ES2946033T3

ES2946033T3 - Método para producir una composición que comprende lípidos de arqueas a partir de un cultivo celular de Sulfolobus

Info

Publication number: ES2946033T3
Application number: ES20705088T
Authority: ES
Inventors: Julian Quehenberger; David Wurm; Oliver Spadiut
Original assignee: Technische Universitaet Wien
Current assignee: Technische Universitaet Wien
Priority date: 2019-03-15
Filing date: 2020-02-21
Publication date: 2023-07-12
Anticipated expiration: 2040-02-21
Also published as: WO2020187526A1; EP3937901B1; EP3708151A1; IL286344A; IL286344B1; JP2022526485A; JP7616666B2; IL286344B2; CA3130657A1; EP3937901A1; CN113365605A; US20220098629A1; CN113365605B; SG11202107250SA; KR20210141452A; KR102780682B1; AU2020242577A1; CN119139234A; AU2020242577B2

Abstract

Resumen La presente invención describe un método para producir una composición que comprende lípidos de arqueas a partir de un cultivo de células de Sulfolobus, que comprende (1) hacer crecer un cultivo de células de Sulfolobus a una temperatura de 75 a 85 °C y a una tasa de crecimiento de 0,025 a 0,035 por hora y ex- extraer los lípidos archaeales del cultivo archaeal para obtener una composición para usar en la terapia de retardo oral, o (2) hacer crecer un cultivo de células de Sulfolobus a una temperatura de 75 a 85 °C y a una tasa de crecimiento de 0,005 a 0,015 por hora y extraer los lípidos de arqueas del cultivo de arqueas para obtener una composición para uso en terapia oral aguda; y composiciones obtenibles por tal método. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Método para producir una composición que comprende lípidos de arqueas a partir de un cultivo celular de Sulfolobus La presente invención se refiere a la producción de composiciones que comprenden lípidos de arqueas y composiciones que comprenden lípidos de arqueas.

Los liposomas son vesículas esféricas de bicapa lipídica (ésteres lipídicos) que rodean un espacio acuoso. Son importantes transportadores para la administración de fármacos, vacunas, genes, proteínas, moléculas pequeñas, antibióticos y nutrientes. Los liposomas están formados por fosfolípidos, principalmente fosfatidilcolina, y colesterol, pero también podría incluir otros lípidos, como la fosfatidiletanolamina. Los liposomas se generan mediante un gran número de métodos diferentes (revisados, por ejemplo, por van Hoogevest, Eur. J. Pharm. Sci. 108 (2017), 1-12; Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9 (1980), 467-508), por ejemplo dispersando fosfolípidos en un medio acuoso, por ejemplo, usando tratamiento mecánico (por ejemplo, en un homogeneizador, preferentemente mediante homogeneización a alta presión) o por tratamiento con ultrasonidos. Varían entre 0,02 y 10 um de diámetro. Su tamaño y composición afectan significativamente a sus propiedades.

Los arqueosomas (es decir, vesículas lipídicas que están compuestas parcial o totalmente por lípidos de arqueas) representan una clase especial de liposomas que se originan a partir de lípidos de membranas aislados de arqueas. Los arqueosomas están formados por éteres lipídicos, a saber, estructuras de diéter (arqueoles) o estructuras de tetraéter (caldarqueoles) (por ejemplo, Kaur et al., Drug delivery 23 (2016), 2497; Patel et al., Critical Reviews in Biotechnology 19 (1999), 317; Fig. 4). Las estructuras de diéter están compuestas por una fracción de glicerol que porta dos cadenas de fitanilo (20-40 carbonos de longitud) en las posiciones sn-2,3. Las estructuras de tetraéter portan dos cadenas de di-fitanilo unidas a dos restos de glicerol de manera antiparalela (caldarqueol) o de manera paralela (isocaldarqueol). Adicionalmente, pueden estar presentes uno o varios anillos de ciclopentano. En general, los arqueosomas están formados por una amplia gama de estructuras lipídicas heterogéneas, lo que afecta significativamente a sus características. Dependiendo de la composición (cantidad de arqueoles frente a caldarqueoles), la capa lipídica es una monocapa o bicapa o una mezcla de las mismas. Los lípidos totales de las Archaea, obtenidos por extracción con solvente, representan aproximadamente el 5 % del peso seco de la célula. Como se demuestra en varios estudios, el tipo y la estructura de los lípidos de las arqueas dependen del organismo del que se extraen y de sus respectivos entornos de vida (por ejemplo, la temperatura), así como de las fases de crecimiento (Jensen et al., Life 5 (2015), 1539). Por ejemplo, un aumento en la temperatura de crecimiento de M. jannaschii de 50 a 65 °C dio como resultado que la distribución porcentual de lípidos centrales del arqueol, el caldarqueol y el arqueol macrocíclico pasara del 60, 21 y 19 % al 15, 42 y 43 %, respectivamente (Sprott et al., J. Bact. 173 (1991), 3907). También para las Archaea Sulfolobus se especula que la fluidez de la membrana está controlada por el número de anillos de ciclopentano dentro de las cadenas de fitanilo de los lípidos caldarqueol, que aumentan en respuesta a temperaturas de crecimiento más altas (Jensen et al., 2015).

El documento US 5.098.588 A divulga el uso de lípidos de arqueobacterias como una nueva clase de lubricantes para superficies metálicas. En este documento no se divulga un procedimiento de cultivo para las arqueobacterias ni se proporcionan composiciones con cantidades cuantitativas específicas de distintos lípidos de arqueas. El documento WO 2007/112567 A1 divulga un lípido sintético polar que comprende al menos un carbohidrato o un grupo aniónico unido por enlace covalente a al menos un grupo hidroxilo libre de un lípido central de arqueas, en donde Thermoplasma se utiliza como fuente de lípidos caldarqueol. El uso de los lípidos de Thermoplasma se divulga en este documento como específicamente preferido en comparación con el uso de Sulfolobus como fuente, para evitar mezclas de caldarqueoles y nonitol-caldarqueoles que se encuentran en Sulfolobus. El documento DE 10 2012216378 A1 describe una matriz de inmovilización que comprende una capa lipídica de tetraéter, sobre la que pueden inmovilizarse covalentemente ligandos (moléculas de captura) que pueden unirse a una diana, y chips biosensores, para métodos de análisis basados en chips, que comprendan tal matriz.

Actualmente, los arqueosomas están recibiendo una mayor atención, ya que han demostrado ser muy estables frente al calor, el pH, las sales biliares, las lipasas y la oxidación, haciéndolos más atractivos que los liposomas convencionales. En varios estudios in vitro, se demostró que los arqueosomas se pueden usar como sistemas versátiles de nanotransportadores para distintas cargas con una gran perspectiva para combatir diversas enfermedades. Sin embargo, los arqueosomas aún no han visto un gran avance en la aplicación debido a las siguientes limitaciones:

1) Se producen en un entorno complejo (medios de cultivo complejos y cultivos en matraces de agitación no controlados) y, por tanto, son muy heterogéneos,

2) no pueden producirse bajo condiciones definidas que contradigan las directrices normativas (Calidad por diseño),

3) la composición lipídica de las Archaea no se puede controlar,

4) no se pueden producir de manera rentable en grandes cantidades.

Por lo tanto, un objeto de la presente invención es reducir la heterogeneidad de los arqueosomas y permitir la generación de lípidos de arqueas hechos a medida mediante parámetros de procedimiento en condiciones de cultivo controladas para Archaea. Más específicamente, el objeto de la presente invención es proporcionar una composición de arqueosoma que comprende muchos lípidos de anillo de ciclopentano pero al mismo tiempo también fosfatidil arqueol. Es un objeto adicional proporcionar composiciones de lípidos de arqueas que sean adecuadas para una vía de suministro y/o administración específica, por ejemplo, para suministro oral retardado y/o suministro oral agudo. Es un objeto adicional proporcionar composiciones de liposomas de arqueas que tengan una estabilidad adecuada (definida, por ejemplo, como la capacidad de envolver de manera estable el fármaco de interés y permitir el paso por el estómago o el paso por la piel o el paso por la mucosa) de los arqueosomas y/o una funcionalidad suficiente (definida, por ejemplo, como la relación entre los caldarqueoles y los arqueoles). Otro objetivo de la presente invención es la preparación de una mezcla lipídica con el mayor número posible de anillos en las cadenas de fitanilo de la especie de caldarqueol al tiempo que se mantiene la ajustabilidad de la relación caldarqueol: Arqueol en los liposomas obtenidos de Archaea (dentro de los límites fisiológicos).

Por consiguiente, la presente invención proporciona métodos de cultivo para Sulfolobus en un medio definido y condiciones de procedimiento controladas para una determinada, composición lipídica más homogénea para generar arqueosomas hechos a medida con heterogeneidad reducida como vesículas para la industria biofarmacéutica.

Más específicamente, la presente invención proporciona un método para producir una composición que comprende lípidos de arqueas a partir de un cultivo celular de Sulfolobus, que comprende

(1) hacer crecer un cultivo celular de Sulfolobus a una temperatura de 75 a 85 °C y a una velocidad de crecimiento de 0,025 a 0,035 por hora y extraer los lípidos de arqueas del cultivo de arqueas para obtener una composición para su uso para una terapia oral retardada, o

(2) hacer crecer un cultivo celular de Sulfolobus a una temperatura de 75 a 85 °C y a una velocidad de crecimiento de 0,005 a 0,015 por hora y extraer los lípidos de arqueas del cultivo de arqueas para obtener una composición para su uso para una terapia oral aguda.

Los arqueosomas tienen propiedades ventajosas que los han convertido en candidatos promisorios para futuros productos farmacéuticos en la técnica anterior. Sin embargo, hasta ahora, los principales obstáculos para convertirlos en candidatos de interés práctico fueron principalmente la falta de controlabilidad de los procedimientos de producción y su alta variabilidad en cuanto a la composición de sus éteres lipídicos. La presente invención ahora permite tal enfoque industrial que convierte a los arqueosomas en candidatos realistas para cargas farmacológicas destinadas a su suministro a pacientes humanos:

Para aplicaciones terapéuticas en humanos, generalmente se precisa que los fármacos formulados tengan un tiempo de conservación mínimo de 1 a 2 años. Esto implica estabilidad física (agregación, pérdida de la carga) y estabilidad química durante el almacenamiento (oxidación, hidrólisis). En los últimos años, el uso de liposomas en el suministro de fármacos/vacunas se ha extendido al sistema de suministro oral. Los liposomas convencionales no se pueden utilizar para este fin debido a su escasa estabilidad en el duro entorno del tracto gastrointestinal (GI) (pH tan bajo como 1 en el estómago y ataque de lipasas y sales biliares). La principal ventaja de los arqueosomas frente a los liposomas convencionales es su alta estabilidad. Se han probado distintos aspectos de la estabilidad, demostrando los beneficios de los arqueosomas sobre los liposomas:

• Estabilidad en el almacenamiento: Los arqueosomas contienen cadenas de fitanilo saturadas y, por tanto, no se oxidan con el aire. Como consecuencia, se pueden almacenar en cloroformo/metanol a temperatura ambiente sin ninguna alteración durante años.

• Estabilidad térmica: La estabilidad térmica comparativa de los arqueosomas fabricados, por ejemplo, con Sulfolobus acidocaldarius con liposomas convencionales demostró que a diferencia de los liposomas convencionales que se vuelven permeables a 35-40 °C y pierden su carga, los arqueosomas no presentaban ninguna fuga a temperaturas mucho más altas. Las estructuras cíclicas de los lípidos de las arqueas, que se depositan como una respuesta termoadaptativa, confieren un empaquetamiento hermético de la membrana y una fluidez reducida de la membrana. Esta alta estabilidad térmica permite la esterilización, que es un requisito fundamental para las aplicaciones in vivo de las vesículas lipídicas, mediante autoclave. En cambio, la esterilización por calor de los liposomas convencionales provoca agregación, hidrólisis y fugas, haciendo que la preparación de liposomas estériles sea un esfuerzo engorroso.

• Estabilidad respecto al pH: Los ensayos in vitro revelaron que los arqueosomas son más estables a pH ácido que los liposomas convencionales: después del almacenamiento a pH 3,0 durante 21 días, los liposomas perdieron hasta el 60 % de su carga, mientras que los arqueosomas solo perdieron el 30 %.

• Estabilidad frente a las lipasas: Las lipasas en el tracto GI provocan una hidrólisis intensa de los liposomas, dando como resultado una liberación rápida de la carga encapsulada. Estudios anteriores demostraron que los liposomas convencionales perdían hasta el 100 % de la carga cuando se exponían a la fosfolipasa A2 durante 4 horas, mientras que los arqueosomas perdieron menos del 20 %.

• Estabilidad en presencia de sales biliares: Se demostró que los arqueosomas conservan toda su carga durante una incubación de 90 min a 37 °C en bilis humana simulada, lo que es más largo que el tiempo de residencia promedio de las vesículas lipídicas en el estómago.

• Estabilidad frente al efecto combinado de lipasas y sales biliares: En el tracto GI, las vesículas lipídicas se encuentran tanto con lipasas como con sales biliares que afectan su estabilidad. Los liposomas convencionales pierden el 100 % de su carga cuando se incuban en presencia de lipasa pancreática en bilis humana simulada ya después de 30 min, mientras que las lipasas y las sales biliares no muestran un efecto sinérgico sobre los arqueosomas.

Resumiendo, los arqueosomas ya tenían el potencial de superar a los liposomas utilizados actualmente en cuanto a su estabilidad (más estables en el tiempo y más resistentes al calor, el pH, las lipasas, el ácido biliar, esterilizables en autoclave). Con la presente invención, se proporciona un método fiable para permitir composiciones adecuadas y reproducibles para el suministro específico de fármacos a través de arqueosomas. Por lo tanto, la presente invención permite la producción de arqueosomas en cantidades suficientes con una calidad suficiente.

Los arqueosomas han sido reconocidos como transportadores tremendamente útiles para el suministro de una diversidad de cargas. La aplicación como transportadores de fármacos, que actualmente resulta más prometedora, es el uso de los arqueosomas como microcápsulas para el suministro oral de proteínas o péptidos terapéuticos (como la insulina). Hasta la fecha, también se consideran adyuvantes muy interesantes en vacunas ya que la captación de arqueosomas en las células fagocíticas es más de 50 veces mayor que la de los liposomas convencionales. Los estudios en ratones muestran que la administración sistémica de varios antígenos de prueba atrapados en arqueosomas produjo respuestas inmunitarias humorales que fueron comparables a las obtenidas con el potente, pero tóxico, adyuvante de Freund. Todos los estudios in vitro e in vivo realizados hasta la fecha indican que los arqueosomas son seguros y no generan ninguna toxicidad apreciable. En general, los requisitos para los transportadores lipídicos en aplicaciones médicas son:

Seguridad, estabilidad, biodisponibilidad, rentabilidad

Sin efectos toxicológicos sobre el cuerpo humano

Inducción de respuestas inflamatorias no patológicas

Estímulo de la interacción entre el sistema inmunitario innato y adquirido

Aumento de la respuesta de anticuerpos humorales e inducción de la respuesta mediada por linfocitos T Los arqueosomas cumplen con todos estos requisitos y, por tanto, se han probado satisfactoriamente como sistemas de suministro de fármacos para vacunas contra el cáncer, inmunoadyuvantes contra la enfermedad de Chagas, nuevos sistemas de suministro génico, transportadores para el suministro oral de proteínas y péptidos, nuevos sistemas de suministro de antígenos, y otros.

Se ha demostrado in vitro y en el modelo animal una amplia gama de posibles aplicaciones de los arqueosomas con importancia médica. Sin embargo, debido a la insuficiente homogeneidad de la composición lipídica, aún no se han realizado aplicaciones clínicas.

Se han preparado satisfactoriamente arqueosomas a partir de distintas especies de arqueas. Habitualmente, los lípidos de arqueas totales se extraen de biomasa congelada mediante extracción con disolventes orgánicos utilizando cloroformo/metanol/agua. A continuación, los lípidos polares y neutros se separan por precipitación con acetona. Los extractos de lípidos resultantes pueden usarse directamente para la preparación de arqueosomas como mezclas complejas de distintas clases de lípidos o pueden purificarse más mediante cromatografía para aislar lípidos polares puros de una clase particular. A partir de estos lípidos de arqueas especiales y naturales, es posible preparar formulaciones de arqueosomas y encapsular o asociar compuestos hidrófilos o hidrófobos usando métodos disponibles desarrollados para la preparación de liposomas convencionales, como el método de dispersión mecánica, el método de hidratación de lípidos, extrusión de membranas o tratamiento con ultrasonidos. Se divulgan métodos para preparar lípidos a partir de Archaea o para cultivar Archaea, por ejemplo, en los documentos US 2017/0152533 A1, US 6316260 B1, EP 1 999 137 B1, EP 0 883 624 B1, EP 2 109 459 B1, Siliakus et al. (Extremophiles 21 (2017), 651-670), Jain et al. (Frontiers in Microbiol. 5 (2014), artículo 641)).

Aunque se sabe que Archaea es una fuente útil de estos lípidos especiales, todavía no se han usado extensamente para ese fin ya que actualmente la composición del liposoma no se puede controlar y es muy heterogénea. La mayoría de las Archaea se cultivan en un medio complejo en matraces de agitación en condiciones no controladas, lo que conduce a variaciones de un lote a otro en términos de composición de clases de lípidos, de estructura del núcleo lipídico, así como de la ramificación. Adicionalmente, la composición y las propiedades del lipidoma no eran hasta ahora controlables. Sin embargo, esto es esencial para la formación de arqueosomas reproducibles de alta calidad con heterogeneidad reducida y propiedades específicas según lo exigen las aplicaciones farmacéuticas. Se observó que la composición lipídica de S. islandicus y S. tokodaii no fue constante en distintos procedimientos, especialmente cuando se cambió la temperatura o se tomaron muestras en distintas fases de crecimiento (Jensen et al., Life 5 (2015), 1539). Al cultivar Archaea en un medio definido en el entorno controlado de un biorreactor, la presente invención proporciona un control eficaz de la calidad (heterogeneidad y composición) de los éteres lipídicos de Archaea al cambiar los parámetros críticos del procedimiento (por ejemplo, temperatura, tasa de crecimiento, etc.), que impiden la preparación de arqueosomas bien definidos.

Los arqueosomas se pueden utilizar para tareas similares a las de los liposomas (administración de fármacos a pacientes), pero muestran propiedades mucho mejores que los liposomas (más estables en el tiempo y más resistentes al calor, el pH, el ácido biliar, esterilizables en autoclave) y se prevé que sean una alternativa viable a los liposomas convencionales, ya que se pueden producir en cantidades suficientes con la calidad suficiente.

El mercado mundial suministro liposómico de fármacos está valorado en 2400 millones de dólares en 2017 y se espera que alcance los 5200 millones de dólares a finales de 2025, creciendo a una tasa de crecimiento anual del 10,1 % durante 2018-2025.

Una revisión reciente sobre el uso clínico de formulaciones liposómicas enumeró un total de 15 productos clínicos aprobados en todo el mundo que abarcan las áreas de antineoplásicos, antifúngicos, vacunas, fármacos antiinflamatorios y genes terapéuticos.

Para el uso de arqueosomas como transportadores de principios activos farmacéuticos, es necesario garantizar una cinética de liberación distinta dependiendo del lugar de acción deseado y la farmacodinámica. Esta cinética de liberación puede estar influenciada esencialmente por la estabilidad de los arqueosomas.

Para la estabilidad, además del tipo básico de lípidos, especialmente es fundamental la relación de lípidos de cadena corta y larga; así como la posible presencia de estructuras de anillo en las cadenas lipídicas que, restringiendo la movilidad de las cadenas, provocan un empaquetamiento más denso y una reducción de la permeabilidad de la membrana. La combinación de arqueol (Arc, un total de 40 átomos de C en las cadenas de fitanilo) y caldarqueol (Cal, un total de 80 átomos de C en las cadenas de fitanilo) representa en este caso una ayuda adecuada. Ambas sustancias son constituyentes naturales de la membrana de Sulfolobus acidocaldarius y otras especies de arqueas. Hay variantes de caldarqueol con diversas modificaciones de los restos terminales de glicerol (sin modificación, fosfatidilinositol (PI, del inglés phosphatidylinositol), dihexosa (2Hex), y combinaciones de los mismos: Cal, PI-Cal, 2Hex-Cal, PI-Cal-2Hex). Adicionalmente, en las cadenas de fitanilo están presentes variantes de Cal con distinto número de anillos (en el caso de S. acidocaldarius, preferentemente 4, 5 o 6 anillos). El arqueol está presente principalmente como PI-Arc.

Por un número de razones, una mezcla de 2Hex-Cal y PI-Arc es una combinación particularmente interesante para la preparación de arqueosomas de acuerdo con la presente invención, especialmente para aplicación oral:

• Se pueden utilizar caldarqueoles con distinto número de anillos.

• La mezcla de lípidos de cadena corta y larga garantiza la influencia sobre la estabilidad de los arqueosomas formados.

• Ambos lípidos tienen una cantidad suficiente de grupos funcionales en los grupos de cabeza para una modificación eficaz con enlazadores para su uso en el suministro dirigido de fármacos (por ejemplo, unión de fragmentos de anticuerpos, aptámeros, etc.).

• Esta modificación se puede llevar a cabo de forma selectiva sobre una de las dos clases de lípido, ya que los grupos de cabeza difieren en estructura y propiedades químicas

Como se demuestra experimentalmente con la presente invención, es posible influir sobre la relación de Cal con respecto a Arc a través de los parámetros de procedimiento temperatura y tasa de crecimiento (relación máxima de Cal: Arc a la temperatura de crecimiento óptima y a la tasa de crecimiento más alta, y viceversa). La proporción de mayor número de anillos (6 anillos frente a 5 o 4 anillos), sin embargo, depende, sorprendentemente, exclusivamente de la temperatura y no se correlaciona con la tasa de crecimiento. La influencia de la temperatura sobre el número de anillos se observó en Sulfolobus spp. Sin embargo, no se conoce bibliografía sobre la influencia de la tasa de crecimiento.

Básicamente, se necesita el mayor número posible de anillos para la menor permeabilidad de membrana posible y, por tanto, resistencia gástrica, lo cual, como ha demostrado la presente invención, precisa por lo tanto un cultivo a la temperatura más alta posible. La pérdida de temperatura asociada como medio adecuado para establecer la relación de Cal:Arc, sin embargo, puede controlarse de acuerdo con la presente invención a través de la tasa de crecimiento. Para la liberación del fármaco en el intestino, los arqueosomas pueden no ser demasiado estables, porque, de lo contrario, el fármaco no podría liberarse. Por tanto, se mantiene la modificabilidad de la cinética de liberación de las formulaciones arqueosómicas según la presente invención y los fármacos producidos en arqueosomas a partir de las mezclas de lípidos hechas a medida proporcionadas por la presente invención, por ejemplo, tras la administración oral, tienen una duración de acción distinta en el intestino.

La presente invención se basa en al menos dos resultados significativos que se han obtenido en el curso de la presente invención. En primer lugar, la presente invención proporciona un método de producción controlado que permite composiciones definidas y reproducibles de lípidos de arqueas. En segundo lugar, con este conocimiento de aplicar y hacer uso del método de producción controlada para lípidos de arqueas (dependiendo de condiciones de cultivo específicas y distintas) de acuerdo con la presente invención, pueden proporcionarse de forma reproducible dos tipos específicos de composiciones de arqueas también en formatos en mayor escala mediante la aplicación de distintas condiciones de cultivo que son específicamente utilizables (a) para terapia retardada oral (es decir, para composiciones farmacéuticas que muestran un efecto retardado o (b) para terapia aguda oral (es decir, para composiciones farmacéuticas que muestran una liberación inmediata a un paciente cuando se administran por vía oral).

Los métodos de cultivo en biorreactores se han desarrollado en el pasado reciente junto con nuevas herramientas de análisis, verificación de procedimientos dirigido por ordenador y control de procedimientos guiado por programas informáticos para lograr una tecnología innovadora en el cultivo de microorganismos en niveles completamente distintos. Esto ha afectado específicamente en la tecnología de cultivo de microorganismos que requieren condiciones de cultivo complejas, tales como las arqueobacterias que, por ejemplo, precisan temperaturas de cultivo significativamente superiores a las temperaturas de cultivo comunes, tales como 30 o 37 °C o incluso temperatura ambiente. Los métodos modernos para observar los parámetros del procedimiento que no estaban disponibles hacen diez o cinco años permiten que los métodos de acuerdo con la presente invención sean una base necesaria para el procedimiento de producción controlable y reproducible para el cultivo de cultivos de células de arqueas de acuerdo con la presente invención, especialmente para un control eficaz de la tasa de crecimiento.

Por ejemplo, Patel et al. (1999, citado anteriormente) informan en la tabla 1 la abundancia relativa (en %) de los principales lípidos centrales en arqueobacterias representativas. Debido a la ausencia de herramientas analíticas apropiadas en ese momento, solo los lípidos centrales se analizaron semicuantitativamente, es decir, como cantidades relativas. Aparte de la baja temperatura de crecimiento (70 °C; en comparación con una temperatura óptima de crecimiento de al menos 75 °C), los lípidos se obtuvieron de la fase de crecimiento logarítmico tardío, porque una fase de crecimiento más específica simplemente no era controlable en ese momento, sino que cambiaba significativamente durante el cultivo (Sprott et al., Can. J. Microbiol. 43 (1997), 467-476). No fue hasta la introducción de nuevos métodos de cultivo actualmente disponibles que los cultivos de células de arqueas fueron manejables para regular los parámetros de cultivo, tales como una tasa de crecimiento específica. Por consiguiente, la técnica anterior ni siquiera era capaz de proporcionar composiciones lipídicas de arqueas que se proporcionaran de forma reproducible en composiciones de entidades lipídicas cualitativas y cuantitativas distintas, pero siempre y reproduciblemente definidas, mediante distintos parámetros de procedimiento y/o distintas condiciones de cultivo. La presente invención proporciona por primera vez lípidos de arqueas obtenidos a partir de cultivos de células de arqueas, especialmente cultivos de células de Sulfolobus.

Con la presente invención, la preparación de una mezcla de lípidos con el mayor número posible de anillos en las cadenas de fitanilo de la especie caldarqueol es posible al tiempo que se mantiene la ajustabilidad de la relación de Cal: Arc (dentro de los límites fisiológicos). Debido a su particular aptitud química, 2Hex-Cal y PI-Arc son especies diana específicamente preferidas de acuerdo con la presente invención. Por lo tanto, con la presente invención es posible proporcionar composiciones con arqueosomas con un alto número de anillos debido a la temperatura de crecimiento aumentada con el ajuste simultáneo de la relación de Cal: Arc con respecto a la tasa de crecimiento. A través de las condiciones de procedimiento controladas, la presente invención hace posible obtener un extracto lipídico que se puede utilizar directamente o con un mínimo esfuerzo de purificación para la producción de arqueosomas con alta resistencia al jugo gástrico y cinéticas de liberación a medida para distintos principios activos farmacéuticos.

Con la presente invención, se proporcionan dos composiciones específicas que comprenden lípidos de arqueas procedentes de un cultivo celular de Sulfolobus, uno siendo específicamente adecuado para su uso para una terapia oral retardada, siendo el otro específicamente adecuado para su uso para una terapia oral aguda. Las expresiones "terapia oral retardada" y "terapia oral aguda" se utilizan de acuerdo con la presente invención en su significado habitual: Mientras que una terapia oral "retardada" (o de "liberación prolongada", "liberación sostenida", "liberación extendida") muestra un "efecto retardado" que permite una liberación continua incluso después de algún tiempo tras el suministro, por ejemplo, 12 h después del suministro (oral), una terapia oral "aguda" (o de "liberación inmediata") se libera inmediatamente después de la administración y tiene una liberación máxima inmediatamente después del suministro, por ejemplo, dentro de las 3 h después de la administración oral (Pschyrembel, "retard effect": protracted release of an active substance due to galenic formulation; Andrade, J. Clin. Psychiatry 76 (2015), e995-e999; Perrie et al. "Controlling drug delivery" en Pharmaceutics: drug Delivery and Targeting" (2012), Pharmaceutical Press).

Los lípidos producidos para la producción de arqueosomas orales con efecto de liberación sostenida se adaptan específicamente a las necesidades de la administración oral y, por tanto, presentan una alta resistencia al jugo gástrico. Esta resistencia está salvaguardada por la presencia de un elevado número de anillos de ciclopentano. De acuerdo con la presente invención, se descubrió que esto se puede lograr mediante la aplicación de altas temperaturas de procedimiento, especialmente en el intervalo de 75 a 85 °C. Para el efecto retardado necesario para la liberación sostenida, se necesita una liberación lenta de la sustancia activa durante un período más largo, por lo que se precisa estabilidad temporal. De acuerdo con la presente invención, esto se puede lograr mediante la presencia de PI-Arc menos desestabilizante. Para obtener esta composición específica de lípidos, la presente invención proporciona la enseñanza de que esto precisa una alta tasa de crecimiento, es decir, preferentemente una tasa de crecimiento de 0,025 a 0,035 por hora, especialmente de 0,027 a 0,033 por hora. En una realización preferida de la presente invención, el presente método proporciona una composición para su uso para una terapia oral retardada que comprende una relación de dihexosa-caldarqueol (2Hex-Cal) con respecto a fosfatidilinositolarqueol (PI-Arc) de 1:5 a 1:7, especialmente de 1:5,5 a 1:6,5.

Los lípidos producidos para la producción de arqueosomas orales para terapia aguda son, por una parte, también están específicamente adaptados a las necesidades de la administración oral y, por tanto, presentan una elevada resistencia al jugo gástrico. Esta resistencia está, como en el caso del retardo, salvaguardada por la presencia de un elevado número de anillos de ciclopentano. De acuerdo con la presente invención, se descubrió que esto se puede lograr mediante la aplicación de altas temperaturas de procedimiento, especialmente en el intervalo de 75 a 85 °C. Por otro lado, una composición para terapia aguda precisa una rápida liberación del fármaco en el intestino. Por lo tanto, es necesaria una menor estabilidad de la composición. De acuerdo con la presente invención, esto se puede lograr mediante la presencia de PI-Arc más desestabilizante. Para obtener esta composición específica de lípidos, la presente invención proporciona la enseñanza de que esto precisa una baja tasa de crecimiento, es decir, preferentemente una tasa de crecimiento de 0,005 a 0,015 por hora, especialmente de 0,007 a 0,013 por hora. En una realización preferida de la presente invención, el presente método proporciona una composición para su uso para una terapia oral aguda que comprende una relación de dihexosa-caldarqueol (2Hex-Cal) con respecto a fosfatidilinositol-arqueol (PI-Arc) de 1:2 a 1:4, especialmente de 1:2,5 a 1:3,5.

Con estas composiciones obtenibles por el presente método, se pueden proporcionar arqueosomas hechos a medida en donde los fármacos que se van a suministrar se pueden envolver para su administración, preferentemente para la administración oral a pacientes humanos que necesitan una cantidad eficaz de este fármaco.

El cultivo de células de Sulfolobus está al alcance de cualquier experto en la materia y es, en principio, una técnica establecida desde hace mucho tiempo (ya en la época de Brock et al., Arch. Mikrobiol. 84 (1972), 54-68). Una cepa preferida de Sulfolobus son las células de Sulfolobus acidocaldarius; esta es una de las cepas establecidas en el campo actual de la técnica. Los depositarios de este organismo Sulfolobus utilizado puede ser, por ejemplo, la colección alemana de cepas de microorganismos (Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares, DSMZ), número de catálogo DSM 639. Una fuente alternativa de suministro es, por ejemplo, la Colección americana de cultivos tipo (ATCC), número de catálogo ATCC 33909. Otras arqueobacterias también están disponibles, por ejemplo, en la d Ms Z o la ATCC

Después de cultivar los cultivos celulares de Sulfolobus de acuerdo con las condiciones de cultivo definidas, los lípidos de las células de Sulfolobus se extraen. Esto se puede hacer de la manera que se divulga en la técnica. Preferentemente, las células se homogeneizan después del cultivo, preferentemente a través de homogeneización, especialmente homogeneización a alta presión o tratamiento con ultrasonidos, de modo que los lípidos sean extraíbles del cultivo acuoso. Un método preferido para purificar los lípidos de acuerdo con la presente invención es la extracción de fluidos supercríticos, especialmente la extracción con CO₂supercrítico (véase, por ejemplo, Hanif et al., Int. J. Mol. Sci. 13 (2012), 3022-3037). Antes de la extracción, se prefiere mezclar las células homogeneizadas con un tampón, por ejemplo, un tampón conocido y descrito en la técnica como adecuado para la extracción de lípidos de células de Sulfolobus, por ejemplo, con tampón de acetato de amonio, especialmente con un tampón de acetato de amonio que tenga acetato de amonio 100 a 200 mM.

De acuerdo con una realización preferida de la presente invención,

los lípidos de arqueas se obtienen por extracción de la fase acuosa que comprende las células y/o las células homogeneizadas en una fase orgánica, preferentemente por extracción en una fase orgánica de cloroformo/metanol, y separación de fases de la fase orgánica de la fase acuosa. La fase orgánica contiene entonces los lípidos en la forma deseada, una relación "a medida". Los lípidos de las arqueas se pueden obtener luego por evaporación de la fase orgánica, preferentemente por evaporación de la fase orgánica a sequedad.

Preferentemente, los lípidos de arqueas obtenidos se combinan con un fármaco farmacéuticamente activo, preferentemente en combinación con un transportador farmacéuticamente aceptable, para obtener una composición que comprende lípidos de arqueas y el fármaco farmacéuticamente activo. Esto se hace preferentemente después de proporcionar la composición purificada que comprende lípidos de arqueas (arqueosomas); sin embargo, es también posible añadir el fármaco y/o componentes adicionales ya en el procedimiento de purificación y copurificarlos con los lípidos.

De acuerdo con otra realización preferida del presente método, los lípidos de arqueas se obtienen mediante extracción de fluidos supercríticos, especialmente extracción con CO₂supercrítico.

De acuerdo con otro aspecto, la presente invención también se refiere a una composición que comprende lípidos de arqueas obtenibles mediante un método de acuerdo con la presente invención. Estas composiciones de arqueosomas "a medida" son novedosas y de gran utilidad para empaquetar fármacos que se suministrarán a los pacientes, especialmente para suministrar fármacos que ya se sabe que son adecuados para el uso terapéutico y profiláctico humano.

La presente invención también proporciona dos composiciones específicamente diseñadas, una para el uso oral retardado y otro para el uso oral activo: Por consiguiente, las composiciones preferidas de acuerdo con la presente invención comprenden una relación de dihexosa-caldarqueol (2Hex-Cal) con respecto a fosfatidil inositol-arqueol (PI-Arc) de 1:5 a 1:7 (uso oral retardado) o una relación de dihexosa-caldarqueol (2Hex-Cal) con respecto a fosfatidil inositol-arqueol (PI-Arc) de 1:2 a 1:4 (uso oral agudo). Ambas composiciones, como se define por esta relación específica de 2Hex-Cal/PI-Arc), tienen una alta resistencia contra el jugo gástrico que les permite un paso eficaz del estómago después de la administración oral. La composición oral retardada comprende además PI-Arc menos desestabilizante y tiene por tanto una propiedad de liberación retardada en el intestino que permite una liberación atrasada oportuna. Las composiciones orales agudas son menos estables en el intestino y, por tanto, el fármaco empaquetado puede liberarse inmediatamente de los liposomas, permitiendo un suministro rápido para la absorción intestinal del fármaco. Inesperadamente, realizar el cultivo del cultivo celular de Sulfolobus a una velocidad de crecimiento de 0,020 por hora no dio como resultado una composición retardada ni una composición de liberación inmediata con las relaciones específicas de 2Hex-Cal/PI-Arc definidas para las composiciones retardadas/agudas. Esto fue aún más inesperado en vista de Patel et al. (1999, citado anteriormente) en donde los datos obtenidos para las composiciones lipídicas, por ejemplo, para la tabla 1, se obtuvieron sin controlar las condiciones de crecimiento (véase, por ejemplo, Sprott et al., 1997, citado anteriormente).

Las composiciones de acuerdo con la presente invención son adecuadas para empaquetar cualquier fármaco que sea adecuado para el empaquetamiento en liposomas. Por consiguiente, las composiciones de acuerdo con la presente invención son específicamente adecuadas para comprender además un fármaco, preferentemente un fármaco para uso médico humano, especialmente un fármaco que está sujeto a una autorización para colocar el producto en el mercado como medicamento expedida en la UE o en los EE. UU. Sin embargo, dado que prácticamente no existen límites fisicoquímicos con respecto al fármaco que se combinará en una preparación de arqueosomas, en las composiciones lipídicas de acuerdo con la presente invención se puede empaquetar cualquier fármaco. Por consiguiente, se prefiere incluir fármacos en las composiciones lipídicas de acuerdo con la presente invención que se especifican para el uso humano (o animal), ya sea porque están sujetos a una autorización de comercialización nacional o regional o porque se administran a seres humanos por otro motivo.

Las composiciones preferidas de acuerdo con la presente invención comprenden PI-Arc al menos al 5 % p/p, preferentemente al menos al 10 % p/p, y 2Hex-Cal al menos al 50 % p/p (% p/p como % p/p de lípido total).

De acuerdo con un aspecto más general, la presente invención proporciona un método para producir una composición que comprende lípidos de arqueas a partir de un cultivo celular de arqueas, que comprende hacer crecer un cultivo de células de arqueas en condiciones controladas y extraer los lípidos de arqueas del cultivo de arqueas para obtener una composición que comprenda lípidos de arqueas. La presente invención proporciona un método de producción controlado que permite composiciones definidas y reproducibles de lípidos de arqueas. Preferentemente, las condiciones controladas se seleccionan de pH, tasa de crecimiento, temperatura y modo de procedimiento. El método de acuerdo con la presente invención es, en principio, aplicable a todas las células de arqueas. Por consiguiente, el cultivo celular de arqueas de acuerdo con la presente invención es un cultivo de S. acidocaldarius, M. hungatei, M. voltae, M. concilii, M. smithii, M. espanolae, T. acidophilum, M. mazei, M. españole, T. acidophilum, H. salinarum, M. smithii, M. stadtmanae, H. halobium, H. morrhuae, M. jannaschii, S. islandicus, S. solfataricus, S. shibatae, S. tokodaii, S. Metallicus, M. sedula, H. hispanica y H. volcanii, preferentemente S. acidocaldarius.

Las temperaturas preferidas para el crecimiento del cultivo de arqueas se pueden optimizar usando las enseñanzas de acuerdo con la presente invención y están preferentemente en el intervalo de una temperatura de 55 a 90 °C, preferentemente de 70 a 85 °C, especialmente de 75 a 85 °C.

Las realizaciones específicamente preferidas de la presente invención comprenden hacer crecer el cultivo de arqueas a una tasa de crecimiento de 0,025 a 0,035 por hora, especialmente de 0,027 a 0,033 por hora, o a una tasa de crecimiento de 0,005 a 0,015 por hora, especialmente de 0,007 a 0,013 por hora.

Las realizaciones específicamente preferidas de la presente invención comprenden hacer crecer el cultivo de arqueas a un pH de 2 a 4, preferentemente de 2,5 a 3,5.

La presente invención se puede aplicar haciendo crecer el cultivo de arqueas en modo continuo y haciendo crecer el cultivo de arqueas en modo discontinuo, especialmente en modo semicontinuo.

El método de acuerdo con la presente invención comprende preferentemente la extracción de los lípidos de arqueas mediante extracción en dos fases, extracción orgánica, especialmente con Soxhlet, extracción a alta presión o alta temperatura; por extracción de líquidos iónicos, o por extracción de fluidos supercríticos.

De acuerdo con una realización preferida, el presente método comprende extraer los lípidos de arqueas mediante un disolvente seleccionado del grupo que consiste en agua, hexano, cloroformo, acetona, dietil éter, metanol, etanol, acetato de etilo, diclorometano, MTBE, CO₂, y mezclas de los mismos. La presente invención se ilustra además mediante los siguientes ejemplos y las figuras, pero sin limitarse a ellos.

La Fig. 1 muestra la composición del patrón de lípidos dependiendo de la temperatura de crecimiento;

la Fig. 2 muestra la composición del patrón de lípidos dependiendo de la tasa de crecimiento;

la Fig. 3 muestra la composición del patrón de lípidos dependiendo del modo de procedimiento;

la Fig. 4 muestra las estructuras principales de los lípidos Sulfolobus acidocaldarius;

la Fig. 5 muestra la influencia de la temperatura de crecimiento sobre el número de anillos de ciclopentano; la Fig. 6 muestra los datos espectrales de la muestra de biomasa crecida a 68 °C;

la Fig. 7 muestra los datos espectrales de la muestra de biomasa crecida a 75 °C;

la Fig. 8 muestra los datos espectrales de la muestra de biomasa crecida a 82 °C;

la^ Fig. 9 muestra los datos espectrales de la muestra de biomasa crecida con una tasa de crecimiento de 0,010 la^ Fig. 10 muestra los datos espectrales de la muestra de biomasa crecida con una tasa de crecimiento de 0,020 la^ Fig. 11 muestra los datos espectrales de la muestra de biomasa crecida con una tasa de crecimiento de 0,034 la Fig. 12 muestra los datos espectrales de la muestra de biomasa crecida en modo semicontinuo;

la Fig. 13 muestra los datos espectrales de la muestra de biomasa cultivada en modo continuo.

Ejemplos

1. Generación de lípidos de arqueas a medida

La presente invención describe una técnica para la producción de distintos patrones de lípidos en Sulfolobus acidocaldarius con una composición definida y ajustable a través de la variación de los parámetros del procedimiento durante el procedimiento aguas arriba.

Los presentes ejemplos muestran que a través de la variación de los parámetros críticos del procedimiento durante la parte de aguas arriba, por ejemplo, la temperatura, la tasa de crecimiento, el modo de procedimiento, el organismo Sulfolobus acidocaldarius produjo distintos patrones de lípidos (relación de distintas fracciones de lípidos). Por tanto, en consecuencia, se pueden recoger distintas composiciones lipídicas después del procesamiento aguas abajo. Dado que el patrón de lípidos puede verse influenciado por un amplio número de parámetros críticos del procedimiento (temperatura, tasa de crecimiento, modo de procedimiento, presión, osmolaridad, composición de medios, contenido de oxígeno disuelto, etc.) es posible una afinación muy específica del patrón.

Los siguientes párrafos describen casos de la influencia de (A) la temperatura, (B) la tasa de crecimiento y (C) el modo de procedimiento sobre la relación de fracciones de lípidos. Dependiendo de la aplicación de la mezcla de lípidos por parte del usuario/cliente, se puede ajustar un patrón de lípidos deseado seleccionando cuidadosamente los parámetros del procedimiento necesarios.

Los cultivos se cultivaron en un entorno de biorreactor controlado en un medio definido.

1.1 Influencia de la temperatura

La temperatura se fijó a 68/75/82 °C por un período de 3 tiempos de generación para cada temperatura y después de eso se tomó una muestra de la biomasa. La abundancia relativa de las 5 fracciones de lípidos principales se determinó mediante MALDI-MS (modo de ion positivo; sin adición de Na+). Los resultados se presentan en las Fig. 1 y 5 a 8.

1.2 Influencia de la tasa de crecimiento

La tasa de crecimiento se ajustó en 0,010/0,020/0,034 h-1 durante un período de 3 tiempos de generación para cada tasa de crecimiento y después de eso se tomó una muestra de la biomasa. La abundancia relativa de las 5 fracciones de lípidos principales se determinó mediante MALDI-MS (modo de ion positivo; sin adición de Na+). Los resultados se presentan en las Fig. 2, 9, 10 y 11.

1.3 Influencia del modo de procedimiento

El cultivo se cultivó en distintos modos de procedimiento (modo semicontinuo y modo continuo) durante un período de 3 tiempos de generación para cada modo de procedimiento y luego se tomó una muestra de la biomasa. La abundancia relativa de las 5 fracciones de lípidos principales se determinó mediante MALDI-MS (modo de ion positivo; sin adición de Na+). Los resultados se presentan en las Fig. 3, 12 y 13.

2. Materiales y métodos

2.1 Aguas arriba: Cultivo en biorreactor de Sulfolobus acidocaldarius DSM639

Para la generación de lípidos de arqueas a medida se cultivó S. acidocaldarius en un modo de procedimiento continuo para garantizar condiciones de procedimiento constantes durante al menos 3 tiempos de generación. La fase continua estuvo precedida por una fase discontinua y semicontinua para la acumulación de biomasa. Los volúmenes en los siguientes párrafos son ilustrativos y pueden ampliarse o reducirse si es necesario.

El precultivo de Sulfolobus acidocaldarius DSM 639 se creció en un matraz de agitación de 100 ml durante 100 h en un baño de aceite rotatorio a 75 °C y 100 rpm en un medio definido de acuerdo con Quehenberger et al. (Journal of Biotechnology (2019) Presentación JBIOTEC-D-18-01483; "Medio VD"; véase la siguiente tabla).

Tabla:

El precultivo se transfirió asépticamente a un recipiente de cultivo que contenía un medio definido de acuerdo con Quehenberger et al. (2019), arrojando un volumen inicial total para la fase discontinua de 1,5 l. La fase discontinua se realizó a 75 °C hasta que se observó una disminución de la señal de CO₂y estuvo seguida por una fase semicontinua a 75 °C (medio que contenía 10 g/l de glutamato de Na y 3 g/l de D-glucosa, alimentación exponencial, |j = 0,03 horas-1) hasta alcanzar un volumen total de 2,5 l. La fase semicontinua estuvo seguida por un cultivo continuo a la temperatura de crecimiento y velocidad de crecimiento deseadas. Para garantizar el tiempo suficiente para que el organismo se adapte a las condiciones de crecimiento específicas durante la fase continua, se recogió biomasa después de al menos 3 tiempos de generación.

El cálculo del caudal inicial (F0) de la alimentación para la fase exponencial se basa en el balance de masas de la fuente de carbono:

V caudal volumétrico [l/h]

Ci concentración del compuesto i [g/l]

V^rvolumen del reactor [l]

ri velocidad de reacción del componente i [g/l/h]

Fórmula 1: Balance general de masas

Después de la simplificación:

V caudal volumétrico [l/h]

Ci concentración del compuesto i [g/l]

VR volumen del reactor [l]

ri velocidad de reacción del componente i [g/l/h]

Fórmula 2: Balance de masas simplificado para semicontinuo

Y estableciendo el lado derecho (términos constantes) en cero y reescribiendo:

F0 velocidad de alimentación inicial del lote alimentado [g/h]

|j tasa de crecimiento específica [h-1]

xo concentración inicial de biomasa [g/l]

Vo Volumen inicial del reactor [l]

so concentración de sustrato de la alimentación [g/l]

Yx/s rendimiento de biomasa [g/g]

Fórmula 3: Tasa de alimentación inicial durante la fase semicontinua (la densidad del caldo se supone de 1 kg/l). Para el cálculo de la tasa de alimentación (Feedrate) (F0, Fórmula 3) x0 se determinó a través de la medición de la DO600 y una curva de calibración para la conversión de la DO600 a peso celular seco; S0 se calculó como la suma de las concentraciones de glutamato de Na y D-glucosa y se supuso un rendimiento de biomasa determinado empíricamente de 0,33. F0 luego se aumentó exponencialmente durante la fase semicontinua de acuerdo con la Fórmula 4.

Fórmula 4: Cálculo de la tasa de alimentación durante la fase semicontinua.

La alimentación se controló mediante el peso del recipiente de alimentación y se utilizó un controlador PID para compensar las desviaciones de la bomba de alimentación.

Durante la fase continua el valor de la tasa de dilución (D) se igualó a la tasa de crecimiento deseada (D=j), por lo que la tasa de dilución se calculó como la suma de la corriente de ácido añadida y la alimentación. Con un volumen de trabajo conocido (Vr) la velocidad de alimentación (Fconti) se calculó a través de Fconti=D*VR (la densidad del caldo se supone de 1 kg/l).

Los niveles de oxígeno disuelto se controlaron en línea y se mantuvieron por encima del 15 % mediante aireación con 0,25 a 0,5 vvm (volúmenes de gas por volumen de cultivo por minuto) de aire presurizado. El aire se sustituyó por oxígeno puro si era necesario. El pH se controló en línea y se mantuvo en 3,0 /- 0,1 mediante la adición de H₂SO4 (9,6 % v/v). El medio de alimentación se suministró a través de un módulo de bomba peristáltica siguiendo una estrategia de alimentación exponencial de alimentación directa. La mezcla se realizó de 300 a 500 rpm. Se controló el contenido de CO₂del gas emitido.

2.2 Aguas abajo: Cosecha de células, homogeneización de biomasa y extracción de lípidos

Las células se recogieron mediante centrifugación a 14.000 g durante 15 min. Después de descartar el sobrenadante, el sedimento celular se almacenó a -20 °C para su posterior procesamiento. Se descongeló un sedimento celular procedente de 100 ml de caldo de cultivo por muestra (el peso celular seco en el momento de la recogida se muestra en la Tabla 1) y se resuspendió en 10 ml de tampón de acetato de amonio enfriado con hielo (155 mM). La suspensión se homogeneizó en un vaso de precipitados de vidrio en un baño de hielo/agua mediante tratamiento con ultrasonidos (6x1 min con una pausa de 30 s entre pulsos). Después de la homogeneización, la muestra se diluyó a una DO600 de 1,5 con tampón de acetato de amonio enfriado con hielo (155 mM). Se añadieron 3,33 partes de una mezcla de CHCl3/MeOH 2:1 enfriada en hielo a 1 parte de homogeneizado diluido y la mezcla resultante se agitó con vórtex durante 30 minutos a 1.400 rpm y 4 °C. Las muestras se centrifugaron (2 min, 1.000 g, 4 °C) para la separación de fases. La fase orgánica se recolectó en un vial de vidrio y la muestra se evaporó a sequedad con N2 a temperatura ambiente. Los lípidos se almacenaron a -20 °C para su posterior análisis.

2.3 Análisis: Identificación de fracciones de lípidos con espectrometría de masas MALDI

Las fracciones de lípidos secas se reconstituyeron en una mezcla de CHC^MeOH 1:3. Estas fracciones se usaron inmediatamente para la preparación de las muestras de MALDI usando 2-4-,6-trihidroxiacetofenona (THAP) como matriz de MALDI (aproximadamente 15 mg de THAP/ml sin o con la adición de cloruro de sodio para favorecer los iones de aducto de sodio). Finalmente, la matriz y la solución de analito se mezclaron 1:1 para el depósito en placas de 384 pocillos de acero inoxidable de MALDI: El instrumento de espectrometría de masas utilizado fue un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo en tándem Shimadzu MALDI 7090 TOHRTOF equipado con una celda de colisión de gas conectada a tierra para experimentos de DIC de alta energía (Elab = 20 keV, gas de colisión: helio). Antes de los experimentos de MS en tándem, las muestras se midieron en TOF-MS reflectrón de iones positivos y negativos. La calibración de masas se realizó con una mezcla peptídica comercial suministrada por Shimadzu que permite la calibración de masas hasta m/z 3600. En el modo de ion positivo, principalmente [M+Na]+ y [M+2Na-H]+ se detectaron iones aducto de las moléculas de analito dependiendo del proceso dopante con sal. La mayoría de los lípidos contenían grupos de cabeza de fosfoinositol. Todos los analitos se caracterizaron mediante DIC de TOHRTOF-MS de alta energía. En cambio, en el modo de ion negativo, solo se detectaron lípidos que contienen fosfoinositol (pero no lípidos neutros) como iones [MH]-, caracterizados también por DIC de TOHRTOF-MS de alta energía. Hasta ahora, todos los analitos lipídicos cargados contienen un grupo de cabeza polar de fosfoinositol. Los lípidos menores, que además pueden estar presente en esta mezcla, pueden analizarse después de la separación por HPTLC y la extracción micropreparativa mediante análisis de MALDI posteriores.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Método para producir una composición que comprende lípidos de arqueas a partir de un cultivo celular de Sulfolobus, que comprende

2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el cultivo celular de Sulfolobus es un cultivo de células de Sulfolobus acidocaldarius.

3. Método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde la composición para su uso para una terapia oral retardada comprende una relación de dihexosa-caldarqueol (2Hex-Cal) con respecto a fosfatidilinositol-arqueol (PI-Arc) de 1:5 a 1:7, especialmente de 1:5,5 a 1:6,5.

4. Método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde la composición para su uso para una terapia oral aguda comprende una relación de dihexosa-caldarqueol (2Hex-Cal) con respecto a fosfatidilinositol-arqueol (PI-Arc) de 1:2 a 1:4, especialmente de 1:2,5 a 1:3,5.

5. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde las células se homogeneizan después del cultivo, preferentemente a través de homogeneización, especialmente homogeneización a alta presión, o tratamiento con ultrasonidos.

6. Método de acuerdo con la reivindicación 5, en donde las células homogeneizadas se mezclan con un tampón, preferentemente con tampón de acetato de amonio, especialmente con un tampón de acetato de amonio que tenga acetato de amonio 100 a 200 mM.

7. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde los lípidos de arqueas se obtienen por extracción de la fase acuosa que comprende las células y/o las células homogeneizadas en una fase orgánica, preferentemente por extracción en una fase orgánica de cloroformo/metanol, y separación de fases de la fase orgánica de la fase acuosa.

8. Método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde los lípidos de arqueas se obtienen por evaporación de la fase orgánica, preferentemente por evaporación de la fase orgánica a sequedad.

9. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde los lípidos de arqueas obtenidos se combinan con un fármaco farmacéuticamente activo, preferentemente en combinación con un transportador farmacéuticamente aceptable, para obtener una composición que comprende lípidos de arqueas y el fármaco farmacéuticamente activo.

10. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde los lípidos de arqueas se obtienen mediante extracción de fluidos supercríticos, especialmente extracción con CO₂supercrítico.

11. Composición que comprende lípidos de arqueas obtenibles mediante un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

12. Composición que comprende lípidos de arqueas, preferentemente de acuerdo con la reivindicación 11, en donde la composición comprende una relación de dihexosa-caldarqueol (2Hex-Cal) con respecto a fosfatidil inositol-arqueol (PI-Arc) de 1:5 a 1:7 o de 1:2 a 1:4.

13. Composición de acuerdo con la reivindicación 11 o 12, que comprende además un fármaco, preferentemente un fármaco para uso médico humano, especialmente un fármaco que está sujeto a una autorización para colocar el producto en el mercado como medicamento expedida en la UE o en los EE. Uu .

14. Composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en donde los arqueosomas comprenden PI-Arc al menos al 5 % p/p, preferentemente al menos al 10 % p/p, y 2Hex-Cal al menos al 50 % p/p (% p/p como % p/p de lípido total).