ES2944559T3 - Formación de imágenes de grupos basadas en el tiempo de fragmentos de bibliotecas de ADN genómico con la contigüidad preservada - Google Patents

Formación de imágenes de grupos basadas en el tiempo de fragmentos de bibliotecas de ADN genómico con la contigüidad preservada Download PDF

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Abstract

En un método de ejemplo, se genera una serie de imágenes de agrupamiento basadas en el tiempo para una pluralidad de fragmentos de biblioteca de una muestra de genoma. Cada imagen de agrupamiento basada en el tiempo de la serie se genera secuencialmente. Para generar cada imagen de agrupamiento basada en el tiempo en la serie: i) se introduce una muestra respectiva en una celda de flujo, la muestra respectiva incluye fragmentos de biblioteca preservados por contigüidad de la pluralidad de fragmentos de biblioteca, en el que los fragmentos de la biblioteca conservados en contigüidad se unen a un soporte sólido o se unen entre sí; ii) los fragmentos de biblioteca conservados en contigüidad se liberan del soporte sólido o entre sí; iii) los fragmentos de la biblioteca conservados en contigüidad se amplifican para generar una pluralidad de cadenas molde respectivas; iv) se tiñen las hebras molde respectivas; yv) se obtienen imágenes de las hebras de plantilla respectivas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Formación de imágenes de grupos basadas en el tiempo de fragmentos de bibliotecas de ADN genómico con la contigüidad preservada
Antecedentes
Existe una variedad de métodos y aplicaciones para los que es deseable generar una biblioteca de moléculas de ácido desoxirribonucleico (ADN) fragmentadas y marcadas a partir de moléculas de ADN bicatenario (ADNbc). A menudo, el objetivo es generar moléculas de ADN más pequeñas (p. ej., fragmentos de ADN) a partir de moléculas de ADNbc más grandes para usarlas como moldes en reacciones de secuenciación de ADN. Los moldes pueden permitir obtener longitudes de lectura cortas. Las lecturas de secuencia corta generalmente se superponen con otras lecturas de secuencia corta para proporcionar una cobertura redundante en diferentes partes de la secuencia general más larga. Durante el análisis de datos, las secuencias superpuestas de numerosas lecturas se pueden usar para reconstruir la información de la secuencia más larga. Como tal, las lecturas de secuencia corta superpuestas se pueden alinear para reconstruir las secuencias de ácido nucleico más largas. En algunos casos, se pueden usar etapas de secuenciación previa (como marcaje con códigos de barras de moléculas de ácido nucleico particulares) para simplificar el análisis de datos.
El documento US 2017/292147 A1 describe un método de secuenciación del genoma completo resuelto por haplotipo mediante transposición que conserva la contigüidad e indexación combinatoria.
Introducción
Un primer aspecto descrito en la presente memoria es un método que comprende generar una serie de imágenes de agrupamiento basadas en el tiempo de una pluralidad de fragmentos de biblioteca con la contigüidad preservada a partir de una muestra de genoma, en donde cada imagen de agrupamiento basada en el tiempo de la serie se genera secuencialmente: introduciendo, en un celda de flujo, una muestra respectiva que incluye algunos de los fragmentos de biblioteca con la contigüidad preservada, en donde algunos de los fragmentos de biblioteca con la contigüidad preservada están unidos a un soporte sólido o están unidos entre sí; iniciar la liberación de algunos de los fragmentos de biblioteca con la contigüidad preservada del soporte sólido o entre sí; amplificar algunos de los fragmentos de biblioteca con la contigüidad preservada para generar una pluralidad de cadenas molde respectivas; teñir las cadenas molde respectivas; y obtener imágenes de las cadenas molde respectivas.
Un segundo aspecto descrito en la presente memoria es un método que comprende preparar una mezcla que incluye una pluralidad de fragmentos de biblioteca con la contigüidad preservada de una muestra de genoma, estando la pluralidad de fragmentos de biblioteca con la contigüidad preservada unidos a soportes sólidos o unidos entre sí; diluir la mezcla para generar un número predeterminado de muestras de dilución para introducirlas en una celda de flujo; y generar una imagen de agrupamiento basada en el tiempo para al menos uno de los fragmentos de biblioteca con la contigüidad preservada: introduciendo una primera de las muestras de dilución que incluye algunos de los fragmentos de biblioteca con la contigüidad preservada en la celda de flujo; iniciar la liberación de algunos de los fragmentos de biblioteca con la contigüidad preservada del soporte sólido o entre sí; amplificar algunos de los fragmentos de biblioteca con la contigüidad preservada para generar una pluralidad de cadenas molde; teñir la pluralidad de cadenas molde; y obtener imágenes de la pluralidad de cadenas molde.
Un tercer aspecto descrito en la presente memoria es un sistema que comprende un receptáculo de celda de flujo; un sistema de control de fluídica que incluye fluídica de suministro para suministrar respectivamente una muestra de dilución y una tinción a una celda de flujo colocada en el receptáculo de la celda de flujo; un sistema de iluminación colocado para iluminar la celda de flujo colocada en el receptáculo de la celda de flujo; un sistema de detección colocado para capturar una imagen de la celda de flujo colocada en el receptáculo de la celda de flujo; y un controlador en comunicación operativa con el sistema de control de fluídica, el sistema de iluminación y el sistema de detección, sirviendo el controlador para: hacer que la fluídica de suministro introduzca la muestra de dilución en la celda de flujo colocada en el receptáculo de la celda de flujo; hacer que la fluídica de suministro introduzca la tinción en la celda de flujo colocada en el receptáculo de la celda de flujo después de que se generen cadenas molde en la celda de flujo colocada en el receptáculo de la celda de flujo a partir de fragmentos de biblioteca con la contigüidad preservada presentes en la muestra de dilución; hacer que el sistema de iluminación ilumine las cadenas molde teñidas en la celda de flujo colocada en el receptáculo de la celda de flujo; y hacer que el sistema de detección genere imágenes de las cadenas molde teñidas e iluminadas en la celda de flujo colocada en el receptáculo de la celda de flujo.
Debe entenderse que cualquier característica del primer método y/o del segundo método y/o del sistema descrito en la presente memoria puede combinarse de cualquier manera y/o configuración deseables y/o con cualquiera de los ejemplos descritos en la presente memoria para lograr los beneficios descritos en la presente descripción, que incluye, por ejemplo, la identificación de un grupo particular de cadenas molde usando una imagen de grupo resuelta.
Breve descripción de los dibujos
Las características de los ejemplos de la presente descripción se harán evidentes como referencia a la siguiente descripción detallada y los siguientes dibujos, en los cuales los mismos números de referencia corresponden a componentes similares, aunque quizás no idénticos. En aras de la brevedad, los números de referencia o las características cuya función ya se haya descrito anteriormente podrán o no describirse en relación con otros dibujos en los que aparezcan.
La Fig. 1 es una ilustración esquemática de un ejemplo de un método para hacer un ejemplo de un complejo que incluye fragmentos de biblioteca con la contigüidad preservada unidos a un soporte sólido;
Las Figs. 2A a 2C son ilustraciones esquemáticas que juntas ilustran otro ejemplo de un método para hacer otro ejemplo de un complejo que incluye fragmentos de biblioteca con la contigüidad preservada unidos a un soporte sólido;
La Fig. 3 es una ilustración esquemática del ligamiento y de la digestión del método de las Fig. 2A a 2C que tiene lugar en una sola reacción en un recipiente;
La Fig. 4 es una ilustración esquemática de un ejemplo de una parte de un proceso de preparación de bibliotecas que genera fragmentos de bibliotecas con la contigüidad preservada unidos;
La Fig. 5A es una vista superior de un ejemplo de una celda de flujo;
La Fig. 5B es una vista ampliada y parcialmente recortada de un ejemplo de un canal de flujo de la celda de flujo;
La Fig. 5C es una vista ampliada y parcialmente recortada de otro ejemplo de un canal de flujo de la celda de flujo;
Las Fig. 6A a 6D son vistas esquemáticas de diversas etapas en un método para generar series de imágenes de agrupamiento basadas en el tiempo;
La Fig. 7 es una ilustración esquemática de imágenes (en el lado izquierdo de la Fig. 7) tomadas después de realizar la generación de grupos para diferentes muestras, e imágenes de agrupamiento resueltas (en el lado derecho de la Fig. 7) generadas para cada una de las muestras;
La Fig. 8 es una ilustración esquemática de un ejemplo de una parte de un proceso de preparación de bibliotecas que tiene lugar en una celda de flujo que utiliza los fragmentos de biblioteca con la contigüidad preservada unidos de la Fig. 4;
Las Fig. 9A a 9C son vistas esquemáticas de diversas etapas en un método para generar una serie de imágenes de agrupamiento basadas en el tiempo;
La Fig. 10 es una captura de pantalla en color original, reproducida en blanco y negro, de un navegador Integrative Genomics Viewer (IGV) que muestra los resultados de una región rica en AT del gen INTS4P1 cuando se eliminó una cadena no transferida mediante desnaturalización por calor y cuando la cadena no transferida se eliminó usando condiciones de exonucleasa T7; y
La Fig. 11 es una gráfica que representa la fluorescencia (eje Y, unidades de fluorescencia) frente al tamaño (eje X, pares de bases) de fragmentos de biblioteca amplificados por PCR generados mediante los métodos que se muestran en las Fig. 2A a 2C y en la Fig. 3.
Descripción detallada
Los fragmentos de la biblioteca son fragmentos de ácido desoxirribonucleico (ADN) de tamaño similar (p. ej., <1000 pb) de un fragmento de ADN mayor o más largo. Los fragmentos de biblioteca se pueden agrupar en datos de secuenciación si se puede identificar un compartimento de origen común en el que se originó el fragmento largo de ADN. La compartimentación de diferentes fragmentos de ADN largos puede ser deseable para lograr un contenido de genoma subhaploide dentro de cada compartimento para lecturas largas sintéticas. Las lecturas largas sintéticas (o lecturas cortas vinculadas) se habilitan cuando se puede agrupar una pluralidad de fragmentos cortos en función de la identificación del compartimento en el que se originó el fragmento largo de ADN. La compartimentación se ha logrado físicamente, por ejemplo, utilizando pocillos, bolas, microgotas u otros compartimentos físicos.
Común a todas estas estrategias de compartimentación es el principio de que se utiliza una secuencia de código de barras o una secuencia de índice para identificar el compartimento en el que se originó el fragmento largo de ADN. La secuencia del código de barras adjunta a cada uno de los fragmentos más cortos puede ser única para un fragmento de ADN largo en particular y, por lo tanto, puede ayudar a marcar diferentes compartimentos durante la preparación de la biblioteca. La secuencia del código de barras es la que se utiliza para agrupar lecturas cortas para formar lecturas largas sintéticas basadas en la suposición de que todas las lecturas cortas se originan en el mismo compartimento.
Los métodos ilustrativos descritos en la presente memoria logran la compartimentación de diferentes fragmentos de la biblioteca sin tener que incorporar una secuencia de código de barras única. El método utiliza fragmentos de biblioteca con la contigüidad preservada y formación de imágenes para crear una serie de imágenes de agrupamiento basadas en el tiempo. Cada imagen de agrupación basada en el tiempo se puede utilizar para identificar una muestra (compartimento) a partir de la cual se generó un conjunto particular de cadenas molde. Además, cada lectura secuenciada se puede agrupar utilizando las imágenes de agrupamiento basadas en el tiempo. Esta agrupación permite que las lecturas se enlacen, lo que permite la reconstitución de un fragmento de ADN largo.
Definiciones
Debe entenderse que los términos utilizados en la presente memoria adoptarán su significado habitual en la técnica correspondiente, a menos que se especifique lo contrario. A continuación, se exponen varios términos utilizados en la presente memoria, y sus significados.
Como se utiliza en la presente memoria, las formas en singular “ un” , “una” , “ uno” y “el” o “ la” hacen referencia tanto al singular como al plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. El término “comprende” tal como se usa en la presente memoria es sinónimo de “ incluye” , “contiene” o “caracterizado por” y es inclusivo o abierto y no excluye elementos o etapas de método adicionales no enumerados.
La referencia a lo largo de la descripción a “como un ejemplo” , “otro ejemplo” , “ un ejemplo” , etc., denota que un elemento en particular (p. ej., propiedad, estructura, composición, configuración y/o característica) que se describe en relación con el ejemplo se incluye en al menos un ejemplo descrito en la presente memoria, y puede estar presente o no en otros ejemplos. Además, debe entenderse que los elementos descritos para cualquier ejemplo pueden combinarse de cualquier manera adecuada en los diversos ejemplos, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
Los términos “sustancialmente” y “aproximadamente” usados a lo largo de esta descripción, incluyendo las reivindicaciones, se usan para describir y considerar pequeñas fluctuaciones, tales como las debidas a variaciones en el procesamiento. Por ejemplo, estos términos pueden referirse a menor o igual a ±5 % de un valor indicado, tal como menor o igual a ±2 % de un valor indicado, tal como menor o igual a ±1 % de un valor indicado, tal como menor o igual a ±0,5 % de un valor indicado, tal como menor o igual a ±0,2 % de un valor indicado, tal como menor o igual a ±0,1 % de un valor indicado, tal como menor o igual a ±0,05 % de un valor indicado.
Adaptador. Una secuencia de oligonucleótidos lineales que se puede fusionar con una molécula de ácido nucleico, por ejemplo, mediante ligamiento o tagmentación. Las longitudes adecuadas del adaptador pueden oscilar entre aproximadamente 10 nucleótidos y aproximadamente 100 nucleótidos, o entre aproximadamente 12 nucleótidos y aproximadamente 60 nucleótidos, o entre aproximadamente 15 nucleótidos y aproximadamente 50 nucleótidos. El adaptador puede incluir cualquier combinación de nucleótidos y/o ácidos nucleicos. En algunos ejemplos, el adaptador puede incluir una secuencia que es complementaria de al menos una parte de un cebador, por ejemplo, un cebador que incluye una secuencia de nucleótidos universal (como una secuencia P5 o P7). Como ejemplo, el adaptador en un extremo de un fragmento incluye una secuencia que es complementaria a al menos una parte de un primer cebador de la celda de flujo, y el adaptador en el otro extremo del fragmento incluye una secuencia que es idéntica a al menos una parte de un segundo cebador de la celda de flujo. El adaptador complementario puede hibridarse con el primer cebador de la celda de flujo, y el adaptador idéntico es un molde para su copia complementaria, que puede hibridarse con el segundo cebador de la celda de flujo durante la agrupación. En algunos ejemplos, el adaptador puede incluir una secuencia de cebador de secuenciación o un sitio de unión de secuenciación. Pueden incorporarse combinaciones de diferentes adaptadores en una molécula de ácido nucleico, como un fragmento de ADN.
Sitio de captura. Una parte de la superficie de una celda de flujo que ha sido modificada físicamente y/o modificada con una propiedad química que permite la localización de complejos. En un ejemplo, el sitio de captura puede incluir un agente de captura químico (es decir, un material, molécula o resto que es capaz de fijarse, retenerse o unirse a una molécula objetivo (por ejemplo, un complejo)). Un ejemplo de agente de captura química incluye un miembro de un par de unión receptor-ligando (por ejemplo, avidina, estreptavidina, biotina, lectina, carbohidrato, proteína de unión a ácido nucleico, epítopo, anticuerpo, etc.) que es capaz de unirse a la molécula objetivo (o a un resto de enlace unido a la molécula diana). Otro ejemplo más del agente de captura química es un reactivo químico capaz de formar una interacción electrostática, un enlace de hidrógeno o un enlace covalente (p. ej., intercambio tiol-disulfuro, química click, Diels-Alder, etc.) con el complejo.
Complejo. Un portador, como un soporte sólido, y fragmentos de ácido nucleico listos para la secuenciación unidos al portador. El portador también puede incluir un miembro de un par de unión cuyo otro miembro forma parte del sitio de captura.
Fragmento. Una parte o trozo de material genético (por ejemplo, ADN, ARN, etc.). Los fragmentos de biblioteca con la contigüidad preservada son trozos más pequeños de la muestra de ácido nucleico más larga que se ha fragmentado, donde los fragmentos más pequeños se mantienen unidos de alguna manera (p. ej., mediante una bola, con un transposoma, etc.).
Molécula o muestra de ácido nucleico: Una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud y puede incluir ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos, análogos de los mismos o mezclas de los mismos. El término puede referirse a polinucleótidos monocatenarios o bicatenarios.
Una molécula (o cadena) de ácido nucleico “ molde” puede referirse a una secuencia que se va a analizar.
Los nucleótidos en una muestra de ácido nucleico pueden incluir ácidos nucleicos naturales y análogos funcionales de los mismos. Algunos ejemplos de análogos funcionales son capaces de hibridarse con un ácido nucleico de una manera específica de secuencia o pueden usarse como molde para la replicación de una secuencia de nucleótidos particular. Los nucleótidos naturales generalmente tienen un armazón que contiene enlaces fosfodiéster. Una estructura análoga puede tener un enlace de armazón alternativo que incluye cualquiera de varios conocidos en la técnica. Los nucleótidos naturales generalmente tienen un azúcar de desoxirribosa (p. ej., se encuentra en el ADN) o un azúcar de ribosa (p. ej., se encuentra en el ARN). Una estructura análoga puede tener un resto de azúcar alternativo que incluye cualquiera de varios conocidos en la técnica. Los nucleótidos pueden incluir bases naturales o no naturales. Un ADN natural puede incluir uno o más de adenina, timina, citosina y/o guanina, y un ARN natural puede incluir uno o más de adenina, uracilo, citosina y/o guanina. Puede usarse cualquier base no natural, tal como un ácido nucleico bloqueado (LNA) y un ácido nucleico puenteado (BNA).
Cebador. Una molécula de ácido nucleico que puede hibridarse con una secuencia objetivo, tal como un adaptador unido a un fragmento de biblioteca con la contigüidad preservada. Como ejemplo, un cebador de amplificación puede servir como punto de partida para la amplificación del molde y la generación de grupos. Como otro ejemplo, una cadena de ácido nucleico sintetizado (molde) puede incluir un sitio con el que puede hibridarse un cebador (p. ej., un cebador de secuenciación) para cebar la síntesis de una nueva cadena que es complementaria a la cadena de ácido nucleico sintetizado (molde). Cualquier cebador puede incluir cualquier combinación de nucleótidos o análogos de los mismos. En algunos ejemplos, el cebador es un polinucleótido u oligonucleótido monocatenario. La longitud del cebador puede ser cualquier cantidad de bases largas y puede incluir una variedad de nucleótidos naturales y/o no naturales. En un ejemplo, el cebador de secuenciación es una cadena corta, en el intervalo de 10 a 60 bases o de 20 a 40 bases.
Fragmentos de ácido nucleico listos para la secuenciación: Una parte (p. ej., fragmento de biblioteca con la contigüidad preservada) de material genético que tiene adaptadores en los extremos 3' y 5'. En el fragmento de ácido nucleico listo para secuenciación, cada adaptador incluye una secuencia universal conocida (p. ej., que es complementaria a al menos una parte de un cebador en una celda de flujo) y una secuencia de cebador de secuenciación. Un fragmento de ácido nucleico listo para la secuenciación puede unirse mediante la inserción de transposones unidos a la superficie de un soporte sólido (p. ej., una bola) o inmovilizarse directamente a través de un par de unión u otro enlazador escindible.
Soporte sólido: Un cuerpo pequeño hecho de un material rígido o semirrígido que tiene una forma caracterizada, por ejemplo, como una esfera, óvalo, microesfera u otra forma de partícula reconocida, ya sea con dimensiones regulares o irregulares. El soporte sólido puede tener una biblioteca de secuenciación unida al mismo. Algunos ejemplos de materiales que son útiles para el soporte sólido incluyen, sin limitación, vidrio; plástico, como acrílico, poliestireno o un copolímero de estireno y otro material, polipropileno, polietileno, polibutileno, poliuretano o politetrafluoroetileno (TEFLON® de Chemours Co); polisacáridos o polisacáridos reticulados, tales como agarosa o Sepharose; nailon; nitrocelulosa; resina; sílice o materiales a base de sílice, incluido el silicio y el silicio modificado; fibra de carbono, metal; vidrio inorgánico; haz de fibra óptica, o una variedad de otros polímeros. Algunos ejemplos de soportes sólidos incluyen bolas de vidrio de poro controlado, bolas paramagnéticas, sol de toria, bolas SEPHAROSE® (forma de bolas reticuladas de agarosa, disponible de Cytiva), nanocristales y otros conocidos en la técnica como se describe, por ejemplo, en Microsphere Detection Guide de Bangs Laboratories, Fishers Ind.
Transposoma: Un complejo formado entre una enzima de integración (p. ej., una integrasa o una transposasa) y una cadena transferible, una cadena no transferible o cadenas transferibles y no transferibles.
Fragmentos de biblioteca con la contigüidad preservada
En los ejemplos descritos en la presente memoria, los fragmentos de la biblioteca que se introducen en la celda de flujo son fragmentos de biblioteca con la contigüidad preservada. Los fragmentos de biblioteca con la contigüidad preservada son trozos más pequeños de una muestra de ácido nucleico más larga que se ha fragmentado, donde las trozos más pequeños se mantienen unidos físicamente de algún modo. En algunos ejemplos descritos en la presente memoria, la contigüidad puede preservarse utilizando un soporte sólido en la preparación de bibliotecas. En otros ejemplos descritos en la presente memoria, la contigüidad puede conservarse mediante la creación de fragmentos que se unen entre sí durante la preparación inicial de la biblioteca a través de transposomas unidos, la introducción de los fragmentos unidos en la celda de flujo y después completando la preparación de la biblioteca en la celda de flujo.
La Fig. 1 representa un ejemplo de un método para formar un complejo 10 que incluye fragmentos de ácido nucleico 12 listos para la secuenciación que incluyen fragmentos 14 de la muestra de ácido nucleico más grande, cuya contigüidad se preserva en un soporte sólido 16.
En un método ilustrativo para formar el complejo 10 que se muestra en la figura 1, una secuencia adaptadora 18 se une al soporte sólido 16 a través de un miembro 20 de un par de unión. En un ejemplo, esta secuencia adaptadora 18 puede incluir una primera secuencia de cebador de secuenciación (por ejemplo, una secuencia de cebador de secuenciación de lectura 1) y una primera secuencia (P5') que es complementaria a al menos una parte de uno de los cebadores de amplificación (por ejemplo, P5) en la celda de flujo (que se muestra en las Fig. 5A y 5B). La secuencia adaptadora 18 está unida a un miembro 20 del par de unión (p. ej., biotina) para que pueda unirse a la superficie del soporte sólido 16, que incluye el otro miembro (p. ej., avidina, estreptavidina, etc.) del par de unión.
Como se muestra en la Fig. 1, un complejo de transposomas 24" también se puede unir al soporte sólido 16. Antes de cargar el complejo de transposoma 24" en el soporte sólido 16, se puede mezclar un adaptador en Y 25' parcial con una enzima transposasa 32 (que, aunque no se muestra, puede incluir dos moléculas Tn5) para formar un ejemplo del complejo de transposoma 24". El adaptador en Y 25' parcial puede incluir dos secuencias terminales en mosaico M1, M2 que se hibridan entre sí. Una de las secuencias terminales en mosaico M1 tiene un extremo libre que puede unirse a las cadenas de ADN fragmentadas durante la tagmentación y, por lo tanto, es similar a la cadena 26 transferida en las Fig. 2A a 2C. La otra de las secuencias terminales en mosaico M2 puede unirse a una segunda secuencia de cebador de secuenciación (p. ej., una secuencia de cebador de secuenciación de lectura 2) y una segunda secuencia (P7) que tiene la misma secuencia que al menos una parte de otro de los cebadores de amplificación (P7) en la celda de flujo, de modo que su copia sea complementaria (p. ej., P7') al cebador de amplificación (P7). En este ejemplo, la otra de las secuencias finales en mosaico M2, la segunda secuencia del cebador de secuenciación y la segunda secuencia forman la secuencia adaptadora 22. Las secuencias adaptadoras 22 no se unen a las cadenas de ADN fragmentadas durante la tagmentación y, por lo tanto, son similares a las cadenas 28 no transferidas en las Fig. 2A a 2C.
La carga del complejo de transposoma 24" en el soporte sólido 16 puede implicar mezclar el complejo de transposoma 24" con el soporte sólido 16 y exponer la mezcla a condiciones adecuadas para ligar el extremo en mosaico M1 del adaptador en Y 25' parcial al extremo 3' de la secuencia adaptadora 18. Como se muestra en la Fig. 1, los complejos de transposomas 24" individuales pueden unirse a cada una de las secuencias adaptadoras 18 en el soporte sólido 16.
En este método ilustrativo para formar el complejo 10, se puede realizar a continuación un proceso de tagmentación. Un fluido (p. ej., un tampón de tagmentación) que incluye la muestra 30 de ácido nucleico más larga (p. ej., ADN) se puede agregar al soporte sólido 16 que tiene la secuencia adaptadora 18 y los complejos de transposoma 24" unidos al mismo. A medida que la muestra entra en contacto con los complejos de transposoma 24” , se tagmenta la muestra de ácido nucleico más larga. Durante este ejemplo de tagmentación, la muestra 30 se fragmenta en los fragmentos 14, 14', y cada uno de los fragmentos 14, 14' se etiqueta, en su extremo 5', con el extremo libre del extremo en mosaico M1 del adaptador en Y 25' parcial.
Como se muestra en la Fig. 1, la tagmentación de la muestra de ácido nucleico más larga 30 da como resultado una pluralidad de moléculas unidas entre los complejos de transposoma 24". Las moléculas puenteadas se enrollan alrededor del soporte sólido 16. Los complejos de transposoma 24" y las secuencias adaptadoras 18 mantienen la contigüidad de la muestra 30 de ácido nucleico como moléculas puenteadas y, por lo tanto, las moléculas puenteadas son los fragmentos de biblioteca 14, 14' con la contigüidad preservada.
A continuación, la enzima transposasa se puede eliminar mediante tratamiento con dodecilsulfato de sodio (SDS), con calor o por digestión con proteinasa K. La eliminación de las enzimas transposasa deja los fragmentos 14, 14' de la biblioteca con la contigüidad preservada unidos al soporte sólido 16.
Para completar los fragmentos listos para la secuenciación, se lleva a cabo una extensión y ligamiento adicionales (indicadas por los asteriscos en la Fig. 1) para garantizar que los fragmentos 14 y 14' se unan a las secuencias 22. El complejo 10 resultante se muestra en la Fig. 1.
Cada fragmento 14, 14' de biblioteca con la contigüidad preservada es parte de un respectivo fragmento 12, 12' de ácido nucleico listo para la secuenciación, cada uno de los cuales también incluye secuencias adaptadoras 18 y 22 respectivas unidas en cualquier extremo. Las secuencias adaptadoras 18 son las unidas inicialmente al soporte sólido 16 e incluyen la primera secuencia del cebador de secuenciación y la primera secuencia complementaria a uno de los cebadores de la celda de flujo. Las secuencias adaptadoras 18 están unidas al miembro 20 de un par de unión. Las secuencias adaptadoras 22 proceden del adaptador en Y 25' parcial e incluyen la segunda secuencia idéntica a otro cebador de celda de flujo y la segunda secuencia cebadora de secuenciación. Debido a que cada fragmento 14, 14' de ácido nucleico listo para la secuenciación incluye adaptadores adecuados para la amplificación y secuenciación del puente, no se realiza la amplificación por PCR. Estos fragmentos 12, 12' están por lo tanto listos para la secuenciación. Además, debido a que los fragmentos de biblioteca 14, 14' con la contigüidad preservada son de la misma muestra 30 de ácido nucleico más larga, los fragmentos de biblioteca 14, 14' con la contigüidad preservada pueden ser adecuados para las aplicaciones de lectura larga vinculadas descritas en la presente memoria.
Otro método ilustrativo para formar otro complejo de ejemplo 10' (Fig. 2C) se representa en las Fig. 2A a 2C.
En este método ilustrativo, la secuencia adaptadora 18' se une al soporte sólido 16 a través de un miembro 20 de un par de unión. En un ejemplo, esta secuencia adaptadora 18' puede incluir una secuencia hibridable H, una primera secuencia de cebador de secuenciación (p. ej., una secuencia de cebador de secuenciación de lectura 1) y una primera secuencia (p. ej., P5) que es idéntica a al menos una parte de uno de los cebadores de amplificación (p. ej., P5) en la celda de flujo, de modo que su copia sea complementaria (p. ej., P5') al cebador de amplificación (P5). La secuencia adaptadora 18' está unida a un miembro 20 del par de unión (p. ej., biotina) para que pueda unirse a la superficie del soporte sólido 16, que incluye el otro miembro (p. ej., avidina, estreptavidina, etc.) del par de unión.
Como se muestra en la Fig. 2A, un complejo de transposomas 24 también se puede unir al soporte sólido 16. Antes de cargar el complejo de transposoma 24 en el soporte sólido 16, se puede mezclar un adaptador en L 21 con una enzima transposasa 32 (por ejemplo, que incluye dos moléculas Tn5), formando un ejemplo del complejo de transposoma 24. El adaptador en L 21 puede incluir dos secuencias con extremos en mosaico M1, M2 que se hibridan entre sí. Una de las secuencias terminales en mosaico M1 es una cadena 26 transferida que se agrega a un extremo de cada fragmento 14, 14' durante un proceso de ligamiento que tiene lugar después de un proceso de tagmentación. La otra de las secuencias terminales en mosaico M2 es parte de una cadena 28 no transferida que se elimina después de los procesos de ligamiento y tagmentación. Esta secuencia terminal en mosaico M2 está unida a una secuencia hibridable complementaria HC que es complementaria a la secuencia hibridable H de la secuencia adaptadora 18' unida al soporte sólido 16. La secuencia hibridable complementaria HC permite que el adaptador en L 21 hibride con la secuencia adaptadora 18'. De este modo, la secuencia hibridable complementaria HC permite cargar el complejo de transposoma 24 sobre el soporte sólido.
La carga del complejo de transposoma 24 en el soporte sólido 16 puede implicar mezclar el complejo de transposoma 24 con el soporte sólido 16 y exponer la mezcla a condiciones adecuadas para la hibridación de la secuencia hibridable complementaria HC del adaptador en L 21 con la secuencia hibridable H de la secuencia adaptadora 18'. Como se muestra en la Fig. 2A, el complejo de transposoma 24 individual se puede unir a cada una de las secuencias adaptadoras 18' en el soporte sólido 16.
En este método ilustrativo para formar el complejo 10', se realiza a continuación un proceso de tagmentación. Se puede añadir un fluido (por ejemplo, un tampón de tagmentación) que incluye la muestra 30 de ácido nucleico más larga (por ejemplo, ADN) al soporte sólido 16 que tiene cargado el complejo de transposoma 24. A medida que la muestra 30 entra en contacto con los complejos de transposoma 24 unidos al soporte sólido, se tagmenta la muestra 30 de ácido nucleico más larga. Durante este ejemplo de tagmentación, la muestra 30 se fragmenta en fragmentos 14, 14', y cada uno de los fragmentos 14, 14' se etiqueta, en su extremo 5', con la secuencia terminal en mosaico M1 del adaptador en L 21.
Como se muestra en la Fig. 2A, la tagmentación de la muestra 30 de ácido nucleico más larga da como resultado una pluralidad de moléculas puenteadas entre complejos de transposoma 24 adyacentes y, por lo tanto, las secuencias adaptadoras 18' adyacentes. Las moléculas puenteadas se enrollan alrededor del soporte sólido 16. Los complejos de transposoma 24 y las secuencias adaptadoras 18' mantienen la contigüidad de la muestra 30 de ácido nucleico como moléculas puenteadas y, por lo tanto, las moléculas puenteadas son los fragmentos de biblioteca 14, 14' con la contigüidad preservada.
A continuación, la enzima transposasa 32 se puede eliminar mediante tratamiento con dodecilsulfato de sodio (SDS), con calor o por digestión con proteinasa K.
A continuación, se puede realizar el ligamiento para unir las secuencias terminales en mosaico M1 libres a las respectivas secuencias adaptadoras 18'. En la Fig. 2A, las estrellas representan el lugar donde se realiza el ligamiento. En un ejemplo, el ligamiento puede iniciarse introduciendo un tampón que contenga una ligasa adecuada y calentando a una temperatura adecuada durante un tiempo adecuado para iniciar la actividad enzimática. Algunos ejemplos de enzimas ligasas adecuadas incluyen ADN ligasa de E. coli, T7 ligasa, etc. En un ejemplo, el tampón que contiene ADN ligasa de E. coli también puede incluir nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+). En este ejemplo, el calentamiento a aproximadamente 16 0C durante aproximadamente 15 minutos inicia la actividad enzimática. La estructura resultante se muestra en la Fig. 2B.
A continuación, puede retirarse la cadena 28 no transferida del adaptador en L 21. En este ejemplo, cada una de las cadenas 28 no transferidas se elimina utilizando cualquier enzima 23 exonucleasa 5'-3' adecuada, como la exonucleasa T7. En un ejemplo, la eliminación de la cadena no transferida puede iniciarse introduciendo un tampón que contiene la enzima 23 exonucleasa 5'-3' y esperando un tiempo predeterminado. La enzima 23 exonucleasa 5'-3' es capaz de digerir la cadena 28 no transferida a temperatura ambiente (p. ej., de aproximadamente 22 0C a aproximadamente 25 0C) y, por lo tanto, no se usa calentamiento adicional. Las cadenas 28 no transferidas digeridas pueden eliminarse por lavado.
El uso de una enzima exonucleasa para eliminar las cadenas 28 no transferidas puede ser más deseable que el uso de la desnaturalización por calor. La enzima 23 exonucleasa 5'-3' digiere eficientemente las cadenas 28 no transferidas, produciendo un molde más limpio (que cuando se usa la desnaturalización por calor) para la hibridación de una secuencia adaptadora unida posteriormente (véanse los números de referencia 22 en la Fig. 2C). Esto puede mejorar el rendimiento de la biblioteca. Además, la eliminación de las cadenas 28 no transferidas mediante la enzima 23 exonucleasa 5'-3' puede mejorar la cobertura de la biblioteca sobre las regiones ricas en adenina (A) y timina (T), cuyas pérdidas se han observado después de la desnaturalización por calor de las cadenas 28 no transferidas (véase la Fig. 11). Además, la digestión mediante la enzima exonucleasa no aumenta el tiempo del proceso global de preparación de la biblioteca.
Haciendo ahora referencia a la Fig. 2C, este ejemplo del método para formar el complejo 10' implica la introducción de un adaptador en Y 25 parcial. El adaptador en Y 25 parcial incluye una secuencia terminal en mosaico M3 que es complementaria a la secuencia terminal en mosaico M1 y a una secuencia adaptadora 22. La secuencia adaptadora 22 puede incluir una segunda secuencia de cebador de secuenciación (p. ej., una secuencia de cebador de secuenciación de lectura 2) y una segunda secuencia (P7') que es complementaria a otro de los cebadores de amplificación (P7) en la celda de flujo. Como se muestra en la Fig. 2C, la secuencia terminal en mosaico M3 del adaptador en Y 25 parcial se hibrida con la secuencia terminal en mosaico M1 de la cadena 26 transferida (ahora ligada a la secuencia adaptadora 18'), y por lo tanto une el adaptador en Y 25 parcial al soporte sólido 16.
En los ejemplos descritos en la presente memoria, las secuencias adaptadoras 18, 18' y/o 22 también pueden incluir un índice de muestra de secuenciación o una secuencia de código de barras. Estas secuencias pueden usarse como respaldo o alternativa a los métodos de compartimentación descritos en la presente memoria.
Para generar fragmentos listos para la secuenciación, se lleva a cabo una extensión y ligamiento adicionales para garantizar que los fragmentos 14 y 14' se unan a la secuencia terminal en mosaico M3, y por lo tanto, a las secuencias 22.
El complejo 10' resultante se muestra en la Fig. 2C.
Otro método ilustrativo más para formar el complejo 10' (que se muestra en la Fig. 2C) se representa parcialmente en la Fig. 3. En este método ilustrativo, el ligamiento de la cadena 26 transferida y la digestión de la cadena 28 no transferida, se realizan como parte de un solo protocolo en un recipiente.
En este método ilustrativo, la secuencia adaptadora 18' se une al soporte sólido 16 a través de un miembro 20 de un par de unión. Se puede usar la secuencia adaptadora 18' como se describe en referencia a la Fig. 2A, que incluye la secuencia hibridable H, la primera secuencia del cebador de secuenciación (por ejemplo, una secuencia del cebador de secuenciación de lectura 1) y la primera secuencia (P5) que es idéntica a al menos una parte de uno de los cebadores de amplificación (p. ej., P5) en la celda de flujo, de modo que su copia sea complementaria (p. ej., P5') al cebador de amplificación (P5). Asimismo, en este método ilustrativo, el complejo de transposoma 24 se carga en el soporte sólido 16 como se describe en referencia a la Fig. 2A. Brevemente, la secuencia hibridable complementaria HC del adaptador en L 21 del complejo de transposoma 24 se hibrida con la secuencia hibridable H de la secuencia adaptadora 18'.
En este método ilustrativo para formar el complejo 10' (Fig. 2C), la tagmentación se realiza como se describe en referencia a la Fig. 2A.
El ligamiento de la cadena 26 transferida y la digestión de la cadena 28 no transferida pueden realizarse conjuntamente. Esto se ilustra esquemáticamente en la Fig. 3. Para que la ligasa y la enzima exonucleasa funcionen sinérgicamente, la formulación del reactivo que se introduce en el soporte sólido tagmentado incluye un tampón, la enzima ligasa, la enzima 23 exonucleasa 5'-3' (p. ej., exonucleasa T7) y cualquier otro componente requerido por las respectivas enzimas (por ejemplo, un cofactor, como NAD+). En un ejemplo, el ligamiento y la digestión pueden iniciarse introduciendo la formulación del reactivo y calentando a aproximadamente 25 0C durante aproximadamente 15 minutos para iniciar la actividad enzimática.
La incorporación de la ligasa y la enzima exonucleasa en la misma formulación de reactivo puede reducir el tiempo del protocolo (p. ej., en aproximadamente 10 minutos en comparación con el método ilustrativo que se muestra en las Fig. 2A a 2C) y también reduce el número de etapas de lavado.
Este ejemplo del método continúa posteriormente con la introducción del adaptador en Y 25 parcial, como se describe en referencia a la Fig. 2C. Para generar fragmentos listos para la secuenciación y el complejo 10' final, se lleva a cabo una extensión y ligamiento adicionales para garantizar que los fragmentos 14 y 14' se unan a la secuencia terminal en mosaico M3, y por lo tanto, a las secuencias 22.
Los métodos descritos con referencia a la Fig. 1, las Fig. 2A a 2C y la Fig. 3 para producir los complejos 10, 10' proporcionan algunos ejemplos, pero debe entenderse que se pueden usar otros métodos siempre que los fragmentos de ácido nucleico 12, 12' listos para la secuenciación estén unidos al soporte sólido 16.
En otros ejemplos descritos en la presente memoria, la información de contigüidad puede conservarse realizando una parte de la preparación de la biblioteca fuera de la celda de flujo y realizando una parte de la preparación de la biblioteca en la celda de flujo.
En este ejemplo, la preparación de la biblioteca se puede iniciar fuera de la celda de flujo mediante tagmentación, como se muestra esquemáticamente en la Fig. 4.
En el ejemplo que se muestra, un fluido (p. ej., un tampón de tagmentación) que incluye la muestra 30 de ácido nucleico más larga (p. ej., ADN bicatenario) puede mezclarse con complejos 24' de transposoma. En el ejemplo que se muestra en la Fig.4, cada complejo 24' de transposoma es un dímero, que incluye dos enzimas transposasas (que se muestran colectivamente como “ 32” en la Fig.4), una cadena 26' transferida y una cadena 28' no transferida. En otros ejemplos, se pueden usar diferentes complejos de transposoma, por ejemplo, uno de los cuales incluye las enzimas transposasa 32 y la cadena 26' transferida y otro que incluye las enzimas transposasa 32 y la cadena 28' no transferida.
En este ejemplo, las cadenas 26' transferidas son adaptadores que se agregan a un extremo de cada fragmento 14, 14' durante el proceso de tagmentación. En un ejemplo, cada cadena 26 transferida es un adaptador que incluye una primera secuencia de cebador de secuenciación (por ejemplo, una secuencia de cebador de secuenciación de lectura 1) y una primera secuencia (P5') que es complementaria a al menos una parte de uno de los cebadores de amplificación (p. ej., P5) en la celda de flujo.
En este ejemplo, las cadenas 28' no transferidas son adaptadores que no se incorporan al fragmento 14, 14' durante la tagmentación, sino que pueden ligarse posteriormente al otro extremo de cada fragmento 14, 14'. Como se muestra en la Fig. 4, las cadenas 28' no transferidas pueden unirse a la cadena 26' transferida a través de un apareamiento de bases al menos parcial durante la tagmentación. En este ejemplo, la cadena 28' no transferida es un adaptador que incluye una segunda secuencia de cebador de secuenciación (p. ej., una secuencia de cebador de secuenciación de lectura 2) y una segunda secuencia (P7) que es idéntica a al menos una parte de uno de los cebadores de amplificación (p. ej., P7) en la celda de flujo, de modo que su copia sea complementaria (p. ej., P7') al cebador de amplificación (P7).
Como se muestra en la Fig. 4, dentro del fluido, los transposomas 24' fragmentan la muestra 30 de ácido nucleico más larga en fragmentos 14, 14' y ligan las cadenas 26' transferidas al extremo 5' de cada fragmento 14, 14'. En un ejemplo, la cadena 26' transferida se incorpora al extremo 5' de cada fragmento 14, 14' de la muestra 30 de ácido nucleico más larga mediante transposición unilateral. Las cadenas 28' no transferidas se pueden unir a la cadena 26' transferida mediante emparejamiento de bases.
Este proceso de tagmentación ilustrativo mantiene la contigüidad de la muestra 30 de ácido nucleico más larga, dado que los fragmentos 14, 14' generados (y cualquiera de las cadenas 26' transferidas y las cadenas 28' no transferidas unidas directa o indirectamente a los mismos) se mantienen unidos entre sí a través de la transposasa 32. Los fragmentos de biblioteca 14, 14' con la contigüidad preservada unidos se denominan en la presente memoria fragmentos 34 unidos.
Como se menciona en la presente memoria, los fragmentos 34 unidos se pueden introducir en la celda de flujo, donde se puede realizar un procesamiento adicional para completar la preparación de la biblioteca. Esto se muestra esquemáticamente en la Fig. 8, que se describirá más detalladamente con referencia a los métodos descritos en la presente memoria.
Celda de flujo
Los métodos descritos en la presente memoria pueden utilizar una celda de flujo 36, cuyo ejemplo se representa en la Fig. 5A. La celda de flujo 36 incluye un sustrato 38 que define al menos parcialmente un carril o canal 40 de flujo.
El sustrato 38 puede ser una sola capa/material. Algunos ejemplos de sustratos de una sola capa adecuados incluyen epoxi siloxano, vidrio, vidrio modificado o funcionalizado, plásticos (incluidos acrílicos, poliestireno y copolímeros de estireno y otros materiales, polipropileno, polietileno, polibutileno, poliuretanos, politetrafluoroetileno (tal como TEFLON® de Chemours), olefinas cíclicas/polímeros de cicloolefinas (COP) (tal como ZEONOR® de Zeon), poliimidas, etc.), nailon (poliamidas), cerámica/óxidos de cerámica, sílice, sílice fundida o materiales a base de sílice, silicato de aluminio, silicio y silicio modificado (p. ej., silicio p+ dopado con boro), nitruro de silicio (Si3N4), óxido de silicio (SiO2), pentóxido de tantalio (Ta2Os) u otros óxidos de tantalio (TaOX), óxido de hafnio (HaO2), carbono, metales, vidrios inorgánicos o similares. El sustrato 38 también puede ser una estructura multicapa. Algunos ejemplos de la estructura multicapa incluyen vidrio o silicio, con una capa de recubrimiento de óxido de tantalio u otro óxido cerámico en la superficie. Otros ejemplos de la estructura multicapa incluyen un soporte subyacente (p. ej., vidrio o silicio) que tiene un patrón de resina sobre él. Otros ejemplos adicionales del sustrato multicapa pueden incluir un sustrato de silicio sobre aislante (SOI).
En un ejemplo, el sustrato 38 puede tener un diámetro en el intervalo de aproximadamente 2 mm a aproximadamente 300 mm, o una hoja o panel rectangular que tiene una dimensión mayor de hasta aproximadamente 10 pies (~3 metros). En un ejemplo, el sustrato 38 es una oblea que tiene un diámetro en el intervalo de aproximadamente 200 mm a aproximadamente 300 mm. En otro ejemplo, el sustrato 38 es una matriz que tiene una anchura en el intervalo de aproximadamente 0,1 mm a aproximadamente 10 mm. Si bien se han proporcionado dimensiones ilustrativas, debe entenderse que se puede usar un sustrato 38 con cualquier dimensión adecuada. Para otro ejemplo, se puede utilizar un panel que es un soporte rectangular, que tiene una superficie mayor que una oblea redonda de 300 mm.
En el ejemplo que se muestra en la Fig. 5A, la celda de flujo 36 incluye canales 40 de flujo. Si bien se muestran varios canales 40 de flujo, debe entenderse que se puede incluir cualquier número de canales 40 en la celda de flujo 36 (por ejemplo, un solo canal 40, cuatro canales 40, etc.). Cada canal 40 de flujo es un área definida entre dos componentes unidos (p. ej., el sustrato 36 y una tapa o dos sustratos 36), en los que pueden introducirse fluidos (p. ej., los descritos en la presente memoria) y eliminarse de los mismos. Cada canal 40 de flujo puede estar aislado de los demás canales 40 de flujo de modo que el fluido introducido en cualquier canal 40 de flujo concreto no fluya hacia ningún canal 40 de flujo adyacente. Algunos ejemplos de los fluidos introducidos en los canales 40 de flujo pueden introducir componentes de reacción (p. ej., fragmentos de biblioteca 14, 14' con la contigüidad preservada (p. ej., en el soporte sólido 16 o unidos entre sí), polimerasas, cebadores de secuenciación, nucleótidos, etc.), soluciones de lavado, agentes desbloqueantes, etc.
El canal 40 de flujo se puede definir en el sustrato 38 utilizando cualquier técnica adecuada que dependa, en parte, del material o materiales del sustrato 38. En un ejemplo, el canal 40 de flujo está grabado en un sustrato 38 de vidrio. En otro ejemplo, el canal 40 de flujo se puede modelar en una resina de un sustrato 38 multicapa utilizando fotolitografía, litografía de nanoimpresión, etc. En otro ejemplo, se puede aplicar un material separado (no mostrado) al sustrato 38 de modo que el material separado define las paredes del canal 40 de flujo y el sustrato 38 define la parte inferior del canal 40 de flujo.
En un ejemplo, el canal 40 de flujo tiene una configuración rectilínea. La longitud y el ancho del canal 40 de flujo pueden ser menores, respectivamente, que la longitud y el ancho del sustrato 38, de modo que la parte de la superficie del sustrato que rodea el canal 40 de flujo esté disponible para unirla a una tapa (no mostrada) u otro sustrato 38. En algunos casos, el ancho de cada canal 40 de flujo puede ser de al menos aproximadamente 1 mm, al menos aproximadamente 2,5 mm, al menos aproximadamente 5 mm, al menos aproximadamente 7 mm, al menos aproximadamente 10 mm o más. En algunos casos, la longitud de cada carril/canal 40 de flujo puede ser de al menos aproximadamente 10 mm, al menos aproximadamente 25 mm, al menos aproximadamente 50 mm, al menos aproximadamente 100 mm o más. El ancho y/o la longitud de cada canal 40 de flujo puede ser mayor que, menor que o encontrarse entre los valores especificados anteriormente. En otro ejemplo, el canal 40 de flujo es cuadrado (por ejemplo, de 10 mm x 10 mm).
La profundidad de cada canal 40 de flujo puede ser tan pequeña como el espesor de una monocapa cuando se utiliza impresión por microcontacto, aerosol o chorro de tinta para depositar un material separado que define las paredes del canal de flujo. La profundidad puede ser mayor cuando se usa un material separado (no mostrado) para unir la tapa al sustrato 38 o para unir dos sustratos 38 entre sí. Para otros ejemplos, la profundidad de cada canal 40 de flujo puede ser de aproximadamente 1 μm, aproximadamente 10 μm, aproximadamente 50 μm, aproximadamente 100 μm o más. En un ejemplo, la profundidad puede oscilar de aproximadamente 10 μm a aproximadamente 100 μm. En otro ejemplo, la profundidad puede oscilar de aproximadamente 10 μm a aproximadamente 30 μm. En otro ejemplo más, la profundidad es de aproximadamente 5 μm o menos. Debe entenderse que la profundidad de cada canal 40 de flujo debe ser mayor, menor o encontrarse entre los valores especificados anteriormente.
En la Fig. 5B y la Fig. 5C se muestran diferentes ejemplos de la arquitectura dentro de los canales 40 de flujo de la celda de flujo 36.
En el ejemplo que se muestra en la Fig. 5B, la celda de flujo 36 incluye un sustrato 38A de una sola capa y el canal 40 de flujo definido al menos parcialmente en el sustrato 38A de una sola capa.
En el canal 40 de flujo está presente un hidrogel 42 polimérico. Un ejemplo del hidrogel 42 polimérico incluye un copolímero de acrilamida, tal como poli(N-(5-azidoacetamidilpentil)acrilamida-co-acrilamida, PAZAM. PAZAm y algunas formas diferentes del copolímero de acrilamida se representan mediante la siguiente estructura (I):
Figure imgf000011_0001
en donde:
RA se selecciona del grupo que consiste en azido, amino opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquino opcionalmente sustituido, halógeno, hidrazona opcionalmente sustituida, hidrazina opcionalmente sustituida, carboxilo, hidroxilo, tetrazol opcionalmente sustituido, tetrazina opcionalmente sustituida, óxido de nitrilo, nitrona, sulfato y tiol;
RB es H o alquilo opcionalmente sustituido;
RC, RD y RE se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en H y alquilo opcionalmente sustituido;
cada uno de los -(CH2)p- puede estar opcionalmente sustituido;
p es un número entero en el intervalo de 1 a 50;
n es un número entero en el intervalo de 1 a 50.000; y
m es un número entero en el intervalo de 1 a 100.000.
Un experto en la materia reconocerá que la disposición de las características “ n” y “ m” recurrentes en la estructura (I) son representativas, y que las subunidades monoméricas pueden estar presentes en cualquier orden en la estructura del polímero (por ejemplo, aleatorio, en bloque, en patrón o una combinación de los mismos).
La masa molecular de PAZAM y otras formas del copolímero de acrilamida puede encontrarse en el intervalo de aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 1500 kDa o de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 1000 kDa o puede ser, en un ejemplo específico, de aproximadamente 312 kDa.
En algunos ejemplos, PAZAM y otras formas del copolímero de acrilamida son polímeros lineales. En algunos ejemplos diferentes, PAZAM y otras formas del copolímero de acrilamida son polímeros ligeramente reticulados.
En otros ejemplos, el hidrogel 42 polimérico puede ser una variación de la estructura (I). En un ejemplo, la unidad de acrilamida se puede reemplazar con N,N-dimetilacrilamida
Figure imgf000011_0002
En este ejemplo, la unidad de acrilamida en la estructura (I) se puede reemplazar con
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, donde RD, RE y RF son cada uno H o un alquilo C1-C6, y RG y RH son cada uno un alquilo C1-C6 (en lugar de H, como en el caso de la acrilamida). En este ejemplo, q puede ser un número entero en el intervalo de 1 a 100.000. En otro ejemplo, se puede usar el N,N-dimetilacrilamida además de la unidad de acrilamida. En este ejemplo, la estructura (I) puede incluir
Figure imgf000012_0002
además de las características “ n” y “ m” recurrentes, donde RD, RE y RF son cada uno H o un alquilo C1-C6, y RG y RH son cada uno un alquilo C1-C6. En este ejemplo, q puede ser un número entero en el intervalo de 1 a 100.000.
Como otro ejemplo del hidrogel polimérico inicial, la característica “ n” recurrente en la estructura (I) se puede reemplazar con un monómero que incluye un grupo azido heterocíclico que tiene la estructura (II):
Figure imgf000012_0003
en donde R1 es H o un alquilo C1-C6; R2 es H o un alquilo C1-C6; L es un enlazador que incluye una cadena lineal con 2 a 20 átomos seleccionados del grupo que consiste en carbono, oxígeno y nitrógeno y 10 sustituyentes opcionales en el carbono y cualquier átomo de nitrógeno en la cadena; E es una cadena lineal que incluye de 1 a 4 átomos seleccionados del grupo que consiste en carbono, oxígeno y nitrógeno, y sustituyentes opcionales en el carbono y cualquier átomo de nitrógeno en la cadena; A es una amida N sustituida con un H o un alquilo C1-C4 unido al N; y Z es un heterociclo que contiene nitrógeno. Algunos ejemplos de Z incluyen de 5 a 10 miembros de anillo presentes como una estructura cíclica única o una estructura fusionada.
Como otro ejemplo más, el hidrogel 42 polimérico puede incluir una unidad recurrente de cada una de las estructuras (III) y (IV):
Figure imgf000013_0001
en donde cada uno de R1a, R2a, R1b y R2b se selecciona independientemente entre hidrógeno un alquilo opcionalmente sustituido o fenilo opcionalmente sustituido; cada uno de R3a y R3b se selecciona independientemente entre hidrógeno, un alquilo opcionalmente sustituido, un fenilo opcionalmente sustituido o un aralquilo C7-C14 opcionalmente sustituido; y cada uno de L1 y L2 se selecciona independientemente entre un enlazador de alquileno opcionalmente sustituido o un enlazador de heteroalquileno opcionalmente sustituido.
Debe entenderse que pueden utilizarse otras moléculas para formar el hidrogel 42 polimérico, en tanto que estén funcionalizadas para injertar los cebadores oligonucleotídicos 44, 46 a las mismas. Otros ejemplos de capas poliméricas adecuadas incluyen aquellas que tienen una estructura coloidal, tal como agarosa; o una estructura de trama polimérica, tal como gelatina; o una estructura de polímero reticulado, tal como polímeros o copolímeros de poliacrilamida, acrilamida exenta de silano (SFA) o una versión azidolizada del SFA. Algunos ejemplos de polímeros de poliacrilamida adecuados pueden sintetizarse a partir de acrilamida y un ácido acrílico o un ácido acrílico que contiene un grupo vinilo, o a partir de monómeros que forman reacciones de fotocicloadición [2+2]. Otros ejemplos adicionales de hidrogeles 42 poliméricos incluyen copolímeros mixtos de acrilamidas y acrilatos. Pueden utilizarse diversas arquitecturas de polímeros que contienen monómeros acrílicos (por ejemplo, acrilamidas, acrilatos, etc.) en los ejemplos divulgados en la presente memoria, tal como polímeros ramificados, incluidos polímeros en estrella, polímeros en forma de estrella o de estrella-bloque, dendrímeros y similares. Por ejemplo, los monómeros (por ejemplo, acrilamida, acrilamida que contiene el catalizador, etc.) pueden incorporarse, ya sea aleatoriamente o en bloque, en las ramas (brazos) de un polímero en forma de estrella.
Para introducir el hidrogel 42 polimérico en el canal 40 de flujo, se puede generar una mezcla del hidrogel 42 polimérico y luego aplicarlo al sustrato 38A (que tiene el canal 40 de flujo definido al menos parcialmente en el mismo). En un ejemplo, el hidrogel 42 polimérico puede estar presente en una mezcla (por ejemplo, con agua o con etanol y agua). A continuación, la mezcla se puede aplicar a las superficies del sustrato (incluso en el o los canales 40 de flujo) usando recubrimiento por centrifugación, inmersión o recubrimiento por inmersión, recubrimiento por pulverización o flujo del material bajo presión positiva o negativa, u otra técnica adecuada. Estos tipos de técnicas depositan de manera general el hidrogel 42 polimérico sobre el sustrato 38A (por ejemplo, en el canal 40 de flujo y en las regiones 48 intersticiales que rodean el canal 40 de flujo). Se pueden usar otras técnicas de deposición selectiva (p. ej., que involucran una máscara, técnicas de impresión controlada, etc.) para depositar específicamente el hidrogel 42 polimérico en el canal 40 de flujo y no en las regiones 48 intersticiales.
En algunos ejemplos, la superficie del sustrato (incluida la parte que está expuesta en el canal 40 de flujo) se puede activar y luego se puede aplicar la mezcla (incluido el hidrogel 42 polimérico). En un ejemplo, se puede depositar un silano o un derivado de silano (p. ej., norbornenosilano) sobre la superficie del sustrato usando deposición de vapor, recubrimiento por centrifugación u otros métodos de deposición. En otro ejemplo, la superficie del sustrato puede exponerse a cenizas de plasma para generar agentes activadores de superficie (p. ej., grupos -OH) que pueden adherirse al hidrogel 42 polimérico.
Dependiendo del hidrogel 42 polimérico, la mezcla aplicada puede exponerse a un proceso de curado. En un ejemplo, el curado puede tener lugar a una temperatura en el intervalo de la temperatura ambiente (por ejemplo, aproximadamente 25 0C) a aproximadamente 95 0C durante un tiempo en el intervalo de aproximadamente 1 milisegundo a aproximadamente varios días.
En algunos ejemplos, se puede realizar un pulido para eliminar el hidrogel 42 polimérico de las regiones 48 intersticiales en el perímetro del canal o los canales 40 de flujo, mientras se deja el hidrogel 42 polimérico en la superficie del canal o canales de flujo 40 al menos sustancialmente intactos.
La celda de flujo 36 también incluye los cebadores 44, 46 de amplificación.
Se puede realizar un proceso de injerto para injertar los cebadores 44, 46 de amplificación en el hidrogel 42 polimérico en el canal 40 de flujo. En un ejemplo, los cebadores 44, 46 de amplificación se pueden inmovilizar en el hidrogel 42 polimérico mediante unión covalente de un solo punto en el extremo 5' de los cebadores 44, 46 o cerca de él. Esta unión deja i) una parte específica del adaptador de los cebadores 44, 46 libres para hibridarse con su fragmento de ácido nucleico afín (p. ej., la parte P5' unida al fragmento 14, 14') y ii) el grupo hidroxilo 3' libre para la extensión del cebador. Para este fin, puede utilizarse cualquier unión covalente adecuado. Algunos ejemplos de cebadores terminados que se pueden usar incluyen cebadores terminados en alquino, que se pueden unir a un resto azida del hidrogel 42 polimérico. Algunos ejemplos específicos de cebadores 44, 46 adecuados incluyen cebadores P5 y P7 utilizados en la superficie de celdas de flujo comerciales comercializadas por Illumina Inc. para la secuenciación en HISEQ™, HISEQX™, MISEQ™, MISEQDX™, MINISEQ™, NEXTSEQ™, NEXTSEQDX™, NOVASEQ™, GENOME ANALYZER™, ISEQ™ y otras plataformas de instrumentos.
En un ejemplo, el injerto puede implicar la deposición por flujo continuo (p. ej., usando una tapa adherida temporalmente o adherida permanentemente), recubrimiento por inmersión, recubrimiento por aspersión, dispensación en charco u otro método adecuado que adherirá los cebadores 44, 46 al hidrogel 42 polimérico en el canal de flujo 42. Cada una de estas técnicas ilustrativas puede utilizar una solución o mezcla de cebadores, que puede incluir los cebadores 44, 46, agua, un tampón y un catalizador. Con cualquiera de los métodos de injerto, los cebadores 44, 46 reaccionan con los grupos reactivos del hidrogel 42 polimérico en el canal 40 de flujo y no tienen afinidad por el sustrato 38A circundante. Como tales, los cebadores 44, 46 se injertan selectivamente en el hidrogel 42 polimérico en el canal 40 de flujo.
En el ejemplo que se muestra en la Fig. 5C, la celda de flujo 38 incluye un sustrato 38B multicapa, que incluye un soporte 52 y un material 50 modelado colocado sobre el soporte 52. El material 50 modelado define depresiones 54 separadas por regiones 48 intersticiales. Las depresiones 54 están ubicadas dentro de cada uno de los canales 40 de flujo.
En el ejemplo que se muestra en la Fig. 5C, el material 50 modelado se coloca sobre el soporte 52. Debe entenderse que cualquier material que pueda depositarse selectivamente, o depositarse y modelarse para formar las depresiones 54 y las regiones 48 intersticiales puede usarse para el material 50 modelado.
A modo de ejemplo, se puede aplicar selectivamente un óxido inorgánico al soporte 52 mediante deposición de vapor, impresión por aerosol o impresión por chorro de tinta. Algunos ejemplos de óxidos inorgánicos adecuados incluyen óxido de tantalio (p. ej., Ta2Os), óxido de aluminio (p. ej., AhOa), óxido de silicio (p. ej., SiO2), óxido de hafnio (p. ej., HfO2), etc.
Como otro ejemplo, se puede aplicar una resina al soporte 52 y luego modelarlo. Las técnicas de deposición adecuadas incluyen deposición química de vapor, recubrimiento por inmersión, recubrimiento por inmersión, recubrimiento por centrifugación, recubrimiento por pulverización, dispensación en charco, recubrimiento por pulverización ultrasónica, recubrimiento por rasqueta, impresión en aerosol, serigrafía, impresión por microcontacto, etc. Las técnicas de creación de patrones adecuadas incluyen fotolitografía, litografía de nanoimpresión (NIL), técnicas de estampado, técnicas de grabado, técnicas de moldeado, técnicas de micrograbado, técnicas de impresión, etc. Algunos ejemplos de resinas adecuadas incluyen una resina poliédrica oligomérica basada en silsesquioxano (POSS), una resina epoxi sin POSS, una resina de poli(etilenglicol), una resina de poliéter (p. ej., resinas epoxi con anillo abierto), una resina acrílica, una resina de acrilato, una resina de metacrilato, una resina de fluoropolímero amorfa (p. ej., CYTOP® de Bellex), y combinaciones de las mismas.
Como se usa en la presente memoria, el término “ silsesquioxano oligomérico poliédrico” (POSS) se refiere a una composición química que es un intermedio híbrido (p. ej., RSiO1.5) entre la de sílice (SiO2) y la silicona (R2SiO). Un ejemplo de POSS puede ser el descrito en Kehagias y col., Microelectronic Engineering 86 (2009), pp. 776-778. En un ejemplo, la composición es un compuesto de organosilicio con la fórmula química [RSiO3/2]n, donde los grupos R pueden ser iguales o diferentes. Algunos ejemplos de grupos R para POSS incluyen epoxi, azida/azido, un tiol, un poli(etilenglicol), un norborneno, una tetrazina, acrilatos y/o metacrilatos, o más, por ejemplo, grupos alquilo, arilo, alcoxi y/o haloalquilo. La composición de resina descrita en la presente memoria puede comprender una o más estructuras de jaula o núcleo diferentes como unidades monoméricas. La estructura poliédrica puede ser una estructura Ts, tal como:
Figure imgf000015_0001
y representada por:
Figure imgf000015_0003
Esta unidad monomérica tiene típicamente ocho brazos de grupos funcionales Ri a Rs .
La unidad monomérica puede tener una estructura de jaula con 10 átomos de silicio y 10 grupos R, denominada Tío, tal como:
Figure imgf000015_0002
o puede tener una estructura de jaula con 12 átomos de silicio y 12 grupos R, denominada T12, tal como:
Figure imgf000015_0004
El material basado en POSS puede incluir, como alternativa, estructuras de jaula T6, T14 o T16. El contenido medio de la jaula puede ajustarse durante la síntesis y/o controlarse mediante métodos de purificación, y puede usarse una distribución de tamaños de jaula de las unidades monoméricas en los ejemplos descritos en la presente memoria.
Como se muestra en la Fig. 5C, el material 50 modelado incluye las depresiones 54 definidas en él y las regiones 48 intersticiales que separan las depresiones 54 adyacentes. Se pueden contemplar muchos diseños diferentes de las depresiones 54, incluidos patrones regulares, repetitivos y no regulares. En un ejemplo, las depresiones 54 están dispuestas en una disposición reticular hexagonal para un empaquetamiento cerrado y una densidad mejorada. Otros diseños pueden incluir, por ejemplo, diseños rectilíneos (rectangulares), diseños triangulares, y así sucesivamente. En algunos ejemplos, el diseño o patrón puede ser un formato x-y de las depresiones 54 que se encuentran en filas y columnas. En algunos ejemplos diferentes, el diseño o patrón puede ser una disposición repetitiva de sitios 54 y/o regiones 48 intersticiales. En otros ejemplos adicionales, el diseño o patrón puede ser una disposición aleatoria de depresiones 54 y/o regiones 48 intersticiales. El patrón puede incluir puntos, almohadillas, rayas, remolinos, líneas, triángulos, rectángulos, círculos, arcos, cuadros, cuadrículas, diagonales, flechas, cuadrados y/o tramas.
El diseño o patrón de las depresiones 54 puede caracterizarse con respecto a la densidad de las depresiones 54 (el número de depresiones 54) en un área definida. Por ejemplo, las depresiones 54 pueden estar presentes a una densidad de aproximadamente 2 millones por mm2. La densidad puede ajustarse a diferentes densidades incluidas, por ejemplo, una densidad de aproximadamente 100 por mm2, aproximadamente 1000 por mm2, aproximadamente 0,1 millones por mm2, aproximadamente 1 millón por mm2, aproximadamente 2 millones por mm2, aproximadamente 5 millones por mm2, aproximadamente 10 millones por mm2, aproximadamente 50 millones por mm2 o más o menos. Debe entenderse además que la densidad de las depresiones 54 en el material 50 modelado puede ser de entre uno de los valores inferiores y uno de los valores superiores seleccionados entre los intervalos anteriores. A modo de ejemplo, una matriz de alta densidad puede caracterizarse por tener depresiones 54 separadas por menos de aproximadamente 100 nm, una matriz de densidad media puede caracterizarse por tener depresiones 54 separadas por aproximadamente 400 nm a aproximadamente 1 μm y una matriz de baja densidad puede caracterizarse por tener depresiones 54 separadas por más de aproximadamente 1 μm. Si bien se han proporcionado densidades ilustrativas, debe entenderse que puede usarse cualquier densidad adecuada. La densidad de las depresiones 54 puede depender, en parte, de la profundidad de las depresiones 54. En algunos casos, puede ser deseable que el espacio entre las depresiones 54 sea incluso mayor que los ejemplos enumerados en la presente memoria.
Además, o como alternativa, el diseño o patrón de las depresiones 54 puede caracterizarse en términos del espaciado promedio, o la separación desde el centro de la depresión 54 hasta el centro de una depresión 54 adyacente (espaciado de centro a centro) o desde el borde de una depresión 54 al borde de una depresión 54 adyacente (separación de borde a borde). El patrón puede ser regular, de modo que el coeficiente de variación alrededor del espaciado promedio sea pequeño, o el patrón puede ser no regular, en cuyo caso el coeficiente de variación puede ser relativamente grande. En cualquiera de los casos, el espaciado promedio puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 50 nm, aproximadamente 0,1 μm, aproximadamente 0,5 μm, aproximadamente 1 μm, aproximadamente 5 μm, aproximadamente 10 μm, aproximadamente 100 μm, o más, o menos. El espaciado promedio para un patrón particular de depresiones 54 puede estar entre uno de los valores inferiores y uno de los valores superiores seleccionados entre los intervalos anteriores. En un ejemplo, las depresiones 54 tienen un espaciado (separación de centro a centro) de aproximadamente 1,5 μm. Si bien se han proporcionado valores de espaciado promedio ilustrativos, debe entenderse que pueden utilizarse otros valores de espaciado promedio.
El tamaño de cada depresión 54 puede caracterizarse por su volumen, área de apertura, profundidad y/o diámetro.
Cada depresión 54 puede tener cualquier volumen que permita confinar un fluido. El volumen mínimo o máximo puede seleccionarse, por ejemplo, para acomodar el rendimiento (por ejemplo, multiplexidad), la resolución, los nucleótidos o la reactividad del analito esperada para usos posteriores de la celda de flujo 38. Por ejemplo, el volumen puede ser de al menos aproximadamente 1x10'3 μm3, al menos aproximadamente 1x10-2 μm3, al menos aproximadamente 0,1 μm3, al menos aproximadamente 1 μm3, al menos aproximadamente 10 μm3, al menos aproximadamente 100 μm3, o más. Como alternativa o además, el volumen puede ser de como máximo aproximadamente 1x104 μm3, como máximo aproximadamente 1x103 μm3, como máximo aproximadamente 100 μm3, como máximo aproximadamente 10 μm3, como máximo aproximadamente 1 μm3, como máximo aproximadamente 0,1 μm3, o menos.
El área ocupada por cada abertura de depresión se puede seleccionar en función de criterios similares a los establecidos anteriormente para el volumen. Por ejemplo, el área de cada abertura de depresión puede ser de al menos aproximadamente 1x10'3 μm2, al menos aproximadamente 1x10'2 μm2, al menos aproximadamente 0,1 μm2, al menos aproximadamente 1 μm2, al menos aproximadamente 10 μm2, al menos aproximadamente 100 μm2, o más. Como alternativa o además, el área puede ser de como máximo aproximadamente 1x103 μm2, como máximo aproximadamente 100 μm2, como máximo aproximadamente 10 μm2, como máximo aproximadamente 1 μm2, como máximo aproximadamente 0,1 μm2, como máximo aproximadamente 1x10-2 μm2, o menos. El área ocupada por cada abertura de depresión puede ser mayor, menor o encontrarse entre los valores especificados anteriormente.
La profundidad de cada depresión 54 puede ser lo suficientemente grande como para albergar parte del hidrogel 42 polimérico. En un ejemplo, la profundidad puede ser de al menos aproximadamente 0,1 μm, al menos aproximadamente 0,5 μm, al menos aproximadamente 1 μm, al menos aproximadamente 10 μm, al menos aproximadamente 100 μm o más. Como alternativa o además, la profundidad puede ser de como máximo aproximadamente 1x103 μm, como máximo aproximadamente 100 μm, como máximo aproximadamente 10 μm, o menos. En algunos ejemplos, la profundidad es de aproximadamente 0,4 μm. La profundidad de cada depresión 54 puede ser mayor que, menor que o encontrarse entre los valores especificados anteriormente.
En algunos casos, el diámetro o la longitud y anchura de cada depresión 54 puede ser de al menos aproximadamente 50 nm, al menos aproximadamente 0,1 μm, al menos aproximadamente 0,5 μm, al menos aproximadamente 1 μm, al menos aproximadamente 10 μm, al menos aproximadamente 100 μm, o más. Como alternativa o además, el diámetro o la longitud y el ancho pueden ser de como máximo aproximadamente 1 x103 μm, como máximo aproximadamente 100 μm, como máximo aproximadamente 10 μm, como máximo aproximadamente 1 μm, como máximo aproximadamente 0,5 μm, como máximo aproximadamente 0,1 μm, o menos (por ejemplo, aproximadamente 50 nm). En algunos ejemplos, el diámetro o la longitud y la anchura es de aproximadamente 0,4 μm. El diámetro o la longitud y la anchura de cada depresión 54 puede ser mayor que, menor que o encontrarse entre los valores especificados anteriormente.
En el ejemplo que se muestra en la Fig. 5C, el hidrogel 42 polimérico se coloca dentro de cada una de las depresiones 54. El hidrogel 42 polimérico se puede aplicar como se describe en referencia a la Fig. 5B, de modo que el hidrogel 42 polimérico esté presente en las depresiones 54 y no presente en las regiones intersticiales 48 circundantes.
51 bien no se muestra en la Fig. 5A, la Fig. 5B o la Fig. 5C, debe entenderse que la celda de flujo 36 también puede incluir una tapa unida al sustrato 38. En un ejemplo, la tapa se puede unir a al menos una parte del sustrato 38, por ejemplo, en algunas de las regiones 48 intersticiales. El enlace que se forma entre la tapa y el sustrato 38 puede ser un enlace químico o un enlace mecánico (por ejemplo, utilizando un cierre, etc.).
La tapa puede ser de cualquier material que sea transparente a una luz de excitación que se dirija hacia el sustrato 38. Como ejemplos, la tapa puede ser de vidrio (por ejemplo, borosilicato, sílice fundida, etc.), plástico o similar. Un ejemplo comercialmente disponible de vidrio de borosilicato adecuado es D 263®, comercializado por Schott North America Inc. Algunos ejemplos comercialmente disponibles de materiales plásticos adecuados, a saber polímeros de cicloolefina, son los productos ZEONOR® comercializados por Zeon Chemicals L.P.
La tapa puede unirse al sustrato 38 usando cualquier técnica adecuada, tal como unión por láser, unión por difusión, unión anódica, unión eutéctica, unión por activación de plasma, unión por frita de vidrio u otros métodos conocidos en la técnica. En un ejemplo, se puede usar una capa espaciadora para unir la tapa al sustrato 38. La capa espaciadora puede ser de cualquier material que selle al menos parte del sustrato 38 y la tapa entre sí. En algunos ejemplos, la capa espaciadora puede ser un material absorbente de radiación que ayude en la unión del sustrato 38 y la tapa.
En otros ejemplos, la celda de flujo 36 también puede incluir un sustrato 38 moldeado o no moldeado adicional unido al sustrato 38. Los sustratos 38 pueden unirse como se describe en la presente memoria.
Métodos
El método generalmente incluye generar una serie de imágenes de agrupamiento basadas en el tiempo para una pluralidad de fragmentos de biblioteca 14, 14' con la contigüidad preservada a partir de una muestra de genoma. Cada imagen de agrupamiento basada en el tiempo en la serie se genera secuencialmente introduciendo, en una celda de flujo 36, una muestra respectiva que incluye algunos de los fragmentos de biblioteca 14, 14' con la contigüidad preservada, en donde algunos de los fragmentos de biblioteca 14, 14' con la contigüidad preservada están unidos a un soporte sólido 16 (Fig. 1) o están unidos entre sí (por ejemplo, los fragmentos 34 unidos que se muestran en la Fig. 3); iniciando la liberación de los fragmentos de biblioteca 14, 14' con la contigüidad preservada del soporte sólido 16 o entre sí 34; amplificando los fragmentos de biblioteca 14, 14' con la contigüidad preservada para generar una pluralidad de cadenas molde respectivas; tiñendo las cadenas molde respectivas; y obteniendo imágenes de las cadenas molde respectivas.
Con el método o los métodos divulgados en la presente memoria, los fragmentos de biblioteca 14, 14' con la contigüidad preservada se utilizan en combinación con amplificación secuencial y formación de imágenes para generar la serie de imágenes de agrupamiento basadas en el tiempo. Cada imagen de agrupamiento basada en el tiempo registra la ubicación espacial y la orientación de las cadenas molde generadas con la muestra concreta. Como tales, estas imágenes se pueden utilizar para identificar ubicaciones de grupos (cadena molde), donde el grupo procede de una muestra particular que se introdujo en la celda de flujo en un momento determinado.
Los métodos pueden variar ligeramente dependiendo de si los complejos 10 se introducen en la celda de flujo 36 o si los fragmentos 34 unidos se introducen en la celda de flujo. A continuación se describirán los diversos ejemplos.
Métodos usando el complejo 10 o 10'
En este ejemplo, una muestra del genoma (p. ej., la muestra 30) se fragmenta para formar una pluralidad de fragmentos 14, 14' con la contigüidad preservada, cada uno de los cuales está unido a un soporte sólido 16. Debe entenderse que todos los fragmentos 14, 14' con la contigüidad preservada de la muestra 30 de genoma pueden no unirse al mismo soporte sólido 16; en cambio, los fragmentos 14, 14' con la contigüidad preservada asociados con porciones particulares de la muestra 30 de genoma pueden unirse a los respectivos soportes sólidos 16. Como tal, la muestra 30 de genoma se fragmenta para formar una pluralidad de complejos 10 o 10'. Esto se puede lograr como se describe en referencia a la Fig. 1, de la Fig. 2A a la Fig. 2C, la Fig. 3, o usando cualquier otro método de preservación de la contigüidad que incorpore adaptadores 18, 22 o 18', 22 a cada uno de los fragmentos 14, 14' para que sean fragmentos 12, 12' listos para la secuenciación.
Los complejos 10 o 10' formados utilizando la muestra genómica 30 pueden incorporarse a una mezcla. Como tal, cada uno de la pluralidad de fragmentos 14, 14' con la contigüidad preservada también se incorpora a la mezcla. El portador líquido de la mezcla puede ser un tampón, como el tampón T ris-HCl o el tampón de solución salina con citrato de sodio (SSC) 0,5x.
El portador líquido se puede añadir a la pluralidad de fragmentos 14, 14' con la contigüidad preservada (por ejemplo, presentes en los complejos 10 o 10') para formar inicialmente la mezcla, y luego la mezcla se puede diluir con un portador líquido adicional para generar un número predeterminado de muestras de dilución que se van a introducir individualmente en la celda de flujo 36 (o en un carril individual 40 de la misma).
El volumen final de la mezcla que se genera y, por tanto, la dilución de la mezcla, puede controlarse de cualquier manera deseable. En algunos casos, la dilución puede depender del volumen de la celda de flujo 36 (o, por ejemplo, de cada canal 40 de una celda de flujo multicanal) y del número deseado de muestras que se introducirán en la celda de flujo 36. En un ejemplo, el volumen de la celda de flujo 36 (o el canal 40 de la misma) puede usarse como factor de dilución limitante. Como tal, en algunos ejemplos, el líquido portador se puede agregar para diluir la mezcla hasta el volumen predeterminado, donde el volumen predeterminado se basa en i) el volumen de la celda de flujo 36 como una dilución limitante y ii) el número predeterminado de muestras de dilución que se introducirán en la celda de flujo 36. Como ejemplo, la celda de flujo 36 o un carril 40 de la celda de flujo 36 pueden tener un volumen de aproximadamente 50 μl y el número deseado de muestras puede ser 200. En este ejemplo, la mezcla se puede diluir hasta aproximadamente 10.000 μl. Como otro ejemplo, la celda de flujo 36 o un carril 40 de la celda de flujo 36 pueden tener un volumen de aproximadamente 100 μl y el número deseado de muestras puede ser 384. En este ejemplo, la mezcla se puede diluir hasta aproximadamente 38.400 μl.
El número deseado de muestras de dilución puede depender, por ejemplo, del volumen de la celda de flujo 36 y de la resolución deseada de las cadenas molde individuales en las respectivas imágenes de agrupamiento basadas en el tiempo. Con celdas de flujo 38 de menor volumen, puede ser deseable tener una mezcla más diluida para que cada muestra de dilución individual que se introduzca en la celda de flujo 36 contenga menos fragmentos de biblioteca 14, 14' con la contigüidad preservada (que si se usara una mezcla menos diluida). En este tipo de celda de flujo 36, menos fragmentos de biblioteca 14, 14' con la contigüidad preservada conducirán a menos cadenas molde, lo que puede mejorar la resolución de las cadenas molde en las respectivas imágenes de agrupamiento basadas en el tiempo. En un ejemplo, el número deseado de muestras puede variar de aproximadamente 100 muestras a aproximadamente 1000 muestras. En otros ejemplos, el número deseado de muestras de dilución que se prepararán a partir de la mezcla puede ser superior a 1000. El límite superior en el número de muestras de dilución puede depender, en parte, del marco de tiempo deseado en el que tendrá lugar el método general.
A continuación, la mezcla se puede dividir en el número predeterminado de muestras de dilución. En un ejemplo, la mezcla diluida se puede dividir de modo que todas las muestras de dilución se generen al mismo tiempo. En otro ejemplo, el volumen predeterminado de cualquier muestra de dilución puede separarse de la mezcla a granel cuando llega el momento de introducir esa muestra en la celda de flujo 36.
Las Fig. 6A a 6D ilustran un ejemplo de una celda de flujo 36 sin patrón (por ejemplo, como se muestra en la Fig. 5B) desde una vista superior durante diferentes etapas de la generación de imágenes de agrupamiento basadas en el tiempo.
Como se muestra esquemáticamente en las Fig. 6A a 6D, la celda de flujo 36 puede introducirse en un sistema que incluye un receptáculo 35 de celda de flujo; un sistema de control 37 de fluídica que incluye fluídica 39 de suministro para suministrar respectivamente una muestra 56A de dilución y una tinción (no mostrada) a una celda de flujo 36 colocada en el receptáculo 35 de celda de flujo; un sistema de iluminación 62 colocado para iluminar la celda de flujo 36 colocada en el receptáculo 35 de celda de flujo; un sistema 64 de detección colocado para capturar una imagen de la celda de flujo 36 colocada en el receptáculo 35 de celda de flujo; y un controlador 41 en comunicación operativa con el sistema de control 37 de fluídica, el sistema de iluminación 62 y el sistema 64 de detección, el controlador 41 hace que la fluídica de suministro 39 introduzca la muestra 56A de dilución en la celda de flujo 36 colocada en el receptáculo 35 de celda de flujo; hacer que la fluídica de suministro 39 introduzca la tinción en la celda de flujo 36 colocada en el receptáculo 35 de celda de flujo después de que se generen las cadenas molde 58A en la celda de flujo 36 colocada en el receptáculo 35 de celda de flujo a partir de fragmentos de biblioteca con la contigüidad preservada presentes en la muestra 56A de dilución; hacer que el sistema de iluminación 62 ilumine las cadenas molde teñidas en la celda de flujo 36 colocada en el receptáculo 35 de celda de flujo; y hacer que el sistema 64 de detección tome imágenes de las cadenas molde teñidas e iluminadas en la celda de flujo 36 colocada en el receptáculo 35 de celda de flujo.
Cuando está en posición, la celda de flujo 36 está en comunicación fluida con el sistema de control 39 de fluídica (por ejemplo, bombas, válvulas y similares) y está en comunicación óptica con un sistema de iluminación 62 y un sistema 64 de detección.
En la Fig. 6A, se introduce una primera de las muestras 56A de dilución (incluidos algunos de los complejos 10 o 10', que se muestran como 10A en la Fig. 6A) en la celda de flujo 36. La introducción de cualquiera de las respectivas muestras 56A de dilución (o, por ejemplo, 56B en la Fig. 6C) implica dirigir fluidamente una de las muestras 56A, 56B de dilución a la celda de flujo 36. La muestra 56A de dilución puede introducirse, por ejemplo, en un cartucho 45, y el sistema de control 37 de fluídica puede transportar fluidamente la muestra 56A de dilución desde el cartucho 45 al canal 40 de flujo de la celda de flujo 36 usando la fluídica de suministro 39 (por ejemplo, bombas, válvulas y similares).
Dada la concentración de complejos 10A en la muestra 56A de dilución, la mayoría de los complejos 10A, si no todos, se asentarán sobre el hidrogel 42 polimérico y cualquier cebador 44, 46 sobre el mismo (que no se muestran en las Fig. 6A a 6D). En algunos ejemplos, los complejos 10A pueden asentarse y permanecer en el canal 40 de flujo o en las depresiones 54 debido a la profundidad del canal 40 de flujo o de las depresiones 54. En otros ejemplos, el canal 40 de flujo o las depresiones 54 pueden incluir un sitio de captura al que se adhieren los complejos 10A.
Debe entenderse que algunos complejos 10A pueden no asentarse, y estos complejos 10A se eliminarán de la celda de flujo 36 antes de los procesos posteriores. Como tal, algunos ejemplos del método incluyen lavar los complejos 10A no atrapados de la celda de flujo 36. El lavado puede implicar la introducción de un fluido en la celda de flujo 36. El flujo puede empujar cualquier complejo 10A que no se haya asentado y/o adherido a través de un puerto de salida de la celda de flujo 36.
Este ejemplo del método incluye iniciar a continuación la liberación de los fragmentos de biblioteca 14, 14' con la contigüidad preservada de los respectivos soportes sólidos 16 a los que están unidos. En este ejemplo, los fragmentos de ácido nucleico 12, 12' listos para la secuenciación (incluidos los fragmentos de biblioteca 14, 14' con la contigüidad preservada y los adaptadores 18, 22 o 18', 22 unidos a ellos) se liberan de los respectivos soportes sólidos 16. En la Fig. 6A, la liberación de los fragmentos de ácido nucleico 12, 12' listos para la secuenciación de los soportes sólidos 16 está representada por las flechas que apuntan hacia afuera desde cada soporte sólido 16.
La liberación de los fragmentos de ácido nucleico 12, 12' listos para la secuenciación puede iniciarse de varias formas diferentes. En un ejemplo, iniciar la liberación implica calentar la celda de flujo 36. En este ejemplo, el sistema puede incluir un calentador 43. El controlador 41 puede hacer que el calentador 43 inicie la liberación de algunos de los fragmentos de biblioteca 12, 12' con la contigüidad preservada del soporte sólido 16 o entre sí. Como ejemplo, se pueden usar temperaturas superiores a 70 0C para romper al menos parcialmente los enlaces y así iniciar la liberación de los fragmentos 12, 12' de ácido nucleico listos para la secuenciación. En otro ejemplo, iniciar la liberación implica introducir un agente de escisión en la celda de flujo 36. El sistema de control 37 de fluídica se puede usar para administrar el agente de escisión. El agente de escisión puede iniciar la liberación química, enzimática o fotoquímica de los fragmentos de ácido nucleico 12, 12' listos para la secuenciación del soporte sólido 16. En estos ejemplos, otro estímulo, tal como calor o luz, puede desencadenar que el agente de escisión libere los fragmentos de ácido nucleico 12, 12' listos para la secuenciación del soporte sólido 16. Como ejemplo, se puede introducir biotina libre como agente de escisión, y se puede usar calentamiento a aproximadamente 92 0C para inducir la liberación de la biotina-oligo del soporte sólido 16.
Los fragmentos de ácido nucleico 12, 12' listos para la secuenciación liberados se transportan desde el soporte sólido 16 y se siembran en el hidrogel 42 polimérico. Más específicamente, los cebadores de amplificación 46, 48 siembran los fragmentos 12, 12' de ácido nucleico listos para la secuenciación liberados de una manera relativamente confinada. En un ejemplo, la siembra se logra mediante hibridación entre la primera o la segunda secuencia del fragmento 12, 12' y uno complementario de los cebadores 46, 48 en el hidrogel 42 polimérico en la celda de flujo 36. La siembra se puede realizar a una temperatura de hibridación adecuada para los fragmentos 12, 12' de ácido nucleico listos para la secuenciación y los cebadores 46, 48. El calentador 43 puede controlarse para que la celda de flujo 36 alcance la temperatura de siembra.
Se puede realizar un proceso de lavado para eliminar las bolas.
Los fragmentos de ácido nucleico 12, 12' listos para la secuenciación sembrados se pueden amplificar usando cualquier método adecuado, como la generación de grupos. En un ejemplo de generación de grupos, los fragmentos 12, 12' de ácido nucleico listos para la secuenciación liberados se copian a partir de los cebadores 46, 48 hibridados por extensión 3' usando una ADN polimerasa de alta fidelidad. Los fragmentos 12, 12' de ácido nucleico listos para la secuenciación originales se desnaturalizan, dejando las copias inmovilizadas dentro del canal 40 de flujo o algunas de las depresiones 54. Puede usarse cualquier proceso de amplificación clonal. En un ejemplo, puede usarse amplificación de puente isotérmico para amplificar las copias inmovilizadas. Por ejemplo, los moldes copiados se enlazan para hibridar con un cebador 46, 48 complementario adyacente, y una polimerasa copia los moldes copiados para formar puentes bicatenarios, que se desnaturalizan para formar dos cadenas monocatenarias. Estas dos cadenas se enlazan e hibridan con los cebadores 46, 48 complementarios adyacentes y se extienden de nuevo para formar dos nuevos bucles bicatenarios. El proceso se repite en cada copia del molde mediante ciclos de desnaturalización isotérmica y amplificación para crear grupos clonales densos. Cada grupo de puentes bicatenarios se desnaturaliza. En un ejemplo, la cadena inversa se elimina mediante la escisión de bases específicas, dejando cadenas de polinucleótidos molde directas. Debe entenderse que el agrupamiento da como resultado la formación de varias cadenas molde 58A en el canal 40 de flujo o en algunas de las depresiones 54. En algunos ejemplos, el controlador 41 hace que el calentador 43 ejecute un ciclo térmico para amplificar los fragmentos 12, 12' de ácido nucleico listos para la secuenciación sembrados.
La Fig. 6B ilustra los grupos 60A de las cadenas molde 58A generadas a partir de los complejos 10A de la primera muestra 56A de dilución (compartimento). Los grupos 60A en la Fig. 6B se describen para mayor claridad. Aunque la Fig. 6B ilustra cuatro grupos 60A, debe entenderse que el número de grupos 60A dependerá del número de complejos 10A introducidos en la muestra 56A, así como del número de fragmentos de ácido nucleico 12, 12' listos para la secuenciación liberados de cada soporte sólido 16. Se genera un grupo 60A a partir de cada uno de los fragmentos 12, 12' de ácido nucleico listos para la secuenciación liberados. Además, los fragmentos 12, 12' de ácido nucleico listos para la secuenciación liberados pueden difundirse a través de la superficie de la celda de flujo y, por lo tanto, pueden generarse grupos 60A a lo largo de la superficie de la celda de flujo.
Después de generar los grupos 60A para la primera muestra 56A de dilución, se introduce una tinción en la celda de flujo 36. Puede usarse cualquier tinción fluorescente que sea capaz de teñir las cadenas molde 58A. Algunos ejemplos de colorantes fluorescentes adecuados incluyen la familia de tinciones SYBR@ de Molecular Probes, Inc. (p. ej., SYBR@ Green, SYBR@ Gold, SYBR@ Safe, etc.), bromuro de etidio, yoduro de propidio, violeta cristal, tinción EVAGREEN® (de Biotium), DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol), o similares. La tinción se introduce en la celda de flujo 36, por ejemplo, desde un segundo cartucho (no mostrado), se deja incubar durante un período de tiempo adecuado para teñir las cadenas molde 58A y luego se elimina de la celda de flujo 36.
A continuación, el sistema de iluminación 62 puede usarse para iluminar las cadenas molde 58A teñidas en la celda de flujo 36. El sistema de iluminación puede incluir una fuente de luz y una pluralidad de componentes ópticos. Algunos ejemplos de fuentes de luz pueden incluir láseres, lámparas de arco, LED o diodos láser. Los componentes ópticos pueden ser, por ejemplo, reflectores, dicroicos, divisores de haz, colimadores, lentes, filtros, cuñas, prismas, espejos, detectores y similares. El sistema de iluminación puede posicionarse operativamente para dirigir una luz de excitación a la superficie de la celda de flujo que corresponde a la tinción utilizada.
El sistema 64 de detección puede usarse para capturar una imagen h de las cadenas molde 58A fluorescentes. Esta imagen h es la imagen de agrupamiento basada en el tiempo para la muestra 56A de dilución, dado que representa una ubicación espacial y orientación de la cadena molde 58A asociada con la muestra 56A de dilución. Se puede usar cualquier cámara adecuada para capturar una imagen h de los grupos 60A en la celda de flujo 36.
La imagen h puede almacenarse electrónicamente para su posterior recuperación y uso. Como tal, algunos ejemplos del sistema incluyen un componente de almacenamiento 47 electrónico para almacenar la imagen h. En el registro electrónico, la imagen I1 puede vincularse a la muestra 56A de dilución. También puede asignarse un registro temporal a la imagen I1. Como tal, algunos ejemplos del método incluyen la asignación de cada imagen de agrupamiento basada en el tiempo I1 en la serie un registro temporal de la introducción de la muestra respectiva que incluye algunos de los fragmentos de biblioteca con la contigüidad preservada. El registro temporal puede incluir una marca de tiempo que indica cuándo se introdujo y/o se obtuvo la imagen de la muestra 56A de dilución, un número de etapa en una secuencia de introducción y/u obtención de la imagen (por ejemplo, muestra 1 de 200, muestra 2 de 200, ... muestra X de 200), o combinaciones de los mismos.
Puede tener lugar un lavado después de que se formen imágenes de los grupos 60A en la celda de flujo 36. Se puede usar agua, un tampón u otra solución de lavado suave.
Los procesos mostrados y descritos con referencia a la Fig. 6A y la Fig. 6B se repiten a continuación con una segunda muestra 56B de dilución (mostrada en la Fig. 6C).
En la Fig. 6C, la segunda muestra 56B de dilución se introduce en la celda de flujo 36. Los complejos 10B (que pueden ser los complejos 10 o 10') se sedimentan y/o adhieren a la superficie de la celda de flujo.
Como se muestra en la Fig. 6C, el método incluye iniciar a continuación la liberación de los fragmentos de biblioteca 14, 14' con la contigüidad preservada de los respectivos soportes sólidos 16 a los que están unidos. En este ejemplo, los fragmentos de ácido nucleico 12, 12' listos para la secuenciación (incluidos los fragmentos de biblioteca 14, 14' con la contigüidad preservada y los adaptadores 18, 22 o 18', 22 unidos a ellos) se liberan de los respectivos soportes sólidos 16.
Los fragmentos de ácido nucleico 12, 12' listos para la secuenciación liberados se transportan desde el soporte sólido 16 y se siembran en el hidrogel 42 polimérico. Los fragmentos de ácido nucleico 12, 12' listos para la secuenciación sembrados se pueden amplificar usando cualquier método adecuado, como la generación de grupos. Debe entenderse que esta ronda de agrupamiento da como resultado la formación de varias cadenas molde 58B adicionales en el canal 40 de flujo o en algunas de las depresiones 54.
La figura 6D ilustra los grupos 60B de las cadenas molde 58B generadas a partir de los respectivos complejos 10B de la segunda muestra 56B de dilución (compartimento). Los grupos 60A y 60B en la Fig. 6D se describen para mayor claridad. Aunque la Fig. 6D ilustra tres grupos 60B, debe entenderse que el número de grupos 60B dependerá del número de complejos 10B introducidos en la muestra 56B, así como del número de fragmentos de ácido nucleico 12, 12' listos para la secuenciación liberados de cada soporte sólido 16.
Después de generar los grupos 60B para la segunda muestra 56B de dilución, la tinción se vuelve a introducir en la celda de flujo 36. El mismo colorante utilizado para teñir las cadenas molde 58A se puede utilizar para teñir las cadenas molde 58B y cualquier cadena de molde generada posteriormente.
A continuación, el sistema de iluminación 62 se puede usar para iluminar las cadenas molde 58A y 58B teñidas en la celda de flujo 36. El sistema 64 de detección puede usarse para capturar una imagen I2 de las cadenas molde 58A y 58B fluorescentes en los respectivos grupos 60A y 60B.
La imagen I2 también puede almacenarse electrónicamente para su posterior recuperación y uso. En el registro electrónico, la imagen I2 puede vincularse a la muestra 56B de dilución. También puede asignarse un registro temporal a la imagen I2. El registro temporal puede incluir una marca de tiempo que indique cuándo se obtuvo la imagen de la muestra 56B de dilución, un número de etapa en una secuencia (por ejemplo, muestra 2 de 200), o combinaciones de los mismos.
Puede tener lugar un lavado después de que se formen imágenes de los grupos 60A, 60B en la celda de flujo 36. Se puede usar agua, un tampón u otra solución de lavado suave.
Los procesos mostrados y descritos con referencia a la Fig. 6A y la Fig. 6B pueden repetirse, por ejemplo, utilizando el sistema descrito, para el número de muestras de dilución derivadas de la mezcla original. Cada imagen adicional I3, I4, ... Ix representará nuevos grupos 60C, 60D, ... 60X de las cadenas molde 58C, 58D, ... 58X generadas con la introducción de una muestra 56C, 56D, ... 56X de dilución respectiva. Todas las imágenes Ii , I2, ... Ix obtenidas de las muestras 56A, 56B, ... 56X de dilución respectivas están asociadas con una mezcla particular y, por lo tanto, con una molécula de ácido nucleico 30 más larga en particular.
Dado que cada imagen secuencial I2, I3, I4, ... Ix representa un grupo 60B, 60C, 60D, ... 60X recién formado con respecto a la imagen Ii , I2, I3, ... Ix, inmediatamente anterior, se puede usar la sustracción de imágenes para generar una imagen de grupo resuelta para cada muestra introducida después de la primera muestra 56A. En la Fig. 6 se muestran algunas imágenes RIx de grupo resueltas.
La Fig. 7 representa imágenes Ii , I2, I3, I4, I5, I6 tomadas de seis muestras 56A, 56B, 56C, 56D, 56E, 56F de dilución diferentes que se introducen, amplifican, tiñen y de las que se obtienen imágenes secuencialmente, como se describe en referencia a la Fig. 6A y la Fig. 6B. Como se representa, se generan respectivamente nuevos grupos 60A, 60B, 60C, 60D, 60E y 60F para cada una de las muestras 56A, 56B, 56C, 56D, 56E, 56F de dilución recién introducidas y procesadas.
Dado que la imagen Ii de la primera muestra 56A incluye grupos 60A de una muestra, no es necesario generar una imagen de grupo resuelta, ya que la imagen Ii original puede usarse para la identificación espacial de los grupos 60A. Para cada muestra introducida después de la primera muestra 56A, se genera una imagen RI2, RI3, RI4, RI5, RI6 de grupo resuelta para cada una de las otras imágenes I2, I3, I4, I5, I6. Como ejemplo, la imagen Ii (que representa cadenas molde 58A en grupos 60A) se pueden restar de la imagen I2 (que representa cadenas molde 58A en grupos 60A y cadenas molde 58B en grupos 60B) para generar una imagen de grupo resuelta RI2 para la segunda muestra 56B. Esta imagen RI2 de grupo resuelta representa una ubicación espacial y orientación de las cadenas molde 58B en los grupos 60B asociados con la segunda muestra 56B. Para otro ejemplo, pueden restarse la imagen Ii (que representa las cadenas molde 58A en los grupos 60A) y la imagen I2 (que representa las cadenas molde 58A en los grupos 60A y las cadenas molde 58B en los grupos 60B) de la imagen I3 (que representa las cadenas molde 58A en los grupos 60A, las cadenas molde 58B en los grupos 60B y las cadenas molde 58C en los grupos 60C) para generar una imagen RI3 de grupo resuelta de una tercera muestra, por ejemplo, 56C. Esta imagen RI3 de grupo resuelta representa una ubicación espacial y orientación de las cadenas molde 58C en los grupos 60C asociados con una tercera muestra 56C. La imagen RI4, RI5 y RI6 de grupo resuelta puede generarse de un modo similar, restando cualquiera de las imágenes anteriores.
Debe entenderse que la sustracción de imágenes puede realizarse para cualquiera de Ii , I2, I3, ... Ix en una serie. La imagen RIx de grupo resuelta resultante de cualquier muestra 56X de dilución concreta representa la ubicación espacial y la orientación de las cadenas molde 58X asociadas con dicha muestra 56X de dilución.
Las imágenes de grupos resueltas pueden almacenarse para su análisis posterior.
Métodos usando los fragmentos 34 unidos
En este ejemplo, se fragmenta una muestra del genoma para formar una pluralidad de fragmentos i4 , 14' con la contigüidad preservada que se unen entre sí, por ejemplo, como fragmentos 34 unidos. Debe entenderse que todos los fragmentos i4 , i4 ' con la contigüidad preservada de la muestra del genoma pueden no unirse entre sí; en cambio, el proceso que se muestra en la Fig. 4 puede resultar en la formación de varios fragmentos 34 unidos.
Los fragmentos 34 unidos formados utilizando la muestra del genoma pueden incorporarse a una mezcla. Como tal, cada uno de la pluralidad de fragmentos i4 , i4 ' con la contigüidad preservada también se incorpora a la mezcla. El portador líquido de la mezcla puede ser un tampón, como el tampón T ris-HCl o el tampón de solución salina con citrato de sodio (SSC) 0,5x.
El portador líquido se puede añadir a una pluralidad de fragmentos 34 unidos para formar inicialmente la mezcla y a continuación, puede diluirse la mezcla con un portador líquido adicional para generar un número predeterminado de muestras de dilución que se van a introducir individualmente en la celda de flujo 36 (o un carril 40 individual de la misma).
El volumen final de la mezcla que se genera, y por lo tanto la dilución de la mezcla, puede controlarse de cualquier manera deseable y como se describe en la presente memoria.
A continuación, la mezcla se puede dividir en el número predeterminado de muestras de dilución. En un ejemplo, la mezcla diluida se puede dividir de modo que todas las muestras de dilución se generen al mismo tiempo. En otro ejemplo, el volumen predeterminado de cualquier muestra de dilución puede separarse de la mezcla a granel cuando llega el momento de introducir esa muestra en la celda de flujo 36.
En este método ilustrativo, los fragmentos 34 unidos que se muestran en la Fig. 4 se introducen en el canal de flujo como parte de una de las muestras de dilución. Un ejemplo de esta muestra de dilución 66A se representa en la Fig. 8.
Como se muestra en la Fig. 8, dentro de la celda de flujo 36, las transposasas 32 se eliminan de los fragmentos 34 unidos. Esto puede lograrse, por ejemplo, usando SDS o proteinasa. La eliminación de las transposasas 32 libera los respectivos fragmentos 14, 14' con la contigüidad preservada (y cualquier cadena 26', 28' unida directa o indirectamente a los mismos) de los fragmentos 14, 14' con la contigüidad preservada adyacentes. En otras palabras, los subfragmentos 72 de los fragmentos 34 unidos se liberan y son capaces de sembrarse en el hidrogel 42 polimérico a través de las cadenas 26' transferidas. Como se muestra esquemáticamente en la Fig. 8, las cadenas 26' transferidas se hibridan con cebadores 46 respectivos y complementarios en la superficie de la celda de flujo 36. En algunos casos, se puede aplicar calor durante la hibridación. La aplicación de calor puede depender de la temperatura de fusión de las cadenas 26' transferidas. Como ejemplo, la parte P5' de la cadena 26' transferida se hibrida con el cebador de amplificación complementario 46 de P5 unido al hidrogel 42 polimérico.
Se puede hacer fluir una solución de lavado a través del canal de flujo de la celda de flujo 36 para eliminar las transposasas 32 de la celda de flujo 36. Un ejemplo de una solución de lavado adecuada incluye SDS, que puede eliminar la transposasa. Se puede usar una segunda solución de lavado, como TRIS o un tampón de lavado de hibridación, para enjuagar la celda de flujo 36.
Antes de la amplificación, este ejemplo del método incluye además la introducción de una segunda parte de secuencia (p. ej., cadenas 28' no transferidas) en cada uno de los fragmentos de biblioteca 14, 14' con la contigüidad preservada hibridados en un extremo opuesto al extremo hibridado. Como tal, en algunos ejemplos del método, cada uno de los fragmentos de biblioteca 14, 14' con la contigüidad preservada incluye una primera parte de secuencia en un primer extremo que se hibrida con una primera secuencia de cebador 46 sobre una superficie de la celda de flujo 26; y antes de la amplificación, el método comprende además unir una segunda parte de la secuencia a cada uno de los fragmentos de biblioteca 14, 14' con la contigüidad preservada hibridados en un segundo extremo opuesto al primero, siendo la segunda parte de la secuencia idéntica a una segunda secuencia 48 de cebador en la superficie de la celda de flujo 36, de modo que la copia de la segunda parte de la secuencia pueda hibridarse con la segunda secuencia 48 de cebador.
La introducción de la segunda parte de la secuencia puede realizarse usando ligamiento por extensión. En un ejemplo, se puede iniciar ligamiento por extensión (como se representa por las flechas 74 en la Fig. 8) para unir las cadenas 28' no transferidas a los fragmentos 14, 14' correspondientes. En un ejemplo, el ligamiento por extensión se puede iniciar introduciendo una mezcla de ligamiento por extensión en la celda de flujo 36 y calentándola a una temperatura adecuada para la actividad enzimática (p. ej., en el intervalo de aproximadamente 37 0C a aproximadamente 50 0C).
La mezcla de ligamiento por extensión puede incluir una enzima de ligamiento (p. ej., ADN ligasa) que cataliza la formación de un enlace entre una cadena 28' no transferida y su correspondiente fragmento 14 o 14'. Como se describe en referencia a la Fig. 4, las cadenas 28' no transferidas incluyen una segunda secuencia de cebador de secuenciación (por ejemplo, una secuencia de cebador de secuenciación de lectura 2) y una segunda secuencia (P7) que es idéntica a al menos una parte de otro de los cebadores 48 de amplificación (P7) en la superficie de la celda de flujo. Esta segunda secuencia permite generar una copia complementaria, por ejemplo, P7', durante la amplificación que puede hibridar con el cebador 48 de amplificación (P7) en la superficie de la celda de flujo durante la agrupación. Como tal, el ligamiento da como resultado la formación de fragmentos de biblioteca 12, 12' listos para la secuenciación unidos a la superficie de la celda de flujo.
La mezcla de ligamiento por extensión también puede incluir un grupo de bloqueo que se une a los extremos expuestos de los cebadores 46 para evitar la extensión no deseada en estos cebadores 46. Como alternativa, los cebadores 46 se pueden injertar en la superficie con grupos de bloqueo (p. ej., un fosfato en 3') unidos a los mismos. En otro ejemplo más, no se pueden usar grupos de bloqueo.
A medida que los fragmentos 12, 12' resultantes se unen entre sí, se puede usar calentamiento para disociar los fragmentos 12' de los fragmentos 12. Los fragmentos 12' que no están hibridados con los cebadores 46 pueden eliminarse de la celda de flujo 36 con un lavado.
Cuando se usa, cualquier cebador bloqueado 46 se puede desbloquear (p. ej., usando cinasa u otro agente de desbloqueo adecuado) para que se pueda realizar la amplificación. En este ejemplo, la amplificación se puede realizar utilizando cualquier método adecuado, como la generación de grupos. La generación de grupos se puede realizar como se describe en la presente memoria en referencia a la Fig. 6A. Puede usarse el sistema descrito con referencia a la Fig. 6A.
La Fig. 9A ilustra los grupos 70A de las cadenas molde 68A generadas a partir de los fragmentos 34 unidos de la muestra 66A de dilución (mostrada en la Fig. 8). Los grupos 70A en la Fig. 9A se describen para mayor claridad. Si bien la Fig. 9A ilustra cuatro grupos 70A, debe entenderse que el número de grupos 70A dependerá del número de fragmentos 34 unidos introducidos en la muestra 66A, así como del número de fragmentos 12, 12' de ácido nucleico listos para la secuenciación liberados de los fragmentos 34 unidos.
Después de generar los grupos 70A para la primera muestra de dilución 66A, se introduce una tinción en la celda de flujo 36 como se describe en referencia a la figura 6B. La tinción se introduce en la celda de flujo 36, se deja incubar durante un período de tiempo adecuado para teñir las cadenas molde 68A y luego se elimina de la celda de flujo 36.
A continuación, el sistema de iluminación 62 puede usarse para iluminar las cadenas molde 68A teñidas en la celda de flujo 36, y el sistema 64 de detección puede utilizarse para capturar una imagen I1 de las cadenas molde 68A fluorescentes. Esta imagen I1 es la imagen de agrupamiento basada en el tiempo para la muestra 66A de dilución, dado que representa una ubicación espacial y orientación de la cadena molde 68A asociada con la muestra 66A de dilución.
La imagen I1 puede almacenarse electrónicamente para su posterior recuperación y uso. En el registro electrónico, la imagen I1 puede vincularse a la muestra 66A de dilución. También puede asignarse un registro temporal a la imagen I1. El registro temporal puede incluir una marca de tiempo que indica cuándo se introdujo y/o se obtuvo la imagen de la muestra 66A de dilución, un número de etapa en una secuencia de introducción y/u obtención de la imagen (por ejemplo, muestra 1 de 200, muestra 2 de 200, ... muestra X de 200), o combinaciones de los mismos.
Puede tener lugar un lavado después de que se formen imágenes de los grupos 70A en la celda de flujo 36. Se puede usar agua, un tampón u otra solución de lavado suave.
Los procesos mostrados y descritos con referencia a la Fig. 8 y la Fig. 9A se repiten a continuación con una segunda muestra 66B de dilución (mostrada en la Fig. 9B).
En la Fig. 9B, la segunda muestra 66B de dilución se introduce en la celda de flujo 36. Los fragmentos 34 unidos se pueden dividir en los subfragmentos 72 como se describe en referencia a la Fig. 8. Una cadena 26 transferida de al menos algunos de los subfragmentos 72 se hibridará con cebadores 46 de amplificación complementarios en la celda de flujo 36. A continuación, se pueden realizar el ligamiento por extensión y los demás procesos descritos con referencia a la Fig. 8, lo que da como resultado fragmentos de ácido nucleico 12 listos para la secuenciación unidos a la superficie de la celda de flujo.
La generación de grupos se puede realizar como se describe en la presente memoria en referencia a la Fig. 6A.
La Fig. 9C ilustra los grupos 70B de las cadenas molde 68B generadas a partir de los fragmentos 34 unidos de la segunda muestra 66B de dilución. Los grupos 70A y 70B en la Fig. 9C se describen para mayor claridad. Si bien la Fig. 9C ilustra dos grupos 70B, debe entenderse que el número de grupos 70B dependerá del número de fragmentos 34 unidos introducidos en la muestra 66B, así como del número de fragmentos 12, 12' de ácido nucleico listos para la secuenciación liberados de los fragmentos 34 unidos.
Después de generar los grupos 70B para la segunda muestra de dilución 66B, la tinción se vuelve a introducir en la celda de flujo 36. El mismo colorante utilizado para teñir las cadenas molde 68A se puede utilizar para teñir las cadenas molde 68B y cualquier cadena de molde generada posteriormente.
A continuación, el sistema de iluminación 62 se puede usar para iluminar las cadenas molde 68A y 68B teñidas en la celda de flujo 36. El sistema 64 de detección puede usarse para capturar una imagen I2 de las cadenas molde 68A y 68B fluorescentes en los respectivos grupos 70A y 70B.
La imagen I2 también puede almacenarse electrónicamente para su posterior recuperación y uso. En el registro electrónico, la imagen I2 puede vincularse a la muestra 66B de dilución. También puede asignarse un registro temporal a la imagen I2. El registro temporal puede incluir una marca de tiempo que indique cuándo se obtuvo la imagen y/o se introdujo la muestra 56B de dilución, un número de etapa en una secuencia (por ejemplo, muestra 2 de 1000), o combinaciones de los mismos.
Puede tener lugar un lavado después de que se formen imágenes de los grupos 70A, 70B en la celda de flujo 36. Se puede usar agua, un tampón u otra solución de lavado suave.
Los procesos mostrados y descritos con referencia a la Fig. 9B y la Fig. 9C pueden repetirse a continuación para el número de muestras de dilución procedentes de la mezcla original. Cada imagen adicional I3, I4, ... Ix representará nuevos grupos 70C, 70D, ... 70X de las cadenas molde 68C, 68D, ... 68X generadas con la introducción de una muestra 66C, 66D, ... 66X de dilución respectiva. Todas las imágenes I1, I2, ... Ix obtenidas de las muestras 66A, 66B, ... 66X de dilución respectivas están asociadas con una mezcla particular y, por lo tanto, con una molécula de ácido nucleico 30 más larga en particular.
Dado que cada imagen secuencial I2, I3, I4, ... Ix representa un grupo 70B, 70C, 70D, ... 70X recién formado con respecto a la imagen Ii , I2, I3, ... Ix, inmediatamente anterior, se puede usar la sustracción de imágenes para generar una imagen de grupo resuelta para cada muestra introducida después de la primera muestra 66A. Las imágenes de grupo resueltas RIx puede generarse como se describe en referencia a la Fig. 7.
Debe entenderse que la sustracción de imágenes puede realizarse para cualquiera de Ii , I2, I3, ... Ix en una serie. La imagen RIx de grupo resuelta resultante de cualquier muestra 66X de dilución concreta representa la ubicación espacial y la orientación de las cadenas molde 68X asociadas con dicha muestra 66X de dilución.
Las imágenes de grupos resueltas pueden almacenarse para su análisis posterior.
Otros métodos
En lugar de introducir muestras de dilución 56A, 66A individuales, la mezcla diluida puede difundirse en la celda de flujo en volúmenes predeterminados, y el procesamiento en la celda de flujo 38 puede tener lugar como se describe en la presente memoria para amplificar, teñir y formar imágenes de las cadenas molde 58X, 68X generadas. La difusión puede controlarse de modo que se introduzca un volumen predeterminado de una vez.
Como tal, algunos ejemplos del método incluyen generar una imagen de agrupamiento basada en el tiempo para cada una de las muestras de dilución limitante introducidas en la celda de flujo 36: controlando la difusión de la mezcla en la celda de flujo para que se introduzca una de las muestras de dilución en la celda de flujo 36 a la vez; iniciar la liberación de fragmentos de biblioteca 14, 14' con la contigüidad preservada desde un soporte sólido 16 o entre sí (p. ej., desde fragmentos 34 unidos) en una de las muestras de dilución imitante en la celda de flujo 36; amplificar los fragmentos de biblioteca 14, 14' con la contigüidad preservada para generar una pluralidad de cadenas molde 58A, 68A respectivas; teñir las cadenas molde 58A, 68A respectivas; y obtener imágenes de las cadenas molde 58A, 68A respectivas.
Secuenciación y análisis
Cuando todas las muestras de dilución de una mezcla se amplifican y se obtienen imágenes como se describe en la presente memoria, la celda de flujo 36 está lista para una operación de secuenciación. Se puede usar una variedad de estrategias o tecnologías de secuenciación, incluidas técnicas a menudo denominadas secuenciación por síntesis (SBS), secuenciación de matriz cíclica, secuenciación por ligamiento, pirosecuenciación, etc.
A modo de ejemplo, una reacción de secuenciación por síntesis (SBS) se puede realizar en un sistema, tal como HISEQ™, HISEQX™, MISEQ™, MISEQDX™, MINISEQ™, NOVASEQ™, NEXTSEQDX™, ISEQ™, NEXTSEQ™, u otros sistemas de secuenciación de Illumina (San Diego, CA). En SBS, la extensión de los cebadores de secuenciación a lo largo de las cadenas molde 58A, 58B, ... 58X se controla para determinar la secuencia de nucleótidos en los moldes. Los extremos 3' de las cadenas molde 58A, 58B, . 58X y cualquier 46, 48 cebador unido a la celda de flujo (no unido a las cadenas molde 58A, 58B, ... 58X) puede bloquearse para evitar la interferencia con la reacción de secuenciación y, en particular, para evitar un cebado no deseado.
Puede introducirse un cebador de secuenciación que se hibrida con una secuencia complementaria en las cadenas molde 58A, 58B, ... 58X. Este cebador de secuenciación hace que las cadenas molde 58a , 58B, ... 58X estén listas para la secuenciación.
El proceso químico subyacente puede ser polimerización (p. ej., catalizada por una enzima polimerasa) o ligamiento (p. ej., catalizado por una enzima ligasa). En un proceso de SBS basada en polimerasa particular, los nucleótidos marcados con fluorescencia se añaden al cebador de secuenciación de una manera dependiente del molde, de tal forma que pueda utilizarse la detección del orden y el tipo de nucleótidos añadidos al cebador de secuenciación para determinar la secuencia del molde. Por ejemplo, para iniciar un primer ciclo de SBS, se pueden suministrar uno o más nucleótidos marcados, ADN polimerasa, etc. en o a través de la celda de flujo 36, etc., donde la extensión del cebador de secuenciación provoca la incorporación de un nucleótido marcado. Esta incorporación se puede detectar a través de un evento de formación de imagen. Durante un suceso de formación de imagen, el sistema de iluminación 62 puede proporcionar una luz de excitación a la celda de flujo 36.
En algunos ejemplos, los nucleótidos marcados con fluorescencia pueden incluir además una propiedad de terminación reversible que termina la extensión adicional del cebador una vez que se ha añadido un nucleótido al molde. Por ejemplo, puede añadirse al molde un análogo de nucleótido que tenga un resto de terminador reversible, de tal forma que no pueda producirse la extensión posterior hasta que se suministre un agente de desbloqueo para eliminar el resto. Por tanto, para los ejemplos que utilizan terminación reversible, puede suministrarse un reactivo de desbloqueo a la celda de flujo 36, etc. (después de que se produzca la detección).
Pueden realizarse lavados entre las diversas etapas de suministro de fluidos. A continuación, puede repetirse el ciclo de SBS n veces para extender el molde en n nucleótidos, detectando de este modo una secuencia de longitud n.
Si bien SBS se ha descrito en detalle, debe entenderse que la celda de flujo 36 descrita en la presente memoria puede utilizarse con otro protocolo de secuenciación, para genotipado o en otras aplicaciones químicas y/o biológicas.
Las lecturas de secuenciación que se obtienen durante la operación de secuenciación pueden agruparse basándose en las imágenes RI2, RI3, ... RIx de grupo resueltas. Las lecturas de secuenciación agrupadas pueden vincularse posteriormente a una de las muestras de dilución respectivas basándose en las imágenes RI2, RI3, ... RIx de grupo resueltas. Se puede inferir que las lecturas de secuenciación agrupadas y ligadas procedían de la misma muestra 30 de ácido nucleico más larga. Como tal, algunos ejemplos del método incluyen realizar una operación de secuenciación en la celda de flujo 26 que incluye las cadenas molde respectivas para cada uno de la pluralidad de fragmentos de la biblioteca; y agrupar las lecturas de secuenciación en diferentes grupos basándose en las imágenes RI, RI2, RI3, ... RIx de agrupamiento resueltas.
Para ilustrar adicionalmente la presente descripción, la presente memoria incluye ejemplos. Cabe mencionar que estos ejemplos se proporcionan con fines ilustrativos y no deben interpretarse como limitativos del alcance de la presente descripción.
Ejemplos
Ejemplo 1
Los oligonucleótidos de código de barras (por ejemplo, el adaptador 18) se unieron a través de un enlazador de biotina a bolas de estreptavidina M280 (ThermoFisher) para formar un grupo de bolas. Se hibridó un transposoma universal con la secuencia complementaria al final de los oligos para formar un transposoma unido a bolas (BLT). A continuación, los BLT se lavaron en un tampón de lavado, se resuspendieron en un tampón de trabajo y se añadieron las proteínas opcionales (proteína de unión monocatenaria (ThermoFisher) y proteínas de unión bicatenarias (Illumina)).
Se añadió ADN NA12878 de alta masa molecular (extraído de células cultivadas utilizando el protocolo de extracción de ADN de alta masa molecular de Qiagen MAGATTRACT®) a la mezcla de BLT y los tubos se invirtieron suavemente para mezclar. A continuación, los tubos se incubaron a temperatura ambiente durante aproximadamente 15 minutos para permitir que el ADN se enrollase alrededor de las bolas. A continuación, se añadió a cada tubo un tampón de tagmentación (que contenía cloruro de magnesio y tris-acetato) y las muestras se incubaron durante aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 55 0C. Durante esta etapa, el transposoma tagmentó el ADN y el a Dn etiquetado se unió a los BLT. Después de la reacción de tagmentación, se añadió dodecilsulfato de sodio (SDS) y las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante aproximadamente 5 minutos para desnaturalizar la transposasa. A continuación, los tubos se colocaron sobre un imán y se eliminó el sobrenadante. Las bolas se lavaron con el tampón de lavado. Después del lavado final, las bolas se resuspendieron en una mezcla de ligasa (que contenía ligasa T7 y su tampón asociado, el tampón de ligasa T7 de NEB). A continuación, las muestras se mezclaron y se dejaron incubar durante aproximadamente 45 minutos a temperatura ambiente. Durante este tiempo, se ligó el espacio en el soporte de transferencia (donde el transposoma se hibridó inicialmente), uniendo así físicamente el ADN etiquetado a la bola. A continuación, las muestras se colocaron sobre un imán, se retiró el sobrenadante y las bolas se lavaron nuevamente en el tampón de lavado.
A continuación, las bolas etiquetadas se dividieron en dos grupos para eliminar las cadenas no transferidas e introducir un índice de muestra (por ejemplo, el adaptador 22). Se expuso un grupo (grupo de comparación) a un flujo de trabajo comparativo, donde se utilizó calor para eliminar las cadenas no transferidas. El otro grupo (grupo ex.) se expuso a un flujo de trabajo ilustrativo en el que se utilizó una exonucleasa para eliminar las cadenas no transferidas.
El grupo comp. se resuspendió en el tampón de lavado y se calentó a aproximadamente 80 0C durante aproximadamente 5 minutos para desnaturalizar las cadenas no transferidas. A continuación, los tubos que contenían el grupo comp. se colocaron sobre un imán, se retiró el sobrenadante y se lavaron las bolas. El índice de la muestra, diluido en el tampón de lavado, se añadió luego a las bolas del grupo comp., y esta mezcla se incubó a aproximadamente 80 0C durante aproximadamente 1 minuto, seguido de una disminución gradual de la temperatura.
El grupo ex. se suspendió en una mezcla de exonucleasa T7 (que contenía exonucleasa T7 y tampón NEB 4) y se dejó incubar a temperatura ambiente durante aproximadamente 10 minutos. La actividad exonucleasa 5' a 3' de la exonucleasa T7 digirió las cadenas no transferidas. A continuación, los tubos que contenían el grupo ex. se colocaron sobre un imán, se retiró el sobrenadante y se lavaron las bolas. El índice de la muestra, diluido en el tampón de lavado, se añadió luego a las bolas del grupo ex., y esta mezcla se incubó a aproximadamente 55 0C durante aproximadamente 5 minutos, para permitir la hibridación del índice de muestra.
Los tubos que contienen respectivamente el grupo comp. y el grupo ex. se colocaron sobre un imán y se eliminó el sobrenadante. Se añadió una mezcla de ligamiento por extensión y las muestras se incubaron durante aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 37 0C. Los tubos se colocaron nuevamente sobre un imán, se retiró el sobrenadante y las bolas de del grupo comp. y el grupo ex. se lavaron en el tampón de lavado. Después del último lavado, las bolas se resuspendieron en el tampón de lavado.
Algunas bolas del grupo comp. y algunas bolas del grupo ex. se submuestrearon y utilizaron en una reacción de PCR. Además de las bolas respectivas, cada mezcla de PCR constaba de Illumina PCR mix EPM y oligos P5 y P7. Cada muestra se amplificó mediante PCR.
Después de la PCR, se tomó una submuestra del sobrenadante de la PCR de cada uno del grupo comp. y el grupo ex. y se transfirió el grupo ex. a un tubo nuevo y se realizó una selección de tamaño de 0,50x-0,62x (inmovilización reversible en fase sólida, SPRI) utilizando bolas de purificación de muestra. Las bibliotecas resultantes se eluyeron en un tampón de resuspensión. Estas bibliotecas se secuenciaron en celdas de flujo HISEQ ™ 2500 Rapid individuales (utilizando una longitud de lectura de ciclo estándar de 2x101). Después de la generación Fastq, las muestras se alinearon con el genoma humano (hg38) y los datos se importaron a IGV.
La Fig. 10 muestra la cobertura obtenida, utilizando la biblioteca de cada uno del grupo comp. (marcado como desnaturalización por calor) y el grupo ex. (marcado como exonucleasa T7), para una región rica en AT del genoma humano que se sabe que se ve afectada negativamente por las etapas a alta temperatura en el protocolo de preparación de la biblioteca. Los resultados de los fragmentos de biblioteca del grupo comp. cuyas cadenas no transferidas se eliminaron mediante desnaturalización por calor se muestran en la parte superior de la Fig. 10 y los resultados de los fragmentos de biblioteca del grupo ex. cuyas cadenas no transferidas se eliminaron mediante digestión con exonucleasa se muestran en la parte inferior de la Fig. 10. Como se ilustra, hubo una cobertura completa en la región rica en AT para los fragmentos de biblioteca del grupo ex., mientras que solo hubo una cobertura parcial en la misma región para los fragmentos de biblioteca del grupo comp. Estos resultados indican que el uso del método de digestión enzimática descrito en la presente memoria aumenta la cobertura de la biblioteca y mejora la secuenciación en las regiones ricas en AT del genoma en comparación con la desnaturalización por calor.
Ejemplo 2
Los complejos se prepararon como se describe en el método de las Fig. 2A a 2C (ligamiento y digestión en varias etapas) y en el método de la Fig. 3 (ligamiento y digestión en un recipiente).
La generación de BLT, la unión al ADN, la tagmentación y la exposición al SDS se realizaron como se describe en el Ejemplo 1. Después de la eliminación de la transposasa y el lavado asociado con la misma, las bolas marcadas se dividieron en dos grupos para eliminar las cadenas no transferidas a través de ligamiento y digestión en varias etapas (denominado grupo ex. 2) o a través de la ligamiento y digestión en un recipiente (denominado grupo ex. 3).
El grupo ex. 2 se resuspendió en una mezcla de ADN ligasa de E. coli que incluía ADN ligasa de E. coli y su tampón asociado, ambos de NEB. A continuación, las mezclas del grupo ex. 2 se mezclaron e incubaron durante aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 16 0C. A continuación, los tubos que contenían las muestras del grupo ex. 2 se colocaron sobre un imán, se retiró el sobrenadante y se lavaron las bolas del grupo ex. 2 en el tampón de lavado. Después del lavado, las bolas del grupo ex. 2 se resuspendieron en una mezcla que contenía exonucleasa T7 y tampón NEB 4 y se incubaron a aproximadamente 25 0C durante aproximadamente 10 minutos.
El grupo ex. 3 se resuspendió en una mezcla combinada de exonucleasa y ligasa que incluía ADN ligasa de E. coli, exonucleasa T7, NAD+, y un tampón CUTSMART™ (de NEB) a aproximadamente 25 0C durante aproximadamente 15 minutos.
A continuación, los tubos que contenían el grupo ex. 2 y el grupo ex. 3 se colocaron sobre un imán, se retiró el sobrenadante y se lavaron las bolas respectivas. El índice de la muestra, diluido en el tampón de lavado, se añadió luego a las bolas de cada grupo ex. y estas mezclas se incubaron a aproximadamente 55 0C durante aproximadamente 5 minutos, para permitir la hibridación del índice de muestra.
Los tubos que contienen respectivamente el grupo ex. 2 y el grupo ex. 3 se colocaron sobre un imán y se eliminó el sobrenadante. Se añadió una mezcla de ligamiento por extensión y las muestras se incubaron durante aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 37 0C. Los tubos se colocaron nuevamente sobre un imán, se retiró el sobrenadante y las bolas de del grupo comp. y el grupo ex. se lavaron en el tampón de lavado. Después del último lavado, las bolas se resuspendieron en el tampón de lavado.
Algunas bolas del grupo ex. 2 y algunas bolas del grupo ex. 3 se submuestrearon y utilizaron en una reacción de PCR. Además de las bolas respectivas, cada mezcla de PCR constaba de Illumina PCR mix EPM y oligos P5 y P7. Cada muestra se amplificó mediante PCR.
Después de la PCR, se transfirió a un tubo nuevo una submuestra del sobrenadante de la PCR de cada uno del grupo ex. 2 y el grupo ex. 3. Se añadieron bolas de purificación de muestra y se realizó un SPRI 2,5x con la biblioteca resultante eluida en un tampón de resuspensión. Las bibliotecas limpias se analizaron posteriormente en un chip Bioanalyzer 2100 High Sensitivity y se obtuvo el trazado de la Fig. 11. Los resultados muestran que los perfiles de tamaño y los rendimientos de las bibliotecas fueron comparables para el ligamiento y la digestión en varias etapas y para el ligamiento y la digestión en un recipiente. Estos resultados indican que la formulación de reactivos combinados no afectó negativamente al ligamiento y no dio como resultado la digestión del fragmento o cadena transferida.
Los fragmentos (complejos) de biblioteca unidos a bolas ilustrativos obtenidos utilizando los métodos de preparación de bibliotecas descritos en los Ejemplos 1 y 2 pueden dividirse en submuestras y diluirse, formando una pluralidad de muestras de dilución como se describe en la presente memoria. A continuación, puede llevarse a cabo el método descrito en referencia a las Fig. 6A a 6D (que incluye el agrupamiento, la tinción y la formación de imágenes) con cada una de las muestras de dilución para generar una serie de imágenes de agrupamiento basadas en el tiempo. Cuando se amplifican y tienen imágenes de todas las muestras de dilución, la celda de flujo está lista para una operación de secuenciación. Las técnicas de preparación de bibliotecas y las técnicas de formación de imágenes basadas en el tiempo descritas en la presente memoria se pueden usar juntas para reconstituir de forma eficaz y fiable un fragmento de ADN largo.
Notas adicionales
Además, ha de entenderse que los intervalos proporcionados en la presente memoria incluyen el intervalo indicado y cualquier valor o subintervalo dentro del intervalo indicado, como si se citasen explícitamente. Por ejemplo, debe interpretarse que un intervalo representado como de aproximadamente 2 mm a aproximadamente 300 mm incluye no solo los límites explícitamente citados de aproximadamente 2 mm a aproximadamente 300 mm, sino que también incluye valores individuales, tal como aproximadamente 15 mm, 22,5 mm, 245 mm, etc., y subintervalos, tal como de aproximadamente 20 mm a aproximadamente 225 mm, etc.
Debe tenerse en cuenta que todas las combinaciones de los conceptos anteriores y conceptos adicionales descritos en mayor detalle a continuación (siempre que tales conceptos no sean mutuamente contradictorios) se contemplan como parte del objeto de la invención descrito en el presente documento. En particular, todas las combinaciones del objeto reivindicado que aparecen al final de esta descripción se contemplan como parte del objeto de la invención descrito en la presente memoria.
Si bien se han descrito en detalle varios ejemplos, debe entenderse que los ejemplos descritos pueden modificarse. Por lo tanto, la descripción anterior debe considerarse no limitativa.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    Un método, que comprende:
    generar una serie de imágenes de agrupamiento basadas en el tiempo de una pluralidad de fragmentos de biblioteca con la contigüidad preservada a partir de una muestra de genoma, en donde cada imagen de agrupamiento basada en el tiempo en la serie se genera secuencialmente: introduciendo, en una celda de flujo, una muestra respectiva que incluye algunos de los fragmentos de biblioteca con la contigüidad preservada, en donde los algunos fragmentos de biblioteca con la contigüidad preservada están unidos a un soporte sólido o están unidos entre sí;
    iniciando la liberación de algunos de los fragmentos de biblioteca con la contigüidad preservada del soporte sólido o entre sí;
    amplificando algunos de los fragmentos de biblioteca con la contigüidad preservada para generar una pluralidad de cadenas molde respectivas;
    tiñendo las cadenas molde respectivas; y
    obteniendo imágenes de las cadenas molde respectivas.
    El método como se define en la reivindicación 1, que además comprende:
    (a) asignar a cada imagen de agrupamiento basada en el tiempo en la serie un registro temporal de la introducción de la muestra respectiva que incluye algunos de los fragmentos de biblioteca con la contigüidad preservada; opcionalmente, en donde el registro temporal es una marca de tiempo o un número de etapa en una secuencia; y/o
    (b) utilizar sustracción de imágenes para generar una imagen de agrupamiento resuelta para cada una de las muestras respectivas, en donde cada imagen de agrupamiento resuelta registra una ubicación y orientación espacial de las cadenas molde respectivas asociadas a una de las muestras diferentes; y/o
    (c) realizar una operación de secuenciación en la celda de flujo que incluye las cadenas molde respectivas para cada uno de la pluralidad de fragmentos de la biblioteca; y
    agrupar las lecturas de secuenciación en diferentes grupos basándose en las imágenes de agrupamiento resueltas; y opcionalmente unir los diferentes grupos a cada una de las diferentes muestras basándose en las imágenes de agrupamiento resueltas; y/o
    (d) almacenar las imágenes de agrupamiento resueltas.
    El método como se define en una de las reivindicaciones 1 y 2, en donde:
    antes de generar la serie de imágenes de agrupamiento basadas en el tiempo, el método comprende, además:
    añadir un portador líquido a la pluralidad de fragmentos de biblioteca con la contigüidad preservada para formar una mezcla; y
    diluir la mezcla con el portador líquido para generar un número predeterminado de muestras de dilución para introducirlas en la celda de flujo;
    la introducción de la muestra respectiva implica dirigir fluídicamente una de las muestras de dilución a la celda de flujo; y opcionalmente
    la mezcla que incluye la pluralidad de fragmentos de biblioteca con la contigüidad preservada se diluye hasta un volumen predeterminado basándose en i) un volumen de la celda de flujo como una dilución limitante y ii) el número predeterminado de muestras de dilución.
    El método como se define en una de las reivindicaciones 1 a 3, en donde:
    cada fragmento de biblioteca con la contigüidad preservada está unido al soporte sólido; y la liberación implica calentamiento; y/o en donde
    cada uno de los fragmentos de biblioteca con la contigüidad preservada incluye una primera parte de secuencia en un primer extremo que se hibrida con una primera secuencia de cebador sobre una superficie de la celda de flujo; y
    antes de la amplificación, el método comprende además unir una segunda parte de la secuencia a cada uno de los fragmentos de biblioteca con la contigüidad preservada hibridados en un segundo extremo opuesto al primero, siendo la segunda parte de la secuencia idéntica a una segunda secuencia de cebador en la superficie de la celda de flujo.
    El método como se define en una de las reivindicaciones 1 a 3, en donde:
    cada fragmento de biblioteca con la contigüidad preservada está unido al soporte sólido;
    el soporte sólido tiene una pluralidad de adaptadores unidos al mismo; y
    el método comprende además preparar el fragmento de biblioteca con la contigüidad preservada unido al soporte sólido:
    tagmentando la muestra de genoma en presencia del soporte sólido y una pluralidad de adaptadores en L, incluyendo cada adaptador en L una cadena transferida y una cadena no transferida, generando de este modo una pluralidad de fragmentos de muestra, mediante lo cual una cadena transferida respectiva se incorpora a un extremo 5' de cada fragmento de muestra y una cadena no transferida respectiva se hibrida a una parte de cada adaptador;
    ligando las cadenas transferidas respectivas a uno de los adaptadores de la pluralidad respectivos;
    digiriendo la cadena no transferida usando una exonucleasa 5'-3'; y
    uniendo un adaptador en Y parcial a cada una de las cadenas transferidas; y el ligamiento y la digestión se producen opcionalmente en un solo protocolo en un recipiente.
    6. Un método, que comprende:
    preparar una mezcla que incluye una pluralidad de fragmentos de biblioteca con la contigüidad preservada de una muestra de genoma, estando la pluralidad de fragmentos de biblioteca con la contigüidad preservada unidos a soportes sólidos o unidos entre sí;
    diluir la mezcla para generar un número predeterminado de muestras de dilución para introducirlas en una celda de flujo; y
    generar una imagen de agrupamiento basada en el tiempo de al menos uno de los fragmentos de biblioteca con la contigüidad preservada:
    introduciendo una primera de las muestras de dilución que incluye algunos de los fragmentos de biblioteca con la contigüidad preservada en la celda de flujo; iniciando la liberación de algunos de los fragmentos de biblioteca con la contigüidad preservada del soporte sólido o entre sí;
    amplificando algunos de los fragmentos de biblioteca con la contigüidad preservada para generar una pluralidad de cadenas molde;
    tiñendo la pluralidad de cadenas molde; y
    obteniendo imágenes de la pluralidad de cadenas molde.
    7. El método como se define en la reivindicación 6, en donde la mezcla se diluye hasta un volumen predeterminado basándose en i) un volumen de la celda de flujo como una dilución limitante y ii) el número predeterminado de muestras de dilución que se va a introducir en la celda de flujo.
    8. El método como se define en la reivindicación 6 o 7, que además comprende:
    generar una segunda imagen de agrupamiento basada en el tiempo de algún otro de los fragmentos de biblioteca con la contigüidad preservada:
    introduciendo en la celda de flujo una segunda de las muestras de dilución que incluya algún otro de los fragmentos de biblioteca con la contigüidad preservada;
    iniciando la liberación de los algunos otros de los fragmentos de biblioteca con la contigüidad preservada del soporte sólido o entre sí;
    amplificando los algunos otros de los fragmentos de biblioteca con la contigüidad preservada para generar una segunda pluralidad de cadenas molde;
    tiñendo la segunda pluralidad de cadenas molde; y
    obteniendo imágenes de la segunda pluralidad de cadenas molde.
    9. El método como se define en la reivindicación 8, que además comprende:
    generar un número predeterminado de imágenes de agrupamiento basadas en el tiempo de un número predeterminado de fragmentos de biblioteca con la contigüidad preservada repitiendo la introducción, el inicio de la liberación, la amplificación, la tinción y la obtención de imágenes con cada uno del número predeterminado de las muestras de dilución; y
    asignar a cada una del número predeterminado de imágenes de agrupamiento basadas en el tiempo, un registro temporal de la introducción de la respectiva muestra de dilución; en donde opcionalmente el registro temporal es una marca de tiempo o un número de etapa en una secuencia.
    10. El método como se define en la reivindicación 9, que además comprende utilizar sustracción de imágenes para generar una imagen de grupo resuelta para cada una de las muestras de dilución introducidas en la celda de flujo, en donde cada imagen de grupo resuelta registra una ubicación y orientación espacial de la pluralidad de cadenas molde asociadas a una de las muestras de dilución diferentes.
    11. El método como se define en una de las reivindicaciones 6 a 10, en donde:
    cada fragmento de biblioteca con la contigüidad preservada está unido al soporte sólido;
    el soporte sólido tiene una pluralidad de adaptadores unidos al mismo; y
    el método comprende además preparar el fragmento de biblioteca con la contigüidad preservada unido al soporte sólido:
    tagmentando la muestra de genoma en presencia del soporte sólido y una pluralidad de adaptadores en L, incluyendo cada adaptador en L una cadena transferida y una cadena no transferida, generando de este modo una pluralidad de fragmentos de muestra, mediante lo cual una cadena transferida respectiva se incorpora a un extremo 5' de cada fragmento de muestra y una cadena no transferida respectiva se hibrida a una parte de cada adaptador;
    ligando las cadenas transferidas respectivas a uno de los adaptadores de la pluralidad respectivos;
    digiriendo la cadena no transferida usando una exonucleasa 5'-3'; y
    uniendo un adaptador en Y parcial a cada una de las cadenas transferidas; y el ligamiento y la digestión se producen opcionalmente en un solo protocolo en un recipiente.
    Un sistema que comprende:
    un receptáculo de celda de flujo;
    un sistema de control de fluídica que incluye fluídica de suministro para suministrar respectivamente una muestra de dilución y
    una tinción a una celda de flujo colocada en el receptáculo de la celda de flujo;
    un sistema de iluminación colocado para iluminar la celda de flujo colocada en el receptáculo de la celda de flujo;
    un sistema de detección colocado para capturar una imagen de la celda de flujo colocada en el receptáculo de la celda de flujo; y
    un controlador en comunicación operativa con el sistema de control de fluídica, el sistema de iluminación y el sistema de detección, sirviendo el controlador para:
    hacer que la fluídica de suministro introduzca la muestra de dilución en la celda de flujo colocada en el receptáculo de la celda de flujo;
    hacer que la fluídica de suministro introduzca la tinción en la celda de flujo colocada en el receptáculo de la celda de flujo después de que se generen cadenas molde en la celda de flujo colocada en el receptáculo de la celda de flujo a partir de fragmentos de biblioteca con la contigüidad preservada presentes en la muestra de dilución;
    hacer que el sistema de iluminación ilumine las cadenas molde teñidas en la celda de flujo colocada en el receptáculo de la celda de flujo; y
    hacer que el sistema de detección genere imágenes de las cadenas molde teñidas e iluminadas en la celda de flujo colocada en el receptáculo de la celda de flujo.
    El sistema como se define en la reivindicación 12, en donde el receptáculo de la celda de flujo forma parte de un secuenciador que incluye un calentador, en donde el controlador es para:
    hacer que el calentador inicie la liberación de algunos de los fragmentos de biblioteca con la contigüidad preservada de un soporte sólido o entre sí;
    hacer que el calentador realice un ciclo térmico para amplificar algunos de los fragmentos de biblioteca con la contigüidad preservada para generar las cadenas molde.
    El sistema como se define en una de las reivindicaciones 12 o 13, que además comprende:
    un primer cartucho que contiene la muestra de dilución;
    un segundo cartucho que contiene la tinción; y opcionalmente
    un componente de almacenamiento electrónico para almacenar la imagen.
    El sistema como se define en la reivindicación 12, en donde la imagen es una imagen de agrupamiento basada en el tiempo en una serie de imágenes de agrupamiento basadas en el tiempo de una pluralidad de fragmentos de biblioteca con la contigüidad preservada a partir de una muestra de genoma, en donde cada imagen de agrupamiento basada en el tiempo en la serie se genera secuencialmente.
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