ES2952105T3

ES2952105T3 - Matrices de organoides

Info

Publication number: ES2952105T3
Application number: ES17781009T
Authority: ES
Inventors: Sylke Hoehnel; Nathalie Brandenberg; Matthias Lutolf
Original assignee: Ecole Polytechnique Federale de Lausanne EPFL
Current assignee: Ecole Polytechnique Federale de Lausanne EPFL
Priority date: 2016-09-19
Filing date: 2017-09-15
Publication date: 2023-10-27
Anticipated expiration: 2037-09-15
Also published as: PT3515600T; DK3515600T3; US20200010797A1; EP3515600B1; HUE062571T2; WO2018050862A1; EP3296018A1; EP3515600A1

Abstract

La invención proporciona métodos para producir matrices de organoides, sus matrices y usos de dichas matrices. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Matrices de organoides

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] La invención proporciona métodos para producir matrices de organoides para análisis de alto rendimiento.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0002] El estudio de órganos y tejidos de mamíferos ha sido un reto de larga duración, ya que es difícil acceder a ellos y analizarlos en tiempo real (Shamir y Ewald, 2014). Como alternativa, tradicionalmente se han extraído y cultivado in vitro cortes de órganos y órganos enteros. Sin embargo, la limitada difusión a través de estos explantes ha restringido este enfoque al uso de órganos embrionarios o delgados. Recientemente, grandes avances en la biología de las células madre han demostrado que las células madre adultas y pluripotentes tienen la capacidad de sobrevivir, crecer y diferenciarse en estructuras homeostáticas que imitan tejidos, u organoides, in vitro, cuando se cultivan en matrices tridimensionales. Este avance tecnológico se está convirtiendo en una herramienta esencial para comprender una amplia gama de procesos biológicos que ocurren in vivo, como el desarrollo y la homeostasis de los tejidos, las funciones de los nichos de células madre y las respuestas de los tejidos a fármacos, mutaciones o daños. Sin embargo, estos cultivos aún se encuentran en fase de desarrollo y siguen siendo variables, lo que impide su uso estándar en el cribado de fármacos y el desarrollo de terapias.

[0003] Pueden destacarse tres limitaciones principales de los organoides in vitro disponibles en la actualidad; (i) las condiciones de cultivo actuales no consiguen imitar el microentorno nativo, es decir, fuerzas biomecánicas, factores de crecimiento/gradientes de señalización, lo que limita en gran medida el control sobre el crecimiento de los organoides, (ii) artefactos inducidos por Matrigel™, una matriz derivada del cáncer que se utiliza normalmente como soporte para el crecimiento de organoides, y (iii) una fuerte heterogeneidad en términos de viabilidad, tamaño y forma, distribución y señalización descontrolada entre organoides, lo que dificulta el desarrollo de ensayos fenotípicos (Fatehullah et al., 2016).

[0004] El crecimiento de células en matrices es una técnica estándar en este campo. Las células se siembran en pocillos individuales de una placa de matriz de múltiples pocillos. Cada pocillo de la placa puede someterse a un ensayo y/o condición experimental diferentes y seguirse de forma independiente a lo largo del tiempo. Recientemente, se han realizado diversos intentos para cultivar agregados celulares y organoides en dichas matrices. Sin embargo, los investigadores han encontrado dificultades para formar organoides en placas de matriz convencionales formadas por plásticos, como se indica a continuación.

[0005] US 2011/0171712, Rivron et al. (Rivron et al., 2011) describe el crecimiento de agregados celulares en el confinamiento de una placa de micromatriz. Los agregados se forman aplicando una suspensión celular sobre una matriz de micropocillos y dejando que las células se asienten en la micromatriz. Tras el confinamiento espacial en los pocillos, las células se agregan espontáneamente (columna 5, párrafos 4-5). A continuación, los agregados celulares confinados se recogen de los micropocillos, se induce su diferenciación celular y morfogénesis tisular, y se combinan para formar tejidos biológicos (página 4, párrafos [0038-0042]). Los micropocillos descritos por Rivron son demasiado pequeños para permitir la formación de organoides dentro de los propios pocillos y, por lo tanto, están limitados a la función de cultivar agregados celulares discretos que deben cosecharse para producir organoides. Por lo tanto, Rivron no soluciona el problema de cultivar organoides en una matriz.

[0006] Gracz et al. (Gracz et al., 2015) proporciona placas de micropocillos para cultivar y diferenciar matrices de células madre intestinales (ISC, por sus siglas en inglés) (Gracz, figura 1). Las ISC se siembran aleatoriamente en los micropocillos de la placa, de forma que la matriz comprende tanto micropocillos que contienen una o más ISC como micropocillos vacíos (página 3, párrafo 4 y figura 1F). Por lo tanto, el análisis de imagen de las matrices se basa en el análisis computacional para identificar los micropocillos que contienen ISC (figura 2A), dado que aproximadamente la mitad de los micropocillos de la placa están vacíos (figura 2I, -1200 pocillos de 2254). Las matrices de ISC se diferencian en enteroides que crecen fuera de sus micropocillos originales a medida que se desarrollan (figura 1L). Por tanto, Gracz proporciona una matriz de organoides. Sin embargo, la utilidad de estos organoides en ensayos de alto rendimiento se ve limitada por la necesidad de un amplio procesamiento y análisis de imágenes para excluir los pocillos vacíos e identificar los propios organoides. Además, el número de condiciones experimentales o ensayos permitidos por experimento no es óptimo, dado que la mitad de los micropocillos de una matriz están vacíos.

[0007] Decembrini et al. (Decembrini et al., 2016) describe brevemente el crecimiento de organoides retinianos en placas de micropocillos con fondo en U. Sin embargo, Decembrini no describe el aspecto de las matrices ni cómo se forman.

[0008] Allbriton et al. (Allbriton et al., 2015) proporciona un soporte de micromatrices para cultivar colonoides (organoides de colon). Los colonoides se cultivan en una matriz de colágeno, se liberan y luego se disponen en el soporte para generar una matriz de colonoides dentro de una placa de micropocillos. Los micropocillos están fabricados con colágeno y tienen un diámetro de 150 |jm y una altura de l5o |jm (página 95, párrafo 1). El método de Allbriton da como resultado una matriz en la que los organoides se distribuyen aleatoriamente dentro de sus respectivos micropocillos (es decir, en el centro o a un lado, figura 3A). A medida que los colonoides crecen dentro de la matriz, sobresalen de los micropocillos para generar una forma de seta (figura 4) y, por lo tanto, ya no se encuentran dentro del mismo plano 2D. Por consiguiente, aunque Allbriton proporciona una matriz de organoides, estos organoides deben, en primer lugar, ser cultivados en una matriz de colágeno. Esto limita el uso de estas matrices para investigar el desarrollo de organoides (ya que este proceso no se produce en la propia matriz). Las matrices de Allbriton presentan el problema adicional de que los organoides se distribuyen aleatoriamente dentro de sus respectivos micropocillos y no se encuentran dentro del mismo plano 2D, lo que plantea de nuevo un reto para el análisis de imagen de los organoides dentro de la matriz.

[0009] Todhunter et al. (Todhunter et al., 2015) describe matrices de células incrustadas en posición mediante ensamblaje programado por ADN. En primer lugar, las células se funcionalizan mediante la incorporación de oligonucleótidos de ADN en sus membranas celulares y, a continuación, se adhieren a portaobjetos de vidrio mediante la interacción de estos oligonucleótidos con secuencias complementarias dentro de puntos de ADN fijados al vidrio. Múltiples rondas de adhesión celular conducen a la formación de estructuras de microtejido en 3D alrededor de los puntos. Se deja que se forme un hidrogel alrededor de la célula fijada para incrustarla en su posición. A continuación, el gel se separa de la superficie de los portaobjetos de vidrio y se coloca en una placa de cultivo sobre otro hidrogel, formando un cultivo sándwich (Todhunter, figura 1). Estas micromatrices no son adecuadas para producir matrices de células madre que puedan desarrollarse en organoides, dado que es probable que el proceso de etiquetado del ADN afecte a la función de las células madre.

[0010] Vrij et al (2016) describe una matriz de cuerpos embrioides formados en pocillos de plástico. Como señalan Vrij et al, los cuerpos embrioides formados son comparativamente pequeños, y que pueden producirse problemas de formación de imágenes con las células situadas en la periferia de los pocillos. Esto impone determinadas limitaciones a los cuerpos embrioides como describe Vrij et al, y hace que este enfoque basado en matrices de plástico no sea adecuado para la generación de organoides más grandes.

[0011] En el documento WO2016/141137 (Harvard) se describen métodos para vascularizar organoides individuales a través de interfaces microfluídicas en un chip. No se divulgan métodos que sean capaces de generar una matriz de organoides reproducibles, teselados, donde los organoides puedan cultivarse y monitorizarse en la misma ubicación a lo largo del tiempo. En el ejemplo 3, se analiza el uso de Aggrewells™ para formar cuerpos embrioides; sin embargo, después de la formación de cuerpos embrioides y para inducir la formación de organoides, los cuerpos embrioides tienen que cosecharse a partir de los Aggrewells™ y necesitan transferirse a una plataforma diferente que no permite la planaridad ni la reproducibilidad.

[0012] Nancy L. Allbritton et al.: "COLONIC ORGANOID ARRAY ON A BIOMIMETIC, MICROENGINEERED HYDROGEL SCAFFOLD", 1 de enero de 2015 (2015-01-01) se refiere a un soporte de micromatrices específicamente diseñado y optimizado para modelos de cultivo organotípico de organoides intestinales derivados de tejido colónico primario.

[0013] Laurel T Tainsh et al.:"Self organization of human induced pluripotent stem cells (iPSC) derived retinal progenitor cells on a 3D scaffold", resúmenes de la reunión anual de ARVO 2016, 1 de mayo de 2016 (2016-05-01 ) se refiere al cultivo de células madre pluripotentes inducidas (iPSC, por sus siglas en inglés) para proporcionar vasos retinianos, que luego se cultivan en un soporte plano.

[0014] Por lo tanto, a pesar de los numerosos intentos de desarrollar matrices de organoides adecuadas para el análisis de alto rendimiento, las matrices de organoides desarrolladas hasta la fecha están limitadas por el uso ineficiente de micropocillos dentro de la matriz; la necesidad de desarrollar los organoides en una matriz antes de ser sembrados en la matriz; la necesidad de cosechar los organoides cultivados en la matriz, con el fin de proporcionar espacio suficiente para que se desarrollen; y/o la necesidad de técnicas invasivas para localizar con precisión las células dentro de la matriz de tal manera que la matriz pueda ser sometida a un análisis de imagen de alto rendimiento y en tiempo real.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

[0015] Con el fin de superar los problemas asociados con el cultivo de organoides in vitro en un formato adecuado para el cribado de fármacos de alto rendimiento y el desarrollo de terapias, los inventores han desarrollado una nueva plataforma de micropocillos de alto rendimiento para el crecimiento reproducible de organoides in situ, incluyendo su cocultivo con otros tipos de células tales como células estromales y su cultivo a largo plazo. Esta tecnología es muy versátil para cultivar diferentes tipos de organoides de forma controlada.

[0016] Los inventores demuestran el análisis automatizado de estos cultivos, sentando las bases para el uso de estos cultivos en cribados fenotípicos de fármacos y el desarrollo de terapias.

[0017] Además, la presente invención permite la generación reproducible de matrices de organoides, de una manera que antes no se consideraba posible. En particular, aspectos de la presente invención permiten la generación de organoides en una matriz utilizando materiales de hidrogel que, debido a su composición muy hidratada y blanda, tienen propiedades físicas y químicas biomiméticas. Los enfoques de la técnica anterior que utilizan matrices fabricadas a partir de materiales no hidratados, como plásticos o vidrio, pueden no ser adecuados para la generación de organoides. Un aspecto especialmente ventajoso de la invención permite la formación directa de organoides in situ, mientras que los enfoques del estado de la técnica pueden requerir la formación de organoides fuera de una matriz y la posterior transferencia de los organoides a una matriz, lo que da lugar a una distribución desigual de organoides de tamaño desigual, así como a una pérdida del historial de desarrollo de los organoides. En algunos aspectos de la presente invención, las células madre se siembran sobre un hidrogel biofuncional u obtenido mediante bioingeniería, y la agregación y formación de organoides se produce en el lugar específico donde las células madre se agregan y experimentan la morfogénesis gracias a las propiedades arquitectónicas y químicas del sustrato utilizado. Esto permite un proceso reproducible, que da lugar a una matriz de organoides formados de manera consistente y dispuestos en el mismo plano, de forma que se proporcionan muchas ventajas para la obtención de imágenes y análisis posteriores, así como una trazabilidad única y la posibilidad de realizar análisis clonales.

[0018] La invención se define mediante las reivindicaciones anexas.

ABREVIATURAS

[0019]

2D bidimensional

3D tridimensional

96U placas de fondo en forma de U de 96 pocillos

CFTR regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística

DHM microscopía holográfica digital

ESC células madre embrionarias

ECM matriz extracelular

GFP proteína verde fluorescente

IPSC células madre pluripotentes inducidas

MW micropocillos

NEAA aminoácidos no esenciales

PDMS polidimetilsiloxano

ROI región de interés

RT-qPCR reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real

y⁰valor de fase inicial

X⁰tiempo de entrada de agua

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Breve descripción de las figuras

[0020]

Figura 1. Matrices y teselaciones

Figura 1a: teselación de cuadrados. Figura 1b: teselación de triángulos equiláteros. Figura 1c: teselación de hexágonos regulares. Figura 1d: una matriz de objetos circulares puede superponerse a una teselación de cuadrados. Figura 1e: matriz de objetos circulares superpuestos a una teselación de hexágonos regulares, de forma que los objetos se sitúan de forma única dentro de teselas adyacentes. Figura 1f: una matriz de objetos circulares superpuestos a una teselación de hexágonos regulares, de forma que los objetos no se sitúan de forma única dentro de teselas adyacentes.

Figura 2. Método para la producción de matrices de organoides

Una gran limitación del cultivo celular en 3D es que las estructuras celulares se distribuyen en muchos focos diferentes (figura 2a). La presente invención proporciona un sistema para el cultivo en 3D dentro de un único plano focal (figura 2b). El cultivo de células en 3D ralentiza el análisis de imágenes (figura 2c), mientras que el cultivo de células dentro de un único plano focal elimina la necesidad de realizar análisis basados en z-stacks (figura 2d). Dentro de una matriz, donde todos los objetos de una matriz se pueden superponer a una teselación de hexágonos regulares de tal forma que los objetos se colocan de forma única dentro de teselas adyacentes, todos los organoides pueden localizarse dentro de una única región de interés (ROI) (figura 1e-g).

Figura 3. Matrices de organoides en comparación con gotas de Matrigel en 3D

Imágenes de campo claro de organoides cultivados en gotas de Matrigel (figura 3a, b) o cultivos de organoides (figura 3c, d) en un primer (figura 3a, c) y segundo momento (figura 3b, d). Análisis de imágenes de organoides cultivados en gotas de Matrigel (figura 3e, f) o cultivos de organoides (figura 3g, h). Figura 3i: Fold change del tamaño de los organoides tras el tratamiento con forskolina de los organoides cultivados en matrices. Figura 3j: Dentro de una matriz de organoides, todos los organoides de la matriz pueden superponerse a una teselación de hexágonos regulares de tal forma que los organoides se sitúen de forma única dentro de teselas adyacentes.

Figura 4. Uso de matrices de organoides en un ensayo de transporte transmembrana de fluidos

Figura 4a: esquema que muestra el tratamiento de un organoide con agonistas del regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR), como la forskolina. Figura 4b: cambio de fase de un organoide tratado con forskolina. Figura 4c: cambio de fase en el tiempo de un organoide tratado con un agonista del CFTR. Figura 4d, e, f, g, h: comparación de varias respuestas físicas de organoides de tipo salvaje o mutantes de deleción de CFTR tratados con agonistas del CFTR.

Figura 5. Matrices de organoides retinianos

Figura 5a: organoides retinianos cultivados en una matriz. Figura 5c, d: Expresión de CRX en cultivos de organoides retinianos de 14 días en placas de fondo en forma de U de 96 pocillos de baja adherencia (96U) (Figura 5b) o micropocillos (MW) de matriz de organoides (Figura 5c). Figura 5d: cuantificación de la expresión de CRX-GFP en organoides cultivados en placas de fondo en forma de U de 96 pocillos o MW. Figura 5e: cuantificación de la organización entre el RPE y el tejido retiniano en organoides cultivados en placas de fondo en forma de U de 96 pocillos o MW. Figura 5f-g: Maduración y polaridad de organoides cultivados en placas de fondo en forma de U de 96 pocillos o MW. Figura 5h: Dentro de una matriz de organoides retinianos, todos los organoides de la matriz pueden superponerse a una teselación de hexágonos regulares de tal forma que los organoides se sitúen de forma única dentro de teselas adyacentes. Figura 5i: imagen ampliada de organoides retinianos dentro de una matriz.

Figura 6. Matrices de colonoides

Figura 6a: cultivo de muestras de biopsias de tumores colorrectales primarios a lo largo del tiempo. Figura 6b: agregados multicelulares (esferoides) de células tumorales. Figura 6c: polaridad de tumoroides cultivados en matrices. Figura 6d: viabilidad de colonoides en matrices de micropocillos a lo largo del tiempo. Figura 6e: efecto de la densidad celular en el crecimiento de colonoides en matrices de organoides.

Figura 7. Matrices de organoides de las glándulas mamarias

Figura 7a: crecimiento de células MCF10A en una matriz. Figura 7b: polarización de colonias MCF10A dentro de una matriz. Figura 7c: plano focal de una matriz de tumoroides MCF10A.

Figura 8. Crecimiento y diferenciación de colonias de células madre intestinales derivadas de iPS. Figura 8: Generación de matrices de organoides intestinales y de matrices de organoides de colon humanos derivados de iPS. Las células se siembran en el día 0 y forman colonias de células madre tras incubación durante la noche. (a) Imagen representativa de campo claro de una matriz de colonias de células madre intestinales derivadas de iPS. (b) Imagen representativa de campo claro de las mismas colonias de células madre cultivadas durante otros dos días en medio de expansión de células madre. (c) Imagen representativa de campo claro de una matriz de las mismas colonias diferenciándose en un organoide de intestino anterior humano derivado de iPS tras dos días de diferenciación. La diferenciación de organoides puede prolongarse en la misma matriz hasta alcanzar un estado de diferenciación deseado. (a) Imagen representativa de campo claro de una matriz de colonias de células madre de colon humano adulto. (e) Imagen representativa de campo claro de las mismas colonias de células madre cultivadas durante otros dos días en medio de expansión de células madre, (f) Imagen representativa de campo claro de una matriz de las mismas colonias diferenciándose en un organoide de colon humano tras dos días de diferenciación. La diferenciación de organoides puede prolongarse en la misma matriz hasta alcanzar un estado de diferenciación deseado.

Figura 9. Crecimiento de matrices de organoides intestinales de ratón

Figura 9: Matrices de organoides intestinales de ratón en micropocillos Aggrewell™ tras dos días de expansión de células madre. (a) Colonias de células madre intestinales de ratón en micropocillos Aggrewell™ sin recubrimiento. (b) Colonias de células madre intestinales de ratón en micropocillos Aggrewell™ recubiertos.

Figura 10. Agregación de células madre embrionarias de ratón

Figura 10: Imagen representativa de células madre embrionarias de ratón CRX::GFP que se agregan a micropocillos Aggrewell de 800 μm de tamaño después de 24 horas.

Definiciones

[0021] Una matriz, tal y como se utiliza en el presente documento, se define como una disposición ordenada de objetos similares o idénticos. Normalmente, los objetos de una matriz pueden dividirse en filas y columnas. Una matriz de organoides es una disposición ordenada de al menos un organoide. En biología, las matrices de muestras o materiales biológicos (micromatrices) se utilizan para el análisis de alto rendimiento.

[0022] El cartigel es un extracto de matriz extracelular de cartílago.

[0023] Un hidrogel biofuncional es un hidrogel que contiene moléculas bioactivas (o bioadhesivas), y/o moléculas de señalización celular que interactúan con células vivas para promover la viabilidad celular y un fenotipo celular deseado. Los hidrogeles biofuncionales también pueden denominarse bioactivos. Algunos ejemplos de moléculas bioadhesivas incluyen, sin carácter limitativo, la fibronectina, la vitronectina, la sialoproteína ósea, la laminina, el colágeno y la elastina. Estas moléculas contienen péptidos adhesivos celulares que rigen su interacción con las células. Algunos ejemplos de secuencias peptídicas de adhesión celular incluyen, sin carácter limitativo, RGD, KQAGDV, REDV y PHSRN derivados de fibronectina, YIGSR, LGTIPG, IKVAV, PDGSR, LRE, LRGDN e IKLLI derivados de laminina, DGEA y GFOGER derivados de colágeno y VAPG derivado de elastina. Un hidrogel diluido se define en la presente memoria como un hidrogel que, debido a su bajo contenido en sólidos, puede comportarse como un fluido viscoso o un medio semisólido, mientras que un hidrogel no diluido se comporta como un gel viscoelástico típico.

[0024] Las moléculas bioactivas (o bioadhesivas o biofuncionales) son moléculas que interactúan con las células para promover la viabilidad celular y se han descrito previamente para una variedad de tipos celulares. Las moléculas bioadhesivas que hacen que un hidrogel sea biofuncional incluyen, sin carácter limitativo, fibronectina o variantes funcionales de la misma, por ejemplo, fragmento FF IM1-C, fragmento FNIII9-10 y FNIII12-14, o péptidos que contienen RGD, por ejemplo, RGD, RG d S, RGDSP, RGDSPK, RGDTP y RGDSPASSKP Las variantes funcionales de moléculas bioactivas son moléculas que tienen una función biológica o bioquímica igual o similar y una secuencia o composición similar, por ejemplo, moléculas truncadas o fragmentos de dichas moléculas.

[0025] Un hidrogel biocompatible es una red de polímeros que no es significativamente tóxica para las células y/o tejidos vivos, y que no provoca una respuesta inmunopatógena en individuos sanos. Un mecanismo activo biocompatible es un proceso que no es tóxico para células o tejidos particulares, por ejemplo, un aumento de temperatura dentro del rango de temperatura fisiológica de los tejidos, o que se aplica de manera suficientemente breve como para no provocar una toxicidad significativa.

[0026] El cultivo de células se refiere al proceso de mantener las células en condiciones apropiadas para su mantenimiento y/o crecimiento, donde las condiciones se refieren, por ejemplo, a la temperatura, la disponibilidad de nutrientes, el contenido atmosférico de CO²y la densidad celular en la que se mantienen las células. Las células pueden cultivarse in vivo o in vitro. Las condiciones de cultivo adecuadas para mantener, proliferar, expandir y diferenciar distintos tipos de células son bien conocidas y están documentadas. Las condiciones adecuadas para la formación de organoides son las que facilitan o permiten la diferenciación celular y la formación de estructuras multicelulares. Véanse en materiales y métodos los detalles de las condiciones de cultivo adecuadas para las células utilizadas en los ejemplos.

[0027] Un plano focal es el plano o la superficie plana a través del foco perpendicular al eje de una lente de, por ejemplo, un microscopio. En un enfoque particular, todos los objetos a la vista están dentro del mismo plano focal.

[0028] Los cribados y ensayos de alto rendimiento son aquellos que se automatizan para alcanzar niveles de adquisición de datos repetibles inviables mediante métodos manuales.

[0029] Un hidrogel (gel) es una matriz tridimensional que comprende una red de cadenas poliméricas hidrofílicas.

[0030] In s itu es un término biológico para el cultivo de células o tejidos sin mover su posición.

[0031] Matrigel es un producto comercial ampliamente utilizado en modelos 2D y 3D de cultivo celular. Comprende una preparación de membrana basal solubilizada extraída de un tumor de ratón rico en ECM.

[0032] Un micropocillo es una cavidad capaz de contener líquido, que comprende una boca abierta, un eje hueco y un fondo. Un micropocillo también puede denominarse pocillo, microcavidad o cavidad. Un pocillo es normalmente un pocillo de una placa de pocillos. Las placas de micropocillos comprenden matrices de micropocillos equivalentes. Estos micropocillos pueden formar patrones en el sustrato que forma la placa, por ejemplo, para formar un hidrogel con patrones. Los micropocillos pueden ser de fondo plano o de fondo redondo (U). El eje de un micropocillo es típicamente cilíndrico. La profundidad de un micropocillo se refiere a la distancia desde la boca hasta la parte más baja del fondo.

[0033] Los microcanales son conductos de fluido provistos dentro de una superficie. Los microcanales pueden formar redes de suministro microfluídicas dentro de un hidrogel, como se ha descrito anteriormente (Brandenberg y Lutolf, 2016).

[0034] Un agregado multicelular que contiene células madre es una población de células que contiene al menos una célula madre; también puede denominarse cuerpo embrioide.

[0035] Los miogeles son matrices extracelulares extraídas del músculo esquelético (Abberton et al., 2008).

[0036] Los organoides son sistemas de cultivo tridimensionales de tipos celulares órgano-específicos que se desarrollan a partir de células madre y se organizan de manera autónoma (o forman un patrón de manera autónoma) a través de la clasificación celular y el compromiso de linaje espacialmente restringido de una manera similar a la situación in vivo. Tal como se utiliza en la presente memoria, un organoide se define como un cultivo tridimensional de células madre y su progenie diferenciada, iniciado a partir de una única célula madre o un agregado multicelular de células con al menos una célula madre (es decir, un cuerpo embrioide). Las células madre pueden aislarse a partir de fragmentos de tejido u organoides. Los organoides cultivados a partir de criptas intestinales aisladas o células madre también pueden denominarse en el campo "enteroides" o "colonoides". Los organoides cultivados a partir de células cancerosas o que contienen células cancerosas se denominan "tumoroides". Los organoides se diferencian de los cuerpos embrioides al menos en que los organoides son autoorganizativos y, de esta manera, son arquitectónicamente similares a un tejido u órgano in vivo, mientras que los cuerpos embrioides no lo son. De hecho, para obtener organoides a partir de cuerpos embrioides, los cuerpos embrioides deben tratarse típicamente con factores de patrón para impulsar la formación de la identidad deseada del organoide.

[0037] La siembra de células se refiere al proceso de permitir que una suspensión de células se asiente sobre una superficie por gravedad o centrifugación.

[0038] El módulo de cizallamiento de un hidrogel equivale al módulo de rigidez, G, módulo elástico o elasticidad de un hidrogel. El módulo de cizallamiento se define como la relación entre la tensión de cizallamiento y la deformación por cizallamiento. El módulo de cizallamiento de un hidrogel puede medirse utilizando un reómetro (ejemplo 1, 1.4 materiales y métodos).

[0039] Las células madre se entienden en la presente memoria como células capaces de formar un organoide.

[0040] Una teselación es una disposición bidimensional de polígonos o teselas, encajados en un patrón repetido sin huecos ni solapamientos. Una teselación regular es una teselación formada por teselas regulares congruentes (es decir, idénticas), donde los lados y ángulos dentro de una tesela regular son todos equivalentes. Sólo hay tres tipos de teselación regular, comprendiendo teselas cuadradas, de triángulo equilátero o de hexágono regular (figura 1a-c). Recubrir una superficie con una teselación es el proceso de superponer la teselación a la superficie, como si se recubriera una cuadrícula de referencia. En la figura 1d se muestra una matriz de objetos en un plano recubierto con una teselación regular. El recubrimiento de una matriz con una teselación, de forma que los objetos de la matriz estén colocados de forma única dentro de teselas adyacentes de la teselación, requiere que cada objeto esté recubierto por su propia tesela (que no recubra ningún otro objeto de la matriz), y que cada una de dichas teselas sea adyacente a una tesela que también recubra de forma única un objeto, como se muestra en la figura 2 1e. En la figura 1f se muestra una matriz de objetos que no pueden ser recubiertos por una teselación regular, de modo que los objetos no se sitúan de forma única dentro de teselas adyacentes de la teselación.

Descripción

[0041] En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método para preparar una matriz de organoides, que comprende:

i. sembrar células madre en una superficie,

ii. cultivar las células madre de la etapa i) in situ para permitir su agregación en agregados multicelulares que contienen células madre,

iii. recubrir los agregados multicelulares de (ii) con un recubrimiento que comprende un hidrogel

iv. cultivar los agregados multicelulares que contienen células madre de (ii) in situ en condiciones adecuadas para el desarrollo de organoides,

donde la matriz de organoides se encuentra dentro de un único plano focal y la superficie puede ser recubierta por una teselación regular, de manera que los organoides se sitúen de forma única dentro de teselas adyacentes de la teselación; y donde la superficie comprende un hidrogel de polímero sintético hidrófilo biofuncional.

[0042] El hidrogel es preferiblemente no diluido; y puede formar un gel con una rigidez (módulo de cizallamiento o elástico) de entre aproximadamente 150 Pa y aproximadamente 50 kPa.

[0043] La invención resuelve el problema de proporcionar un método reproducible para producir matrices de organoides in situ que puedan someterse a análisis de imágenes de alto rendimiento y en tiempo real. Las matrices de organoides producidas mediante este método poseen tal grado de homogeneidad geométrica que cada organoide de la matriz puede ser representado y rastreado independientemente a lo largo del tiempo en alto rendimiento, sin necesidad de un análisis de imágenes extenso. Además, las matrices de organoides de la presente invención se desarrollan a partir de una matriz de células madre in situ, proporcionando por primera vez un método novedoso para investigar los factores que afectan al desarrollo de organoides en alto rendimiento.

[0044] En otro aspecto, la invención comprende adicionalmente recubrir el agregado multicelular con un recubrimiento, preferiblemente donde el recubrimiento comprende un material compatible con las células, más preferiblemente donde el material compatible con las células es un hidrogel. El hidrogel del recubrimiento puede estar diluido de tal manera que forme una solución viscosa o medios semisólidos, o puede formar un gel con una rigidez (módulo de cizallamiento o elástico) de entre aproximadamente 150 Pa y aproximadamente 50 kPa.

[0045] La rigidez del sustrato de hidrogel de las capas inferior (es decir, superficie) y superior (es decir, recubrimiento) controla el crecimiento y la morfogénesis de las matrices de células madre y organoides. Diferentes tipos de organoide pueden preferir hidrogeles con diferentes valores de rigidez. Los organoides de la copa óptica, por ejemplo, requieren normalmente sustratos más rígidos que fomenten la diferenciación de las células madre en el linaje del tejido retiniano.

[0046] En un aspecto de la invención, la superficie se marca con cavidades o micropocillos de diversos tamaños, formas y profundidades. Las matrices de la invención pueden formarse tomando una suspensión de células madre individuales, ajustando la densidad para alcanzar un número preciso o adecuado de células por cavidad y depositando esta suspensión celular sobre la superficie de hidrogel con patrones para dejar que las células se distribuyan en cada una de las cavidades o micropocillos por gravedad o centrifugación. La densidad de las cavidades es tan alta que cada célula acaba en una cavidad. Tras 15-30 minutos en la incubadora, todas las células se agrupan en el fondo de las cavidades, de modo que no quedan huecos en el patrón teselado de micropocillos ocupados. Se pueden añadir medios adicionales al recipiente en el que se depositó la capa de hidrogel con patrones, de modo que las células permanezcan inalteradas en el fondo de las cavidades. Las células se compactan en agregados multicelulares con un número límite superior ilimitado de células, de las cuales al menos una es una célula madre, preferiblemente partiendo de una población homogénea de células madre. Los agregados de células madre o las estructuras de compactación pueden recubrirse, como se ha indicado anteriormente, preferiblemente con un hidrogel diluido o no diluido, para fomentar el desarrollo de organoides. Esto forma un nuevo tipo de cultivo sándwich. Por último, se añaden homogéneamente al cultivo medios adecuados y las combinaciones de nutrientes y proteínas, tales como factores de crecimiento y morfógenos, para guiar el crecimiento y el desarrollo de los organoides.

[0047] El hidrogel de la superficie o del recubrimiento, o de ambos, está formado preferiblemente por biomateriales obtenidos naturalmente, como polisacáridos, proteínas gelatinosas o componentes de la ECM que comprenden los siguientes o variantes funcionales de los mismos: agarosa; alginato; quitosano; dextrano; gelatina; lamininas; colágenos; hialuronano; fibrina, y mezclas de los mismos. Alternativamente, el hidrogel puede estar formado por Matrigel, Myogel y Cartigel, o una combinación de Matrigel, Myogel y Cartigel y un biomaterial o varios biomateriales obtenidos naturalmente.

[0048] Las proteínas utilizadas en la presente invención pueden ser de origen natural o recombinantes.

[0049] El hidrogel sintético hidrófilo biofuncional de la superficie o del recubrimiento o de ambos puede ser una macromolécula de polímeros hidrófilos lineales o ramificados, más preferiblemente donde los polímeros son moléculas de polietilenglicol) y más preferiblemente donde las moléculas de polietilenglicol) se seleccionan del grupo que comprende: polietilenglicol), poliuretanos polialifáticos, poliuretanos de poliéter, poliuretanos de poliéster, copolímeros de polietileno, poliamidas, alcoholes polivinílicos, poli( óxido de etileno), óxido de polipropileno, polietilenglicol, polipropilenglicol, óxido de politetrametileno, polivinilpirrolidona, poliacrilamida, poli(acrilato de hidroxietilo), poli(metacrilato de hidroxietilo) y mezclas de los mismos.

[0050] En otro aspecto de la invención, la superficie comprende una matriz de micropocillos, donde cada micropocillo de la matriz es capaz de soportar:

1. i. La agregación de números definidos de células madre en un agregado multicelular de tamaño y forma reproducibles,

2. ii. La expansión celular espacialmente confinada, y/o

3. iii. La autoorganización de células madre y el desarrollo de organoides.

[0051] El micropocillo puede funcionar para restringir el movimiento de un organoide en desarrollo de manera que el centro de masa del organoide esté a menos de 100 μm del centro del fondo del micropocillo, es decir, a una distancia suficiente del centro del fondo del micropocillo para facilitar el procesamiento de alto rendimiento de la matriz. Los micropocillos son, además, preferiblemente de fondo redondo (U).

[0052] Los micropocillos pueden tener un diámetro de entre aproximadamente 10 μm y aproximadamente 5 mm, un radio de curvatura de entre aproximadamente 5 μm y aproximadamente 2,5 mm y una profundidad de entre aproximadamente 10 μm y aproximadamente 6 mm. Preferiblemente, la profundidad de los micropocillos es 1,2 veces el diámetro de la cavidad. Las dimensiones y la forma de los micropocillos o cavidades tienen un efecto sobre el control del crecimiento y la morfogénesis de los organoides.

[0053] La superficie utilizada en el método de la invención puede comprender uno o más factores bioactivos que fomentan la expansión de las células madre, la diferenciación, la autoorganización y/o el desarrollo de organoides, con el fin de mantener, fomentar y/o dirigir el crecimiento y la morfogénesis de las células madre y/o los organoides en desarrollo. Los factores bioactivos son preferiblemente factores de matriz extracelular o proteínas de las principales vías de señalización, más preferiblemente proteoglicanos, polisacáridos no proteoglicanos o proteínas fibrosas. Los biofactores pueden proporcionarse en la superficie de cada micropocillo y preferiblemente suministrarse a cada micropocillo por difusión pasiva desde microcavidades en la superficie. Las microcavidades pueden formar depósitos o canales dentro de la superficie y pueden colocarse dentro de la superficie en cualquier lado o en ambos lados de cada micropocillo.

[0054] En particular, la superficie o el hidrogel con patrones de la invención pueden interconectarse con un material duro biocompatible como el plástico o un polímero blando como el PDMS (polidimetilsiloxano) que forman redes microfluídicas o depósitos. Estas redes microfluídicas o los depósitos pueden ser la fuente de suministro/sumidero o pueden interconectarse con el hidrogel para permitir la fabricación microfluídica en la fase de gel para crear la fuente de suministro/sumidero para las cavidades (Brandenberg y Lutolf, 2016). Las redes microfluídicas pueden accionarse (es decir, para un flujo convectivo) o las moléculas pueden suministrarse pasivamente por difusión, mediante un gradiente que puede abarcar una o más microcavidades o micropocillos. Las redes microfluídicas o los depósitos pueden estar debajo de las microcavidades o en uno o ambos lados de las microcavidades.

[0055] El establecimiento del suministro local o el gradiente de las moléculas de interés puede establecerse mediante el control de la concentración local de las moléculas dentro de las redes. Las moléculas pueden difundirse en el espacio de hidrogel entre las redes microfluídicas o los depósitos y las microcavidades, de manera que el movimiento de las moléculas es impulsado únicamente por difusión. El tiempo de difusión depende del peso molecular de las moléculas de interés y de la distancia entre las redes microfluídicas o los depósitos y las microcavidades.

[0056] En otro aspecto, la invención se refiere a una matriz de organoides producida mediante los métodos de la invención.

[0057] En otro aspecto adicional, la invención se refiere a una matriz de organoides en una superficie, donde

i) la matriz de organoides se ha cultivado in situ en la superficie a partir de una matriz de células madre o de una matriz de agregados multicelulares, donde cada agregado comprende al menos una célula madre,

ii) la matriz de organoides se encuentra dentro de un único plano focal

iii) la superficie puede estar dividida por una teselación regular, de forma que los organoides se sitúen individualmente dentro de teselas adyacentes de la teselación.

[0058] La superficie es un hidrogel, preferiblemente un hidrogel biofuncional.

[0059] Preferiblemente, la matriz de organoides de la invención se forma in situ en la superficie a partir de una matriz de células madre o de una matriz de poblaciones homogéneas de células madre.

[0060] En otro modo de realización, la densidad de organoides en la matriz es de al menos un organoide por cm2, preferiblemente al menos 30 organoides por cm2, más preferiblemente al menos 1 millón de organoides/cm2, más preferiblemente 1,1 millones de organoides por cm2, más preferiblemente donde el centro de masa de cada organoide en la matriz está a unos 100 μm o menos del centro de la tesela en la que está posicionado,

[0061] En otro modo de realización, el centro de masa de cada organoide de la matriz está a unos 100 μm o menos del centro de la tesela en la que está colocado, preferiblemente donde la distancia entre el centro de masa de organoides adyacentes de la matriz es de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 5000 μm, preferiblemente entre 10 y aproximadamente 2000 μm, de forma que la matriz es adecuada para el procesamiento y la obtención de imágenes de alto rendimiento. La matriz de la invención puede colocarse en un pocillo de una placa de pocillos múltiples, preferiblemente donde la placa es compatible con la manipulación de líquidos, la manipulación de líquidos automatizada, el cribado de alto rendimiento y/o el micropipeteo, más preferiblemente donde los pocillos de la placa son de fondo plano.

[0062] En otro aspecto, la divulgación que no forma parte de la invención se refiere a un kit que comprende una superficie de la invención y puede comprender además medios para cultivar células madre en condiciones de supervivencia celular, medios para cultivar células en condiciones de diferenciación y formación de organoides, y preferiblemente células madre. Los componentes de los medios se proporcionan preferiblemente en un recipiente separado, más preferiblemente un tubo o una botella. Las células madre también se proporcionan preferiblemente en un recipiente separado, preferiblemente un tubo o criotubo.

[0063] En otro aspecto, la divulgación que no forma parte de la invención comprende el kit para preparar una matriz de organoides según la invención, que comprende

i) una matriz de micropocillos o cavidades impresas en una superficie según la invención;

ii) un medio definido, que comprende factores específicos del tejido, nutrientes y morfógenos; y

iii) células madre y/o células diferenciadas.

[0064] Preferiblemente, la superficie se proporciona en un recipiente de cultivo, los componentes de los medios se proporcionan en un recipiente separado, preferiblemente un tubo o una botella, y las células madre se proporcionan en un recipiente separado, en un tubo o en un criotubo. Preferiblemente, la matriz se proporciona previamente suministrada en un recipiente, preferiblemente en pocillos de una placa de múltiples pocillos, de una placa de microtitulación o en un transwell de una placa de múltiples pocillos, en una forma ya reaccionada, sumergida en líquido. El medio puede proporcionarse previamente suministrado en un recipiente, preferiblemente en una botella, un tubo o en una multitud de botellas y tubos listos para mezclar, a ser posible a baja temperatura. Las células se proporcionan preferiblemente en un recipiente, preferiblemente un criotubo y, a ser posible, a muy baja temperatura.

[0065] En otro aspecto, la divulgación que no forma parte de la invención se refiere a un ensayo de cribado para evaluar cuantitativamente el desarrollo de organoides, o perturbaciones de los mismos, que comprende:

i. la siembra de una población de células madre en un sustrato de cultivo celular microestructurado desencadenando su agregación en esferoides multicelulares,

ii. la aplicación de compuestos farmacológicos, biomoléculas o células (es decir, sustancia farmacológica) a la matriz de colonias de células madre

iii. el fomento del desarrollo de organoides mediante el suministro de señales instructivas para la autorrenovación, diferenciación y/o morfogénesis

iv. la monitorización de un efecto de compuestos farmacológicos, biomoléculas o células (es decir, sustancia farmacológica) sobre el tamaño, la forma y la composición celular de los organoides,

v. el cambio de manera regular del medio sobre la matriz de organoides sin alterar la ubicación de los organoides para permitir periodos de crecimiento de entre una semana y varios meses.

[0066] Preferiblemente, las perturbaciones se introducen localmente en el cultivo utilizando redes microfluídicas o depósitos.

[0067] En otro aspecto, la invención se refiere a un ensayo de cribado basado en organoides, que comprende

i. el cultivo de una población de células madre en una matriz de organoides,

ii. la aplicación de compuestos farmacológicos, biomoléculas o células a la matriz de organoides,

iii. la monitorización de un efecto de la sustancia sobre el tamaño del organoide, su forma, su composición celular y sus cambios fenotípicos

iv. el análisis de los cambios fenotípicos mediante imágenes de campo amplio o de campo claro

v. la monitorización de un efecto de la sustancia sobre las variaciones de los niveles de marcadores específicos (informadores) de interés mediante formación de imágenes,

vi. el análisis del nivel de los marcadores mediante imágenes de fluorescencia de campo amplio y microscopía confocal

vii. opcionalmente, el análisis del nivel de los marcadores mediante análisis de expresión génica

viii. opcionalmente, el análisis del nivel de moléculas no informadoras mediante inmunofluorescencia

ix. opcionalmente, el análisis de las ultraestructuras celulares mediante microscopía electrónica

x. opcionalmente, el análisis del nivel de marcadores proteínicos mediante proteómica.

[0068] En este y en cada uno de los siguientes ensayos descritos en el presente documento, preferiblemente la matriz de organoides se forma de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento.

[0069] En otro aspecto, la invención se refiere a un ensayo de cribado basado en organoides para medicina personalizada, comprendiendo el ensayo

i. proporcionar una muestra de biopsia de tejido de un paciente,

ii. cultivar células madre o células tumorales aisladas de la muestra de biopsia como matriz de organoides, iii. cultivar la matriz de organoides en condiciones adecuadas en presencia de los compuestos farmacológicos o biomoléculas que se van a probar, y

iv. monitorizar la reducción exitosa del daño o la muerte celular, el restablecimiento de la integridad de la unión epitelial o la inflamación,

v. opcionalmente, monitorizar el éxito de la eliminación de las células metastásicas y tumorigénicas.

[0070] En otro aspecto, la invención se refiere a un ensayo de cribado basado en organoides para medicina personalizada, comprendiendo el ensayo

i. proporcionar una muestra de biopsia de tejido de un paciente,

ii. generar células madre pluripotentes inducidas a partir de la biopsia

iii. opcionalmente, modificar secuencias genéticas específicas en las células madre pluripotentes inducidas generadas utilizando, por ejemplo, pero no exclusivamente, la tecnología CRISPR,

iv. cultivar las células madre pluripotentes inducidas generadas a partir de la muestra de biopsia como una matriz de organoides,

v. cultivar la matriz de organoides en condiciones adecuadas en presencia de los compuestos farmacológicos o biomoléculas que se van a probar, y

vi. monitorizar la reducción exitosa del daño o la muerte celular, el restablecimiento de la integridad de la unión epitelial o la inflamación,

v. opcionalmente, monitorizar el éxito de la eliminación de las células metastásicas y tumorigénicas,

viii. definir el tratamiento adecuado para enfermedades específicas o tejido sano cuyo fenotipo se haya reproducido in vitro.

[0071] En otro aspecto, la invención se refiere a un ensayo de cribado basado en organoides para medicina personalizada o para cribado de compuestos de transporte transepitelial utilizando microscopía holográfica, comprendiendo el ensayo

i. proporcionar una biopsia de tejido o células madre derivadas de pluripotencia inducida,

ii. cultivar células madre o células tumorales aisladas de la muestra de biopsia como matriz de organoides epiteliales, iii. madurar los organoides epiteliales en matriz,

iv. inducir la dilución luminal o la dilución intracelular estimulando los organoides mediante activadores de los canales de transporte de iones (como la forskolina y la toxina del cólera),

v. monitorizar la dilución haciendo un seguimiento de la disminución del índice de refracción mediante la formación de imágenes con microscopía holográfica,

vi. definir opcionalmente el tratamiento de impacto de compuesto para enfermedades específicas o tejido sano cuyo fenotipo se haya reproducido in vitro.

vii. opcionalmente, definir la mejor combinación de tratamiento para enfermedades específicas o tejido sano cuyo fenotipo se haya reproducido in vitro.

EJEMPLOS

[0072] Los expertos en la materia observarán que la invención descrita en la presente memoria es susceptible de variaciones y modificaciones distintas de las descritas específicamente. Cabe entender que la invención incluye todas esas variaciones y modificaciones sin desviarse del espíritu o de las características esenciales de la misma. La invención también incluye todas las etapas, características, composiciones y compuestos mencionados o indicados en la presente memoria, individual o colectivamente, y todas y cada una de las combinaciones o dos o más de las etapas o características. Por lo tanto, la presente divulgación debe considerarse en todos los aspectos como ilustrativa y no restrictiva, siendo el alcance de la invención el indicado por las reivindicaciones adjuntas, y todos los cambios que entren dentro del significado y rango de equivalencia se pretenden abarcar en la misma.

[0073] Las descripciones anteriores se entenderán plenamente con referencia a los siguientes ejemplos. Tales ejemplos, son, sin embargo, ilustrativos de métodos para poner en práctica la presente invención y no pretenden limitar el alcance de la invención.

Ejemplo 1. Matrices de organoides: características y análisis

1.1 Introducción

[0074] Mediante el uso del dispositivo de plataforma descrito en WO2016103002 A1 (Hohnel et al., 2016) los inventores generaron matrices de organoides de alto rendimiento.

1.2 Resultados

[0075] Se imprimió una capa de hidrogel con cavidades o micropocillos de varios tamaños/formas/profundidades como se describe en WO2016103002 A1 (Hohnel et al., 2016) y se utilizó para preparar matrices de organoides. Los organoides se cultivaron in situ, de tal manera que, desde el inicio hasta la formación de la estructura final de los organoides, no hubo transferencia a estructuras preformadas a otra posición o entorno de cultivo. Las dimensiones de las cavidades se ajustaron en función del tipo de matriz de organoides que se iba a preparar (Tabla 1).

Diámetro de Altura de Distancia entre Diámetro de matriz

micropocillo micropocillo micropocillos de micropocillos

Matriz

(M m ) (M m ) (M m ) (M m )

Esferoides

Organoides intestinales

Organoides retinianos

Organoides de cáncer

colorrectal

Organoide de acinos MCF10a

Tabla 1: Resumen de diversas aplicaciones de matriz y su correspondiente geometría de micropocillo

[0076] En resumen, se formó una matriz de organoides tomando una suspensión de células madre individuales, ajustando la densidad para alcanzar el número exacto de células por cavidad, depositando esta suspensión celular sobre la superficie de hidrogel con patrones y dejando que las células se distribuyeran en cada cavidad por gravedad o centrifugación. La densidad de las cavidades era tan alta que cada célula acababa en una cavidad. Tras 15-30 minutos de incubación, todas las células se reunieron en el fondo de las cavidades. Se pudieron añadir medios adicionales al recipiente donde se depositó la capa de hidrogel con patrones sin perturbar las células en el fondo de las cavidades.

[0077] Las células se compactaron en agregados multicelulares, partiendo de al menos una o dos células con un número límite superior de células que es ilimitado, de las cuales al menos una es una célula madre, idealmente partiendo de una población homogénea de células madre.

[0078] Opcionalmente, los agregados de células madre o las estructuras de compactación se recubren con un hidrogel, que puede ser diluido (es decir, forma una solución viscosa, o medios semisólidos) o no (forma un gel sólido), para fomentar el desarrollo de nuestros organoides. Diluido significa que no polimeriza, no diluido significa que formará una capa superior de gel.

[0079] Los medios adecuados, las combinaciones de nutrientes y proteínas (es decir, factores de crecimiento, morfógenos) se añaden en el cultivo de forma homogénea para guiar el crecimiento y el desarrollo de los organoides.

[0080] En los siguientes ejemplos 2-5, se proporcionan detalles de las diversas matrices de organoides que pueden formarse.

1.3 Discusión

[0081] La repetibilidad extremadamente precisa de las geometrías de dispositivo de las matrices de organoides de la presente invención garantiza finalmente la compatibilidad de estas matrices de organoides para el cribado de fármacos de alto rendimiento. Utilizando esta tecnología, todos los organoides se encuentran en un plano focal (figura 2a). Esto resuelve una de las principales limitaciones actuales de los cultivos celulares en 3D, donde el análisis de imágenes se ralentiza significativamente debido a la distribución de las estructuras celulares en muchos focos diferentes, eliminando así la necesidad de realizar análisis basados en z-stacks (figura 2b). Adicionalmente, todos los organoides se encuentran dentro de regiones localizadas (regiones de interés, ROI), representadas por los micropocillos (figura 2f). Esta particularidad garantiza que cada organoide pueda ser rastreado y analizado por separado y a lo largo del tiempo. Esto ofrece la oportunidad de evaluar la variación en las poblaciones de organoides y la comprensión estadística de los comportamientos generales. Las distancias entre las ROI siguen la geometría del pocillo, es decir, las distancias de cada ROI serán siempre (2*D)+p, donde D es el diámetro de una estructura concreta y p la distancia entre micropocillos. En concreto, la matriz de organoides puede recubrirse con una teselación regular, de forma que los organoides se sitúen de forma única dentro de teselas adyacentes de la teselación (figura 2g). Este patrón altamente reproducible permite la automatización del análisis y, por tanto, la compatibilidad de estos cultivos con el cribado de alto rendimiento.

[0082] Son posibles varios métodos de análisis en estas matrices de organoides. La base o superficie del dispositivo está hecha de un material biocompatible transparente, que garantiza una transparencia óptica total. Esto permite el desarrollo de ensayos basados en escaneo de matrices utilizando fluorescencia de seguimiento de células vivas de campo claro e inmunofluorescencia (figura 2d). Con estas técnicas, se pueden realizar y analizar cribados fenotípicos totalmente exhaustivos basados en ROI para la detección de organoides.

[0083] Esta plataforma también permite por primera vez el desarrollo de histología de alto rendimiento. Debido a la altura constante y las geometrías de los cultivos, el seccionamiento histológico puede realizarse de forma reproducible y, como todos los agregados y organoides se encuentran en el mismo plano focal, las secciones contienen todas las estructuras en un único corte histológico.

1.4 Materiales y métodos

1.4.1. Fabricación de matrices de micropocillos con fondo en forma de U utilizando moldes de PDMS

[0084] Se generaron microcavidades en forma de U de cualquier tamaño entre 10 μm y 1,5 mm sobre obleas de silicio estándar de 4 pulgadas utilizando Si Bosch estándar en combinación con procesos de litografía suave. Se vertió PDMS (proporción 1:10) sobre las obleas y se curó durante la noche a 75 °C. Tras la reticulación, se desmoldaron los sellos de PDMS y se perforaron con distintos diámetros: 5,5; 6, 8, 10 o 12 mm.

1.4.2. Impresión de los micropocillos en forma de U sobre sustratos de hidrogel

[0085] Los sellos deseados se montaron en los soportes de epoxi. La mezcla de hidrogel de PEG no reticulado se depositó sobre el sello de PDMS, y el constructo soporte-sello-hidrogel se colocó en un anillo de PDMS en el fondo de los pocillos de una placa de 24 pocillos. Los hidrogeles se incubaron a 37 °C y un 5 % de CO²durante 15 minutos a 1 h, en función del tipo de hidrogel utilizado. Tras la reticulación, se pipeteó tampón acuoso (por ejemplo, 1X PBS) en los pocillos y se retiraron cuidadosamente los soportes-sellos. Las matrices de micropocillos resultantes se esterilizaron a fondo en tampón con luz ultravioleta y se almacenaron a 4 °C tras su uso.

1.4.3. Preparación de hidrogeles

[0086] Los hidrogeles de PEG reticulados mediante reacción de adición de tipo Michael (denominados "MT-gel") se prepararon como se ha descrito (Gobaa et al., 2011), mezclando soluciones acuosas que contenían macrómeros de PEG de 4 y 8 brazos funcionalizados con tiol y vinilsulfona (pesos moleculares de 10 kDa y 40 kDa, respectivamente) en diversas concentraciones para ajustar la rigidez y la relación estequiométrica. La solución se depositó y moldeó como se ha explicado anteriormente. El constructo se reticuló durante 15 minutos a temperatura ambiente.

[0087] Los hidrogeles de PEG reticulados mediante el factor transglutaminasa XIIIa (FXIIIa) (denominados "TG-gel") fueron preparados como se describió anteriormente (Ehrbar et al., 2007a, 2007b, 2011). En resumen, se mezclaron macrómeros de PEG de 8 brazos (40 kDa) con péptidos sustrato de FXIIIa que contenían lisina o glutamina en varias concentraciones para ajustar la rigidez y la relación estequiométrica. Además, se incorporaron proteínas o péptidos, de forma covalente o no covalente, en la red de hidrogel. La solución se depositó y se moldeó como se ha mencionado anteriormente. El constructo se reticuló durante 30 minutos a 37 °C y un 5 % de CO².

1.4.4. Preparación de matrices de micropocillos esferoides

[0088] Las células de interés se separaron con tripsina (TrypLE, Life Technologies). Se prepararon suspensiones celulares con densidades específicas (por ejemplo, 4,68*10® células/mL, 9,36*104 células/mL y 9360 células/mL para conseguir 500 células/micropocillo, 100 células/micropocillo y 1 célula/micropocillo, respectivamente) en los medios específicos de tipo celular. Posteriormente, se añadieron 50 μl de la solución celular preparada en el anillo interior que contenía las matrices de micropocillos. Las células se asentaron por sedimentación gravitatoria durante 30 minutos a 37 °C y un 5 % de CO²y, a continuación, se añadieron 700 μL de medio apropiado. Todos los tipos celulares se cultivaron durante 5 días y sus respectivos medios se cambiaron cada dos días.

1.4.5. Caracterización mecánica de los hidrogeles de PEG

[0089] El módulo de cizallamiento de los geles de PEG se determinó realizando mediciones de cizallamiento oscilatorio de pequeña tensión en un reómetro Bohlin CVO 120. En resumen, se dejó que discos de hidrogel preformados de 1 1,4 mm de grosor se hincharan en medio de cultivo celular completo durante al menos 3 h, y posteriormente se colocaron entre las placas paralelas del reómetro. La respuesta mecánica de los geles se registró realizando mediciones de barrido de frecuencia (0,1-10 Hz) en modo de tensión constante (0,05), a 37 °C.

Ejemplo 2. Matrices de organoides de ISC adultas primarias

2.1 Introducción

[0090] Como primera prueba de concepto, los inventores demostraron la facilidad de realizar y analizar cribas fenotípicas utilizando organoides derivados de células madre intestinales (ISC, por sus siglas en inglés) e imágenes de campo claro. Las ISC adultas se cultivan convencionalmente en gotas de Matrigel™ en 3D. Estas gotas son muy variables en términos de número de organoide por cultivo, tamaños y formas de los organoides (figura 3a). Las estructuras celulares en Matrigel sólo pueden analizarse manualmente y como entidades individuales. Esta es actualmente una gran limitación del sistema. En estudios anteriores, también se ha evaluado el crecimiento de organoides en estos cultivos calculando el área total combinada de todos los organoides de un cultivo, en lugar de medir los organoides individualmente (Dekkers et al., 2013). En el presente documento, los inventores informan de la formación de organoides intestinales en matrices de micropocillos con fondo en U en una configuración geométrica específica (figura 3c,d).

2.2 Resultados

[0091] En estudios anteriores, se demostró que se pueden realizar ensayos funcionales en organoides intestinales. En el ámbito de la fibrosis quística, una enfermedad que afecta al transporte de fluidos a través del epitelio intestinal, se demostró que los organoides derivados de pacientes sanos y enfermos reaccionan de forma diferente a un activador de este transporte de fluidos, denominado forskolina (Dekkers et al., 2013). Se demostró que los organoides sanos se hinchaban más que los enfermos. Además, el fenotipo de los organoides enfermos podía rescatarse utilizando combinaciones de fármacos que se encuentran actualmente en fase de ensayo clínico. Sin embargo, este análisis se basó en el aumento global de la superficie de todos los organoides en un único cultivo (figura 3b). Este método presenta grandes inconvenientes en lo que se refiere a la comprensión de la dinámica de los organoides individuales, especialmente porque los efectos poblacionales pueden quedar enmascarados por estos promedios (figura 3e,f). El método también requiere que los organoides se traten con tintes de etiquetado fluorescentes para cuantificar las diferencias en el área media.

[0092] El método de la presente invención resuelve estos problemas. La matriz de organoides de la invención puede utilizarse para monitorizar organoides individuales en ROI específicas (círculos punteados) y realizar análisis de diferencias de área en organoides individuales a lo largo del tiempo (figura 3g, h). Dicho análisis revela variaciones sustanciales de comportamiento entre organoides individuales de la misma población que pueden monitorizarse con precisión a lo largo del tiempo (figura 3i). La matriz de organoides puede superponerse a una teselación regular, de forma que los organoides se sitúen de forma única dentro de teselas adyacentes de la teselación (figura 3j).

[0093] La matriz de organoides de la invención también puede utilizarse en ensayos sensibles de transporte de fluidos transmembrana en organoides intestinales. Mediante la utilización de microscopía holográfica digital (DHM, por sus siglas en inglés), la masa seca acumulada en el lumen del organoide puede medirse por un desplazamiento de fase entre un haz de luz de referencia y un haz de luz que atraviesa el organoide (Jourdain et al., 2014). Cuando los organoides se tratan con forskolina u otros agonistas de CFTR, el fluido entra en el lumen del organoide, el desplazamiento de fase disminuye y, por tanto, el rendimiento integrado de todos los transportadores CFTR (figura 4a, b).

[0094] El cambio de fase se monitorizó a lo largo del tiempo y pudo ajustarse a una meseta seguida de un declive exponencial con alta fidelidad. Este ajuste permitió la extracción de parámetros críticos como el valor de fase inicial (antes de que el organoide reaccionara a los agonistas transportadores), Y⁰, la meseta final, el declive, a partir del cual puede calcularse la vida media, el tiempo de entrada de agua (X⁰) y el alcance (figura 4c). Con estos parámetros, se pudo calcular el factor de dilución del lumen (Y⁰dividido por la meseta), lo que demostró que la cantidad de absorción de líquido en el lumen era significativamente mayor en los organoides de tipo salvaje que en los organoides CFTR del 508 (figuras 4d a 4h).

2.3 Discusión

[0095] Utilizando este ensayo, los inventores demuestran que el rendimiento de los transportadores de membrana en organoides intestinales se puede evaluar de forma fiable. El ensayo también puede utilizarse para buscar combinaciones óptimas de fármacos para recuperar la función de proteínas transmembrana mutadas, como el transportador CFTR.

[0096] En general, esto da ejemplos específicos que demuestran la facilidad de realizar análisis funcionales en organoides intestinales con técnicas simples libres de etiquetado.

2.4 Materiales y métodos

2.4.1. Cultivo celular

[0097] Células madre intestinales de ratón LGR5::GFP: Las criptas se extrajeron del intestino delgado murino como se informó anteriormente (Sato et al., 2009). Las criptas aisladas se mantuvieron y expandieron en Matrigel™, en medio de autorrenovación, ENR-CV (Yin et al., 2014).

2.4.2. Preparación de matrices de micropocillos de organoides intestinales

[0098] Los organoides intestinales LGR5::GFP se liberaron de Matrigel™ en medio basal frío (DMEM/F-12 avanzado que contenía 1 mM de HEPES, Glutamax™ y un 1 % de P/S). Los organoides se centrifugaron a 800 rpm, durante 4 minutos, a 4 °C y se volvieron a suspender en 1 mL de solución de disociación celular (TryμLE, 2 mg/mL de DNAsa I, Gibco, 1 mM de N-acetilcisteína y 10 μM de Y27632). Las células se disociaron durante 8 minutos a 37 °C y posteriormente se lavaron con medio basal que contenía un 10 % de suero bovino fetal (FBS, por sus siglas en inglés, inactivado por calor, Gibco). Tras centrifugación a 1000 rpm durante 4 minutos, a 4 °C, las células se volvieron a suspender a una densidad de 2,24*105 células/mL en medio ENR-CV suplementado con 2,5 μM de tiazovivina y diferentes concentraciones de laminina o Matrigel™ (véase la tabla 3.1) para depositar 100 células por micropocillo. Se añadieron 50μL de la suspensión celular en cada micropocillo. Las células se agregaron durante la noche en un medio que contenía un componente de lámina basal diluida no gelificante y posteriormente se emparedaron en TG-PEG no degradable de 300 Pa, que contenía 100 μg/mL de laminina de longitud completa (Laminin Mouse Protein, Natural, ThermoFisher Scientific) y 1 mM de RGD unido a la red de hidrogel. El hidrogel se dejó reticular durante 4 h a 37 °C y un 5 % de CO². Por último, se añadieron 750 μL de medio de autorrenovación (ENR-CV) a cada pocillo. Las mlSC agregadas se expandieron en condiciones de autorrenovación durante 2 días, y los organoides se diferenciaron durante 4 días en medio de diferenciación (ENR). Los factores de crecimiento se reponían cada dos días.

Ejemplo 3. Matrices de organoides retinianos derivados de ESC o iPSC

3.1 Introducción

[0099] Los organoides retinianos derivados de células madre embrionarias (ESC, por sus siglas en inglés) o células madre pluripotentes inducidas (IPSC, por sus siglas en inglés) se han mostrado como una potente fuente de células progenitoras de la retina que tienen una amplia aplicación, que va desde el trasplante al cribado de fármacos. Sin embargo, hasta la fecha, no se ha descrito ninguna plataforma que permita, de forma reproducible, la generación de alto rendimiento de estos organoides retinianos. Con este fin, los inventores definieron geometrías y propiedades mecánicas específicas para permitir el crecimiento adecuado de tejido retiniano de ratón según los métodos de la invención.

3.2 Resultados y discusión

[0100] A diferencia del método convencional, es decir, las placas de fondo en forma de U de 96 pocillos de baja adherencia, se pudo cultivar una multitud de organoides retinianos en un solo micropocillo o cavidad de la superficie (figura 5a). Los organoides retinianos se situaron en el centro de cada micropocillo y ocuparon todos los pocillos de la matriz.

[0101] Las estructuras de organoides retinianos generadas en la plataforma de micropocillos también mostraron un desarrollo muy similar en comparación con los métodos de cultivo estándar. En particular, CRX, un marcador precursor de fotorreceptor, se expresó tras catorce días de cultivo (figura 5b, c). Curiosamente, tras la cuantificación en el mismo punto temporal, mientras que los niveles de CRX eran similares (figura 5d), la organización entre la pigmentación retiniana y el tejido retiniano mejoró significativamente en los organoides retinianos procedentes del cultivo en matriz de organoides de micropocillos (figura 5e). Además, el tejido retiniano de los organoides maduró junto con el epitelio pigmentado y la polaridad del epitelio de la retina procedente de los micropocillos se invirtió con frecuencia en comparación con el cultivo convencional (figura 5f, g). Se demostró que los informadores fluorescentes en tiempo real que aparecían en las estructuras celulares 3D podían monitorizarse en tiempo real dentro de la matriz de organoides. La matriz de organoides podía superponerse a una teselación regular, de tal manera que los organoides se posicionan de forma única dentro de teselas adyacentes de la teselación (figura 5h, i).

[0102] Los inventores muestran que los métodos de la presente invención pueden utilizarse para producir matrices de conjuntos de organoides retinianos adecuados para análisis de alto rendimiento, como la cuantificación de la expresión de CRX.

3.3 Materiales y métodos

3.3.1. Cultivo celular

[0103] Las células madre embrionarias de ratón OCT4::GFP (mESC, por sus siglas en inglés) proporcionadas por Austin Smith (Universidad de Cambridge) se expandieron rutinariamente sin alimentadores en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, por sus siglas en inglés) suplementado con factor inhibidor de leucemia (LIF, por sus siglas en inglés), medio de suero fetal bovino (FBS, Gibco) tamizado para ESC (15 %), aminoácidos no esenciales (NEAA, por sus siglas en inglés) piruvato sódico (10 mM) y b-mercaptoetanol (0,1 mM), en lo sucesivo denominado medio celular ES (Smith).

[0104] Las células madre embrionarias de ratón CRX::GFP (mESC) obtenidas de Decembrini y colegas se mantuvieron rutinariamente como se informó anteriormente (Decembrini et al., 2014).

3.3.2. Preparación de matrices de micropocillos de organoides retiñíanos:

[0105] Se lavaron mESCs6 CRX::GFP con solución salina tamponada con fosfato (1X PBS, Gibco) y se separaron con tripsina (Gibco, n.° cat.25200-056). A continuación, las células se volvieron a suspender en medio de inducción de vesícula óptica (OV, por sus siglas en inglés) a una densidad de 525000 células/mL para sembrar 3000 células por micropocillo. A continuación, se añadió la suspensión celular por encima las matrices, en el anillo interior, y se dejaron sedimentar las células durante 30 minutos a 37 °C y un 5 % de CO². A continuación, se añadieron 660 μl de medio de inducción de OV fuera de la matriz de micropocillos sin perturbar las células sedimentadas. Tras una incubación de una noche, las células formaron agregados en cada micropocillo y se añadieron 140 μl de una solución diluida de Matrigel™ reducida en factor de crecimiento (12 %, Corning) en cada 24 pocillos, para alcanzar una concentración final de Matrigel™ de un 2 %. Se dejaron las células agregadas en medio de inducción de OV durante 7 días. En el día 7, el medio se cambió a medio6 de inducción de copa óptica (OC, por sus siglas en inglés) y se dejó hasta el día 12. En el día 12, el medio se cambió posteriormente a medio6 de maduración de retina hasta el día 30. En este caso, el medio se cambió cada dos días. Además, los organoides se incubaron con un 40 % de oxígeno desde el día 12 en adelante para fomentar la supervivencia de los fotorreceptores recién nacidos.

Ejemplo 4. Matrices de organoides de tumores colorrectales de humanos adultos

4.1 Introducción

[0106] Se espera que los modelos in vitro de cáncer se conviertan en modelos potentes, si se demuestra que se comportan in vitro de forma similar al tejido cancerígeno nativo in vivo. Los tumores son una colección heterogénea de células, incluyendo células madre cancerígenas, lo que altera el tejido nativo. Este ejemplo demuestra la producción de micromatrices a partir de biopsias de tumores colorrectales humanos, una enfermedad que se erige como uno de los cánceres más extendidos.

4.2 Resultados y discusión

[0107] Las muestras de biopsia de tumores colorrectales humanos primarios pueden cultivarse y crecer durante largos periodos de tiempo (figura 6a). Para evitar perder la heterogeneidad de cada agregado tumoral, las células se disocian en células individuales y se vuelven a agregar a partir de múltiples células en micropocillos en cada pasaje. Los esferoides resultantes conservan la viabilidad (figura 6b) y se duplican cada 7 días, de forma similar a cuando se cultivan en gota de Matrigel™. Además, las diferentes condiciones de cultivo modifican la polaridad de los tumoroides (figura 6c). Estos organoides cancerosos se pudieron mantener y cultivar en un entorno sin Matrigel™ durante más de 15 pasajes. Su crecimiento fue variable a lo largo de periodos prolongados, pero, de media, la población celular se duplicó cada 7 días (figura 6d).

[0108] El diámetro del micropocillo influye en el crecimiento de los tumoroides. De hecho, para un número igual de células sembradas por micropocillo, el diámetro mayor permitió que el esferoide creciera más extensamente. Este efecto se conservó en dos densidades celulares diferentes por micropocillo (figura 6e).

[0109] El método de producción de matrices tumoroides descrito en el presente documento permite la modificación y el ajuste fino del microentorno local, permitiendo así el control del comportamiento tumoroide en la matriz tumoroide. La supervivencia celular en las matrices de micropocillos pudo monitorizarse mediante ensayos de fluorescencia vivo/muerto y la organización de los organoides pudo analizarse mediante inmunofluorescencia.

4.3 Materiales y métodos

4.3.1. Cultivo celular

[0110] Los organoides de cáncer colorrectal humano (una donación generosa de la Dra. Ordóñez Morán Paloma, del grupo del Prof. Huelsken, EPFL) se pasaron rutinariamente por Matrigel™ como se ha informado anteriormente (Jung et al., 2011).

4.3.2. Preparación de matrices de micropocillos de organoides de cáncer colorrectal

[0111] Los organoides de cáncer colorrectal humano fueron liberados de Matrigel™ en medio basal frío (DMEM/F-12 avanzado que contenía 1 mM de HEPES, Glutamax™ y un 1 % de P/S). Los organoides se centrifugaron a 800 rpm durante 4 minutos, a 4 °C y se volvieron a suspender en 1 mL de solución de disociación celular (TryμLE, 2 mg/mL de DNAsa I, Gibco, 1 mM de N-acetilcisteína y 10 μM de Y27632). Las células se disociaron durante 8 minutos a 37 °C y posteriormente se lavaron con medio basal que contenía un 10 % de suero bovino fetal (FBS [por sus siglas en inglés] inactivado por calor, Gibco). Tras centrifugación a 1000 rpm durante 4 minutos, a 4 °C, las células se volvieron a suspender a una densidad de 2,24*105 células/mL en medio de organoides de cáncer colorrectal suplementado con 2,5 μM de tiazovivina para depositar 100 células por micropocillo. Se añadieron 50 μL de la suspensión celular en cada micropocillo. Las células se asentaron por sedimentación gravitatoria durante 30 minutos a 37 °C y un 5 % de CO²y, a continuación, se añadieron 700 μL de medio de organoides de cáncer colorrectal. Las células se mantuvieron durante 7 días y el medio se cambió cada cuatro días.

Ejemplo 5. Matrices de organoides de glándulas mamarias humanas

5.1 Introducción

[0112] Se analizó si podían cultivarse líneas celulares derivadas de humanos en tres dimensiones en las matrices de micropocillos, centrándose en una línea celular epitelial mamaria humana (MCF10A), que, cuando se cultiva en gotas de Matrigel™ o en ensayos de sándwich, forma acinos, que pueden representar algunas características de las glándulas mamarias humanas.

5.2 Resultados y discusión

[0113] Las células MCF10A cultivadas en una fase Matrigel™ a partir de una o unas pocas células pueden utilizarse para formar matrices (figura 7a). Las estructuras resultantes están polarizadas de la localización de núcleos celulares en el exterior de la colonia, una focalización de la señal de F-actina en el interior, así como la señal de laminina restringida en el borde exterior de la colonia. GM130, una proteína de Golgi, se colocaliza con los bordes de los núcleos (figura 7b). Este fenotipo indica que las estructuras celulares imitan la organización de los acinos in vivo y, por lo tanto, proporciona un modelo elegante para el cribado de fármacos contra el cáncer de mama.

[0114] Los fenotipos del cáncer de mama pueden modelarse mediante la introducción de mutaciones en estas matrices y analizarse más detalladamente tras el tratamiento con fármacos específicos. Las matrices de micropocillos permiten el seccionamiento histológico y garantizan que todas las estructuras celulares se encuentran en un mismo plano, lo que simplifica enormemente el seccionamiento. Se demostró que las agrupaciones de la matriz están efectivamente en un mismo plano, de modo que es muy fácil obtener imágenes de alto contenido utilizando esta técnica (figura 7c).

5.3 Materiales y métodos

5.3.1. Cultivo celular

[0115] Se pasaron rutinariamente células epiteliales de mama MCF10a por cultivos monocapa estándar, como se ha informado anteriormente (Debnath et al., 2003).

5.3.2. Preparación de matrices de micropocillos de acinos MCF10a

[0116] Las células se separaron con tripsina (TryLife Life Technologies). Se prepararon suspensiones celulares con densidades específicas (por ejemplo, 1,12*10® células/mL, 2,24*10® células/mL y 2240 células/mL para conseguir 500 células/micropocillo, 100 células/micropocillo y 1 célula/micropocillo, respectivamente) en los medios específicos de tipo celular. Posteriormente, se añadieron 50 μl de la solución celular preparada en el anillo interior que contenía las matrices de micropocillos. Las células se asentaron por sedimentación gravitatoria durante 30 minutos a 37 °C y un 5 % de CO²y, a continuación, se añadieron 700 μL de medio de ensayo. Las células se mantuvieron durante 14 días en medio de ensayo y el medio se cambió cada cuatro días.

Ejemplo 6. Matrices de organoides de colon e intestino delgado humanos

6.1 Introducción

[0117] Se analizó si células madre humanas del tracto gastrointestinal (es decir, intestino delgado y colon), de las que informaron Hannan y sus colegas (Hannan et al, 2013) y Sato y sus colegas (Sato et al, 2009), podían cultivarse y diferenciarse en tres dimensiones como organoides en las matrices de micropocillos. Los progenitores derivados de iPS son de gran interés, ya que podrían evitar el muestreo de material biológico en pacientes y podrían servir con precisión emparejada para el descubrimiento de fármacos, así como para el diagnóstico de pacientes. Por otra parte, las células madre de colon adultas extraídas, cultivadas como organoides, son de gran interés para imitar de cerca el fenotipo específico de órgano de los pacientes de interés.

6.2 Resultados y discusión

[0118] Al sembrar una única suspensión celular (es decir, 100 células por micropocillo) en medio de expansión de células madre suplementado con Matrigel al 2 %, se pudieron formar colonias de células madre intestinales derivadas de iPS o colonias de células madre de colon en el fondo de cada microcavidad (figura 8a, d). Se pudo observar que las células eran capaces de sedimentar, agregarse eficientemente y formar colonias durante la noche. A continuación, las colonias de células madre se expandieron durante otros dos días para formar colonias luminales y quísticas que albergan un epitelio fino de células madre (figura 8b, e). En el día 3, las colonias alcanzaron un tamaño y, por tanto, un número de células que permitirían su diferenciación (figura 8b, e). Por consiguiente, en el día 3 se cambió el medio a un medio de diferenciación (véase material y métodos 6.3). Transcurridos ya dos días de diferenciación, las colonias de células madre experimentan un cambio morfológico y pasan a albergar un epitelio más grueso, comienzan a colapsarse y forman estructuras similares a yemas (figura 8c, f).

6.3 Materiales y métodos

6.3.1. Cultivo celular

[0119] Se obtuvieron organoides de intestino anterior derivados de iPS como se ha descrito anteriormente (Hannan et al., 2014). Los organoides se mantuvieron en gotas de matrigel y se pasaron cada 7 días. El medio de expansión de células madre se cambió cada dos días. Los organoides de colon adulto se extrajeron y se mantuvieron como se ha descrito anteriormente (Sato et al.). Los organoides se mantuvieron en gotas de matrigel y se pasaron cada 7-10 días. El medio de expansión de células madre se cambió cada 2-3 días.

6.3.2. Preparación de matrices de organoides intestinales derivados de iPS

[0120] Se prepararon y sembraron matrices de organoides del intestino anterior derivados de iPS siguiendo el mismo procedimiento que con las matrices de organoides intestinales de ratón LGR5::GFP (véase el ejemplo 2, subcapítulo 2.4.2). En este caso, tras la agregación durante la noche, se añadieron 700 μl adicionales de medio de expansión de células madre. En el día 3, el medio se cambió a medio de diferenciación, es decir, medio de expansión de células madre sin Wnt3A ni nicotinamida.

Ejemplo 7. Los organoides intestinales de ratón no pueden formarse a partir de células individuales agregadas en micropocillos Aggrewell™.

7.1 Introducción

[0121] En la última década, se han comercializado micropocillos diseñados para la generación de EB. Una de las tecnologías más utilizadas para este fin es Aggrewell™, que consiste en micropocillos piramidales de 400 μm u 800 μm. Esta tecnología ha demostrado la capacidad de generar EB en un periodo de 24-48 horas. Sin embargo, no existen informes que demuestren la posibilidad de realizar cultivos de células madre y cultivos de organoides a largo plazo utilizando esta tecnología. En este caso, se analizó si un sistema de organoides muy bien descrito, como los organoides intestinales de ratón, podía cultivarse en una plataforma Aggrewell™.

7.2 Resultados y discusión

[0122] Tras preparar las células como se describe en la sección material y métodos (7.3), se sembró la suspensión celular adecuada en los micropocillos Aggrewell™ siguiendo las instrucciones del fabricante. El fabricante indica que los micropocillos deben recubrirse antes de añadir las células utilizando su producto específico, la solución de enjuague Aggrewell™. Por lo tanto, se decidió recubrir la mitad de la placa y dejar la otra mitad sin recubrir como control. A continuación, se sembraron las células y se intentaron formar matrices de organoides intestinales de ratón en micropocillos Aggrewell™ siguiendo nuestro novedoso procedimiento (véase el ejemplo 2, subcapítulo 2.4.2).

[0123] Después de expandir las células madre intestinales como colonias durante dos días en ENRCV, ya se podía ver que en el estado sin recubrimiento, las células se adherían a la superficie de plástico y comenzaban a formar colonias adherentes (véase la figura 9a, flechas azules; numeración de los pocilios de arriba a la izquierda a abajo a la derecha, pocilios 6 y 10) y luego monocapas de células diferenciadas (véase la figura 9a, flechas rojas; numeración de los pocillos de arriba a la izquierda a abajo a la derecha, pocillos 1 y 7). Por otra parte, cuando los micropocillos Aggrewell™ estaban recubiertos, las células crecían simplemente en suspensión por encima de las matrices de micropocillos de forma muy desorganizada y era imposible generar una matriz de organoides estable y sólida (véase la figura 9b, flechas). En este caso, se pudo demostrar que los sustratos duros, como los plásticos o el polidimetilsiloxano (PDMS), no son suficientes para generar matrices de organoides intestinales de ratón.

7.3 Materiales y métodos

7.3.1. Cultivo celular

[0124] Células madre intestinales de ratón LGR5::GFP: Las criptas se extrajeron del intestino delgado murino como se informó anteriormente (Sato, 2009). Las criptas aisladas se mantuvieron y expandieron en Matrigel™, en medio de autorrenovación, ENR-C^v(Yin, 2014).

7.3.2. Preparación de matrices de organoides intestinales en micropocillos Aggrewell™

[0125] Se prepararon células madre intestinales LGR5::GFP como se describe en los ejemplos 2, subcapítulo 2.4.2. Para depositar 100 células por micropocillo piramidal de 800 μm, se añadieron 2 mL de la suspensión celular adecuada en cada pocillo, tal como se indica en la hoja de información del producto del fabricante. Las células se agregaron durante la noche en medio que contenía un componente de lámina basal diluida no gelificante. Las mlSC agregadas se expandieron en condiciones de autorrenovación durante 2 días, y los organoides se diferenciaron durante 4 días en medio de diferenciación (ENR). Los factores de crecimiento se reponían cada dos días.

Ejemplo 8. Los organoides retinianos de ratón no pueden diferenciarse eficientemente a partir de células individuales agregadas en micropocillos Aggrewell™.

8.1 Introducción

[0126] De manera similar al ejemplo 7, en la última década, se han comercializado micropocillos diseñados para la generación de EB. Una de las tecnologías más utilizadas para este fin es Aggrewell™, que consiste en micropocillos piramidales de 400 μm u 800 μm. Esta tecnología ha demostrado la capacidad de generar EB en un periodo de 24-48 horas. Sin embargo, no existen informes que demuestren la posibilidad de realizar cultivos de células madre y cultivos de organoides a largo plazo utilizando esta tecnología. En este caso, se analizó si un sistema de organoides derivados de células madre pluripotentes, como los organoides retinianos de ratón, podía cultivarse en una plataforma Aggrewell™.

8.2 Resultados y discusión

[0127] Utilizando el mayor tamaño disponible de micropocillos piramidales disponibles en el mercado, es decir, 800 μm, se intentaron generar agregados de mESC y más organoides retinianos a partir de la línea de células madre embrionarias de ratón CRX::GFP descrita por Decembrini et al. Tras realizar la siembra siguiendo la hoja de información del producto del fabricante, se dejó que las células se agregaran durante la noche de acuerdo con los protocolos publicados. Tras este primer paso, ya se pudo observar que tanto el sustrato como la forma no natural inhibían a las células de formar agregados compactados y sólidos (véase la figura 10). Esta incapacidad para formar agregados de forma fiable dificultó la continuación del protocolo y, por tanto, la diferenciación de las células en organoides retinianos. De forma similar al ejemplo 7, se pudo observar que tanto la forma como el sustrato son componentes críticos para formar matrices sólidas de organoides retinianos de ratón.

8.3 Materiales y métodos

8.3.1. Cultivo celular

[0128] Las células madre embrionarias de ratón CRX::GFP (mESC) obtenidas de Decembrini y colegas se mantuvieron rutinariamente como se informó anteriormente (Decembrini, 2014).

8.3.2. Preparación de matrices de organoides retinianos en micropocillos Aggrewell™

[0129] Se prepararon mESC CRX::GFP (Decembrini, 2014) como se describe en el ejemplo 3. Para depositar 3000 células por micropocillo piramidal de 800 |jm, se añadieron 2 mL de la suspensión celular adecuada en cada pocillo, tal como se indica en la hoja de información del producto del fabricante, y se dejó que se sedimentaran durante la noche. Las células se siguieron cultivando como se describe en el ejemplo 3.

REFERENCIAS

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Método para preparar una matriz de organoides, que comprende:

i. sembrar células madre en una superficie,

donde la matriz de organoides se encuentra dentro de un único plano focal y la superficie puede recubrirse con una teselación regular, de manera que los organoides se sitúan de forma única dentro de teselas adyacentes de la teselación; y donde la superficie comprende un hidrogel de polímero sintético hidrófilo biofuncional.

2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, donde las células no madre se siembran en combinación con las células madre sembradas en la etapa i, y/o donde el recubrimiento comprende un gel o una solución viscosa, preferiblemente donde el recubrimiento comprende un material compatible con las células que permite el desarrollo y mantenimiento de los organoides.

3. Método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, donde el hidrogel de superficie y/o el hidrogel de recubrimiento comprende biomateriales obtenidos de forma natural,

preferiblemente donde los biomateriales obtenidos de forma natural se seleccionan del grupo que comprende:

i. polisacáridos, proteínas gelatinosas, componentes de la ECM que comprenden: agarosa; alginato; quitosano; dextrano; gelatina; lamininas; colágenos; hialuronano; fibrina, variantes funcionales de los mismos y mezclas de los mismos; o

ii. un gel derivado de ECM natural, preferiblemente Matrigel, Myogel o Cartigel.

4. Método de acuerdo con la reivindicación 1, 2 o 3, donde el hidrogel de superficie y/o el hidrogel de recubrimiento es una macromolécula reticulada de polímeros hidrófilos, donde los polímeros son lineales o ramificados,

preferiblemente donde los polímeros son sintéticos,

más preferiblemente, donde los polímeros sintéticos se seleccionan del grupo que comprende: poli(etilenglicol), poliuretanos polialifáticos, poliuretanos de poliéter, poliuretanos de poliéster, copolímeros de polietileno, poliamidas, alcoholes polivinílicos, poli(óxido de etileno), óxido de polipropileno, polietilenglicol, polipropilenglicol, óxido de politetrametileno, polivinilpirrolidona, poliacrilamida, poli(acrilato de hidroxietilo), poli(metacrilato de hidroxietilo) y mezclas de los mismos,

más preferiblemente, donde el polímero es una macromolécula ramificada a base de poli(etilenglicol).

5. Método de acuerdo con las reivindicaciones 1-4, donde la superficie comprende una matriz de micropocillos, donde cada micropocillo de la matriz es capaz de soportar:

i. la agregación de números definidos de células madre en un agregado multicelular de tamaño y forma predefinidos, ii. la expansión celular espacialmente confinada, y/o

iii. la autoorganización de células madre y el desarrollo de organoides,

preferiblemente donde el micropocillo limita el movimiento de un organoide en desarrollo de tal forma que el centro de masa del organoide está a menos de unos 100 μm del centro del fondo del micropocillo;

preferiblemente donde cada micropocillo tiene un fondo redondo.

6. Método de acuerdo con la reivindicación 5, donde cada micropocillo presenta un diámetro de entre aproximadamente 10 μm y aproximadamente 5 mm,

preferiblemente donde cada micropocillo presenta un radio de curvatura de entre aproximadamente 5 μm y aproximadamente 2,5 mm,

más preferiblemente donde cada micropocillo presenta una profundidad de entre aproximadamente 10 μm y aproximadamente 6 mm,

más preferiblemente donde la profundidad del micropocillo es 1,2 veces el diámetro de la cavidad.

7. Método de acuerdo con la reivindicación 5 o 6, donde la superficie comprende uno o más factores bioactivos que fomentan la expansión, diferenciación, autoorganización de las células madre y/o el desarrollo de organoides,

preferiblemente donde el uno o más factores bioactivos son factores de matriz extracelular y/o proteínas de las principales vías de señalización,

más preferiblemente donde los factores bioactivos son proteoglicanos, polisacáridos no proteoglicanos o proteínas fibrosas,

más preferiblemente donde el uno o más factores bioactivos se proporcionan en la superficie de cada micropocillo, más preferiblemente donde el uno o más factores bioactivos son suministrados a la superficie de cada micropocillo por difusión desde uno o más microcanales en la superficie,

más preferiblemente donde el uno o más microcanales están situados dentro de la superficie en uno o ambos lados de cada micropocillo.

8. Matriz de organoides en una superficie que comprende un hidrogel de polímero sintético hidrófilo biofuncional, donde:

i) la matriz de organoides se ha cultivado in situ en la superficie a partir de una matriz de células madre o de una matriz de agregados multicelulares, donde cada agregado comprende al menos una célula madre, y donde los organoides están cubiertos por un recubrimiento que comprende un hidrogel,

ii) la matriz de organoides se encuentra dentro de un único plano focal,

iii) la superficie puede estar dividida por una teselación regular, de forma que los organoides se sitúen individualmente dentro de teselas adyacentes de la teselación.

9. Matriz de organoides de acuerdo con la reivindicación 8, donde los agregados multicelulares se forman in situ en la superficie a partir de una matriz de células madre o de una matriz de poblaciones homogéneas de células madre,

preferiblemente donde la densidad de organoides en la matriz es de al menos un organoide por cm2, preferiblemente de al menos 30 organoides por cm2, más preferiblemente de al menos 1 millón de organoides/cm2, más preferiblemente de 1,1 millones de organoides por cm2,

más preferiblemente donde el centro de masa de cada organoide de la matriz está a unos 100 μm o menos del centro de la tesela en la que está colocado,

más preferiblemente donde la distancia entre el centro de masa de organoides adyacentes de la matriz es de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 5000 μm, preferiblemente 2000 μm.

10. Matriz de organoides de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8-9, donde cada organoide de la matriz está situado en un pocillo de una placa de múltiples pocillos,

preferiblemente donde la placa es compatible con la manipulación de líquidos, la manipulación de líquidos automatizada, el cribado de alto rendimiento y/o el micropipeteo,

más preferiblemente donde los pocillos de la placa son de fondo plano.

11. Kit que comprende una matriz de organoides de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8-10 y medios adecuados para permitir el mantenimiento de los organoides.

12. Uso de cualquiera de los métodos de las reivindicaciones 1-7 para cribar moléculas y factores mecánicos para su efecto en el desarrollo y/o mantenimiento de organoides,

preferiblemente donde el cribado es de alto rendimiento,

más preferiblemente donde el uso comprende un ensayo de cribado para evaluar de manera cuantitativa el desarrollo de los organoides o perturbaciones de los mismos, comprendiendo:

ii. la aplicación de compuestos farmacológicos, biomoléculas o células, a la matriz de colonias de células madre, iii. el fomento del desarrollo de organoides mediante el suministro de señales instructivas para la autorrenovación, diferenciación y/o morfogénesis

iv. la monitorización del efecto de la sustancia farmacológica sobre el tamaño, la forma y la composición celular de los organoides,

v. el cambio de manera regular del medio sobre la matriz de organoides sin alterar la ubicación de los organoides para permitir periodos de crecimiento de entre 1 semana y varios meses

preferiblemente donde las perturbaciones se introducen localmente en el cultivo de microcavidades en la superficie de acuerdo con la reivindicación 7.

13. Uso de cualquiera de las matrices de organoides de las reivindicaciones 8-10 para cribar moléculas para su efecto en la biología de los organoides,

preferiblemente donde los organoides individuales de la matriz se exponen a diferentes moléculas o combinaciones de moléculas,

más preferiblemente donde el efecto de una molécula en la biología de los organoides se evalúa mediante imágenes de alto contenido de la matriz de organoides o mediante el aislamiento de los organoides individuales de la matriz, más preferiblemente donde los organoides comprenden células que expresan una molécula informadora fluorescente,

más preferiblemente donde el cribado es de alto rendimiento

más preferiblemente donde el uso comprende un ensayo de cribado, que comprende

i. el cultivo de una población de células madre en una matriz de organoides,

iii. la monitorización de un efecto de la sustancia sobre el tamaño del organoide, su forma, su composición celular y sus cambios fenotípicos,

iv. el análisis de los cambios fenotípicos mediante imágenes de campo amplio/campo claro

v. la monitorización de un efecto de la sustancia sobre las variaciones de los niveles de marcadores específicos de interés mediante formación de imágenes,

vii. opcionalmente, el análisis del nivel de los marcadores mediante expresión génica

viii. opcionalmente, el análisis del nivel de moléculas no informadoras mediante inmunofluorescencia ix. opcionalmente, el análisis de las ultraestructuras celulares mediante microscopía electrónica

x. opcionalmente, el análisis del nivel de marcador proteínico mediante proteómica.

14. Ensayo de cribado basado en organoides para medicina personalizada, comprendiendo el ensayo

i. generar IPSC a partir de una muestra de biopsia de tejido, preferiblemente donde se modifican las secuencias genéticas específicas en las IPSC, o cultivar células madre o células tumorales aisladas de la muestra de biopsia ii. cultivar las IPSC o células aisladas de acuerdo con cualquiera de los métodos de las reivindicaciones 1-7 para preparar una matriz de organoides,

iii. evaluar el efecto de los compuestos farmacológicos o las biomoléculas que se van a probar sobre el daño o la muerte celular, el restablecimiento de la integridad de la unión epitelial o la inflamación,

iv. definir el tratamiento adecuado para enfermedades específicas o tejido sano modelado fenotípicamente por la matriz de organoides.