ES2952996T3 - Polipéptido de fusión fluorescente capaz de detectar la fosforilación de receptores de membrana celular por GRK (cinasas receptoras de proteína G) y/o tirosina cinasas receptoras (RTK) - Google Patents
Polipéptido de fusión fluorescente capaz de detectar la fosforilación de receptores de membrana celular por GRK (cinasas receptoras de proteína G) y/o tirosina cinasas receptoras (RTK) Download PDFInfo
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Abstract
Los autores de la presente invención diseñaron un nuevo polipéptido de fusión fluorescente que comprende un péptido de localización en membrana, un péptido capaz de unirse a receptores de proteína G o de tirosina tras la fosforilación de estos receptores por GRK o RTK, un péptido de vesicularización y un péptido fluorescente. Este biosensor está formado por dos péptidos dirigidos a dos compartimentos celulares diferentes, permitiendo detectar la translocación de GRKs (G-protein receptor quinasas) y/o beta-arrestina o Receptores tirosina quinasas (RTKs) desde el citoplasma celular al citoplasma celular. membrana in vivo monitorizando la distribución del polipéptido fluorescente dentro del citoplasma celular. En este sentido, la translocación del biosensor dentro de la célula se debe a un cambio en su conformación 3D que oculta o expone las señales de localización en ambos extremos del polipéptido desencadenado por la unión del péptido capaz de unirse a los receptores de proteína G o de tirosina siguiendo fosforilación de estos receptores a la proteína G fosforilada o receptores de tirosina. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Polipéptido de fusión fluorescente capaz de detectar la fosforilación de receptores de membrana celular por GRK (cinasas receptoras de proteína G) y/o tirosina cinasas receptoras (RTK)
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo biotecnológico, particularmente a un polipéptido de fusión fluorescente, a un biosensor que comprende dicho polipéptido y a usos de los mismos.
Antecedentes de la invención
La transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia (BRET) es una técnica potente y cada vez más popular para estudiar las interacciones proteína-proteína en células vivas y en tiempo real. En particular, ha habido un interés considerable en la capacidad de monitorizar las interacciones entre los receptores acoplados a proteína G (GPCR) y las proteínas que sirven como reguladores clave de la función receptora, tales como la beta-arrestina. La metodología de BRET implica la coexpresión heteróloga de proteínas fusionadas genéticamente que unen una proteína de interés (por ejemplo, un GPCR) a una enzima donadora bioluminiscente y una segunda proteína de interés (por ejemplo, beta-arrestina) a un fluoróforo aceptor. Si las proteínas de fusión están muy próximas, la energía de resonancia se transferirá de la molécula donadora a la aceptora y la fluorescencia posterior del aceptor puede detectarse a una longitud de onda característica. Por tanto, tal fluorescencia es indicativa de las proteínas de interés unidas al donador y al aceptor que interactúan directamente o como parte de un complejo. Además de monitorizar las interacciones proteína-proteína para dilucidar la función celular, BRET también tiene el potencial de convertirse en una técnica importante para el cribado de alto rendimiento de células vivas para fármacos que seleccionan como diana los GPCR, utilizando interacciones inducidas por ligando con beta-arrestinas.
Sin embargo, estos tipos de biosensores dependen en gran medida de la distancia entre (por ejemplo, <10 nm para CFP/YFP) y la orientación relativa del fluoróforo donador y aceptor. Además, los biosensores basados en BREt o FRET en el contexto de métodos de cribado de alto contenido requieren de un equipo de detección de al menos cuatro filtros, dos para la excitación y dos para la emisión. Además, debido a la baja intensidad de la señal de detección, el intervalo de la señal de detección y la sensibilidad de cribado son bajos. Por último, el uso de más de una señal de emisión de fluorescencia requiere el uso de más algoritmos para analizar correctamente la señal final. Por tanto, todavía existe la necesidad de desarrollar métodos o productos mejorados para la medición en tiempo real de interacciones proteína-proteína en células vivas tales como las interacciones entre receptores acoplados a proteína G (GPCR) y proteínas que sirven como reguladores clave de la función receptora, tales como la betaarrestina.
Breve descripción de la invención
La presente invención se enfrenta al problema de proporcionar herramientas de localización precisa, alto intervalo dinámico y la menor perturbación posible de la fisiología celular que sean capaces de monitorizar una variación en la translocación de GRK (cinasas receptoras de proteína G) y/o beta-arrestina o tirosina cinasas receptoras (RTK) desde el citoplasma celular hasta la membrana citoplásmica celular in vivo mediante el uso de cribado de alto contenido (HCS) en sistemas basados en células, en las que estas herramientas no tienen las desventajas de los biosensores basados en FRET.
Para resolver el problema anterior, los autores de la presente invención diseñaron un nuevo polipéptido de fusión fluorescente que comprende un péptido de localización en la membrana, un péptido capaz de unir receptores de proteína G o tirosina tras la fosforilación de estos receptores por GRK o RTK, un péptido de vesicularización y un péptido fluorescente. Este biosensor está formado por dos péptidos dirigidos a dos compartimentos celulares diferentes, permitiendo la detección de la translocación de GRK (cinasas receptoras de proteína G) y/o betaarrestina o tirosina cinasas receptoras (RTK) desde el citoplasma celular hasta la membrana citoplásmica celular in vivo monitorizando la distribución del polipéptido fluorescente dentro del citoplasma celular. En este sentido, la translocación de biosensores dentro de la célula se deberá a un cambio en su conformación 3D que oculta o expone las señales de ubicación en ambos extremos del polipéptido desencadenadas por la unión del péptido capaz de unir receptores de proteína G o tirosina tras la fosforilación de estos receptores a los receptores de proteína G o tirosina fosforilados.
Breve descripción de las figuras
Los dibujos adjuntos, que se incorporan en y constituyen una parte de esta memoria descriptiva, ilustran diversas realizaciones y junto con la descripción ilustran las composiciones y los métodos dados a conocer.
Figura 1. Visión general del aumento en la fluorescencia de la línea celular “NK1-biosensor p-ARRNomad rojo”. (A) Control negativo. (B) Células estimuladas con sustancia P 1 |iM. (C) Curva dosis-respuesta.
Figura 2. Análisis de imágenes de la línea celular “NKI-biosensor p-ARRNomad rojo”. (A) Control negativo. (B) Células estimuladas con sustancia P 1 |iM. (C) Curva dosis-respuesta.
Figura 3. Ensayo de inhibición de la línea celular “NK1-biosensor p-ARRNomad rojo”. (A) Control negativo. (B) Células estimuladas con sustancia P 1 |iM. (C) Células inhibidas con L733,060. (C) Gráfico de inhibición.
Figura 4. Visión general del aumento en la fluorescencia de “receptor de EP4-biosensor ArrestinaNomad rojo” en la línea celular HEK293. (A) Control negativo. (B) Células estimuladas con PGE2 10 |iM. (C) Curva dosis-respuesta. CE50 de PGE2=8,64*10' 9 M; Z'= 0,67
Figura 5. Análisis de imágenes de “PAR2-biosensor Arres-Ca2+Nomad” múltiple de Ca2+-arrestina en la línea celular U2OS. (A) Visión general del aumento en la fluorescencia de biosensor Ca2+Nomad verde (panel izquierdo), biosensor ArrestinaNomad rojo (panel central) y fusión (panel derecho) (B) Curvas dosis-respuesta de cada uno de los biosensores con dos agonistas diferentes del receptor PAR2.
Figura 6. Cribado de una biblioteca de 490 compuestos usando la línea celular U2OS NK1R-ArrestinaNomad. Datos representativos del número de vesículas por célula normalizado con respecto al control. El control negativo (DMSO) se representa en blanco y el control positivo (sustancia P 10 |iM) en verde.
Figura 7. Compuestos positivos. Los compuestos que muestran un aumento en la activación de la ruta de la arrestina se representan en negro y el porcentaje de viabilidad celular se representa en blanco. El control positivo (sustancia P) se representa en puntos verdes y el control negativo (DMSO) se representa en blanco.
Figura 8. NomadKin. Localización en la membrana de biosensor NomadKin en la línea celular U2OS.
Figura 9. Ensayo de inmunofluorescencia con anticuerpo anti-Tac de “NTSR1-biosensor ArrestinaNomad”. El biosensor ArrestinaNomad está situado en la membrana plasmática en condiciones basales (panel superior), después de la adición del agonista (NTS, 1 |iM) puede observarse una relocalización del biosensor desde la membrana plasmática hasta las rutas de tráfico de vesículas (panel inferior).
Descripción detallada de la invención
A menos que se especifique de manera expresa lo contrario, el término “que comprende” se usa en el contexto del presente documento para indicar que pueden estar presentes opcionalmente elementos adicionales además de los elementos de la lista introducidos por “que comprende”. Sin embargo, se contempla como una realización específica de la presente invención que el término “que comprende” abarque la posibilidad de no que no estén presentes elementos adicionales, es decir, debe entenderse que, para el propósito de esta realización, “que comprende” tiene el significado de “que consiste en”.
Definiciones
En el contexto de la presente invención, el término “polipéptido de fusión” se refiere a un polipéptido híbrido que comprende una combinación de al menos cuatro péptidos de diferentes proteínas que se combinan en la misma estructura de polipéptido.
En el contexto de la presente invención, se entiende que el término “péptido de localización en la membrana” significa un péptido cuya localización intracelular natural está en la membrana plasmática.
Tal como se usa en el presente documento, se entiende que el término “péptido capaz de unir receptores de proteína G o tirosina tras la fosforilación de estos receptores por GRK o RTK” significa un dominio de péptido o proteína que tiene la capacidad de interactuar con los receptores de proteína G o tirosina sólo cuando estos están fosforilados. Un ejemplo claro de tal péptido es el péptido de unión a receptores fosforilados de b-arrestina de SEQ ID 2.
Cabe destacar que la secuencia de nucleótidos que codifica para el péptido de unión a receptores fosforilados de SEQ ID NO 2 es la siguiente:
Tal como se usa en el presente documento, se entiende que el término “péptido de vesicularización” significa una cadena peptídica corta que dirige el transporte del polipéptido a las vesículas de retención. Preferiblemente tal péptido de vesicularización es el péptido clatrina y beta-adaptina de arrestina. Más preferiblemente, la secuencia peptídica para el péptido clatrina y beta-adaptina de arrestina es la siguiente (a continuación en el presente documento SEQ ID NO 4):
Tyr Gly Arg Glu Asp Leu Asp Val Leu Gly Leu Ser Phe Arg Lys Asp Leu Gly Gly Leu lie Glu Phe
Gly Gly Gly Arg Leu Arg Leu Lys
Tal como se usa en el presente documento, se entiende que el término “péptido fluorescente” significa un péptido fluorescente que tiene capacidades fluorescentes. Los dominios de péptidos fluorescentes se caracterizan por tener
un espectro de excitación y un espectro de emisión específicos.
En el contexto de la presente invención, el ligador tiene al menos un residuo de aminoácido, preferiblemente al menos dos residuos de aminoácido consecutivos.
Tal como se usa en el presente documento, se entiende que el término “biosensor” significa una herramienta o entidad molecular que es sensible a, y puede responder a, un estímulo físico o químico y transmitir información sobre el estado celular.
Tal como se usa en el presente documento, se entiende que el término “fármaco” significa una molécula que actúa posiblemente como agonista o antagonista o modulador de una ruta de señalización.
Tal como se usa en el presente documento, se entiende que “línea celular estable” significa una línea celular que se ha transfectado o infectado con un fragmento extraño de ADN que se ha incorporado por sí mismo en el genoma de la célula.
Descripción
La presente invención se enfrenta al problema de proporcionar herramientas de localización precisa, alto intervalo dinámico y la menor perturbación posible de la fisiología celular que sean capaces de monitorizar una variación en la translocación de GRK (cinasas receptoras de proteína G) y/o beta-arrestina o tirosina cinasas receptoras (RTK) desde el citoplasma celular hasta la membrana citoplásmica celular in vivo mediante el uso de cribado de alto contenido (HCS) en sistemas basados en células, en las que estas herramientas no tienen las desventajas de los biosensores basados en FRET.
Para resolver el problema anterior, los autores de la presente invención diseñaron un nuevo polipéptido de fusión fluorescente que comprende un péptido de localización en la membrana, un péptido capaz de unir receptores de proteína G o tirosina tras la fosforilación de estos receptores por GRK o RTK, un péptido de vesicularización y un péptido fluorescente. Este biosensor está formado por dos péptidos dirigidos a dos compartimentos celulares diferentes, permitiendo la detección de la translocación de GRK (cinasas receptoras de proteína G) y/o betaarrestina o tirosina cinasas receptoras (RTK) desde el citoplasma celular hasta la membrana citoplásmica celular in vivo monitorizando la distribución del polipéptido fluorescente dentro del citoplasma celular. En este sentido, la translocación de biosensores dentro de la célula se deberá a un cambio en su conformación 3D que oculta o expone las señales de ubicación en ambos extremos del polipéptido desencadenadas por la unión del péptido capaz de unir receptores de proteína G o tirosina tras la fosforilación de estos receptores a los receptores de proteína G o tirosina fosforilados.
En el estado basal, el biosensor está situado en uno de los compartimentos; esto significa que el péptido de localización dirigido al otro compartimento celular se oculta por la conformación 3D. Cuando existe una translocación de GRK (cinasas receptoras de proteína G) y/o beta-arrestina o tirosina cinasas receptoras (RTK) desde el citoplasma celular hasta la membrana citoplásmica celular debido a una estimulación celular, el péptido capaz de unir receptores de proteína G o tirosina tras la fosforilación de estos receptores se une a los receptores de proteína G o tirosina fosforilados provocando un cambio conformacional en el biosensor. En este punto, se modifica la distribución espacial de los diferentes elementos estructurales en el biosensor y el péptido de vesicularización dirigido al otro compartimento celular se expone por la nueva conformación 3D de modo que todo el biosensor se transporta a su nueva ubicación en el nuevo compartimento celular. Todo este procedimiento puede trazarse en células vivas debido a la presencia de la proteína fluorescente en el biosensor.
Se observa además que los autores de la presente invención se dieron cuenta de que el orden de los péptidos dentro del polipéptido de fusión fluorescente mencionado anteriormente no podían colocarse de manera arbitraria dentro del polipéptido. Este es el caso puesto que después de numerosos experimentos los autores concluyeron que sólo una combinación de elementos proporcionaba el efecto técnico de transportar el biosensor al otro compartimento celular, tal combinación era:
a. el péptido de localización en la membrana está situado en el extremo N-terminal del polipéptido de fusión fluorescente y está unido físicamente, opcionalmente a través de un ligador, al péptido fluorescente, que a su vez está unido físicamente, opcionalmente a través de un ligador, al péptido capaz de unir receptores de proteína G o tirosina tras la fosforilación de estos receptores por GRK o RTK; y
b. el péptido capaz de unir receptores de proteína G o tirosina tras la fosforilación de estos receptores por GRK o RTK está unido físicamente, opcionalmente a través de un ligador, al péptido de vesicularización, que a su vez está situado en el extremo C-terminal del polipéptido de fusión fluorescente;
Los autores sometieron a prueba si tal biosensor que tiene la estructura anterior podría emplearse para detectar y cuantificar la translocación de beta-arrestina provocada por la sustancia P. Tal como se ilustra en los ejemplos divulgados en el presente documento, los autores de la presente invención construyeron un polipéptido de fusión
fluorescente, capaz de detectar y cuantificar beta-arrestina con éxito, que comprende el péptido de unión a receptores fosforilados de b-arrestina de SEQ ID 2. Sorprendentemente, los autores identificaron que usando como péptido de vesicularización el péptido clatrina y beta-adaptina de arrestina, la señal de detección era significativamente mejor.
Los resultados mostrados en los ejemplos y dibujos presentados en el presente documento mediante el uso del polipéptido de fusión anterior indican que un aumento en la translocación de beta-arrestina indujo un cambio conformacional en el biosensor que fomentó una redistribución del biosensor fluorescente. La actividad se calculó como un aumento de la granularidad de las células transfectadas con los biosensores de la invención. La redistribución de fluorescencia del biosensor se detectó mediante fluorescencia usando algoritmos de análisis de imágenes. Por consiguiente, las variaciones en la ubicación de la beta arrestina pueden monitorizarse a través de este procedimiento de “ocultación y exposición” de señales de ubicación y la localización final del biosensor.
Por tanto, un primer aspecto de la presente invención se refiere a un polipéptido de fusión fluorescente capaz de cambiar su localización dentro de la célula desde la membrana citoplásmica celular hasta las vesículas de retención, tras un aumento en la translocación de GRK (cinasas receptoras de proteína G) y/o beta-arrestina o tirosina cinasas receptoras (RTK) desde el citoplasma celular hasta la membrana citoplásmica celular, que comprende un péptido de localización en la membrana, un péptido capaz de unir receptores de proteína G o tirosina tras la fosforilación de estos receptores por GRK o RTK, un péptido de vesicularización y un péptido fluorescente, en el que:
a. el péptido de localización en la membrana está situado en el extremo N-terminal del polipéptido de fusión fluorescente y está unido físicamente, opcionalmente a través de un ligador, al péptido fluorescente, que a su vez está unido físicamente, opcionalmente a través de un ligador, al péptido capaz de unir receptores de proteína G o tirosina tras la fosforilación de estos receptores por GRK o RTK; y
b. el péptido capaz de unir receptores de proteína G o tirosina tras la fosforilación de estos receptores por GRK o RTK está unido físicamente, opcionalmente a través de un ligador, al péptido de vesicularización, que a su vez está situado en el extremo C-terminal del polipéptido de fusión fluorescente;
y en el que se entiende que el término “péptido de localización en la membrana” significa un péptido cuya localización intracelular natural está en la membrana plasmática.
Preferiblemente, tal polipéptido de fusión fluorescente es capaz de cambiar su localización dentro de la célula desde la membrana citoplásmica celular hasta las vesículas de retención, tras un aumento en la translocación de GRK (cinasas receptoras de proteína G) y beta-arrestina desde el citoplasma celular hasta la membrana citoplásmica celular.
Más preferiblemente el polipéptido de fusión fluorescente del primer aspecto de la invención se caracteriza porque: a. el péptido de localización en la membrana es el dominio extracelular del receptor de interleucina-2 de SEQ ID 3 o una variante que es al menos el 90 % homóloga a esta secuencia en toda la región basándose en la identidad de aminoácidos; y
b. el péptido de vesicularización es el péptido clatrina y beta-adaptina de arrestina.
La SEQ ID No 3 de aminoácidos es la siguiente:
Más preferiblemente el polipéptido de fusión fluorescente del primer aspecto de la invención se caracteriza porque: a. el péptido de localización en la membrana es el dominio extracelular del receptor de interleucina-2 de SEQ ID 3; y b. el péptido de vesicularización es el péptido clatrina y beta-adaptina de arrestina, preferiblemente de SEQ ID No 4. Más preferiblemente el polipéptido de fusión fluorescente del primer aspecto de la invención se caracteriza porque: a. el péptido de localización en la membrana es el dominio extracelular del receptor de interleucina-2 de SEQ ID 3; b. el péptido de vesicularización es el péptido clatrina o beta-adaptina de arrestina, preferiblemente de SEQ ID No 4; y
c. el péptido capaz de unir receptores de proteína G tras la fosforilación de estos receptores por GRK es el péptido
de unión a receptores fosforados de b-arrestina de SEQ ID 2.
En aún otra realización preferida del primer aspecto de la invención, tal polipéptido es capaz de cambiar su localización dentro de la célula desde la membrana citoplásmica celular hasta las vesículas de retención, tras un aumento en la translocación de tirosina cinasas receptoras (RTK) desde el citoplasma celular hasta la membrana citoplásmica celular.
Más preferiblemente el polipéptido de fusión fluorescente de la realización preferida mencionada anteriormente de la invención (el biosensor capaz de detectar un aumento en la translocación de tirosina cinasas receptoras (RTK) desde el citoplasma celular hasta la membrana citoplásmica celular) se caracteriza porque:
a. el péptido de localización en la membrana es el dominio extracelular del receptor de interleucina-2 de SEQ ID 3 o una variante que es al menos el 90 % homóloga a esta secuencia en toda la región basándose en la identidad de aminoácidos; y
b. el péptido de vesicularización es el péptido clatrina y beta-adaptina de arrestina.
Más preferiblemente el polipéptido de fusión fluorescente de la realización preferida mencionada anteriormente de la invención (el biosensor capaz de detectar un aumento en la translocación de tirosina cinasas receptoras (RTK) desde el citoplasma celular hasta la membrana citoplásmica celular) se caracteriza porque:
a. el péptido de localización en la membrana es el dominio extracelular del receptor de interleucina-2 de SEQ ID 3; y b. el péptido de vesicularización es el péptido clatrina y beta-adaptina de arrestina, preferiblemente de SEQ ID No 4. Más preferiblemente el polipéptido de fusión fluorescente de la realización preferida mencionada anteriormente de la invención (el biosensor capaz de detectar un aumento en la translocación de tirosina cinasas receptoras (RTK) desde el citoplasma celular hasta la membrana citoplásmica celular) se caracteriza porque:
a. el péptido de localización en la membrana es el dominio extracelular del receptor de interleucina-2 de SEQ ID 3; b. el péptido de vesicularización es el péptido clatrina y beta-adaptina de arrestina, preferiblemente de SEQ ID No 4; y
c. el péptido capaz de unir los receptores de proteína tirosina tras la fosforilación de estos receptores por RTK es un péptido capaz de reconocer la proteína tirosina receptora fosforilada.
Se observa que tal péptido capaz de reconocer la proteína tirosina receptora fosforilada puede comprender un dominio SH2 y/o un dominio diseñado in silico, siendo cualquiera de estos capaz de reconocer receptores de tirosina cinasa fosforilados. El experto en la técnica conoce bien tales dominios.
En otra realización preferida del primer aspecto de la invención, el polipéptido de fusión fluorescente puede seleccionarse de cualquiera de la siguiente lista de compuestos que consiste en GFP, YFP, turboGFP, turboRFP, turboRFP602 y turboFP650.
Un segundo aspecto de la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de polinucleótido que codifica para un polipéptido tal como se define en cualquiera de los aspectos anteriores de la invención.
Un tercer aspecto de la invención se refiere a un biosensor que comprende el polipéptido de fusión tal como se define en el primer aspecto de la invención.
Un cuarto aspecto de la invención se refiere a una célula que comprende el polipéptido de fusión fluorescente tal como se define en el primer aspecto de la invención, en el que preferiblemente dicha célula es una línea celular U2OS (véanse los ejemplos).
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a varios usos para el polipéptido de fusión fluorescente tal como se define en el primer aspecto de la invención. Un primer uso del biosensor según la presente invención es para detectar y cuantificar compuestos capaces de la translocación de GRK (cinasas receptoras de proteína G) y/o beta-arrestina o tirosina cinasas receptoras (RTK) desde el citoplasma celular hasta la membrana citoplásmica celular incluyendo, pero sin limitarse a, la sustancia P. Tal como ya se ha indicado, la unión del péptido capaz de unir receptores de proteína G o tirosina tras la fosforilación de estos receptores se une a los receptores de proteína G o tirosina fosforilados, lo que da como resultado un cambio sustancial en la conformación espacial que conduce a un cambio en la localización de fluorescencia intracelular. Esta translocación de fluorescencia puede aprovecharse para la cuantificación de compuestos mediante fluorescencia. Además, todo este procedimiento puede trazarse en células vivas debido a la presencia de la proteína fluorescente en el biosensor.
El empleo del polipéptido de fusión fluorescente tal como se define en el primer aspecto de la invención implica además su uso como herramienta de cribado de fármacos.
Además, el polipéptido de fusión fluorescente tal como se define en el primer aspecto de la invención es útil en la práctica de esencialmente cualquier aplicación para la que se obtiene la lectura de la transducción del segundo mensajero. Tales aplicaciones se conocen bien en la técnica. Sin embargo, más aplicaciones a modo de ejemplo de la presente invención incluyen, pero no se limitan a:
a. Identificar compuestos de prueba que actúan como agonistas, antagonistas, agonistas inversos o ligandos naturales de receptor de superficie celular seleccionados de factores de crecimiento, citocinas, receptores acoplados a proteína G, integrinas y canales de iones de calcio estudiando el movimiento del segundo mensajero usando dispositivos de microscopía de fluorescencia. En una realización preferida, dicho receptor de superficie celular es un receptor acoplado a proteína G (GPCR).
b. Clonar la expresión de agonista, antagonista y agonista inverso peptídico de los receptores.
c. Clonar la expresión de los moduladores que cambian la presencia intracelular del segundo mensajero.
d. Establecer curvas dosis-respuesta de moduladores de moléculas de la membrana.
e. Determinar alteraciones en moduladores y moléculas de la membrana implicados en una enfermedad o un trastorno cuya cascada de señalización depende de estos segundos mensajeros y de ese modo el biosensor puede usarse como herramienta de diagnóstico.
En una realización preferida de la invención, el polipéptido de fusión fluorescente tal como se define en el primer aspecto de la invención puede usarse para generar líneas celulares estables que permiten estudiar los receptores acoplados a proteína G (GPCR), y la actividad de otras proteínas en células vivas. La translocación rápida del biosensor de la invención permite la cuantificación de GPCR y la estimulación de canales de iones.
El polipéptido de fusión fluorescente y el biosensor correspondiente de la presente invención pueden fabricarse mediante técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica, pero a modo de ejemplo, pueden construirse de la siguiente manera. Las secuencias codificantes correspondientes al péptido de localización en la membrana, el péptido fluorescente, el péptido capaz unir receptores de proteína G o tirosina tras la fosforilación de estos receptores por GRK o RTK y el péptido de vesicularización pueden amplificarse fácilmente mediante PCR y clonarse en un plásmido lanzadera. Luego, estas secuencias codificantes pueden clonarse fácilmente en el plásmido de fusión final en el orden específico presentado en el presente documento usando los sitios de enzimas de restricción que flanquean cada secuencia.
Los siguientes ejemplos sirven simplemente para ilustrar la presente invención.
Ejemplos
Ejemplo 1. Materiales y métodos
Cultivo celular de células U2OS
Se hizo crecer una línea celular de osteosarcoma óseo humano (DSMZ), derivada de ATCC (n.° de catálogo HTB-96), en mezcla de nutrientes con medio de Eagle modificado por Dulbecco F-12 HAM (Sigma-Aldrich) complementada con suero bovino fetal al 10 % (Sigma-Aldrich), aminoácidos no esenciales MEM (Sigma-Aldrich), gentamicina (Sigma-Aldrich), geneticina 500 |ig/ml (Sigma-Aldrich) y puromicina 10 |ig/ml (Sigma) a 37 °C en una atmósfera humidificada complementada con el 5 % de CO2.
Generación de línea celular estable recombinante
Se creó un plásmido de biosensor p-ARRNomad rojo clonando posteriormente el ADNc de Tac, ADNc de proteína turboFP602 (Evrogen), péptido de unión a receptores fosforilados de b-arrestina y el péptido de vesicularización (péptido clatrina y beta-adaptina de arrestina) en el vector CMV-ptNL resistente a la geneticina en el laboratorio de los presentes inventores. Se subclonó ADNc del receptor receptor de taquiquinina 1 (NK1) (cDNA.org) en un vector resistente a la puromicina, CMV-pPuro, diseñado en el laboratorio de los presentes inventores usando las enzimas de restricción Nhel y Xhol.
Se confirmaron todas las clonaciones mediante secuenciación de ADN. Se transfectó el plásmido que contenía biosensor p-ARRNomad rojo en células U2OS usando Lipofectamine LTX (Invitrogen) y se seleccionaron células transfectadas positivas usando geneticina 500 |ig/ml (Sigma-Aldrich), se transfectó el clon positivo denominado C1 con el plásmido resistente a la puromicina que contenía receptor de taquiquinina 1 (NK1-pPuro) y se seleccionaron
los clones positivos usando puromicina 10 |ig/ml (Sigma-Aldrich) y geneticina 500 |ig/ml (Sigma-Aldrich). Se obtuvieron clones resistentes mediante dilución límite. Luego se sometió a prueba una línea celular estable doble, denominada “línea celular NK1-biosensor p-ARRNomad rojo” usando sustancia P (Sigma-Aldrich) para determinar la respuesta funcional del biosensor p-ARRNomad rojo.
Desarrollo de los ensayos
Se sembraron células a 18.000 células/placa en placas de obtención de imágenes negras de 96 pocillos de fondo transparente (BD Biosciences) para ensayos de p-arrestina. Se trató una línea celular “NK1-biosensor p-ARRNomad rojo” con dilución 8 log (n=6) de sustancia P (Sigma-Aldrich) que oscilaba desde 0 hasta 1 |iM en medio Opti-MEM (Gibco) durante 24 horas a 37 °C, el 5 % de CO2, el 95 % de humedad relativa antes de la adquisición de datos. Ensayo de intensidad de fluorescencia
Para las determinaciones de intensidad de fluorescencia, se midieron los cambios en la distribución del biosensor p-ARRNomad rojo usando el lector de microplacas “Synergy 2” (Biotek). Se retiró el medio Opti-MEM con los agonistas y se reemplazó por PBS 1X sin calcio ni magnesio (Sigma-Aldrich) antes de la adquisición de datos. Se adquirieron datos de turboFp602 con filtros de ex./em. 590/620.
Ensayo de obtención de imágenes
Se desarrolló la rutina de análisis de imágenes de la redistribución de biosensor p-ARRNomad rojo con una plataforma de imágenes automatizada de alto contenido BD Pathway 855 (BD Biosciences) usando algoritmos de análisis de imágenes con el software de obtención de imágenes biológicas Attovision (BD). Los filtros de excitación/emisión de rodamina usados para la adquisición de imágenes fueron 548/20 y 570LP. Se normalizó el número de vesículas del biosensor Nomad calculado como porcentaje de actividad en comparación con el control negativo (vehículo H2O).
Ensayo de inhibición
Se sembraron células a 18.000 células/placa en placas de 96 pocillos para el ensayo de inhibición. Se trató conjuntamente la línea celular “NK1-biosensor p-ARRNomad rojo” con sustancia P 100 nM (Sigma-Aldrich) y dilución log de clorhidrato de L733,060 (Tocris) que oscilaba desde 100 μM hasta 3 |iM en medio Opti-MEM (Gibco) durante 24 horas a 37 °C, el 5 % de CO2 , el 95 % de humedad relativa antes de la adquisición de datos.
Determinación de señal con respecto a fondo y factor Z'
Se calculó el parámetro de señal con respecto a fondo (S/B) como |ic+-|ic-, y se calculó el factor Z' usando la siguiente fórmula: Z'= 1-[(3ac++3ac-)/(|ic+-|ic-)].
Ejemplo 1. Resultados
La línea celular “NK1-biosensor p-ARRNomad rojo” que expresa de manera estable biosensor p-ARRNomad rojo y receptor de neuroquinina 1 se ha diseñado para someter a ensayo compuestos o analizar su capacidad para modular el receptor NK1. Antes de la estimulación mediada por el agonista de interés, se localiza el biosensor fluorescente en la membrana celular, la unión de sustancia P al receptor de neuroquinina 1 conduce a un cambio en el plegamiento estructural de biosensor p-ARRNomad rojo que fomenta su reubicación celular en el tráfico vesicular de las células.
Ensayo de intensidad de fluorescencia
Se detectó el aumento en la fluorescencia y se analizó usando un lector de microplacas “Synergy 2” de Biotek. La CE50 para la sustancia P era de aproximadamente 5,20*10' 9 M después de un tratamiento de 24 h con el agonista. Se validó el ensayo con un promedio de Z'= 0,70+/-0,02 (n=6).
Ensayo de obtención de imágenes
Se detectaron los procedimientos de activación y cambio de localización del biosensor p-ARRNomad rojo y se analizaron usando el dispositivo de obtención de imágenes biológicas de alto contenido “BD Pathway 855” de BD Biosciences. La CE50 para la sustancia P fue de aproximadamente 2,99*10' 9 M después de un tratamiento de 24 h con el agonista. Se validó el ensayo con un promedio de Z'= 0,79+/-0,02 (n=6).
Ensayo de inhibición
Se trató conjuntamente la línea celular “NK1-biosensor p-ARRNomad rojo” con sustancia P 100 nM y
concentraciones crecientes de L733,060 (inhibidor de NKR1) durante 24 h. Después del tratamiento, se tiñeron los núcleos con DAPI y se detectó la inhibición del receptor NK1 analizando el cambio de localización del biosensor p-ARRNomad rojo usando un dispositivo de obtención de imágenes biológicas de alto contenido “BD Pathway 855” de BD Biosciences. La CI50 para L733,060 era de aproximadamente1,84x10-7 M después de un tratamiento de 24 h con el agonista. Se validó el ensayo con un promedio de Z'= 0,66+/-0,02.
Ejemplo 2: “Receptor de EP4-biosensor ArrestinaNomad rojo” en la línea celular HEK293
Ejemplo 2. Resultados
Una línea celular HEK293 con “receptor de EP4-biosensor ArrestinaNomad rojo” que expresa de manera transitoria biosensor ArrestinaNomad rojo y receptor de prostaglandina E 4 se ha diseñado para someter a ensayo compuestos o analizar su capacidad para modular el receptor de EP4. Antes de la estimulación mediada por el agonista de interés, el biosensor fluorescente se localiza en la membrana celular, la unión de PGE2 al receptor de EP4 conduce a un cambio en el plegamiento estructural del biosensor ArrestinaNomad que fomenta su relocalización celular en el tráfico vesicular de las células. La CE50 para PGE2 fue de 8,64*10‘9 M después de un tratamiento de 24 h con el agonista. Se validó el ensayo con un promedio de Z'= 0,67+/-0,04 (n=6).
Ejemplo 2. Materiales y métodos
Cultivo celular de células HEK293
Se hicieron crecer células HEK293 derivadas de ATCC (n.° de catálogo CRL-1573), en medio de Eagle modificado por Dulbecco con alto contenido de glucosa (Sigma-Aldrich) complementado con suero bovino fetal al 10 % (Sigma-Aldrich), aminoácidos no esenciales MEM (Sigma-Aldrich) y gentamicina (Sigma-Aldrich) a 37 °C en una atmósfera humidificada complementada con el 5 % de CO2.
Generación de línea celular transfectada de manera transitoria
Se creó un plásmido de biosensor ArrestinaNomad rojo clonando posteriormente el ADNc de Tac, ADNc de proteína turboFP602 (Evrogen), péptido de unión a receptores fosforilados de b-arrestina y el péptido de vesicularización (péptido clatrina y beta-adaptina de arrestina) en el vector CMV-ptNL resistente a la geneticina en el laboratorio de los presentes inventores. Se subclonó ADNc del receptor receptor de EP4 (EP4) (cDNA.org) en un vector resistente a la puromicina, CMV-pPuro, diseñado en el laboratorio de los presentes inventores usando las enzimas de restricción Nhel y Xhol.
Se realizó la transfección transitoria usando el método de fosfato de calcio y luego se sometió a prueba la línea celular transfectada de manera transitoria, denominada “línea celular EP4-biosensor ArrestinaNomad rojo” usando PGE2 (Sigma-Aldrich) para determinar la respuesta funcional del biosensor ArrestinaNomad rojo.
Desarrollo de los ensayos
Se sembraron células a 20.000 células/placa en placas de obtención de imágenes negras de 96 pocillos de fondo transparente (BD Biosciences) para los ensayos de p-arrestina. Se trató la línea celular “EP4-biosensor ArrestinaNomad rojo” con una dilución 8 log (n=6) de PGE2 (Sigma-Aldrich) que oscilaba desde 0 hasta 10 |iM en medio Opti-MEM (Gibco) durante 24 horas a 37 °C, el 5 % de CO2, el 95 % de humedad relativa antes de la adquisición de datos. Se adquirieron imágenes de fluorescencia en la plataforma de imágenes automatizada de alto contenido BD Pathway 855 con un objetivo seco x20.
Ensayo de intensidad de fluorescencia
Para las determinaciones de intensidad de fluorescencia, se midieron los cambios en la distribución de biosensor p-ARRNomad rojo usando un lector de microplacas “Synergy 2” (Biotek). Se retiró el medio Opti-MEM con los agonistas y se reemplazó por PBS 1X sin calcio ni magnesio (Sigma-Aldrich) antes de la adquisición de datos. Se adquirieron datos de turboFP602 con filtros de ex./em. 590/620.
Determinación de señal con respecto a fondo y factor Z’
Se calculó el parámetro de señal con respecto a fondo (S/B) como |ic+-|ic-, y se calculó el factor Z’ usando la siguiente fórmula: Z’= 1-[(3ac++3ac-) /(^ +-H-c-)]
Ejemplo 3: “PAR2-biosensor Arres-Ca2+Nomad” múltiple de Ca2+-arrestina en la línea celular U2OS
Ejemplo 3. Resultados
Un “PAR2-biosensor Arres-ca2+Nomad” múltiple de Ca2+-arrestina en la línea celular U2OS que expresa de manera estable biosensor Ca2+Nomad verde, biosensor ArrestinaNomad rojo y receptor de tripsina similar a F2R 1 se ha diseñado para someter a ensayo compuestos o analizar su capacidad para modular PAR2. Antes de la estimulación mediada por los agonistas de interés, el biosensor fluorescente se localiza en la membrana celular, la unión de SLIGKV o SLIGRL-NH2 a PAR2 conduce a un cambio en el plegamiento estructural de ambos biosensores Nomad que fomenta su relocalización celular en el tráfico vesicular de las células.
Se detectó el aumento en la fluorescencia y se analizó usando el lector de microplacas “Synergy 2” de Biotek. Se midió la CE50 para los agonistas después de un tratamiento de 24 h. Se validó el ensayo con Z'>0,6 para cada agonista.
Ejemplo 3. Materiales y métodos
Cultivo celular de células U2OS
Se hizo crecer una línea celular de osteosarcoma óseo humano (DSMZ), derivada de ATCC (n.° de catálogo HTB-96), en mezcla de nutrientes con medio de Eagle modificado por Dulbecco F-12 HAM (Sigma-Aldrich) complementada con suero bovino fetal al 10 % (Sigma-Aldrich), aminoácidos no esenciales MEM (Sigma-Aldrich), gentamicina (Sigma-Aldrich) a 37 °C en una atmósfera humidificada complementada con el 5 % de CO2.
Generación de línea celular estable recombinante
Se transfectó el plásmido que codifica para el biosensor Ca2+Nomad verde en células U2OS usando Lipofectamine LTX (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Se obtuvieron clones resistentes mediante dilución límite, y se seleccionaron células transfectadas positivamente usando puromicina 10 μg/ml (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Una vez que esta línea celular estable estaba lista, se transfectó un clon positivo con el plásmido que codifica para el biosensor ArrestinaNomad rojo, y se seleccionaron los clones positivos mediante dilución límite usando puromicina 10 μg/ml (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) y geneticina 500 μg/ml (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Se transfectó posteriormente la línea celular que expresa conjuntamente ambos biosensores, denominada línea celular Arres-Ca2+Nomad, con la construcción PAR2-CMV-pHygro, y se obtuvieron clones resistentes mediante dilución límite y se seleccionaron usando geneticina 500 μg/ml (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), puromicina 10 μg/ml (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) e higromicina B 100 μg/ml (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Estas células expresaron de manera constitutiva biosensor Ca2+Nomad verde, biosensor ArrestinaNomad rojo y el receptor de tripsina similar a F2R 1, y esta triple línea celular estable se denominó “línea celular PAR2-Arres-Ca2+Nomad”.
Desarrollo de los ensayos
Se sembraron células a 20.000 células/placa en placas de obtención de imágenes negras de 96 pocillos de fondo transparente (BD Biosciences) para los ensayos de Ca2+ y arrestina. Se trató la línea celular “PAR2-Arres-Ca2+Nomad” con una dilución 10 log (n=6) de SLIGKV (Sigma-Aldrich) o SLIGRL-NH2 (Sigma-Aldrich) que oscilaba desde 0 hasta 300 μM en medio Opti-MEM (Gibco) durante 24 horas a 37 °C, el 5 % de CO2, el 95 % de humedad relativa antes de la adquisición de datos. Se adquirieron imágenes de fluorescencia en la plataforma de imágenes automatizada de alto contenido BD Pathway 855 con un objetivo seco x20.
Ensayo de intensidad de fluorescencia
Para las determinaciones de intensidad de fluorescencia, se midieron los cambios en la distribución de biosensor p-ARRNomad rojo usando un lector de microplacas “Synergy 2” (Biotek). Se retiró el medio Opti-MEM con los agonistas y se reemplazó por PBS 1X sin calcio ni magnesio (Sigma-Aldrich) antes de la adquisición de datos. Se adquirieron los datos de turboFP650 con filtros de ex./em. 590/650 y se capturaron las lecturas de turboGFP con filtros de ex./em. 485/585.
Determinación de señal con respecto a fondo y factor Z’
Se calculó el parámetro de señal con respecto a fondo (S/B) como pc+-pc-, y se calculó el factor Z' usando la siguiente fórmula: : Z'= 1-[(3ac++3ac-)/(pc+-pc-)]
Ejemplo 4: Cribado de alto contenido de Prestwick Chemical Library en la línea celular U2OS NK1R-Arrest¡naNomad. Ejemplo 4. Resultados
Se obtuvo una biblioteca química que comprendía 490 compuestos de Prestwick Chemical Library® , y basándose en la diversidad química y farmacológica de los compuestos y su biodisponibilidad y seguridad para los humanos, se usaron estos compuestos para el ensayo de cribado. El compuesto de referencia era la sustancia P. Se disolvieron todos los compuestos de la biblioteca en dimetilsulfóxido (DMSO) a 5 mM y el compuesto de referencia en agua a 1 mM. Se trataron las células U2OS NK1R-ArrestinaNomad con sustancia P (control positivo) a 10 |iM, mientras que los compuestos de la biblioteca se sometieron a prueba a 10 |iM durante 24 horas en medio Opti-MEM antes de la adquisición de imágenes.
Ejemplo 4. Materiales y métodos
Adquisición y análisis de imágenes: después de 24 h de tratamiento, se fijaron las células con solución salina tamponada con fosfato complementada con formaldehído al 3,7 % durante 10 min a temperatura ambiente (TA) y se permeabilizaron con Triton-X100 al 0,3 % en PBS durante 3 min a TA. Luego se tiñeron los núcleos de las células con DAPI durante 5 min a TA. Se adquirieron imágenes de fluorescencia en la plataforma de imágenes automatizada de alto contenido BD Pathway 855 con un objetivo seco x20. Se procesaron los cambios en los patrones de fluorescencia del biosensor ArrestinaNomad y se cuantificaron usando algoritmos de análisis de imágenes con el software de obtención de imágenes biológicas Attovision en subcampos de 3x3 de cada pocillo (500-1.000 células analizadas por pocillo). Los filtros de excitación y emisión usados fueron los siguientes: para DAPI, 380/10 y 540/20, y para rodamina, 548/20 y 570LP. Se midió la actividad de arrestina contando los gránulos rojos fluorescentes y normalizando el resultado con respecto al número de células. Se normalizaron los datos como porcentajes de actividad en comparación con el control positivo (sustancia P) después de restar el valor del control de vehículo. Se determinó la viabilidad celular contando los núcleos (DAPI). Para cada una de las condiciones, se usaron 5 réplicas. Se procesaron los datos usando Excel y se representaron gráficamente en SigmaPlot 11.0.
Ejemplo 5. Desarrollo de línea celular estable U2OS NomadKin
Ejemplo 5: Resultados y materiales y métodos
Generación de línea celular estable recombinante
Se transfectó el plásmido que codifica para el biosensor KinNomad en células U2OS usando Lipofectamine LTX (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Ma ). Se obtuvieron clones resistentes mediante dilución límite, y se seleccionaron células transfectadas positivamente usando geneticina 500 |ig/ml (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Estas células expresaron de manera constitutiva el biosensor KinNomad verde.
Se adquirieron imágenes de fluorescencia en la plataforma de imágenes automatizada de alto contenido BD Pathway 855 con un objetivo seco x20.
Ejemplo 6. Ensayo de inmunofluorescencia con anticuerpo anti-TAC de biosensor “NTSR1-Arres-ca2+Nomad de múltiple de Ca2+-arrestina”
Ejemplo 6. Resultados
Se realizó un ensayo de inmunofluorescencia con anticuerpo anti-TAC para trazar la localización de biosensor ArrestinaNomad. La localización en la membrana del biosensor observado en el control (paneles superiores) se difumina en las células activadas (paneles inferiores) con el agonista. El biosensor se relocaliza desde la membrana plasmática hasta las vesículas citosólicas.
Ejemplo 6. Materiales y métodos
Se sembraron células a 12.000 células/placa en placas de obtención de imágenes negras de 96 pocillos de fondo transparente (BD Biosciences). Se trató la línea celular “NTSR1-ArrestinaNomad” con 1 |iM de NTS (Sigma-Aldrich) en medio Opti-MEM (Gibco) durante 24 horas a 37 °C, el 5 % de CO2, el 95 % de humedad relativa.
Después de la incubación durante la noche, se retiró el medio celular y se realizó una incubación de 15 minutos con FBS (Sigma-Aldrich) a 4 °C. Seguido de una incubación de 90 minutos a 4 °C con anticuerpo anti-CD25 humana marcado con FITC (Biolegend) a una concentración 1:20. Luego se lavaron las células dos veces con PBS (Sigma-Aldrich). Se adquirieron imágenes de fluorescencia en la plataforma de imágenes automatizada de alto contenido BD Pathway 855 (Franklin Lakes, NJ) con un objetivo seco x20. Los filtros de excitación y emisión usados fueron los siguientes: para FITC, 488/10 y 540/20; y para FP650, 548/20 y 570LP.
Claims (9)
1. Polipéptido de fusión fluorescente capaz de cambiar su localización e intensidad de fluorescencia dentro de la célula desde la membrana citoplásmica celular hasta las vesículas de retención, tras un aumento en la translocación de beta-arrestina desde el citoplasma celular hasta la membrana citoplásmica celular, que comprende un péptido de localización en la membrana que consiste en el dominio extracelular del receptor de interleucina-2 de SEQ ID 3 o una variante que es al menos el 90 % homóloga a esta secuencia en toda la región basándose en la identidad de aminoácidos; un péptido capaz de unir receptores de proteína G o tirosina tras la fosforilación de estos receptores por GRK o RTK que consiste en el péptido de unión a receptores fosforilados de b-arrestina de SEQ ID 2; un péptido de vesicularización que consiste en el péptido clatrina y beta-adaptina de arrestina; y un péptido fluorescente, en el que:
a. el péptido de localización en la membrana está situado en el extremo N-terminal del polipéptido de fusión fluorescente y está unido físicamente, opcionalmente a través de un ligador, al péptido fluorescente, que a su vez está unido físicamente, opcionalmente a través de un ligador, al péptido capaz de unir receptores de proteína G o tirosina tras la fosforilación de estos receptores por GRK o rTK; y
b. el péptido capaz de unir receptores de proteína G o tirosina tras la fosforilación de estos receptores por GRK o RTK está unido físicamente, opcionalmente a través de un ligador, al péptido de vesicularización, que a su vez está situado en el extremo C-terminal del polipéptido de fusión fluorescente;
y en el que se entiende que el término “péptido de localización en la membrana” significa un péptido cuya localización intracelular natural está en la membrana plasmática.
2. Polipéptido de fusión fluorescente según la reivindicación 1, en el que el péptido de vesicularización que consiste en el péptido clatrina y beta-adaptina de arrestina consiste en SEQ ID NO 4.
3. Polipéptido de fusión fluorescente según la reivindicación 1, en el que:
a. el péptido de localización en la membrana es el dominio extracelular del receptor de interleucina-2 de SEQ ID 3; y
b. el péptido de vesicularización que consiste en el péptido clatrina y beta-adaptina de arrestina consiste en SEQ ID NO 4.
4. Polipéptido de fusión fluorescente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el péptido fluorescente se selecciona del grupo que consiste en GFP, YFP, turboGFP, turboRFP, turboRFP602 y turboRFP650.
5. Molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de polinucleótido que codifica para un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
6. Biosensor que comprende el polipéptido de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
7. Célula in vitro que comprende el polipéptido fluorescente según cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
8. Célula según la reivindicación 7, en la que dicha célula es una línea celular U2OS (línea celular de osteosarcoma óseo humano).
9. Uso in vitro del polipéptido fluorescente según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para detectar y/o reclutar beta arrestina.
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