ES2945323T3 - Código de barras por aptámeros - Google Patents

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Christina Chang
Eleen Shum
Sixing Li
Margaret Nakamoto
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Abstract

En el presente documento se describen sistemas, métodos, composiciones y kits para la identificación de muestras y el perfilado de la expresión de proteínas. Una composición de indexación de muestras, o una composición para el perfil de expresión de proteínas, puede comprender, por ejemplo, un aptámero de unión a proteínas asociado con un oligonucleótido, tal como un oligonucleótido de indexación de muestras. Diferentes oligonucleótidos pueden tener diferentes secuencias. El origen de la muestra de las células, o los perfiles de expresión de proteínas de las células, pueden determinarse basándose en las secuencias de los oligonucleótidos, por ejemplo, mediante códigos de barras de los oligonucleótidos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

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DESCRIPCIÓN
Código de barras por aptámeros
SOLICITUDES RELACIONADAS
[0001] Esta solicitud reivindica el beneficio bajo 35 U.S.C. §119(e) de la Solicitud de Patente Provisional de EE. UU.
62/719,406, presentada el 17 de agosto de 2018.
REFERENCIA A LA Lista de Secuencias
[0002] La presente solicitud se presenta junto con una Lista de Secuencias en formato electrónico. La Lista de Secuencias se proporciona como un archivo titulado Lista de Secuencias, creado el 2 de agosto de 2019, que tiene un tamaño de 4 kilobytes.
ANTECEDENTES
Campo
[0003] La presente divulgación se relaciona generalmente con el campo de la biología molecular, por ejemplo, identificando células de diferentes muestras y determinando perfiles de expresión de proteínas en células usando códigos de barras moleculares.
Descripción de la técnica relacionada
[0004] La tecnología actual permite la medición de la expresión génica de células individuales de forma masivamente paralela (p. ej., >10000 células) mediante la unión de códigos de barras de oligonucleótidos específicos de células a moléculas de ARNm de poli(A) de células individuales a medida que cada una de las células se colocaliza con una perla de reactivo con código de barras en un compartimento. La expresión génica puede afectar la expresión de proteínas. La interacción proteína-proteína puede afectar la expresión génica y la expresión de proteínas. Existe la necesidad de sistemas y métodos que puedan analizar cuantitativamente la expresión de proteínas en las células y medir simultáneamente la expresión de proteínas y la expresión génica en las células. Delley et al. (2017) describe un método para caracterizar simultáneamente el transcriptoma y el proteoma de células individuales. El documento US 2018/208975 A1 describe un ensayo para análisis genómico y proteómico simultáneos. El documento WO 2018/226293 A1 describe sistemas, métodos, composiciones y kits para la identificación de muestras utilizando reactivos de unión a proteínas asociados con un oligonucleótido de indexación de muestras.
RESUMEN
[0005] La invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjunto. En el presente documento se describen formas de realización de un método para la identificación de muestras. En algunas formas de realización, el método comprende: poner en contacto cada una de una pluralidad de muestras con una composición de indexación de muestras de una pluralidad de composiciones de indexación de muestras, respectivamente, donde cada una de la pluralidad de muestras comprende una o más células, cada una de las cuales comprende una o más proteínas objetivo, donde la composición de indexación de muestra comprende una composición de aptámero que comprende un aptámero y un oligonucleótido de indexación de muestra, donde un solo polinucleótido comprende el oligonucleótido de indexación de muestra y el aptámero, donde el aptámero es capaz de unirse específicamente a al menos uno de uno o más objetivos proteicos, en el que el oligonucleótido de indexación de muestras comprende una secuencia de indexación de muestras, y en el que las secuencias de indexación de muestras de al menos dos composiciones de indexación de muestras de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras comprenden secuencias diferentes; codificar con barras los oligonucleótidos de indexación de muestras usando una pluralidad de códigos de barras para generar una pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras; obtener datos de secuenciación de la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras; e identificar el origen de la muestra de al menos una célula de una o más células basándose en la secuencia de indexación de muestras de al menos un oligonucleótido de indexación de muestras con código de barras de la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras.
[0006] En algunas formas de realización, el método comprende: poner en contacto cada una de una pluralidad de muestras con una composición de indexación de muestras de una pluralidad de composiciones de indexación de muestras, respectivamente, en el que cada una de la pluralidad de muestras comprende una o más células, cada una de las cuales comprende uno o más objetivos de componentes celulares, donde la composición de indexación de muestra comprende una composición de aptámero que comprende un aptámero y un oligonucleótido de indexación de muestra, donde un solo polinucleótido comprende el oligonucleótido de indexación de muestra y el aptámero, donde el aptámero es capaz de unirse específicamente a al menos uno o más objetivos de componentes celulares, donde el oligonucleótido de indexación de muestra comprende una secuencia de indexación de muestra, y donde las secuencias de indexación de muestra de al menos dos composiciones de indexación de muestra de la pluralidad de composiciones de indexación de muestra comprenden secuencias diferentes; e identificar el origen de la muestra de al menos una célula de una o más células basándose en la secuencia de indexación de muestra de al menos un oligonucleótido de indexación de muestra de la pluralidad de composiciones de indexación de muestra. En algunas formas de realización, el componente celular objetivo comprende una proteína objetivo. En algunas formas de realización, identificar el origen de la muestra de al menos una célula comprende: codificar con barras oligonucleótidos de indexación de muestras de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras usando una pluralidad de códigos de barras para generar una pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con códigos de barras; obtener datos de secuenciación de la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras; e identificar el origen de la muestra de la célula basándose en la secuencia de indexación de muestra de al menos un oligonucleótido de indexación de muestra con código de barras de la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestra con código de barras en los datos de secuenciación.
[0007] En algunas formas de realización, identificar el origen de la muestra de al menos una célula comprende identificar la presencia o ausencia de la secuencia de indexación de muestra de al menos un oligonucleótido de indexación de muestra de la pluralidad de composiciones de indexación de muestra. Identificar la presencia o ausencia de la secuencia de indexación de la muestra puede comprender: replicar el al menos un oligonucleótido de indexación de la muestra para generar una pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras replicados; obtener datos de secuenciación de la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras replicados; e identificar el origen de la muestra de la célula basándose en la secuencia de indexación de muestra de un oligonucleótido de indexación de muestra replicado de la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestra que corresponden al menos un oligonucleótido de indexación de muestra con código de barras en los datos de secuenciación.
[0008] En algunas formas de realización, replicar al menos un oligonucleótido de indexación de muestras para generar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras replicados comprende: antes de replicar al menos un oligonucleótido de indexación de muestras con código de barras, ligar un adaptador de replicación a al menos un oligonucleótido de indexación de muestras con código de barras, y en el que la replicación del al menos un oligonucleótido de indexación de muestras con código de barras comprende la replicación del al menos un oligonucleótido de indexación de muestras con código de barras usando el adaptador de replicación ligado al al menos un oligonucleótido de indexación de muestras con código de barras para generar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras replicados. En algunas formas de realización, replicar al menos un oligonucleótido de indexación de muestras para generar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras replicados comprende: antes de replicar al menos un oligonucleótido de indexación de muestras con código de barras, poner en contacto una sonda de captura con al menos un oligonucleótido de indexación de muestras para generar una sonda de captura hibridada con el oligonucleótido de indexación de la muestra; y extender la sonda de captura hibridada con el oligonucleótido de indexación de muestra para generar un oligonucleótido de indexación de muestras asociado con la sonda de captura. La replicación del al menos un oligonucleótido de indexación de muestras puede comprender la replicación del oligonucleótido de indexación de muestras asociado con la sonda de captura para generar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras replicados.
[0009] En algunas formas de realización, la secuencia de indexación de la muestra tiene una longitud de 6 a 60 nucleótidos. El oligonucleótido de indexación de muestra puede tener una longitud de 50-500 nucleótidos. Las secuencias de indexación de muestras de al menos 10, 100 o 1000 composiciones de indexación de muestras de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras pueden comprender diferentes secuencias.
[0010] En algunas formas de realización, el aptámero puede estar en 5' con respecto al oligonucleótido de indexación de la muestra en el polinucleótido único. El aptámero puede estar en 3' con respecto al oligonucleótido de indexación de la muestra en el polinucleótido único.
[0011] El aptámero comprende un aptámero de nucleótido. El aptámero de nucleótido puede comprender ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN), ácido xenonucleico (XNA) o una combinación de los mismos. El aptámero de nucleótido puede comprender un análogo de base. El análogo de base puede comprender un análogo de base fluorescente. El aptámero de nucleótido puede comprender un fluoróforo.
[0012] En algunas formas de realización, la composición de indexación de muestras se puede asociar con un primer soporte. Diferentes composiciones de indexación de muestras de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras se pueden asociar con diferentes primeros soportes.
[0013] En algunas formas de realización, la composición de aptámero se puede asociar con un primer vehículo. La composición de aptámero puede comprender: un segundo aptámero capaz de unirse específicamente a al menos una o más proteínas objetivo o uno o más objetivos de componentes celulares, y un segundo oligonucleótido de indexación de muestra que comprende una segunda secuencia de indexación de muestra. El aptámero y el segundo aptámero pueden estar asociados con un primer vehículo. El aptámero se puede asociar con un primer vehículo y el segundo aptámero se asocia con un segundo vehículo. El aptámero y el segundo aptámero pueden tener al menos un 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de secuencia idéntica. El aptámero y el segundo aptámero pueden ser idénticos, por ejemplo, en secuencia. El aptámero y el segundo aptámero pueden ser diferentes. Las proteínas objetivo, o los objetivos de componentes celulares, del aptámero y el segundo aptámero pueden ser idénticas. El aptámero y el segundo aptámero pueden ser capaces de unirse a diferentes regiones de una proteína objetivo o un componente celular objetivo. Las proteínas objetivo, o los objetivos de componentes celulares, del aptámero y el segundo aptámero pueden ser diferentes.
[0014] En algunas formas de realización, el primer vehículo comprende nanomaterial metálico. El primer vehículo puede comprender una nanoestructura metálica, una nanopartícula metálica o una combinación de las mismas. El primer portador puede comprender nanomaterial de oro. El primer vehículo puede comprender una nanoestructura de oro, una nanopartícula de oro o una combinación de los mismos. El primer vehículo puede comprender un lisosoma, una micela, una vesícula, una membrana lipídica, una bicapa lipídica, una monocapa lipídica o una combinación de los mismos.
[0015] En algunas formas de realización, el aptámero se puede unir al primer vehículo. El aptámero se puede unir covalentemente al primer vehículo. El aptámero se puede conjugar con el primer vehículo. El aptámero se puede conjugar con el primer vehículo a través de un grupo químico seleccionado del grupo que consiste en un grupo fotoescindible por UV, una estreptavidina, una biotina, una amina y una combinación de los mismos. El aptámero se puede unir de forma no covalente al primer vehículo. El aptámero se puede asociar con el primer portador a través de un enlazador. El aptámero puede estar inmovilizado en el primer portador, parcialmente inmovilizado en el primer portador, inmovilizado en el primer portador, parcialmente inmovilizado en el primer portador, encerrado en el primer portador, parcialmente encerrado en el primer portador, incrustado en el primer portador, parcialmente incrustado en el primer portador, o una combinación de los mismos.
[0016] En algunas formas de realización, el método comprende disociar el aptámero del primer vehículo. La disociación puede ocurrir después de codificar con barras los oligonucleótidos de indexación de la muestra. La disociación puede ocurrir antes de codificar con barras los oligonucleótidos de indexación de la muestra.
[0017] En algunas formas de realización, poner en contacto cada una de la pluralidad de muestras con la composición de indexación de muestras comprende poner en contacto una célula de una o más células de la muestra con la composición de indexación de muestras. El primer portador se puede internalizar en la célula. El primer portador se puede internalizar en la célula a través de endocitosis, pinocitosis, nanopinocitosis, micropinocitosis, fagocitosis, fusión de membranas o una combinación de los mismos. El primer portador se puede internalizar en la célula a través de la internalización medicada con clatrina, la internalización mediada por caveolina, la internalización dependiente del receptor, la internalización independiente del receptor o una combinación de las mismas.
[0018] En algunas formas de realización, el método comprende eliminar las composiciones de indexación de muestras no unidas de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras. La eliminación de las composiciones de indexación de muestras no unidas puede comprender el lavado de una o más células de cada una de la pluralidad de muestras con un tampón de lavado. Eliminar las composiciones de indexación de muestras no unidas puede comprender seleccionar células unidas a al menos un aptámero usando la citometría de flujo. En algunas formas de realización, el método comprende lisar una o más células de cada una de la pluralidad de muestras.
[0019] En algunas formas de realización, el oligonucleótido de indexación de muestra está configurado para ser (o puede ser) no separable del aptámero. El oligonucleótido de indexación de muestra puede configurarse para ser (o puede ser) separable del aptámero. El método puede comprender separar el oligonucleótido de indexación de la muestra del aptámero. Separar el oligonucleótido de indexación de la muestra puede comprender separar el oligonucleótido de indexación de la muestra del aptámero mediante fotoescisión UV, tratamiento químico, calentamiento, tratamiento con enzimas o cualquier combinación de los mismos.
[0020] En algunas formas de realización, el oligonucleótido de indexación de la muestra no es homólogo a las secuencias genómicas de ninguna de las una o más células, es homólogo a las secuencias genómicas de una especie o una combinación de las mismas. La especie puede ser una especie no mamífera.
[0021] En algunas formas de realización, una muestra de la pluralidad de muestras comprende una pluralidad de células, una pluralidad de células individuales, un tejido, una muestra de tumor o cualquier combinación de los mismos. La pluralidad de muestras puede comprender una célula de mamífero, una célula bacteriana, una célula vírica, una célula de levadura, una célula fúngica o cualquier combinación de las mismas.
[0022] En algunas formas de realización, el oligonucleótido de indexación de muestra comprende una secuencia complementaria a una secuencia de captura configurada para capturar (o capaz de capturar, hibridar o unirse a) la secuencia del oligonucleótido de indexación de muestra. El código de barras puede comprender una región de unión al objetivo que comprende la secuencia de captura. La región de unión al objetivo puede comprender una región poli(dT). La secuencia del oligonucleótido de indexación de muestra complementaria a la secuencia de captura puede comprender una región poli(dA).
[0023] En algunas formas de realización, el oligonucleótido de indexación de muestra comprende una secuencia de alineación adyacente a la región poli(dA). La secuencia de alineación puede tener 1 o más nucleótidos de longitud. La secuencia de alineación puede tener una longitud de 2 o más nucleótidos. La secuencia de alineación puede comprender una guanina, una citosina, una timina, un uracilo o una combinación de los mismos. La secuencia de alineación puede comprender una región poli(dT), una región poli(dG), una región poli(dC), una región poli(dU), o una combinación de las mismas. El oligonucleótido de indexación de muestra puede comprender una secuencia marcadora molecular, un sitio de unión para un cebador universal o ambos. La secuencia del marcador molecular puede tener una longitud de 2 a 20 nucleótidos. El cebador universal puede tener una longitud de 5 a 50 nucleótidos. El cebador universal puede comprender un cebador de amplificación, un cebador de secuenciación o una combinación de los mismos.
[0024] En algunas formas de realización, el aptámero está asociado con dos o más oligonucleótidos de indexación de muestra con una secuencia idéntica. El aptámero se puede asociar con dos o más oligonucleótidos de indexación de muestra con diferentes secuencias de indexación de muestra. En algunas formas de realización, la composición de indexación de muestras de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras comprende un segundo aptámero no asociado con el oligonucleótido de indexación de muestras. El aptámero y el segundo aptámero pueden ser idénticos. En algunas formas de realización, cada una de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras comprende el aptámero.
[0025] En algunas formas de realización, la composición de indexación de muestras de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras comprende una segunda composición de aptámero que comprende un segundo aptámero de unión a proteínas, y el segundo aptámero es capaz de unirse específicamente a al menos una de una o más proteínas. objetivos, o al menos uno de uno o más objetivos de componentes celulares. El aptámero y el segundo aptámero pueden ser capaces de unirse a la misma proteína objetivo de una o más proteínas objetivo, o de uno o más objetivos de componente celular, y donde el segundo aptámero no está asociado con el oligonucleótido de indexación de la muestra. El segundo aptámero se puede asociar con un segundo oligonucleótido de indexación de muestra que comprende una segunda secuencia de indexación de muestra. El aptámero y el segundo aptámero pueden tener al menos un 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de secuencia idéntica. El aptámero y el segundo aptámero pueden ser idénticos, por ejemplo, en secuencia. El aptámero y el segundo aptámero pueden ser diferentes. El aptámero y el segundo aptámero pueden ser capaces de unirse a diferentes regiones de la misma proteína objetivo, o diferentes regiones del mismo componente celular objetivo. El aptámero y el segundo aptámero pueden ser capaces de unirse a diferentes objetivos proteicos de uno o más objetivos proteicos, o diferentes objetivos de componentes celulares de uno o más objetivos de componentes celulares. La secuencia de indexación de muestra y la segunda secuencia de indexación de muestra pueden ser idénticas. La secuencia de indexación de muestra y la segunda secuencia de indexación de muestra pueden ser diferentes.
[0026] En algunas formas de realización, el método comprende: antes de codificar en barras los oligonucleótidos de indexación de muestras, agrupar la pluralidad de muestras en contacto con la pluralidad de composiciones de indexación de muestras.
[0027] En algunas formas de realización, un código de barras de la pluralidad de códigos de barras comprende una región de unión al objetivo y una secuencia de etiquetas moleculares, y las secuencias de etiquetas moleculares de al menos dos códigos de barras de la pluralidad de códigos de barras comprenden diferentes secuencias de etiquetas de moléculas. El código de barras puede comprender una secuencia de etiquetas celulares, un sitio de unión para un cebador universal o cualquier combinación de los mismos. La región de unión al objetivo puede comprender una región poli(dT).
[0028] En algunas formas de realización, la pluralidad de códigos de barras está asociada con una partícula. Al menos un código de barras de la pluralidad de códigos de barras puede estar inmovilizado en la partícula, parcialmente inmovilizado en la partícula, encerrado en la partícula, parcialmente encerrado en la partícula o una combinación de los mismos. La partícula puede ser disruptible. La partícula puede comprender una perla. La partícula puede comprender una perla de Sepharose, una perla de estreptavidina, una perla de agarosa, una perla magnética, una perla conjugada, una perla conjugada de proteína A, una perla conjugada de proteína G, una perla conjugada de proteína NG, una perla conjugada de proteína L, una perla conjugada con oligo(dT), una perla de sílice, una perla similar a la sílice, una perla de hidrogel, una microperla antibiotina, una microperla antifluorocromo o cualquier combinación de los mismos, o donde la partícula comprende un material seleccionado del grupo compuesto por polidimetilsiloxano (PDMS), poliestireno, vidrio, polipropileno, agarosa, gelatina, hidrogel, paramagnético, cerámico, plástico, vidrio, metilestireno, polímero acrílico, titanio, látex, sefarosa, celulosa, nailon, silicona y cualquier combinación de los mismos. La partícula puede comprender una perla de hidrogel rompible.
[0029] En algunas formas de realización, los códigos de barras de la partícula comprenden secuencias de etiquetas moleculares seleccionadas de al menos 1000, 10000, o una combinación de las mismas, secuencias de etiquetas moleculares diferentes. Las secuencias de etiquetas moleculares de los códigos de barras pueden comprender secuencias aleatorias. La partícula puede comprender al menos 10000 códigos de barras.
[0030] En algunas formas de realización, la codificación de barras de los oligonucleótidos de indexación de muestras utilizando la pluralidad de códigos de barras comprende: poner en contacto la pluralidad de códigos de barras con los oligonucleótidos de indexación de muestras para generar códigos de barras hibridados con los oligonucleótidos de indexación de muestras; y extender los códigos de barras hibridados a los oligonucleótidos de indexación de muestras para generar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras.
[0031] En algunas formas de realización, el método comprende, antes de extender los códigos de barras hibridados a los oligonucleótidos de indexación de muestra, agrupar los códigos de barras hibridados a los oligonucleótidos de indexación de muestra, y en donde extender los códigos de barras hibridados a los oligonucleótidos de indexación de muestra comprende extender los códigos de barras agrupados hibridados a los oligonucleótidos de indexación de muestras para generar una pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras agrupados con código de barras. La extensión de los códigos de barras puede comprender la extensión de los códigos de barras usando una ADN polimerasa para generar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras. La extensión de los códigos de barras puede comprender la extensión de los códigos de barras utilizando una transcriptasa inversa para generar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras.
[0032] En algunas formas de realización, el método comprende: amplificar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestra con código de barras para producir una pluralidad de amplicones. La amplificación de la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras puede comprender la amplificación, usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), al menos una parte de la secuencia del marcador molecular y al menos una parte del oligonucleótido de indexación de muestras. La obtención de datos de secuenciación de la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras puede comprender la obtención de datos de secuenciación de la pluralidad de amplicones. La obtención de los datos de secuenciación puede comprender la secuenciación de al menos una parte de la secuencia del marcador molecular y al menos una parte del oligonucleótido de indexación de la muestra.
[0033] En algunas formas de realización, la codificación de barras de los oligonucleótidos de indexación de muestra usando la pluralidad de códigos de barras para generar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestra con código de barras comprende la codificación de barras estocástica de los oligonucleótidos de indexación de muestra usando una pluralidad de códigos de barras estocásticos para generar una pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestra con código de barras estocástico.
[0034] En algunas formas de realización, el método comprende: codificar en barras una pluralidad de objetivos de la célula usando la pluralidad de códigos de barras para generar una pluralidad de objetivos con código de barras, donde cada uno de la pluralidad de códigos de barras comprende una secuencia de etiquetas de célula, y donde al menos dos códigos de barras de la pluralidad de códigos de barras comprenden una secuencia de etiquetas de célula idéntica; y obtener datos de secuenciación de los objetivos con código de barras. La codificación de barras de la pluralidad de objetivos utilizando la pluralidad de códigos de barras para generar la pluralidad de objetivos con código de barras puede comprender: poner en contacto copias de los objetivos con regiones de unión de objetivos de los códigos de barras; y la transcripción inversa de la pluralidad de objetivos utilizando la pluralidad de códigos de barras para generar una pluralidad de objetivos transcriptos inversamente. El método puede comprender: antes de obtener los datos de secuenciación de la pluralidad de objetivos con código de barras, amplificar los objetivos con código de barras para generar una pluralidad de objetivos con código de barras amplificados. La amplificación de los objetivos con código de barras para generar la pluralidad de objetivos con código de barras amplificados puede comprender: la amplificación de los objetivos con código de barras mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La codificación de barras de la pluralidad de objetivos de la célula utilizando la pluralidad de códigos de barras para generar la pluralidad de objetivos con código de barras puede comprender la codificación estocástica de la pluralidad de objetivos de la célula utilizando una pluralidad de códigos de barras estocásticos para generar una pluralidad de objetivos con código de barras estocástico.
[0035] En el presente documento se describen formas de realización de una pluralidad de composiciones de indexación de muestras. En algunas formas de realización, cada una de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras comprende una composición de aptámero que comprende un primer aptámero de unión a componente celular y un oligonucleótido de indexación de muestra, un único polinucleótido comprende el oligonucleótido de indexación de muestra y el aptámero, el aptámero de unión a componente celular es capaz de unirse específicamente a al menos un componente celular objetivo, el oligonucleótido de indexación de muestra comprende una secuencia de indexación de muestra para identificar el origen de la muestra de una o más células de una muestra, el oligonucleótido de indexación de muestra comprende una secuencia complementaria a una secuencia de captura configurada para capturar la secuencia del oligonucleótido de indexación de muestras, en el que la secuencia del oligonucleótido de indexación de muestras complementaria a la secuencia de captura comprende una región poli(dA), y las secuencias de indexación de muestras de al menos dos composiciones de indexación de muestras de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras comprenden secuencias diferentes.
[0036] En algunas formas de realización, la secuencia de indexación de muestras tiene una longitud de 6-60 nucleótidos. El oligonucleótido de indexación de muestra puede tener una longitud de 50-500 nucleótidos. Las secuencias de indexación de muestras de al menos 10, 100 o 1000 composiciones de indexación de muestras de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras pueden comprender diferentes secuencias.
[0037] En algunas formas de realización, el aptámero puede estar en 5' con respecto al oligonucleótido de indexación de la muestra en el polinucleótido único. El aptámero puede estar en 3' con respecto al oligonucleótido de indexación de la muestra en el polinucleótido único.
[0038] En algunas formas de realización, el aptámero de unión a proteínas, o el aptámero de unión a componentes celulares, comprende un aptámero de nucleótido. El aptámero de nucleótido puede comprender ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN), ácido xenonucleico (XNA) o una combinación de los mismos. El aptámero de nucleótido puede comprender un análogo de base. El análogo de base puede comprender un análogo de base fluorescente. El aptámero de nucleótido puede comprender un fluoróforo.
[0039] En algunas formas de realización, la composición de indexación de muestras está asociada con un primer soporte. Diferentes composiciones de indexación de muestras de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras se pueden asociar con diferentes primeros soportes. En algunas formas de realización, la composición de aptámero se asocia con un primer vehículo.
[0040] En algunas formas de realización, la composición de aptámero comprende: un segundo aptámero de unión a componente celular capaz de unirse específicamente a al menos una o más proteínas objetivo o uno o más objetivos de componente celular, y un segundo oligonucleótido de indexación de muestra que comprende un segunda secuencia de indexación de muestra. El aptámero que se une al componente celular y el segundo aptámero que se une al componente celular se pueden asociar con un primer vehículo. El aptámero que se une al componente celular se puede asociar con un primer vehículo, y el segundo aptámero que se une al componente celular se puede asociar con un segundo vehículo.
[0041] En algunas formas de realización, el aptámero de unión al componente celular y el segundo aptámero de unión al componente celular tienen al menos un 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de identidad de secuencia. El aptámero que se une al componente celular y el segundo aptámero que se une al componente celular pueden ser idénticos, por ejemplo, en secuencia. El aptámero que se une al componente celular y el segundo aptámero que se une al componente celular pueden ser diferentes.
[0042] En algunas formas de realización, las proteínas objetivo, o los objetivos de componentes celulares, del aptámero que se une al componente celular y el segundo aptámero que se une al componente celular son idénticas. El aptámero que se une al componente celular y el segundo aptámero que se une al componente celular pueden ser capaces de unirse a diferentes regiones de una proteína objetivo o un componente celular objetivo. Las proteínas objetivo, o los objetivos del componente celular, del aptámero que se une al componente celular y el segundo aptámero que se une al componente celular pueden ser diferentes.
[0043] En algunas formas de realización, el primer vehículo comprende nanomaterial metálico. El primer vehículo puede comprender una nanoestructura metálica, una nanopartícula metálica o una combinación de las mismas. El primer portador puede comprender nanomaterial de oro. El primer vehículo puede comprender una nanoestructura de oro, una nanopartícula de oro o una combinación de los mismos. El primer vehículo puede comprender un lisosoma, una micela, una vesícula, una membrana lipídica, una bicapa lipídica, una monocapa lipídica o una combinación de los mismos.
[0044] En algunas formas de realización, el aptámero que se une al componente celular se une al primer vehículo. El aptámero que se une al componente celular se puede unir covalentemente al primer vehículo. El aptámero de unión al componente celular se puede conjugar con el primer vehículo. El aptámero que se une al componente celular se puede conjugar con el primer vehículo a través de un grupo químico seleccionado del grupo que consiste en un grupo fotoescindible por UV, una estreptavidina, una biotina, una amina y una combinación de los mismos. El aptámero de unión al componente celular puede estar unido de forma no covalente al primer vehículo. El aptámero de unión al componente celular se puede asociar con el primer portador a través de un enlazador.
[0045] En algunas formas de realización, el aptámero de unión al componente celular está inmovilizado en el primer portador, parcialmente inmovilizado en el primer portador, inmovilizado en el primer portador, parcialmente inmovilizado en el primer portador, encerrado en el primer portador, parcialmente encerrado en el primer portador, integrado en el primer soporte, parcialmente integrado en el primer soporte, o una combinación de los mismos.
[0046] En algunas formas de realización, el primer portador está configurado para ser internalizado (o capaz de ser internalizado) en la célula. El primer portador se puede internalizar en la célula mediante endocitosis, pinocitosis, nanopinocitosis, micropinocitosis, fagocitosis, fusión de membranas o una combinación de los mismos. El primer portador se puede internalizar en la célula a través de la internalización medicada con clatrina, la internalización mediada por caveolina, la internalización dependiente del receptor, la internalización independiente del receptor o una combinación de las mismas.
[0047] En algunas formas de realización, el oligonucleótido de indexación de la muestra no es homólogo a las secuencias genómicas de ninguna de las una o más células. Al menos una muestra de la pluralidad de muestras puede comprender una o más células individuales, una pluralidad de células, un tejido, una muestra de tumor o cualquier combinación de los mismos. La muestra puede comprender una muestra de mamífero, una muestra bacteriana, una muestra viral, una muestra de levadura, una muestra fúngica o cualquier combinación de las mismas.
[0048] En algunas formas de realización, el oligonucleótido de indexación de muestra comprende una secuencia complementaria a una secuencia de captura configurada para capturar (o capaz de capturar, hibridarse o unirse a) la secuencia del oligonucleótido de indexación de muestra. La región de unión al objetivo puede comprender una región poli(dT). La secuencia del oligonucleótido de indexación de muestra complementaria a la secuencia de captura puede comprender una región poli(dA).
[0049] En algunas formas de realización, el oligonucleótido de indexación de muestra comprende una secuencia de alineación adyacente a la región poli(dA). La secuencia de alineación puede tener una longitud de o más nucleótidos. La secuencia de alineación puede tener una longitud de 2 o más nucleótidos. La secuencia de alineación puede comprender una guanina, una citosina, una timina, un uracilo o una combinación de los mismos. La secuencia de alineación puede comprender una región poli(dT), una región poli(dG), una región poli(dC), una región poli(dU), o una combinación de las mismas.
[0050] En algunas formas de realización, el oligonucleótido de indexación de muestras comprende una secuencia marcadora molecular, una región poli(dA) o una combinación de las mismas. La secuencia del marcador molecular puede tener una longitud de 2 a 20 nucleótidos. El cebador universal puede tener una longitud de 5 a 50 nucleótidos. El cebador universal puede comprender un cebador de amplificación, un cebador de secuenciación o una combinación de los mismos.
[0051] En algunas formas de realización, el componente celular objetivo comprende una proteína de la superficie celular, un marcador celular, un receptor de células B, un receptor de células T, un complejo principal de histocompatibilidad, un antígeno tumoral, un receptor o cualquier combinación de los mismos. El objetivo del componente celular se puede seleccionar de un grupo que comprende de 10 a 100 objetivos del componente celular diferentes. En algunas formas de realización, al menos uno de uno o más objetivos de proteínas, o uno o más objetivos de componentes celulares, está en una superficie celular. En algunas formas de realización, la proteína objetivo o el componente celular objetivo comprende un carbohidrato, un lípido, una proteína, una proteína extracelular, una proteína de superficie celular, un marcador celular, un receptor de células B, un receptor de células T, un complejo principal de histocompatibilidad, un antígeno tumoral, un receptor, una proteína intracelular o cualquier combinación de los mismos. La proteína objetivo, o el componente celular objetivo, se puede seleccionar de un grupo que comprende 10-100 proteínas objetivo o componentes celulares objetivo diferentes.
[0052] En algunas formas de realización, el aptámero de unión al componente celular está asociado con dos o más oligonucleótidos de indexación de muestra con una secuencia idéntica. El aptámero de unión al componente celular se puede asociar con dos o más oligonucleótidos de indexación de muestra con diferentes secuencias de indexación de muestra.
[0053] En algunas formas de realización, la composición de indexación de muestras comprende un segundo aptámero de unión a componentes celulares, y el segundo aptámero de unión a componentes celulares es capaz de unirse específicamente a al menos una de uno o más objetivos de componentes celulares.
[0054] El aptámero de unión a componente celular y el segundo aptámero de unión a componente celular pueden ser capaces de unirse al mismo objetivo de componente celular de uno o más objetivos de componente celular, y el segundo aptámero de unión a componente celular puede no estar asociado con el oligonucleótido de indexación de la muestra. El segundo aptámero de unión al componente celular se puede asociar con un segundo oligonucleótido de indexación de muestra que comprende una segunda secuencia de indexación de muestra. La secuencia de indexación de muestra y la segunda secuencia de indexación de muestra pueden ser idénticas. La secuencia de indexación de muestra y la segunda secuencia de indexación de muestra pueden ser diferentes.
[0055] En algunas formas de realización, el aptámero que se une al componente celular y el segundo aptámero que se une al componente celular son al menos 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % idénticos. El aptámero que se une al componente celular y el segundo aptámero que se une al componente celular pueden ser idénticos. El aptámero de unión al componente celular y el segundo aptámero de unión al componente celular pueden ser capaces de unirse a diferentes regiones de la misma proteína objetivo. El aptámero que se une al componente celular y el segundo aptámero que se une al componente celular pueden ser capaces de unirse a diferentes proteínas objetivo de una o más proteínas objetivo.
[0056] En el presente documento se describen formas de realización de un kit para la identificación de muestras. En algunas formas de realización, el kit comprende una pluralidad de composiciones de indexación de muestras. En algunas formas de realización, el kit comprende una pluralidad de códigos de barras. Un código de barras de la pluralidad de códigos de barras comprende una región de unión al objetivo. La región de unión al objetivo puede comprender una secuencia de captura configurada para capturar (o capaz de capturar, hibridarse o unirse a) una secuencia de un oligonucleótido de indexación de muestra. Un aptámero de unión a componentes celulares puede comprender el oligonucleótido de indexación de la muestra y un primer aptámero de unión a componentes celulares.
[0057] En el presente documento se describen formas de realización de un método para medir la expresión de proteínas en las células. En algunas formas de realización, el método comprende: poner en contacto una pluralidad de aptámeros de unión a proteínas con una pluralidad de células que comprenden una pluralidad de proteínas objetivo, en el que cada uno de la pluralidad de aptámeros de unión a proteínas comprende un oligonucleótido específico de aptámero que comprende una secuencia de identificación única para el aptámero de unión a componentes celulares, y en el que el aptámero de unión a proteínas es capaz de unirse específicamente a al menos una de la pluralidad de proteínas objetivo; dividir la pluralidad de células asociadas con la pluralidad de aptámeros de unión a proteínas en una pluralidad de particiones, donde una partición de la pluralidad de particiones comprende una sola célula de la pluralidad de células asociadas con los aptámeros de unión a proteínas; en la partición que comprende la célula única, poner en contacto una partícula de código de barras con los oligonucleótidos específicos de aptámero, en donde la partícula de código de barras comprende una pluralidad de sondas de oligonucleótidos, cada una de las cuales comprende una región de unión objetivo y una secuencia de código de barras seleccionada de un conjunto diverso de secuencias de código de barras únicas; extender sondas de oligonucleótidos hibridadas con los oligonucleótidos específicos de aptámero para producir una pluralidad de ácidos nucleicos marcados, en donde cada uno de los ácidos nucleicos marcados comprende una secuencia identificadora única, o una secuencia complementaria de la misma, y una secuencia de código de barras; y obtener información de secuencia de la pluralidad de ácidos nucleicos marcados o una parte de los mismos para determinar la cantidad de una o más de la pluralidad de proteínas objetivo en una o más de la pluralidad de células.
[0058] En este documento se describen formas de realización de un método para medir la expresión de componentes celulares en las células. En algunas formas de realización, el método comprende: poner en contacto una pluralidad de aptámeros de unión a componentes celulares con una pluralidad de células que comprenden una pluralidad de objetivos de componentes celulares, en el que cada uno de la pluralidad de aptámeros de unión a componentes celulares comprende un oligonucleótido específico de aptámero que comprende una secuencia identificadora única para el aptámero que se une al componente celular, donde el oligonucleótido específico del aptámero y el aptámero forman un solo polinucleótido, y donde el aptámero que se une al componente celular es capaz de unirse específicamente a al menos uno de la pluralidad de objetivos de componentes celulares; extender sondas de oligonucleótidos hibridadas con los oligonucleótidos específicos de aptámero para producir una pluralidad de ácidos nucleicos marcados, en donde cada uno de los ácidos nucleicos marcados comprende una secuencia identificadora única, o una secuencia complementaria de la misma, y una secuencia de código de barras; y obtener información de secuencia de la pluralidad de ácidos nucleicos marcados o una parte de los mismos para determinar la cantidad de uno o más de la pluralidad de objetivos de componentes celulares en una o más de la pluralidad de células. El método puede comprender: antes de extender las sondas de oligonucleótidos: dividir la pluralidad de células asociadas con la pluralidad de aptámeros de unión a componentes celulares en una pluralidad de particiones, donde una partición de la pluralidad de particiones comprende una sola célula de la pluralidad de células asociada con los aptámeros de unión a componentes celulares; en la partición que comprende la célula única, poner en contacto una partícula de código de barras con los oligonucleótidos específicos de aptámero, en el que la partícula de código de barras comprende una pluralidad de sondas de oligonucleótidos, cada una de las cuales comprende una región de unión objetivo y una secuencia de código de barras seleccionada de un conjunto diverso de secuencias de código de barras únicas. La pluralidad de objetivos de componentes celulares comprende una pluralidad de proteínas objetivo, y donde el aptámero de unión al componente celular es capaz de unirse específicamente a al menos una de la pluralidad de proteínas objetivo.
[0059] En algunas formas de realización, el aptámero puede estar en 5' con respecto al oligonucleótido específico del aptámero en el polinucleótido único. El aptámero puede estar en 3' con respecto al oligonucleótido específico del aptámero en el polinucleótido único.
[0060] El aptámero comprende un aptámero de nucleótido. El aptámero de nucleótido puede comprender ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN), ácido xenonucleico (XNA) o una combinación de los mismos. El aptámero de nucleótido puede comprender un análogo de base. El análogo de base puede comprender un análogo de base fluorescente. El aptámero de nucleótido puede comprender un fluoróforo.
[0061] En algunas formas de realización, la pluralidad de aptámeros de unión a proteínas comprende un segundo aptámero de unión a proteínas, o la pluralidad de aptámeros de unión a componentes celulares comprende un segundo aptámero de unión a componentes celulares. El aptámero y el segundo aptámero pueden estar asociados con un primer vehículo. El aptámero se puede asociar con un primer vehículo y el segundo aptámero se puede asociar con un segundo vehículo. El aptámero y el segundo aptámero pueden tener al menos un 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de secuencias idénticas. El aptámero y el segundo aptámero de unión a proteínas pueden ser idénticos. El aptámero y el segundo aptámero pueden ser diferentes.
[0062] En algunas formas de realización, las proteínas objetivo, o los objetivos de componentes celulares, del aptámero y el segundo aptámero son idénticos. El aptámero y el segundo aptámero pueden ser capaces de unirse a diferentes regiones de una proteína objetivo o un componente celular objetivo. Las proteínas objetivo, o los objetivos de componentes celulares, del aptámero y el segundo aptámero pueden ser diferentes.
[0063] En algunas formas de realización, el primer vehículo comprende nanomaterial metálico. El primer vehículo puede comprender una nanoestructura metálica, una nanopartícula metálica o una combinación de las mismas. El primer portador puede comprender nanomaterial de oro. El primer vehículo puede comprender una nanoestructura de oro, una nanopartícula de oro o una combinación de los mismos. El primer vehículo puede comprender un lisosoma, una micela, una vesícula, una membrana lipídica, una bicapa lipídica, una monocapa lipídica o una combinación de los mismos.
[0064] En algunas formas de realización, el aptámero se une al primer soporte. El aptámero se puede unir covalentemente al primer vehículo. El aptámero se puede conjugar con el primer vehículo. El aptámero se puede conjugar con el primer vehículo a través de un grupo químico seleccionado del grupo que consiste en un grupo fotoescindible por UV, una estreptavidina, una biotina, una amina y una combinación de los mismos. El aptámero se puede unir de forma no covalente al primer vehículo. El aptámero se puede asociar con el primer portador a través de un enlazador. El aptámero puede estar inmovilizado en el primer portador, parcialmente inmovilizado en el primer portador, inmovilizado en el primer portador, parcialmente inmovilizado en el primer portador, encerrado en el primer portador, parcialmente encerrado en el primer portador, incrustado en el primer portador, parcialmente incrustado en el primer portador, o una combinación de los mismos.
[0065] En algunas formas de realización, el método comprende disociar el aptámero del primer vehículo. La disociación puede ocurrir después del contacto en la partición que comprende las células individuales. La disociación puede ocurrir antes del contacto en la partición que comprende las células individuales.
[0066] En algunas formas de realización, poner en contacto la pluralidad de aptámeros con la pluralidad de células comprende: poner en contacto el primer vehículo que comprende el aptámero con una célula de la pluralidad de células que comprende la pluralidad de proteínas objetivo. El primer portador se puede internalizar en la célula. El primer portador se puede internalizar en la célula mediante endocitosis, pinocitosis, nanopinocitosis, micropinocitosis, fagocitosis, fusión de membranas o una combinación de los mismos. El primer portador se puede internalizar en la célula a través de la internalización medicada con clatrina, la internalización mediada por caveolina, la internalización dependiente del receptor, la internalización independiente del receptor o una combinación de las mismas.
[0067] En algunas formas de realización, el oligonucleótido específico de aptámero comprende una secuencia complementaria a una secuencia de captura configurada para capturar (o capaz de capturar, hibridar o unirse a) la secuencia del oligonucleótido específico de aptámero. El código de barras puede comprender una región de unión al objetivo que comprende la secuencia de captura. La región de unión al objetivo puede comprender una región poli(dT). La secuencia del oligonucleótido específico del aptámero complementario a la secuencia de captura puede comprender una región poli(dA).
[0068] En algunas formas de realización, el oligonucleótido específico del aptámero cambia desde una primera conformación en la que la región poli(dA) es inaccesible a una segunda conformación en la que la región poli(dA) es accesible cuando el aptámero entra en contacto con al menos uno de la pluralidad de proteínas objetivo, o objetivos de componentes celulares. La región poli(dA) del oligonucleótido específico de aptámero en la primera conformación puede comprender una estructura de horquilla. La región poli(dA) con la estructura de horquilla puede ser accesible a la región poli(dT) de la región de unión al objetivo del código de barras. Las sondas de oligonucleótidos se pueden hibridar con los oligonucleótidos específicos de aptámero mediante la hibridación entre las regiones poli(dA) de los oligonucleótidos específicos de aptámero y las regiones poli(dT) de las sondas de oligonucleótidos.
[0069] En algunas formas de realización, el oligonucleótido específico de aptámero comprende una secuencia de alineación adyacente a la región poli(dA). La secuencia de alineación puede tener 1 o más nucleótidos de longitud. La secuencia de alineación puede tener una longitud de 2 nucleótidos. La secuencia de alineación puede comprender una guanina, una citosina, una timina, un uracilo o una combinación de los mismos. La secuencia de alineación puede comprender una región poli(dT), una región poli(dG), una región poli(dC), una región poli(dU), o una combinación de las mismas.
[0070] En algunas formas de realización, el oligonucleótido específico de aptámero comprende una secuencia marcadora molecular, un sitio de unión para un cebador universal o ambos. La secuencia del marcador molecular puede tener una longitud de 2 a 20 nucleótidos. El cebador universal puede tener una longitud de 5 a 50 nucleótidos. El cebador universal puede comprender un cebador de amplificación, un cebador de secuenciación o una combinación de los mismos.
[0071] En algunas formas de realización, el método comprende después de poner en contacto la pluralidad de aptámeros con la pluralidad de células, eliminar los aptámeros que no están en contacto con la pluralidad de células. Eliminar los aptámeros que no están en contacto con la pluralidad de células puede comprender: eliminar los aptámeros que no están en contacto con la respectiva al menos una de la pluralidad de proteínas objetivo. La eliminación de los aptámeros que no están en contacto con la respectiva al menos una de la pluralidad de proteínas objetivo puede comprender: la eliminación de los aptámeros que no están en contacto con la respectiva al menos una de la pluralidad de proteínas objetivo comprende el uso de una esponja de aptámero. La esponja aptámera puede comprender una pluralidad de secuencias complementarias a las secuencias de los aptámeros. Los aptámeros que no se ponen en contacto con la respectiva al menos una de la pluralidad de proteínas objetivo puede hibridar con la pluralidad de secuencias de la esponja aptámera.
[0072] En algunas formas de realización, los aptámeros comprenden secuencias complementarias. Los aptámeros que no se ponen en contacto con la respectiva al menos una de la pluralidad de proteínas objetivo puede hibridarse entre sí para formar un agregado. El agregado puede ser objeto de degradación en la célula.
[0073] En algunas formas de realización, la eliminación de los aptámeros que no están en contacto con la respectiva al menos una de la pluralidad de proteínas objetivo comprende: eliminar los aptámeros que no están en contacto con la respectiva al menos una de la pluralidad de proteínas objetivo comprende el uso de una pluralidad de aptámeros antisentido, en el que cada aptámero antisentido de la pluralidad de aptámeros antisentido comprende un segundo aptámero que comprende un oligonucleótido específico de aptámero antisentido que comprende la secuencia complementaria, o una parte de la misma, del oligonucleótido específico de aptámero de uno de los aptámeros no en contacto con el respectivo al menos uno de la pluralidad de proteínas objetivo, y en el que el oligonucleótido específico de aptámero y el oligonucleótido específico de aptámero antisentido forman una molécula de ácido desoxirribonucleico (ADN) de doble cadena o parcialmente de doble cadena.
[0074] En algunas formas de realización, dividir la pluralidad de células comprende dividir la pluralidad de células asociadas con la pluralidad de aptámeros y una pluralidad de partículas de código de barras que comprenden la partícula de código de barras a la pluralidad de particiones, donde la partición de la pluralidad de particiones comprende la célula única de la pluralidad de células asociadas con el aptámero conjugado con oligonucleótido y la partícula de código de barras. En algunas formas de realización, la partición es un pocillo o una gota. En algunas formas de realización, obtener información de secuenciación de la pluralidad de ácidos nucleicos marcados o una parte de los mismos comprende someter los ácidos nucleicos marcados a una o más reacciones para generar un conjunto de ácidos nucleicos para la secuenciación de ácidos nucleicos.
[0075] En algunas formas de realización, la pluralidad de proteínas objetivo comprende una proteína de superficie celular, una proteína intracelular, un marcador celular, un receptor de células B, un receptor de células T, un anticuerpo, un complejo principal de histocompatibilidad, un antígeno tumoral, un receptor, o una combinación de los mismos. En algunas formas de realización, la pluralidad de células comprende células T, células B, células tumorales, células mieloides, células sanguíneas, células normales, células fetales, células maternas o una mezcla de las mismas.
[0076] En algunas formas de realización, cada una de las sondas de oligonucleótidos comprende un marcador celular, un sitio de unión para un cebador universal, un adaptador de amplificación, un adaptador de secuenciación o una combinación de los mismos. En algunas formas de realización, la partícula de código de barras es una perla de sefarosa, una perla de estreptavidina, una perla de agarosa, una perla magnética, una perla de sílice, una perla de tipo sílice, una perla de hidrogel, una microperla antibiotina, una microperla antifluorocromo, o una perla de hidrogel.
[0077] En este documento se describe una composición que comprende: una pluralidad de aptámeros que se unen a componentes celulares, donde cada uno de la pluralidad de aptámeros que se unen a componentes celulares comprende un oligonucleótido específico de aptámero que comprende una secuencia de identificación única para el aptámero que se une a componentes celulares, donde el aptámero el oligonucleótido específico del aptámero y el aptámero forman un único polinucleótido, en el que el oligonucleótido específico del aptámero comprende una secuencia complementaria a una secuencia de captura configurada para capturar la secuencia del oligonucleótido específico del aptámero, en el que la secuencia del oligonucleótido específico del aptámero complementaria a la secuencia de captura comprende un poli(dA), y en el que el aptámero que se une al componente celular es capaz de unirse específicamente a al menos uno de una pluralidad de objetivos de componentes celulares.
[0078] En algunas formas de realización, el aptámero que se une al componente celular puede estar en 5' con respecto al oligonucleótido específico del aptámero en el polinucleótido único. El aptámero de unión al componente celular puede estar en 3' con respecto al oligonucleótido específico del aptámero en el polinucleótido único.
[0079] En algunas formas de realización, el aptámero de unión al componente celular comprende un aptámero de nucleótido. El aptámero de nucleótido puede comprender ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN), ácido xenonucleico (XNA) o una combinación de los mismos. El aptámero de nucleótido puede comprender un análogo de base. El análogo de base puede comprender un análogo de base fluorescente. El aptámero de nucleótido puede comprender un fluoróforo.
[0080] En algunas formas de realización, la pluralidad de aptámeros de unión a componentes celulares comprende un segundo aptámero de unión a componentes celulares. El aptámero que se une al componente celular y el segundo aptámero que se une al componente celular se pueden asociar con un primer vehículo. El aptámero que se une al componente celular se puede asociar con un primer vehículo, y el segundo aptámero que se une al componente celular se puede asociar con un segundo vehículo.
[0081] En algunas formas de realización, el aptámero de unión al componente celular y el segundo aptámero de unión al componente celular pueden tener al menos un 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de identidad de secuencia. El aptámero que se une al componente celular y el segundo aptámero que se une a la proteína pueden ser idénticos. El aptámero que se une al componente celular y el segundo aptámero que se une al componente celular pueden ser diferentes.
[0082] En algunas formas de realización, las proteínas objetivo, o los objetivos de componentes celulares, del aptámero que se une al componente celular y el segundo aptámero que se une al componente celular son idénticas. El aptámero que se une al componente celular y el segundo aptámero que se une al componente celular pueden ser capaces de unirse a diferentes regiones de una proteína objetivo o un componente celular objetivo. Las proteínas objetivo, o los objetivos del componente celular, del aptámero que se une al componente celular y el segundo aptámero que se une al componente celular pueden ser diferentes.
[0083] En algunas formas de realización, el primer vehículo comprende nanomaterial metálico. El primer vehículo puede comprender una nanoestructura metálica, una nanopartícula metálica o una combinación de las mismas. El primer portador puede comprender nanomaterial de oro. El primer vehículo puede comprender una nanoestructura de oro, una nanopartícula de oro o una combinación de los mismos. El primer vehículo puede comprender un lisosoma, una micela, una vesícula, una membrana lipídica, una bicapa lipídica, una monocapa lipídica o una combinación de los mismos.
[0084] En algunas formas de realización, el aptámero de unión al componente celular se une al primer vehículo. El aptámero que se une al componente celular se puede unir covalentemente al primer vehículo. El aptámero de unión al componente celular se puede conjugar con el primer vehículo. El aptámero que se une al componente celular se puede conjugar con el primer vehículo a través de un grupo químico seleccionado del grupo que consiste en un grupo fotoescindible por UV, una estreptavidina, una biotina, una amina y una combinación de los mismos. El aptámero de unión al componente celular puede estar unido de forma no covalente al primer vehículo. El aptámero de unión al componente celular se puede asociar con el primer portador a través de un enlazador. El aptámero que se une al componente celular puede estar inmovilizado en el primer soporte, parcialmente inmovilizado en el primer soporte, inmovilizado en el primer soporte, parcialmente inmovilizado en el primer soporte, encerrado en el primer portador, parcialmente encerrado en el primer portador, incrustado en el primer portador, parcialmente incrustado en el primer portador, o una combinación de los mismos.
[0085] En algunas formas de realización, el primer portador está configurado para ser internalizado (o capaz de ser internalizado) en una célula. El primer portador puede configurarse para ser internalizado (o capaz de ser internalizado) en la célula mediante endocitosis, pinocitosis, nanopinocitosis, micropinocitosis, fagocitosis, fusión de membranas o una combinación de los mismos. El primer portador puede configurarse para internalizarse (o ser capaz de internalizarse) en la célula mediante internalización medicada con clatrina, internalización mediada por caveolina, internalización dependiente del receptor, internalización independiente del receptor o una combinación de los mismos.
[0086] En algunas formas de realización, el oligonucleótido específico de aptámero comprende una secuencia complementaria a una secuencia de captura configurada para capturar (o capaz de capturar, unirse o hibridar con) la secuencia del oligonucleótido específico de aptámero. El código de barras puede comprender una región de unión al objetivo que comprende la secuencia de captura. La región de unión al objetivo puede comprender una región poli(dT). La secuencia del oligonucleótido específico del aptámero complementario a la secuencia de captura puede comprender una región poli(dA).
[0087] En algunas formas de realización, el oligonucleótido específico del aptámero cambia de una primera conformación en la que la región poli(dA) es inaccesible a una segunda conformación en la que la región poli(dA) es accesible cuando el aptámero entra en contacto con al menos una de los pluralidad de proteínas objetivo, o objetivos de componentes celulares. La región poli(dA) del oligonucleótido específico de aptámero en la primera conformación puede comprender una estructura de horquilla. La región poli(dA) con la estructura de horquilla puede ser accesible a la región poli(dT) de la región de unión al objetivo del código de barras. Las sondas de oligonucleótidos se pueden hibridar con los oligonucleótidos específicos de aptámero mediante la hibridación entre las regiones poli(dA) de los oligonucleótidos específicos de aptámero y las regiones poli(dT) de las sondas de oligonucleótidos.
[0088] En algunas formas de realización, el oligonucleótido específico de aptámero comprende una secuencia de alineación adyacente a la región poli(dA). La secuencia de alineación puede tener 1 o más nucleótidos de longitud. La secuencia de alineación puede tener una longitud de 2 nucleótidos. La secuencia de alineación puede comprender una guanina, una citosina, una timina, un uracilo o una combinación de los mismos. La secuencia de alineación puede comprender una región poli(dT), una región poli(dG), una región poli(dC), una región poli(dU), o una combinación de las mismas.
[0089] En algunas formas de realización, el oligonucleótido específico de aptámero puede comprender una secuencia marcadora molecular, un sitio de unión para un cebador universal o ambos. La secuencia del marcador molecular puede tener una longitud de 2 a 20 nucleótidos. El cebador universal puede tener una longitud de 5 a 50 nucleótidos. El cebador universal puede comprender un cebador de amplificación, un cebador de secuenciación o una combinación de los mismos.
[0090] En algunas formas de realización, la composición comprende una esponja de aptámero. La esponja aptámera puede comprender una pluralidad de secuencias complementarias a las secuencias de los aptámeros.
[0091] En algunas formas de realización, los aptámeros comprenden secuencias complementarias. Los aptámeros pueden configurarse para hibridarse (o ser capaces de hibridarse) entre sí para formar un agregado. El agregado puede ser objeto de degradación en la célula.
[0092] En algunas formas de realización, la composición comprende: una pluralidad de aptámeros antisentido, donde cada aptámero antisentido de la pluralidad de aptámeros antisentido comprende un segundo aptámero que comprende un oligonucleótido específico de aptámero antisentido que comprende la secuencia complementaria, o una parte de la misma, del oligonucleótido específico de aptámero de uno de los aptámeros, y en el que el oligonucleótido específico de aptámero y el oligonucleótido específico de aptámero antisentido forman una molécula de ácido desoxirribonucleico (ADN) de doble cadena o parcialmente de doble cadena.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0093]
FIG. 1 ilustra un código de barras estocástico ejemplar no limitativo.
FIG. 2 muestra un flujo de trabajo ejemplar no limitativo de códigos de barras estocásticos y conteo digital. FIG. 3 es una ilustración esquemática que muestra un proceso ejemplar no limitativo para generar una biblioteca indexada de los objetivos con código de barras estocástico a partir de una pluralidad de objetivos.
FIG. 4 muestra una ilustración esquemática de un reactivo de unión a proteínas de ejemplo (anticuerpo ilustrado en este documento) asociado con un oligonucleótido que comprende un identificador único para el reactivo de unión a proteínas.
FIG. 5 muestra una ilustración esquemática de un reactivo de unión ejemplar (anticuerpo ilustrado en este documento) asociado con un oligonucleótido que comprende un identificador único para la indexación de muestras para determinar células de la misma muestra o de muestras diferentes.
FIG. 6 muestra una ilustración esquemática de un flujo de trabajo ejemplar del uso de anticuerpos asociados a oligonucleótidos para determinar la expresión de componentes celulares (p. ej., expresión de proteínas) y la expresión génica simultáneamente con un alto rendimiento.
FIG. 7 muestra una ilustración esquemática de un flujo de trabajo ejemplar del uso de anticuerpos asociados a oligonucleótidos para la indexación de muestras.
FIGS. 8A-8E muestran una ilustración esquemática de un flujo de trabajo ejemplar del uso de aptámeros asociados a oligonucleótidos (p. ej., conjugados) para determinar la expresión de componentes celulares (p. ej., expresión de proteínas).
FIG. 9 es un aptámero ejemplar no limitativo y secuencias asociadas.
FIGS. 10A-10B muestran una ilustración esquemática de un flujo de trabajo ejemplar del uso de aptámeros asociados a oligonucleótidos para la indexación de muestras.
FIGS. 11A-11D muestran diseños ejemplares no limitantes de oligonucleótidos para determinar la expresión de proteínas y la expresión génica simultáneamente y para la indexación de muestras.
FIG. 12 muestra una ilustración esquemática de una secuencia de oligonucleótidos de ejemplo no limitante para determinar la expresión de proteínas y la expresión génica simultáneamente y para la indexación de muestras.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
[0094] La cuantificación de pequeños números de ácidos nucleicos, por ejemplo, moléculas de ácido ribonucleótido mensajero (ARNm), es clínicamente importante para determinar, por ejemplo, los genes que se expresan en una célula en diferentes etapas de desarrollo o bajo diferentes condiciones ambientales. Sin embargo, también puede ser muy difícil determinar el número absoluto de moléculas de ácido nucleico (p. ej., moléculas de ARNm), especialmente cuando el número de moléculas es muy pequeño. Un método para determinar el número absoluto de moléculas en una muestra es la reacción en cadena de la polimerasa digital (PCR). Idealmente, la PCR produce una copia idéntica de una molécula en cada ciclo. Sin embargo, la PCR puede tener desventajas tales como que cada molécula se replica con una probabilidad estocástica, y esta probabilidad varía según el ciclo de la PCR y la secuencia del gen, lo que da como resultado un sesgo de amplificación y mediciones de expresión génica inexactas. Los códigos de barras estocásticos con etiquetas moleculares únicas (también denominados índices moleculares [IM]) se pueden utilizar para contar el número de moléculas y corregir el sesgo de amplificación. Los códigos de barras estocásticos, como el ensayo Precise™ (Cellular Research, Inc. (Palo Alto, CA)) puede corregir el sesgo inducido por la PCR y los pasos de preparación de la biblioteca mediante el uso de etiquetas moleculares (ML) para etiquetar los ARNm durante la transcripción inversa (RT).
[0095] El ensayo Precise™ puede utilizar un grupo no agotador de códigos de barras estocásticos con un gran número, por ejemplo 6561 a 65536, etiquetas moleculares únicas en oligonucleótidos poli(T) para hibridar con todos los ARNm poli(A) en una muestra durante el paso RT. Un código de barras estocástico puede comprender un sitio de cebado de PCR universal. Durante la RT, las moléculas del gen objetivo reaccionan aleatoriamente con códigos de barras estocásticos. Cada molécula diana puede hibridarse con un código de barras estocástico que da como resultado generar moléculas de ácido ribonucleótido complementario (ADNc) con código de barras estocástico). Después del etiquetado, las moléculas de ADNc con código de barras estocástico de los micropocillos de una placa de micropocillos se pueden agrupar en un solo tubo para la amplificación y secuenciación por PCR. Los datos de secuenciación sin procesar se pueden analizar para producir el número de lecturas, el número de códigos de barras estocásticos con marcadores moleculares únicos, y el número de moléculas de ARNm.
[0096] Los métodos para determinar los perfiles de expresión de ARNm de células individuales se pueden realizar de manera masivamente paralela. Por ejemplo, el ensayo Precise™ se puede utilizar para determinar los perfiles de expresión de ARNm de más de 10000 células simultáneamente. El número de células individuales (p. ej., cientos o miles de células individuales) para el análisis por muestra puede ser inferior a la capacidad de la tecnología de célula individual actual. La combinación de células de diferentes muestras permite una mejor utilización de la capacidad de la tecnología única actual, lo que reduce el desperdicio de reactivos y el costo del análisis de células individuales. La divulgación proporciona métodos de indexación de muestras para distinguir células de diferentes muestras para la preparación de bibliotecas de ADNc para análisis celular, tal como análisis de células individuales. La combinación de células de diferentes muestras puede minimizar las variaciones en la preparación de la biblioteca de ADNc de células de diferentes muestras, lo que permite comparaciones más precisas de diferentes muestras.
[0097] En este documento se describen formas de realización de un método para la identificación de muestras. En algunas formas de realización, el método comprende: poner en contacto cada una de una pluralidad de muestras con una composición de indexación de muestras de una pluralidad de composiciones de indexación de muestras, respectivamente, donde cada una de la pluralidad de muestras comprende una o más células, cada una de las cuales comprende una o más proteínas objetivo, donde la composición de indexación de muestra comprende una composición de aptámero que comprende un aptámero y un oligonucleótido de indexación de muestra, donde un solo polinucleótido comprende el oligonucleótido de indexación de muestra y el aptámero, donde el aptámero es capaz de unirse específicamente a al menos uno de uno o más objetivos proteicos, en el que el oligonucleótido de indexación de muestras comprende una secuencia de indexación de muestras, y en el que las secuencias de indexación de muestras de al menos dos composiciones de indexación de muestras de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras comprenden secuencias diferentes; codificar con barras los oligonucleótidos de indexación de muestras usando una pluralidad de códigos de barras para generar una pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras; obtener datos de secuenciación de la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras; e identificar el origen de la muestra de al menos una célula de una o más células basándose en la secuencia de indexación de muestras de al menos un oligonucleótido de indexación de muestras con código de barras de la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras.
[0098] En el presente documento se describen formas de realización de una pluralidad de composiciones de indexación de muestras. En algunas formas de realización, cada una de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras comprende una composición de aptámero que comprende un primer aptámero de unión a componente celular y un oligonucleótido de indexación de muestra, un único polinucleótido comprende el oligonucleótido de indexación de muestra y el aptámero, el aptámero de unión a componente celular es capaz de unirse específicamente a al menos un componente celular objetivo, el oligonucleótido de indexación de muestra comprende una secuencia de indexación de muestra para identificar el origen de la muestra de una o más células de una muestra, el oligonucleótido de indexación de muestra comprende una secuencia complementaria a una secuencia de captura configurada para capturar la secuencia del oligonucleótido de indexación de muestras, en el que la secuencia del oligonucleótido de indexación de muestras complementaria a la secuencia de captura comprende una región poli(dA), y las secuencias de indexación de muestras de al menos dos composiciones de indexación de muestras de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras comprenden secuencias diferentes.
[0099] En el presente documento se describen formas de realización de un método para medir la expresión de proteínas en células. En algunas formas de realización, el método comprende: poner en contacto una pluralidad de aptámeros de unión a proteínas con una pluralidad de células que comprenden una pluralidad de proteínas objetivo, en el que cada uno de la pluralidad de aptámeros de unión a proteínas comprende un oligonucleótido específico de aptámero que comprende una secuencia de identificación única para el aptámero de unión a componentes celulares, y en el que el aptámero de unión a proteínas es capaz de unirse específicamente a al menos una de la pluralidad de proteínas objetivo; dividir la pluralidad de células asociadas con la pluralidad de aptámeros de unión a proteínas en una pluralidad de particiones, donde una partición de la pluralidad de particiones comprende una sola célula de la pluralidad de células asociadas con los aptámeros de unión a proteínas; en la partición que comprende la célula única, poner en contacto una partícula de código de barras con los oligonucleótidos específicos de aptámero, en donde la partícula de código de barras comprende una pluralidad de sondas de oligonucleótidos, cada una de las cuales comprende una región de unión objetivo y una secuencia de código de barras seleccionada de un conjunto diverso de secuencias de código de barras únicas; extender sondas de oligonucleótidos hibridadas con los oligonucleótidos específicos de aptámero para producir una pluralidad de ácidos nucleicos marcados, en donde cada uno de los ácidos nucleicos marcados comprende una secuencia identificadora única, o una secuencia complementaria de la misma, y una secuencia de código de barras; y obtener información de secuencia de la pluralidad de ácidos nucleicos marcados o una parte de los mismos para determinar la cantidad de una o más de la pluralidad de proteínas objetivo en una o más de la pluralidad de células.
[0100] En el presente documento se describen formas de realización de un método para medir la expresión de componentes celulares en las células. En algunas formas de realización, el método comprende: poner en contacto una pluralidad de aptámeros de unión a componentes celulares con una pluralidad de células que comprenden una pluralidad de objetivos de componentes celulares, en el que cada uno de la pluralidad de aptámeros de unión a componentes celulares comprende un oligonucleótido específico de aptámero que comprende una secuencia identificadora única para el aptámero que se une al componente celular, donde el oligonucleótido específico del aptámero y el aptámero forman un solo polinucleótido, y donde el aptámero que se une al componente celular es capaz de unirse específicamente a al menos uno de la pluralidad de objetivos del componente celular; extender sondas de oligonucleótidos hibridadas con los oligonucleótidos específicos de aptámero para producir una pluralidad de ácidos nucleicos marcados, en donde cada uno de los ácidos nucleicos marcados comprende una secuencia identificadora única, o una secuencia complementaria de la misma, y una secuencia de código de barras; y obtener información de secuencia de la pluralidad de ácidos nucleicos marcados o una parte de los mismos para determinar la cantidad de uno o más de la pluralidad de objetivos de componentes celulares en una o más de la pluralidad de células.
[0101] En este documento se describe una composición que comprende: una pluralidad de aptámeros que se unen a componentes celulares, donde cada uno de la pluralidad de aptámeros que se unen a componentes celulares comprende un oligonucleótido específico de aptámero que comprende una secuencia de identificación única para el aptámero que se une a componentes celulares, donde el aptámero el oligonucleótido específico del aptámero y el aptámero forman un único polinucleótido, en el que el oligonucleótido específico del aptámero comprende una secuencia complementaria a una secuencia de captura configurada para capturar la secuencia del oligonucleótido específico del aptámero, en el que la secuencia del oligonucleótido específico del aptámero complementaria a la secuencia de captura comprende un poli(dA), y en el que el aptámero que se une al componente celular es capaz de unirse específicamente a al menos uno de una pluralidad de objetivos de componentes celulares.
Definiciones
[0102] A menos que se defina de otro modo, los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entienden comúnmente los expertos en la técnica a la que pertenece la presente descripción. Véase, por ejemplo, Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2a ed., J. Wiley & Sons (Nueva York, NY 1994); Sambrook y col., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor, NY 1989). A los efectos de la presente divulgación, los siguientes términos se definen a continuación.
[0103] Como se usa en el presente documento, el término "adaptador" puede significar una secuencia para facilitar la amplificación o secuenciación de ácidos nucleicos asociados. Los ácidos nucleicos asociados pueden comprender ácidos nucleicos diana. Los ácidos nucleicos asociados pueden comprender una o más etiquetas espaciales, etiquetas diana, etiquetas de muestra, etiquetas de indexación o secuencias de código de barras (p. ej., etiquetas moleculares). Los adaptadores pueden ser lineales. Los adaptadores pueden ser adaptadores preadenilados. Los adaptadores pueden ser de doble o simple hebra. Se pueden ubicar uno o más adaptadores en el extremo 5' o 3' de un ácido nucleico. Cuando los adaptadores comprenden secuencias conocidas en los extremos 5' y 3', las secuencias conocidas pueden ser secuencias iguales o diferentes. Un adaptador ubicado en los extremos 5' y/o 3' de un polinucleótido puede hibridar con uno o más oligonucleótidos inmovilizados en una superficie. Un adaptador puede, en algunas formas de realización, comprender una secuencia universal. Una secuencia universal puede ser una región de secuencia de nucleótidos que es común a dos o más moléculas de ácido nucleico. Las dos o más moléculas de ácido nucleico también pueden tener regiones de diferente secuencia. Así, por ejemplo, los adaptadores 5' pueden comprender secuencias de ácido nucleico idénticas y/o universales y los adaptadores 3' pueden comprender secuencias idénticas y/o universales. Una secuencia universal que puede estar presente en diferentes miembros de una pluralidad de moléculas de ácido nucleico puede permitir la replicación o amplificación de múltiples secuencias diferentes usando un solo cebador universal que es complementario a la secuencia universal. De manera similar, al menos una, dos (p. ej., un par) o más secuencias universales que pueden estar presentes en diferentes miembros de una colección de moléculas de ácido nucleico pueden permitir la replicación o amplificación de múltiples secuencias diferentes utilizando al menos uno, dos (p. ej., un par) o más cebadores universales únicos que son complementarios a las secuencias universales. Por lo tanto, un cebador universal incluye una secuencia que puede hibridarse con dicha secuencia universal. Las moléculas portadoras de la secuencia de ácido nucleico diana pueden modificarse para unir adaptadores universales (p. ej., secuencias de ácido nucleico no diana) a uno o ambos extremos de las diferentes secuencias de ácido nucleico diana. El uno o más cebadores universales unidos al ácido nucleico diana pueden proporcionar sitios para la hibridación de cebadores universales. El uno o más cebadores universales unidos al ácido nucleico diana pueden ser iguales o diferentes entre sí.
[0104] Como se usa en el presente documento, un anticuerpo puede ser una molécula de inmunoglobulina de longitud completa (por ejemplo, de origen natural o formada por procesos de recombinación de fragmentos de genes de inmunoglobulina normales) (por ejemplo, un anticuerpo IgG) o una parte inmunológicamente activa (es decir, que se une específicamente) de una molécula de inmunoglobulina, como un fragmento de anticuerpo.
[0105] En algunas formas de realización, un anticuerpo es un fragmento de anticuerpo funcional. Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo puede ser una parte de un anticuerpo tal como F(ab')2, Fab', Fab, Fv, sFv y similares. Un fragmento de anticuerpo puede unirse con el mismo antígeno que reconoce el anticuerpo completo. Un fragmento de anticuerpo puede incluir fragmentos aislados que constan de las regiones variables de los anticuerpos, como los fragmentos "Fv" que constan de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera y moléculas polipeptídicas de cadena sencilla recombinantes en las que las regiones variables ligeras y pesadas están conectadas por un conector peptídico ("proteínas scFv"). Los ejemplos de anticuerpos pueden incluir, entre otros, anticuerpos para células cancerosas, anticuerpos para virus, anticuerpos que se unen a receptores de la superficie celular (por ejemplo, CD8, CD34 y CD45) y anticuerpos terapéuticos.
[0106] Como se usa en el presente documento, el término "asociado" o "asociado con" puede significar que dos o más especies son identificables como coubicadas en un punto en el tiempo. Una asociación puede significar que dos o más especies están o estuvieron dentro de un contenedor similar. Una asociación puede ser una asociación informática. Por ejemplo, la información digital sobre dos o más especies se puede almacenar y se puede usar para determinar que una o más de las especies fueron coubicadas en un momento dado. Una asociación también puede ser una asociación física. En algunas formas de realización, dos o más especies asociadas están "atadas", "unidas" o "inmovilizadas" entre sí o a una superficie sólida o semisólida común. Una asociación puede referirse a medios covalentes o no covalentes para unir etiquetas a soportes sólidos o semisólidos, como perlas. Una asociación puede ser un enlace covalente entre un objetivo y una etiqueta. Una asociación puede comprender la hibridación entre dos moléculas (tales como una molécula diana y un marcador).
[0107] Como se usa en el presente documento, el término "complementario" puede referirse a la capacidad para el emparejamiento preciso entre dos nucleótidos. Por ejemplo, si un nucleótido en una posición dada de un ácido nucleico es capaz de formar enlaces de hidrógeno con un nucleótido de otro ácido nucleico, entonces los dos ácidos nucleicos se consideran complementarios entre sí en esa posición. La complementariedad entre dos moléculas de ácido nucleico monocatenario puede ser "parcial", en la que sólo se unen algunos de los nucleótidos, o puede ser completa cuando existe una complementariedad total entre las moléculas monocatenarias. Se puede decir que una primera secuencia de nucleótidos es el "complemento" de una segunda secuencia si la primera secuencia de nucleótidos es complementaria a la segunda secuencia de nucleótidos. Se puede decir que una primera secuencia de nucleótidos es el "complemento inverso" de una segunda secuencia, si la primera secuencia de nucleótidos es complementaria a una secuencia que es inversa (es decir, el orden de los nucleótidos se invierte) de la segunda secuencia. Como se usa en este documento, los términos "complemento", "complementario" y "complemento inverso" se pueden usar indistintamente. Se entiende a partir de la descripción que, si una molécula puede hibridarse con otra molécula, puede ser el complemento de la molécula la que está hibridando.
[0108] Como se usa en el presente documento, el término "recuento digital" puede referirse a un método para estimar un número de moléculas objetivo en una muestra. El conteo digital puede incluir el paso de determinar una cantidad de etiquetas únicas que se han asociado con objetivos en una muestra. Esta metodología, que puede ser de naturaleza estocástica, transforma el problema de contar moléculas de ubicar e identificar moléculas idénticas a una serie de preguntas digitales de sí/no relacionadas con la detección de un conjunto de etiquetas predefinidas.
[0109] Como se usa en el presente documento, el término "marca" o "marcas" puede referirse a códigos de ácido nucleico asociados con un objetivo dentro de una muestra. Una etiqueta puede ser, por ejemplo, una etiqueta de ácido nucleico. Una etiqueta puede ser una etiqueta total o parcialmente amplificable. Una etiqueta puede ser total o parcialmente una etiqueta secuenciable. Un marcador puede ser una parte de un ácido nucleico nativo que es identificable como distinto. Una etiqueta puede ser una secuencia conocida. Un marcador puede comprender una unión de secuencias de ácido nucleico, por ejemplo, una unión de una secuencia nativa y no nativa. Como se usa en este documento, el término "etiqueta" se puede usar indistintamente con los términos "índice", "etiqueta" o "etiqueta-etiqueta". Las etiquetas pueden transmitir información. Por ejemplo, en varias formas de realización, las etiquetas se pueden usar para determinar la identidad de una muestra, una fuente de una muestra, una identidad de una célula y/o un objetivo.
[0110] Como se usa en el presente documento, el término "reservorios que no se agotan" puede referirse a un grupo de códigos de barras (p. ej., códigos de barras estocásticos) formado por muchas etiquetas diferentes. Un depósito que no se agota puede comprender un gran número de códigos de barras diferentes, de modo que cuando el depósito que no se agota está asociado con un grupo de objetivos, es probable que cada objetivo esté asociado con un código de barras único. La singularidad de cada molécula diana marcada puede determinarse mediante las estadísticas de elección aleatoria y depende del número de copias de moléculas objetivo idénticas en la colección en comparación con la diversidad de etiquetas. El tamaño del conjunto resultante de moléculas objetivo etiquetadas puede determinarse por la naturaleza estocástica del proceso de codificación de barras, y el análisis de la cantidad de códigos de barras detectados permite calcular la cantidad de moléculas objetivo presentes en la colección o muestra original. Cuando la relación entre el número de copias de una molécula objetivo presente y el número de códigos de barras únicos es bajo, las moléculas objetivo marcadas son altamente únicas (es decir, existe una probabilidad muy baja de que más de una molécula objetivo haya sido marcada con una etiqueta dada).
[0111] Como se usa en el presente documento, el término "ácido nucleico" se refiere a una secuencia de polinucleótidos, o fragmento de la misma. Un ácido nucleico puede comprender nucleótidos. Un ácido nucleico puede ser exógeno o endógeno a una célula. Un ácido nucleico puede existir en un entorno libre de células. Un ácido nucleico puede ser un gen o un fragmento del mismo. Un ácido nucleico puede ser ADN. Un ácido nucleico puede ser ARN. Un ácido nucleico puede comprender uno o más análogos (p. ej., estructura alterada, azúcar o nucleobase). Algunos ejemplos no limitativos de análogos incluyen: 5-bromouracilo, ácido nucleico peptídico, ácido xenonucleico, morfolinos, ácidos nucleicos bloqueados, ácidos nucleicos de glicol, ácidos nucleicos de treosa, didesoxinucleótidos, cordicepina, 7-deaza-GTP, fluoróforos (p. ej., rodamina o fluoresceína unida al azúcar), nucleótidos que contienen tiol, nucleótidos unidos a biotina, análogos de bases fluorescentes, islas CpG, metil-7-guanosina, nucleótidos metilados, inosina, tiouridina, pseudouridina, dihidrouridina, queuosina y wyosina. "Ácido nucleico", "polinucleótido", "polinucleótido diana" y "ácido nucleico diana" pueden usarse indistintamente.
[0112] Un ácido nucleico puede comprender una o más modificaciones (p. ej., una modificación de base, una modificación de cadena principal), para proporcionar el ácido nucleico con una característica nueva o mejorada (p. ej., estabilidad mejorada). Un ácido nucleico puede comprender una etiqueta de afinidad de ácido nucleico. Un nucleósido puede ser una combinación de base y azúcar. La parte de base del nucleósido puede ser una base heterocíclica. Las dos clases más comunes de tales bases heterocíclicas son las purinas y las pirimidinas. Los nucleótidos pueden ser nucleósidos que además incluyen un grupo fosfato unido covalentemente a la parte de azúcar del nucleósido. Para aquellos nucleósidos que incluyen un azúcar de pentofuranosilo, el grupo fosfato puede estar unido al resto hidroxilo 2', 3' o 5' del azúcar. Al formar ácidos nucleicos, los grupos fosfato pueden enlazar covalentemente nucleósidos adyacentes entre sí para formar un compuesto polimérico lineal. A su vez, los respectivos extremos de este el compuesto polimérico lineal se puede unir para formar un compuesto circular; sin embargo, los compuestos lineales son generalmente adecuados. Además, los compuestos lineales pueden tener complementariedad interna de bases de nucleótidos y, por lo tanto, pueden plegarse de manera que produzcan un compuesto total o parcialmente de doble cadena. Dentro de los ácidos nucleicos, los grupos fosfato pueden denominarse comúnmente como formadores del esqueleto internucleósido del ácido nucleico. El enlace o columna vertebral puede ser un enlace fosfodiéster de 3' a 5'.
[0113] Un ácido nucleico puede comprender un esqueleto modificado y/o enlaces internucleosídicos modificados. Los esqueletos modificados pueden incluir aquellos que retienen un átomo de fósforo en el esqueleto y aquellos que no tienen un átomo de fósforo en el esqueleto. Los esqueletos de ácidos nucleicos modificados adecuados que contienen un átomo de fósforo pueden incluir, por ejemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriésteres, fosfotriésteres de aminoalquilo, metilo y otros fosfonatos de alquilo tales como fosfonatos de 3'-alquileno, fosfonatos de 5'-alquileno, fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos que incluyen 3'-amino fosforamidato y aminoalquil fosforamidatos, fosforodiamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres, selenofosfatos y boranofosfatos que tienen enlaces 3'-5' normales, análogos con enlaces 2'-5' y aquellos que tienen polaridad invertida en los que uno o más enlaces entre nucleótidos es un enlace de 3' a 3', de 5' a 5' o de 2' a 2'.
[0114] Un ácido nucleico puede comprender esqueletos de polinucleótidos que están formados por enlaces internucleósidos de alquilo o cicloalquilo de cadena corta, enlaces internucleósidos mixtos de heteroátomos y alquilo o cicloalquilo, o uno o más enlaces internucleósidos heteroatómicos o heterocíclicos de cadena corta. Éstos pueden incluir aquellos que tienen enlaces morfolino (formados en parte a partir de la parte de azúcar de un nucleósido); cadenas principales de siloxano; cadenas principales de sulfuro, sulfóxido y sulfona; cadenas principales de formacetilo y tioformacetilo; cadenas principales de metileno formacetilo y tioformacetilo; esqueletos de riboacetilo; esqueletos que contienen alquenos; esqueletos de sulfamato; esqueletos de metilenoimino y metilenohidrazino; esqueletos de sulfonato y sulfonamida; esqueletos de amida; y otros que tienen componentes mixtos de N, O, S y Ch2.
[0115] Un ácido nucleico puede comprender un mimético de ácido nucleico. El término "mimético" puede incluir polinucleótidos en los que solo el anillo de furanosa o tanto el anillo de furanosa como el enlace entre nucleótidos se reemplazan con grupos que no son furanosa, el reemplazo del anillo de furanosa también puede denominarse como un sustituto de azúcar. La fracción de base heterocíclica o una fracción de base heterocíclica modificada puede mantenerse para la hibridación con un ácido nucleico diana apropiado. Uno de tales ácidos nucleicos puede ser un ácido nucleico peptídico (ANP). En un ANP, el esqueleto de azúcar de un polinucleótido se puede reemplazar con un esqueleto que contiene amida, en particular, un esqueleto de aminoetilglicina. Los nucleótidos se pueden retener y se unen directa o indirectamente a los átomos de nitrógeno aza de la parte de amida del esqueleto. El esqueleto en los compuestos de ANP puede comprender dos o más unidades de aminoetilglicina unidas que dan al ANP un esqueleto que contiene amida. Los restos de base heterocíclicos se pueden unir directa o indirectamente a átomos de nitrógeno aza de la parte de amida del esqueleto.
[0116] Un ácido nucleico puede comprender una estructura principal de morfolino. Por ejemplo, un ácido nucleico puede comprender un anillo de morfolino de 6 miembros en lugar de un anillo de ribosa. En algunas de estas formas de realización, un enlace internucleósido fosforodiamidato u otro no fosfodiéster puede reemplazar un enlace fosfodiéster.
[0117] Un ácido nucleico puede comprender unidades de morfolino unidas (p. ej., ácido nucleico de morfolino) que tienen bases heterocíclicas unidas al anillo de morfolino. Los grupos de unión pueden unir las unidades monoméricas de morfolino en un ácido nucleico de morfolino. Los compuestos oligoméricos basados en morfolino no iónico pueden tener menos interacciones no deseadas con las proteínas celulares. Los polinucleótidos basados en morfolino pueden ser imitadores no iónicos de ácidos nucleicos. Una variedad de compuestos dentro de la clase de morfolino se pueden unir utilizando diferentes grupos de unión. Una clase adicional de miméticos de polinucleótidos puede denominarse ácidos nucleicos de ciclohexenilo (CeNA). El anillo de furanosa normalmente presente en una molécula de ácido nucleico se puede reemplazar con un anillo de ciclohexenilo. Los monómeros de fosforamidita protegidos con CeNA DMT se pueden preparar y usar para la síntesis de compuestos oligoméricos usando química de fosforamidita. La incorporación de monómeros de CeNA en una cadena de ácido nucleico puede aumentar la estabilidad de un híbrido de ADN/ARN. Los oligoadenilatos de CeNA pueden formar complejos con complementos de ácidos nucleicos con una estabilidad similar a la de los complejos nativos. Una modificación adicional puede incluir ácidos nucleicos bloqueados (ANB) en los que el grupo 2'-hidroxilo está unido al átomo de carbono 4' del anillo de azúcar formando así un enlace 2'-C, 4'-C-oximetileno formando así un resto de azúcar bicíclico. El enlace puede ser un grupo metileno (-CH2), que une el átomo de oxígeno 2' y el átomo de carbono 4' en el que n es 1 o 2. ANB y los análogos de ANB pueden mostrar estabilidades térmicas dúplex muy altas con ácido nucleico complementario (Tm=+3 a 10 °C), estabilidad frente a la degradación 3'-exonucleolítica y buenas propiedades de solubilidad.
[0118] Un ácido nucleico también puede incluir modificaciones o sustituciones de nucleobase (a menudo denominado simplemente como "base"). Como se usa en el presente documento, las bases nitrogenadas "sin modificar" o "naturales" pueden incluir las bases de purina (p. ej., adenina (A) y guanina (G)), y las bases de pirimidina (p. ej., timina (T), citosina (C) y uracilo (U)). Las bases nitrogenadas modificadas pueden incluir otras bases nitrogenadas sintéticas y naturales como 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metilo y otros derivados alquílicos de adenina y guanina, 2-propilo y otros derivados alquílicos de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinil (-C=C-CH3) uracilo y citosina y demás derivados alquinílicos de bases pirimidínicas, 6 -azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-halo particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas sustituidos en 5,7-metilguanina y 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-aminoadenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-deazaguanina y 7-deazaadenina y 3-desazaguanina y 3-desazaadenina. Las nucleobases modificadas pueden incluir pirimidinas tricíclicas como fenoxazina citidina (1H-pirimido(5,4-b)(1,4)benzoxazin-2(3H)-ona), fenotiazina citidina (1H-pirimido(5,4-b)(1,4)benzotiazina-2(3H)-ona), abrazaderas G como una fenoxazina citidina sustituida (p. ej., 9-(2-aminoetoxi)-H-pirimido(5,4-(b) (1,4)benzoxazin-2(3H)-ona), fenotiazina citidina (1H-pirimido(5,4-b)(1,4)benzotiazina-2(3H)-ona), abrazaderas G como una fenoxazina citidina sustituida (p.ej, 9-(2-aminoetoxi)-H-pirimido(5,4-(b) (1,4)benzoxazin-2(3H)-ona), carbazol citidina (2H-pirimido(4,5-b)indol-2-ona), piridoindol citidina (H-pirido(3',2':4,5)pirrolo[2,3-d]pirimidin-2-ona).
[0119] Como se usa en el presente documento, el término "muestra" puede referirse a una composición que comprende dianas. Las muestras adecuadas para el análisis mediante los métodos, dispositivos y sistemas descritos incluyen células, tejidos, órganos u organismos.
[0120] Como se usa en el presente documento, el término "dispositivo de muestreo" o "dispositivo" puede referirse a un dispositivo que puede tomar una sección de una muestra y/o colocar la sección sobre un sustrato. Un dispositivo de muestra puede referirse, por ejemplo, a una máquina de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), una máquina de clasificación de células, una aguja de biopsia, un dispositivo de biopsia, un dispositivo de corte de tejido, un dispositivo de microfluidos, una rejilla de hojas y/o una micrótomo.
[0121] Como se usa en el presente documento, el término "soporte sólido" puede referirse a superficies discretas sólidas o semisólidas a las que se pueden unir una pluralidad de códigos de barras (por ejemplo, códigos de barras estocásticos). Un soporte sólido puede abarcar cualquier tipo de esfera, bola, cojinete, cilindro u otra configuración similar sólida, porosa o hueca compuesta de material plástico, cerámico, metálico o polimérico (por ejemplo, hidrogel) sobre el cual se puede inmovilizar un ácido nucleico (por ejemplo, de forma covalente o no covalente). Un soporte sólido puede comprender una partícula discreta que puede ser esférica (por ejemplo, microesferas) o tener una forma no esférica o irregular, como cúbica, cuboide, piramidal, cilíndrica, cónica, oblonga o en forma de disco, y similares. Una cuenta puede tener forma no esférica. Una pluralidad de soportes sólidos espaciados en una matriz puede no comprender un sustrato. Un soporte sólido se puede usar indistintamente con el término "perla".
[0122] Como se usa en el presente documento, el término "código de barras estocástico" puede referirse a una secuencia de polinucleótidos que comprende etiquetas de la presente divulgación. Un código de barras estocástico puede ser una secuencia de polinucleótidos que se puede utilizar para la codificación de barras estocástica. Los códigos de barras estocásticos se pueden utilizar para cuantificar objetivos dentro de una muestra. Los códigos de barras estocásticos se pueden usar para controlar los errores que pueden ocurrir después de asociar una etiqueta con un objetivo. Por ejemplo, se puede utilizar un código de barras estocástico para evaluar la amplificación o los errores de secuenciación. Un código de barras estocástico asociado con un objetivo puede denominarse objetivo de código de barras estocástico o objetivo de etiqueta de código de barras estocástico.
[0123] Como se usa en el presente documento, el término "código de barras estocástico específico de gen" puede referirse a una secuencia de polinucleótidos que comprende etiquetas y una región de unión a diana que es específica de gen. Un código de barras estocástico puede ser una secuencia de polinucleótidos que se puede utilizar para la codificación de barras estocástica. Los códigos de barras estocásticos se pueden utilizar para cuantificar objetivos dentro de una muestra. Los códigos de barras estocásticos se pueden usar para controlar los errores que pueden ocurrir después de asociar una etiqueta con un objetivo. Por ejemplo, se puede utilizar un código de barras estocástico para evaluar la amplificación o los errores de secuenciación. Un código de barras estocástico asociado con un objetivo puede denominarse código de barras objetivo estocástico o código de barras-etiqueta-objetivo estocástico.
[0124] Como se usa en el presente documento, el término "código de barras estocástico" puede referirse al marcaje aleatorio (p. ej., código de barras) de ácidos nucleicos. El código de barras estocástico puede utilizar una estrategia de Poisson recursiva para asociar y cuantificar las etiquetas asociadas con los objetivos. Como se usa en este documento, el término "código de barras estocástico" se puede usar indistintamente con "etiquetado estocástico".
[0125] Como se usa aquí, el término "objetivo" puede referirse a una composición que puede asociarse con un código de barras (p. ej., un código de barras estocástico). Ejemplos de dianas adecuadas para el análisis mediante los métodos, dispositivos y sistemas descritos incluyen oligonucleótidos, ADN, ARN, ARNm, microARN, ARNt y similares. Los objetivos pueden ser monocatenarios o bicatenarios. En algunas formas de realización, los objetivos pueden ser proteínas, péptidos o polipéptidos. En algunas formas de realización, los objetivos son lípidos. Como se usa en este documento, "objetivo" se puede usar indistintamente con "especie".
[0126] Como se usa en el presente documento, el término "transcriptasas inversas" puede referirse a un grupo de enzimas que tienen actividad de transcriptasa inversa (es decir, que catalizan la síntesis de ADN a partir de una plantilla de ARN). En general, tales enzimas incluyen, pero no se limitan a, transcriptasa inversa retroviral, transcriptasa inversa de retrotransposón, transcriptasas inversas de retroplásmido, transcriptasas inversas de retron, transcriptasas inversas bacterianas, transcriptasa inversa derivada de intrones del grupo II y mutantes, variantes o derivados de las mismas. Las transcriptasas inversas no retrovirales incluyen transcriptasas inversas de retrotransposones no LTR, transcriptasas inversas de retroplásmidos, transcriptasas inversas de retrones y transcriptasas inversas de intrones del grupo II. Los ejemplos de transcriptasas inversas del intrón del grupo II incluyen la transcriptasa inversa del intrón LI.LtrB de Lactococcus lactis, la transcriptasa inversa del intrón Thermosynechococcus elongatus TeI4c o la transcriptasa inversa del intrón Geobacillus stearothermophilus GsI-IIC. Otras clases de transcriptasas inversas pueden incluir muchas clases de transcriptasas inversas no retrovirales (es decir, retrones, intrones del grupo II y retroelementos generadores de diversidad, entre otros).
[0127] Los términos "cebador adaptador universal", "adaptador de cebador universal" o "secuencia adaptadora universal" se usan indistintamente para referirse a una secuencia de nucleótidos que se puede usar para hibridarse con códigos de barras (por ejemplo, códigos de barras estocásticos) para generar códigos de barras específicos a genes. Una secuencia adaptadora universal puede, por ejemplo, ser una secuencia conocida que sea universal en todos los códigos de barras utilizados en los métodos de divulgación. Por ejemplo, cuando se marcan múltiples dianas usando los métodos descritos en el presente documento, cada una de las secuencias específicas de la diana puede estar unida a la misma secuencia adaptadora universal. En algunas formas de realización, se puede usar más de una secuencia adaptadora universal en los métodos descritos en el presente documento. Por ejemplo, cuando se etiquetan múltiples objetivos utilizando los métodos descritos en este documento, al menos dos de las secuencias específicas de diana están unidas a diferentes secuencias adaptadoras universales. Un cebador adaptador universal y su complemento pueden incluirse en dos oligonucleótidos, uno de los cuales comprende una secuencia específica de diana y el otro comprende un código de barras. Por ejemplo, una secuencia adaptadora universal puede ser parte de un oligonucleótido que comprende una secuencia específica de diana para generar una secuencia de nucleótidos que es complementaria a un ácido nucleico diana. Un segundo oligonucleótido que comprende un código de barras y una secuencia complementaria de la secuencia adaptadora universal puede hibridarse con la secuencia de nucleótidos y generar un código de barras específico del objetivo (p. ej., un código de barras estocástico específico del objetivo). En algunas formas de realización, un cebador adaptador universal tiene una secuencia que es diferente de un cebador PCR universal usado en los métodos de esta descripción.
Códigos de barras
[0128] Los códigos de barras, como los códigos de barras estocásticos, se han descrito, por ejemplo, en US20150299784, WO2015031691 y Fu et al, Proc Natl Acad Sci EE. UU. 2011 Mayo 31 ;108(22):9026-31. En algunas formas de realización, el código de barras divulgado en el presente documento puede ser un código de barras estocástico que puede ser una secuencia de polinucleótidos que puede usarse para etiquetar estocásticamente (p. ej., código de barras, etiquetar) un objetivo. Los códigos de barras se pueden referir a códigos de barras estocásticos si la proporción del número de secuencias de códigos de barras diferentes de los códigos de barras estocásticos y el número de ocurrencias de cualquiera de los objetivos a etiquetar puede ser, o ser aproximadamente, 1:1, 2:1, 3:1,4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1,20:1,30:1,40:1,50:1,60:1,70:1,80:1,90:1, 100:1, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores. Un objetivo puede ser una especie de ARNm que comprenda moléculas de ARNm con secuencias idénticas o casi idénticas. Los códigos de barras se pueden denominar códigos de barras estocásticos si la proporción del número de secuencias de códigos de barras diferentes de los códigos de barras estocásticos y el número de ocurrencias de cualquiera de los objetivos a etiquetar es al menos, o como máximo, 1:1,2:1, 3 :1,4:1,5 :1,6:1,7 :1,8:1,9 :1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1,20:1, 30:1,40:1,50:1,60:1,70:1, 80:1, 90:1, o 100:1. Las secuencias de códigos de barras de códigos de barras estocásticos pueden denominarse etiquetas moleculares.
[0129] Un código de barras, por ejemplo, un código de barras estocástico puede comprender una o más etiquetas. Los ejemplos de etiquetas pueden incluir una etiqueta universal, una etiqueta de célula, una secuencia de código de barras (p. ej., una etiqueta molecular), una etiqueta de muestra, una etiqueta de placa, una etiqueta espacial y/o una etiqueta preespacial. FIG. 1 ilustra un ejemplo de código de barras 104 con una etiqueta espacial. El código de barras 104 puede comprender una 5'amina que puede vincular el código de barras a un soporte sólido 105. El código de barras puede comprender una etiqueta universal, una etiqueta de dimensión, una etiqueta espacial, una etiqueta celular y/o una etiqueta molecular. El orden de las diferentes etiquetas (incluidas, entre otras, la etiqueta universal, la etiqueta de dimensión, la etiqueta espacial, la etiqueta de célula y la etiqueta de molécula) en el código de barras puede variar. Por ejemplo, como se muestra en la FIG. 1, el marcador universal puede ser el marcador más 5' y el marcador molecular puede ser el marcador más 3'. La etiqueta espacial, la etiqueta de dimensión y la etiqueta de célula pueden estar en cualquier orden. En algunas formas de realización, la etiqueta universal, la etiqueta espacial, la etiqueta de dimensión, la etiqueta de célula y la etiqueta molecular están en cualquier orden. El código de barras puede comprender una región de unión al objetivo. La región de unión al objetivo puede interactuar con un objetivo (p. ej., ácido nucleico objetivo, ARN, ARNm, ADN) en una muestra. Por ejemplo, una región de unión al objetivo puede comprender una secuencia de oligo(dT) que puede interactuar con las colas poli(A) de los ARNm. En algunos casos, las etiquetas del código de barras (p. ej., etiqueta universal, etiqueta de dimensión, etiqueta espacial, etiqueta de célula y secuencia de código de barras) pueden estar separadas por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 o más nucleótidos.
[0130] Una etiqueta, por ejemplo, la etiqueta celular, puede comprender un conjunto único de subsecuencias de ácido nucleico de longitud definida, por ejemplo, siete nucleótidos cada una (equivalente a la cantidad de bits utilizados en algunos códigos de corrección de errores de Hamming), que pueden estar diseñados para proporcionar la capacidad de corrección de errores. El conjunto de subsecuencias de corrección de errores comprende siete secuencias de nucleótidos que pueden diseñarse de manera que cualquier combinación de secuencias por pares en el conjunto muestre una "distancia genética" definida (o número de bases no coincidentes), por ejemplo, un conjunto de subsecuencias de corrección de errores. las secuencias pueden diseñarse para exhibir una distancia genética de tres nucleótidos. En este caso, la revisión de las secuencias de corrección de errores en el conjunto de datos de secuencias para moléculas de ácido nucleico diana marcadas (descritas con más detalle a continuación) puede permitir detectar o corregir errores de amplificación o secuenciación. En algunas formas de realización, la longitud de las subsecuencias de ácido nucleico utilizadas para crear códigos de corrección de errores puede variar, por ejemplo, pueden ser o ser aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 31,40, 50, o un número o un rango entre dos cualquiera de estos valores, nucleótidos de longitud. En algunas formas de realización, las subsecuencias de ácido nucleico de otras longitudes pueden usarse para crear códigos de corrección de errores.
[0131] El código de barras puede comprender una región de unión al objetivo. La región de unión al objetivo puede interactuar con un objetivo en una muestra. El objetivo puede ser, o comprender, ácidos ribonucleicos (ARN), ARN mensajeros (ARNm), microARN, pequeños ARN de interferencia (ARNi), productos de degradación de ARN, ARN que comprenden cada uno una cola de poli(A), o cualquier combinación de los mismos. En algunas formas de realización, la pluralidad de dianas puede incluir ácidos desoxirribonucleicos (ADN).
[0132] En algunas formas de realización, una región de unión al objetivo puede comprender una secuencia oligo(dT) que puede interactuar con las colas poli(A) de los ARNm. Una o más de las etiquetas del código de barras (p. ej., la etiqueta universal, la etiqueta de dimensión, la etiqueta espacial, la etiqueta de célula y las secuencias del código de barras (p. ej., etiqueta molecular)) pueden estar separadas por un espaciador de otra o dos de las etiquetas restantes del código de barras. El espaciador puede ser, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20, o más nucleótidos. En algunas formas de realización, ninguna de las etiquetas del código de barras está separada por un espaciador.
Etiquetas universales
[0133] Un código de barras puede comprender una o más etiquetas universales. En algunas formas de realización, una o más etiquetas universales pueden ser las mismas para todos los códigos de barras en el conjunto de códigos de barras unidos a un soporte sólido dado. En algunas formas de realización, una o más etiquetas universales pueden ser las mismas para todos los códigos de barras adheridos a una pluralidad de perlas. En algunas formas de realización, un marcador universal puede comprender una secuencia de ácido nucleico que es capaz de hibridarse con un cebador de secuenciación. Los cebadores de secuenciación se pueden utilizar para secuenciar códigos de barras que comprenden una etiqueta universal. Los cebadores de secuenciación (p. ej., cebadores de secuenciación universales) pueden comprender cebadores de secuenciación asociados con plataformas de secuenciación de alto rendimiento. En algunas formas de realización, un marcador universal puede comprender una secuencia de ácido nucleico que es capaz de hibridar con un cebador de PCR. En algunas formas de realización, el marcador universal puede comprender una secuencia de ácido nucleico que es capaz de hibridarse con un cebador de secuenciación y un cebador de PCR. La secuencia de ácido nucleico del marcador universal que es capaz de hibridar con un cebador de secuenciación o de PCR puede denominarse sitio de unión del cebador. Una etiqueta universal puede comprender una secuencia que puede usarse para iniciar la transcripción del código de barras. Una etiqueta universal puede comprender una secuencia que se puede usar para la extensión del código de barras o una región dentro del código de barras. Una etiqueta universal puede ser 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores, nucleótidos de longitud. Por ejemplo, un marcador universal puede comprender al menos alrededor de 10 nucleótidos. Una etiqueta universal puede tener al menos, o como máximo, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 200 o 300 nucleótidos de longitud. En algunas formas de realización, un enlazador escindible o un nucleótido modificado puede formar parte de la secuencia marcadora universal para permitir que el código de barras se escinda del soporte.
Etiquetas de dimensión
[0134] Un código de barras puede comprender una o más etiquetas de dimensión. En algunas formas de realización, una etiqueta de dimensión puede comprender una secuencia de ácido nucleico que proporciona información sobre una dimensión en la que se produjo el marcaje (p. ej., marcaje estocástico). Por ejemplo, una etiqueta de dimensión puede proporcionar información sobre el momento en que se codificó un objetivo. Una etiqueta de dimensión se puede asociar con un tiempo de codificación de barras (p. ej., codificación de barras estocástica) en una muestra. Se puede activar una etiqueta de dimensión en el momento del etiquetado. Se pueden activar diferentes etiquetas de dimensión en diferentes momentos. La etiqueta de dimensión proporciona información sobre el orden en que se codificaron los objetivos, grupos de objetivos y/o muestras. Por ejemplo, se puede codificar una población de células en la fase G0 del ciclo celular. Las células se pueden pulsar de nuevo con códigos de barras (p. ej., códigos de barras estocásticos) en la fase G1 del ciclo celular. Las células se pueden pulsar de nuevo con códigos de barras en la fase S del ciclo celular, y así sucesivamente. Los códigos de barras en cada pulso (por ejemplo, cada fase del ciclo celular) pueden comprender diferentes etiquetas de dimensión. De esta forma, la etiqueta de dimensión proporciona información sobre los objetivos que se etiquetaron en cada fase del ciclo celular. Las etiquetas de dimensión pueden interrogar muchos tiempos biológicos diferentes. Los tiempos biológicos ejemplares pueden incluir, pero no se limitan a, el ciclo celular, la transcripción (p. ej., el inicio de la transcripción) y la degradación de la transcripción. En otro ejemplo, se puede marcar una muestra (p. ej., una célula, una población de células) antes y/o después del tratamiento con un fármaco y/o terapia. Los cambios en el número de copias de distintas dianas pueden ser indicativos de la respuesta de la muestra al fármaco y/o a la terapia.
[0135] Una etiqueta de dimensión puede ser activable. Una etiqueta de dimensión activable se puede activar en un punto de tiempo específico. La etiqueta activable puede estar, por ejemplo, activada constitutivamente (por ejemplo, no apagada). La etiqueta de dimensión activable puede activarse, por ejemplo, de forma reversible (por ejemplo, la etiqueta de dimensión activable puede activarse y desactivarse). La etiqueta de dimensión puede ser, por ejemplo, reversiblemente activable al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más veces. La etiqueta de dimensión se puede activar de forma reversible, por ejemplo, al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más veces. En algunas formas de realización, la etiqueta de dimensión se puede activar con fluorescencia, luz, un evento químico (p. ej., escisión, unión de otra molécula, adición de modificaciones (p. ej., pegilado, sumoilado, acetilado, metilado, desacetilado, desmetilado), un evento fotoquímico (p. ej., fotoenjaulado) e introducción de un nucleótido no natural.
[0136] La etiqueta de dimensión puede, en algunas formas de realización, ser idéntica para todos los códigos de barras (p. ej., códigos de barras estocásticos) unidos a un soporte sólido dado (p. ej., una perla), pero diferente para diferentes soportes sólidos (p. ej., perlas). En algunas formas de realización, al menos el 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 99 % o 100 % de los códigos de barras en el mismo soporte sólido puede comprender la misma etiqueta de dimensión. En algunas formas de realización, al menos el 60 % de los códigos de barras en el mismo soporte sólido pueden comprender la misma etiqueta de dimensión. En algunas formas de realización, al menos el 95 % de los códigos de barras en el mismo soporte sólido pueden comprender la misma etiqueta de la misma dimensión.
[0137] Puede haber hasta 106 o más secuencias de etiquetas de dimensión únicas representadas en una pluralidad de soportes sólidos (por ejemplo, perlas). Una etiqueta de dimensión puede ser, o ser aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores, nucleótidos de longitud. Una etiqueta de dimensión puede tener al menos, o como máximo, 1,2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 200 o 300 nucleótidos en longitud. Una etiqueta de dimensión puede comprender entre aproximadamente 5 y aproximadamente 200 nucleótidos. Una etiqueta de dimensión puede comprender entre aproximadamente 10 y aproximadamente 150 nucleótidos. Una etiqueta de dimensión puede comprender entre aproximadamente 20 y aproximadamente 125 nucleótidos de longitud.
Etiquetas espaciales
[0138] Un código de barras puede comprender una o más etiquetas. En algunas formas de realización, una etiqueta espacial puede comprender una secuencia de ácido nucleico que proporciona información sobre la orientación espacial de una molécula objetivo que está asociada con el código de barras. Una etiqueta espacial se puede asociar con una coordenada en una muestra. La coordenada puede ser una coordenada fija. Por ejemplo, una coordenada se puede fijar en referencia a un sustrato. Una etiqueta espacial puede hacer referencia a una cuadrícula de dos o tres dimensiones. Una coordenada se puede fijar en referencia a un punto de referencia. El punto de referencia puede ser identificable en el espacio. Un punto de referencia puede ser una estructura de la que se puede obtener una imagen. Un punto de referencia puede ser una estructura biológica, por ejemplo, un punto de referencia anatómico. Un punto de referencia puede ser un punto de referencia celular, por ejemplo, un orgánulo. Un hito puede ser un hito no natural, como una estructura con un identificador identificable, como un código de color, un código de barras, una propiedad magnética, fluorescentes, radiactividad o un tamaño o forma únicos. Una etiqueta espacial se puede asociar con una partición física (p. ej., un pocillo, un contenedor o una gota). En algunas formas de realización, múltiples etiquetas espaciales se usan juntas para codificar una o más posiciones en el espacio.
[0139] La etiqueta espacial puede ser idéntica para todos los códigos de barras adheridos a un soporte sólido dado (p. ej., una perla), pero diferente para diferentes soportes sólidos (p. ej., perlas). En algunas formas de realización, el porcentaje de códigos de barras en el mismo soporte sólido que comprende la misma etiqueta espacial puede ser, o ser aproximadamente, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 99 %, 100 %, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, el porcentaje de códigos de barras en el mismo soporte sólido que comprende la misma etiqueta espacial puede ser al menos, o como máximo, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 99 %, o 100 %. En algunas formas de realización, al menos el 60 % de los códigos de barras en el mismo soporte sólido pueden comprender la misma etiqueta espacial. En algunas formas de realización, al menos el 95 % de los códigos de barras en el mismo soporte sólido pueden comprender la misma etiqueta espacial.
[0140] Puede haber hasta 106 o más secuencias de etiquetas espaciales únicas representadas en una pluralidad de soportes sólidos (p. ej., perlas). Una etiqueta espacial puede ser, o ser aproximadamente, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores, nucleótidos de longitud. Una etiqueta espacial puede tener al menos o como máximo 1,2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 200 o 300 nucleótidos de longitud. Una etiqueta espacial puede comprender entre aproximadamente 5 y aproximadamente 200 nucleótidos. Una etiqueta espacial puede comprender entre aproximadamente 10 y aproximadamente 150 nucleótidos. Una etiqueta espacial puede comprender entre aproximadamente 20 y aproximadamente 125 nucleótidos de longitud.
Etiquetas de célula
[0141] Un código de barras (por ejemplo, un código de barras estocástico) puede comprender una o más etiquetas de célula. En algunas formas de realización, un marcador celular puede comprender una secuencia de ácido nucleico que proporciona información para determinar qué ácido nucleico diana se originó a partir de qué célula. En algunas formas de realización, la etiqueta de la célula es idéntica para todos los códigos de barras adheridos a un soporte sólido dado (p. ej., una perla), pero diferente para diferentes soportes sólidos (p. ej., perlas). En algunas formas de realización, el porcentaje de códigos de barras en el mismo soporte sólido que comprende la misma etiqueta de célula puede ser aproximadamente 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 99 %, 100 %, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, el porcentaje de códigos de barras en el mismo soporte sólido que comprende la misma etiqueta de célula puede ser de aproximadamente 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 99 % o 100 %. Por ejemplo, al menos el 60 % de los códigos de barras en el mismo soporte sólido pueden comprender la misma etiqueta de célula. Como otro ejemplo, al menos el 95 % de los códigos de barras en el mismo soporte sólido pueden comprender la misma etiqueta de célula.
[0142] Puede haber hasta 106 o más secuencias de etiquetas celulares únicas representadas en una pluralidad de soportes sólidos (p. ej., perlas). Una etiqueta de célula puede ser, o ser aproximadamente, 1,2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores, nucleótidos de longitud. Una etiqueta de célula puede tener al menos, o como máximo, 1,2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 200 o 300 nucleótidos de longitud. Por ejemplo, un marcador celular puede comprender entre aproximadamente 5 y aproximadamente 200 nucleótidos. Como otro ejemplo, un marcador celular puede comprender entre aproximadamente 10 y aproximadamente 150 nucleótidos. Como otro ejemplo más, un marcador celular puede comprender entre aproximadamente 20 y aproximadamente 125 nucleótidos de longitud.
Secuencias de códigos de barras
[0143] Un código de barras puede comprender una o más secuencias de códigos de barras. En algunas formas de realización, una secuencia de código de barras puede comprender una secuencia de ácido nucleico que proporciona información de identificación para el tipo específico de especie de ácido nucleico diana hibridada con el código de barras. Una secuencia de código de barras puede comprender una secuencia de ácido nucleico que proporciona un contador (p. ej., que proporciona una aproximación aproximada) para la aparición específica de la especie de ácido nucleico objetivo hibridada con el código de barras (p. ej., región de unión al objetivo).
[0144] En algunas formas de realización, un conjunto diverso de secuencias de códigos de barras se une a un soporte sólido dado (p. ej., una perla). En algunas formas de realización, puede haber, o haber alrededor de, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, o un número o un rango entre dos cualquiera de estos valores, secuencias marcadoras moleculares únicas. Por ejemplo, una pluralidad de códigos de barras puede comprender aproximadamente 6561 secuencias de códigos de barras con secuencias distintas. Como otro ejemplo, una pluralidad de códigos de barras puede comprender aproximadamente 65536 secuencias de códigos de barras con secuencias distintas. En algunas formas de realización, puede haber al menos, o como máximo, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 o 109 secuencias de código de barras únicas. Las secuencias de etiquetas moleculares únicas se pueden unir a un soporte sólido dado (p. ej., una perla).
[0145] La longitud de un código de barras puede ser diferente en diferentes implementaciones. Por ejemplo, un código de barras puede ser, o ser aproximadamente, 1,2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, o un número o un rango entre dos cualesquiera de estos valores, nucleótidos de longitud. Como otro ejemplo, un código de barras puede ser como mínimo o como máximo 1,2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 200 o 300 nucleótidos de longitud.
Etiquetas moleculares
[0146] Un código de barras (p. ej., un código de barras estocástico) puede comprender una o más etiquetas moleculares. Las etiquetas moleculares pueden incluir secuencias de códigos de barras. En algunas formas de realización, un marcador molecular puede comprender una secuencia de ácido nucleico que proporciona información de identificación para el tipo específico de especie de ácido nucleico diana hibridada con el código de barras. Un marcador molecular puede comprender una secuencia de ácido nucleico que proporciona un contador para la aparición específica de la especie de ácido nucleico objetivo hibridada con el código de barras (p. ej., región de unión al objetivo).
[0147] En algunas formas de realización, se une un conjunto diverso de marcadores moleculares a un soporte sólido dado (p. ej., una perla). En algunas formas de realización, puede haber, o puede haber alrededor de, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores, de secuencias marcadoras moleculares únicas. Por ejemplo, una pluralidad de códigos de barras puede comprender alrededor de 6561 etiquetas moleculares con secuencias distintas. Como otro ejemplo, una pluralidad de códigos de barras puede comprender aproximadamente 65536 etiquetas moleculares con secuencias distintas. En algunas formas de realización, puede haber al menos, o como máximo, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 o 109 secuencias marcadoras moleculares únicas. Los códigos de barras con secuencias de etiquetas moleculares únicas se pueden unir a un soporte sólido determinado (p. ej., una perla).
[0148] Para la codificación de barras estocástica que utiliza una pluralidad de códigos de barras estocásticos, la proporción del número de secuencias de etiquetas moleculares diferentes y el número de aparición de cualquiera de los objetivos puede ser, o ser aproximadamente, 1:1,2:1, 3: 1,4:1,5:1, 6:1,7:1,8:1,9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 100: 1, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores. Un objetivo puede ser una especie de ARNm que comprenda moléculas de ARNm con secuencias idénticas o casi idénticas. En algunas formas de realización, la proporción del número de secuencias de etiquetas moleculares diferentes y el número de aparición de cualquiera de los objetivos es al menos, o como máximo, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1,7:1,8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1,30:1,40:1,50:1, 60:1,70:1,80:1, 90:1 o 100:1.
[0149] Un marcador molecular puede ser, o ser aproximadamente, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, o un número o un rango entre dos de estos valores, nucleótidos de longitud. Una etiqueta molecular puede tener al menos, o como máximo, 1,2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 200 o 300 nucleótidos de longitud.
Región de unión al objetivo
[0150] Un código de barras puede comprender una o más regiones de unión al objetivo, como sondas de captura. En algunas formas de realización, una región de unión al objetivo puede hibridarse con un objetivo de interés. En algunas formas de realización, las regiones de unión al objetivo pueden comprender una secuencia de ácido nucleico que hibrida específicamente con una diana (p. ej., ácido nucleico diana, molécula diana, p. ej., un ácido nucleico celular a analizar), por ejemplo, con una secuencia génica específica. En algunas formas de realización, una región de unión al objetivo puede comprender una secuencia de ácido nucleico que se puede unir (p. ej., hibridar) a una ubicación específica de un ácido nucleico diana específico. En algunas formas de realización, la región de unión al objetivo puede comprender una secuencia de ácido nucleico que es capaz de una hibridación específica con un sitio de enzima de restricción que sobresale (p. ej., un extremo cohesivo de EcoRI). A continuación, el código de barras se puede ligar a cualquier molécula de ácido nucleico que comprenda una secuencia complementaria al saliente del sitio de restricción.
[0151] En algunas formas de realización, una región de unión al objetivo puede comprender una secuencia de ácido nucleico diana no específica. Una secuencia de ácido nucleico diana no específica puede referirse a una secuencia que puede unirse a múltiples ácidos nucleicos diana, independientemente de la secuencia específica del ácido nucleico diana. Por ejemplo, la región de unión al objetivo puede comprender una secuencia multimérica aleatoria o una secuencia oligo(dT) que se hibrida con la cola poli(A) en moléculas de ARNm. Una secuencia aleatoria de multímeros puede ser, por ejemplo, una secuencia aleatoria de dímero, trímero, cuátramero, pentámero, hexámero, septámero, octámero, nonámero, decámero o multímero superior de cualquier longitud. En algunas formas de realización, la región de unión del objetivo es la misma para todos los códigos de barras unidos a una perla determinada. En algunas formas de realización, las regiones de unión al objetivo para la pluralidad de códigos de barras unidos a una perla dada pueden comprender dos o más secuencias de unión al objetivo diferentes. Una región de unión al objetivo puede tener, o tener aproximadamente, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, o un número o un intervalo entre cualquiera de estos dos valores, de nucleótidos de longitud. Una región de unión al objetivo puede tener como máximo aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más nucleótidos de longitud.
[0152] En algunas formas de realización, una región de unión al objetivo puede comprender un oligo(dT) que puede hibridarse con ARNm que comprenden extremos poliadenilados. Una región de unión al objetivo puede ser específica de un gen. Por ejemplo, una región de unión al objetivo puede configurarse para hibridar con una región específica de un objetivo. Una región de unión al objetivo puede ser, o ser aproximadamente, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 2627, 28, 29, 30, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores, nucleótidos de longitud. Una región de unión al objetivo puede ser al menos, o como máximo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 2627, 28, 29 o 30 nucleótidos de longitud. Una región de unión al objetivo puede tener una longitud de aproximadamente 5-30 nucleótidos. Cuando un código de barras comprende una región de unión al objetivo específica de un gen, el código de barras puede denominarse en el presente documento código de barras específico de un gen.
Propiedad de orientación
[0153] Un código de barras estocástico (por ejemplo, un código de barras estocástico) puede comprender una o más propiedades de orientación que pueden usarse para orientar (por ejemplo, alinear) los códigos de barras. El código de barras puede comprender un resto para enfoque isoeléctrico. Diferentes códigos de barras pueden comprender diferentes puntos de enfoque isoeléctrico. Cuando estos códigos de barras se introducen en una muestra, la muestra puede someterse a enfoque isoeléctrico para orientar los códigos de barras de una manera conocida. De esta forma, la propiedad de orientación se puede utilizar para desarrollar un mapa conocido de códigos de barras en una muestra. Las propiedades de orientación ejemplares pueden incluir movilidad electroforética (p. ej., en base al tamaño del código de barras), punto isoeléctrico, espín, conductividad y/o autoensamblaje. Por ejemplo, los códigos de barras con una propiedad de orientación de autoensamblaje pueden autoensamblarse en una orientación específica (p. ej., nanoestructura de ácido nucleico) tras la activación.
Propiedad de afinidad
[0154] Un código de barras (por ejemplo, un código de barras estocástico) puede comprender una o más propiedades de afinidad. Por ejemplo, una etiqueta espacial puede comprender una propiedad de afinidad. Una propiedad de afinidad puede incluir un resto químico y/o biológico que puede facilitar la unión del código de barras a otra entidad (p. ej., receptor celular). Por ejemplo, una propiedad de afinidad puede comprender un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo específico para un resto específico (p. ej., receptor) en una muestra. En algunas formas de realización, el anticuerpo puede guiar el código de barras a un tipo de célula o molécula específica. Los objetivos en y/o cerca del tipo de célula o molécula específicos pueden marcarse (p. ej., marcarse estocásticamente). La propiedad de afinidad puede, en algunas formas de realización, proporcionar información espacial además de la secuencia de nucleótidos de la etiqueta espacial porque el anticuerpo puede guiar el código de barras a una ubicación específica. El anticuerpo puede ser un anticuerpo terapéutico, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal. El anticuerpo puede ser humanizado o quimérico. El anticuerpo puede ser un anticuerpo desnudo o un anticuerpo de fusión.
[0155] El anticuerpo puede ser una molécula de inmunoglobulina de longitud completa (es decir, de origen natural o formada por procesos de recombinación de fragmentos de genes de inmunoglobulina normales) (por ejemplo, un anticuerpo IgG) o una parte inmunológicamente activa (es decir, que se une específicamente) de una molécula de inmunoglobulina, como un fragmento de anticuerpo.
[0156] El fragmento de anticuerpo puede ser, por ejemplo, una parte de un anticuerpo tal como F(ab')2, Fab', Fab, Fv, sFv y similares. En algunas formas de realización, el fragmento de anticuerpo puede unirse con el mismo antígeno que reconoce el anticuerpo de longitud completa. El fragmento de anticuerpo puede incluir fragmentos aislados que constan de las regiones variables de los anticuerpos, como los fragmentos "Fv" que constan de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera y moléculas polipeptídicas de cadena sencilla recombinantes en las que las regiones variables ligeras y pesadas están conectadas por un conector peptídico ("proteínas scFv"). Los ejemplos de anticuerpos pueden incluir, entre otros, anticuerpos para células cancerosas, anticuerpos para virus, anticuerpos que se unen a receptores de la superficie celular (CD8, CD34, CD45) y anticuerpos terapéuticos.
Cebador adaptador universal
[0157] Un código de barras puede comprender uno o más cebadores adaptadores universales. Por ejemplo, un código de barras específico de un gen, tal como un código de barras estocástico específico de un gen, puede comprender un cebador adaptador universal. Un cebador de adaptador universal puede hacer referencia a una secuencia de nucleótidos que es universal en todos los códigos de barras. Se puede utilizar un cebador de adaptador universal para crear códigos de barras específicos de genes. Un cebador de adaptador universal puede ser, o ser aproximadamente, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 2627, 28, 29, 30, o un número o un intervalo de longitud entre cualquiera de estos dos nucleótidos. Un cebador adaptador universal puede ser como mínimo, o como máximo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 2627, 28, 29 o 30 nucleótidos de longitud. Un cebador adaptador universal puede tener una longitud de 5 a 30 nucleótidos.
Enlazador
[0158] Cuando un código de barras comprende más de un tipo de etiqueta (p. ej., más de una etiqueta celular o más de una secuencia de código de barras, como una etiqueta molecular), las etiquetas pueden intercalarse con una secuencia de etiqueta enlazadora. Una secuencia marcadora enlazadora puede tener al menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más nucleótidos de longitud. Una secuencia marcadora enlazadora puede tener como máximo aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más nucleótidos de longitud. En algunos casos, una secuencia marcadora enlazadora tiene una longitud de 12 nucleótidos. Se puede utilizar una secuencia de etiquetas enlazadoras para facilitar la síntesis del código de barras. La etiqueta del enlazador puede comprender un código de corrección de errores (por ejemplo, Hamming).
Soportes sólidos
[0159] Los códigos de barras, como los códigos de barras estocásticos, descritos en el presente documento pueden, en algunas formas de realización, estar asociados con un soporte sólido. El soporte sólido puede ser, por ejemplo, una partícula sintética. En algunas formas de realización, algunas o todas las secuencias de códigos de barras, tales como etiquetas moleculares para códigos de barras estocásticos (p. ej., las primeras secuencias de códigos de barras) de una pluralidad de códigos de barras (p. ej., la primera pluralidad de códigos de barras) en un soporte sólido difieren en al menos un nucleótido Las etiquetas de las células de los códigos de barras sobre un mismo soporte sólido pueden ser las mismas. Las etiquetas de las células de los códigos de barras en diferentes soportes sólidos pueden diferir en al menos un nucleótido. Por ejemplo, las primeras etiquetas de célula de una primera pluralidad de códigos de barras sobre un primer soporte sólido pueden tener la misma secuencia, y las segundas etiquetas de célula de una segunda pluralidad de códigos de barras sobre un segundo soporte sólido pueden tener la misma secuencia. Las primeras etiquetas de célula de la primera pluralidad de códigos de barras en el primer soporte sólido y las segundas etiquetas de célula de la segunda pluralidad de códigos de barras en el segundo soporte sólido pueden diferir en al menos un nucleótido. Un marcador celular puede tener, por ejemplo, una longitud de aproximadamente 5-20 nucleótidos. Una secuencia de código de barras puede ser, por ejemplo, alrededor de 5-20 nucleósotidas de largo. La partícula sintética puede ser, por ejemplo, una perla.
[0160] La perla puede ser, por ejemplo, una perla de gel de sílice, una perla de vidrio de poro controlado, una perla magnética, una Dynabead, una perla de Sephadex/Sepharose, una perla de celulosa, una perla de poliestireno o cualquier combinación de las mismas. La perla puede comprender un material como polidimetilsiloxano (PDMS), poliestireno, vidrio, polipropileno, agarosa, gelatina, hidrogel, paramagnético, cerámico, plástico, vidrio, metilestireno, polímero acrílico, titanio, látex, sefarosa, celulosa, nailon, silicona, o cualquier combinación de los mismos.
[0161] En algunas formas de realización, la perla puede ser una perla polimérica, por ejemplo, una perla deformable o una perla de gel, funcionalizada con códigos de barras o códigos de barras estocásticos (como perlas de gel de 10X Genomics (San Francisco, CA). En alguna implementación, una perla de gel puede comprender geles basados en polímeros. Las perlas de gel se pueden generar, por ejemplo, encapsulando uno o más precursores poliméricos en gotitas. Tras la exposición de los precursores poliméricos a un acelerador (p. ej., tetrametiletilendiamina (TEMED)), una perla de gel puede generarse.
[0162] En algunas formas de realización, la partícula puede ser degradable. Por ejemplo, la perla polimérica puede disolverse, fundirse o degradarse, por ejemplo, en una condición deseada. La condición deseada puede incluir una condición ambiental. La condición deseada condición puede resultar en que la perla polimérica se disuelva, derrita o degrade de manera controlada. Una perla de gel puede disolverse, derretirse o degradarse debido a un estímulo químico, un estímulo físico, un estímulo biológico, un estímulo térmico, un estímulo magnético, un estímulo eléctrico, un estímulo de luz, o cualquier combinación de los mismos.
[0163] Los analitos y/o reactivos, como códigos de barras de oligonucleótidos, por ejemplo, pueden acoplarse/inmovilizarse a la superficie interior de una perla de gel (p. ej., el interior accesible a través de la difusión de un código de barras de oligonucleótidos y/o materiales utilizados para generar un código de barras de oligonucleótidos) y/o la superficie exterior de una perla de gel o cualquier otra microcápsula descrita en este documento. El acoplamiento/inmovilización puede ser a través de cualquier forma de enlace químico (p. ej., enlace covalente, enlace iónico) o fenómenos físicos (p. ej., fuerzas de Van der Waals, interacciones dipolo-dipolo, etc.). En algunas formas de realización, el acoplamiento/inmovilización de un reactivo a una perla de gel o cualquier otra microcápsula descrita en este documento puede ser reversible, como, por ejemplo, a través de un resto lábil (p. ej., a través de un reticulante químico, incluidos los reticulantes químicos descritos en este documento). Tras la aplicación de un estímulo, el resto lábil puede escindirse y el reactivo inmovilizado puede liberarse. En algunas formas de realización, el resto lábil es un enlace disulfuro. Por ejemplo, en el caso de que un código de barras de oligonucleótido se inmovilice en una perla de gel a través de un enlace disulfuro, la exposición del enlace disulfuro a un agente reductor puede romper el enlace disulfuro y liberar el código de barras del oligonucleótido de la perla. El resto lábil puede incluirse como parte de una perla de gel o microcápsula, como parte de un enlazador químico que une un reactivo o analito a una perla de gel o microcápsula y/o como parte de un reactivo o analito. En algunas formas de realización, al menos un código de barras de la pluralidad de códigos de barras puede inmovilizarse en la partícula, inmovilizarse parcialmente en la partícula, encerrarse en la partícula, encerrarse parcialmente en la partícula o cualquier combinación de los mismos.
[0164] En algunas formas de realización, una perla de gel puede comprender una amplia gama de diferentes polímeros que incluyen, entre otros: polímeros, polímeros sensibles al calor, polímeros fotosensibles, polímeros magnéticos, polímeros sensibles al pH, polímeros sensibles a la sal, polímeros químicamente sensibles, polielectrolitos, polisacáridos, péptidos, proteínas y/o plásticos. Los polímeros pueden incluir, entre otros, materiales como poli(N-isopropilacrilamida) (PNIPAAm), poli(sulfonato de estireno) (PSS), poli(alilamina) (PAAm), ácido poli(acrílico) (PAA), poli(etilenimina) (PEI), poli(cloruro de dialildimetilamonio) (PDa Dm a C), poli(pirola) (PPy), poli(vinilpirrolidona) (pVPo N), poli(vinilpiridina) (PVP), ácido poli(metacrílico) (PMAA), poli(metacrilato de metilo) (PMMA), poliestireno (PS), poli(tetrahidrofurano) (PTHF), poli(ftaladehído) (PTHf ), poli(hexilviológeno) (PHV), poli(Llisina) (p Ll ), poli(L-arginina) (PARG), ácido poli(lácticocoglicólico) (PLGA).
[0165] Se pueden usar numerosos estímulos químicos para desencadenar la rotura, disolución o degradación de las perlas. Los ejemplos de estos cambios químicos pueden incluir, entre otros, cambios mediados por el pH en la pared de la perla, desintegración de la pared de la perla a través de la escisión química de los enlaces de reticulación, despolimerización desencadenada de la pared de la perla y reacciones de cambio de pared de la perla. También se pueden usar cambios de volumen para desencadenar la interrupción de las perlas.
[0166] Los cambios físicos o de volumen en la microcápsula a través de varios estímulos también ofrecen muchas ventajas en el diseño de cápsulas para liberar reactivos. Los cambios físicos o masivos ocurren en una escala macroscópica, en la que la ruptura de las perlas es el resultado de fuerzas mecanofísicas inducidas por un estímulo. Estos procesos pueden incluir, entre otros, ruptura inducida por presión, fusión de la pared del cordón o cambios en la porosidad de la pared del cordón.
[0167] También se pueden usar estímulos biológicos para desencadenar la alteración, disolución o degradación de las perlas. En general, los desencadenantes biológicos se parecen a los desencadenantes químicos, pero muchos ejemplos utilizan biomoléculas o moléculas que se encuentran comúnmente en los sistemas vivos, como enzimas, péptidos, sacáridos, ácidos grasos, ácidos nucleicos y similares. Por ejemplo, las perlas pueden comprender polímeros con enlaces cruzados de péptidos que son sensibles a la escisión por proteasas específicas. Más específicamente, un ejemplo puede comprender una microcápsula que comprende enlaces cruzados de péptido GFLGK. Tras la adición de un activador biológico como la proteasa catepsina B, los enlaces cruzados peptídicos de la cubierta se escinden y se libera el contenido de las perlas. En otros casos, las proteasas pueden activarse por calor. En otro ejemplo, las perlas comprenden una pared de cubierta que comprende celulosa. La adición de la enzima hidrolítica quitosano sirve como desencadenante biológico para la escisión de los enlaces celulósicos, la despolimerización de la pared de la cubierta y la liberación de sus contenidos interiores.
[0168] También se puede inducir a las perlas a que liberen su contenido tras la aplicación de un estímulo térmico. Un cambio de temperatura puede causar una variedad de cambios en las cuentas. Un cambio en el calor puede provocar la fusión de una perla de tal manera que la pared de la perla se desintegre. En otros casos, el calor puede aumentar la presión interna de los componentes internos de la perla de manera que la perla se rompa o explote. En otros casos, el calor puede transformar la perla en un estado deshidratado y encogido. El calor también puede actuar sobre polímeros sensibles al calor dentro de la pared de una perla para provocar la ruptura de la perla.
[0169] La inclusión de nanopartículas magnéticas en la pared de la perla de las microcápsulas puede permitir la ruptura desencadenada de las perlas, así como guiar las perlas en una matriz. Un dispositivo de esta divulgación puede comprender perlas magnéticas para cualquier propósito. En un ejemplo, la incorporación de nanopartículas de Fe3Ü4 en perlas que contienen polielectrolitos desencadena la ruptura en presencia de un estímulo de campo magnético oscilante.
[0170] Una perla también puede romperse, disolverse o degradarse como resultado de la estimulación eléctrica. De manera similar a las partículas magnéticas descritas en la sección anterior, las perlas eléctricamente sensibles pueden permitir tanto la ruptura desencadenada de las perlas como otras funciones, como la alineación en un campo eléctrico, la conductividad eléctrica o las reacciones redox. En un ejemplo, las perlas que contienen material eléctricamente sensible se alinean en un campo eléctrico de manera que se puede controlar la liberación de los reactivos internos. En otros ejemplos, los campos eléctricos pueden inducir reacciones redox dentro de la propia pared de la perla que pueden aumentar la porosidad.
[0171] También se puede usar un estímulo de luz para romper las perlas. Numerosos activadores de luz son posibles y pueden incluir sistemas que usan varias moléculas, como nanopartículas y cromóforos, capaces de absorber fotones de rangos específicos de longitudes de onda. Por ejemplo, los recubrimientos de óxido de metal se pueden usar como disparadores de cápsulas. La irradiación UV de las cápsulas de polielectrolito recubiertas con SiÜ2 puede provocar la desintegración de la pared de la perla. En otro ejemplo más, pueden incorporarse en la pared de la perla materiales fotoconmutables tales como grupos azobenceno. Tras la aplicación de luz UV o visible, los productos químicos como estos experimentan una isomerización reversible de cis a trans tras la absorción de fotones. En este aspecto, la incorporación de interruptores de fotones da como resultado una pared de perlas que puede desintegrarse o volverse más porosa con la aplicación de un disparador de luz.
[0172] Por ejemplo, en un ejemplo no limitativo de código de barras (p. ej., código de barras estocástico) ilustrado en la FIG. 2, después de introducir células tales como células individuales en una pluralidad de micropocillos de una matriz de micropocillos en el bloque 208, se pueden introducir perlas en la pluralidad de micropocillos de la matriz de micropocillos en el bloque 212. Cada micropocillo puede comprender una perla. Las perlas pueden comprender una pluralidad de códigos de barras. Un código de barras puede comprender una región de amina 5' unida a una perla. El código de barras puede comprender una etiqueta universal, una secuencia de código de barras (p. ej., una etiqueta molecular), una región de unión al objetivo o cualquier combinación de los mismos.
[0173] Los códigos de barras descritos en el presente documento se pueden asociar con (p. ej., unir a) un soporte sólido (p. ej., una perla). Los códigos de barras asociados con un soporte sólido pueden comprender cada uno una secuencia de códigos de barras seleccionada de un grupo que comprende al menos 100 o 1000 secuencias de códigos de barras con secuencias únicas. En algunas formas de realización, diferentes códigos de barras asociados con un soporte sólido pueden comprender códigos de barras con diferentes secuencias. En algunas formas de realización, un porcentaje de códigos de barras asociados con un soporte sólido comprende la misma etiqueta de célula. Por ejemplo, el porcentaje puede ser, o estar alrededor del 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 99 %, 100 %, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores. Como otro ejemplo, el porcentaje puede ser como mínimo o como máximo 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 99 % o 100 %. En algunas formas de realización, los códigos de barras asociados con un soporte sólido pueden tener la misma etiqueta de célula. Los códigos de barras asociados con diferentes soportes sólidos pueden tener diferentes etiquetas de células seleccionadas de un grupo que comprende al menos 100 o 1000 etiquetas de células con secuencias únicas.
[0174] Los códigos de barras descritos en el presente documento se pueden asociar a (p. ej., unir a) un soporte sólido (p. ej., una perla). En algunas formas de realización, la codificación de barras de la pluralidad de objetivos en la muestra se puede realizar con un soporte sólido que incluye una pluralidad de partículas sintéticas asociadas con la pluralidad de códigos de barras. En algunas formas de realización, el soporte sólido puede incluir una pluralidad de partículas sintéticas asociadas con la pluralidad de códigos de barras. Las etiquetas espaciales de la pluralidad de códigos de barras sobre diferentes soportes sólidos pueden diferir en al menos un nucleótido. El soporte sólido puede, por ejemplo, incluir la pluralidad de códigos de barras en dos dimensiones o en tres dimensiones. Las partículas sintéticas pueden ser perlas. Las perlas pueden ser perlas de gel de sílice, perlas de vidrio de poro controlado, perlas magnéticas, Dynabeads, perlas de Sephadex/Sepharose, perlas de celulosa, perlas de poliestireno o cualquier combinación de las mismas. El soporte sólido puede incluir un polímero, una matriz, un hidrogel, un dispositivo de matriz de agujas, un anticuerpo o cualquier combinación de los mismos. En algunas formas de realización, los soportes sólidos pueden flotar libremente. En algunas formas de realización, los soportes sólidos se pueden incrustar en una matriz semisólida o sólida. Los códigos de barras no pueden estar asociados a soportes sólidos. Los códigos de barras pueden ser nucleótidos individuales. Los códigos de barras se pueden asociar con un sustrato.
[0175] Como se usa en este documento, los términos "atado", "unido" e "inmovilizado" se usan indistintamente y pueden referirse a medios covalentes o no covalentes para unir códigos de barras a un soporte sólido. Cualquiera de una variedad de diferentes soportes sólidos se puede utilizar como soporte sólido para adjuntar códigos de barras presintetizados o para la síntesis de código de barras en fase sólida in situ.
[0176] En algunas formas de realización, el soporte sólido es una perla. La perla puede comprender uno o más tipos de esfera sólida, porosa o hueca, bola, cojinete, cilindro u otra configuración similar en la que se puede inmovilizar un ácido nucleico (p. ej., de forma covalente o no covalente). La perla puede estar compuesta, por ejemplo, de plástico, cerámica, metal, material polimérico o cualquier combinación de los mismos. Una perla puede ser, o comprender, una partícula discreta que es esférica (por ejemplo, microesferas) o que tiene una forma no esférica o irregular, como cúbica, cuboide, piramidales, cilíndricas, cónicas, oblongas o en forma de disco, y similares. En algunas formas de realización, una perla puede tener una forma no esférica.
[0177] Las perlas pueden comprender una variedad de materiales que incluyen, entre otros, materiales paramagnéticos (p. ej., magnesio, molibdeno, litio y tántalo), materiales superparamagnéticos (p. ej., nanopartículas de ferrita (Fe3O4; magnetita), materiales ferromagnéticos (p. ej.,, hierro, níquel, cobalto, algunas de sus aleaciones y algunos compuestos de metales de tierras raras), cerámica, plástico, vidrio, poliestireno, sílice, metilestireno, polímeros acrílicos, titanio, látex, sefarosa, agarosa, hidrogel, polímero, celulosa, nailon, o cualquier combinación de los mismos.
[0178] En algunas formas de realización, la perla (p. ej., la perla a la que se unen las etiquetas) es una perla de hidrogel. En algunas formas de realización, la perla comprende hidrogel.
[0179] Algunas formas de realización descritas en este documento incluyen una o más partículas (por ejemplo, perlas). Cada una de las partículas puede comprender una pluralidad de oligonucleótidos (p. ej., códigos de barras). Cada uno de la pluralidad de oligonucleótidos puede comprender una secuencia de código de barras (p. ej., una secuencia de marca molecular), una marca celular y una región de unión al objetivo (p. ej., una secuencia de oligo(dT), una secuencia específica de gen, un multímero aleatorio, o una combinación de los mismos). La secuencia del marcador celular de cada uno de la pluralidad de oligonucleótidos puede ser la misma. Las secuencias de etiquetas de células de oligonucleótidos en diferentes partículas pueden ser diferentes de modo que se puedan identificar los oligonucleótidos en diferentes partículas. El número de secuencias de etiquetas de células diferentes puede ser diferente en diferentes implementaciones. En algunas formas de realización, el número de secuencias de etiquetas celulares puede ser, o ser aproximadamente 10, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 106, 107, 108, 109, un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores, o más. En algunas formas de realización, el número de secuencias de etiquetas celulares puede ser al menos, o como máximo 10, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 106, 107, 108 o 109. En algunas formas de realización, no más de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 más de la pluralidad de partículas incluyen oligonucleótidos con la misma secuencia celular. En alguna forma de realización, la pluralidad de partículas que incluyen oligonucleótidos con la misma secuencia celular puede ser como máximo 0,1 %, 0,2 %, 0,3 %, 0,4 %, 0,5 %, 0,6 %, 0,7 %, 0,8 %, 0,9 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 % o más. En algunas formas de realización, ninguna de la pluralidad de partículas tiene la misma secuencia de marcador celular.
[0180] La pluralidad de oligonucleótidos en cada partícula puede comprender diferentes secuencias de código de barras (por ejemplo, etiquetas moleculares). En algunas formas de realización, el número de secuencias de código de barras puede ser, o ser aproximadamente 10, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 106, 107, 108, 109, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, el número de secuencias de código de barras puede ser al menos o como máximo 10, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 106, 107, 108 o 109. Por ejemplo, al menos 100 de la pluralidad de diferentes secuencias de oligonucleótidos de código de barras. Como otro ejemplo, en una sola partícula, al menos 100, 500, 1000, 5000, 10000, 15000, 20000, 50000, un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores, o más de la pluralidad de oligonucleótidos comprenden diferentes secuencias de código de barras. Algunas formas de realización proporcionan una pluralidad de partículas que comprenden códigos de barras. En algunas formas de realización, la proporción de una ocurrencia (o una copia o un número) de un objetivo a etiquetar y las diferentes secuencias de código de barras puede ser al menos 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90 o más. En algunas formas de realización, cada uno de la pluralidad de oligonucleótidos comprende además un marcador de muestra, un marcador universal o ambos. La partícula puede ser, por ejemplo, una nanopartícula o una micropartícula.
[0181] El tamaño de las perlas puede variar. Por ejemplo, el diámetro de la perla puede oscilar entre 0,1 micrómetros y 50 micrómetros. En algunas formas de realización, el diámetro de la perla puede ser, o ser aproximadamente, 0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 micrómetros, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores.
[0182] El diámetro de la perla se puede relacionar con el diámetro de los pocillos del sustrato. En algunas formas de realización, el diámetro de la perla puede ser, o ser aproximadamente, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores, más largo o más corto que el diámetro del pocillo. El diámetro de las perlas se puede relacionar con el diámetro de una célula (p. ej., una única célula atrapada en un pocillo del sustrato). En algunas formas de realización, el diámetro del cordón puede ser al menos, o como máximo, un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 % más largo. o menor que el diámetro del pocillo. El diámetro de las perlas se puede relacionar con el diámetro de una célula (p. ej., una única célula atrapada en un pocillo del sustrato). En algunas formas de realización, el diámetro de la perla puede ser, o ser aproximadamente, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 150 %, 200 %, 250 %, 300 %, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores, más largo o más corto que el diámetro de la célula. En algunas formas de realización, el diámetro de las perlas puede ser al menos, o como máximo, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 150 %, 200 %, 250 % o 300 % más largo o más corto que el diámetro de la célula.
[0183] Una perla se puede unir y/o incrustar en un sustrato. Una perla se puede unir y/o incrustar en un gel, hidrogel, polímero y/o matriz. La posición espacial de una perla dentro de un sustrato (p. ej., gel, matriz, armazón o polímero) puede identificarse mediante la etiqueta espacial presente en el código de barras de la perla que puede servir como una dirección de ubicación.
[0184] Los ejemplos de perlas pueden incluir, entre otros, perlas de estreptavidina, perlas de agarosa, perlas magnéticas, Dynabeads®, microperlas MACS®, perlas conjugadas con anticuerpos (p. ej., microperlas antiinmunoglobulina), perlas conjugadas con proteína A, proteína G perlas conjugadas, perlas conjugadas de proteína NG, perlas conjugadas de proteína L, perlas conjugadas de oligo(dT), perlas de sílice, perlas similares a la sílice, microperlas antibiotina, microperlas antifluorocromo y perlas magnéticas terminadas en carboxilo BcMag™.
[0185] Una perla se puede asociar (p. ej., impregnar con) puntos cuánticos o colorantes fluorescentes para hacerla fluorescente en un canal óptico de fluorescencia o múltiples canales ópticos. Una perla se puede asociar con óxido de hierro u óxido de cromo para hacerla paramagnética o ferromagnética. Las cuentas pueden ser identificables. Por ejemplo, se puede obtener una imagen de una cuenta usando una cámara. Una perla puede tener un código detectable asociado con la perla. Por ejemplo, una cuenta puede comprender un código de barras. Una perla puede cambiar de tamaño, por ejemplo, debido al hinchamiento en una solución orgánica o inorgánica. Una perla puede ser hidrófoba. Una perla puede ser hidrófila. Una perla puede ser biocompatible.
[0186] Se puede visualizar un soporte sólido (p. ej., una perla). El soporte sólido puede comprender una etiqueta de visualización (p. ej., un tinte fluorescente). Un soporte sólido (p. ej., una perla) se puede grabar con un identificador (p. ej., un número). El identificador se puede visualizar a través de imágenes de las perlas.
[0187] Un soporte sólido puede comprender un material insoluble, semisoluble o insoluble. Se puede hacer referencia a un soporte sólido como ''funcionalizado'' cuando incluye un enlazador, un andamio, un bloque de construcción u otro resto reactivo unido al mismo, mientras que un soporte sólido puede estar "no funcionalizado" cuando carece de dicho resto reactivo unido al mismo. El soporte sólido puede emplearse libre en solución, como en un formato de pocillo de microtitulación; en un formato continuo, como en una columna; o en una varilla.
[0188] El soporte sólido puede comprender una membrana, papel, plástico, superficie recubierta, superficie plana, vidrio, portaobjetos, chip o cualquier combinación de los mismos. Un soporte sólido puede tomar la forma de resinas, geles, microesferas u otras configuraciones geométricas. Un soporte sólido puede comprender chips de sílice, micropartículas, nanopartículas, placas, matrices, capilares, soportes planos como filtros de fibra de vidrio, superficies de vidrio, superficies metálicas (acero, oro, plata, aluminio, silicio y cobre), soportes de vidrio, soportes de plástico, soportes de silicona, chips, filtros, membranas, placas de micropocillos, portaobjetos, materiales plásticos, incluidas placas o membranas de pocillos múltiples (p. ej., formadas de polietileno, polipropileno, poliamida, difluoruro de polivinilideno) y/u obleas, peines, alfileres o agujas (p. ej., matrices de clavijas adecuadas para síntesis o análisis combinatorios) o perlas en una serie de hoyos o pocillos de nanolitros de superficies planas tales como obleas (p. ej., obleas de silicio), obleas con hoyos con o sin fondo de filtro.
[0189] El soporte sólido puede comprender una matriz de polímero (por ejemplo, gel, hidrogel). La matriz de polímero puede penetrar en el espacio intracelular (p. ej., alrededor de los orgánulos). La matriz polimérica puede bombearse por todo el sistema circulatorio.
Sustratos y matriz de micropocillos
[0190] Como se usa en este documento, un sustrato puede referirse a un tipo de soporte sólido. Un sustrato puede referirse a un soporte sólido que puede comprender códigos de barras o códigos de barras estocásticos de la divulgación. Un sustrato puede, por ejemplo, comprender una pluralidad de micropocillos. Por ejemplo, un sustrato puede ser una matriz de pocillos que comprende dos o más micropocillos. En algunas formas de realización, un micropocillo puede comprender una pequeña cámara de reacción de volumen definido. En algunas formas de realización, un micropocillo puede atrapar una o más células. En algunas formas de realización, un micropocillo puede atrapar solo una célula. En algunas formas de realización, un micropocillo puede atrapar uno o más soportes sólidos. En algunas formas de realización, un micropocillo puede atrapar solo un soporte sólido. En algunas formas de realización, un micropocillo atrapa una única célula y un único soporte sólido (p. ej., una perla). Un micropocillo puede comprender reactivos de código de barras de la divulgación.
Métodos de codificación de barras
[0191] La descripción proporciona métodos para estimar el número de objetivos distintos en ubicaciones distintas en una muestra física (p. ej., tejido, órgano, tumor, célula). Los métodos pueden comprender colocar códigos de barras (por ejemplo, códigos de barras estocásticos) muy cerca de la muestra, lisar la muestra, asociar distintos objetivos con los códigos de barras, amplificar los objetivos y/o contar digitalmente los objetivos. El método puede comprender además analizar y/o visualizar la información obtenida de las etiquetas espaciales en los códigos de barras. En algunas formas de realización, un método comprende visualizar la pluralidad de objetivos en la muestra. Mapear la pluralidad de objetivos sobre el mapa de la muestra puede incluir generar un mapa bidimensional o un mapa tridimensional de la muestra. El mapa bidimensional y el mapa tridimensional pueden generarse antes o después de codificar con barras (por ejemplo, codificar con barras estocásticamente) la pluralidad de objetivos en la muestra. La visualización de la pluralidad de objetivos en la muestra puede incluir mapear la pluralidad de objetivos en un mapa de la muestra. Mapear la pluralidad de objetivos sobre el mapa de la muestra puede incluir generar un mapa bidimensional o un mapa tridimensional de la muestra. El mapa bidimensional y el mapa tridimensional pueden generarse antes o después de codificar con barras la pluralidad de objetivos en la muestra. En algunas formas de realización, el mapa bidimensional y el mapa tridimensional pueden generarse antes o después de lisar la muestra. El lisado de la muestra antes o después de generar el mapa bidimensional o el mapa tridimensional puede incluir calentar la muestra, poner la muestra en contacto con un detergente, cambiar el pH de la muestra o cualquier combinación de los mismos.
[0192] En algunas formas de realización, el código de barras de la pluralidad de objetivos comprende hibridar una pluralidad de códigos de barras con una pluralidad de objetivos para crear objetivos con códigos de barras (por ejemplo, objetivos con códigos de barras estocásticos). Codificar con barras la pluralidad de objetivos puede comprender generar una biblioteca indexada de los objetivos con código de barras. La generación de una biblioteca indexada de los objetivos con código de barras se puede realizar con un soporte sólido que comprenda la pluralidad de códigos de barras (por ejemplo, códigos de barras estocásticos).
Poner en contacto una muestra y un código de barras
[0193] La divulgación proporciona métodos para poner en contacto una muestra (p. ej., células) con un sustrato de la divulgación. Una muestra que comprende, por ejemplo, una sección delgada de célula, órgano o tejido puede ponerse en contacto con códigos de barras (por ejemplo, códigos de barras estocásticos). Las células pueden ponerse en contacto, por ejemplo, mediante flujo por gravedad, en el que las células pueden asentarse y crear una monocapa. La muestra puede ser una sección delgada de tejido. La sección delgada se puede colocar sobre el sustrato. La muestra puede ser unidimensional (por ejemplo, forma una superficie plana). La muestra (p. ej., células) se puede esparcir por el sustrato, por ejemplo, haciendo crecer/cultivar las células sobre el sustrato.
[0194] Cuando los códigos de barras están muy cerca de los objetivos, los objetivos pueden hibridarse con el código de barras. Los códigos de barras se pueden contactar en una proporción no agotable de modo que cada objetivo distinto se pueda asociar con un código de barras distinto de la divulgación. Para asegurar una asociación eficiente entre el objetivo y el código de barras, los objetivos se pueden entrecruzar con el código de barras.
Lisis celular
[0195] Después de la distribución de células y códigos de barras, las células pueden lisarse para liberar las moléculas objetivo. La lisis celular se puede lograr por cualquiera de una variedad de medios, por ejemplo, por medios químicos o bioquímicos, por choque osmótico o por medio de lisis térmica, lisis mecánica o lisis óptica. Las células se pueden lisar mediante la adición de un tampón de lisis celular que comprende un detergente (p. ej., SDS, sulfato de dodecil Li, Triton X-100, Tween-20 o NP-40), un disolvente orgánico (p. ej., metanol o acetona) o enzimas digestivas (p. ej., proteinasa K, pepsina o tripsina), o cualquier combinación de las mismas. Para aumentar la asociación de un objetivo y un código de barras, la tasa de difusión de las moléculas objetivo puede alterarse, por ejemplo, reduciendo la temperatura y/o aumentando la viscosidad del lisado.
[0196] En algunas formas de realización, la muestra se puede lisar utilizando un papel de filtro. El papel de filtro se puede empapar con un tampón de lisis encima del papel de filtro. El papel de filtro se puede aplicar a la muestra con presión, lo que puede facilitar la lisis de la muestra y la hibridación de las dianas de la muestra con el sustrato.
[0197] En algunas formas de realización, la lisis se puede realizar mediante lisis mecánica, lisis por calor, lisis óptica y/o lisis química. La lisis química puede incluir el uso de enzimas digestivas como proteinasa K, pepsina y tripsina. La lisis se puede realizar mediante la adición de un tampón de lisis al sustrato. Un tampón de lisis puede comprender Tris HCl. Un tampón de lisis puede comprender al menos aproximadamente 0,01,0,05, 0,1, 0,5 o 1 M o más de Tris HCl. Un tampón de lisis puede comprender como máximo aproximadamente 0,01,0,05, 0,1,0,5 o 1 M o más de Tris HCL. Un tampón de lisis puede comprender Tris HCl aproximadamente 0,1 M. El pH del tampón de lisis puede ser al menos aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más. El pH del tampón de lisis puede ser como máximo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más. En algunas formas de realización, el pH del tampón de lisis es de aproximadamente 7,5. El tampón de lisis puede comprender una sal (p. ej., LiCl). La concentración de sal en el tampón de lisis puede ser al menos aproximadamente 0,1, 0,5 o 1 M o más. La concentración de sal en el tampón de lisis puede ser como máximo aproximadamente 0,1, 0,5 o 1 M o más. En algunas formas de realización, la concentración de sal en el tampón de lisis es de aproximadamente 0,5 M. El tampón de lisis puede comprender un detergente (p. ej., SDS, sulfato de dodecil Li, triton X, tween, NP-40). La concentración del detergente en el tampón de lisis puede ser de al menos aproximadamente 0,0001 %, 0,0005 %, 0,001 %, 0,005 %, 0,01 %, 0,05 %, 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 % o 7 %, o más. La concentración del detergente en el tampón de lisis puede ser como máximo del 0,0001 %, 0,0005 %, 0,001 %, 0,005 %, 0,01 %, 0,05 %, 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 % o 7 %, o más. En algunas formas de realización, la concentración del detergente en el tampón de lisis es de aproximadamente 1 % de sulfato de dodecil Li. El tiempo utilizado en el método de lisis puede depender de la cantidad de detergente utilizada. En algunas formas de realización, cuanto más detergente se usa, menos tiempo se necesita para la lisis. El tampón de lisis puede comprender un agente quelante (p. ej., EDTA, EGTA). La concentración de un agente quelante en el tampón de lisis puede ser de al menos aproximadamente 1, 5, 10, 15, 20, 25 o 30 mM o más. La concentración de un agente quelante en el tampón de lisis puede ser como máximo aproximadamente 1, 5, 10, 15, 20, 25 o 30 mM o más. En algunas formas de realización, la concentración de agente quelante en el tampón de lisis es de aproximadamente 10 mM. El tampón de lisis puede comprender un reactivo reductor (p. ej., beta-mercaptoetanol, DTT). La concentración del reactivo reductor en el tampón de lisis puede ser al menos aproximadamente 1, 5, 10, 15 o 20 mM o más. La concentración del reactivo reductor en el tampón de lisis puede ser como máximo aproximadamente 1,5, 10, 15 o 20 mM o más. En algunas formas de realización, la concentración de reactivo reductor en el tampón de lisis es de aproximadamente 5 mM. En algunas formas de realización, un tampón de lisis puede comprender TrisHCl aproximadamente 0,1 M, pH aproximadamente 7,5, LiCl aproximadamente 0,5 M, dodecilsulfato de litio aproximadamente al 1 %, EDTA aproximadamente 10 mM y DTT aproximadamente 5 mM.
[0198] La lisis se puede realizar a una temperatura de aproximadamente 4, 10, 15, 20, 25 o 30 °C. La lisis se puede realizar durante aproximadamente 1, 5, 10, 15 o 20 o más minutos. Una célula lisada puede comprender al menos aproximadamente 100000, 200000, 300000, 400000, 500000, 600000 o 700000 o más moléculas de ácido nucleico diana. Una célula lisada puede comprender como máximo aproximadamente 100000, 200000, 300000, 400000, 500000, 600000 o 700000 o más moléculas de ácido nucleico diana.
Unión de códigos de barras a moléculas de ácido nucleico diana
[0199] Después de la lisis de las células y la liberación de moléculas de ácido nucleico de las mismas, las moléculas de ácido nucleico pueden asociarse al azar con el códigos de barras del soporte sólido co-localizado. La asociación puede comprender la hibridación de la región de reconocimiento de diana de un código de barras con una parte complementaria de la molécula de ácido nucleico diana (p. ej., el oligo(dT) del código de barras puede interactuar con una cola poli(A) de una diana). Las condiciones de ensayo utilizadas para la hibridación (p. ej., pH del tampón, fuerza iónica, temperatura, etc.) pueden elegirse para promover la formación de híbridos específicos y estables. En algunas formas de realización, las moléculas de ácido nucleico liberadas de las células lisadas pueden asociarse con la pluralidad de sondas en el sustrato (p. ej., hibridarse con las sondas en el sustrato). Cuando las sondas comprenden oligo(dT), las moléculas de ARNm pueden hibridarse con las sondas y transcribirse de forma inversa. La parte de oligo(dT) del oligonucleótido puede actuar como cebador para la síntesis de la primera cadena de la molécula de ADNc. Por ejemplo, en un ejemplo no limitativo de código de barras ilustrado en la FIG. 2, en el bloque 216, las moléculas de ARNm pueden hibridar con códigos de barras en perlas. Por ejemplo, los fragmentos de nucleótidos monocatenarios pueden hibridarse con las regiones de unión al objetivo de los códigos de barras.
[0200] La unión puede comprender además la unión de la región de reconocimiento objetivo de un código de barras y una parte de la molécula de ácido nucleico objetivo. Por ejemplo, la región de unión al objetivo puede comprender una secuencia de ácido nucleico que puede ser capaz de una hibridación específica con un saliente del sitio de restricción (p. ej., un saliente del extremo pegajoso de EcoRI). El procedimiento de ensayo puede comprender además el tratamiento de los ácidos nucleicos diana con una enzima de restricción (p. ej., EcoRI) para crear un sitio de restricción sobresaliente. A continuación, el código de barras puede ligarse a cualquier molécula de ácido nucleico que comprenda una secuencia complementaria al saliente del sitio de restricción. Puede usarse una ligasa (p. ej., ADN ligasa T4) para unir los dos fragmentos.
[0201] Por ejemplo, en un ejemplo no limitativo de código de barras ilustrado en la FIG. 2, en el bloque 220, las dianas marcadas de una pluralidad de células (o una pluralidad de muestras) (por ejemplo, moléculas de código de barras diana) pueden agruparse posteriormente, por ejemplo, en un tubo. Los objetivos etiquetados se pueden agrupar, por ejemplo, recuperando los códigos de barras y/o las perlas a las que se unen las moléculas de código de barras objetivo.
[0202] La recuperación de colecciones basadas en soporte sólido de moléculas de código de barras diana unidas puede implementarse mediante el uso de perlas magnéticas y un campo magnético aplicado externamente. Una vez que se han agrupado las moléculas del código de barras objetivo, todo el procesamiento posterior puede continuar en un solo recipiente de reacción. El procesamiento adicional puede incluir, por ejemplo, reacciones de transcripción inversa, reacciones de amplificación, reacciones de escisión, reacciones de disociación y/o reacciones de extensión de ácido nucleico. Se pueden realizar más reacciones de procesamiento dentro de los micropocillos, es decir, sin reunir primero las moléculas de ácido nucleico diana marcadas de una pluralidad de células.
Transcripción inversa
[0203] La descripción proporciona un método para crear un conjugado de código de barras objetivo usando transcripción inversa (p. ej., en el bloque 224 de la FIG. 2). El conjugado de código de barras objetivo puede comprender el código de barras y una secuencia complementaria de todo o una parte del ácido nucleico objetivo (es decir, una molécula de ADNc con código de barras, tal como una molécula de ADNc con código de barras estocástico). La transcripción inversa de la molécula de ARN asociada puede ocurrir mediante la adición de un cebador de transcripción inversa junto con la transcriptasa inversa. El cebador de transcripción inversa puede ser un cebador oligo(dT), un cebador hexanucleotídico aleatorio o un cebador oligonucleotídico específico de la diana. Los cebadores oligo(dT) pueden tener, o pueden tener aproximadamente, 12-18 nucleótidos de longitud y se unen a la cola poli(A) endógena en el extremo 3' del ARNm de mamífero. Los cebadores de hexanucleótidos aleatorios pueden unirse al ARNm en una variedad de sitios complementarios. Los cebadores de oligonucleótidos específicos de la diana suelen cebar selectivamente el ARNm de interés.
[0204] En algunas formas de realización, la transcripción inversa de la molécula de ARN marcada puede ocurrir mediante la adición de un cebador de transcripción inversa. En algunas formas de realización, el cebador de transcripción inversa es un cebador oligo(dT), un cebador hexanucleotídico aleatorio o un cebador oligonucleotídico específico de la diana. En general, los cebadores oligo(dT) tienen una longitud de 12 a 18 nucleótidos y se unen a la cola poli(A) endógena en el extremo 3' del ARNm de mamífero. Los cebadores de hexanucleótidos aleatorios pueden unirse al ARNm en una variedad de sitios complementarios. Los cebadores de oligonucleótidos específicos de la diana suelen cebar selectivamente el ARNm de interés.
[0205] La transcripción inversa puede ocurrir repetidamente para producir múltiples moléculas de ADNc marcadas. Los métodos descritos en este documento pueden comprender realizar al menos aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 reacciones de transcripción inversa. El método puede comprender realizar al menos aproximadamente 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 reacciones de transcripción inversa.
Amplificación
[0206] Se pueden realizar una o más reacciones de amplificación de ácidos nucleicos (p. ej., en el bloque 228 de la FIG.
2) para crear múltiples copias de las moléculas de ácido nucleico diana marcadas. La amplificación se puede realizar de manera multiplexada, en la que múltiples secuencias de ácido nucleico diana se amplifican simultáneamente. La reacción de amplificación se puede usar para agregar adaptadores de secuenciación a las moléculas de ácido nucleico. Las reacciones de amplificación pueden comprender la amplificación de al menos una parte de un marcador de muestra, si está presente. Las reacciones de amplificación pueden comprender la amplificación de al menos una parte del marcador celular y/o la secuencia del código de barras (p. ej., un marcador molecular). Las reacciones de amplificación pueden comprender la amplificación de al menos una parte de una etiqueta de muestra, una etiqueta celular, una etiqueta espacial, una secuencia de código de barras (p. ej., una etiqueta molecular), un ácido nucleico diana o una combinación de los mismos. Las reacciones de amplificación pueden comprender amplificación 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 100 %, o un rango o un número entre cualquiera de estos dos valores, de la pluralidad de ácidos nucleicos. El método puede comprender además la forma de realización de una o más reacciones de síntesis de ADNc para producir una o más copias de ADNc de moléculas de código de barras diana que comprenden una etiqueta de muestra, una etiqueta de célula, una etiqueta espacial y/o una secuencia de código de barras (p. ej., una etiqueta molecular).
[0207] En algunas formas de realización, la amplificación se puede realizar utilizando una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Como se usa en este documento, PCR puede referirse a una reacción para la amplificación in vitro de secuencias de ADN específicas mediante la extensión simultánea de cebadores de hebras complementarias de ADN. Como se usa aquí, la PCR puede abarcar formas derivadas de la reacción, incluidas, entre otras, RT-PCR, PCR en tiempo real, PCR anidada, PCR cuantitativa, PCR multiplexada, PCR digital y PCR ensamblada.
[0208] La amplificación de los ácidos nucleicos marcados puede comprender métodos no basados en PCR. Los ejemplos de métodos que no se basan en PCR incluyen, entre otros, amplificación por desplazamiento múltiple (MDA), amplificación mediada por transcripción (TMA), amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA), amplificación por desplazamiento de cadena (SDA), SDA en tiempo real, amplificación por círculo rodante, o amplificación de círculo a círculo. Otros métodos de amplificación no basados en PCR incluyen ciclos múltiples de amplificación de transcripción de ARN impulsada por ARN polimerasa dependiente de ADN o síntesis y transcripción de ADN dirigida por ARN para amplificar objetivos de ADN o ARN, una reacción en cadena de ligasa (LCR) y un método de replicasa Qp (Qp), uso de sondas palindrómicas, amplificación por desplazamiento de cadena, amplificación dirigida por oligonucleótidos usando una endonucleasa de restricción, un método de amplificación en el que un cebador se hibrida con una secuencia de ácido nucleico y el dúplex resultante se escinde antes de la reacción de extensión y amplificación, desplazamiento de cadena amplificación utilizando una polimerasa de ácido nucleico que carece de actividad de exonucleasa 5', amplificación de círculo rodante y amplificación de extensión de ramificación (RAM). En algunas formas de realización, la amplificación no produce transcritos circularizados.
[0209] En algunas formas de realización, los métodos descritos en el presente documento comprenden además la forma de realización de una reacción en cadena de la polimerasa en el ácido nucleico marcado (p. ej., ARN marcado, ADN marcado, ADNc marcado) para producir un amplicón marcado (p. ej., un amplicón marcado estocásticamente). El amplicón marcado puede ser una molécula de doble cadena. La molécula de doble cadena puede comprender una molécula de ARN de doble cadena, una molécula de ADN de doble cadena o una molécula de ARN hibridada con una molécula de ADN. Una o ambas cadenas de la molécula de doble cadena pueden comprender un marcador de muestra, un marcador espacial, un marcador celular y/o una secuencia de código de barras (p. ej., un marcador molecular). El amplicón marcado puede ser una molécula monocatenaria. La molécula monocatenaria puede comprender ADN, ARN o una combinación de los mismos. Los ácidos nucleicos de la divulgación pueden comprender ácidos nucleicos sintéticos o alterados.
[0210] La amplificación puede comprender el uso de uno o más nucleótidos no naturales. Los nucleótidos no naturales pueden comprender nucleótidos fotolábiles o activables. Los ejemplos de nucleótidos no naturales pueden incluir, entre otros, ácido nucleico peptídico (ANP), morfolino y ácido nucleico bloqueado (ANB), así como ácido nucleico de glicol (ANG) y ácido nucleico de treosa (ANT). Se pueden agregar nucleótidos no naturales a uno o más ciclos de una reacción de amplificación. La adición de nucleótidos no naturales se puede utilizar para identificar productos como ciclos específicos o puntos de tiempo en la reacción de amplificación.
[0211] La forma de realización de una o más reacciones de amplificación puede comprender el uso de uno o más cebadores. El uno o más cebadores pueden comprender, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 o más nucleótidos. El uno o más cebadores pueden comprender al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 o más nucleótidos. El uno o más cebadores pueden comprender menos de 12-15 nucleótidos. El uno o más cebadores pueden hibridarse con al menos una parte de la pluralidad de dianas marcadas (p. ej., dianas marcadas estocásticamente). El uno o más cebadores pueden hibridarse con el extremo 3' o el extremo 5' de la pluralidad de dianas marcadas. El uno o más cebadores pueden hibridarse con una región interna de la pluralidad de dianas marcadas. La región interna puede ser al menos 50, 100, 150, 200, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900 o 1000 nucleótidos desde los extremos 3' de la pluralidad de dianas marcadas. El uno o más cebadores pueden comprender un panel fijo de cebadores. El uno o más cebadores pueden comprender al menos uno o más cebadores personalizados. El uno o más cebadores pueden comprender al menos uno o más cebadores de control. El uno o más cebadores pueden comprender al menos uno o más cebadores específicos de genes.
[0212] El uno o más cebadores pueden comprender un cebador universal. El cebador universal puede hibridarse con un sitio de unión del cebador universal. El uno o más cebadores personalizados pueden hibridarse con un primer marcador de muestra, un segundo marcador de muestra, un marcador espacial, un marcador celular, una secuencia de código de barras (p. ej., un marcador molecular), un objetivo o cualquier combinación de los mismos. El uno o más cebadores pueden comprender un cebador universal y un cebador personalizado. El cebador personalizado se puede diseñar para amplificar uno o más objetivos. Los objetivos pueden comprender un subconjunto de los ácidos nucleicos totales en una o más muestras. Los objetivos pueden comprender un subconjunto del total de objetivos etiquetados en una o más muestras. El uno o más cebadores pueden comprender al menos 96 o más cebadores personalizados. El uno o más cebadores pueden comprender al menos 960 o más cebadores personalizados. El uno o más cebadores pueden comprender al menos 9600 o más cebadores personalizados. El uno o más cebadores personalizados pueden hibridarse con dos o más ácidos nucleicos marcados diferentes. Los dos o más ácidos nucleicos marcados diferentes pueden corresponder a uno o más genes.
[0213] Cualquier esquema de amplificación se puede utilizar en los métodos de la presente descripción. Por ejemplo, en un esquema, la primera ronda de PCR puede amplificar moléculas unidas a la perla usando un cebador específico de gen y un cebador contra la secuencia del cebador 1 de secuenciación universal de Illumina. La segunda ronda de PCR puede amplificar los primeros productos de PCR utilizando un cebador específico de gen anidado flanqueado por la secuencia del cebador 2 de secuenciación de Illumina y un cebador contra la secuencia del cebador 1 de secuenciación universal de Illumina. La tercera ronda de PCR agrega P5 y P7 y el índice de muestra para convertir los productos de PCR en una biblioteca de secuenciación de Illumina. La secuenciación con secuenciación de 150 pb x 2 puede revelar la etiqueta celular y la secuencia del código de barras (p. ej., etiqueta molecular) en la lectura 1, el gen en la lectura 2 y el índice de la muestra en la lectura del índice 1.
[0214] En algunas formas de realización, los ácidos nucleicos se pueden eliminar del sustrato mediante la escisión química. Por ejemplo, se puede usar un grupo químico o una base modificada presente en un ácido nucleico para facilitar su eliminación de un soporte sólido. Por ejemplo, se puede usar una enzima para eliminar un ácido nucleico de un sustrato. Por ejemplo, se puede eliminar un ácido nucleico de un sustrato a través de una digestión con endonucleasas de restricción. Por ejemplo, se puede usar el tratamiento de un ácido nucleico que contiene un dUTP o ddUTP con uracil-dglicosilasa (UDG) para eliminar un ácido nucleico de un sustrato. Por ejemplo, se puede eliminar un ácido nucleico de un sustrato utilizando una enzima que realiza la escisión de nucleótidos, como una enzima reparadora de escisión de bases, como una endonucleasa apurínica/apirimidínica (AP). En algunas formas de realización, se puede eliminar un ácido nucleico de un sustrato utilizando un grupo fotoescindible y luz. En algunas formas de realización, se puede usar un conector escindible para eliminar un ácido nucleico del sustrato. Por ejemplo, el enlazador escindible puede comprender al menos uno de biotina/avidina, biotina/estreptavidina, biotina/neutravidina, Ig-proteína A, un enlazador fotolábil, un grupo enlazador lábil a ácidos o bases, o un aptámero.
[0215] Cuando las sondas son específicas de genes, las moléculas pueden hibridar con las sondas y ser transcritas y/o amplificadas de forma inversa. En algunas formas de realización, después de que se haya sintetizado el ácido nucleico (p. ej., transcrito de forma inversa), se puede amplificar. La amplificación se puede realizar de manera multiplex, en la que múltiples secuencias de ácido nucleico diana se amplifican simultáneamente. La amplificación puede agregar adaptadores de secuenciación al ácido nucleico.
[0216] En algunas formas de realización, la amplificación se puede realizar en el sustrato, por ejemplo, con amplificación de puente. Los ADNc pueden tener una cola de homopolímero para generar un extremo compatible para la amplificación de puente utilizando sondas de oligo(dT) en el sustrato. En la amplificación puente, el cebador que es complementario al extremo 3' del ácido nucleico molde puede ser el primer cebador de cada par que se une covalentemente a la partícula sólida. Cuando una muestra que contiene el ácido nucleico plantilla se pone en contacto con la partícula y se realiza un solo ciclo térmico, la molécula plantilla puede hibridarse con el primer cebador y el primer cebador se alarga en la dirección de avance mediante la adición de nucleótidos para formar una molécula dúplex que consta de la molécula molde y una hebra de ADN recién formada que es complementaria a la plantilla. En el paso de calentamiento del siguiente ciclo, la molécula dúplex se puede desnaturalizar, liberando la molécula molde de la partícula y dejando la hebra de ADN complementaria unida a la partícula a través del primer cebador. En la etapa de hibridación del paso de hibridación y elongación que sigue, la hebra complementaria puede hibridarse con el segundo cebador, que es complementario a un segmento de la hebra complementaria en una ubicación eliminada del primer cebador. Esta hibridación puede hacer que la hebra complementaria forme un puente entre el primer y el segundo cebador asegurado al primer cebador por un enlace covalente y al segundo cebador por hibridación. En la etapa de elongación, el segundo cebador se puede alargar en la dirección inversa mediante la adición de nucleótidos en la misma mezcla de reacción, convirtiendo así el puente en un puente de doble cadena. Entonces comienza el siguiente ciclo, y el puente de doble cadena se puede desnaturalizar para producir dos moléculas de ácido nucleico de cadena sencilla, cada una con un extremo unido a la superficie de la partícula a través del primer y segundo cebador, respectivamente, con el otro extremo de cada uno sin unir. En el paso de hibridación y elongación de este segundo ciclo, cada hebra puede hibridar con otro cebador complementario, no utilizado previamente, en la misma partícula, para formar nuevos puentes monocatenarios. Los dos cebadores no utilizados anteriormente que ahora están hibridados se alargan para convertir los dos nuevos puentes en puentes de doble hebra.
[0217] Las reacciones de amplificación pueden comprender amplificar al menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % del pluralidad de ácidos nucleicos.
[0218] La amplificación de los ácidos nucleicos marcados puede comprender métodos basados en PCR o métodos no basados en PCR. La amplificación de los ácidos nucleicos marcados puede comprender la amplificación exponencial de los ácidos nucleicos marcados. La amplificación de los ácidos nucleicos marcados puede comprender la amplificación lineal de los ácidos nucleicos marcados. La amplificación se puede realizar por reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La PCR puede referirse a una reacción para la amplificación in vitro de secuencias de ADN específicas mediante la extensión simultánea de cebadores de hebras complementarias de ADN. La PCR puede abarcar formas derivadas de la reacción, incluidas, entre otras, RT-PCR, PCR en tiempo real, PCR anidada, PCR cuantitativa, PCR multiplexada, PCR digital, PCR de supresión, PCR semisupresora y PCR de ensamblaje.
[0219] En algunas formas de realización, la amplificación de los ácidos nucleicos marcados comprende métodos no basados en PCR. Los ejemplos de métodos no basados en PCR incluyen, entre otros, amplificación por desplazamiento múltiple (MDA), amplificación mediada por transcripción (TMA), amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA), amplificación por desplazamiento de cadena (SDA), amplificación en tiempo real SDA, amplificación de círculo rodante o amplificación de círculo a círculo. Otros métodos de amplificación no basados en PCR incluyen ciclos múltiples de amplificación de la transcripción ARN impulsado por polimerasa de ARN dependiente de ADN o síntesis y transcripción de ADN dirigida por ARN para amplificar objetivos de ADN o ARN, una reacción en cadena de ligasa (LCR), una replicasa Qp (Qp), uso de sondas palindrómicas, amplificación por desplazamiento de cadena, amplificación dirigida por oligonucleótidos utilizando una endonucleasa de restricción, un método de amplificación en el que un cebador se hibrida con una secuencia de ácido nucleico y el dúplex resultante se escinde antes de la reacción de extensión y amplificación, amplificación por desplazamiento de cadena utilizando un polimerasa de ácido nucleico que carece de actividad de exonucleasa 5', amplificación de círculo rodante y/o amplificación de extensión de ramificación (RAM).
[0220] En algunas formas de realización, los métodos descritos en el presente documento comprenden además la forma de realización de una reacción en cadena de la polimerasa anidada en el amplicón amplificado (p. ej., el objetivo). El amplicón puede ser una molécula de doble cadena. La molécula de doble cadena puede comprender una molécula de ARN de doble cadena, una molécula de ADN de doble cadena o una molécula de ARN hibridada con una molécula de ADN. Una o ambas cadenas de la molécula de doble cadena pueden comprender una etiqueta de muestra o una etiqueta identificadora molecular. Alternativamente, el amplicón puede ser una molécula monocatenaria. La molécula monocatenaria puede comprender ADN, ARN o una combinación de los mismos. Los ácidos nucleicos de la presente invención pueden comprender ácidos nucleicos sintéticos o alterados.
[0221] En algunas formas de realización, el método comprende amplificar repetidamente el ácido nucleico marcado para producir múltiples amplicones. Los métodos descritos en este documento pueden comprender realizar al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 reacciones de amplificación. Alternativamente, el método comprende realizar al menos aproximadamente 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 reacciones de amplificación.
[0222] La amplificación puede comprender además agregar uno o más ácidos nucleicos de control a una o más muestras que comprenden una pluralidad de ácidos nucleicos. La amplificación puede comprender además agregar uno o más ácidos nucleicos de control a una pluralidad de ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos de control pueden comprender un marcador de control.
[0223] La amplificación puede comprender el uso de uno o más nucleótidos no naturales. Los nucleótidos no naturales pueden comprender nucleótidos fotolábiles y/o activables. Los ejemplos de nucleótidos no naturales incluyen, entre otros, ácido nucleico peptídico (ANP), morfolino y ácido nucleico bloqueado (ANB), así como ácido nucleico de glicol (ANG) y ácido nucleico de treosa (ANT). Se pueden agregar nucleótidos no naturales a uno o más ciclos de una reacción de amplificación. La adición de nucleótidos no naturales se puede utilizar para identificar productos como ciclos específicos o puntos de tiempo en la reacción de amplificación.
[0224] La forma de realización de una o más reacciones de amplificación puede comprender el uso de uno o más cebadores. El uno o más cebadores pueden comprender uno o más oligonucleótidos. El uno o más oligonucleótidos pueden comprender al menos alrededor de 7-9 nucleótidos. El uno o más oligonucleótidos pueden comprender menos de 12-15 nucleótidos. El uno o más cebadores pueden hibridarse con al menos una parte de la pluralidad de ácidos nucleicos marcados. El uno o más cebadores pueden hibridarse con el extremo 3' y/o el extremo 5' de la pluralidad de ácidos nucleicos marcados. El uno o más cebadores pueden hibridarse con una región interna de la pluralidad de ácidos nucleicos marcados. La región interna puede ser al menos 50, 100, 150, 200, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900 o 1000 nucleótidos desde los extremos 3' la pluralidad de ácidos nucleicos marcados. El uno o más cebadores pueden comprender un panel fijo de cebadores. El uno o más cebadores pueden comprender al menos uno o más cebadores personalizados. El uno o más cebadores pueden comprender al menos uno o más cebadores de control. El uno o más cebadores pueden comprender al menos uno o más cebadores de genes de mantenimiento. El uno o más cebadores pueden comprender un cebador universal. El cebador universal puede hibridarse con un sitio de unión del cebador universal. El uno o más cebadores personalizados pueden hibridarse con la primera etiqueta de muestra, la segunda etiqueta de muestra, la etiqueta identificadora molecular, el ácido nucleico o un producto del mismo. El uno o más cebadores pueden comprender un cebador universal y un cebador personalizado. El cebador personalizado se puede diseñar para amplificar uno o más ácidos nucleicos diana. Los ácidos nucleicos diana pueden comprender un subconjunto de los ácidos nucleicos totales en una o más muestras. En algunas formas de realización, los cebadores son las sondas unidas a la matriz de la divulgación.
[0225] En algunas formas de realización, la codificación de barras (p. ej., codificación de barras estocástica) de la pluralidad de objetivos en la muestra comprende además generar una biblioteca indexada de los objetivos con código de barras (p. ej., objetivos con código de barras estocástico) o fragmentos con código de barras de los objetivos. Las secuencias de códigos de barras de diferentes códigos de barras (p. ej., las etiquetas moleculares de diferentes códigos de barras estocásticos) pueden ser diferentes entre sí. La generación de una biblioteca indexada de los objetivos con código de barras incluye la generación de una pluralidad de polinucleótidos indexados a partir de la pluralidad de objetivos en la muestra. Por ejemplo, para una biblioteca indexada de dianas con código de barras que comprende una primera diana indexada y una segunda diana indexada, la región etiquetada del primer polinucleótido indexado puede diferir de la región etiquetada del segundo polinucleótido indexado en, aproximadamente, al menos, o como máximo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores, nucleótidos. En algunas formas de realización, generar una biblioteca indexada de los objetivos con código de barras incluye poner en contacto una pluralidad de objetivos, por ejemplo, moléculas de ARNm, con una pluralidad de oligonucleótidos que incluyen una región poli(T) y una región marcadora; y llevar a cabo una síntesis de la primera cadena utilizando una transcriptasa inversa para producir moléculas de ADNc marcadas de cadena sencilla, cada una de las cuales comprende una región de ADNc y una región marcadora, en la que la pluralidad de dianas incluye al menos dos moléculas de ARNm de secuencias diferentes y la pluralidad de oligonucleótidos incluye al menos dos oligonucleótidos de diferente secuencia. La generación de una biblioteca indexada de los objetivos con código de barras puede comprender además la amplificación de las moléculas cD-NA etiquetadas con cadena única para producir moléculas de ADNc marcadas de doble cadena; y llevar a cabo una PCR anidada en las moléculas de ADNc marcadas de doble hebra para producir amplicones marcados. En algunas formas de realización, el método puede incluir generar un amplicón marcado con adaptador.
[0226] La codificación de barras (p. ej., codificación de barras estocástica) puede incluir el uso de etiquetas o códigos de barras de ácido nucleico para etiquetar moléculas individuales de ácido nucleico (p. ej., ADN o ARN). En algunas formas de realización, implica agregar etiquetas o códigos de barras de ADN a las moléculas de ADNc a medida que se generan a partir del ARNm. Se puede realizar una PCR anidada para minimizar el sesgo de amplificación de la PCR. Se pueden agregar adaptadores para secuenciar usando, por ejemplo, secuenciación de próxima generación (NGS). Los resultados de la secuenciación pueden usarse para determinar etiquetas celulares, etiquetas moleculares y secuencias de fragmentos de nucleótidos de una o más copias de las dianas, por ejemplo, en el bloque 232 de la FIG. 2.
[0227] FIG. 3 es una ilustración esquemática que muestra un proceso ejemplar no limitante de generar una biblioteca indexada de los objetivos con código de barras (por ejemplo, objetivos con código de barras estocástico), tales como ARNm con código de barras o fragmentos de los mismos. Como se muestra en el paso 1, el proceso de transcripción inversa puede codificar cada molécula de ARNm con una etiqueta molecular única, una etiqueta celular y un sitio de PCR universal. En particular, las moléculas de ARN 302 se pueden transcribir de forma inversa para producir moléculas de ADNc 304 marcadas, incluida una región de ADNc 306, mediante hibridación (p. ej., hibridación estocástica) de un conjunto de códigos de barras (p. ej., códigos de barras estocásticos) 310 a la región de cola poli(A) 308 de las moléculas de ARN 302. Cada uno de los códigos de barras 310 puede comprender una región de unión a la diana, por ejemplo, una región poli(dT) 312, una región marcadora 314 (p. ej., una secuencia de código de barras o una molécula) y una región de PCR universal 316.
[0228] En algunas formas de realización, el marcador celular puede incluir de 3 a 20 nucleótidos. En algunas formas de realización, el marcador molecular puede incluir de 3 a 20 nucleótidos. En algunas formas de realización, cada uno de la pluralidad de códigos de barras estocásticos comprende además uno o más de una etiqueta universal y una etiqueta de célula, donde las etiquetas universales son las mismas para la pluralidad de códigos de barras estocásticos en el soporte sólido y las etiquetas de célula son las mismas para la pluralidad de códigos de barras estocásticos sobre el soporte sólido. En algunas formas de realización, el marcador universal puede incluir de 3 a 20 nucleótidos. En algunas formas de realización, el marcador celular comprende de 3 a 20 nucleótidos.
[0229] En algunas formas de realización, la región de la etiqueta 314 puede incluir una secuencia de código de barras o una etiqueta molecular 318 y una etiqueta celular 320. En algunas formas de realización, la región de la etiqueta 314 puede incluir una o más de una etiqueta universal, una etiqueta de dimensión y una etiqueta de célula. La secuencia de código de barras o etiqueta molecular 318 puede ser, puede ser aproximadamente, puede ser al menos o puede ser como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, o un número o un intervalo entre cualquiera de estos valores, de nucleótidos de longitud. La etiqueta de célula 320 puede ser, puede ser aproximadamente, puede ser al menos o puede ser como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, o un número o un rango entre cualquiera de estos valores, de nucleótidos de longitud. La etiqueta universal puede ser, puede ser sobre, puede ser al menos, o puede ser como máximo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, o un número o un rango entre cualquiera de estos valores, de nucleótidos de longitud. Las etiquetas universales pueden ser las mismas para la pluralidad de códigos de barras estocásticos sobre el soporte sólido y las etiquetas de célula son las mismas para la pluralidad de códigos de barras estocásticos sobre el soporte sólido. La etiqueta de dimensión puede ser, puede ser aproximadamente, puede ser al menos o puede ser como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, o un número o un rango entre cualquiera de estos valores, de nucleótidos de longitud.
[0230] En algunas formas de realización, la región de la etiqueta 314 puede comprender, comprender aproximadamente, comprender al menos o comprender como máximo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, o un número o un rango entre cualquiera de estos valores, diferentes etiquetas, como una secuencia de código de barras o una etiqueta molecular 318 y una etiqueta celular 320. Cada etiqueta puede ser, puede ser aproximadamente, puede ser al menos o puede ser como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, o un número o un intervalo entre cualquiera de estos valores, de nucleótidos de longitud. Un conjunto de códigos de barras o códigos de barras estocásticos 310 puede contener, contener sobre, contener al menos, o puede ser como máximo, 10, 20, 40, 50, 70, 80, 90, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1015, 1020, o un número o un rango entre cualquiera de estos valores, códigos de barras o códigos de barras estocásticos 310. Y el conjunto de códigos de barras o códigos de barras estocásticos 310 puede, por ejemplo, cada uno contiene una región de marca única 314. Las moléculas de ADNc marcadas 304 se pueden purificar para eliminar el exceso de códigos de barras o los códigos de barras estocásticos 310. La purificación puede comprender la purificación con perlas Ampure.
[0231] Como se muestra en el paso 2, los productos del proceso de transcripción inversa en el paso 1 se pueden agrupar en 1 tubo y amplificar por PCR con un primer grupo de cebadores de PCR y un primer cebador de PCR universal. El agrupamiento es posible debido a la región marcadora única 314. En particular, las moléculas de ADNc marcadas 304 se pueden amplificar para producir amplicones 322 marcados con PCR anidados. La amplificación puede comprender amplificación por PCR multiplex. La amplificación puede comprender una amplificación por PCR multiplex con 96 cebadores multiplex en un solo volumen de reacción. En algunas formas de realización, la amplificación por PCR multiplex puede utilizar, utilizar aproximadamente, utilizar al menos o utilizar como máximo 10, 20, 40, 50, 70, 80, 90, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 1020, o un número o un rango entre cualquiera de estos valores, cebadores multiplexados en un único volumen de reacción. La amplificación puede comprender el uso de un primer grupo de cebadores de PCR 324 que comprende cebadores personalizados 326A-C dirigidos a genes específicos y un cebador universal 328. Los cebadores personalizados 326 pueden hibridar con una región dentro de la parte de ADNc 306' de la molécula de ADNc marcada 304. El cebador universal 328 puede hibridar con la región PCR universal 316 de la molécula de ADNc marcada 304.
[0232] Como se muestra en el paso 3 de la FIG. 3, los productos de la amplificación por PCR en el paso 2 se pueden amplificar con un conjunto de cebadores de PCR anidados y un segundo cebador de PCR universal. La PCR anidada puede minimizar el sesgo de amplificación de la PCR. En particular, los amplicones 322 marcados con PCR anidada pueden amplificarse adicionalmente mediante PCR anidada. La PCR anidada puede comprender una PCR multiplex con un grupo de cebadores de PCR anidados 330 de cebadores de PCR anidados 332a-c y un segundo cebador de PCR universal 328' en un único volumen de reacción. El grupo de cebadores de PCR anidados 328 puede contener, contener aproximadamente, contener al menos o contener como máximo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, o un número o un rango entre cualquiera de estos valores, diferentes cebadores de PCR anidados 330. Los cebadores de PCR anidados 332 puede contener un adaptador 334 e hibridar con una región dentro de la parte de ADNc 306" del amplicón marcado 322. El cebador universal 328' puede contener un adaptador 336 e hibridar con la región PCR universal 316 del amplicón marcado 322. Así, el paso 3 produce un amplicón marcado con adaptador 338. En algunas formas de realización, los cebadores de PCR anidados 332 y el segundo cebador de PCR universal 328' pueden no contener los adaptadores 334 y 336. En cambio, los adaptadores 334 y 336 pueden ligarse a los productos de PCR anidados para producir adaptadores marcados amplicón 338.
[0233] Como se muestra en el paso 4, los productos de PCR del paso 3 se pueden amplificar por PCR para la secuenciación usando cebadores de amplificación de biblioteca. En particular, los adaptadores 334 y 336 se pueden usar para realizar uno o más ensayos adicionales en el amplicón 338 marcado. Los adaptadores 334 y 336 pueden hibridarse con los cebadores 340 y 342. El uno o más cebadores 340 y 342 pueden ser cebadores de amplificación por PCR. Los uno o más cebadores 340 y 342 pueden ser cebadores de secuenciación. El uno o más adaptadores 334 y 336 se pueden usar para amplificación adicional de los amplicones 338 marcados con adaptador. El uno o más adaptadores 334 y 336 se pueden usar para secuenciar el amplicón 338 marcado con adaptador. El cebador 342 puede contener un índice de placa 344 de modo que que los amplicones generados usando el mismo conjunto de códigos de barras o códigos de barras estocásticos 310 pueden secuenciarse en una reacción de secuenciación usando secuenciación de próxima generación (NGS).
Composiciones que comprenden reactivos de unión a componentes celulares asociados con oligonucleótidos
[0234] Algunas formas de realización descritas en el presente documento proporcionan una pluralidad de composiciones, cada una de las cuales comprende un reactivo de unión a componentes celulares (como un reactivo de unión a proteínas) que está conjugado con un oligonucleótido, en el que el oligonucleótido comprende un identificador único para el reactivo de unión al componente celular con el que está conjugado. Los reactivos de unión a componentes celulares (como los anticuerpos con código de barras) y sus usos (como la indexación de muestras de células) se han descrito en la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. N.° 2018/0088112 y la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. N.° 2018/0346970.
[0235] En algunas formas de realización, el reactivo de unión de componentes celulares es capaz de unirse específicamente a un objetivo de componente celular. Por ejemplo, un objetivo de unión del reactivo de unión del componente celular puede ser, o comprender, un carbohidrato, un lípido, una proteína, una proteína extracelular, una proteína de la superficie celular, un marcador celular, un receptor de células B, un receptor de células T, un complejo principal de histocompatibilidad, un antígeno tumoral, un receptor, una integrina, una proteína intracelular o cualquier combinación de los mismos. En algunas formas de realización, el reactivo de unión al componente celular (p. ej., un reactivo de unión a proteínas) es capaz de unirse específicamente a un antígeno diana o a una proteína objetivo. En algunas formas de realización, cada uno de los oligonucleótidos puede comprender un código de barras, como un código de barras estocástico. Un código de barras puede comprender una secuencia de código de barras (p. ej., una etiqueta molecular), una etiqueta de célula, una etiqueta de muestra o cualquier combinación de las mismas. En algunas formas de realización, cada uno de los oligonucleótidos puede comprender un enlazador. En algunas formas de realización, cada uno de los oligonucleótidos puede comprender un sitio de unión para una sonda de oligonucleótidos, como una cola de poli(A). Por ejemplo, la cola de poli(A) puede estar, por ejemplo, no anclada a un soporte sólido o anclada a un soporte sólido. La cola poli(A) puede tener una longitud de aproximadamente 10 a 50 nucleótidos. En algunas formas de realización, la cola poli(A) puede tener una longitud de 18 nucleótidos. Los oligonucleótidos pueden comprender desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos o ambos.
[0236] Los identificadores únicos pueden ser, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos que tenga cualquier longitud adecuada, por ejemplo, de aproximadamente 4 nucleótidos a aproximadamente 200 nucleótidos. En algunas formas de realización, el identificador único es una secuencia de nucleótidos de 25 nucleótidos a aproximadamente 45 nucleótidos de longitud. En algunas formas de realización, el identificador único puede tener una longitud que es aproximadamente, es menor que, es mayor que 4 nucleótidos, 5 nucleótidos, 6 nucleótidos, 7 nucleótidos, 8 nucleótidos, 9 nucleótidos, 10 nucleótidos, 15 nucleótidos, 20 nucleótidos, 25 nucleótidos, 30 nucleótidos, 35 nucleótidos, 40 nucleótidos, 45 nucleótidos, 50 nucleótidos, 55 nucleótidos, 60 nucleótidos, 70 nucleótidos, 80 nucleótidos, 90 nucleótidos, 100 nucleótidos, 200 nucleótidos, o un rango que está entre cualquiera de dos de los valores anteriores.
[0237] En algunas formas de realización, los identificadores únicos se seleccionan de un conjunto diverso de identificadores únicos. El conjunto diverso de identificadores únicos puede comprender, o comprender aproximadamente, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 5000, o un número o un rango entre dos de estos valores, identificadores únicos diferentes. El conjunto diverso de identificadores únicos puede comprender al menos, o comprender como máximo, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000 o 5000, identificadores únicos diferentes. En algunas formas de realización, el conjunto de identificadores únicos está diseñado para tener una homología de secuencia mínima con las secuencias de ADN o ARN de la muestra que se va a analizar. En algunas formas de realización, las secuencias del conjunto de identificadores únicos son diferentes entre sí, o su complemento, en, o en aproximadamente, 1 nucleótido, 2 nucleótidos, 3 nucleótidos, 4 nucleótidos, 5 nucleótidos, 6 nucleótidos, 7 nucleótidos, 8 nucleótidos, 9 nucleótidos, 10 nucleótidos, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, las secuencias del conjunto de identificadores únicos son diferentes entre sí, o el complemento del mismo, por al menos, o por al menos la mayoría, 1 nucleótido, 2 nucleótidos, 3 nucleótidos, 4 nucleótidos, 5 nucleótidos, 6 nucleótidos, 7 nucleótidos, 8 nucleótidos, 9 nucleótidos, 10 nucleótidos. En algunas formas de realización, las secuencias del conjunto de identificadores únicos son diferentes entre sí, o su complemento, en al menos un 3 %, al menos un 5 %, al menos un 8 %, al menos un 10 %, al menos un 15 %, al menos el 20 % o más.
[0238] En algunas formas de realización, los identificadores únicos pueden comprender un sitio de unión para un cebador, como un cebador universal. En algunas formas de realización, los identificadores únicos pueden comprender al menos dos sitios de unión para un cebador, como un cebador universal. En algunas formas de realización, los identificadores únicos pueden comprender al menos tres sitios de unión para un cebador, como un cebador universal. Los cebadores se pueden usar para la amplificación de los identificadores únicos, por ejemplo, mediante amplificación por PCR. En algunas formas de realización, los cebadores pueden usarse para reacciones de PCR anidadas.
[0239] En esta descripción se contempla cualquier reactivo de unión a componentes celulares adecuado, como reactivos de unión a proteínas, anticuerpos o fragmentos de los mismos, aptámeros, moléculas pequeñas, ligandos, péptidos, oligonucleótidos, etc., o cualquier combinación de los mismos. En algunas formas de realización, los reactivos de unión al componente celular pueden ser anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos recombinantes, anticuerpos monocatenarios (sc-Ab) o fragmentos de los mismos, como Fab, Fv, etc. En algunas formas de realización, la pluralidad de componentes celulares los reactivos de unión pueden comprender, o comprender aproximadamente, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 5000, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores, reactivos de componentes celulares diferentes. En algunas formas de realización, la pluralidad de reactivos de unión a componentes celulares puede comprender al menos, o comprender como máximo, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000 o 5000, diferentes reactivos de componentes celulares.
[0240] El oligonucleótido se puede conjugar con el reactivo de unión al componente celular a través de varios mecanismos. En algunas formas de realización, el oligonucleótido se puede conjugar covalentemente con el reactivo de unión al componente celular. En alguna forma de realización, el oligonucleótido se puede conjugar con el reactivo de unión al componente celular de forma no covalente. En algunas formas de realización, el oligonucleótido se conjuga con el reactivo de unión al componente celular a través de un enlazador. El enlazador puede ser, por ejemplo, escindible o separable del reactivo de unión al componente celular y/o del oligonucleótido. En algunas formas de realización, el enlazador puede comprender un grupo químico que une reversiblemente el oligonucleótido a los reactivos de unión del componente celular. El grupo químico se puede conjugar con el enlazador, por ejemplo, a través de un grupo amino. En algunas formas de realización, el enlazador puede comprender un grupo químico que forma un enlace estable con otro grupo químico conjugado con el reactivo de unión al componente celular. Por ejemplo, el grupo químico puede ser un grupo fotoescindible UV, un enlace disulfuro, una estreptavidina, una biotina, una amina, etc. En algunas formas de realización, el grupo químico puede conjugarse con el reactivo de unión del componente celular a través de una amina primaria en un aminoácido, como la lisina, o el N-terminal. Los kits de conjugación disponibles en el mercado, como el kit de conjugación de proteínas y oligos (Solulink, Inc., San Diego, California), el sistema de conjugación de oligos Thunder-Link® (Innova Biosciences, Cambridge, Reino Unido), etc., se pueden utilizar para conjugar el oligonucleótido al reactivo de unión al componente celular.
[0241] El oligonucleótido se puede conjugar con cualquier sitio adecuado del reactivo de unión al componente celular (p. ej., un reactivo de unión a proteínas), siempre que no interfiera con la unión específica entre el reactivo de unión al componente celular y su diana de componente celular. En algunas formas de realización, el reactivo de unión al componente celular es una proteína, como un anticuerpo. En algunas formas de realización, el reactivo de unión al componente celular no es un anticuerpo. En algunas formas de realización, el oligonucleótido se puede conjugar con el anticuerpo en cualquier lugar que no sea el sitio de unión al antígeno, por ejemplo, la región Fc, el dominio Ch1, el dominio Ch2, el dominio Ch3, el dominio Cl, etc. Métodos de conjugación de oligonucleótidos a reactivos de unión a componentes celulares (p. ej., anticuerpos) se han descrito previamente, por ejemplo, en la Patente de EE. UU. N° 6.531.283. La estequiometría del reactivo de unión del oligonucleótido al componente celular puede variar. Para aumentar la sensibilidad de detección del oligonucleótido específico del reactivo de unión al componente celular en la secuenciación, puede ser ventajoso aumentar la proporción de oligonucleótido a reactivo de unión al componente celular durante la conjugación. En algunas formas de realización, cada reactivo de unión a componente celular se puede conjugar con una sola molécula de oligonucleótido. En algunas formas de realización, cada reactivo de unión a componente celular se puede conjugar con más de una molécula de oligonucleótido, por ejemplo, al menos, o como máximo, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 1000, o un número o un intervalo entre cualquiera de estos dos valores, moléculas de oligonucleótidos en las que cada una de las moléculas de oligonucleótidos comprende identificadores únicos iguales o diferentes. En algunas formas de realización, cada reactivo de unión a componente celular se puede conjugar con más de una molécula de oligonucleótido, por ejemplo, al menos, o como máximo, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 1000, moléculas de oligonucleótidos, en las que cada una de las moléculas de oligonucleótidos comprende identificadores únicos iguales o diferentes.
[0242] En algunas formas de realización, la pluralidad de reactivos de unión de componentes celulares es capaz de unirse específicamente a una pluralidad de objetivos de componentes celulares en una muestra, como una sola célula, una pluralidad de células, una muestra de tejido, una muestra de tumor, un muestra de sangre, o similar. En algunas formas de realización, la pluralidad de objetivos de componentes celulares comprende una proteína de la superficie celular, un marcador celular, un receptor de células B, un receptor de células T, un anticuerpo, un complejo principal de histocompatibilidad, un antígeno tumoral, un receptor o cualquier combinación de los mismos. En algunas formas de realización, la pluralidad de objetivos de componentes celulares puede comprender componentes celulares intracelulares. En algunas formas de realización, la pluralidad de objetivos de componentes celulares puede comprender componentes celulares intracelulares. En algunas formas de realización, la pluralidad de componentes celulares puede ser, o ser aproximadamente, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 %, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores, de todos los componentes celulares (p. ej., proteínas) en una célula o un organismo. En algunas formas de realización, la pluralidad de componentes celulares puede ser al menos, o como máximo, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de todos los componentes celulares (por ejemplo, proteínas) en una célula o un organismo. En algunas formas de realización, la pluralidad de objetivos de componentes celulares puede comprender, o comprender aproximadamente, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 1000, 10000, o un número o un rango entre dos cualesquiera de estos valores, objetivos de diferentes componentes celulares. En algunas formas de realización, la pluralidad de objetivos de componentes celulares puede comprender al menos, o comprender como máximo, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 1000, 10000 objetivos de componentes celulares diferentes.
[0243] La FIG. 4 muestra una ilustración esquemática de un ejemplo de reactivo de unión a componente celular (p. ej., un anticuerpo) que está asociado (p. ej., conjugado) con un oligonucleótido que comprende una secuencia de identificación única para el anticuerpo. Un oligonucleótido conjugado con un reactivo de unión a un componente celular, un oligonucleótido para la conjugación con un reactivo de unión a un componente celular o un oligonucleótido previamente conjugado con un reactivo de unión a un componente celular pueden denominarse en el presente documento oligonucleótido de anticuerpo (abreviado como oligonucleótido de reactivo de unión). Un oligonucleótido conjugado con un anticuerpo, un oligonucleótido para la conjugación con un anticuerpo o un oligonucleótido previamente conjugado con un anticuerpo pueden denominarse en el presente documento oligonucleótido de anticuerpo (abreviado como "AbOligo" o "AbO"). El oligonucleótido también puede comprender componentes adicionales, incluidos, entre otros, uno o más enlazadores, uno o más identificadores únicos para el anticuerpo, opcionalmente una o más secuencias de código de barras (p. ej., etiquetas moleculares) y una cola de poli(dA). En algunas formas de realización, el oligonucleótido puede comprender, de 5' a 3', un enlazador, un identificador único, una secuencia de código de barras (p. ej., un marcador molecular) y una cola de poli(dA). Un oligonucleótido de anticuerpo puede ser un imitador de ARNm.
[0244] La FIG. 5 muestra una ilustración esquemática de un reactivo de unión de componente celular ejemplar (p. ej., un anticuerpo) que está asociado (p. ej., conjugado) con un oligonucleótido que comprende una secuencia de identificación única para el anticuerpo. El reactivo de unión de componentes celulares puede ser capaz de unirse específicamente a al menos un objetivo de componente celular, como un objetivo de antígeno o un objetivo de proteína. Un oligonucleótido reactivo de unión (p. ej., un oligonucleótido de indexación de muestra o un oligonucleótido de anticuerpo) puede comprender una secuencia (p. ej., una secuencia de indexación de muestra) para realizar los métodos de la descripción. Por ejemplo, un oligonucleótido de indexación de muestras puede comprender una secuencia de indexación de muestras para identificar el origen de una o más células de una muestra. Las secuencias de indexación (p. ej., secuencias de indexación de muestras) de al menos dos composiciones que comprenden dos reactivos de unión a componentes celulares (p. ej., composiciones de indexación de muestras) de la pluralidad de composiciones que comprenden reactivos de unión a componentes celulares pueden comprender secuencias diferentes. En algunas formas de realización, el oligonucleótido del reactivo de unión no es homólogo a las secuencias genómicas de una especie. El oligonucleótido del reactivo de unión puede configurarse para ser (o puede ser) separable o no separable del reactivo de unión del componente celular.
[0245] El oligonucleótido conjugado con un reactivo de unión a componente celular puede, por ejemplo, comprender una secuencia de código de barras (p. ej., una secuencia de marcador molecular), una cola de poli(dA) o una combinación de las mismas. Un oligonucleótido conjugado con un reactivo de unión a un componente celular puede ser un mimético de ARNm. En algunas formas de realización, el oligonucleótido de indexación de muestras comprende una secuencia complementaria a una secuencia de captura de al menos un código de barras de la pluralidad de códigos de barras. Una región de unión objetivo del código de barras puede comprender la secuencia de captura. La región de unión al objetivo puede, por ejemplo, comprender una región poli(dT). En algunas formas de realización, la secuencia del oligonucleótido de indexación de la muestra complementaria a la secuencia de captura del código de barras puede comprender una cola de poli(dA). El oligonucleótido de indexación de muestras puede comprender un marcador molecular.
[0246] En algunas formas de realización, el oligonucleótido reactivo de unión (p. ej., el oligonucleótido de muestra) comprende una secuencia de nucleótidos o una secuencia de nucleótidos de aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 128, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, o un número o un rango entre dos cualquiera de estos valores, nucleótidos de longitud. En algunas formas de realización, el oligonucleótido del reactivo de unión comprende una secuencia de nucleótidos de al menos, o como máximo, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 128, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990 o 1000 nucleótidos de longitud.
[0247] En algunas formas de realización, el reactivo de unión al componente celular comprende un anticuerpo, un tetrámero, un aptámero, un andamio de proteína o una combinación de los mismos. El oligonucleótido del reactivo de unión se puede conjugar con el reactivo de unión del componente celular, por ejemplo, a través de un enlazador. El oligonucleótido reactivo de unión puede comprender el enlazador. El enlazador puede comprender un grupo químico. El grupo químico puede unirse de forma reversible o irreversible a la molécula del reactivo de unión al componente celular.
El grupo químico se puede seleccionar del grupo que consiste en un grupo fotoescindible por UV, un enlace disulfuro, una estreptavidina, una biotina, una amina y cualquier combinación de los mismos.
[0248] En algunas formas de realización, el reactivo de unión de componentes celulares puede unirse a ADAM10, CD156c, ANO6, ATP1B2, ATP1B3, BSG, CD147, CD109, CD230, CD29, CD298, ATP1B3, CD44, CD45, CD47, CD51, CD59, CD63, CD97, CD98, SLC3A2, CLDND1, HLA-ABC, ICAM1, ITFG3, MPZL1, NA K ATPasa alfa1, ATP1A1, NPTN, PMCA ATPasa, ATP2B1, SLC1A5, SLC29A1, SLC2A1, SLC44A2 o cualquier combinación de los mismos.
[0249] En algunas formas de realización, la proteína objetivo es, o comprende, una proteína extracelular, una proteína intracelular o cualquier combinación de las mismas. En algunas formas de realización, el antígeno o proteína objetivo es, o comprende, una proteína de la superficie celular, un marcador celular, un receptor de células B, un receptor de células T, un complejo principal de histocompatibilidad, un antígeno tumoral, un receptor, una integrina, o cualquier combinación de los mismos. El objetivo de antígeno o proteína puede ser, o comprender, un lípido, un carbohidrato o cualquier combinación de los mismos. La proteína objetivo se puede seleccionar de un grupo que comprende una serie de proteínas objetivo. El número de dianas de antígeno o dianas de proteína puede ser, o ser aproximadamente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores. El número de proteínas objetivo puede ser como mínimo o como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 o 10000.
[0250] El reactivo de unión al componente celular (p. ej., un reactivo de unión a proteínas) se puede asociar con dos o más oligonucleótidos del reactivo de unión (p. ej., oligonucleótidos de indexación de muestras) con una secuencia idéntica. El reactivo de unión al componente celular se puede asociar con dos o más oligonucleótidos del reactivo de unión con secuencias diferentes. El número de oligonucleótidos del reactivo de unión asociados con el reactivo de unión del componente celular puede ser diferente en diferentes implementaciones. En algunas formas de realización, el número de oligonucleótidos del reactivo de unión ya sea que tengan una secuencia idéntica o secuencias diferentes, puede ser, o ser aproximadamente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, el número de oligonucleótidos del reactivo de unión puede ser al menos, o como máximo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000.
[0251] La pluralidad de composiciones que comprenden reactivos de unión de componentes celulares (por ejemplo, la pluralidad de composiciones de indexación de muestras) puede comprender uno o más reactivos de unión a componentes celulares adicionales no conjugados con el oligonucleótido reactivo de unión (como el oligonucleótido de indexación de muestras), que también se denomina en el presente documento como el reactivo de unión reactivo de unión a componentes celulares sin oligonucleótidos (como el reactivo de unión a componentes celulares sin oligonucleótidos de indexación de muestras). El número de reactivos de unión de componentes celulares adicionales en la pluralidad de composiciones puede ser diferente en diferentes implementaciones. En algunas formas de realización, el número de reactivos de unión a componentes celulares adicionales puede ser, o ser aproximadamente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, el número de reactivos de unión de componentes celulares adicionales puede ser al menos, o como máximo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100. El reactivo de unión de componentes celulares y cualquiera de los reactivos de unión de componentes celulares adicionales pueden ser idénticos, en algunas formas de realización.
[0252] En algunas formas de realización, una mezcla que comprende reactivos de unión a componentes celulares que se conjugan con uno o más oligonucleótidos de reactivos de unión (p. ej., oligonucleótidos de indexación de muestras) y reactivos de unión a componentes celulares que no están conjugados con oligonucleótidos de reactivos de unión está provisto. La mezcla se puede usar en algunas formas de realización de los métodos descritos en el presente documento, por ejemplo, para poner en contacto la(s) muestra(s) y/o la(s) célula(s). La proporción de (1) el número de un reactivo de unión a un componente celular conjugado con un oligonucleótido de un reactivo de unión y (2) el número de otro reactivo de unión a un componente celular (p. ej., el mismo reactivo de unión a un componente celular) no conjugado con el oligonucleótido de un reactivo de unión (por ejemplo, oligonucleótido de indexación de muestra) u otro(s) oligonucleótido(s) de reactivo de unión en la mezcla pueden ser diferentes en diferentes implementaciones. En algunas formas de realización, la relación puede ser, o ser aproximadamente, 1:1, 1:1,1, 1:1,2, 1:1,3, 1:1,4, 1:1,5, 1:1,6, 1:1,7, 1:1,8, 1:1.9, 1:2, 1:2.5, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, 1:31, 1:32, 1:33, 1:34, 1:35, 1:36, 1:37, 1:38, 1:39, 1:40, 1:41, 1:42, 1:43, 1:44, 1:45, 1:46, 1:47, 1:48, 1:49, 1:50, 1:51, 1:52, 1:53, 1:54, 1:55, 1:56, 1:57, 1:58, 1:59, 1:60, 1:61, 1:62, 1:63, 1:64, 1:65, 1:66, 1:67, 1:68, 1:69, 1:70, 1:71, 1:72, 1:73, 1:74, 1:75, 1:76, 1:77, 1:78, 1:79, 1:80, 1:81, 1:82, 1:83, 1:84, 1:85, 1:86, 1:87, 1:88, 1:89, 1:90, 1:91, 1:92, 1:93, 1:94, 1:95, 1:96, 1:97, 1:98, 1:99, 1:100, 1:200, 1:300, 1:400, 1:500, 1:600, 1:700, 1:800, 1:900, 1:1000, 1:2000, 1:3000, 1:4000, 1:5000, 1:6000, 1:7000, 1:8000, 1:9000, 1:10000, o un número o rango entre cualquiera de los dos valores. En algunas formas de realización, la relación puede ser al menos, o como máximo, 1:1, 1:1,1, 1:1,2, 1:1,3, 1:1,4, 1:1,5, 1:1,6, 1:1,7, 1:1.8, 1:1.9, 1:2, 1:2.5, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, 1:31, 1:32, 1:33, 1:34, 1:35, 1:36, 1:37, 1:38, 1:39, 1:40, 1:41, 1:42, 1:43, 1:44, 1:45, 1:46, 1:47, 1:48, 1:49, 1:50, 1:51, 1:52, 1:53, 1:54, 1:55, 1:56, 1:57, 1:58, 1:59, 1:60, 1:61, 1:62, 1:63, 1:64, 1:65, 1:66, 676837 1:67, 1:68, 1:69, 1:70, 1:71, 1:72, 1:73, 1:74, 1:75, 1:76, 1:77, 1:78, 1:79, 1:80, 1:81, 1:82, 1:83, 1:84, 1:85, 1:86, 1:87, 1:88, 1:89, 1:90, 1:91, 1:92, 1:93, 1:94, 1:95, 1:96, 1:97, 1:98, 1:99, 1:100, 1:200, 1:300, 1:400, 1:500, 1:600, 1:700, 1:800, 1:900, 1:1000, 1:2000, 1:3000, 1:4000, 1:5000, 1:6000, 1:7000, 1:8000, 1:9000 o 1:10000.
[0253] En algunas formas de realización, la relación puede ser, o ser aproximadamente, 1:1, 1,1:1, 1,2:1, 1,3:1, 1,4:1, 1,5:1, 1,6:1, 1,7:1, 1,8:1, 1.9:1, 2:1, 2.5:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1,
18:1, 19:1, 20:1, 21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1, 33:1, 34:1, 35:1, 36:1, 37:1, 38:1, 39:1, 40:1, 41:1, 42:1, 43:1, 44:1, 45:1, 46:1, 47:1, 48:1, 49:1, 50:1, 51:1, 52:1, 53:1, 54:1, 55:1, 56:1, 57:1, 58:1, 59:1, 60:1, 61:1, 62:1, 63:1, 64:1, 65:1, 66:1, 67:1, 68:1, 69:1, 70:1, 71:1, 72:1, 73:1, 74:1, 75:1, 76:1, 77:1, 78:1, 79:1, 80:1, 81:1,82:1,83:1, 84:1,85:1,86:1,87:1,88:1,89:1,90:1,91:1, 92:1,93:1,94:1,95:1,96:1,97:1,98:1,99:1, 100:1,200:1, 300:1,400:1, 500:1,600:1,700:1,800:1,900:1, 1000:1,2000:1,3000:1,4000:1,5000:1,6000:1,7000:1,8000:1,9000:1, 10000:1, o un número o un rango entre cualquiera de los dos valores. En algunas formas de realización, la relación puede ser al menos, o como máximo, 1:1, 1,1:1, 1,2:1, 1,3:1, 1,4:1, 1,5:1, 1,6:1, 1,7:1, 1,8:1, 1.9:1, 2:1, 2.5:1, 3:1,4:1, 5:1,6:1, 7:1,8:1,9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 21:1,22:1, 23:1, 24:1,25:1, 26:1,27:1,28:1,
29:1, 30:1, 31:1, 32:1, 33:1, 34:1, 35:1, 36:1, 37:1, 38:1, 39:1, 40:1, 41:1, 42:1, 43:1, 44:1, 45:1, 46:1, 47:1, 48:1, 49:1, 50:1, 51:1, 52:1, 53:1, 54:1, 55:1, 56:1, 57:1, 58:1, 59:1, 60:1, 61:1, 62:1, 63:1, 64:1, 65:1, 66:1, 67:1, 68:1, 69:1, 70:1, 71:1, 72:1, 73:1, 74:1, 75:1, 76:1, 77:1, 78:1, 79:1, 80:1, 81:1, 82:1, 83:1, 84:1, 85:1, 86:1, 87:1, 88:1, 89:1, 90:1, 91:1, 92:1,93:1,94:1,95:1,96:1,97:1,98:1,99:1, 100:1,200:1,300:1,400:1,500:1,600:1,700:1,800:1,900:1, 1000:1,2000:1, 3000:1,4000:1,5000:1, 6000:1,7000:1,8000:1,9000:1 o 10000:1.
[0254] Un reactivo de unión a componente celular se puede conjugar con un oligonucleótido de reactivo de unión (p. ej., un oligonucleótido de indexación de muestra), o no. En algunas formas de realización, el porcentaje del reactivo de unión del componente celular conjugado con un oligonucleótido del reactivo de unión (p. ej., un oligonucleótido de indexación de muestra) en una mezcla que comprende el reactivo de unión del componente celular que está conjugado con el oligonucleótido del reactivo de unión y el reactivo de unión del (de los) componente(s) celular(es) que no está conjugado con el reactivo de unión oligonucleótido puede ser, o ser aproximadamente, 0,000000001 %, 0,00000001 %, 0,0000001
%, 0,000001 %, 0,00001 %, 0,0001 %, 0,001 %, 0,01 %, 0,1 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11
%, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 %, 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 %, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, el porcentaje del reactivo de unión al componente celular conjugado con un oligonucleótido de indexación de muestra en una mezcla puede ser al menos, o como máximo, 0,000000001 %, 0,00000001 %, 0,0000001 %, 0,000001 %, 0,00001 %, 0,0001 %, 0,001 %, 0,01 %, 0,1 %, 1 %, 2 %, 3
%, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23
%, 24 %, 25 %, 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 %, 41 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 100 %.
[0255] En algunas formas de realización, el porcentaje del reactivo de unión de componentes celulares no conjugado con un oligonucleótido de reactivo de unión (p. ej., un oligonucleótido de indexación de muestra) en una mezcla que comprende un reactivo de unión de componentes celulares conjugado con un oligonucleótido de reactivo de unión (p. ej., un oligonucleótido de muestra oligonucleótido de indexación) y el reactivo de unión del componente celular que no está conjugado con el oligonucleótido de indexación de la muestra puede ser, o ser aproximadamente, 0,000000001 %, 0,00000001 %, 0,0000001 %, 0,000001 %, 0,00001 %, 0,0001 %, 0,001 %, 0,01 %, 0,1 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %,
7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 26
%, 27 %, 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 %, 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 %, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, el porcentaje del reactivo de unión del componente celular no conjugado con un oligonucleótido del reactivo de unión en una mezcla puede ser al menos, o como máximo, 0,000000001 %, 0,00000001 %, 0,0000001 %, 0,000001 %, 0,00001 %, 0,0001 %, 0,001 %,
0,01 %, 0,1 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19
%, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 39 %, 40 %, 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %.
Cócteles de componentes celulares
[0256] En algunas formas de realización, se puede usar un cóctel de reactivos de unión de componentes celulares (p. ej., un cóctel de anticuerpos) para aumentar la sensibilidad de marcaje en el métodos descritos en este documento. Sin estar vinculado por ninguna teoría en particular, se cree que esto puede deberse a que la expresión del componente celular o la expresión de la proteína puede variar entre los tipos de células y los estados celulares, lo que dificulta encontrar un reactivo universal de unión a componentes celulares o un anticuerpo que marque todos los tipos de células. Por ejemplo, se puede utilizar un cóctel de reactivos de unión a componentes celulares para permitir un etiquetado más sensible y eficaz de más tipos de muestras. El cóctel de reactivos de unión a componentes celulares puede incluir dos o más tipos diferentes de reactivos de unión a componentes celulares, por ejemplo, una gama más amplia de reactivos de unión a componentes celulares o anticuerpos. Los reactivos de unión a componentes celulares que marcan diferentes objetivos de componentes celulares se pueden combinar para crear un cóctel que marque suficientemente todos los tipos de células, o uno o más tipos de células de interés.
[0257] En algunas formas de realización, cada una de la pluralidad de composiciones (p. ej., composiciones de indexación de muestras) comprende un reactivo de unión de componentes celulares. En algunas formas de realización, una composición de la pluralidad de composiciones comprende dos o más reactivos de unión a componentes celulares, en donde cada uno de los dos o más reactivos de unión a componentes celulares está asociado con un oligonucleótido reactivo de unión (p. ej., un oligonucleótido de indexación de muestra), en donde al menos uno de los dos o más reactivos de unión a componentes celulares es capaz de unirse específicamente a al menos una de las uno o más objetivos de componentes celulares. Las secuencias de los oligonucleótidos del reactivo de unión asociados con los dos o más reactivos de unión del componente celular pueden ser idénticas. Las secuencias de los oligonucleótidos del reactivo de unión asociados a los dos o más reactivos de unión a componentes celulares pueden comprender secuencias diferentes. Cada una de la pluralidad de composiciones puede comprender los dos o más reactivos de unión a componentes celulares.
[0258] El número de diferentes tipos de reactivos de unión a componentes celulares (por ejemplo, un anticuerpo CD147 y un anticuerpo CD47) en una composición puede ser diferente en diferentes implementaciones. Una composición con dos o más tipos diferentes de reactivos de unión a componentes celulares puede denominarse en este documento cóctel de reactivos de unión a componentes celulares (p. ej., un cóctel de composición de indexación de muestras). El número de diferentes tipos de reactivos de unión de componentes celulares en un cóctel puede variar. En algunas formas de realización, el número de diferentes tipos de reactivos de unión a componentes celulares en el cóctel puede ser de aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 10000, 100000, o un número o rango entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, el número de diferentes tipos de reactivos de unión a componentes celulares en el cóctel puede ser al menos, o como máximo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 10000 o 100000. Los diferentes tipos de reactivos de unión a componentes celulares se pueden conjugar con oligonucleótidos de reactivos de unión. con secuencias iguales o diferentes (p. ej., secuencias de indexación de muestra).
Métodos de análisis cuantitativo de objetivos de componentes celulares
[0259] En algunas formas de realización, los métodos descritos en el presente documento también se pueden usar para el análisis cuantitativo de una pluralidad de objetivos de componentes celulares (por ejemplo, objetivos proteicos) en una muestra utilizando las composiciones descritas en este documento y sondas de oligonucleótidos que pueden asociar una secuencia de código de barras (p. ej., una secuencia marcadora molecular) a los oligonucleótidos de los reactivos de unión a componentes celulares (p. ej., reactivos de unión a proteínas). Los oligonucleótidos de los reactivos de unión de componentes celulares pueden ser, o comprender, un oligonucleótido de anticuerpo, un oligonucleótido de indexación de muestra, un oligonucleótido de identificación celular, un oligonucleótido de partícula de control, un oligonucleótido de control, un oligonucleótido de determinación de interacción, etc. puede ser una sola célula, una pluralidad de células, una muestra de tejido, una muestra de tumor, una muestra de sangre o similares. En algunas formas de realización, la muestra puede comprender una mezcla de tipos de células, como células normales, células tumorales, células sanguíneas, células B, células T, células maternas, células fetales, etc., o una mezcla de células de diferentes sujetos.
[0260] En algunas formas de realización, la muestra puede comprender una pluralidad de células individuales separadas en compartimentos individuales, como micropocillos en una matriz de micropocillos.
[0261] En algunas formas de realización, el objetivo de unión de la pluralidad de objetivos del componente celular (es decir, el objetivo del componente celular) puede ser, o comprender, un carbohidrato, un lípido, una proteína, una proteína extracelular, una proteína de la superficie celular, un marcador celular, un receptor de células B, un receptor de células T, un complejo principal de histocompatibilidad, un antígeno tumoral, un receptor, una integrina, una proteína intracelular o cualquier combinación de los mismos. En algunas formas de realización, el componente celular objetivo es una proteína objetivo. En algunas formas de realización, la pluralidad de objetivos de componentes celulares comprende una proteína de la superficie celular, un marcador celular, un receptor de células B, un receptor de células T, un anticuerpo, un complejo principal de histocompatibilidad, un antígeno tumoral, un receptor o cualquier combinación de los mismos. En algunas formas de realización, la pluralidad de objetivos de componentes celulares puede comprender componentes celulares intracelulares. En algunas formas de realización, la pluralidad de componentes celulares puede ser de al menos 1 %, al menos 2 %, al menos 3 %, al menos 4 %, al menos 5 %, al menos 6 %, al menos 7 %, al menos 8 %, al menos el 9 %, al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o más, de todos los componentes celulares codificados en un organismo. En algunas formas de realización, la pluralidad de objetivos de componentes celulares puede comprender al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 100, al menos 1000, al menos 10000 o más objetivos de componentes celulares diferentes.
[0262] En algunas formas de realización, la pluralidad de reactivos de unión de componentes celulares se pone en contacto con la muestra para la unión específica con la pluralidad de objetivos de componentes celulares. Los reactivos de unión de componentes celulares no unidos se pueden eliminar, por ejemplo, mediante lavado. En las formas de realización en las que la muestra comprende células, se pueden eliminar los reactivos de unión a componentes celulares que no se unen específicamente a las células.
[0263] En algunos casos, las células de una población de células pueden separarse (p. ej., aislarse) en pocillos de un sustrato de la divulgación. La población de células se puede diluir antes de la separación. La población de células se puede diluir de tal manera que al menos 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, El 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % de los pocillos del sustrato reciben una única célula. La población de células se puede diluir de manera que como máximo 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, El 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % de los pocillos del sustrato reciben una sola célula. La población de células se puede diluir de manera que el número de células en la población diluida sea, o sea al menos, 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % del número de pocillos en el sustrato. La población de células se puede diluir de manera que el número de células en la población diluida sea, o sea al menos, 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % del número de pocillos en el sustrato. En algunos casos, la población de células se diluye de manera que el número de células es aproximadamente el 10 % del número de pocillos en el sustrato.
[0264] La distribución de células individuales en pocillos del sustrato puede seguir una distribución de Poisson. Por ejemplo, puede haber al menos un 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 % o 10 %, o más probabilidad de que un pocillo del sustrato tiene más de una célula. Puede haber al menos un 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 % o 10 %, o más probabilidad de que un pocillo de el sustrato tiene más de una célula. La distribución de células individuales en pocillos del sustrato puede ser aleatoria. La distribución de células individuales en pocillos del sustrato puede no ser aleatoria. Las células se pueden separar de manera que un pocillo del sustrato reciba sólo una célula.
[0265] En algunas formas de realización, los reactivos de unión de componentes celulares se pueden conjugar adicionalmente con moléculas fluorescentes para permitir la clasificación por flujo de las células en compartimentos individuales.
[0266] En algunas formas de realización, los métodos descritos en el presente documento proporcionan poner en contacto una pluralidad de composiciones con la muestra para la unión específica con la pluralidad de objetivos de componentes celulares. Se apreciaría que las condiciones utilizadas pueden permitir la unión específica de los reactivos de unión de componentes celulares, por ejemplo, anticuerpos, a los objetivos de componentes celulares. Después del paso de contacto, se pueden eliminar las composiciones no unidas. Por ejemplo, en formas de realización en las que la muestra comprende células, y las composiciones se unen específicamente a los componentes celulares que se dirigen son componentes celulares de la superficie celular, como las proteínas de la superficie celular, las composiciones no unidas se pueden eliminar lavando las células con tampón de manera que solo las composiciones que se unen específicamente a los blancos del componente celular permanecen con las células.
[0267] En algunas formas de realización, los métodos descritos en el presente documento pueden comprender asociar un oligonucleótido (p. ej., un código de barras o un código de barras estocástico), incluida una secuencia de código de barras (como una etiqueta molecular), una etiqueta celular, una etiqueta de muestra, etc., o cualquier combinación de los mismos, a la pluralidad de oligonucleótidos asociados con los reactivos de unión a componentes celulares. Por ejemplo, se puede usar una pluralidad de sondas de oligonucleótidos que comprenden un código de barras para hibridar con la pluralidad de oligonucleótidos de las composiciones.
[0268] En algunas formas de realización, la pluralidad de sondas de oligonucleótidos se puede inmovilizar en soportes sólidos. Los soportes sólidos pueden flotar libremente, por ejemplo, perlas en una solución. Los soportes sólidos se pueden incrustar en una matriz semisólida o sólida. En algunas formas de realización, la pluralidad de sondas de oligonucleótidos puede no estar inmovilizada sobre soportes sólidos. Cuando la pluralidad de sondas de oligonucleótidos está muy próxima a la pluralidad asociada con oligonucleótidos de los reactivos de unión a componentes celulares, la pluralidad de oligonucleótidos de los reactivos de unión a componentes celulares puede hibridar con las sondas de oligonucleótidos. Las sondas de oligonucleótidos se pueden poner en contacto en una relación no agotable de modo que cada oligonucleótido distinto de los reactivos de unión a componentes celulares se pueda asociar con sondas de oligonucleótidos que tengan diferentes secuencias de código de barras (p. ej., etiquetas moleculares) de la descripción.
[0269] En algunas formas de realización, los métodos descritos en el presente documento proporcionan la separación de los oligonucleótidos de los reactivos de unión del componente celular que se unen específicamente a los objetivos del componente celular. El desprendimiento se puede realizar de diversas formas para separar el grupo químico del reactivo de unión del componente celular, como fotoescisión UV, tratamiento químico (p. ej., tratamiento con ditiotreitol), calentamiento, tratamiento enzimático o cualquier combinación de los mismos. La separación del oligonucleótido del reactivo de unión al componente celular se puede realizar antes, después o durante la etapa de hibridación de la pluralidad de sondas de oligonucleótidos con la pluralidad de oligonucleótidos de las composiciones.
Métodos de análisis cuantitativo simultáneo de objetivos de componentes celulares y ácidos nucleicos
[0270] En algunas formas de realización, los métodos descritos en el presente documento también se pueden usar para el análisis cuantitativo simultáneo de una pluralidad de objetivos de componentes celulares (p. ej., dianas de proteínas) y una pluralidad de moléculas objetivo de ácidos nucleicos en una muestra usando las composiciones descritas en este documento y sondas de oligonucleótidos que pueden asociar una secuencia de código de barras (p. ej., una secuencia de marca molecular) a tanto los oligonucleótidos de los reactivos de unión al componente celular como las moléculas objetivo de ácido nucleico. Otros métodos de análisis cuantitativo simultáneo de una pluralidad de objetivos de componentes celulares y una pluralidad de moléculas objetivo de ácido nucleico se describen en la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. N.° 2018/0088112. En algunas formas de realización, la muestra puede ser una sola célula, una pluralidad de células, una muestra de tejido, una muestra de tumor, una muestra de sangre o similares. En algunas formas de realización, la muestra puede comprender una mezcla de tipos de células, como células normales, células tumorales, células sanguíneas, células B, células T, células maternas, células fetales o una mezcla de células de diferentes sujetos.
[0271] En algunas formas de realización, la muestra puede comprender una pluralidad de células individuales separadas en compartimentos individuales, como micropocillos en una matriz de micropocillos.
[0272] En algunas formas de realización, la pluralidad de objetivos de componentes celulares comprende una proteína de superficie celular, un marcador celular, un receptor de células B, un receptor de células T, un anticuerpo, un complejo principal de histocompatibilidad, un antígeno tumoral, un receptor, o cualquier combinación de los mismos. En algunas formas de realización, la pluralidad de objetivos de componentes celulares puede comprender componentes celulares intracelulares. En algunas formas de realización, la pluralidad de componentes celulares puede ser, o ser aproximadamente, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 %, o un número o rango entre cualquiera de estos dos valores, de todos los componentes celulares, como proteínas expresadas, en un organismo, o una o más células del organismo. En algunas formas de realización, la pluralidad de componentes celulares puede ser al menos, o como máximo, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 %, de todos los componentes celulares, como las proteínas que se pueden expresar en un organismo, o una o más células del organismo. En algunas formas de realización, la pluralidad de objetivos de componentes celulares puede comprender, o comprender aproximadamente, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 1000, 10000, o un número o un rango entre dos cualesquiera de estos valores, objetivos de diferentes componentes celulares. En algunas formas de realización, la pluralidad de objetivos de componentes celulares puede comprender al menos, o comprender como máximo, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 1000 o 10000 objetivos de componentes celulares diferentes.
[0273] En algunas formas de realización, la pluralidad de reactivos de unión de componentes celulares se pone en contacto con la muestra para la unión específica con la pluralidad de objetivos de componentes celulares. Los reactivos de unión de componentes celulares no unidos se pueden eliminar, por ejemplo, mediante lavado. En las formas de realización en las que la muestra comprende células, se pueden eliminar los reactivos de unión a componentes celulares que no se unen específicamente a las células.
[0274] En algunos casos, las células de una población de células pueden separarse (p. ej., aislarse) en pocillos de un sustrato de la divulgación. La población de células se puede diluir antes de la separación. La población de células se puede diluir de tal manera que al menos 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, El 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % de los pocillos del sustrato reciben una sola célula. La población de células se puede diluir de manera que como máximo 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, El 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % de los pocillos del sustrato reciben una sola célula. La población de células se puede diluir de manera que el número de células en la población diluida sea, o sea al menos, 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % del número de pocillos en el sustrato. La población de células se puede diluir de manera que el número de células en la población diluida sea, o sea al menos, 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % del número de pocillos en el sustrato. En algunos casos, la población de células se diluye de manera que el número de células es aproximadamente el 10 % del número de pocillos en el sustrato.
[0275] La distribución de células individuales en pocillos del sustrato puede seguir una distribución de Poisson. Por ejemplo, puede haber al menos un 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 % o 10 %, o más probabilidad de que un pocillo del sustrato tiene más de una célula. Puede haber al menos un 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 % o 10 %, o más probabilidad de que un pocillo de el sustrato tiene más de una célula. La distribución de células individuales en pocillos del sustrato puede ser aleatoria. La distribución de células individuales en pocillos del sustrato puede no ser aleatoria. Las células se pueden separar de manera que un pocillo del sustrato reciba sólo una célula.
[0276] En algunas formas de realización, los reactivos de unión de componentes celulares se pueden conjugar adicionalmente con moléculas fluorescentes para permitir la clasificación de flujo de células en compartimentos individuales.
[0277] En algunas formas de realización, los métodos descritos en el presente documento proporcionan poner en contacto una pluralidad de composiciones con la muestra para la unión específica con la pluralidad de objetivos de componentes celulares. Se apreciaría que las condiciones utilizadas pueden permitir la unión específica de los reactivos de unión de componentes celulares, por ejemplo, anticuerpos, a los objetivos de componentes celulares. Después del paso de contacto, se pueden eliminar las composiciones no unidas. Por ejemplo, en formas de realización en las que la muestra comprende células, y las composiciones se unen específicamente a los objetivos del componente celular que se encuentran en la superficie celular, como las proteínas de la superficie celular, las composiciones no unidas se pueden eliminar lavando las células con tampón de manera que solo las composiciones que específicamente se unen a los objetivos del componente celular permanecen con las células.
[0278] En algunas formas de realización, los métodos descritos en el presente documento pueden proporcionar la liberación de la pluralidad de moléculas objetivo de ácido nucleico de la muestra, por ejemplo, células. Por ejemplo, las células se pueden lisar para liberar la pluralidad de moléculas objetivo de ácido nucleico. La lisis celular se puede lograr por cualquiera de una variedad de medios, por ejemplo, por tratamiento químico, choque osmótico, tratamiento térmico, tratamiento mecánico, tratamiento óptico o cualquier combinación de los mismos. Las células se pueden lisar mediante la adición de un tampón de lisis celular que comprende un detergente (p. ej., SDS, sulfato de dodecil Li, Triton X-100, Tween-20 o NP-40), un disolvente orgánico (p. ej., metanol o acetona), o enzimas digestivas (p. ej., proteinasa K, pepsina o tripsina), o cualquier combinación de los mismos.
[0279] Un experto normal en la técnica apreciaría que la pluralidad de moléculas de ácido nucleico puede comprender una variedad de moléculas de ácido nucleico. En algunas formas de realización, la pluralidad de moléculas de ácido nucleico puede comprender moléculas de ADN, moléculas de ARN, moléculas de ADN genómico, moléculas de ARNm, moléculas de ARNr, moléculas de ARNip o una combinación de las mismas, y pueden ser de cadena doble o sencilla. En algunas formas de realización, la pluralidad de moléculas de ácido nucleico comprende, o comprende aproximadamente, 100, 1000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 100000, 1000000, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores, especies. En algunas formas de realización, la pluralidad de moléculas de ácido nucleico comprende al menos, o comprende como máximo, 100, 1000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 100000 o 1000000 especies. En algunas formas de realización, la pluralidad de moléculas de ácido nucleico puede ser de una muestra, como una sola célula o una pluralidad de células. En algunas formas de realización, la pluralidad de moléculas de ácido nucleico puede combinarse a partir de una pluralidad de muestras, como una pluralidad de células individuales.
[0280] En algunas formas de realización, los métodos descritos en el presente documento pueden comprender asociar un código de barras (p. ej., un código de barras estocástico), que puede incluir una secuencia de código de barras (como una etiqueta molecular), una etiqueta de célula, una etiqueta de muestra, etc., o cualquier combinación de los mismos, a la pluralidad de moléculas objetivo de ácido nucleico y la pluralidad de oligonucleótidos de los reactivos de unión a componentes celulares. Por ejemplo, se puede usar una pluralidad de sondas de oligonucleótidos que comprenden un código de barras estocástico para hibridar con la pluralidad de moléculas objetivo de ácido nucleico y la pluralidad de oligonucleótidos de las composiciones.
[0281] En algunas formas de realización, la pluralidad de sondas de oligonucleótidos se puede inmovilizar en soportes sólidos. Los soportes sólidos pueden flotar libremente, por ejemplo, perlas en una solución. Los soportes sólidos se pueden incrustar en una matriz semisólida o sólida. En algunas formas de realización, la pluralidad de sondas de oligonucleótidos puede no estar inmovilizada sobre soportes sólidos. Cuando la pluralidad de sondas de oligonucleótidos está muy cerca de la pluralidad de moléculas objetivo de ácido nucleico y la pluralidad de oligonucleótidos de los reactivos de unión a componentes celulares, la pluralidad de moléculas objetivo de ácidos nucleicos y la pluralidad de oligonucleótidos de los reactivos de unión a componentes celulares pueden hibridarse. a las sondas de oligonucleótidos. Las sondas de oligonucleótidos pueden ponerse en contacto en una proporción no agotable de modo que cada molécula diana de ácido nucleico distinta y los oligonucleótidos de los reactivos de unión al componente celular puedan asociarse con sondas de oligonucleótidos que tengan diferentes secuencias de código de barras (p. ej., etiquetas moleculares) de la divulgación.
[0282] En algunas formas de realización, los métodos descritos en el presente documento proporcionan la separación de los oligonucleótidos de los reactivos de unión del componente celular que se unen específicamente a los objetivos del componente celular. El desprendimiento se puede realizar de diversas formas para separar el grupo químico del reactivo de unión del componente celular, como fotoescisión UV, tratamiento químico (p. ej., tratamiento con ditiotreitol), calentamiento, tratamiento enzimático o cualquier combinación de los mismos. La separación del oligonucleótido del reactivo de unión al componente celular se puede realizar antes, después o durante la etapa de hibridación de la pluralidad de sondas de oligonucleótidos con la pluralidad de moléculas objetivo de ácido nucleico y la pluralidad de oligonucleótidos de las composiciones.
Análisis cuantitativo simultáneo de dianas de proteínas y ácidos nucleicos
[0283] En algunas formas de realización, los métodos descritos en el presente documento también se pueden usar para el análisis cuantitativo simultáneo de múltiples tipos de moléculas objetivo, por ejemplo, dianas de proteínas y ácidos nucleicos. Por ejemplo, las moléculas objetivo pueden ser, o comprender, componentes celulares. FIG. 6 muestra una ilustración esquemática de un método ejemplar de análisis cuantitativo simultáneo de objetivos de ácido nucleico y otros objetivos de componentes celulares (p. ej., proteínas) en células individuales. En algunas formas de realización, se proporciona una pluralidad de composiciones 605, 605b, 605c, etc., cada una de las cuales comprende un reactivo de unión al componente celular, tal como un anticuerpo. Diferentes reactivos de unión a componentes celulares, tales como anticuerpos, que se unen a diferentes objetivos de componentes celulares, se conjugan con diferentes identificadores únicos. A continuación, los reactivos de unión a componentes celulares se pueden incubar con una muestra que contiene una pluralidad de células 610. Los diferentes reactivos de unión a componentes celulares pueden unirse específicamente a componentes celulares en la superficie celular, como un marcador celular, un receptor de células B, un receptor de células T, un anticuerpo, un complejo principal de histocompatibilidad, un antígeno tumoral, un receptor o cualquier combinación de los mismos. Los reactivos de unión de componentes celulares no unidos pueden eliminarse, por ejemplo, lavando las células con un tampón. Las células con los reactivos de unión a componentes celulares se pueden separar luego en una pluralidad de compartimentos, como una matriz de micropocillos, en la que un solo compartimento 615 tiene el tamaño para adaptarse a una sola célula y una sola perla 620. Cada perla puede comprender una pluralidad de oligonucleótidos. sondas, que pueden comprender un marcador celular que es común a todas las sondas de oligonucleótidos en una perla, y secuencias de código de barras (p. ej., secuencias de marcadores moleculares). En algunas formas de realización, cada sonda de oligonucleótidos puede comprender una región de unión a la diana, por ejemplo, una secuencia poli(dT). Los oligonucleótidos 625 conjugados con el reactivo de unión al componente celular pueden separarse del reactivo de unión al componente celular utilizando medios químicos, ópticos u otros. La célula se puede lisar 635 para liberar ácidos nucleicos dentro de la célula, como ADN genómico o ARNm celular 630. El ARNm celular 630, los oligonucleótidos 625 o ambos pueden ser capturados por las sondas de oligonucleótidos en la perla 620, por ejemplo, hibridando con el poli secuencia (dT). Se puede usar una transcriptasa inversa para extender las sondas de oligonucleótidos hibridadas con el ARNm celular 630 y los oligonucleótidos 625 usando el ARNm celular 630 y los oligonucleótidos 625 como moldes. Los productos de extensión producidos por la transcriptasa inversa pueden ser objeto de amplificación y secuenciación. Las lecturas de secuenciación pueden estar sujetas a demultiplexación de secuencias o identificaciones de etiquetas celulares, códigos de barras (p. ej., etiquetas moleculares), genes, oligonucleótidos específicos del reactivo de unión de componentes celulares (p. ej., oligonucleótidos específicos de anticuerpos), etc., que pueden dar lugar a una representación digital de los componentes celulares y la expresión génica de cada célula individual de la muestra.
Asociación de códigos de barras
[0284] Los oligonucleótidos asociados con los reactivos de unión de componentes celulares (p. ej., reactivos de unión a antígenos o reactivos de unión a proteínas) y/o las moléculas de ácido nucleico pueden asociarse aleatoriamente con las sondas de oligonucleótidos (p. ej., códigos de barras, como códigos de barras estocásticos). Los oligonucleótidos asociados con los reactivos de unión de componentes celulares, denominados en el presente documento oligonucleótidos de reactivos de unión, pueden ser o comprender oligonucleótidos de la divulgación, como un oligonucleótido de anticuerpo, un oligonucleótido de indexación de muestra, un oligonucleótido de identificación celular, un oligonucleótido de partícula de control, un oligonucleótido de control, un oligonucleótido de determinación de interacción, etc. La asociación puede comprender, por ejemplo, la hibridación de una región de unión diana de una sonda de oligonucleótidos con una parte complementaria de la molécula de ácido nucleico diana y/o los oligonucleótidos de los reactivos de unión a proteínas. Por ejemplo, una región oligo(dT) de un código de barras (p. ej., un código de barras estocástico) puede interactuar con una cola poli(A) de una molécula de ácido nucleico diana y/o una cola poli(dA) de un oligonucleótido de una proteína de unión. reactivo. Las condiciones de ensayo utilizadas para la hibridación (p. ej., pH del tampón, fuerza iónica, temperatura, etc.) pueden elegirse para promover la formación de híbridos específicos y estables.
[0285] La divulgación proporciona métodos para asociar un marcador molecular con un ácido nucleico diana y/o un oligonucleótido asociado con un reactivo de unión a componente celular usando transcripción inversa. Como transcriptasa inversa, puede usar tanto ARN como ADN como molde. Por ejemplo, el oligonucleótido conjugado originalmente en el reactivo de unión al componente celular puede ser una base de ARN o ADN, o ambas. Un oligonucleótido reactivo de unión se puede copiar y vincular (p. ej., enlazar covalentemente) a un marcador celular y una secuencia de código de barras (p. ej., un marcador molecular) además de la secuencia, o una parte de la misma, de la secuencia del reactivo de unión. Como otro ejemplo, una molécula de ARNm se puede copiar y enlazar (p. ej., enlazar covalentemente) a un marcador celular y una secuencia de código de barras (p. ej., un marcador molecular) además de la secuencia de la molécula de ARNm, o una parte de la misma.
[0286] En algunas formas de realización, las etiquetas moleculares se pueden agregar mediante la unión de una región de unión al objetivo de una sonda de oligonucleótidos y una parte de la molécula de ácido nucleico diana y/o los oligonucleótidos asociados con (p. ej., actualmente o previamente asociados con) con reactivos de unión de componentes celulares. Por ejemplo, la región de unión al objetivo puede comprender una secuencia de ácido nucleico que puede ser capaz de una hibridación específica con un saliente del sitio de restricción (p. ej., un saliente del extremo pegajoso de EcoRI). Los métodos pueden comprender además el tratamiento de los ácidos nucleicos diana y/o los oligonucleótidos asociados con los reactivos de unión a componentes celulares con una enzima de restricción (p. ej., EcoRI) para crear un sitio de restricción sobresaliente. Puede usarse una ligasa (p. ej., ADN ligasa T4) para unir los dos fragmentos.
Determinación del número o la presencia de secuencias marcadoras moleculares únicas
[0287] En algunas formas de realización, los métodos descritos en el presente documento comprenden la determinación del número o la presencia de secuencias marcadoras moleculares únicas para cada identificador único, cada molécula diana de ácido nucleico y/o cada oligonucleótido reactivo de unión (por ejemplo, oligonucleótidos de anticuerpos). Por ejemplo, las lecturas de secuenciación se pueden usar para determinar el número de secuencias de etiquetas moleculares únicas para cada identificador único, cada molécula diana de ácido nucleico y/o cada oligonucleótido reactivo de unión. Como otro ejemplo, las lecturas de secuenciación se pueden usar para determinar la presencia o ausencia de una secuencia de marcador molecular (como una secuencia de marcador molecular asociada con un objetivo, un oligonucleótido de reactivo de unión, un oligonucleótido de anticuerpo, un oligonucleótido de indexación de muestra, un oligonucleótido de identificación celular). oligonucleótido, un oligonucleótido de partícula de control, un oligonucleótido de control, un oligonucleótido de determinación de interacción, etc. en las lecturas de secuenciación).
[0288] En algunas formas de realización, el número de secuencias de etiquetas moleculares únicas para cada identificador único, cada molécula objetivo de ácido nucleico y/o cada oligonucleótido reactivo de unión indica la cantidad de cada componente celular objetivo (p. ej., un antígeno objetivo o una proteína objetivo) y/o cada molécula diana de ácido nucleico en la muestra. En algunas formas de realización, la cantidad de un componente celular objetivo y la cantidad de sus moléculas objetivo de ácido nucleico correspondientes, por ejemplo, moléculas de ARNm, pueden compararse entre sí. En algunas formas de realización, se puede calcular la proporción de la cantidad de un componente celular objetivo y la cantidad de sus correspondientes moléculas objetivo de ácido nucleico, por ejemplo, moléculas de ARNm. Los objetivos del componente celular pueden ser, por ejemplo, marcadores de proteínas de la superficie celular. En algunas formas de realización, la relación entre el nivel de proteína de un marcador de proteína de superficie celular y el nivel del ARNm del marcador de proteína de superficie celular es bajo.
[0289] Los métodos descritos en este documento se pueden usar para una variedad de aplicaciones. Por ejemplo, los métodos descritos en el presente documento se pueden usar para el análisis del proteoma y/o del transcriptoma de una muestra. En algunas formas de realización, los métodos descritos en el presente documento se pueden usar para identificar un objetivo de componente celular y/o un objetivo de ácido nucleico, es decir, un biomarcador, en una muestra. En algunas formas de realización, el objetivo del componente celular y el objetivo del ácido nucleico se corresponden entre sí, es decir, el ácido nucleico diana codifica el componente celular objetivo. En algunas formas de realización, los métodos descritos en este documento se pueden usar para identificar objetivos de componentes celulares que tienen una relación deseada entre la cantidad del objetivo del componente celular y la cantidad de su molécula diana de ácido nucleico correspondiente en una muestra, por ejemplo, una molécula de ARNm. En algunas formas de realización, la relación es, o es aproximadamente, 0,001, 0,01, 0,1, 1, 10, 100, 1000, o un número o un rango entre cualquiera de los dos valores anteriores. En algunas formas de realización, la relación es al menos, o es como máximo, 0,001,0,01,0,1, 1, 10, 100 o 1000. En algunas formas de realización, los métodos descritos en el presente documento pueden usarse para identificar objetivos de componentes celulares en una muestra que la cantidad de su correspondiente molécula diana de ácido nucleico en la muestra es, o es aproximadamente, 1000, 100, 10, 5, 2 1, 0, o un número o un intervalo entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, los métodos descritos en el presente documento se pueden usar para identificar objetivos de componentes celulares en una muestra en la que la cantidad de su molécula diana de ácido nucleico correspondiente en la muestra es mayor o menor que 1000, 100, 10, 5, 21, o 0.
Composiciones y kits
[0290] Algunas formas de realización descritas en el presente documento proporcionan kits y composiciones para el análisis cuantitativo simultáneo de una pluralidad de componentes celulares (p. ej., proteínas) y/o una pluralidad de moléculas objetivo de ácido nucleico en una muestra. Los kits y composiciones pueden, en algunas formas de realización, comprender una pluralidad de reactivos de unión a componentes celulares (p. ej., una pluralidad de reactivos de unión a proteínas) cada uno conjugado con un oligonucleótido, en el que el oligonucleótido comprende un identificador único para el reactivo de unión a componentes celulares, y una pluralidad de sondas de oligonucleótidos, donde cada una de la pluralidad de sondas de oligonucleótidos comprende una región de unión objetivo, una secuencia de código de barras (p. ej., una secuencia de marcador molecular), donde la secuencia de código de barras es de un conjunto diverso de secuencias de código de barras únicas. En algunas formas de realización, cada uno de los oligonucleótidos puede comprender un marcador molecular, un marcador celular, un marcador de muestra o cualquier combinación de los mismos. En algunas formas de realización, cada uno de los oligonucleótidos puede comprender un enlazador. En algunas formas de realización, cada uno de los oligonucleótidos puede comprender un sitio de unión para una sonda de oligonucleótidos, como una cola de poli(A). Por ejemplo, la cola poli(A) puede ser, por ejemplo, oligodAis (no anclada a un soporte sólido) u oligoA18V (anclada a un soporte sólido). Los oligonucleótidos pueden comprender restos de ADN, restos de ARN o ambos.
[0291] En el presente documento se incluye una pluralidad de composiciones de indexación de muestras. Cada una de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras puede comprender dos o más reactivos de unión a componentes celulares. Cada uno de los dos o más reactivos de unión a componentes celulares se puede asociar con un oligonucleótido de indexación de muestra. Al menos uno de los dos o más reactivos de unión a componentes celulares puede ser capaz de unirse específicamente a al menos un objetivo de componente celular. El oligonucleótido de indexación de muestras puede comprender una secuencia de indexación de muestras para identificar el origen de una o más células de una muestra. Las secuencias de indexación de muestra de al menos dos composiciones de indexación de muestra de la pluralidad de composiciones de indexación de muestra pueden comprender secuencias diferentes.
[0292] En el presente documento se describen kits que comprenden composiciones de indexación de muestras para la identificación de células. En algunas formas de realización. Cada una de las dos composiciones de indexación de muestras comprende un reactivo de unión a componentes celulares (p. ej., un reactivo de unión a proteínas) asociado con un oligonucleótido de indexación de muestras, en el que el reactivo de unión a componentes celulares es capaz de unirse específicamente a al menos uno de uno o más componentes celulares. dianas (p. ej., una o más proteínas objetivo), en las que el oligonucleótido de indexación de muestras comprende una secuencia de indexación de muestras, y en las que las secuencias de indexación de muestras de las dos composiciones de indexación de muestras comprenden secuencias diferentes. En algunas formas de realización, el oligonucleótido de indexación de muestra comprende una secuencia marcadora molecular, un sitio de unión para un cebador universal o una combinación de los mismos.
[0293] En el presente documento se incluyen kits para la identificación de células. En algunas formas de realización, el kit comprende: dos o más composiciones de indexación de muestras. Cada una de las dos o más composiciones de indexación de muestras puede comprender un reactivo de unión de componentes celulares (por ejemplo, un reactivo de unión de antígenos) asociado con un oligonucleótido de indexación de muestras, donde el reactivo de unión de componentes celulares es capaz de unirse específicamente a al menos uno de uno o más objetivos de componentes celulares, en los que el oligonucleótido de indexación de muestras comprende una secuencia de indexación de muestras, y en los que las secuencias de indexación de muestras de las dos composiciones de indexación de muestras comprenden secuencias diferentes. En algunas formas de realización, el oligonucleótido de indexación de muestra comprende una secuencia marcadora molecular, un sitio de unión para un cebador universal o una combinación de los mismos. En el presente documento se describen kits para la identificación de multipletes. En algunas formas de realización, el kit comprende dos composiciones de indexación de muestras. Cada una de las dos composiciones de indexación de muestras puede comprender un reactivo de unión de componentes celulares (p. ej., un reactivo de unión de antígenos) asociado con un oligonucleótido de indexación de muestras, en el que el reactivo de unión de antígenos es capaz de unirse específicamente a al menos una de uno o más objetivos de componentes celulares (por ejemplo, dianas de antígeno), en el que el oligonucleótido de indexación de muestra comprende una secuencia de indexación de muestra, y en el que las secuencias de indexación de muestra de las dos composiciones de indexación de muestra comprenden secuencias diferentes.
[0294] Los identificadores únicos (u oligonucleótidos asociados con reactivos de unión a componentes celulares, tales como oligonucleótidos de reactivos de unión, oligonucleótidos de anticuerpos, oligonucleótidos de indexación de muestras, oligonucleótidos de identificación celular, oligonucleótidos de partículas de control, oligonucleótidos de control u oligonucleótidos de determinación de interacción) pueden tener cualquier longitud adecuada, por ejemplo, de aproximadamente 25 nucleótidos a aproximadamente 45 nucleótidos de largo. En algunas formas de realización, el identificador único puede tener una longitud que es, es aproximadamente, es menor que, es mayor que, 4 nucleótidos, 5 nucleótidos, 6 nucleótidos, 7 nucleótidos, 8 nucleótidos, 9 nucleótidos, 10 nucleótidos, 15 nucleótidos, 20 nucleótidos, 25 nucleótidos, 30 nucleótidos, 35 nucleótidos, 40 nucleótidos, 45 nucleótidos, 50 nucleótidos, 55 nucleótidos, 60 nucleótidos, 70 nucleótidos, 80 nucleótidos, 90 nucleótidos, 100 nucleótidos, 200 nucleótidos, o un rango que está entre dos cualesquiera de los valores anteriores.
[0295] En algunas formas de realización, los identificadores únicos se seleccionan de un conjunto diverso de identificadores únicos. El conjunto diverso de identificadores únicos puede comprender, o comprender aproximadamente, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 5000, o un número o un rango entre dos de estos valores, identificadores únicos diferentes. El conjunto diverso de identificadores únicos puede comprender al menos, o comprender como máximo, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000 o 5000, identificadores únicos diferentes. En algunas formas de realización, el conjunto de identificadores únicos está diseñado para tener una homología de secuencia mínima con las secuencias de ADN o ARN de la muestra que se va a analizar. En algunas formas de realización, las secuencias del conjunto de identificadores únicos son diferentes entre sí, o su complemento, en, o en aproximadamente, 1 nucleótido, 2 nucleótidos, 3 nucleótidos, 4 nucleótidos, 5 nucleótidos, 6 nucleótidos, 7 nucleótidos, 8 nucleótidos, 9 nucleótidos, 10 nucleótidos, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, las secuencias del conjunto de identificadores únicos son diferentes entre sí, o su complemento, en al menos, o como máximo, 1 nucleótido, 2 nucleótidos, 3 nucleótidos, 4 nucleótidos, 5 nucleótidos, 6 nucleótidos, 7 nucleótidos, 8 nucleótidos, 9 nucleótidos o 10 nucleótidos.
[0296] En algunas formas de realización, los identificadores únicos pueden comprender un sitio de unión para un cebador, como un cebador universal. En algunas formas de realización, los identificadores únicos pueden comprender al menos dos sitios de unión para un cebador, como un cebador universal. En algunas formas de realización, los identificadores únicos pueden comprender al menos tres sitios de unión para un cebador, como un cebador universal. Los cebadores se pueden usar para la amplificación de los identificadores únicos, por ejemplo, mediante amplificación por PCR. En algunas formas de realización, los cebadores pueden usarse para reacciones de PCR anidadas.
[0297] En esta descripción se contempla cualquier reactivo de unión a componentes celulares adecuado, como cualquier reactivo de unión a proteínas (p. ej., anticuerpos o fragmentos de los mismos, aptámeros, moléculas pequeñas, ligandos, péptidos, oligonucleótidos, etc., o cualquier combinación de los mismos). En algunas formas de realización, los reactivos de unión a componentes celulares pueden ser anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos recombinantes, anticuerpos monocatenarios (scAb) o fragmentos de los mismos, como Fab, Fv, etc. En algunas formas de realización, la pluralidad de reactivos de unión a proteínas puede comprender, o comprender aproximadamente, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 5000, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores, diferentes reactivos de unión a proteínas. En algunas formas de realización, la pluralidad de reactivos de unión a proteínas puede comprender al menos, o comprender como máximo, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000 o 5000, diferentes reactivos de unión a proteínas.
[0298] En algunas formas de realización, el oligonucleótido se conjuga con el reactivo de unión al componente celular a través de un enlazador. En algunas formas de realización, el oligonucleótido puede conjugarse covalentemente con el reactivo de unión a proteínas. En alguna forma de realización, el oligonucleótido se puede conjugar con el reactivo de unión a proteínas de forma no covalente. En algunas formas de realización, el enlazador puede comprender un grupo químico que une de forma reversible o irreversible el oligonucleótido a los reactivos de unión a proteínas. El grupo químico se puede conjugar con el enlazador, por ejemplo, a través de un grupo amino. En algunas formas de realización, el conector puede comprender un grupo químico que forma un enlace estable con otro grupo químico conjugado con el reactivo de unión a proteínas. Por ejemplo, el grupo químico puede ser un grupo fotoescindible UV, un enlace disulfuro, una estreptavidina, una biotina, una amina, etc. En algunas formas de realización, el grupo químico puede conjugarse con el reactivo de unión a proteínas mediante una amina primaria en un amino ácido, como la lisina, o el N-terminal. El oligonucleótido se puede conjugar con cualquier sitio adecuado del reactivo de unión a proteínas, siempre que no interfiera con la unión específica entre el reactivo de unión a proteínas y su proteína objetivo. En formas de realización en las que el reactivo de unión a proteínas es un anticuerpo, el oligonucleótido se puede conjugar con el anticuerpo en cualquier lugar que no sea el sitio de unión al antígeno, por ejemplo, la región Fc, el dominio Ch1, el dominio Ch2, el dominio Ch3, el dominio Cl, etc. En algunas formas de realización, cada reactivo de unión a proteínas se puede conjugar con una sola molécula de oligonucleótido. En algunas formas de realización, cada reactivo de unión a proteínas se puede conjugar con, o con aproximadamente, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 1000, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores, moléculas de oligonucleótidos, donde cada una de las moléculas de oligonucleótidos comprende el mismo identificador único. En algunas formas de realización, cada reactivo de unión a proteínas se puede conjugar con más de una molécula de oligonucleótido, por ejemplo, al menos o como máximo, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100 o 1000, moléculas de oligonucleótidos, en las que cada una de las moléculas de oligonucleótidos comprende el mismo identificador único.
[0299] En algunas formas de realización, la pluralidad de reactivos de unión a componentes celulares (p. ej., reactivos de unión a proteínas) son capaces de unirse específicamente a una pluralidad de objetivos de componentes celulares (p. ej., dianas de proteínas) en una muestra. La muestra puede ser, o comprender, una única célula, una pluralidad de células, una muestra de tejido, una muestra de tumor, una muestra de sangre o similares. En algunas formas de realización, la pluralidad de objetivos de componentes celulares comprende una proteína de la superficie celular, un marcador celular, un receptor de células B, un receptor de células T, un anticuerpo, un complejo principal de histocompatibilidad, un antígeno tumoral, un receptor o cualquier combinación de los mismos. En algunas formas de realización, la pluralidad de componentes celulares objetivo puede comprender proteínas intracelulares. En algunas formas de realización, la pluralidad de objetivos de componentes celulares puede comprender proteínas intracelulares. En algunas formas de realización, la pluralidad de objetivos de componentes celulares puede ser, o ser aproximadamente, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 %, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores de todos los objetivos de componentes celulares (p. ej., proteínas expresadas o podrían expresarse) en un organismo. En algunas formas de realización, la pluralidad de objetivos de componentes celulares puede ser al menos, o como máximo, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de todos los objetivos de componentes celulares (p. ej., proteínas expresadas o que podrían expresarse) en un organismo. En algunas formas de realización, la pluralidad de objetivos de componentes celulares puede comprender, o comprender aproximadamente, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 1000, 10000, o un número o un rango entre dos cualesquiera de estos valores, objetivos de diferentes componentes celulares. En algunas formas de realización, la pluralidad de objetivos de componentes celulares puede comprender al menos, o comprender como máximo, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 1000 o 10000 objetivos de componentes celulares diferentes.
Indexación de muestras usando reactivo de unión de componentes celulares conjugados con oligonucleótidos
[0300] En el presente documento se describen métodos para la identificación de muestras. En algunas formas de realización, el método comprende: poner en contacto una o más células de cada una de una pluralidad de muestras con una composición de indexación de muestras de una pluralidad de composiciones de indexación de muestras, donde cada una o más células comprende uno o más objetivos de componentes celulares, donde cada una de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras comprende un reactivo de unión de componentes celulares asociado con un oligonucleótido de indexación de muestras, donde el reactivo de unión de componentes celulares es capaz de unirse específicamente a al menos una de las uno o más objetivos de componentes celulares, donde el oligonucleótido de indexación de muestras comprende una secuencia de indexación de muestras, y en el que las secuencias de indexación de muestras de al menos dos composiciones de indexación de muestras de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras comprenden secuencias diferentes; eliminar las composiciones de indexación de muestras no unidas de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras; codificar con barras (p. ej., codificar con barras estocásticamente) los oligonucleótidos de indexación de muestras utilizando una pluralidad de códigos de barras (p. ej., códigos de barras estocásticos) para crear una pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras; obtener datos de secuenciación de la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras; e identificar el origen de la muestra de al menos una célula de una o más células basándose en la secuencia de indexación de muestras de al menos un oligonucleótido de indexación de muestras con código de barras de la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras.
[0301] En algunas formas de realización, la codificación de barras de los oligonucleótidos de indexación de muestras usando la pluralidad de códigos de barras comprende: poner en contacto la pluralidad de códigos de barras con los oligonucleótidos de indexación de muestras para generar códigos de barras hibridados con los oligonucleótidos de indexación de muestras; y extender los códigos de barras hibridados a los oligonucleótidos de indexación de muestras para generar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras. La extensión de los códigos de barras puede comprender la extensión de los códigos de barras usando una ADN polimerasa para generar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras. La extensión de los códigos de barras puede comprender la extensión de los códigos de barras utilizando una transcriptasa inversa para generar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras.
[0302] Un oligonucleótido conjugado con un anticuerpo, un oligonucleótido para la conjugación con un anticuerpo, o un oligonucleótido previamente conjugado con un anticuerpo se denomina en el presente documento oligonucleótido de anticuerpo ("AbOligo"). Los oligonucleótidos de anticuerpos en el contexto de la indexación de muestras se denominan en este documento oligonucleótidos de indexación de muestras. Un anticuerpo conjugado con un oligonucleótido de anticuerpo se denomina aquí anticuerpo caliente o anticuerpo oligonucleótido. Un anticuerpo no conjugado con un oligonucleótido de anticuerpo se denomina aquí anticuerpo frío o anticuerpo sin oligonucleótido. Un oligonucleótido conjugado con un reactivo de unión (p. ej., un reactivo de unión a proteínas), un oligonucleótido para la conjugación con un reactivo de unión o un oligonucleótido previamente conjugado con un reactivo de unión se denomina aquí oligonucleótido reactivo. Los oligonucleótidos reactivos en el contexto de la indexación de muestras se denominan en este documento oligonucleótidos de indexación de muestras. Un reactivo de unión conjugado con un oligonucleótido de anticuerpo se denomina aquí reactivo de unión caliente o reactivo de unión de oligonucleótidos. Un reactivo de unión no conjugado con un oligonucleótido de anticuerpo se denomina aquí reactivo de unión en frío o reactivo de unión libre de oligonucleótidos.
[0303] La FIG. 7 muestra una ilustración esquemática de un flujo de trabajo ejemplar que utiliza reactivos de unión a componentes celulares asociados a oligonucleótidos para la indexación de muestras. En algunas formas de realización, se proporciona una pluralidad de composiciones 705a, 705b, etc., cada una de las cuales comprende un reactivo de unión. El reactivo de unión puede ser un reactivo de unión a proteínas, tal como un anticuerpo. El reactivo de unión al componente celular puede comprender un anticuerpo, un tetrámero, un aptámero, un armazón proteico o una combinación de los mismos. Los reactivos de unión de la pluralidad de composiciones 705a, 705b pueden unirse a un objetivo de componente celular idéntico. Por ejemplo, los reactivos de unión de la pluralidad de composiciones 705, 705b pueden ser idénticos (excepto los oligonucleótidos de indexación de muestras asociados con los reactivos de unión).
[0304] Las diferentes composiciones pueden incluir reactivos de unión conjugados con oligonucleótidos de indexación de muestra con diferentes secuencias de indexación de muestra. El número de composiciones diferentes puede ser diferente en diferentes implementaciones. En algunas formas de realización, el número de composiciones diferentes puede ser, o ser aproximadamente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, el número de composiciones diferentes puede ser al menos, o como máximo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 o 10000.
[0305] En algunas formas de realización, los oligonucleótidos de indexación de muestra de los reactivos de unión en una composición pueden incluir una secuencia de indexación de muestra idéntica. Los oligonucleótidos de indexación de muestra de los reactivos de unión en una composición pueden no ser idénticos. En algunas formas de realización, el porcentaje de oligonucleótidos de indexación de muestra de reactivos de unión en una composición con una secuencia de indexación de muestra idéntica puede ser, o ser aproximadamente, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,9 %, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, el porcentaje de oligonucleótidos de indexación de muestra de reactivos de unión en una composición con una secuencia de indexación de muestra idéntica puede ser al menos, o como máximo, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 99,9 %.
[0306] Las composiciones 705a y 705b se pueden usar para etiquetar muestras de diferentes muestras. Por ejemplo, los oligonucleótidos de indexación de muestras del reactivo de unión de componentes celulares en la composición 705a pueden tener una secuencia de indexación de muestras y se pueden usar para marcar células 710a, que se muestran como círculos negros, en una muestra 707a, como una muestra de un paciente. Los oligonucleótidos de indexación de muestras de los reactivos de unión de componentes celulares en la composición 705b pueden tener otra secuencia de indexación de muestras y se pueden usar para marcar las células 710b, que se muestran como círculos sombreados, en una muestra 707b, como una muestra de otro paciente u otra muestra de el mismo paciente Los reactivos de unión de componentes celulares pueden unirse específicamente a objetivos de componentes celulares o proteínas en la superficie celular, como un marcador celular, un receptor de células B, un receptor de células T, un anticuerpo, un complejo principal de histocompatibilidad, un antígeno tumoral, un receptor, o cualquier combinación de los mismos. Los reactivos de unión de componentes celulares no unidos pueden eliminarse, por ejemplo, lavando las células con un tampón.
[0307] Las células con los reactivos de unión de componentes celulares pueden separarse luego en una pluralidad de compartimentos, como una matriz de micropocillos, en la que un solo compartimento 715a, 715b tiene el tamaño para adaptarse a una sola célula 710a y una sola perla 720a o un solo célula 710b y una sola perla 720b. Cada perla 720a, 720b puede comprender una pluralidad de sondas de oligonucleótidos, que pueden comprender una etiqueta celular que es común a todas las sondas de oligonucleótidos en una perla, y secuencias de etiquetas moleculares. En algunas formas de realización, cada sonda de oligonucleótidos puede comprender una región de unión a la diana, por ejemplo, una secuencia poli(dT). Los oligonucleótidos de indexación de muestra 725a conjugados con el reactivo de unión al componente celular de la composición 705a pueden configurarse para ser (o pueden ser) separables o no separables del reactivo de unión del componente celular. Los oligonucleótidos de indexación de muestra 725a conjugados con el reactivo de unión al componente celular de la composición 705a pueden separarse del reactivo de unión al componente celular utilizando medios químicos, ópticos u otros. Los oligonucleótidos de indexación de muestra 725b conjugados con el reactivo de unión al componente celular de la composición 705b pueden configurarse para ser (o pueden ser) separables o no separables del reactivo de unión del componente celular. Los oligonucleótidos de indexación de muestra 725b conjugados con el reactivo de unión al componente celular de la composición 705b se pueden separar del reactivo de unión al componente celular utilizando medios químicos, ópticos u otros.
[0308] La célula 710a se puede lisar para liberar ácidos nucleicos dentro de la célula 710a, como el ADN genómico o el ARNm celular 730a. La célula lisada 735a se muestra como un círculo de puntos. El ARNm celular 730a, los oligonucleótidos de indexación de muestras 725a o ambos pueden ser capturados por las sondas de oligonucleótidos en la perla 720a, por ejemplo, hibridando con la secuencia poli(dT). Se puede usar una transcriptasa inversa para extender las sondas de oligonucleótidos hibridadas con el ARNm celular 730a y los oligonucleótidos 725a usando el ARNm celular 730a y los oligonucleótidos 725a como moldes. Los productos de extensión producidos por la transcriptasa inversa pueden ser objeto de amplificación y secuenciación.
[0309] De manera similar, la célula 710b se puede lisar para liberar ácidos nucleicos dentro de la célula 710b, como el ADN genómico o el ARNm celular 730b. La célula lisada 735b se muestra como un círculo de puntos. El ARNm celular 730b, los oligonucleótidos de indexación de muestras 725b, o ambos, pueden ser capturados por las sondas de oligonucleótidos en la perla 720b, por ejemplo, hibridando con la secuencia poli(dT). Se puede usar una transcriptasa inversa para extender las sondas de oligonucleótidos hibridadas con el ARNm celular 730b y los oligonucleótidos 725b usando el ARNm celular 730b y los oligonucleótidos 725b como moldes. Los productos de extensión producidos por la transcriptasa inversa pueden ser objeto de amplificación y secuenciación.
[0310] Las lecturas de secuenciación pueden estar sujetas a la desmultiplexación de etiquetas celulares, etiquetas moleculares, identidades génicas e identidades de muestra (p. ej., en términos de secuencias de indexación de muestra de oligonucleótidos de indexación de muestra 725a y 725b). La demultiplexación de etiquetas celulares, etiquetas moleculares e identidades génicas puede dar lugar a una representación digital de la expresión génica de cada célula individual de la muestra. La desmultiplexación de etiquetas celulares, etiquetas moleculares e identidades de muestras, utilizando secuencias de indexación de muestras de oligonucleótidos de indexación de muestras, puede usarse para determinar el origen de una muestra.
[0311] En algunas formas de realización, los reactivos de unión a componente celular contra reactivos de unión a componente celular en la superficie celular se pueden conjugar con una biblioteca de oligonucleótidos de indexación de muestra únicos para permitir que las células conserven la identidad de la muestra. Por ejemplo, los anticuerpos contra los marcadores de la superficie celular se pueden conjugar con una biblioteca de oligonucleótidos de indexación de muestras únicos para permitir que las células conserven la identidad de la muestra. Esto permitirá que se carguen varias muestras en el mismo cartucho Rhapsody™, ya que la información relativa a la fuente de la muestra se conserva durante la preparación y la secuenciación de la biblioteca. La indexación de muestras puede permitir que varias muestras se ejecuten juntas en un solo experimento, simplificando y acortando el tiempo del experimento y eliminando el efecto de lote.
[0312] En este documento se describen métodos para la identificación de muestras. En algunas formas de realización, el método comprende: poner en contacto una o más células de cada una de una pluralidad de muestras con una composición de indexación de muestras de una pluralidad de composiciones de indexación de muestras, donde cada una o más células comprende uno o más objetivos de componentes celulares, donde cada una de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras comprende un reactivo de unión de componentes celulares asociado con un oligonucleótido de indexación de muestras, donde el reactivo de unión de componentes celulares es capaz de unirse específicamente a al menos una de las uno o más objetivos de componentes celulares, donde el oligonucleótido de indexación de muestras comprende una secuencia de indexación de muestras, y en el que las secuencias de indexación de muestras de al menos dos composiciones de indexación de muestras de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras comprenden secuencias diferentes; eliminar las composiciones de indexación de muestras no unidas de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras. El método puede incluir la codificación de barras (p. ej., codificación estocástica de barras) de los oligonucleótidos de indexación de muestras usando una pluralidad de códigos de barras (p. ej., códigos de barras estocásticos) para crear una pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras; obtener datos de secuenciación de la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras; e identificar el origen de la muestra de al menos una célula de una o más células basándose en la secuencia de indexación de muestras de al menos un oligonucleótido de indexación de muestras con código de barras de la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras.
[0313] En algunas formas de realización, el método para la identificación de muestras comprende: poner en contacto una o más células de cada una de una pluralidad de muestras con una composición de indexación de muestras de una pluralidad de composiciones de indexación de muestras, donde cada una o más células comprende uno o más objetivos de componentes celulares, donde cada una de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras comprende un reactivo de unión de componentes celulares asociado con un oligonucleótido de indexación de muestras, donde el reactivo de unión de componentes celulares es capaz de unirse específicamente a al menos una de las uno o más objetivos de componentes celulares, en el que el oligonucleótido de indexación de muestras comprende una secuencia de indexación de muestras, y en el que las secuencias de indexación de muestras de al menos dos composiciones de indexación de muestras de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras comprenden secuencias diferentes; eliminar las composiciones de indexación de muestras no unidas de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras; e identificar el origen de la muestra de al menos una célula de una o más células basándose en la secuencia de indexación de muestra de al menos un oligonucleótido de indexación de muestra de la pluralidad de composiciones de indexación de muestra.
[0314] En algunas formas de realización, identificar el origen de la muestra de al menos una célula comprende: códigos de barras (por ejemplo, códigos de barras estocásticos) oligonucleótidos de indexación de muestras de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras usando una pluralidad de códigos de barras (por ejemplo, códigos de barras estocásticos) para crear una pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras; obtener datos de secuenciación de la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras; e identificar el origen de la muestra de la célula basándose en la secuencia de indexación de muestras de al menos un oligonucleótido de indexación de muestras con código de barras de la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras. En algunas formas de realización, la codificación de barras de los oligonucleótidos de indexación de muestras utilizando la pluralidad de códigos de barras para crear la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con códigos de barras comprende la codificación de barras estocástica de los oligonucleótidos de indexación de muestras utilizando una pluralidad de códigos de barras estocásticos para crear una pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con códigos de barras estocásticos.
[0315] En algunas formas de realización, identificar el origen de la muestra de al menos una célula puede comprender identificar la presencia o ausencia de la secuencia de indexación de muestra de al menos un oligonucleótido de indexación de muestra de la pluralidad de composiciones de indexación de muestra. Identificar la presencia o ausencia de la secuencia de indexación de muestra puede comprender: replicar el al menos un oligonucleótido de indexación de muestra para generar una pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestra replicados; obtener datos de secuenciación de la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras replicadas; e identificar el origen de la muestra de la célula basándose en la secuencia de indexación de muestra de un oligonucleótido de indexación de muestra replicado de la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestra que corresponden al menos un oligonucleótido de indexación de muestra con código de barras en los datos de secuenciación.
[0316] En algunas formas de realización, replicar al menos un oligonucleótido de indexación de muestra para generar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestra replicados comprende: antes de replicar al menos un oligonucleótido de indexación de muestra con código de barras, ligar un adaptador de replicación a al menos un oligonucleótido de indexación de muestra con código de barras. oligonucleótido. La replicación del al menos un oligonucleótido de indexación de muestras con código de barras puede comprender la replicación del al menos un oligonucleótido de indexación de muestras con código de barras usando el adaptador de replicación ligado al al menos un oligonucleótido de indexación de muestras con código de barras para generar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras replicados.
[0317] En algunas formas de realización, replicar al menos un oligonucleótido de indexación de muestra para generar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestra replicados comprende: antes de replicar al menos un oligonucleótido de indexación de muestra con código de barras, poner en contacto una sonda de captura con al menos un oligonucleótido de indexación de muestra para generar una sonda de captura hibridada con el oligonucleótido de indexación de muestra; y extender la sonda de captura hibridada con el oligonucleótido de indexación de muestra para generar un oligonucleótido de indexación de muestra asociado con la sonda de captura. La replicación del al menos un oligonucleótido de indexación de muestras puede comprender la replicación del oligonucleótido de indexación de muestras asociado con la sonda de captura para generar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras replicados.
Sobrecarga de células e identificación de multipletes
[0318] También se describen en este documento métodos, kits y sistemas para identificar sobrecarga de células y multipletes. Dichos métodos, kits y sistemas se pueden usar en, o en combinación con, cualquier método, kit y sistema adecuado descrito en el presente documento, por ejemplo, los métodos, kits y sistemas para medir el nivel de expresión del componente celular (como el nivel de expresión de proteína) usando los reactivos de unión a componente celular asociados con oligonucleótidos.
[0319] Utilizando la tecnología actual de carga de células, cuando se cargan alrededor de 20000 células en un cartucho o matriz de micropocillos con ~60000 micropocillos, la cantidad de micropocillos o gotitas con dos o más células (denominadas dobletes o multipletes) puede ser mínima. Sin embargo, cuando aumenta la cantidad de células cargadas, la cantidad de micropocillos o gotitas con múltiples células puede aumentar significativamente. Por ejemplo, cuando se cargan alrededor de 50000 células en alrededor de 60000 micropocillos de un cartucho o matriz de micropocillos, el porcentaje de micropocillos con múltiples células puede ser bastante alto, como 11-14 %. Tal carga de un gran número de células en micropocillos puede denominarse sobrecarga de células. Sin embargo, si las células se dividen en varios grupos (p. ej., 5) y las células de cada grupo se etiquetan con oligonucleótidos de indexación de muestras con distintas secuencias de indexación de muestras, una etiqueta de célula (p. ej., una etiqueta de célula de un código de barras, como un código de barras estocástico) asociado con dos o más secuencias de indexación de muestras puede identificarse en los datos de secuenciación y eliminarse del procesamiento posterior. En algunas formas de realización, las células se dividen en una gran cantidad de grupos (p. ej., 10000), y las células de cada grupo se etiquetan con oligonucleótidos de indexación de muestras con distintas secuencias de indexación de muestras, se puede etiquetar una muestra asociada con dos o más secuencias de indexación de muestras identificadas en los datos de secuenciación y eliminados del procesamiento posterior. En algunas formas de realización, diferentes células se marcan con oligonucleótidos de identificación celular con distintas secuencias de identificación celular, una secuencia de identificación celular asociada con dos o más oligonucleótidos de identificación celular puede identificarse en los datos de secuenciación y eliminarse del procesamiento posterior. Dicho mayor número de células puede cargarse en micropocillos en relación con el número de micropocillos en un cartucho o matriz de micropocillos.
[0320] En este documento se describen métodos para la identificación de muestras. En algunas formas de realización, el método comprende: poner en contacto una primera pluralidad de células y una segunda pluralidad de células con dos composiciones de indexación de muestra, respectivamente, donde cada una de la primera pluralidad de células y cada una de la segunda pluralidad de células comprenden uno o más componentes celulares, donde cada una de las dos composiciones de indexación de muestras comprende un reactivo de unión de componentes celulares asociado con un oligonucleótido de indexación de muestras, donde el reactivo de unión de componentes celulares es capaz de unirse específicamente a al menos uno de uno o más componentes celulares, donde el oligonucleótido de indexación de muestras comprende una secuencia de indexación de muestra, y donde las secuencias de indexación de muestra de las dos composiciones de indexación de muestra comprenden secuencias diferentes; codificar con barras los oligonucleótidos de indexación de muestras utilizando una pluralidad de códigos de barras para crear una pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con códigos de barras, en el que cada uno de la pluralidad de códigos de barras comprende una secuencia de etiquetas de células, una secuencia de códigos de barras (p. ej., una secuencia de etiquetas moleculares) y un objetivo de unión región, en la que las secuencias de códigos de barras de al menos dos códigos de barras de la pluralidad de códigos de barras comprenden secuencias diferentes, y en la que al menos dos códigos de barras de la pluralidad de códigos de barras comprenden una secuencia de etiqueta de célula idéntica; obtener datos de secuenciación de la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras; e identificar una o más secuencias de marcadores celulares, cada una de las cuales está asociada con dos o más secuencias de indexación de muestra en los datos de secuenciación obtenidos; y eliminar los datos de secuenciación asociados con una o más secuencias de etiquetas de células que están asociadas con dos o más secuencias de indexación de muestra de los datos de secuenciación obtenidos y/o excluir los datos de secuenciación asociados con una o más secuencias de etiquetas de células que están asociadas con dos o más secuencias de indexación de muestras de análisis posteriores (p. ej., perfiles de ARNm de una sola célula o análisis de transcriptoma completo). En algunas formas de realización, el oligonucleótido de indexación de muestra comprende una secuencia de código de barras (p. ej., una secuencia de marcador molecular), un sitio de unión para un cebador universal o una combinación de los mismos.
[0321] Por ejemplo, el método se puede usar para cargar 50000 o más células (en comparación con 10000-20000 células) usando la indexación de muestras. La indexación de muestras puede utilizar reactivos de unión de componentes celulares conjugados con oligonucleótidos (p. ej., anticuerpos) o reactivos de unión de componentes celulares contra un componente celular (p. ej., un marcador proteico universal) para etiquetar células de diferentes muestras con un índice de muestra único. Cuando dos o más células de diferentes muestras, dos o más células de diferentes poblaciones de células de una muestra, o dos o más células de una muestra, se capturan en el mismo micropocillo o gotita, la "célula" combinada (o el contenido de la dos o más células) se pueden asociar con oligonucleótidos de indexación de muestras con diferentes secuencias de indexación de muestras (u oligonucleótidos de identificación de células con diferentes secuencias de identificación de células). El número de diferentes poblaciones de células puede ser diferente en diferentes implementaciones. En algunas formas de realización, el número de poblaciones diferentes puede ser, o ser aproximadamente, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, o un número o un rango entre cualesquiera dos de estos valores. En algunas formas de realización, el número de poblaciones diferentes puede ser al menos, o como máximo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100. El número, o el número medio, de células en cada población puede ser diferente en diferentes implementaciones. En algunas formas de realización, el número, o el número medio, de células en cada población puede ser, o ser aproximadamente, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, el número, o el número promedio, de células en cada población puede ser al menos, o como máximo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100. Cuando el número, o el número promedio, de células en cada población es lo suficientemente pequeño (p. ej., igual o menor que 50, 25, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 células por población), la composición de indexación de muestras para la sobrecarga de células y la identificación de multipletes se puede denominar composiciones de identificación de células.
[0322] Las células de una muestra se pueden dividir en múltiples poblaciones dividiendo las células de la muestra en alícuotas en las múltiples poblaciones. Una "célula" asociada con más de una secuencia de indexación de muestra en los datos de secuenciación puede identificarse como un "multiplete" basado en dos o más secuencias de indexación de muestra asociadas con una secuencia de etiqueta de célula (p. ej., una secuencia de etiqueta de célula de un código de barras, como como un código de barras estocástico) en los datos de secuenciación. Los datos de secuenciación de una "célula" combinada también se denominan aquí multiplete. Un multiplete puede ser un doblete, un triplete, un cuarteto, un quinteto, un sexteto, un septeto, un octeto, un noneto o cualquier combinación de los mismos. Un multiplete puede ser cualquier n-pleto. En algunas formas de realización, n es, o es aproximadamente, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o un rango entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, n es al menos, o es como máximo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20.
[0323] Al determinar los perfiles de expresión de células individuales, dos células pueden identificarse como una célula y los perfiles de expresión de las dos células pueden identificarse como el perfil de expresión para una célula (denominado perfil de expresión doble). Por ejemplo, cuando se determinan los perfiles de expresión de dos células utilizando códigos de barras (p. ej., códigos de barras estocásticos), las moléculas de ARNm de las dos células se pueden asociar con códigos de barras que tienen la misma etiqueta celular. Como otro ejemplo, dos células pueden estar asociadas con una partícula (por ejemplo, una perla). La partícula puede incluir códigos de barras con la misma etiqueta de célula. Después de lisar las células, las moléculas de ARNm en las dos células se pueden asociar con los códigos de barras de la partícula, por lo tanto, la misma etiqueta celular. Los perfiles de expresión de doblete pueden sesgar la interpretación de los perfiles de expresión.
[0324] Un doblete puede referirse a una "célula" combinada asociada con dos oligonucleótidos de indexación de muestra con diferentes secuencias de indexación de muestra. Un doblete también puede referirse a una "célula" combinada asociada con oligonucleótidos de indexación de muestra con dos secuencias de indexación de muestra. Puede ocurrir un doblete cuando dos células asociadas con dos oligonucleótidos de indexación de muestra de diferentes secuencias (o dos o más células asociadas con oligonucleótidos de indexación de muestra con dos secuencias de indexación de muestra diferentes) se capturan en el mismo micropocillo o gota, la "célula" combinada puede ser asociada con dos oligonucleótidos de indexación de muestra con diferentes secuencias de indexación de muestra. Un triplete puede referirse a una "célula" combinada asociada con tres oligonucleótidos de indexación de muestra, todos con diferentes secuencias de indexación de muestra, o una "célula" combinada asociada con oligonucleótidos de indexación de muestra con tres secuencias de indexación de muestra diferentes. Un cuarteto puede referirse a una "célula" combinada asociada con cuatro oligonucleótidos de indexación de muestra, todos con diferentes secuencias de indexación de muestra, o una "célula" combinada asociada con oligonucleótidos de indexación de muestra con cuatro secuencias de indexación de muestra diferentes. Un quinteto puede referirse a una "célula" combinada asociada con cinco oligonucleótidos de indexación de muestra, todos con diferentes secuencias de indexación de muestra, o una "célula" combinada asociada con oligonucleótidos de indexación de muestra con cinco secuencias de indexación de muestra diferentes. Un sexteto puede referirse a una "célula" combinada asociada con seis oligonucleótidos de indexación de muestra, todos con diferentes secuencias de indexación de muestra, o una "célula" combinada asociada con oligonucleótidos de indexación de muestra con seis secuencias de indexación de muestra diferentes. Un septeto puede referirse a una "célula" combinada asociada con siete oligonucleótidos de indexación de muestra, todos con diferentes secuencias de indexación de muestra, o una "célula" combinada asociada con oligonucleótidos de indexación de muestra con siete secuencias de indexación de muestra diferentes. Un octeto puede referirse a una "célula" combinada asociada con ocho oligonucleótidos de indexación de muestra, todos con diferentes secuencias de indexación de muestra, o una "célula" combinada asociada con oligonucleótidos de indexación de muestra con ocho secuencias de indexación de muestra diferentes. Un noneto puede referirse a una "célula" combinada asociada con nueve oligonucleótidos de indexación de muestra, todos con diferentes secuencias de indexación de muestra, o una "célula" combinada asociada con oligonucleótidos de indexación de muestra con nueve secuencias de indexación de muestra diferentes. Un multiplete puede ocurrir cuando dos o más células asociadas con dos o más oligonucleótidos de indexación de muestras de diferentes secuencias (o dos o más células asociadas con oligonucleótidos de indexación de muestras con dos o más secuencias de indexación de muestras diferentes) se capturan en el mismo micropocillo o gota, la "célula" combinada se puede asociar con oligonucleótidos de indexación de muestra con dos o más secuencias de indexación de muestra diferentes.
[0325] Como otro ejemplo, el método se puede usar para la identificación de multipletes, ya sea en el contexto de la sobrecarga de muestras o en el contexto de cargar células en micropocillos de una matriz de micropocillos o generar gotitas que contienen células. Cuando se cargan dos o más células en un micropocillo, los datos resultantes de la "célula" combinada (o el contenido de las dos o más células) es un multiplete con un perfil de expresión génica aberrante. Mediante el uso de la indexación de muestras, uno puede reconocer algunos de estos multipletes buscando etiquetas de células que estén asociadas o asignadas a dos o más oligonucleótidos de indexación de muestras con diferentes secuencias de indexación de muestras (u oligonucleótidos de indexación de muestras con dos o más oligonucleótidos de indexación de muestras con dos o más oligonucleótidos de secuencias de indexación de muestras). Con la secuencia de indexación de muestras, los métodos descritos en el presente documento se pueden usar para la identificación de multipletes (ya sea en el contexto de sobrecarga de muestras o no, o en el contexto de cargar células en micropocillos de una matriz de micropocillos o generar gotitas que contienen células). En algunas formas de realización, el método comprende: poner en contacto una primera pluralidad de células y una segunda pluralidad de células con dos composiciones de indexación de muestra, respectivamente, donde cada una de la primera pluralidad de células y cada una de la segunda pluralidad de células comprenden uno o más componentes celulares, donde cada una de las dos composiciones de indexación de muestras comprende un reactivo de unión de componentes celulares asociado con un oligonucleótido de indexación de muestras, donde el reactivo de unión de componentes celulares es capaz de unirse específicamente a al menos uno de uno o más componentes celulares, donde el oligonucleótido de indexación de muestras comprende una secuencia de indexación de muestra, y donde las secuencias de indexación de muestra de las dos composiciones de indexación de muestra comprenden secuencias diferentes; codificar con barras los oligonucleótidos de indexación de muestras utilizando una pluralidad de códigos de barras para crear una pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con códigos de barras, en el que cada uno de la pluralidad de códigos de barras comprende una secuencia de etiquetas de células, una secuencia de códigos de barras (p. ej., una secuencia de etiquetas moleculares) y un objetivo de unión región, en la que las secuencias de códigos de barras de al menos dos códigos de barras de la pluralidad de códigos de barras comprenden secuencias diferentes, y en la que al menos dos códigos de barras de la pluralidad de códigos de barras comprenden una secuencia de etiqueta de célula idéntica; obtener datos de secuenciación de la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras; e identificar una o más secuencias de etiquetas de células multiplete, cada una de las cuales está asociada con dos o más secuencias de indexación de muestra en los datos de secuenciación obtenidos.
[0326] El número de células que se pueden cargar en micropocillos de un cartucho de micropocillos o en gotitas generadas usando un dispositivo de microfluidos puede estar limitado por la tasa de multiplete. Cargar más células puede generar más multipletes, que pueden ser difíciles de identificar y crear ruido en los datos de una sola célula. Con la indexación de muestras, el método se puede utilizar para etiquetar o identificar multipletes con mayor precisión y eliminar los multipletes de los datos de secuenciación o análisis posteriores. Ser capaz de identificar multipletes con mayor confianza puede aumentar la tolerancia del usuario a la tasa de multipletes y cargar más células en cada cartucho de micropocillos o generar gotas con al menos una célula cada una.
[0327] En algunas formas de realización, poner en contacto la primera pluralidad de células y la segunda pluralidad de células con las dos composiciones de indexación de muestras comprende respectivamente: poner en contacto la primera pluralidad de células con una primera composición de indexación de muestras de las dos composiciones de indexación de muestras; y poner en contacto la primera pluralidad de células con una segunda composición de indexación de muestra de las dos composiciones de indexación de muestra. El número de pluralidades de células y el número de pluralidades de composiciones de indexación de muestras pueden ser diferentes en diferentes implementaciones. En algunas formas de realización, el número de pluralidades de células y/o composiciones de indexación de muestras puede ser, o ser aproximadamente, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 10000, 100000, 1000000, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, el número de pluralidades de células y/o composiciones de indexación de muestras puede ser al menos, o como máximo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 10000, 100000 o 1000000. El número de células puede ser diferente en diferentes implementaciones. En algunas formas de realización, el número, o el número medio, de células puede ser, o ser aproximadamente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 10000, 100000, 1000000, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, el número, o el número promedio, o las células pueden ser al menos, o como máximo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 10000, 100000 o 1000000.
[0328] En algunas formas de realización, el método comprende: eliminar las composiciones de indexación de muestras no unidas de las dos composiciones de indexación de muestras. La eliminación de las composiciones de indexación de muestras no unidas puede comprender el lavado de las células de la primera pluralidad de células y la segunda pluralidad de células con un tampón de lavado. La eliminación de las composiciones de indexación de muestras no unidas puede comprender la selección de células unidas a al menos un reactivo de unión de componentes celulares de las dos composiciones de indexación de muestras usando citometría de flujo. En algunas formas de realización, el método comprende: lisar una o más células de cada una de la pluralidad de muestras.
[0329] En algunas formas de realización, el oligonucleótido de indexación de la muestra está configurado para ser (o puede ser) separable o no separable del reactivo de unión al componente celular. El método puede comprender separar el oligonucleótido de indexación de la muestra del reactivo de unión al componente celular. Separar el oligonucleótido de indexación de la muestra puede comprender separar el oligonucleótido de indexación de la muestra del reactivo de unión al componente celular mediante fotoescisión UV, tratamiento químico (p. ej., utilizando un reactivo reductor, como ditiotreitol), calentamiento, tratamiento enzimático o cualquier combinación de los mismos.
[0330] En algunas formas de realización, la codificación de barras de los oligonucleótidos de indexación de muestras utilizando la pluralidad de códigos de barras comprende: poner en contacto la pluralidad de códigos de barras con los oligonucleótidos de indexación de muestras para generar códigos de barras hibridados con los oligonucleótidos de indexación de muestras; y extender los códigos de barras hibridados a los oligonucleótidos de indexación de muestras para generar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras. La extensión de los códigos de barras puede comprender la extensión de los códigos de barras usando una ADN polimerasa para generar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras. La extensión de los códigos de barras puede comprender la extensión de los códigos de barras utilizando una transcriptasa inversa para generar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras.
[0331] En algunas formas de realización, el método comprende: amplificar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestra con código de barras para producir una pluralidad de amplicones. La amplificación de la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras puede comprender amplificar, usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), al menos una parte de la secuencia del código de barras (p. ej., la secuencia del marcador molecular) y al menos una parte del oligonucleótido de indexación de la muestra. En algunas formas de realización, obtener los datos de secuenciación de la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras puede comprender obtener datos de secuenciación de la pluralidad de amplicones. La obtención de los datos de secuenciación comprende la secuenciación de al menos una parte de la secuencia del código de barras y al menos una parte del oligonucleótido de indexación de la muestra. En algunas formas de realización, identificar el origen de la muestra de al menos una célula comprende identificar el origen de la muestra de la pluralidad de dianas con código de barras basándose en la secuencia de indexación de muestra del al menos un oligonucleótido de indexación de muestra con código de barras.
[0332] En algunas formas de realización, la codificación de barras de los oligonucleótidos de indexación de muestra usando la pluralidad de códigos de barras para crear la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestra con código de barras comprende la codificación de barras estocástica de los oligonucleótidos de indexación de muestra usando una pluralidad de códigos de barras estocásticos para crear una pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestra con código de barras estocástico.
[0333] En algunas formas de realización, el método incluye: codificar en barras una pluralidad de objetivos de la célula usando la pluralidad de códigos de barras para crear una pluralidad de objetivos con código de barras, donde cada uno de la pluralidad de códigos de barras comprende una secuencia de etiquetas de célula, y donde al menos dos de los códigos de barras de la pluralidad de códigos de barras comprenden una secuencia de etiquetas de célula idéntica; y obtener datos de secuenciación de los objetivos con código de barras. La codificación de barras de la pluralidad de objetivos usando la pluralidad de códigos de barras para crear la pluralidad de objetivos con código de barras puede incluir: poner en contacto copias de los objetivos con regiones de unión de objetivos de los códigos de barras; y transcripción inversa de la pluralidad de objetivos usando la pluralidad de códigos de barras para crear una pluralidad de objetivos transcriptos inversamente.
[0334] En algunas formas de realización, el método comprende: antes de obtener los datos de secuenciación de la pluralidad de objetivos con código de barras, amplificar los objetivos con código de barras para crear una pluralidad de objetivos con código de barras amplificados. La amplificación de los objetivos con código de barras para generar la pluralidad de objetivos con código de barras amplificados puede comprender: la amplificación de los objetivos con código de barras mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La codificación de barras de la pluralidad de objetivos de la célula usando la pluralidad de códigos de barras para crear la pluralidad de objetivos con código de barras puede comprender la codificación estocástica de la pluralidad de objetivos de la célula usando una pluralidad de códigos de barras estocásticos para crear una pluralidad de objetivos con código de barras estocástico.
[0335] En algunas formas de realización, el método para la identificación de células comprende: poner en contacto una primera pluralidad de una o más células y una segunda pluralidad de una o más células con dos composiciones de identificación de células respectivamente, donde cada una de la primera pluralidad de una o más células y cada una de la segunda pluralidad de una o más células comprende uno o más componentes celulares, donde cada una de las dos composiciones de identificación celular comprende un reactivo de unión de componentes celulares asociado con un oligonucleótido de identificación celular, donde el reactivo de unión de componentes celulares es capaz de unirse específicamente a al menos uno de uno o más componentes celulares, en el que el oligonucleótido de identificación celular comprende una secuencia de identificación celular, y en el que las secuencias de identificación celular de las dos composiciones de identificación celular comprenden secuencias diferentes; codificar con barras los oligonucleótidos de identificación celular usando una pluralidad de códigos de barras para crear una pluralidad de oligonucleótidos de identificación celular con código de barras, en el que cada uno de la pluralidad de códigos de barras comprende una secuencia de etiqueta celular, una secuencia de código de barras (p. ej., una secuencia de etiqueta molecular) y una región de unión objetivo, en la que las secuencias de códigos de barras de al menos dos códigos de barras de la pluralidad de códigos de barras comprenden secuencias diferentes, y en la que al menos dos códigos de barras de la pluralidad de códigos de barras comprenden una secuencia de etiqueta de célula idéntica; obtener datos de secuenciación de la pluralidad de oligonucleótidos de identificación de células con código de barras; e identificar una o más secuencias de etiquetas de células, cada una de las cuales está asociada con dos o más secuencias de identificación de células en los datos de secuenciación obtenidos; y eliminar los datos de secuenciación asociados con una o más secuencias de etiquetas de células que están asociadas con dos o más secuencias de identificación de células de los datos de secuenciación obtenidos y/o excluir los datos de secuenciación asociados con una o más secuencias de etiquetas de células que están asociadas con dos o más secuencias de identificación celular de análisis posteriores (p. ej., perfiles de ARNm de una sola célula o análisis de transcriptoma completo). En algunas formas de realización, el oligonucleótido de identificación celular comprende una secuencia de código de barras (p. ej., una secuencia de marcador molecular), un sitio de unión para un cebador universal o una combinación de los mismos.
[0336] Un multiplete (por ejemplo, un doblete, triplete, etc.) puede ocurrir cuando dos o más células asociadas con dos o más oligonucleótidos de identificación celular de secuencias diferentes (o dos o más células asociadas con oligonucleótidos de identificación celular con dos o más secuencias de identificación celular diferentes) se capturan en el mismo micropocillo o gotita, la "célula" combinada se puede asociar con oligonucleótidos de identificación celular con dos o más secuencias de identificación celular diferentes.
[0337] Las composiciones de identificación de células se pueden usar para la identificación de multipletes, ya sea en el contexto de la sobrecarga de células o en el contexto de la carga de células en micropocillos de una matriz de micropocillos o la generación de gotitas que contienen células. Cuando se cargan dos o más células en un micropocillo, los datos resultantes de la "célula" combinada (o el contenido de las dos o más células) es un multiplete con un perfil de expresión génica aberrante. Mediante el uso de la identificación celular, se puede reconocer algunos de estos multipletes buscando etiquetas celulares (p. ej., etiquetas celulares de códigos de barras, como códigos de barras estocásticos) que están asociadas o asignadas a dos o más oligonucleótidos de identificación celular con diferentes secuencias de identificación celular (u oligonucleótidos de identificación celular con dos o más secuencias de identificación celular). Con la secuencia de identificación de células, los métodos descritos en este documento se pueden utilizar para la identificación de multipletes (ya sea en el contexto de sobrecarga de muestras o no, o en el contexto de cargar células en micropocillos de una matriz de micropocillos o generar gotitas que contienen células). En algunas formas de realización, el método comprende: poner en contacto una primera pluralidad de una o más células y una segunda pluralidad de una o más células con dos composiciones de identificación de células respectivamente, donde cada una de la primera pluralidad de una o más células y cada una de la segunda pluralidad de una o más células comprenden uno o más componentes celulares, donde cada una de las dos composiciones de identificación celular comprende un reactivo de unión de componentes celulares asociado con un oligonucleótido de identificación celular, donde el reactivo de unión de componentes celulares es capaz de unirse específicamente a al menos uno de los uno o más componentes celulares, en el que el oligonucleótido de identificación celular comprende una secuencia de identificación celular, y en el que las secuencias de identificación celular de las dos composiciones de identificación celular comprenden secuencias diferentes; codificar con barras los oligonucleótidos de identificación celular usando una pluralidad de códigos de barras para crear una pluralidad de oligonucleótidos de identificación celular con código de barras, en el que cada uno de la pluralidad de códigos de barras comprende una secuencia de etiqueta celular, una secuencia de código de barras (p. ej., una secuencia de etiqueta molecular) y un objetivo de unión región, en la que las secuencias de códigos de barras de al menos dos códigos de barras de la pluralidad de códigos de barras comprenden secuencias diferentes, y en la que al menos dos códigos de barras de la pluralidad de códigos de barras comprenden una secuencia de etiqueta de célula idéntica; obtener datos de secuenciación de la pluralidad de oligonucleótidos de identificación de células con código de barras; e identificar una o más secuencias de etiquetas de células multiplete, cada una de las cuales está asociada con dos o más secuencias de identificación de células en los datos de secuenciación obtenidos.
[0338] El número de células que se pueden cargar en micropocillos de un cartucho de micropocillos o en gotitas generadas usando un dispositivo de microfluidos puede estar limitado por la tasa de multiplete. Cargar más células puede generar más multipletes, que pueden ser difíciles de identificar y crear ruido en los datos de una sola célula. Con la identificación de células, el método se puede utilizar para etiquetar o identificar multipletes con mayor precisión y eliminar los multipletes de los datos de secuenciación o del análisis posterior. Ser capaz de identificar multipletes con mayor confianza puede aumentar la tolerancia del usuario a la tasa de multipletes y cargar más células en cada cartucho de micropocillos o generar gotas con al menos una célula cada una.
[0339] En algunas formas de realización, poner en contacto la primera pluralidad de una o más células y la segunda pluralidad de una o más células con las dos composiciones de identificación de células comprende respectivamente: poner en contacto la primera pluralidad de una o más células con una primera composición de identificación de células de las dos composiciones de identificación celular; y poner en contacto la primera pluralidad de una o más células con una segunda composición de identificación de células de las dos composiciones de identificación de células. El número de pluralidades de composiciones de identificación celular puede ser diferente en diferentes implementaciones. En algunas formas de realización, el número de composiciones de identificación celular puede ser, o ser aproximadamente, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 10000, 100000, 1000000, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, el número de composiciones de identificación celular puede ser al menos, o como máximo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 10000, 100000 o 1000000. El número, o número promedio, de células en cada pluralidad de una o más células puede ser diferentes en diferentes implementaciones. En algunas formas de realización, el número, o número promedio, de células en cada pluralidad de una o más células puede ser, o ser aproximadamente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 10000, 100000, 1000000, o un número o un rango entre dos cualquiera de estos valores En algunas formas de realización, el número, o número promedio, de células en cada pluralidad de una o más células puede ser al menos, o como máximo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 10000,100000 o 1000000.
[0340] En algunas formas de realización, el método comprende: eliminar las composiciones de identificación celular no unidas de las dos composiciones de identificación celular. Eliminar las composiciones de identificación de células no unidas puede comprender lavar las células de la primera pluralidad de una o más células y la segunda pluralidad de una o más células con un tampón de lavado. Eliminar las composiciones de identificación de células no unidas puede comprender seleccionar células unidas a al menos un reactivo de unión de componentes celulares de las dos composiciones de identificación de células usando citometría de flujo. En algunas formas de realización, el método comprende: lisar una o más células de cada una de la pluralidad de muestras.
[0341] En algunas formas de realización, el oligonucleótido de identificación celular está configurado para ser (o puede ser) separable o no separable del reactivo de unión al componente celular. El método puede comprender separar el oligonucleótido de identificación celular del reactivo de unión al componente celular. Separar el oligonucleótido de identificación celular puede comprender separar el oligonucleótido de identificación celular del reactivo de unión al componente celular mediante fotoescisión UV, tratamiento químico (p. ej., usando reactivo reductor, como ditiotreitol), calentamiento, tratamiento enzimático o cualquier combinación de los mismos.
[0342] En algunas formas de realización, la codificación de barras de los oligonucleótidos de identificación celular utilizando la pluralidad de códigos de barras comprende: poner en contacto la pluralidad de códigos de barras con los oligonucleótidos de identificación celular para generar códigos de barras hibridados con los oligonucleótidos de identificación celular; y extender los códigos de barras hibridados a los oligonucleótidos de identificación celular para generar la pluralidad de oligonucleótidos de identificación celular con código de barras. La extensión de los códigos de barras puede comprender la extensión de los códigos de barras usando una ADN polimerasa para generar la pluralidad de oligonucleótidos de identificación de células con código de barras. La extensión de los códigos de barras puede comprender la extensión de los códigos de barras usando una transcriptasa inversa para generar la pluralidad de oligonucleótidos de identificación de células con código de barras.
[0343] En algunas formas de realización, el método comprende: amplificar la pluralidad de oligonucleótidos de identificación de células con código de barras para producir una pluralidad de amplicones. La amplificación de la pluralidad de oligonucleótidos de identificación celular con código de barras puede comprender amplificar, usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), al menos una parte de la secuencia del código de barras (p. ej., la secuencia del marcador molecular) y al menos una parte del oligonucleótido de identificación celular. En algunas formas de realización, la obtención de datos de secuenciación de la pluralidad de oligonucleótidos de identificación de células con código de barras puede comprender la obtención de datos de secuenciación de la pluralidad de amplicones. La obtención de los datos de secuenciación comprende secuenciar al menos una parte de la secuencia del código de barras y al menos una parte del oligonucleótido de identificación celular. En algunas formas de realización, identificar el origen de la muestra de al menos una célula comprende identificar el origen de la muestra de la pluralidad de objetivos con código de barras basándose en la secuencia de identificación celular del al menos un oligonucleótido de identificación de células con código de barras.
[0344] En algunas formas de realización, la codificación de barras de los oligonucleótidos de identificación celular usando la pluralidad de códigos de barras para crear la pluralidad de oligonucleótidos de identificación celular con código de barras comprende la codificación estocástica de los oligonucleótidos de identificación celular usando una pluralidad de códigos de barras estocásticos para crear una pluralidad de oligonucleótidos de identificación celular con código de barras estocástico.
Método de perfilado de componentes celulares de aptámeros
[0345] En este documento se describen formas de realización de un método para perfilar la expresión de componentes celulares (como la expresión de componentes celulares intracelulares, incluida la expresión de proteínas intracelulares) utilizando aptámeros. FIGS. 8A-8E muestran una ilustración esquemática de un flujo de trabajo ejemplar del uso de aptámeros asociados a oligonucleótidos (p. ej., conjugados) para determinar la expresión de componentes celulares (p. ej., expresión de proteínas). En algunas formas de realización, el método puede usarse con cualquier método de secuenciación de ARN de una sola célula (incluido cualquier método de secuenciación de ARN de 3' de una sola célula, como BD Rhapsody™, y método de secuenciación de ARN de 5' de una sola célula). En algunas formas de realización, el método se puede usar con un método de secuenciación de ARN de una sola célula sin necesidad de fijar y permeabilizar las células (como fijar y/o permeabilizar parcial o completamente las células).
[0346] En algunas formas de realización, un aptámero 804 puede ser un polinucleótido 804ss monocatenario (p. ej., ácido ribonucleico (ARN) o ácido desoxirribonucleico (ADN)). El polinucleótido monocatenario puede tener, por ejemplo, 100 nucleótidos de longitud. La longitud del polinucleótido monocatenario puede ser diferente en diferentes implementaciones. En algunas formas de realización, el polinucleótido monocatenario puede ser, o puede ser aproximadamente, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, o un número o rango entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, el nucleótido monocatenario puede ser al menos, o puede ser como máximo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,
18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49,
50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,
82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200,
210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540,
550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780,
790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990 o 1000. Un aptámero 804 puede plegarse en una estructura tridimensional 804 que puede reconocer un objetivo 808, como un componente celular objetivo 808 (por ejemplo, una proteína objetivo).
[0347] En algunas formas de realización, los aptámeros 804 específicos de los componentes intracelulares diana (p. ej., proteínas intracelulares) pueden asociarse (p. ej., unirse o conjugarse) con nanopartículas de oro 812 (véase la FIG. 8B).
Dicha asociación puede permitir la absorción de los aptámeros 804 en las células 816. Después de la absorción de los aptámeros 804 en las células 816, los aptámeros 804 pueden disociarse de las nanopartículas de oro 816 y unirse a los objetivos de los aptámeros 804.
[0348] En algunas formas de realización, el aptámero 804 es un único polinucleótido que contiene una región de unión al objetivo del aptámero 804t (que es capaz de unirse a un componente celular objetivo del aptámero), un sitio de unión del cebador universal 804h (p. ej., un identificador de PCR, un Illumina R2 completo o parcial y/o secuencia P7), una secuencia identificadora 804i (también denominada en el presente documento como código de barras de aptámero) y una cola de poli(dA) 804a (véanse las FIG. 8C y 9) para permitir la captura y amplificación del aptámero usando una sola célula 3 ' Plataforma de secuenciación de ARN (p. ej., BD Rhapsody™). En algunas formas de realización, hay una pluralidad de nucleótidos 804b entre el código de barras del aptámero y el poli(dA) para alinear la cola del poli(dA) con la secuencia de oligo(dT) de un código de barras (denominado en este documento secuencia de alineación). Cada uno de la pluralidad de nucleótidos puede ser una no adenosina (por ejemplo, una guanina, una citosina, una timina y un uracilo). En algunas formas de realización, un polinucleótido incluye la región de unión al objetivo del aptámero y un segundo polinucleótido incluye el sitio de unión del cebador universal, la secuencia identificadora, la secuencia de alineación y la cola poli(dA).
[0349] En algunas formas de realización, el exceso de aptámeros no se une a los componentes celulares objetivo (p. ej., moléculas de proteína) se pueden quitar. Por ejemplo, como se ilustra en la FIG. 8D, los aptámeros 804 pueden diseñarse para que cada uno pueda formar una estructura de horquilla 820, de modo que la cola de poli(dA) 804a sola pueda ser accesible tras cambios conformacionales inducidos por la unión al componente celular objetivo (una proteína objetivo 824 ilustrada aquí). Cualquier aptámero 820 no unido no puede hibridarse con secuencias de oligo(dT) en códigos de barras
(por ejemplo, secuencias de oligo(dT) en códigos de barras, como códigos de barras estocásticos, asociados a una perla de captura de secuenciación de ARN 3'). Como otro ejemplo, se pueden introducir aptámeros antisentido (p. ej., en las células) después de la administración de aptámeros con sentido para absorber los aptámeros no unidos y crear nucleótidos de doble cadena (p. ej., ADN de doble cadena, ARN de doble cadena, híbrido de ADN/ARN) que no pueden ser capturados en una perla de captura de secuenciación de ARN.
[0350] Como otro ejemplo, como se ilustra en la FIG. 8E, se puede introducir una "esponja" de aptámeros 828 en una célula usando, por ejemplo, un vector con secuencias en tándem 828 complementarias (por ejemplo, parcial o completamente) a las secuencias de aptámeros 804 o subsecuencias de las mismas. La identidad de secuencia entre una secuencia en tándem 828 complementaria a una secuencia de aptámero (o una subsecuencia de la misma) y la secuencia de aptámero (o una subsecuencia de la misma) puede ser diferente en diferentes implementaciones. Los aptámeros no unidos pueden unirse a las secuencias en tándem 828 complementarias a las secuencias de aptámero, agregarse y ser objeto de degradación en la célula. Los aptámeros, por lo tanto, pueden absorber aptámeros no unidos a objetivos de componentes celulares. En algunas formas de realización, la identidad de secuencia entre la secuencia complementaria 828 a la secuencia de aptámero (o una subsecuencia de la misma) y la secuencia de aptámero (o una subsecuencia de la misma) puede ser, o puede ser aproximadamente, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %,
58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 % 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %,
96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 %, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, la identidad de secuencia entre la secuencia complementaria 828 a la secuencia de aptámero (o una subsecuencia de la misma) y la secuencia de aptámero (o una subsecuencia de la misma) puede ser al menos, o puede ser como máximo, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %,
66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 % 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %.
[0351] En el presente documento se describen formas de realización de un método para medir la expresión de proteínas en células. En algunas formas de realización, el método comprende: poner en contacto una pluralidad de aptámeros que se unen a proteínas (p. ej., la región de unión al objetivo del aptámero 804t descrita con referencia a las FIG. 8C y 9) con una pluralidad de células que comprenden una pluralidad de proteínas objetivo (como la célula 816 descrita con referencia a la FIG. 8B), en la que cada uno de la pluralidad de aptámeros que se unen a proteínas comprende un oligonucleótido específico de aptámero que comprende una secuencia identificadora única (p. ej., el identificador de aptámero o código
de barras 804i descrito con referencia a las FIGS. 8C y 9) para el aptámero que se une al componente celular, y en el que el aptámero que se une a la proteína es capaz de unirse específicamente a al menos una de la pluralidad de proteínas objetivo. En algunas formas de realización, el método comprende dividir la pluralidad de células (como la célula 816 descrita con referencia a la FIG. 8B) asociadas con la pluralidad de aptámeros de unión a proteínas en una pluralidad de particiones, donde una partición de la pluralidad de particiones comprende una sola célula de la pluralidad de células asociadas con los aptámeros de unión a proteínas; en la partición que comprende la célula única, poner en contacto una partícula de código de barras con los oligonucleótidos específicos del aptámero, en el que la partícula de código de barras comprende una pluralidad de sondas de oligonucleótidos (p. ej., el código de barras 104 descrito con referencia a la FIG.
1), cada una de las cuales comprende una región de unión objetivo y una secuencia de código de barras seleccionada de un conjunto diverso de secuencias de códigos de barras únicas; extender sondas de oligonucleótidos hibridadas con los oligonucleótidos específicos de aptámero para producir una pluralidad de ácidos nucleicos marcados, en donde cada uno de los ácidos nucleicos marcados comprende una secuencia identificadora única, o una secuencia complementaria de la misma, y una secuencia de código de barras; y obtener información de secuencia de la pluralidad de ácidos nucleicos marcados o una parte de los mismos para determinar la cantidad de una o más de la pluralidad de proteínas objetivo en una o más de la pluralidad de células.
[0352] En el presente documento se describen formas de realización de un método para medir la expresión de componentes celulares en las células. En algunas formas de realización, el método comprende: poner en contacto una pluralidad de aptámeros de unión a componentes celulares (p. ej., los aptámeros 804 descritos con referencia a las FIGS.
8A-8E y 9) con una pluralidad de células (como la célula 816 descrita con referencia a la FIG. 8B) que comprende una pluralidad de objetivos de componentes celulares (como la célula 816 descrita con referencia a la FIG. 8B), donde cada uno de la pluralidad de aptámeros de unión a componentes celulares comprende un oligonucleótido específico de aptámero que comprende una secuencia de identificador única (p. ej., el identificador de aptámero o código de barras
804i descrito con referencia a las FIGS. 8C y 9) para el aptámero que se une al componente celular, y en el que el aptámero que se une al componente celular es capaz de unirse específicamente a al menos uno de la pluralidad de objetivos del componente celular; sondas de oligonucleótidos extensibles (p. ej., el código de barras 104 descrito con referencia a la FIG. 1) hibridadas con los oligonucleótidos específicos del aptámero para producir una pluralidad de ácidos nucleicos marcados, en los que cada uno de los ácidos nucleicos marcados comprende una secuencia identificadora única o una secuencia complementaria de la misma, y una secuencia de código de barras; y obtener información de secuencia de la pluralidad de ácidos nucleicos marcados o una parte de los mismos para determinar la cantidad de uno o más de la pluralidad de objetivos de componentes celulares en una o más de la pluralidad de células.
[0353] El oligonucleótido específico de aptámero puede referirse a un polinucleótido que no incluye la región de unión al objetivo de aptámero 804t, como un polinucleótido que incluye un identificador de PCR 804h (p. ej., una secuencia Illumina
R2 y/o P7 completa o parcial), una secuencia identificadora 804i (también denominada en el presente documento aptámero código de barras), una secuencia de alineación 804a y/o una cola de poli(dA) 804a. En algunas formas de realización, la región de unión al objetivo del aptámero 804t y el oligonucleótido específico del aptámero pueden formar un solo polinucleótido como se ilustra con referencia a la FIG. 9.
[0354] La longitud de un aptámero (o una región de unión al objetivo del aptámero) puede ser diferente en diferentes implementaciones. En algunas formas de realización, la longitud de un aptámero puede ser, o puede ser aproximadamente, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33,
34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65,
66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97,
98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 410, 420,
430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660,
670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900,
910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, o un número o rango entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, la longitud de un aptámero puede ser al menos, o puede ser como máximo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,
12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43,
44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75,
76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150,
160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490,
500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730,
740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970,
980, 990 o 1000.
[0355] La longitud de un oligonucleótido específico de aptámero puede ser diferente en diferentes implementaciones. En algunas formas de realización, la longitud de un oligonucleótido específico de aptámero puede ser, o puede ser aproximadamente, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62,
63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94,
95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 300, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630,
640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870,
880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, o un número o rango entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, la longitud de un oligonucleótido específico de aptámero puede ser al menos, o puede ser como máximo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990 o 1000.
[0356] La longitud de una secuencia identificadora de un aptámero puede ser diferente en diferentes implementaciones.
En algunas formas de realización, la longitud de una secuencia identificadora de un aptámero puede ser, o puede ser aproximadamente, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, o un número o rango entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, la longitud de una secuencia identificadora de un aptámero puede ser al menos, o puede ser como máximo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990 o 1000.
[0357] El método puede comprender: antes de extender las sondas de oligonucleótidos: dividir la pluralidad de células asociadas con la pluralidad de aptámeros que se unen a componentes celulares en una pluralidad de particiones, en donde una partición de la pluralidad de particiones comprende una sola célula de la pluralidad de células asociadas con los aptámeros de unión al componente celular; en la partición que comprende la célula única, poner en contacto una partícula de código de barras (p. ej., la perla 105 descrita con referencia a la FIG. 1) con los oligonucleótidos específicos de aptámero, en el que la partícula de código de barras comprende una pluralidad de sondas de oligonucleótidos, cada una de las cuales comprende una región de unión objetivo y una secuencia de código de barras seleccionada de un conjunto diverso de secuencias de códigos de barras únicas. La pluralidad de objetivos de componentes celulares puede comprender una pluralidad de proteínas objetivo, y donde el aptámero de unión al componente celular es capaz de unirse específicamente a al menos una de la pluralidad de proteínas objetivo.
[0358] En algunas formas de realización, dividir la pluralidad de células comprende dividir la pluralidad de células asociadas con la pluralidad de aptámeros y una pluralidad de partículas de código de barras que comprenden la partícula de código de barras a la pluralidad de particiones (ver, por ejemplo, los bloques 208 y 212 descritos con referencia a la FIG. 2), en el que la partición de la pluralidad de particiones comprende la única célula de la pluralidad de células asociadas con el aptámero conjugado con oligonucleótido y la partícula de código de barras. En algunas formas de realización, la partición es un pocillo o una gota.
[0359] En algunas formas de realización, obtener información de secuenciación de la pluralidad de ácidos nucleicos marcados o una parte de los mismos comprende someter los ácidos nucleicos marcados a una o más reacciones para generar un conjunto de ácidos nucleicos para la secuenciación de ácidos nucleicos (ver, por ejemplo, FIG.3 y la descripción adjunta).
[0360] En algunas formas de realización, cada una de las sondas de oligonucleótidos comprende un marcador celular, un sitio de unión para un cebador universal, un adaptador de amplificación, un adaptador de secuenciación o una combinación de los mismos (p. ej., el código de barras 104 descrito con referencia a la FIG. 1). En algunas formas de realización, la partícula de código de barras es una perla de sefarosa, una perla de estreptavidina, una perla de agarosa, una perla magnética, una perla de sílice, una perla de tipo sílice, una perla de hidrogel, una microperla de antibiotina, una microperla de antifluorocromo o una perla de hidrogel
Oligonucleótidos específicos de aptámero
[0361] El oligonucleótido específico de aptámero y el aptámero forman un único polinucleótido (p. ej., el único polinucleótido 804 que se muestra en las FIG. 8A y 9).
[0362] En algunas formas de realización, el oligonucleótido específico de aptámero comprende una secuencia complementaria a una secuencia de captura configurada para capturar (o capaz de capturar, hibridar o unirse a) la secuencia del oligonucleótido específico de aptámero. El código de barras puede comprender una región de unión al objetivo que comprende la secuencia de captura. La región de unión al objetivo puede comprender una región poli(dT).
La secuencia del oligonucleótido específico del aptámero complementario a la secuencia de captura puede comprender una región poli(dA).
[0363] En algunas formas de realización, el oligonucleótido específico de aptámero comprende una secuencia marcadora molecular, un sitio de unión para un cebador universal (p. ej., el sitio de unión de cebador universal 804h descrito con referencia a la FIG. 9), o ambos. La secuencia del marcador molecular puede tener una longitud de 2 a 20 nucleótidos. El cebador universal puede tener una longitud de 5 a 50 nucleótidos. El cebador universal puede comprender un cebador de amplificación (por ejemplo, una secuencia Illumina P7 o una subsecuencia de la misma), un cebador de secuenciación
(por ejemplo, una secuencia Illumina R2 o una subsecuencia de la misma) o una combinación de los mismos. La longitud de un marcador molecular o un sitio de unión para un cebador universal de un oligonucleótido específico de aptámero puede ser diferente en diferentes implementaciones. En algunas formas de realización, la longitud de un marcador molecular o un sitio de unión para un cebador universal de un oligonucleótido específico de aptámero puede ser, o puede ser aproximadamente, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29,
30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,
62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93,
94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, o un número o rango entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, la longitud de un marcador molecular o un sitio de unión para un cebador universal de un oligonucleótido específico de aptámero puede ser al menos, o puede ser como máximo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,
20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,
52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83,
84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100.
Secuencia de alineación
[0364] En algunas formas de realización, el oligonucleótido específico de aptámero comprende una secuencia de alineación (p. ej., la secuencia de alineación 804b descrita con referencia a la FIG. 9) adyacente a la región poli(dA). La secuencia de alineación puede ser de 1 o más nucleótidos de longitud. La secuencia de alineación puede tener una longitud de 2 nucleótidos. La secuencia de alineación puede comprender una guanina, una citosina, una timina, un uracilo o una combinación de los mismos. La secuencia de alineación puede comprender una región poli(dT), una región poli(dG), una región poli(dC), una región poli(dU), o una combinación de las mismas.
[0365] La longitud de la secuencia de alineación puede ser diferente en diferentes implementaciones. En algunas formas de realización, la longitud de la secuencia de alineación puede ser, o puede ser sobre, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,
13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, la longitud de la secuencia de alineación puede ser al menos, o puede ser como máximo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26,
27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58,
59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90,
91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100. El número de guanina(s), citosina(s), timina(s) o uracilo(s) en la secuencia de alineación puede ser diferente en diferentes implementaciones. El número de guanina(s), citosina(s), timina(s) o uracilo(s) puede ser, o puede ser aproximadamente, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24,
25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, o un número o rango entre cualquiera de estos dos valores. El número de guanina(s), citosina(s), timina(s) o uracilo(s) puede ser como mínimo, o como máximo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,
13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100.
Aptámero
[0366] En algunas formas de realización, el aptámero es o comprende un aptámero de nucleótido. El aptámero de nucleótido puede comprender ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN), ácido xenonucleico (XNA) o una combinación de los mismos. El aptámero de nucleótido puede comprender un análogo de base. El análogo de base puede comprender un análogo de base fluorescente. El aptámero de nucleótido puede comprender un fluoróforo.
Portador
[0367] En algunas formas de realización, la pluralidad de aptámeros de unión a proteínas comprende un segundo aptámero de unión a proteínas, o la pluralidad de aptámeros de unión a componentes celulares comprende un segundo aptámero de unión a componentes celulares. El aptámero y el segundo aptámero pueden estar asociados con un primer vehículo. El aptámero se puede asociar con un primer vehículo y el segundo aptámero se puede asociar con un segundo vehículo. El aptámero y el segundo aptámero pueden ser al menos 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % idénticos. La identidad de secuencia entre el aptámero y el segundo aptámero puede ser diferente en diferentes implementaciones. En algunas
formas de realización, el aptámero y el segundo aptámero pueden tener una identidad de secuencia de aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21
%, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 30
%, 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59
%, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78
%, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97
%, 98 %, 99 %, 100 %, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, el aptámero y el segundo aptámero pueden tener una identidad de secuencia de al menos, o como máximo, 1 %, 2 %, 3
%, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %., 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23
%, 24 %, 25 %, 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 30 %, 41 %, 42
%, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61
%, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80
%, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99
% o 100 %. El aptámero y el segundo aptámero de unión a proteínas pueden ser idénticos. El aptámero y el segundo aptámero pueden ser diferentes.
[0368] El número de diferentes portadores puede ser diferente en diferentes implementaciones. En algunas formas de realización, hay un tipo de transportador. En algunas formas de realización, el número de diferentes tipos de portadores puede ser, o puede ser aproximadamente, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60,
70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, o un número o rango entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, el número de diferentes tipos de portadores puede ser al menos, o puede ser como máximo,
2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990 o 1000. El número de moléculas transportadoras de cada tipo de transportador puede ser diferente en diferentes implementaciones. En algunas formas de realización, el número de moléculas portadoras de cada tipo de portador puede ser, o puede ser aproximadamente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70,
80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 900, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 100000, 1000000, 10000000, 100000000 o 1000000000, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, el número de moléculas portadoras de cada tipo de portador puede ser al menos, o puede ser como máximo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13., 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 2000, 3000, 4000, 50000, 7000, 8000, 9000, 10000, 100000, 1000000, 10000000, 100000000 o 1000000000.
[0369] En algunas formas de realización, las proteínas objetivo o los objetivos de componentes celulares del aptámero y el segundo aptámero son idénticas. El aptámero y el segundo aptámero pueden ser capaces de unirse a diferentes regiones de una proteína objetivo o un componente celular objetivo. Las proteínas objetivo, o los objetivos de componentes celulares, del aptámero y el segundo aptámero pueden ser diferentes.
[0370] En algunas formas de realización, el primer vehículo comprende nanomaterial metálico. El primer vehículo puede comprender una nanoestructura metálica, una nanopartícula metálica o una combinación de las mismas. El primer portador puede comprender nanomaterial de oro. El primer vehículo puede comprender una nanoestructura de oro, una nanopartícula de oro o una combinación de los mismos. El primer vehículo puede comprender un lisosoma, una micela, una vesícula, una membrana lipídica, una bicapa lipídica, una monocapa lipídica o una combinación de los mismos.
[0371] En algunas formas de realización, el aptámero se une al primer vehículo. El aptámero se puede unir covalentemente al primer vehículo. El aptámero se puede conjugar con el primer vehículo. El aptámero se puede conjugar con el primer vehículo a través de un grupo químico seleccionado del grupo que consiste en un grupo fotoescindible por UV, una estreptavidina, una biotina, una amina y una combinación de los mismos. El aptámero se puede unir de forma no covalente al primer vehículo. El aptámero se puede asociar con el primer portador a través de un enlazador. El aptámero puede estar inmovilizado en el primer portador, parcialmente inmovilizado en el primer portador, inmovilizado en el primer portador, parcialmente inmovilizado en el primer portador, encerrado en el primer portador, parcialmente encerrado en el primer portador, incrustado en el primer portador, parcialmente incrustado en el primer portador, o una combinación de los mismos.
[0372] En algunas formas de realización, el método comprende disociar el aptámero del primer vehículo. La disociación
puede ocurrir después del contacto en la partición que comprende las células individuales. La disociación puede ocurrir antes del contacto en la partición que comprende las células individuales.
[0373] En algunas formas de realización, poner en contacto la pluralidad de aptámeros con la pluralidad de células comprende: poner en contacto el primer vehículo que comprende el aptámero con una célula de la pluralidad de células que comprende la pluralidad de proteínas objetivo. El primer portador se puede internalizar en la célula. El primer portador se puede internalizar en la célula mediante endocitosis, pinocitosis, nanopinocitosis, micropinocitosis, fagocitosis, fusión de membranas o una combinación de los mismos. El primer portador se puede internalizar en la célula a través de la internalización medicada con clatrina, la internalización mediada por caveolina, la internalización dependiente del receptor, la internalización independiente del receptor o una combinación de las mismas.
Eliminación de aptámeros
[0374] En algunas formas de realización, el método comprende después de poner en contacto la pluralidad de aptámeros con la pluralidad de células, eliminar los aptámeros que no están en contacto con la pluralidad de células. Eliminar los aptámeros que no están en contacto con la pluralidad de células puede comprender: eliminar los aptámeros que no están en contacto con la respectiva al menos una de la pluralidad de proteínas objetivo.
Eliminación de aptámeros - Esponja de aptámeros
[0375] La eliminación de los aptámeros que no están en contacto con la respectiva al menos una de la pluralidad de proteínas objetivo puede comprender: eliminar los aptámeros que no están en contacto con la respectiva al menos una de la pluralidad de proteínas objetivo comprende usar un aptámero esponja (por ejemplo, la esponja aptámera 828 descrita con referencia a la Figura 8E). La esponja aptámera puede, por ejemplo, comprender una pluralidad de secuencias complementarias a las secuencias de los aptámeros. Los aptámeros que no se ponen en contacto con la respectiva al menos una de la pluralidad de proteínas objetivo puede hibridar con la pluralidad de secuencias de la esponja aptámera.
Eliminación de aptámeros: conformación del oligonucleótido específico del aptámero
[0376] En algunas formas de realización, el oligonucleótido específico del aptámero cambia de una primera conformación en la que la región poli(dA) es inaccesible a una segunda conformación en la que la región poli(dA) es accesible cuando el aptámero se pone en contacto con al menos uno de la pluralidad de proteínas objetivo o objetivos de componentes celulares. Por ejemplo, como se ilustra en la FIG. 8D, un aptámero 804in asociado con un oligonucleótido específico de aptámero con una región poli(dA) inaccesible puede convertirse en un aptámero 804ac asociado con un oligonucleótido específico de aptámero con una región poli(dA) accesible cuando el aptámero 804in se une a su componente celular objetivo. La región poli(dA) del oligonucleótido específico de aptámero en la primera conformación puede comprender una estructura de horquilla (p. ej., la estructura de horquilla 820 descrita con referencia a la FIG. 8D). La región poli(dA) con la estructura de horquilla puede ser accesible a la región poli(dT) de la región de unión al objetivo del código de barras. Las sondas de oligonucleótidos se pueden hibridar con los oligonucleótidos específicos del aptámero a través de la hibridación entre las regiones poli(dA) de los oligonucleótidos específicos de aptámero y las regiones poli(dT) de las sondas de oligonucleótidos. Un oligonucleótido específico de aptámero asociado con un aptámero que no está en contacto con el objetivo del compartimento celular puede tener una región poli(dA) inaccesible que no puede hibridar con la región poli(dT) de una sonda de oligonucleótido. Dicho oligonucleótido específico de aptámero y su aptámero asociado pueden eliminarse.
[0377] En algunas formas de realización, los aptámeros comprenden secuencias complementarias. Los aptámeros que no se ponen en contacto con la respectiva al menos una de la pluralidad de proteínas objetivo puede hibridarse entre sí para formar un agregado. El agregado puede ser objeto de degradación en la célula.
Eliminación de aptámeros - antisentido
[0378] En algunas formas de realización, eliminar los aptámeros que no están en contacto con la respectiva al menos una de la pluralidad de proteínas objetivo comprende: eliminar los aptámeros que no están en contacto con la respectiva al menos una de la pluralidad de proteínas objetivo comprende usar una pluralidad de aptámeros antisentido, donde cada aptámero antisentido de la pluralidad de aptámero antisentido comprende un segundo aptámero que comprende un oligonucleótido específico de aptámero antisentido que comprende la secuencia complementaria, o una parte de la misma, del oligonucleótido específico de aptámero de uno de los aptámeros no se ha puesto en contacto con la respectiva al menos una de la pluralidad de proteínas objetivo, y en el que el oligonucleótido específico de aptámero y el oligonucleótido específico de aptámero antisentido forman una molécula de ácido desoxirribonucleico (ADN) de doble cadena o parcialmente de doble cadena.
Objetivos y muestras
[0379] En algunas formas de realización, la pluralidad de proteínas objetivo comprende una proteína de superficie celular, una proteína intracelular, un marcador celular, un receptor de células B, un receptor de células T, un anticuerpo, un complejo principal de histocompatibilidad, un antígeno tumoral, un receptor o una combinación de los mismos. En algunas formas de realización, la pluralidad de células comprende células T, células B, células tumorales, células mieloides, células sanguíneas, células normales, células fetales, células maternas o una mezcla de las mismas.
Composiciones de perfilado de componentes celulares aptámeros
[0380] Las descritas en este documento incluyen una composición que comprende: una pluralidad de aptámeros que se unen a componentes celulares, donde cada uno de la pluralidad de aptámeros que se unen a componentes celulares comprende un oligonucleótido específico de aptámero que comprende una secuencia de identificación única para el componente que se une a celulares. aptámero, en el que el oligonucleótido específico del aptámero y el aptámero forman un solo polinucleótido, en el que el oligonucleótido específico del aptámero comprende una secuencia complementaria a una secuencia de captura configurada para capturar la secuencia del oligonucleótido específico del aptámero, en el que la secuencia del oligonucleótido específico del aptámero complementaria a la secuencia de captura comprende una región poli(dA), y en la que el aptámero que se une al componente celular es capaz de unirse específicamente a al menos una de una pluralidad de objetivos de componentes celulares.
Oligonucleótido específico de aptámero
[0381] En algunas formas de realización, el aptámero que se une al componente celular puede estar en 5' con respecto al oligonucleótido específico de aptámero en el polinucleótido único. El aptámero que se une al componente celular puede estar en 3' con respecto al oligonucleótido específico del aptámero en el polinucleótido único.
[0382] En algunas formas de realización, el oligonucleótido específico del aptámero está asociado con el aptámero que se une al componente celular. El oligonucleótido específico del aptámero se puede unir al aptámero que se une al componente celular. El oligonucleótido específico del aptámero se puede unir covalentemente al aptámero que se une al componente celular. El oligonucleótido específico del aptámero se puede unir de forma no covalente al aptámero que se une al componente celular. El oligonucleótido específico del aptámero se puede conjugar con el aptámero que se une al componente celular. El oligonucleótido específico del aptámero se puede conjugar con el aptámero que se une al componente celular a través de un grupo químico seleccionado del grupo que consiste en un grupo fotoescindible por UV, una estreptavidina, una biotina, una amina y una combinación de los mismos. El oligonucleótido específico del aptámero se puede unir covalentemente al aptámero que se une al componente celular.
[0383] En algunas formas de realización, el oligonucleótido específico de aptámero puede comprender una secuencia marcadora molecular, un sitio de unión para un cebador universal, o ambos. La secuencia del marcador molecular puede tener una longitud de 2 a 20 nucleótidos. El cebador universal puede tener una longitud de 5 a 50 nucleótidos. El cebador universal puede comprender un cebador de amplificación, un cebador de secuenciación o una combinación de los mismos.
Secuencia de alineación
[0384] En algunas formas de realización, el oligonucleótido específico de aptámero comprende una secuencia de alineación adyacente a la región poli(dA). La secuencia de alineación puede tener 1 o más nucleótidos de longitud. La secuencia de alineación puede tener una longitud de 2 nucleótidos. La secuencia de alineación puede comprender una guanina, una citosina, una timina, un uracilo o una combinación de los mismos. La secuencia de alineación puede comprender una región poli(dT), una región poli(dG), una región poli(dC), una región poli(dU), o una combinación de las mismas.
Aptámero
[0385] En algunas formas de realización, el aptámero que se une al componente celular comprende un aptámero de nucleótido. El aptámero de nucleótidos puede comprender ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN), ácido xenonucleico (XNA), o una combinación de los mismos. El aptámero de nucleótido puede comprender un análogo de base. El análogo de base puede comprender un análogo de base fluorescente. El aptámero de nucleótido puede comprender un fluoróforo.
Portador
[0386] En algunas formas de realización, la pluralidad de aptámeros de unión a componentes celulares comprende un segundo aptámero de unión a componentes celulares. El aptámero que se une al componente celular y el segundo aptámero que se une al componente celular se pueden asociar con un primer vehículo. El aptámero que se une al componente celular se puede asociar con un primer vehículo, y el segundo aptámero que se une al componente celular se puede asociar con un segundo vehículo.
[0387] En algunas formas de realización, el aptámero que se une al componente celular y el segundo aptámero que se une al componente celular son al menos 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % idénticos. El aptámero que se une al componente celular y el segundo aptámero que se une a la proteína pueden ser idénticos. El aptámero que se une al componente celular y el segundo aptámero que se une al componente celular pueden ser diferentes.
[0388] En algunas formas de realización, las dianas de proteína, o las dianas de componente celular, del aptámero de unión a componente celular y el segundo aptámero de unión a componente celular son idénticas. El aptámero que se une al componente celular y el segundo aptámero que se une al componente celular pueden ser capaces de unirse a diferentes regiones de una proteína objetivo o un componente celular objetivo. Las proteínas objetivo, o los objetivos del componente celular, del aptámero que se une al componente celular y el segundo aptámero que se une al componente celular pueden ser diferentes.
[0389] En algunas formas de realización, el primer vehículo comprende nanomaterial metálico. El primer vehículo puede comprender una nanoestructura metálica, una nanopartícula metálica o una combinación de las mismas. El primer portador puede comprender nanomaterial de oro. El primer vehículo puede comprender una nanoestructura de oro, una nanopartícula de oro o una combinación de los mismos. El primer vehículo puede comprender un lisosoma, una micela, una vesícula, una membrana lipídica, una bicapa lipídica, una monocapa lipídica o una combinación de los mismos.
[0390] En algunas formas de realización, el aptámero de unión al componente celular se une al primer vehículo. El aptámero que se une al componente celular se puede unir covalentemente al primer vehículo. El aptámero de unión al componente celular se puede conjugar con el primer vehículo. El aptámero que se une al componente celular se puede conjugar con el primer vehículo a través de un grupo químico seleccionado del grupo que consiste en un grupo fotoescindible por UV, una estreptavidina, una biotina, una amina y una combinación de los mismos. El aptámero de unión al componente celular puede estar unido de forma no covalente al primer vehículo. El aptámero de unión al componente celular se puede asociar con el primer portador a través de un enlazador. El aptámero que se une al componente celular puede estar inmovilizado en el primer soporte, parcialmente inmovilizado en el primer soporte, inmovilizado en el primer soporte, parcialmente inmovilizado en el primer soporte, encerrado en el primer portador, parcialmente encerrado en el primer portador, incrustado en el primer portador, parcialmente incrustado en el primer portador, o una combinación de los mismos.
[0391] En algunas formas de realización, el primer portador está configurado para ser internalizado (o capaz de ser internalizado) en una célula. El primer portador puede configurarse para ser internalizado (o capaz de ser internalizado) en la célula mediante endocitosis, pinocitosis, nanopinocitosis, micropinocitosis, fagocitosis, fusión de membranas o una combinación de los mismos. El primer portador puede configurarse para internalizarse (o ser capaz de internalizarse) en la célula mediante internalización medicada con clatrina, internalización mediada por caveolina, internalización dependiente del receptor, internalización independiente del receptor o una combinación de los mismos.
[0392] En algunas formas de realización, el oligonucleótido específico de aptámero comprende una secuencia complementaria a una secuencia de captura configurada para capturar (o capaz de capturar, unirse o hibridarse con) la secuencia del oligonucleótido específico de aptámero. El código de barras puede comprender una región de unión al objetivo que comprende la secuencia de captura. La región de unión al objetivo puede comprender una región poli(dT). La secuencia del oligonucleótido específico del aptámero complementario a la secuencia de captura puede comprender una región poli(dA).
Eliminación de aptámeros: esponja de aptámero
[0393] En algunas formas de realización, la composición comprende una esponja de aptámero. La esponja aptámera puede comprender una pluralidad de secuencias complementarias a las secuencias de los aptámeros. La esponja de aptámeros se puede utilizar para eliminar los aptámeros que no están unidos a los objetivos.
Eliminación de aptámeros - Conformación del oligonucleótido específico del aptámero
[0394] En algunas formas de realización, el oligonucleótido específico del aptámero cambia de una primera conformación en la que la región poli(dA) es inaccesible a una segunda conformación en la que la región poli(dA) es accesible cuando el aptámero entra en contacto con al menos una de la pluralidad de proteínas objetivo o objetivos de componentes celulares. La región poli(dA) del oligonucleótido específico de aptámero en la primera conformación puede comprender una estructura de horquilla. La región poli(dA) con la estructura de horquilla puede ser accesible a la región poli(dT) de la región de unión al objetivo del código de barras. Las sondas de oligonucleótidos se pueden hibridar con los oligonucleótidos específicos de aptámero mediante la hibridación entre las regiones poli(dA) de los oligonucleótidos específicos de aptámero y las regiones poli(dT) de las sondas de oligonucleótidos.
[0395] En algunas formas de realización, los aptámeros comprenden secuencias complementarias. Los aptámeros pueden configurarse para hibridarse (o ser capaces de hibridarse) entre sí para formar un agregado. El agregado puede ser objeto de degradación en la célula.
Eliminación de aptámeros - antisentido
[0396] En algunas formas de realización, la composición comprende: una pluralidad de aptámeros antisentido, donde cada aptámero antisentido de la pluralidad de aptámeros antisentido comprende un segundo aptámero que comprende un oligonucleótido específico de aptámero antisentido que comprende la secuencia complementaria, o una parte de la misma, del oligonucleótido específico de aptámero de uno de los aptámeros, y en el que el oligonucleótido específico de aptámero y el oligonucleótido específico de aptámero antisentido forman una doble molécula de ácido desoxirribonucleico (ADN) de cadena doble o parcialmente bicatenaria.
Kit de perfilado de componentes celulares aptámeros
[0397] En el presente documento se describe un kit para perfilar componentes celulares (p. ej., para perfilar la expresión de proteínas). El kit puede comprender una composición que comprende: una pluralidad de aptámeros que se unen a componentes celulares, donde cada uno de la pluralidad de aptámeros que se unen a componentes celulares comprende un oligonucleótido específico de aptámero que comprende una secuencia de identificación única para el aptámero que se une a componentes celulares, y donde el aptámero de unión a componentes es capaz de unirse específicamente a al menos uno de una pluralidad de objetivos de componentes celulares. El kit puede incluir una partícula de código de barras para el código de barras (p. ej., código de barras estocástico) de oligonucleótidos específicos de aptámero. El kit puede incluir una esponja aptámera. Los aptámeros pueden configurarse para hibridarse (o ser capaces de hibridarse) entre sí para formar un agregado. La composición puede incluir una pluralidad de aptámeros antisentido.
Método de indexación de muestras de aptámeros
[0398] Las FIGS. 10A-10B muestran una ilustración esquemática de un flujo de trabajo ejemplar del uso de aptámeros asociados a oligonucleótidos para la indexación de muestras o la identificación de muestras. El método puede incluir poner en contacto células de cada muestra con una composición de indexación de muestras en el paso 1000a; agrupar células de diferentes muestras puestas en contacto con las composiciones de indexación de muestras en el paso 1000b; coparticionar células individuales de células agrupadas con perlas individuales en particiones en el paso 1000c; lisar las células y codificar con barras los oligonucleótidos de indexación de muestras de las composiciones de indexación de muestras en las particiones en el paso 1000d; y obtener datos de secuenciación de los oligonucleótidos de indexación de muestra con código de barras en el paso 1000e.
[0399] En algunas formas de realización, el método comprende: poner en contacto cada una de una pluralidad de muestras (p. ej., muestras 1004a-1004e en la FIG. 10A) con una composición de indexación de muestras de una pluralidad de composiciones de indexación de muestras, respectivamente (p. ej., en el paso 1000a en la FIG. 10A), en el que cada una de la pluralidad de muestras comprende una o más células (p. ej., las células 1008a-1008e en la FIG. 10A), cada una de las cuales comprende una o más proteínas objetivo, en el que la composición de indexación de la muestra comprende una composición de aptámero (p. ej., composiciones de aptámeros 1012a-1012e descritas con referencia a las FIGS.
10A-10B) que comprenden un aptámero (p. ej., aptámeros 1016a-1016e) y un oligonucleótido de indexación de muestra (p. ej., oligonucleótidos de indexación de muestra 1020a-1020e), donde el aptámero es capaz de unirse específicamente a al menos uno de uno o más objetivos proteicos, donde el oligonucleótido de indexación de muestra comprende una secuencia de indexación de muestra, y donde las secuencias de indexación de muestra de al menos dos composiciones de indexación de muestra de la pluralidad de composiciones de indexación de muestra comprenden diferentes secuencias. Las secuencias de indexación (también denominadas aquí identificadores de aptámeros o códigos de barras) 1020a-1020e tienen secuencias diferentes, como se ilustra en la FIG. 10A. El método puede incluir el código de barras (p. ej., en el paso 1000d en la FIG. 10) de los oligonucleótidos de indexación de la muestra usando una pluralidad de códigos de barras (p. ej., los códigos de barras 1024a-1024c asociados con una perla 1028 en la FIG. 10B) para generar una pluralidad de códigos de barras de la muestra. oligonucleótidos de indexación; obtener datos de secuenciación de la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras; e identificar el origen de la muestra de al menos una célula de una o más células basándose en la secuencia de indexación de muestras de al menos un oligonucleótido de indexación de muestras con código de barras de la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras.
[0400] En algunas formas de realización, el método comprende: poner en contacto cada una de una pluralidad de muestras con una composición de indexación de muestras de una pluralidad de composiciones de indexación de muestras, respectivamente, donde cada una de la pluralidad de muestras comprende una o más células, cada una de las cuales comprende una o más objetivos de componentes celulares, donde la composición de indexación de muestras comprende una composición de aptámero que comprende un aptámero y un oligonucleótido de indexación de muestras, donde el aptámero es capaz de unirse específicamente a al menos uno de uno o más objetivos de componentes celulares, donde el oligonucleótido de indexación de muestras comprende una secuencia de indexación de muestras, y donde las secuencias de indexación de muestras de al menos dos composiciones de indexación de muestras de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras comprenden secuencias diferentes; e identificar el origen de la muestra de al menos una célula de una o más células basándose en la secuencia de indexación de muestra de al menos un oligonucleótido de indexación de muestra de la pluralidad de composiciones de indexación de muestra.
[0401] En algunas formas de realización, el componente celular objetivo comprende una proteína objetivo. En algunas formas de realización, identificar el origen de la muestra de al menos una célula comprende: codificar con barras oligonucleótidos de indexación de muestras de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras usando una pluralidad de códigos de barras para generar una pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con códigos de barras; obtener datos de secuenciación de la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras; e identificar el origen de la muestra de la célula basándose en la secuencia de indexación de muestra de al menos un oligonucleótido de indexación de muestra con código de barras de la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestra con código de barras en los datos de secuenciación.
[0402] La longitud del oligonucleótido de indexación de muestra puede ser diferente en diferentes implementaciones. En algunas formas de realización, la longitud del oligonucleótido de indexación de muestra puede ser, o puede ser aproximadamente, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760 o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, la longitud del oligonucleótido de indexación de muestra puede ser al menos, o puede ser como máximo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990 o 1000.
[0403] La longitud de la secuencia de indexación de muestra puede ser diferente en diferentes implementaciones. En algunas formas de realización, la longitud de la secuencia de indexación de muestra puede ser, o puede ser aproximadamente, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, o un número o rango entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, la longitud de la secuencia de indexación de muestra puede ser al menos, o puede ser como máximo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990 o 1000.
[0404] El número de composiciones de indexación de muestras de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras que comprenden secuencias de indexación de muestras con diferentes secuencias puede ser diferente en diferentes implementaciones. En algunas formas de realización, el número de composiciones de indexación de muestras que comprenden secuencias de indexación de muestras con diferentes secuencias puede ser, o puede ser aproximadamente, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, el número de composiciones de indexación de muestras que comprenden secuencias de indexación de muestras con diferentes secuencias puede ser al menos, o puede ser como máximo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990 o 1000.
Identificación de origen de muestra
[0405] En algunas formas de realización, identificar el origen de la muestra de al menos una célula comprende identificar la presencia o ausencia de la secuencia de indexación de muestra de al menos un oligonucleótido de indexación de muestra de la pluralidad de composiciones de indexación de muestra. Identificar la presencia o ausencia de la secuencia de indexación de muestra puede comprender: replicar el al menos un oligonucleótido de indexación de muestra para generar una pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestra replicados; obtener datos de secuenciación de la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras replicadas; e identificar el origen de la muestra de la célula basándose en la secuencia de indexación de muestra de un oligonucleótido de indexación de muestra replicado de la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestra que corresponden al menos un oligonucleótido de indexación de muestra con código de barras en los datos de secuenciación.
Composiciones de indexación de muestras
[0406] En algunas formas de realización, la composición de indexación de muestras de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras comprende un segundo aptámero no asociado con el oligonucleótido de indexación de muestras. El aptámero y el segundo aptámero pueden ser idénticos. El número de aptámeros en la composición de indexación de muestra puede ser diferente en diferentes implementaciones. En algunas formas de realización, cada una de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras comprende el aptámero.
[0407] En algunas formas de realización, el número de aptámeros en la composición de indexación de muestra puede ser, o puede ser aproximadamente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, el número de aptámeros en la composición de indexación de muestra puede ser al menos, o puede ser como máximo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990 o 1000.
Oligonucleótidos de indexación de muestras
[0408] En algunas formas de realización, un solo polinucleótido comprende el oligonucleótido de indexación de la muestra y el aptámero. El aptámero puede estar en 5' con respecto al oligonucleótido de indexación de la muestra en el polinucleótido único. El aptámero puede estar en 3' con respecto al oligonucleótido de indexación de la muestra en el polinucleótido único. El oligonucleótido de indexación de muestra se puede asociar con el aptámero. El oligonucleótido de indexación de la muestra se puede unir al aptámero. El oligonucleótido de indexación de muestra se puede unir covalentemente al aptámero. El oligonucleótido de indexación de la muestra se puede conjugar con el aptámero. El oligonucleótido de indexación de la muestra se puede conjugar con el aptámero a través de un grupo químico seleccionado del grupo que consiste en un grupo fotoescindible por UV, una estreptavidina, una biotina, una amina y una combinación de los mismos. En algunas formas de realización, el oligonucleótido de indexación de la muestra se puede unir de forma no covalente al aptámero. El oligonucleótido de indexación de muestra se puede asociar con el aptámero a través de un enlazador.
[0409] En algunas formas de realización, el oligonucleótido de indexación de muestra está configurado para ser (o puede ser) no separable del aptámero. El oligonucleótido de indexación de muestra puede configurarse para ser (o puede ser) separable del aptámero. El método puede comprender separar el oligonucleótido de indexación de la muestra del aptámero. Separar el oligonucleótido de indexación de la muestra puede comprender separar el oligonucleótido de indexación de la muestra del aptámero mediante fotoescisión UV, tratamiento químico, calentamiento, tratamiento con enzimas o cualquier combinación de los mismos.
[0410] En algunas formas de realización, la secuencia de indexación de la muestra tiene una longitud de 6-60 nucleótidos. El oligonucleótido de indexación de muestra puede tener una longitud de 50-500 nucleótidos. Las secuencias de indexación de muestras de al menos 10, 100 o 1000 composiciones de indexación de muestras de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras pueden comprender diferentes secuencias.
[0411] El oligonucleótido de indexación de muestra puede comprender una secuencia marcadora molecular, un sitio de unión para un cebador universal, o ambos. La secuencia del marcador molecular puede tener una longitud de 2 a 20 nucleótidos. El cebador universal puede tener una longitud de 5 a 50 nucleótidos. El cebador universal puede comprender un cebador de amplificación (por ejemplo, una secuencia Illumina P7 o una subsecuencia de la misma), un cebador de secuenciación (por ejemplo, una secuencia Illumina R2 o una subsecuencia de la misma) o una combinación de los mismos. En algunas formas de realización, la longitud de un marcador molecular o un sitio de unión para un cebador universal de un oligonucleótido de indexación de muestra puede ser, o puede ser aproximadamente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, o un número o rango entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, la longitud de un marcador molecular o un sitio de unión para un cebador universal de un oligonucleótido de indexación de muestra puede ser al menos, o puede ser como máximo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100.
[0412] En algunas formas de realización, el oligonucleótido de indexación de muestra no es homólogo a secuencias genómicas de cualquiera de una o más células, es homóloga a las secuencias genómicas de una especie, o una combinación de las mismas. La especie puede ser una especie no mamífera.
[0413] En algunas formas de realización, el oligonucleótido de indexación de muestra comprende una secuencia complementaria a una secuencia de captura configurada para capturar (o capaz de capturar, hibridarse o unirse a) la secuencia del oligonucleótido de indexación de muestra. El código de barras puede comprender una región de unión al objetivo que comprende la secuencia de captura. La región de unión al objetivo puede comprender una región poli(dT). La secuencia del oligonucleótido de indexación de muestra complementaria a la secuencia de captura puede comprender una región poli(dA).
Secuencia de alineación
[0414] En algunas formas de realización, el oligonucleótido de indexación de la muestra comprende una secuencia de alineación adyacente a la región poli(dA). La secuencia de alineación puede tener 1 o más nucleótidos de longitud. La secuencia de alineación puede tener una longitud de 2 o más nucleótidos. La secuencia de alineación puede comprender una guanina, una citosina, una timina, un uracilo o una combinación de los mismos. La secuencia de alineación puede comprender una región poli(dT), una región poli(dG), una región poli(dC), una región poli(dU), o una combinación de las mismas.
Aptámero
[0415] El aptámero comprende un aptámero de nucleótido. El aptámero de nucleótido puede comprender ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN), ácido xenonucleico (XNA) o una combinación de los mismos. El aptámero de nucleótido puede comprender un análogo de base. El análogo de base puede comprender un análogo de base fluorescente. El aptámero de nucleótido puede comprender un fluoróforo.
[0416] En algunas formas de realización, el aptámero está asociado con dos o más oligonucleótidos de indexación de muestra con una secuencia idéntica. El aptámero se puede asociar con dos o más oligonucleótidos de indexación de muestra con diferentes secuencias de indexación de muestra.
Portador
[0417] En algunas formas de realización, la composición de indexación de muestras se puede asociar con un primer portador. Diferentes composiciones de indexación de muestras de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras se pueden asociar con diferentes primeros soportes. El número de portadores puede ser diferente en diferentes implementaciones. En algunas formas de realización, el número de portadores puede ser, o puede ser aproximadamente, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, el número de portadores puede ser al menos, o puede ser como máximo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990 o 1000.
[0418] En algunas formas de realización, el primer portador comprende nanomaterial metálico. El primer vehículo puede comprender una nanoestructura metálica, una nanopartícula metálica o una combinación de las mismas. El primer portador puede comprender nanomaterial de oro. El primer vehículo puede comprender una nanoestructura de oro, una nanopartícula de oro o una combinación de los mismos. El primer vehículo puede comprender un lisosoma, una micela, una vesícula, una membrana lipídica, una bicapa lipídica, una monocapa lipídica o una combinación de los mismos.
[0419] En algunas formas de realización, el aptámero se puede unir al primer vehículo. El aptámero se puede unir covalentemente al primer vehículo. El aptámero se puede conjugar con el primer vehículo. El aptámero se puede conjugar con el primer vehículo a través de un grupo químico seleccionado del grupo que consiste en un grupo fotoescindible por UV, una estreptavidina, una biotina, una amina y una combinación de los mismos. El aptámero se puede unir de forma no covalente al primer vehículo. El aptámero se puede asociar con el primer portador a través de un enlazador. El aptámero puede estar inmovilizado en el primer portador, parcialmente inmovilizado en el primer portador, inmovilizado en el primer portador, parcialmente inmovilizado en el primer portador, encerrado en el primer portador, parcialmente encerrado en el primer portador, incrustado en el primer portador, parcialmente incrustado en el primer portador, o una combinación de los mismos.
[0420] En algunas formas de realización, el método comprende disociar el aptámero del primer vehículo. La disociación puede ocurrir después de codificar con barras los oligonucleótidos de indexación de la muestra. La disociación puede ocurrir antes de codificar con barras los oligonucleótidos de indexación de la muestra.
[0421] En algunas formas de realización, poner en contacto cada una de la pluralidad de muestras con la composición de indexación de muestras comprende poner en contacto una célula de una o más células de la muestra con la composición de indexación de muestras. El primer portador se puede internalizar en la célula. El primer portador se puede internalizar en la célula mediante endocitosis, pinocitosis, nanopinocitosis, micropinocitosis, fagocitosis, fusión de membranas o una combinación de los mismos. El primer portador se puede internalizar en la célula a través de la internalización medicada con clatrina, la internalización mediada por caveolina, la internalización dependiente del receptor, la internalización independiente del receptor o una combinación de las mismas.
Segundo aptámero de unión a proteínas
[0422] En algunas formas de realización, la composición de indexación de muestras de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras comprende una segunda composición de aptámero que comprende un segundo aptámero de unión a proteínas, y el segundo aptámero es capaz de unirse específicamente a al menos una de uno o más objetivos proteicos, o a al menos uno de uno o más objetivos de componentes celulares. El aptámero y el segundo aptámero pueden ser capaces de unirse a la misma proteína objetivo de una o más proteínas objetivo, o de uno o más objetivos de componente celular, y donde el segundo aptámero no está asociado con el oligonucleótido de indexación de la muestra.
El segundo aptámero se puede asociar con un segundo oligonucleótido de indexación de muestra que comprende una segunda secuencia de indexación de muestra. El aptámero y el segundo aptámero pueden ser al menos 60 %, 70 %, 80
%, 90 % o 95 % idénticos. El aptámero y el segundo aptámero pueden ser idénticos. El aptámero y el segundo aptámero pueden ser diferentes.
[0423] El número de diferentes aptámeros puede ser diferente en diferentes implementaciones. En algunas formas de realización, el número de aptámeros puede ser, o puede ser aproximadamente, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,
15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230,
240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570,
580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810,
820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, el número de aptámeros diferentes puede ser al menos, o puede ser como máximo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80,
90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 410, 420,
430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660,
670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900,
910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990 o 1000.
[0424] La identidad de secuencia del aptámero y el segundo aptámero puede ser diferente en diferentes implementaciones. En algunas formas de realización, el aptámero y el segundo aptámero pueden tener una identidad de secuencia de aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16
%, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 30 %, 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 %, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, el aptámero y el segundo aptámero pueden tener una identidad de secuencia de al menos, o como máximo, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %., 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %,
19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 30 %, 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %.
[0425] El aptámero y el segundo aptámero pueden ser capaces de unirse a diferentes regiones de la misma proteína objetivo, o diferentes regiones del mismo componente celular objetivo. El aptámero y el segundo aptámero pueden ser capaces de unirse a diferentes objetivos proteicos de uno o más objetivos proteicos, o diferentes objetivos de componentes celulares de uno o más objetivos de componentes celulares. La secuencia de indexación de muestra y la segunda secuencia de indexación de muestra pueden ser idénticas. La secuencia de indexación de muestra y la segunda secuencia de indexación de muestra pueden ser diferentes.
[0426] En algunas formas de realización, la composición de aptámero se puede asociar con un primer vehículo. La composición de aptámero puede comprender: un segundo aptámero capaz de unirse específicamente a al menos una o más proteínas objetivo o uno o más objetivos de componentes celulares, y un segundo oligonucleótido de indexación de muestra que comprende una segunda secuencia de indexación de muestra. El aptámero y el segundo aptámero pueden estar asociados con un primer vehículo. El aptámero se puede asociar con un primer vehículo y el segundo aptámero se asocia con un segundo vehículo. El aptámero y el segundo aptámero pueden tener al menos un 60 %, 70 %, 80 %, 90 %
o 95 % de secuencia idéntica. El aptámero y el segundo aptámero pueden ser idénticos, por ejemplo, en secuencia. El aptámero y el segundo aptámero pueden ser diferentes. Las dianas de proteínas, o los objetivos de componentes celulares, del aptámero y el segundo aptámero pueden ser idénticas, por ejemplo, en secuencia. El aptámero y el segundo aptámero pueden ser capaces de unirse a diferentes regiones de una proteína objetivo o un componente celular objetivo.
Las proteínas objetivo, o los objetivos de componentes celulares, del aptámero y el segundo aptámero pueden ser diferentes.
Objetivos y muestras
[0427] En algunas formas de realización, una muestra de la pluralidad de muestras comprende una pluralidad de células, una pluralidad de células individuales, un tejido, una muestra de tumor o cualquier combinación de los mismos. La pluralidad de muestras puede comprender una célula de mamífero, una célula bacteriana, una célula vírica, una célula de levadura, una célula fúngica o cualquier combinación de las mismas.
[0428] En algunas formas de realización, al menos uno de uno o más objetivos de proteínas, o uno o más objetivos de componentes celulares, está en una superficie celular. En algunas formas de realización, la proteína objetivo o el componente celular objetivo comprende un carbohidrato, un lípido, una proteína, una proteína extracelular, una proteína de superficie celular, un marcador celular, un receptor de células B, un receptor de células T, un complejo principal de histocompatibilidad, un antígeno tumoral, un receptor, una proteína intracelular o cualquier combinación de los mismos.
La proteína objetivo, o el componente celular objetivo, se puede seleccionar de un grupo que comprende 10-100 proteínas objetivo o componentes celulares objetivo diferentes.
[0429] El número de objetivo(s) de proteína, o el(los) objetivo(s) de componente celular puede ser diferente en diferentes implementaciones. En algunas formas de realización, el número de objetivos puede ser, o puede ser aproximadamente,
1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 14 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, o un número o un rango entre cualquiera de estos dos valores. En algunas formas de realización, el número de objetivos puede ser al menos, o puede ser como máximo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,
18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260,
270, 280, 290, 300, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600,
610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 8, 403, 850,
860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990 o 1000.
Flujo de trabajo de indexación de muestras
[0430] En algunas formas de realización, el método comprende eliminar las composiciones de indexación de muestra no unida de la pluralidad de composiciones de indexación de muestra. La eliminación de las composiciones de indexación de muestras no unidas puede comprender el lavado de una o más células de cada una de la pluralidad de muestras con un tampón de lavado. Eliminar las composiciones de indexación de muestras no unidas puede comprender seleccionar células unidas a al menos un aptámero usando citometría de flujo. En algunas formas de realización, el método comprende lisar una o más células de cada una de la pluralidad de muestras (p. ej., en el paso 1000d en la FIG. 10B).
[0431] En algunas formas de realización, replicar al menos un oligonucleótido de indexación de muestra para generar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestra replicados comprende: antes de replicar al menos un oligonucleótido de indexación de muestra con código de barras, ligar un adaptador de replicación a al menos un oligonucleótido de indexación de muestra con código de barras, y en el que la replicación del al menos un oligonucleótido de indexación de muestras con código de barras comprende la replicación del al menos un oligonucleótido de indexación de muestras con código de barras usando el adaptador de replicación ligado al al menos un oligonucleótido de indexación de muestras con código de barras para generar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras replicados.
En algunas formas de realización, replicar al menos un oligonucleótido de indexación de muestras para generar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras replicados comprende: antes de replicar al menos un oligonucleótido de indexación de muestras con código de barras, poner en contacto una sonda de captura con al menos un oligonucleótido de indexación de muestras para generar una sonda de captura hibridada con el oligonucleótido de indexación de la muestra; y extender la sonda de captura hibridada con el oligonucleótido de indexación de muestra (p.
ej., en el paso 1000e en la FIG. 10B) para generar un oligonucleótido de indexación de muestra asociado con la sonda de captura. La replicación del al menos un oligonucleótido de indexación de muestras puede comprender la replicación del oligonucleótido de indexación de muestras asociado con la sonda de captura para generar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras replicados.
Códigos de barras y codificación de barras
[0432] En algunas formas de realización, el método comprende: antes de codificar con barras los oligonucleótidos de indexación de muestras, agrupar la pluralidad de muestras en contacto con la pluralidad de composiciones de indexación de muestras (p. ej., en el paso 1000b en la FIG. 10A).
[0433] En algunas formas de realización, un código de barras de la pluralidad de códigos de barras comprende una región de unión al objetivo y una secuencia de etiquetas moleculares, y las secuencias de etiquetas moleculares de al menos dos códigos de barras de la pluralidad de códigos de barras comprenden diferentes secuencias de etiquetas de moléculas.
El código de barras puede comprender una secuencia de etiquetas celulares, un sitio de unión para un cebador universal o cualquier combinación de los mismos. La región de unión al objetivo puede comprender una región poli(dT).
[0434] En algunas formas de realización, la pluralidad de códigos de barras está asociada con una partícula. Al menos un código de barras de la pluralidad de códigos de barras puede estar inmovilizado en la partícula, parcialmente inmovilizado en la partícula, encerrado en la partícula, parcialmente encerrado en la partícula o una combinación de los mismos. La partícula puede ser disruptible. La partícula puede comprender una perla. La partícula puede comprender una perla de sefarosa, una perla de estreptavidina, una perla de agarosa, una perla magnética, una perla conjugada, una perla conjugada de proteína A, una perla conjugada de proteína G, una perla conjugada de proteína NG, una perla conjugada de proteína L, una perla conjugada con oligo(dT), una perla de sílice, una perla similar a la sílice, una perla de hidrogel,
una microperla antibiotina, una microperla antifluorocromo o cualquier combinación de los mismos, o donde la partícula comprende un material seleccionado del grupo compuesto por polidimetilsiloxano (PDMS), poliestireno, vidrio, polipropileno, agarosa, gelatina, hidrogel, paramagnético, cerámico, plástico, vidrio, metilestireno, polímero acrílico, titanio, látex, sefarosa, celulosa, nailon, silicona y cualquier combinación de los mismos. La partícula puede comprender una perla de hidrogel rompible.
[0435] En algunas formas de realización, los códigos de barras de la partícula comprenden secuencias de etiquetas moleculares seleccionadas de al menos 1000, 10000, o una combinación de las mismas, secuencias de etiquetas moleculares diferentes. Las secuencias de etiquetas moleculares de los códigos de barras pueden comprender secuencias aleatorias. La partícula puede comprender al menos 10000 códigos de barras.
[0436] En algunas formas de realización, la codificación de barras de los oligonucleótidos de indexación de muestras usando la pluralidad de códigos de barras comprende: poner en contacto la pluralidad de códigos de barras con los oligonucleótidos de indexación de muestras para generar códigos de barras hibridados con los oligonucleótidos de indexación de muestras; y extender los códigos de barras hibridados a los oligonucleótidos de indexación de muestras para generar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras.
[0437] En algunas formas de realización, el método comprende, antes de extender los códigos de barras hibridados a los oligonucleótidos de indexación de muestra, agrupar los códigos de barras hibridados a los oligonucleótidos de indexación de muestra, y en donde extender los códigos de barras hibridados a los oligonucleótidos de indexación de muestra comprende extender los códigos de barras agrupados hibridados a los oligonucleótidos de indexación de muestras para generar una pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras agrupados con código de barras. La extensión de los códigos de barras puede comprender la extensión de los códigos de barras usando una ADN polimerasa para generar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras. La extensión de los códigos de barras puede comprender la extensión de los códigos de barras utilizando una transcriptasa inversa para generar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras.
[0438] En algunas formas de realización, el método comprende: amplificar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestra con código de barras para producir una pluralidad de amplicones. La amplificación de la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras puede comprender la amplificación, usando la reacción en cadena polimerasa (PCR), al menos una parte de la secuencia del marcador molecular y al menos una parte del oligonucleótido de indexación de la muestra. La obtención de datos de secuenciación de la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras puede comprender la obtención de datos de secuenciación de la pluralidad de amplicones. La obtención de los datos de secuenciación puede comprender la secuenciación de al menos una parte de la secuencia del marcador molecular y al menos una parte del oligonucleótido de indexación de la muestra.
[0439] En algunas formas de realización, la codificación de barras de los oligonucleótidos de indexación de muestra usando la pluralidad de códigos de barras para generar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestra con código de barras comprende la codificación de barras estocástica de los oligonucleótidos de indexación de muestra usando una pluralidad de códigos de barras estocásticos para generar una pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestra con código de barras estocástico.
[0440] En algunas formas de realización, el método comprende: codificar en barras una pluralidad de objetivos de la célula usando la pluralidad de códigos de barras para generar una pluralidad de objetivos con código de barras, donde cada uno de la pluralidad de códigos de barras comprende una secuencia de etiqueta de célula, y donde al menos dos los códigos de barras de la pluralidad de códigos de barras comprenden una secuencia de etiquetas de célula idéntica; y obtener datos de secuenciación de los objetivos con código de barras. La codificación de barras de la pluralidad de objetivos utilizando la pluralidad de códigos de barras para generar la pluralidad de objetivos con código de barras puede comprender: poner en contacto copias de los objetivos con regiones de unión de objetivos de los códigos de barras; y la transcripción inversa de la pluralidad de objetivos utilizando la pluralidad de códigos de barras para generar una pluralidad de objetivos transcriptos inversamente. El método puede comprender: antes de obtener los datos de secuenciación de la pluralidad de objetivos con código de barras, amplificar los objetivos con código de barras para generar una pluralidad de objetivos con código de barras amplificados. La amplificación de los objetivos con código de barras para generar la pluralidad de objetivos con código de barras amplificados puede comprender: la amplificación de los objetivos con código de barras mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La codificación de barras de la pluralidad de objetivos de la célula utilizando la pluralidad de códigos de barras para generar la pluralidad de objetivos con código de barras puede comprender la codificación estocástica de la pluralidad de objetivos de la célula utilizando una pluralidad de códigos de barras estocásticos para generar una pluralidad de objetivos con código de barras estocástico.
Composiciones de indexación de muestras de aptámeros
[0441] En el presente documento se describen formas de realización de una pluralidad de composiciones de indexación de muestras. En algunas formas de realización, cada una de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras comprende una composición de aptámero que comprende un primer aptámero de unión a componente celular y un oligonucleótido de indexación de muestra, un único polinucleótido comprende el oligonucleótido de indexación de muestra y el aptámero, el aptámero de unión a componente celular es capaz de unirse específicamente a al menos un componente celular objetivo, el oligonucleótido de indexación de muestra comprende una secuencia de indexación de muestra para identificar el origen de la muestra de una o más células de una muestra, el oligonucleótido de indexación de muestra comprende una secuencia complementaria a una secuencia de captura configurada para capturar la secuencia del oligonucleótido de indexación de muestras, en el que la secuencia del oligonucleótido de indexación de muestras complementaria a la secuencia de captura comprende una región poli(dA), y las secuencias de indexación de muestras de al menos dos composiciones de indexación de muestras de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras comprenden secuencias diferentes.
Aptámero de unión al segundo componente celular
[0442] En algunas formas de realización, la composición de indexación de muestras comprende un segundo aptámero de unión a componentes celulares, y donde el segundo aptámero de unión a componentes celulares es capaz de unirse específicamente a al menos uno de uno o más objetivos de componentes celulares.
[0443] El aptámero de unión a componente celular y el segundo aptámero de unión a componente celular pueden ser capaces de unirse al mismo objetivo de componente celular de uno o más objetivos de componente celular, y el segundo aptámero de unión a componente celular puede no estar asociado con el oligonucleótido de indexación de la muestra. El segundo aptámero de unión al componente celular se puede asociar con un segundo oligonucleótido de indexación de muestra que comprende una segunda secuencia de indexación de muestra. La secuencia de indexación de muestra y la segunda secuencia de indexación de muestra pueden ser idénticas. La secuencia de indexación de muestra y la segunda secuencia de indexación de muestra pueden ser diferentes.
[0444] En algunas formas de realización, el aptámero de unión al componente celular y el segundo aptámero de unión al componente celular son idénticos en secuencia al menos en un 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 %. El aptámero que se une al componente celular y el segundo aptámero que se une al componente celular pueden ser idénticos. El aptámero de unión al componente celular y el segundo aptámero de unión al componente celular pueden ser capaces de unirse a diferentes regiones de la misma proteína objetivo. El aptámero que se une al componente celular y el segundo aptámero que se une al componente celular pueden ser capaces de unirse a diferentes proteínas objetivo de una o más proteínas objetivo.
Oligonucleótido de indexación de muestra
[0445] Un único polinucleótido comprende el oligonucleótido de indexación de muestra y el aptámero de unión al componente celular. El aptámero puede estar en 5' con respecto al oligonucleótido de indexación de la muestra en el polinucleótido único. El aptámero puede estar en 3' con respecto al oligonucleótido de indexación de la muestra en el polinucleótido único.
[0446] En algunas formas de realización, la secuencia de indexación de la muestra tiene una longitud de 6-60 nucleótidos. El oligonucleótido de indexación de muestra puede tener una longitud de 50-500 nucleótidos. Las secuencias de indexación de muestras de al menos 10, 100 o 1000 composiciones de indexación de muestras de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras pueden comprender diferentes secuencias.
[0447] En algunas formas de realización, el oligonucleótido de indexación de muestra comprende una secuencia de marcador molecular, una región poli(dA), o una combinación de las mismas. La secuencia del marcador molecular puede tener una longitud de 2 a 20 nucleótidos. El cebador universal puede tener una longitud de 5 a 50 nucleótidos. El cebador universal puede comprender un cebador de amplificación (por ejemplo, una secuencia Illumina P7 o una subsecuencia de la misma), un cebador de secuenciación (por ejemplo, una secuencia Illumina R2 o una subsecuencia de la misma) o una combinación de los mismos.
[0448] En algunas formas de realización, el oligonucleótido de indexación de la muestra no es homólogo a las secuencias genómicas de cualquiera de una o más células. Al menos una muestra de la pluralidad de muestras puede comprender una o más células individuales, una pluralidad de células, un tejido, una muestra de tumor o cualquier combinación de los mismos. La muestra puede comprender una muestra de mamífero, una muestra bacteriana, una muestra viral, una muestra de levadura, una muestra fúngica o cualquier combinación de las mismas.
[0449] En algunas formas de realización, el oligonucleótido de indexación de muestra comprende una secuencia complementaria a una secuencia de captura configurada para capturar (o capaz de capturar, hibridarse o unirse a) la secuencia del oligonucleótido de indexación de muestra. La región de unión al objetivo puede comprender una región poli(dT). La secuencia del oligonucleótido de indexación de muestra complementaria a la secuencia de captura puede comprender una región poli(dA).
Secuencia de alineación
[0450] En algunas formas de realización, el oligonucleótido de indexación de la muestra comprende una secuencia de alineación adyacente a la región poli(dA). La secuencia de alineación puede tener una longitud de o más nucleótidos. La secuencia de alineación puede tener una longitud de 2 o más nucleótidos. La secuencia de alineación puede comprender una guanina, una citosina, una timina, un uracilo o una combinación de los mismos. La secuencia de alineación puede comprender una región poli(dT), una región poli(dG), una región poli(dC), una región poli(dU), o una combinación de las mismas.
Aptámero
[0451] En algunas formas de realización, el aptámero de unión a proteína, o el aptámero de unión a componente celular, comprende un aptámero de nucleótido. El aptámero de nucleótido puede comprender ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN), ácido xenonucleico (XNA) o una combinación de los mismos. El aptámero de nucleótido puede comprender un análogo de base. El análogo de base puede comprender un análogo de base fluorescente. El aptámero de nucleótido puede comprender un fluoróforo.
[0452] En algunas formas de realización, el aptámero de unión al componente celular está asociado con dos o más oligonucleótidos de indexación de muestra con una secuencia idéntica. El aptámero de unión al componente celular se puede asociar con dos o más oligonucleótidos de indexación de muestra con diferentes secuencias de indexación de muestra.
Portador
[0453] En algunas formas de realización, la composición de indexación de muestras está asociada con un primer portador. Diferentes composiciones de indexación de muestras de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras se pueden asociar con diferentes primeros soportes. En algunas formas de realización, la composición de aptámero se asocia con un primer vehículo.
[0454] En algunas formas de realización, el primer vehículo comprende nanomaterial metálico. El primer vehículo puede comprender una nanoestructura metálica, una nanopartícula metálica o una combinación de las mismas. El primer portador puede comprender nanomaterial de oro. El primer vehículo puede comprender una nanoestructura de oro, una nanopartícula de oro o una combinación de los mismos. El primer vehículo puede comprender un lisosoma, una micela, una vesícula, una membrana lipídica, una bicapa lipídica, una monocapa lipídica o una combinación de los mismos.
[0455] En algunas formas de realización, el aptámero de unión al componente celular se une al primer vehículo. El aptámero que se une al componente celular se puede unir covalentemente al primer vehículo. El aptámero de unión al componente celular se puede conjugar con el primer vehículo. El aptámero que se une al componente celular se puede conjugar con el primer vehículo a través de un grupo químico seleccionado del grupo que consiste en un grupo fotoescindible por UV, una estreptavidina, una biotina, una amina y una combinación de los mismos. El aptámero de unión al componente celular puede estar unido de forma no covalente al primer vehículo. El aptámero de unión al componente celular se puede asociar con el primer portador a través de un enlazador.
[0456] En algunas formas de realización, el aptámero de unión al componente celular está inmovilizado en el primer portador, parcialmente inmovilizado en el primer portador, inmovilizado en el primer portador, parcialmente inmovilizado en el primer portador, encerrado en el primer portador, parcialmente encerrado en el primer portador, integrado en el primer soporte, parcialmente integrado en el primer soporte, o una combinación de los mismos.
[0457] En algunas formas de realización, el primer portador está configurado para ser internalizado (o capaz de ser internalizado) en la célula. El primer portador se puede internalizar en la célula mediante endocitosis, pinocitosis, nanopinocitosis, micropinocitosis, fagocitosis, fusión de membranas o una combinación de los mismos. El primer portador se puede internalizar en la célula a través de la internalización medicada con clatrina, la internalización mediada por caveolina, la internalización dependiente del receptor, la internalización independiente del receptor o una combinación de las mismas.
Segundo componente celular de unión a aptámero de unión a aptámero
[0458] En algunas formas de realización, la composición de aptámero comprende: un segundo aptámero de unión a componente celular capaz de unirse específicamente a al menos uno de uno o más objetivos de proteína o uno o más objetivos de componente celular, y un segundo oligonucleótido de indexación de muestra que comprende una segunda secuencia de indexación de muestra.
[0459] En algunas formas de realización, el aptámero que se une al componente celular y el segundo aptámero que se une al componente celular pueden tener al menos 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, o 95 % de identidad de secuencia. El aptámero que se une al componente celular y el segundo aptámero que se une al componente celular pueden ser idénticos. El aptámero que se une al componente celular y el segundo aptámero que se une al componente celular pueden ser diferentes. En algunas formas de realización, el aptámero que se une al componente celular y el segundo aptámero que se une al componente celular se pueden asociar con un primer vehículo. El aptámero que se une al componente celular se puede asociar con un primer vehículo, y el segundo aptámero que se une al componente celular se puede asociar con un segundo vehículo.
[0460] En algunas formas de realización, los objetivos de proteína, o los objetivos de componente celular, del aptámero de unión a componente celular y el segundo aptámero de unión a componente celular son idénticos. El aptámero que se une al componente celular y el segundo aptámero que se une al componente celular pueden ser capaces de unirse a diferentes regiones de una proteína objetivo o un componente celular objetivo. Los objetivos de proteínas, o los objetivos del componente celular, del aptámero que se une al componente celular y el segundo aptámero que se une al componente celular pueden ser diferentes.
Kit de indexación de muestras de aptámeros
[0461] En el presente documento se describen formas de realización de un kit para la identificación de muestras. En algunas formas de realización, el kit comprende una pluralidad de composiciones de indexación de muestras. En algunas formas de realización, el kit comprende una pluralidad de códigos de barras. Un código de barras de la pluralidad de códigos de barras comprende una región de unión al objetivo. La región de unión al objetivo puede comprender una secuencia de captura configurada para capturar (o capaz de capturar, hibridarse o unirse a) una secuencia de un oligonucleótido de indexación de muestra. Un aptámero de unión a componentes celulares puede comprender el oligonucleótido de indexación de la muestra y un primer aptámero de unión a componentes celulares.
EJEMPLOS
[0462] Algunos aspectos de las formas de realización discutidas anteriormente se describen con más detalle en los siguientes ejemplos, que de ninguna manera pretenden limitar el alcance de la presente descripción.
Ejemplo 1
Oligonucleótidos para asociar con reactivos de unión a proteínas
[0463] Este ejemplo demuestra el diseño de oligonucleótidos que pueden conjugarse con reactivos de unión a proteínas. Los oligonucleótidos se pueden usar para determinar la expresión de proteínas y la expresión génica simultáneamente. Los oligonucleótidos también se pueden usar para la indexación de muestras para determinar células de la misma muestra o de muestras diferentes.
Diseño de oligonucleótidos de 95 meros
[0464] Se usó el siguiente método para generar secuencias de oligonucleótidos candidatas y secuencias de cebadores correspondientes para la determinación simultánea de la expresión de proteínas y la expresión génica o la indexación de muestras.
1. Generación y eliminación de secuencias
[0465] Se usó el siguiente proceso para generar secuencias de oligonucleótidos candidatas para la determinación simultánea de la expresión de proteínas y la expresión génica o la indexación de muestras.
[0466] Paso 1 a. Genere aleatoriamente un número de secuencias candidatas (50000 secuencias) con la longitud deseada (45 bps).
[0467] Paso 1b. Agregue la secuencia LSRR del regulador transcripcional al extremo 5' de las secuencias generadas y una secuencia poli(dA) (25 pb) al extremo 3' de las secuencias generadas.
[0468] Paso 1c. Elimine las secuencias generadas y adjuntas que no tengan contenidos de GC en el rango de 40 % a 50 %.
[0469] Paso 1d. Elimine las secuencias restantes con una o más estructuras de horquilla cada una.
[0470] El número de secuencias de oligonucleótidos candidatas restantes fue de 423.
2. Diseño de cebadores
[0471] Se usó el siguiente método para diseñar cebadores para las 423 secuencias de oligonucleótidos candidatas restantes.
[0472] 2.1 Cebador N1: Usar la secuencia universal N1: 5'-GTTGTCAAGATGCTACCGTTCAGAG-3' (secuencia LSRR; SEQ ID NO. 5) como cebador N1.
[0473] 2.2 Cebador N2: (para amplificar oligonucleótidos de índice de muestra específicos; por ejemplo, cebador N2 en las FIGS. 11B-11D):
2.2a. Retire los cebadores N2 candidatos que no comiencen corriente abajo de la secuencia N1.
2.2b. Retire los cebadores N2 candidatos que se superponen en los últimos 35 pb de la secuencia de oligonucleótidos candidata.
2.2c. Retire los candidatos de cebadores que están alineados con el transcriptoma de las especies de células que se están estudiando utilizando los oligonucleótidos (p. ej., el transcriptoma humano o el transcriptoma de ratón).
2.2d. Utilice la secuencia ILR2 como control predeterminado (ACACGACGCTCTTCCGATCT; SEQ ID NO. 6) para minimizar o evitar las interacciones cebador-cebador.
[0474] De las 423 secuencias de oligonucleótidos candidatas, se diseñaron cebadores N2 para 390 candidatas.
3. Filtrado
[0475] Se usó el siguiente proceso para filtrar las 390 secuencias de cebadores candidatas restantes.
[0476] 3a. Elimine cualquier secuencia de oligonucleótidos candidata con una secuencia aleatoria que termine en As (es decir, la longitud efectiva de la secuencia poli(dA) es superior a 25 pb) para mantener la cola poli(dA) con la misma longitud para todos los códigos de barras.
[0477] 3b. Elimine las secuencias de oligonucleótidos candidatas con 4 o más G consecutivas (> 3 G) debido al costo adicional y al rendimiento potencialmente menor en la síntesis de oligo de ejecuciones de G.
[0478] La FIG. 11A muestra una secuencia de oligonucleótido candidata de ejemplo no limitante generada utilizando el método anterior.
Diseño de oligonucleótidos 200 meros
[0479] Se usó el siguiente método para generar secuencias de oligonucleótidos candidatas y secuencias de cebadores correspondientes para la determinación simultánea de la expresión de proteínas y la expresión génica y la indexación de muestras.
1. Generación y eliminación de secuencias
[0480] Se usó lo siguiente para generar secuencias de oligonucleótidos candidatas para la determinación simultánea de la expresión de proteínas y la expresión génica y la indexación de muestras.
[0481] 1a. Genere aleatoriamente un número de secuencias candidatas (100000 secuencias) con la longitud deseada (128 bps).
[0482] 1b. Agregue la secuencia LSRR del regulador transcripcional y una secuencia de anclaje adicional que no sea humana ni de ratón al extremo 5' de las secuencias generadas y una secuencia poli(dA) (25 pb) al extremo 3' de las secuencias generadas.
[0483] 1c. Elimine las secuencias generadas y adjuntas que no tengan contenidos de GC en el rango de 40 % a 50 %.
[0484] 1d. Ordene las secuencias de oligonucleótidos candidatas restantes en función de las puntuaciones de estructura de horquilla.
[0485] 1e. Seleccione las 1000 secuencias de oligonucleótidos candidatas restantes con las puntuaciones de horquilla más bajas.
2. Diseño de cebadores
[0486] Se usó el siguiente método para diseñar cebadores para 400 secuencias de oligonucleótidos candidatas con las puntuaciones de horquilla más bajas.
[0487] 2.1 Cebador N1: Usar la secuencia universal N1: 5'-GTTGTCAAGATGCTACCGTTCAGAG-3' (secuencia LSRR; SEQ ID NO. 5) como cebador N1.
[0488] 2.2 Cebador N2 (para amplificar oligonucleótidos de índice de muestra específicos; por ejemplo, cebador N2 en las Figuras 11B y 11C):
2.2a. Retire los cebadores N2 candidatos que no comiencen 23 nts corriente abajo de la secuencia N1 (la secuencia de anclaje era universal en todas las secuencias de oligonucleótidos candidatas).
2.2b. Retire los cebadores N2 candidatos que se superponen en los últimos 100 pb de la secuencia objetivo. Los cebadores candidatos resultantes pueden estar entre el nucleótido 48 y el nucleótido 100 de la secuencia diana.
2.2c. Retire los candidatos de cebadores que están alineados con el transcriptoma de las especies de células que se están estudiando utilizando los oligonucleótidos (p. ej., el transcriptoma humano o el transcriptoma de ratón).
2.2d. Utilice la secuencia ILR2, 5'-ACACGACGCTCTTCCGATCT-3' (SEQ ID NO. 6) como control predeterminado para minimizar o evitar las interacciones cebador-cebador.
2.2e. Elimine los candidatos de cebadores N2 que se superponen en los últimos 100 pb de la secuencia objetivo.
[0489] De las 400 secuencias de oligonucleótidos candidatas, se diseñaron cebadores N2 para 392 candidatas.
3. Filtrado
[0490] Se usó lo siguiente para filtrar las 392 secuencias de cebadores candidatas restantes.
[0491] 3a. Elimine cualquier secuencia de oligonucleótidos candidata con una secuencia aleatoria que termine en As (es decir, la longitud efectiva de la secuencia poli(dA) es superior a 25 pb) para mantener la cola poli(dA) con la misma longitud para todos los códigos de barras.
[0492] 3b. Elimine las secuencias de oligonucleótidos candidatas con 4 o más G consecutivas (> 3 G) debido al costo adicional y al rendimiento potencialmente menor en la síntesis de oligo de ejecuciones de G.
[0493] La FIG. 11B muestra una secuencia de oligonucleótido candidata de ejemplo no limitativa generada usando el método anterior. El cebador N2 anidado que se muestra en la FIG. 11B puede unirse al anticuerpo o a la secuencia específica de la muestra para la amplificación dirigida. FIG. 11C muestra la misma secuencia de oligonucleótidos candidata de ejemplo no limitante con un cebador N2 universal anidado que corresponde a la secuencia de anclaje para la amplificación dirigida. FIG. 11D muestra la misma secuencia de oligonucleótidos candidata de ejemplo no limitante con un cebador N2 para amplificación dirigida en un paso.
[0494] En conjunto, estos datos indican que las secuencias de oligonucleótidos de diferentes longitudes pueden diseñarse para la determinación simultánea de la expresión de proteínas y la expresión génica o la indexación de muestras. Las secuencias de oligonucleótidos pueden incluir una secuencia de cebador universal, una secuencia de oligonucleótidos específica de anticuerpo o una secuencia de índice de muestra y una secuencia poli(dA).
Ejemplo 2
Flujo de trabajo de anticuerpo asociado a oligonucleótido
[0495] Este ejemplo demuestra un flujo de trabajo de usar un anticuerpo conjugado con oligonucleótido para determinar el perfil de expresión de una proteína objetivo.
[0496] Se descongelan las células congeladas (p. ej., células mononucleares de sangre periférica (PBMC) congeladas) de un sujeto. Las células descongeladas se tiñen con un anticuerpo conjugado con oligonucleótidos (p. ej., un anticuerpo anti-CD4 a 0,06 μg/100 μl (dilución 1:333 de una reserva de anticuerpos conjugados con oligonucleótidos)) a una temperatura durante un tiempo (p. ej., a temperatura ambiente). durante 20 minutos). El anticuerpo conjugado con oligonucleótido se conjuga con 1, 2 o 3 oligonucleótidos ("oligonucleótidos de anticuerpo"). La secuencia del oligonucleótido del anticuerpo se muestra en la FIG. 12. Las células se lavan para eliminar el anticuerpo conjugado con oligonucleótido no unido. Las células se tiñen opcionalmente con calceína AM (BD (Franklin Lake, Nueva Jersey)) y Draq7™ (Abcam (Cambridge, Reino Unido)) para clasificarlas con citometría de flujo para obtener células de interés (p. ej., células vivas). Las células se lavan opcionalmente para eliminar el exceso de Calcein AM y Draq7™. Las células individuales teñidas con calceína AM (células vivas) y no con Draq7™ (células que no están muertas ni permeabilizadas) se clasifican mediante citometría de flujo en un cartucho BD Rhapsody™.
[0497] De los pocillos que contienen una única célula y una perla, las células individuales de los pocillos (p. ej., 3500 células vivas) se lisan en un tampón de lisis (p. ej., un tampón de lisis con DTT 5 mM). El perfil de expresión de ARNm de un objetivo (p. ej., CD4) se determina utilizando perlas BD Rhapsody™. El perfil de expresión de proteínas de un objetivo (p. ej., CD4) se determina utilizando perlas BD Rhapsody™ y los oligonucleótidos de anticuerpos. Brevemente, las moléculas de ARNm se liberan después de la lisis celular. Las perlas Rhapsody™ están asociadas con códigos de barras (p. ej., códigos de barras estocásticos), cada uno de los cuales contiene una etiqueta molecular, una etiqueta celular y una región oligo(dT). Las regiones poli(A) de las moléculas de ARNm liberadas de las células lisadas se hibridan con las regiones poli(T) de los códigos de barras estocásticos. Las regiones poli(dA) de los oligonucleótidos del anticuerpo hibridan con las regiones oligo(dT) de los códigos de barras. Las moléculas de ARNm se transcribieron inversamente utilizando los códigos de barras. Los oligonucleótidos de anticuerpos se replican utilizando los códigos de barras. La transcripción inversa y la replicación ocurren opcionalmente en una alícuota de muestra al mismo tiempo.
[0498] Los productos transcritos inversamente y los productos replicados se amplifican por PCR usando cebadores para determinar los perfiles de expresión de ARNm de genes de interés, usando cebadores N1, y el perfil de expresión de proteína de un objetivo, usando el cebador N1 de oligonucleótido de anticuerpo. Por ejemplo, los productos de transcripción inversa y los productos replicados se pueden amplificar por PCR durante 15 ciclos a una temperatura de hibridación de 60 grados usando cebadores para determinar los perfiles de expresión de ARNm de 488 genes del panel sanguíneo, usando cebadores N1 del panel sanguíneo y el perfil de expresión de la proteína CD4, utilizando el cebador N1 del oligonucleótido de anticuerpo ("PCR 1"). El exceso de códigos de barras se elimina opcionalmente con la limpieza de Ampure. Los productos de PCR 1 se dividen opcionalmente en dos alícuotas, una alícuota para determinar los perfiles de expresión de ARNm de los genes de interés, utilizando los cebadores N2 para los genes de interés, y una alícuota para determinar el perfil de expresión de proteínas del objetivo de interés, utilizando el cebador N2 del oligonucleótido de anticuerpo ("PCR 2"). Ambas alícuotas se amplifican por PCR (p. ej., durante 15 ciclos a una temperatura de hibridación de 60 grados). La expresión de la proteína del objetivo en las células se determina en base a los oligonucleótidos del anticuerpo como se ilustra en la FIG. 12 ("PCR 2"). Los datos de secuenciación se obtienen y analizan después de la adición del adaptador de secuenciación ("PCR 3"), como la ligadura del adaptador de secuenciación. Los tipos de células se determinan en función de los perfiles de expresión de ARNm de los genes de interés.
[0499] En conjunto, este ejemplo describe el uso de un anticuerpo conjugado con oligonucleótido para determinar el perfil de expresión de proteínas de un objetivo de interés. Este ejemplo describe además que el perfil de expresión de proteínas del objetivo de interés y los perfiles de expresión de ARNm de genes de interés pueden determinarse simultáneamente.

Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Un método para la identificación de muestras, que comprende:
poner en contacto cada una de una pluralidad de muestras con una composición de indexación de muestras de una pluralidad de composiciones de indexación de muestras, respectivamente,
en el que cada una de la pluralidad de muestras comprende una o más células, cada una de las cuales comprende una o más objetivos de componentes celulares, donde la composición de indexación de muestra comprende una composición de aptámero que comprende un aptámero y un oligonucleótido de indexación de muestra, donde un solo polinucleótido comprende el oligonucleótido de indexación de muestra y el aptámero, donde el aptámero es capaz de unirse específicamente a al menos uno de los o más objetivos de componentes celulares,
en el que el oligonucleótido de indexación de muestra comprende una secuencia de indexación de muestra, y donde las secuencias de indexación de muestra de al menos dos composiciones de indexación de muestra de la pluralidad de composiciones de indexación de muestra comprenden secuencias diferentes; e
identificar el origen de la muestra de al menos una célula de una o más células basándose en la secuencia de indexación de muestra de al menos un oligonucleótido de indexación de muestra de la pluralidad de composiciones de indexación de muestra.
2. El método de la reivindicación 1, en el que:
(a) identificar el origen de la muestra de al menos una célula comprende:
oligonucleótidos de indexación de muestra con código de barras de la pluralidad de composiciones de indexación de muestra usando una pluralidad de códigos de barras para generar una pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestra con código de barras;
obtener datos de secuenciación de la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras; e
identificar el origen de la muestra de la célula basándose en la secuencia de indexación de muestras de al menos un oligonucleótido de indexación de muestras con código de barras de la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras con código de barras en los datos de secuenciación;
(b) identificar el origen de la muestra de al menos una célula comprende identificar la presencia o ausencia de la secuencia de indexación de muestra de al menos un oligonucleótido de indexación de muestra de la pluralidad de composiciones de indexación de muestra, opcionalmente en donde identificar la presencia o ausencia de la secuencia de indexación de muestra la secuencia comprende:
replicar el al menos un oligonucleótido de indexación de muestra para generar una pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestra replicados;
obtener datos de secuenciación de la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras replicadas; e
identificar el origen de la muestra de la célula basándose en la secuencia de indexación de muestra de un oligonucleótido de indexación de muestra replicado de la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestra que corresponden al menos un oligonucleótido de indexación de muestra con código de barras en los datos de secuenciación; y opcionalmente en el que replicar al menos un oligonucleótido de indexación de muestras para generar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras replicados comprende:
(i) antes de replicar al menos un oligonucleótido de indexación de muestras con código de barras, ligar un adaptador de replicación a al menos un oligonucleótido de indexación de muestras con código de barras, y en el que replicar el al menos un oligonucleótido de indexación de muestras con código de barras comprende replicar el al menos un oligonucleótido de indexación de muestras con código de barras usando el adaptador de replicación ligado al al menos un oligonucleótido de indexación de muestras con código de barras para generar la pluralidad de oligonucleótidos de indexación de muestras replicados; o (ii) antes de replicar el al menos un oligonucleótido de indexación de muestra con código de barras, poner en contacto una sonda de captura con el al menos un oligonucleótido de indexación de muestra para generar una sonda de captura hibridada con el oligonucleótido de indexación de muestra; y extender la sonda de captura hibridada con el oligonucleótido de indexación de muestra para generar un oligonucleótido de indexación de muestra asociado con la sonda de captura, y en el que replicar el al menos un oligonucleótido de indexación de muestra comprende replicar el oligonucleótido de indexación de muestra asociado con la sonda de captura para generar la pluralidad de oligonucleótidos replicados oligonucleótidos de indexación de muestras.
3. Una pluralidad de composiciones de indexación de muestras,
en el que cada una de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras comprende una composición de aptámero que comprende un primer aptámero de unión al componente celular y un oligonucleótido de indexación de muestras,
en el que un solo polinucleótido comprende el oligonucleótido de indexación de muestras y el aptámero, en el que el aptámero de unión a componente celular es capaz de unirse específicamente a al menos un objetivo de componente celular,
en el que el oligonucleótido de indexación de muestra comprende una secuencia de indexación de muestra para identificar el origen de la muestra de una o más células de una muestra,
en el que el oligonucleótido de indexación de muestra comprende una secuencia complementaria a una secuencia de captura configurada para capturar la secuencia del oligonucleótido de indexación de muestra, en el que la secuencia del oligonucleótido de indexación de muestra complementaria a la secuencia de captura comprende una región poli(dA), y
en el que las secuencias de indexación de muestra de al menos dos composiciones de indexación de muestra de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras comprenden diferentes secuencias.
4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, o la pluralidad de composiciones de indexación de muestras de la reivindicación 3, en el que:
(a) el componente celular objetivo comprende una proteína objetivo;
(b) la secuencia de indexación de la muestra tiene una longitud de 6-60 nucleótidos o una longitud de 50-500 nucleótidos;
(c) secuencias de indexación de muestras de al menos 10, 100 o 1000 composiciones de indexación de muestras de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras comprenden diferentes secuencias;
(d) el aptámero está:
(i) 5' con respecto al oligonucleótido de indexación de la muestra en el polinucleótido único; o (ii) 3' con respecto al oligonucleótido de indexación de la muestra en el polinucleótido individual; y/o
(e) el aptámero comprende un aptámero de nucleótido, opcionalmente el aptámero de nucleótido comprende ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN), ácido xenonucleico (XNA), un fluoróforo, o una combinación de los mismos, donde opcionalmente el aptámero de nucleótido comprende un análogo de base y, opcionalmente, el análogo de base comprende un análogo de base fluorescente.
5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 o 4, o la pluralidad de composiciones de indexación de muestras de la reivindicación 3 o 4, en el que:
(a) la composición de indexación de muestras está asociada con un primer vehículo;
(b) la composición de aptámero está asociada con un primer vehículo; y/o
(c) la composición de aptámero comprende un segundo aptámero capaz de unirse específicamente a al menos uno de uno o más objetivos proteicos o uno o más objetivos de componentes celulares, y un segundo oligonucleótido de indexación de muestra que comprende una segunda secuencia de indexación de muestra, opcionalmente donde:
(i) el aptámero y el segundo aptámero están asociados con un primer vehículo; o
(ii) el aptámero está asociado con un primer vehículo y el segundo aptámero está asociado con un segundo vehículo; y opcionalmente
(iii) el aptámero y el segundo aptámero tienen al menos 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de identidad de secuencia; y/o
(iv) el aptámero y el segundo aptámero son idénticos o donde el aptámero y el segundo aptámero son diferentes; y/o
(v) las proteínas objetivo, o los objetivos del componente celular, del aptámero y el segundo aptámero son idénticas, opcionalmente en donde el aptámero y el segundo aptámero son capaces de unirse a diferentes regiones de una proteína objetivo, o un componente celular objetivo.
6. El método o la pluralidad de composiciones de indexación de muestras de la reivindicación 4 o 5, donde:
(a) el primer vehículo comprende:
(i) nanomaterial metálico, y opcionalmente el nanomaterial mental comprende una nanoestructura metálica, una nanopartícula metálica o una combinación del mismo; y/o
(ii) nanomaterial de oro, y opcionalmente el nanomaterial de oro es una nanoestructura de oro, una nanopartícula de oro o una combinación de los mismos; y/o
(iii) un lisosoma, una micela, una vesícula, una membrana lipídica, una bicapa lipídica, una monocapa lipídica o una combinación de los mismos;
(b) el aptámero se une al primer vehículo y, opcionalmente, el aptámero se une covalentemente al primer vehículo;
(c) el aptámero se conjuga con el primer vehículo y, opcionalmente, el aptámero se conjuga con el primer vehículo a través de un grupo químico seleccionado del grupo que consiste en un grupo fotoescindible UV, una estreptavidina, una biotina, una amina y una combinación de los mismos;
(d) el aptámero no está unido covalentemente al primer vehículo;
(e) el aptámero se asocia con el primer portador a través de un enlazador; y/o
(f) el aptámero está inmovilizado en el primer soporte, parcialmente inmovilizado en el primer soporte, inmovilizado en el primer soporte, parcialmente inmovilizado en el primer soporte, encerrado en el primer soporte, parcialmente encerrado en el primer soporte, incrustado en el primer portador, parcialmente incrustado en el primer portador, o una combinación de los mismos.
7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 5(c) o 6:
(a) que comprende disociar el aptámero del primer vehículo, en el que opcionalmente la disociación ocurre:
(i) después de codificar con barras los oligonucleótidos de indexación de la muestra; o (ii) antes de codificar con barras los oligonucleótidos de indexación de la muestra; y/o
(b) en el que poner en contacto cada una de la pluralidad de muestras con la composición de indexación de muestras comprende poner en contacto una célula de una o más células de la muestra con la composición de indexación de muestras, opcionalmente en el que el primer vehículo se internaliza en la célula, opcionalmente la internalización es a través de endocitosis, pinocitosis, nanopinocitosis, micropinocitosis, fagocitosis, fusión de membranas, internalización medicada con clatrina, internalización mediada por caveolina, internalización dependiente del receptor, internalización independiente del receptor, o una combinación de las mismas.
8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -2 o 4-7, en el que:
(a) la al menos una de una o más proteínas objetivo, o uno o más objetivos de componentes celulares, está en una superficie celular;
(b) el método comprende eliminar las composiciones de indexación de muestras no unidas de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras;
(c) eliminar las composiciones de indexación de muestras no unidas comprende (a) lavar una o más células de cada una de la pluralidad de muestras con un tampón de lavado, (b) seleccionar células unidas a al menos un aptámero usando citometría de flujo, o ambos; y/o
(d) el método comprende lisar una o más células de cada una de la pluralidad de muestras.
9. La pluralidad de composiciones de indexación de muestras de cualquiera de las reivindicaciones 3-6, en las que:
(a) el oligonucleótido de indexación de muestras no es homólogo a las secuencias genómicas de ninguna de las una o más células, es homólogo a las secuencias genómicas de una especie, o una combinación de los mismos, y opcionalmente la especie es una especie no mamífera;
(b) una muestra de la pluralidad de muestras comprende una pluralidad de células, una pluralidad de células individuales, un tejido, una muestra de tumor o cualquier combinación de los mismos;
(c) la pluralidad de muestras comprende una célula de mamífero, una célula bacteriana, una célula viral, una célula de levadura, una célula fúngica o cualquier combinación de las mismas;
(d) el oligonucleótido de indexación de la muestra comprende una secuencia de alineamiento adyacente a la región poli(dA), y opcionalmente (a) la secuencia de alineamiento es uno o más nucleótidos, o dos o más nucleótidos de longitud, (b) la secuencia de alineamiento comprende un guanina, una citosina, una timina, un uracilo o una combinación de los mismos, y/o (c) la secuencia de alineación comprende una región poli(dT), una región poli(dG), una región poli(dC), una región poli(región dU), o una combinación de las mismas; y/o (e) el oligonucleótido de indexación de la muestra comprende una secuencia marcadora molecular, un sitio de unión para un cebador universal, o ambos, y opcionalmente la secuencia marcadora molecular tiene una longitud de 2-20 nucleótidos o una longitud de 5-50 nucleótidos, y opcionalmente el cebador universal comprende un cebador de amplificación, un cebador de secuenciación o una combinación de los mismos;
(f) la proteína objetivo, o el componente celular objetivo, comprende un carbohidrato, un lípido, una proteína, una proteína extracelular, una proteína de la superficie celular, un marcador celular, un receptor de células B, un receptor de células T, un complejo principal de histocompatibilidad, un antígeno tumoral, un receptor, una proteína intracelular o cualquier combinación de los mismos;
(g) la proteína objetivo, o el componente celular objetivo, se selecciona de un grupo que comprende 10-100 proteínas objetivo o componentes celulares objetivo diferentes; y/o
(h) el aptámero está asociado con dos o más oligonucleótidos de indexación de muestra con:
(A) una secuencia idéntica; o
(B) diferentes secuencias de indexación de muestras y/o
(i) la composición de indexación de muestras de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras comprende un segundo aptámero no asociado con el oligonucleótido de indexación de muestras, opcionalmente donde el aptámero y el segundo aptámero son idénticos; y/o
(j) cada una de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras comprende el aptámero.
10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -2 o 4-8, en el que:
(a) el oligonucleótido de indexación de la muestra no es homólogo a las secuencias genómicas de ninguna de las una o más células, es homólogo a las secuencias genómicas de una especie, o una combinación de los mismos, y opcionalmente la especie es una especie no mamífera; y/o
(b) una muestra de la pluralidad de muestras comprende una pluralidad de células, una pluralidad de células individuales, un tejido, una muestra de tumor o cualquier combinación de los mismos; y/o
(c) la pluralidad de muestras comprende una célula de mamífero, una célula bacteriana, una célula viral, una célula de levadura, una célula fúngica o cualquier combinación de las mismas; y/o
(d) el oligonucleótido de indexación de muestra comprende una secuencia complementaria a una secuencia de captura configurada para capturar la secuencia del oligonucleótido de indexación de muestra, opcionalmente donde:
(i) el código de barras comprende una región de unión al objetivo que comprende la secuencia de captura, y opcionalmente, la región de unión al objetivo comprende una región poli(dT); o
(ii) la secuencia del oligonucleótido de indexación de muestra complementaria a la secuencia de captura comprende una región poli(dA), opcionalmente en donde el oligonucleótido de indexación de muestra comprende una secuencia de alineación adyacente a la región poli(dA), y opcionalmente (a) la región de alineación la secuencia es uno o más nucleótidos, o dos o más nucleótidos de longitud, (b) la secuencia de alineación comprende una guanina, una citosina, una timina, un uracilo o una combinación de los mismos, y/o (c) la secuencia de alineación comprende una región poli(dT), una región poli(dG), una región poli(dC), una región poli(dU), o una combinación de los mismos; y/o
(f) el oligonucleótido de indexación de la muestra comprende una secuencia marcadora molecular, un sitio de unión para un cebador universal, o ambos, y opcionalmente la secuencia marcadora molecular tiene una longitud de 2-20 nucleótidos o una longitud de 5-50 nucleótidos, y opcionalmente el cebador universal comprende un cebador de amplificación, un cebador de secuenciación o una combinación de los mismos; y/o
(g) la proteína objetivo, o el componente celular objetivo, comprende un carbohidrato, un lípido, una proteína, una proteína extracelular, una proteína de la superficie celular, un marcador celular, un receptor de células B, un receptor de células T receptor, un complejo principal de histocompatibilidad, un antígeno tumoral, un receptor, una proteína intracelular o cualquier combinación de los mismos; y/o
(h) la proteína objetivo, o el componente celular objetivo, se selecciona de un grupo que comprende 10-100 proteínas objetivo o componentes celulares objetivo diferentes; y/o
(i) el aptámero está asociado con dos o más oligonucleótidos de indexación de muestra con:
(A) una secuencia idéntica; o
(B) diferentes secuencias de indexación de muestra y/o
(j) la composición de indexación de muestra de la pluralidad de composiciones de indexación de muestra comprende un segundo aptámero no asociado con el oligonucleótido de indexación de muestra, opcionalmente donde el aptámero y el segundo aptámero son idénticos; y/o
(k) cada una de la pluralidad de composiciones de indexación de muestras comprende el aptámero.
11. Un método para medir la expresión de componentes celulares en células, que comprende:
poner en contacto una pluralidad de aptámeros que se unen a componentes celulares con una pluralidad de células que comprenden una pluralidad de objetivos de componentes celulares, en el que cada uno de la pluralidad de aptámeros que se unen a componentes celulares comprende un oligonucleótido específico de aptámero que comprende una secuencia de identificador único para el aptámero de unión al componente celular, en el que el oligonucleótido específico del aptámero y el aptámero forman un solo polinucleótido, y en el que el aptámero de unión al componente celular es capaz de unirse específicamente a al menos uno de la pluralidad de objetivos del componente celular;
extender sondas de oligonucleótidos hibridadas con los oligonucleótidos específicos de aptámero para producir una pluralidad de ácidos nucleicos marcados, en donde cada uno de los ácidos nucleicos marcados comprende una secuencia identificadora única, o una secuencia complementaria de la misma, y una secuencia de código de barras; y
obtener información de secuencia de la pluralidad de ácidos nucleicos marcados o una parte de los mismos para determinar la cantidad de uno o más de la pluralidad de objetivos de componentes celulares en una o más de la pluralidad de células.
12. El método de la reivindicación 11, que comprende antes de extender las sondas de oligonucleótidos:
dividir la pluralidad de células asociadas con la pluralidad de aptámeros de unión a componentes celulares en una pluralidad de particiones, en el que una partición de la pluralidad de particiones comprende una sola célula de la pluralidad de células asociadas con los aptámeros de unión a componentes celulares;
en la partición que comprende la célula única, poner en contacto una partícula de código de barras con los oligonucleótidos específicos del aptámero, en el que la partícula de código de barras comprende una pluralidad de sondas de oligonucleótidos, cada una de las cuales comprende una región de unión objetivo y una secuencia de código de barras seleccionada de un conjunto diverso de secuencias de código de barras únicas.
13. Una composición que comprende:
una pluralidad de aptámeros que se unen a componentes celulares, donde cada uno de la pluralidad de aptámeros que se unen a componentes celulares comprende un oligonucleótido específico de aptámero que comprende una secuencia de identificación única para el aptámero que se une a componentes celulares, donde el oligonucleótido específico de aptámero y el aptámero formar un único polinucleótido, en el que el oligonucleótido específico del aptámero comprende una secuencia complementaria a una secuencia de captura configurada para capturar la secuencia del oligonucleótido específico del aptámero, en el que la secuencia del oligonucleótido específico del aptámero complementaria a la secuencia de captura comprende una región poli(dA), y en el que el aptámero que se une al componente celular es capaz de unirse específicamente a al menos uno de una pluralidad de objetivos de componentes celulares.
14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 11-12, o la composición de la reivindicación 13, en donde:
(a) la pluralidad de dianas de componente celular comprende una pluralidad de dianas de proteína, y donde el aptámero de unión a componente celular es capaz de específicamente unión a al menos una de la pluralidad de proteínas objetivo; y/o
(b) el aptámero está:
(i) 5' con respecto al oligonucleótido específico del aptámero en el polinucleótido individual; o (ii) 3' al oligonucleótido específico de aptámero en el polinucleótido único; y/o
(c) el aptámero comprende un aptámero de nucleótido, y opcionalmente el aptámero de nucleótido comprende ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN), ácido xenonucleico (XNA), un fluoróforo o una combinación de los mismos, opcionalmente en donde el nucleótido el aptámero comprende un análogo de base, opcionalmente el análogo de base comprende un análogo de base fluorescente.
15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 11-12 o 14, o la composición de la reivindicación 13 o 14, en el que la pluralidad de aptámeros de unión a proteínas comprende un segundo aptámero de unión a proteínas, o en el que la pluralidad de aptámeros de unión a componentes celulares comprende un segundo aptámero que se une al componente celular, opcionalmente en el que:
(a) el aptámero:
(i) y el segundo aptámero están asociados con un primer vehículo; o
(ii) está asociado con un primer vehículo, y en el que el segundo aptámero está asociado con un segundo vehículo; y/o
(b) el aptámero y el segundo aptámero son idénticos en secuencia al menos en un 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 %; y/o
(c) el aptámero y el segundo aptámero de unión a proteínas son:
(i) idénticos; o
(ii) diferente, opcionalmente en el que:
(A) las dianas de proteína, o las dianas de componente celular, del aptámero y el segundo aptámero son idénticas;
(B) el aptámero y el segundo aptámero son capaces de unirse a diferentes regiones de una proteína objetivo o un componente celular objetivo; o
(C) las proteínas objetivo, o los objetivos de componentes celulares, del aptámero y el segundo aptámero son diferentes; y/o
(d) el primer vehículo comprende
(i) nanomaterial metálico y, opcionalmente, el nanomaterial metálico es una nanoestructura metálica, una nanopartícula metálica o una combinación de los mismos; y/o
(ii) nanomaterial de oro, y opcionalmente el nanomaterial de oro es una nanoestructura de oro, una nanopartícula de oro o una combinación de los mismos; y/o
(iii) un lisosoma, una micela, una vesícula, una membrana lipídica, una bicapa lipídica, una monocapa lipídica o una combinación de los mismos; y/o
(e) el aptámero se une al primer vehículo y, opcionalmente, el aptámero se une covalentemente al primer vehículo;
(f) el aptámero se conjuga con el primer vehículo y, opcionalmente, el aptámero se conjuga con el primer vehículo a través de un grupo químico seleccionado del grupo que consiste en un grupo fotoescindible UV, una estreptavidina, una biotina, una amina y una combinación de los mismos;
(g) el aptámero no está unido covalentemente al primer vehículo;
(h) el aptámero se asocia con el primer portador a través de un enlazador; y/o
(i) el aptámero está inmovilizado en el primer soporte, parcialmente inmovilizado en el primer soporte, inmovilizado en el primer soporte, parcialmente inmovilizado en el primer soporte, encerrado en el primer soporte, parcialmente encerrado en el primer soporte, incrustado en el primer portador, parcialmente incrustado en el primer portador, o una combinación de los mismos.
16. La composición de la reivindicación 15, en la que:
(a) el oligonucleótido específico del aptámero cambia de una primera conformación en la que la región poli(dA) es inaccesible a una segunda conformación en la que la región poli(dA) es accesible cuando el aptámero entra en contacto con la al menos una de la pluralidad de proteínas objetivo, u objetivos de componentes celulares, opcionalmente donde la región poli(dA) del oligonucleótido específico de aptámero en la primera conformación comprende una estructura de horquilla, y opcionalmente la región poli(dA) con la estructura de horquilla es accesible a la región poli(dT) de la región de unión al objetivo del código de barras;
(b) el oligonucleótido específico de aptámero comprende una secuencia de alineamiento adyacente a la región poli(dA), y opcionalmente (a) la secuencia de alineamiento tiene uno o más nucleótidos de longitud, o dos o más nucleótidos de longitud, (b) la secuencia de alineamiento comprende una guanina, una citosina, una timina, un uracilo o una combinación de los mismos, y/o (c) la secuencia de alineación comprende una región poli(dT), una región poli(dG), una región poli(dC), un región poli(dU), o una combinación de las mismas; y/o
(c) el oligonucleótido específico del aptámero comprende una secuencia marcadora molecular, un sitio de unión para un cebador universal, o ambos, y opcionalmente la secuencia marcadora molecular tiene una longitud de 2 a 20 nucleótidos, o el cebador universal tiene una longitud de 5 a 50 nucleótidos. de longitud, o ambos, opcionalmente en los que el cebador universal comprende un cebador de amplificación, un cebador de secuenciación o una combinación de los mismos.
17. El método de la reivindicación 15, en el que el oligonucleótido específico de aptámero comprende una secuencia complementaria a una secuencia de captura configurada para capturar la secuencia del oligonucleótido específico de aptámero, opcionalmente en el que:
(a) el código de barras comprende una región de unión al objetivo que comprende la secuencia de captura la secuencia y, opcionalmente, la región de unión al objetivo comprende una región poli(dT); y/o
(b) la secuencia del oligonucleótido específico del aptámero complementario a la secuencia de captura comprende una región poli(dA), opcionalmente donde:
(i) el oligonucleótido específico del aptámero cambia desde una primera conformación en la que la región poli(dA) es inaccesible a una segunda conformación en la que la región poli(dA) es accesible cuando el aptámero entra en contacto con al menos una de la pluralidad de proteínas objetivo o objetivos de componentes celulares, opcionalmente en la que la región poli(dA) del oligonucleótido específico del aptámero en la primera conformación comprende una estructura de horquilla, y opcionalmente la región poli(dA) con la estructura de horquilla es accesible a la región poli(dT) de la región de unión al objetivo del código de barras; y/o
(ii) las sondas de oligonucleótidos se hibridan con los oligonucleótidos específicos de aptámero mediante la hibridación entre las regiones poli(dA) de los oligonucleótidos específicos de aptámero y las regiones poli(dT) de las sondas de oligonucleótidos; y/o
(iii) el oligonucleótido específico de aptámero comprende una secuencia de alineamiento adyacente a la región poli(dA), y opcionalmente (a) la secuencia de alineamiento tiene uno o más nucleótidos de longitud, o dos o más nucleótidos de longitud, (b) la secuencia de alineación comprende una guanina, una citosina, una timina, un uracilo o una combinación de los mismos, y/o (c) la secuencia de alineación comprende una región poli(dT), una región poli(dG), una región poli(dC) región, una región poli(dU) o una combinación de las mismas; y/o
(d) el oligonucleótido específico del aptámero comprende una secuencia de alineamiento adyacente a la región poli(dA), y opcionalmente (a) la secuencia de alineamiento tiene uno o más nucleótidos de longitud, o dos o más nucleótidos de longitud, (b) la secuencia de alineación comprende una guanina, una citosina, una timina, un uracilo o una combinación de los mismos, y/o (c) la secuencia de alineación comprende una región poli(dT), una región poli(dG), una región poli(dC), una región poli(dU) o una combinación de las mismas; y/o
(e) el oligonucleótido específico del aptámero comprende una secuencia marcadora molecular, un sitio de unión para un cebador universal, o ambos, y opcionalmente la secuencia marcadora molecular tiene una longitud de 2 a 20 nucleótidos, o el cebador universal tiene una longitud de 5 a 50 nucleótidos de longitud, o ambos, opcionalmente en los que el cebador universal comprende un cebador de amplificación, un cebador de secuenciación o una combinación de los mismos.
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