ES2947291T3 - Heparán sulfato que presenta una elevada tasa de 3-O-sulfatación en los residuos de glucosamina - Google Patents

Heparán sulfato que presenta una elevada tasa de 3-O-sulfatación en los residuos de glucosamina Download PDF

Info

Publication number
ES2947291T3
ES2947291T3 ES16881651T ES16881651T ES2947291T3 ES 2947291 T3 ES2947291 T3 ES 2947291T3 ES 16881651 T ES16881651 T ES 16881651T ES 16881651 T ES16881651 T ES 16881651T ES 2947291 T3 ES2947291 T3 ES 2947291T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
polysaccharide
sulfation
heparosan
glcn
solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES16881651T
Other languages
English (en)
Inventor
Kenichi Mori
Yuriko Tokura
Shunsuke Yamazaki
Tomoko Shimizu
Yasuhiro Mihara
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ajinomoto Co Inc
Original Assignee
Ajinomoto Co Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ajinomoto Co Inc filed Critical Ajinomoto Co Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2947291T3 publication Critical patent/ES2947291T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0075—Heparin; Heparan sulfate; Derivatives thereof, e.g. heparosan; Purification or extraction methods thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/726—Glycosaminoglycans, i.e. mucopolysaccharides
    • A61K31/727—Heparin; Heparan
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

La invención proporciona un nuevo polisacárido sulfatado que tiene actividad anticoagulante. Específicamente, la invención proporciona un polisacárido que incluye estructuras repetitivas de unidades de disacárido que comprenden residuos de ácido hexurónico (HexA) y residuos de α-D-glucosamina (GlcN) en los que la tasa de 3-O-sulfatación de los residuos de GlcN es del 13 % o superior. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Heparán sulfato que presenta una elevada tasa de 3-O-sulfatación en los residuos de glucosamina
Campo técnico
La presente invención se refiere a un nuevo polisacárido sulfatado que presenta una actividad anticoagulante. El polisacárido sulfatado que presenta la actividad anticoagulante resulta útil en, por ejemplo, el campo médico.
Antecedentes de la técnica
Por ejemplo, se conocen diversos heparán sulfatos, tales como la heparina, como polisacáridos sulfatados que presentan una actividad anticoagulante. Es decir, la heparina es uno de los anticoagulantes, y se utiliza para el tratamiento del tromboembolismo y la coagulación intravascular diseminada (CID) y para la prevención de la coagulación sanguínea en la diálisis artificial o la circulación extracorpórea.
La heparina muestra un efecto de anticoagulación a través de la activación de la antitrombina III, que es un factor anticoagulación. La antitrombina III inhibe la trombina, el factor Xa (la forma activa de un factor X) y otras serina proteasas mediante la unión a su sitio activo de serina. La trombina es un factor de coagulación sanguínea y el factor Xa es un factor que participa en la maduración de la trombina. La heparina se une a la antitrombina III, cambiando su estructura y activando su actividad inhibidora. La trombina presenta una afinidad superior para el complejo de heparina-antitrombina III que el factor Xa.
La heparina de bajo peso molecular que presenta un peso molecular medio de entre 4000 y 6000 Da obtenido mediante el tratamiento enzimático/químico y el fraccionamiento de la heparina presenta menos efectos secundarios de sangrado y se ha utilizado más frecuentemente en los últimos años. La heparina de bajo peso molecular puede unirse a la antitrombina III debido a su cadena sacárida corta, aunque se une poco a la trombina. En la presente memoria, la trombina necesita unirse a la heparina durante la inhibición de la trombina por el complejo de heparina-antitrombina III, mientras que el factor Xa no necesita unirse a la heparina durante la inhibición del factor Xa por el complejo de heparina-antitrombina III. De esta manera, la heparina de bajo peso molecular apenas inhibe la actividad de la trombina, mientras que puede inhibir la actividad del factor Xa.
Actualmente, la mayoría de las preparaciones de heparina son productos de extracción obtenidos de la mucosa intestinal porcina. Sin embargo, en 2008 se produjo un accidente fatal causado por contaminación y por ello se ha estado investigando cómo desarrollar la producción de heparina de origen no animal de calidad controlada.
Se han publicado muchos procedimientos de producción de heparina de origen no animal y se dividen ampliamente en dos tipos. En un primer tipo de procedimiento, el heparosano, que es el esqueleto de cadena sacárida de la heparina, se produce mediante un procedimiento de fermentación que utiliza un microorganismo tal como la cepa Escherichia coli K5 y se convierte en un polisacárido anticoagulante como la heparina mediante la utilización de una técnica química o enzimática, seguido de la reducción de su peso molecular mediante la utilización de una técnica química, enzimática o física (referencias de la literatura no de patentes n.° 1 y n.° 2). En un segundo tipo de procedimiento, las cadenas sacáridas se unen únicamente mediante un procedimiento de síntesis química (referencia de literatura de patentes n.° 1).
Como procedimiento para producir heparina mediante la utilización de heparosano como material de partida, se ha informado de un procedimiento que incluye principalmente la conversión química y un procedimiento que implica principalmente la conversión enzimática. Los polisacáridos análogos a heparina producidos presentan características estructurales y potencia de la actividad anticoagulante diferentes (documentos de patente n.° 2 y n.° 3).
En los polisacáridos análogos a la heparina producidos en el procedimiento que incluye principalmente la conversión química, la tasa de 3-O-sulfatación en los residuos de glucosamina es elevada, mientras que una parte de los residuos de ácido glucurónico también están 3-O-sulfatados. Este residuo de ácido glucurónico 3-O-sulfatado es una estructura que no está presente en la heparina de origen animal y se produce su reacción lateral in vivo.
Por otra parte, aunque los polisacáridos análogos a heparina producidos en el procedimiento que implica principalmente la conversión enzimática presentan el mismo patrón de sulfatación que la heparina de origen animal, su actividad anticoagulante es aproximadamente la mitad de la de los productos de origen animal.
A partir de los resultados anteriores que se han indicado anteriormente, todavía no se conoce ningún polisacárido análogo a heparina que presente el mismo patrón de sulfatación que el de la heparina de origen animal y que muestre una elevada actividad anticoagulante.
Referencias de la técnica anterior
Referencias de la literatura de patentes
Referencia n.° 1 de la literatura de patentes: US20120116066
Referencia n.° 2 de la literatura de patentes: US8227449
Referencia n.° 3 de la literatura de patentes: US20120322114
Referencia de la literatura no de patentes
Referencia n.° 1 de la literatura no de patentes: Lindahl U. et al. (2005), J. Med. Chem., 48(2): 349-352. Referencia n.° 2 de la literatura no de patentes: Zhang Z. et al. (2008), Journal of the American Chemical Society, 130 (39): 12998-13007.
Exposición de la invención
Problema que debe resolver la invención
Es un objetivo de la presente invención proporcionar un nuevo polisacárido sulfatado que presenta una actividad anticoagulante.
Medios para resolver el problema
Como resultado de un amplio estudio, los presentes inventores han encontrado un nuevo polisacárido sulfatado que comprende una estructura repetitiva de una unidad disacárido compuesta de un residuo ácido hexurónico (HexA) y un residuo a-D-glucosamina (GlcN), que muestra una elevada tasa de 3-O-sulfatación en los residuos GlcN y que presenta una actividad anticoagulante, y han llevado a cabo la presente invención.
Es decir, la presente invención se define en las reivindicaciones adjuntas.
En particular, la presente invención se refiere a un polisacárido que presenta una actividad anticoagulante, en el que la proporción de actividad antifactor Xa/actividad antifactor IIa es de 1.5 o superior, que comprende una estructura repetitiva de una unidad disacárido mostrada en la fórmula general (I) siguiente:
Figure imgf000003_0001
en la que:
R1 a R5 satisfacen las condiciones siguientes:
R1, R2, R4 y R5 representan, cada uno independientemente, un hidrógeno o un grupo sulfato,
R3 representa un hidrógeno, un grupo sulfato o un grupo acetilo,
la proporción de grupos sulfato en R2 en los residuos de ácido glucurónico es inferior a 15 %,
por lo menos parte de R3 es un grupo sulfato,
una proporción de grupos sulfato en R4 es de 13 % o superior, y
una proporción de grupos sulfato en R5 es de 50 % o superior,
estando el 50 % o más de las cadenas sacáridas del número total de cadenas sacáridas que constituyen dicho polisacárido compuesto de una estructura mostrada en la fórmula general (II) siguiente:
Figure imgf000004_0001
en la que:
Ri a R5 son iguales a R1 a R5 en dicha fórmula general (I), y
n es un valor entre 3 y 30 como valor medio,
siendo el peso molecular medio en número medido mediante cromatografía de permeación en gel mediante la utilización de pululano como patrón de entre 12000 y 40000.
Efecto de la invención
La presente invención puede proporcionar un nuevo polisacárido sulfato que presenta la actividad anticoagulante.
Forma de realización para llevar a cabo la invención
A continuación en la presente memoria se describe en detalle la presente invención.
<1> Polisacárido en la presente invención.
El polisacárido de la presente invención es un nuevo polisacárido sulfatado que presenta una actividad anticoagulante. El polisacárido de la presente invención se denomina opcionalmente “heparán sulfato”. El polisacárido de la presente invención puede estar compuesto de un único tipo de cadena sacárida o puede ser una mezcla de múltiples tipos de cadenas sacáridas. El polisacárido de la presente invención habitualmente se obtiene en forma de una mezcla de múltiples tipos de cadenas sacáridas. La “mezcla de múltiples tipos de cadenas sacáridas” se refiere a una combinación de dos o varios tipos de cadenas sacáridas que son de estructura diferente (número de azúcares enlazados, peso molecular y tipo y posición de un sustituyente, y similares). En el caso de que el polisacárido de la presente invención esté compuesto de un único tipo de cadena sacárida, cada parámetro que identifique el polisacárido de la presente invención corresponderá a ese parámetro en esa cadena sacárida a menos que se especifique lo contrario. En el caso de que el polisacárido de la presente invención sea una mezcla de múltiples tipos de cadenas sacáridas, cada parámetro que identifique el polisacárido de la presente invención corresponderá a un valor medio de los parámetros en toda la mezcla, a menos que se especifique lo contrario. Lo mismo es de aplicación a otros polisacáridos, tales como intermediarios durante la producción del polisacárido de la presente invención.
Cada parámetro que identifica el polisacárido de la presente invención puede determinarse mediante técnicas conocidas utilizadas para la detección y la identificación de compuestos, tales como polisacáridos. Entre los ejemplos de dichas técnicas se incluyen el análisis de disacáridos, el análisis de pesos moleculares (por ejemplo, la cromatografía de permeación en gel, CPG), la cromatografía de exclusión por tamaños acuosa (CET) mediante la utilización de un detector de absorbancia de luz ultravioleta (UV) y visible y un detector de índice de refracción (IR) (procedimiento SEC-RI/UV, por sus siglas en inglés), así como HPLC, CL/EM y RMN. Dichas técnicas pueden utilizarse solas o en combinación, según resulte apropiado. Dichas técnicas pueden seleccionarse apropiadamente según el tipo de parámetro que deba determinarse. Por ejemplo, puede determinarse la estructura de un disacárido o el contenido en proporción del mismo mediante un análisis de disacáridos. El análisis de disacáridos puede llevarse a cabo mediante un procedimiento estándar. El análisis de disacáridos puede llevarse a cabo de acuerdo con las condiciones en una publicación anterior (T. Imanari et al., “High-performance liquid chromatographic analysis of glycosaminoglycan-derived oligosaccharides”, J.O. Chromato. A, 720, 275-293 (1996)). Es decir, por ejemplo, puede cuantificarse una cantidad de disacáridos constituyentes mediante, según se requiera, la descomposición de un polisacárido N-sulfatado en disacáridos insaturados mediante la utilización de heparinasa, y la separación y cuantificación de los productos descompuestos. Entre los ejemplos de heparinasa se incluyen heparinasa I, heparinasa II y heparinasa III. La heparinasa puede utilizarse sola o en combinación, según resulte apropiado. La heparinasa que debe utilizarse puede seleccionarse apropiadamente según diversas condiciones, tales como el tipo de residuo de ácido hexurónico (HexA) contenido en el polisacárido. Por ejemplo, puede utilizarse una combinación de heparinasa II y III para el análisis de disacáridos de un polisacárido que comprende residuo de ácido p-D-glucurónico (GlcA). Además, por ejemplo, puede utilizarse una combinación de heparinasa I y II para el análisis de disacáridos de un polisacárido que comprende residuo de ácido a-L-idurónico (IdoA). Puede cuantificarse la cantidad de cada disacárido constituyente mediante la descomposición del polisacárido con ácido nitroso y separación y cuantificación del producto descompuesto. La separación y cuantificación del producto descompuesto pueden llevarse a cabo mediante procedimientos conocidos de identificación de los compuestos, tales como HPLC y CL/EM. Entre los condiciones para el análisis de disacáridos se incluyen específicamente, por ejemplo, las condiciones indicadas en los Ejemplos. El contenido en proporción de una unidad disacárida diana puede calcularse basándose en la cantidad de cada constituyente disacárido. En el caso de que un polisacárido se corte mediante la utilización de heparinasa, tal como heparinasa III, habitualmente un enlace entre C4 y C5 se convierte en un doble enlace en un residuo HexA en un extremo no reducido que resulta del mismo. El residuo IdoA y el residuo GlcA no pueden distinguirse del residuo HexA que presenta un doble enlace entre C4 y C5. De esta manera, en el caso de que resulte necesario distinguir el residuo IdoA del residuo GlcA, puede llevarse a cabo un análisis de disacáridos mediante una técnica tal como un procedimiento de descomposición con ácido nitroso que puede distinguir el residuo IdoA del residuo GlcA. También puede determinarse cada parámetro que identifica otros polisacáridos, tal como intermediarios en el caso de que se produzca el polisacárido de la presente invención.
En la presente invención, pueden determinarse directamente el peso molecular medio (peso molecular medio en número (Mn y peso molecular medio en peso (Mw)) mediante la utilización de pululano como patrón, a menos que se indique lo contrario. Alternativamente, puede calcularse un peso molecular medio real del heparán sulfato de manera indirecta mediante cálculo proporcional basado en una molécula que presenta un peso molecular medio real conocido (por ejemplo, la enoxaparina sodio). En la presente invención, el peso molecular medio del heparán sulfato puede medirse directa o indirectamente tal como anteriormente, y preferentemente se mide directamente.
El polisacárido de la presente invención es específicamente un polisacárido que presenta una actividad anticoagulante, que comprende una estructura repetitiva de una unidad disacárida, tal como se muestra en la fórmula general (I) siguiente:
Figure imgf000005_0001
En la fórmula, R1, R2, R4 y R5 representan, cada uno independientemente, un hidrógeno (-H) o un grupo sulfato (-SO3H) y R3 representa un hidrógeno (-H), un grupo sulfato (-SO3H) o un grupo acetilo (-COCH3). R1 a R5 se seleccionan independientemente en cada unidad repetida y en cada cadena sacárida. Un tipo de residuo ácido hexurónico (HexA) también se selecciona independientemente en cada unidad repetida y en cada cadena sacárida.
El polisacárido de la presente invención puede comprender la estructura repetitiva anteriormente indicada como elemento constituyente principal. La expresión “el polisacárido de la presente invención puede comprender la estructura repetitiva anteriormente indicada como elemento constituyente principal” puede referirse a que una parte que es 90 % o más, 95 % o más, 97 % o más, 99 % o más o 100 % (la totalidad) del polisacárido de la presente invención está compuesta de la estructura repetitiva anteriormente indicada. La expresión “el polisacárido de la presente invención puede comprender la estructura repetitiva anteriormente indicada como un elemento constituyente principal” puede referirse sustancialmente a que una parte que es 90 % o más, 95 % o más, 97 % o más, 99 % o más o 100 % (la totalidad) del polisacárido de la presente invención está compuesta de la unidad disacárido anteriormente indicada (la unidad disacárido mostrada en la fórmula general (I)). El porcentaje de la parte compuesta de la unidad disacárido anteriormente indicada también se denomina “proporción de contenido de la unidad disacárido anteriormente indicada”. Es decir, la proporción de contenido de la unidad disacárido anteriormente indicada en el polisacárido de la presente invención puede ser, por ejemplo, 90 % o más, 95 % o más, 97 % o más, 99 % o más o 100 %. La proporción de contenido de la unidad disacárido anteriormente indicada puede medirse mediante, por ejemplo, análisis de disacáridos. Es decir, la proporción de contenido de la unidad disacárido anteriormente indicada puede calcularse, por ejemplo, como un porcentaje (proporción molar) de una cantidad total de las unidades disacárido anteriormente indicadas respecto a la cantidad total de disacárido en el caso de que el polisacárido de la presente invención se someta a análisis de disacáridos.
Pueden configurarse adecuadamente en el polisacárido de la presente invención el número medio de repeticiones de la unidad disacárida anteriormente indicada, el número medio de azúcares enlazados, el peso molecular medio en número (Mn) y el peso molecular medio en peso (Mw). El número medio de repeticiones de la unidad disacárida anteriormente indicada puede ser de, por ejemplo, 3 o más, 4 o más, 5 o más, o 6 o más, o 50 o menos, 30 o menos, 20 o menos, 15 o menos, 12 o menos, o 9 o menos, o una combinación de los mismos. Específicamente, el número medio de repeticiones de la unidad disacárida anteriormente indicada puede ser de entre 3 y 15, o de entre 6 y 9. El número medio de azúcares enlazados (número de residuos) puede ser de, por ejemplo, 6 o más, 8 o más, 10 o más, o de 12 o más, 100 o menos, 60 o menos, 40 o menos, 30 o menos, 24 o menos, o 18 o menos, o una combinación de los mismos. Específicamente, el número medio de azúcares enlazados puede ser de, por ejemplo, 6 a 60, 6 a 30 o 12 a 18 residuos. El número medio de repeticiones y el número medio de azúcares enlazados puede determinarse mediante técnicas utilizadas para la detección o la identificación de compuestos, tal como se ha ejemplificado anteriormente. Específicamente, el número medio de repeticiones y el número medio de azúcares enlazados puede determinarse basándose en, por ejemplo, el peso molecular. El peso molecular puede medirse mediante un procedimiento estándar. Un procedimiento de medir el peso molecular incluye la cromatografía de permeación en gel (CPG) y la cromatografía de exclusión por tamaño (CET) en medio acuoso mediante la utilización de un detector de absorbancia de luz ultravioleta (UV) y visible y un detector del índice de refracción (IR) (procedimiento CET-IR/UV, según la Farmacopea europea (FE)). Específicamente, entre las condiciones para medir el peso molecular mediante CPG se incluyen, por ejemplo, las condiciones indicadas en los Ejemplos. El peso molecular medio en número (Mn) puede ser, por ejemplo, de 7000 o más, 8000 o más, 10000 o más, 12000 o más, 15000 o más, o 18000 o más, 150000 o menos, 100000 o menos, 60000 o menos, 50000 o menos, 43000 o menos o 40000 o menos, o una combinación de los mismos, como valor medido mediante CPG mediante la utilización de pululano como patrón. Específicamente, el peso molecular medio en número (Mn) puede ser, por ejemplo, de entre 8000 y 60000, o de entre 12000 y 40000, o de entre 18000 y 43000, como valor medido mediante CPG mediante la utilización de pululano como patrón. El peso molecular medio en peso (Mw) puede ser de, por ejemplo, 9000 o más, 10000 o más, 12000 o más, 15000 o más, 21000 o más, o 25000 o más, 200000 o menos, 150000 o menos, 100000 o menos, 80000 o menos, 60000 o menos, o 50000 o menos, o una combinación de los mismos como valor medido mediante CPG mediante la utilización de pululano como patrón. Específicamente, el peso molecular medio en peso (Mw) puede ser, por ejemplo, de entre 10000 y 100000, o de entre 15000 y 50000, o de entre 25000 y 60000 como valor medido mediante CPG mediante la utilización de pululano como patrón. La proporción (Mw/Mn) del peso molecular medio en peso (Mw) al peso molecular medio en número (Mn) puede ser de, por ejemplo, 1 o superior, 2.0 o inferior, 1.9 o inferior, 1.8 o inferior, 1.7 o inferior, 1.6 o inferior, 1.55 o inferior, 1.5 o inferior, 1.45 o inferior, 1.4 o inferior, 1.35 o inferior, 1.3 o inferior, 1.25 o inferior, o de 1.2 o inferior, o una combinación de los mismos como valor medido mediante CPG mediante la utilización de pululano como patrón. Específicamente, la proporción de peso molecular medio en peso a peso molecular medio en número (Mw/Mn) puede ser, por ejemplo, de entre 1 y 1.6, de entre 1 y 1.5 o de entre 1 y 1.4 como valor medido mediante CPG mediante la utilización de pululano como patrón.
La unidad disacárida anteriormente indicada está compuesta de un residuo de ácido hexurónico (HexA) (residuo sacárido izquierdo en la fórmula) y un residuo de a-D-glucosamina (GlcN) (residuo sacárido derecho en la fórmula). En la unidad disacárida anteriormente indicada, el lado de residuo HexA (lado izquierdo) y el lado de residuo GlcN (lado derecho) también se denominan “ lado terminal no reducido” y “lado terminal reducido”, respectivamente. El residuo de ácido hexurónico es un residuo de ácido p-D-glucurónico (GlcA) o un residuo de a-L-idurónico (IdoA). Es decir, en la presente invención, la expresión “ácido hexurónico (HexA)” se utiliza como expresión inclusiva para el ácido p-D-glucurónico y para el ácido a-L-idurónico (IdoA). La expresión “ácido hexurónico (HexA)”, es decir, las expresiones “p-D-glucurónico (GlcA)” y “ácido a-L-idurónico (IdoA)”, incluye todos los posibles derivados según la selección de R1 y R2, a menos que se especifique otra cosa. La expresión “a-D-glucosamina” incluye potencialmente todos los derivados según la selección de R3, R4 y R5, a menos que se especifique otra cosa.
El polisacárido de la presente invención puede presentar la estructura de repetición anteriormente indicada, de manera que la unidad disacárida anteriormente indicada esté presente en una parte o en la totalidad del extremo no reducido. Por ejemplo, 90 % o más, 95 % o más, 97 % o más, 99 % o más o 100 % de las unidades disacáridas en el extremo no reducido del polisacárido de la presente invención pueden ser la unidad disacárida anteriormente indicada. Es decir, por ejemplo, 90 % o más, 95 % o más, 97 % o más, 99 % o más o 100 % de los residuos sacáridos en el extremo no reducido del polisacárido de la presente invención pueden ser de residuo HexA. Además, el polisacárido de la presente invención puede presentar la estructura de repetición anteriormente indicada, de manera que la unidad disacárida anteriormente indicada esté presente en una parte o en la totalidad del extremo reducido. Por ejemplo, 90 % o más, 95 % o más, 97 % o más, 99 % o más o 100 % de las unidades disacáridas en el extremo reducido del polisacárido de la presente invención pueden ser de la unidad disacárida anteriormente indicada. Es decir, por ejemplo, 90 % o más, 95 % o más, 97 % o más, 99 % o más o 100 % de los residuos sacáridos en el extremo reducido del polisacárido de la presente invención pueden ser del residuo GlcN. En el caso de que la unidad disacárida anteriormente indicada se encuentre presente en el extremo terminal de la cadena sacárida, puede sustituirse apropiadamente un enlace glucósido terminal por una estructura adecuada a modo de extremo. Es decir, el enlace glucósido en la posición C-4 del residuo HexA en el extremo no reducido puede sustituirse por un grupo hidroxilo (-OH) o por un doble enlace entre C-4 y C-5. En el residuo HexA que presenta un doble enlace entre C-4 y C-5, el residuo IdoA y el residuo GlcA no se distinguen. De esta manera, al calcular cada parámetro que identifica el polisacárido, tal como el polisacárido de la presente invención, se hace referencia a dicho residuo HexA como uno correspondiente al residuo HexA pero que no corresponde ni al residuo IdoA ni al residuo GlcA, a menos que se especifique lo contrario. Además, el enlace glucósido en la posición C-1 del residuo GlcN en el extremo reducido puede sustituirse, por ejemplo, por el grupo hidroxilo (-OH).
Más específicamente, el polisacárido de la presente invención puede comprender una estructura mostrada en la fórmula general (II) siguiente. Por ejemplo, una parte o la totalidad del polisacárido de la presente invención (es decir, una parte o la totalidad de las cadenas sacáridas que constituyen el polisacárido de la presente invención) puede estar compuesto de la estructura mostrada en la fórmula (II) siguiente. Por ejemplo, 50 % o más, 70 % o más, 80 % o más, 90 % o más, 95 % o más, 97 % o más 99 % o más, o 100 % de las cadenas sacáridas del número total de cadenas sacáridas que constituyen el polisacárido de la presente invención puede estar compuesto de la estructura mostrada en la fórmula (II) siguiente. En la fórmula, R1 a R5 son tal como se ha indicado anteriormente. En la fórmula, el número “n” representa el número de repeticiones de la unidad disacárida anteriormente indicada en la fórmula. El número “n” puede configurarse de manera que el polisacárido de la presente invención puede conseguir el número de repetición de la unidad disacárida anteriormente indicada, el número medio de cadenas sacáridas enlazadas, el peso molecular medio en número (Mn), el peso molecular medio en peso (Mw) o combinaciones de los mismos, tal como se ha indicado anteriormente. El número “n” puede calcularse convirtiendo adicionalmente el peso molecular medio en peso en términos de pululano mediante la utilización del peso molecular de la enoxaparina sodio (Sanofi-Aventis, Francia), que es una formulación de heparina de bajo peso molecular. Específicamente, el valor 3.75, que se calcula dividiendo el valor 16215, que es el valor medido de la enoxaparina sodio mediante el procedimiento de CPG, por el valor 4325, que es el valor medido mediante el procedimiento CET-IR/UV según la FE, se utiliza como un factor de conversión, y el número “n” puede calcularse dividiendo el peso molecular medio en peso en términos de pululano del polisacárido de la presente invención por el factor de conversión 3.75 y el peso molecular medio del disacárido de la heparina, 665.4. En cada cadena sacárida, el número “n” puede ser, por ejemplo, de entre 3 y 200, de entre 3 y 100 o de entre 3 y 50. Además, el número “n” puede ser específicamente, por ejemplo, el número medio de repeticiones de la unidad disacárida anteriormente indicada (por ejemplo, entre 3 y 30, entre 3 y 15 o entre 6 y 9) en el polisacárido de la presente invención, como valor medio de toda la mezcla de cadenas sacáridas.
Figure imgf000007_0001
Un porcentaje del residuo IdoA en el residuo HexA (también denominado “tasa de epimerización”) puede ser de, por ejemplo, 0 % o superior, 10 % o superior, 20 % o superior, 30 % o superior, 40 % o superior, o 50 % o superior, 100 % o inferior, 90 % o inferior, 80 % o inferior, 70 % o inferior, o 60 % o inferior, o una combinación de los mismos. Específicamente, la tasa de epimerización puede ser, por ejemplo, de entre 0 % y 70 %, de entre 20 % y 70 % o de entre 30 % y 60 %. En este caso, el “residuo HexA” al calcular la tasa de epimerización se refiere al residuo IdoA y al residuo GlcA bajo la condición de que el residuo HexA que presenta un doble enlace entre C-4 y C-5 sea excluido. La tasa de epimerización puede medirse mediante, por ejemplo, análisis de disacáridos. Es decir, la tasa de epimerización puede calcularse como porcentaje (proporción molar) de la cantidad de las unidades disacáridas anteriormente indicadas en donde el residuo HexA es el residuo IdoA, respecto a la cantidad total de las unidades disacáridas anteriormente indicadas, en donde el residuo HexA es el residuo IdoA o el residuo GlcA al someter el polisacárido de la presente invención al análisis de disacáridos. El enlace entre C-4 y C-5 del residuo HexA puede ser un doble enlace. La posición del residuo HexA que presenta un doble enlace entre C-4 y C-5 no se encuentra particularmente limitada. Por ejemplo, en particular, el enlace entre C-4 y C-5 puede ser un doble enlace en el residuo HexA en el extremo no reducido. Es decir, por ejemplo, 50 % o más, 70 % o más, 80 % o más, 90 % o más, 95 % o más, 97 % o más, 99 % o más, o 100 % de los residuos HexA que presentan un doble enlace entre C-4 y C-5 puede estar presentes en el extremo no reducido. Además, por ejemplo, 50 % o más, 70 % o más, 80 % o más, 90 % o más, 95 % o más, 97 % o más, 99 % o más, o 100 % de los residuos HexA que no presentan un doble enlace entre C-4 y C-5 pueden estar presentes en posiciones diferentes del extremo no reducido. Además, por ejemplo, el enlace entre C-4 y C-5 puede ser un doble enlace en 50 % o más, 70 % o más, 80 % o más, 90 % o más, 95 % o más, 97 % o más, 99 % o más o 100 % de los residuos HexA en el extremo no reducido. Además, por ejemplo, el enlace entre C-4 y C-5 puede no ser un doble enlace en 50 % o más, 70 % o más, 80 % o más, 90 % o más, 95 % o más, 97 % o más, 99 % o más, o 100 % de los residuos HexA en posiciones diferentes del extremo no reducido.
R1 representa un hidrógeno (-H) o un grupo sulfato (-SO3H). El porcentaje de grupo sulfato en R1 puede ser idéntico o no al de residuo IdoA y residuo GlcA. El porcentaje del grupo sulfato en R1 de todos los residuos HexA (también denominado “tasa de 2-O-sulfatación de los residuos HexA”), el porcentaje de grupo sulfato en R1 en los residuos IdoA (también denominado “tasa de 2-O-sulfatación de los residuos IdoA”) y el porcentaje de grupo sulfato en R1 en los residuos GlcA (también denominado “tasa de 2-O-sulfatación de los residuos GlcA”), cada uno, puede ser, por ejemplo, de 0 % o superior, 5 % o superior, 10 % o superior, 15 % o superior, 20 % o superior, 30 % o superior, 40 % o superior, 50 % o superior, 60 % o superior, 70 % o superior, 80 % o superior, o 90 % o superior, 100 % o inferior, 95 % o inferior, 90 % o inferior, 85 % o inferior, 80 % o inferior, 70 % o inferior, 60 % o inferior, 50 % o inferior, 40 % o inferior, o 30 % o inferior, o una combinación consistente de los mismos. Específicamente, la tasa de 2-O-sulfatación de los residuos HexA puede ser, por ejemplo, de entre 0 % y 80 %, de entre 10 % y 70 % o de entre 15 % y 70 %. Específicamente, la tasa de 2-O-sulfatación de los residuos IdoA puede ser, por ejemplo, de entre 0 % y 100 %, de entre 15 % y 100 % o de entre 30 % y 100 %. Específicamente, la tasa de 2-O-sulfatación de los residuos GlcA puede ser, por ejemplo, de entre 0 % y 50 %, de entre 0 % y 40 % o de entre 0 % y 30 %. El porcentaje de grupo sulfato en R1 puede medirse mediante, por ejemplo, análisis de disacáridos. Es decir, la tasa de 2-O-sulfatación del residuo HexA puede calcularse como porcentaje (proporción molar) de la cantidad de las unidades disacáridas anteriormente indicadas en donde el residuo HexA es un residuo HexA 2-O-sulfatado, respecto a la cantidad total de las unidades disacáridas anteriormente indicadas al someter el polisacárido de la presente invención a análisis de disacáridos. Además, la tasa de 2-O-sulfatación del residuo IdoA puede calcularse como porcentaje (proporción molar) de la cantidad de las unidades disacáridas anteriormente indicadas en donde el residuo HexA es un residuo IdoA 2-O-sulfatado respecto a la cantidad total de las unidades disacáridas anteriormente indicadas en donde el residuo HexA es el residuo IdoA al someter el polisacárido de la presente invención a análisis de disacáridos. Además, la tasa de 2-O-sulfatación del residuo GlcA puede calcularse como porcentaje (proporción molar) de la cantidad de las unidades disacáridas anteriormente indicadas en donde el residuo HexA es un residuo GlcA 2-O-sulfatado, respecto a la cantidad total de las unidades disacáridas anteriormente indicadas en donde el residuo HexA es el residuo GlcA, al someter el polisacárido de la presente invención a análisis de disacáridos.
R2 representa un hidrógeno (-H) o un grupo sulfato (-SO3H). El porcentaje de grupo sulfato en R2 puede ser idéntico o no en los residuos IdoA y GlcA. El grupo sulfato de R2 no está presente en la heparina natural. De esta manera, por ejemplo, a la luz del problema de las reacciones secundarias que se producen in vivo, puede resultar potencialmente preferente que el porcentaje de grupo sulfato en R2 sea bajo. El porcentaje de grupo sulfato en R2 en todos los residuos HexA (también denominado “tasa de 3-O-sulfatación en los residuos HexA”), el porcentaje de grupo sulfato en R2 en los residuos IdoA (también denominado “tasa de 3-O-sulfatación en los residuos IdoA”) y el porcentaje de grupo sulfato en R2 en los residuos GlcA (también denominado “tasa de 3-O-sulfatación en los residuos GlcA”) pueden ser, cada uno, por ejemplo, inferiores a 15 %, inferiores a 10 %, inferiores a 5 %, inferiores a 3 %, inferiores a 1 %, inferiores a 0.5 %, inferiores a 0.1 %, o de 0 %. El porcentaje de grupo sulfato en R2 puede medirse mediante, por ejemplo, análisis de disacáridos. Es decir, la tasa de 3-O-sulfatación en los residuos HexA puede calcularse en forma de porcentaje (proporción molar) de la cantidad de unidades disacáridas anteriormente indicadas en donde el residuo HexA es un residuo HexA 3-O-sulfatado, respecto a la cantidad total de unidades disacáridas anteriormente indicadas al someter el polisacárido de la presente invención a análisis de disacáridos. Además, la tasa de 3-O-sulfatación en los residuos IdoA puede calcularse en forma de porcentaje (proporción molar) de la cantidad de unidades disacáridas anteriormente indicadas en donde el residuo HexA es un residuo IdoA 3-O-sulfatado, respecto a la cantidad total de las unidades disacáridas anteriormente indicadas en donde el residuo HexA es el residuo IdoA al someter el polisacárido de la presente invención a análisis de disacáridos. Además, la tasa de 3-O-sulfatación en residuos GlcA puede calcularse como porcentaje (proporción molar) de la cantidad de unidades disacáridas anteriormente indicadas en donde el residuo HexA es un residuo GlcA 3-O-sulfatado, respecto a la cantidad total de unidades disacáridas anteriormente indicadas en donde el residuo HexA es residuo GlcA, al someter el polisacárido de la presente invención a análisis de disacáridos.
R3 representa un hidrógeno (-H), un grupo sulfato (-SO3H) o un grupo acetilo (-COCH3). Por lo menos una parte de R3 es el grupo sulfato. Por lo menos una parte de R3 es el grupo sulfato. El porcentaje de grupo sulfato (también denominado “tasa de N-sulfatación”) en R3 puede ser de, por ejemplo, 60 % o superior, 70 % o superior, un 80 % o superior, 100 % o inferior, 95 % o inferior, o 90 % o inferior, o una combinación de los mismos. Específicamente, la tasa de N-sulfatación puede ser, por ejemplo, de entre 70 % y 100 % o de entre 80 % y 95 %. El porcentaje de grupo acetilo (también denominado “tasa de N-acetilación”) en R3 puede ser de, por ejemplo, 0 % o superior, 1 % o superior, 1.5 % o superior, 3 % o superior, 5 % o superior, 7 % o superior, 9 % o superior, u 11 % o superior, 50 % o inferior, 45 % o inferior, 40 % o inferior, 35 % o inferior, 33 % o inferior, 30 % o inferior, 25 % o inferior, 20 % o inferior, o 17 % o inferior, o una combinación de los mismos. Específicamente, la tasa de N-acetilación puede ser, por ejemplo, de entre 0 % y 33 %, de entre 1 % y 33 %, de entre 7 % y 33 %, de entre 7 % y 30 % o de entre 11 % y 17%. La tasa de N-sulfatación y la tasa de N-acetilación pueden medirse, por ejemplo, mediante análisis de disacáridos. Es decir, la tasa de N-sulfatación puede calcularse como porcentaje (proporción molar) de la cantidad de las unidades disacáridas anteriormente indicadas en donde el residuo GlcN es un residuo GlcN N-sulfatado, respecto a la cantidad total de las unidades disacáridas anteriormente indicadas al someter el polisacárido de la presente invención a análisis de disacáridos. Además, la tasa de N-acetilación puede calcularse como porcentaje (proporción molar) de la cantidad de las unidades disacáridas anteriormente indicadas en donde el residuo GlcN es un residuo GlcN N-desacetilado, respecto a la cantidad total de las unidades disacáridas anteriormente indicadas al someter el polisacárido de la presente invención a análisis de disacáridos. Una posición del residuo GlcN en donde R3 es un hidrógeno, un grupo sulfato o un grupo acetilo no se encuentra particularmente limitado. Por ejemplo, en particular, R3 puede ser un hidrógeno o un grupo acetilo en el residuo GlcN en el extremo reducido. Es decir, por ejemplo, 50 % o más, 70 % o más, 80 % o más, 90 % o más, 95 % o más, 97 % o más, 99 % o más, o 100 % de los residuos GlcN en donde R3 es un hidrógeno o un grupo acetilo, pueden estar presentes en el extremo reducido.
R4 representa un hidrógeno (-H) o un grupo sulfato (-SO3H). El porcentaje de grupo sulfato en R4 (también denominado “tasa de 3-O-sulfatación en los residuos GlcN” o simplemente “tasa de 3-O-sulfatación”) es de 13 % o superior. La tasa de 3-O-sulfatación en los residuos GlcN puede ser, por ejemplo, de 45 % o inferior, 40 % o inferior o 33 % o inferior. Específicamente, la tasa de 3-O-sulfatación en los residuos GlcN puede ser, por ejemplo, de entre 13 % y 45 %, de entre 13 % y 40 % o de entre 13 % y 33 %. La tasa de N-sulfatación de los residuos GlcN puede medirse, por ejemplo, mediante análisis de disacáridos. Es decir, la tasa de N-sulfatación de los residuos GlcN puede calcularse como porcentaje (proporción molar) de la cantidad de las unidades disacáridas anteriormente indicadas en donde el grupo GlcN es un grupo GlcN 3-O-sulfatado, respecto a la cantidad total de las unidades disacáridas anteriormente indicadas al someter el polisacárido de la presente invención a análisis de disacáridos.
R5 representa un hidrógeno (-H) o un grupo sulfato (-SO3H). Por lo menos una parte de R5 es el grupo sulfato. Un porcentaje de grupo sulfato en R5 (también denominado “tasa de 6-O-sulfatación de los grupos GlcN” o simplemente “tasa de 6-O-sulfatación”) puede ser, por ejemplo, de 50 % o superior, 60 % o superior, 70 % o superior, 80 % o superior o 90 % o superior, 100 % o inferior, o 95 % o inferior, o una combinación de los mismos. Específicamente, la tasa de 6-O-sulfatación puede ser, por ejemplo, de entre 50 % y 100 %, de entre 60 % y 100 % o de entre 70 % y 100 %. La tasa de 6-O-sulfatación puede medirse, por ejemplo, mediante análisis de disacáridos. Es decir, la tasa de 6-O-sulfatación puede calcularse como porcentaje (proporción molar) de la cantidad de las unidades disacáridas anteriormente indicadas en donde el residuo GlcN es un residuo GlcN 6-O-sulfatado respecto a la cantidad total de las unidades disacáridas anteriormente indicadas al someter el polisacárido de la presente invención a análisis de disacáridos.
Específicamente, el polisacárido de la presente invención puede comprender, por ejemplo, una o más, por ejemplo, todas las unidades disacáridas seleccionadas de entre GlcA-GlcN (NS3S6S), GlcA(2S)-GlcN(NS6S), IdoA(2S)-GlcN(NS6S), GlcA-GlcN(NS6S), IdoA(2S)-GlcN(NS), IdoA(2S)-GlcN(NS3S), IdoA-GlcN(NS6S) y GlcA-GlcN(NS). La tasa de contenido total de GlcA-GlcN(NS3S6S), GlcA(2S)-GlcN(NS6S), IdoA(2S)-GlcN(NS6S), GlcA-GlcN(NS6S), IdoA(2S)-GlcN(NS), IdoA(2S)-GlcN(NS3S), IdoA-GlcN(NS6S) y GlcA-GlcN(NS) en el polisacárido de la presente invención puede ser, por ejemplo de 50 % o superior, 60 % o superior, 70 % o superior, 80 % o superior, o 90 % o superior. La tasa de contenido total anteriormente indicada puede medirse, por ejemplo, mediante análisis de disacáridos. Es decir, la tasa de contenido total anteriormente indicada puede calcularse como porcentaje (proporción molar) de la cantidad total de GlcA-GlcN(NS3S6S), GlcA(2S)-GlcN(NS6S), IdoA(2S)-GlcN(NS6S), GlcA-GlcN(NS6S), IdoA(2S)-GlcN(NS), IdoA(2S)-GlcN(NS3S), IdoA-GlcN(NS6S) y GlcA-GlcN(NS) respecto a la cantidad total de disacáridos al someter el polisacárido de la presente invención a análisis de disacáridos. En la descripción de dicha unidad disacárida, la posición y el tipo de sustituyente se escriben entre paréntesis, y R1 a R5 no escritos en el paréntesis representan hidrógeno (-H).
El polisacárido de la presente invención presenta una actividad anticoagulante. La actividad anticoagulante se refiere específicamente a una actividad anticoagulación sanguínea. La actividad anticoagulante incluye una actividad antifactor Xa y una actividad antifactor IIa. El polisacárido de la presente invención puede presentar por lo menos la actividad antifactor Xa. La actividad antifactor Xa en el polisacárido de la presente invención puede ser, por ejemplo, de 100 UI/mg o superior, 200 UI/mg o superior, 300 UI/mg o superior o 400 UI/mg o superior. La actividad antifactor Xa en el polisacárido de la presente invención particularmente no presenta límite superior y puede ser, por ejemplo, de 5000 UI/mg o inferior, 2000 UI/mg o inferior o 1000 UI/mg o inferior. El polisacárido de la presente invención también puede presentar una elevada proporción de actividad antifactor Xa/actividad antifactor IIa. La proporción de actividad antifactor Xa/actividad antifactor IIa en el polisacárido de la presente invención puede ser, por ejemplo, de 1.5 o superior, 2 o superior, 2.5 o superior o 3 o superior. Además, la proporción de actividad antifactor Xa/actividad antifactor IIa en el polisacárido de la presente invención particularmente no presenta límite superior y puede ser, por ejemplo, de 50 o inferior, 20 o inferior o 10 o inferior. Tanto la actividad antifactor Xa como la actividad antifactor IIa pueden medirse mediante procedimientos estándar. Entre los procedimientos para medir la actividad antifactor Xa y la actividad antifactor IIa se incluyen, por ejemplo, procedimientos descritos en los Ejemplos.
El polisacárido de la presente invención puede estar en una forma libre, una forma de sal o una mezcla de las mismas. Es decir, la expresión “polisacárido de la presente invención (por ejemplo, heparán sulfato)” se refiere a una forma libre del polisacárido, o una forma de sal del mismo, o una mezcla de las mismas, a menos que se especifique lo contrario. Es decir, cualquier grupo funcional que esté presente en el polisacárido de la presente invención y pueda formar una sal puede ser una forma libre, puede formar una sal o puede ser una combinación de las mismas, a menos que se especifique lo contrario. Específicamente, por ejemplo, cualquier grupo funcional capaz de formar una sal en la fórmula general (I) y la fórmula general (II) puede ser una forma libre, puede formar una sal o puede ser una combinación de las mismas, a menos que se especifique lo contrario. El grupo funcional capaz de formar la sal en la fórmula general (I) y en la fórmula general (II) incluye un grupo amino (-NH2) del residuo GlcN y un grupo carboxilo (-COOH) del residuo HexA en el caso de que R1 a R5 sean grupos sulfato (-SO3H) y R3 sea un hidrógeno (-H). Es decir, la expresión “grupo sulfato” se refiere a una forma libre del grupo sulfato, o un grupo sulfato que forma una sal, o una combinación de las mismas. La explicación del grupo sulfato puede aplicarse a otros grupos funcionales capaces de formar una sal. Entre las sales se incluyen sales farmacológicamente aceptables. La sal farmacológicamente aceptable puede seleccionarse apropiadamente según diversas condiciones, tales como aspectos de utilización del polisacárido de la presente invención. Entre las sales farmacológicamente aceptables se incluyen las indicadas posteriormente. Entre los ejemplos de sales para un grupo ácido, tal como un grupo sulfato, se incluyen específicamente una sal amónica, una sal con un metal alcalino, tal como sodio, potasio y litio; una sal con un metal alcalinotérreo, tal como calcio y magnesio; una sal de aluminio, una sal de cinc, una sal con una amina orgánica, tal como trietilamina, etanolamina, morfolina, pirrolidina, piperidina, piperazina o diciclohexilamina, y una sal con un aminoácido básico, tal como arginina y lisina. Además, entre los ejemplos de sales para un grupo básico, tal como un grupo amino, se incluyen específicamente una sal con un ácido inorgánico, tal como ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido nítrico y ácido bromhídrico; una sal con un ácido orgánico carboxílico, tal como ácido acético, ácido cítrico, ácido benzoico, acido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido tánico, ácido butírico, ácido hibéncico, ácido pamoico, ácido enántico, ácido decanoico, ácido teicoico, ácido salicílico, ácido láctico, ácido oxálico, ácido mandélico y ácido málico, y una sal con un ácido orgánico sulfónico, tal como ácido metanosulfónico, ácido bencenosulfónico y ácido p-toluenosulfónico. La sal puede seleccionarse, por ejemplo, de entre una sal amónica, una sal sódica, una sal de litio y una sal de calcio. Como la sal, puede utilizarse una sal, o pueden utilizarse dos o más sales en combinación.
<2> Procedimientos para producir polisacárido de la presente invención.
La técnica para producir el polisacárido de la presente invención no se encuentra particularmente limitada. El polisacárido de la presente invención puede producirse mediante derivación a partir de otro polisacárido (es decir, utilizando otro polisacárido como material de partida). El otro polisacárido incluye un glucosaminoglicano (GAG). GAG incluye N-acetilheparosano (también denominado simplemente “heparosano”) y heparán sulfatos aparte del polisacárido de la presente invención. El heparosano es un polisacárido compuesto de una estructura repetitiva de un disacárido compuesto de residuo de ácido glucurónico (GlcA) y residuo de N-acetil-D-glucosamina (GlcNAc) [^4)-p-GlcA-(1^4)-a-GlcNAc-(1^-]. La producción del polisacárido de la presente invención mediante la utilización del otro polisacárido como un material de partida puede llevarse a cabo mediante, por ejemplo, una técnica física, una técnica química, una técnica enzimática o una combinación de las mismas. Específicamente, mediante la utilización de otro polisacárido como un material de partida, puede producirse el polisacárido de la presente invención mediante ajuste a un peso molecular predeterminado, la isomerización en una proporción predeterminada, la introducción o la eliminación de un grupo funcional en una proporción predeterminada, o una combinación de las mismas. El polisacárido de la presente invención puede sintetizarse completamente a partir de monosacáridos y similares a modo de materiales de partida.
Se explica a continuación un ejemplo de un procedimiento para producir el polisacárido de la presente invención a partir de heparosano.
El polisacárido de la presente invención puede producirse, por ejemplo, mediante N-desacetilación parcial de heparosano seguida del tratamiento del mismo con heparinasa III para llevar a cabo una molecularización en productos de bajo peso molecular y seguidamente la conversión de los productos de bajo peso molecular producidos en el polisacárido de la presente invención. Es decir, el procedimiento de producción del polisacárido de la presente invención incluye un procedimiento que comprende: (A) una etapa de N-desacetilación parcial de heparosano, (B) una etapa de tratamiento de un producto de la etapa (A) con heparinasa III para llevar a cabo la molecularización en productos de bajo peso molecular y (C) una etapa de producción del polisacárido de la presente invención a partir de un producto de la etapa (B). Las etapas (A), (B) y (C) también se denominan “etapa de N-desacetilación”, “etapa de molecularización en moléculas pequeñas” y “etapa de producción de heparán sulfato”, respectivamente. Según dicho procedimiento, en particular, puede producirse eficientemente el polisacárido de la presente invención con un peso molecular medio deseado.
<2-1> Producción de heparosano.
El heparosano puede producirse mediante un procedimiento de fermentación utilizando una bacteria con la capacidad de producir heparosano (también denominada “bacteria productora de heparosano”) (documento n.° WO2015/050184).
En la presente invención, la “bacteria que presenta la capacidad de producir heparosano (bacteria productora de heparosano)” se refiere a una bacteria que presenta la capacidad de producir heparosano al cultivarla en medio y de acumularlo en el medio en la medida en que puede recuperarse el heparosano. La bacteria que presenta la capacidad de producir heparosano puede ser una bacteria que pueda acumular heparosano en el medio, por ejemplo, en una cantidad de 50 mg/l o superior, 100 mg/l o superior, 200 mg/l o superior o 300 mg/l o superior.
El tipo de bacteria no se encuentra particularmente limitado. La bacteria incluye bacterias pertenecientes al género Escherichia. Las bacterias pertenecientes al género Escherichia no están particularmente limitadas, y entre ellas se incluyen bacterias clasificadas en el género Escherichia mediante una clasificación conocida por los expertos en microbiología. Entre las bacterias pertenecientes al género Escherichia se incluyen, por ejemplo, las indicadas en la literatura por Neidhardt et al. (Backmann, B.J. 1996. Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, páginas 2460 a 2488, Tabla 1, en: F.D. Neidhartd (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/segunda edición, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.). Entre los ejemplos de bacterias pertenecientes al género Escherichia se incluyen Escherichia coli. Entre los ejemplos de Escherichia coli se incluyen cepas de Escherichia coli K-12, tales como la cepa W3110 (ATCC n.° 27325) y la cepa MG1655 (ATCC n.° 47076); Escherichia coli cepa K5 (ATCC n.° 23506); Escherichia coli cepa B, tal como la cepa BL21 (DE3) y cepas derivadas de las mismas.
Estas cepas bacterianas pueden obtenerse de la American Type Culture Collection (dirección: 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, v A 20108, Estados Unidos). Es decir, se ha asignado un número de acceso a cada cepa bacteriana y las cepas bacterianas pueden adquirirse mediante la utilización de estos números de acceso (véase http://www.atcc.org/). El número de acceso correspondiente a cada cepa bacteriana está listado en un catálogo de la American Type Culture Collection. La cepa BL21 (DE3) se encuentra disponible en, por ejemplo, Life Technologies (número de producto C6000-03).
La bacteria que presenta la capacidad de producir heparosano puede ser una que presente inherentemente la capacidad de producir heparosano o una modificada para que presente la capacidad de producir heparosano. Entre las bacterias que presentan inherentemente la capacidad de producir heparosano se incluyen Escherichia coli cepa K5 (ATCC n.° 23506). La capacidad de producir heparosano de la bacteria puede adquirirse proporcionando la capacidad de producir heparosano a la bacteria de la manear indicada anteriormente. La bacteria que presenta inherentemente la capacidad de producir heparosano puede modificarse para incrementar esta capacidad de producir heparosano, y utilizarse.
La capacidad de producir heparosano puede proporcionarse mediante la introducción de un gen codificante de una proteína que participa en la producción de heparosano. La proteína que participa en la producción de heparosano incluye glucosiltransferasa y una proteína portadora de flujo de salida de heparosano. En la presente invención, puede introducirse un gen, o pueden introducirse dos o más genes. La introducción del gen puede llevarse a cabo al igual que la técnica de incremento del número de copia de un gen que se describe posteriormente.
El término “glucosiltransferasa” que se utiliza en la presente memoria se refiere a una proteína que presenta una actividad de catálisis de una reacción en la que se añade N-acetil-D-glucosamina (GlcNAc) y/o ácido glucurónico (GlcA) a un extremo no reducido de una cadena sacárida para extender una cadena de heparosano. Esta actividad también se denomina “actividad de glucosiltransferasa”. Un gen codificante de glucosiltransferasa incluye un gen kfiA, un gen kfiC y un gen pmHSI.
El gen kfiA y el gen kfiC incluyen el gen kfiA y el gen kfiC en Escherichia coli cepa K5. La proteína KfiA codificada por el gen kfiA en Escherichia coli cepa K5 añade GlcNAc al extremo no reducido de la cadena sacárida mediante la utilización de UDP-GlcNAc como sustrato. La proteína KfiC codificada por el gen kfiC en Escherichia coli cepa k5 añade GlcA al extremo no reducido de la cadena sacárida mediante la utilización de UDP-GlcA como sustrato. El gen kfiA y el gen kfiC en Escherichia coli cepa K5, junto con los genes kfiB y kfiD, constituyen el operón KfiABCD (también denominado “Región 2”). La secuencia de nucleótidos de una región que incluye el operón KfiABCD en Escherichia coli cepa K5 se muestra en SEC ID n.° 1. En la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID n.° 1, los genes kfiA, kfiB, kfiC y kfiD corresponden a una secuencia en las posiciones 445 a 1164, una secuencia en las posiciones 1593 a 3284, una secuencia en las posiciones 4576 a 6138 y una secuencia en las posiciones 6180 a 7358, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de las proteínas KfiA, KfiB, KfiC y KfiD se muestran en las secuencias SEC ID n.° 2 a n.° 5.
El gen pmHSI incluye el gen pmHSI en la cepa Pasteurella multocida tipo D. La proteína PmHS1 codificada por el gen pmHS1 en la cepa Pasteurella multocida tipo D añade alternativamente GlcNAc y GlcA al extremo no reducido de la cadena sacárida mediante la utilización de UDP-GlcNAc y UDP-GlcA como sustratos.
La “proteína portadora de flujo de salida de heparosano” a la que se hace referencia en la presente memoria se refiere a una proteína que presenta una actividad transportadora de la cadena de heparosano hacia el exterior de la célula a través de la membrana celular. Esta actividad también se denomina “actividad de flujo de salida de heparosano”. Entre los genes codificantes de la proteína portadora de flujo de salida de heparosano se incluyen los genes kpsC, kpsD, kpsE, kpsM, kpsS y kpsT. Entre los genes kpsS, kpsD, kpsE, kpsM, kpsS y kpsTse incluyen los genes kpsC, kpsD, kpsE, kpsM, kpsS y kpsT en Escherichia coli cepa K5 y Escherichia coli cepa B. Los genes kpsC, kpsD, kpsE y kpsS en dichas cepas, junto con los genes kpsF y kpsU, constituyen el operón kpsFEDUCS (también denominado “Región 1”). Además, los genes kpsM y kpsT constituyen el operón kpsMT (también denominado “Región 3”).
Un gen para la introducción puede seleccionarse apropiadamente según el tipo de bacteria que deba utilizarse. Es decir, puede conferirse a una bacteria la capacidad de producir heparosano mediante la modificación de la bacteria para que presente tanto el gen codificante de glucosiltransferasa como el gen codificante de la proteína portadora de flujo de salida de heparosano. Por ejemplo, Escherichia coli cepa B presenta el gen codificante de la proteína portadora de flujo de salida de heparosano pero no presenta el gen codificante de glucosiltransferasa. De esta manera, la capacidad de producir heparosano puede proporcionarse a Escherichia coli cepa B mediante la introducción del gen codificante de glucosiltransferasa. Además, por ejemplo, Escherichia coli cepa K-12 no presenta ni el gen codificante de glucosiltransferasa ni el gen codificante de la proteína portadora de flujo de salida de heparosano. De esta manera, puede proporcionarse la capacidad de producir heparosano a Escherichia coli cepa K-12 mediante la introducción tanto del gen codificante de glucosiltransferasa como del gen codificante de la proteína portadora de flujo de salida de heparosano.
Es decir, entre los ejemplos de bacterias del género Escherichia que presentan la capacidad de producir heparosano se incluyen Escherichia coli cepa K5; cepas obtenidas mediante la introducción de los genes kfiA y kfiC derivados de Escherichia coli cepa K5 en Escherichia coli cepa B, tal como BL21 (DE3); cepas obtenidas mediante la introducción de los genes kfiA y kfiC derivados de Escherichia coli cepa K5 y los genes kpsC, kpsD, kpsE, kpsM, kpsS y kpsT derivados de Escherichia coli cepa K5 o Escherichia coli cepa B en Escherichia coli cepa K-12, tal como las cepas W3110 y MG1655, y cepas derivadas de las mismas. Entre los ejemplos de cepas obtenidas mediante la introducción de los genes kfiA y kfiC derivados de Escherichia coli cepa K5 en Escherichia coli cepa B se incluyen específicamente Escherichia coli BL21 (DE3)/pVK9-kfiABCD (documento n.° WO2015/050184).
Además, la bacteria que presenta la capacidad de producir heparosano puede modificarse de manera que se potencie la expresión del gen que posee originalmente la bacteria entre los genes codificantes de las proteínas que participan en la producción del heparosano. Es decir, por ejemplo puede modificarse Escherichia coli cepa K5 para que se potencie la expresión de uno o más genes codificantes de las proteínas que participan en la producción de heparosano. Además, por ejemplo, puede modificarse Escherichia coli cepa B para que se potencie la expresión de uno o más genes codificantes de la proteína portadora de flujo de salida de heparosano.
Además, bajo la condición de que no se deteriore la capacidad de producir heparosano, pueden realizarse otras modificaciones en la bacteria que presenta la capacidad de producir heparosano. Por ejemplo, la bacteria que presenta la capacidad de producir heparosano puede modificarse de manera que se potencie la expresión de uno o más genes seleccionados de entre los genes kfiB, kifD, kpsF y kpsU. Es decir, por ejemplo, en el caso de que se introduzca el gen codificante de glucosiltransferasa, puede introducirse colectivamente la región 2, y en el caso de que se introduzcan el gen codificante de glucosiltransferasa y el gen codificante de la proteína portadora de flujo de salida de heparosano, pueden introducirse colectivamente las regiones 1 a 3. El gen kfiB y el gen kfiD incluyen el gen kfiB y el gen kfiD en Escherichia coli cepa K5. Entre los genes kpsF y kpsU se incluyen los genes kpsF y kpsU en Escherichia coli cepa K5 y en Escherichia coli cepa B.
La bacteria que presenta la capacidad de producir heparosano puede modificarse de manera que se potencie la expresión de uno o más genes seleccionados de entre rbsR, rbsK, rbsB, hsrA, glgB, lgX, micF, rcsD, rcsB, ybiX, ybil, ybiJ, ybiC, ybiB, rfaH, nusG, pcoR, pcoS, pcoE, yhcN, yhcO, aaeB, aaeA, aaeX, g1455, alpA, g1453, yrbA, mlaB, mlaC, mlaD, mlaE, mlaF, yrbG, norW, ybjI, ybjJ, ybjK, rybB, yjjY, yjtD, thrL, thrA, thrB, fruA, psuK, ytfT, yjfF, fbp, yagU, paoA, paoB, gsiC, gsiD, yliE, irp2, irp1, bhsA, yscfS, lepB, rnc, era, dapA, gcvR, bcp, hyfA, rpoE, nadB, yfiC, srmB, g1414, g1413, nuoE, nuoF, nuoG, glmZ, hemY, hemX, hemD, rlmL, artQ, artM, artJ, rlmC, ybjO, yejO, yejM, yejL, rpoS, ygbN, ygbM, ygbL, g3798, g3797, g3796, g3795, g3794, g3793, g3792, ryjA, soxR, soxS, yjcC, yjcB, efeU, efeO, slyA, hns, pgm, galF, ugd, glmU, glmS, glmM y rcsA (documento n.° WO2015/050184, Journal of Technical Disclosure n.° 2015-501775). Entre estos genes se incluyen genes en Escherichia coli, tales como las cepas K-12 MG1655, BL21 (DE3) y K5 de Escherichia coli, y genes en otras diversas bacterias.
“Se potencia la expresión de un gen” comprende no solo incrementar el nivel de expresión de un gen diana en una cepa bacteriana que expresa originalmente el gen diana, sino además expresar el gen diana en una cepa bacteriana que no expresa originalmente el gen diana. Es decir, “se potencia la expresión de un gen” comprende, por ejemplo, introducir un gen diana en una cepa bacteriana que no expresa originalmente el gen diana y expresar el gen diana. La expresión del gen puede potenciarse mediante, por ejemplo, el incremento del número de copia del gen y el incremento de la transcripción y traducción del gen. El número de copia del gen puede incrementarse mediante la introducción de un vector en el que se ha montado el gen en un huésped, o mediante la introducción del gen en un cromosoma del huésped. El gen que debe introducirse puede obtenerse mediante clonación de un organismo que presenta el gen o mediante síntesis química. El gen obtenido puede utilizarse en su estado original o con modificaciones adecuadas. La transcripción y traducción del gen puede incrementarse mediante modificación de una secuencia reguladora de la expresión del gen, tal como promotores y secuencias SD.
Las secuencias de nucleótidos de los genes utilizados para la modificación de bacterias, tal como proporcionar la capacidad de producir heparosano, y las secuencias de aminoácidos de proteínas codificadas por dichos genes, pueden obtenerse de bases de datos públicas, tales como NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) y de referencias tales como el documento n.° WO2015/050184 y Journal of Technical Disclosure n.° 2015-501775.
Los genes utilizados para la modificación de bacterias, tal como proporcionar la capacidad de producir heparosano, no están limitados a los genes ejemplificados anteriormente y a los genes que presentan una secuencia de nucleótidos conocida, y pueden ser variantes de los mismos, con la condición de que el gen codifique una proteína que mantenga una función original. La variante incluye homólogos y genes modificados artificialmente de los genes conocidos. La expresión “que mantiene la función original” se refiere a una variante de una proteína que presenta una actividad de glucosiltransferasa en el caso de la función de glucosiltransferasa, y una variante de una proteína que presenta una actividad de transporte de flujo de salida de heparosano en el caso de la función de la proteína portadora de flujo de salida de heparosano. Por ejemplo, los genes utilizados para la modificación de bacterias, tal como proporcionar la capacidad de producir heparosano, pueden ser genes codificantes de proteínas que presentan una secuencia de aminoácidos con una o varias (por ejemplo, 1 a 50, 1 a 40, 1 a 30, preferentemente 1 a 20, más preferentemente 1 a 10, todavía más preferentemente 1 a 5, particularmente preferentemente 1 a 3) sustituciones, deleciones, inserciones o adiciones de aminoácidos en una o varias posiciones en una secuencia de aminoácidos de una proteína conocida. Por ejemplo, los genes utilizados para la modificación de bacterias, tal como proporcionar la capacidad de producir heparosano, pueden ser genes codificantes de proteínas que presentan, por ejemplo, 50 % o más, 65 % o más, 80 % o más, preferentemente 90 % o más, más preferentemente 95 % o más, todavía más preferentemente 97 % o más, y particularmente preferentemente 99 % o más, identidad respecto a la secuencia de aminoácidos de la proteína conocida. La descripción de tales variantes puede aplicarse a otras proteínas, tales como heparinasa III, y a genes codificantes de las mismas.
El heparosano se acumula en el medio mediante el cultivo de una bacteria productora de heparosano. Las condiciones de cultivo para la bacteria productora de heparosano no están particularmente limitadas, con la condición de que se obtenga la cantidad deseada de heparosano. Las condiciones de cultivo de la bacteria productora de heparosano pueden configurarse apropiadamente según diversas condiciones, tales como la configuración del sistema de expresión y el tipo de huésped para el gen involucrado en la producción de heparosano. El cultivo puede llevarse a cabo aeróbicamente, por ejemplo, mediante la utilización de un medio líquido que contenga diversos ingredientes orgánicos e ingredientes inorgánicos tales como una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno y nutrición de oligoelementos, a una temperatura de entre 30 °C y 37 °C durante 16 a 72 horas (documento n.° WO2015/050184).
El heparosano puede someterse a una etapa de N-desacetilación mientras está incluido en una solución de cultivo, o puede recuperarse a partir de la solución de cultivo y seguidamente someterse a la etapa de N-desacetilación. El procedimiento para recuperar heparosano a partir de la solución de cultivo no se encuentra particularmente limitado. El procedimiento para recuperar heparosano incluye técnicas conocidas utilizadas para la separación y la purificación de un compuesto, tales como un procedimiento de tratamiento con membrana y un procedimiento de precipitación. Por ejemplo, el heparosano en el sobrenadante de cultivo puede precipitarse y recuperarse mediante la separación del sobrenadante respecto de la solución de cultivo y añadir a continuación un solvente orgánico miscible en agua, tal como etanol o metanol (documento n.° WO2015/050184). La cantidad del solvente orgánico que debe añadirse puede ser de 2,5 a 3,5 veces la cantidad del sobrenadante. El heparosano puede someterse apropiadamente a un tratamiento, tal como la purificación, la dilución, la concentración, el secado y la disolución, y a continuación someterse a la etapa de N-desacetilación. La purificación puede llevarse a cabo en una medida deseada. Estos tratamientos pueden llevarse a cabo solos o en combinación, según resulte apropiado.
<2-2> Etapa de N-desacetilación.
La etapa de N-desacetilación es una etapa en la que se N-desacetila parcialmente el heparosano. El heparosano parcialmente N-desacetilado se produce mediante la etapa de N-desacetilación. El producto de la etapa de N-desacetilación (heparosano parcialmente N-desacetilado) también se denomina “heparosano N-desacetilado”. El “heparosano se N-desacetila parcialmente” se refiere a N-desacetilar el heparosano de manera que quede una parte de grupos N-acetilo en el heparosano. Al dejar que quede una parte de los grupos N-acetilo en el heparosano, resulta posible escindir preferentemente en una etapa de molecularización en moléculas pequeñas un sitio de un residuo glucosamina con el grupo N-acetilo, de manera que puede producirse eficientemente el polisacárido de la presente invención con un peso molecular medio deseado. El grado de la N-desacetilación no está particularmente limitado con la condición de que pueda producirse el polisacárido de la presente invención. La etapa de N-desacetilación puede llevarse a cabo de manera que la tasa residual de grupo N-acetilo se convierta en el valor siguiente. Es decir, la tasa residual del grupo N-acetilo puede ser, por ejemplo, de 1 % o superior, 1,5 % o superior, 3 % o superior, 5 % o superior, 7 % o superior, 9 % o superior, o de 11 % o superior, 50 % o inferior, 45 % o inferior, 40 % o inferior, 35 % o inferior, 33 % o inferior, 30 % o inferior, 25 % o inferior, 20 % o inferior, o 17 % o inferior, o una combinación de las mismas. Específicamente, la tasa residual de grupo N-acetilo puede ser, por ejemplo, de entre 1 % y 33 %, entre 7 % y 33 %, entre 7 % y 30 %, o entre 11 % y 17 %. Por ejemplo, una tasa residual de grupo N-acetilo de entre 7 % y 30 % corresponde aproximadamente a un estado en el que los grupos N-acetilo están presentes en una proporción de un grupo N-acetilo por cada 6 a 28 residuos de azúcar (uno por cada 3 a 14 unidades en forma de unidad disacárida). Además, por ejemplo, una tasa residual de grupo N-acetilo de entre 11 % y 17% corresponde aproximadamente a un estado en el que los grupos N-acetilo están presentes en una proporción de un grupo N-acetilo por cada 12 a 18 residuos de azúcar (uno por cada 6 a 9 unidades en forma de unidad disacárida). El grado de N-desacetilación (es decir, la tasa residual de grupos N-acetilo) puede confirmarse mediante, por ejemplo, análisis de disacáridos. La tasa residual de grupos N-acetilo puede medirse como la tasa de N-acetilación anteriormente mencionada.
Los grupos N-acetilo residuales pueden eliminarse apropiadamente después de la etapa de molecularización en moléculas pequeñas. Por ejemplo, puede llevarse a cabo una N-desacetilación adicional, o pueden llevarse a cabo N-desacetilación y N-sulfatación adicionales en cualquier momento después de la etapa de molecularización en moléculas pequeñas.
El procedimiento para llevar a cabo la etapa de N-desacetilación no está particularmente limitado con la condición de que se obtenga el grado deseado de N-desacetilación. La etapa de N-desacetilación puede llevarse a cabo químicamente mediante la utilización de un agente de desacetilación. El agente de desacetilación incluye hidróxido sódico o hidrazina.
Como condiciones para la N-desacetilación utilizando hidróxido sódico, por ejemplo, puede hacerse referencia a condiciones anteriormente publicadas (Kuberan B. et al. (2003) “Chemoenzymatic Synthesis of Classical and Nonclassical Anticoagulant Heparan Sulfate Polysaccharides”, J. Biol. Chem., 278 (52): 52613-52621, y el documento n.° US2011281820A1). Es decir, la N-desacetilación puede llevarse a cabo mediante la disolución del heparosano en una solución acuosa de hidróxido sódico con calentamiento. Pueden configurarse apropiadamente una concentración, una temperatura de reacción y un periodo de tiempo de reacción de cada componente en el sistema de reacción para que se obtenga el grado deseado de N-desacetilación. La concentración de heparosano puede ser, por ejemplo, de entre 0.05 % (p/v) y 50 % (p/v). La concentración de hidróxido sódico puede ser, por ejemplo, de entre 1 y 5 M. La temperatura de reacción puede ser, por ejemplo, de entre 40 °C y 80 °C. El periodo de tiempo de reacción puede ser, por ejemplo, de entre 5 minutos y 30 horas.
Como condiciones para la N-desacetilación utilizando hidrazina, por ejemplo, puede hacerse referencia a las condiciones anteriormente publicadas ([1] Glycobiology, 10 (2000) 159-l7 l; [2] Carbohydrate Research, 290 (1996) 87-96; [3] Biochem. J. 217 (1984) 187-197). Además, entre las condiciones para la N-desacetilación utilizando hidrazina se incluyen específicamente, por ejemplo, las condiciones indicadas en los Ejemplos. Es decir, la N-desacetilación puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante disolución del heparosano en una solución acuosa de hidrazina que contiene ácido sulfúrico o sulfato de hidrazina, sustituyendo la fase gaseosa por un gas inerte, tal como nitrógeno, y sometiendo a calentamiento. La hidrazina incluye anhidrato de hidrazina y monohidrato de hidrazina. Por ejemplo, el monohidrato de hidrazina puede utilizarse directamente o mediante dilución apropiada en forma de una solución acuosa de hidrazina. Después del calentamiento, la reacción puede detenerse mediante enfriamiento en hielo. A continuación, el extremo de la cadena sacárida puede reducirse con yodo. Pueden configurarse apropiadamente una concentración, una temperatura de reacción y un periodo de tiempo de reacción de cada componente en el sistema de reacción, de manera que se obtenga el grado deseado de N-desacetilación. La concentración del heparosano puede ser, por ejemplo, de entre 0.05 % (p/v) y 50 % (p/v). La concentración de hidrazina puede ser, por ejemplo, de entre 10 % (p/v) y 70 % (p/v). La concentración de ácido sulfúrico o sulfato de hidrazina puede ser, por ejemplo, de entre 0.01 M y 0.1 M. La temperatura de reacción puede ser, por ejemplo, de entre 60 °C y 118 °C. El periodo de tiempo de reacción puede ser, por ejemplo, de entre 5 minutos y 20 horas. Específicamente, por ejemplo, en el caso de que la N-desacetilación se lleve a cabo bajo las condiciones indicadas en los Ejemplos, el periodo de tiempo de reacción puede ser, por ejemplo, de entre 4 y 5 horas.
El heparosano N-desacetilación se produce realizando la N-desacetilación de esta manera. El heparosano N-desacetilado puede someterse a la etapa de molecularización en moléculas pequeñas mientras está contenido en la solución de reacción en la etapa de N-desacetilación, o puede recuperarse a partir de la solución de reacción, seguido de la etapa de molecularización en moléculas pequeñas. El procedimiento para recuperar el heparosano N-desacetilación a partir de la solución de reacción no está particularmente limitado. El procedimiento para recuperar heparosano N-desacetilado incluye técnicas conocidas que se utilizan para la separación y purificación de compuestos, tales como el procedimiento de tratamiento mediante membrana y el procedimiento de precipitación. El heparosano N-desacetilado puede someterse apropiadamente a tratamientos tales como la purificación, la neutralización, la desalación, la dilución, la concentración, el secado y la disolución, seguido de la etapa de molecularización en moléculas pequeñas. La purificación puede llevarse a cabo en el grado deseado. Estos tratamientos pueden llevarse a cabo solos o en combinación, según resulte apropiado.
<2-3> Etapa de molecularización en moléculas pequeñas.
La etapa de molecularización en moléculas pequeñas es una etapa en la que el heparosano N-desacetilado se corta con heparinasa III para producir moléculas pequeñas. El heparosano N-desacetilado molecularizado en moléculas pequeñas se produce mediante la etapa de molécularización en moléculas pequeñas. El producto de la etapa de molecularización en moléculas pequeñas (heparosano N-desacetilado molecularizado en moléculas pequeñas) también se denomina “heparosano N-desacetilado de bajo peso molecular”. El grado de molecularización en moléculas de bajo peso molecular no está particularmente limitado con la condición de que pueda producirse el polisacárido de la presente invención. La etapa de molecularización en moléculas pequeñas puede llevarse a cabo, por ejemplo, de manera que el peso molecular medio del heparosano N-desacetilado de bajo peso molecular se convierta en peso molecular medio del polisacárido de la presente invención, tal como se indica posteriormente (por ejemplo, un peso molecular medio en número (Mn) de entre 1000 y 150000, preferentemente de entre 8000 y 60000, y un peso molecular medio en peso (Mw) de entre 2000 y 300000, preferentemente de entre 10000 y 100000, como valor medido mediante CPG mediante la utilización de pululano como patrón).
El grado de molecularización en moléculas pequeñas puede confirmarse, por ejemplo, mediante la medición de su peso molecular. La medición del peso molecular puede llevarse a cabo mediante un procedimiento estándar. Entre los procedimientos para medir el peso molecular se incluyen la cromatografía de permeación en gel (CPG) y la cromatografía de exclusión por tamaño (CET) acuosa mediante la utilización de un detector de absorbancia de luz ultravioleta (UV) y visible y un detector de índice de refracción (IR) (procedimiento de CET-IR/UV, según la Farmacopea europea (FE)). Específicamente, entre las condiciones para medir el peso molecular mediante CPG se incluyen, por ejemplo, las condiciones indicadas en los Ejemplos. El peso molecular medio en número (Mn) del heparosano N-desacetilado molecularizado en moléculas pequeñas puede ser, por ejemplo, de entre 1000 y 150000, entre 3000 y 36000, o de entre 4000 y 26000, o de entre 5000 y 36000, o de entre 12000 y 26000, como valor medido mediante CPG mediante la utilización de pululano como patrón. El peso molecular medio en peso (Mw) del heparosano N-desacetilado molecularizado en moléculas pequeñas puede ser, por ejemplo, de entre 2000 y 300000, entre 5000 y 60000, entre 6000 y 70000, o de entre 9000 y 35000, o puede ser de entre 7000 y 60000, o entre 17000 y 35000, como valor medido mediante CPG mediante la utilización de pululano como patrón. Puede medirse el peso molecular para confirmar el grado de molecularización en moléculas pequeñas después de realizar una parte o la totalidad de las etapas de producción de heparán sulfato, tal como la etapa de sulfatación descrita posteriormente. En el caso de que se mida el peso molecular después de realizar una parte o la totalidad de las etapas de producción de heparán sulfato, puede considerarse la variación del peso molecular dependiendo de la etapa realizada. En el caso de que se mida el peso molecular de un producto después de realizar una parte o la totalidad de las etapas de producción de heparán sulfato, el peso molecular medio en número (Mn) del producto puede ser de entre 1000 y 150000, entre 2000 y 100000, entre 4000 y 80000, entre 7000 y 42000, o entre 15000 y 30000, y el peso molecular medio en peso (Mw) del producto puede ser de entre 2000 y 300000, entre 5000 y 150000, entre 5000 y 100000, entre 8000 y 70000, entre 8000 y 41000, o de entre 21000 y 41000, como valores medidos mediante CPG mediante la utilización de pululano como patrón.
La expresión “heparinasa III” se refiere a un enzima (habitualmente EC 4.2.2.8) que corta un sitio de residuo glucosamina N-sulfatado o N-desacetilado del glucosaminoglicano, tal como el heparosano. La heparinasa III que se utiliza en la presente invención no está particularmente limitada con la condición de que pueda cortar preferentemente en un sitio de un residuo de glucosamina que presenta un grupo N-acetilo en el heparosano N-desacetilado. La expresión “que corta preferentemente en el sitio del residuo de glucosamina que presenta el grupo N-acetilo” se refiere a que corta en el sitio del residuo de glucosamina que presenta el grupo N-acetilo más preferentemente que en el sitio del residuo de glucosamina que no presenta grupo N-acetilo. La expresión “que corta preferentemente en el sitio del residuo de glucosamina que presenta el grupo N-acetilo” se refiere a que corta en el sitio del residuo de glucosamina que presenta grupo N-acetilo pero que no corta sustancialmente en el sitio del residuo de glucosamina que no presenta grupo N-acetilo. La expresión “que corta en el sitio de residuo glucosamina” se refiere a que corta el enlace a-1,4-glucósido entre el residuo de glucosamina y un residuo de ácido glucurónico (GlcA) cadena abajo del primero (en el lado del extremo reducido).
El origen de la heparinasa III no está particularmente limitado y la heparinasa puede derivarse de cualquier microorganismo, animal o planta. Como heparinasa III pueden utilizarse variantes, tales como homólogos y enzimas modificados artificialmente, de la heparinasa III conocida. Específicamente, la heparinasa III incluye la heparinasa bacteriana III derivada de Flavobacterium heparinum, Bacteroides thetaiotaomicron, Bacteroides eggerthii y similares. Se muestra una secuencia de nucleótidos del gen hepC codificante de heparinasa III en Flavobacterium heparinum ATCC 13125 y una secuencia de aminoácidos de la heparinasa III (HepC), en las SEC ID n.° 16 y n.° 17, respectivamente.
Puede producirse la heparinasa III dejando que un huésped que presenta un gen codificante de heparinasa III (gen de heparinasa III) exprese el gen. También se hace referencia al huésped que presenta el gen de heparinasa III como huésped con heparinasa III. El huésped con gen de heparinasa III puede ser uno que presente inherentemente el gen de heparinasa III o uno modificado para presentar el gen de heparinasa III. El huésped que presenta inherentemente el gen de heparinasa III incluye las bacterias anteriormente indicadas a partir de las que se deriva la heparinasa III. El huésped modificado para que posea el gen de heparinasa III incluye un huésped en el que se ha introducido el gen de heparinasa III. El huésped en el que se ha introducido el gen de heparinasa III no está particularmente limitado con la condición de que pueda expresar heparinasa III funcional. El huésped incluye bacterias, actinomicetos, levaduras, hongos, células vegetales, células de insecto y células animales. Entre las bacterias se incluyen las bacterias Enterobacteriaceae y el grupo de bacterias corineformes. Entre las bacterias Enterobacteriaceae se incluyen las bacterias de género Escherichia, tales como Escherichia coli. El grupo de bacterias corineformes incluye el género de bacterias Corynebacterium, tal como Corynebacterium glutamicum. El huésped que presenta inherentemente el gen de heparinasa III puede modificarse para potenciar la expresión del gen de la heparinasa III, y utilizarse. El gen de heparinasa III puede expresarse y obtenerse un cultivo que contenga heparinasa III mediante el cultivo del huésped que posee el gen de heparinasa III. Las condiciones de cultivo del huésped pueden configurarse apropiadamente según diversas condiciones, tales como la constitución de un sistema de expresión del gen de heparinasa III y el tipo de huésped.
También puede producirse heparinasa III mediante la expresión del gen de heparinasa III en un sistema de síntesis de proteínas libre de células.
Además, puede utilizarse un producto disponible comercialmente como heparinasa III.
La heparinasa III contenida en la solución de cultivo y similar puede utilizarse directamente o puede utilizarse heparinasa III después de recuperarla a partir de la solución de cultivo y similar. Es decir, puede utilizarse heparinasa III purificada (enzima purificado) o puede utilizarse cualquier fracción que contenga heparinasa III, a modo de heparinasa III. La recuperación de heparinasa III puede llevarse a cabo mediante una técnica conocida de separación y purificación de proteínas. La heparinasa III puede purificarse en la medida deseada. Puede utilizarse heparinasa III en un estado libre o en un estado en el que el enzima está inmovilizado en una fase sólida, tal como una resina. La fracción que contiene heparinasa II no está particularmente limitada con la condición de que la heparinasa III esté contenida para poder actuar sobre el heparosano N-desacetilado. La fracción que contiene heparinasa III incluye un cultivo de un huésped que posee el gen de heparinasa III, una célula microbiana recogida a partir del cultivo (célula microbiana cultivada), un producto alterado de la célula microbiana, un producto lisado de la célula microbiana, un producto extraído de la célula microbiana (solución de extracto libre de células), una célula microbiana tratada, tal como una célula microbiana inmovilizada que se ha obtenido mediante inmovilización de la célula microbiana en un portador, tal como acrilamida o carragenano, un sobrenadante de cultivo recogido del cultivo y un producto parcialmente purificado del mismo (producto purificado en bruto). Cada una de estas fracciones puede utilizarse sola o en combinación con heparinasa III purificada.
La etapa de molecularización en moléculas pequeñas puede llevarse a cabo dejando que la heparinasa III actúe sobre el heparosano N-desacetilado. Específicamente, dejar que la heparinasa III actúe sobre el heparosano N-desacetilado puede llevarse a cabo dejando que la heparinasa III y el heparosano N-desacetilado coexistan en una solución de reacción. Es decir, la etapa de molecularización en moléculas pequeñas puede llevarse a cabo en una solución de reacción apropiada. La etapa de molecularización en moléculas pequeñas puede llevarse a cabo mediante un sistema de lotes o en un sistema de columnas. En el sistema de lotes, por ejemplo, la etapa de molecularización en moléculas pequeñas puede llevarse a cabo mediante la mezcla de heparinasa III y heparosano N-desacetilado en la solución de reacción en un reactor. La etapa de molecularización en moléculas pequeñas puede llevarse a cabo dejando en reposo o realizarla con mezclado o agitación. En el sistema de columnas, por ejemplo, la etapa de molecularización en moléculas pequeñas puede llevarse a cabo pasando una solución de reacción que contiene heparosano N-desacetilado por una columna empaquetada con células microbianas inmovilizadas o un enzima inmovilizado. La solución de reacción incluye medio acuoso (solvente acuoso), tal como agua y tampones acuosos.
La solución de reacción puede contener en caso necesario un componente diferente del heparosano N-desacetilado además de heparosano N-desacetilado. El otro componente aparte de heparosano N-desacetilado incluye iones metálicos y agentes tamponadores del pH. Puede configurarse apropiadamente el tipo y concentración del componente contenido en la solución de reacción según diversas condiciones, tales como la naturaleza de la heparinasa III que debe utilizarse.
Las condiciones (pH de la solución de reacción, temperatura de reacción, periodo de tiempo de reacción, concentración de cada componente y similares) no están particularmente limitadas con la condición de que se obtenga el grado deseado de molecularización en moléculas pequeñas. Es decir, pueden configurarse apropiadamente las condiciones de reacción de manera que se obtenga el grado deseado de molecularización en moléculas de bajo peso molecular. Específicamente, entre las condiciones de reacción se incluyen, por ejemplo, las condiciones indicadas en los Ejemplos. La concentración de heparosano N-desacetilado en la solución de reacción puede ser, por ejemplo, de entre 0.05 % (p/v) y 50 % (p/v). La concentración de heparinasa III en la solución de reacción puede ser, por ejemplo, de entre 6.3 UI/l y 6.3x104 UI/l o de entre 6.3x101 Ui/I y 6.3x103 UI/l. Un valor de pH en la solución de reacción habitualmente puede ser, por ejemplo, de entre 6.0 y 10.0, preferentemente de entre 6.5 y 9.0. La temperatura de reacción habitualmente puede ser, por ejemplo, de entre 15 °C y 50 °C, preferentemente de entre 15 °C y 45 °C, más preferentemente de entre 20 °C y 40 °C. El periodo de tiempo de reacción habitualmente puede ser, por ejemplo, de entre 5 minutos y 20 horas, preferentemente de entre l0 minutos y 10 horas. Específicamente, por ejemplo, en el caso de que la molecularización en moléculas pequeñas se lleve a cabo bajo las condiciones indicadas en los Ejemplos, el periodo de tiempo de reacción puede ser de entre 5 y 10 horas. En el caso del sistema de columnas, una velocidad de paso de líquido de la solución de reacción puede ser, por ejemplo, una velocidad para que el periodo de tiempo de reacción se encuentre comprendido en uno de los periodos de tiempo de reacción ejemplificados anteriormente.
Puede medirse la actividad de heparinasa III basándose, por ejemplo, en la producción de un ácido hexurónico insaturado de una manera dependiente del enzima y un sustrato, en una reacción enzimática realizada a pH 7.0 y a 37 °C mediante la utilización de heparosano como sustrato. La producción del ácido hexurónico insaturado puede medirse como un incremento de la A232 nm. La cantidad del enzima que produce el ácido hexurónico insaturado de 1 |jmol por minuto se define como una unidad internacional (UI).
La heparinasa III, el heparosano N-desacetilado y el otro componente adicionalmente pueden suministrarse solos o en cualquier combinación en la solución de reacción en un procedimiento de la etapa de molecularización en moléculas pequeñas. Estos componentes pueden suministrarse una vez o múltiples veces, o pueden suministrarse en continuo.
Además, las condiciones de reacción pueden ser uniformes de principio a fin de la etapa de molecularización en moléculas pequeñas, o pueden modificarse durante el procedimiento de la etapa de molecularización en moléculas pequeñas. La expresión “ las condiciones de reacción se modifican en el procedimiento de la etapa de molecularización en moléculas pequeñas” incluye no solo que las condiciones de reacción se cambian temporalmente, sino también que las condiciones de reacción se cambian espacialmente. La expresión “ las condiciones de reacción se cambian espacialmente” se refiere a que, por ejemplo, las condiciones de reacción, tales como la temperatura de reacción y la concentración de enzima y similares, son diferentes dependiendo de la posición en el camino de flujo durante la realización de la etapa de molecularización en moléculas pequeñas en el sistema de columnas.
El heparosano N-desacetilado molecularizado en moléculas pequeñas se produce mediante la realización de esta manera de la etapa de molecularización en moléculas pequeñas. El heparosano N-desacetilado molecularizado en moléculas pequeñas en la solución de reacción de la etapa de molecularización en moléculas pequeñas puede someterse directamente a una etapa de producción de heparán sulfato o puede recuperarse a partir de la solución de reacción y después someterse a la etapa de producción de heparán sulfato. El procedimiento para recuperar heparosano N-desacetilado molecularizado en moléculas pequeñas no está particularmente limitado. El procedimiento para recuperar heparosano N-desacetilado molecularizado en moléculas pequeñas incluye técnicas conocidas y utilizadas para la separación y purificación del compuesto, tal como el procedimiento de tratamiento con membrana y el procedimiento de precipitación. El heparosano N-desacetilado molecularizado en moléculas pequeñas puede someterse apropiadamente a tratamientos tales como la purificación, la dilución, la concentración, el secado y la disolución, y después someterse a la etapa de producción de heparán sulfato. La purificación puede llevarse a cabo en el grado deseado. Estos tratamientos pueden llevarse a cabo solos o en combinación, según resulte apropiado.
<4> Etapa de producción de heparán sulfato.
La etapa de producción de heparán sulfato es una etapa de producción del polisacárido de la presente invención a partir de heparosano N-desacetilado molecularizado en moléculas pequeñas. La etapa de producción de heparán sulfato puede comprender una o más, por ejemplo, todas las etapas seleccionadas de entre las etapas de N-sulfatación, epimerización en C5, 2-O-sulfatación, 3-O-sulfatación en residuos de GlcN, y 6-O- sulfatación de heparosano N-desacetilado molecularizado en moléculas pequeñas. Los tipos de etapas incluidas en la etapa de producción de heparán sulfato no están particularmente limitadas con la condición de que se obtenga el polisacárido de la presente invención. Es decir, los tipos de etapas incluidas en la etapa de producción de heparán sulfato pueden configurarse apropiadamente dependiendo de la estructura del polisacárido de la presente invención. La etapa de producción de heparán sulfato puede comprender, por ejemplo, por lo menos las etapas de N-sulfatación- 3-O-sulfatación en residuos de GlcN y 6-O-sulfatación.
El orden de realización de las etapas respectivas incluidas en la etapa de producción de heparán sulfato no está particularmente limitado con la condición de que se obtenga el polisacárido de la presente invención. El orden de realización de las etapas respectivas incluidas en la etapa de producción de heparán sulfato puede configurarse apropiadamente dependiendo de diversas condiciones, tales como el procedimiento para realizar las etapas respectivas y la especificidad de sustrato de los enzimas utilizados en las etapas respectivas. Las etapas incluidas en la etapa de producción de heparán sulfato pueden llevarse a cabo, cada una, por separado o no. Es decir, una parte o la totalidad de las etapas incluidas en la etapa de producción de heparán sulfato puede llevarse a cabo simultáneamente en una parte o en la totalidad del periodo de tiempo.
La etapa de producción de heparán sulfato puede llevarse a cabo en el orden de las etapas C1 y C3 siguientes.
(C1) N-sulfatación
(C3) 3-O-sulfatación en residuos GlcN y 6-O-sulfatación
La etapa de producción de heparán sulfato puede llevarse a cabo en el orden de las etapas C1, C2 y C3 siguientes.
(C1) N-sulfatación
(C2) Epimerización en C5 y 2-O-sulfatación
(C3) 3-O-sulfatacion en residuos de GlcN y 6-O-sulfatación.
La etapa C2 puede llevarse a cabo en el orden de epimerización en C5 y 2-O-sulfatación, o puede llevarse a cabo en el orden de 2-O-sulfatación y epimerización en C5. En la etapa C2, la epimerización en C5 y la 2-O-sulfatación pueden llevarse a cabo simultáneamente en una parte o en la totalidad del periodo de tiempo de reacción.
La etapa C3 puede llevarse a cabo en el orden de 3-O-sulfatación en los residuos de GlcN y 6-O-sulfatación, o puede llevarse a cabo en el orden de 6-O-sulfatación y 3-O-sulfatación en los residuos de GlcN.
A continuación en la presente memoria, a menos que se especifique lo contrario, se explica cada etapa sobre la premisa de que la etapa de producción de heparán sulfato se lleva a cabo en el orden de N-sulfatación, epimerización en C5, 2-O-sulfatación, 3-O-sulfatación en residuos de GlcN y 6-O-sulfatación. En el caso de que el tipo de etapas incluidas en la etapa de producción de heparán sulfato y el orden de realización de las etapas respectivas sean diferentes de lo anterior, la explicación puede leerse apropiadamente dependiendo del tipo de la etapa seleccionada y el orden configurado de realización de las etapas.
La N-sulfatación es una etapa de sulfatación de grupo amino en el heparosano N-desacetilado molecularizado en moléculas pequeñas. La N-sulfatación puede llevarse a cabo químicamente mediante la utilización de un reactivo de sulfatación. El reactivo de sulfatación incluye complejo de trióxido de azufre, tal como complejo de trióxido de azufre-piridina (PySO3) y complejo de trióxido de azufre-trimetilamina (TMASO3). El experto en la materia podrá configurar apropiadamente las condiciones de reacción para la N-sulfatación. Como condiciones de reacción para la N-sulfatación, puede hacerse referencia a las condiciones anteriormente publicadas (Kuberan B. et al. (2003) “Chemoenzymatic Synthesis of Classical and Non-classical Anticoagulant Heparan Sulfate Polysaccharides” J. Biol. Chem., 278 (52): 52613-52621; documento n.° US8227449B2 (24 de julio, 2012)). Específicamente, entre las condiciones de reacción para la N-sulfatación se incluyen, por ejemplo, las condiciones indicadas en los Ejemplos. El grado de N-sulfatación no está particularmente limitado con la condición de que se obtenga el polisacárido de la presente invención. Es decir, la N-sulfatación puede llevarse a cabo de manera que se obtenga la tasa de N-sulfatación ejemplificada anteriormente. Además, puede llevarse a cabo la N-sulfatación de manera que 90 % o más, 95 % o más, 99 % o más, o la totalidad, de los residuos de glucosamina N-desacetilada sean N-sulfatados. El grado de N-sulfatación (es decir, la tasa de N-sulfatación) puede confirmarse mediante, por ejemplo, análisis de disacáridos.
La epimerización en C5 es una etapa de isomerización del residuo de ácido glucurónico (GlcA) en el producto N-sulfatado para producir el residuo de ácido idurónico (IdoA). La epimerización en C5 puede llevarse a cabo enzimáticamente mediante la utilización de C5 epimerasa. La C5 epimerasa no está particularmente limitada con la condición de que pueda catalizar la isomerización del residuo de ácido glucurónico (GlcA) en residuo de ácido idurónico (IdoA). Además, dependiendo del orden de la epimerización en C5 y de las demás etapas, puede seleccionarse y utilizarse una C5 epimerasa con una especificidad de sustrato adecuada. La C5 epimerasa puede derivarse de cualquiera de entre animales, plantas, microorganismos y similares. Por ejemplo, puede utilizarse C5 epimerasa humana como C5 epimerasa. Además, como C5 epimerasa pueden utilizarse variantes, tales como homólogos y modificaciones artificiales de enzimas C5 epimerasa conocidos. La descripción de los procedimientos de producción y aspectos de utilización para la heparinasa III pueden aplicarse a procedimientos de producción y aspectos de utilización de la C5 epimerasa. El experto en la materia podrá configurar apropiadamente las condiciones de reacción de la epimerización en C5. Como condiciones de reacción para la epimerización en C5, puede hacerse referencia a las condiciones previamente publicadas (Chen J. et al., “Enzymatic redesigning of biologically active heparan sulfate”, J. Biol. Chem. 280(52): 42817-25, 30 de diciembre, 2005). Específicamente, entre las condiciones de reacción para la epimerización en C5 se incluyen, por ejemplo, las condiciones indicadas en los Ejemplos. El grado de epimerización en C5 no está particularmente limitado con la condición de que se obtenga el polisacárido de la presente invención. Es decir, la epimerización en C5 puede llevarse a cabo de manera que se obtenga la tasa de epimerización ejemplificada anteriormente.
La 2-O-sulfatación es una etapa de sulfatación de la posición 2-O en el residuo IdoA en el producto mediante epimerización en C5. La 2-O-sulfatación puede llevarse a cabo enzimáticamente mediante la utilización de un enzima de 2-O-sulfatación (2-OST). El 2-OST no está particularmente limitado con la condición de que pueda catalizar la sulfatación en la posición 2-O del residuo de IdoA. Además, 2-OST puede ser capaz de catalizar la sulfatación en la posición 2-O del residuo de GlcA. Además, 2-OST puede ser capaz de catalizar la sulfatación en la posición 2-O del residuo de HexA en donde el enlace entre c 4 y C5 es un enlace doble. Además, puede seleccionarse y utilizarse un 2-OST que presente una especificidad de sustrato adecuada dependiendo del orden de la 2-O-sulfatación y las demás etapas. Puede derivarse 2-OST de cualquiera de entre animales, plantas, microorganismos y similares. Por ejemplo, como el 2-OST puede utilizarse 2-OST de hámster. Además, como 2-OST pueden utilizarse variantes, tales como homólogos y enzimas modificados artificialmente de 2-OST conocidos. La descripción de los procedimientos de producción y aspectos de utilización de la heparinasa III pueden aplicarse a procedimientos de producción y aspectos de utilización de 2-OST. El experto en la materia podrá configurar apropiadamente las condiciones de reacción para la 2-O-sulfatación. Como condiciones de reacción para la 2-O-sulfatación, puede hacerse referencia a las condiciones previamente publicadas (Chen J. et al., “Enzymatic redesigning of biologically active heparan sulfate”, J. Biol. Chem. 280(52): 42817-25, 30 de diciembre de 2005). Específicamente, entre las condiciones de reacción para la 2-O-sulfatación se incluyen, por ejemplo, las condiciones indicadas en los Ejemplos. El grado de 2-O-sulfatación no está particularmente limitado con la condición de que se obtenga el polisacárido de la presente invención. Es decir, la 2-O-sulfatación puede llevarse a cabo de manera que se obtenga la tasa de 2-O-sulfatación ejemplificada anteriormente.
La isomerización del residuo de GlcA en residuo de IdoA por la C5 epimerasa es una reacción en equilibrio reversible. Es decir, al llevar a cabo la epimerización en C5 utilizando la C5 epimerasa, una parte de los residuos de IdoA producidos por la epimerización en C5 puede convertirse nuevamente en los residuos de GlcA. Por otra parte, un residuo de ácido hexurónico (HexA) 2-O-sulfatado no es un sustrato de la C5 epimerasa en general. De esta manera, por ejemplo, llevando a cabo la epimerización en C5 y la 2-O-sulfatación en combinación, el residuo de IdoA producido por la epimerización en C5 puede 2-O-sulfatarse secuencialmente, evitando de esta manera que el residuo de IdoA se convierta nuevamente en el residuo GlcA. Por lo tanto, la tasa de epimerización en C5 puede potenciarse llevando a cabo la epimerización en C5 y la 2-O-sulfatación en combinación. De esta manera, la epimerización en C5 y la 2-O-sulfatación pueden llevarse a cabo simultáneamente en una parte o en la totalidad del periodo de tiempo de reacción. Por ejemplo, la epimerización en C5 y la 2-O-sulfatación pueden llevarse a cabo colectivamente dejando que un producto de la N-sulfatación, la C5 epimerasa y 2-OST coexistan en el sistema de reacción. Específicamente, entre las condiciones para una reacción acoplada de la epimerización en C5 y la 2-O-sulfatación se incluyen las condiciones indicadas en los Ejemplos.
La 6-O-sulfatación es una etapa de sulfatación de la posición 6-O de un residuo de glucosamina N-sulfatado (GlcNS) en un producto producido mediante 2-O-sulftación.
La 6-O-sulfatación puede llevarse a cabo enzimáticamente mediante la utilización de, por ejemplo, un enzima de 6-O-sulfatación (6-OST). El enzima 6-OST no está particularmente limitado con la condición de que pueda catalizar la sulfatación en la posición O-6 en el residuo de glucosamina N-sulfatado (GlcNS). Puede seleccionarse y utilizarse 6-OST con una especificidad de sustrato adecuada dependiendo del orden de la 6-O-sulfatación y las demás etapas. El enzima 6-OST puede derivarse de cualquiera de entre animales, plantas, microorganismos y similares. 6-OST incluye 6-OST-1, 6-OST-2 y 6-OST-3. Por ejemplo, puede utilizarse 6-OST-1 de hámster y 6-OST-3 de ratón como el enzima 6-OST. Como el enzima 6-OSt también pueden utilizarse variantes, tales como homólogos y enzimas modificados artificialmente de 6-OST conocido. La descripción de los procedimientos de producción y aspectos de utilización de la heparinasa III puede aplicarse a procedimientos de producción y aspectos de utilización de 6-OST. El experto en la materia podrá configurar adecuadamente las condiciones de reacción para la 6-O-sulfatación. Como condiciones de reacción para la 6-O-sulfatación puede hacerse referencia a las condiciones previamente publicadas (Chen J. et al., “Enzymatic redesigning of biologically active heparan sulfate”, J. Biol. Chem. 280(52): 42817-25, 30 de diciembre de 2005).
La 6-O-sulfatación también puede llevarse a cabo químicamente mediante la utilización de un reactivo de sulfatación. El reactivo de sulfatación incluye complejo de trióxido de azufre, tal como complejo de trióxido de azufre-piridina (PySO3) y complejo de trióxido de azufre-trimetilamina (TMASO3). El experto en la materia podrá configurar apropiadamente las condiciones de reacción para la 6-O-sulfatación. Como condiciones de reacción para la 6-O-sulfatación mediante la utilización del reactivo de sulfatación, puede hacerse referencia a las condiciones previamente publicadas (documento n.° US8227449B2 (24 de julio de 2012)). Específicamente, entre las condiciones de reacción para la 6-O-sulfatación utilizando el reactivo de sulfatación se incluyen, por ejemplo, las condiciones indicadas en los Ejemplos. La 6-O-sulfatación mediante la utilización del reactivo de sulfatación puede llevarse a cabo en un solvente orgánico, tal como N,N-dimetilformamida (DMF). La temperatura de reacción en la 6-O-sulfatación puede ser, por ejemplo, de entre -20 °C y 5 °C, preferentemente de entre 20 °C y 0 °C. La cantidad de reactivo de sulfatación utilizada para la 6-O-sulfatación puede ser, por ejemplo, de entre 1.5 y 10 equivalentes molares, preferentemente de entre 2 y 5 equivalentes molares, respecto a la cantidad de grupo hidroxilo que es la diana de la 6-O-sulfatación.
El grado de la 6-O-sulfatación no está particularmente limitado con la condición de que se obtenga el polisacárido de la presente invención. Es decir, la 6-O-sulfatación puede llevarse a cabo de manera que se obtenga la tasa de 6-O-sulfatación ejemplificada anteriormente.
La 3-O-sulfatación en los residuos de GlcN es una etapa de sulfatación de la posición 3-O de los residuos de glucosamina que están N-sulfatados y 6-O-sulfatados en un producto mediante la 6-O-sulfatación. La 3-O-sulfatación en los residuos de GlcN puede llevarse a cabo enzimáticamente mediante la utilización de un enzima de 3-O-sulfatación (3-OST). El enzima 3-OST no está particularmente limitado con la condición de que pueda catalizar la sulfatación en la posición O-3 del residuo de glucosamina 6-O-sulfatado N-sulfatado. Puede utilizarse 3-OST con una especificidad de sustrato adecuada dependiendo del orden de la 3-O-sulfatación en los residuos de GlcN y las demás etapas. El enzima 3-OST puede derivarse de cualquiera de entre animales, plantas, microorganismos y similares. 3-OST incluye 3-OST-1, 3-OST-2, 3-OST-3, 3-o St -4 y 3-OST-5. Por ejemplo, como 3-OST puede utilizarse 3-OST-1 procedente de un ratón. También pueden utilizarse como 3-OST variantes, tales como homólogos y enzimas modificados artificialmente a partir de 3-OST conocido. La descripción de los procedimientos de producción y aspectos de utilización de la heparinasa III puede aplicarse a procedimientos de producción y aspectos de utilización de 3-OST. El experto en la materia podrá configurar apropiadamente las condiciones de reacción para la 3-O-sulfatación en los residuos de GlcN. Como condiciones de reacción para la 6-O-sulfatación del residuo de GlcN, puede hacerse referencia a las condiciones previamente publicadas (Chen J. et al., “Enzymatic redesigning of biologically active heparan sulfate”, J. Biol. Chem. 280 (52): 42817-25, 30 de diciembre de 2005). Específicamente, entre las condiciones de reacción para la 3-O-sulfatación en los residuos de GlcN se incluyen, por ejemplo, las condiciones indicadas en los Ejemplos. El grado de 3-O-sulfatación en los residuos de GlcN no está particularmente limitado con la condición de que se obtenga el polisacárido de la presente invención. Es decir, la 3-O-sulfatación de los residuos de GlcN puede llevarse a cabo de manera que se obtenga la tasa de 3-O-sulfatación de los residuos de GlcN ejemplificada anteriormente.
El producto en cada etapa contenida en la solución de reacción de cada etapa puede someterse directamente a una etapa posterior o puede recuperarse a partir de la solución de reacción y después someterse a la etapa siguiente. El procedimiento para recuperar cada producto a partir de la solución de reacción no está particularmente limitado. El procedimiento para recuperar cada producto incluye técnicas conocidas utilizadas para la separación y la purificación del compuesto, tal como un procedimiento de tratamiento con membrana y un procedimiento de precipitación. El producto en cada etapa puede someterse apropiadamente a tratamientos tales como la purificación, la dilución, la concentración, el secado, la disolución y la inactivación del enzima, y después someterse a la etapa siguiente. La purificación puede llevarse a cabo en el grado deseado. Estos tratamientos pueden llevarse a cabo solos o en combinación, según resulte apropiado.
El polisacárido de la presente invención se produce llevando a cabo la etapa de producción de heparán sulfato tal como se ha indicado anteriormente. El polisacárido de la presente invención puede recuperarse apropiadamente a partir de la solución de reacción. El polisacárido de la presente invención puede recuperarse mediante la técnica conocida y utilizada para la separación y purificación del compuesto. Entre los ejemplos de dicha técnica se incluyen un procedimiento de resina de intercambio iónico, un procedimiento de tratamiento con membrana, un procedimiento de precipitación y un procedimiento de cristalización. Estas técnicas pueden utilizarse en combinación, según resulte apropiado. El polisacárido recuperado de la presente invención puede comprender componentes, tales como agua, y componentes utilizados al producir el polisacárido de la presente invención, además del polisacárido de la presente invención. Es decir, puede proporcionarse el polisacárido de la presente invención, por ejemplo, en forma de una mezcla que contiene el polisacárido de la presente invención. El polisacárido de la presente invención puede purificarse en el grado deseado. El polisacárido de la presente invención puede configurarse apropiadamente dependiendo de diversas condiciones, tales como aspectos de utilización del polisacárido de la presente invención. Por ejemplo, puede proporcionarse el polisacárido de la presente invención como purificado en un grado farmacológicamente aceptable para la producción de compuesto y la utilización como ingrediente activo de una composición farmacéutica. Específicamente, la pureza del polisacárido de la presente invención puede ser, por ejemplo, de 30 % (p/p) o superior, 50 % (p/p) o superior, 70 % (p/p) o superior, 80 % (p/p) o superior, 90 % (p/p) o superior o de 95 % (p/p) o superior.
<3> Utilización del polisacárido de la presente invención.
El polisacárido de la presente invención puede prepararse como compuesto en forma de un ingrediente activo en una composición y utilizarse. Es decir, la presente invención proporciona un compuesto que contiene el polisacárido de la presente invención. Dicha composición también se denomina “composición de la presente invención”. La composición incluye una composición farmacéutica. La composición de la presente invención puede estar destinada, por ejemplo, a la prevención, mejora y/o tratamiento de síntomas atribuidos a la coagulación sanguínea. Es decir, la composición de la presente invención puede ser, por ejemplo, un agente preventivo, un agente de mejora y/o un agente terapéutico para los síntomas atribuidos a la coagulación sanguínea. Entre los síntomas atribuidos a la coagulación sanguínea se incluyen la coagulación intravascular diseminada (CID), el embolismo trombótico (trombosis venosa, infarto de miocardio, embolismo pulmonar, embolismo cerebral, embolismo trombótico arterial de extremidades, embolismo trombótico durante y después de cirugía, y similares), coagulación sanguínea en la diálisis artificial y coagulación sanguínea en la circulación extracorpórea.
La composición de la presente invención contiene el polisacárido de la presente invención. La composición de la presente invención puede consistir en el polisacárido de la presente invención por sí solo o puede contener otro u otros componentes. El “otro componente” o los “otros componentes” no están particularmente limitados con la condición de que sean farmacológicamente aceptables. El “otro componente” o los “otros componentes” incluyen, por ejemplo, componentes que utilizan para preparar la composición farmacéutica y se utilizan.
Por ejemplo, la composición de la presente invención puede formularse en cualquier forma de administración. Entre los ejemplos de la forma de administración se incluyen agentes líquidos, suspensiones, agentes en forma de polvos, tabletas, píldoras, cápsulas y agentes inyectables. Tras ser formulados, por ejemplo, pueden utilizarse aditivos farmacológicamente aceptables, tales como excipientes, agentes ligantes, desintegrantes, lubricantes, agentes estabilizantes, agentes saborizantes, agentes mejorantes del olor, perfumes, diluyentes, surfactantes y similares.
La concentración del polisacárido de la presente invención en la composición de la presente invención no está particularmente limitada con la condición de que sea una cantidad eficaz dependiendo del uso de la composición de la invención. Es decir, la concentración del polisacárido de la presente invención en la composición de la presente invención puede ser una concentración eficaz para la prevención, la mejora y/o el tratamiento de los síntomas atribuidos a la coagulación sanguínea. La concentración del polisacárido de la presente invención en la composición de la presente invención puede configurarse apropiadamente dependiendo de diversas condiciones, tales como la actividad anticoagulante del polisacárido de la presente invención, la forma de administración de la composición de la presente invención y aspectos de uso de la composición de la presente invención. La concentración del polisacárido de la presente invención en la composición de la presente invención no está particularmente limitada y puede ser, por ejemplo, de 0.01 % o superior, 0.1 % o superior o de 1 % o superior, 100 % o inferior, 10 % o inferior o de 1 % o inferior, o una combinación de las mismas.
Los síntomas atribuidos a la coagulación sanguínea en un sujeto pueden prevenirse, mejorarse y/o tratarse mediante la administración de la composición de la presente invención en el sujeto. Es decir, la presente invención proporciona un procedimiento para prevenir, mejorar y/o tratar los síntomas atribuidos a la coagulación sanguínea, que comprende administrar la composición de la presente invención en el sujeto. Además, por ejemplo, para el propósito de prevenir la coagulación sanguínea en la diálisis artificial o en la circulación extracorpórea, podría añadirse extracorpóreamente a la sangre la composición de la presente invención. La expresión “administra la composición de la presente invención en el sujeto” incluye no solo el caso de administrar en un organismo, tal como un ser humano, sino también el caso de añadir a un material abiótico, tal como la sangre. Es decir, el “sujeto” al que se hace referencia en la presente memoria puede ser un organismo, tal como un ser humano o un material abiótico, tal como la sangre.
La composición de la presente invención puede administrarse directamente en el sujeto o puede diluirse, disolverse o dispersarse mediante la utilización de un solvente farmacológicamente aceptable, tal como agua, solución salina 0 tampón, para la administración en el sujeto. Evidentemente el caso de diluirla, disolverla o dispersarla de esta manera está comprendido en el alcance de la composición de la presente invención. El procedimiento de administración no está particularmente limitado e incluye, por ejemplo, la administración oral, la administración invasiva, tal como la inyección, y la administración transdérmica. El procedimiento de administración puede configurarse apropiadamente dependiendo de diversas condiciones, tales como la utilización de la composición de la presente invención. Puede configurarse apropiadamente la dosis de la composición de la presente invención dependiendo de diversas condiciones, tales como la actividad anticoagulante del polisacárido de la presente invención, la concentración del polisacárido de la presente invención, el procedimiento de administración, la edad, el sexo y el nivel de los síntomas
Ejemplos
A continuación en la presente memoria se explicará la presente invención más específicamente basándose en ejemplos.
Ejemplo 1: preparación de heparosano.
(1) Fermentación del heparosano.
Se obtuvo una solución de cultivo que contenía heparosano mediante la utilización de la bacteria productora de heparosano (cepa Escherichia coli BL21 (DE3)/pVK9-kfiABCD) y las condiciones de cultivo indicadas en el Ejemplo 1 del documento n.° WO2015/050184.
(2) Purificación del heparosano.
Se recogió un sobrenadante de cultivo a partir de la solución de cultivo mediante centrifugación. Con el fin de eliminar los ingredientes del medio, se lavó 1 ml del sobrenadante de cultivo con agua Milli-Q utilizando una membrana UF y se concentró a 250 μl. A 250 μl de la solución concentrada con la membrana UF se añadieron 500 μl de etanol al 100 % y se precipitó el heparosano mediante centrifugación. El precipitado resultante se secó al aire, obteniendo heparosano. También a partir del sobrenadante de cultivo remanente se purificó heparosano mediante el mismo procedimiento. En total se obtuvieron 10 g de heparosano.
Ejemplo 2: N-desacetilación del heparosano.
1) A 1.22 g de heparosano, se añadieron 61 ml de hidrazina-^O y 4.7 ml de ácido sulfúrico 1 N, y tras reemplazar la fase gaseosa por nitrógeno, se calentó la mezcla a 100 °C y se hizo reaccionar durante 4.75 horas.
2) Tras detener la reacción mediante enfriamiento con hielo, se añadieron 61 ml de solución acuosa de NaCl al 16 % y 610 ml de MeOH y se centrifugó la mezcla. Se eliminó el sobrenadante. El precipitado resultante se disolvió en 50 ml de H2O y a continuación se desaló y se concentró mediante la utilización de una membrana de UF (3 kDa) de Amicon.
3) A la solución concentrada resultante se añadió dos veces el volumen de H2O y el volumen equivalente de NaHCO31 M y seguidamente se añadió gota a gota solución de I20.2 M/KI 0.4 M hasta que adquirir color amarillo. A continuación, se añadió gota a gota hidrazina-^O para reducir el exceso de yoduro a ion yodo y después se desaló la solución y se concentró mediante la utilización nuevamente de membrana de UF (3 kDa) de Amicon. La solución concentrada se secó bajo presión reducida, obteniendo heparosano N-desacetilado. La tasa residual de grupo acetilo en el heparosano N-desacetilado obtenido era de 14.9 % (indicado posteriormente).
Ejemplo 3: molecularización en moléculas pequeñas de heparosano N-desacetilado.
(1) Preparación de heparinasa III.
<Construcción de plásmido de expresión de gen hepC derivado de Flavobacterium heparinum>
Se clonó el gen hepc codificante de heparinasa III derivado de Flavobacterium heparinum en el vector μMIV-Pnlp0 (solicitud publicada de patente US n.° 20050196846) para construir el plásmido de expresión de gen hepC llamado μMIV-PnlpO-hepC. El plásmido μMIV-Pnlp0-ter incluye el promotor fuerte nlp0 (Pnlp0) y elterminador rrnB, y puede funcionar como unidad de expresión mediante la inserción de un gen objetivo entre el promotor y el terminador. “Pnlp0” representa un promotor para el gen nlpD de tipo salvaje derivado de Escherichia coli K-12.
Se muestran a continuación los detalles de la construcción del plásmido de expresión. Se obtuvo un fragmento de ADN que comprendía aproximadamente 300 pb de una región de promotor (Pnlp0) para el gen nlpD mediante PCR con ADN cromosómico de Escherichia coli MG1655 como molde mediante la utilización del cebador P1 (SEC ID n.° 6) y el cebador P2 (SEC ID n.° 7). Se han diseñado sitios para los enzimas de restricción SalI y Pael en cada extremo 5' de dichos cebadores. Los ciclos de PCR fueron los siguientes. En primer lugar, 95 °C durante 3 minutos, seguido de dos ciclos de 95 °C durante 60 segundos, 50 °C durante 30 segundos y 72 °C durante 40 segundos, y seguidamente 25 ciclos de 94 °C durante 20 segundos, 55 °C durante 20 segundos y 72 °C durante 15 segundos, y finalmente 72 °C durante 5 minutos. Se trató el fragmento resultante con Sall y Pael, y se insertó en el sitio Sall-Pael de μMIV-5JS (solicitud publicada de patente japonesa n.° 2008-99668), obteniendo el plásmido μMIV-Pnlp0. La secuencia de nucleótidos del fragmento Pael-Sall del promotor Pnlp0 insertado en dicho plásmido μMIV-Pnlp0 es tal como se muestra en SEC ID n.° 8.
Seguidamente, el fragmento de ADN (SEC ID n.° 11) que comprendía aproximadamente 300 pb de una región de terminador del gen rrnB se obtuvo mediante PCR con ADN cromosómico de MG1655 como molde mediante la utilización del cebador P3 (SEC ID n.° 9) y el cebador P4 (SEC ID n.° 10). Se diseñaron los sitios de los enzimas de restricción Xbal y BamHl en cada extremo 5' de dichos cebadores. Los ciclos de PCR eran los siguientes. En primer lugar, 95 °C durante 3 minutos, seguido de dos ciclos de 95 °C durante 60 segundos, 50 °C durante 30 segundos y 72 °C durante 40 segundos, y seguidamente 25 ciclos de 94 °C durante 20 segundos, 59 °C durante 20 segundos y 72 °C durante 15 segundos, y finalmente 72 °C durante 5 minutos. El fragmento resultante se trató con Xbal y BamHl, y se insertó en el sitio Xbal-BamHl de μMIV-Pnlp0, obteniendo el plásmido μMIV-Pnlp0-ter.
Seguidamente, se sintetizó artificialmente una cadena de ADN que comprendía el ORF del gen hepC derivado de Flavobacterium heparinum (ATCC n.° 13125) (Su H. et al., Appl. Environ. Microbiol., 1996, 62: 2723-2734). Se amplificó un fragmento de ADN del gen hepC mediante PCR con dicha cadena de ADN como molde mediante la utilización del cebador P5 (SEC ID n.° 12) y el cebador P6 (SEC ID n.° 13). La PCR se llevó a cabo mediante la utilización de la polimerasa PrimeStar (TaKaRa) en la composición de reacción descrita en el protocolo. El ciclo de PCR era el siguiente. En primer lugar, 94 °C durante 5 minutos, seguido de 30 ciclos de 98 °C durante 5 segundos, 55 °C durante 10 segundos y 72 °C durante 8 minutos, y finalmente el mantenimiento a 4 °C. Además, se obtuvo un fragmento de ADN de μMIV-Pnlp0 mediante PCR con μMIV-Pnlp0 como ADN de molde mediante la utilización de oligonucleótidos del cebador 7 (SEC ID n.° 14) y el cebador 8 (SEC ID n.° 15) como cebadores. Se llevó a cabo la PCR mediante la utilización de la polimerasa PrimeStar (TaKaRa) y la composición de reacción descrita en el protocolo. El ciclo de PCR era el siguiente. En primer lugar, 94 °C durante 5 minutos, seguido de 30 ciclos de 98 °C durante 5 segundos, 55 °C durante 10 segundos y 72 °C durante 6 minutos, y finalmente el mantenimiento a 4 °C. Se ligaron ambos fragmentos de ADN resultantes mediante la utilización del kit de clonación HD In-Fusion (marca comercial registrada) (Clontech) para construir el plásmido de expresión del gen hepC llamado μMIV-Pnlp0-hepC. Se muestra la secuencia de nucleótidos del gen hepC clonado y la secuencia de aminoácidos de la heparinasa III (HepC) codificada por ella en las SEC ID n.° 16 y n.° 17, respectivamente.
<Construcción de la cepa Escherichia coli BL21 (DE3) que expresa el gen hepC y preparación de solución de enzima heparinasa III>
Se introdujo el plásmido de expresión del gen hepC llamado μMIV-Pnlp0-hepC en la cepa Escherichia coli BL21 (DE3) (Life Technologies) mediante electroporación (Cell; 80 μl, 200 O, 25 pF, 1.8 kV, cubeta de 0.1 ml), obteniendo la cepa Escherichia coli BL21 (DE3)/μMIV-Pnlp0-hepC como cepa productora de heparinasa III. Se precultivó esta cepa en medio LB con adición de cloranfenicol 25 μg/ml a 37 °C durante la noche. Seguidamente, se inoculó la solución de cultivo en 300 ml de medio LB en un matraz de Sakaguchi a una concentración final de 2 % v/v. Se llevó a cabo el cultivo bajo agitación a 37 °C durante 4 horas y se detuvo el cultivo. Tras la centrifugación, se lavaron las células microbianas dos veces con NaCl al 0.85 % y se suspendieron en 30 ml de tampón HEPES 50 mM (pH 7.0). La suspensión se sometió a disrupción mediante sonicación para romper las células microbianas. La solución de células microbianas rotas se centrifugó para preparar una solución de enzima heparinasa III como sobrenadante (solución de extracto sin células).
(2) Molecularización en moléculas pequeñas mediante reacción de la heparinasa III.
Se disolvió 1 g de heparosano N-desacetilado con una tasa residual de grupo N-acetilo de 14.9 % obtenida en el Ejemplo 2 y 2 ml de solución de heparinasa III 31.3 mUI/μl, en 100 ml de solución de tampón Tris (pH 8.0) que contenía NaCl 100 mM y CaCh 1.5 mM, y se hizo reaccionar a 37 °C durante 5.3 horas. A la solución de reacción se añadieron 100 ml de solución acuosa de NaCl al 16 % y 900 ml de EtOH, y se mezclaron y centrifugaron para eliminar el sobrenadante, obteniendo heparosano N-desacetilado molecularizado en moléculas pequeñas.
Ejemplo 4: N-sulfatación de heparosano N-desacetilado molecularizado en moléculas pequeñas.
1) El 1 g del heparosano N-desacetilado molecularizado en moléculas pequeñas que se había obtenido en el Ejemplo 3 se disolvió en 50 ml de agua MilliQ y se añadieron 50 ml de una solución acuosa de NaHCO3 20 mg/ml/trimetilaminaSO320 mg/ml, y la mezcla se hizo reaccionar a 55 °C durante la noche.
2) A la mezcla se añadió 1 l de EtOH, que a continuación se centrifugó para eliminar el sobrenadante a fin de obtener heparosano N-sulfatado molecularizado en moléculas pequeñas.
3) El heparosano N-sulfatado molecularizado en moléculas pequeñas obtenido se disolvió en agua MilliQ hasta un volumen de 500 μl y se llevó a cabo análisis de disacáridos para calcular el rendimiento de heparosano N-desacetilado. Además, se sometió a CPG para calcular la distribución de pesos moleculares. A continuación se muestran los procedimientos.
<Análisis de disacáridos>
El análisis de disacáridos del heparosano N-sulfatado molecularizado en moléculas pequeñas se llevó a cabo de acuerdo con las condiciones previamente publicadas (T. Imanari et al., “High-performance liquid chromatography analysis of glycosaminoglycan-derived oligosaccharides”, J.O. Chromato. A, 720, 275-293 (1996)). Es decir, se cuantificó la cantidad de cada disacárido constituyente mediante la descomposición del heparosano N-sulfatado molecularizado en moléculas pequeñas en disacáridos insaturados mediante la utilización de las heparinasas II y III y el análisis de cada producto descompuesto, mediante HPLC.
De manera similar, se llevó a cabo el análisis de disacáridos del heparosano N-desacetilado. El análisis de disacáridos del heparosano N-desacetilado se llevó a cabo después de N-sulfatar el heparosano N-desacetilado. Es decir, se cuantificó la cantidad de cada disacárido constituyente mediante N-sulfatación del heparosano N-desacetilado, descomponiéndolo seguidamente en disacáridos insaturados mediante la utilización de las heparinasas II y III, y el análisis de cada producto descompuesto, mediante HPLC. La N-sulfatación del heparosano N-desacetilado se llevó a cabo tal como con la N-sulfatación del heparosano N-desacetilado molecularizado en moléculas pequeñas.
El análisis de disacáridos se llevó a cabo específicamente mediante el procedimiento siguiente.
1) Se mezclaron 0.2 U de heparinasa II (Sigma), entre 0.02 y 0.03 mUI de heparinasa III, 5 μg de una muestra de polisacárido y 10 μl de tampón para la digestión enzimática (CH3COONa 100 mM, (CH3CoO)2Ca 10 mM, pH 7.0) y se diluyeron con agua Milli-Q hasta 100 μl de volumen medido para el uso como solución de reacción.
2) La solución de reacción se hizo reaccionar a 37 °C durante 16 horas o más y posteriormente se sometió a ebullición a 100 °C durante 2 minutos para detener la reacción.
3) Se eliminaron las impurezas a través de un filtro de 0.45 μm, obteniendo una solución que seguidamente se utilizó como muestra para el análisis de disacáridos.
4) El análisis se llevó a cabo mediante la utilización de una columna de Inertsil ODS-3 150 mm x 2.1 mm de 5 μm de tamaño de partícula bajo las condiciones de temperatura de 50 °C, un caudal de 0.25 ml/min y una longitud de onda de detección de 230 nm, y mediante la utilización de una composición de eluyente de acetonitrilo al 4 % y tributilamina 1.2 mM como solución A y acetonitrilo al 4 % y CsCl 0.1 M como solución B, con un gradiente de 1 % a 90 % de solución B.
Se calculó el rendimiento a partir de la suma de las cantidades de disacáridos constituyentes producidos a partir de cada muestra de polisacáridos. Es decir, se calculó el rendimiento como porcentaje (proporción molar) de la cantidad total de disacáridos producida a partir de heparosano N-sulfatado molecularizado en moléculas pequeñas, respecto a una cantidad total de disacáridos producida a partir de heparosano N-desacetilado. Además, en ese momento, se confirmó que el 99 % o más de los grupos amino producidos mediante N-acetilación estaba N-sulfatado en el heparosano N-sulfatado molecularizado en moléculas pequeñas que se había obtenido.
Además, se calculó la tasa residual de grupos N-acetilo en el heparosano N-desacetilado basándose en la cantidad de cada disacárido constituyente producido a partir del heparosano N-desacetilado. Es decir, se calculó la tasa residual de grupos acetilo como porcentaje (proporción molar) de la cantidad de disacáridos que presentaban el grupo acetilo respecto a la cantidad total de disacáridos. La tasa residual de grupos acetilo era de 14.9 %.
<Análisis de CPG>
Se sometió el heparosano N-sulfatado molecularizado en moléculas pequeñas y el heparán sulfato (disuelto en una concentración de 1 mg/ml en agua MilliQ) a filtración en gel mediante HPLC (análisis de CPG). Se utilizó GS520 (Shodex, Asahipak GS-520HQ, 7.5 mm x 300 mm, tamaño de partícula de 7 μm) como columna; como eluyente se utilizó una solución acuosa de dihidrogenofosfato potásico 100 mM y el análisis se llevó a cabo a un caudal de 0.6 ml/min, a una temperatura de la columna de 40°C y a una longitud de onda de detección de 200 nm. Se calcularon los pesos moleculares medios (Mn y Mw) mediante la utilización de un juego de marcadores de peso molecular de pululano (Shodex, STANDARD P-82, intervalo de pesos moleculares de 5900 a 708000) como patrones.
Ejemplo 5: reacción acoplada de epimerización en C5 y 2-O-sulfatación.
(1) Expresión y purificación de la C5 epimerasa.
Como la C5 epimerasa se utilizó la proteína de fusión del sitio catalítico de la C5 epimerasa de origen humano (Gln29 a Asn617) y proteína de unión a maltosa (MBP, por sus siglas en inglés) (MBP-C5-epimerasa). De esta manera, se clonó la secuencia de nucleótidos codificante de dicho sitio catalítico en el vector μMAL-c2x (New England Biolabs) a fin de construir el plásmido de expresión de MBP-C5-epimerasa llamado μMAL-c2x-MBP-C5epi. Con el vector μMAL-c2x, se expresó el gen clonado en forma de una proteína de fusión con MBP.
A continuación se muestran los detalles de la construcción del plásmido de expresión. En referencia al informe de Jin-ping Li et al. (Li J. et al., Jour. Biol. Chem. 1997, 272: 28158-28163), el ADNc de la C5 epimerasa de origen humano se preparó mediante síntesis de genes artificiales (Thermo Fisher Scientific). Se obtuvo un fragmento de ADN que comprendía una secuencia de nucleótidos codificante del sitio catalítico de la C5 epimerasa (Gln29 a Asn617) mediante PCR con dicho ADNc como molde mediante la utilización de los cebadores C5-epi fw (SEC ID n.° 18) y C5-epi rv (SEC ID n.° 19). Se llevó a cabo la PCR mediante la utilización de la polimerasa PrimeStar (TaKaRa) en la composición de reacción descrita en el protocolo. El ciclo de PCR fue el siguiente. En primer lugar, 94 °C durante 5 minutos, seguido de 30 ciclos de 98 °C durante 5 segundos, 55 °C durante 10 segundos y 72 °C durante 2 minutos, y finalmente el mantenimiento a 4 °C. Además, se obtuvo un fragmento de ADN de μMAL-c2x mediante PCR con μMAL-c2x (SEC ID n.° 20, New England Biolabs) como ADN molde mediante la utilización de los oligonucleótidos de SEC ID n.° 21 y n.° 22 como cebadores. La PCR se llevó a cabo mediante la utilización de la polimerasa PrimeStar en la composición de reacción descrita en el protocolo. El ciclo de PCR fue el siguiente. En primer lugar, 94 °C durante 5 minutos, seguido de 30 ciclos de 98 °C durante 5 segundos, 55 °C durante 10 segundos y 72 °C durante 6 minutos, y finalmente el mantenimiento a 4 °C. Ambos fragmentos de ADN resultantes se ligaron mediante la utilización del kit de clonación In-Fusion HD (marca comercial registrada) (Clontech) para construir el plásmido de expresión de MBP-C5-epimerasa llamado μMAL-c2x-MBP-C5epi, en el que se fusionó la secuencia de nucleótidos codificante del sitio catalítico de la C5 epimerasa con el gen de MBP originalmente incluido en μMAL-c2x. La secuencia de nucleótidos del fragmento de inserción de la C5 epimerasa (secuencia de nucleótidos codificante del sitio catalítico de la C5 epimerasa) y la secuencia de aminoácidos codificada de esta manera se muestran en las SEC ID n.° 23 y n.° 24, respectivamente.
El plásmido de expresión de MBP-C5-epimerasa llamado μMAL-c2x-MBP-C5epi y el plásmido de expresión de chaperonina, pGro7 (TaKaRa), se introdujeron en la cepa Escherichia coli Origami B (DE3) (Novagen) mediante electroporación (Cell; 80 μl, 200 O, 25 pF, 1.8 kV, cubeta: 0.1 ml), obteniendo la cepa Origami B(DE3)/μMAL-c2x-MBP-C5epi/pGro7. Esta cepa se inoculó en el medio LB (peptona al 0.1 % (p/v), extracto de levadura al 0.5 % (p/v) y NaCl al 1.0 % (p/v)) con adición de 100 μg/ml de ampicilina y 25 μg/ml de cloranfenicol, y se precultivó a 37 °C durante la noche. Seguidamente, la solución de cultivo resultante se inoculó a una concentración final de 1 % en 100 ml de medio LB en un matraz de Sakaguchi. Tras el cultivo bajo agitación a 37 °C durante 3 horas, se añadió a lo anterior isopropil-p-D-tiogalactopiranósido (IPTG) (Nacalai Tesque) a una concentración final de 0.5 mM y arabinosa (Wako Pure Chemical) a una concentración final de 0.2 %, y se continuó el cultivo a 22 °C durante la noche.
Tras centrifugar la solución de cultivo, se recogieron las células microbianas, se lavaron una vez con una solución de lavado (Tris-HCl 20 mM, pH 7.5, NaCl 200 mM) y se suspendieron en la solución de lavado. Se añadió FastBreak (Promega) a la suspensión resultante, que seguidamente se incubó a 30 °C durante 10 minutos a una hora, y a continuación se centrifugó a 9,100 g durante 10 minutos. La solución resultante se utilizó como solución de extracto de células microbianas.
(2) Expresión y purificación del enzima de 2-O-sulfatación (2-OST).
Como enzima de 2-O-sulfatación (2-OST) se utilizó la proteína de fusión (MBP-2-OST) del sitio catalítico (Arg51 a Asn356) de 2-OST mutante derivado de hámster chino con sustitución del residuo tirosina en la posición 94 por residuo de isoleucina, con la proteína de unión a maltosa (MBP). De esta manera, se clonó una secuencia de nucleótidos codificante de dicho sitio catalítico en el vector μMAL-c2x (New England Biolabs) a fin de construir el plásmido de expresión de MBP-2-OST llamado μMAL-c2x-MBP-2OST.
Se muestran a continuación los detalles de la construcción del plásmido de expresión. En referencia al informe de Kobayashi et al. (Kobayashi M. et al., Journ. Biol. Chem. 1997, 272: 13980-13985), se preparó ADNc de 2-OST mutante derivado de hámster chino con sustitución del residuo de tirosina en la posición 94 por residuo de isoleucina, mediante síntesis de genes artificiales (Thermo Fisher Scientific). El fragmento de ADN que comprendía la secuencia de nucleótidos codificante del sitio catalítico (Ag51 a Asn356) de 2-OST mutante se obtuvo mediante PCR con dicho fragmento de ADNc como molde, mediante la utilización de los cebadores 2-OST fw (SEC ID n.° 25) y 2-OST rv (SEC ID n.° 26). La PCR se llevó a cabo mediante la utilización de la polimerasa PrimerStar (TaKaRa) en la composición de reacción descrita en el protocolo. El ciclo de PCR era el siguiente. En primer lugar, 94 °C durante 5 minutos, seguido de 30 ciclos de 98 °C durante 5 segundos, 55 °C durante 10 segundos y 72 °C durante 2 minutos, y finalmente el mantenimiento a 4 °C. Además, el fragmento de ADN de μMAL-c2x se obtuvo mediante PCR con μMAL-c2X como ADN molde, utilizando los oligonucleótidos de SEC ID n.° 21 y n.° 22 como cebadores. La PCR se llevó a cabo mediante la utilización de la polimerasa PrimeStar en la composición de reacción descrita en el protocolo. El ciclo de PCR fue el siguiente. En primer lugar, 94 °C durante 5 minutos, seguido de 30 ciclos de 98 °C durante 5 segundos, 55 °C durante 10 segundos y 72 °C durante 6 minutos, y finalmente el mantenimiento a 4 °C. Ambos fragmentos de ADN resultantes se ligaron mediante la utilización del kit de clonación In-Fusion HD (marca comercial registrada) (Clontech) para construir el plásmido de expresión de MBP-2-OST llamado μMAL-c2x-MBP-2OST, en el que se encontraba fusionada la secuencia de nucleótidos codificante del sitio catalítico de 2-OST mutante con el gen de MBP originalmente incluido en μMAL-c2x. La secuencia de nucleótidos del fragmento de inserción de 2-OST (secuencia de nucleótidos codificante del sitio catalítico de 2-OST mutante) y la secuencia de aminoácidos codificante de esta manera se muestran en SEC ID n.° 27 y n.° 28, respectivamente.
Se introdujo el plásmido de expresión de MBP-2OST llamado μMAL-c2x-MBP-2OST y el plásmido de expresión de la chaperonina, pGro7 (TaKaRa), en la cepa Escherichia coli Origami B (DE3) (Novagen) siguiendo las mismas técnicas que en el Ejemplo 5(1), obteniendo la cepa Origami B(DE3)/μMAL-c2x-MBP-2OST/pGro7. Se inoculó esta cepa en el medio l B con adición de ampicilina 100 μg/ml y cloranfenicol 25 μg/ml, y se precultivó a 37 °C durante la noche. Seguidamente, la solución de cultivo resultante se inoculó a una concentración final de 1 % en 100 ml de medio LB en un matraz de Sakaguchi. Tras el cultivo bajo agitación a 37 °C durante 3 horas, se añadió a lo anterior isopropil-p-D-tiogalactopiranósido (IPTG) (Nacalai Tasque) a una concentración final de 0.5 mM y arabinosa (Wako Pure Chemical) a una concentración final de 0.2 %, y se continuó el cultivo a 22 °C durante la noche.
Se preparó MBP-2-OST purificado a partir de la solución de cultivo mediante el procedimiento siguiente. En primer lugar, se centrifugó la solución de cultivo para recoger células microbianas. A continuación, se rompieron las células microbianas mediante sonicación para obtener una solución de extracto de células microbianas. Seguidamente, se mezcló la solución de extracto de células microbianas con resina de amilosa (New England Biolabs) equilibrada con Tris 20 mM (pH 7.5) y NaCl 200 mM para adsorber MBP-2-OST en la resina. A continuación, se lavó la resina con el tampón de equilibración en una cantidad de 4 veces la cantidad de la resina y se añadió el tampón de equilibración al que se había añadido maltosa 10 mM (tampón de elución). Las fracciones que contenían MBP-2-o St se fraccionaron para la utilización como MBP-2-OST purificado.
(3) Reacciones enzimáticas (reacción acoplada de epimerización en C5 y 2-O-sulfatación).
Se llevó a cabo la epimerización en C5 y la 2-O-sulfatación mediante la utilización de la solución de extracto de células microbianas de MBP-C5-epimerasa que se había preparado y MBP-2-OST purificado. A 703 ml de una solución mezclada de 166 mg de heparosano N-sulfatado molecularizado en moléculas pequeñas obtenido en el Ejemplo 4, se añadió MES 50 mM (pH 7.0), NaCl 100 mM y PAPS 1 mM, 108 ml de la solución de extracto de células microbianas que expresaban C5 epimerasa, a una concentración final de 0.9 mg/ml, y 16.9 ml de MBP-2-OST purificado a una concentración final de 0.5 mg/ml, para preparar una solución de rección en una cantidad total de 828 ml. Esta solución de reacción se hizo reaccionar a 37 °C durante 24 horas.
(4) Cuantificación de la tasa de conversión.
Se cuantificó la tasa de conversión (tasa de epimerización en C5 y tasa de 2-O-sulfatación) mediante un análisis de la composición de disacáridos utilizando la descomposición con ácido nitroso.
<Reactivos>
NaNO2 (n.° CAS: 7632-00-0, peso molecular (PM): 69.01).
Ácido cítrico (n.° CAS: 77-92-9, PM: 192.1).
2,4-Dinitrofenilhidrazina (n.° CAS: 119-26-6, PM: 198.1), producto hidratado al 50 % (abreviatura: DNPH). Heparina (fabricada por Aldrich).
<Solución de ensayo>
Solución estándar de heparina: 1 mg/ml.
Solución acuosa de NaNO2: se disolvieron 49.5 mg del reactivo en 1 ml de H2O.
Solución acuosa de ácido cítrico: se disolvieron 384.2 mg del reactivo en 1 ml de H2O.
Solución de DNPH: se disolvieron 20.4 mg (hidratados al 50 %) del reactivo en 1 ml de acetonitrilo.
<Condiciones del análisis de cromatografía líquida-espectrometría de masas (CL-EM)>
<Condiciones de la CL>
Columna: ODS Z-CLUE 3 |jm de 2.0 mm x 250 mm fabricada por Sumika Chemical Analysis Service.
Temperatura del horno de la columna: 50 °C.
Caudal de eluyente: 0.3 ml/min.
Detección: UV 365 nm.
Cantidad de inyección: 5 jl.
Composición del eluyente: solución A: HCOONH450 mM (pH 4.5); solución B: MeCN.
Tabla 1. Condiciones de gradiente para la CL.
Figure imgf000026_0002
<Condiciones de la EM>
Procedimiento de ionización: ionización por electropulverización (ESI, por sus siglas en inglés, (+/-)).
Temperatura de la línea de desolvatación (LD): 250 °C.
Bloque térmico: 250 °C.
Caudal de gas del nebulizador: 1.5 l//min.
Caudal de gas de secado: 15 l/min.
Tabla 2
Figure imgf000026_0001
<Procedimiento de análisis y resultados>
Se añadieron los 20 j l de la solución de patrón de heparina, 20 j l de la solución acuosa de tampón citrato y 10 j l de la solución acuosa de NaNO2, en este orden, a un microtubo (Eppendorf) de 1.5 ml, y la solución mezclada se sometió a agitación a 65 °C durante 2 horas (1000 rpm), obteniendo una solución de descomposición de ácido nitroso. A 40 j l de la solución de descomposición de ácido nitroso resultante se añadieron 20 j l de la solución de DNPH, y se sometieron a agitación a 45 °C durante 2 horas (1000 rpm), obteniendo una solución de derivatización. La composición de la solución de derivatización resultante se analizó mediante CL-EM. Se calculó el factor de conversión [área de la pureza de 1 mg x IdoA(2S)-GlcN(NS6S)/área del valor de IdoA(2S)-GlcN(NS6S)] a partir del pico de IdoA(2S)-GlcN(NS6S) obtenido mediante análisis de la solución patrón de heparina. Se calculó la concentración a partir del valor del área de cada derivado disacárido en la solución en cuestión. Las estructuras de disacárido calculadas y la proporción de las mismas se muestran en la Tabla 3. En la tabla, se han omitido los datos de picos no identificados que se cree que incluyen derivados disacárido y similares que presentan el grupo N-acetilo, y se parte de la premisa de que la cantidad total de GlcA(2S)-GlcN(NS), IdoA(2S)-GlcN(NS), GlcA-GlcN(NS) y IdoA-GlcN(NS) es el 100%. La tasa de epimerización en C5 (la suma de las tasas de IdoA(2S)-GlcN(NS) e IdoA-GlcN(NS)) y la tasa de 2-O-sulfatación (la suma de las tasas de GlcA(2S)-GlcN(NS) e IdoA(2S)-GlcN(NS)) se confirmó que eran de 58 % y 65 %, respectivamente.
Tabla 3. Composición de disacáridos en los productos de reacción mediante la reacción acoplada de epimerización en C5 y 2-O-sulfatación.
Figure imgf000026_0003
Ejemplo 6: 6-O-sulfatación.
Los 30 ml de la solución de reacción enzimática (solución de reacción después de la reacción acoplada de epimerización en C5 y 2-O-sulfatación) obtenidos en el Ejemplo 5 se centrifugaron (7000 G, 30 minutos) y se filtró el sobrenadante a través de un filtro de 0.45 μm. La solución filtrada (27.3 g) se aplicó a 15 g de una resina de intercambio aniónico débil (DIAION WA-30, fabricada por Mitsubishi Chemical, ajustada preliminarmente a pH 5.5 con NaH2PO425.6 mM) empaquetada en una columna (número de modelo: XK26) fabricada por Pharmacia, para adsorber los componentes polisacárido sobre la resina, y se pasaron 480 ml de una solución de lavado (NaCl 0.5 M NaH2PO425.6 mM (pH 5.5)) a través de la columna (caudal: 6.4 ml/min). Seguidamente, se pasaron 230 ml de un eluyente (NaCl 2 M NaH2PO425.6 mM (pH 5.5)) por la columna (caudal: 6.4 ml/min), obteniendo el eluyente que contenía los componentes polisacáridos. El eluyente obtenido se cargó en Amicon-3K (fabricado por Merck Millipore), que seguidamente se centrifugó (4000 G). Se añadieron 100 ml de agua adicionales a la solución concentrada resultante, que a continuación se centrifugó nuevamente. Se repitió esta operación de lavado tres veces, obteniendo 11 g de una solución concentrada y lavada.
<Intercambio iónico>
Los 11 g de la solución concentrada y lavada se pasaron por 3 ml de resina de intercambio catiónico fuerte (DIAION UBK550, fabricada por Mitsubishi Chemical, intercambiada preliminarmente a tipo H con ácido clorhídrico 1 M) (pH 2.25), y seguidamente se neutralizó (pH 8.36) mediante la adición de 1.8 ml de solución mezclada de 2.36 mg de tributilamina/10 μl de etanol. La solución neutralizada obtenida se liofilizó.
<Reacción de 6-O-sulfatación>
Bajo flujo de gas argón, se añadieron 1.92 ml de DMF y 76.4 mg (0.48 mmoles) de un complejo de trióxido de azufre-piridina a una cantidad total de la solución liofilizada anterior, y la mezcla se sometió a agitación a -10 °C durante 48 horas. Tras la reacción, se añadieron 2.8 ml de una solución acuosa de acetato de Na 5 M y 31 ml de agua, y se sometió a agitación a temperatura ambiente durante 1 hora para detener la reacción. La solución con la reacción detenida se filtró a través de un filtro de 0.2 μm y se cargó su filtrado en Amicon-3K (fabricado por Merck Millipore), que seguidamente se centrifugó (4000 G). Además, se añadieron 20 ml de agua a la solución concentrada resultante, que seguidamente se centrifugó nuevamente. Se repitió esta manipulación dos veces, obteniendo 3.92 g de una solución concentrada y lavada. Se obtuvo una muestra de la solución concentrada y lavada obtenida y se sometió a análisis de disacáridos mediante descomposición con ácido nitroso siguiendo el mismo procedimiento que en el Ejemplo 5. Como resultado se confirmó un contenido de producto de reacción (polisacárido) en una cantidad de 76.5 mg en términos de cantidad de unidades disacárido en 3.92 g de solución concentrada y lavada.
Ejemplo 7: reacción de 3-O-sulfatación en residuos de GIcN.
(1) Preparación de cepa expresante de enzima de 3-O-sulfatación (3-OST).
Se obtuvo la secuencia de aminoácidos de 3-OST-1 de ratón (NCBI-ID de proteína: NP_034604: SEC ID n.° 29) a partir de la base de datos de KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes). El fragmento de ADN que comprendía la secuencia de nucleótidos codificante del sitio catalítico de 3-OST-1 (Gly48 a His311) y optimizada basándose en el uso de codones en Escherichia coli (SEC ID n.° 30) se sintetizó con referencia a la publicación anterior (Edavettal S.C. et al., J. Biol. Chem. 2004; 279 (24) 25789-97). El fragmento de ADN resultante se insertó en el sitio EcoRI-SalI del vector pETDuet-1 (Novagen) para construir el plásmido de expresión de 3-OST-1 llamado pETDuet-3-OST-1. Según este plásmido, se expresa 3-OST-1 con etiqueta de His añadida al lado N-terminal y, de esta manera, resulta posible purificar 3-OST-1 utilizando esta etiqueta de His. Se introdujo este plásmido de expresión en la cepa Escherichia coli BL21 (DE3) siguiendo la misma técnica que en el Ejemplo 5 (1), obteniendo la cepa expresante de 3-OST-1: cepa pETDuet-3-OST-1/BL21 (DE3).
(2) Expresión y purificación de 3-OST-1.
Se inoculó la cepa Escherichia coli pETDuet-3-OST-1/BL21 (DE3) en medio agar LB (peptona al 1.0% (p/v), extracto de levadura al 0.5 % (p/v), NaCl al 1.0 % (p/v) y agar al 1.5 % (p/v)) que contenía 100 μg/ml de ampicilina, y se cultivó estáticamente a 37 °C durante la noche. Seguidamente, se suspendieron 20 μl de células microbianas cultivadas sobre el medio agar, en 1 ml del medio LB y se añadieron 50 μl del medio a 50 ml de medio TB Overnight Express (Merck, que contiene 100 μg/ml de ampicilina) en un matraz de Sakaguchi. Se cultivaron las células microbianas en 16 matraces de Sakaguchi bajo agitación a 120 oscilaciones/min a 22 °C durante 24 a 26 horas y después se recogieron mediante centrifugación (4 °C, 8,000 rpm, 5 minutos). Las células microbianas obtenidas como un pellet se suspendieron en 160 ml de un tampón de equilibración (fosfato sódico 50 mM, NaCl 300 mM, pH 7.0) y se centrifugaron (4 °C, 8,000 rpm, 5 minutos) nuevamente, para lavar las células microbianas. Después de repetir esta operación de lavado dos veces, se resuspendieron las células microbianas obtenidas como pellet, en 160 ml del tampón de equilibración, que a continuación se sometieron a disrupción mediante sonicación (190W, 20 minutos) bajo enfriamiento con hielo. La solución celular sonicada se centrifugó (4 °C, 8,000 rpm, 10 minutos) y un sobrenadante resultante se utilizó como solución de extracto sin células.
La solución de extracto sin células resultante se aplicó a una columna compuesta de tres columnas HisTALON Superflow Cartridge conectadas (fabricadas por Clontech) equilibradas preliminarmente con el tampón de equilibración para adsorber el 3-OST-1. Las columnas se lavaron con tampón de lavado (fosfato sódico 50 mM, NaCl 300 mM e imidazol 10 mM, pH 7.0) y después se eluyó el 3-OST-1 con tampón de elución (fosfato sódico 50 mM, NaCl 300 mM e imidazol 150 mM, pH 7.0), obteniendo las fracciones activas de 3-OST-1. El tampón en la fracción activa obtenida se intercambió con un tampón (fosfato sódico 50 mM y NaCl 300 mM, pH 7.0) mediante la utilización de una columna PD-10 (fabricada por GE Healthcare) siguiendo el protocolo. La solución de enzima después del intercambio de tampón se utilizó como 3-OST-1 purificado en los experimentos siguientes.
(3) Reacción enzimática (reacción de 3-O-sulfatación en residuos de GlcN).
Se preparó la solución mezclada en una cantidad de 326.5 ml que contenía la cantidad total del producto de reacción obtenido en el Ejemplo 6, HEPES 50 mM (pH 7.5) y PAPS 221 μM. Se añadieron los 56 ml de 3-OST-1 purificado, a una concentración final de 234 mg/l a dicha solución mezclada, calentada preliminarmente a 37 °C en un baño de agua, con el fin de preparar una solución de reacción en una cantidad total de 382.5 ml, y se inició la reacción. La reacción se llevó a cabo bajo agitación suave y una vez habían transcurrido 24 horas, se inactivó el enzima mediante calentamiento a 90 °C durante 20 minutos.
(4) Cuantificación de la tasa de 3-O-sulfatación en los residuos de GlcN.
Se llevó a cabo el análisis de composición de disacáridos del producto de reacción mediante descomposición con ácido nitroso siguiendo el mismo procedimiento que en el Ejemplo 5. Las estructuras calculadas de los disacáridos y sus tasas se muestran en la Tabla 4.
Tabla 4. Composición de disacáridos de los productos de reacción antes y después de la reacción de 3-O-sulfatación en residuos de GlcN.
Figure imgf000028_0001
Ejemplo 8: purificación del producto de reacción.
Se centrifugaron los 371 g de la solución de reacción enzimática (solución de reacción después de la reacción de 3-O-sulfatación en los residuos de GlcN) obtenida en el Ejemplo 7 (8000 G, 30 minutos) y se filtró su sobrenadante a través de un filtro de 0.45 μm. Se cargó este filtrado en un filtro Amicon-3K (fabricado por Merck Millipore), que seguidamente se centrifugó (4000 G). Además, se añadieron 200 ml de agua a la solución concentrada resultante, que seguidamente se centrifugó nuevamente. Se repitió esta operación de lavado tres veces, obteniendo 11.6 g de una solución concentrada y lavada. Esta solución concentrada y lavada se aplicó a 7.5 g de una resina de intercambio aniónico débil (DlAlON WA-30, fabricada por Mitsubishi Chemical, ajustada preliminarmente a pH 5.5 con NaH2PO425.6 mM) empaquetada en una columna (número de modelo XK16) fabricada por Pharmacia, para adsorber los componentes polisacárido sobre la resina, y se pasaron 500 ml de una solución de lavado (NaCl 0.5 M NaH2PO425.6 mM (pH 5.5)) por la columna (caudal: 3.0 ml/min). Seguidamente, se pasaron 500 ml de un eluyente (NaCl 2 M NaH2PO425.6 mM (pH 5.5) por la columna (caudal: 3.0 ml/min), obteniendo el eluyente que contenía los componentes polisacáridos. Se cargaron 171 g del eluyente obtenido en Amicon-50K (fabricada por Merck Millipore), que seguidamente se centrifugó (4000 G). Se cargó adicionalmente la solución permeada resultante en un filtro Amicon-3K (fabricado por Merck Millipore), que seguidamente se centrifugó (4000 G). Además, se añadieron 100 ml de agua a la solución concentrada resultante, que seguidamente se centrifugó nuevamente. Se repitió esta operación de lavado tres veces, obteniendo 8.58 g de una solución concentrada y lavada. La solución concentrada y lavada obtenida se liofilizó, obteniendo 41 mg de polisacárido purificado.
Ejemplo 9: análisis de calidad de polisacárido purificado.
Se midieron los ítems mostrados en la Tabla 5 para el polisacárido purificado que se había obtenido en el Ejemplo 8. Se indican los procedimientos de medición posteriormente. Se muestran los resultados en la Tabla 5.
Tabla 5. Calidad del polisacárido purificado.
Figure imgf000029_0003
Ejemplo 10: preparación de polisacárido sulfatado con diferentes estructuras.
Se prepararon múltiples tipos de polisacáridos sulfatados que eran diferentes en parámetros tales como la tasa de epimerización, tasa de 2-O-sulfatación y tasa de 3-O-sulfatación en residuos de GlcN, y se evaluaron para actividad anticoagulante.
(1) Reacción acoplada de epimerización en C5 y 2-O-sulfatación.
Se preparó un total de 100 ml de una solución de reacción que presentaba la misma composición de solución de reacción que en el Ejemplo 5(3), y se hizo reaccionar a 37 °C durante 0 horas, 4 horas y 8 horas. Se analizó la composición de disacáridos contenida en el producto de reacción mediante descomposición con ácido nitroso siguiendo el mismo procedimiento que en el Ejemplo 5. Las estructuras calculadas de los disacáridos y sus tasas se muestran en la Tabla 6. En la tabla, se omitieron los datos de los picos no identificados que se creía que incluían derivados disacárido y similares que presentaban el grupo N-acetilo, y se partió de la premisa de que la cantidad total de GlcA(2S)-GlcN(NS), IdoA(2S)-GlcN(NS), GlcA-GlcN(NS) e IdoA-GlcN(NS) era el 100 %.
Tabla 6. Composición de disacáridos del producto de reacción mediante la reacción acoplada de epimerización en C5 y 2-O-sulfatación.
Figure imgf000029_0001
(2) Reacción de 6-O-sulfatación.
Se purificaron cada 100 ml de la solución de reacción enzimática obtenida (solución de reacción después de la reacción acoplada de epimerización en C5 y 2-O-sulfatación) y se 6-O-sulfató siguiendo los mismos procedimientos que en el Ejemplo 6, obteniendo una solución concentrada y lavada. Se obtuvo una muestra de la solución concentrada y lavada resultante y se analizó la composición de disacáridos en la muestra mediante descomposición con ácido nitroso siguiendo el mismo procedimiento que en el Ejemplo 5. Como resultado, se confirmó que cada muestra contenía un producto de reacción (polisacárido) en una cantidad aproximada de 80 |jg en términos de cantidad de unidad disacárida en la solución concentrada y lavada.
(3) Reacción de 3-O-sulfatación en residuos de GlcN.
Para el producto de reacción obtenido en la reacción de 6-O-sulfatación, se preparó una solución de reacción en una cantidad total de 300 j l de la misma composición de solución de reacción que en el Ejemplo 7, y se hizo reaccionar a 37 °C durante 24 horas. Se analizó la composición de disacáridos del producto de reacción mediante descomposición con ácido nitroso siguiendo el mismo procedimiento que en el Ejemplo 5. Se muestran en la Tabla 7 las estructuras calculadas de los disacáridos y las tasas de los mismos. En la tabla, para las muestras de 4 horas y 8 horas, se omitieron los datos para los picos no identificados y se partió de la premisa de que la cantidad total de unidades disacáridas mostradas en la tabla era el 100 %.
Tabla 7. Composición de disacáridos de los productos de reacción de 3-O-sulfatación en los residuos de GlcN.
Figure imgf000029_0002
Figure imgf000030_0001
En la tabla, el tiempo representa el tiempo de una reacción acoplada de epimerización en C5 y 2-O-sulfatación. (4) Actividad anticoagulante del polisacárido purificado.
Los productos de reacción de la reacción de 3-O-suulfatación en residuos de GlcN se purificaron siguiendo el mismo procedimiento que en el Ejemplo 8 y se midió la actividad anticoagulante de los mismos. Se muestran los resultados en la Tabla 8.
Tabla 8. Calidad de los polisacáridos purificados.
Figure imgf000030_0002
En la tabla, el tiempo representa el tiempo de una reacción acoplada de epimerización en C5 y 2-O-sulfatación. <Procedimientos de medición>
Se midieron los ítems respectivos en los Ejemplos 9 y 10 siguiendo los procedimientos mostrados a continuación. <Antifactor Xa>
Kit utilizado: Test Team Heparin S (fabricado por Shimizu Medical).
Preparación de patrón de heparina de bajo peso molecular: preparación de patrón de la Farmacopea japonesa (fabricada por Pharmaceutical and Medical Device Regulatory Science Society of Japan, antifactor Xa: 1750 UI).
Instrumentos utilizados:
Mezclador e incubador: Thermomixer compact (fabricado por Eppendorf).
Espectrómetro de absorción de UV: PD-303S (fabricado por APEl ).
Celda de UV: celda cuadrada acrílica (longitud de camino óptico: 10 mm).
Preparación de reactivos.
Solución de sustrato: se disolvió un vial de un agente sustrato en 20 ml de agua MilliQ.
Solución de antitrombina III: se disolvió un vial de un agente antitrombina III en 10 ml de agua MilliQ.
Solución de factor Xa: se disolvió un vial de un agente factor Xa en 10 ml de agua MilliQ.
Tampón: se utilizó directamente un vial proporcionado.
Plasma normal: se disolvió un vial de un producto de plasma normal en 0.1 ml de agua MilliQ.
Solución de parada de reacción: se añadió agua MilliQ a 20 ml de ácido acético glacial (grado especial) para preparar un volumen total de 40 ml.
Solución de patrón de heparina:
Se disolvió solución de heparina diluida primaria (35 UI/ml): se disolvieron 1750 UI de heparina en 50 ml de agua MilliQ.
Solución de heparina diluida secundaria (0.175 UI/ml): a 100 μl de la solución de heparina diluida primaria se añadieron exactamente 900 μl del tampón y se mezclaron. Además, se añadieron exactamente 950 μl del tampón y se mezclaron con 50 μl de la mezcla anterior.
Solución de patrón de heparina: la solución de heparina diluida secundaria se diluyó y se mezcló tal como se muestra en la Tabla 9.
Tabla 9. Series de dilución.
Figure imgf000031_0002
* SE: solución estándar.
Preparación de especímenes (muestras para medición).
El polisacárido purificado se diluyó o se disolvió en agua MilliQ de manera que la concentración de sustrato fuese de 2 |jg/ml, obteniendo una solución diluida A.
Tabla 10
Figure imgf000031_0001
Procedimiento de medición
Se recogieron exactamente 200 j l de un espécimen en un microtubo para medición y un espécimen de blanco, respectivamente, y se incubaron bajo agitación a 37 °C durante 4 minutos. Se añadieron los l0o j l de solución de factor Xa al microtubo para medición, se mezclaron a fondo y se dejaron en reposo durante 30 segundos y seguidamente se incubaron a 37 °C durante exactamente 30 segundos. Al microtubo para medición se añadieron 200 j l de una solución de sustrato incubada preliminarmente a 37 °C, se mezclaron a fondo, se dejaron en reposo durante 30 segundos y seguidamente se incubaron a 37 °C durante exactamente 180 segundos. Se añadieron 300 j l de una solución de parada de reacción a cada microtubo y se mezclaron inmediatamente. Se dispensaron 800 j l de la solución de reacción en una celda de UV y se midió la absorbancia a una longitud de onda de 405 nm. De manera similar, se llevó a cabo una medición para las soluciones patrón de heparina en las series de dilución y se calculó una curva patrón a partir de las soluciones patrón de heparina Se obtuvo la actividad antifactor Xa basándose en la curva patrón. Se definió la concentración a la que se inhibía la coagulación de 1 ml de sangre durante 1 hora como 1 Ul/ml.
<Antifactor lla>
Reactivo y kit utilizados.
Solución de cloruro de calcio para medir el tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPa) (0.025 mol/l, GMY-300A), fabricada por Sysmex.
Kit de tiempo de tromboplastina parcial activada Actin FSL GAC-200A, fabricado por Sysmex.
Plasma de control normal Dade Citrol nivel 1, GCA-110A, fabricado por Sysmex.
Preparación de patrón de heparina de bajo peso molecular: preparación de patrón de la Farmacopea japonesa (fabricada por Pharmaceutical and Medical Device Regulatory Science Society of Japan, antifactor Ila: 670 Ul). Instrumento utilizado: aparato de medición semiautomática de la coagulación sanguínea (CA-104, fabricado por Sysmex).
Procedimiento de medición.
Se añadieron a una cubeta 10 j l de la solución patrón (serie de dilución de preparación de patrón de heparina de bajo peso molecular) o una solución en cuestión (solución de polisacárido purificado), 50 j l de actina y 50 j l del plasma de control; la cubeta se insertó inmediatamente en la unidad de detección y se cerró la compuerta de pantalla de la luz. Tras someter a agitación durante 3 minutos, se añadieron 50 j l de una solución de cloruro de calcio por una unidad de introducción. Se obtuvo una visualización automática del tiempo de coagulación. Se obtuvo la actividad antifactor IIa de la solución en cuestión basándose en la curva patrón calculada a partir de las soluciones patrón. Se definió la concentración a la que se inhibía la coagulación de 1 ml de sangre durante una hora como 1 UI/ml.
<Procedimiento de LPS>
Instrumento utilizado: Toxinometer ET-6000 (fabricado por Wako Pure Chemical).
Reactivos utilizados: reactivo de lisado (Limulus ES-11 Single Test Wako).
Patrón de LPS (JPSE10000).
Soluciones patrón de LPS (UE/ml): 0.01, 0.1 y 1.
Procedimientos de medición.
En un ES-11 Single Test Wako se dispensaron 20 μl de una solución patrón de LPS o una solución en cuestión (solución de polisacárido purificado) y se sometieron a agitación con un mezclador durante 5 segundos. Tras confirmar que no había burbujas de aire grandes en el tubo, se insertó este en la posición 1 del Toxinometer (se inicia automáticamente la medición). Se obtuvo el tiempo en que la transmitancia alcanzaba 94.9 % y se obtuvo la concentración de LPS en la solución en cuestión basándose en una curva patrón calculada a partir de las soluciones patrón de LPS.
<Análisis de proteínas>
Instrumento utilizado: lector de placas (SPECTRA NAX190, fabricado por Molecular Devices).
Reactivos utilizados:
solución de NaOH/Na2CO3: se disolvieron 2 g de NaOH y 10 g de Na2CO3 en agua para preparar un volumen total de 500 ml.
Solución de sulfato de cobre/tartrato de Na: se disolvieron 2.5 g de sulfato de cobre pentahidrato y 5.96 g de tartrato sódico dihidrato en agua para preparar un volumen total de 500 ml.
Solución alcalina de sulfato de cobre: se mezclaron 5 ml de la solución de NaOH/Na2CO3 y 1 ml de la solución de sulfato de cobre/tartrato de Na (recién preparada).
Solución acuosa de Folin: se diluyó reactivo de Folin fabricado por Aldrich (F9252-100 ml) dos veces con agua. Solución patrón de albúmina: se utilizó solución patrón (2 mg/ml) fabricada por Thermo Scientific y se diluyó a 0.125, 0.25, 0.5 y 1 mg/ml.
Procedimiento de medición.
A un microtubo de 1.5 ml se añadieron 20 μl de la solución patrón de albúmina o la solución en cuestión (solución de polisacárido purificado) y se dispensaron 300 μl de la solución alcalina de sulfato de cobre; la mezcla se sometió a agitación con un mezclador y seguidamente se dejó en reposo durante 10 minutos. Además, se añadieron 30 μl de la solución acuosa de Folin y la mezcla se sometió a agitación y seguidamente se dejó en reposo durante 30 minutos. Se introdujeron 300 μl de la solución de color revelado resultante en una placa de 96 pocillos y se obtuvo la absorbancia a 750 nm. Se obtuvo la concentración de proteína en la solución en cuestión basándose en la curva patrón calculada a partir de las soluciones patrón de albúmina.
<Análisis de disacáridos>
Se analizó la composición de disacáridos mediante descomposición con ácido nitroso siguiendo los mismos procedimientos que en el Ejemplo 5 para calcular el contenido de GlcA-GlcN(NS3S6S).
<Medición del peso molecular medio>
Se llevó a cabo un análisis de CPG mediante la utilización de marcadores de peso molecular de pululano como patrón siguiendo el mismo procedimiento que en el Ejemplo 4 para calcular los pesos moleculares (Mn y Mw) medios. Ejemplo 11: reducción del peso molecular del heparosano N-sulfatado con una tasa residual elevada de grupos acetilo.
(1) N-desacetilación del heparosano.
1) A 120 mg de heparosano se añadieron 6 ml de NaOH 2 M y la mezcla se calentó hasta 48 °C y se hizo reaccionar durante 4.1 horas.
2) Tras detener la reacción mediante adición de 12 ml de HCl 6N, se añadieron 45 ml de MeOH; a continuación, se centrifugó la mezcla y se eliminó el sobrenadante. El pellet resultante se disolvió en 8 ml de NaHCO3 0.25 M y seguidamente la solución se desaló y se concentró mediante la utilización de una membrana de UF (3 kDa) de Amicon, obteniendo 6 ml de solución de heparosano N-desacetilado. La tasa residual de grupos acetilo en el heparosano N-desacetilado que se obtuvo era de 27.6 % (indicado posteriormente). (2) Molecularización en moléculas pequeñas con heparinasa III.
Se mezclaron los 6 ml de la solución de heparosano N-desacetilado que presentaba una tasa residual de grupos N-acetilo de 27.6 % obtenida en (1), anteriormente, y 221 μl de solución de heparinasa III 10 mUI/μl con 0.6 ml de solución tampón de Tris (pH 8.0) que contenía NaCl 1 M y CaCh 15 mM; a continuación, se añadió a lo anterior agua MilliQ para preparar un volumen total de 12 ml y la mezcla se hizo reaccionar a 37 °C durante 8 horas. A la solución de reacción se añadieron 86 ml de EtOH y se mezclaron; se centrifugó la solución y se eliminó el sobrenadante, obteniendo heparosano N-desacetilado molecularizado en moléculas pequeñas.
(3) N-sulfatación de heparosano N-desacetilado y molecularizado en moléculas pequeñas.
1) La cantidad total del heparosano N-desacetilado molecularizado en moléculas pequeñas obtenido en (2), anteriormente, se disolvió en 6 ml de agua MilliQ; se añadieron 6 ml de una solución acuosa de 20 mg/ml de NaHCO3/20 mg/ml de trimetilamina SO3 a lo anterior y la mezcla se hizo reaccionar a 55 °C durante la noche.
2) Se añadieron a lo anterior 86 ml de EtOH y se mezclaron; se centrifugó la mezcla y se eliminó el sobrenadante, obteniendo heparosano N-sulfatado molecularizado en moléculas pequeñas.
3) Se calcularon los pesos moleculares medios del heparosano N-sulfatado molecularizado en moléculas pequeñas, siguiendo las mismas técnicas que en el Ejemplo 4.
Ejemplo 12: control del peso molecular del heparosano N-sulfatado molecularizado en moléculas pequeñas, según la tasa residual de grupos N-acetilo.
(1) N-deacetilación del heparosano.
El heparosano se sometió a una reacción de N-desacetilación de la misma manera que en el Ejemplo 11 y se obtuvo heparosano N-desacetilado con una tasa residual de grupos N-acetilo de entre 2.6 % y 29.6 % mediante el control del tiempo de reacción.
(2) Molecularización en moléculas pequeñas utilizando heparinasa III.
El heparosano N-desacetilado obtenido en (1), anteriormente, se hizo reaccionar con heparinasa III bajo las mismas condiciones que en el Ejemplo 11, obteniendo heparosano N-desacetilado molecularizado en moléculas pequeñas. (3) N-sulfatación de heparosano N-desacetilado molecularizado en moléculas pequeñas.
El heparosano N-desacetilado molecularizado en moléculas pequeñas que se había obtenido en (2), anteriormente, se sometió a una reacción de N-sulfatación bajo las mismas condiciones que en el Ejemplo 11, obteniendo heparosano N-sulfatado molecularizado en moléculas pequeñas.
(4) Resumen de pesos moleculares medios.
Se calcularon los pesos moleculares medios del heparosano N-sulfatado molecularizado en moléculas pequeñas siguiendo la misma técnica que en el Ejemplo 4. Los rendimientos y pesos moleculares medios resultantes (en términos de pululano) se muestran en la Tabla 11.
A partir de los resultados en la Tabla 11 se mostró que podía controlarse el peso molecular, reduciéndolo, mediante el incremento de la tasa residual de grupos N-acetilo.
Tabla 11
Figure imgf000033_0001
Figure imgf000034_0001
Ejemplo 13: preparación de heparosano N-sulfatado molecularizado en moléculas pequeñas para el examen de las diferencias de actividad debido a diferencias de peso molecular.
Debido a que la cantidad residual de grupos N-acetilo afecta a la actividad del heparán sulfato, para el propósito de examinar el efecto de la diferencia de peso molecular sobre la actividad, se prepararon muestras de heparosano N-sulfatado molecularizado en moléculas pequeñas que presentaban la misma cantidad residual de grupos N-acetilo y diferente peso molecular. Se controló el peso molecular a partir del tiempo de reacción de la molecularización en moléculas pequeñas.
(1) N-desacetilación del heparosano.
El heparosano se sometió a una reacción de N-desacetilación de la misma manera que en el Ejemplo 11, obteniendo heparosano N-desacetilado con 29.4 % de tasa residual de grupos N-acetilo.
(2) Molecularización en moléculas pequeñas mediante reacción de heparinasa III.
Se llevó a cabo la molecularización en moléculas pequeñas del heparosano N-desacetilado que se había obtenido en (1), anteriormente, mediante la reacción con heparinasa III bajo las mismas condiciones que en el Ejemplo 11. Se controló el peso molecular mediante modificación de la cantidad aditiva de oxígeno y el tiempo de reacción, obteniendo cuatro tipos de heparosano N-desacetilado y molecularizado en moléculas pequeñas.
(3) N-sulfatación de heparosano N-desacetilado y molecularizado en moléculas pequeñas.
Los cuatro tipos de heparosano N-desacetilado y molecularizado en moléculas pequeñas que se habían obtenido en (2), anteriormente, se sometieron a la reacción de N-sulfatación bajo las mismas condiciones que en el Ejemplo 11, obteniendo heparosano N-sulfatado y molecularizado en moléculas pequeñas.
(4) Se calcularon los rendimientos y la distribución de pesos molecular del heparosano N-sulfatado y molecularizado en moléculas pequeñas siguiendo las mismas técnicas que en el Ejemplo 4.
Tabla 12
Figure imgf000034_0002
Ejemplo 14: preparación de polisacáridos sulfatados que presentan pesos moleculares diferentes.
(1) Expresión y purificación de C5 epimerasa.
Como C5 epimerasa, se utilizó la proteína de fusión (MBP*-C5-epimerasa (G101)) del sitio catalítico de la C5 epimerasa de origen humano (Gly101 a Asn617) y proteína de unión a maltosa con sustitución de tres aminoácidos en el extremo C-terminal (MBP*, informe anterior (Rob J. Center et al., “Cristallization of a trimeric human T cell leukemia virus type 1 gp21 ectodomain fragment as a chimera with maltose-binding protein”, Protein Science, 7, 1612-1619 (1998)).
Los detalles para la construcción del plásmido de expresión se muestran a continuación. En primer lugar, se obtuvo un fragmento de ADN de la región C-terminal de MBP* mediante PCR con μMAL-c2x (SEC ID n.° 20, New England Biolabs) como ADN molde utilizando los oligonucleótidos de SEC ID n.° 31 y n.° 32 como cebadores. En la reacción de PCR anteriormente indicada, se añadió un sitio de reconocimiento para el enzima de restricción BglII al extremo 5'-terminal y sitios de reconocimiento para los enzimas de restricción HindIII, BamHI, SacI, Xhol y Notl al extremo 3'-terminal. El ADN del plásmido μMAL-c2x y el fragmento de ADN de la región C-terminal de MBP* se cortaron con BglII e HindIII y se ligaron, obteniendo el plásmido μMAL-MBP*. La secuencia de nucleótidos del plásmido μMAL-MBP* se muestra en la SEC ID n.° 33.
Se obtuvo un fragmento de ADN de la C5 epimerasa (G101) mediante PCR con el plásmido μMAL-c2x-MBP-C5epi preparado en el Ejemplo 5 como ADN molde utilizando los oligonucleótidos de SEC ID n.° 34 y n.° 35 como cebadores. En esta PCR, se añadió un sitio de reconocimiento para el enzima de restricción Notl al extremo 5'-terminal y un sitio de reconocimiento para el enzima de restricción Xhol al extremo 3'-terminal. El ADN del plásmido μMAL-c2x-MBP-c5epi y el fragmento de ADN de la C5 epimerasa (G101) se cortaron con Notl y Xhol, y se ligaron, obteniendo el plásmido μMAL-MBP*-C5epi (G101). La secuencia de nucleótidos del fragmento de inserción (secuencia de nucleótidos codificante del sitio catalítico (Gly101 a Asn617) de la C5 epimerasa) y la secuencia de aminoácidos codificada por la misma se muestran en SEC ID n.° 36 y n.° 37, respectivamente. El plásmido de expresión μMAL-MBP*-C5epi (G101) y plásmido de expresión de chaperonina pGro7 (TaKaRa) se introdujeron en la cepa Escherichia coli Origami B (DE3) (Novagen) siguiendo el mismo procedimiento que en el Ejemplo 5, obteniendo una cepa Origami B (DE3)/μMAL-MBP*-C5epi (G101)/pGro7. Se preparó una solución de extracto de células microbianas mediante la utilización de dicha cepa siguiendo el mismo procedimiento que en el Ejemplo 5.
(2) Expresión y purificación del enzima de 2-O-sulfatación (2-OST).
Como enzima de 2-O-sulfatación (2-OST), se utilizó una proteína de fusión del sitio catalítico (Asp68 a Asn356) del mutante de 2-OST derivado de hámster chino, con sustitución del residuo de tirosina en la posición 94 por isoleucina y MBP* (MBP*-2-OST (D68)).
Los detalles de la construcción del plásmido de expresión se muestran a continuación. Se obtuvo un fragmento de ADN de 2-OST (D68) mediante PCR con el plásmido μMAL-c2x-MBP-2OST construido en el Ejemplo 5 como ADN de molde mediante la utilización de los oligonucleótidos de SEC ID n.° 38 y n.° 39 como cebadores. En esta PCR, se añadieron sitios de reconocimiento para los enzimas de restricción Notl y Xhol a los extremos 5'-terminal y 3'-terminal, respectivamente. El ADN del plásmido μMAL-c2x-MBP-2OST y el fragmento de ADN de 2-OST (D68) se cortaron con Notl y Xhol, y se ligaron, obteniendo el plásmido μMAL-MBP*-2OST (D68). La secuencia de nucleótidos del fragmento de inserción (secuencia de nucleótidos codificante del sitio catalítico (Asp68 a Asn356) de 2-OST) y la secuencia de aminoácidos codificada por la misma se muestran en SEC ID n.° 40 y n.° 41, respectivamente. Se introdujo el plásmido de expresión de MBP*-2-OST (D68) llamado μMAL-MBP*-2OST (D68) y el plásmido de expresión de chaperonina pGro7 (TaKaRa) se introdujeron en la cepa Escherichia coli Origami B (DE3) (Novagen) siguiendo el mismo procedimiento que en el Ejemplo 5, obteniendo la cepa Origami B (DE3)/μMAL-MBp*-2OST (D68)/pGro7. Se preparó una proteína 2-OST purificada mediante la utilización de dicha cepa siguiendo el mismo procedimiento que en el Ejemplo 5.
(3) Reacción acoplada de epimerización en C5 y 2-O-sulfatación.
A 68.9 ml de una solución mezclada que contenía 14 mg de heparosano N-sulfatado n.° 1, n.° 2 o n.° 3 preparados en el Ejemplo 13, se añadió MES 50 mM (pH 7.0), NaCl 100 mM y PAPS 0.5 mM como composición de solución de reacción, 0.7 ml de solución de extracto de células microbianas expresantes de C5 epimerasa a una concentración final de 0.09 mg/ml y 0.4 ml de la proteína 2-OST purificada a una concentración final de 0.07 mg/ml, para preparar soluciones de reacción cada una con un volumen total de 70 ml, que a continuación se hicieron reaccionar a 37 °C durante 10 horas.
Se analizó la composición de disacáridos contenidos en el producto de reacción mediante descomposición con ácido nitroso siguiendo el mismo procedimiento que en el Ejemplo 5. Las estructuras de disacáridos calculadas y las tasas de los mismos se muestran en la Tabla 13. En la tabla, los datos para picos no identificados que se cree que incluían derivados disacáridos y similares que presentaban grupo N-acetilo han sido omitidos y la cantidad total de GlcA(2S)-GlcN(NS), IdoA(2S)-GlcN(NS), GlcA-GlcN(NS) e IdoA-GlcN(NS) se partió de la premisa de que era el 100 %.
Tabla 13. Contenido (%) de composición de disacáridos en el producto de reacción mediante la reacción acoplada de epimerización en C5 y 2-O-sulfatación.
Figure imgf000035_0001
(4) Reacción de epimerización en C5.
A 5.4 ml de la solución mezclada que contenía 14 mg de heparosano N-sulfatado n.° 1, n.° 2 o n.° 3 preparados en el Ejemplo 13, se añadió MES 50 mM (pH 7.0) y NaCl 100 mM en forma de una composición de solución de reacción, se añadieron 0.6 ml de una solución de extracto de células microbianas expresantes de C5 epimerasa a una concentración final de 1.0 mg/ml para preparar cada una de las soluciones de reacción en un volumen total de 5 ml, que a continuación se hicieron reaccionar a 37 °C durante 24 horas. Se utilizó la misma C5 epimerasa que en el Ejemplo 14(1). Se analizó la composición de disacáridos contenida en los productos de reacción mediante descomposición con ácido nitroso siguiendo los mismos procedimientos que en el Ejemplo 5. Las estructuras calculadas de disacárido y las tasas de las mismas se muestran en la Tabla 14.
Tabla 14.
Figure imgf000036_0002
(5) Reacción de 6-O-sulfatación.
Las soluciones de reacción enzimática obtenidas n.° 4 a n.° 9 (soluciones de reacción después de la reacción acoplada de epimerización en C5 y 2-O-sulfatación, o soluciones de reacción después de la reacción de epimerización en C5 sola) se purificaron y se 6-O-sulfataron siguiendo los mismos procedimientos que en el Ejemplo 6, obteniendo soluciones concentradas y lavadas.
(6) Reacción de 3-O-sulfatación.
Se preparó una solución de reacción en la misma composición de solución de reacción que en el Ejemplo 7 y se preparó una cantidad total de 300 j l que incluía 80 |jg de cada producto de reacción obtenidos de la reacción de 6-O-sulfatación, y se hicieron reaccionar a 37 °C durante 24 horas. Se analizó la composición de disacáridos en el producto de reacción mediante descomposición con ácido nitroso siguiendo el mismo procedimiento que en el Ejemplo 5. Las estructuras de disacárido calculadas y la tasa de las mismas se muestran en la Tabla 15. Los datos de los picos no identificados han sido omitidos y la cantidad total de unidades disacárido mostradas en la tabla se parte de la premisa de que es el 100 %.
Tabla 15. Composición de disacáridos en los productos de reacción mediante reacción de 3-O-sulfatación.
Figure imgf000036_0001
(7) Actividad anticoagulante de los polisacáridos purificados.
Los productos de reacción de la reacción de 3-O-sulfatación se purificaron siguiendo el mismo procedimiento que en el Ejemplo 8 y se midió su actividad anticoagulante. Se muestran los resultados en la Tabla 16.
Tabla 16. Calidad de los polisacáridos purificados.
Figure imgf000036_0003
Explicación del listado de secuencias>
SEC ID n.° 1 Secuencia de nucleótidos del operón kfiABCD de la cepa Escherichia coli K5
SEC ID n.° 2 Secuencia de aminoácidos de la proteína KfiA de la cepa Escherichia coli K5
SEC ID n.° 3 Secuencia de aminoácidos de la proteína KfiB de la cepa Escherichia coli K5
SEC ID n.° 4 Secuencia de aminoácidos de la proteína KfiC de la cepa Escherichia coli K5
SEC ID n.° 5 Secuencia de aminoácidos de la proteína KfiD de la cepa Escherichia coli K5
SEC ID n.° 6 y n.° 7 Cebadores
SEC ID n.° 8 Secuencia de nucleótidos del fragmento Pael-Sall que incluye el promotor nlpD de tipo salvaje (PnlpO)
SEC ID n.° 9 y n.° 10 Cebadores
SEC ID n.° 11 Secuencia de nucleótidos del terminador rrnB
SEC ID n.° 12 a n.° 15 Cebadores
SEC ID n.° 16 Secuencia de nucleótidos del gen hepC de Flavobacterium heparinum ATCC 13125 SEC ID n.° 17 Secuencia de aminoácidos de la proteína HepC de Flavobacterium heparinum ATCC 13125 SEC ID n.° 18 y n.° 19 Cebadores
SEC ID n.° 20 μMAL-c2x
SEC ID n.° 21 y n.° 22 Cebadores
SEC ID n.° 23 Secuencia de nucleótidos de fragmento insertado de C5 epimerasa (secuencia de nucleótidos codificante del sitio catalítico de la C5 epimerasa de origen humano)
SEC ID n.° 24 Secuencia de aminoácidos del sitio catalítico de la C5 epimerasa de origen humano SEC ID n.° 25 y n.° 26 Cebadores
SEC ID n.° 27 Secuencia de nucleótidos de fragmento insertado de 2-OST (secuencia de nucleótidos codificante del sitio catalítico de 2-OST mutante derivado de hámster chino)
SEC ID n.° 28 Secuencia de aminoácidos del sitio catalítico de 2-OST mutante derivada de hámster chino SEC ID n.° 29 Secuencia de aminoácidos de 3-OST-1 derivado de ratón
SEC ID n.° 30 Secuencia de nucleótidos optimizada para el uso de codones en Escherichia coli y codificante del sitio catalítico (Gly48 a His311) de 3-OST-1 derivado de ratón
SEC ID n.° 31 y n.° 32 Cebadores
SEC ID n.° 33 μMAL-MBP*
SEC ID n.° 34 y n.° 35 Cebadores
SEC ID n.° 36 Secuencia de nucleótidos de fragmento insertado de C5 epimerasa (G101) (secuencia de nucleótidos codificante de sitio catalítico (Gly101 a Asn617) de la C5 epimerasa de origen humano) SEC ID n.° 37 Secuencia de aminoácidos de sitio catalítico (Gly101 a Asn617) de C5 epimerasa de origen humano
SEC ID n.° 38 y n.° 39 Cebadores
SEC ID n.° 40 Secuencia de nucleótidos de fragmento insertado de 2-OST (D68) (secuencia de nucleótidos codificante de sitio catalítico (Asp68 a Asn356) de 2-OST mutante derivado de hámster chino)
SEC ID n.° 41 Secuencia de aminoácidos de sitio catalítico (Asp68 a Asn356) de 2-OST mutante derivado de hámster chino.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Polisacárido que presenta una actividad anticoagulante, en el que la proporción de actividad antifactor Xa/actividad antifactor IIa es de 1.5 o superior, que comprende una estructura repetitiva de una unidad disacárida mostrada en la fórmula general (I) siguiente:
Figure imgf000072_0001
en la que
R1 a R5 cumplen las condiciones siguientes;
R1, R2, R4 y R5 representan, cada uno independientemente, un hidrógeno o un grupo sulfato;
R3 representa un hidrógeno, un grupo sulfato o un grupo acetilo;
una proporción de grupo sulfato en R2 en residuos de ácido glucurónico es inferior a 15 %;
por lo menos una parte de R3 es un grupo sulfato;
una proporción de grupo sulfato en R4 es de 13 % o superior y
una proporción de grupo sulfato en R5 es de 50 % o superior,
estando el 50 % o más de las cadenas sacáridas del número total de cadenas sacáridas que constituyen dicho polisacárido compuesto de una estructura mostrada en la fórmula general (II) siguiente:
Figure imgf000072_0002
en la que
R1 a R5 son iguales a R1 a R5 en dicha fórmula general (I);
y
n es 3 a 30 como valor medio,
siendo el peso molecular medio en número medido mediante cromatografía de permeación en gel mediante la utilización de pululano como patrón de entre 12000 y 40000.
2. Polisacárido según la reivindicación 1, en el que el contenido de dicha unidad disacárida es de 90 % o superior.
3. Polisacárido según la reivindicación 1 o 2, en el que 50 % o más de las cadenas sacáridas del número total de cadenas sacáridas que constituye dicho polisacárido está compuesto de una estructura mostrada en la fórmula general (II) siguiente:
Figure imgf000073_0001
en la que
Ri a R5 son iguales a R1 a R5 en dicha fórmula general (I);
y
n es 3 a 15 como el valor medio.
4. Polisacárido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el número medio de residuos sacáridos unidos es de entre 6 y 60.
5. Polisacárido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la proporción de un grupo sulfato en R1 es de entre 0 % y 80 %.
6. Polisacárido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la proporción de grupos sulfatos en R3 es de entre 70 % y 100 %.
7. Polisacárido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la proporción de grupos sulfatos en R4 es de 45 % o inferior.
8. Polisacárido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la proporción de grupos sulfatos en R5 es de entre 70 % y 100 %.
9. Polisacárido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende una o varias unidades disacáridas seleccionadas de entre GlcA-GlcN(NS3S6S), GlcA(2S)-GlcN(NS6S), IdoA(2S)-GlcN(NS6S), GlcA-GlcN(NS6S), IdoA(2S)-GlcN(NS), IdoA(2S)-GlcN(NS3S), IdoA-GlcN(NS6S) y GlcA-GlcN(NS) en un contenido total de 50 % o superior.
10. Polisacárido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que es una forma libre o una sal farmacológicamente aceptable, o una mezcla de las mismas.,
11. Composición farmacéutica que comprende el polisacárido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
12. Composición según la reivindicación 11, que se utiliza para la prevención, mejora y/o tratamiento de un síntoma atribuido a la coagulación sanguínea.
13. Composición según la reivindicación 12, en la que dicho síntoma es síndrome de coagulación intravascular diseminada, embolismo trombótico, coagulación sanguínea en la diálisis artificial o coagulación sanguínea en la circulación extracorpórea.
ES16881651T 2015-12-28 2016-12-16 Heparán sulfato que presenta una elevada tasa de 3-O-sulfatación en los residuos de glucosamina Active ES2947291T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2015257022 2015-12-28
PCT/JP2016/087689 WO2017115675A1 (ja) 2015-12-28 2016-12-16 グルコサミン残基の３－ｏ－硫酸化率が高いヘパラン硫酸

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2947291T3 true ES2947291T3 (es) 2023-08-04

Family

ID=59225733

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES16881651T Active ES2947291T3 (es) 2015-12-28 2016-12-16 Heparán sulfato que presenta una elevada tasa de 3-O-sulfatación en los residuos de glucosamina

Country Status (8)

Country Link
US (1) US10889656B2 (es)
EP (1) EP3399045B9 (es)
JP (2) JP7006275B2 (es)
CN (1) CN108699580B (es)
ES (1) ES2947291T3 (es)
HR (1) HRP20230820T1 (es)
HU (1) HUE062293T2 (es)
WO (1) WO2017115675A1 (es)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117417912A (zh) 2017-09-05 2024-01-19 味之素株式会社 2-o-硫酸化酶突变体和3-o-硫酸化酶突变体及其使用方法
JP7456381B2 (ja) 2018-06-27 2024-03-27 味の素株式会社 幹細胞の培養用添加物および培養用培地、ならびに培養方法
CN109321508B (zh) * 2018-10-12 2022-12-27 北京化工大学 产heparosan的基因工程菌及其应用
JP7540168B2 (ja) * 2019-04-16 2024-08-27 東ソー株式会社 強酸性陽イオン交換体及びその製造方法
CN116103275B (zh) * 2022-12-01 2024-03-08 上海兴糖生物技术有限公司 一种葡萄糖醛酸c5-差向异构酶、其核苷酸序列、表达载体、细胞株及其构建方法

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4396762A (en) * 1981-08-24 1983-08-02 Massachusetts Institute Of Technology Heparinase derived anticoagulants
US8227449B2 (en) * 2000-03-30 2012-07-24 Glycores 2000 S.R.L. Glycosaminoglycans derived from K5 polysaccharide having high anticoagulant and antithrombotic activities and process for their preparation
ITMI20032498A1 (it) * 2003-12-17 2005-06-18 Pasqua Anna Oreste Polisaccaridi antitrombotici a basso peso molecolare e
US20050027117A1 (en) * 2000-12-18 2005-02-03 Pasqua Oreste Anticoagulant and antithrombotic LMW-glycosaminoglycans derived from K5 polysaccharide and process for their preparation
AU2003293122A1 (en) 2002-11-27 2004-06-23 Massachusetts Institute Of Technology Methods for synthesizing polysaccharides
WO2006124801A2 (en) 2005-05-12 2006-11-23 The University Of North Carolina At Chapel Hill Enzymatic synthesis of sulfated polysaccharides
CN101531723A (zh) 2009-02-27 2009-09-16 江南大学 一种用生物酶对肝素进行选择性结构修饰制备肝素衍生物的方法
US8420790B2 (en) 2009-10-30 2013-04-16 Reliable Biopharmaceutical Corporation Efficient and scalable process for the manufacture of Fondaparinux sodium
US11203772B2 (en) * 2010-12-23 2021-12-21 The University Of North Carolina At Chapel Hill Chemoenzymatic synthesis of structurally homogeneous ultra-low molecular weight heparins
JP6569530B2 (ja) 2013-10-02 2019-09-04 味の素株式会社 ヘパロサン生産細菌及びヘパロサンの製造法

Also Published As

Publication number Publication date
CN108699580A (zh) 2018-10-23
EP3399045B9 (en) 2023-10-04
US10889656B2 (en) 2021-01-12
JPWO2017115675A1 (ja) 2018-10-18
EP3399045A1 (en) 2018-11-07
JP2022003136A (ja) 2022-01-11
HUE062293T2 (hu) 2023-10-28
US20180298117A1 (en) 2018-10-18
EP3399045A4 (en) 2019-08-28
HRP20230820T1 (hr) 2023-11-10
EP3399045B1 (en) 2023-06-07
JP7006275B2 (ja) 2022-02-10
EP3399045C0 (en) 2023-06-07
CN108699580B (zh) 2022-09-23
WO2017115675A1 (ja) 2017-07-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2869525T3 (es) Método para producir heparán sulfato que presenta una actividad anticoagulante
ES2947291T3 (es) Heparán sulfato que presenta una elevada tasa de 3-O-sulfatación en los residuos de glucosamina
US11542534B2 (en) Methods for synthesizing anticoagulant polysaccharides
HUT64087A (en) Process for producing n,o-sulfated heparosanes of high molecular weigh and pharmaceutical compositions comprising such compounds
JP2022523638A (ja) 改変型硫酸アリール依存性酵素
ES2341249T3 (es) Derivados polisacaridos con alta actividad antitrombotica en plasma.
ITMI20000665A1 (it) Glicosaminoglicani derivati dal polisaccaride k5 aventi elevata attivita&#39; anticoagulante ed antitrombotica e processo per la loro preparazio
JP5053512B2 (ja) 非常に大きい硫酸化度を持つｋ５多糖体のエピマー化誘導体
TW202338098A (zh) 自低分子量肝素前體化學酶合成低分子量肝素之方法
HK1261704A1 (en) Heparan sulfate having high 3-o-sulfation rate of glucosamine residues
HK1261704B (en) Heparan sulfate having high 3-o-sulfation rate of glucosamine residues
CN105399870B (zh) 一种低抗凝肝素、其低聚糖及其制备方法和在制备抗阿尔兹海默症的药物中的应用
HK1261705A1 (en) Method for producing heparan sulfate having anticoagulant activity
HK1261705B (en) Method for producing heparan sulfate having anticoagulant activity
RU2333222C2 (ru) Эпимеризованные производные полисахарида к5 с высокой степенью сульфатирования
ES2357320T3 (es) Derivados epimerizados de polisacárido k5 con un grado de sulfatación muy alto.
Kandola An investigation into the structure-function relationships of the heparin degrading, lyase I enzymes from Bacteroides eggerthii and Pedobacter heparinus
EP4182452A1 (en) Methods for synthesizing non-anticoagulant heparan sulfate
Onoue et al. Novel approach for preparation of heparins specific to factor Xa using affinity chromatography coupled with synthetic antithrombin III-related peptides
KR20220032086A (ko) 항응고제 다당류의 합성 방법
JP2006291102A (ja) 精製オリゴ糖画分
Howell et al. Catalytic mechanism and mode of action of the periplasmic alginate epimerase AlgG
JP2004002236A (ja) 部分的脱硫酸化ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の製造方法