ES2947336T3 - Terapia epigenética dirigida para el aneurisma aórtico hereditario - Google Patents

Terapia epigenética dirigida para el aneurisma aórtico hereditario Download PDF

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Abstract

Las respuestas transcripcionales del factor de crecimiento transformante β (TGFβ) están involucradas en la patogenia de los síndromes de aneurisma aórtico. Las composiciones que inhiben la actividad de histona acetiltransferasa normalizan la expresión génica en la aorta, preservan la arquitectura de la pared aórtica y anulan la progresión del aneurisma. Los métodos incluyen el uso de estas composiciones para regular epigenéticamente la expresión y/o actividad anormales de los genes TGFβ. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Terapia epigenética dirigida para el aneurisma aórtico hereditario
La presente solicitud reivindica el beneficio en virtud del 35 U.S.C. 119(e) de la Solicitud Provisional de EE. UU.
62/553.394, presentada el 1 de septiembre de 2017.
Campo de la invención
Las realizaciones se refieren a composiciones para la prevención y el tratamiento de afecciones hereditarias de aneurisma aórtico mediante la modulación epigenética de los genes diana del factor de crecimiento transformante p.
Antecedentes
Los síndromes aórticos agudos comprenden la disección aórtica clásica, HIA y úlcera aterosclerótica penetrante (Coady MA, et al. Cardiol Clin. 1999;l7(4):637-657). La pared aórtica consiste en 3 capas (túnica íntima, túnica media y adventicia). Se presume que la disección aórtica aguda (DAA) ocurre cuando se desarrolla un desgarro de la íntima, permitiendo la entrada de sangre a un medio subyacente afectado caracterizado por degeneración elástica y pérdida de células musculares lisas. Las afecciones crónicas adquiridas, como la hipertensión arterial sistémica, a veces en combinación con aterosclerosis, causan engrosamiento y fibrosis de la capa íntima y degradación y apoptosis de las células del músculo liso en la capa media. Estos procesos conducen a la necrosis y fibrosis de los componentes elásticos de la pared arterial, los que a su vez produce rigidez y debilidad de la pared, lo cual puede causar la disección y ruptura. Debido a la alta presión del flujo sanguíneo en la aorta y, por lo tanto, a través del desgarro de la íntima, se crea un segundo lumen o "falso", que tiene el potencial de expansión rápida hacia el aspecto exterior de la media aórtica y que puede propagarse proximal o distalmente (Svensson LG, Crawford ES. Cardiovascular and Vascular Disease of the Aorta Philadelphia, PA: WB Saunders Co.; 1997:1-6; Nienaber CA. Pathophysiology of acute aortic syndromes. En: Baliga RR, Nienaber CA, Isselbacher EM, Eagle KA, editors, eds. Aortic Dissection and Related Syndromes New York, NY: Springer; 2007:17-43).
Sumario
Tal como se describe a continuación, la presente divulgación presenta composiciones para la terapia epigenética dirigida del aneurisma aórtico heredado y otras enfermedades o trastornos asociados con la regulación alterada de los genes diana del TGFp. Cualquier referencia a un método de tratamiento de un cuerpo humano o animal en esta solicitud debe considerarse como una referencia a una composición para tal uso.
En determinadas realizaciones, un método para tratar a un sujeto que tiene o está en riesgo de desarrollar una enfermedad, trastorno y/o afección asociado al factor de crecimiento transformante p, comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de uno o más agentes que modulan la expresión del factor de crecimiento transformante p (TGFp) mediante la modulación de la expresión y/o actividad de la histona acetiltransferasa (HAT), tratando de esta manera al sujeto.
En determinadas realizaciones, una enfermedad asociada al TGFp es el síndrome de aneurisma aórtico y/o trastornos asociados del mismo. Los ejemplos de un síndrome de aneurisma aórtico comprenden el síndrome de Shprintzen-Goldberg (SSG), Síndrome de Marfan (SMF), Síndrome de Loeys-Dietz (SLD), Síndrome de Ehlers-Danlos (SED), disección aórtica familiar o ectasia anuloaórtica.
En determinadas realizaciones, un agente inhibe la expresión y/o actividad de la histona acetil-transferasa (HAT) en comparación con un control normal y/o acetilación excesiva de H3K27. En algunas realizaciones, el inhibidor es un inhibidor selectivo de la expresión y/o actividad de EP300/proteína de unión a CREB (CBP) medida por la expresión y/o actividad del TGFp.
En algunas realizaciones, el método de tratamiento comprende además administrar uno o más inhibidores de la expresión y/o actividad del TGFp.
En realizaciones, el uno o más inhibidores del TGFp modulan la acetilación de la histona H3K27 y/o normalizan la expresión del repertorio sintético (TSR) del TGFp.
En otras realizaciones, un método para prevenir o tratar un síndrome de aneurisma aórtico inducido por el factor de crecimiento transformante p (TGFp) en un sujeto, comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de la histona acetiltransferasa (HAT), tratando de esta manera al sujeto.
En determinados aspectos de la invención, un agente inhibe la expresión y/o actividad de la histona acetil-transferasa (HAT) en comparación con un control normal.
En determinadas realizaciones, el agente es un inhibidor selectivo de la expresión y/o actividad de EP300/proteína de unión a CREB (CBP) medida por la expresión y/o actividad del TGFp.
En algunas realizaciones, el método de tratamiento comprende además administrar uno o más inhibidores de la expresión y/o actividad del TGFp. En algunas realizaciones, el uno o más inhibidores del TGFp modulan la acetilación de la histona H3K27 y/o normalizan la expresión del repertorio sintético (TSR) del TGFp.
En otras realizaciones, un método para prevenir o tratar la progresión del aneurisma y/o la preservación de la arquitectura de la pared aórtica en un sujeto, comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de la histona acetiltransferasa (HAT), tratando de esta manera al sujeto.
En realizaciones, una composición farmacéutica comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un inhibidor de la histona acetiltransferasa (HAT).
En determinadas realizaciones, la composición farmacéutica comprende además uno o más inhibidores de la expresión y/o actividad del TGFp.
En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende además uno o más agentes que modulan la expresión del gen diana del factor de crecimiento transformante p.
Se describen otros aspectos infra.
Definiciones
A menos que se definan de otro modo, todos los términos (incluyendo los términos técnicos y científicos) utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente invención. Se entenderá además que los términos, como los definidos en los diccionarios de uso común, deben interpretarse como que tienen un significado que es coherente con su significado en el contexto de la técnica relevante y no deben interpretarse en un sentido idealizado o demasiado formal a menos que se defina expresamente en el presente documento.
T al como se usan en el presente documento, las formas en singular "un", "uno/una" y "el/la" pretenden incluir también las formas en plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Asimismo, en la medida en que los términos y expresiones "que incluye/n", "incluye", "que tiene/n", "tiene", "con", o las variantes de los mismos, se utilizan en la descripción detallada y/o en las reivindicaciones, tales términos pretenden ser inclusivos de una manera similar a la expresión "que comprende".
El término "aproximadamente" o la expresión "de manera aproximada" significa dentro de un intervalo de error aceptable para el valor particular determinado por un experto en la materia, que dependerá en parte de cómo se mida o determine el valor, es decir, de las limitaciones del sistema de medida. Por ejemplo, "aproximadamente" puede significar más/menos 1 o más de 1 desviación típica, según la practica en la técnica. Como alternativa, "aproximadamente" puede significar un intervalo de hasta el 20 %, hasta el 10 %, hasta el 5 %, o hasta el 1 % de un valor o intervalo determinado. Como alternativa, particularmente con respecto a los sistemas o procesos biológicos, el término puede significar dentro de un orden de magnitud dentro de 5 veces, y también dentro de 2 veces, de un valor. Cuando se describan valores particulares en la solicitud y en las reivindicaciones, a menos que se indique lo contrario, se debe asumir el término "aproximadamente" dentro de un intervalo de error aceptable para el valor particular.
Tal como se usan en el presente documento, el término "agente" pretende abarcar cualquier molécula, entidad química, composición, fármaco, agente terapéutico, agente quimioterapéutico o agente biológico capaz de prevenir, mejorar o tratar una enfermedad u otra afección médica. El término incluye compuestos de molécula pequeña, oligonucleótidos antisentido, reactivos de ARNip, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos que contienen sitios de reconocimiento de epítopos, tales como Fab, Fab', fragmentos F(ab')2, fragmentos Fv, anticuerpos monocatenarios, imitadores de anticuerpos (como DARPins, moléculas affibody, afilinas, afitinas, anticalinas, avímeros, finómeros, péptidos de dominio Kunitz y monocuerpos), peptoides, aptámeros; enzimas, moléculas peptídicas orgánicas o inorgánicas, compuestos naturales o sintéticos y similares. Un agente puede ensayarse de acuerdo con los métodos de la invención en cualquier etapa durante los ensayos clínicos, durante las pruebas previas al ensayo o después de la aprobación de la FDA.
Por "mejorar" se entiende reducir, suprimir, atenuar, disminuir, detener o estabilizar el desarrollo o progresión de una enfermedad.
Por "oligonucleótidos antisentido" o "compuesto antisentido" se entiende una molécula de ARN o ADN que se une a otro ARN o ADN (ARN diana, ADN). Por ejemplo, si es un oligonucleótido de ARN se une a otra diana de a Rn mediante interacciones ARN-ARN y altera la actividad del ARN diana (Eguchi et al., 1991 Ann. Rev. Biochem. 60, 631-652). Un oligonucleótido antisentido puede regular al alza o a la baja la expresión y/o función de un polinucleótido particular. La definición pretende incluir cualquier molécula extraña de ARN o ADN que sea útil desde un punto de vista terapéutico, diagnóstico u otro punto de vista. Dichas moléculas incluyen, por ejemplo, moléculas de ADN o ARN antisentido, ARN de interferencia (ARNi), microARN, moléculas de ARN señuelo, ARNip, ARN enzimático, ARN de edición terapéutica y ARN agonista y antagonista, compuestos oligoméricos antisentido, oligonucleótidos antisentido, oligonucleótidos de secuencia de guía externa (EGS), elementos de corte y empalme alternos, cebadores, sondas y otros compuestos oligoméricos que se hibridan con al menos una parte del ácido nucleico diana. De esta manera, estos compuestos se pueden introducir en forma de compuestos oligoméricos monocatenarios, bicatenarios, parcialmente monocatenarios o circulares.
Como se usan en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, el término "o" generalmente se emplea en su sentido que incluye "y/o" a menos que el contenido dicte claramente lo contrario.
Tal como se usan en el presente documento, los términos "que comprende", "comprender" o "comprendido", y variaciones de los mismos, en referencia a elementos definidos o descritos de un artículo, composición, aparato, método, proceso, sistema, etc. están destinados a ser inclusivos o abiertos, permitiendo elementos adicionales, indicando así que el artículo, composición, aparato, método, proceso, sistema, etc. definido o descrito incluye esos elementos especificados o, según proceda, equivalentes de los mismos, y que otros elementos pueden incluirse y seguir estando dentro del alcance/definición del artículo, composición, aparato, método, proceso, sistema, etc. definido.
"Diagnóstico" o "diagnosticado" significa identificar la presencia o naturaleza de una afección patológica. Los métodos de diagnóstico difieren en su sensibilidad y especificidad. La "sensibilidad" de un ensayo de diagnóstico es el porcentaje de personas enfermas que dan positivo (porcentaje de "verdaderos positivos"). Los individuos enfermos no detectados por el ensayo son "falsos negativos". Los sujetos que no estén enfermos y que den negativo en el ensayo, se denominan "verdaderos negativos". La "especificidad" de un ensayo de diagnóstico es 1 menos la tasa de falsos positivos, donde la tasa de "falsos positivos" se define como la proporción de personas sin la enfermedad que dan positivo. Si bien un método de diagnóstico en particular puede no proporcionar un diagnóstico definitivo de una afección, es suficiente si el método proporciona una indicación positiva que ayuda en el diagnóstico.
Una "enfermedad" es un estado de salud de un animal en donde el animal no puede mantener la homeostasia, y en donde si la enfermedad no mejora, la salud del animal continúa deteriorándose. Ejemplos de enfermedades incluyen el síndrome de Shprintzen-Goldberg (SSG), Síndrome de Marfan (SMF), Síndrome de Loeys-Dietz (SLD), Síndrome de Ehlers-Danlos (SED), disección aórtica familiar o ectasia anuloaórtica.
En cambio, un "trastorno" en un animal es un estado de salud en el que el animal es capaz de mantener la homeostasia, pero en el que el estado de salud del animal es menos favorable de lo que sería en ausencia del trastorno. Si se deja sin tratar, un trastorno no necesariamente causa una disminución adicional en el estado de salud del animal.
Una enfermedad o trastorno se "alivia" si se reduce la gravedad de un síntoma de la enfermedad o trastorno, la frecuencia con la que un paciente experimenta dicho síntoma, o ambos.
El término "variante", cuando se usa en el contexto de una secuencia de polinucleótidos, puede abarcar una secuencia de polinucleótidos relacionada con un gen de tipo silvestre. Esta definición también puede incluir, por ejemplo, "alélico", "corte y empalme", "especie", o variantes "polimórficas". Una variante de corte y empalme puede tener una identidad significativa con una molécula de referencia, pero generalmente tendrá un número mayor o menor de polinucleótidos debido al corte y empalme alternativo de los exones durante el procesamiento del ARNm. El polipéptido correspondiente puede poseer dominios funcionales adicionales o ausencia de dominios. Las variantes de especie son secuencias de polinucleótidos que varían de una especie a otra. De particular utilidad en la invención son las variantes de los productos del gen diana de tipo silvestre. Las variantes pueden ser el resultado de al menos una mutación en la secuencia de ácido nucleico y pueden dar como resultado ARNm alterados o polipéptidos cuya estructura o función puede o no estar alterada. Cualquier gen natural o recombinante dado puede no tener ninguna, una o muchas formas alélicas. Los cambios mutacionales comunes que dan lugar a variantes generalmente se atribuyen a deleciones, adiciones o sustituciones naturales de nucleótidos. Cada uno de estos tipos de cambios puede tener lugar en solitario, o en combinación con las demás, una o más veces en una secuencia dada.
Los polipéptidos resultantes generalmente tendrán una identidad de aminoácidos significativa entre sí. Una variante polimórfica es una variación en la secuencia de polinucleótidos de un gen particular entre individuos de una especie determinada. Las variantes polimórficas también pueden abarcar "polimorfismos de un solo nucleótido" (SNP) o mutaciones de una sola base en las que la secuencia de polinucleótidos varía en una base. La presencia de SNP puede ser indicativa de, por ejemplo, una determinada población con una propensión a un estado de enfermedad, eso es susceptibilidad frente a resistencia.
La administración "parenteral" de una composición inmunogénica incluye, p. ej., inyección subcutánea (s.c.), intravenosa (i.v.), intramuscular (i.m.) o intraesternal, o técnicas de infusión.
Los términos "paciente" o "individuo" o "sujeto" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a un sujeto mamífero a tratar, prefiriéndose los pacientes humanos. En algunos casos, los métodos de la invención se pueden usar en animales de experimentación, en aplicaciones veterinarias y en el desarrollo de modelos animales para enfermedades, que incluyen, pero no se limita a, los roedores incluyen ratones, ratas, hámsteres y primates.
La expresión "farmacéuticamente aceptable" (o "farmacológicamente aceptable") se refiere a entidades moleculares y a composiciones que no producen una reacción adversa, alérgica o de otro tipo, cuando se administran a un animal o a un ser humano, según sea adecuado. La expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable", tal como se usa en el presente documento, incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, antibacterianos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, tampones, excipientes, aglutinantes, lubricantes, geles, tensioactivos y similares, que pueden usarse como medios para una sustancia farmacéuticamente aceptable.
Por "referencia" se entiende una afección patrón o de control.
Por "ARNip" se entiende un ARN de doble cadena. De manera óptima, un ARNip tiene 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 nucleótidos de longitud y tiene un saliente de 2 bases en su extremo 3'. Estos ARNdc se pueden introducir en una célula individual o en un animal completo; por ejemplo, pueden introducirse sistémicamente a través del torrente sanguíneo. Dichos ARNip se utilizan para regular a la baja los niveles de ARNm o la actividad del promotor.
Por "enfermedad, trastorno y/o afección asociada al TGFp", se entiende cualquier enfermedad, trastorno y/o afección que se ha identificado o puede identificarse como asociado a la expresión y/o actividad alterada del TGFp. Ejemplos de enfermedades, trastornos y/o afecciones asociadas al TGFp de la divulgación actual incluyen el síndrome de Shprintzen-Goldberg (SSG), Síndrome de Marfan (SMF), Síndrome de Loeys-Dietz (SLD), Síndrome de Ehlers-Danlos (SED), disección aórtica familiar o ectasia anuloaórtica y aquellas asociadas con la regulación al alza de TGFp2 (opcionalmente inducida por secuencia(s) potenciadora(s) distal(es) de TGFp2), como la esclerodermia, otra enfermedad fibrótica, glioblastoma (GBM) de grado 4 y/o glaucoma primario de ángulo abierto (GPAA).
Tal como se usan en el presente documento, los términos "tratar", "que trata", "tratamiento", y similares se refieren a reducir o mejorar un trastorno y/o los síntomas asociados al mismo. Se apreciará que, aunque no se excluye, tratar un trastorno o afección no requiere que el trastorno, afección o síntomas asociados con los mismos se eliminen por completo.
Todos los genes, nombres de genes, y productos génicos divulgados en el presente documento pretenden corresponderse a homólogos de cualquier especie para la cual las composiciones y procedimientos divulgados en el presente documento son aplicables. Así, los términos incluyen, pero sin limitación, genes y productos génicos de seres humanos y ratones. Se entiende que cuando se divulga un gen o producto génico de una especie particular, esta divulgación pretende ser ilustrativa solamente, y no se interpreta como una limitación, a menos que el contexto en el que aparece lo indique claramente. Así, por ejemplo, para los genes o productos génicos divulgados en el presente documento, que en algunas realizaciones se relacionan con secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos de mamíferos, se pretende abarcar genes homólogos y/u ortólogos y productos génicos de otros animales, incluidos, pero sin limitación, otros mamíferos, peces, anfibios, reptiles y aves. En realizaciones preferidas, los genes, secuencias de ácido nucleico, secuencias de aminoácidos, péptidos, polipéptidos y las proteínas son humanos. El término "gen" también pretende incluir variantes.
Se entiende que los intervalos proporcionados en el presente documento son una forma abreviada de todos los valores comprendidos en el intervalo. Por ejemplo, se entiende que un intervalo de 1 a 50 incluye cualquier número, combinación de números, o subintervalo del grupo que consiste en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 y 50.
La práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique de otro modo, técnicas convencionales de química, biología molecular, microbiología, ADN recombinante, genética, inmunología, biología celular, cultivo celular y biología transgénica, que se encuentran entre las capacidades de la técnica. Véase, p. ej., Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, 2a Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); Sambrook y Russell, 2001, Molecular Cloning, 3a ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); Ausubel et al., 1992), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, incluyendo actualizaciones periódicas); Glover, 1985, DNA Cloning (IRL Press, Oxford); Anand, 1992; Guthrie and Fink, 1991; Harlow and Lane, 1988, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); Jakoby and Pastan, 1979; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames y S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); el tratado, "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller y M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory);
"Methods In Enzymology", Vols. 154 y 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer y Walker, eds., Academic Press, Londres, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volúmenes I-IV (D. M. Weir y C. C. Blackwell, eds., 1986); Riott, Essential Immunology, 6a edición, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1988; Hogan et al., "Manipulating the Mouse Embryo", (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986); Westertield, M., The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio), (4a Ed., Univ. of Oregon Press, Eugene, 2000).
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es una visión general esquemática de varias líneas de ratones SKI. El ratón haploinsuficienteSki, denominado Ski /-, es heterocigoto para la deleción de los exones 2 y 3 del gen Ski. Esto conduce a una haploinsuficiencia funcional debido a una degradación del ARNm mediada por mutaciones terminadoras. El ratón Ski G34D/+:Neo es heterocigoto para una mutación de sentido erróneo observada previamente en un paciente con SSG grave. El alelo retiene un casete de resistencia a neomicina flanqueado por sitios loxP que causa interferencia transcripcional y haploinsuficiencia funcional. Tras la exposición a la recombinasa Cre, este alelo pierde el casete Neo, permitiendo la transcripción del alelo mutante y la expresión de SKI mutante. Los ratones heterocigotos para este alelo, denominados Ski G34D/+, recapitulan el mecanismo molecular del síndrome de Shprintzen-Goldberg humano.
Las Figuras 2A y 2B muestran el nivel de expresión de Ski en cada línea de ratón. La Figura 2A es un gráfico que muestra el nivel de expresión del complemento del ARNm de Ski (+/- EEM) en cada línea de ratón. Ambas líneas de ratón haploinsuficientes, Ski /- y Ski G34D/+:Neo, expresan la mitad del complemento normal del ARNm de Ski mientras que la línea de ratón Ski G34D/+ expresa en su totalidad el complemento normal del ARNm de Ski que incluye la expresión del alelo mutante. * P<0,o5; **P<0,01; ***P<0,001; NS, no significativo. La Figura 2B muestra el ADNc de Ski amplificado de cada línea de ratón. La línea de ratón Ski G34D/+ expresa de forma única el alelo mutante como se muestra en el fragmento de restricción BamHI de ADNc amplificado.
La Figura 3 es un gráfico que muestra el diámetro absoluto promedio de la raíz aórtica normalizado por peso corporal (+/- EEM) medido por ecocardiograma a los 6 meses de edad para cada línea de ratón. Hay que tener en cuenta que los ratones Ski G34D/+ tienen un diámetro de la raíz aórtica significativamente mayor que cualquier otro ratón. Diámetro final absoluto de la raíz aórtica normalizado por peso corporal: WT (0,066 /- 0,004 mm/g), Ski /- (0,069 /-0,004 mm/g), Ski G34D/+:Neo (0,064 /- 0,002 mm/g) y Ski G34D/+ (0,107 /- 0,012 mm/g). WT (n = 9), Ski +/-(n=10), Ski G34D/+:Neo (N=10), Ski G34D/+ (n=11). * P<0,05; **P<0,01; NS, no significativo.
La Figura 4 es un panel de radiografías representativas a los 6 meses de edad para cada línea de ratones. En comparación con otras líneas de ratón, solo los ratones Ski G34D/+ mostraron el fenotipo de deformidad esquelética.
La Figura 5 es un panel de microfotografías de tinción VVG y tinción tricrómica de Masson de cortes dérmicos dorsales representativos de ratones Ski G34D/+ y otros miembros de la camada WT. En comparación con otros miembros de la camada WT, los ratones Ski G34D/+ mostraron una capa de grasa subcutánea reducida.
La Figura 6 son gráficos que muestran los resultados de las pruebas de campo abierto de otros miembros de la camada WT y ratones Ski G34D/+ a las 10 semanas de edad. En comparación con otros miembros de la camada WT, los ratones Ski G34D/+ mostraron hipoactividad conductual. Los datos se muestran como recuentos de rotura de haz por 30 minutos (+/- EEM). Para la actividad total, WT (3715,6 /- 144,5 recuentos/30 min), Ski G34D/+ (2554,0 /- 233,1 Recuentos/30 min). Para la actividad del centro, WT (3113,2 /- 130,2 recuentos/30 min), Ski G34D/+ (1672,0 /- 252,8 Recuentos/30 min). Para la actividad periférica, WT (602,4 /- 58,0 recuentos/30 min), Ski G34D/+ (882,0 /- 55,2 Recuentos/30 min). WT (n=5) y Ski G34D/+ (n=5). * P<0,05; **P<0,01.
La Figura 7 son gráficos que muestran los resultados de la prueba rotarod de otros miembros de la camada WT y ratones Ski G34D/+ a las 10 semanas de edad. En comparación con otros miembros de la camada WT, Los ratones Ski G34D/+ mostraron un funcionamiento motor deteriorado. La latencia hasta la caída se muestra como el tiempo (segundos /-EEM) que los ratones permanecieron en un rotarod en aceleración (1 rpm a 20 rpm durante 100 segundos) antes de caer. WT (64,74 /- 6,19 seg), Ski G34D/+ (49,50 /- 3,71 seg). Para la velocidad de rotación promedio (rpm /- EEM) en el momento de la caída, WT (16,44 /- 1,23 rpm), Ski G34D/+ (13,33 /- 0,78 rpm). * P < 0,05.
La Figura 8 contiene una visión general esquemática de líneas de ratón Ski G34D/+ específicas de múltiples tejidos y gráficos que muestran el diámetro absoluto promedio de la raíz aórtica normalizado por peso corporal (+/- EEM) medido por ecocardiograma a los 6 meses de edad para cada línea de ratón. Mef2cSHF-Cre es una recombinasa Cre bajo el control transcripcional de un promotor específico de tejido del segundo campo cardíaco (SHF). SM22a es un promotor específico de células del músculo liso vascular (VSMC). Wnt1 es un promotor específico de tejido de la cresta neural cardíaca (CNC). Hay que tener en cuenta que cada uno de los ratones Cre/Ski G34D/+ tienen un diámetro de la raíz aórtica significativamente mayor que los otros miembros de la camada WT y los ratones no recombinados Ski G34D/+:Neo. Diámetro final absoluto de la raíz aórtica normalizado por peso corporal: WT (0,067 /- 0,002 mm/g), Ski G34D/+:Neo (0,064 /- 0,002 mm/g), SHF/Ski G34D/+ (0,079 /- 0,004 mm/g), VSMC/Ski G34D/+ (0,080 /- 0,001 mm/g), CNC/Ski G34D/+ (0,085 /- 0,004 mm/g). WT (n= 10), Ski G34D/+:Neo (n=11), SHHSki G34D/+ (n=6), VSMC/Ski G34D/+ (n=10), CNC/Ski G34D/+ (n=5). * P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001.
La Figura 9 es un panel de fotomicrografías representativas de ecocardiogramas para cada línea de ratones. En comparación con otros miembros de la camada WT, los ratones Ski G34D/+ mostraron un diámetro de la raíz aórtica significativamente mayor.
La Figura 10 es un gráfico que muestra el diámetro absoluto promedio de la raíz aórtica (+/- EEM) medido por ecocardiograma para cada línea de ratón. Se realizaron tres mediciones independientes de la raíz aórtica a partir de la vista de eco de eje largo en sístole en cada punto temporal (8 semanas de edad, 12 semanas de edad, 16 semanas de edad, 24 semanas de edad). Todos los análisis se realizaron con genotipo enmascarado. Hay que tener en cuenta que los ratones Ski G34D/+ y los ratones VSMC/Ski G34D/+ tienen un diámetro de la raíz aórtica significativamente mayor que los otros miembros de la camada WT. Diámetro absoluto final de la raíz aórtica: WT (1,674 / 0,021 mm), Ski G34D/+ (2,039 /- 0,062 mm), VSMC/Ski G34D/+ (2,138 /- 0,044 mm). WT (n=11), Ski G34D/+ (n=10), VSMC/Ski G34D/+ (n=12). * P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001; P<10-4; +P<10-6; NS, no significativo.
La Figura 11 es un gráfico que muestra el crecimiento promedio de la raíz aórtica (+/- EEM) durante 16 semanas medido por ecocardiograma. Hay que tener en cuenta que la velocidad de crecimiento de la raíz aórtica de los ratones Ski G34D/+ y los ratones VSMC/Ski G34D/+ es más rápida que la de otros miembros de la camada WT. Velocidad final de crecimiento de la raíz aórtica: WT (0,125 /- 0,012 mm/16 semanas), Ski G34D/+ (0,318 /- 0,057 mm/16 semanas), VSMC/Ski G34D/+ (0,347 /- 0,032 mm/16 semanas). WT (n=11), Ski G34D/+ (n=10), VSMC/Ski G34D/+ (n=12). * P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001; P<10-4; +P<10-6; NS, no significativo.
La figura 12 es un panel de microfotografías de tinción VVG y tinción tricrómica de Masson de cortes representativos de la raíz aórtica. En comparación con otros miembros de la camada WT, los ratones Ski G34D/+ y los ratones VSMC/Ski G34D/+ mostraron engrosamiento medial, fragmentación de las fibras elásticas y aumento del depósito de colágeno.
La Figura 13 son gráficos que muestran el grosor promedio de la pared aórtica y el número promedio de roturas de la arquitectura de la fibra de elastina a partir de la tinción VVG de cortes de la raíz aórtica. El espesor promedio de la pared aórtica (+/- EEM) se determinó mediante cuatro mediciones de cada una de los cuatro cortes representativos de cada uno de los tres ratones de cada genotipo. El número promedio de roturas de la arquitectura de la fibra de elastina (+/- EEM) se midió contando las roturas de fibra en cuatro cortes de la aorta de tres ratones de cada genotipo. Los cortes se procesaron a 5 μm de espesor y se obtuvieron cada 25 μm del anillo aórtico. Todos los análisis se realizaron con genotipo enmascarado. Hay que tener en cuenta que en comparación con los otros miembros de la camada WT, los ratones Ski G34D/+ y los ratones VSMC/Ski G34D/+ mostraron engrosamiento medial y fragmentación de fibras elásticas. Espesor absoluto final de la pared aórtica: WT (63,753 /- 4,262 μm), Ski G34D/+ (80,520 /- 4,169 pm), VSMC/Ski G34d/+ (87,423 /- 3,791 pm). Número final de alteraciones de la arquitectura de la fibra de elastina: WT (1,33 /- 0,33), Ski G34D/+ (17,00 /- 2,31), VSMC/Ski G34D/+ (14 /- 1,155). * P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001; P<10-4; +P<10-6; nS, no significativo.
La Figura 14 es un panel de fotomicrografías de la expresión de ARNm de CTGF (rojo) por hibridación in situ en cortes de raíz aórtica. Los núcleos se tiñen con DAPI (rojo). Hay que tener en cuenta que en comparación con otros miembros de la camada WT, Los ratones Ski G34D/+ muestran mayores niveles de expresión de CTGF, uno de los genes diana del TGFp.
La Figura 15 es un gráfico que muestra los niveles de expresión de los genes diana del TGFp en relación con los de p-actina normalizados por los niveles de expresión de WT (+/- EEM) determinados por PCRc. En comparación con otros miembros de la camada WT, los ratones Ski G34D/+ y VSMC/Ski G34D/+ mostraron el aumento del nivel de expresión de los genes diana del TGFp. * P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001; P<10-4; +P<10-6.
La figura 16 es una visión general esquemática de WT SKI en células normales y el mutante SKI en células con síndrome de Shprintzen-Goldberg (SSG). Cuando el ligando de TGFp se une a los receptores del TGFp, estos fosforilan R-SMAD (SMAD 2/3) que luego se une a C0-SMAD (SMAD 4) en el citosol, permitiendo que todo el complejo SMAD se transloque al núcleo. En las células WT, SKI se une a los complejos nucleares SMAD y CBP/P300 e inhibe la transcripción de los genes diana del TGFp. En las células SSG, SKI mutante no puede inhibir CBP/P300, lo que le permite acetilar las colas de histonas y, por lo tanto, activar la transcripción de los genes diana del TGFp.
La figura 17 es una vista general esquemática de cómo C646, un inhibidor selectivo de CBP/P300, actúa en las células SSG. Al unirse e inhibir la actividad HAT de CBP/P300, C646 bloquea la transcripción del gen diana del TGFB, compensando el alelo SKI defectuoso.
La Figura 18 es un panel de microfotografías de detección inmunofluorescente de acetilación de histona 3 lisina 27 (H3K27ac) en raíces aórticas de control y ratones VSMC/Ski G34D/+ tratados con C646 o vehículo de control (DMSO). Para el tratamiento con vehículo, se inyectó DMSO al 10 % en PBS tanto en ratones control como VSMC/Ski G34D/+ para el grupo placebo. Para el tratamiento con C646, se inyectó C646 disuelto en DMSO al 10 % tanto en ratones de control como VSMC/Ski G34D/+ con dosis de 5 mg/kg/día para el grupo de tratamiento. Los ratones comenzaron el tratamiento a las 8 semanas de edad.
En comparación con otros miembros de la camada WT, los ratones VSMC/Ski G34D/+ mostraron una mayor acetilación de H3K27. También, en comparación con ratones VSMC/Ski G34D/+ tratados con DMSO, los ratones VSMC/Ski G34D/+ tratados con C646 mostraron una disminución de la acetilación de H3K27.
La Figura 19 es un panel de fotomicrografías representativas de ecocardiogramas para ratones de control y VSMC/Ski G34D/+ tratados con vehículo o C646. En comparación con otros miembros de la camada de control, los ratones VSMC/Ski G34D/+ mostraron un diámetro de la raíz aórtica significativamente mayor. También, en comparación con los ratones VSMC/Ski G34D/+ tratados con DMSO, los ratones VSMC/Ski G34D/+ tratados con C646 mostraron un diámetro de la raíz aórtica normalizado.
La Figura 20 muestra los efectos terapéuticos de C646 en el aneurisma aórtico de ratones VSMC/Ski G34D/+. Un gráfico muestra el diámetro absoluto promedio de la raíz aórtica (+/- EEM) durante 12 semanas de tratamiento en ratones de control y VSMC/Ski G34D/+ con DMSO (placebo) y C646 medidos en serie mediante ecocardiograma. En comparación con otros miembros de la camada WT, los ratones VSMC/Ski G34D/+ mostraron un diámetro de la raíz aórtica significativamente mayor. También, en comparación con los ratones VSMC/Ski G34D/+ tratados con DMSO, los ratones VSMC/Ski G34D/+ tratados con C646 mostraron el diámetro de la raíz aórtica rescatado. Diámetro absoluto final de la raíz aórtica: Control - DMSO (1,729 /- 0,030 mm), VSMC/Ski G34D/+ - DMSO (2,024 /- 0,051 mm), Control - C646 (1,686 /- 0,024 mm), VSMC/Ski G34D/+ - C646 (1,848 /- 0,045 mm). Control - DMSO (n=11), VSMC/Ski G34D/+ - DMSO (n=13), Control - C646 (n=14), VSMC/Ski G34D/+ - C646 (n=13). * P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001; P<10-4; +P<10-6.
La Figura 21 es un gráfico que muestra el crecimiento de la raíz aórtica (+/- EEM) durante las 12 semanas de tratamiento en ratones de control y VSMC/Ski G34D/+ con DMSO (placebo) y de ratones de control tratados y VSMC/Ski G34D/+ con C646 medidos en serie por ecocardiograma. En comparación con otros miembros de la camada de control, los ratones VSMC/Ski G34D/+ mostraron un crecimiento de la raíz aórtica significativamente más rápido. También, en comparación con los ratones VSMC/Ski G34D/+ tratados con DMSO, los ratones VSMC/Ski G34D/+ tratados con C646 mostraron el diámetro de la raíz aórtica rescatado. Velocidad de crecimiento absoluta final de la raíz aórtica: Control - DMSO (0,061 /- 0,025 mm/12 semanas), VSMC/Ski G34D/+ - DMSO (0,247 /- 0,023 mm/12 semanas), Control - C646 (0,067 /- 0,023 mm/12 semanas), VSMC/Ski G34D/+ - C646 (0,119 /- 0,042 mm/12 semanas). Control - DMSO (n=11), VSMC/Ski G34D/+ - DMSO (n=13), Control - C646 (n=14), VSMC/Ski G34D/+ -C646 (n=13). * P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001; P<10'4; +P<10'6; NS, no significativo.
La Figura 22 es un panel de microfotografías de tinción VVG y tinción tricrómica de Masson de cortes representativos de la raíz aórtica. En comparación con otros miembros de la camada de control, los ratones VSMC/Ski G34D/+ mostraron engrosamiento medial, fragmentación de las fibras elásticas y aumento del depósito de colágeno. También, en comparación con los ratones VSMC/Ski G34D/+ tratados con DMSO, los ratones VSMC/Ski G34D/+ tratados con C646 mostraron una reducción del engrosamiento medial y la fragmentación de las fibras elásticas y la deposición de colágeno recuperada.
La Figura 23 son gráficos que muestran el grosor promedio de la pared aórtica y el número promedio de roturas de fibras de elastina en cortes de la raíz aórtica. El espesor promedio de la pared aórtica (+/- EEM) se determinó mediante cuatro mediciones de cada una de los cuatro cortes representativos de cada uno de los tres ratones de cada genotipo. El número promedio de roturas de la arquitectura de la fibra de elastina (+/- EEM) se midió contando las roturas de fibra en cuatro cortes de la aorta de tres ratones de cada genotipo. Los cortes se procesaron a 5 μm de espesor y se obtuvieron cada 25 μm del anillo aórtico. Todos los análisis se realizaron con genotipo enmascarado. En comparación con otros miembros de la camada de control, los ratones VSMC/Ski G34D/+ mostraron engrosamiento medial, fragmentación de las fibras elásticas y aumento del depósito de colágeno. También, en comparación con los ratones VSMC/Ski G34D/+ tratados con Dm So , los ratones VSMC/Ski G34D/+ tratados con C646 mostraron reducción del engrosamiento medial y la fragmentación de las fibras elásticas. Espesor absoluto final de la pared aórtica: Control -DMSO (58,309 /- 4,086 μm), VSMC/Ski G34D/+ - DMSO (70,491 /- 0,817 μm), Control - C646 (58,547 /- 1,415 μm), VSMC/Ski G34D/+ - C646 (63,438 /- 1,818 μm). Número final de alteraciones en la arquitectura de la fibra de elastina: Control - DMSO (1,667 /- 0,882), VSMC/Ski G34D/+ - DMSO (15 /- 2,082), Control - C646 (1 /- 0,577), VSMC/Ski G34D/+ - C646 (6 /- 1,155). * P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001; P<10'4; +P<10'6; NS, no significativo.
La Figura 24 es un gráfico que muestra los niveles de expresión de los genes diana del TGFp en relación con la pactina normalizada al nivel de expresión WT (+/- EEM) determinado por PCRc. En comparación con otros miembros de la camada de control, Los ratones VSMC/Ski G34D/+ mostraron un nivel de expresión significativamente mayor de los genes diana del TGFp. También, en comparación con los ratones VSMC/Ski G34D/+ tratados con DMSO, los ratones VSMC/Ski G34D/+ tratados con C646 mostraron una disminución de los niveles de expresión de los genes diana del TGFp excepto COL1A1, SKI y SKIL. * P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001; P<10'4; +P<10'6; NS, no significativo.
La figura 25 es un gráfico que muestra una mayor acetilación de H3K27 (H3K27ac) en los potenciadores ubicados proximales a los loci Col3a1 y Fn1 en la raíz aórtica de cada línea de ratón mediante inmunoprecipitación de cromatina a-H3K27ac seguida de PCRc (CHIP-qPCR). En comparación con otros miembros de la camada de control, la raíz aórtica de los ratones VSMC/Ski G34D/+ mostraron una acetilación significativamente mayor de H3K27 en los potenciadores ubicados proximales al locus Col3a1 y Fn1. * P<0,05; **P<0,01.
La Figura 26 son gráficos que muestran los niveles de expresión de COL3A1 y FN1 en relación con los de [3-actina en fibroblastos de pacientes con SSG normalizados a niveles de expresión de fibroblastos humanos de control (+/- EEM) determinado por PCRc. Comparación de fibroblastos de control y fibroblastos de pacientes con SSG entre tratados con vehículo sin estimulación con TGFp1, tratados con vehículo con estimulación con TGFp1 (10 ng/ml durante 6 horas), tratados con C646 (20 μM durante 24 horas de tratamiento previo antes de la estimulación con TGFμl) y tratados con SD208 (un inhibidor de la quinasa del receptor de TGFp) (10 μM durante 1 hora de tratamiento previo antes de la estimulación con TGFμl). En comparación con los fibroblastos de control, los fibroblastos de pacientes con SSG mostraron un nivel de expresión significativamente mayor de COL3A1 y FN1 con o sin estimulación con TGFμl. Al comparar con los tratados con vehículo tanto para fibroblastos de control como para fibroblastos de pacientes con SSG, ambos grupos mostraron una disminución significativa del nivel de expresión de COL3A1 y FN1. Hay que tener en cuenta que no hay una diferencia significativa en el nivel de expresión de COL3A1 y FN1 entre los fibroblastos de pacientes con SSG tratados con C646 y los fibroblastos de control tratados con vehículo. * P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001; P<10-4; +P<10-6; NS, no significativo.
La Figura 27 son gráficos que muestran los niveles de expresión de SKI y SMAD7 en relación con los de p-actina en fibroblastos de pacientes con SSG normalizados a niveles de expresión en fibroblastos humanos de control (+/- EEM) determinado por PCRc. Tanto los fibroblastos de control como los fibroblastos de pacientes con SSG se compararon entre tratados con vehículo sin estimulación con TGFμl, tratados con vehículo con estimulación con TGFμl (10 ng/ml durante 6 horas), tratados con C646 (20 μM durante 24 horas de tratamiento previo antes de la estimulación con TGFp1) y tratados con SD208 (un inhibidor de la quinasa del receptor de TGFp) (10 μM durante 1 hora de tratamiento previo antes de la estimulación con TGFp1). En comparación con los fibroblastos de control, los fibroblastos de pacientes con SSG mostraron un nivel de expresión significativamente mayor de SKI con o sin estimulación con TGFp1. En comparación con los tratados con vehículo tanto para fibroblastos de control como para fibroblastos de pacientes con SSG, ambos fibroblastos mostraron un nivel de expresión significativamente reducido de SKI y SMAD7. Hay que tener en cuenta que no hay una diferencia significativa del nivel de expresión de SKI entre los fibroblastos de pacientes con SSG tratados con C646 y los fibroblastos de control tratados con vehículo. * P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001; P<10-4; +P<10-6; NS, no significativo.
Descripción detallada
Las realizaciones de la invención se refieren a métodos y composiciones para la prevención y el tratamiento de afecciones hereditarias de aneurisma aórtico mediante modulación epigenética. La presente divulgación se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que el tratamiento de modelos de ratón del síndrome de Shprintzen-Goldberg (SSG) con C646, un inhibidor selectivo de la histona acetiltransferasa (HAT) CBP/EP300, normaliza la expresión génica en la aorta, preserva la arquitectura de la pared aórtica y anula la progresión del aneurisma.
Por consiguiente, en determinadas realizaciones, la administración de agentes que inhiben la expresión y/o la actividad de la histona acetiltransferasa (HAT) es terapéutica para una amplia clase de trastornos que asocian la regulación alterada de los genes diana del factor de crecimiento transformante p con el aneurisma aórtico.
Factor de crecimiento transformante i3 y síndromes de aneurisma aórtico
Los síndromes de aneurisma aórtico inducidos por el factor de crecimiento transformante p (TGFp) están unificados por una sorprendente superposición clínica de manifestaciones craneofaciales, esqueléticas, cutáneas y cardiovasculares y un mecanismo común, como lo demuestra una firma tisular uniforme para la señalización alta de TGFp en la aorta. Las mutaciones primarias ocurren en los genes que codifican reguladores de la biodisponibilidad de TGFp extracelular (FBN1 o GBN), ligandos del TGFp (TGFB2 o TGFB3), efectores de la señalización del TGFp (TGFBR1, TGFBR2 o SMAD3) o reguladores de la respuesta transcripcional del TGFp (SKI). La discordancia en las consecuencias de la señalización predichas de las mutaciones subyacentes y la falta de una comprensión patogénica precisa ha generado ambigüedad con respecto a las estrategias de tratamiento más prometedoras. El síndrome de Shprintzen-Goldberg (SSG) comparte la mayoría de las características de los síndromes de Marfan y Loeys-Dietz (SMF y SLD) con la característica adicional de discapacidad intelectual. Las mutaciones subyacentes en la protooncoproteína del Instituto Sloan-Kettering SKI ocurren en el dominio de unión a Smad y afectan al reclutamiento de SKI a elementos reguladores en los genes diana del TGFp. Esto conduce a la actividad de la histona acetiltransferasa (HAT) sin oposición de EP300/proteína de unión a CREB (CBP), dando como resultado una respuesta transcripcional de TGFp amplificada. Los ratones heterocigotos para una mutación SSG grave (Sk/G34D/+) fenocopian la afección humana; el direccionamiento condicional específicamente a las células del músculo liso vascular (SkiVSMC:G34D/+) causa aneurisma y disección de la raíz aórtica (AoR) altamente penetrante. Esto ocurre en asociación con todas las características histológicas y funcionales del MFS y el LDS, incluyendo el engrosamiento de la pared aórtica causado por la acumulación de colágeno, fragmentación de las fibras elásticas y una firma manifiesta de ARNm para un repertorio sintético de TGFp (TSR).
Sin desear quedar ligado a teoría alguna, se planteó la hipótesis de que los inhibidores de HAT (HATi) tendrían potencial terapéutico. Cabe destacar que, C646 administrado sistémicamente (un HATi selectivo de EP300/CBP) impidió la progresión del aneurisma en ratones sk iVSMC:G34D/+ además de la preservación de la arquitectura de la pared aórtica, la prevención de la acetilación excesiva de la histona 3 lisina 27 (H3K27) (tanto globalmente como en potenciadores del gen diana del TGFp) y normalización del TSR. C646 también normalizó la expresión del gen diana del TGFp en fibroblastos de pacientes con SSG con una eficacia comparable a la de un inhibidor de la quinasa del receptor de TGFp tipo I (Alk5). Estos datos implican inequívocamente la respuesta transcripcional de TGFp en la patogenia del aneurisma AoR y destacan nuevas estrategias terapéuticas dirigidas a la modulación epigenética.
Por consiguiente, en determinadas realizaciones, un método para tratar a un sujeto que tiene o está en riesgo de desarrollar una enfermedad, trastorno y/o afección asociado al factor de crecimiento transformante p, comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de uno o más agentes que modulan la expresión del factor de crecimiento transformante p (TGFp) mediante la modulación de la expresión y/o actividad de la histona acetiltransferasa (HAT), tratando de esta manera al sujeto.
En determinadas realizaciones, una enfermedad asociada al TGFp es el síndrome de aneurisma aórtico y/o trastornos asociados del mismo. Los ejemplos de un síndrome de aneurisma aórtico comprenden el síndrome de Shprintzen-Goldberg (SSG), Síndrome de Marfan (SMF), Síndrome de Loeys-Dietz (SLD), Síndrome de Ehlers-Danlos (SED), disección aórtica familiar o ectasia anuloaórtica.
Las histona acetiltransferasas (HAT) modulan la expresión génica al catalizar la acetilación dirigida del grupo £-amino de los residuos de lisina en histonas y proteínas no histonas. Las HAT se pueden clasificar en varias familias según el número de motivos estructurales altamente conservados. Estas incluyen la familia GNAT (N-acetiltransferasa relacionada con Gcn5, por ejemplo, Gcn5, PCAF), el grupo MYST (MOZ, YBF2/SAS3 y TIP60) y la familia p300/CBP. La p300 y CBP son coactivadores transcripcionales globales, expresados de forma ubicua, que tienen funciones fundamentales en una amplia variedad de fenómenos celulares, incluido el control del ciclo celular, la diferenciación y la apoptosis. La función coactivadora transcripcional de estas dos proteínas está parcialmente facilitada por su actividad HAT intrínseca. p300/CBP también acetila varias proteínas no histonas con consecuencias funcionales. El ejemplo más notable es la acetilación de p53. p300/CBP interactúa directamente con p53 y acetila el supresor de tumores in vivo e in vitro para mejorar su capacidad de activación transcripcional y, en consecuencia, la reparación del ADN.
En determinadas realizaciones, un agente inhibe la expresión y/o actividad de la histona acetil-transferasa (HAT) en comparación con un control normal y/o acetilación excesiva de H3K27, por ejemplo, al menos una diferencia de 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 % en la expresión y/o actividad de HAT en comparación con un control normal. En algunas realizaciones, el agente usado en los métodos y composiciones divulgados en el presente documento es un inhibidor selectivo de la expresión y/o actividad de EP300/proteína de unión a CREB (CBP) medida por la expresión y/o actividad del TGFp. Otros ejemplos no limitantes de inhibidores de la HAT para uso en los métodos y composiciones divulgados en el presente documento incluyen ácido anacárdico, garcinol, curcumina y quinolonas. Véase, por ejemplo, F. Manzo et al., Expert Opin Ther Pat. (6):761-74 (2009).
CBP/P300 es la principal enzima que crea la modificación H3K27ac en las secuencias potenciadoras. En algunas realizaciones, un inhibidor selectivo de la HAT EP300/CBP para uso en los métodos y composiciones divulgados en el presente documento incluye C646 (ácido 4-[(4Z)-4-[[5-(4,5-dimetil-2-nitrofenil)furan-2-il]metiliden]-3-metil-5-oxopirazol-1-il]benzoico) que tiene la siguiente estructura:
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En algunas realizaciones, un inhibidor selectivo de la HAT EP300/CBP para uso en los métodos y composiciones divulgados en el presente documento incluye un ácido anacárdico o un derivado del mismo que tiene la siguiente fórmula:
Figure imgf000010_0002
, en donde R puede ser alquilo sustituido o no sustituido (p. ej., C1-C30, C1-C20, C1-C15, C1-C12, C1-C10 o C1-C8), que pueden ser saturados o insaturados. Por ejemplo, el ácido anacárdico de ejemplo puede ser
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En algunas realizaciones, un inhibidor selectivo de la HAT EP300/CBP para uso en los métodos y composiciones divulgados en el presente documento incluye garcinol ((1R,5R,7R)-3-(3,4-dihidroxibenzoil)-4-hidroxi-8,8-dimetil-1,7 -bis(3-metil-2-buten-1-il)-5-[(2S)-5-metil-2-(1-metiletenil)-4-hexen-1-il]-bicido[3.3.1] non-3-eno-2,9-diona, camboginol) que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000011_0002
En algunas realizaciones, un inhibidor selectivo de la HAT EP300/CBP para uso en los métodos y composiciones divulgados en el presente documento incluye curcumina ((1E,6E)-1,7-bis (4-hidroxi-3-metoxifenil)-1,6-heptadieno-3,5-diona, (1E,6E)-1,7-bis(4-hidroxi-3-metoxifenil)-1,6-heptadieno-3,5-diona o diferuloilmetano) que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000011_0003
En algunas realizaciones, un inhibidor selectivo de la HAT EP300/CBP para uso en los métodos y composiciones divulgados en el presente documento incluye MB-3 (ácido (2R,3S)-rel-4-metilen-5-oxo-2-propiltetrahidrofurano-3-carboxílico) que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000011_0004
En algunas realizaciones, un inhibidor selectivo de la HAT EP300/CBP para uso en los métodos y composiciones divulgados en el presente documento incluye isotiazolonas que tienen la siguiente estructura:
Figure imgf000012_0001
En algunas realizaciones, un inhibidor selectivo de la HAT EP300/CBP para uso en los métodos y composiciones divulgados en el presente documento incluye quinolonas tales como 2-quinolona o 4-quinolona que tienen las siguientes estructuras:
Figure imgf000012_0002
En algunas realizaciones, un inhibidor selectivo de la HAT EP300/CBP para uso en los métodos y composiciones divulgados en el presente documento incluye CPTH2 (2-[4-(4-clorofenil)-2-tiazolil]hidrazona-ciclopentanona) que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000012_0003
y una sal farmacéuticamente aceptable (p. ej., monoclorhidrato de 2-[4-(4-clorofenil)-2-tiazolil]hidrazonaciclopentanona) de la misma.
En algunas realizaciones, un inhibidor selectivo de la HAT EP300/CBP para uso en los métodos y composiciones divulgados en el presente documento incluye MC2884 (1-bencil-3,5-bis((E)-3-bromobenciliden)piperidin-4-ona) que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000012_0004
En algunas realizaciones, un inhibidor selectivo de la HAT EP300/CBP incluye SPV106 (éster 1,3-dietílico del ácido 2-pentadeciliden-propanodioico) que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000013_0001
En algunas realizaciones, un inhibidor selectivo de la HAT EP300/CBP para uso en los métodos y composiciones divulgados en el presente documento incluye L002 (4-[O-[(4-metoxifenil)sulfonil]oxima]-2,6-dimetil-2,5-ciclohexadien-1,4 -diona) que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000013_0002
En algunas realizaciones, un inhibidor selectivo de la HAT EP300/CBP para uso en los métodos y composiciones divulgados en el presente documento incluye windorphen ((Z)-3-cloro-2,3-bis(4-metoxifenil)acrilaldehído) que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000013_0003
En algunas realizaciones, un inhibidor selectivo de la HAT EP300/CBP para uso en los métodos y composiciones divulgados en el presente documento incluye PU-139 (2-(4-fluorofenil)isotiazol[5,4-b]piridin-3(2H)-ona) que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000013_0004
En algunas realizaciones, un inhibidor selectivo de la HAT EP300/CBP i para uso en los métodos y composiciones divulgados en el presente documento incluye PU-141 (2-[[4-(trifluorometil)fenil]metil]isotiazol[5,4-b]piridin-3(2H)- ona) que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000013_0005
En algunas realizaciones, un inhibidor selectivo de la HAT EP300/CBP para uso en los métodos y composiciones divulgados en el presente documento incluye TH1834 (clorhidrato del ácido 2-[5-(4-{[(2-feniletil)({4-[4-(pirrolidin-1-ilmetil)fenoxi]butil})amino]metil}fenil)-2H-1,2,3,4-tetrazol-2-il]acético) y una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, por ejemplo, diclorhidrato TH1834 que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000014_0001
En algunas realizaciones, un inhibidor selectivo de la HAT EP300/CBP para uso en los métodos y composiciones divulgados en el presente documento incluye A-485 ((1R)-N-[(4-fluorofenil)metil]-2,3-dihidro-5-[[(metilamino)carbonil]amino]-2',4'-dioxo-N-[(1S)-2,2,2-trifluoro-1-metiletil]espiro[1H-inden-1,5'-oxazolidin]-3'-acetamida) que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000014_0002
En algunas realizaciones, un inhibidor selectivo de la HAT EP300/CBP para uso en los métodos y composiciones divulgados en el presente documento incluye I-CBP112 (1-[7-(3,4-dimetoxifenil)-9-[[(3S)-1-metilpiperidin-3-il] metoxi]-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-benzoxazepin-4-il]propan-1-ona) que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000014_0003
En algunas realizaciones, un inhibidor selectivo de la HAT EP300/CBP para uso en los métodos y composiciones divulgados en el presente documento incluye CTPB (N-[4-cloro-3-(trifluorometil)fenil]-2-etoxi-6-pentadecil-benzamida) que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000015_0001
En algunas realizaciones, un inhibidor selectivo de la HAT EP300/CBP para uso en los métodos y composiciones divulgados en el presente documento incluye MG149 (ácido 2-[2-(4-heptilfenil)etil]-6-hidroxibenzoico) que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000015_0002
En algunas realizaciones, un inhibidor selectivo de la HAT EP300/CBP incluye remodelina (4-[2-(2-ciclopentilidenhidrazinil)-4-tiazolil]-benzonitrilo) (4-[2-(2-ciclopentilidenhidrazinil)-4-tiazolil]-benzonitrilo) que tiene lo siguiente estructura:
Figure imgf000015_0003
una de sus sales farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, bromhidrato de 4-[2-(2-ciclopentilidenhidrazinil)-4-tiazolil]-benzonitrilo).
En algunas realizaciones, un inhibidor selectivo de la HAT EP300/CBP incluye EML 425 (5-[(4-hidroxi-2,6-dimetilfenil)metilen]-1,3-bis(fenilmetil)-2,4,6(1H,3H,5H)-niridintriona) que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000015_0004
En algunas realizaciones, un inhibidor selectivo de la HAT EP300/CBP incluye ISOX DUAL ([3-[4-[2-[5-(dimetil-1,2-oxazol-4-il)-1-[2-(morfolin-4-il)etil]-1H-1,3-benzodiazol-2-il]etil]fenoxi]propil]dimetilamina) que tiene la siguiente estructura:
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En algunas realizaciones, un inhibidor selectivo de la HAT EP300/CBP incluye Lys-CoA (trifluoroacetato de S-[2-[[(5S)-5-(acetilamino)-6-amino-6-oxohexil]amino]-2-oxoetil] coenzima A), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo (p. ej., trifluoroacetato), que tiene la siguiente estructura.
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En algunas realizaciones, un inhibidor selectivo de la HAT EP300/CBP incluye SGC-CBP30 (2-[2-(3-cloro-4-metoxifenil)etil]-5-(dimetil-1,2-oxazol-4-il)-1-[(2S )-2-(morfolin-4-il)propil]-1H-1,3-benzodiazol) que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000017_0001
Los agentes útiles en los métodos de la divulgación pueden ser moléculas pequeñas, pero también pueden ser enzimas y/o moléculas de ácido nucleico, p. ej., antisentido, ribozima, o tecnología de interferencia de ARN, p. ej., moléculas de ARNip correspondientes a una porción de la secuencia de nucleótidos que codifica la HAT.
Los polinucleótidos antisentido pueden actuar bloqueando directamente la traducción por hibridación con transcritos de ARNm o degradando dichos transcritos de un gen. La molécula antisentido puede fabricarse de forma recombinante usando al menos una porción funcional de un gen en la orientación antisentido como una región en dirección 3' de un promotor en un vector de expresión. Pueden usarse bases o enlaces químicamente modificados para estabilizar el polinucleótido antisentido al reducir la degradación o aumentar la semivida en el cuerpo (p. ej., metil fosfonatos, fosforotioato, ácidos nucleicos peptídicos). La secuencia de la molécula antisentido puede ser complementaria al sitio de inicio de la traducción (p. ej., entre -10 y 10 de la secuencia de nucleótidos de la diana).
ARNip se refiere al ARN de doble cadena de al menos 20-25 pares de bases que media en la interferencia del ARN (ARNi). El dúplex de ARNip correspondiente a un ARN diana puede formarse mediante transcripción separada de las hebras, transcripción acoplada de un par de promotores con polaridades opuestas, o hibridación de una sola cadena de ARN que tiene una secuencia al menos parcialmente autocomplementaria. Como alternativa, pueden sintetizarse químicamente oligorribonucleótidos en dúplex de al menos aproximadamente 21 a aproximadamente 23 pares de bases (p. ej., un dúplex de 21 ribonucleótidos con salientes 3' de dos ribonucleótidos) siendo toleradas algunas sustituciones con bases modificadas. Los apareamientos erróneos en el centro de la secuencia de ARNip, sin embargo, anulan la interferencia. La región diana de la interferencia del ARN debe transcribirse, preferentemente como una región codificante del gen. La interferencia parece depender de factores celulares (p. ej., ribonucleasa III) que escinden el ARN diana en sitios con una separación de 21 a 23 bases; la posición del sitio de escisión parece estar definida por el extremo 5' del ARNip guía en lugar de su extremo 3'. El cebado por una pequeña cantidad de ARNip puede desencadenar interferencias después de la amplificación por una ARN polimerasa dependiente de ARN.
Nucleasas: Se puede usar cualquier sistema de nucleasa adecuado que incluya, por ejemplo, la familia Argonauta de endonucleasas, nucleasas del tipo repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente espaciadas (CRISPR), nucleasas de dedo de zinc (ZFN), nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN), meganucleasas, otras endo- o exo-nucleasas, o combinaciones de las mismas. Véase Schiffer, 2012, J Virol 88(17):8920-8936, que se incorpora como referencia. En determinadas realizaciones, el sistema es un sistema de nucleasa Argonauta.
CRISPR-Cas: En determinados aspectos, la inhibición de la HAT se puede lograr mediante la administración de ácidos nucleicos inhibidores (p. ej., ARNbc, ARNip, oligonucleótidos antisentido, etc.) dirigidos a inhibir la expresión o actividad de la HAT. También se contempla que los métodos CRISPR-Cas (p. ej., CRISPR-Cas9) se puedan usar para eliminar y reemplazar las mutaciones primarias que ocurren en los genes que codifican reguladores de la biodisponibilidad de TGFp extracelular (FBN1 o GBN), ligandos del TGFp (TGFB2 o TGFB3), efectores de la señalización del TGFp ( tGf BR1, TGFBR2 o SMAD3) o reguladores de la respuesta transcripcional del TGFp (SKI). Dichos métodos se pueden realizar en células de un sujeto in vivo o ex-vivo. También se contempla el uso de cualquier combinación de los anteriores y/u otro inhibidor conocido de HAT o TGFp.
El sistema CRISPR-Cas es conocido en la técnica. Los aspectos no limitativos de este sistema se describen en la patente de EE. UU. n.° 8.697.359, concedida el 15 de abril de 2014, cuyo contenido íntegro se incorpora al presente documento por referencia.
Los ejemplos no limitantes de proteínas Cas incluyen Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (también conocida como Csn1 y Csxl2), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csxl7, Csxl4, Csx1O, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csxl5, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, homólogos de las mismas, o versiones modificadas de las mismas. Estas enzimas son conocidas; por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la proteína Cas9 de S. pyogenes se puede encontrar en la base de datos SwissProt con el número de referencia Q99ZW2. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR sin modificar tiene actividad de escisión del ADN, tales como Cas9. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR es Cas9 y puede ser Cas9 de S. pyogenes o S. pneumoniae. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR dirige la escisión de una o ambas cadenas en la ubicación de una secuencia diana, tal como dentro de la secuencia diana y/o dentro del complemento de la secuencia diana. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR dirige la escisión de una o ambas cadenas a una distancia de aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500 o más pares de bases desde el primer o último nucleótido de una secuencia diana. En algunas realizaciones, un vector codifica una enzima CRISPR que está mutada con respecto a una enzima de tipo silvestre correspondiente, de manera que la enzima CRISPR mutada carece de la capacidad de escindir una o ambas cadenas de un polinucleótido diana que contiene una secuencia diana. Por ejemplo, una sustitución aspartato-a-alanina (D10A) en el dominio catalítico RuvC I de Cas9 de S. pyogenes convierte Cas9 de una nucleasa que escinde ambas cadenas a una nickasa (escinde una sola cadena). Otros ejemplos de mutaciones que hacen de Cas9 una nickasa incluyen, sin limitación, H840A, N854A y N863A. En aspectos de la invención, las nickasas pueden usarse para la edición del genoma mediante recombinación homóloga.
En general, una secuencia guía es cualquier secuencia polinucleotídica que tenga suficiente complementariedad con una secuencia polinucleotídica diana para hibridar con la secuencia diana y dirigir la unión específica de secuencia de un complejo CRISPR a la secuencia diana. En algunas realizaciones, el grado de complementariedad entre una secuencia guía y su secuencia diana correspondiente, cuando se alinea de manera óptima utilizando un algoritmo de alineamiento adecuado, es de aproximadamente o más de aproximadamente 50 %, 60 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97,5 %, 99 % o más. El alineamiento óptimo se puede determinar con el uso de cualquier algoritmo adecuado para alinear secuencias, del que los ejemplos no limitantes incluyen el algoritmo Smith-Waterman, el algoritmo Needleman-Wunsch, algoritmos basados en la Transformación de Burrows-Wheeler (p. ej., el Alineador Wheeler Burrows), ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign (Novocraft Technologies, ELAND (Illumina, San Diego, Calif.), SOAP (disponible en soap.genomics.org.cn), y Maq (disponible en maq.sourceforge.net). En algunas realizaciones, la secuencia diana candidata tiene aproximadamente o más de aproximadamente 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75, o más nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, una secuencia guía tiene menos de aproximadamente 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12 o menos nucleótidos de longitud. La capacidad de una secuencia guía para dirigir la unión específica de la secuencia de un complejo CRISPR a una secuencia diana se puede evaluar mediante cualquier ensayo adecuado. Por ejemplo, los componentes de un sistema CRISPR suficientes para formar un complejo CRISPR, incluyendo la secuencia guía a ensayar, pueden proporcionarse a una célula hospedadora que tenga la secuencia diana correspondiente, tal como por transfección con vectores que codifican los componentes de la secuencia CRISPR, seguida de una evaluación de la escisión preferencial dentro de la secuencia diana, tal como mediante el ensayo Surveyor como se describe en el presente documento. De modo similar, la escisión de una secuencia polinucleotídica diana puede evaluarse en un tubo de ensayo proporcionando la secuencia diana, componentes de un complejo CRISPR, incluyendo la secuencia guía a ensayar y una secuencia guía de control diferente de la secuencia guía de ensayo, y comparando la unión o tasa de escisión en la secuencia diana entre las reacciones de la secuencia guía de ensayo y de control. Son posibles otros ensayos y se les ocurrirán a los expertos en la materia.
Argonautas: Las Argonautas son una familia de endonucleasas que utilizan ácidos nucleicos monocatenarios cortos fosforilados en 5' como guías para escindir las dianas (Swarts, DC et al. The evolutionary journey of Argonaute proteins. Nat. Struct. Mol. Biol. 21, 743-753 (2014)). Similar a Cas9, las Argonautas tienen funciones clave en la represión de la expresión génica y la defensa contra ácidos nucleicos extraños (Swarts, D.C. et al. Nat. Struct. Mol. Biol. 21, 743-753 (2014); Makarova, K.S., et al. Biol. Direct 4, 29 (2009). Molloy, S. Nat. Rev. Microbiol. 11,743 (2013); Vogel, J. Science 344, 972-973 (2014). Swarts, D.C. et al. Nature 507, 258-261 (2014); Olovnikov, I., et al. Mol. Cell 51,594-605 (2013)). Sin embargo, las Argonautas se diferencian de Cas9 en muchos aspectos (Swarts, D.C. et al. Nat. Struct. Mol. Biol.
21, 743-753 (2014)). Cas9 solo existe en procariotas, mientras que las Argonautas se conservan a lo largo de la evolución y existen prácticamente en todos los organismos; aunque la mayoría de las Argonautas se asocian con ARNmc (monocatenarios) y tienen un papel central en el silenciamiento del ARN, algunas Argonautas se unen a los ADNmc y escinden los ADN diana (Swarts, D.C. et al. Nature 507, 258-261 (2014); Swarts, D.C. et al. Nucleic Acids Res. 43, 5120-5129 (2015)). Los a Rn guía deben tener una estructura de hibridación ARN-ARN 3' para una correcta unión a Cas9, aunque no se requiere una estructura secundaria de guías consensuada específica para la unión de Argonauta; mientras que Cas9 solo puede escindir una diana en dirección 5' de un PAM, no hay una secuencia específica en las dianas requerida para Argonauta. Una vez que Argonauta y los guías se unen, afectan a las características fisicoquímicas de cada uno y funcionan como un todo con propiedades cinéticas más típicas de las proteínas de unión a ácidos nucleicos (Salomon, W.E., et al. Cell 162, 84-95 (2015)).
Las proteínas Argonauta suelen tener un peso molecular de ~100 kDa y se caracterizan por un dominio Piwi-Argonaute-Zwille (PAZ) y un dominio PIW i. Los estudios cristalográficos de proteínas Argonauta arqueales y bacterianas revelaron que el dominio PAZ, que también es común a las enzimas Dicer, forma un bolsillo de unión específico para el extremo 3' que sobresale del ARN pequeño con el que se asocia (Jinek y Doudna, (2009) Nature 457, 405-412)). La estructura del dominio PIWI se parece a la de la ARNasa H bacteriana, que se ha demostrado que escinde la cadena de ARN de un híbrido ARN-ADN (Jinek y Doudna, (2009) Nature 457, 405-412)). Más recientemente, se descubrió que la actividad catalítica de los complejos efectores de miARN, también conocida como actividad Slicer, reside en la propia proteína Argonauta.
Los miembros de la subfamilia humana Ago, que consiste en AGO1, AGO2, AGO3 y AGO4, se expresan de forma ubicua y se asocian con miRNA y ARNip. Las proteínas Ago se han conservado en todas las especies, y muchos organismos expresan múltiples miembros de la familia, que van desde uno en Schizosaccharomyces pombe, cinco en Drosophila, ocho en humanos, diez en Arabidopsis a veintisiete en C. elegans (Tolia y Joshua-Tor, (2007) Nat. Chem. Biol. 3, 36-43). Las proteínas Argonauta también están presentes en algunas especies de levaduras en ciernes, incluido Saccharomyces castellii. Se descubrió que S. castellii expresa ARNip que son producidos por una proteína Dicer que difiere de las proteínas Dicer canónicas que se encuentran en los animales, plantas y otros hongos (Drinnenberg et al., (2009) Science 326, 544-550).
Más recientemente, los estudios estructurales se han extendido a la Argonauta de Thermus thermophilus en complejo con una cadena guía únicamente o una cadena de ADN guía y un dúplex de ARN diana. Este análisis reveló que la estructura del complejo está dividida en dos lóbulos. Un lóbulo contiene el dominio PAZ conectado al dominio N-terminal a través de una región enlazadora, L1. El segundo lóbulo consiste en el dominio medio (MID) (ubicado entre los dominios PAZ y PIWI) y el dominio PIWI. El fosfato 5' del ARN pequeño, al que se une Argonauta, está posicionado en un bolsillo de unión específico en el dominio MID (Jinek y Doudna, (2009) Nature 457, 405-412). Los contactos entre la proteína Argonauta y la molécula guía de ADN o ARN están dominados por interacciones con el esqueleto de azúcar-fosfato del ARN pequeño o del ADN; así, las bases de la cadena guía de ARN o ADN están libres para el apareamiento de bases con el ARN diana complementario. La estructura indica que la base del ARNm diana se aparea con la cadena de ADN guía, pero no toca la proteína (Wang et al., (2008a) Nature 456, 921-926; Wang, Y. et al., (2009) Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 1259-1266; Wang et al., (2008b) Nature 456, 209-213).
Las características útiles de las endonucleasas Argonauta, p. ej., la Argonauta Natronobacterium gregoryi (NgAgo) para la edición del genoma incluye lo siguiente: (i) NgAgo tiene una tolerancia baja para el apareamiento erróneo de guía-diana, (ii) los ADNmc cortos fosforilados en 5' son raros en células de mamíferos, lo que minimiza la posibilidad de que los oligonucleótidos celulares guíen erróneamente a NgAgo. (iii) NgAgo sigue una regla de "una guía fiel", es decir, una guía solo se puede cargar cuando la proteína NgAgo está en proceso de expresión, y, una vez cargada, NgAgo no puede intercambiar su ADNg con otro ADNmc libre a 37 °C.
Por consiguiente, en determinadas realizaciones, las endonucleasas Argonauta comprenden aquellas que se asocian con ARN monocatenario (ARNmc) o ADN monocatenario (ADNmc). En determinadas realizaciones, la Argonaute deriva de Natronobacterium gregoryi. En otras realizaciones, la Argonauta de Natronobacterium gregoryi (NgAgo) es una NgAgo de tipo silvestre, una NgAgo modificada, o un fragmento de una NgAgo de tipo silvestre o modificada. La NgAgo puede ser modificada para aumentar la afinidad de unión al ácido nucleico y/o la especificidad, alterar una actividad enzimática y/o cambiar otra propiedad de la proteína. Por ejemplo, los dominios de nucleasa (p. ej., ADNasa) del NgAgo se pueden modificar, eliminar o desactivar.
La secuencia de NgAgo de tipo silvestre puede modificarse. La secuencia de nucleótidos de NgAgo puede modificarse para codificar variantes biológicamente activas de NgAgo y estas variantes pueden tener o pueden incluir, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos que difiere de una NgAgo de tipo silvestre debido a que contiene una o más mutaciones (por ejemplo, una mutación de adición, deleción o sustitución o una combinación de dichas mutaciones). Una o más de las mutaciones de sustitución pueden ser una sustitución (por ejemplo, una sustitución de aminoácidos conservadora). Por ejemplo, una variante biológicamente activa de un polipéptido NgAgo puede tener una secuencia de aminoácidos con al menos o aproximadamente 50 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos o aproximadamente 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia) con un polipéptido NgAgo de tipo silvestre. Las sustituciones de aminoácidos conservadoras normalmente incluyen sustituciones dentro de los siguientes grupos: glicina y alanina; valina, isoleucina, y leucina; ácido aspártico y ácido glutámico; asparagina, glutamina, serina y treonina; lisina, histidina y arginina; y fenilalanina y tirosina. Los restos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de NgAgo pueden ser restos de aminoácidos de origen no natural. Los restos de aminoácidos de origen natural incluyen los codificados naturalmente por el código genético, así como los aminoácidos no convencionales (por ejemplo, aminoácidos que tienen la configuración D en lugar de la configuración L). Los presentes péptidos también pueden incluir restos de aminoácidos que son versiones modificadas de restos convencionales (por ejemplo, puede usarse pirrolisina en lugar de lisina y selenocisteína en lugar de cisteína). Los restos de aminoácidos de origen no natural son aquellos que no se han encontrado en la naturaleza, pero que se ajustan a la fórmula básica de un aminoácido y pueden incorporarse en un péptido. Éstos incluyen el ácido D-aloisoleucina (2R,3S)-2-amino-3-metilpentanoico y el ácido L-ciclopentil glicina (S)-2-amino-2-ciclopentílico acético. Para otros ejemplos, pueden consultarse libros de texto o la web (el Instituto Tecnológico de California mantiene actualmente un sitio en el que se muestran estructuras de aminoácidos no naturales que se han incorporado satisfactoriamente en proteínas funcionales).
Agentes terapéuticos candidatos
Los agentes terapéuticos candidatos pueden seleccionarse usando cualquier número y tipo de ensayos. Por ejemplo, los ensayos de genómica funcional de alto rendimiento se pueden utilizar para identificar moduladores de: la expresión de HAT, la expresión de TGFp, la acetilación de H3K27 o cualquier combinación de las mismas.
Se puede usar cualquier tipo de célula, incluidas las que se han transformado con uno o más vectores que codifican las secuencias de ácido nucleico de TGFp y/o HAT. Normalmente, en tales ensayos, las células se ponen en contacto con un agente terapéutico candidato, tal como, por ejemplo, ADNc, una biblioteca de péptidos aleatorios (codificados por ácidos nucleicos), reactivos antisentido, anticuerpos etc. En los casos en que los agentes comprenden una biblioteca de ADNc, la biblioteca de ADNc puede comprender ADNc sentido, antisentido, de longitud completa y truncados. La biblioteca de péptidos está codificada por ácidos nucleicos. Posteriormente se controla el efecto del agente terapéutico candidato sobre la expresión de TGFp o la inhibición de la expresión y/o actividad de HAT. El efecto del agente se puede validar y distinguir de las mutaciones somáticas, usando, p. ej., expresión regulable del ácido nucleico tal como la expresión de un promotor de tetraciclina.
Las proteínas que interactúan con el péptido o con la proteína codificada por el ADNc (p. ej., potenciadores distales) se pueden aislar utilizando un sistema de dos híbridos de levadura, un sistema de dos híbridos de mamíferos o un sistema de presentación en fagos, etc. Las dianas así identificadas se pueden usar más como cebo en estos ensayos para identificar miembros adicionales de las vías regulables del TGFp, cuyos miembros también son dianas para el desarrollo de fármacos (véase, p. ej., Fields et al., Nature 340:245 (1989); Vasavada et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 88:10686 (1991); Fearon et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:7958 (1992); Dang et al., Mol. Cell. Biol. 11:954 (1991); Chien et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 9578 (1991); y las patentes de EE. UU. números 5.283.173, 5.667.973, 5.468.614, 5.525.490 y 5.637.463.
En una realización preferida, un método para identificar agentes terapéuticos comprende contactar: cultivar una célula aislada que expresa HAT con un agente terapéutico candidato; determinar si (i) el agente modula la expresión de TGFp; y/o (ii) el agente modula la expresión y/o actividad de HAT; y/o (iii) el agente modula la acetilación de H3K27; y/o (iv) el agente es un inhibidor selectivo de la expresión y/o actividad de EP300/proteína de unión a CREB (CBP); y/o (v) el agente normaliza la expresión del repertorio sintético (TSR) de TGFp, o cualquier combinación de los mismos; correlacionar la expresión o actividad de HAT y/o la expresión de TGF en presencia o ausencia de un agente terapéutico candidato en comparación con las células de control, en donde un fármaco se identifica basándose en los resultados terapéuticos deseables.
Otro método adecuado para el diagnóstico y el descubrimiento de fármacos candidatos incluye poner en contacto una muestra de prueba con una célula que expresa HAT, un alelo o fragmento del mismo; y detectar la interacción de la muestra de prueba con secuencias HAT y/o elementos transcripcionales de las mismas, y/o expresión de TGFp, un alelo o fragmento del mismo, y/o acetilación de H3K27. HAT, un alelo o fragmento del mismo, o producto de expresión del mismo, se puede marcar de forma detectable, p. ej. con un componente fluorescente o radiactivo.
En otra realización preferida, una célula de un paciente se aísla y se pone en contacto con una molécula terapéutica candidata. Los genes, productos de expresión de los mismos, se controlan para identificar qué genes o productos de expresión están regulados por el fármaco.
Micromatrices de ácido nucleico: La identificación de una secuencia de ácido nucleico capaz de unirse a una secuencia HAT se puede lograr mediante la inmovilización de una biblioteca de ácidos nucleicos sobre la superficie del sustrato para que cada ácido nucleico único se ubique en una posición definida para formar una matriz. En general, la biblioteca inmovilizada de ácidos nucleicos se expone a una biomolécula o agente candidato en condiciones que favorecen la unión de la biomolécula a los ácidos nucleicos. Las biomoléculas que se unen a aliados no específicos podrían eliminarse por lavado usando condiciones de tampón de suaves a estrictas dependiendo del nivel de especificidad de unión deseado. A continuación, se analizaría la matriz de ácidos nucleicos para determinar qué secuencias de ácidos nucleicos se unían a la biomolécula. Preferentemente, las biomoléculas llevarían una etiqueta fluorescente para uso en la detección de la ubicación de los ácidos nucleicos unidos. Estas moléculas también pueden someterse después a pruebas cruzadas en uno o más ensayos para determinar la expresión y/o función y/o actividad de HAT o cualquier combinación de los mismos.
Para determinar la secuencia de un ácido nucleico desconocido se puede usar un ensayo que usa una matriz inmovilizada de secuencias de ácidos nucleicos; un análisis de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP); un análisis de patrones de expresión génica de una especie, tejido, tipo celular particular, etc.; identificación de genes; etc.
Los usos de diagnóstico adicionales para los oligonucleótidos diseñados a partir de las secuencias que codifican un producto de expresión génica deseado pueden implicar el uso de PCR. Estos oligómeros pueden sintetizarse químicamente, generarse enzimáticamente o producirse in vitro. Los oligómeros contendrán preferentemente un fragmento de un polinucleótido que codifica los productos de expresión, o un fragmento de un polinucleótido complementario a los polinucleótidos, y se emplearán en condiciones optimizadas para la identificación de un gen específico. Los oligómeros también se pueden emplear en condiciones menos estrictas para la detección o cuantificación de secuencias de ADN o ARN estrechamente relacionadas.
En realizaciones adicionales, oligonucleótidos o fragmentos más largos derivados de cualquiera de las secuencias de polinucleótidos, pueden usarse como dianas en una micromatriz. La micromatriz se puede utilizar para controlar la identidad y/o el nivel de expresión de HAT y/o secuencias potenciadoras, genes y transcripciones de genes simultáneamente para identificar cualquier otro gen con el que interactúan genes diana o su producto y/o para evaluar la eficacia de agentes terapéuticos candidatos en la regulación de productos de expresión de genes que median, por ejemplo, en enfermedades o trastornos asociados al TGFp.
Se pueden preparar, utilizar y analizar micromatrices, utilizando métodos conocidos en la técnica (véase, p. ej., Brennan et al., 1995, patente de EE. UU. n.° 5.474.796; Schena et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 10614­ 10619; Baldeschweiler et al., 1995, solicitud PCT WO95/251116; Shalon, et al., 1995, solicitud PCT WO95/35505; Heller et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 2150-2155; y Heller et al., 1997, patente de EE. UU. n.° 5.605.662). En otras realizaciones, una micromatriz comprende péptidos u otras moléculas deseadas que pueden ensayarse para identificar un agente candidato.
Los agentes candidatos incluyen numerosas clases químicas, aunque normalmente son compuestos orgánicos que incluyen pequeños compuestos orgánicos, ácidos nucleicos que incluyen oligonucleótidos y péptidos. Los compuestos orgánicos pequeños pueden tener adecuadamente, p. ej., un peso molecular de más de aproximadamente 40 o 50 pero menos de aproximadamente 2.500. Los agentes candidatos pueden comprender grupos químicos funcionales que interactúan con proteínas y/o ADN.
Los agentes candidatos pueden obtenerse a partir de una amplia variedad de fuentes que incluyen bibliotecas de compuestos sintéticos o naturales. Por ejemplo, se encuentran disponibles numerosos medios para la síntesis aleatoria y dirigida de una gran variedad de compuestos orgánicos y biomoléculas, incluyendo la expresión de oligonucleótidos aleatorizados. Como alternativa, las bibliotecas de compuestos naturales en la forma de extractos bacterianos, fúngicos y animales están disponibles y se producen fácilmente.
La selección de ensayos de agentes terapéuticos de la invención incluye adecuadamente, modelos animales, sistemas basados en células y sistemas no basados en células. Preferentemente, genes identificados, variantes, fragmentos u oligopéptidos de los mismos se utilizan para identificar agentes de interés terapéutico, p. ej., examinando bibliotecas de compuestos o identificando de otro modo compuestos de interés mediante cualquiera de una variedad de técnicas de análisis o cribado de fármacos. El gen, alelo, el fragmento u oligopéptido del mismo empleado en dicho cribado puede estar libre en solución, fijado a un soporte sólido, soportado en una superficie celular, o localizado intracelularmente.
Otra técnica para el cribado de fármacos proporciona un cribado de alto rendimiento de compuestos que tienen una afinidad de unión adecuada a la proteína de interés (véase, p. ej., Geysen et al., 1984, solicitud PCT WO84/03564). En este método, se sintetizan sobre un sustrato sólido grandes cantidades de diferentes compuestos pequeños de prueba. Los compuestos de prueba se hacen reaccionar con genes identificados, o fragmentos de los mismos, y se lavan. A continuación, las moléculas unidas se pueden detectar por métodos bien conocidos en la técnica. Como alternativa, se pueden usar anticuerpos no neutralizantes para capturar el péptido e inmovilizarlo sobre un soporte sólido.
Los métodos de cribado de la invención comprenden el uso de ensayos de cribado para identificar, a partir de una biblioteca de diversas moléculas, uno o más compuestos que tienen una actividad deseada, p. ej., la actividad histona acetiltransferasa. Un "ensayo de cribado" es un ensayo selectivo diseñado para identificar, aislar y/o determinar la estructura de, compuestos dentro de una colección que tienen una actividad preseleccionada. Por "identificar" se entiende que se aísla un compuesto que tiene una actividad deseable, se determina su estructura química (incluida, entre otras, la determinación de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de ácidos nucleicos y polipéptidos, respectivamente), su estructura, y, además o como alternativa, compuestos purificadores que tienen la actividad seleccionada). Los ensayos bioquímicos y biológicos están diseñados para probar la actividad en una amplia gama de sistemas que van desde interacciones proteína-proteína, catálisis enzimática, unión proteína-molécula pequeña, con las funciones celulares. Dichos ensayos incluyen ensayos automáticos, semiautomáticos y ensayos HTS (cribado de alto rendimiento).
En los métodos HTS, muchos compuestos discretos se prueban preferentemente en paralelo mediante métodos de robótica, automáticos o semiautomáticos para cribar un gran número de compuestos de prueba y detectar una actividad deseada simultáneamente o casi simultáneamente. Es posible ensayar y cribar hasta aproximadamente 6.000 a 20.000, e incluso hasta aproximadamente 100.000 a 1.000.000 compuestos diferentes al día utilizando los sistemas integrados de la invención.
Normalmente en el HTS, las moléculas diana se administran o cultivan con células aisladas con receptores modulados, incluyendo los controles correspondientes.
En una realización, el cribado comprende poner en contacto cada cultivo celular con una biblioteca diversa de compuestos miembros, algunos de los cuales son ligandos de la diana, en condiciones en las que pueden formarse complejos entre la diana y los ligandos, e identificar qué miembros de las bibliotecas están presentes en tales complejos. En otra modalidad no limitativa, el cribado comprende poner en contacto una enzima diana con una biblioteca diversa de compuestos miembros, algunos de los cuales son inhibidores (o activadores) de la diana, en condiciones en las que un producto o un reactivo de la reacción catalizada por la enzima produce una señal detectable. En esta última modalidad, los inhibidores de la enzima diana disminuyen la señal de un producto detectable o aumentan la señal de un reactivo detectable (o viceversa para activadores).
En una realización, la invención proporciona ensayos solubles que usan una secuencia de ácido nucleico HAT o un producto de la misma, o una célula o tejido que expresa una proteína HAT, ya sea natural o recombinante. En otra realización, la invención proporciona ensayos in vitro basados en fase sólida en un formato de alto rendimiento, donde la secuencia de ácido nucleico y/o producto y/o fragmento del mismo, se une a un sustrato de fase sólida. Cualquiera de los ensayos descritos en el presente documento se puede adaptar para el cribado de alto rendimiento, p. ej., unión de ligando, expresión de TGFp2, función potenciadora, estado de acetilación/desacetilación de un elemento potenciador de TGFp2, flujo de marcador de superficie celular de TGFp2, unión de ligandos radiomarcados, flujo de segundo mensajero, p. ej., Ca2+, producción de citocinas, etc.
En los ensayos de alto rendimiento de la invención, ya sea soluble o en estado sólido, es posible cribar hasta varios miles de moduladores o ligandos diferentes en un solo día. Esta metodología se puede utilizar para proteínas. in vitro o para ensayos basados en células o basados en membranas. En particular, se puede utilizar cada pocillo de una placa de microtitulación para realizar un ensayo separado contra un modulador potencial seleccionado o, si se van a observar los efectos de la concentración o del tiempo de incubación, cada 5-10 pocillos pueden analizar un solo modulador. Así, una sola placa de microtitulación estándar puede analizar aproximadamente 100 (por ejemplo, 96) moduladores. Si se usan placas de 1536 pocillos, entonces una sola placa puede analizar fácilmente de aproximadamente 100 a aproximadamente 1500 compuestos diferentes. Es posible analizar muchas placas por día; son posibles cribados de ensayo de hasta aproximadamente 6.000, 20.000, 50.000 o más de 100.000 compuestos diferentes usando los sistemas integrados de la invención.
Para una reacción en estado sólido, la proteína de interés o un fragmento de la misma, p. ej., un dominio extracelular, o una célula o membrana que comprende la proteína de interés o un fragmento de la misma como parte de una proteína de fusión puede unirse al componente en estado sólido, directa o indirectamente, mediante enlace covalente o no covalente, p. ej., mediante una etiqueta. La etiqueta puede ser cualquiera de una diversidad de componentes. En general, una molécula que se une a la etiqueta (un enlazador de etiqueta) se fija a un soporte sólido, y la molécula etiquetada de interés se une al soporte sólido por interacción de la etiqueta y el enlazador de etiqueta. Se pueden usar varias etiquetas y enlazadores de etiqueta, basándose en interacciones moleculares conocidas, bien descritas en la literatura. De modo similar, se puede usar cualquier compuesto hapténico o antigénico en combinación con un anticuerpo adecuado para formar un par etiqueta/enlazador de etiqueta. Miles de anticuerpos específicos están disponibles en el mercado y muchos anticuerpos adicionales se describen en la literatura.
Los polímeros sintéticos, tales como poliuretanos, poliésteres, policarbonatos, poliureas, poliamidas, polietilenoiminas, poliarilen sulfuros, polisiloxanos, poliimidas y poliacetatos también pueden formar una etiqueta o un enlazador de etiqueta apropiado. Muchos otros pares de etiqueta/enlazador de etiqueta son también útiles en los sistemas de ensayo descritos en el presente documento, como sería evidente para un experto tras la revisión de esta divulgación.
Los enlazadores comunes tales como péptidos, poliéteres y similares también pueden servir como etiquetas e incluyen secuencias polipeptídicas, tales como secuencias poli-Gly de entre aproximadamente 5 y 200 aminoácidos. Dichos enlazadores flexibles son conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, los enlazadores de poli(etilenglicol) están disponibles en Shearwater Polymers, Inc. Huntsville, Ala. Estos enlazadores tienen opcionalmente enlaces amida, enlaces sulfhidrilo o enlaces heterofuncionales.
Los aglutinantes de etiqueta se fijan a sustratos sólidos usando cualquiera de una diversidad de métodos actualmente disponibles. Los sustratos sólidos se derivatizan o funcionalizan comúnmente exponiendo toda o una porción del sustrato a un reactivo químico que fija un grupo químico a la superficie que es reactiva con una porción del enlazador de etiqueta. Por ejemplo, los grupos que son adecuados para unirse a una porción de cadena más larga incluirían grupos amina, hidroxilo, tiol y carboxilo. Los aminoalquilsilanos y los hidroxialquilsilanos pueden usarse para funcionalizar una diversidad de superficies, tales como superficies de vidrio. La construcción de dichas matrices de biopolímeros en fase sólida está bien descrita en la literatura. Véase, p. ej., Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963) (que describe la síntesis en fase sólida de, p. ej., péptidos); Geysen et al., J. Immun. Meth. 102:259-274 (1987) (que describe la síntesis de componentes de fase sólida en pins); Frank & Doring, Tetrahedron 44:60316040 (1988) (que describe la síntesis de varias secuencias peptídicas en discos de celulosa); Fodor et al., Science, 251:767-777 (1991); Sheldon et al., Clinical Chemistry 39(4):718-719 (1993); y Kozal et al., Nature Medicine 2(7):753759 (1996) (todos describen matrices de biopolímeros fijados a sustratos sólidos). Los enfoques no químicos para fijar enlazadores de etiquetas a sustratos incluyen otros métodos comunes, tal como calor, reticulación por radiación UV, y similares.
Bibliotecas químicas: Los desarrollos en química combinatoria permiten la síntesis rápida y económica de cientos a miles de compuestos discretos. Estos compuestos normalmente se organizan en bibliotecas de tamaño moderado de moléculas pequeñas diseñadas para un cribado eficaz. Los métodos combinatorios se pueden utilizar para generar bibliotecas imparciales adecuadas para la identificación de nuevos compuestos. De manera adicional, se pueden generar bibliotecas más pequeñas y menos diversas que descienden de un solo compuesto original con una actividad biológica previamente determinada. En ambos casos, la falta de sistemas de cribado eficientes para dirigirse específicamente a moléculas biológicas terapéuticamente relevantes producidas por química combinatoria, como los inhibidores de enzimas importantes, dificulta el uso óptimo de estos recursos.
Una biblioteca química combinatoria es una colección de diversos compuestos químicos generados por síntesis química o síntesis biológica, mediante la combinación de una serie de "bloques estructurales" químicos tales como reactivos. Por ejemplo, una biblioteca química combinatoria lineal, como una biblioteca de polipéptidos, se forma combinando un conjunto de componentes químicos (aminoácidos) en un gran número de combinaciones, y potencialmente en todas las formas posibles, para una longitud de compuesto determinada (es decir, el número de aminoácidos en un compuesto polipeptídico). Se pueden sintetizar millones de compuestos químicos a través de dicha mezcla combinatoria de componentes químicos básicos.
Una "biblioteca" puede comprender de 2 a 50.000.000 de compuestos miembros diversos. Preferentemente, una biblioteca comprende al menos 48 compuestos diversos, preferentemente 96 o más compuestos diversos, más preferentemente 384 o más compuestos diversos, más preferentemente, 10.000 o más compuestos diversos, preferentemente más de 100.000 miembros diversos y lo más preferentemente más de 1.000.000 de compuestos de miembros diversos. Por "diverso" se entiende que más del 50 % de los compuestos de una biblioteca tienen estructuras químicas que no son idénticas a ningún otro miembro de la biblioteca. Preferentemente, más del 75 % de los compuestos de una biblioteca tienen estructuras químicas que no son idénticas a ningún otro miembro de la colección, más preferentemente superior al 90 % y lo más preferentemente superior a aproximadamente el 99 %.
La preparación de bibliotecas químicas combinatorias es bien conocida por los expertos en la materia. Para consultar revisiones, véase Thompson et al., Synthesis and application of small molecule libraries, Chem Rev 96:555-600, 1996; Kenan et al., Exploring molecular diversity with combinatorial shape libraries, Trends Biochem Sci 19:57-64, 1994; Janda, Tagged versus untagged libraries: methods for the generation and screening of combinatorial chemical libraries, Proc Natl Acad Sci USA. 91:10779-85, 1994; Lebl et al., One-bead-one-structure combinatorial libraries, Biopolymers 37:177-98, 1995; Eichler et al., Peptide, peptidomimetic, and organic synthetic combinatorial libraries, Med Res Rev.
15:481-96, 1995; Chabala, Solid-phase combinatorial chemistry and novel tagging methods for identifying leads, Curr Opin Biotechnol. 6:632-9, 1995; Dolle, Discovery of enzyme inhibitors through combinatorial chemistry, Mol Divers.
2:223-36, 1997; Fauchere et al., Peptide and nonpeptide lead discovery using robotically synthesized soluble libraries, Can J. Physiol Pharmacol. 75:683-9, 1997; Eichler et al., Generation and utilization of synthetic combinatorial libraries, Mol Med Today 1: 174-80, 1995; y Kay et al., Identification of enzyme inhibitors from phage-displayed combinatorial peptide libraries, Comb Chem High Throughput Screen 4:535-43, 2001.
También se pueden usar otras químicas para generar bibliotecas de diversidad química. Tales químicas incluyen, pero no se limitan a, peptoides (publicación PCT n.° WO 91/19735); péptidos codificados (publicación PCT WO 93/20242); bio-oligómeros aleatorios (Publicación PCT n.° WO 92/00091); benzodiazepinas (patente de EE. UU. n.° 5.288.514); diversómeros, como hidantoínas, benzodiazepinas y dipéptidos (Hobbs, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 90:6909-6913 (1993)); polipéptidos vinílogos (Hagihara, et al., J. Amer. Chem. Soc. 114:6568 (1992)); peptidomiméticos no peptídicos con andamiaje de beta-D-glucosa (Hirschmann, et al., J. Amer. Chem. Soc., 114:9217-9218 (1992)); síntesis orgánicas análogas de bibliotecas de compuestos pequeños (Chen, et al., J. Amer. Chem. Soc., 116:2661 (1994)); oligocarbamatos (Cho, et al., Science, 261:1303 (1993)); y/o peptidil fosfonatos (Campbell, et al., J. Org. Chem. 59:658 (1994)); bibliotecas de ácidos nucleicos (véase, Ausubel, Berger y Sambrook, todos supra); bibliotecas de ácidos nucleicos peptídicos (véase, p. ej., la patente de EE. UU. n.° 5.539.083); bibliotecas de anticuerpos (véase, p. ej., Vaughn, et al., Nature Biotechnology, 14(3):309-314 (1996) y PCT/US96/10287); bibliotecas de carbohidratos (véase, p. ej., Liang, et al., Science, 274:1520-1522 (1996) y la patente de EE. UU. n.° 5.593.853; bibliotecas de moléculas orgánicas pequeñas (véase, p. ej., benzodiazepinas, Baum C&E News, 18 de enero, página 33 (1993); isoprenoides (patente de EE. UU. n.° 5.569.588); tiazolidinonas y metatiazanonas (patente de EE. UU. n.° 5.549.974); pirrolidinas (patentes de EE.UU. N.° 5.525.735 y 5.519.134); compuestos de morfolino (patente de EE. UU. n.° 5.506.337); benzodiazepinas (patente de EE. UU. n.° 5.288.514); y similares.
Los dispositivos para la preparación de bibliotecas químicas combinatorias están comercializados (véase, p. ej., 357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem. Tech, Louisville Ky., Symphony, Rainin, Woburn, Mass., 433A Applied Biosystems, Foster City, Calif., 9050 Plus, Millipore, Bedford, Mass.). De manera adicional, numerosas bibliotecas combinatorias están comercializadas (véase, p. ej., ComGenex, Princeton, N.J., Asinex, Moscú, Ru, Tripos, Inc., St. Louis, Mo., ChemStar, Ltd., Moscú, RU, 3D Pharmaceuticals, Exton, Pa., Martek Bio sciences, Columbia, Md., etc.).
La detección de alto rendimiento se puede utilizar para medir los efectos de los fármacos en acontecimientos moleculares complejos, p. ej., regulación de la expresión de HAT por uno o una multitud de reguladores transcripcionales de HAT. La fluorescencia multicolor permite analizar múltiples dianas y procesos celulares en una sola pantalla. La correlación cruzada de las respuestas celulares generará una gran cantidad de información necesaria para la validación de dianas y la optimización de prototipos.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para analizar células que comprende proporcionar una serie de ubicaciones que contienen múltiples células en las que las células contienen una o más moléculas indicadoras fluorescentes; escanear múltiples células en cada uno de los lugares que contienen células para obtener señales fluorescentes de la molécula indicadora fluorescente en las células; convertir las señales fluorescentes en datos digitales; y utilizar los datos digitales para determinar la distribución, ambiente o actividad de la molécula indicadora fluorescente dentro de las células.
Un componente importante del nuevo paradigma de descubrimiento de fármacos es una familia en continuo crecimiento de reactivos fluorescentes y luminiscentes que se utilizan para medir la distribución temporal y espacial, contenido y actividad de iones intracelulares, metabolitos, macromoléculas y orgánulos. Las clases de estos reactivos incluyen reactivos de marcaje que miden la distribución y la cantidad de moléculas en células vivas y fijadas, indicadores ambientales que indican acontecimientos de transducción de señales en el tiempo y el espacio, y biosensores de proteínas fluorescentes para medir actividades moleculares diana dentro de las células vivas. Un enfoque multiparamétrico que combina varios reactivos en una sola célula es una herramienta nueva y poderosa para el descubrimiento de fármacos.
Este método se basa en la alta afinidad de las moléculas fluorescentes o luminiscentes por componentes celulares específicos. La afinidad por componentes específicos está gobernada por fuerzas físicas tales como interacciones iónicas, enlace covalente (que incluye fusión quimérica con cromóforos basados en proteínas, fluoróforos y lumíforos), así como interacciones hidrófobas, potencial eléctrico, y, en algunos casos, simple atrapamiento dentro de un componente celular. Las sondas luminiscentes pueden ser moléculas pequeñas, macromoléculas marcadas, o proteínas modificadas genéticamente, que incluyen, pero sin limitarse a quimeras de proteína verde fluorescente.
Los expertos en esta técnica reconocerán una amplia variedad de moléculas indicadoras fluorescentes que se pueden usar en la presente invención, que incluyen, pero no se limita a, biomoléculas marcadas con fluorescencia, como proteínas, fosfolípidos, sondas de hibridación de ARN y ADN. De modo similar, los reactivos fluorescentes sintetizados específicamente con propiedades químicas particulares de unión o asociación se han utilizado como moléculas indicadoras fluorescentes (Barak et al., (1997), J. Biol. Chem. 272:27497-27500; Southwick et al., (1990), Cytometry 11:418-430; Tsien (1989) en Methods in Cell Biology, Vol. 29 Taylor and Wang (eds.), págs. 127-156). Los anticuerpos marcados con fluorescencia son moléculas indicadoras particularmente útiles debido a su alto grado de especificidad para unirse a una única diana molecular en una mezcla de moléculas tan complejas como una célula o un tejido.
Las sondas luminiscentes se pueden sintetizar dentro de la célula viva o se pueden transportar a la célula a través de varios modos no mecánicos, incluida la difusión, transporte facilitado o activo, transporte mediado por secuencias de señales y captación endocítica o pinocítica. Los métodos mecánicos de carga a granel, que son bien conocidos en la técnica, también se puede utilizar para cargar sondas luminiscentes en células vivas (Barber et al. (1996), Neuroscience Letters 207:17-20; Bright et al. (1996), Cytometry 24:226-233; McNeil (1989) en Methods in Cell Biology, Vol. 29, Taylor and Wang (eds.), págs. 153-173). Estos métodos incluyen la electroporación y otros métodos mecánicos como carga con bisturí, carga con cuentas, carga de impacto, carga con jeringa, carga hipertónica e hipotónica. Además, las células pueden modificarse genéticamente para expresar moléculas indicadoras, tal como GFP, acopladas a una proteína de interés como se ha descrito previamente (Chalfie and Prasher Patente de los Estados Unidos n.° 5.491.084; Cubitt et al. (1995), Trends in Biochemical Science 20:448-455).
Una vez en la célula, las sondas luminiscentes se acumulan en su dominio diana como resultado de interacciones específicas y de alta afinidad con el dominio diana u otros modos de direccionamiento molecular como el transporte mediado por secuencias de señales. Las moléculas indicadoras marcadas con fluorescencia son útiles para determinar la ubicación, cantidad y ambiente químico del indicador. Por ejemplo, se puede determinar si el indicador está en un ambiente de membrana lipófila o en un ambiente más acuoso (Giuliano et al. (1995), Ann. Rev. of Biophysics and Biomolecular Structure 24:405-434; Giuliano y Taylor (1995), Methods in Neuroscience 27.1-16). Se puede determinar el entorno de pH del indicador (Bright et al. (1989), J. Cell Biology 104:1019-1033; Giuliano et al. (1987), Anal. Biochem.
167:362-371; Thomas et al. (1979), Biochemistry 18:2210-2218). Se puede determinar si un indicador que tiene un grupo quelante está unido a un ion, como Ca++, o no (Bright et al. (1989), En Methods in Cell Biology, Vol. 30, Taylor and Wang (eds.), págs. 157-192; Shimoura et al. (1988), J. of Biochemistry (Tokyo) 251:405-410; Tsien (1989) en Methods in Cell Biology, Vol. 30, Taylor and Wang (eds.), págs. 127-156).
Los expertos en la materia reconocerán una amplia variedad de formas de medir la fluorescencia. Por ejemplo, algunas moléculas indicadoras fluorescentes presentan un cambio en los espectros de excitación o emisión, algunos presentan transferencia de energía de resonancia donde un indicador fluorescente pierde fluorescencia, mientras que un segundo gana en fluorescencia, algunos presentan una pérdida (extinción) o apariencia de fluorescencia, mientras que algunos indican movimientos de rotación (Giuliano et al. (1995), Ann. Rev. of Biophysics and Biomol. Structure 24:405-434; Giuliano et al. (1995), Methods in Neuroscience 27:1-16).
Todo el procedimiento se puede automatizar por completo. Por ejemplo, el muestreo de materiales de muestra se puede lograr con una pluralidad de etapas, que incluyen extraer una muestra de un recipiente de muestra y dispensar al menos una parte de la muestra extraída al cultivo celular de ensayo (p. ej., un cultivo celular en donde se regula la expresión génica). El muestreo también puede incluir etapas adicionales, particular y preferentemente, etapas de preparación de la muestra. En un enfoque, solo se extrae y coloca una muestra en la sonda del muestreador automático a la vez y solo una muestra reside en la sonda a la vez. En otras realizaciones, se pueden extraer y colocar múltiples muestras en la sonda del muestreador automático separadas por disolventes. En otras realizaciones más, se pueden utilizar varias sondas en paralelo para el muestreo automático.
En el caso general, el muestreo puede efectuarse manualmente, de forma semiautomática o de forma automática. Se puede extraer una muestra de un contenedor de muestra manualmente, por ejemplo, con una pipeta o con una sonda manual tipo jeringa, y después dispensarla manualmente a un puerto de carga o un puerto de inyección de un sistema de caracterización. En un protocolo semiautomático, algún aspecto del protocolo se efectúa automáticamente (p. ej., la dispensación), pero algún otro aspecto requiere intervención manual (p. ej., la extracción de muestras de una línea de control de proceso). Preferentemente, sin embargo, la(s) muestra(s) se extrae(n) de un contenedor de muestras y se envía(n) al sistema de caracterización, de forma totalmente automatizada, por ejemplo, con un muestreador automático.
Marcadores: El marcador particular o resto detectable o etiqueta usado en el ensayo no es un aspecto crítico de la invención. El grupo detectable puede ser cualquier material que tenga una propiedad física o química detectable. Dichos marcadores detectables están bien desarrollados en el campo de los inmunoensayos y, en general, la mayoría de los marcadores útiles en tales métodos se pueden aplicar a la presente invención. Así, un marcador es cualquier composición detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos o químicos. Los marcadores útiles en la presente invención incluyen perlas magnéticas (p. ej., DYNABEADS™), tintes fluorescentes (p. ej., isotiocianato de fluoresceína, rojo Texas, rodamina, y similares), radiomarcadores (p. ej. 3H, 125I, 35S, 14C o 32P), enzimas (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina y otros habitualmente utilizados en un ELISA) y marcadores colorimétricos tales como oro coloidal, o perlas de vidrio o plástico coloreadas (p. ej., poliestireno, polipropileno, látex, etc.).
El marcador puede acoplarse directa o indirectamente al componente deseado del ensayo de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica. Tal como se ha indicado anteriormente, puede usarse una amplia variedad de marcadores, donde la selección del marcador depende de la sensibilidad necesaria, la facilidad de conjugación con el compuesto, los requisitos de estabilidad, la instrumentación disponible y las provisiones de eliminación.
Los marcadores no radioactivos frecuentemente están unidos por medios indirectos. Generalmente, una molécula de ligando (por ejemplo, biotina) está covalentemente unida a la molécula. Seguidamente, el ligando se une a otras moléculas (por ejemplo, estreptavidina), que bien es detectable inherentemente o bien está unida covalentemente a un sistema de señalización, tal como una enzima detectable, un compuesto fluorescente o un compuesto quimioluminiscente.
Las moléculas también se pueden conjugar directamente con compuestos generadores de señal, p. ej., mediante la conjugación con una enzima o fluoróforo. Se puede usar cualquier tipo de marcador enzimático siempre que no interfiera con uno de los resultados deseados del ensayo, p. ej., la expresión de HAT y/o función potenciadora y/o estado de acetilación/desacetilación de un elemento potenciador de compuestos fluorescentes de HAT incluyen fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, etc. Los compuestos quimioluminiscentes incluyen luciferina y 2,3-dihidroftalazindionas, p. ej., luminol. Para una revisión de los diversos sistemas de marcaje y producción de señales que se pueden usar, véase la patente de EE. UU. N.° 4.391.904.
Los medios para obtener marcadores detectables son bien conocidos de los expertos en la materia. Así, por ejemplo, cuando el marcador es un marcador radiactivo, los medios de detección incluyen un contador de centelleo o una película fotográfica como en la autorradiografía. Cuando el marcador es un marcador fluorescente, se puede detectar por excitación del fluorocromo con la longitud de onda de la luz adecuada, y detección de la fluorescencia resultante. La fluorescencia se puede detectar visualmente, mediante una película fotográfica, mediante el uso de detectores electrónicos tales como dispositivos de carga acoplada (CCD) o fotomultiplicadores y similares. De modo similar, los marcadores enzimáticos se pueden detectar proporcionando los sustratos adecuados para la enzima y la detección del producto de reacción resultante. Por último, los marcadores colorimétricos simples se pueden detectar simplemente observando el color asociado al marcador. Así, en varios ensayos con tiras reactivas, el oro conjugado aparece frecuentemente de color rosa, mientras que diferentes perlas conjugadas aparecen con el color de la perla.
Métodos de tratamiento
Tal como se usan en el presente documento, la expresión "enfermedad, trastorno y/o afección asociado al TGFp" significa cualquier enfermedad, trastorno y/o afección que se ha identificado o puede identificarse como asociado a la expresión y/o actividad alterada del TGFp.
Los agentes y las composiciones farmacéuticas de la divulgación se pueden administrar a un sujeto para tratar o prevenir enfermedades, trastornos y afecciones asociados con la expresión o actividad aberrante del TGFp. En una realización, los agentes y composiciones farmacéuticas se usan para tratar o prevenir el síndrome de aneurisma aórtico y/o trastornos asociados al mismo. Los ejemplos de un síndrome de aneurisma aórtico comprenden el síndrome de Shprintzen-Goldberg (SSG), Síndrome de Marfan (SMF), Síndrome de Loeys-Dietz (SLD), Síndrome de Ehlers-Danlos (SED), disección aórtica familiar o ectasia anuloaórtica.
En una realización, los agentes o composiciones farmacéuticas se administran en una cantidad eficaz usando un programa de dosificación determinado por un proveedor médico para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno descrito en el presente documento. Los agentes o composiciones farmacéuticas se pueden administrar de diversas formas, como se describe en el presente documento y es conocido por un experto en la materia.
En un aspecto, la divulgación proporciona un método para tratar o prevenir en un sujeto, una enfermedad o afección asociada con la expresión o actividad aberrante del TGFp, o un producto génico del mismo, administrando al sujeto un agente que modula la expresión y/o actividad de la HAT. Los sujetos con riesgo de padecer una enfermedad que es causada o contribuye a la expresión o actividad aberrante del TGFp, o un producto génico del mismo, pueden ser identificados mediante, por ejemplo, cualquiera o una combinación de ensayos de diagnóstico o pronóstico como se describe en el presente documento.
La administración de un agente profiláctico puede ocurrir antes de la manifestación de los síntomas característicos de la aberración de la expresión o actividad de la HAT y/o el TGFp, de modo que se prevenga una enfermedad o trastorno o, como alternativa, se retrase su progresión.
Otro aspecto de la divulgación se refiere a métodos de modulación de la expresión o actividad de un regulador de la HAT, con fines terapéuticos. Por consiguiente, en un ejemplo de realización, el método modulador de la divulgación implica poner en contacto una célula con un agente que modula una o más de las actividades de la HAT. Un agente que modula la expresión o actividad de la HAT puede ser un agente como se describe en el presente documento, tal como una molécula pequeña, un ácido nucleico o un polipéptido. En una realización, el agente inhibe una o más actividades de la HAT. Estos métodos de modulación se pueden realizar in vitro (p. ej., cultivando la célula con el agente) o, como alternativa, in vivo (p. ej., administrando el agente a un sujeto). De esta manera, la presente divulgación proporciona métodos para tratar a un individuo afectado por una enfermedad o trastorno caracterizado por una expresión aberrante del TGFp, p. ej., síndrome de aneurisma aórtico y/o trastornos asociados del mismo. En una realización, el método implica administrar un agente, o una combinación de agentes que modulan. En ciertas realizaciones, un método para tratar a un sujeto que tiene o está en riesgo de desarrollar una enfermedad, trastorno y/o afección asociado al factor de crecimiento transformante p, comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de uno o más agentes que modulan la expresión del factor de crecimiento transformante p (TGFp) mediante la modulación de la expresión y/o actividad de la histona acetiltransferasa (HAT), tratando de esta manera al sujeto.
La divulgación proporciona además kits que comprenden agentes o composiciones farmacéuticas de la divulgación e instrucciones de uso. En una realización, los kits de la divulgación son para el tratamiento de enfermedades y trastornos caracterizados por una expresión aberrante del TGFp.
Composiciones farmacéuticas de la invención
Los agentes descritos en el presente documento se pueden formular en composiciones farmacéuticas para el tratamiento de enfermedades, trastornos y afecciones divulgados en el presente documento. La expresión "composición farmacéutica" incluye preparaciones adecuadas para la administración a mamíferos, p. ej., seres humanos. Cuando los compuestos usados en los métodos de la presente divulgación se administran como productos farmacéuticos a mamíferos, p. ej., seres humanos, pueden administrarse tal cual o en forma de una composición farmacéutica que contiene, por ejemplo, del 0,1 al 99,5 % (más preferentemente, del 0,5 al 90 %) de principio activo junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" está reconocida en la técnica e incluye un material farmacéuticamente aceptable, una composición o un vehículo, adecuado para la administración de compuestos de la presente divulgación a mamíferos. Los vehículos incluyen cargas líquidas o sólidas, diluyente, excipiente, disolvente o material encapsulante, implicados en portar o transportar el agente objeto de un órgano, o parte del organismo, a otro órgano o parte del cuerpo. Cada vehículo debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la formulación y no ser perjudicial para el paciente. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen: azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones, tales como almidón de maíz y almidón de patata; celulosa y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa de sodio, etilcelulosa y acetato de celulosa; goma de tragacanto en polvo; malta; gelatina; talco; excipientes, tales como manteca de cacao y ceras para supositorios; aceites, tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; glicoles, tales como propilenglicol; polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; ésteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agar; agentes tamponantes, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; ácido algínico; agua apirógena; solución salina isotónica; solución de Ringer; alcohol etílico; soluciones de tampón fosfato; y otras sustancias compatibles no tóxicas empleadas en formulaciones farmacéuticas.
Los agentes humectantes, emulsionantes y lubricantes, tales como lauril sulfato de sodio y estearato de magnesio, así como agentes colorantes, agentes de liberación, agentes de recubrimiento, edulcorantes, agentes aromatizantes y perfumantes, conservantes y antioxidantes también pueden estar presentes en las composiciones.
Los ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen: antioxidantes solubles en agua, tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y similares; antioxidantes solubles en aceite, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, a-tocoferol y similares; y agentes quelantes de metales, tales como ácido cítrico, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico y similares.
Las formulaciones de la presente divulgación incluyen las adecuadas para la administración oral, nasal, tópica, transdérmica, bucal, sublingual, rectal, vaginal y/o parenteral. Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en una forma farmacéutica unitaria y se pueden preparar mediante cualquier método bien conocido en la técnica de farmacia. La cantidad de principio activo que puede combinarse con un material de vehículo para producir una forma de monodosis, en general, será aquella cantidad del compuesto que produce un efecto terapéutico. Generalmente, de un cien por ciento, esta cantidad variará de aproximadamente un 1 por ciento a aproximadamente un noventa y nueve por ciento de principio activo, preferentemente de aproximadamente un 5 por ciento a aproximadamente un 70 por ciento, lo más preferentemente de aproximadamente un 10 por ciento a aproximadamente un 30 por ciento.
Los métodos para preparar estas formulaciones o composiciones incluyen la etapa de asociar un compuesto de la presente divulgación con el vehículo y, opcionalmente, uno o más ingredientes accesorios. En general, las formulaciones se preparan asociando de manera uniforme e íntima un compuesto de la presente divulgación con vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos o ambos y a continuación, si es necesario, dando forma al producto.
Las formulaciones de la divulgación adecuadas para administración oral pueden estar en forma de cápsulas, obleas, píldoras, comprimidos, pastillas para chupar (utilizando una base aromatizada, normalmente sacarosa y goma arábiga o goma de tragacanto), polvos, gránulos o en forma de una solución o una suspensión en un líquido acuoso o no acuoso o en forma de una emulsión líquida de aceite en agua o de agua en aceite o en forma de un elixir o jarabe o en forma de pastillas (usando una base inerte, tal como gelatina y glicerina o sacarosa y goma arábiga) y/o en forma de colutorios y similares, conteniendo cada uno una cantidad predeterminada de un compuesto de la presente divulgación como principio activo. Un compuesto de la presente divulgación también puede administrarse en forma de un bolo, electuario o pasta.
En formas farmacéuticas sólidas de la divulgación para administración oral (cápsulas, comprimidos, píldoras, grageas, polvos, gránulos y similares), el principio activo se mezcla con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables, tales como citrato de sodio o fosfato dicálcico y/o cualquiera de los siguientes: cargas o expansores, tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y/o ácido silícico; aglutinantes, tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarosa y/o goma arábiga; humectantes, tales como glicerol; agentes disgregantes, tales como agar-agar, carbonato de calcio, almidón de patata o tapioca, ácido algínico, determinados silicatos y carbonato de sodio; agentes retardantes de la disolución, tales como parafina; aceleradores de la absorción, tales como compuestos de amonio cuaternario; agentes humectantes, tales como, por ejemplo, alcohol cetílico y monoestearato de glicerol; absorbentes, tales como caolín y arcilla de bentonita; lubricantes, tales como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, laurilsulfato de sodio y mezclas de los mismos; y agentes colorantes. En el caso de las cápsulas, comprimidos y píldoras, las composiciones farmacéuticas también pueden comprender agentes tamponantes. También pueden emplearse composiciones sólidas de un tipo similar como cargas en cápsulas de gelatina blanda y dura usando excipientes tales como lactosa o azúcares de la leche, así como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares.
Un comprimido se puede preparar por compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más ingredientes auxiliares. Los comprimidos prensados pueden prepararse usando un aglutinante (por ejemplo, gelatina o hidroxipropilmetilcelulosa), lubricante, diluyente inerte, conservante, disgregante (por ejemplo, glicolato sódico de almidón o carboximetilcelulosa de sodio reticulada), tensioactivo o dispersante. Los comprimidos moldeados pueden prepararse moldeando en una máquina adecuada una mezcla del compuesto en polvo humedecido con un diluyente líquido inerte.
Los comprimidos y otras formas farmacéuticas sólidas de las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación, tales como grageas, cápsulas, píldoras y gránulos, pueden ranurarse opcionalmente o se pueden preparar con recubrimientos y cubiertas, tales como recubrimientos entéricos y otros recubrimientos bien conocidos en la técnica de la formulación farmacéutica. También se pueden formular para proporcionar una liberación lenta o controlada del principio activo usando, por ejemplo, hidroxipropilmetilcelulosa en proporciones variables para proporcionar el perfil de liberación deseado, otras matrices poliméricas, liposomas y/o microesferas. Se pueden esterilizar mediante, por ejemplo, filtración a través de un filtro de retención de bacterias o incorporando agentes esterilizantes en forma de composiciones sólidas estériles que pueden disolverse en agua estéril o algún otro medio inyectable estéril inmediatamente antes de su uso. Estas composiciones también pueden contener opcionalmente agentes opacificantes y pueden ser de una composición en la que solamente liberan el o los principios activos o, preferentemente, en una determinada parte del tracto gastrointestinal, opcionalmente, de manera retardada. Los ejemplos de composiciones de inclusión que pueden usarse incluyen sustancias poliméricas y ceras. El principio activo también puede estar en forma microencapsulada, si se considera apropiado, con uno o más de los excipientes descritos anteriormente.
Las formas farmacéuticas líquidas para la administración oral de los compuestos de la divulgación incluyen emulsiones, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables. Además del principio activo, las formas farmacéuticas líquidas pueden contener diluyentes inertes usados habitualmente en la técnica, tales como, por ejemplo, agua u otros disolventes, agentes solubilizantes y emulsionantes, tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, aceites (en particular, semillas de algodón, cacahuete, maíz, germen, olivo, ricino y sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurílico, polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos de sorbitán, y sus mezclas.
Además de diluyentes inertes, las composiciones orales también pueden incluir adyuvantes tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspensión, edulcorantes, aromatizantes, colorantes, perfumantes y conservantes.
Las suspensiones, además de los compuestos activos, pueden contener agentes de suspensión como, por ejemplo, alcoholes isoestearílicos etoxilados, polioxietilensorbitol y ésteres de sorbitán, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar y goma de tragacanto y sus mezclas.
Las formulaciones de las composiciones farmacéuticas de la divulgación para administración rectal o vaginal pueden presentarse en forma de un supositorio, que puede prepararse mezclando uno o más compuestos de la divulgación con uno o más excipientes o vehículos no irritantes adecuados que comprenden, por ejemplo, manteca de cacao, polietilenglicol, una cera o un salicilato para supositorio y que es sólido a temperatura ambiente, pero líquido a temperatura corporal y, por lo tanto, se fundirá en el recto o la cavidad vaginal y liberará el compuesto activo.
Las formulaciones de la presente divulgación que son adecuadas para administración vaginal también incluyen pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones en pulverización que contienen dichos vehículos que se conoce en la técnica que son apropiados.
Las formas farmacéuticas para administración tópica o transdérmica de un compuesto de la presente divulgación incluyen polvos, pulverizaciones, pomadas, pastas, cremas, lociones, geles, soluciones, parches e inhaladores. El compuesto activo puede mezclarse en condiciones estériles con un vehículo farmacéuticamente aceptable y con cualquier conservante, tampón o propulsor que pueda ser necesario.
Las pomadas, pastas, cremas y geles pueden contener, además del compuesto activo de la presente divulgación, excipientes, tales como grasas animales y vegetales, aceites, ceras, parafinas, almidón, goma de tragacanto, derivados de celulosa, polietilenglicoles, siliconas, bentonitas, ácido silícico, talco y óxido de cinc o mezclas de los mismos.
Los polvos y pulverizaciones pueden contener, además de un compuesto de la presente divulgación, excipientes tales como lactosa, talco, ácido silícico, hidróxido de aluminio, silicatos de calcio y polvo de poliamida o mezclas de estas sustancias. Los pulverizadores pueden contener además propulsores habituales, tales como clorofluorohidrocarburos e hidrocarburos sin sustituir volátiles, tales como butano y propano.
Los parches transdérmicos tienen la ventaja añadida de proporcionar el suministro controlado de un compuesto de la presente divulgación al organismo. Tales formas de dosificación pueden prepararse disolviendo o dispersando el compuesto en el medio apropiado. También pueden usarse potenciadores de la absorción para aumentar el flujo del compuesto a través de la piel. La velocidad de tal flujo puede controlarse proporcionando una membrana controladora de velocidad o dispersando el compuesto activo en una matriz polimérica o gel.
Las formulaciones oftálmicas, pomadas oculares, polvos, soluciones y similares, también se contemplan que están dentro del alcance de la presente divulgación.
Las composiciones farmacéuticas de esta divulgación adecuadas para la administración parenteral comprenden uno o más compuestos de la divulgación en combinación con una o más soluciones acuosas o no acuosas isotónicas estériles farmacéuticamente aceptables, dispersiones, suspensiones o emulsiones o polvos estériles que se pueden reconstituir en soluciones o dispersiones inyectables estériles justo antes de su uso, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos, solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor previsto o agentes de suspensión o espesantes.
Ejemplos de vehículos acuosos y no acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmacéuticas de la divulgación incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares) y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en caso de dispersiones, y mediante el uso de tensioactivos.
Estas composiciones también pueden contener adyuvantes tales como agentes conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la acción de microorganismos puede asegurarse por la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, fenol de ácido sórbico y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro sódico y similares en las composiciones. De manera adicional, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable se puede llevar a cabo mediante la inclusión de agentes que retarden la absorción, tales como monoestearato de aluminio y gelatina.
En algunos casos, a fin de prolongar el efecto de un fármaco, es deseable ralentizar la absorción del fármaco mediante inyección subcutánea o intramuscular. Esto puede lograrse mediante el uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo que tiene poca solubilidad en agua. La velocidad de absorción del fármaco depende por tanto de su velocidad de disolución que, a su vez, puede depender del tamaño del cristal y de la forma cristalina. Como alternativa, la absorción retardada de una forma de fármaco administrada por vía parenteral se logra mediante la disolución o suspensión del fármaco en un vehículo oleoso.
Las formas de depósito inyectables se preparan formando matrices microencapsuladas de los compuestos en cuestión en polímeros biodegradables tales como poliláctido-poliglicólido. Dependiendo de la relación entre el fármaco y el polímero y de la naturaleza del polímero particular empleado, puede controlarse la velocidad de liberación del fármaco. Los ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen poli(ortoésteres) y poli(anhídridos). Las formulaciones inyectables de depósito también se preparan atrapando el fármaco en liposomas o microemulsiones que son compatibles con tejido corporal.
Las preparaciones de la presente divulgación pueden administrarse por vía oral, parenteral, tópica o rectal. Por supuesto, se proporcionan mediante formas adecuadas para cada vía de administración. Por ejemplo, se administran en forma de comprimidos o cápsulas, mediante inyección, inhalación, loción ocular, pomada, supositorio, etc.; administración por inyección, infusión o inhalación; tópica en una loción o pomada; y rectal en supositorios. Se prefiere la administración oral.
Las expresiones "administración parenteral" y "administrado/a por vía parenteral", tal como se usan en el presente documento, se refieren a modos de administración distintos de la administración entérica y tópica, habitualmente mediante inyección e incluyen, sin limitación, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intrarraquídea e intraesternal e infusión.
Las expresiones "administración sistémica", "administrado/a por vía sistémica", "administración periférica" y "administrado/a por vía periférica", tal como se usan en el presente documento, significan la administración de un compuesto, fármaco u otro material distinto de directamente en el sistema nervioso central, de manera que entra en el sistema del paciente y, así, se somete al metabolismo y otros procesos similares, por ejemplo, administración subcutánea.
Estos compuestos pueden administrarse a seres humanos y otros animales para el tratamiento por cualquier vía adecuada de administración, incluyendo la vía oral, nasal, tal como, por ejemplo, un atomizador, la vía rectal, intravaginal, parenteral, vía intracisternal y tópica, como mediante polvos, pomadas o gotas, incluyendo la vía bucal y sublingual.
Independientemente de la vía de administración seleccionada, los compuestos de la presente divulgación, que pueden usarse en una forma hidratada adecuada y/o las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación, se formulan en formas farmacéuticas farmacéuticamente aceptables por métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia.
Los niveles reales de dosificación de los principios activos en las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación pueden variarse para obtenerse una cantidad del principio activo que sea eficaz para conseguir la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición y modo de administración particular, sin que sean tóxicos para el paciente.
El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una diversidad de factores incluyendo la actividad del compuesto particular de la presente divulgación empleado o el éster, la sal o la amida del mismo, la vía de administración, el tiempo de administración, la tasa de excreción del compuesto particular que se está empleando, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales usados en combinación con el compuesto particular empleado, la edad, el sexo, el peso, afección, salud general e historial médico previo del paciente que se está tratando y factores similares bien conocidos en las materias médicas.
Un médico o veterinario que tenga experiencia en la materia puede determinar y prescribir fácilmente la cantidad eficaz de la composición farmacéutica necesaria. Por ejemplo, el médico o el veterinario podría empezar con dosis de los compuestos de la divulgación empleados en la composición farmacéutica a niveles inferiores que los requeridos para conseguir el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosificación hasta conseguir el efecto deseado.
En general, una dosis diaria adecuada de un compuesto de la divulgación será aquella cantidad del compuesto que sea la dosis eficaz más baja para producir un efecto terapéutico. Generalmente, tal dosis eficaz dependerá de los factores descritos anteriormente. Generalmente, las dosis intravenosa y subcutánea de los compuestos de la presente divulgación para un paciente, cuando se usan para los efectos analgésicos indicados, variarán de aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 100 mg por kilogramo de peso corporal por día, más preferentemente de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 50 mg por kg por día y aún más preferentemente de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 100 mg por kg por día.
Una cantidad eficaz es aquella cantidad que trata una enfermedad, trastorno o afección expuestos en este documento.
Si se desea, la dosis diaria eficaz del compuesto activo puede administrarse en forma de dos, tres, cuatro, cinco, seis o más subdosis administradas por separado a intervalos apropiados a lo largo del día, opcionalmente, en formas farmacéuticas unitarias.
Si bien es posible que un compuesto de la presente divulgación se administre solo, es preferible administrar el compuesto como una composición farmacéutica.
Ciertos aspectos de la divulgación implican la administración de agentes de ácido nucleico. Los agentes de ácido nucleico se pueden administrar eficazmente a un sujeto como agentes estabilizados, y dicha estabilidad a menudo se proporciona mediante el recubrimiento de nanopartículas lipídicas (LNP) de agentes activos de ácido nucleico y/o modificación de agentes terapéuticos de ácido nucleico con una o más modificaciones estabilizadoras, que incluyen, p. ej., modificaciones de 2'-O-alquilo (incluido 2'-O-metilo), modificaciones 2'-F, modificaciones de la cadena principal, configuraciones de ácido nucleico bloqueado (LNA), modificaciones de GalNAc, conjugados de colesterol, etc. Dichas modificaciones son conocidas en la técnica y pueden ser fácilmente empleadas por el experto en la materia para la administración de los agentes de ácido nucleico de la presente divulgación.
Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes y otras referencias mencionadas en el presente documento se incorporan como referencia en su totalidad. En caso de conflicto, la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones, prevalecerá. De manera adicional, los materiales, los métodos y los ejemplos son solamente ilustrativos y no se pretende que sean limitantes.
Ejemplos
Líneas de ratón
Todos los ratones fueron cuidados bajo estricto cumplimiento del Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Facultad de Medicina de la Universidad Johns Hopkins. Los ratones Ski G34D/+ se generaron por recombinación homóloga como se describe en la siguiente sección.
Las células ES skitm1a(EUCOMM)Hmgu (tm1a representa la mutación dirigida la, y hmgu representa Helmholtz Zentrum Muenchen GmbH) se obtuvieron del Programa Europeo de Mutagénesis Condicional de Ratón y se inyectaron en la cavidad de blastocistos de 3,5 días de ratones C57BL/6J en el centro de transgénica de la Facultad de Medicina de la Universidad Johns Hopkins. Las quimeras macho se aparearon con ratones hembra C57BL/6J de tipo silvestre para establecer la transmisión de la línea germinal. El casete LacZ-Neo se eliminó cruzando con la cepa eliminadora de FlpO (B6.Cg-Tg(Pgkl-flpo)10Sykr/J, n.° 011065) adquirida en Jackson Laboratory y para generar ratones Ski /-, el exón 2 y 3 del gen Ski flanqueado por secuencias loxP se eliminó cruzando con la cepa eliminadora de Cre (B6.C-Tg(CMV-cre)1Cgn/J, n.° 006054) adquirida en Jackson Laboratory, seguido del apareamiento con la cepa C57BL/6J durante al menos cinco generaciones. El esperma de ratón Mef2c-Cre (Tg(Mef2c-cre)2Blk, n.° 030262-UNC) se adquirió de los Centros de recursos regionales de ratones mutantes (MMRRC). Se estableció una colonia después de la rederivación por fertilización in vitro de ovocitos C57BL/6J. Los ratones Wnt1-Cre (B6.Cg-Tg(Wntl-cre)2Sor/J, n.° 022501) y ratones Sm22a-Cre (B6.Cg-Tg(Tag1n-cre)lHer/J, n.° 017491) fueron adquiridos en Jackson Laboratory, seguido del apareamiento con la cepa C57BL/6J durante al menos cinco generaciones. Para minimizar los posibles efectos de fondo de confusión, todas las comparaciones entre genotipos y entre brazos de tratamiento dentro de un genotipo se realizaron entre otros miembros de la camada del mismo género.
Los ratones se revisaron diariamente en busca de evidencia de letalidad prematura. Al final de un ensayo farmacológico, todos los ratones fueron sacrificados mediante inhalación de halotano (Sigma) o anestesiados con isofluorano. Después del sacrificio, los ratones se sometieron a laparotomía inmediata, transección de la aorta abdominal descendente, y se infundió PBS (pH 7,4) por todo el árbol vascular a través del ventrículo izquierdo. Para el corte de la aorta congelada, se infundió de nuevo paraformaldehído al 4 % en PBS para fijar el tejido. Los ratones sacrificados se utilizaron para tres métodos de recogida, infusión de látex para análisis histológico, congelación del corazón y aorta incrustados en un compuesto de temperatura de corte óptimo (compuesto OCT) para la tinción inmunofluorescente y la hibridación in situ y la aorta congelada instantáneamente en nitrógeno líquido.
Para la RT-PCR cuantitativa e inmunoprecipitación de la cromatina, la raíz aórtica y la aorta ascendente (por encima de la raíz aórtica hasta el origen del tronco braquiocefálico derecho) de los ratones recogidas por separado, se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a menos 80 grados centígrados hasta su procesamiento. Para la extracción de ARN, las aortas se homogeneizaron en Trizol (ThermoFisher) mediante FastPrep-24 (MP Biomedicals, LLC.), según el manual del fabricante. Después de la homogeneización, el ARN se extrajo con el RNeasy mini kit (QIAGEN), según el manual del fabricante. A continuación, las muestras de ARN se almacenaron una vez más a menos 80 grados hasta que se realizó el experimento de RT-PCR cuantitativa.
Para el corte de la aorta congelada, la aorta recogida con el corazón se fijó en paraformaldehído fresco al 4 % en PBS a 4 grados durante la noche y luego se colocó en una solución fría de sacarosa al 30 % en PBS y se incubó a 4 grados durante la noche nuevamente. A continuación, el tejido se incrustó en el compuesto O.C.T Tissue-Tek y se congeló instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenó a menos 80 grados hasta que se procesó.
De acuerdo con un protocolo previamente descrito con una ligera modificación (1), a los ratones en los que se analizó la histología aórtica se les infundió látex en el ventrículo izquierdo a través de la aorta abdominal descendente. A continuación, los ratones se fijaron durante 24 horas en formalina tamponada neutra al 10 % y luego se cambiaron a etanol al 70 % hasta que se realizó el análisis histológico.
Generación de ratones Ski G34D/+
Los ratones Ski G34D/+ se generaron por recombinación homóloga. Se generó un fragmento de Ski de 10 kilo-bases por PCR a partir de ADN de células ES de ratón. El amplicón se subclonó en pCR2.1-TOPO (Invitrogen Corp.). La mutagénesis dirigida al sitio se realizó con el In-Fusion HD kit (Clontech Inc.), creando la mutación G34D. El casete Neo se amplificó a partir del vector μMClneo-polyA (Stratagene Inc.) y el fragmento que contenía el sitio de restricción Sail y el casete Neo con secuencias loxP flanqueantes se subclonó en un único sitio Sail en el intrón de Ski después del exón 1. Toda la secuencia del vector de direccionamiento, incluidas las secuencias de los sitios loxP y las mutaciones creadas por mutagénesis dirigida al sitio se confirmaron mediante secuenciación de Sanger. El vector se linealizó utilizando un único sitio (EcoR1) y se sometió a electroporación en células madre embrionarias R1. Los clones positivos se identificaron mediante la prueba de PCR. Los clones positivos se inyectaron en blastocistos 129S6/ScEvTac en el día embrionario 3,5 y se transfirieron a hembras pseudopreñadas. La descendencia quimérica se apareó con ratones C57BL/6J y se observó la transmisión de la línea germinal durante al menos tres acontecimientos de direccionamiento independientes para el genotipo mutante. Todos los exones incluidos y que flanqueaban inmediatamente al vector de direccionamiento se analizaron mediante secuenciación de ADN genómico amplificado por PCR derivado de ratones mutantes para demostrar la fidelidad del direccionamiento. Los ratones fueron genotipados a partir de la creación de un nuevo sitio BamH1 en ratones direccionados correctamente. Los cebadores utilizados para la amplificación fueron 5-GAGCCCGATCG CACCATGGAA-3' (sentido; SEQ ID NO: 1) y 5'-AAGAGATGGTCTCCCCTTCC-3' (antisentido; SEQ ID NO: 2). Para probar la inserción aleatoria del vector diana linealizado, la PCR cuantitativa de la secuencia del casete Neo se realizó con una muestra de ADN previamente verificada que contenía solo una única secuencia del casete Neo. El casete Neo flanqueado por loxP- se eliminó cruzando con la cepa eliminadora de Cre, CMV-Cre(B6.C-Tg (CMV-cre)1Cgn/J, n.° 006054) adquirida en Jackson Laboratory, seguido por el apareamiento con la cepa C57BL/6J durante al menos cinco generaciones para una constitución genética C57BL/6J o Prm-Cre (129S/Sv-Tg(Prm-cre)580g/J, n.° 003328) adquirido en Jackson Laboratory, seguido del apareamiento con la cepa 129S6/ScEvTac durante al menos cinco generaciones para una constitución genética 129S6/ScEvTac. Los ratones Ski G34D/+ con constitución genética 129S6/ScEvTac se usaron para los análisis del fenotipo dérmico, esquelético y cardiovascular y los ratones Ski G34D/+ con constitución genética C57BL/6J se usaron para el análisis del fenotipo conductual. Los ratones Ski G34D/+:Neo se cruzaron con la cepa 129S6/ScEvTac durante al menos cinco generaciones sin eliminación del casete Neo como una línea de ratón separada. La concordancia completa del fenotipo para tres o dos líneas independientes y el retrocruzamiento con cada una de las cepas endogámicas congénicas durante al menos cinco generaciones excluyeron cualquier efecto importante fuera de la diana.
Tratamiento farmacológico de los ratones
C646 (Selleckchem, n.° S7152) se reconstituyó en DMSO al 10 % (Sigma) disuelto en PBS y se administró diariamente mediante inyección intraperitoneal (IP) a una dosis de 5 mg/kg/día. El tratamiento se inició a las 8 semanas de edad y continuó durante 12 semanas. Se administró DMSO al 10 % en PBS como control.
Ecocardiografía de ratón
Se utilizó crema depilatoria Nair para eliminar el pelaje del tórax anterior de los ratones el día anterior a la ecocardiografía. Según lo descrito anteriormente con ligeras modificaciones (1), todas las ecocardiografías se realizaron en ratones que estaban despiertos y sin sedación con el uso del sistema de imágenes Vevo 2100 y el transductor de 40 MHz (Visualsonics). Se tomaron imágenes de los ratones a las 8 semanas de edad como referencia y cada 4 semanas a partir de entonces, hasta las 20 semanas de edad. Se tomaron imágenes de la aorta de los ratones en la vista de eje largo paraesternal. Se realizaron tres mediciones separadas de la dimensión interna máxima en el seno de Valsalva durante la sístole en ciclos cardíacos separados y se promediaron. Todas las imágenes y análisis se realizaron enmascarados en cuanto al genotipo y al brazo de tratamiento.
Presión arterial de los ratones
De acuerdo con lo descrito previamente con ligeras modificaciones (1), la presión arterial se midió mediante pletismografía con manguito de cola usando un dispositivo de manguito de cola no invasivo Harvard Apparatus IITC. Los ratones se colocaron en un inmovilizador acrílico estándar para ratones adultos, diámetro interno de 25 mm con una puerta de cabeza ajustable, y la placa final era extraíble, permitiendo que los ratones caminen hacia el inmovilizador sin fuerza. Los registros hemodinámicos se realizaron sin sedación ni anestesia. La presión arterial se midió al final del ensayo farmacológico. Los ratones se habituaron durante 4 días. Al 5° día, se obtuvieron y promediaron 10 presiones arteriales.
Radiografía de los ratones
De acuerdo con los protocolos descritos anteriormente con ligeras modificaciones (1), los ratones se anestesiaron usando una combinación de 50 mg/kg de ketamina-HCl y 5 mg/kg de xilazina-HCl mediante inyección intraperitoneal (IP) antes de la obtención de imágenes por rayos X. Los ratones se colocaron en la posición de decúbito lateral izquierdo en una plataforma radiotransparente con un clip de metal como barra de escala y se tomaron imágenes con un aumento de 1x usando un Faxitron MX20 (Faxitron).
Análisis histológico de la aorta de ratón
De acuerdo con los protocolos descritos anteriormente con ligeras modificaciones (1), el corazón y la aorta infundidos con látex se extrajeron del cuerpo y se cortaron justo por debajo del nivel del anillo aórtico, y justo por encima de la raíz aórtica, y se montaron cortes transversales de 2-3 mm en 4 % de agar antes de la fijación en parafina. Se sometieron a tinción de Verhoeff-van Giesen (VVG) y tricrómica de Masson cinco cortes aórticos de cinco micrómetros y se tomaron imágenes con un aumento de 40x, utilizando un microscopio Nikon Eclipse E400. Se midió el grosor de la pared aórtica de cuatro sitios de cuatro cortes representativos para cada ratón y se contaron las alteraciones de la arquitectura de la fibra de elastina en cuatro cortes cada 25 micrómetros desde el anillo aórtico. Todos los análisis se realizaron enmascarados en cuanto al genotipo y al brazo de tratamiento y se promediaron los resultados.
Prueba conductual de los ratones
Las pruebas conductuales se realizaron según el manual del fabricante. Todas las pruebas conductuales se realizaron a las 10 semanas de edad. Para la prueba de campo abierto, los ratones se colocaron en una de las esquinas de cada cámara abierta de 45 x 45 cm (San Diego Instruments) con una configuración de haz de luz de 16 x 16 y se controló su comportamiento durante 5 minutos por cada ciclo de 6 ciclos (30 minutos en total). La actividad de los ratones en el área central y/o las actividades periféricas se registraron mediante todas las interrupciones del haz. La actividad total se calculó sumando todas las interrupciones del haz durante los ciclos y la actividad central y la actividad periférica se calcularon sumando las interrupciones del haz en el área central y el área periférica, respectivamente. Para la prueba Rotarod, los ratones se colocaron en un cilindro (rodillo) giratorio orientado horizontalmente y suspendido sobre el piso de la jaula de Rotamex 5 rotarod (Columbus Instruments). La aceleración comenzó a 0 rpm y aumentó en 1,0 rpm cada 5 segundos. La velocidad y el tiempo se registraron en el momento de la caída para tres mediciones. Los ratones tenían 3 minutos de tiempo de descanso entre cada ensayo. Todos los análisis se realizaron enmascarados en cuanto al genotipo y los resultados se promediaron.
Cultivo de células humanas
Los fibroblastos dérmicos humanos primarios se derivaron de biopsias de piel del antebrazo de dos controles y dos pacientes con síndrome de Shprintzen-Goldberg de los descritos anteriormente.2. Los fibroblastos se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con suero bovino fetal (FBS) al 10 % en presencia de antibióticos y confluencia de pases. De acuerdo con los protocolos descritos anteriormente con ligeras modificaciones (2), todos los experimentos de cultivo celular se realizaron en medios privados de suero durante 24 horas antes del tratamiento farmacológico. La estimulación se realizó utilizando 10 ng/ml de TGFp1 humano recombinante (R&D system). C646 disuelto en DMSO se trató a una dosis de 20 μM durante 24 horas de pretratamiento antes de la estimulación con TGFp1 y SD208 disuelto en DMSO se trató a una dosis de 10 μM durante 24 horas de pretratamiento antes de la estimulación con TGFp1. Las células se recogieron al inicio, 6 horas después de la estimulación con TGFp1. El ARN se extrajo de las células usando Trizol (ThermoFisher) mediante el RNeasy mini kit (QIAGEN), según el manual del fabricante.
Análisis de expresión mediante RT-PCR cuantitativa
El ARN total se aisló de aortas de ratón o células cultivadas mediante el RNeasy mini kit (QIAGEN), según el manual del fabricante. La PCR cuantitativa se realizó por triplicado con TaqMan Universal PCR Master Mix usando un aparato ABI Prism 7900 HT QPCR (todas de Applied Biosystems), según el manual del fabricante. Se usaron las siguientes sondas TaqMan prevalidadas para detectar transcritos específicos: Mm00801666_g1 (Collal), Mm01254476_m1 (CoGA7), Mm01256744_m1 (Fn1), Mm04205640_g1 (Cdknla), Mm01192932_g1 (Ctgf), y Mm00435860_m1 (Serpinel), Mm00448744_m1 (Ski), Mm00456917_m1 (Skil), Mm00484742_m1 (Smad7) y Mm00607939_s1 (Actb) (Life Technologies). Para muestras humanas, se utilizaron las siguientes sondas: Hs00943809_m1 (COL3A1), Hs00365052_m1 (FN1), Hs00161707_m1 (SKI), Hs01045418_m1 (SKIL) y Hs01060665_g1 (ACTB). Las reacciones se realizaron por triplicado y la cuantificación relativa de cada transcrito se obtuvo mediante la normalización frente al transcrito de control constitutivo, como p-ACTINA (ACTB) según la fórmula 2'Ct/2'Ct(ACTB).
Análisis de PCR cuantitativa de inmunoprecipitación de cromatina
La inmunoprecipitación de la cromatina se realizó con el EpiQuik Tissue Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Kit (Epigentek) con los siguientes ajustes al protocolo estándar. En resumen, las aortas congeladas instantáneamente se reticularon en paraformaldehído fresco al 1 % en PBS. La sonicación se realizó usando un Bioruptor (Diagenode). Se utilizó el siguiente anticuerpo: H3K27ac (Abcam, ab4729). Los cebadores llevan el nombre de los genes diana putativos proximales de los potenciadores investigados. Para cada elemento genómico probado, se utilizó un conjunto de cebadores. Las secuencias de cebadores de PCR cuantitativa son Col3a1: 5'-AGGGAAGCCAAACTTTTTCC-3' (sentido; SEQ ID NO: 3) y 5'-GAGACTCTTTGTGCAAAAGA-3' (antisentido; SEQ ID NO: 4) y Fn1: 5'-GGAGGTGGAGATGGACTGTA-3' (sentido; SEQ ID NO: 5) y 5'-CGGCATTAACTCTGTACTGT-3' (antisentido; SEQ ID NO: 6). El análisis cuantitativo se realizó con Fast SYBR Green Master Mix (ThermoFisher) usando un aparato ABI Prism 7900 HT QPCR (Applied Biosystems). Las reacciones se realizaron por triplicado y los resultados se calcularon como porcentaje de la entrada.
Tinción de inmunofluorescencia
La tinción de inmunofluorescencia se realizó como se ha descrito anteriormente (3). Se obtuvieron cortes congelados de vista de eje largo de 10 μM con un criostato y se montaron en portaobjetos de vidrio. Los cortes se secaron a temperatura ambiente durante la noche antes de la tinción. Los cortes se permeabilizaron en tampón de tinción (PBS que contenía Triton-X 100 al 0,1 %) durante 30 minutos y a continuación se incubaron con bloque receptor Fc de Innovex durante 30 minutos a temperatura ambiente, se lavaron brevemente en tampón de tinción y luego se incubaron nuevamente en solución de bloqueo (Triton-X 100 al 0,1 %, suero de cabra 1:50, glicina 0,3 M) durante 30 minutos. Los anticuerpos primarios se diluyeron a 1:100 en tampón de tinción y se prepararon antes de la incubación con anticuerpo secundario anti-conejo de cabra conjugado con Alexa Fluor 555 (Life Technologies) a 1:200 durante 1 hora y luego se montó con VECTASHIELD Hard Set Mounting Media con DAPI. Las imágenes se adquirieron en un Zeiss AxioExaminer con un microscopio confocal multifotónico 710NLO-Meta con un aumento de 25x. Se utilizó el siguiente anticuerpo primario: anti-H3K27ac (Abcam, ab4729).
Hibridación in situ del ARN
Se obtuvieron cortes congelados de vista de eje largo de 10 μM con un criostato y se montaron en portaobjetos de vidrio. El ensayo de hibridación del ARN in situ (ISH) se realizó con el RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit (Advanced Cell Diagnostics, Inc.), según el manual del fabricante. En resumen, los cortes congelados se permeabilizaron en el tampón y el ARN de CTGF de los cortes se hibridó con sondas específicas de CTGF (Mm-CTGF-C2, n.° 314541-C2). Las sondas hibridadas se amplificaron con amplificadores y sondas marcadoras proporcionadas por el fabricante y luego se montaron con VECTASHIELD Hard Set Mounting Media con DAPI. Las imágenes se adquirieron en un Zeiss AxioExaminer con un microscopio confocal multifotónico 710NLO-Meta con un aumento de 40x.
Análisis estadístico
Todos los datos cuantitativos se muestran como gráficos de barras producidos usando Microsoft Excel. Se muestran la media ± errores estándar de la media (EEM). Los análisis estadísticos se realizaron utilizando pruebas t de dos colas. Los análisis estadísticos adicionales incluyeron el uso de ANOVA de dos vías para evaluar si había una interacción significativa entre el genotipo de los ratones y el efecto de la medicación. Un valor de p <0,05 se consideró estadísticamente significativo para todas las pruebas.
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Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una cantidad eficaz de un inhibidor de la histona acetil transferasa (HAT) para su uso en el tratamiento o la prevención de un síndrome de aneurisma aórtico en un sujeto que lo necesite.
2. El inhibidor de la HAT para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el sujeto ha sido diagnosticado de un trastorno asociado con la regulación alterada de uno o más genes diana del TGFp.
3. El inhibidor de la HAT para su uso de acuerdo con la reivindicación 2, en donde los genes diana del TGFp codifican reguladores de la biodisponibilidad de TGFp extracelular (FBN1 o GBN), ligandos de TGFp (TGFB2 o TGFB3), efectores de la señalización de TGFp (TGFBR1, TGFBR2 o SMAD3) o reguladores de la respuesta transcripcional de TGFp (SKI).
4. El inhibidor de la HAT para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el síndrome de aneurisma aórtico se selecciona del síndrome de Shprintzen-Goldberg (SSG), Síndrome de Marfan (SMF), Síndrome de Loeys-Dietz (SLD), Síndrome de Ehlers-Danlos (SED), disección aórtica familiar y ectasia anuloaórtica.
5. El inhibidor de la HAT para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el síndrome de aneurisma aórtico es el síndrome de Marfan (SMF).
6. El inhibidor de la HAT para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la cantidad eficaz es una cantidad terapéuticamente eficaz.
7. El inhibidor de la HAT para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el sujeto corre el riesgo de desarrollar un trastorno asociado con la regulación alterada de uno o más genes diana del TGFp.
8. El inhibidor de la HAT para su uso de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la cantidad eficaz es una cantidad profilácticamente eficaz.
9. El inhibidor de la HAT para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde el inhibidor de la HAT es un inhibidor selectivo de la expresión y/o actividad de EP300/CBP.
10. El inhibidor de la HAT para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde el inhibidor de la HAT se selecciona de C646, ácido anacárdico, garcinol, isotiazol-3(2H)-ona, 2-quinolona, 4-quinolona, CPTH2, MC2884, SPV106, L002, windorphen, PU-139, PU-141, TH1834, A-485, I-CBP112, CTPB, MG149, EML, ISOX, Lys-CoA y SGC-CBP30.
11. El inhibidor de la HAT para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde el inhibidor de la HAT es C646.
12. El inhibidor de la HAT para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde el tratamiento o la prevención se realiza mediante la administración sistémica del inhibidor de la HAT.
13. El inhibidor de la HAT para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde el inhibidor de la HAT está presente en una composición farmacéutica en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
14. El inhibidor de la HAT para su uso de acuerdo con la reivindicación 13, en donde la composición farmacéutica comprende además un inhibidor del TGFp.
15. El inhibidor de la HAT para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en donde la regulación de la expresión y/o actividad anormales comprende además el uso de una cantidad eficaz de un inhibidor del TGFp.
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