ES2953196T3 - Radiotrazador de modo dual de unión a PSMA y terapéutico - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un compuesto según la fórmula (V): o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que contiene opcionalmente un catión radiactivo quelado y en la que F es opcionalmente 18F. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Radiotrazador de modo dual de unión a PSMAy terapéutico

La presente invención se refiere a un compuesto de acuerdo con la fórmula (V):

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que contiene un catión radioactivo quelado o en donde F es opcionalmente 18F. La presente invención se refiere además a un método para sintetizar el compuesto que evita la racemización durante la síntesis.

Cáncer de próstata

El cáncer de próstata (PCa) se mantuvo durante las últimas décadas como la enfermedad maligna más común en hombres con una alta incidencia de bajas tasas de supervivencia. Debido a su sobreexpresión en el cáncer de próstata, el antígeno de membrana específico de próstata (PSMA) o la glutamato carboxipeptidasa II (GCP II) demostraron su idoneidad como objetivo excelente para el desarrollo de agentes radiomarcados altamente sensibles para endorradioterapia y obtención de imágenes de PCa. El antígeno de membrana específico de próstata es una hidrolasa extracelular cuyo centro catalítico comprende dos iones de zinc (II) con un ligando hidróxido puente. Se encuentra regulado muy positivamente en carcinomas de próstata metastásicos y resistentes a hormonas, pero también se ha informado su expresión fisiológica en riñones, glándulas salivales, intestino delgado, cerebro y, en menor medida, también en tejido prostático sano. En el intestino, el PSMA facilita la absorción de folato mediante la conversión de pteroilpoli-Y-glutamato en pteroilglutamato (folato). En el cerebro, hidroliza el N-acetil-Laspartil-L-glutamato (NAAG) a N-acetil-L-aspartato y glutamato.

Antígeno de membrana específico de próstata (PSMA)

El antígeno de membrana específico de próstata (PSMA) es una glicoproteína transmembrana de tipo II que se sobreexpresa altamente en las células epiteliales del cáncer de próstata. A pesar de su nombre, el PSMA también se expresa, en diversos grados, en la neovasculatura de una amplia variedad de cánceres no prostáticos.

Entre los cánceres no prostáticos más comunes que demuestran expresión de PSMA se incluyen el carcinoma de mama, pulmón, colorrectal y células renales.

Las estructuras generales necesarias de las moléculas dirigidas a PSMA comprenden una unidad de unión que abarca un grupo de unión a zinc (tal como urea, fosfinato o fosforamidato) conectado a un resto de glutamato P1', que garantiza una alta afinidad y especificidad por el PSMA y típicamente está conectado además a una funcionalidad efectora. La parte efectora es más flexible y hasta cierto punto tolerante a las modificaciones estructurales. El túnel de entrada acomoda otras dos características estructurales prominentes, que son importantes para la unión al ligando. La primera es un parche de arginina, un área cargada positivamente en la pared del embudo de entrada y la explicación mecanicista de la preferencia de funcionalidades cargadas negativamente en la posición P1 de PSMA. Esta parece ser la razón de la incorporación preferente de residuos cargados negativamente dentro del ligando-armazón. Hasta el momento, hasta donde sabemos no se ha realizado un análisis en profundidad del efecto de las cargas positivas en los ligandos de PSMA. Tras la unión, el reposicionamiento concertado de las cadenas laterales de arginina puede conducir a la apertura de un bolsillo auxiliar hidrófobo S1, la segunda estructura importante que se ha demostrado que acomoda un grupo yodo-bencilo de varios inhibidores basados en urea, lo que contribuye por tanto a su alta afinidad por PSMA.

Zhang y otros descubrieron un sitio de unión remoto de PSMA, que se puede emplear para el modo de unión bidentado (Zhang y otros, Journal of the American Chemical Society 132, 12711-12716 (2010)). El llamado sitio de unión de areno es un motivo estructural simple formado por las cadenas laterales de Arg463, Arg511 y Trp541, y es parte de la tapa de entrada de GCPII. El acoplamiento del sitio de unión de areno a un resto inhibidor distal puede dar como resultado un aumento sustancial en la afinidad del inhibidor por PSMA debido a los efectos de avidez. PSMA I&T se desarrolló con la intención de interactuar de esta manera con PSMA, aunque no se dispone de un análisis de la estructura cristalina del modo de unión. Una característica necesaria de acuerdo con Zhang y otros es una unidad enlazadora (ácido subérico en el caso de PSMA I&T) que facilite una conformación abierta de la tapa de entrada de GCPII y de esta manera permita la accesibilidad del sitio de unión de areno. Además, se demostró que la composición estructural del enlazador tiene un impacto significativo en la actividad biológica y dirigida al tumor, así como también en el contraste de imágenes y la farmacocinética (Liu y otros, Bioorganic & medicinal chemistry letters 21, 7013-7016 (2011)), propiedades que son cruciales tanto para la alta calidad de imagen como para la endorradioterapia dirigida eficiente.

Actualmente se usan dos categorías de inhibidores dirigidos a PSMA en contextos clínicos. Por un lado, hay trazadores con unidades quelantes para la formación de complejos con radionúclidos tales como PSMA I&T o compuestos relacionados. Por otro lado, hay moléculas pequeñas, que comprenden una unidad dirigida y moléculas efectoras.

Los agentes que se usan con mayor frecuencia para obtener imágenes selectivas de PSMA son PSMA HBED-CC, PSMA-617 y PSMA I&T, que están marcados predominantemente con 68Ga (88,9 % p+, Ep+,máx = 1,89 MeV, ty = 68 min). Entre estos 68Ga-PSMA-HBED-CC (también conocido como 68Ga-PSMA-11), se considera hasta ahora como el estándar de referencia para la obtención de imágenes de PET de PCa.

Marcaje con 18F

Recientemente, varios grupos se han centrado en el desarrollo de nuevos inhibidores basados en urea marcados con 18F para el diagnóstico de PCa. A diferencia del radiometal 68Ga, que puede obtenerse de los generadores de radionúclidos 68Ge/68Ga distribuidos comercialmente (68Ge; ty = 270,8 d), el radioisótopo 18F-fluoruro (96,7 % p+, Ep+, máx = 634 keV) requiere un ciclotrón in situ para su producción. A pesar de esta limitación, 18F ofrece debido a su vida media más larga (ty2 = 109,8 min) y su menor energía de positrones, ventajas significativas en términos de manipulación habitual y calidad de imagen. Además, existe la posibilidad de una producción a gran escala en un ciclotrón, lo que sería beneficioso para un mayor rendimiento de pacientes y una reducción de los costos de producción. El inhibidor de PSMA basado en urea marcado con 18F, 18F-DCFPyl, demostró resultados prometedores en la detección de PCa primario y metastásico (Rowe y otros, Molecular Imaging and Biology, 1-9 (2016)) y superioridad a 68Ga-PSMA-HBED-CC en un estudio comparativo (Dietlein y otros, Molecular Imaging and Biology 17, 575-584 (2015)). En base a la estructura de PSMA-617, recientemente se desarrolló el análogo PSMA-1007 marcado con 18F, que mostró relaciones de tumor a órgano comparables (Cardinale y otros, Journal of nuclear medicine: official publication, Society of Nuclear Medicine 58, 425-431 (2017); Giesel y otros, European journal of nuclear medicine and molecular imaging 43, 1929-1930 (2016)). Un estudio comparativo con 68Ga-PSMA-HBED-CC reveló una exactitud diagnóstica similar de ambos trazadores y un aclaramiento urinario reducido de 18F-PSMA-1007, lo que permite una mejor evaluación de la próstata (Giesel y otros, European journal of nuclear medicine and molecular imaging 44, 678-688 (2017)).

Un enfoque atractivo para introducir marcadores 18F es el uso de aceptores de fluoruro de silicio (SIFA). Los aceptores de fluoruro de silicio se describen, por ejemplo, en Lindner y otros, Bioconjugate Chemistry 25, 738-749 (2014). Para preservar el enlace silicio-fluoruro, el uso de aceptores de fluoruro de silicio introduce la necesidad de grupos estéricamente exigentes alrededor del átomo de silicio. Esto, a su vez, hace que los aceptores de fluoruro de silicio sean altamente hidrófobos. En términos de unión a la molécula objetivo, en particular a la molécula objetivo que es PSMA, el resto hidrófobo proporcionado por el aceptor de fluoruro de silicio puede explotarse con el propósito de establecer interacciones del compuesto radiodiagnóstico o terapéutico con el bolsillo hidrófobo descrito en Zhang y otros, Journal of the American Chemical Society 132, 12711-12716 (2010). Sin embargo, antes de la unión, el mayor grado de lipofilicidad introducido en la molécula plantea un grave problema con respecto al desarrollo de radiofármacos con biodistribución in vivo adecuada, es decir, baja unión inespecífica en tejido no objetivo.

Falla al resolver el problema de la hidrofobicidad.

A pesar de muchos intentos, el problema de la hidrofobicidad causado por los aceptores de fluoruro de silicio no se ha resuelto satisfactoriamente en el estado de la técnica.

Para explicar más, Schirrmacher E. y otros (Bioconjugate Chem. 2007, 18, 2085-2089) sintetizaron diferentes péptidos marcados con 18F mediante el uso del sintón de marcaje altamente efectivo p-(di-terc-butilfluorosilil) benzaldehído ([18F]SIFA-A), que es un ejemplo de un aceptor de fluoruro de silicio. La técnica SIFA dio como resultado un intercambio isotópico 19F-18F inesperadamente eficiente y produjo el sintón 18F con rendimientos casi cuantitativos con actividades específicas altas entre 225 y 680 GBq/μmol (6081-18 378 Ci/mmol) sin aplicar purificación por HPLC. Por último, se usó [18F]SIFA-benzaldehído para marcar los péptidos derivatizados con aminooxi N-terminal (N-AO) AO-Tyr3-octreotato (AO-TATE), ciclo(fK(AO-N)RGD) y N-AO-PEG²-[D-Tyr-Gln-Trp-Ala-Val-Ala-His-Thi-Nle-NH²] (AO-BZH3, un derivado de la bombesina) con rendimientos radioquímicos altos. Sin embargo, los péptidos marcados son altamente lipófilos (como puede deducirse de los tiempos de retención de HPLC mediante el uso de las condiciones descritas en este documento) y, por lo tanto, no son adecuados para una evaluación adicional en modelos animales o humanos.

En Wangler C. y otros (Bioconjugate Chem., 2009, 20 (2), pp 317-321), se ha descrito la primera radiofluoración tipo kit basada en SIFA de una proteína (albúmina sérica de rata, RSA). Como agente de marcaje, se produjo 4-(di-tercbutil[18F]fluorosilil)bencenotiol (Si[18F]FA-SH) mediante intercambio isotópico simple con un rendimiento radioquímico (RCY) del 40-60 % y el producto se acopló directamente a albúmina sérica derivatizada con maleimida con un RCY global del 12 % en 20-30 min. El procedimiento de marcaje técnicamente simple no requiere ningún procedimiento de purificación elaborado y es un ejemplo sencillo de una aplicación exitosa de la química Si-18F para la obtención de imágenes in vivo con PET. Las curvas de tiempo-actividad y las imágenes de pPET de ratones mostraron que la mayor parte de la actividad se localizaba en el hígado, lo que demuestra por tanto que el agente de marcaje es demasiado lipófilo y dirige el trazador in vivo a la excreción hepatobiliar y al metabolismo hepático extenso.

Wangler C. y otros (ver Bioconjug Chem. 2010 Dec 15;21(12):2289-96) subsecuentemente intentaron superar el principal inconveniente de la tecnología SIFA, la alta lipofilicidad de los radiofármacos resultantes, mediante la síntesis y evaluación de nuevos análogos de SIFA-octreotato (SIFA-Tyr3-octreotato, SIFA-Asn(AcNH-p-Glc)-Tyr3-octreotato y SIFA-Asn(AcNH-p-Glc)-PEG-Tyr3-octreotato). En estos compuestos, se introdujeron enlazadores hidrófilos y modificadores farmacocinéticos entre el péptido y el resto SIFA, es decir, un carbohidrato y un enlazador PEG más un carbohidrato. Como medida de la lipofilicidad de los conjugados, se determinó el log P(ow) y se encontró que era 0,96 para SIFA-Asn(AcNH-p-Glc)-PEG-Tyr3-octreotato y 1,23 para SIFA-Asn(AcNH-p-Glc)-Tyr3-octreotato. Estos resultados muestran que la alta lipofilicidad del resto SIFA solo puede compensarse marginalmente mediante la aplicación de restos hidrófilos. Un primer estudio de imágenes demostró un aclaramiento hepático/captación hepática excesivos y, por tanto, nunca se ha transferido a un primer estudio en seres humanos.

Bernard-Gauthier y otros (Biomed Res Int. 2014;2014:454503) reseñan una gran cantidad de especies de SIFA diferentes que se han informado en la bibliografía, desde grupos prostéticos pequeños y otros compuestos de bajo peso molecular hasta péptidos marcados y, más recientemente, moléculas de aficuerpo. En base a estos datos, el problema de la lipofilicidad de los grupos prostéticos basados en SIFA no se ha resuelto hasta ahora; es decir, no se ha descrito una metodología que reduzca la lipofilicidad total de un péptido conjugado con SIFA hasta un log D menor que aproximadamente -2,0.

En Lindner S. y otros (Bioconjug Chem. 2014 Apr 16;25(4):738-49) se describe que los derivados de bombesina PEGilados (PESIN) como ligandos específicos del receptor de GRP y los péptidos RGD (códigos de una letra para arginina-glicina-ácido aspártico) como aglutinantes específicos de avp3 se sintetizaron y etiquetaron con un resto aceptor de silicio-flúor (SIFA). Para compensar la alta lipofilicidad del resto SIFA, se introdujeron varias modificaciones hidrófilas a la estructura que condujeron a valores de logD reducidos. SIFA-Asn(AcNH-p-Glc)-PESIN, SIFA-Ser(p-Lac)-PESIN, SIFA-Cya-PESIN, SIFA-LysMe3-PESIN, SIFA-Y-carboxi-d-Glu-PESIN, SIFA-Cya2-PESIN, SIFA-LysMe3-y-carboxi-d-Glu-PESIN, SIFA-(Y-carboxi-d-Glu)₂-PESIN, SIFA-RGD, SIFA-Y-carboxi-d-Glu-RGD, SIFA-(y-carboxi-d-Glu)₂-RGD, SIFA-LysMe3-Y-carboxi-d-Glu-RGD. Todos estos péptidos, ya mejorados y derivatizados con el objetivo de reducir la lipofilicidad, mostraron un valor de logD en el intervalo entre 2 y -1,22.

En Niedermoser S. y otros (J Nucl Med. 2015 Jul;56(7):1100-5), se compararon derivados de TATE modificados con 18F-SIFA y 18F-SIFAlin (SIFA = aceptor de fluoruro de silicio) recién desarrollados con el estándar de referencia clínico actual 68Ga-DOTATATE para obtención de imágenes de alta calidad de tumores portadores de receptores de somatostatina. Para este propósito, se desarrollaron 18F-SIFA-TATE y dos análogos bastante complejos, 18F-SIFA-Glc-PEG1-TATE, 18F-SIFAlin-Glc-Asp2-PEG1-TATE. Ninguno de los agentes mostró un logD <-1,5. S. Litau y otros (Bioconjugate Chem. 2015, 26, 2350-2359) describen derivados de TATE basados en SIFAlin para la obtención de imágenes de PET de tumores positivos para SSTR.

En vista de lo anterior, el problema técnico subyacente a la presente invención puede verse en proporcionar agentes de radiodiagnóstico y radioterapéuticos que contengan un aceptor de fluoruro de silicio y que, al mismo tiempo, se caractericen por propiedades in vivo favorables.

Como será evidente a continuación, la presente invención estableció una prueba de principio mediante el uso de conjugados específicos que se unen con alta afinidad al antígeno específico de próstata (PSMA) como objetivo. En consecuencia, un problema técnico adicional subyacente a la presente invención puede verse en proporcionar agentes radioterapéuticos y de diagnóstico mejorados para la indicación médica que es el cáncer, preferentemente el cáncer de próstata.

El documento WO2019020831 A describe un género de compuestos de unión a PSMA. En la presente descripción se describe un subconjunto ventajoso de los compuestos de la solicitud anterior. La solicitud en la presente descripción es una selección de características ventajosas no apreciadas por los inventores en el momento de la presentación del documento WO2019020831 A.

Estos problemas técnicos se solucionan con la materia de las reivindicaciones. En consecuencia, la presente invención se refiere al compuesto de acuerdo con la fórmula (V):

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que contiene un catión radioactivo quelado o en donde F es opcionalmente 18F.

Los compuestos descritos pueden estar en forma de sales. La presente invención se refiere además a compuestos de fórmula (Va):

o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, en donde;

cada X es independientemente OH u O-;

M es un catión radioactivo quelado o está ausente;

y F es opcionalmente 18F.

Además, la combinación del uso de un quelante y un intercambio isotópico en SIFA por medio de 18F-fluoruro también da como resultado trazadores de diagnóstico "pareados" que pueden usarse como trazadores [18F][natIon] en centros con ciclotrón in situ o centros que obtienen 18F-fluoruro por envío desde centros con ciclotrón, mientras que en los centros que no tienen acceso a 18F-fluoruro, pero tienen acceso a generadores de radioisótopos, tales como un generador de Ge-68/Ga-68, pueden usarse las versiones correspondientes, por ejemplo trazadores [natF][68Ga].

Es importante destacar que, en ambos casos, se inyecta el radiofármaco químicamente idéntico y, por tanto, no se prevén diferencias en el comportamiento in vivo. Mientras que actualmente, debido a las diferencias químicas, los datos clínicos de un compuesto marcado con 18F proporcionado por una cohorte de pacientes en un sitio no puede compararse directamente con los datos clínicos de un análogo de 68Ga proporcionado por otro grupo en otro sitio, los agentes radiofarmacéuticos y/o de diagnóstico de acuerdo con la invención pueden compararse directamente y, por tanto, permitirán asociar dichos datos (por ejemplo, datos de un centro en Europa que trabaja con F-18 y otro centro en India que trabaja con Ga-68).

Además, cuando se selecciona adecuadamente, el quelato también puede usarse para el marcaje con un isótopo terapéutico, tal como los isótopos beta emisores Lu-177, Y-90 o el isótopo alfa emisor Ac-225, lo que permite por tanto ampliar el concepto de trazadores "pareados" para asociar los radiofármacos de diagnóstico (trazadores [18F][natLu]) y terapéuticos ([natF][177Lu].

Otra ventaja de los compuestos, especialmente de los compuestos dirigidos a PSMA de la presente invención, es su acumulación sorprendentemente baja en los riñones de ratones en comparación con otros radiofármacos dirigidos a PSMA, tales como PSMA I&T. Sin desear limitarse a una teoría particular, parece ser la combinación del elemento estructural SIFA con un quelante lo que proporciona la reducción inesperada de la acumulación en los riñones.

En términos de lipofilicidad/hidrofilicidad, el valor de logP (a veces también denominado valor de logD) es una medida establecida en la técnica.

El término "lipofilicidad" se refiere al potencial de disolverse o absorberse en soluciones de lípidos, o de adsorberse en una superficie o matriz lipídica. Indica una preferencia por los lípidos (significado literal) o por líquidos orgánicos o apolares o por líquidos, soluciones o superficies con un momento dipolar pequeño en comparación con el agua. El término "hidrofobicidad" se usa en la presente descripción con un significado equivalente. Los adjetivos lipófilo e hidrófobo se usan con el significado correspondiente a los sustantivos descritos anteriormente.

El flujo de masa de una molécula en la interfaz de dos solventes inmiscibles o sustancialmente inmiscibles se rige por su lipofilicidad. Cuanto más lipófila es una molécula, más soluble es en la fase orgánica lipófila. El coeficiente de reparto de una molécula que se observa entre el agua y el n-octanol se ha adoptado como medida estándar de lipofilicidad. El coeficiente de reparto P de una especie A se define como la relación P = [A]n-octanol / [A]agua. Una cifra comúnmente informada es el valor de logP, que es el logaritmo del coeficiente de reparto. En caso de que una molécula sea ionizable, en principio estarán presentes en ambas fases una pluralidad de microespecies distintas (formas ionizadas y no ionizadas de la molécula). La cantidad que describe la lipofilicidad total de una especie ionizable es el coeficiente de distribución D, definido como la relación D = [suma de las concentraciones de todas las microespecies]n-octanol / [suma de las concentraciones de todas las microespecies]agua. De manera análoga a logP, con frecuencia se informa el logaritmo del coeficiente de distribución, logD. A menudo, se usa un sistema tampón, como solución salina tamponada con fosfato, como alternativa al agua en la determinación de logP descrita anteriormente.

Si se va a evaluar y/o determinar cuantitativamente el carácter lipófilo de un sustituyente en una primera molécula, se puede evaluar una segunda molécula correspondiente a ese sustituyente, en donde dicha segunda molécula se obtiene, por ejemplo, mediante la ruptura del enlace que conecta dicho sustituyente al resto de la primera molécula y que conecta la(s) valencia(s) libre(s) obtenida(s) de esta manera a hidrógeno(s).

Alternativamente, se puede determinar la contribución del sustituyente al logP de una molécula. La contribución nx x de un sustituyente X al logP de una molécula R-X se define como nx x = logPR-x - logPR-H, en donde R-H es el compuesto original no sustituido.

Valores de P y D mayores que uno, así como también valores de logP, logD y nx ^x mayores que cero indican carácter lipófilo/hidrófobo, mientras que valores de P y D menores que uno, así como también valores de logP, logD y nx x menores que cero indican carácter hidrófilo de las respectivas moléculas o sustituyentes.

Los parámetros descritos anteriormente que caracterizan la lipofilicidad del grupo lipófilo o la molécula completa de acuerdo con la invención pueden determinarse por medios experimentales y/o predecirse mediante métodos computacionales conocidos en la técnica (ver por ejemplo Sangster, Octanol-water Partition Coefficients: fundamentals and physical chemistry, John Wiley & Sons, Chichester. (1997)).

En una modalidad preferida, el valor de logP de los compuestos de la invención está entre -5 y -1,5. Se prefiere particularmente que el valor de logP esté entre -3,5 y -2,0.

En una modalidad preferida, el grupo quelante comprende un catión quelado que es radioactivo. Se prefiere más un isótopo de metal radioactivo quelado.

Los ejemplos preferidos de cationes que pueden quelarse con el grupo quelante son los cationes de 43Sc, 44Sc, 47Sc,

51Cr, 52mMn, 58Co, 52Fe, 56Ni, 57Ni, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 66Ga, 67Ga 68Ga, 89Zr, 90Y, 89Y, <Tc, 99mTc, 97Ru, 105Rh, 109Pd, 111Ag,110mIn, 111In, 113mIn, 114mIn, 117mSn, 121Sn, 127Te, 142Pr, 143Pr, 149Pm, 151Pm, 149Tb, 152Tb, 155Tb, 161Tb, 153Sm, 157Gd, 161Tb, 166Ho, 165Dy, 169Er, 169Yb, 175Yb, 172Tm, 177Lu, 186Re, 188Re, 191Pt, 197Hg, 198Au, 199Au, 212Pb, 203Pb, 211At,

212Bi, 213Bi, 223Ra, 225Ac, 227Th, una molécula catiónica que comprende 18F o un catión tal como 18F-[AlF]2+; con mayor preferencia los cationes de 44Sc, 47Sc, 64Cu, 67Cu, 68Ga, 90Y, 111In 161Tb, 166Ho, 177Lu, 188Re, 212 225Ac, y 227Th o una molécula catiónica que comprende 18F. Los cationes se pueden seleccionar de Lu-177, Y-90 o

Ac-225.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende o que consiste en uno o más compuestos de la invención como se describió anteriormente en la presente descripción.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una composición de diagnóstico que comprende o que consiste en uno o más compuestos de la invención como se describió anteriormente en la presente descripción.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una composición terapéutica que comprende o que consiste en uno o más compuestos de la invención como se describió anteriormente en la presente descripción.

La composición farmacéutica puede comprender además portadores, excipientes y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos de portadores, excipientes y/o diluyentes farmacéuticos adecuados se conocen bien en la

técnica e incluyen soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones, tales como emulsiones de aceite/agua, varios tipos de agentes humectantes, soluciones estériles, etc. Las composiciones que comprenden tales portadores pueden formularse mediante métodos convencionales bien conocidos. Estas composiciones farmacéuticas pueden administrarse al sujeto en una dosis adecuada. La administración de las composiciones adecuadas puede efectuarse de diferentes maneras, por ejemplo, por administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, tópica, intradérmica, intranasal o intrabronquial. Se prefiere particularmente que dicha administración se lleve a cabo mediante inyección y/o suministro, por ejemplo, en un sitio del páncreas o en una arteria cerebral o directamente en el tejido cerebral. Las composiciones también se pueden administrar directamente en el sitio objetivo, por ejemplo, mediante suministro biolístico a un sitio objetivo externo o interno, como el páncreas o el cerebro. El régimen de dosificación será determinado por el médico de cabecera y los factores clínicos. Como se conoce bien en las técnicas médicas, las dosificaciones para cada paciente dependen de muchos factores, que incluyen el tamaño del paciente, el área de superficie corporal, la edad, el compuesto en particular que se administrará, el sexo, el tiempo y la vía de administración, la salud general y de otros fármacos que se administren simultáneamente. La materia farmacéuticamente activa puede estar presente en cantidades entre 0,1 ng y 10 mg/kg de peso corporal por dosis; sin embargo, se prevén dosis por debajo o por encima de este intervalo ilustrativo, especialmente al considerar los factores antes mencionados.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona uno o más compuestos de la invención como se describe en la presente descripción para el uso en medicina.

Los usos preferidos en medicina son en medicina nuclear tal como imágenes de diagnóstico nuclear, también denominadas imágenes moleculares nucleares, y/o radioterapia dirigida de enfermedades asociadas con una sobreexpresión, preferentemente de PSMA en el tejido enfermo.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un compuesto de la invención como se definió anteriormente en la presente descripción para el uso en un método de diagnóstico y/o estadificación del cáncer, preferentemente cáncer de próstata. El cáncer de próstata no es el único cáncer que expresa PSMA. Los cánceres que no son de próstata conocidos por demostrar expresión de PSMA incluyen carcinoma de mama, pulmón, colorrectal y de células renales. Por lo tanto, cualquier compuesto descrito en la presente descripción que tenga un resto de unión a PSMA puede usarse en el diagnóstico, obtención de imágenes o tratamiento de un cáncer que tenga expresión de PSMA.

Las indicaciones preferidas son la detección o estadificación del cáncer, tal como, pero sin limitarse a, gliomas de alto grado, cáncer de pulmón y especialmente cáncer de próstata y cáncer de próstata metastásico, la detección de enfermedad metastásica en pacientes con cáncer de próstata primario de riesgo intermedio a riesgo alto, y la detección de sitios metastásicos, incluso con valores de PSA sérico bajos en pacientes con cáncer de próstata bioquímicamente recurrente. Otra indicación preferida es la obtención de imágenes y la visualización de la neoangiogénesis.

En términos de indicaciones médicas a someter a terapia, especialmente radioterapia, el cáncer es una indicación preferida. El cáncer de próstata es una indicación particularmente preferida.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un compuesto de la invención como se definió anteriormente en la presente descripción para el uso en un método de diagnóstico y/o estadificación del cáncer, preferentemente cáncer de próstata.

La presente descripción se refiere además a los siguientes puntos.

El compuesto de acuerdo con la fórmula (V):

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que contiene un catión radioactivo quelado o en donde F es opcionalmente 18F.

El compuesto puede contener un catión quelado seleccionado de los cationes de Sc, Cu, Ga, Y, In, Tb, Ho, Lu, Re,

Pb, Bi, Ac, Er y Th. El catión quelado puede ser radioactivo. El catión radioactivo quelado puede ser cualquier isótopo radioactivo de galio, erbio, cobre, escandio, lutecio o itrio.

El compuesto puede ser un compuesto de fórmula (Va):

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde;

cada X es independientemente OH u O-;

M es un catión radioactivo quelado o está ausente;

y F es opcionalmente 18F.

En el compuesto de fórmula (Va), X puede ser OH. X puede ser O-. Uno o más de los grupos X pueden quelarse con

M cuando M está presente.

En el compuesto de fórmula (Va), M puede ser un catión radioactivo quelado. M puede estar ausente. M puede ser un catión radioactivo quelado con uno o más grupos X. M puede ser un catión radioactivo quelado con uno o más átomos de N. M puede ser un catión radioactivo quelado con uno o más átomos de N o uno o más grupos X. M puede ser un catión radioactivo quelado con uno o más átomos de N y uno o más grupos X.

En el compuesto de fórmula (V) o (Va), F puede ser 18F. F puede ser 19F.

En el compuesto de fórmula (V) o (Va), el catión radioactivo quelado se puede seleccionar de los cationes de 43Sc, 44Sc, 47Sc, 51Cr, 52mMn, 58Co, 52Fe, 56Ni, 57Ni, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 66Ga, 67Ga 68Ga, 89Zr, 90Y, 89Y, <Tc, 99mTc, 97Ru, 105Rh, 109Pd, 111Ag,110mIn, 111In 113mIn, 114mIn, 117mSn, 121Sn, 127Te, 142Pr, 143Pr, 149Pm, 151Pm, 149Tb, 152Tb, 155Tb, 161Tb, 153Sm, 157Gd, 161Tb, 166Ho, 165Dy, 169Er, 169Yb, 175Yb, 172Tm, 177Lu, 186Re, 188Re, 191Pt, 197Hg, 198Au, 199Au, 212Pb, 203Pb, 211At, 212Bi, 213Bi, 223Ra, 225Ac, 227Th, una molécula catiónica que comprende 18F o un catión tal como 18F-[AlF]2+; con mayor preferencia los cationes de 44Sc, 47Sc, 64Cu, 67Cu, 68Ga, 90Y, 111In, 161Tb, 166Ho, 177Lu, 188Re, 212Pb, 212Bi, 213Bi, 225Ac, y 227Th o una molécula catiónica que comprende 18F. El catión radioactivo quelado se puede seleccionar de los cationes de Sc, Cu, Ga, Y, In, Tb, Ho, Lu, Re, Pb, Bi, Ac, E ry Th. El catión radioactivo quelado puede serGa. El catión radioactivo quelado puede ser Lu-177, Y-90 o Ac-225.

En el compuesto de fórmula (Va), M se puede seleccionar de los cationes de 43Sc, 44Sc, 47Sc, 51Cr, 52mMn, 58Co, 52Fe, 56Ni, 57Ni, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 66Ga, 67Ga 68Ga, 89Zr, 90Y, 89Y, <Tc, 99mTc, 97Ru, 105Rh, 109Pd, 111A 113mIn, 114mIn, 117mSn, 121Sn, 127Te, 142Pr, 143Pr, 149Pm, 151Pm, 149Tb, 152Tb, 155Tb, 161Tb, 153Sm, 157Gd, 161Tb, 166Ho, 165Dy, 169Er, 169Yb, 175Yb, 172Tm, 177Lu, 186Re, 188Re, 191Pt, 197Hg, 198Au, 199Au, 212Pb, 203Pb, 211At, 212Bi, 213Bi, 223Ra, 225Ac, 227Th, una molécula catiónica que comprende 18F o un catión tal como 18F-[AlF]2+; con mayor preferencia los cationes de 44Sc, 47Sc, 64Cu, 67Cu, 68Ga, 90Y, 111In 161Tb, 166Ho, 177Lu, 188Re, 212Pb, 212Bi, 213Bi, 225Ac, y 227Th o una molécula catiónica que comprende 18F. M se puede seleccionar de los cationes de Sc, Cu, Ga, Y, In, Tb, Ho, Lu, Re,

Pb, Bi, Ac, Er y Th. M puede ser Ga. M puede ser Lu-177, Y-90 o Ac-225.

Es ventajoso sintetizar compuestos con el menor número posible de isómeros. Si bien los isómeros se pueden separar, solo se usa un único isómero in vivo y, por lo tanto, el isómero incorrecto simplemente se descarta y no se usa. Por tanto, idealmente se evitan las condiciones que minimizan la racemización o la inversión de cualquiera de los centros quirales definidos.

También se describe un método para producir el compuesto que comprende las etapas de:

a) hacer reaccionar un compuesto de fórmula (I):

con un compuesto de fórmula (II):

para formar un compuesto de fórmula (111):

en donde PGi es tBu, PG2 es Fmocy PG3 es Dde;

y las condiciones de reacción implican el uso de una base, en donde la base es 2,4,6-colidina o 2,6-dimetilpiridina;

b) hacer reaccionar el compuesto de fórmula (III) en condiciones adecuadas para formar un compuesto de fórmula (IV)

y

c) hacer reaccionar el compuesto de fórmula (IV) en condiciones adecuadas para formar el compuesto (V):

El método anterior incluye un método en donde el compuesto (II) se preactiva por reacción con tetrafluoroborato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilaminio (TBTU), 1-hidroxi-7-azabenzotriazol (HOAt) y 2,4,6-colidina antes de la reacción con el compuesto (I). La preactivación tiene lugar durante 5 minutos o menos.

El uso de 2,4,6-colidina o 2,6-dimetilpiridina como base, junto con el corto tiempo de activación, ayuda a minimizar la racemización del compuesto quiral activado (II) en comparación con otras bases nitrogenadas tales como DIPEA. La base más impedida estéricamente no extrae el protón ácido en el centro quiral del ácido, por lo que reduce la racemización antes del acoplamiento a la amina.

En la presente descripción se describe el compuesto de acuerdo con la fórmula (VI)

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Cuando se muestra el metal quelado, los grupos ácidos a los que está quelado se muestran simplemente de forma representativa como COO-, el cuarto ácido equivalente también puede estar parcialmente quelado y, por lo tanto, puede no ser literalmente COOH.

En la presente descripción se describe el compuesto de acuerdo con la fórmula (VII)

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

En la presente descripción se describe una composición farmacéutica o de diagnóstico que comprende el compuesto de fórmula (V) o (VI). El conjugado, compuesto o composición puede usarse como agente de diagnóstico o de obtención de imágenes del cáncer.

Se describe un método de obtención de imágenes y/o diagnóstico del cáncer que comprende administrar un conjugado, compuesto o composición de acuerdo con la fórmula (V) o (VI) a un paciente que lo necesite.

Se describe un conjugado, compuesto o composición de acuerdo con la fórmula (V) o (VI) para el uso en el tratamiento del cáncer.

Se describe un conjugado, compuesto o composición de acuerdo con la fórmula (V) o (VI) para el uso en el diagnóstico, obtención de imágenes o prevención de neoangiogénesis/angiogénesis.

Se describe un conjugado, compuesto o composición de acuerdo con la fórmula (V) o (VI) para el uso como agente de diagnóstico o de obtención de imágenes del cáncer o para el uso en el tratamiento del cáncer en donde el cáncer es carcinoma de próstata, mama, pulmón, colorrectal o de células renales.

Las figuras ilustran:

Figura 1: Correlación ilustrativa de la determinación de las nueve sustancias de referencia en OriginPro 2016G. Figura 2a: Control de calidad de [19F][natGa]-rhPSMA7-rac ([19F][natGa]D/L-Dap-R/S-DOTAGA-rhPSMA-7-rac),

(lote 10, precursor para la producción de ([18F][natGa]D/L-Dap-R/S-DOTAGA-rhPSMA-7 en el Departamento de Medicina Nuclear, TUM). Condiciones de HPLC: Solvente A: H₂O FA al 0,1 %; Solvente B: MeCN TFA al 0,1 %. Gradiente: 25 - 35 % de B 0-40 min, 95 - 95 % de B 40-45 min, 35 -35 % de B 45-50 min; flujo: 1 ml/min, columna: Nucleosil 100-5 C18, 125 * 4,6 mm, Muestra: 1 mM (DMSO), 10 |jl.

Figura 2b: Asignación de picos: D-Dap-R-DOTAGA-rhPSMA-7.1; rhPSM7-rac de la Figura 2a coinyectado con D-Dap-R-DOTAGA-rhPSMA-7.1 enantiopuro. Condiciones de HPLC: Solvente A: H₂O FA al 0,1 %; Solvente B: MeCN TFA al 0,1 %. Gradiente: 25 - 35 % de B 0-40 min, 95 - 95 % de B 40-45 min, 35 -35 % de B 45-50 min; flujo: 1 ml/min, columna: Nucleosil 100-5 C18, 125 * 4,6 mm, Muestra: 1 mM (DMSO), 10 jl.

Figura 2c: Perfil de HPLC de D-Dap-R-DOTAGA-rhPSMA-7.1; Condiciones de HPLC: Solvente A: H₂O FA al 0,1 %; Solvente B: MeCN TFA al 0,1 %. Gradiente: 25 - 35 % de B 0-40 min, 95 - 95 % de B 40­ 45 min, 35 - 35 % de B 45-50 min; flujo: 1 ml/min, columna: Nucleosil 100-5 C18, 125 * 4,6 mm, Muestra: 1 mM (DMSO), 10 jl.

Figura 3a: Asignación de picos: L-Dap-R-DOTAGA-rhPSMA-7.2; rhPSM7-rac de la Figura 2a coinyectado con L-Dap-R-DOTAGA-rhPSMA-7.2 enantiopuro. Condiciones de HPLC: Solvente A: H₂O FA al 0,1 %; Solvente B: MeCN TFA al 0,1 %. Gradiente: 25 - 35 % de B 0-40 min, 95 - 95 % de B 40-45 min, 35 -35 % de B 45-50 min; flujo: 1 ml/min, columna: Nucleosil 100-5 C18, 125 * 4,6 mm, Muestra: 1 mM (DMSO), 10 jl.

Figura 3b: Perfil de HPLC de L-Dap-R-DOTAGA-rhPSMA-7.2; Condiciones de HPLC: Solvente A: H₂O FA al 0,1 %; Solvente B: MeCN TFA al 0,1 %. Gradiente: 25 - 35 % de B 0-40 min, 95 - 95 % de B 40­ 45 min, 35 - 35 % de B 45-50 min; flujo: 1 ml/min, columna: Nucleosil 100-5 C18, 125 * 4,6 mm, Muestra: 1 mM (DMSO), 10 jl.

Figura 4a: Asignación de picos: D-Dap-S-DOTAGA-rhPSMA-7.3; rhPSM7-rac de la Figura 2a coinyectado con D-Dap-S-DOTAGA-rhPSMA-7.3 enantiopuro. Condiciones de HPLC: Solvente A: H₂O FA al 0,1 %; Solvente B: MeCN TFA al 0,1 %. Gradiente: 25 - 35 % de B 0-40 min, 95 - 95 % de B 40-45 min, 35 -35 % de B 45-50 min; flujo: 1 ml/min, columna: Nucleosil 100-5 C18, 125 * 4,6 mm, Muestra: 1 mM (DMSO), 10 jl.

Figura 4b: Perfil de HPLC de D-Dap-D-DOTAGA-rhPSMA-7.3; Condiciones de HPLC: Solvente A: H₂O FA al 0,1 %; Solvente B: MeCN TFA al 0,1 %. Gradiente: 25 - 35 % de B 0-40 min, 95 - 95 % de B 40­ 45 min, 35 - 35 % de B 45-50 min; flujo: 1 ml/min, columna: Nucleosil 100-5 C18, 125 * 4,6 mm, Muestra: 1 mM (DMSO), 10 jl.

Figura 5a: Asignación de picos: L-Dap-S-DOTAGA-rhPSMA-7.4; rhPSM7-rac de la Figura 2a coinyectado con D-Dap-S-DOTAGA-rhPSMA-7.3 enantiopuro. Condiciones de HPLC: Solvente A: H₂O FA al 0,1 %; Solvente B: MeCN TFA al 0,1 %. Gradiente: 25 - 35 % de B 0-40 min, 95 - 95 % de B 40-45 min, 35 -35 % de B 45-50 min; flujo: 1 ml/min, columna: Nucleosil 100-5 C18, 125 * 4,6 mm, Muestra: 1 mM (DMSO), 10 jl.

Figura 5b: Perfil de HPLC de L-Dap-D-DOTAGA-rhPSMA-7.4; Condiciones de HPLC: Solvente A: H₂O FA al 0,1 %; Solvente B: MeCN TFA al 0,1 %. Gradiente: 25 - 35 % de B 0-40 min, 95 - 95 % de B 40­ 45 min, 35 - 35 % de B 45-50 min; flujo: 1 ml/min, columna: Nucleosil 100-5 C18, 125 x 4,6 mm, Muestra: 1 mM (DMSO), 10 jl.

Figura 6a: Afinidades de unión (IC₅₀ [nM]) de rhPSMA7.1 y 7.2 a PSMA. Las afinidades se determinaron mediante el uso de células LNCaP (150 000 células/pocillo) y ((4-[125!]yodobenzoi!)KuE ([125I]IB-KuE; c = 0,2 nM) como radioligando (1 h, 4 °C, HBSS BSA al 1 %). Los datos se expresan como media ± SD (n = 3, en 3 experimentos diferentes).

Figura 6b: Determinación de las afinidades de unión [nM] de los isómeros de rhPSMA7 a PSMA. Cada una de las cuatro columnas muestra las mediciones de afinidad individuales de rhPSAM7.1 (izquierda) a rhPSMA7.4 (derecha). Condiciones como se describió en la leyenda de la Figura 6a.

Figura 7: Representación de las mediciones individuales de IC₅₀ [nM] mostradas en las Figuras 6a y 6b. Se eliminó el valor núm. 5 de rhPSMA7.1 Condiciones como se describió en la leyenda de la Figura 6a Figura 8: Representación de las mediciones de internalización individuales [% de [125I]IB-KuE]. Actividad internalizada (c = 0,5 nM) a 1 hora como % del ligando de referencia ([125I]I-BA)KuE (c = 0,2 nM), determinada en células LNCaP (37 °C, DMEM F12 BSA al 5 %, 125000 células/pocillo). Los datos se corrigen respecto a la unión no específica (10 μmol de PMPA) y se expresan como media ± SD (n = 3). Figura 9: Representación de las mediciones individuales de los logP de los isómeros de rhPSMA.

Figura 10: Biodistribución (en %ID/g) de trazadores rhPSMA marcados con 18F a 1 h p.i en ratones SCID portadores de tumor LNCaP. Los datos se expresan como media ± SD (n=4 para rhPSMA7.1, n=5 para 7.2, n=4 para 7.3, n=5 para 7.4 y n=3 para 7-rac).

Figura 11: Biodistribución [ %ID/g] de 18F-rhPsMA coinyectado con PMPA (8 mg/kg) a 1 h p.i en ratones SCID portadores de tumor LNCaP. Los datos se expresan como la media ± SD (n=3).

Figura 12: Posibles especies generadas por escisión metabólica de enlaces amida. iL: la escisión forma una especie con mayor lipofilicidad; DF: desfluoración; nd: no detectable, ya que no es radioactivo. Figura 13: Izquierda: Análisis gráfico de los picos superpuestos 1 (rhPSMA7.2) y 2 (rhPSMA7.3); derecha:

deconvolución e integración de perfiles de pico con el software Systat PeakFit); arriba: datos experimentales ajustados, parte inferior: picos únicos deconvolucionados.

Figura 14a: Cuantificación de los cambios relativos (en % de cambio de la mezcla racémica inyectada) para evaluar la reproducibilidad de la integración clásica (por programa de HPLC) y deconvolución (por 'PeakFit') del pico 4 (rhPSMA7.1). Ambos métodos demuestran un rendimiento similar para este pico.

Figura 14b: Cuantificación de los cambios relativos (en % de cambio de la mezcla racémica inyectada) para evaluar la reproducibilidad de la integración clásica (por programa de HPLC) y deconvolución (por 'PeakFit') del pico 3 (rhPSMA7.4). Ambos métodos demuestran un rendimiento similar para este pico.

Figura 15: Cambio porcentual de cada isómero rhPSAM7.1-7.4 en sangre, hígado, riñón, tumor y orina con respecto a su proporción en la solución inyectada ([18F][natGa]rhPSMA7-rac. Los datos se expresan como valores medios ± SD (n=4; ver también la Figura 16).

Figura 16: Cambio porcentual de cada isómero rhPSAM7.1-7.4 para cada muestra y experimento) en sangre, hígado, riñón, tumor y orina con respecto a su proporción en la solución inyectada ([18F][natGa]rhPSMA7-rac). Los análisis se llevaron a cabo con Systat PeakFit.

Figura 17: Izquierda: Perfil de escáner de TLC de una placa de TLC con muestra de hígado (30.07.2018, total de cts: 142 cts). Debido a sus malas estadísticas y validez limitada, se eliminó el conjunto de datos con cts<200. Derecha: Fosfoimagen de una placa de TLC con muestra de hígado: cola larga del trazador en movimiento.

Figura 18: Izquierda: Perfil de escáner de TLC de una placa de TLC con una muestra de control de calidad (01.08.2018, total de cts: 384). Derecha: Fosfoimagen ilustrativa de una placa de TLC con muestra de orina, riñón, hígado, tumor, sangre y QK.

Figura 19: Radio-TLC de [F-18]rhPSMA7-rac (30.07.2018) como parte del control de calidad en el Departamento de Medicina Nuclear antes de la aplicación clínica del trazador. Tenga en cuenta que incluso se observa una cola del trazador en el tampón de formulación (y, por tanto, en ausencia de proteínas). Figura 20: Cuantificación de [F-18]fluoruro libre y [F-18]rhPSMA7-rac 'intacto' mediante radio-TLC de una muestra de orina (30.07.2018).

Figura 21: Izquierda: Análisis de radio-HPLC de orina recogida y combinada de 4 ratones normales a los que se les inyectó el trazador [F-18]rhPSAM-7.x respectivo. Derecha: Análisis de radio-HPLC de orina 'fría' enriquecida con el trazador [F-18]rhPSAM-7.x respectivo durante un período de 1 h (7.1., 7.2.), 0,5 h (7.3.) y 2 h (7.4.). Condiciones de HPLC: Solvente A: H₂O FA al 0,1 %; Solvente B: MeCN TFA al 0,1 %; Gradiente: 5 % isocrático 0-3 min, 25 - 35 % de B 3-43 min, 95 - 95 % de B 43-48 min; flujo: 1 ml/min, columna: Nucleosil 100-5 C18, 125 * 4,6 mm.

Figura 22: Separación de especies radioactivas en orina mediante fijación en cartucho y TLC. Arriba: Análisis de radio-HPLC de orina 30 min p.i. de [F-18]rhPSMA7.3 en ratones que muestra una pequeña proporción a los 1,6 min y trazador intacto a casi 34,5 min. Parte inferior (izquierda): la orina de los ratones, 30 min p.i. de [F-18]rhPSMA7.3, se diluyó y se sometió a la fijación en cartucho STRATA-X. El cartucho se lavó y eluyó con MeCN/agua (60/40 v/v TFA al 1 %); solo se detectó trazador intacto. Parte inferior (derecha): tanto el flujo pasante de la fijación en cartucho (componentes no retenidos) como la fracción finalmente eluida de MeCN/agua del cartucho se analizaron por TLC (parte inferior, derecha). Mientras que el 96,1 % de [F-18]rhPSMA7.3 y solo el 3,9 % de [F-18]fluoruro se encontraron en el eluato del cartucho, la relación inversa se encontró en el flujo pasante del cartucho (3,4 % de [F-18]rhPSMA7.3 y solo 96,6 % de [F-18]fluoruro).

Figura 23: A orina fresca y no radioactiva de ratones se añadió [F-18]rhPSMA7.3, seguido de 0,5 μmol de F-19-fluoruro frío; incubación durante 2 h. La radioactividad se convirtió completamente (98,5 %) en una fracción muy hidrófila que representaba el [F-18]fluoruro (pico a los 1,6 min). Nota: el pico a los 1,6 min se inmovilizó subsecuentemente en un cartucho QMAy se eluyó con NaCl (1 M) (=fluoruro). Figura 24: Biodistribución clínica y captación en lesiones tumorales de 18F-rhPSMA-7 (izquierda) y 18F-rhPSMA-7.3 (derecha) demostradas por SUVmáx. Los datos se expresan como la media ± SD.

Figura 25: Biodistribución clínica y captación en lesiones tumorales de 18F-rhPSMA-7 (izquierda) y 18F-rhPSMA-7.3

(derecha) demostradas por SUVmedio. Los datos se expresan como la media ± SD.

Figura 26. Biodistribución clínica y captación en lesiones tumorales de 18F-rhPSMA-7 (izquierda) y 18F-rhPSMA-7.3

(derecha) demostradas por la relación de SUVmáx respecto a la señal de fondo. Los datos se expresan como la media ± SD.

Figura 27: Biodistribución clínica y captación en lesiones tumorales de ¹⁸F-rhPSMA-7 (izquierda) y ¹⁸F-rhPSMA-7.3 (derecha) demostradas por la relación de SUVmedio respecto a la señal de fondo. Los datos se expresan como la media ± SD.

Figura 28: Dos ejemplos de casos clínicos de obtención de imágenes de PET con ¹⁸F-rhPSMA-7.3.

Los ejemplos ilustran la invención.

Ejemplo 1: Materiales y Métodos

El Fmoc-(9-fluorenilmetoxicarbonil-) y todos los demás análogos de aminoácidos protegidos se adquirieron de Bachem (Bubendorf, Suiza) o Iris Biotech (Marktredwitz, Alemania). La resina de poliestireno de cloruro de tritilo (TCP) se obtuvo de PepChem (Tübingen, Alemania). Chematech (Dijon, Francia) suministró los quelantes DOTAGA-anhídrido, (R)-DOTA-GA(tBu^{) 4} y (S)-DOTA-GA(í Bu)4. Todos los solventes necesarios y otros reactivos orgánicos se adquirieron de Alfa Aesar (Karlsruhe, Alemania), Sigma-Aldrich (Munich, Alemania) o VWR (Darmstadt, Alemania). La síntesis en fase sólida de los péptidos se llevó a cabo mediante operación manual mediante el uso de un agitador de jeringa Intelli-Mixer (Neolab, Heidelberg, Alemania). La cromatografía de alta presión de fase inversa (RP-HPLC) analítica y preparativa se realizó mediante el uso de sistemas de gradiente Shimadzu (Shimadzu Deutschland GmbH, Neufahrn, Alemania), cada uno equipado con un detector SPD-20A UV/Vis (220 nm, 254 nm). Se usó una columna Nucleosil 100 C18 (125 x 4,6 mm, tamaño de partícula de 5 ^m) (CS GmbH, Langerwehe, Alemania) para mediciones analíticas a un régimen de flujo de 1 ml/min. Tanto los gradientes específicos como los tiempos de retención correspondientes ír se mencionan en el texto. La purificación por HPLC preparativa se realizó con una columna Multospher 100 RP 18 (250 x 10 mm, tamaño de partícula de 5 ^m) (CS GmbH, Langerwehe, Alemania) a un régimen de flujo constante de 5 ml/min. La radio RP-HμLC analítica y preparativa se realizó mediante el uso de una columna Nucleosil 100 C18 (5 ^m, 125 x 4,0 mm) (CS GmbH, Langerwehe, Alemania). Los eluyentes para todas las operaciones de HPLC fueron agua (solvente A) y acetonitrilo (solvente B), ambos con un 0,1 % de ácido trifluoroacético. Los espectros de masas de ionización por electropulverización para la caracterización de las sustancias se adquirieron en un espectrómetro de masas L CMS de expresión (Advion Ltd., Harlow, Reino Unido). Los espectros de NMR se registraron en espectrómetros Bruker AVHD-300 o AVHD-400 a 300 K. Los valores de pH se midieron con un medidor de pH SevenEasy (Mettler Toledo, GieBen, Alemania).

Protocolos de síntesis

1) Síntesis de péptidos en fase sólida según la estrategia Fmoc

Carga de resina de TCP (GP1)

La carga de la resina de poliestireno de cloruro de tritilo (TCP) con un aminoácido (AA) protegido con Fmoc se llevó a cabo mediante la agitación de una solución de la resina de TCP (1,95 mmol/g) y Fmoc-AA-OH (1,5 eq.) en DCM anhidro con DIPEA (4,5 eq.) a temperatura ambiente durante 2 h. El cloruro de tritilo restante se protegió mediante la adición de metanol (2 ml/g de resina) durante 15 min. Subsecuentemente, la resina se filtró y se lavó con DCM (2 x 5 ml/g de resina), DMF (² x ⁵ ml/g de resina), metanol (5 ml/g de resina) y se secó al vacío. La carga final l de Fmoc-AA-OH se determinó mediante la siguiente ecuación:

m² = masa de resina cargada [g]

m¹ = masa de resina no cargada [g]

Mw = peso molecular de AA [g/mol]

MHCl = peso molecular de HCl [g/mol]

Formación de enlaces amida en la resina (GP2)

Para la conjugación de un elemento estructural al péptido unido a la resina, se usa una mezcla de TBTU y HOBT para la preactivación con DIPEA o 2,4,6-trimetilpiridina como base en DMF (10 ml/g de resina) durante 5 min. La estequiometría y el tiempo de reacción exactos para cada etapa de conjugación se proporcionan en el protocolo de síntesis. Después de la reacción, la resina se lavó con DMF (6 x 5 ml/g de resina).

Desprotección de Fmoc en la resina (GP3)

El péptido Fmoc unido a la resina se trató con piperidina al 20 % en DMF (v/v, ⁸ ml/g de resina) durante 5 min y, subsecuentemente, durante 15 min. Después de eso, la resina se lavó bien con DMF (⁸ x ⁵ ml/g de resina).

Desprotección de Dde en la resina (GP4)

El péptido protegido con Dde (1,0 eq.) se disolvió en una solución de monohidrato de hidrazina al 2 % en DMF (v/v, 5 ml/g de resina) y se agitó durante 20 min (GP4a). En el caso de los grupos Fmoc presentes, la desprotección de Dde se realizó mediante la adición de una solución de imidazol (0,92 g/g de resina), clorhidrato de hidroxilamina (1,26 g/g de resina) en NMP (5,0 ml) y DMF (1,0 ml) durante 3 h a temperatura ambiente (GP4b). Después de la desprotección, la resina se lavó con d Mf ( 8 x 5 ml/g de resina).

Escisión de péptidos de la resina con desprotección simultánea de grupos protectores lábiles al ácido (GP 5) El péptido unido a resina totalmente protegido se disolvió en una mezcla de TFA/TIPS/agua (v/v/v; 95/2,5/2,5) y se agitó durante 30 min. La solución se filtró y la resina se trató de la misma manera durante otros 30 min. Ambos filtrados se combinaron, se agitaron durante 5 h adicionales y se concentraron bajo una corriente de nitrógeno. Después de disolver el residuo en una mezcla de terc-butanol y agua y subsecuente liofilización, se obtuvo el péptido crudo.

Formación de complejos con natGa (GP6)

Para la formación de complejos con natGa, el péptido (1,0 eq.) se disolvió en una mezcla 3:1 (v/v) de tBuOH en H₂O y se añadió una solución acuosa de Ga(NO³⁾³ (3,5 eq.). Después de calentar la mezcla resultante durante 30 min a 75 °C, el péptido se purificó mediante RP-HPLC.

2) Síntesis del motivo de unión a PSMA

Glu-urea-Glu ((tBuO)EuE(OtBu)₂)

El motivo de unión Glu-urea-Glu (EuE) protegido con tBu se sintetizó de acuerdo con un procedimiento publicado previamente (esquema 1) para Glu-urea-Lys (EuK) protegido con tBu.

(1H-imidazol-1-carbonil)-L-glutamato de di-terc-butilo (i)

Una solución de DCM que contiene 2,0 g (7,71 mmol, 1,0 eq.) L-glutamato de I-di-ferc-butiloHCl se enfrió en hielo durante 30 min y después de eso se trató con 2,69 ml de TEA (19,28 mmol, 2,5 eq.) y 3,3 mg (0,3 mmol, 0,04 eq.) de DMAP. Después de la agitación adicional durante 5 min, se añadieron lentamente 1,38 g (8,84 mmol, 1,1 eq.) de 1,1'-carbonildiimidazol (CDI) disueltos en DCM durante un período de 30 min. La mezcla de reacción se agitó adicionalmente durante la noche y se dejó calentar hasta RT. La reacción se detuvo mediante el uso de 8 ml de NaHCO₃ saturado con etapas de lavado concomitantes de agua (2 ^x) y salmuera (2 ^x) y se secó en Na₂SO₄. El solvente restante se eliminó al vacío y el producto crudo 2-(1H-imidazol-1-carboxamido)pentanodioato de (5)-di-tercbutilo (i) se usó sin purificación adicional.

1 -(terc-butil) (((S)-1,5-di-terc-butoxi-1,5-dioxopentan-2-il)carbamoil)-L-glutamato de 5-bencilo (ii)

2,72 g (7,71 mmol, 1,0 eq.) del producto crudo 2-(1H-imidazol-1-carboxamido) pentanodioato de (S)-di-terc-butilo (i) se disolvieron en 1,2-dicloroetano (DCE) y se enfrió en hielo durante 30 min. A esta solución se le añadieron 2,15 ml (15,42 mmol, 2,0 eq.) de TEA y 2,54 g (7,71 mmol, 1,0 eq.) de H-L-Glu(OBzl)-OtBuHCl y la solución se agitó durante la noche a 40 °C. El solvente restante se evaporó y el producto crudo se purificó mediante el uso de cromatografía ultrarrápida en gel de sílice con una mezcla de eluyentes que contenía acetato de etilo/hexano/TEA (500:500:0,8; v/v/v). Después de eliminar el solvente, se obtuvo 5-bencil-1-(terc-butil)-(((S)-1,5-di-terc-butoxi-1,5-dioxopentan-2-il)carbamoil)-L-glutamato (ii) como un aceite incoloro.

(tBuO)EuE(OtBu)² (iii)

Para sintetizar (tBuO)EuE(OtBu)₂, 3,17 g (5,47 mmol, 1,0 eq.) de 5-bencil-1-(terc-butil)-(((S)-1,5-di-terc-butoxi-1,5-dioxopentan-2-il)carbamoil)-L-glutamato (ii) se disolvieron en 75 ml de EtOH y a esta solución se le administraron 0,34 g (0,57 mmol, 0,1 eq.) de paladio sobre carbón activado (10 %). El matraz que contenía la mezcla de reacción se purgó inicialmente con H² y la solución se agitó durante la noche a temperatura ambiente bajo presión ligera de H² (globo). El producto crudo se purificó a través de celite y el solvente se evaporó al vacío. El producto (iii) se obtuvo como un sólido higroscópico (84 %). HPLC

(10 % a 90 % de B en 15 min): ír = 11,3 min. Masa monoisotópica calculada (C23H49N₂O9): 488,3; encontrada: m/z = 489,4 [M+H]+, 516,4 [M+Na]+.

Esquema 1 Síntesis de(tBuO)EuE(OtBu)₂: a) DCI, TEA, DMAP (DCM); b) H-L-Glu(OBzl)-OtBuHCl, TEA

(DCE); c) Pd/C (10%), H₂ (EtOH).

3) Síntesis del aceptor de fluoruro de silicio

Ácido 4-(di-terc-butilfluorosilil)benzoico (SiFA-BA)

SiFA-BA se sintetizó de acuerdo con un procedimiento publicado previamente (esquema 2). Todas las reacciones se llevaron a cabo en recipientes de reacción secos bajo argón mediante el uso de un colector de gas al vacío.

((4-bromobencil)oxi)(terc-butil)dimetilsilano (i)

A una solución agitada de alcohol 4-bromobencílico (4,68 g, 25,0 mmol, 1,0 eq.) en DMF anhidro (70 ml) se añadieron imidazol (2,04 g, 30,0 mmol, 1,2 eq.) y TB^d M^s CI (4,52 g, 30,0 mmol, 1,2 eq.) y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 16 h. Después la mezcla se vertió en H²O enfriada con hielo (250 ml) y se extrajo con Et²O (5 * 50 ml). Las fracciones orgánicas combinadas se lavaron con NaHCO³ sat. ac. (2 * 100 ml) y salmuera (100 ml), se secaron, se filtraron y se concentraron al vacío para dar el producto crudo que se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida (sílice, EtOAc al 5 %/bencina) para dar i como un aceite incoloro (7,18 g, 95 %). 1H NMR (400 MHz, CDCl3): 8 [ppm] = 0,10 (6H, s, SiMe²t-Bu), 0,95 (9H, s, SiMe²tBu), 4,69 (2H, s, C ^O S i), 7,21 (2H, d), 7,46 (2H, d). HPLC (50 a 100 % de B en 15 min): tR =15 min.

Di-terc-butil{4-[(terc-butildimetilsililoxi)metil]fenil}fluorosilano (ii)

A -78 °C con agitación magnética, se añadió una solución de tBuLi en pentano (7,29 ml, 1,7 mol/l, 12,4 mmol 2,4 eq.) a una solución de ((4-bromobencil)oxi)(terc-butil)dimetilsilano (i) (1,56 g, 5,18 mmol, 1,0 eq.) en THF seco (15 ml). Después de agitar la mezcla de reacción durante 30 min a -78 °C, la suspensión obtenida se añadió gota a gota durante un período de 30 min a una solución enfriada (-78 °C) de di-terc-butildifluorosilano (1,12 g, 6,23 mmol, 1,2 eq.) en THF seco (10 ml). La mezcla de reacción se dejó calentar a temperatura ambiente durante un período de 12 h y después se hidrolizó con una solución saturada acuosa de NaCl (100 ml). La capa orgánica se separó y la capa acuosa se extrajo con éter dietílico (3 * 50 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron con sulfato de magnesio y se filtraron. El filtrado se concentró al vacío para proporcionar ii como un aceite amarillento (1,88 g, 95 %). Se usó para reacciones subsecuentes sin purificación adicional. Los espectros de NMR estaban de acuerdo con los datos informados en la bibliografía [2]. HPLC (50 a 100 % de B en 20 min): tR =19 min.

Alcohol 4-(di-terc-butilfluorosilanil)bencílico (iii)

Se añadió una cantidad catalítica de HCl acuoso concentrado (0,5 ml) a una suspensión de ii (1,88 g, 4,92 mmol, 1,0 eq.) en metanol (50 ml). La mezcla de reacción se agitó durante 18 h a temperatura ambiente y después se eliminaron el solvente y los volátiles bajo presión reducida. El residuo se volvió a disolver en éter dietílico (40 ml) y la solución se lavó con solución saturada acuosa de NaHCO³. La capa acuosa se extrajo con éter dietílico (3 * 50 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron con sulfato de magnesio y se filtraron. El filtrado se concentró al vacío para proporcionar iii como un aceite amarillento (1,29 g, 98 %) que se solidificó. El producto se usó sin purificación adicional. Los espectros de NMR estaban de acuerdo con los datos informados en la bibliografía [2]. HPLC (50 a 100 % de B en 15 min): tR = 8,2 min.

4-(Di-terc-butilfluorosilil)benzaldehído (iv)

Se añadió gota a gota una solución del alcohol iii (1,37 g, 5,10 mmol, 1,0 eq.) en diclorometano seco (20 ml) a una suspensión agitada y enfriada con hielo de clorocromato de piridinio (2,75 g, 12,8 mmol, 2,5 eq.) en diclorometano seco (60 ml). Después de agitar la mezcla de reacción durante 30 min a 0 °C y durante 2,5 h a temperatura ambiente, se añadió éter dietílico anhidro (40 ml) y la solución sobrenadante se decantó del material negro similar a una goma negra. El material insoluble se lavó bien con éter dietílico y las fases orgánicas combinadas se pasaron a través de una almohadilla corta de gel de sílice (10 cm por g de producto crudo) para la filtración. Los solventes se eliminaron al vacío para producir el aldehído iv como un aceite amarillento (1,31 g, 96 %). Los espectros de NMR estaban de acuerdo con los datos informados en la bibliografía [2]. HPLC (50 a 100 % de B en 15 min): ír = 10,5 min. Ácido 4-(di-terc-butilfluorosilil)benzoico (v)

A temperatura ambiente, se añadió KMnO₄ acuoso 1 M (30 ml) a una mezcla de iv (1,31 g, 4,92 mmol, 1,0 eq.), tercbutanol (30 ml), diclorometano (3,3 ml) y tampón NaH₂Po4 H₂O 1,25 M (20 ml) a pH 4,0-4,5. Después de agitar la mezcla durante 25 min, esta se enfrió hasta 5 °C, con lo cual se añadió KMnO₄ en exceso (0,78 g, 4,92 mmol, 1,0 eq.). Después la reacción se inactivó mediante la adición de solución saturada acuosa de Na₂SO₃ (50 ml). Tras la adición de HCl acuoso 2 M, todo el MnO₂ se disolvió. La solución resultante se extrajo con éter dietílico (3 * 100 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con solución saturada acuosa de NaHCO₃, se secaron con MgSO⁴ , se filtraron y se concentraron a presión reducida para proporcionar un sólido blanco, que se purificó por recristalización en Et²O/n-hexano (1:3, durante 12 h) para dar v (0,84 g, 60 %). Los espectros de NMR estaban de acuerdo con los datos informados en la bibliografía [2]. HPLC (50 a 100 % de B en 15 min): ír = 8,5 min.

Esquema 2 Síntesis de SiFA-BA: a)TBDMSCl, imídazol (DMF); b) tBuLi, dí-terc-butíldífluorosílano (THF); c) HCl (MeOH); d) clorocromato de piridinio (DCM); e) KMnC ^>4 (DCM, te/r-butanol, tampón de NaH₂P04)

4) Síntesis de rhPSMA-7.1 - 7.4

Las primeras etapas de síntesis para la preparación de los cuatro isómeros diferentes de rhPSMA-7 son idénticas y se llevan a cabo juntas, mediante la aplicación del protocolo de Fmoc-SPPS estándar descrito anteriormente, a partir de Fmoc-D-Orn(Dde)-OH unido a resina. Después de la escisión del grupo Fmoc con piperidina al 20 % en DMF (GP3), se conjugó (tBuO)EuE(OíBu⁾² (2,0 eq.) con HOAt (2,0 eq.), TBTU (2,0 eq.) y DIPEA (6,0 eq.) en DMF durante 4,5 h. Después de la escisión del grupo Dde con una mezcla de hidrazina al 2 % en DMF (GP4a), se añadió una solución de anhídrido succínico (7,0 eq.) y DIPEA (7,0 eq.) en DMF y se dejó reaccionar durante 2,5 h. La conjugación de Fmoc-D-Lys(OtBu)-HCl (2,0 eq.) se logró mediante la adición de una mezcla de HOAt (2,0 eq.), TBTU (2,0 eq.) y DIPEA (6,0 eq.) en DMF a la resina. Después de la preactivación durante 5 min, se añadió Fmoc-D-Lys(OtBu)HCl (2,0 eq.) disuelto en DMF y se dejó reaccionar durante 2,5 h (GP2). Se realizó la escisión subsecuente del grupo Fmoc, mediante la adición de una mezcla de piperidina al 20 % en DMF (GP3). Por último, la resina se dividió para sintetizar rhPSMA-7.1-7.4 (esquema 3).

rhPSMA-7.1 (D-Dap-(R)-DOTA-GA):

Se preactivó Fmoc-D-Dap(Dde)-OH (2,0 eq.) en una mezcla de HOAt (2,0 eq.), TBTU (2,0 eq.) y 2,4,6-trimetilpiridina (6,7 eq.) en DMF y se añadió al péptido unido a la resina durante 2,5 h. La desprotección ortogonal de Dde siguiente se realizó mediante el uso de imidazol y clorhidrato de hidroxilamina disueltos en una mezcla de NMP y DMF durante 3 h. Se hizo reaccionar SiFA-BA (1,5 eq.) con la amina libre de la cadena lateral con HOAt (1,5 eq.), TBTU (1,5 eq.) y DIPEA (4,5 eq.), como reactivos de activación en DMF durante 2 h. Después de la desprotección de Fmoc con piperidina (GP3), se conjugó (R)-DOTA-GA(tBu⁾⁴ (2,0 eq.) con HOAT (2,0 eq.), TBTU (2,0 eq.) y 2,4,6-trimetilpiridina (6,7 eq.) en ^d M^f durante 2,5 h. La escisión de la resina con la desprotección simultánea de los grupos protectores lábiles al ácido se realizó en TFA, de acuerdo con GP5. Se llevó a cabo la formación de complejos del péptido con natGa, como se describió en GP6.

rhPSMA-7.2 (L-Dap-(R)-DOTA-GA):

Se preactivó Fmoc-L-Dap(Dde)-OH (2,0 eq.) en una mezcla de HOAt (2,0 eq.), TBTU (2,0 eq.) y 2,4,6-trimetilpiridina (6,7 eq.) en DMF durante 2,5 h. Después de la desprotección ortogonal de Dde, se llevó a cabo la conjugación de SiFA-BA y la escisión de Fmoc como se describió para rhPSMA-7.1. Se conjugó (R)-DOTAGA(tBu)4 (2,0 eq.) con HOAT (2,0 eq.), TBTU (2,0 eq.) y 2,4,6-trimetilpiridina (6,7 eq.) en DMF durante 2,5 h. La escisión de la resina con la desprotección simultánea de los grupos protectores lábiles al ácido se realizó en TFA de acuerdo con GP5. Se llevó a cabo la formación de complejos del péptido con natGa, como se describió en GP6.

rhPSMA-7.3 (D-Dap-(S)-DOTA-GA):

Se preactivó Fmoc-D-Dap(Dde)-OH (2,0 eq.) en una mezcla de HOAt (2,0 eq.), TBTU (2,0 eq.) y 2,4,6-trimetilpiridina (6,7 eq.) en DMF durante 2,5 h. Después de la desprotección ortogonal de Dde, se llevó a cabo la conjugación de SiFA-BA y la escisión de Fmoc como se describió para rhPSMA-7.1. Se conjugó (S)-DOTAGA(tBu)4 (2,0 eq.) con HOAT (2,0 eq.), TBTU (2,0 eq.) y 2,4,6-trimetilpiridina (6,7 eq.) en DMF durante 2,5 h. La escisión de la resina con la desprotección simultánea de los grupos protectores lábiles al ácido se realizó en TFA de acuerdo con GP5. Se llevó a cabo la formación de complejos del péptido con natGa, como se describió en GP6.

rhPSMA-7.4 (L-Dap-(S)-DOTA-GA):

Se preactivó Fmoc-L-Dap(Dde)-OH (2,0 eq.) en una mezcla de HOAt (2,0 eq.), TBTU (2,0 eq.) y 2,4,6-trimetilpiridina (6,7 eq.) en DMF durante 2,5 h. Después de la desprotección ortogonal de Dde, se llevó a cabo la conjugación de SiFA-BA y la escisión de Fmoc como se describió para rhPSMA-7.1. Se conjugó (S)-DOTAGA(tBu⁾⁴ (2,0 eq.) con HOAT (2,0 eq.), TBTU (2,0 eq.) y 2,4,6-trimetilpiridina (6,7 eq.) en DMF durante 2,5 h. La escisión de la resina con la desprotección simultánea de los grupos protectores lábiles al ácido se realizó en TFA de acuerdo con GP5. Se llevó a cabo la formación de complejos del péptido con natGa, como se describió en GP6.

rhPSMA-7.1:

HPLC (10 a 70 % de B en 15 min): tR = 10,5 min.

HPLC (25 a 35 % de B en 40 min): tR = 31,4 min.

rhPSMA-7.2:

HPLC (10 a 70 % de B en 15 min): tR = 10,4 min.

HPLC (25 a 35 % de B en 40 min): tR = 27,9 min.

rhPSMA-7.3:

HPLC (10 a 70 % de B en 15 min): tR = 10,4 min.

HPLC (25 a 35 % de B en 40 min): tR = 28,1 min.

rhPSMA-7.4:

HPLC (10 a 70 % de B en 15 min): tR = 10,5 min.

HPLC (25 a 35 % de B en 40 min): tR = 29,1 min.

rhPSMA-7.1-7.4:

Masa monoisotópica calculada (C63H96FGaN1₂O₂5Si): 1536,6 encontrada: m/z = 1539,4 [M+H]+, 770,3 [M+2H]2+.

Esquema 3 Síntesis de rhPSMA-7.1-7.4: a) piperidina al 20 % (DMF); b) (tBuO)EuE(OtBu)₂, HOAt, TBTU, DIPEA, (DMF); c) hidrazina al 2 % (DMF); d) anhídrido succínico, DIPEA (DMF); e) Fmoc-D-Lys(OtBu) FICI, HOAt, TBTU, DIPEA (DMF); f 1) Fmoc-D-Dap(Dde)-OH, HOAt, TBTU, 2,4,6-colidina, (DMF); f 2) Fmoc-L-Dap(Dde)-OH, HOAt, TBTU, 2,4,6-colidina, (DMF); g) imidazol, clorhidrato de hidroxilamina, (NMP, DMF); h) SiFA-BA, HOAt, TBTU, DIPEA (DMF); il) (R)-DOTA-GA(tBu)4, HOAt, TBTU, 2,4,6-colidina (DMF); i2) (S)-DOTA-GA(tBu)4, HOAt, TBTU, 2,4,6-colidina (DMF); j) escisión y desprotección: TFA, TIPS, H20 ; k) Ga(N03)₃, (tBuOH, H20).

5) Mareaje con 18F

Para el mareaje con 18F se aplicó un procedimiento publicado previamente, que se modificó ligeramente. Brevemente, se hizo pasar 18F- acuoso a través de un cartucho SAX (Sep-Pak Accell Plus QMA Carbonato ligero), el cual se preacondicionó con 10 ml de agua. Después de secar con 10 ml de aire, se eliminó el agua, mediante enjuague del cartucho con 10 ml de acetonitrilo anhidro seguido de 20 ml de aire. El 18F se eluyó con 100 μmol de [K+c2.2.2]OH‘ disuelto en 500 μl de acetonitrilo anhidro. Antes del marcaje, se añadieron 30 pmo! de ácido oxálico en acetonitrilo anhidro (1 M, 30 μl). Esta mezcla se usó en su totalidad o en alícuotas para la fluoración de 10-25 nmol de PSMA-SiFA (1 mM en DMSO anhidro). La mezcla de reacción resultante se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente. Para la purificación del trazador, se usó un cartucho Sep-Pak C18 ligero, preacondicionado con 10 ml de EtOH, seguido de 10 ml de H₂O. La mezcla de marcaje se diluyó con 9 ml de PBS (pH 3) y se pasó a través del cartucho seguido de 10 ml de H²O. El péptido se eluyó con 500 μl de una mezcla 4:1 (v/v) de EtOH en agua. La pureza radioquímica del compuesto marcado se determinó mediante radio RP-HPLC y radio-TLC (gel de sílice 60 R^p -18 F²⁵⁴s, fase móvil: mezcla 3:2 (v/v) de MeCN en H²O suplementada con 10 % de NaOAc acuoso 2 M y 1 % de TFA).

6) Marcaje de 125I

El ligando de referencia para estudios in vitro ([125I]I-BA)KuE se preparó de acuerdo con un procedimiento publicado previamente. Brevemente, se disolvieron 0,1 mg del precursor estannilado (SnBu3-BA)(OtBu)KuE(OtBu)² en una solución que contenía 20 μl de ácido peracético, 5,0 μl (21 MBq) [125I]NaI (74 TBq/mmol, 3,1 GBq/ml, NaOH 40 mM, Hartmann Analytic, Braunschweig, Alemania), 20 μl de MeCN y 10 μl de ácido acético. La solución de reacción se incubó durante 10 min a RT, se cargó en un cartucho y se enjuagó con 10 ml de agua (cartucho C18 Sep Pak Plus, preacondicionado con 10 ml de MeOH y 10 ml de agua). Después de la elución con 2,0 ml de una mezcla 1:1 (v/v) de EtOH/MeCN, la solución radioactiva se evaporó hasta sequedad bajo una corriente suave de nitrógeno y se trató con 200 μl de TFA durante 30 min con la evaporación subsecuente de TFA. El producto crudo de ([125I]I-BA)KuE se purificó por RP-HPLC (20 % a 40 % de B en 20 min): tR = 13,0 min.

Experimentos in vitro

1) Determinación de IC⁵⁰

Las células LNCaP positivas para PSMA se cultivaron en medio Eagle modificado de Dublecco/Mezcla nutritiva F-12 con Glutamax-I (1:1) (Invitrigon), suplementado con suero fetal de ternera al 10 % y mantenidas a 37 °C en una atmósfera humidificada de 5 % de CO². Para la determinación de la afinidad por PSMA (IC⁵⁰), las células se cosecharon 24 ± 2 horas antes del experimento y se sembraron en placas de 24 pocillos (1,5 * 105 células en 1 ml/pocillo). Después de eliminar el medio de cultivo, las células se trataron una vez con 500 μl de HBSS (solución salina equilibrada de Hank, Biochrom, Berlín, Alemania, con la adición de albúmina sérica bovina (BSA) al 1 %) y se dejaron 15 min en hielo para que se equilibraran en 200 μl de HBSS (BSA al 1 %). A continuación, se añadieron 25 μl por pocillo de soluciones, que contenían HBSS (BSA al 1 %, control) o el ligando respectivo en concentración creciente (10'1° - 10'4 M en HBs S, con la subsecuente adición de 25 μl de ([125I]I-BA)KuE (2,0 nM) en HBSS (BSA al 1 %). Todos los experimentos se realizaron al menos tres veces para cada concentración. Después de 60 min de incubación en hielo, el experimento finalizó mediante la eliminación del medio y enjuague consecutivo con 200 μl de HBSS. Los medios de ambas etapas se combinaron en una fracción y representan la cantidad de radioligando libre. Después de eso, las células se lisaron con 250 μl de NaOH 1 M y se unieron con los 200 μl de HBSS de la siguiente etapa de lavado. La cuantificación del radioligando unido y libre se realizó en un contador y.

2) Internalización

Para los estudios de internalización, las células LNCaP se cosecharon 24 ± 2 horas antes del experimento y se sembraron en placas de 24 pocillos (1,25 * 105 células en 1 ml/pocillo). Subsecuentemente a la eliminación del medio de cultivo, las células se lavaron una vez con 500 μl de DMEM-F12 (BSA al 5 %) y se dejaron equilibrar durante al menos 15 min a 37 °C en 200 μl de DMEM-F12 (BSA al 5 %). Cada pocillo se trató con 25 μl de D^m EM-F12 (BSA al 5 %) o una solución de PMPA 100 μM para el bloqueo. A continuación, se añadieron 25 μl del inhibidor de PSMA marcado con 68Ga/18F (5,0 nM) y las células se incubaron a 37 °C durante 60 min. El experimento finalizó al colocar la placa de 24 pocilios en hielo durante 3 min y eliminar consecutivamente el medio. Cada pocilio se enjuagó con 250 j l de HBSS y las fracciones de estas dos primeras etapas se combinaron, lo que representa la cantidad de radioligando libre. La eliminación de la actividad unida a la superficie se realizó mediante la incubación de las células con 250 j l de solución de PMPA enfriada con hielo (10 jM en PBS) durante 5 min y se enjuagó de nuevo con otros 250 j l de PBS enfriado con hielo. La actividad internalizada se determinó mediante la incubación de las células en 250 j l de NaOH 1 M y la combinación con la fracción de una etapa de lavado subsecuente con 250 j l de NaOH 1,0 M. Cada experimento (control y bloqueo) se realizó por triplicado. La actividad libre, unida a la superficie e internalizada se cuantificó en un contador y. Todos los estudios de internalización estuvieron acompañados de estudios de referencia mediante el uso de ([125I]I-BA)KuE (c = 0,2 nM), que se realizaron de manera análoga. Los datos se corrigieron para la internalización no específica y se normalizaron respecto a la internalización específica observada para el compuesto de referencia radioyodado.

3) Coeficiente de reparto en octanol-agua

Se disolvió aproximadamente 1 MBq del trazador marcado en 1 ml de una mezcla 1:1 (en volúmenes) de solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) y n-octanol en un tubo Eppendorf. Después de mezclar vigorosamente la suspensión durante 3 minutos a temperatura ambiente, el vial se centrifugó a 15000 g durante 3 minutos (Biofuge 15, Heraus Sepatech, Osterode, Alemania) y se midieron alícuotas de 100 j l de ambas capas en un contador gamma. El experimento se repitió al menos seis veces.

4) Unión a HSA

Para la determinación de la unión a HSA, se usó una columna Chiralpak HSA (50 * 3 mm, 5 jm , H13H-2433) a un régimen de flujo constante de 0,5 ml/min. La fase móvil (A: NH⁴OAc, 50 mM en agua, pH 7 y B: isopropanol) se preparó fresca para cada experimento y solo se usó durante un día. La columna se mantuvo a temperatura ambiente y cada ejecución se detuvo después de la detección de la señal para reducir el tiempo de adquisición. Todas las sustancias se disolvieron en una concentración de 0,5 mg/ml en 50 % de 2-propanol y 50 % de tampón de acetato de amonio 50 mM pH 6,9. Las sustancias de referencia elegidas muestran un intervalo de unión a HSA de 13 % a 99 % ya que se asumió una amplia variedad de unión a albúmina con respecto a los péptidos. Las nueve sustancias de referencia se inyectaron consecutivamente para establecer una regresión no lineal con OriginPro 2016G.

Tabla 1: Sustancias de referencia usadas para la calibración de la columna con HSA.

El tiempo de retención se muestra de manera ilustrativa para un experimento realizado; tR tiempo de retención; Bib. valor de HSA en la bibliografía de la unión a la albúmina sérica humana en [%]; Log K HAS K logarítmica de unión a la albúmina sérica humana._____________________________________

Experimentos in vivo

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las normas generales de bienestar animal en Alemania y las directrices institucionales para el cuidado y uso de animales. Para establecer xenoinjertos tumorales, se suspendieron células LNCaP (107 células / 200 j l) en una mezcla 1:1 (v/v) de medio Eagle modificado de Dulbecco / Mezcla nutritiva F-12 con Glutamax-I (1:1) y Matrigel (BD Biosciences, Alemania), y se inocularon por vía subcutánea sobre el hombro derecho de ratones CB17-SCID de 6-8 semanas de edad (Charles River, Sulzfeld, Alemania). Los ratones se usaron cuando los tumores habían crecido hasta un diámetro de 5-8 mm (3-4 semanas después de la inoculación).

1) Biodistribución

Se inyectó aproximadamente 1-2 MBq (< 0,2 nmol) del inhibidor de PSMA marcado con 18F en la vena de la cola de ratones SClD CB-17 machos portadores de tumor LNCaP y se sacrificaron después de 1 h después de la inyección (n = 4-5). Los órganos seleccionados se extrajeron, se pesaron y se midieron en un contador y

2) Estudios metabólicos

a) Diseño analítico

La cromatografía analítica de alta presión de fase inversa (RP-HPLC) se realizó mediante el uso de sistemas de gradiente Shimadzu (Shimadzu Deutschland GmbH, Neufahrn, Alemania), equipados con un detector SPD-20A UV/Vis (220 nm, 254 nm). Se usó una columna Multospher 100 RP18 (125 * 4,6 mm, tamaño de partícula de 5 |jm) (CS GmbH, Langerwehe, Alemania) para las mediciones analíticas a un régimen de flujo de 1 ml/min. Los eluyentes para todas las operaciones de HPLC fueron agua (solvente A) y acetonitrilo (solvente B), ambos contenían ácido trifluoroacético al 0,1 %. La radioactividad se detectó mediante la conexión de la salida del fotómetro UV a un detector HERM LB 500 (Berthold Technologies GmbH, Bad Wildbad, Alemania). El gradiente para todas las operaciones de HPLC fue: 5 % de B isocrático 0-3 min, 25 - 35 % de B 3-43 min, 95 - 95 % de B 43-48 min.

Para radiocromatografía en capa fina, se usaron láminas de aluminio recubiertas con gel de sílice 60 RP-18 F²⁵⁴ con una fase móvil que consistía en una mezcla 3:2 (v/v) de MeCN en H²O suplementada con 10 % de NaOAc 2 M acuoso y 1 % de TFA. El análisis se realizó mediante el uso de un detector de radio-TLC Scan-RAM (LabLogic Systems Ltd., Sheffield, Reino Unido) o un generador de imágenes de fósforo CR 35 BIO (Duerr Medical GmbH, Bietigheim-Bissingen, Alemania).

b) Determinación de la estabilidad metabólica de rhPSMA-7.1 - 7.4

Para estudios in vivo de jmetabolismo, se inyectaron 8-12 MBq (< 0,6 nmol) del ligando marcado con 18F respectivo (rhPSMA-7.1-7.4) en la vena de la cola de ratones CB17-SCID sanos hembras (n=4). Se dejó a los ratones bajo anestesia durante 30 min y se recogió la orina mediante el uso de un catéter vesical. Las muestras de orina se combinaron y se centrifugaron durante 5 min a 9000 rpm para eliminar los sólidos en suspensión. El sobrenadante se usó directamente para el análisis por radio-HPLc con las condiciones mencionadas anteriormente. Para demostrar que el intercambio isotópico de 19F con 18F unido a péptido está teniendo lugar en la orina, cada compuesto se incubó durante ciertos intervalos de tiempo con muestras de orina de ratones CB-17-SCID sanos hembras, que se analizaron por radio-HPLC y/o radio-TLC. Adicionalmente, este experimento se llevó a cabo con la adición de Na19F en exceso (0,5 jm ol) e incubación durante 2 h con rhPSMA-7.3 marcado con 18F.

c) Determinación de la distribución in vivo de rhPSMA-7.1 - 7.4

Para cuantificar la captación relativa de cada isómero (rhPSMA-7.1 - 7.4), se inyectó a un ratón CB-17-SCID macho portador de tumor la mezcla racémica de rhPSMA-7 (180-280 MBq, Sa = 247-349 GBq/jmol, producido en el Klinikum rechts der Isar en un procedimiento completamente automatizado). El animal se dejó bajo anestesia durante 30 min y se sacrificó. Se recogieron orina, sangre, hígado, riñones y tumor y se procesaron de acuerdo con los procedimientos descritos a continuación. La muestra de orina se centrifugó durante 5 min a 9000 rpm para producir una solución transparente y se sometió directamente a análisis de radio-HPLC. La sangre se diluyó a 1 ml con H²O y se centrifugó dos veces a 13000 g durante 5 min. El sobrenadante se recogió y se cargó en un cartucho Strata X (fase inversa polimérica de 33 jm , 500 mg, preacondicionado con 5 ml de MeOH, seguido de 5 ml de H²O). Después de lavar con 5 ml de H²O, el cartucho se eluyó con una mezcla 6:4 (v/v) de MeCN en H²O, suplementada con TFA al 1 %. El eluato se diluyó con agua y se analizó por radio-HPLC. El tumor, los riñones y el hígado se homogeneizaron mediante el uso de un triturador de tejidos Potter-Elvehjem (Kontes Glass Co, Vineland, EE. UU.) o un molino de bolas MM-400 (Retsch GmbH, Haan, Alemania).

I) Triturador de tejidos Potter-Elvehjem

El tumor y los riñones se homogeneizaron por separado en el homogeneizador de tejidos con 1 ml de tampón de extracción (850 j l de HEPES 1 M pH 7,4, 100 j l de PMPA 20 mM y 100 j l de NaCl 1 M) durante 30 min. El homogeneizado resultante se recogió y se centrifugó a 13 000 g durante 5 min. Subsecuentemente se recogió el sobrenadante, se centrifugó nuevamente (13 000 g, 5 min) y se cargó en un cartucho Strata X (fase inversa polimérica de 33 jm , 500 mg, preacondicionado con 5 ml MeOH, seguido de 5 ml de H²O). Después de lavar con 5 ml de H²O, el cartucho se eluyó con una mezcla 6:4 (v/v) de MeCN en H²O, suplementada con TFA al 1 %. El eluato de cada órgano se diluyó con agua y se analizó por radio-HPLC.

II) Molino de bolas MM-400

Los órganos (tumor, riñón, hígado) se homogeneizaron por separado en un tubo de 2 ml junto con 3 bolas trituradoras (3 mm de diámetro) y 1 ml de tampón de extracción (850 j l de HEPES 1 M pH 7,4, 100 j l de PMPA 20 mM y 100 j l de NaCl 1 M) durante 10 min a 30 Hz. El homogeneizado se centrifugó a 13000 g durante 5 min y el sobrenadante se recogió. Subsecuentemente, el sedimento se suspendió en 1 ml de tampón de extracción y se homogeneizó nuevamente con el molino de bolas durante 10 min a 30 Hz. Después de la centrifugación (13 000 g, 5 min), ambos sobrenadantes se combinaron y se cargaron en un cartucho Strata X (fase inversa polimérica de 33 jm , 500 mg, preacondicionado con 5 ml de MeOH, seguido de 5 ml de H²O). Después de lavar con 5 ml de H²O, el cartucho se eluyó con una mezcla 6:4 (v/v) de MeCN en H²O, suplementada con TFA al 1 %. El eluato de cada órgano se diluyó con agua y se analizó por radio-HPLC. Para demostrar que el flujo pasante durante la carga del cartucho no es un resultado de F-18 no unido, el sobrenadante también se examinó mediante radio-TLC después de la centrifugación.

Por último, las relaciones de los isómeros individuales se determinaron a partir de los perfiles de HPLC de las muestras extraídas y se compararon con las relaciones de los isómeros del control de calidad de la mezcla racémica de rhPSMA-7. La eficiencia de extracción y carga del cartucho corregida respecto a la descomposición, así como también la actividad extraída total de las muestras examinadas se proporcionan en la tabla 2. La eficiencia de elución del cartucho fue >99 % para todos los experimentos.

Ejemplo 2: Resultados

Asignación de picos cromatográficos

La asignación de picos cromatográficos se realizó por comparación de los perfiles UV de

a) la mezcla de rhPSMA7-rac con

b) la mezcla de rhPSMA7-rac inyectada con cada compuesto enantiopuro de rhPSMA7.

Los siguientes nombres se usan para los diferentes isómeros:

rhPSMA-rac [19F][natGa]D/L-Dap-R/S-DOTAGA-rhPSMA7

rhPSMA-7-1 [19F][natGa]D-Dap-R-DOTAGA-rhPSMA7

rhPSMA-7-2 [19F][natGa]L-Dap-R-DOTAGA-rhPSMA7

rhPSMA-7-3 [19F][natGa]D-Dap-S-DOTAGA-rhPSMA7

rhPSMA-7-4 [19F][natGa]L-Dap-S-DOTAGA-rhPSMA7

Tabla 2: Asignación de los diferentes isómeros, nombres, tiempos de retención típicos (las condiciones de HPLC se proporcionan en la Figura 2a-4b y el porcentaje de cada isómero en una mezcla típica de rhPSAM7-rac). La cantidad exacta puede variar para cada isómero.

Afinidades de unión

El primer conjunto de valores (rhPSMA-7.1 y rhPSMA-7.2; Figura 6a) se determinó mediante el uso de series de diluciones de una solución obtenida directamente después de la formación de complejos de natGa con el ligando respectivo. En el segundo conjunto de datos (Figura 6b), los ligandos en complejo se purificaron mediante RP-HPLC para separar las sales de natGa que no forman complejos. Dado que no se observaron diferencias significativas, se fusionaron ambas series y se usaron para el cálculo de los valores medios (±SD).

Tabla 3: Representación de las mediciones de IC⁵⁰[nM] individuales (como se muestra en las Figuras 6a y 6b). Condiciones como se describió en la leyenda de la Figura 6a.

Tabla 4: Afinidades de unión (IC⁵⁰ [nM]) de otros inhibidores de PSMA seleccionados (*).

* llevado a cabo en nuestro laboratorio mediante el uso del ensayo de unión idéntico (Robu y otros EJNMMI Research 2018; 8:30).____________________________________________________________ Estudios de internalización

Tabla 5: Representación de las tasas de internalización individuales [% de [125I]IB-KuE].

Tabla 6: Valores de internalización [% de [125I]IB-KuE] de otros inhibidores de PSMA seleccionados (*).

____________________________________________________________

Lipofilicidades (Coeficiente de reparto en octanol-agua)

La determinación de los valores de logP se llevó a cabo en solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) y noctanol (= logPoct/PBS).

Tabla 7: Mediciones de log P individuales para los isómeros de rhPSMA7 7.1-7.4, determinadas en mezclas de octanol / PBS^{7 4}.

Tabla 8: valores de log P de PSMA-1007, DCFPYL, rhPSMA7-rac y los isómeros rhPSAM7.1-7.4; (n = 6), octanol/PBS7,4.

Unión de inhibidores de PSMAa proteína plasmática humana

Tabla 9: Unión a HSA de PSMA-1007, DCFPYL, rhPSMA7-rac y los isómeros rhPSAM7.1-7.4; (n = 6). Determinada en una columna Chiralpak HSA (50 * 3 mm, 5 μm, H13H-2433).

Biodistribución de [18F][natGa]rhPSMA7.1-7.4 a 1 h pi

Biodistribución de [18F][natGa]rhPSMA7.1-7.4 a 1 h pi con competencia

Tabla 11: Biodistribución [% ID/g] de trazadores rhPSMA marcados con 18F coinyectados con PMPA(8 mg/kg) a 1 h p.i en ratones SCID portadores de tumores LNCaP. Los datos se expresan como la media ± SD (n=3).

Cuantificación de los cambios relativos de la cantidad de cada isómero rhPSMA7.x en sangre, riñón, hígado, orina y tumores después de la aplicación de [18F]rhPSMA7-rac

Con el objetivo de cuantificar los cambios relativos de cada isómero de rhPSMA7 en sangre, hígado, riñón, orina y tumor 30 min después de la inyección de [18F]rhPSMA7-rac en un ratón portador de tumor LNCaP, se usaron dos métodos de homogeneización diferentes (un triturador de tejidos Potter y un molino de bolas) para extraer el trazador de riñón, hígado y tejido tumoral (ver Materiales y Métodos).

La Tabla 12 resume las eficiencias observadas para ambos métodos de homogeneización y la eficiencia del procedimiento de extracción en fase sólida subsecuente (para separar el trazador de la fracción proteica).

Tabla 12: Determinación de las actividades extraídas corregidas respecto a la descomposición de las muestras de tejido examinadas a través del triturador de tejidos Potter-Elvehjem (n = 1) y el molino de bolas MM-400 (n = 3). Triturador de tejidos Potter-Elvehjem (n = 1):

EFICIENCIA [%]

Mientras que la extracción de actividad de las muestras mediante el uso del triturador de tejidos Potter fue bastante eficiente, el uso del molino de bolas fue decepcionante. Sin embargo, incluso con el molino de bolas se alcanzó una eficiencia de extracción >60 %.

Teniendo en cuenta las posibles especies que podrían formarse mediante la escisión metabólica de los enlaces amida de rhPSMA7, solo a) especies con una lipofilicidad significativamente mayor de b) F18-fluoruro parecen probables. Por tanto, en principio, parece posible que las especies "iL" representadas en la Figura 12 no se extraigan de la muestra de tejido (extracción acuosa) y, por tanto, no aparezcan en el análisis final. Sin embargo, se debe señalar que dichas especies aparecerían in vivo en el hígado y el intestino (excreción hepatobiliar de compuestos lipófilos) o deberían estar unidas a proteínas plasmáticas (lo que da como resultado niveles elevados de actividad para la sangre, que por otro lado mostró una eficiencia de extracción excelente).

Para la cuantificación de cada isómero en la mezcla racémica y especialmente para el primer y segundo pico mal separados (rhPSMA 7.2 y rhPSMA7.3) se usó inicialmente una aproximación gráfica. Este enfoque se basó en la suposición de que a) cada isómero se eluye de la columna de HPLC con una forma de pico idéntica y b) las diferentes alturas de los picos pueden usarse como primera aproximación para calcular por medio de factores lineales picos menos separados (es decir, rhPSMA 7.2 y rhPSMA7.3).

En base a estas suposiciones, el primer análisis se realizó mediante el uso de ratones portadores de tumores LNCaP a los que se les inyectó conjuntamente [18F][natGe]rhPSMA7-rac. Con el objetivo de validar estos experimentos por medio de tres experimentos adicionales y para mejorar los análisis gráficos mediante un procedimiento más válido, se usó el paquete de software Systat 'PeakFit'. PeakFit permite la separación no lineal, el análisis y la cuantificación automatizados de los perfiles de elución de HPL^c mediante procedimientos de deconvolución que usan una función de respuesta gaussiana con un algoritmo de deconvolución/filtrado de Fourier (https://systatsoftware.com/products/peakfit/).

Una comparación del análisis gráfico de los primeros experimentos reveló que el análisis gráfico sobrestimaba el segundo pico (rhPSMA7.3), mientras que el primer pico se subestimaba. En consecuencia, todos los conjuntos de datos se volvieron a analizar y cuantificar por medio de PeakFit.

Análisis HPLC de 4 experimentos independientes en ratones portadores de tumores 30 min p.i.

1. Evaluación del Pico 3 y 4 (rhPSMA7.4 y rhPSMA 7.1) mediante radio-HPLC

Primero se examinó si la técnica de deconvolución muestra datos similares para los dos últimos picos (rhPSMA7.4 y 7.1) que tienen una buena separación (aunque no están separados en la línea base).

2. Evaluación de todos los picos (rhPSMA7.1, 7.2, 7.3 y 7.4) mediante radio-HPLC

Las Figuras 14a y 14b resumen el cambio porcentual de cada isómero rhPSAM7.n en una muestra dada con respecto a su porcentaje en la solución inyectada ([18F][natGa]rhPSMA7-rac); los resultados para el experimento individual se muestran en la Figura 14. La proporción de cada isómero se cuantificó mediante análisis del perfil de elución de HPLC por Systat 'PeakFit'. Subsecuentemente, se calculó el cambio porcentual de cada isómero en una muestra dada con respecto a su porcentaje en la solución inyectada.

3. Análisis de los datos de HPLC

Los análisis de radio-HPLC de la radioactividad extraída de los tejidos homogeneizados (riñón, hígado, tumor) o diluidos (sangre) y subsecuentemente inmovilizados y eluidos del cartucho de extracción en fase sólida no mostraron signos de inestabilidad metabólica. Por tanto, no se observaron fragmentos metabólicos lipófilos. Se debe señalar que el F-18-fluoruro no se puede detectar con exactitud mediante HPLC en las condiciones usadas para la preparación de muestras (ver el análisis de TLC).

Aunque existe una clara tendencia hacia el derivado D-Dap de rhPSMA7.1 y 7.3, los cambios totales son bajos (máximo 15 %). También es importante destacar en este contexto que las Figuras 15 y 16 muestran "cambios relativos" sin tener en cuenta los valores absolutos de captación.

Aunque rhPSMA7.1 tiene la afinidad e internalización más débiles de todos los compuestos de rhPSMA7, muestra el mayor cambio porcentual positivo en sangre, hígado, riñón y tumor.

Aunque la razón de este resultado no está clara, se puede especular que la homogeneización de las muestras de tejido, incluso con el molino de bolas, no dio como resultado una ruptura celular cuantitativa. Por tanto, los trazadores rhPSMA7 con la internalización más alta (rhPSMA7.2: 191,83 % ± 15,54 %, rhPSMA7.4: 207,33 ± 4,06 % y rhPSMA7.3: 161,41 % ± 8,88 %) podrían haberse extraído de manera menos eficiente, mientras que rhPSMA7.1 con su baja internalización de solo 69,55 % ± 5,29 % se extrajo eficientemente y, en consecuencia, se sobrestima en el análisis de HPLC.

Además, parece que los compuestos rhPSMA 7.2 y 7.4 se excretan algo más rápidamente (ver los valores para orina). Estos compuestos muestran cambios generalmente negativos en tejidos sólidos y sangre, aunque ambos compuestos exhiben afinidades y tasas de internalización mayores en comparación con rhPSMA7.1. No está claro si esto podría deberse a la degradación metabólica de 7.2 y 7.4 (ambos son el derivado L-Dap), ya que no se han detectado metabolitos, es decir, metabolitos liofílicos. Sin embargo, podría ser posible que tales metabolitos (ver la Figura 11), debido a su alto valor de logP, no sean extraíbles en soluciones tampón acuosas. En este caso, deberían aparecer en el hígado (ver la biodistribución) y quizás en muestras de sangre (alta probabilidad de alta unión a proteínas séricas). Dado que no se ha observado una acumulación de actividad elevada para el tejido hepático en el transcurso de los estudios de biodistribución y la extracción de actividad de la sangre fue muy eficiente (ver la tabla 3), asumimos que no se produjo una degradación significativa de rhPSMA7.2 y 7.4. Esta suposición está respaldada por valores de SUV no sospechosos para el tejido hepático (vesícula biliar, intestino) en el contexto del uso clínico de [18F]rhpsma-rac en seres humanos.

Análisis de TLC en ratones portadores de tumores 30 min p.i.

El análisis de radio-TLC se llevó a cabo a) en muestras de orina al someter directamente un pequeño volumen a una tira de TLC, b) mediante el análisis de un pequeño volumen de la actividad no inmovilizada durante el proceso de SPE (la "fracción de flujo pasante"), y c) por análisis de un pequeño volumen de los eluatos del cartucho.

Tabla 13: Análisis de TLC de muestras de sangre, órganos y orina

(*) debido al bajo nivel de actividad, se han eliminado las mediciones de TLC con intensidad de señal <200 cts.

Análisis de los datos de TLC

Ya que es muy difícil detectar 18F-fluoruro n.c.a. por medio de cromatografía en RP-18 (debido a los grupos Si-OH libres de la matriz que interactúan con el fluoruro nca), se realizó una cromatografía en capa fina para investigar y cuantificar F-18-Fluoruro en las soluciones extraídas.

Dado que ninguno de los reactivos y las sales que se usan normalmente para la precipitación de proteínas se prueban para detectar fluoruro frío y evitar la posible liberación de F-18-fluoruro del trazador por intercambio isotópico, la precipitación de proteínas no se implementó en el proceso de preparación de muestras, aunque tal carga de proteínas a menudo da como resultado una separación de picos limitada, un alargamiento del pico y una actividad que se atasca en la línea de salida. Las soluciones obtenidas después de la extracción del tejido (o centrifugación de la sangre) se usaron directamente para el análisis de TLC.

Aunque la actividad disponible para el análisis fue bastante baja en todas las muestras, los resultados de TLC revelan que el contenido total de F-18-fluoruro estaba por debajo de aprox. 6 % en el tejido investigado, excepto:

- la muestra de orina obtenida el 30 de julio de 2018 (17,49 % de fluoruro libre),

- la muestra de hígado obtenida el 02 de agosto de 2018 (25,85 % de fluoruro libre).

Mientras que el análisis de la orina por TLC se considera un resultado válido (ver el perfil en la Figura 20), el resultado obtenido con la muestra de hígado se debe a un alargamiento extenso del pico que representa el trazador intacto (ver la Figura 18). Además, se puede concluir que el máx. de 6 % de fluoruro libre mencionado representa una sobreestimación, ya que el alargamiento del pico, incluso obtenido durante el QK y la liberación de [F-18]rhPSMA7-rac en PBS (Figura 18) para aplicación clínica, muestra un alargamiento del pico del producto. Como lo demuestran las fosfoimágenes, este alargamiento se observa en casi todos los análisis de TLC y contribuye al área integrada del F-18-fluoruro.

Se debe señalar que ni los estudios de biodistribución ni las exploraciones de PET clínicas en seres humanos (estado de julio de 2018: aprox. 1400 exploraciones con [F-18]rhPSMA7-rac) dieron como resultado ninguna acumulación de F-18 sospechosa o identificable en el hueso por F-18-fluoruro liberado. Para investigar más a fondo la liberación de F-18-fluoruro de [F-18]rhPSMA7-rac (como se observó en una muestra de orina), investigamos la aparición de F-18-Fluoruro en muestras de orina adicionales (ratones normales) por medio de HPLC en RP-18 (nueva columna RP-18 con extremos bloqueados) y análisis de TLC.

Análisis de radio-TLC de la formación de F-18-fluoruro en ratones normales 30 min p.i.

Para este propósito se usaron ratones normales. Las muestras de orina se recogieron por medio de un catéter durante un período de 30 min. La orina se centrifugó y se sometió directamente a HPLC y TLC.

Como se muestra en la Figura 21, columna izquierda, se encontró F-18-fluoruro libre en muestras de orina de todos los isómeros y también se forma cuando la orina fresca se "incuba con [F-18]rhPSMA7.4. (columna a la derecha). La identificación del F-18-fluoruro se realizó al demostrar que a) esta especie se retiene en los cartuchos QMA (no se muestran los datos), b) se eluye en el volumen muerto de las columnas RP-18 y c) no se puede retener ni movilizar en columnas RP-18 o placas de TLC RP-18, respectivamente, independientemente de las fases móviles usadas.

Debido al hecho de que no se detectaron cantidades tan altas de F-18-fluoruro en los análisis de HPLC de sangre u órganos, tales como riñones, tumor, hígado, etc., no se observó una captación de actividad elevada en hueso en los estudios de biodistribución en ratones y no se observó una captación de actividad elevada en hueso durante las exploraciones de PET clínicas con el compuesto [F-18]rhPSMA7-rac desde que se estableció [F-18]rhPSMA7-rac para exploración clínica a finales de 2017 en el TUM (estado a finales de julio, 2018: aprox. 1400 exploraciones de PET en pacientes con cáncer de próstata), concluimos que el [F-18]fluoruro podría formarse aguas abajo de la filtración glomerular del trazador, lo que da como resultado la formación y subsecuente excreción de [F-18]fluoruro SIN captación de F-18-fluoruro en sangre, órganos o huesos.

Esta suposición está respaldada por la bibliografía sobre la toxicología del fluoruro que describe cantidades relevantes de fluoruro en RIÑONES Y ORINA. Se observaron niveles normales de fluoruro urinario de 0,3 ppm en ratones (Bouaziz H y otros, Fluoride 2005;38(1):23-31). En otra publicación, se determinó que la concentración promedio de fluoruro en la orina de ratones normales era de 0,13-0,14 μg/ml (Poesina ND y otros Rom J Morphol Embryol 2014, 55(2):343-349) e Inkielewicz I. y otros encontraron que el contenido de fluoruro en el suero de ratas es aproximadamente el 5 % de la concentración de fluoruro en los riñones (suero: 0,051 μg/ml, riñones: 0,942 μg/ml) (Fluoride; 36 (4); 263-266). Teniendo en cuenta que la mayor parte del trazador se absorbe específicamente en y también se elimina fisiológicamente por los riñones, un nivel elevado de fluoruro en el riñón, combinado con una temperatura corporal de 36,6 °C, podría dar como resultado una eliminación continua de F-18-fluoruro de los compuestos rhPSMA en los riñones.

En consecuencia, las muestras de orina frescas y no radioactivas recogidas de ratones normales se incubaron con [F-18]rhPSMA7.x durante varios períodos de tiempo (ver la leyenda de la Figura 21). La Figura 22, columna derecha, demuestra claramente que la incubación de orina con [F-18]rhPSMA7.x EX VIVO da como resultado la formación de [F-18]fluoruro libre en varios grados, promovido por las diferentes concentraciones de F-19-Fluoruro frío en las muestras de orina y que aumentan con el tiempo.

Para respaldar aún más la hipótesis, se añadieron 500 nmol de F-19-fluoruro frío a orina fresca y no radioactiva de ratones, seguido de la adición de [F-18]rhPSMA7.3 e incubación durante 2 h. De acuerdo con la hipótesis, la alta concentración de [F-19]fluoruro debería dar como resultado la formación de una cantidad significativa de [F-18]fluoruro. La Figura 23 muestra que, en estas condiciones, el 98,5 % de la radioactividad se intercambia y forma [F-18]fluoruro en 2 h (Figura 23).

Dado que las tasas de intercambio isotópico dependen de la concentración de las cuatro especies relevantes en el equilibrio ([F-18]fluoruro, [F-19]fluoruro, [F-18]rhPSMA7.3 y [F-19]rhPSMA7.3), también se investigó, si la adición de [F-18]fluoruro a orina fresca y radioactiva (20,6 % de [F-18]Fluoruro, 79,4 % de [F-18]rhpsma7.3) seguido de la adición del trazador [F-19]rhPSMA7.3 frío también da como resultado el marcaje del radiofármaco [F-18]rhPSMA7-3. Inesperadamente, incluso una pequeña cantidad de 5 nmol de [F-19]rhPSMA7-3 en la orina anterior dio como resultado un aumento de [F-18]rhPSMA7.3 de 79,4 % a 85,8 % (F-18]fluoruro disminuyó de 20,6 % a 14,2 %) a temperatura ambiente.

Los resultados obtenidos por el intercambio isotópico en la orina se consideran representativos de todos los trazadores conjugados con el resto 4-(di-terc-butil[(18)F]fluorosilil)-bencil)oxi y, por tanto, de todos los isómeros de rhPSAM7.

Dosimetría preclínica, biodistribución en seres humanos y captación en lesiones tumorales

Tenga en cuenta que en lo siguiente 18F-rhPSMA-7 se refiere a natGa-18F-rhPSMA7-rac y 18F-rhPSMA-7.3 a natGa-18F-rhPSMA7.3

A) Dosimetría preclínica de 18F-rhPSMA-7 y 18F-rhPSMA-7.3 en ratones

El objetivo era evaluar la distribución y excreción de 18F-rhPSMA-7 y 18F-rhPSMA-7.3 en diferentes puntos de tiempo hasta 300 minutos después de una única administración intravenosa en ratones y realizar cálculos de dosimetría interna.

Métodos

Se inyectaron 3-5 ratones por punto de tiempo con una media de 25,6 ± 3,6 MBq de 18F-rhPSMA-7 y 28,5 ± 4,8 MBq de 18F-rhPSMA-7.3, respectivamente. Se usaron ratones con inmunodeficiencia combinada severa (SCID), para los experimentos. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las normas generales de bienestar animal en Alemania y las directrices institucionales para el cuidado y uso de animales.

Los ratones se sacrificaron en los siguientes puntos de tiempo:

18F-rhPSMA-7: 10, 20, 40, 60, 120 y 180 minutos después de la administración.

18F-rhPSMA-7.3: 10, 60, 120, 180 y 300 minutos después de la administración.

Tenga en cuenta que, de acuerdo con los experimentos iniciales que exhiben una captación renal en riñón prolongada para 18F-rhPSMA-7.3, se usó un punto de tiempo tardío (300 min) para los experimentos finales.

Se cosecharon los siguientes tejidos/fluidos:

Orina, sangre, corazón, pulmón, bazo, páncreas, hígado, estómago (vaciado), intestino delgado (vaciado), intestino grueso (vaciado), riñones, vejiga, testículos, grasa, músculo (parcial, femoral), fémur, cola y cerebro. La orina se recogió con una pipeta en la cámara de gas CO². En caso de falta de micción en la cámara, se aspiró la vejiga con una jeringa de insulina. La sangre se extrajo instantáneamente después del sacrificio con una jeringa de insulina desde el corazón. Todos los demás tejidos y órganos se diseccionaron y transfirieron directamente a contenedores de plástico.

Los pesos de las muestras en los contenedores de plástico se midieron mediante el uso de una balanza electrónica. Los pesos de los contenedores de plástico vacíos y preetiquetados para las muestras específicas se midieron con antelación. El peso de tara de los contenedores de plástico se restó del peso de la muestra de medición con el contenedor de plástico. El peso así calculado se designó como el peso de la muestra de medición.

Los contenedores de plástico que contenían las muestras de medición se colocaron en soportes específicos de un contador gamma automático (PerkinElmer - Wallac, Waltham, EE. UU.) para medir la tasa de conteos durante 60 segundos (conteos por minuto = cpm). Además, se midió junto con las muestras un estándar al 1 % (v/v) (n=5) con una cantidad conocida de radioactividad para convertir la tasa de conteos de las muestras de órganos en actividad.

Análisis de Datos

Las tasas de conteos de las muestras de medición se corrigieron automáticamente respecto a la descomposición. Las relaciones de distribución de radioactividad (unidad: porcentaje de la dosis inyectada (% ID) en las muestras de medición se determinaron mediante el uso de la ecuación más abajo. La suma de las tasas de conteos de todas las muestras de medición obtenidas de un ratón se designó como la tasa de conteos para la radioactividad administrada.

La relación de distribución de radioactividad por unidad de peso de la muestra de medición (unidad: %ID/g), que excluye las muestras de orina y heces fecales, se determinó mediante el uso de la ecuación más abajo. El peso de la muestra de medición se determinó al restar el contenedor de medición vacío al contenedor que incluye la muestra.

Análisis de dosimetría

Para la consistencia de los cálculos estadísticos para cada radiotrazador, se usó el mismo número de puntos de tiempo para 18F-rhPSMA-7 y 18F-rhPSMA-7.3. Por lo tanto, para 18F-rhPSMA-7 los puntos de tiempo de 10 min y 20 min se combinaron para crear un punto final de 15 min.

La integral de tiempo de actividad para la acumulación en los órganos fuente significativos (AUC) se generó tanto con integración numérica como con descomposición física de acuerdo con J Juan y otros, Journal of Pharmaceutical Sciences, 1993, 82:762-763.

Kirshner y otros establecieron un método que usa una escala lineal del por ciento de dosis inyectada en el animal por la relación entre los pesos de los órganos y los pesos corporales totales de los simuladores en ambas especies.

- Kirschner AS, Ice RD, Beierwaltes WH. Radiation Dosimetry of 131l-19-lodocholesterol. J Nucl Med. 1973 Sep 1;14(9):713-7.

- Kirschner A, Ice R, Beierwaltes W. Letterstothe editor. J Nucl Med. (1975):248-9.

En resumen, para calcular una dosimetría humana a partir de la biodistribución en los ratones, fue necesaria una extrapolación para tener en cuenta las diferencias entre los animales y los seres humanos. Las dosis de radiación en órganos normales se estimaron para el modelo anatómico de adulto estándar de 70 kg mediante el uso de concentraciones de actividad en órganos dependiente del tiempo (en por ciento de la dosis inyectada por gramo, %ID/g) y actividades corporales totales medidas en los estudios de biodistribución en ratones.

Las concentraciones de actividad tisular en ratones se convirtieron en actividades fraccionarias de tejido en el adulto estándar de 70 kg mediante el uso de las masas de órganos fraccionarias relativas en el adulto estándar y el ratón "estándar" de 25 gramos. La actividad corporal total dependiente del tiempo se ajustó a una función exponencial y se asumió que la diferencia entre la actividad inyectada y la actividad corporal total se excretaba en la orina porque las concentraciones de actividad en el hígado y el trazador GI fueron bajas en todos los puntos de tiempo estudiados.

El tiempo de residencia en el órgano se calculó por integración numérica mediante el uso de la regla trapezoidal y los tiempos de residencia de 18F en el resto del cuerpo se calcularon como la diferencia entre el tiempo de residencia corporal total y la suma de los tiempos de residencia en órganos y orina. El tiempo de residencia en el contenido vesical se estimó mediante el uso del modelo de evacuación dinámico en el software de dosimetría OLINDA/EXM 1.0. Por último, se calcularon los equivalentes de dosis media en órganos del adulto estándar (en mSv/MBq) y la dosis efectiva (también en mSv/MBq) mediante el uso de OLINDA/EXM 1.0.

Cálculo final de dosis de radiación absorbida y dosimetría de biodistribución en ratones: Los tejidos u órganos en los que se produce una acumulación significativa de radioactividad (es decir, órgano fuente) fueron riñón, bazo, pulmón, hígado y corazón. Con respecto a la acumulación y el aclaramiento de la actividad, se encontró un aclaramiento rápido de la sangre y un aclaramiento para la orina, pero una acumulación relativamente lenta en el riñón.

Resultados

Tabla 14. Resultados de dosimetría para 18F-rhPSMA-7 mediante el uso de un intervalo de evacuación vesical de 3,5 h.

Tabla 15. Resultados de dosimetría para 18F-rhPSMA-7 mediante el uso de un intervalo de evacuación vesical de 1,0 h.

16. Resultados de dosimetría para 18F-rhPSMA-7.3 mediante el uso de un intervalo de evacuación vesi 3,5 h

Tabla 17. Resultados de dosimetría para 18F-rhPSMA-7.3 mediante el uso de un intervalo de evacuación vesical de 1,0 h.

Conclusión

Las relaciones de distribución de radioactividad fueron más altas en los riñones después de la administración tanto de 18F-rhPSMA-7 como de 18F-rhPSMA-7.3 en todos los puntos de tiempo examinados en ratones. Por otra parte, fue alta en el bazo y en la vejiga para ambos radiotrazadores en comparación con todos los demás tejidos evaluados, donde las relaciones de actividad fueron inferiores al 8 % ID/g.

Dado que la mayor parte del aumento de la actividad de 18F-rhPSMA-H 18F-rhPSMA-7.3 en los riñones y la excreción por medio de la vejiga revelan actividades altas, la ruta principal de excreción se define por medio de los riñones y el sistema urinario.

Mediante el uso de un intervalo de evacuación vesical de 3,5 h y 1,0 h, las dosis efectivas totales extrapoladas fueron 2,66E-02 y 1,22E-02 mSv/MBq para 18F-rhPSMA-7 y 2,17E-02 y 1,28E-02 mSv/MBq para 18F-rhPSMA-7.3, respectivamente. Una inyección de hasta 370 MBq (10 mCi) para una exploración clínica daría como resultado una exposición favorable a la radiación de menos de 5 mSv para ambos agentes, suponiendo un intervalo de evacuación de 1 h.

Las diferencias a destacar entre ambos radiotrazadores solo son evidentes con respecto a la captación renal ya que 18F-rhPSMA-7.3 tiende a acumularse de manera más gradual con una retención más prolongada. Sin embargo, la exposición a la radiación es comparable entre ambos agentes.

B) Biodistribución en seres humanos y captación en lesiones tumorales de 18F-rhPSMA-7 y 18F-rhPSMA-7.3

Las siguientes secciones describen la biodistribución de 18F-rhPSMA-7 y 18F-rhPSMA-7.3. La evaluación de prueba de concepto se realizó bajo uso compasivo. El agente se aplicó de conformidad con la Ley alemana de productos medicinales, AMG §132b, y de acuerdo con el organismo regulador responsable (Gobierno de Oberbayern).

Todos los sujetos se examinaron en un escáner Biograph mCT (Siemens Medical Solutions, Erlangen, Alemania). Todas las exploraciones de PET se adquirieron en modo 3D con un tiempo de adquisición de 2-4 min por posición del lecho. Los datos de emisión se corrigieron respecto a aleatoriedad, tiempo muerto, dispersión y atenuación y se reconstruyeron iterativamente mediante un algoritmo de maximización de expectativas de subconjuntos ordenados (cuatro iteraciones, ocho subconjuntos) seguido de un filtro gaussiano de suavizado posterior a la construcción (5 mm de ancho completo a la mitad del máximo).

Métodos

La biodistribución en seres humanos se estimó mediante el análisis de exámenes clínicos de PET/CT con 18F-rhPSMA-7 y 18F-rhPSMA-7.3 en 47 y 32 pacientes, respectivamente. Las actividades inyectadas medias fueron 324 (intervalo 236-424) MBq frente a 345 (intervalo 235-420) MBq y los tiempos de captación fueron 84 (intervalo 42­ 166) min y 76 (intervalo 59-122) min para 18F-rhPSMA-7 frente a 18F-rhPSMA-7.3, respectivamente.

Los valores de captación estandarizados medios y máximos (SUVmedio/SUVmáx) se determinaron para la señal de fondo (músculo del glúteo), órganos normales (glándulas salivales, acumulación de sangre, pulmón, hígado, bazo, páncreas, duodeno, riñón, vejiga, hueso) y tres lesiones tumorales representativas. Se analizó la captación tumoral en 89 lesiones (26 tumores primarios/recidivas locales, 23 metástasis óseas, 38 ganglionares y 2 viscerales) y 63 lesiones (14 tumores primarios/recidivas locales, 30 metástasis óseas, 18 ganglionares y 1 visceral) para 18F-rhPSMA-7 y 18F-rhPSMA-7.3, respectivamente.

Para el cálculo del SUV, se dibujaron regiones circulares de interés alrededor de áreas con captación aumentada focalmente en cortes transaxiales y se adaptaron automáticamente a un volumen de interés (VOI) tridimensional en un isocontorno del 50 %. Se calcularon las relaciones órgano-señal de fondo y tumor-señal de fondo.

Resultados

La biodistribución en seres humanos de 18F-rhPSMA-7 y 18F-rhPSMA-7.3 mostró el patrón típico conocido de otros ligandos de PSMA. Los parámetros de captación para 18F-rhPSMA-7 y 18F-rhPSMA-7.3 fueron muy similares con una menor retención de actividad en la vejiga y una mayor captación en lesiones tumorales para 18F-rhPSMA-7.3: Los SUVmedios para 18F-rhPSMA-7 frente a 18F-rhPSMA-7.3 fueron 16,9 frente a 16,0 (glándula parótida), 19,6 frente a 19,6 (glándula submandibular), 2,0 frente a 1,9 (acumulación de sangre), 0,7 frente a 0,7 (pulmones), 7,0 frente a 7,3 (hígado), 9,1 frente a 8,5 (bazo), 32,4 frente a 35,5 (riñón), 2,5 frente a 2,8 (páncreas), 10,9 frente a 11,0 (duodeno), 1,1 frente a 1,3 (hueso sano) y 10,2 frente a 2,0 (vejiga) para 18F-rhPSMA-7 frente a 18F-rhPSMA-7.3, respectivamente. En particular, los valores de captación de 18F-rhPSMA-7.3 frente a 18F-rhPSMA-7 fueron significativamente más bajos para la retención en la vejiga (2,0 ± 0,8 frente a 6,3 ± 21,2, p <0,05) y significativamente mayor para las lesiones tumorales (32,5 ± 42,7 frente a 20,0 ± 20,2, p <0,05).

Tabla 18. SUVmáx y SUVmedio de órganos normales y lesiones tumorales mediante el uso de 18F-rhPSMA-7. Los datos se muestran como media, mínimo y máximo.

Tabla 19. SUVmáx y SUVmedio de órganos normales y lesiones tumorales mediante el uso de 18F-rhPSMA-7.3. Los datos se muestran como media, mínimo y máximo.

Tabla 20. Relación de SUVmáx y SUVmedio con respecto a la señal de fondo de órganos normales y lesiones tumorales mediante el uso de 18F-rhPSMA-7. Los datos se muestran como media, mínimo y máximo.

Tabla 21. Relación de SUVmáx y SUVmedio con respecto a la señal de fondo de órganos normales y lesiones tumorales mediante el uso de 18F-rhPSMA-7.3. Los datos se muestran como media, mínimo y máximo.

Conclusión:

La biodistribución en seres humanos es similar entre 18F-rhPSMA-7 y 18F-rhPSMA-7.3 para la mayoría de los órganos normales. Sin embargo, la retención del trazador en la vejiga es significativamente menor y la captación en las lesiones tumorales es significativamente mayor para 18F-rhPSMA-7.3 lo que presenta una clara ventaja para la obtención de imágenes clínicas. En la Figura 28 se muestran ejemplos de obtención de imágenes con biodistribución en seres humanos favorable y alta captación en lesiones tumorales de 18F-rhPSMA-7.3.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES

   1. El comp

   

   uesto de acuerdo con la fórmula (V)

   o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que contiene un catión radioactivo quelado o en donde F es opcionalmente 18F.

   2. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 de acuerdo con la fórmula Va :

   

   o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde;

   cada X es independientemente OH u O-;

   M es un catión radioactivo quelado o está ausente;

   y F es opcionalmente 18F

   3. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el catión radioactivo quelado se selecciona de los cationes de Sc, Cu, Ga, Y, In, Tb, Ho, Lu, Re, Pb, Bi, Ac, E ry Th.

   4. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el catión radioactivo quelado es Ga.

   5. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el catión radioactivo quelado es Lu-177, Y-90 o Ac-225.

   6. Un método para producir el compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende las etapas de:

   a) hacer reaccionar un compuesto de fórmula (I):

   

   con un compuesto de fórmula (II):

   

   para formar un compuesto de fórmula (III):

   

   en donde PGi es tBu, PG2 es Fmocy PG3 es Ode;

   y las condiciones de reacción implican el uso de una base, en donde la base es 2,4,6-colidina o 2,6-dimetilpiridina;

   b) hacer reaccionar el compuesto de fórmula (III) en condiciones adecuadas para formar un compuesto de fórmula IV :

   

   y

   c) hacer reaccionar el compuesto de fórmula (IV) en condiciones adecuadas para formar el compuesto (V):

   

   7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el compuesto (II) se preactiva por reacción con tetrafluoroborato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilaminio (TbTU), 1-hidroxi-7-azabenzotriazol (HOAt)y 2,4,6-colidina antes de la reacción con el compuesto (I).

   8. El método de la reivindicación 7, en donde la preactivación tiene lugar durante 5 minutos o menos.

   9. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 de fórmula (VI)

   

   o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

   

   11. Una composición farmacéutica o de diagnóstico que comprende el compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, 9, 10.

   12. Un compuesto o composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, 9-11 para el uso como agente de diagnóstico o de obtención de imágenes del cáncer.

   13. Un compuesto o composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, 9-11 para el uso en el tratamiento del cáncer.

   14. Un compuesto o composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, 9-11 para el diagnóstico, obtención de imágenes o prevención de la neoangiogénesis/angiogénesis.

   15. Un compuesto o composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, 9-11 para el uso como agente de diagnóstico o de obtención de imágenes del cáncer o para el uso en el tratamiento del cáncer en donde el cáncer es carcinoma de próstata, mama, pulmón, colorrectal o de células renales.