ES2948767T3 - Moléculas orgánicas pequeñas para uso en el tratamiento de trastornos neuroinflamatorios - Google Patents

Abstract

Esta invención proporciona pequeñas moléculas orgánicas útiles como terapéutica de enfermedades neurodegenerativas. Pequeñas moléculas orgánicas que actúan como inhibidores de las proteínas morfogenéticas óseas (BMP) son útiles en el tratamiento de trastornos neuroinflamatorios, en particular la esclerosis múltiple. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Moléculas orgánicas pequeñas para uso en el tratamiento de trastornos neuroinflamatorios

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] La presente invención se relaciona con el campo de la terapéutica de enfermedades neurodegenerativas y neuroinflamatorias. Las moléculas orgánicas pequeñas que pueden actuar como inhibidores de las proteínas morfogenéticas óseas (PMO) se describen como útiles en el tratamiento de trastornos neuroinflamatorios, en particular la esclerosis múltiple.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0002] La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad desmielinizante ampliamente conocida en la que se daña la mielina, las cubiertas aislantes de las células nerviosas, en el cerebro y la médula espinal [1]. Las proteínas morfogenéticas óseas (PMO) se implicaron como inhibidores de la mielinización durante el desarrollo y los estados patológicos (revisado en [2]).

[0003] El documento WO 2013/186777 [17] divulga composiciones farmacéuticas para el tratamiento de enfermedades neuroinflamatorias o neurodegenerativas que comprenden uno solo o una combinación de varios agentes bloqueantes de la señalización de PMO.

[0004] El documento US 2015/139983 [3] describe métodos para el tratamiento de enfermedades neuroinflamatorias o neurodegenerativas que comprenden un solo anticuerpo o una combinación de varios dirigidos contra PMO-2 y PMO-4.

[0005] El documento US 2008/0249038 [4] divulga un método de alivio o reducción de los síntomas y signos asociados con tejidos neuronales dañados, ya sea como resultado de un traumatismo tisular o de cambios degenerativos crónicos o agudos, utilizando un inhibidor de BMP2A, en particular moléculas de ARNpi o moléculas antisentido.

[0006] Simonini et al. [5] examinó los efectos del agonista GW0742 de PPAR5 (receptores activados por proliferadores de peroxisomas) en las CPO (células progenitoras de oligodendrocitos) y mostró que GW0742 redujo los niveles de ARNm de BMP2 y BMP4 en las CPO, con efectos menores en los astrocitos. Simonini et al. concluyó que PPAR5 juega un papel en la maduración de CPO, mediada, en parte, por la regulación de PMO y antagonistas de PMO.

[0007] Li et al. [6] evaluaron la proliferación de células del hipocampo en la zona subgranular DG (DG-SGZ) y el nivel de ARNm de BMP4 en el ratón transgénico APPsweIPS 1 DeltaE9, un modelo de ratón de la enfermedad de Alzheimer. Los investigadores encontraron una correlación significativa entre un aumento de la expresión del ARNm de BMP4 y una disminución del número de células marcadas con BrdU y sugirieron que el aumento de la expresión del ARNm de BMP4 dentro del DG del hipocampo puede contribuir a la disminución de la proliferación celular en ratones transgénicos APPsweIPS 1 DeltaE9.

[0008] Mabie et al [7] informan que las PMO promueven la diferenciación selectiva dependiente de la dosis de células progenitoras oligodendroglialastrogliales (O-2A) en astrocitos con supresión simultánea de la diferenciación oligodendroglial.

[0009] Gross et al [8] demuestran que las PMO provocan la elaboración selectiva, dependiente de la dosis, del linaje astroglial a partir de células progenitoras multipotentes de la zona subventricular embrionaria (ZSV) murina.

[0010] Gomes et al [9] construyeron ratones transgénicos que sobreexpresan BMP4. La sobreexpresión de BMP4 resultó en un aumento notable en la densidad de astrocitos en múltiples regiones del cerebro acompañado de una disminución en la densidad de oligodendrocitos. No se detectaron cambios en el número de neuronas ni en el patrón de mielinización, y no hubo anomalías estructurales graves. Estas observaciones sugieren que BMP4 dirige a las células progenitoras in vivo a comprometerse con el linaje astrocítico en lugar del oligodendroglial y que las PMO son probablemente mediadores importantes del desarrollo de astrocitos in vivo.

[0011] Lim et al [10] muestran que el antagonista de PMO Noggin se expresa en células ependimales adyacentes a la zona subventricular (ZSV). Se encontró que las células ZSV expresaban PMO así como sus receptores afines. La proteína Noggin de ratón purificada promovió la neurogénesis in vitro e inhibió la diferenciación de células gliales y la Noggin ectópica promovió la diferenciación neuronal de las células ZSV injertadas en el cuerpo estriado. Por lo tanto, los investigadores propusieron que la producción de Noggin ependimal crea un entorno neurogénico en la ZSV adyacente mediante el bloqueo de la señalización endógena de PMO.

[0012] El documento WO 11/019678 [11] describe el uso de isotiazoles para tratar afecciones oculares, por ejemplo, degeneración macular relacionada con la edad. El documento US 2006/217390 [12] divulga cicloalquilo, arilo y heteroaril amino isotiazoles para el tratamiento de la hepatitis C. El documento WO 03/105857 [13] divulga composiciones farmacéuticas que contienen compuestos activos que inhiben la actividad de las quimiocinas, MIP-1 alfa y RANTES. También se refiere a métodos para tratar enfermedades inflamatorias usando estas composiciones farmacéuticas. El documento US 2004/039037 [14] describe compuestos de isotiazol sustituidos dirigidos hacia la inhibición de varias proteínas quinasas (especialmente MEK y/o ERK). También está dirigido a métodos de tratamiento de enfermedades asociadas con anomalías en la función ^m E^k y/o ERK.

[0013] Sanvitale et al. (Caroline E Sanvitale, PLoS One. 8(4):e62721,30 de abril; 2013 describen un inhibidor de molécula pequeña de la señalización de PMO, en particular, mencionan los inhibidores del receptor de la proteína morfogenética ósea quinasa ALK₂ (ACVR1) para el tratamiento de la enfermedad musculoesquelética progresivamente debilitante fibrodisplasia osificante progresiva.

[0014] Sigue existiendo la necesidad de tratamientos mejorados para la esclerosis múltiple.

[0015] Las sustancias que se describirán a continuación para su uso particular pueden ser compuestos generalmente conocidos por los químicos. Como tales, "metil 3-[(2E)-2-[ciano(tiofen-2-ilsulfonil)metilideno]hidrazinil]tiofeno-2-carboxilato" está publicado en la base de datos de Pubchem, 9 de septiembre de 2005; CID 6371770, https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compounds/6371770. La sustancia "4-ciano-3-[(2E)-2-[ciano(tiofen-2-ilsulfonil)metiliden]hidrazinil]tiofeno-2-carboxilato de metilo está publicada en Pubchem Database, 11 de septiembre de 2005; CID 6376145, https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/6376145.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0016] Ahora se describe por primera vez que las moléculas orgánicas pequeñas pueden actuar como inhibidores de las proteínas morfogenéticas óseas (PMO) que incluyen, entre otras, BMP2. Se describe además que las moléculas que se seleccionan sobre la base de su capacidad para inhibir las PMO son útiles en el tratamiento de trastornos neuroinflamatorios, en particular la esclerosis múltiple.

[0017] La invención se define únicamente por el conjunto de reivindicaciones adjunto. El tema descrito más allá del alcance de las reivindicaciones debe considerarse únicamente como ilustración. Las referencias a métodos de tratamiento deben interpretarse como referencias a compuestos o composiciones farmacéuticas de la presente invención para uso en esos métodos, respectivamente.

[0018] Según algunos aspectos de la invención, se proporcionan pequeñas moléculas orgánicas capaces de inhibir BMP2 con una CI50 inferior a 10 μM. Según aspectos adicionales de la invención, se proporcionan pequeñas moléculas orgánicas capaces de inhibir tanto BMP2 como BMP4. Según aún otros aspectos, se proporcionan moléculas orgánicas pequeñas capaces de inhibir BMP2 en composiciones farmacéuticas útiles para el tratamiento de enfermedades neuroinflamatorias, que incluyen, pero no se limitan a, la esclerosis múltiple.

[0019] La presente invención se basa en parte en el descubrimiento de que los compuestos orgánicos pequeños de fórmula (la), así como los compuestos específicos designados en el presente documento SM1, SM6, SM7 y SM9 inhibían la actividad de la proteína morfogenética ósea 2 (BMP2) en un ensayo basado en células. Además, estas moléculas inhibieron la progresión de la enfermedad en un modelo animal de encefalomielitis autoinmune experimental recurrente/remitente (EAE-RR), un modelo bien establecido que simula la esclerosis múltiple (EM). Sin desear limitarse a ninguna teoría particular de un mecanismo de acción, estas pequeñas moléculas orgánicas parecen inducir la neurogénesis y la oligodendrogénesis y mantener la cantidad de mielina inhibiendo la desmielinización, induciendo la remielinización o ambas.

[0020] Según algunas formas de realización, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto de Fórmula (la) o una sal del mismo:

en la que X1 y X2 son cada uno independientemente S; X3 es CN; X4, X5, X6, X7 y X8 son cada uno H; R1 es H; y R3 es OR5, donde R5 es metilo o etilo.

[0021] De acuerdo con algunas formas de realización, se proporciona un método para tratar una enfermedad neuroinflamatoria, comprendiendo el método el paso de administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto que tiene la fórmula general (Ia) o una de sus sales, donde X1 y X2 son cada uno independientemente S; X3 es CN; X4, X5, X6, X7 y X8 son cada uno H; R1 es H; y R3 es OR5, donde R5 es metilo o etilo.

[0022] Según algunas formas de realización, el compuesto tiene la fórmula SM1:

[0023] De acuerdo con algunas formas de realización, la composición farmacéutica es para uso en el tratamiento de una enfermedad neuroinflamatoria.

[0024] Según algunas formas de realización, la composición farmacéutica comprende además un agente terapéutico adicional.

[0025] Según algunas formas de realización, la enfermedad neuroinflamatoria es esclerosis múltiple.

[0026] Según algunas formas de realización, la esclerosis múltiple es una esclerosis múltiple remitente recurrente.

[0027] Según algunas formas de realización, el método comprende además la administración de un agente terapéutico adicional a dicho sujeto.

[0028] Según algunas formas de realización, el agente terapéutico adicional se administra antes, de forma concomitante o después de la administración de al menos un compuesto, o una composición farmacéutica que comprende dicho al menos un compuesto.

[0029] Según algunas formas de realización, la composición farmacéutica comprende el compuesto SM1.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

[0030] Para comprender mejor el tema que se describe en este documento y para ejemplificar cómo se puede llevar a cabo en la práctica, ahora se describirán las formas de realización, solo a modo de ejemplo no limitativo, con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:

Fig. 1 - Evaluación del bioensayo de cribado de alto rendimiento (HTS). (A) Actividad ALP, determinada por el sustrato quimioluminiscente CDP-Star®, presentada como O.D405nm por pocillo, en presencia o ausencia de PMO-2 (cuadrados "con PMO-2", diamantes "Sin PMO-2"). (B) Viabilidad celular, determinada por Cell Titer-Glo® Sustrato luminiscente, presentado como O.D405nm por pocillo, en presencia o ausencia de PMO-2 (cuadrados "con PMO-2", diamantes "Sin PMO-2")). (C) La proporción de ALP/célula por pocillo en presencia o ausencia de PMO-2 ("con PMO-2"- cuadrados, "Sin PMO-2"- diamantes).

Fig. 2 - El efecto de SM1-SM9 sobre la estimulación de ALP por BPM-2 y sobre la viabilidad celular. Se muestra el porcentaje (%) de ALP (diamantes) y el porcentaje (%) de viabilidad celular (cuadrados) para SM1-SM9 para varias concentraciones de las moléculas (0,62 μM, 1,25 μM, 2,5 μM, 5 μM y 10 μM).

Fig. 3 - El efecto de SM1-SM9 en EAE-RR. Puntuación clínica de EAE en ratones EAE-RR, cada grupo (n = 7) tratado con una molécula pequeña (SM 1-9 respectivamente, 10 mg/kg/día) en comparación con el vehículo solo (DMSO al 5% en PBS, 200 μg/ratón) durante 30 días a partir del día 9 después de la inmunización. SMs -diamantes, Vehículo - cuadrados.

Fig. 4 - El efecto de SM1, SM6, SM7 y SM9 en EAE-RR. Puntuación clínica de EAE en ratones EAE-RR, cada grupo (n = 14) tratado con SM1, S^m 7, SM9 o SM6 en dos dosis, 10 mg/kg/día (cuadrados) y 20 mg/kg/día (triángulos), en comparación con vehículo solo (DMSO al 5% en PBS, 200 μl/ratón) (diamantes) desde el día 9 durante 30 días.

Fig. 5 - Efecto de SM1, SM6, SM7 y SM9 sobre el número de ratones con EAE moderada-grave. El número de ratones con puntuación clínica superior o igual a 2, por día, por grupo (10 mg/kg/día - cuadrados, 20 mg/kg/día - triángulos, vehículo - rombos).

Fig. 6 - El efecto de SM1, SM6, SM7 y SM9 sobre la desmielinización. (A) Imágenes representativas de la sección de la médula espinal lumbar, teñidas con LFB (funículo lateral anterior), de ratones tratados con vehículo, SM1 10 mg/kg/día, SM1 20 mg/kg/día, SM7 10 mg/kg/día, SM9 10 mg/kg/día, SM9 20 mg/kg/día, SM6 10 mg/kg/día y SM620 mg/kg/día. (B) Cuantificación del área mielinizada. El gráfico muestra el porcentaje (%) del área teñida con LFB de la sección total de la médula espinal, el día 48 después de la inmunización. La cuantificación se realizó utilizando el software Image J en 6 ratones/grupo y 3 secciones/ratón.

Fig. 7 - El efecto de SM1, SM7 y SM9 sobre el fenotipo neuronal en células P19. (A) Imágenes representativas de células P19 el día 8, teñidas con MAP-2 y Hoechst. Las imágenes se obtuvieron utilizando el microscopio fluorescente invertido Olympus BX 81. (B) Análisis de % de células positivas para MAP-2. El análisis se realizó con el software Image J.

Fig.8 - El efecto de SM1, SM7 y SM9 en la señalización SMAD1/5/8, detectado por transferencia WESTERN. (A) transferencia WESTERN de SMAD fosforilada (p-SMAD), SMAD total y tubulina en respuesta a ninguna estimulación ("Control") o estimulación con PMO-2, PMO-2+ anti-PMO-2/4 Ab, PMO-2 SM1 o SM7 o SM9 a 2,5 μM y 5 μM como se indica. (B) Cuantificación de p-SMAD/tubulina realizada por el software Image J.

Fig. 9 - El efecto de SM1, SM7, SM9 y SM6 en un bioensayo de ATDC5 inducido por PMO-4/PMO-2.

Porcentaje de inducción de Al P y porcentaje de viabilidad celular para SM1, SM7, SM9 y SM6 a 2,5 μM y 5 μM en presencia de estimulación con PMO-4 frente a estimulación con PMO-2.

Fig. 10 - El efecto de SM1, SM7, SM9 y SM6 sobre la expresión de novo del marcador de neuroblastos doblecortina en la ZSV. (A) Imágenes de inmunofluorescencia que muestran el marcaje de BrdU y doblecortina (DCX) en la ZSV. Las imágenes se obtuvieron usando microscopio confocal Zeiss 710, secciones coronales. LV, ventrículo lateral, ZSV, zona subventricular. Barra de escala para imágenes: a, c, e, g, i, k, m, o = 100 μm (ampliación x 10) e imágenes: b, d, f, h, j, l, n, p =20 μm (aumento x 63). (B) Cuantificación de células BrdU DCX en la ZSV. El análisis se realizó utilizando el software image J en 3 secciones de cada ratón (3 ratones de cada grupo, total n=9). Los valores se dan como media ± SEM y los resultados de la prueba t de Student se representan como *p < 0,05.

Fig. 11 - El efecto de SM1, SM7, SM9 y SM6 sobre la expresión de novo de doblecortina en la SGZ. (A) son imágenes inmunohistoquímicas que muestran el marcaje de células BrdU DCX en la SGZ. Las imágenes se obtuvieron usando un microscopio Olympus 8.1 (aumento x 10). (B) Cuantificación de células BrdU DCX en la SGZ. El análisis se realizó utilizando el software image J en 3 secciones de cada ratón (3 ratones de cada grupo, total n=9). Los valores se dan como media ± SEM y los resultados de la prueba t de Student se representan como *p < 0,05.

Fig. 12 - El efecto de SM1, SM7, SM9 y SM6 sobre la expresión de novo del marcador de neuronas maduras NeuN en la SGZ. (A) Imágenes inmunohistoquímicas que muestran el marcaje de células BrdU NeuN en la SGZ. Las imágenes se obtuvieron usando un microscopio Olympus 8.1 (aumento x 10). (B) Cuantificación de BrdU NeuN en la SGZ. El análisis se realizó utilizando el software image J en 3 secciones de cada ratón (3 ratones de cada grupo, total n=9). Los valores se dan como media ± SEM y los resultados de la prueba t de Student se representan como *p < 0,05.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0031] La presente invención proporciona moléculas orgánicas pequeñas capaces de inhibir las PMO que muestran utilidad terapéutica para inhibir la EAE, en particular una forma recurrente de EAE que es un modelo que imita la esclerosis múltiple remitente recurrente.

[0032] La presente descripción se basa en parte en el descrubrimiento de que los compuestos orgánicos pequeños denominados aquí SM1, SM6, SM7 y SM9 inhibían la actividad de la proteína morfogenética ósea 2 (BMP2) en un ensayo basado en células. Se demostró que estas moléculas inhiben la progresión de la enfermedad en un modelo animal de encefalomielitis autoinmune experimental recurrente/remitente (RRAE), un modelo bien establecido que imita la esclerosis múltiple (EM). Sin querer limitarse a ninguna teoría particular de un mecanismo de acción, estas moléculas parecen inducir la neurogénesis y la oligodendrogénesis, y mantener la cantidad de mielina, inhibiendo la desmielinización, induciendo la remielinización o ambas.

[0033] Por tanto, existe una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de la proteína morfogenética ósea 2 (BMP2), en la que el inhibidor de BMP2 es una molécula pequeña. Según algunas formas de realización, la composición farmacéutica es para uso en el tratamiento de enfermedades neuroinflamatorias, como la esclerosis múltiple.

[0034] Según algunas formas de realización, se proporciona un método para tratar una enfermedad neuroinflamatoria, comprendiendo el método el paso de administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de la proteína morfogenética ósea 2 (BMP2), en el que la BMP2 inhibidor es una molécula pequeña.

[0035] De acuerdo con algunas formas de realización, la molécula pequeña tiene un peso molecular de no más de 1000 gr/mol.

[0036] Según la invención, la molécula pequeña tiene la Fórmula (Ia) y sus sales. Según algunas formas de realización, la molécula pequeña tiene la fórmula SM1 y sus sales. Según algunas formas de realización, la molécula pequeña tiene la fórmula SM1 o sales de la misma.

[0037] Según la invención, la composición farmacéutica comprende el compuesto de Fórmula (Ia) o una de sus sales:

[0038] De acuerdo con algunas formas de realización, se proporciona un método para tratar una enfermedad neuroinflamatoria, comprendiendo el método el paso de administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto que tiene la Fórmula general (Ia) o una sal de los mismos, en donde X1 y X2 son cada uno independientemente S; X3 es CN; X4, X5, X6, X7 y X8 son cada uno H; R1 es H; y R3 es OR5, donde R5 es metilo o etilo.

[0039] Según algunas formas de realización, el compuesto tiene la fórmula SM1:

[0040] Según algunas formas de realización, la composición farmacéutica se utiliza en el tratamiento de una enfermedad neuroinflamatoria.

[0041] Según algunas formas de realización, la composición farmacéutica comprende además un agente terapéutico adicional.

[0042] Según algunas formas de realización, la enfermedad neuroinflamatoria es esclerosis múltiple.

[0043] Según algunas formas de realización, la esclerosis múltiple es una esclerosis múltiple remitente recurrente.

[0044] Según algunas formas de realización, el método comprende además la administración de un agente terapéutico adicional a dicho sujeto.

[0045] Según algunas formas de realización, el agente terapéutico adicional se administra antes, de forma concomitante o después de la administración de al menos un compuesto, o una composición farmacéutica que comprende dicho al menos un compuesto.

[0046] En compuestos utilizados de acuerdo con la invención:

Los términos "molécula pequeña ” y "molécula orgánica pequeña ” como se usan aquí son intercambiables y se refieren a una molécula orgánica que tiene un peso molecular no superior a 2000 gr/mol. Según algunas formas de realización, el peso molecular de la molécula pequeña no es superior a 1000 gr/mol. Según algunas formas de realización, el peso molecular de la molécula pequeña no es superior a 750 gr/mol. Según algunas formas de realización, el peso molecular de la molécula pequeña no es superior a 500 gr/mol.

[0047] Como se usa en el presente documento, el término "sal" o "una de sus sales" se refiere a sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos descritos en el presente documento. Los ejemplos no limitantes incluyen sales catiónicas de adición de ácido y sales aniónicas. Las "sales" se forman típicamente cuando un compuesto que tiene un átomo básico se expone a un ambiente ácido. Estos incluyen, como ejemplos no limitantes, iones de amonio, como los que se forman por protonación de un compuesto que contiene nitrógeno. "sal aniónica" se forman normalmente cuando un compuesto que tiene un átomo de hidrógeno se expone a un entorno básico.Estos incluyen, como ejemplos no limitantes, carboxilatos, que pueden formarse tras la desprotonación de un ácido carboxílico o la saponificación de un éster, y compuestos que tienen un nitrógeno desprotonado.

[0048] Cuando se hace referencia a una posible sustitución, se dice que cualquiera de los grupos indicados como "opcionalmente sustituidos" o "sustituidos" de otro modo tiene uno o más átomos o grupos de átomos que sustituyen a un átomo o grupo nativo (como un átomo de hidrógeno átomo) en cualquiera de los átomos del mismo.

[0049] La invención proporciona además el uso de cualquiera de los compuestos designados aquí como SM1.

[0050] La presente invención proporciona además composiciones, por ejemplo, composiciones farmacéuticas que comprenden al menos un compuesto de Fórmula (Ia), por ejemplo, compuestos designados aquí como "SM1" y opcionalmente un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

[0051] Por otro aspecto, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden "SM1" y opcionalmente un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable para usar en el tratamiento de trastornos neuroinflamatorios, por ejemplo, esclerosis múltiple, neurotoxicidad o daño cerebral.

[0052] La invención también abarca enantiómeros, estereoisómeros o cualquier otro isómero de cualquiera de los compuestos citados en el presente documento.

[0053] La eficacia terapéutica de los compuestos de la invención o cualquiera de sus enantiómeros, estereoisómeros o isómeros puede probarse in vitro o en modelos animales, por ejemplo, el modelo animal EAE.

[0054] Todos estos compuestos están disponibles en fuentes comerciales, por ejemplo, Thermo Fisher Scientific Inc.

[0055] Como se usa en este documento, el término " composición farmacéutica” se refiere a una preparación de al menos una molécula orgánica pequeña como se describe en este documento. Además, las composiciones farmacéuticas de la invención comprenden un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

[0056] El término "vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable” incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos y similares y se refiere a un vehículo o diluyente que no causa irritación significativa a un organismo y no anula la actividad biológica y las propiedades del pequeño compuesto orgánico administrado. Un adyuvante está incluido bajo este término. En este documento, el término "excipiente" se refiere a una sustancia inerte añadida a una composición farmacéutica para facilitar aún más la administración de un ingrediente activo.

[0057] Los ejemplos, sin limitación, de excipientes o vehículos no tóxicos incluyen, entre otros, carbonato de calcio, fosfato de calcio, varios azúcares y tipos de almidón, glucosa, sacarosa, sacarina de sodio, manitol, lactosa, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales, estearato de magnesio, carbonato de magnesio, talco, polialquilenglicoles y polietilenglicoles.

[0058] Las composiciones farmacéuticas según la invención pueden fabricarse mediante procesos bien conocidos en la técnica, usando uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, mediante procesos convencionales de mezcla, disolución, granulación, emulsión, encapsulación, atrapamiento o liofilización. La formulación adecuada depende de la vía de administración elegida. La composición farmacéutica se puede producir como forma de dosificación sólida, por ejemplo, polvo, píldora, tableta o similar, o como solución, emulsión, suspensión, aerosol, jarabe o elixir.

[0059] El término "tratamiento" o "método de tratamiento" tal como se define en el presente documento se refiere a la intervención clínica en un intento de alterar el curso natural de la enfermedad en el sujeto que se está tratando y se puede realizar mediante profilaxis o durante el curso de la patología clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen la prevención de la aparición o recurrencia de la enfermedad, la reducción, el alivio o la eliminación de los síntomas, la disminución de la tasa de progresión de la enfermedad, la mejora o reducción de la gravedad o el estado de la enfermedad, la mejora del pronóstico, el retraso de la aparición de los síntomas de una enfermedad, retrasar las recaídas, así como inducir la neurogénesis y la mielinización.

[0060] El tratamiento según la invención en sujetos que padecen EM puede controlarse mediante la "Escala de estado de discapacidad ampliada" (EDSS), que es una escala que va de 0 a 10 en incrementos de 0,5 unidades que representan niveles de discapacidad. La puntuación se basa en un examen realizado por un neurólogo. Los pasos 1,0 a 4,5 de la EDSS se refieren a personas con EM que pueden caminar sin ninguna ayuda y se basa en medidas de deterioro en ocho sistemas funcionales (FS), de la siguiente manera: piramidal, cerebeloso, tronco encefálico, sensorial, intestinal y vesical, visual, cerebral y otros (ambulación) [15]. Cada sistema funcional se califica en una escala de 0 (normal) a 5 o 6 (deficiencia máxima). Los pasos EDSS 5,0 a 9,5 se definen por la discapacidad para caminar.

[0061] Los términos "trastorno neuroinflamatorio”, "enfermedad neuroinflamatoria” o "afección neuroinflamatoria"se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a afecciones en las que las respuestas inmunitarias dañan componentes del sistema nervioso. Los ejemplos comunes son la esclerosis múltiple (EM) y la neuromielitis óptica (NMO), que se caracterizan por la desmielinización inflamatoria del sistema nervioso central y el daño posterior a las células nerviosas y los axones. Los mecanismos inflamatorios también se han implicado en la patogenia de muchos otros trastornos del SNC, incluidas las afecciones inflamatorias sistémicas con afectación del sistema nervioso central, como vasculitis, sarcoidosis y enfermedad de Behcet, así como trastornos neurodegenerativos, psiquiátricos, afecciones neurotóxicas, accidentes cerebrovasculares y lesiones cerebrales.

[0062] El término "enfermedad, afección o trastorno neurodegenerativo", tal como se define en el presente documento, es la pérdida progresiva de la estructura o función de las neuronas, incluida la muerte de las neuronas, en el cerebro o la médula espinal. La neurodegeneración se observa después de un ataque viral y principalmente en varias de las llamadas "enfermedades neurodegenerativas", generalmente observadas en los ancianos, como la enfermedad de Alzheimer (EA), la enfermedad de Parkinson (EP) y la esclerosis lateral amiotrófica (ELA, también denominada enfermedad de Lou Gehrig).

[0063] En algunas formas de realización específicas, la composición farmacéutica según la invención es para el tratamiento de una "enfermedad desmielinizante''. El término "enfermedad desmielinizante", tal como se define en el presente documento, es cualquier enfermedad del sistema nervioso en la que la vaina de mielina de las neuronas se daña o se elimina dando como resultado la anulación de la función de las células neuronales.

[0064] En algunas formas de realización, la enfermedad neurodegenerativa según la invención es la esclerosis múltiple. En formas de realización específicas adicionales, la composición farmacéutica según la invención es para el tratamiento de la esclerosis múltiple.

[0065] El término "esclerosis múltiple" (EM) como se define en el presente documento es una enfermedad neurodegenerativa inflamatoria crónica del sistema nervioso central que destruye la mielina, los oligodendrocitos y los axones. La EM es la enfermedad neurológica más común entre los adultos jóvenes y suele aparecer entre los 20 y los 40 años de edad. Los síntomas de la EM varían, desde la aparición de alteraciones visuales como pérdida visual en un ojo, visión doble hasta debilidad muscular, fatiga, dolor, entumecimiento, rigidez e inestabilidad, pérdida de coordinación y otros síntomas como temblores, mareos, dificultad para hablar, dificultad para tragar y trastornos emocionales. A medida que la enfermedad avanza, los pacientes pueden perder su capacidad de deambulación, pueden sufrir un deterioro cognitivo, perder la autogestión de las actividades cotidianas y pueden volverse gravemente discapacitados y dependientes.

[0066] Los síntomas de la EM se desarrollan porque los elementos del sistema inmunitario atacan las células del cerebro (glía y/o neuronas) y dañan la vaina protectora de mielina de los axones. Las áreas en las que ocurren estos ataques se denominan lesiones que interrumpen la transmisión de mensajes a través del cerebro.

[0067] La esclerosis múltiple se clasifica en cuatro tipos, caracterizados por la progresión de la enfermedad: (1) EM remitente-recurrente (EMRR), que se caracteriza por recaídas (ataques de brotes de síntomas) seguidos de remisiones (períodos de estabilización y posible recuperación); mientras que en algunas remisiones hay recuperación total, en otras remisiones hay recuperación parcial o nula). Los síntomas de la EMRR pueden variar de leves a graves y las recaídas pueden durar días o meses. Más del 80 por ciento de las personas que tienen EM comienzan con ciclos de recaídas y remisiones; (2) La EM progresiva secundaria (EMPS, por sus siglas en inglés) se desarrolla en personas que tienen EM remitente recurrente. En EMPS, pueden ocurrir recaídas, pero no hay remisión (estabilización) por un período de tiempo significativo y la discapacidad empeora progresivamente; (3) EM progresiva primaria (EMPP), que progresa lenta y constantemente desde su inicio y representa menos del 20 por ciento de los casos de EM. No hay períodos de remisión y los síntomas generalmente no disminuyen en intensidad; y (4) EM progresiva-recidivante (EMPR). En este tipo de EM, las personas experimentan un empeoramiento constante de los síntomas y ataques durante los períodos de remisión.

[0068] Actualmente, la esclerosis múltiple no tiene cura. El tratamiento generalmente se enfoca en estrategias para tratar los ataques de EM, controlar los síntomas y reducir el progreso de la enfermedad. Entre los agentes conocidos que se usan para el tratamiento de la EM se encuentran los corticosteroides que se usan principalmente para reducir la inflamación que se dispara durante una recaída, los interferones beta, que retrasan el progreso de la esclerosis múltiple, reducen el número de ataques y disminuyen la gravedad de los ataques, Glatiramer acetato (Copaxone®), que reduce el número de ataques de EM, Fingolimod (Gilenya®), Natalizumab (Tysabri®) y otros agentes conocidos en la técnica. Las nuevas terapias emergentes que reducen la tasa de recaídas y afectan levemente el progreso de la discapacidad incluyen dimetilfumarato (BG-12, Tecfidera®), teriflunomida (Aubagio®), Alemtuzumab (Campath® 1-H, Lemtrada®) y Ocrelizumab (Ocrevus ™).

[0069] El diagnóstico de esclerosis múltiple se puede realizar mediante cualquier método conocido en la técnica e incluye punción lumbar (punción espinal) para pruebas de líquido cefalorraquídeo, que incluyen bandas oligoclonales del LCR, resonancia magnética del cerebro y resonancia magnética de la columna vertebral (médula espinal) y estudio de la función de la vía neuronal (pruebas de potenciales evocados).

[0070] Como se muestra en los ejemplos a continuación (por ejemplo, los ejemplos 2 y 3), la administración intraperitoneal de los compuestos orgánicos pequeños de la invención SM1, SM7 y SM9 mejoraron los síntomas clínicos en un modelo de animal con encefalomielitis autoinmune experimental recurrente/remitente (EAE-RR), un modelo bien establecido que imita la esclerosis múltiple (EM).

[0071] El término "encefalomielitis autoinmune experimental” (EAE, o encefalomielitis alérgica experimental) como se define en el presente documento generalmente se refiere a una enfermedad desmielinizante inflamatoria inducida del sistema nervioso central (SNC) que es ampliamente aceptada como un modelo animal de enfermedades desmielinizantes del SNC humano., que incluyen, entre otros, esclerosis múltiple (EM) y encefalomielitis diseminada aguda (EMDA).

[0072] La EAE se puede inducir en varias especies, incluidos ratones, ratas, cobayos, conejos y primates. La inducción de la enfermedad generalmente se realiza mediante la exposición de los animales a varios antígenos. Los antígenos más utilizados son el homogeneizado de la médula espinal (HME), la mielina purificada, la proteína de mielina como la proteína básica de mielina (PBM), la proteína de proteolípido de mielina (PPL o lipofilina) y la glicoproteína de oligodendrocitos de mielina (GMO), o péptidos de estas proteínas, todo lo que resulta en modelos distintos con diferentes características de la enfermedad con respecto a la inmunología y la patología.

[0073] Según el antígeno utilizado y la composición genética del animal, los roedores pueden mostrar un ataque monofásico de EAE, una forma remitente-recurrente o EAE crónica. El roedor susceptible típico debutará con síntomas clínicos alrededor de dos semanas después de la inmunización y presentará síntomas de una enfermedad remitenterecurrente.

[0074] El modelado de la esclerosis múltiple se puede realizar con ratones SJL/J. Este modelo de EAE se induce en ratones hembra SJL/J de 8 semanas de edad mediante el fragmento de proteína proteolipídica (PPL) (junto con la toxina de la tos ferina). Este modelo exhibe un curso de enfermedad remitente-recurrente (RR), similar a los observados en pacientes con EM.

[0075] El modelado de esclerosis múltiple también se puede realizar usando ratones hembra C57BL/6, en los que la enfermedad se induce con péptido de glicoproteína de mielina-oligodendrocitos (GMO). Este modelo representa la forma progresiva (también conocida como crónica) de la enfermedad.

[0076] Como se sabe en la técnica, los animales modelo generalmente se califican para la actividad de la enfermedad (denominado "Índice de actividad de la enfermedad", DAI) utilizando el siguiente índice de puntuación: "0", ratón normal, sin signos manifiestos de enfermedad, "1", Debilidad de la cola cojera o de las extremidades traseras, pero no ambas, "2", Debilidad de la cola cojera y de las extremidades traseras, "3", Parálisis parcial de las extremidades traseras, "4" Parálisis completa de las extremidades traseras, y "5", Muerte o sacrificio por razones humanitarias. También existen otros DAI, por ejemplo DIA que utilizan la siguiente puntuación: "1", atonía de cola; "2", debilidad leve a moderada de las extremidades posteriores; "3", debilidad severa de las extremidades posteriores; "4", parálisis completa de uno o más miembros; "5", moribundo.

[0077] El índice de puntuación anterior se puede usar así para controlar la gravedad de la enfermedad y la aparición de recaídas para determinar el efecto terapéutico de las moléculas orgánicas pequeñas de la invención.

[0078] Por lo tanto, en una forma de realización, los compuestos de la invención pueden usarse para el tratamiento de EM-RR.

[0079] En otras formas de realización, los compuestos de la invención se pueden usar para el tratamiento de la EM progresiva secundaria (EMPS), la EM primaria progresiva (EMPP) o la EM progresiva recurrente (EMPR).

[0080] En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para tratar una esclerosis múltiple, comprendiendo el método el paso de administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de "SM1" o una composición farmacéutica que comprende dicho al menos un compuesto.

[0081] A modo de ejemplo, el paso de administrar un compuesto de la invención o una composición farmacéutica de la invención se puede realizar mediante, pero no se limita a, las siguientes vías de administración: oral, rectal, transmucosa, transnasal, intestinal o administración parenteral, incluidas las inyecciones intramusculares, subcutáneas e intramedulares, así como las inyecciones intratecales, intraventriculares directas, intravenosas, intraperitoneales, intranasales o intraoculares. Alternativamente, se puede administrar la composición farmacéutica según la invención de forma local en lugar de sistémica, por ejemplo, mediante inyección de la composición farmacéutica directamente en una región tisular de un sujeto, por ejemplo, en las áreas afectadas del SNC.

[0082] En algunas formas de realización, la molécula orgánica pequeña de la invención se administra en combinación con un agente terapéutico adicional.

[0083] El agente terapéutico adicional puede ser cualquier agente terapéutico adecuado o conocido para tratar la esclerosis múltiple o para reducir la tasa de recaídas y afectar el progreso de la discapacidad. Los ejemplos no limitantes incluyen Interferon-beta1 (como Avonex®, Betaferon®, Rebif®), Acetato de glatiramer (Copaxone®), Fingolimod (Gilenya®), Natalizumab (Tysabri®), Ocrelizumab (Ocrevus®) y otros agentes conocidos en la técnica.

[0084] El agente terapéutico adicional puede ser una terapia celular que incluye la administración de células que incluyen, entre otras, células madre mesenquimales (CMM), células similares a CMM, células progenitoras neurales, células CD34+, células CD133+ de todas las fuentes disponibles, células madre pluripotentes inducidas (iPSC), células madre pluripotentes diferenciadas y similares.

[0085] En una forma de realización, dicho agente terapéutico adicional es un agente que media en la apertura de la BHE, por ejemplo, manitol, que puede inyectarse por vía intravenosa.

[0086] El agente terapéutico adicional se puede formular junto con el pequeño compuesto orgánico de la invención o ser parte de una composición separada. El agente adicional se puede administrar junto con los compuestos de la invención o por separado. Puede administrarse antes, concomitantemente o después de la administración de los compuestos o composiciones farmacéuticas de la invención.

[0087] Como se sabe en la técnica, el término "barrera hematoencefálica (BBB)” se refiere a la separación de la membrana estructural del sistema nervioso central de la sangre circulante.

[0088] El término "cantidad terapéuticamente efectiva" (o cantidades) de al menos una molécula orgánica pequeña de acuerdo con la invención se determina por consideraciones conocidas en la técnica para curar, detener o al menos aliviar la condición médica. La dosis precisa y la frecuencia de administración dependen de la gravedad de la enfermedad del paciente, de la vía de administración y de la farmacocinética del compuesto. La determinación de la dosis es un procedimiento rutinario y bien conocido por los médicos y otros expertos en la materia. Para cualquier preparación utilizada en los métodos de la invención, la dosificación o la cantidad terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos in vitro, ensayos de cultivos celulares y experimentos in vivo realizados en modelos animales, por ejemplo, EAE.

[0089] Por ejemplo, la dosis proporcionada a continuación se estimó basándose en el modelo de ratón EAE de esclerosis múltiple. Como se muestra en los Ejemplos 2 y 3 a continuación, el tratamiento con 10 mg/kg o 20 mg/kg de cada uno de SM1, SM7 o SM9 mejoró la EAE. Sorprendentemente, los síntomas en los ratones EAE tratados fueron menos graves que los de los controles, en cada fase del estudio. Este efecto también se manifestó por el hecho de que en el grupo de ratones EAE tratados, menos ratones exhibieron una forma más grave de la enfermedad (es decir, puntuación clínica de 2-5). Además, se demostró que el tratamiento condujo a un aumento de la cantidad de mielina en la médula espinal de los ratones EAE, lo que indica un aumento de los procesos de remielinización o una disminución de la desmielinización en respuesta al tratamiento con estos SM, o ambos.

[0090] Los ejemplos no limitativos de dosis terapéuticas incluyen, pero no se limitan a, 400-800 mg por aproximadamente 70 kg de ser humano.

[0091] Cabe señalar que la cantidad de la molécula orgánica pequeña a administrar puede variar en aproximadamente un 5-25%, en consideración del peso molecular y otras características de un agente específico. Por lo tanto, el término "aproximadamente" como se define en este documento se refiere a una fluctuación del 5-25% de la cantidad definida en este documento. Preferiblemente, el término "alrededor de” abarca variaciones de /-10%, más preferiblemente /-5%, incluso más preferiblemente /-1% y aún más preferiblemente /-0. 1% de un valor especificado.

[0092] La molécula orgánica pequeña según la invención o cualquier composición farmacéutica que la comprenda se puede administrar a un paciente en una sola o en múltiples administraciones. La molécula orgánica pequeña o la composición farmacéutica que la comprende puede administrarse al paciente de forma continua o por períodos discretos de tiempo, según se determine por consideraciones conocidas por un experto en la técnica para curar, detener o al menos aliviar la afección médica.

[0093] La toxicidad y la eficacia terapéutica de la molécula orgánica pequeña descrita en el presente documento pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar in vitro, en cultivos celulares o animales de experimentación. Los datos obtenidos de estos ensayos in vitro y de cultivos celulares y estudios en animales se pueden usar para formular una variedad de dosis para uso en humanos. La dosificación puede variar según la forma de dosificación empleada y la vía de administración.

[0094] El término "sujeto", como se usa en este documento, significa animales de sangre caliente, como por ejemplo ratas, ratones, perros, gatos, cobayos, primates y humanos. Aunque los métodos de la invención están destinados particularmente al tratamiento de un sujeto humano que padece una enfermedad neurodegenerativa, se incluyen otros sujetos mamíferos. Los términos sujeto y paciente se usan indistintamente en este documento.

[0095] La presente invención también describe un compuesto de fórmula "SM1" y un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable para usar en un método de tratamiento de un sujeto que padece esclerosis múltiple, en el que dicho método comprende administrar dicho al menos una molécula orgánica pequeña y un vehículo farmacéuticamente aceptable para dicho sujeto.

[0096] Los compuestos de la invención se seleccionaron inicialmente en función de su capacidad para inhibir la señalización de PMO-2 in vitro. Como se muestra en el Ejemplo 1, las moléculas orgánicas pequeñas SM1, SM6, SM7 y SM9 se seleccionaron de una gran biblioteca por su capacidad para inhibir PMO-2 in vitro sin conducir a citotoxicidad en células ATDC5 de ratón. Además, como se muestra en los Ejemplos 4, 7 y 8, estos compuestos mostraron un aumento en varios marcadores que son indicativos de diferenciación neuronal in vitro.

[0097] El término "proteína (o proteínas) morfogenética ósea” (PMO) como se define en el presente documento se refiere a un grupo de factores de crecimiento también conocidos como citoquinas o metabológenos. Las PMO inducen la formación de hueso y cartílago y tienen múltiples funciones en el desarrollo del cerebro embrionario. Hasta la fecha se han descubierto veinte PMO, de las cuales seis PMO (es decir, PMO-2 a PMO-7) pertenecen a la superfamilia de proteínas del factor de crecimiento transformante p (beta). En particular, la presente invención se refiere a las PMO que están asociadas con la proliferación y el desarrollo neuronal. Los ejemplos no limitantes incluyen PMO-2 y PMO-4. En una forma de realización específica, la PMO es PMO humana.

[0098] La "proteína morfogenética ósea 2" (o PMO-2), al igual que otras proteínas morfogenéticas óseas, la PMO-2 desempeña un papel importante en el desarrollo del hueso y el cartílago. Está implicado en la vía hedgehog, la vía de señalización de TGF p y en la interacción citoquina-receptor de citoquina. También participa en la diferenciación de células cardíacas y en la transición epitelial a mesenquimatosa. PMO-2 actúa como un homodímero unido por enlaces disulfuro y se demostró que estimula la producción de hueso.

[0099] La proteína morfogenética ósea 2 puede ser PMO-2 humana, que tiene el número de acceso NM_001200.2 del NCBI (National Center for Biotechnology Information).

[0100] La "proteína morfogenética ósea 4" (o PMO-4) también está implicada en el desarrollo de huesos y cartílagos, específicamente en el desarrollo de dientes y extremidades y en la reparación de fracturas. Este miembro de la familia en particular juega un papel importante en el inicio de la formación de hueso endocondral en humanos. Se ha demostrado que participa en el desarrollo muscular, la mineralización ósea y el desarrollo de la yema ureteral. En el desarrollo embrionario humano, PMO-4 es una molécula de señalización crítica requerida para la diferenciación temprana del embrión y el establecimiento de un eje dorsal-ventral. La PMO-4 se secreta desde la porción dorsal de la notocorda y actúa en conjunto con Sonic Hedgehog (liberada desde la porción ventral de la notocorda) para establecer un eje dorsalventral para la diferenciación de estructuras posteriores.

[0101] La proteína morfogenética ósea 4 puede ser PMO-4 humana, que tiene el número de acceso P12644 del NCBI (Centro Nacional de Información Biotecnológica).

[0102] Las PMO interactúan con receptores específicos en la superficie celular, denominados receptores de proteínas morfogenéticas óseas (BMPR). La transducción de señales a través de BMPR da como resultado la movilización de miembros de la familia de proteínas SMAD. Como se usa en este documento, el término "señalización de PMO"se refiere a la vía de señalización iniciada por la unión de una PMO a su receptor y los procesos celulares subsiguientes inducidos por esta unión, por ejemplo, la movilización de miembros de la familia de proteínas SMAD.

[0103] Debe entenderse que esta invención no se limita a los ejemplos, pasos de proceso y materiales particulares descritos en este documento, ya que tales pasos de proceso y materiales pueden variar un poco. También debe entenderse que la terminología utilizada en este documento se utiliza únicamente con el fin de describir formas de realización particulares y no pretende ser limitativa ya que el alcance de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas y sus equivalentes.

[0104] Debe señalarse que, como se usa en esta especificación y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “una”, “el” y “ella” incluyen referentes plurales a menos que el contenido dicte claramente lo contrario.

[0105] A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entienden comúnmente los expertos en la técnica a la que se refiere esta invención. Los siguientes términos se definen para los fines de la invención como se describe en este documento.

EJEMPLOS

[0106] Sin más elaboración, se cree que un experto en la técnica puede, utilizando la descripción anterior, utilizar la presente invención en toda su extensión. Por lo tanto, los siguientes ejemplos deben interpretarse como meramente ilustrativos y no limitativos de la invención reivindicada de ninguna manera.

[0107] Los protocolos de biología molecular estándar conocidos en la técnica que no se describen específicamente en este documento generalmente se siguen esencialmente como en Sambrook & Russell, 2001.

Abreviaturas:

[0108]

Moléculas pequeñas - MP

Encefalomielitis autoinmune experimental - EAE;

Recurrente y remitente - RR;

Esclerosis múltiple - EM;

Encefalomielitis autoinmune experimental recurrente y remitente - EAE-RR;

Péptido de proteína proteolipídica - PPL;

Péptido de glicoproteína de mielina-oligodendrocitos - GMO;

Solución salina tamponada con fosfato - PBS;

Adyuvante completo de Freund - ACF;

Toxina pertussis - TXP;

Proteína morfogenética ósea - PMO;

Barrera hematoencefálica - BBB;

Sistema nervioso central - SNC;

Hora - hr, h;

Minuto - min.

Procedim ientos experimentales

Bioensayo de cribado de alto rendimiento (HTS)

[0109] Se añadió poli-L-lisina (Sigma-Aldrich) a placas de 384 pocillos y se retiró después de 30 min de incubación a temperatura ambiente. Se añadió a cada pocillo un medio de ensayo que contenía DMEM/F12, FBS al 2%, 100 unidades/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina (Industrias biológicas). A continuación, se añadió PMO-2 humana recombinante (rhBMP-2, R&D Systems) a cada pocillo hasta una concentración final de 2 gg/ml. Se recogieron células ATDC5 (Sigma-Aldrich), se resuspendieron en medio de ensayo y se añadieron a una concentración final de 2000 células/pocillo. Finalmente, se añadió heparina (Sigma-Aldrich) hasta una concentración final de 2 gg/ml. Las células se incubaron durante 48 horas a 37°C con 5% de CO2 en una cámara humidificada en presencia o ausencia de posibles inhibidores de molécula pequeña de BPM-2. Después de la incubación, se determinaron los niveles de ALP y la viabilidad celular utilizando un protocolo completamente automatizado. Las células se lavaron con PBS, se lisaron usando un tampón de lisis que contenía Triton X-100 al 0,2 % en PBS suplementado con un cóctel inhibidor de proteasa (Sigma-Aldrich) y se incubaron durante 25 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se determinó el nivel de ALP mediante la adición de sustrato quimioluminiscente CDP-Star® (Sigma-Aldrich) y la medición de la luminiscencia después de la incubación durante 25 min a temperatura ambiente en la oscuridad. La viabilidad celular se determinó finalmente mediante la adición del reactivo CellTiter-Glo® (Biological Industries) y la medición de la luminiscencia después de 10 min de incubación.

[0110] Inducción de encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) en ratones Se indujo EAE-RR en ratones hembra SJL (6-8 semanas de edad) mediante inmunización subcutánea (día 0) con 100 gg/péptido proteolipídico de ratón (PPL 139-151, sintetizado por Sigma-Aldrich) en 0,1 ml de PBS. El péptido se emulsionó en un volumen igual de adyuvante completo de Freund (ACF, de DIFCO) que contenía 500 gg de Mycobacterium tuberculosis H37RA (MT, de DIFCO). Los ratones también recibieron una inyección intraperitoneal de 300 ng de toxina pertussis (TXP, de Sigma-Aldrich) en 0,2 ml de PBS. Se administró una segunda inyección de TXP (300 ng/ratón) 48 h más tarde.

[0111] Se controlaron los ratones para detectar síntomas de EAE-RR y se puntuaron como sigue: "0" para ausencia de enfermedad; "1", parálisis de la cola; "2", debilidad de las extremidades posteriores; "3", parálisis de las extremidades posteriores; "4", debilidad/parálisis de las extremidades posteriores y anteriores; "5", moribundo.

[0112] Todos los procedimientos en los que intervinieron ratones se realizaron de acuerdo con las directrices del Comité de Ética Animal del Centro Médico Sourasky.

Ensayo de diferenciación in vitro de células P19

[0113] Las células P19 se cultivaron en un medio esencial mínimo a (MEMa) (Gibco) que contenía 7,5 % de suero de ternera, 2,5 % de suero de ternera fetal, y 0,4 gl/ml de penicilina-estreptomicina (Gibco), a 37°C, 5% CO2. Las células se repusieron con medio fresco cada 48 h. Para el estudio de diferenciación, se cultivaron células P19 a una concentración de 2 x 105 células/placa bacteriana de 60 mm y no se estimularon o se incubaron con las siguientes estimulaciones:

1) 5 x 10-7 M de ácido all-trans-retinoico (AR) (Sigma)

2) RA 5 ng/ml de rhBMP2 (sistemas de I+D)

3) RA rhBMP-2 500 ng/ml de anti-humano de ratón PMO-2/4 mAb (sistemas de I+D)

4) RA+ rhBMP-2 SM1/ SM7 /SM9 (Maybridge (HitFinder™ Collection)) en concentraciones: 0,625, 1,25 y 2,5 mm .

[0114] El medio, incluidos los suplementos de RA, PMO y SM, se repuso después de 48 h. Después de 4 días, los agregados que se formaron durante el tratamiento con RA se dispersaron enzimáticamente (tripsina al 0,05 % v/v - EDTA al 0,02 % v/v) y mecánicamente y se sembraron en placas de cultivo de tejidos. En esta etapa, las células se cultivaron en medio libre de RA, PMO y SM, que se actualizó cada 48 h. Las neuronas positivas para MAP-2 se examinaron el día 8 (es decir, el día 4 después del tratamiento con AR) mediante inmunofluorescencia. Brevemente, el día 7, las células se volvieron a cultivar en placas de 24 pocillos con cubreobjetos a una concentración final de 5 x 104 células/pocillo. El día 8, las células se lavaron con PBS, se fijaron con PFA al 4 % durante 15 min, se permeabilizaron con Triton Tx al 0,5 %, se bloquearon con FCS al 10 %, BSA al 0,1 % y Tween al 0,05 % durante 30 min, y se tiñeron con mAb de conejo MAP2 (1:100, D5G1, Señalización celular) durante 1 hora. El segundo paso de anticuerpos se realizó marcando con anticuerpos IgG conjugados con Alexa Fluor® 488 contra conejo durante 1 h (1: 1000; Molecular Probes USA).

Determinación de la señalización de SMAD1/5/8 mediante análisis de transferencia Western

[0115] Se sembraron células P19 en placas de 6 pocillos (3,5 x 105 células/pocillo). Al día siguiente, las células no se trataron o se trataron con 5 x 10-7 M RA, 5 ng/ml de PMO-2 o SM durante 4 h. Las células se lavaron con PBS enfriado con hielo, se recolectaron y lisaron con tampón RIPA enfriado con hielo (Sigma-Aldrich) complementado con cóctel inhibidor de proteasa y ortovanadato de sodio (Na3VO₄) como inhibidor de fosfatasa (Sigma-Aldrich). Las concentraciones de proteínas se determinaron utilizando un kit de ensayo de proteínas BCA (Pierce, Rockford, IL). Los lisados celulares (40-60 mg de proteína) se separaron mediante electroforesis en gel SDS-PAGE al 4-15 % y luego se transfirieron a membranas de nitrocelulosa a 0,2 A durante 2 h. Las membranas se bloquearon a temperatura ambiente durante 1 h en leche desnatada en polvo al 5 % (p/v) y luego se incubaron con anti-fosfo-Smad1/5/9, anti-Smad1 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, EE. UU.) y anticuerpos anti-tubulina (Sigma-Aldrich) a temperatura ambiente durante 2 h. Las membranas se lavaron y se incubaron con anticuerpo secundario conjugado con fosfatasa alcalina (Jackson Laboratories Immune Research, PA, EE. UU.). La señal se detectó utilizando un kit de quimioluminiscencia mejorado (Clarity, Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) y las imágenes digitales fueron capturadas por MicroChemi (DNR Bio-imaging Systems, Jerusalem, Israel). Los niveles de proteína se cuantificaron utilizando el software ImageJ y se normalizaron a {alfa}-tubulina.

Ejemplo 1

Detección de alto rendimiento de moléculas pequeñas

[0116] Se realizó un ensayo basado en células ATDC5 para evaluar la relación estructura-función de BMP-2 y el receptor IA de BMP descrito originalmente en Keller et al (Nature Structural & Molecular Biology 2004 11,481-488) describieron originalmente un ensayo basado en células ATDC5 para evaluar la relación estructura-función de PMO-2 y el receptor IA de PMO. Con el fin de seleccionar un gran volumen de agentes terapéuticos potenciales, el bioensayo basado en células ATDC5 para detectar la inhibición de PMO se adaptó para su uso en la selección de alto rendimiento. El bioensayo se basa en la estimulación de la producción de fosfatasa alcalina (ALP) en células ATDC5 de ratón mediante la administración de PMO-2 y heparina, y la medición de los niveles de ALP en presencia de los posibles inhibidores. El ensayo se caracterizó por las siguientes características:

(a) se encontraron las condiciones óptimas para los instrumentos automatizados HTS a fin de obtener una brecha satisfactoria (es decir, Z-prime positivo, superior a 0,5) entre la producción de ALP en presencia de PMO-2 y la producción de ALP en ausencia de PMO-2 (sin estimulación).

(b) se diseñó un método sensible para la determinación de ALP para HTS: a saber, el uso de sustrato quimioluminiscente CDP-Star® y medición de luminiscencia.

(c) tanto la producción de ALP como la viabilidad de las células se midieron simultáneamente. Esto se logró utilizando el ensayo de viabilidad de células luminiscentes CellTiterGlo® para evaluar la viabilidad de las células después de que la señal luminiscente de CDP-Star® se ha desvanecido. La evaluación simultánea de la producción de ALP y la viabilidad de las células era necesaria, ya que las moléculas pequeñas probadas potencialmente tóxicas pueden conducir a niveles reducidos de ALP por citotoxicidad celular en lugar de por interferencia con la señalización de PMO-2. Por lo tanto, era esencial examinar en el mismo cultivo celular tanto los niveles de ALP como la viabilidad de las células para excluir las moléculas que simplemente causaban la muerte celular. Los detalles del bioensayo se detallan en la sección de procedimientos experimentales anterior.

[0117] La eficacia de esta prueba totalmente automatizada se demuestra en la Figura 1. La Figura 1(A) muestra la actividad de ALP en células ATDC5 en respuesta a la estimulación con rhBMP-2 en presencia de heparina. La actividad ALP se determinó usando sustrato quimioluminiscente CDP-Star®. Evidentemente, como se muestra en la Figura 1(B), la estimulación de las células con rhBMP-2 reduce el número de células. Esto puede ser el resultado de la condrogénesis inducida por PMO-2 de las células ATDC5, seguida de una proliferación reducida. Como se muestra en la Figura 1(C), la proporción de ALP/célula fue inducida 4,3 veces, Z'=0,59. Z' es un parámetro que indica la importancia del efecto, es decir, qué tan alta es la señal ALP en presencia de BMP2 en comparación con el nivel de la señal en ausencia de PMO 2. Cuanto más cerca esté Z' de 1, mayor será la diferencia. El cálculo se realiza de la siguiente manera:

donde o = desviación estándar, p = promedio, p = positivo (con PMO), n = negativo (sin PMO) e I = valor

[0118] Se cribó una biblioteca de moléculas pequeñas (SM) usando el bioensayo High Throughput Screening descrito anteriormente. Se seleccionaron alrededor de 7600 SM, de la biblioteca de Maybridge, que consta de compuestos orgánicos "similares a fármacos", utilizando la colección HitFinder™ preplaquetada. Los compuestos se agregaron a cada pocillo hasta una concentración final de 5 μM, después del paso de recubrimiento con poli-L-lisina y antes de la adición de rhBMP-2. Tras un primer cribado, se seleccionaron 96 moléculas potenciales para la inhibición de PMO-2 (denominadas aquí "aciertos"), que presentan un porcentaje de inhibición de la señalización de PMO-2 superior al 25% y un porcentaje de toxicidad celular inferior al 20%. Varias concentraciones (0,62 μM, 1,25 μM, 2,5 μM, 5 μM y 10 μM) de estas moléculas se probaron adicionalmente en el bioensayo para calcular la CI50. Después de la determinación de CI50, se obtuvieron 17 aciertos positivos. Se seleccionaron nueve moléculas que exhibían los mejores valores de CI50 para su posterior análisis. Estas moléculas se denominan en este documento SM1-SM9. En la Figura 2 se muestra la actividad inhibitoria de SM1-SM9 y su efecto citotóxico en la línea celular. Los niveles de ALP y la viabilidad celular se muestran en la Figura 2 como un porcentaje de los niveles de luminiscencia de ALP o viabilidad en presencia de PMO-2 sin SM. Los SM se probaron a diversas concentraciones, es decir, a 0,62 μM, 1,25 μM, 2,5 μM, 5 μM y 10 μM.

[0119] La Tabla 1 resume el nombre químico, la estructura y los valores CI50 para SM1-SM9.

Tabla 1

Ejemplo 2

Efecto de los SM in vivo sobre la progresión de la enfermedad usando el modelo EAE-RR

[0120] El efecto de los inhibidores de molécula pequeña que se identificaron en el Ejemplo 1 anterior se probó adicionalmente in vivo usando el modelo de encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) en ratones SJL. EAE sirve como modelo para la esclerosis múltiple (EM) recurrente/remitente. Se indujo EAE como se describe en la sección de procedimientos experimentales. Los SM 1-9 o el vehículo solo (DMSO al 5 % en PBS) se administraron diariamente mediante inyecciones intraperitoneales de 250 μg/ratón (10 mg/kg/día), a partir del día 9 después de la inmunización, durante los siguientes 30 días. Los animales fueron monitoreados hasta el día 45 después de la inducción para los síntomas de EAE y puntuados de la siguiente manera: 0 = sin enfermedad, 1 = parálisis de la cola, 2 = debilidad de las extremidades posteriores, 3 = parálisis de las extremidades posteriores, 4 = parálisis de las extremidades posteriores más de las extremidades anteriores, y 5 = moribundo.

[0121] Como se demuestra en la Figura 3, se observó un efecto beneficioso para el tratamiento con las moléculas SM1, SM7 y SM9 (p<0,01 frente al vehículo). El efecto más pronunciado se observó para el tratamiento con SM1-KM03702. El efecto beneficioso ya se observó el día 19 después de la inmunización (puntuación clínica EAE de 0,5 ± 0,2 frente a 1,1 ± 0,3 en el grupo del vehículo). Este efecto aumentó hasta el día 27, cuando la puntuación clínica alcanzó 0,3 ± 0,3. SM7- RF02433 y SM9-KM01484 también mejoraron la EAE a partir del día 21 posterior a la inmunización (puntuación clínica de EAE de 0,6 ± 0,1 y 0,8 ± 0,3 en los grupos tratados con SM7 y SM9, respectivamente, frente a 1,1 ± 0,3 en el grupo del vehículo). Aparentemente, SM6 no mostró ningún efecto beneficioso en este experimento, sin embargo, también se eligió para un análisis más detallado en el próximo experimento con el fin de proporcionar algunos resultados comparativos.

[0122] Se repitieron los experimentos con las 4 moléculas SM1, SM6, SM7 y SM9 mencionadas anteriormente. El experimento se realizó en condiciones similares al anterior, excepto que se administraron dos dosis de las moléculas: una dosis de 10 mg/kg y una dosis de 20 mg/kg, es decir, 250 gg/ratón y 500 gg/ratón en los días 9-38 (ver Figura 4).

[0123] Se observó un efecto beneficioso significativo para el tratamiento con la dosis baja de 10 mg/kg de SM1 (p=0,0005 frente al vehículo). También se observó una tendencia de mejora para la dosis alta de SM1, aunque no fue estadísticamente significativa (p=0,09). Además, el tratamiento con dosis baja y alta de SM9 mejoró la EAE. En este documento, la dosis alta de 20 mg/kg fue más potente en comparación con la dosis baja (p=0,049 para 10 mg/kg de peso corporal y p=0,0001 para 20 mg/kg). Similar al experimento anterior, la mejoría se observó principalmente durante la segunda y la tercera recaída (en los días 23-31 y en los días 37-44, respectivamente).

[0124] El efecto del tratamiento con SM6 fue más suave y no significativo. Sin embargo, al contrario del experimento anterior, se observó que SM7 tiene un efecto tóxico que resulta en la muerte de la mayoría de los ratones tratados: al final del experimento (día 48), 8 ratones murieron en el grupo de dosis baja de 10 mg/kg y todos los ratones murieron en el grupo de dosis alta de 20 mg/kg.

[0125] También se analizó el número de animales que presentaban al menos una puntuación de 2 (paresia de las extremidades traseras) en cualquier momento durante el estudio (véase la Figura 5). Como se muestra, de manera similar al análisis de puntaje clínico promedio, tanto SM1 (principalmente la dosis baja de 10 mg/kg) como SM9 (principalmente la dosis alta de 20 mg/kg) demostraron un efecto beneficioso en el contexto de un número reducido de ratones con puntajes severos de EAE.

[0126] Curiosamente, en el grupo de ratones tratados con SM6 se redujo el número de ratones con una EAE más grave (durante la segunda recaída: 2-3 ratones en los grupos tratados con SM6 frente a 5-6 ratones en el grupo del vehículo, y durante la tercera recaída: 5-7 en los grupos tratados con SM6 frente a 8-9 ratones en el grupo del vehículo). Aparentemente, SM6 tiene un efecto en la mejora de EAE grave.

Ejemplo 3

Efecto de SM1, SM6, SM7 y SM9 sobre la desmielinización en EAE

[0127] Se analizó el efecto directo de los SM sobre los procesos de desmielinización y remielinización. Se extrajo la médula espinal de 6 ratones de cada grupo y se seccionó el segmento lumbar de la médula espinal (sección de parafina coronal de 10 gM) y se procesó para LFB-H&E (luxol fast blue con H&E) para tinción de mielina e infiltrados. Como se muestra en la Figura 6A, se observó un mayor número de infiltrados y desmielinización en el grupo tratado con vehículo. Hubo una ligera tendencia a la elevación del % de área mielinizada para todos los SM examinados (Figura 6B), aunque se observó un efecto significativo para 10 mg/kg de SM7 (34,0 ± 0,8 % en el grupo tratado con 10 mg/kg de SM7 frente a 28,3 ± 1,8 % en vehículo p=0,04, no se examinó la dosis alta por toxicidad), así como para 20mg/kg SM9 (34,6 ± 1,6%, p=0,03), y 10mg/kg SM6 (34,8 ± 1,6%= p,0,03). Estos resultados pueden indicar un aumento de los procesos de remielinización o una disminución de la desmielinización en respuesta al tratamiento de estos SM, o ambos.

Ejemplo 4

El efecto de SM1, SM7 y SM9 sobre la neurogénesis in vitro

[0128] A continuación, se midió el efecto de las moléculas pequeñas sobre la neurogénesis en un modelo de diferenciación de P19. Se ha demostrado que las células P19, células de teratocarcinoma derivadas de embriones murinos, se diferencian en neuronas en respuesta a la estimulación con ácido retinoico (AR) y que esta diferenciación puede bloquearse mediante la adición de rhBMP-2 (proteína morfogenética ósea -2) [8]. La diferenciación neuronal está marcada por la expresión del marcador neuronal MAP-2, mientras que la adición de PMO-2 reduce los niveles de este marcador. La adición del anticuerpo monoclonal murino anti-PMO-2/4 invierte el efecto de PMO-2 e induce la adquisición del fenotipo neuronal. Así, se examinó el efecto de SM1, SM7 y SM9 sobre la expresión del marcador neuronal MAP-2 en células P19 en presencia de RA y PMO-2. Se probaron tres concentraciones de las moléculas: 0,625 gM, 1,25 gM y 2,5 gM.

[0129] No se observaron células positivas para MAP-2 en ausencia de cualquier estimulación. Como se demuestra en las Figuras 7A-7B, la estimulación con AR de las células P19 aumentó el número de células MAP-2 (73,8 ± 6,5%). La adición de rhBMP-2 redujo significativamente el número de células MAP-2 (31,4 ± 4,3 %), es decir, bloqueó el fenotipo neuronal, mientras que la adición del mAb anti-PMO-2/4 revirtió el efecto de PMO-2 aumentando la número de células MAP-2 (83,6 ± 3,5%, p<0,01 frente a RA+PMO-2). Similar al efecto del mAb neutralizante anti-PMO-2/4, SM1, SM7 y SM9 revirtieron el efecto de PMO-2 y aumentaron el número de células MAP-2+ (neuronas), en comparación con simplemente estimulación RA+PMO-2.

[0130] El fenotipo neuronal inducido por SM1 en todas las concentraciones examinadas, pero más notablemente en la concentración más alta de 2,5 gM (62,2 ± 3,9 %, p<0,01 frente a AR+PMO-2).

[0131] También se observó un efecto dependiente de la dosis para SM7, que inducía el fenotipo neuronal tanto en las concentraciones bajas como en las leves, particularmente en la concentración leve de 1,25 gM (76,1 ± 3,1 %, p<0,01 frente a AR+PMO-2). No se observó ningún efecto significativo para la concentración más alta, quizás debido a un efecto tóxico. SM9 no fue eficaz en la concentración baja y la neurogénesis inducida tanto en las concentraciones leves como en las más altas de 1,25 μM y 2,5 μM (76,4 ± 12,6 % y 80,6 ± 10,0 % respectivamente, p<0,05 frente a AR+PMO-2).

Ejemplo 5

El efecto de SM1, SM7 y SM9 sobre la señalización de SMAD en células P19

[0132] Se sabe que la señal de PMO canónica está mediada por la fosforilación de SMAD. Las PMO transducen señales al unirse a complejos de receptores de serina/treonina quinasa de tipo I y II. La unión del ligando induce la fosforilación de los receptores, que luego activan la señalización canónica a través del receptor Smads (R-Smads) 1, 5 y 8. Los R-Smads son fosforilados por el receptor de tipo I activado. Luego forman un complejo con Smad4, lo que desencadena la translocación nuclear [16]. Se examinó el efecto de los SM sobre la fosforilación de la señalización canónica SMAD1/5/8, inducida en células P19 en respuesta a la estimulación con PMO-2.

[0133] Como se demuestra en las Figuras 8A y 8B, la estimulación de células P19 con rhBMP-2 durante 4 horas indujo la expresión de p-SMAD (normalizada a la expresión de tubulina) en 4,9 veces. La adición de mAb anti-PMO-2/4 inhibió la expresión de p-SMAD en un 76,2 % en comparación con la estimulación con PMO-2 solo. SM7 y SM9, particularmente a la concentración más baja de 2,5 μM, tuvieron el efecto más pronunciado en la fosforilación de SMAD (reducción de 40,0 % y 42,7 % en p-SMAD/tubulina para SM7 y SM9, respectivamente, en comparación con la estimulación con PMO-2). SM1 tuvo solo un efecto leve sobre la fosforilación de SMAD (inhibición del 24,2 % y 19,9 % para 2,5 μM y 5 μM, respectivamente).

Ejemplo 6

El efecto de SM1, SM7, SM9 y SM6 sobre la inhibición de PMO-4

[0134] Debido a la alta homología entre PMO-2 y PMO-4, la capacidad de los SM para inhibir la señalización de PMO-2 y PMO-4 (similar al efecto del mAb anti-PMO-2/4) también se examinó. La neutralización de PMO-4 se analizó usando el mismo bioensayo que se usó para la detección (es decir, bioensayo ATDC5 con ALP y detección de viabilidad), excepto que para la estimulación de las células ATDC5 se empleó rhBMP-4 en lugar de rhBMP-2.

[0135] Como se muestra en la Figura 9, SM1 y SM6 tuvieron el mismo efecto sobre la producción de ALP inducida por PMO-4 y por PMO-2. Tanto SM7 como SM9 parecían inhibir PMO-2 ligeramente más que PMO-4 (durante 2,5 μM s M7-47,3% de inhibición de PMO-2, en comparación con 29,8% de inhibición de PMO-4, y para 2,5 μM SM9- 29,1% de inhibición de PMO-2, en comparación con 18,9% de inhibición de PMO-4).

Ejemplo 7

El efecto de SM1, SM7, SM9 y SM6 sobre la expresión de novo del marcador de neuroblastos doblecortina (DCX) en la zona subventricular (z S v) y la zona subgranular (SGZ)

[0136] A ratones inducidos con EAE-RR se les inyectó por vía intraperitoneal 250 μg/ratón (Low-L) o 500 μg/ratón (High-H) de las moléculas pequeñas SM1, SM7, SM9, SM6 o el vehículo correspondiente. Los SM se inyectaron cada día a partir del día 9 después de la inmunización durante 30 días. Para el análisis inmunohistoquímico, a 3 ratones de cada grupo se les inyectó por vía intraperitoneal diariamente bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) a partir del día 9 después de la inmunización durante los 8 días siguientes. Como puede verse en las Figuras 10A-10B, la cuantificación de células BrdU DCX en la ZSV de los ratones con EAE reveló que SM9L (la dosis baja de SM9) provocó un aumento significativo de células BrdU DCX . Los resultados también revelan una tendencia a una mayor inducción de células BrdU DCX por parte de SM9H, SM1L, SM1H y SM6H en comparación con el vehículo de control.

[0137] A continuación, se evaluó la cantidad de células BrdU DCX en la SGZ de ratones. Las Figuras 11A-11B muestran el marcaje inmunohistoquímico de células BrdU DCX en ratones con EAE después del tratamiento con los SM o con vehículo. Cuantificación de las células BrdU DCX revelaron un aumento significativo de la inducción de células BrdU DCX en la SGZ por parte de SM9H junto con una tendencia a una mayor inducción de células BrdU DCX por parte de SM9L, SM6L y SM7L en comparación con el tratamiento con el vehículo.

Ejemplo 8

El efecto de SM1, SM7, SM9 y SM6 sobre la expresión de novo del marcador de neuronas maduras NeuN en la SGZ.

[0138] En este experimento, se evaluó la cantidad de células BrdU NeuN en la SGZ de ratones. Las Figuras 12A-12B muestran el marcaje inmunohistoquímico de células BrdU NeuN en ratones con EAE que fueron tratados con SMs o vehículo, usando microscopio Olympus 8.1 (aumento x 10). La cuantificación de células BrdU NeuN reveló un aumento significativo de la inducción de células BrdU NeuN en la SGZ por parte de los ratones tratados con SM1H y SM9L junto con una tendencia a un aumento de la inducción de células BrdU NeuN por parte de SM9H, en comparación con el tratamiento con el vehículo.

Referencias citadas

[0139] Las referencias que se consideran relevantes como antecedentes del tema actualmente divulgado se enumeran a continuación:

[1] Trapp, B. D. and Nave, K.A. Annu. Rev. Neurosci. 2008; 31:247-269.

[2] Grinspan J. B. (2015) Vitamins and Hormones, Capítulo 6, volumen 99, páginas 195-222.

[3] US 2015/139983

[4] US 2008/0249038

[5] Simonini M. V. et al. ASN Neuro. 2010 enero 15; 2(1); e00025

[6] Li D. et al. Hippocampus 2008; 18: 692-8

[7] Mabie P.C. et al. J. Neurosci. 1997, 17: 4112-4120

[8] Gross R.E. et al. Neuron 1996, 17: 595-606

[9] Gomes W.A. et al. Dev. Biol. 2003, 255: 164-177

[10] Lim D.A. et al. Neuron 2000, 28: 713-726

[11] WO 11/019678

[12] US 2006217390

[13] WO 03/105857

[14] US 2004039037

[15] Kurtzke, J. F. neurology 1983: 33(11):1444-1452

[16] Bani-Yaghoub M, Felker JM, Sans C, Naus CC. Exp Neurol. 2000; 162:13-26.

[17] WO 2013/18677

[0140] El reconocimiento de las referencias anteriores en este documento no debe inferirse en el sentido de que estas son de alguna manera relevante para la patentabilidad de la materia actualmente divulgada.

Claims (6)

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto que tiene la formula general (la) o una de sus sales:

donde

X1 y X2 son cada uno independientemente S;

X3 es CN;

X4, X5, X6, X7 y X8 son cada uno H;

R1 es H; y

R3 es OR5, donde R5 es metilo o etilo.

2. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, para uso en el tratamiento de una enfermedad neuroinflamatoria.

3. La composición farmacéutica para uso de la reivindicación 2, en la que dicho tratamiento comprende además un agente terapéutico adicional.

4. La composición farmacéutica para uso de cualquiera de las reivindicaciones 2-3, en la que la enfermedad neuroinflamatoria es esclerosis múltiple.

5. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 4, en la que la esclerosis múltiple es una esclerosis múltiple remitente recurrente.

6. La composición farmacéutica de la reivindicación 1 o la composición farmacéutica para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 2-5, donde el compuesto es SM1.