ES2951666T3 - Procedimientos y composiciones para purificar ácidos nucleicos bicatenarios - Google Patents

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Cherie Holcomb
Alan Casilla
Trevor Hryce
Qiao Ruan
Karan Kampani
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Abstract

En el presente documento se proporcionan métodos y composiciones para aislar eficazmente ácidos nucleicos cortos de doble cadena en partículas de vidrio magnéticas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimientos y composiciones para purificar ácidos nucleicos bicatenarios
Antecedentes de la invención
Se usan convenientemente microesferas de vidrio magnéticas para la purificación de ácidos nucleicos. Recientemente, se ha centrado la atención en la obtención de ácidos nucleicos de muestras obtenidas de manera mínimamente invasiva o no invasiva, por ejemplo, de sangre, saliva, orina, etc. Los ácidos nucleicos libres de células (ANlc) en estas muestras pueden incluir polinucleótidos relativamente cortos, por ejemplo, menos de 100 o 1000 pb, que no se recuperan eficazmente con microesferas de vidrio magnéticas usando condiciones de elución y unión estándar. Además, se obtienen ANlc bicatenarios insuficientes, que se requieren para algunas técnicas analíticas, usando condiciones estándar.
Dichos procedimientos estándar se divulgan, por ejemplo, en los siguientes documentos.
El documento WO2013/003376 divulga procedimientos para segregar ácidos nucleicos diana de muestras de ácidos nucleicos mixtos. El documento e P 1748072 divulga procedimientos para obtener ácidos nucleicos usando PVM recubiertas con hidroxisal particulares, en los que la elución de ADN se realiza a una temperatura de 80 °C. El documento US 6.255.477 divulga el uso de PVM que tienen una superficie de vidrio para aislar ácidos nucleicos, en el que la elución de ADN se realiza a una temperatura de 70 °C. Sin embargo, ninguno de estos documentos divulga un procedimiento automatizado en el que los ácidos nucleicos libres de células permanezcan en forma bicatenaria desde la muestra hasta la elución, permitiendo, de este modo, una alta recuperación de ácidos nucleicos bicatenarios.
El documento WO2014/122288 divulga un procedimiento para aislar ADN, que se une a una superficie que contiene silicio, en el que el tamaño de ADN que se une a la superficie se controla por el pH de la mezcla de unión. Degenkolbe et al.; Analytical Biochemistry (2005), vol. 346, n.° 2; páginas 217-224 divulga un procedimiento de obtención del perfil de expresión génica en micromatrices usando un procedimiento de preparación de muestras que utiliza PVM para unir ARNm, en el que el ARNm se eluye de las microesferas durante 2 minutos a 95 °C y en el que la etapa de elución se realiza dos veces. El documento US 2002/132244 divulga un procedimiento para detectar mutaciones nucleares de baja frecuencia que comprende el aislamiento de ADN genómico usando microesferas recubiertas con estreptavidina, en el que, después de la separación, el ADN capturado se calienta para su elución y posteriormente rehibridarse para formar dobles cadenas. Sin embargo, no existe divulgación en ninguno de estos documentos sobre un procedimiento automatizado en el que los ácidos nucleicos libres de células permanezcan en forma bicatenaria desde la muestra hasta la elución, permitiendo, de este modo, una alta recuperación de ácidos nucleicos bicatenarios.
El documento US 2003/199078 divulga protocolos para el aislamiento de ADN usando PVM que comprende una etapa de elución que se realiza a temperatura ambiente o, de forma alternativa, usando un tampón de elución precalentado que tiene una temperatura de 70 u 80 °C. El documento EP 1519577 divulga un procedimiento para aislar ADN o ARN usando microesferas magnéticas de sílice en un procedimiento preferentemente automatizado. Después del aislamiento automatizado de ADN genómico, se realiza una única etapa de elución a temperatura ambiente. Sin embargo, ninguno de estos documentos tampoco divulga el aislamiento de ácidos nucleicos libres de células en el que se realicen al menos dos etapas de elución a una temperatura de entre 25 °C y 45 °C, ni existe ninguna indicación de que el ADN libre de células permanezca en forma bicatenaria desde la muestra hasta la elución.
Sumario de la invención
El alcance de la invención se define por las reivindicaciones adjuntas.
En el presente documento se proporcionan procedimientos y composiciones para la recuperación automatizada de ácidos nucleicos bicatenarios de microesferas de vidrio magnéticas (PVM). Los procedimientos comprenden eluir ácidos nucleicos bicatenarios unidos de forma no covalente a las PVM de las PVM usando dos o más eluciones a baja temperatura. En el presente documento, se proporciona un procedimiento automatizado para recuperar ácidos nucleicos bicatenarios de una muestra de líquido, que comprende a) poner en contacto una muestra de líquido que contiene ácidos nucleicos bicatenarios con partículas de vidrio magnéticas (PVM) en una solución caótropa a una temperatura de entre 25 °C y 45 °C en un recipiente, permitiendo, de este modo, que los ácidos nucleicos bicatenarios se unan de forma no covalente a las PVM en solución en el recipiente; b) aplicar un campo magnético al recipiente que contiene ácidos nucleicos bicatenarios unidos de forma no covalente a las PVM en solución (por ejemplo, que comprende tampón de lavado o muestra con tampón de unión) y retirar el líquido no unido a las PVM; c) llevar a cabo una primera etapa de elución, en el que dicha primera etapa de elución comprende (i) poner en contacto ácidos nucleicos bicatenarios unidos de forma no covalente a las PVM con tampón de elución que tiene un pH de 7-10 en el recipiente a una temperatura de entre 25 °C y 45 °C durante 5-30 minutos; (ii) aplicar un campo magnético al recipiente; y (iii) obtener líquido no unido a las PVM obteniendo de este modo el eluato; d) llevar a cabo una segunda etapa de elución, en el que dicha segunda etapa de elución comprende (i) poner en contacto ácidos nucleicos bicatenarios unidos de forma no covalente a las PVM con tampón de elución que tiene un pH de 7-10 en el recipiente a una temperatura de entre 25 °C y 45 °C durante 5-30 minutos; (ii) aplicar un campo magnético al recipiente; y (iii) obtener líquido no unido a las PVM, obteniendo, de este modo, el eluato; en el que el eluato obtenido en las etapas c)(iii) y d)(iii) comprende al menos un 30 % de ácidos nucleicos bicatenarios recuperados de las PVM de los ácidos nucleicos totales en el eluato y en el que los ácidos nucleicos bicatenarios son ADN libre de células de 50-500 pares de bases de longitud.
La temperatura en las etapas c)(i) y d)(i) está entre 25 °C y 45 °C, por ejemplo, 25 °C, 37 °C, 42 °C o 45 °C. En algunos modos de realización, los ácidos nucleicos bicatenarios son de una muestra libre de células, por ejemplo, seleccionada del grupo que consiste en sangre, plasma, suero, líquido amniótico, líquido cefalorraquídeo y orina.
En algunos modos de realización, la solución en las etapas a) y b) tiene un pH menor de 7, por ejemplo, 3-6,5 o 3,5-6. En algunos modos de realización, el tampón de elución tiene un pH de 7,5-9.
En algunos modos de realización, el procedimiento automatizado comprende además entre las etapas a) y b): aplicar un campo magnético al recipiente y retirar el líquido no unido a las PVM, dejando, de este modo, ácidos nucleicos bicatenarios unidos de forma no covalente a las PVM; y añadir líquido (por ejemplo, tampón de lavado) a los ácidos nucleicos bicatenarios unidos de forma no covalente a las PVM. En algunos modos de realización, las etapas de suspender ácidos nucleicos bicatenarios unidos de forma no covalente a las PVM en tampón de lavado, aplicar un campo magnético y retirar el líquido no unido se llevan a cabo más de una vez (por ejemplo, 2, 3, 4 o 5 veces) antes de la elución.
En algunos modos de realización, el tampón de elución se pone en contacto con los ácidos nucleicos bicatenarios unidos de forma no covalente a las PVM durante 5-10, 10-30, 5-25 o 7-25 minutos) en las etapas c)(i) y d)(i). En algunos modos de realización, se llevan a cabo más de dos eluciones, por ejemplo, 3, 4, 5 o 6 eluciones. En algunos modos de realización, las dos o más eluciones tienen duraciones diferentes, mientras que en otros modos de realización las eluciones son de la misma duración.
En algunos modos de realización, el tampón de elución se mezcla con los ácidos nucleicos bicatenarios unidos de forma no covalente a las PVM usando una pipeta automatizada. En algunos modos de realización, el recipiente es un pocillo en una placa multipocillo. En algunos modos de realización, el recipiente es un tubo, por ejemplo, con una capacidad de 1-5 o 1,5-3 ml. En algunos modos de realización, el recipiente es un micropocillo/microcámara en una micromatriz genética.
Los ácidos nucleicos recuperados en el eluato de las etapas c)(iii) y d) (iii) comprenden al menos un 30 % de ácidos nucleicos bicatenarios (por ejemplo, no desnaturalizados, emparejados de forma natural). Es decir, los ácidos nucleicos bicatenarios recuperados en el eluato comprenden al menos un 30 % de los ácidos nucleicos totales en el eluato. En algunos modos de realización, los ácidos nucleicos recuperados en el eluato de las etapas c) (iii) y d) (iii) comprenden al menos un 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 % o más ácidos nucleicos bicatenarios.
Descripción detallada de la invención
I. Introducción
La presente divulgación proporciona reactivos que mejoran la purificación de ácidos nucleicos (AN) de pequeño tamaño (por ejemplo, ≤1 kb, 50-2000 pb, 50-500 pb, 100-1000 pb) a partir de fuentes biológicas (por ejemplo, plasma, suero, orina, y otros líquidos corporales, así como a partir de muestras celulares o lisados) usando partículas de vidrio magnéticas (PVM). Las técnicas y composiciones divulgadas actualmente permiten la recuperación de ANlc bicatenario en una cantidad suficiente para las técnicas analíticas posteriores, tales como amplificación y secuenciación. El desarrollo de dichos reactivos y técnicas es necesario porque, con los reactivos de aislamiento de ácidos nucleicos estándar, los ácidos nucleicos pequeños no se recuperan de las PVM y, por tanto, no se purifican en cantidades apreciables. Los reactivos y procedimientos divulgados actualmente superan el problema de baja recuperación de los AN circulantes cuando se usan en combinación con otros reactivos existentes en productos de preparación de ácidos nucleicos (PAN).
Estos procedimientos son útiles no solo con productos de PAN de Roche (por ejemplo, reactivos MagNA Pure), sino con otros sistemas similares.
Las partículas de vidrio magnéticas se pueden usar para la purificación de ácidos nucleicos (PAN) manual o para la pAn automatizada en un sistema especializado apropiado (por ejemplo, MagNA Pure 96 o MagNA Pure 24) o un manipulador de líquidos general (por ejemplo, Biomek NX).
Los volúmenes de muestras biológicas usadas pueden variar desde muy pequeños (por ejemplo, 50 ul) hasta grandes (por ejemplo, 4 ml o más). Los ejemplos no limitantes de usos para los procedimientos y reactivos descritos actualmente incluyen la purificación de ácido nucleico libre de células a partir de plasma u orina como "biopsia líquida" para cáncer, pruebas prenatales no invasivas (PPNI) y detección temprana de rechazo de trasplante de órganos sólidos.
Los procedimientos divulgados actualmente permiten la purificación de ácidos nucleicos bicatenarios pequeños usando microesferas magnéticas con mayor recuperación que otros sistemas automatizados, e incluso algunas técnicas manuales para PAN, por ejemplo, columnas giratorias.
II. Definiciones
El término "automatizado" se refiere a acciones llevadas a cabo de manera programada sin acción humana directa. La acción automatizada se puede controlar de forma remota, programar u observar por un técnico, pero sin requerir que el técnico interfiera manualmente, por ejemplo, use una pipeta manual, mueva recipientes a mano, etc.
El término "partícula de vidrio magnética" o "PVM" se refiere a una partícula que comprende vidrio que se une de forma no covalente a ácidos nucleicos, y al menos un núcleo magnético (por ejemplo, una dispersión de núcleos magnéticos) que responden a un campo magnético. El vidrio no es necesariamente sílice pura, aunque la sílice puede ser un componente. Las PVM son lo suficientemente pequeñas como para pipetearse en una punta de pipeta estándar y formar una suspensión, típicamente de 0,5-15 um. Las PVM son aproximadamente esféricas en promedio, y pueden ser porosas o no porosas. El núcleo magnético puede ser ferromagnético o paramagnético (solo magnetizado en presencia de un campo magnético). Las PVM adecuadas se describen con más detalle, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. n.os 6.255.477 y 6.545.143.
Los términos "matriz sólida (o semisólida)", "soporte sólido (o semisólido)" se usan en el presente documento para indicar una superficie o cuerpo inerte al que se puede inmovilizar un agente, tal como un ácido nucleico. Los ejemplos no limitantes incluyen vidrio, sílice, plástico, nitrocelulosa, membranas, micromatrices genéticas y partículas. El término "inmovilizado" como se usa en el presente documento indica un acoplamiento con base molecular que no se desacopla significativamente en las condiciones impuestas durante las etapas de los ensayos descritos en el presente documento. Dicha inmovilización se puede lograr a través de un enlace covalente, un enlace iónico, un enlace de tipo afinidad o cualquier otro enlace químico.
El término "en solución", por ejemplo, en referencia a un soporte sólido en solución, puede indicar que el soporte sólido está expuesto a una solución (por ejemplo, en contacto con los componentes del ensayo en solución) o que los propios soportes sólidos están en solución (por ejemplo, microesferas o partículas suspendidas en líquido). El término se usa para distinguir entre la fase líquida hidrófila y una emulsión con componentes hidrófilos e hidrófobos separados.
Los términos "receptáculo", "recipiente", "tubo", "pocillo", "cámara", "microcámara", etc., se refieren a un recipiente que puede contener reactivos o un ensayo. Si el receptáculo está en un kit y contiene reactivos, o se usa para una reacción de amplificación, se puede cerrar o sellar para evitar la contaminación o evaporación. Si el receptáculo se usa para un ensayo, puede estar abierto o ser accesible, al menos durante la configuración del ensayo.
El término "captura", "capturar", "unir" o "unión", en el contexto de un ácido nucleico que se une a PVM, se refiere a la unión no covalente, por ejemplo, a través de interacción caótropa o iónica. La interacción PVM-ácido nucleico se puede alterar por elución, por ejemplo, usando un tampón de elución que interfiera con la interacción no covalente.
Los términos "ácido nucleico", "polinucleótido" y "oligonucleótido" se refieren a polímeros de nucleótidos (por ejemplo, ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos) e incluyen ácidos nucleicos naturales (adenosina, guanidina, citosina, uracilo y timidina), no naturales y modificados. El término no está limitado por la longitud (por ejemplo, número de monómeros) del polímero. Un ácido nucleico puede ser monocatenario o bicatenario y, en general, contendrá enlaces fosfodiéster 5'-3', aunque, en algunos casos, los análogos nucleotídicos pueden tener otros enlaces. Los monómeros típicamente se denominan nucleótidos. El término "nucleótido modificado" se refiere a un nucleótido no natural que contiene un grupo fosfato, glúcido o base nitrogenada modificada, o que incorpora un resto no natural en su estructura. Los ejemplos de nucleótidos no naturales incluyen didesoxinucleótidos, nucleótidos biotinilados, aminados, desaminados, alquilados, bencilados y marcados con fluoróforo.
Los ácidos nucleicos bicatenarios, en el contexto de la presente divulgación, se refieren típicamente a tramos de ADN emparejados de forma natural, no desnaturalizados, que no se han separado y rehibridado (reemparejados por emparejamiento de bases de Watson-Crick). En muestras de biopsia líquida, tales como sangre, plasma, suero, orina, moco, líquido cefalorraquídeo y líquido amniótico, los ácidos nucleicos libres de células incluyen dichos ácidos nucleicos bicatenarios en longitudes que varían de aproximadamente 40-1000 pares de bases de longitud. Los ácidos nucleicos libres de células se liberan de las células, por ejemplo, de células destruidas por apoptosis, o en vesículas extracelulares o exosomas. Los fragmentos bicatenarios, a medida que se liberan en los ácidos nucleicos libres de células, normalmente se emparejan casi completamente, por ejemplo, sin ningún nucleótido con emparejamiento de bases, solo unos pocos protuberantes, en cada extremo. Los fragmentos de ADN bicatenario también se pueden producir sintéticamente por ejemplo por sonicación o cizallamiento de ADN genómico. Estos fragmentos de ADNbc producidos sintéticamente también tienen extremos, en gran medida, romos. Los fragmentos de ADN bicatenario con extremos romos también se pueden producir por digestión o amplificación con enzimas de restricción. Cuando una mezcla de dichos fragmentos bicatenarios se expone a alta temperatura, se pueden dañar (fundir, desnaturalizar, no hi bridar) y, a temperatura reducida, permanecer en forma monocatenaria o rehibridarse (experimentar reemparejamiento de bases, renaturalizar) con una hebra que tenga un diferente tramo de secuencia o longitud que la hebra con la que se emparejó cuando se liberó de una célula. Esto último puede dar lugar al emparejamiento de fragmentos solapantes, de modo que exista una porción monocatenaria más larga y emparejada de forma errónea en cualquier extremo de la sección bicatenaria, es decir, más protuberancia. Los emparejamientos erróneos con protuberancias o ácidos nucleicos monocatenarios podrían dar lugar a un rendimiento reducido durante los procedimientos posteriores, por fallo en el relleno de los extremos romos antes de la fijación de la secuencia de adaptador (por ejemplo, para la secuenciación) o bien en procedimientos de purificación con una recuperación más eficaz de ADNbc que monocatenario. De forma alternativa, se puede producir el emparejamiento erróneo en un número limitado de sitios internos, por ejemplo, donde una hebra tenga una mutación y la otra no. Dichos emparejamientos erróneos de único par de bases son incompatibles con la secuenciación de nueva generación posterior, en la que se comprueba la concordancia de hebras para asegurar la exactitud.
El término "cebador" se refiere a un ácido nucleico monocatenario corto (un oligonucleótido) que actúa como un punto de iniciación de la síntesis de hebras de polinucleótido por una ácido nucleico polimerasa en condiciones adecuadas. Las reacciones de síntesis y amplificación de polinucleótidos típicamente incluyen un tampón apropiado, dNTP y/o rNTP, y uno o más cofactores opcionales, y se llevan a cabo a una temperatura adecuada. Un cebador incluye típicamente al menos una región hibridada a la diana que es al menos sustancialmente complementaria a la secuencia diana (por ejemplo, que tiene 0, 1, 2 o 3 emparejamientos erróneos). Esta región típicamente es de aproximadamente 8 a aproximadamente 40 nucleótidos de longitud, por ejemplo, 12-25 nucleótidos. Como se usa en el presente documento, "sonda" significa cualquier molécula que se pueda unir selectivamente a una biomolécula diana específicamente pretendida, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico de interés que se va a unir, capturar o hibridar por las sondas.
Las palabras "complementario" o "complementariedad" se refieren a la capacidad de un ácido nucleico en un polinucleótido de formar un par de bases con otro ácido nucleico en un segundo polinucleótido. Por ejemplo, la secuencia A-G-T (A-G-U para ARN) es complementaria a la secuencia T-C-A (U-C-A para ARN). La complementariedad puede ser parcial, en la que solo algunos de los ácidos nucleicos coinciden de acuerdo con el emparejamiento de bases, o completa, donde todos los ácidos nucleicos coinciden de acuerdo con el emparejamiento de bases. Una sonda o cebador se considera "específico para" una secuencia diana si es al menos parcialmente complementario a la secuencia diana. Dependiendo de las condiciones, el grado de complementariedad a la secuencia diana es típicamente mayor para un ácido nucleico más corto tal como un cebador (por ejemplo, más de un 80 %, 90 %, 95 % o mayor) que para una secuencia más larga.
Los términos "idéntico" o "porcentaje de identidad", en el contexto de dos o más ácidos nucleicos, o dos o más polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de nucleótidos, o aminoácidos, que son iguales (por ejemplo, aproximadamente un 60 % de identidad, por ejemplo, al menos cualquiera de un 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mayor identidad en una región especificada, cuando se compara y alinea para una máxima correspondencia en un margen de comparación o región designada) como se mide usando un algoritmo de comparación de secuencias BLAST o BLAST 2.0 con parámetros predeterminados, o por alineación manual e inspección visual. Véase, por ejemplo, el sitio web del NCBI en ncbi.nlm.nih.gov/BLAST. Se dice entonces que dichas secuencias son "sustancialmente idénticas". El porcentaje de identidad típicamente se determina sobre secuencias óptimamente alineadas, de modo que la definición se aplica a secuencias que tienen deleciones y/o adiciones, así como a las que tienen sustituciones. Los algoritmos usados comúnmente en la técnica consideran los huecos y similares. Típicamente, la identidad existe en una región que comprende una secuencia que es al menos aproximadamente 8-25 aminoácidos o nucleótidos de longitud, o en una región que es de 50-100 aminoácidos o nucleótidos de longitud, o en toda la longitud de la secuencia de referencia.
El término "kit" se refiere a cualquier fabricación (por ejemplo, un envase o un recipiente) que incluye al menos un reactivo, tal como una sonda o grupo de sondas de ácido nucleico o similares, para específicamente amplificar, capturar, marcar/convertir o detectar ARN o ADN como se describe en el presente documento.
El término "condiciones de amplificación" se refiere a condiciones en una reacción de amplificación de ácido nucleico (por ejemplo, amplificación por PCR) que permiten la hibridación y extensión dependiente de molde de los cebadores. Los términos "amplicón" y "producto de amplificación" se refieren a una molécula de ácido nucleico que contiene toda o un fragmento de la secuencia de ácido nucleico diana y que se forma como producto de amplificación in vitro por cualquier procedimiento de amplificación adecuado. Un experto entenderá que un cebador directo e inverso (par de cebadores) definen los límites de un producto de amplificación. El término "generar un producto de amplificación", cuando se aplica a los cebadores, indica que los cebadores, en condiciones apropiadas (por ejemplo en presencia de una nucleótido polimerasa y NTP), producirán el producto de amplificación definido. Diversas condiciones de PCR se describen en PCR Strategies (Innis et al 1995 Academic Press San Diego, CA) en el capítulo 14; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., Academic Press, NY, 1990).
El término "producto de amplificación" se refiere al producto de una reacción de amplificación. El producto de amplificación incluye los cebadores usados para iniciar cada ronda de síntesis de polinucleótidos. Un "amplicón" es la secuencia seleccionada para amplificación, y el término también se puede usar para referirse al producto de amplificación. Los límites 5' y 3' del amplicón están definidos por los cebadores directo e inverso.
El término "muestra" o "muestra biológica" se refiere a cualquier composición que contiene o que se sospecha que contiene ácido nucleico. El término incluye componentes purificados o separados de células, tejidos o sangre, por ejemplo, ADN, ARN, proteínas, porciones libres de células o lisados celulares. En el contexto de la presente divulgación, la muestra es líquida, por ejemplo, sangre o un componente sanguíneo (plasma o suero), orina, semen, saliva, esputo, moco, semen, lágrima, linfa, líquido cefalorraquídeo, enjuague bucal/de garganta, lavado broncoalveolar, material lavado de un hisopo, etc. Las muestras también pueden incluir constituyentes y componentes de cultivos in vitro de células obtenidas de un individuo, incluyendo líneas celulares. La muestra de líquido también se puede procesar parcialmente de una muestra obtenida directamente de un individuo, por ejemplo, lisado celular o sangre deficitaria en glóbulos sanguíneos.
En el contexto de la presente divulgación, el término "líquido no unido" o "muestra no unida" se refiere a líquido y otros componentes (por ejemplo, material proteínico o restos celulares) que no está unido al soporte sólido o PVM, por ejemplo, líquido deficitario en ácidos nucleicos u otra diana. El líquido no unido todavía puede incluir una cantidad residual de ácidos nucleicos o diana.
Las vesículas extracelulares, que incluyen exosomas, microvesículas y cuerpos apoptóticos, son vesículas derivadas de células (cuerpo encerrado en membrana) presentes en líquidos biológicos, por ejemplo, sangre y orina. Las células pueden liberar vesículas extracelulares, por ejemplo, directamente desde la membrana plasmática, o se pueden formar cuando los cuerpos multivesiculares se fusionan con la membrana plasmática. Las vesículas extracelulares típicamente incluyen componentes tales como ácidos nucleicos y proteínas de su célula de origen. Los exosomas tienen típicamente un diámetro de 40-120 nm, las microvesículas tienen típicamente un diámetro de 50-1000 nm y los cuerpos apoptóticos tienen típicamente un diámetro de 500-2000 nm.
Una muestra o un valor de "control" se refiere a un valor que sirve como referencia, normalmente una referencia conocida, para su comparación con una muestra de prueba o condiciones de prueba. Por ejemplo, se puede tomar una muestra de prueba de una condición de prueba, por ejemplo, de un individuo que se sospecha que tiene cáncer, y comparar con muestras de condiciones conocidas, por ejemplo, de un individuo sin cáncer (control negativo), o de un individuo que se sabe que tiene cáncer (control positivo). Un control también puede representar un valor promedio o un intervalo recabado de una serie de pruebas o resultados. También se puede preparar un control para las condiciones de reacción. Por ejemplo, un control positivo en cuanto a la presencia de ácido nucleico podría incluir cebadores o sondas que detectarán una secuencia que se sabe que está presente en la muestra (por ejemplo, un gen constitutivo tal como beta-actina, beta-globina, DHFR o succinato deshidrogenasa, o un polinucleótido añadido conocido, por ejemplo, que tenga una longitud designada). Un ejemplo de un control negativo es uno libre de ácidos nucleicos o uno que incluye cebadores o sondas específicos para una secuencia que no estaría presente en la muestra, por ejemplo, de una especie diferente. Un experto entenderá que la selección de control positivo y negativo dependerá del ensayo particular, por ejemplo, de modo que el control sea apropiado para el tipo de célula y organismo. Un experto en la técnica reconocerá que se pueden diseñar controles para la evaluación de cualquier serie de parámetros. Por ejemplo, se puede idear un control para comparar el beneficio terapéutico basado en datos farmacológicos (por ejemplo, semivida) o medidas terapéuticas (por ejemplo, comparación de beneficio y/o efectos secundarios). Los controles se pueden diseñar para aplicaciones in vitro, por ejemplo, una secuencia conocida en una cantidad conocida. Un experto en la técnica entenderá qué controles son valiosos en una situación dada y podrá analizar datos en base a comparaciones con valores de control. Los controles también son valiosos para determinar la significación de los datos. Por ejemplo, si los valores para un parámetro dado son ampliamente variables en los controles, la variación en las muestras de prueba no se considerará significativa.
Los términos "marcador", "marca", "resto detectable" y términos similares se refieren a una composición detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, químicos u otros medios físicos. Por ejemplo, los marcadores útiles incluyen tintes fluorescentes, agentes luminiscentes, radioisótopos (por ejemplo, 32P, 3H), reactivos de alta densidad electrónica o un resto basado en afinidad, por ejemplo, una marca de poli-A (interactúa con poli-T) o de poli-T (interactúa con poli-A), una marca His (interactúa con Ni) o una marca de estreptavidina (separable con biotina).
A menos que se defina de otro modo, los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que como se entiende comúnmente por un experto en la técnica. Véanse, por ejemplo, Lackie, DICTIONARY OF CELL AND MOLECULAR BIOLOGY, Elsevier (4.a ed. 2007); Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, N.Y. 1989). Se pretende que el término "un" o "una" signifique "uno/a o más". Se pretende que los términos "comprender", "comprende" y "que comprende", cuando preceden a la mención de una etapa o un elemento signifiquen que la adición de otras etapas o elementos es opcional y no se excluye.
MI. Muestras de ácido nucleico
Las muestras para la amplificación de ácido nucleico se pueden obtener de cualquier fuente que se sospeche que contiene ácido nucleico. En algunos modos de realización, la muestra se obtiene de manera no invasiva, por ejemplo, de orina, piel, hisopo, saliva, sangre o una fracción de sangre. Las muestras también se pueden tomar de una biopsia tisular, tejido incluido en parafina fijado con formol (FFPET) o células cultivadas. Son conocidos procedimientos para aislar ácidos nucleicos de muestras biológicas, por ejemplo, como se describe en Sambrook, y están disponibles comercialmente varios kits (por ejemplo, kit de aislamiento de ADN para células y tejidos, kit de aislamiento de ADN para sangre de mamífero, kit de aislamiento de ADN de FFPEt de alta pureza, kit de aislamiento de ARN de alta pureza, kit de ácido nucleico vírico de alta pureza y kit de aislamiento de ácidos nucleicos totales MagNA Pure LC, disponibles de Roche).
Los presentes procedimientos también se pueden aplicar a líquidos, por ejemplo, preparados a partir de muestras de alimentos o plantas o de toallitas de superficies, por ejemplo, en un entorno hospitalario.
En una muestra que incluye células, las células se pueden separar (por ejemplo, usando filtración o centrifugación basada en tamaño), dejando, de este modo, ácidos nucleicos libres de células (ANlc), incluyendo ácidos nucleicos en exosomas, microvesículas, partículas víricas o aquellos que circulan libremente. De forma alternativa, las células se pueden lisar para obtener ácidos nucleicos celulares, en presencia de PVM o bien antes de la adición del lisado celular a las PVM.
El tampón de lisis (TL) que se puede usar para el aislamiento de ácidos nucleicos puede incluir GuSCN 3-6 M o urea, tampón 0-500 mM (Tris-HCl, MOPS, HEPES, etc.), detergente al 10-25 % (por ejemplo, Tween, Triton-X o polidocanol, etc.), citrato de sodio 0-200 mM, a pH 5,0-8. Aunque que el TL se refiera a la lisis, se puede usar en muestras libres de células, tales como plasma o suero, y puede actuar para lisar vesículas extracelulares, exosomas o microvesículas, si están presentes.
IV. Soportes sólidos y partículas de vidrio magnéticas (PVM)
Los procedimientos de preparación de ácidos nucleicos descritos actualmente implican el uso de un soporte sólido o semisólido, por ejemplo, una partícula (por ejemplo, micropartículas o microesferas). El intervalo de tamaños de las micropartículas puede variar y los intervalos de tamaños particulares no son críticos. En la mayoría de los casos, el intervalo de tamaños de agregados de las micropartículas se encuentra dentro del intervalo de desde aproximadamente 5 nanómetros a aproximadamente 500 micrómetros de diámetro de partícula, por ejemplo, dentro del intervalo de desde aproximadamente 500 nanómetros a aproximadamente 50 micrómetros, de aproximadamente 1 micrómetro a aproximadamente 100 micrómetros, o de aproximadamente 1 micrómetro a 30 micrómetros.
Las partículas de vidrio magnéticas (PVM) son conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. n.os 6.255.477 y 6.545.143. Las partículas usadas para los procedimientos descritos actualmente son típicamente ferromagnéticas. Las partículas son, en promedio, aproximadamente esféricas con un diámetro de 0,5­ 15 um (por ejemplo, 1-10, 0,8-2 o 1-1,5 um). En algunos modos de realización, las partículas son no porosas.
Las PVM pueden tener un único núcleo magnético recubierto por vidrio, o comprender vidrio infundido con varios objetos magnéticos. La sustancia magnética puede ser hierro u óxido de hierro, como magnetita (Fe3O4) o Fe2O3 (por ejemplo, gamma-Fe2O3). Se puede usar ferrita de bario, níquel, cobalto, aleaciones de Al-Ni-Fe-Co u otras sustancias ferromagnéticas. También se pueden incluir óxidos metálicos en el núcleo magnético, por ejemplo, óxido de aluminio, óxido de hierro, óxido de cromo, óxido de cobre, óxido de manganeso, óxido de plomo, óxido de estaño, óxido de titanio, óxido de cinc u óxido de circonio.
El componente de vidrio típicamente se basa en sílice, por ejemplo, óxido de silicio y vidrio en polvo, alquil-sílice, silicato de aluminio o sílice activada con NH2. En algunos modos de realización, el vidrio comprende al menos un óxido metálico (por ejemplo, SiO2, B2O3, AhO3, K2O, CaO y/o ZnO). En algunos modos de realización, el vidrio comprende SiO2, B2O3, AhO3, K2O y CaO en orden de porcentaje molar. En algunos modos de realización, el vidrio comprende SiO2, B2O3, AhO3, K2O, CaO y ZnO en orden de porcentaje molar. En algunos modos de realización, además de SiO2, el vidrio puede incluir B2O3 (0-30 %), AhO3 (0-20 %), CaO (0-20 %), BaO (0-10 %), K2O (0-20 %), Na2O (0-20 %), MgO (0-18 %), Pb2O3 (0-15 %), ZnO (0-6 %). En algunos modos de realización, el vidrio comprende aproximadamente un 70-75 % de SiO2, aproximadamente un 14-16 % de B2O3, aproximadamente un 4-6 % de Al2O3, aproximadamente un 4-5 % de K2O, aproximadamente un 2-3 % de CaO y aproximadamente un 0-5 % de ZnO. Las PVM apropiadas para los procedimientos divulgados actualmente están disponibles comercialmente, por ejemplo, en los kits de preparación de muestras MagNA Pure y cobas® 4800 de Roche.
El ácido nucleico se une a las PVM en solución caótropa. Las soluciones caótropas pueden incluir tiocianato de guanidinio (GuSCN), clorhidrato de guanindina urea yoduro de sodio perclorato de sodio ion de tiocianato, ion de yodo, ion de perclorato, ion de nitrato, ion de bromo, ion de acetato, ion de cloro, ion de flúor o ion de azufre, o combinaciones de los mismos. En algunos modos de realización, el caótropo está en solución a aproximadamente 1-10 M, por ejemplo, 2-8 o 4-6 M, para permitir la unión del ácido nucleico.
Los procedimientos de, y la instrumentación para la, aplicación y retirada de un campo magnético como parte de un ensayo son conocidos para los expertos en la técnica y se informan en la literatura. Los ejemplos incluyen las patentes de EE. UU. n.os 4.141.687 y 4.115.534 y Vlieger et al., Analytical Biochemistry 205:1-7 (1992). Se puede usar cualquier instrumento que pueda llevar a cabo una separación magnética usando PVM. Dependiendo del dispositivo, las muestras se pueden procesar en cartuchos o placas de múltiples recipientes, o en recipientes individuales. Los recipientes (por ejemplo, tubos o pocillos de procesamiento) para su uso en instrumentos automatizados típicamente contienen un volumen de líquido de 50 ul a 4 ml, más típicamente de 1-2 ml.
Los ejemplos de instrumentos que se pueden usar para automatizar los procedimientos divulgados actualmente incluyen, pero no se limitan a, los instrumentos MagNA Pure (Roche), los instrumentos Dynamag® (Thermo Fisher), los sistemas QIAsymphony® (Qiagen), los sistemas Biomek® (Beckman) y los instrumentos Maxwell® (Promega).
V. Procesamiento y detección posteriores
Los ácidos nucleicos típicamente se eluyen de las microesferas antes del análisis, aunque las PVM son compatibles con algunos ensayos (por ejemplo, la detección de una sonda marcada hibridada a ácido nucleico en la PVM, PCR o cuando se produce la elución como parte del ensayo, tal como transferencia de Southern). Las condiciones de elución interfieren con la interacción no covalente (por ejemplo, caótropa o iónica) del ácido nucleico con la PVM, por ejemplo, agua, tampón con menor concentración de caótropo que la usada para unir ácidos nucleicos a las PVM, y/o temperatura elevada, como se apreciará por un experto en la técnica. El término "eluato" se refiere a un analito deseado (por ejemplo, ácidos nucleicos) liberado en solución desde un soporte sólido u otra matriz de separación.
La muestra de ácido nucleico purificado se puede usar para la detección, por ejemplo, usando secuenciación de nueva generación, micromatrices (ARN o ADN), transferencia de Southern o Northern, o amplificación de ácido nucleico, por ejemplo, usando cualquier procedimiento dependiente de cebador. Se pueden usar procedimientos basados en a Dn para la amplificación y detección, por ejemplo, PCR. En algunos modos de realización, se usa PCR ultrarrápida o cuantitativa (RTPCR o qPCR). La qPCR permite la detección y medición fiables de productos generados durante cada ciclo del procedimiento de PCR. Dichas técnicas son bien conocidas en la técnica, y los kits y reactivos están disponibles comercialmente, por ejemplo, de Roche Molecular Systems, Life Technologies, Bio-Rad, etc. Véase, por ejemplo, Pfaffl (2010) Methods: The ongoing evolution of qPCR, vol. 50. En algunos modos de realización, la porción de sonda de la sonda-cebador ramificado está marcada de forma doble (por ejemplo, una sonda TaqMan, CPT, LNA o MGB) con un extintor y un fluoróforo (véase, por ejemplo, Gasparic et al. (2010) Anal. Bioanal. Chem. 396:2023).
En algunos modos de realización, se lleva a cabo una etapa de retrotranscripción preliminar (también denominada RT-PCR, que no se debe confundir con PCR ultrarrápida). Véase, por ejemplo, Hierro et al. (2006) 72:7148. El término "qRT-PCR" como se usa en el presente documento se refiere a retrotranscripción seguida de PCR cuantitativa. Se pueden llevar a cabo ambas reacciones en un único tubo sin interrupción, por ejemplo, para añadir reactivos. Por ejemplo, se puede usar un cebador de poliT para retrotranscribir todos los ARNm en una muestra con una cola de poliA, o se puede diseñar un cebador que sea específico para un transcrito diana particular que se retrotranscribirá en ADNc. También se pueden usar procedimientos de amplificación basados en ARN adicionales, por ejemplo, amplificación basada en secuencia de ácido nucleico (NASBA) o amplificación mediada por transcripción (TMA).
Los dispositivos de detección son conocidos en la técnica y se pueden seleccionar según sea apropiado para los marcadores seleccionados. Los dispositivos de detección apropiados para la PCR cuantitativa incluyen los sistemas cobas® y Light Cycler® (Roche), los sistemas de p Cr ultrarrápida PRISM 7000 y 7300 (Applied Biosystems), etc.
Los resultados se pueden expresar en términos de un ciclo umbral (abreviado como Ct, Cq o Cp). Un menor valor de Ct refleja el rápido logro de un nivel umbral predeterminado, por ejemplo, debido a una mayor concentración de ácido nucleico diana o a una amplificación más eficaz. Un mayor valor de Ct puede reflejar una menor concentración de ácido nucleico diana o una amplificación ineficaz o inhibida. El ciclo umbral se selecciona, en general, para que esté en el intervalo lineal de amplificación para una diana dada. En algunos modos de realización, el Ct se establece como el ciclo en el que la señal de crecimiento excede una línea umbral predefinida, por ejemplo, en relación con el valor de referencia (Ct), o determinando el máximo de la segunda derivada de la curva de crecimiento (Cp). Debido a que los valores de Ct y Cp típicamente están bastante cerca, a menudo se usan de manera intercambiable. La determinación de Ct/Cq/Cp es conocida en la técnica y se describe, por ejemplo, en Bustin et al. (2009) Clin. Chem. 55:4 (que describe las directrices de MIQE) y la patente de EE. UU. n.° 7.363.168.
Las técnicas adicionales incluyen la cuantificación por ejemplo usando Qubit (ThermoFisher) o Agilent Bioanalyzer, y la secuenciación, tal como técnicas de secuenciación de nueva generación (SNG). Determinadas técnicas de SNG se basan en la fijación de adaptadores con extremos romos a fragmentos de ADN bicatenario. Estos adaptadores se pueden fijar, a su vez, a adaptadores con secuencias conocidas para permitir el cebado y la amplificación/secuenciación específicos de secuencia (véase, por ejemplo, Poptsova et al. (2014) Nature). Los ejemplos incluyen la prep. de muestras de ADN genómico Illumina, la preparación de colecciones Roche 454 y la preparación de colecciones Life SOLiD. Para maximizar el porcentaje de fragmentos de ADNbc en una muestra con extremos romos de fosfato en 5', se puede usar un kit de reparación, por ejemplo, el kit de reparación de extremos de ADN fragmentado de MCLAB.
VI. Kits
En algunos modos de realización, los reactivos y materiales para llevar a cabo los procedimientos actualmente divulgados se incluyen en un kit. En algunos modos de realización, el kit incluye PVM que se unen a ácidos nucleicos, uno o más tampones de unión, uno o más tampones de lavado y tampón de elución. En algunos modos de realización, el tampón de unión incluye caótropo, detergente y un agente de tamponación del pH (por ejemplo, Tris, MOPS, HEPES, PIPES o un sistema de tamponación que implica citrato, borato, acetato, etc.). Opcionalmente, el tampón de unión incluye al menos una sal, isopropanol y/o proteinasa K. El tampón de unión se puede ajustar dependiendo de la concentración y tamaño de los ácidos nucleicos en la muestra.
De forma similar, los tampones de lavado típicamente tienen caótropo, detergente y un agente de tamponación del pH, y pueden variar dependiendo de la cantidad esperada de material no deseado en la muestra. Si se usa más de un tampón de lavado, los tampones de lavado posteriores pueden tener menores concentraciones de dichos componentes de modo que la elución será más eficaz y el eluato no tendrá una alta concentración de caótropo, detergente, sal, etc., que podría interferir con el análisis posterior.
Los tampones de elución típicamente tienen ingredientes mínimos, de modo que el eluato se pueda usar directamente para el análisis (por ejemplo, amplificación o secuenciación). Por ejemplo, el tampón de elución puede incluir un agente de tamponación del pH y/o al menos una sal.
En algunos modos de realización, el kit incluye además al menos un control, por ejemplo, fragmentos de ácido nucleico de tamaño y concentración conocidos. En algunos modos de realización, el kit incluye además material fungible, por ejemplo, placas o tubos para la preparación de ácidos nucleicos, tubos para la obtención de muestras, etc. En algunos modos de realización, el kit incluye además instrucciones para su uso, referencias a un sitio web o programa informático.
VII. Ejemplos
Se han observado mayores niveles de ANlc en el plasma de pacientes de cáncer en comparación con el plasma de individuos normales sin cáncer. Además, los polinucleótidos cortos, en el intervalo de aproximadamente 50-1000 pb, son, en general, mucho más prevalentes en el plasma de pacientes de cáncer en comparación con el plasma normal. Estos ANlc son útiles para técnicas de diagnóstico, por ejemplo, para detectar mutaciones relacionadas con enfermedades, variantes genéticas o niveles de expresión génica, así como para pruebas genéticas prenatales.
Las microesferas de vidrio magnéticas (PVM) proporcionan un procedimiento conveniente para purificar ácidos nucleicos de forma automatizada. Se concibió y aplicó un flujo de trabajo automatizado para la recuperación de fragmentos de ADN pequeño, en particular, ANlc bicatenario, usando PVM de Roche. Los procedimientos y composición divulgados actualmente se pueden usar con reactivos de preparación de ácidos nucleicos similares, por ejemplo, tampones de lisis o de unión que proporcionan condiciones caótropas y PVM que utilizan la tecnología Boom (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 6.562.569 y Boom (1990) J. Clin. Microbiol. 28:495).
Ejemplo 1
Se recuperaron cantidades máximas de ácidos nucleicos unidos a las PVM sin alterar la hibridación de los ácidos nucleicos bicatenarios. Se llevan a cabo procedimientos de elución actuales a temperatura elevada, por ejemplo, 90-100 °C, para garantizar la disociación completa de los ácidos nucleicos de las PVM. Los ácidos nucleicos bicatenarios se desnaturalizan o se vuelven monocatenarios a temperaturas tan elevadas. Esto es especialmente cierto en el caso de ácidos nucleicos más cortos, tales como ANlc, que pueden tener una temperatura de fusión tan baja como de aproximadamente 60 °C. Dado que se requieren ácidos nucleicos bicatenarios para determinadas técnicas analíticas posteriores, la hibridación de los ácidos nucleicos bicatenarios se retuvo reduciendo la temperatura de elución.
Para el análisis se usó plasma agregado con ADNbc de concentración, tamaño y secuencia conocidos. Las secuencias conocidas eran GUSB (glucuronidasa beta; secuencia diana de 86 pb) y PBGD (porfobilinógeno desaminasa; secuencia diana de 150 pb). Se agrupó el plasma usado de mujeres embarazadas y, por tanto, contenía ANlc de las mujeres, así como algunos ANlc de sus fetos Adicionalmente se seleccionaron secuencias diana específicas de ANIc endógenas para el análisis: una secuencia de LINE (presente en números de copias variables en ADN genómico y que sirve como marcador para ADN en ANlc) y una de DYZ de 149 pb (secuencia del cromosoma Y derivada fetal que, cuando está presente en el plasma de una mujer, indica el ADN fetal masculino en su ANlc). Para las dianas endógenas, no se conocía la concentración precisa. Para LINE, el rendimiento calculado se puede usar para comparar rendimientos relativos del mismo material de partida (por ejemplo, plasma), pero no es una cuantificación absoluta.
Los procedimientos se llevaron a cabo en un instrumento MagNA Pure 96 y en un instrumento similar, pero más pequeño, en desarrollo, con variaciones que dieron lugar a resultados comparables. Por ejemplo, se añadió plasma a aproximadamente 1:1 (variando entre 5:1-1:5) con tampón de unión (caótropo, detergente, proteinasa K e isopropanol) a las PVM. La unión se llevó a cabo durante 4-8 minutos a 25 °C, 37 °C y 45 °C. En algunos casos, se añadieron múltiples alícuotas de plasma agregado a las PVM para incrementar la cantidad de ANlc capturados. Las PVM se separaron del material no unido usando un campo magnético, seguido de una resuspensión pipeteando en tampón de lavado. Se llevaron a cabo varios (2-5) lavados que carecían de proteinasa K, y con cantidades decrecientes de detergente y sales.
Una vez que se lavaron las PVM, se eluyó el ADNbc usando una elución o dos, ambas llevadas a cabo a baja temperatura. Las una o más eluciones se llevaron a cabo por debajo de 50 °C (25 °C-45 °C), durante 5-30 minutos cada una. Cada diana se amplificó y detectó usando qPCR en el LightCycler® 480 usando cebadores y sondas para amplificar y detectar específicamente cada diana. La recuperación en porcentaje o rendimiento se calculó usando valores de Cp en comparación con patrones conocidos. Para las dianas conocidas, el control fue una amplificación llevada a cabo con la cantidad total de esa diana agregada a la muestra de plasma, de modo que se pueda expresar en términos de recuperación en porcentaje. Para la diana endógena, la cantidad [ng] recuperada se podría extrapolar en base a la amplificación de una cantidad conocida de una secuencia diana de control. En la tabla 1 a continuación se muestran resultados representativos.
Tabla 1
Figure imgf000010_0001
Los resultados muestran que la elución doble proporcionó cantidades significativamente mayores de ANlc. Debido a que las eluciones se llevaron a cabo a baja temperatura, se mantuvo la estructura emparejada del ADNbc en la muestra, haciendo que estuviera disponible para el análisis posterior.
Ejemplo 2
Se determinó el rendimiento de ADN bicatenario a partir de una elución única a alta temperatura y se comparó con una elución doble a baja temperatura. Los procedimientos fueron esencialmente los mismos que en el ejemplo 1. El plasma agrupado se agregó con una cantidad conocida de un ADN bicatenario de 150 pb que contenía una secuencia diana de G6PD. El ácido nucleico se purificó a partir del plasma en el MagNA Pure 96 de Roche, usando una elución única a alta temperatura (variando de 90 a 96 °C) o bien una elución doble a baja temperatura (variando de 30 a 47 °C). Los eluatos resultantes se evaluaron en cuanto al rendimiento/recuperación usando el kit de ensayo de ADNbc ThermoFisher Quant-iT PicoGreen (para detectar ADN bicatenario), qPCR para LINE (ADN mono- o bicatenario endógeno total) o qPCR para G6PD (ADN mono- o bicatenario agregado total). Los resultados se muestran en la tabla 2.
Tabla 2
Figure imgf000010_0002
Los datos muestran que, aunque la recuperación global de ADN sea la misma independientemente de las condiciones de elución usadas, la recuperación de ADN en el estado bicatenario se reduce, en gran medida, en condiciones de alta temperatura. De nuevo, se pueden usar los resultados de LINE para comparar entre condiciones usando el mismo grupo de muestras, pero no refleja el rendimiento de ADN absoluto. La recuperación del fragmento de 150 pb con G6PD es consecuente con los datos mostrados en la tabla 1 para la elución doble, aunque algo reducida para la elución única a alta temperatura. Sin embargo, los resultados del ensayo de ADNbc PicoGreen muestran que el rendimiento de ADN bicatenario se incrementa, en gran medida, en la elución doble a temperatura reducida.

Claims (9)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento automatizado para recuperar ácidos nucleicos bicatenarios de una muestra de líquido, que comprende:
a) poner en contacto la muestra de líquido que contiene ácidos nucleicos bicatenarios con partículas de vidrio magnéticas (PVM) en una solución caótropa a una temperatura de entre 25 °C y 45 °C en un recipiente, permitiendo, de este modo, que los ácidos nucleicos bicatenarios se unan de forma no covalente a las PVM en solución en el recipiente;
b) aplicar un campo magnético al recipiente que contiene ácidos nucleicos bicatenarios unidos de forma no covalente a las PVM en solución y retirar el líquido no unido a las PVM;
c) llevar a cabo una primera etapa de elución, en el que dicha primera etapa de elución comprende
(i) poner en contacto ácidos nucleicos bicatenarios unidos de forma no covalente a las PVM con tampón de elución que tiene un pH de 7-10 en el recipiente a una temperatura de entre 25 °C y 45 °C durante 5-30 minutos; (ii) aplicar un campo magnético al recipiente; y
(iii) obtener líquido no unido a las PVM, obteniendo, de este modo, el eluato;
d) llevar a cabo una segunda etapa de elución, en el que dicha segunda etapa de elución comprende (i) poner en contacto ácidos nucleicos bicatenarios unidos de forma no covalente a las PVM con tampón de elución que tiene un pH de 7-10 en el recipiente a una temperatura de entre 25 °C y 45 °C durante 5-30 minutos; (ii) aplicar un campo magnético al recipiente; y
(iii) obtener líquido no unido a las PVM, obteniendo, de este modo, el eluato;
en el que el eluato obtenido en las etapas c)(iii) y d)(iii) comprende al menos un 30 % de ácidos nucleicos bicatenarios recuperados de las PVM de los ácidos nucleicos totales en el eluato y en el que los ácidos nucleicos bicatenarios son ácido nucleico libre de células de 50-500 pares de bases de longitud.
2. El procedimiento automatizado de la reivindicación 1, en el que la temperatura en las etapas c)(i) y d)(i) está entre 30 °C y 45 °C.
3. El procedimiento automatizado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que la solución en las etapas a) y b) tiene un pH menor de 7.
4. El procedimiento automatizado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la solución en las etapas a) y b) tiene un pH menor de 6,5.
5. El procedimiento automatizado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que los ácidos nucleicos en el eluato obtenido en las etapas c)(iii) y d)(iii) comprenden al menos un 50 % de ácidos nucleicos bicatenarios de los ácidos nucleicos totales en el eluato.
6. El procedimiento automatizado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende además entre las etapas a) y b):
aplicar un campo magnético al recipiente y retirar el líquido no unido a las PVM, dejando, de este modo, ácidos nucleicos bicatenarios unidos de forma no covalente a las PVM; y
añadir líquido a los ácidos nucleicos bicatenarios unidos de forma no covalente a las PVM.
7. El procedimiento automatizado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el tampón de elución se pone en contacto con los ácidos nucleicos bicatenarios unidos de forma no covalente a las PVM durante 5-25 minutos en las etapas c)(i) y d)(i).
8. El procedimiento automatizado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el tampón de elución se mezcla con los ácidos nucleicos bicatenarios unidos de forma no covalente a las PVM usando una pipeta mecánica automatizada.
9. El procedimiento automatizado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que los ácidos nucleicos bicatenarios son de una muestra libre de células seleccionada del grupo que consiste en sangre plasma, suero, líquido amniótico, líquido cefalorraquídeo y orina.
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