos, se retira el cultivo de Agrobacterium.

Las placas de cocultivo se preparan superponiendo un trozo de papel estéril sobre el medio de cocultivo de soja (SCC). Sin transferencia, los cotiledones inoculados se cultivan con el lado adaxial hacia abajo en el papel de filtro. Se pueden cultivar alrededor de 20 explantes en cada placa. Las placas se sellan con Parafilm y se cultivan a 24C y alrededor de 120 umoles m-2s-1 (en una incubadora Percival) durante 4-5 días.

Después del cocultivo, los cotiledones se lavan 3 veces en 25 ml de Medio de Lavado de Soja con 200 mg/l de cefotaxima y timentina. Los cotiledones se transfieren a papel de filtro estéril y luego se transfieren a Medio de Inducción de Brotes de Soja (SSI). El extremo nodal del explante se hunde ligeramente en el medio con el extremo distal mantenido por encima de la superficie a aproximadamente 45 grados. No se cultivan más de 10 explantes en cada placa. Las placas se envuelven con cinta Micropore y se cultivan en el Percival a 24 °C y alrededor de 120 pmoles m-2s-1.

Los explantes se transfieren a medio SSI nuevo después de 14 días. Los brotes emergentes del ápice del brote y el nudo cotiledonar se descartan. La inducción de brotes se continúa durante otros 14 días en las mismas condiciones.

Después de 4 semanas de inducción de brotes, el cotiledón se separa del extremo nodal y se hace un corte paralelo debajo del área de inducción de brotes (almohadilla de brotes). El área del corte paralelo se coloca en Medio de Elongación de Brotes de Soja (SSE) y los explantes se cultivan en el Percival a 24 °C y alrededor de 120 pmoles m-2s-1. Esta etapa se repite cada dos semanas durante hasta 8 semanas mientras los brotes continúen elongándose.

Cuando los brotes alcanzan una longitud de 2-3 cm, se transfieren a Medio de Enraizamiento de Soja (SR) en un recipiente Plantcon y se incuban en las mismas condiciones durante 2 semanas o hasta que las raíces alcanzan una longitud de alrededor de 3-4 cm. Después de esto, las plantas se transfieren al suelo.

Tenga en cuenta que todos los medios mencionados para la transformación de la soja se encuentran en Paz et al. (2010) Transformación de soja mediada por Agrobacterium y recuperación de plantas de soja transgénicas; Instalación de Transformación de Plantas de la Universidad Estatal de Iowa. (Véase, agronwww.agron.iastate.edu/ptf/protocol/Soybean.pdf.)

Ejemplo 6. Transformación de Maíz

Las mazorcas de maíz se recolectan mejor 8-12 días después de la polinización. Los embriones se aíslan de las mazorcas, y se prefieren aquellos embriones de 0,8-1,5 mm de tamaño para su uso en la transformación. Los embriones se siembran en placa con el escutelo hacia arriba en un medio de incubación adecuado, tal como el medio DN62A5S (3,98 g/L de sales N6; 1 mL/L (de 1.000 veces la preparación madre) de vitaminas N6; 800 mg/L de L-asparagina; 100 mg /L de Mio-inositol; 1,4 g/L de L-Prolina; 100 mg/L de Casaminoácidos; 50 g/L de sacarosa; 1 mL/L (de preparación madre a 1 mg/mL) de 2,4-D). Sin embargo, los medios y sales distintos de DN62A5S son adecuados y se conocen en la técnica. Los embriones se incuban toda la noche a 25 °C en la oscuridad. Sin embargo, no es necesario per se incubar los embriones toda la noche.

Los explantes resultantes se transfieren a cuadrados de malla (30-40 por placa), se transfieren a medios osmóticos durante aproximadamente 30-45 minutos y luego se transfieren a una placa radiante (véase, por ejemplo, la Publicación PCTNo. WO/01/38514 y la Pat. de EE. UU. No. 5.240.842). Las construcciones de ADN diseñadas para expresar una cualquiera de las SEQ ID NO: 1-309 o una variante activa o fragmento de la misma en células vegetales se aceleran en tejido vegetal usando un acelerador de haz de aerosol, usando condiciones esencialmente como se describe en la Publicación PCT No. WO/01/38514. Después de la radiación, los embriones se incuban durante aproximadamente 30 min en medios osmóticos y se colocan en medios de incubación toda la noche a 25 °C en la oscuridad. Para evitar dañar indebidamente los explantes radiados, se incuban durante al menos 24 horas antes de transferirlos a medios de recuperación. A continuación, los embriones se distribuyen en medios del período de recuperación, durante aproximadamente 5 días, 25 °C en la oscuridad, y luego se transfieren a un medio de selección. Los explantes se incuban en medios de selección durante hasta ocho semanas, dependiendo de la naturaleza y las características de la selección particular utilizada. Después del período de selección, el callo resultante se transfiere a medios de maduración de embriones, hasta que se observa la formación de embriones somáticos maduros. Los embriones somáticos maduros resultantes se colocan luego bajo luz tenue y el proceso de regeneración se inicia mediante métodos conocidos en la técnica. Los brotes resultantes se dejan enraizar en medios de enraizamiento y las plantas resultantes se transfieren a macetas de vivero y se propagan como plantas transgénicas.

Ejemplo 7. Actividad plaguicida contra nematodos.

A. Ensayo in vitro de Heterodera glycine (nematodo del quiste de la soja)

Los nematodos del quiste de la soja se dispensan en una placa de ensayo de 96 pocillos con un volumen total de

100 ul y 100 J2 por pocillo. La proteína de interés como se muestra en una cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5,

6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 , 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37,

38, 39, 40, 41, 42, 43 ,44 , 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68 ,

69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93 , 94, 95, 96, 97, 98, 99,

100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118 119 120 121 122 123

124 125126127128129 130131 132133134135136 137138139140141 142143144, 145, 146, 147, 148, 149,

150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168 169170, 171 172173

174 175176177178179180181 182183184185186187188 189190 191 192193 , 194, 195, 196, 197, 198, 199,

200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218,218, 219, 220, 221,

222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242,243, 244,

245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267 ,

268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290,

291, 292 , 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308 y/o 309, o una variante activa o fragmento de cualquiera de las mismas, se dispensa en los pocillos y se mantienen a temperatura ambiente para su evaluación. Finalmente, se analiza la motilidad de la placa de 96 pocillos que contiene el SCN J2. Los datos se informan como % de inhibición en comparación con los controles. Los aciertos se definen como mayores o iguales al 70 % de inhibición.

B. Ensayo en planta de Heterodera glycine (nematodo del quiste de la soja)

Se generan plantas de soja que expresan uno o más de las SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,

16, 17, 18, 19, 20 ,21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 ,46 ,

47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 , 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77,

78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106,

107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120 , 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145 , 146, 147, 148, 149, 150, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195 , 196, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 218, 219,220,

221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244,245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266,

267, 268, 269,270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289,

290, 291,292, 293, 294,295, 296, 297, 298, 299, 300, 301,302, 303, 304, 305, 306, 307, 308 y/o 309, o una variante activa o fragmento de cualquiera de ellas, como se describe en otra parte de la presente memoria. Un esqueje de soja de 3 semanas de edad se inocula con 5.000 huevos de SCN por planta. Esta infección se mantiene durante 70 días y luego se cosecha para contar el quiste SCN que se ha desarrollado en la planta. Los datos se informan como % de inhibición en comparación con los controles. Los aciertos se definen como mayores o iguales al 90 % de inhibición.

C: Ensayo in vitro de Meloidogyne incognita (Nematodo del Nudo de la Raíz)

Los nematodos del nudo de la raíz se dspensan en una placa de ensayo de 96 pocillos con un volumen total de

100 ul y 100 J2 por pocillo. La proteína de interés que comprende una cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6,

7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69,

70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100,

101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123,

124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146,

147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169,

170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192,

193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215,

216, 217, 218, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237,

238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260,

261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283,

284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306,

307, 308 y/o 309, o una variante activa o fragmento de cualquiera de ellas, se dispensa en los pocillos y se mantuvo a temperatura ambiente para su evaluación. Finalmente, se analiza la motilidad de la placa de 96 pocillos que contiene el RKN J2. Los datos se informan como % de inhibición en comparación con los controles. Los aciertos se definen como mayores o iguales al 70 % de inhibición.

D. Ensayo en planta de Meloidogyne incógnita (Nematodo del Nudo de la Raíz)

Se generan plantas de soja que expresan una o más de las SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,

16, 17, 18, 19, 20 ,21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45,46,

78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95,96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106,

107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120 , 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129,

130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145 , 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152,

153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195 , 196, 197, 198,

199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 218, 219,220,

290, 291,292, 293, 294,295, 296, 297, 298, 299, 300, 301,302, 303, 304, 305, 306, 307, 308 y/o 309, o una variante activa o fragmento de cualquiera de ellas, como se describe en otra parte de la presente memoria. Una soja de 3 semanas de edad se inocula con 5.000 huevos de RKN por planta. Esta infección se mantiene durante 70 días y luego se recolecta para contar los huevos de RKN que se han desarrollado en la planta. Los datos se informan como % de inhibición en comparación con los controles. Los aciertos se definen como mayores o iguales al 90 % de inhibición.

Ejemplo 7. Ensayos adicionales para determinar la actividad plaguicida

Los diversos polipéptidos mostrados en las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,

20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50,

51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,

82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109,

110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 13 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 1 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 17 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 2 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 218, 219, 220, 221, 222, 2 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 2 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 2 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 2 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308 y/o 309, o una variante activa o fragmento de cualquiera de ellas puede probarse para actuar como plaguicida sobre una plaga de varias maneras.

Uno de dichos métodos es realizar un ensayo de alimentación. En un ensayo de alimentación de este tipo, se expone la plaga a una muestra que contiene compuestos a ensayar o muestras de control. A menudo, esto se realiza colocando el material que se va a analizar, o una dilución adecuada de dicho material, sobre un material que la plaga ingerirá, tal como una dieta artificial. El material a ensayar puede estar compuesto por un líquido, un sólido o una suspensión de sólidos. El material a ensayar puede colocarse sobre la superficie y luego dejarse secar.

Alternativamente, el material a ensayar puede mezclarse con una dieta artificial fundida y luego dispensarse en la cámara de ensayo. La cámara de ensayo puede ser, por ejemplo, una copa, una placa o un pocillo de una placa de microtitulación.

Los ensayos para plagas chupadoras (por ejemplo, áfidos) pueden implicar separar el material de prueba del insecto mediante un tabique, idealmente una parte que pueda ser perforada por las partes bucales chupadoras del insecto chupador, para permitir la ingestión del material de prueba. A menudo, el material de prueba se mezcla con un estimulante de la alimentación, tal como sacarosa, para promover la ingestión del compuesto de prueba.

Otros tipos de ensayos pueden incluir la microinyección del material de prueba en la boca o el intestino de la plaga, así como el desarrollo de plantas transgénicas, seguido de una prueba de la capacidad de la plaga para alimentarse

de la planta transgénica. Las pruebas de plantas pueden implicar el aislamiento de las partes de la planta que normalmente se consumen, por ejemplo, pequeñas jaulas adheridas a una hoja o el aislamiento de plantas enteras en jaulas que contienen insectos.

En la técnica, se conocen otros métodos y enfoques para ensayar plagas y se pueden encontrar, por ejemplo, en Robertson y Preisler, eds. (1992) Pesticide bioassays with arthropods, CRC, Boca Raton, Fla. Alternativamente, los ensayos se describen comúnmente en las revistas Arthropod Management Tests y Journal of Economic Entomology o por discusión con miembros de la Sociedad Entomológica Americana (ESA). Una cualquiera de las SEQ ID NO: 1

309 puede expresarse y emplearse en un ensayo como se muestra en los Ejemplos 3 y 4, en la presente memoria.

Ejemplo 8. Actividad plaguicida contra coleópteros y lepidópteros

Expresión de proteínas: Cada secuencia mostrada en la Tabla 3 se expresó en E. coli como se describe en el Ejemplo

2. Se inocularon 400 mL de LB y se cultivaron hasta una DO600 de 0,6. El cultivo se indujo con IPTG 0,25 mM toda

la noche a 16 °C. Las células se centrifugaron y el sedimento celular se resuspendió en 5 mL de tampón. La resuspensión se sonicó durante 2 min en hielo.

Bioensayo: Se adquieren huevos de gusano cogollero (FAW), gusano de la mazorca de maíz (CEW), barrenador europeo del maíz (ECB), barrenador sudoccidental del maíz (SWCB) y polilla de espalda de diamante (DBM o Px) de un insectario comercial (Benzon Research Inc., Carlisle, PA). Los huevos de FAW, CEW, ECB y BCW se incubaron hasta el punto en que se produciría la eclosión dentro de las 12 h posteriores a la configuración del ensayo. SWCB y DBM se introdujeron en el ensayo como larvas recién nacidas. Los ensayos se llevaron a cabo en bandejas de 24 pocillos que contenían dieta de lepidópteros multiespecie (Southland Products Inc., Lake Village, AR). Se aplicaron muestras del lisado sonicado a la superficie de la dieta (superposición de la dieta) y se dejó que se evaporaran y penetraran en la dieta. Para CEW, FAW, BCW, ECB y SWCB, se añadieron 125 pl de lisado sonicado a la superficie de la dieta y se secaron. Para DBM, se añadieron a la superficie de la dieta 50 pl de una dilución 1:2 de lisado sonicado. Las placas de bioensayo se sellaron con una película de sellado de placas ventilada con perforaciones. Las placas se incubaron a 26 °C con una humedad relativa (HR) del 65 % en un ciclo día:noche de 16:8 en un Percival durante 5 días. Los ensayos se evaluaron en cuanto al nivel de mortalidad, inhibición del crecimiento e inhibición de la alimentación.

Para el bioensayo del gusano de la raíz del maíz occidental (WCR), la construcción/lisado de proteína se evaluó en un bioensayo de insectos mediante la dispensación de un volumen de 60 pl en la superficie superior de la dieta en pocillo(s) de una placa de 24 pocillos (Cellstar, 24 pocillos, Greiner Bio Uno) y se deja secar. Cada pocillo contenía 500 pl de dieta (Marrone et al., 1985). Se introdujeron de quince a veinte larvas neonatas en cada pocillo usando un pincel de punta fina y se cubrió la placa con una membrana (Viewseal, Greiner Bio One). El bioensayo se almacenó a temperatura ambiente y se puntuó para la mortalidad y/o la inhibición del crecimiento/alimentación en el día 4.

Para el escarabajo de la patata de Colorado (CPB), se extrae un disco de hoja con sacabocados de corcho No. 8 de la hoja de patata y se sumerge en la construcción de proteína/lisado hasta que esté completamente húmedo y se coloca en la parte superior del disco de filtro (Millipore, filtro de fibra de vidrio, 13 mm). Se añadieron 60 pl de dH2o a cada disco de filtro y se colocaron en cada pocillo de una placa de 24 pocillos (Cellstar, 24 pocillos, Greiner Bio One). Se dejó secar el disco de la hoja y se introdujeron de cinco a siete larvas de primer estadio en cada pocillo usando un pincel de punta fina. La placa se cubrió con una membrana (Viewseal, Greiner Bio One) y se perforó un pequeño orificio en cada pocillo de la membrana. La construcción se evaluó con cuatro replicados y se puntuó en cuanto a mortalidad y daño foliar en el día 3.

La Tabla 3 proporciona un resumen de la actividad plaguicida contra coleópteros y lepidópteros de las diversas secuencias. Código de tabla: indica que no se ha visto actividad; "+" indica actividad plaguicida; "NT" indica no probado; "S" indica retraso; "SS" indica ligero retraso; "LF" indica baja alimentación; "M" indica mortalidad.

Tabla 3. Resumen de actividad plaguicida contra coleópteros y lepidópteros.

Ejemplo 9. Actividad plaguicida contra hemípteros

Expresión de proteínas: Cada una de las secuencias mostradas en la Tabla 4 se expresó en E. coli como se describe en el Ejemplo 2. Se inocularon 400 mL de LB y se cultivaron hasta una DO600 de 0,6. El cultivo se indujo con IPTG 0,25 mM toda la noche a 16 °C. Las células se centrifugaron y el sedimento celular se resuspendió en 5 mL de tampón. La resuspensión se sonicó durante 2 min en hielo.

La chinche apestosa verde del sur de segundo estadio (SGSB) se obtuvo de un insectario comercial (Benzon Research Inc., Carlisle, PA). En el bioensayo se empleó una relación del 50 % v/v de muestra de lisado sonicada al 20 % de sacarosa. Se usó parafilm estirado como membrana de alimentación para exponer el SGSB a la mezcla de dieta/muestra. Las placas se incubaron a 25 °C:21 °C, ciclo día:noche 16:8 al 65 % de HR durante 5 días.

Se puntuó la mortalidad para cada muestra. Los resultados se muestran en la Tabla 4. Una línea discontinua indica que no se detectó mortalidad. Las proteínas enumeradas en la Tabla 4 mostraron desde aproximadamente un 10 % hasta aproximadamente un 100 % de mortalidad, un 25 % de mortalidad o un 50 % de mortalidad (como se indica) contra la chinche apestosa verde del sur (murió 1 chinche apestosa de 4). Los controles negativos (dominio de unión expresado en vector vacío y tampón solamente) no mostraron mortalidad (0 chinches apestosas de 4).

Tabla 4. Resumen de actividad plaguicida contra hemípteros

Las SEQ ID NO. 2, 5, 9, 10, 12, 16, 17, 19, 20, 23, 28, 29, 31, 33, 34, 35, 38, 40, 41, 42, 44, 46, 58, 72, 78, 80, 83, 85, 88, 95, 100, 102, 104, 106, 117, 119, 123, 125, 129, 131, 137, 140, 146, 148, 150, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 166, 173, 177, 181, 182, 193, 200, 201,203, 207, 216, 217 y 238 se probaron y no tuvieron actividad en este experimento.

Ejemplo 10. Actividad plaguicida contra el pulgón de la soja

Los pulgones de la soja (SBA) se obtienen de la Universidad Estatal de Michigan. Se añaden seis pulgones adultos a cada pocillo de una placa de 24 pocillos. Las proteínas purificadas se proporcionan en dieta artificial líquida a razón del 25 % (50 ul de proteína, 150 ul de dieta artificial), y se sellan con una membrana artificial a través de la cual los pulgones pueden alimentarse. Las placas se mantienen en una incubadora a 26 °C, 60 % HR, 16:8 ciclo día:noche durante 5 días.

La mortalidad, la alimentación y la reproducción se puntúan para cada muestra en los días 3, 4 y 5 posteriores al tratamiento. La mortalidad se calcula como el porcentaje muerto de los 6 pulgones adultos originales. A las actividades de alimentación y reproducción se les asigna una puntuación en una escala de 0-3 puntos, siendo 0 ninguna alimentación o reproducción y 3 una alta alimentación o reproducción. La alimentación se mide como la cantidad de melaza (excreciones líquidas producidas por pulgones) que se acumula en cada pocillo. La reproducción es el número de pulgones inmaduros vivos que se observan en cada pocillo. Los datos de mortalidad, alimentación y reproducción se evalúan usando un sistema de puntuación combinado para establecer niveles de punto de corte para la actividad. La puntuación combinada se calcula como: Puntuación combinada = (Alimentación Reproducción Puntuación de Mortalidad)/3, donde Puntuación de Mortalidad = 3 - (3 x % de Mortalidad/100).

Tabla 5. Puntos de corte usados para calificar los pocillos individuales como activos o no para cada día de observación posterior a la introducción de pulgones en los pocillos de ensayo. Un pocillo se considera activo si la medida < punto de corte.

Ejemplo 11. Actividad plaguicida contra el pulgón de la soja

Expresión de proteínas: Cada secuencia mostrada en la Tabla 7 (o una variante activa o fragmento de la misma) se expresó en E. coli como se describe en el Ejemplo 2. Se inocularon 400 mL de LB y se cultivaron hasta una DO600 de 0,6. El cultivo se indujo con IPTG 0,25 mM toda la noche a 16 °C. Las células se centrifugaron y el sedimento celular se resuspendió en 5 mL de tampón. La resuspensión se sonicó durante 2 min en hielo.

Los pulgones de la soja (SBA) se obtuvieron de la Universidad Estatal de Michigan. Se añadieron seis pulgones adultos a cada pocillo de una placa de 24 pocillos. Las proteínas purificadas se proporcionaron en dieta artificial líquida a razón del 25 % (50 ul de proteína, 150 ul de dieta artificial), y se sellaron con una membrana artificial a través de la cual los pulgones pueden alimentarse. Las placas se mantuvieron en una incubadora a 26 °C, 60 % HR, 16:8 ciclo día:noche durante 5 días.

La mortalidad, la alimentación y la reproducción se puntuaron para cada muestra en los días 3, 4 y 5 posteriores al tratamiento. La mortalidad se calculó como el porcentaje muerto de los 6 pulgones adultos originales. A las actividades de alimentación y reproducción se les asignó una puntuación en una escala de 0-3 puntos, siendo 0 ninguna alimentación o reproducción y 3 una alta alimentación o reproducción. La alimentación se midió como la cantidad de melaza (excreciones líquidas producidas por pulgones) que se acumulaba en cada pocillo. La reproducción fue el número de pulgones inmaduros vivos que se observaron en cada pocillo. Los datos de mortalidad, alimentación y reproducción se evaluaron usando un sistema de puntuación combinado para establecer niveles de punto corte para la actividad. La puntuación combinada se calculó como:

Puntuación Combinada = (Alimentación Reproducción Puntuación de Mortalidad)/3, donde Puntuación de Mortalidad = 3 -(3 x % de Mortalidad/100). Los resultados se muestran en la Tabla 7. "+" indica actividad plaguicida.

Tabla 6. Puntos de corte usados para calificar los pocillos individuales como activos o no para cada día de observación posterior a la introducción de pulgones en los pocillos de ensayo. Un pocillo se considera activo si la medida < punto de corte.

Tabla 7. Resumen de la actividad plaguicida contra el pulgón de la soja

Las SEQ ID NO: 1, 3, 4, 5, 14, 19, 20, 23, 24, 29, 31, 36, 39, 40, 41, 42, 44, 46, 48, 51, 53, 57, 61, 64, 65, 67, 70, 72, 74, 76, 77, 78, 79, 80, 83, 88, 89, 90, 94, 95, 98, 100, 104, 107, 109, 112, 113, 114, 115, 118, 119, 121, 122, 123, 126, 127, 129, 132, 133, 135, 137, 138, 140, 142, 144, 146, 147, 148, 150, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 162, 163, 164, 166, 169, 170, 174, 175, 177, 181, 182, 184, 188, 193, 194, 195, 196, 198, 199, 200, 201, 203, 205, 207, 212, 215, 216, 217, 218, 219, 222, 223, 224, 225, 226, 230, 232, 233, 237, 238, 240, 242, 245, 246, 251, 252, 255, 256, 257, 259, 260, 261, 262, 263, 265, 267, 268, 269, 272, 281, 284, 288, 290, 292, 300, 306, 307 y 308 se probaron y no tuvieron actividad en este experimento.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido recombinante que tiene actividad plaguicida, que comprende:

(b) la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 186.

2. El polipéptido de la reivindicación 1, que comprende además una secuencia de aminoácidos heteróloga.

3. Una composición que comprende el polipéptido de la reivindicación 1 o 2.

(b) la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 186;

5. La molécula de ácido nucleico recombinante de la reivindicación 4, en donde dicha molécula de ácido nucleico recombinante es una secuencia sintética diseñada para la expresión en una planta.

6. La molécula de ácido nucleico recombinante de la reivindicación 4 o 5, en donde dicho promotor heterólogo es capaz de dirigir la expresión en una célula vegetal.

7. La molécula de ácido nucleico recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 4-6, en donde dicho promotor heterólogo es capaz de dirigir la expresión en una bacteria.

8. Una célula huésped que comprende la molécula de ácido nucleico recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 4-7.

9. La célula huésped de la reivindicación 8, en donde dicha célula huésped es una célula huésped bacteriana.

10. Una construcción de ADN que comprende un promotor que dirige la expresión en una célula vegetal unido operativamente a una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica

(a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 186, en donde el polipéptido retiene la actividad plaguicida de la SEQ ID NO: 186; o

11. La construcción de ADN de la reivindicación 10, en donde dicha secuencia de nucleótidos es una secuencia de ADN sintética diseñada para la expresión en una planta.

12. Un vector que comprende la construcción de ADN de la reivindicación 10 u 11.

13. Una célula huésped que comprende la construcción de ADN de la reivindicación 10 u 11 o el vector de la reivindicación 12.

14. Una composición que comprende la célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 8, 9 o 13.

15. La composición de la reivindicación 14, en donde dicha composición se selecciona del grupo que consiste en polvo, bolitas, gránulos, pulverización, emulsión, coloide y solución.

16. Un método para controlar una población de plagas que comprende poner en contacto dicha población de plagas con una cantidad efectiva como plaguicida de la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 3 o 14-15.

17. Un método para producir un polipéptido con actividad plaguicida que comprende cultivar la célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 8, 9 o 13 en condiciones en las que se expresa la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido.

19. Una semilla transgénica de la planta de la reivindicación 18, en donde la semilla transgénica comprende la construcción de ADN de la reivindicación 18.

21. El método de la reivindicación 20, en donde dicha planta produce un polipéptido plaguicida que tiene actividad plaguicida contra al menos una plaga de lepidópteros, una plaga de coleópteros o una plaga de hemípteros.

22. Un método para aumentar el rendimiento en una planta que comprende cultivar en un campo una planta o semilla de la misma que tiene incorporada de forma estable en su genoma una construcción de ^aDⁿque comprende un promotor que dirige la expresión en una planta unido operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido plaguicida, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica: