ES2953463T3

ES2953463T3 - Productos farmacéuticos bioelectrónicos

Info

Publication number: ES2953463T3
Application number: ES16753096T
Authority: ES
Inventors: Kevin J Tracey; Sangeeta S Chavan
Original assignee: Feinstein Institutes for Medical Research
Current assignee: Feinstein Institutes for Medical Research
Priority date: 2015-02-20
Filing date: 2016-02-19
Publication date: 2023-11-13
Anticipated expiration: 2036-02-19
Also published as: AU2016219949B2; DK3259015T3; EP3259015A4; EP3259015B1; US11278469B2; US20180021214A1; AU2016219949A1; WO2016134197A1; CA2977244A1; CA2977244C; HK1246711A1; EP3259015A1

Abstract

Se divulgan métodos para tratar a un sujeto que tiene una enfermedad o trastorno que comprende proporcionar al sujeto un estímulo de energía acústica derivado de un neurograma específico de la enfermedad, específico de la condición, específico del mediador endógeno o específico del agente farmacológico en una cantidad y manera efectiva para tratar la enfermedad o trastorno. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Productos farmacéuticos bioelectrónicos

Declaración de financiación gubernamental

Esta invención se realizó con financiación gubernamental bajo el número de subvención W911NF-09-1-0125 otorgada por la Agencia de Proyectos de Investigación Avanzada de Defensa (DARPA). El gobierno posee determinados derechos sobre la invención.

Antecedentes de la invención

A lo largo de esta solicitud se hace referencia entre paréntesis a diversas publicaciones. Las citas completas de estas referencias se pueden encontrar al final de la memoria descriptiva.

El sistema nervioso se desarrolló a lo largo del tiempo evolutivo para optimizar la supervivencia en respuesta a las señales del entorno interno y externo. En mamíferos, las señales químicas, mecánicas y electromagnéticas son detectadas por las neuronas, que propagan potenciales de acción al sistema nervioso central (SNC). Estos comprenden los arcos aferentes de los circuitos reflejos que mantienen la homeostasis del cuerpo. Este principio fundamental de detectar cambios del entorno para montar respuestas reflejas apropiadas es fundamental para los mecanismos fisiológicos que permiten no solo la homeostasis sino también la adaptabilidad y la supervivencia de las especies.

Hace treinta años, se descubrió que los productos del sistema inmunitario, incluyendo citocinas y otros mediadores, podían ser percibidos por el sistema nervioso, lo que provocó la sugerencia de que el sistema inmunitario podría servir como una modalidad sensorial funcional (1). En este contexto, invasores extraños, productos microbianos y otros estimuladores inmunitarios exógenos culminan en la liberación de citocinas. Estos productos inmunitarios pueden, a su vez, interactuar con el sistema nervioso periférico y el SNC para desencadenar respuestas neurofisiológicas; sin embargo, la pregunta sigue siendo si las señales neuronales sensoriales están codificadas en patrones específicos de citocinas.

Ha habido un cúmulo de conocimiento en expansión que delinea la extensa interfaz entre los sistemas nervioso e inmunitario. Similar al control neuronal de los estados fisiológicos y metabólicos generales del cuerpo, las vías inflamatorias sistémicas pueden ser moduladas por el SNC, siendo la vía arquetípica el reflejo inflamatorio del nervio vago (NV) (2). En su arco eferente, las señales eléctricas bajan por el nervio vago hasta el ganglio celíaco desde donde el nervio esplénico propaga aún más la señal hacia el bazo. Dentro del bazo, un subconjunto especializado de linfocitos T completa el vínculo entre los sistemas nervioso e inmunitario (3, 4). La acetilcolina, que es liberada por estas células T, regula a la baja la producción de citocinas por parte de los macrófagos residentes, lo que produce un efecto antiinflamatorio sistémico (3).

En contraste con el arco motor bien mapeado, el arco aferente sigue siendo entendido de forma incompleta. De manera destacable, el nervio vago es principalmente sensorial, de modo que numerosas señales aferentes relacionadas con el estado fisiológico viajan por el nervio vago desde la periferia hacia el SNC. A menudo se descuida la noción de que estas señales podrían incluir el estado inflamatorio del animal. El trabajo pionero de Niijima y colaboradores (5-7) les llevó a postular que la IL-1p podría activar aferentes periféricos del nervio vago que señalarían al SNC la presencia de esta citocina. Los estudios fisiológicos han demostrado que se requiere un nervio vago intacto para una respuesta de pirexia a la administración intraabdominal de IL-1p, corroborando aún más la noción de que el nervio vago podría ser un sensor primario de inflamación periférica para el SNC (8, 9). Estudios paralelos en neuronas sensoriales aisladas muestran que las neuronas expresan una variedad de receptores de citocinas, tales como los receptores de TNF e IL-1p, y son capaces de cambiar sus umbrales de activación cuando se exponen a las citocinas exógenas correspondientes (10-12). Steinberg et al "Pro- and Anti-inflammatory Cytokines Differentially Activate the Sensory Vagus Nerve" (American Society of Anesthesiologists, Abstract, 14 de octubre de 2014, página 1, XP055482730) divulga la administración intraperitoneal de factor de necrosis tumoral (TNF) proinflamatorio purificado o interleucina-1 (IL-1 •) que conduce a un aumento de la actividad eléctrica en el nervio vago cervical mientras que la IL-10 no lo hace. En combinación, estos estudios sugieren que el nervio vago es un sustrato importante para una red neuronal periférica capaz de capturar señales en tiempo real relacionadas con cambios en los estados inflamatorio e inmunitario periféricos. La publicación "Spike2 for Windows" (Cambridge Electronics Design Limited, 1 de enero de 2017 (2017 01-01), XP055519070 es un manual de usuario para software de adquisición y análisis de datos de señales.

La presente invención aborda la necesidad de tratamientos mejorados de enfermedades y trastornos, en particular que no requieran la administración de fármacos a un sujeto. Los métodos divulgados en el presente documento usan un patrón de estímulo derivado de un neurograma del nervio vago específico de una enfermedad, específico de una afección o específico de un mediador endógeno o específico de un agente farmacológico para producir un patrón de estímulo acústico que puede usarse posteriormente para tratar la enfermedad o el trastorno.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona métodos para producir un archivo .wav en donde el archivo .wav se puede reproducir como un estímulo de energía acústica para su uso posterior en el tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad o trastorno, en donde la enfermedad o trastorno es hiperglucemia o hipoglucemia, comprendiendo el método generar el archivo .wav basándose en un neurograma específico de un mediador endógeno o específico de un agente farmacológico de acuerdo con la reivindicación 1.

En particular, la invención proporciona un método para producir un archivo .wav en donde el archivo .wav se puede reproducir como un estímulo de energía acústica para su uso posterior en el control de los niveles de glucosa en sangre en sujetos que comprende generar el archivo .wav basándose en un neurograma del nervio vago específico de hipoglucemia o hiperglucemia de acuerdo con la reivindicación 1. Los aspectos que se describen a continuación en el presente documento como "no reivindicados actualmente" no forman parte de la invención reivindicada, pero son útiles para comprender la invención reivindicada, que se define por las reivindicaciones independientes.

Breve descripción de los dibujos

Fig. 1A-1D. Registro de potenciales de acción compuestos del nervio vago. (A) Registros simultáneos (se muestran 2 de 3 electrodos) de actividad espontánea en el nervio vago (NV). (B) Izquierda, excitación del nervio vago por KCl (4 mM, cuadro gris) aplicado al campo quirúrgico. Derecha, Parte superior, período de actividad quiescente antes de KCl (marcado por i). Parte media, período de picos intensos durante KCl (marcado por ii). La línea indica el umbral adaptativo usado para detectar potenciales de acción compuestos (CAP). Parte inferior, los CAP identificados están alineados con el trazo anterior. (C) Recuadro, los CAP provocados se obtienen mediante breves pulsos eléctricos que estimulan el nervio vago. El gráfico muestra el área de CAP (media ± SD), que se hace más grande al aumentar la intensidad de la estimulación (círculos pre). La lidocaína (2 %) bloquea en gran medida los CAP provocados (círculos post). (D) Recuadro, CAP provocados previos al tratamiento con tetrodotoxina (100 μM). El gráfico muestra el área de CAP (media ± SD) que está completamente bloqueada por el fármaco. Barras de escala (x, y), A, 100 ms, 100 pV; B izquierda, 1 s, 20 pV; B derecha, 10 ms, 20 pV; C, D, 2 ms, 40 pV.

Fig. 2A-2E. Las fibras aferentes del nervio vago portan neurogramas inducidos por TNF; aspecto no reivindicado actualmente pero considerado útil para comprender la invención. (A) Parte superior, trazo que muestra la actividad espontánea del nervio vago cervical. Parte inferior, trazo que muestra la actividad del nervio vago cervical después de la inyección periférica de TNF (dosis de 50 μg, marcada con una flecha). (B) Gráfico que representa la frecuencia de descarga de CAP para los neurogramas de control e inducidos por TNF (mostrados en A). El período de 10 minutos inmediatamente después de la inyección de TNF se usa para calcular la frecuencia de descarga de CAP, así como el período equivalente desde la situación de referencia. (C) Diagramas de las vagotomías quirúrgicas empleadas para probar la dirección del flujo del neurograma inducido por TNF. Una transección proximal (Prox.), entre los electrodos y el cerebro, aísla el componente aferente, mientras que una transección distal aísla la rama eferente. (D) Gráfico que muestra la frecuencia de descarga de CAP en intervalos de 60 segundos (media ± SEM, línea ± área sombreada) comenzando 10 minutos antes de la inyección de TNF (dosis de 50 μg) en el tiempo cero. Los datos representan N = 3 para cada una de las vagotomías proximales (círculos rellenos) y distales (círculos abiertos). (E) Gráfico que muestra las frecuencias de CAP (media ± SEM) para los períodos de 10 minutos antes y justo después de TNF en ratones individuales. La transección distal suprime por completo el efecto de TNF, que no se ve afectado por la transección proximal (P = 0,03 para valores post, prueba t), indicando que se requieren fibras aferentes.

Fig. 3A-3E. Evolución temporal para neurogramas mediados por TNF e IL-1p; aspecto no reivindicado actualmente considerado útil para la comprensión de la invención. (A) Parte superior, trazo que muestra la actividad del nervio vago con vehículo (200 μl de solución salina estéril, marcado con una flecha), que se usa como control. Parte inferior, gráfico que describe la frecuencia de descarga de CAP (media ± SEM, área gris) para N = 5 ratones, comenzando 10 minutos antes de la inyección de solución salina. (B) Parte superior, neurograma representativo para TNF (dosis de 50 μg, marcado con una flecha). Parte inferior, gráfico que muestra la frecuencia media ± SEM (área azul) para N = 6 ratones. (C) Parte superior, neurograma representativo para IL-1p (dosis de 350 ng, marcado con una flecha). Parte inferior, gráfico que muestra la frecuencia media ± SEM (área verde) para N = 8 ratones. (D) Gráfico que representa la frecuencia de descarga de CAP (media ± SEM) para TNF a dosis baja (5 μg, N = 6) y dosis alta (50 μg, N = 6). 'Pre' se refiere al intervalo de 30 segundos justo antes de la inyección y 'Post' al intervalo de 30 segundos 5 minutos después de la inyección. (E) Gráfico que representa la frecuencia de descarga de CAP (media ± SEM) para IL-1p a dosis baja (35 ng, N = 8) y dosis alta (350 ng, N = 8). 'Pre' se refiere al período de 30 segundos justo antes de la inyección y 'Post' al período de 30 segundos 2,5 minutos después de la inyección. Fig. 4A-4C. Análisis en el dominio del tiempo de neurogramas mediados por TNF e IL-1p; aspecto no reivindicado actualmente pero considerado útil para comprender la invención. (A) Diagrama de caja que muestra la diferencia (postinyección menos preinyección) en la frecuencia media de CAP. Para TNF (N = 6) y solución salina (N = 5), se usaron intervalos de 10 minutos. Para IL-1p (N = 8), se usaron intervalos de 5 minutos. (B) Diagrama de caja que muestra la diferencia en la frecuencia máxima de CAP. (C) Izquierda, gráfico que representa la latencia (media ± SEM) para las respuestas de TNF e IL-1p. El primero es ligeramente más lento que el segundo (P = 0,043, prueba t). Parte media, gráfico que muestra la duración (media ± SEM) de los neurogramas inducidos por TNF e IL-1p. Derecha, gráfico que presenta la frecuencia de CAP (media ± SEM) de las respuestas de TNF e IL-1p.

Fig. 5A-5B. Ablación de neurogramas mediados por citocinas en ratones deficientes en TNFR2 e IL-1R; aspecto no reivindicado actualmente pero considerado útil para comprender la invención. (A) Izquierda, trazos representativos 5 minutos después de la aplicación de TNF (dosis de 50 |jg) en ratones KO para TNFR2 y de tipo silvestre. Derecha, gráfico que muestra las frecuencias de CAP individuales inmediatamente antes y después de TNF (intervalos de 10 minutos) en animales KO para TNFR2 (N = 3) y animales de tipo silvestre (N = 6) (B) Izquierda, trazos representativos 150 segundos después de la aplicación de IL-1p (dosis de 350 ng) en ratones KO para IL-1R y de tipo silvestre. Derecha, gráfico que muestra las frecuencias de CAP individuales inmediatamente antes y después de IL-1p (intervalos de 5 minutos) en animales KO para IL-1R (N = 3) y de tipo silvestre (N = 8). Fig. 6A-6B. Análisis espectral de neurogramas mediados por TNF e IL-1p; aspecto no reivindicado actualmente pero considerado útil para comprender la invención. (A) Densidades espectrales de potencia (PSD) representativas para las respuestas de TNF e IL-1p en los registros de neurogramas sin filtrar. (B) Las áreas bajo las PSD (intervalo de 20-400 Hz) se calcularon para TNF e IL-1p. El área calculada para cada respuesta se muestra para TNF e IL-1p, junto con los promedios de grupo (líneas). Las respuestas son estadísticamente diferentes (N = 7 para cada grupo; P = 0,05, D = 0,71, prueba de Kolmogorov-Smirnov), lo que sugiere un sustrato biológico potencial para la discriminación de citocinas dentro del SNC.

Fig. 7. Paradigma para inducir el fenotipo inflamatorio en ratones no tratados anteriormente mediante estimulación acústica usando una señal específica de IL1p; aspecto no reivindicado actualmente pero considerado útil para comprender la invención. Se extrae una señal de referencia o específica de IL1p de un neurograma de nervio vago obtenido del ratón A y se convierte en un archivo 'wav'. La señal de referencia o específica de IL1p se transfirió a otro ratón B receptor no tratado anteriormente mediante estimulación acústica. Los niveles de citocinas circulantes se analizaron en el ratón B después de 1 h.

Fig. 8. La estimulación acústica usando neurograma mediado por IL1p indujo niveles aumentados de citocinas inflamatorias circulantes; aspecto no reivindicado actualmente pero considerado útil para comprender la invención. Los animales no tratados anteriormente reciben estimulación acústica usando una señal de neurograma de referencia o mediada por IL1p (activación en serie 1X o 3X). La señal específica de IL1p pero no la de referencia indujo fenotipo inflamatorio en ratones receptores no tratados anteriormente.

Fig. 9. Registro de neurograma hipoglucémico del nervio vago. Los ratones no tratados anteriormente recibieron una inyección en embolada de insulina (6 mg/kg) y se registró la actividad del nervio vago a lo largo del tiempo. Los niveles de glucosa en sangre se monitorizaron cada 2,5 minutos. La insulina indujo un estado hipoglucémico en ratones, como se ilustra mediante la línea superior de la figura, que indica los niveles de glucosa en sangre en mg/dl.

Fig. 10. Registro de neurograma euglucémico del nervio vago. Los ratones no tratados anteriormente recibieron una inyección en embolada de glucagón (1 mg/kg) y se registró la actividad del nervio vago a lo largo del tiempo. Los niveles de glucosa en sangre se monitorizaron cada 2,5 minutos. Los niveles de glucosa en sangre se indican en la línea superior de la figura en mg/dl.

Fig. 11. Registro de neurograma hiperglucémico del nervio vago. Los ratones no tratados anteriormente recibieron una inyección en embolada de glucosa, y se registró la actividad del nervio vago a lo largo del tiempo. Los niveles de glucosa en sangre se monitorizaron cada 2,5 minutos. Los niveles de glucosa en sangre se indican en la línea superior de la figura en mg/dl.

Fig. 12. Paradigma para aumentar los niveles de glucosa en sangre en sujetos humanos sanos mediante estimulación acústica usando una señal específica de hipoglucemia. Se extrajo una señal de referencia o específica de hipoglucemia de un neurograma del nervio vago obtenido del ratón A. La señal se convirtió a un archivo 'wav' y se transfirió como una salida de audio a sujetos humanos sanos. Los niveles de glucosa en sangre se monitorizaron en sujetos humanos a intervalos de tiempo regulares.

Fig. 13. La reproducción acústica del neurograma específico de hipoglucemia indujo hiperglucemia en sujetos humanos sanos. Se registraron neurogramas del nervio vago a partir de ratones que recibieron una inyección en embolada de insulina. Los niveles de glucosa en sangre disminuyeron en ratones que recibieron insulina. A continuación, el neurograma se reprodujo como un archivo 'wav' para sujetos humanos sanos y los niveles de glucosa en sangre se monitorizaron a lo largo del tiempo (n=5/grupo).

Fig. 14. La reproducción acústica del neurograma específico de hiperglucemia indujo hipoglucemia en sujetos humanos sanos. Se registraron neurogramas del nervio vago a partir de ratones que recibieron una inyección en embolada de glucosa. Los niveles de glucosa en sangre aumentaron en los ratones que recibieron glucosa. A continuación, el neurograma se reprodujo como un archivo 'wav' para sujetos humanos sanos y los niveles de glucosa en sangre se monitorizaron a lo largo del tiempo (n=3/grupo).

Fig. 15. La reproducción acústica del neurograma específico de euglucemia no indujo un cambio en los niveles de glucosa en sangre en sujetos humanos sanos. Se registraron neurogramas del nervio vago a partir de ratones que recibieron una inyección en embolada de glucagón. Los niveles de glucosa en sangre no cambiaron en ratones que recibieron glucagón. A continuación, el neurograma se reprodujo como un archivo 'wav' para sujetos humanos sanos y los niveles de glucosa en sangre se monitorizaron a lo largo del tiempo (n=5/grupo).

Fig. 16. Registro de neurograma inducido por hidrocortisona de un nervio vago de ratón. Los ratones no tratados anteriormente recibieron una inyección en embolada de hidrocortisona (cortisol) (10 mg/ratón) y se registró la actividad del nervio vago a lo largo del tiempo.

Fig. 17. Administración de hipoglucemia inducida por cortisol en ratones. Los ratones no tratados anteriormente recibieron solución salina o cortisol mediante administración intraperitoneal. Los niveles de glucosa en sangre se monitorizaron a lo largo del tiempo. La administración de cortisol pero no de solución salina indujo hipoglucemia. Fig. 18. La reproducción acústica del neurograma del nervio vago específico de cortisol en indujo hiperglucemia sujetos humanos sanos. Se registraron neurogramas del nervio vago a partir de ratones que recibieron una inyección en embolada de hidrocortisona. Se generó un "control de señal codificada" transformando la señal específica de cortisol en una señal codificada usando un código matlab que genera una señal aleatorizada con las mismas amplitudes, pero frecuencias aleatorias, manteniendo la potencia total de la señal. El neurograma específico de cortisol o la señal codificada se reprodujo a continuación como un archivo 'wav' a sujetos humanos sanos y los niveles de glucosa en sangre se monitorizaron a lo largo del tiempo. (n=8/grupo).

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona un método para producir un archivo .wav en donde el archivo .wav se puede reproducir como un estímulo de energía acústica para su uso posterior en el tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad o trastorno que comprende generar el archivo .wav basándose en un neurograma específico de un mediador endógeno o específico de un agente farmacológico.

La enfermedad o trastorno de acuerdo con la invención puede ser, por ejemplo, una o más de hiperglucemia o hipoglucemia. Se puede tratar la diabetes tipo 1 o diabetes tipo 2, la intolerancia a la glucosa. Otra enfermedad o trastorno no reivindicado actualmente, puede ser, por ejemplo, inflamación, síndrome metabólico, traumatismo, sangrado, choque hemorrágico, lesión por isquemia-reperfusión, náuseas, vómitos, cáncer, cáncer de próstata, artritis, artritis reumatoide, colitis, septicemia, endotoxemia, colitis, pancreatitis, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, fiebre, anorexia, dolor, hinchazón, una respuesta del hospedador a la infección, una respuesta inmunitaria y una enfermedad o trastorno en el que es deseable aumentar la actividad o el nivel de una citocina.

Un estímulo de energía acústica derivado de un neurograma específico de citocinas puede usarse posteriormente para modular un efecto fisiológico específico de citocinas; este aspecto no se reivindica actualmente. De acuerdo con la invención, un patrón de estímulo correctivo derivado del nivel de glucosa o insulina de un sujeto puede usarse posteriormente para controlar la glucosa y, por tanto, puede reemplazar preferentemente la administración de insulina al sujeto.

La presente invención proporciona el control de los niveles de glucosa en sangre en un sujeto mediante la producción de un archivo .wav que puede reproducirse como un estímulo de energía acústica, el archivo .wav derivado de un neurograma específico de hipoglucemia o hiperglucemia registrado desde un nervio vago, controlando así los niveles de glucosa en sangre en un sujeto.

En una realización proporcionada para aumentar los niveles de glucosa en sangre en un sujeto, el archivo .wav se puede reproducir como un estímulo de energía acústica, derivado de un neurograma específico de hipoglucemia, específico de insulina o específico de cortisol registrado desde un nervio vago, aumentando así los niveles de glucosa en sangre en un sujeto. El neurograma específico de hipoglucemia se puede registrar desde un nervio vago de un sujeto después, por ejemplo, de la administración de insulina o cortisol al sujeto. El sujeto que recibe el estímulo de energía acústica puede tener, por ejemplo, uno o más de hipoglucemia, insuficiencia renal, enfermedad hepática e hipotiroidismo.

En otra realización proporcionada para disminuir los niveles de glucosa en sangre en un sujeto, el archivo .wav se puede reproducir como un estímulo de energía acústica, derivado de un neurograma específico de hiperglucemia o específico de glucosa registrado desde un nervio vago, disminuyendo así los niveles de glucosa en sangre en un sujeto. El neurograma específico de hiperglucemia se puede registrar desde un nervio vago de un sujeto después, por ejemplo, de la administración de glucosa al sujeto. El sujeto que recibe el estímulo de energía acústica puede tener, por ejemplo, uno o más de diabetes mellitus de tipo 1, diabetes mellitus de tipo 2, síndrome metabólico, resistencia a la insulina, intolerancia a la glucosa e hiperglucemia.

El muestreo eléctrico de la actividad neuronal ("neurogramas") se puede obtener en sujetos humanos o no humanos, tal como un modelo animal de una enfermedad o trastorno, en donde los neurogramas son neurogramas específicos de una enfermedad, específicos de una afección, específicos de un mediador endógeno o específicos de un agente farmacológico.

El neurograma se puede obtener, por ejemplo, en respuesta a la administración de sustancias de origen fisiológico a un sujeto. Por ejemplo, en respuesta a la administración de una citocina; este aspecto no se reivindica actualmente. La citocina puede ser, por ejemplo, una quimiocina, un factor estimulante de colonias, proteína del grupo de alta movilidad B1 (HMGB1), un interferón (IFN), una interleucina (por ejemplo, cualquiera de IL-1 a IL-36), una linfocina, factor inhibidor de migración de macrófagos (MIF), una monocina, un factor de crecimiento transformante beta (por ejemplo, TGF-p1, TGF-p2 y TGF-p3), un factor de necrosis tumoral (por ejemplo, TNFα o TNFp). El neurograma se puede obtener, de acuerdo con la invención en respuesta a la administración de glucagón, glucosa o insulina, o en respuesta a un cambio en los niveles de glucosa, por ejemplo, los niveles de glucosa en sangre. El neurograma puede, por ejemplo, registrarse en respuesta a una señal proinflamatoria o una señal antiinflamatoria; este aspecto no se reivindica actualmente.

El neurograma se obtiene desde el nervio vago.

El muestreo eléctrico de la actividad neuronal vagal ("neurogramas") se puede obtener a partir de un modelo animal o de un paciente humano y se obtiene preferentemente a partir de un nervio vago cervical.

El registro de nervios se puede llevar a cabo usando, por ejemplo, un electrodo implantable, tal como, por ejemplo, un electrodo de estilo manguito. Los neurogramas se pueden obtener a partir del mismo sujeto que se está tratando posteriormente con estimulación acústica o a partir de un sujeto diferente. El sujeto que se trata posteriormente puede ser un sujeto humano o un sujeto veterinario.

El estímulo de energía acústica se puede aplicar posteriormente a un αdo o a ambos αdos del sujeto, incluyendo, por ejemplo, usando auriculares. El estímulo de energía acústica puede incluir estimulación de energía auditiva y vibratoria.

Un neurograma del nervio vago específico de hipoglucemia o de hiperglucemia puede usarse posteriormente para proporcionar a un sujeto un estímulo de energía acústica en una cantidad y de una manera eficaz para tratar la hipoglucemia o la hiperglucemia.

Esta invención se comprenderá mejor a partir de los Detalles experimentales, que se exponen a continuación. Sin embargo, un experto en la materia apreciará fácilmente que los métodos específicos y los resultados analizados son meramente ilustrativos de la invención como se describe más completamente en las reivindicaciones que siguen a continuación.

DETALLES EXPERIMENTALES

EJEMPLO 1. Neurogramas específicos de citocinas registrados a partir del nervio vago aferente Descripción general. Actualmente no se reivindican realizaciones del ejemplo 1 relativas a citocinas, pero son útiles para comprender la invención.

Las redes neuronales en la periferia envían señales sobre el estado fisiológico del cuerpo al sistema nervioso central (SNC) a través de fibras aferentes, y particularmente a través del nervio vago (NV). Como parte de esta red, el nervio vago sensorial responde a la interleucina-1p (IL-1p) y al lipopolisacárido, y transmite estas señales al núcleo del tracto solitario dentro del SNC. El presente estudio mapeó de la actividad neuronal periférica que se produjo en respuesta al factor de necrosis tumoral (TNF) y la IL-1p registrando a partir del nervio vago cervical de ratones adultos. Con el uso de vagotomías quirúrgicas selectivas, se demostró que los neurogramas generados por citocinas son portados por las fibras aferentes del nervio vago. Las dosis bajas de citocinas (5 |jg de TNF o 35 |jg de IL-1p) no mejoraron la actividad de referencia del nervio vago, mientras que dosis más altas (50 jg de TNF o 350 ng de IL-1(3) desencadenaron mejoras significativas. El análisis de la dinámica temporal y las características espectrales de potencia de los neurogramas mediados por TNF e IL-1p reveló señales selectivas de citocinas en el nervio vago.

Materiales y métodos

Animales. Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales (IACUC) en el Instituto Feinstein de Investigación Médica, Northwell Health (anteriormente el North Shore-LIJ Health System), que sigue las directrices del NIH para el tratamiento ético de los animales. Los estudios usaron ratones BALB/c macho (8-12 semanas, con un peso de 20-30 g), que se adquirieron en The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Se alojaron a 25 °C, con agua y comida ad libitum, y se aclimataron a un ciclo de luz y oscuridad de 12 h durante >3 días antes de llevar a cabo los experimentos.

Productos químicos. Se adquirieron lidocaína, tetrodotoxina (Sigma-Aldrich) e IL-1p humana (eBiosciences). El TNF humano recombinante y libre de marcadores se produjo internamente. Después de la expresión en E. coli, el TNF se purificó usando una columna de intercambio catiónico y las endotoxinas se eliminaron por separación de fases con Triton X-114.

Registros del NV in vivo. Los ratones se mantuvieron en ayunas (3-4 h) antes de cada experimento. Cada uno fue inducido (isoflurano al 2,5 %) y mantenido (isoflurano al 1,5 %) en posición supina para la cirugía. Se realizó una incisión cervical en la línea media y se aisló la rama cervical izquierda del nervio vago del haz carotídeo acompañante. Bajo aumento, el tejido conectivo se eliminó mecánicamente y el nervio vago se colocó sobre tres electrodos de gancho de plata hechos a la medida. Las señales electrofisiológicas se digitalizaron (frecuencia de muestreo, 32 kHz) a través de un sistema de adquisición de datos (Digital Lynx 4SX, software Cheetah v5, Neuralynx, Bozeman, MT) y se referenciaron a un electrodo de tierra animal colocado entre la piel y la glándula salival derecha. En todos los experimentos, el nervio vago se protegió de la desecación y se aisló bañando el campo quirúrgico con aceite mineral. Después de la adquisición de la actividad de referencia (15-20 minutos), a los animales se les inyectó i.p. TNF, IL-1p, o el control de solución salina y los registros continuaron durante 20-30 minutos después de la inyección. El experimentador estaba conectado a tierra cada vez que manipulaba al animal durante los registros.

Vagotomías. Se completó una transección quirúrgica del nervio vago proximal o distal a los electrodos de gancho, considerando el cerebro como punto de referencia (Fig. 2D). Después de la colocación del nervio vago en los electrodos de gancho, se pasó una sutura de seda por debajo y se aseguró al nervio vago con un solo nudo. Se usó cianoacrilato de etilo para adherir el nervio vago a la sutura de seda y se completó la transección quirúrgica.

Respuestas provocadas del NV. El nervio vago se colocó sobre un pañuelo de papel húmedo dispuesto sobre una plataforma acrílica a medida y se mantuvo húmedo usando líquido cefalorraquídeo artificial (NaCl 126 mM, NaHCO₃26 mM, glucosa 10 mM, KCl 2,5 mM, CaCl²2,4 mM, MgCh 1,3 mM, y NaH²PO⁴1,2 mM). Un electrodo de registro (pipeta de vidrio llena de NaCl 2M) y un electrodo de estimulación (FHC, Bowdoin, ME) se colocaron sobre el nervio vago, con el último a 4-5 mm de distancia del primero (y más lejos de la cabeza). Las señales se amplificaron (x1000, modelo 1800, AM Systems, Everett WA) y se digitalizaron (30 kHz) a través de un sistema de adquisición (unidad Micro1400 y software Spike2 versión 7, CED, Cambridge, RU). Se administraron estímulos (20 ps de duración) de intensidad creciente (1-50 V) con un estimulador (SD9, Grass, Warwick RI) para generar curvas de entrada/salida (incrementos de 1 V en el intervalo de 1-10, incrementos de 5 V en el intervalo de 10-50), que se generaron primero en una solución salina y, a continuación, en el entorno de lidocaína (2 %) o tetrodotoxina (100 μM). Las respuestas se evaluaron integrando el área entre la curva de respuesta y el valor de referencia (determinado 1-10 ms antes de la estimulación).

Análisis de los datos. Se usó el software Spike2 (versión 7, CED) para el análisis de registros sin procesar, los cuales fueron filtrados (usando un filtro de paso alto con un borde de 160 Hz) y suavizados. Las señales neuronales se identificaron mediante la metodología de umbral adaptativo especificada por el usuario. Se revisaron los potenciales de acción compuestos (CAP) identificados y se eliminaron manualmente las señales capturadas erróneamente por el umbral adaptativo. También se ignoraron todas las áreas de saturación de señal, así como señales correspondientes a componentes cardíacos y respiratorios. Después de este procesamiento de la señal, la información sobre velocidad y patrones de codificación temporal se extrajo y se analizó más a fondo usando el software OriginPro (versión 8, OriginLab, Northampton, MA). Los neurogramas se definieron como el primer intervalo de tiempo en el que la frecuencia de CAP fue >3x el nivel de referencia. Los neurogramas de TNF e IL-1p se extrajeron y se sometieron a la transformada rápida de Fourier (FFT) para el análisis de PSD (resolución de frecuencia de 3,9 Hz, usando una ventana de Hanning). En el dominio de la frecuencia, se aplicaron filtros de muesca (60 ± 10 y 120 ± 10 Hz) para minimizar la contribución del ruido eléctrico junto con su armónico dominante. Los datos se interpolaron linealmente entre los intervalos filtrados por muescas. Las áreas bajo las PSD (intervalo de 20 a 400 Hz) se calcularon para cada respuesta a citocina.

Pruebas estadísticas. Los datos se presentan como muestras individuales, media ± SD y media ± SEM. La prueba de Shapiro-Wilk se usó para probar la normalidad. Se usaron ANOVA, la prueba t de Student, la prueba U de Mann-Whitney y la prueba de Kolmogorov-Smirnov para examinar la significación estadística. Los valores de p < 0,05 fueron considerados significativos.

Resultados

Los registros del NV capturan potenciales de acción compuestos neuronales. Para investigar la actividad neuronal del nervio vago, se construyó un sistema de registro electrofisiológico con tres electrodos de gancho. Las señales se digitalizaron, se sometieron a algoritmos de filtrado de paso alto y suavizado posterior a la adquisición (como se describe en Métodos). La señal registrada mostró excursiones periódicas desde la situación de referencia que correspondían a componentes cardíacos (amplitud, 30-80 pV, con una duración de 4-5 ms) y respiratorios (amplitud, ~50 pV, con una duración de ~120 ms). De manera destacable, contenidos dentro de la señal, hubo picos discretos aperiódicos de amplitud variable que duraron ~2 ms (Fig. 1A). Se usó una técnica de umbral adaptativo para identificar estos picos rápidos (Fig. 1B) y suponer que correspondían a potenciales de acción compuestos (CAP), que fueron generados por la descarga casi al unísono de múltiples axones. Para probar si los picos realmente reflejaban la actividad neuronal, se realizaron estudios de activación e inhibición nerviosa. En el primero, después de la adquisición de la situación de referencia, se aplicó KCl (4 mM) al campo quirúrgico muy cerca del nervio vago para despolarizar el tejido neuronal. Este tratamiento produjo un aumento significativo en la actividad neuronal (Fig. 1B), con CAP individuales que mostraban una gran amplitud y una forma estereotípica (Fig. 1B). Al estimular eléctricamente la preparación del nervio vago con pulsos breves de intensidades crecientes, se obtuvieron CAP provocados de amplitudes crecientes (Fig. 1C, D). La aplicación de lidocaína, un potente anestésico que bloquea los canales de sodio, dio como resultado una desaparición casi total de los CAP provocados (Fig. 1C). Por otra parte, la aplicación de tetrodotoxina, un bloqueador de los canales de sodio altamente específico, anuló por completo los CAP provocados (Fig. 1D), lo que corrobora la naturaleza neuronal de los registros. Notablemente, la inhibición de la actividad neuronal no eliminó por completo los componentes cardíaco y respiratorio, que probablemente eran una combinación de señales electrocardíacas, señales electromiográficas y artefactos de movimiento (datos no mostrados).

Naturaleza aferente de los neurogramas del NV. El examen de la actividad de referencia del nervio vago indicó que los ratones anestesiados no estimulados mostraron una activación mínima (Fig. 2A) con una frecuencia media de CAP subyacente de 7,6 ± 1,6 Hz (media ± SEM, N = 36 registros con una duración >10 minutos). Los trazos se dividieron en intervalos de 60 segundos, que revelaron largos períodos de completa quiescencia (N = 85 eventos con frecuencia de CAP = 0) que fueron interrumpidos por breves períodos de fuerte actividad neuronal. La distribución de frecuencia de CAP para eventos no silenciosos no se distribuyó normalmente (N = 275, P = 0, W = 0,69, prueba de Shapiro-Wilk), con la mayoría de los eventos ocurriendo a muy baja frecuencia y unos pocos ocurriendo en la cola de alta frecuencia (Fig. 2B). Se realizó una prueba inicial de la hipótesis de que el estado inflamatorio periférico de un organismo puede representar un componente de la función sensorial del nervio vago aplicando TNF (50 |jg en 200 jl, i.p.), mientras se registraba continuamente la actividad del nervio vago. El neurograma posterior a la inyección resultante mostró un aumento agudo en la actividad neuronal (Fig. 2A), con una fracción de CAP que se produjeron con una frecuencia mucho mayor que la situación de referencia (Fig. 2B). El neurograma mejorado que sigue a la administración de TNF podría reflejar señales sensoriales, señales motoras, o incluso ambas, que se desplazan a través del nervio vago. Para probar directamente la direccionalidad de la señal, se realizaron vagotomías proximales y distales (en relación con el cerebro) antes de administrar TNF (Fig. 2C). Con una transección proximal, las fibras aferentes que se dirigían hacia los electrodos de registro desde los órganos viscerales permanecieron intactas, mientras que las fibras eferentes ya no interactúan con los electrodos. Ocurrió lo contrario con la vagotomía distal, en la que los electrodos de registro ya no accedían a las fibras aferentes pero las fibras eferentes permanecían intactas. Para cada experimento, se identificaron los CAP y las frecuencias medias de los CAP se representaron gráficamente en los registros (Fig. 2D). Para evaluar las respuestas, se consideraron intervalos de 10 minutos inmediatamente antes y después de la inyección de TNF. Con la vagotomía proximal, la frecuencia de CAP mostró un aumento significativo desde la situación de referencia (pre, 5,8 ± 2,8, post, 39,5 ± 9,1 Hz, media ± SEM). En marcado contraste, la vagotomía distal dio como resultado una mejora nula (pre, 5,7 ± 1,3, post, 2,9 ± 1,5 Hz, media ± SEM). La comparación de las frecuencias de CAP individuales posteriores a la inyección (Fig. 2E) demostró aún más la diferencia significativa entre transecciones proximales y distales (P = 0,03, T = 3,28, prueba t). Estos datos indican que la primera respuesta registrada en los neurogramas del nervio vago cervical, después de la administración de citocina, incluye y requiere la función sensorial del nervio vago.

Neurogramas del NV inducidos por atocinas proinflamatorias. Para diseccionar aún más la actividad neuronal asociada con los estímulos inflamatorios, los patrones de respuestas entre TNF e IL-1p se compararon usando citocinas proinflamatorias exógenas purificadas que se inyectaron en la cavidad peritoneal. Se usó inyección de solución salina como control (Fig. 3A). La aplicación de TNF (50 jg en 200 jl, i.p.) fue seguido por un aumento notable en la actividad (Fig. 3B). El análisis de intervalos de 10 minutos (inmediatamente antes y después de TNF) reveló una frecuencia media de CAP significativamente mayor después de TNF (pre, 4,1 ± 3,7, post, 19,8 ± 4,2 Hz, N = 6, P = 0,013, U = 2, prueba de Mann-Whitney [MW]). La frecuencia máxima de CAP, definida como el valor máximo dentro del intervalo, también fue significativamente elevada después de TNF (pre, 19,8 ± 5,9, post, 69,0 ± 17,8 Hz, N = 6, P = 0,005, U = 0, prueba de MW). Tanto el inicio como la terminación de las curvas de actividad fueron rápidos, ocurriendo en el orden de segundos. Por otra parte, el período que siguió a la mejora inducida por TNF tuvo una frecuencia media de CAP (7,4 ± 4,7 Hz) que fue similar a la actividad de referencia.

A continuación, los neurogramas del nervio vago se evaluaron en el contexto de la inyección de IL-1p (350 ng en 200 jl, i.p.). Curiosamente, la respuesta máxima a IL-1p ocurrió antes que la de TNF (Fig. 3C). Por esta razón, se usó un intervalo de 5 minutos para evaluar las respuestas inmediatamente antes y después de la inyección de IL-1p. La frecuencia media de ^cA^pfue significativamente mayor después de la citocina (pre, 6,9 ± 3,6, post, 25,5 ± 4,9 Hz, media ± SEM, N = 8, P = 0,007, U = 6, prueba de MW), así como la frecuencia máxima de CAP (pre, 23,9 ± 11,3, post, 74 ± 10,2 Hz, N = 8, P = 0,013, U = 8, prueba de MW). Después del neurograma realzado de IL-1p, la frecuencia media de CAP volvió al nivel de referencia (4,4 ± 1,9 Hz). Es importante destacar que, el aumento de la actividad del nervio vago desencadenado por las citocinas no reflejó un trauma físico o una alteración de la cavidad peritoneal y sus vísceras porque la inyección i.p. de vehículo solo (200 j l de solución salina estéril) no desencadenó un cambio en la actividad del nervio vago (Fig. 3A), como lo demuestra la frecuencia media de CAP (pre, 11,9 ± 4,9, post, 9,6 ± 4,1 Hz, N = 5, P = 1, U = 12, prueba de MW) y la frecuencia máxima (pre, 106,6 ± 23,0, post, 46,0 ± 11,1 Hz, N = 5, P = 0,037, U = 23, prueba de MW).

Para investigar la dependencia de la dosis de la mejora del neurograma inducida por citocina, se tituló la cantidad de citocina proinflamatoria administrada. Reducir diez veces la cantidad de TNF (5 jg en 200 jl, i.p.) abolió en gran medida la respuesta máxima observada 5 minutos después de inyectar la dosis más alta (50 jg ) de TNF (Fig. 3D). De manera similar, la frecuencia de CAP no aumentó en 150 segundos después de la administración de IL-1p cuando esta disminuyó diez veces (35 ng en 200 jl, i.p.) (Fig. 3E). Los intervalos de tiempo más cortos usados para IL-1p en comparación con TNF reflejaron los diferentes perfiles temporales de activación del neurograma para IL-1p en comparación con TNF. En particular, la respuesta a IL-1p alcanzó su punto máximo antes (150 segundos después de la inyección) en comparación con TNF (300 segundos después de la inyección).

Diferencias entre neurogramas inducidos por TNF e IL-1p. La comparación de las frecuencias medias de CAP (Fig. 4A), antes y después del tratamiento, reveló diferencias significativas entre los grupos de solución salina, TNF e IL-1p (P = 0,0125, F [2, 21] = 5,57, ANOVA unidireccional). Las pruebas post-hoc también mostraron que los valores de TNF e IL-1p fueron significativamente diferentes a los de la solución salina (TNF, P = 0,006, U = 2; lL-1p, P = 0,01, U = 7, prueba de MW). Sin embargo, no hubo diferencia entre las citocinas proinflamatorias (P = 0,65, U = 20, prueba de MW). El análisis de la frecuencia máxima de CAP (Fig. 4B), antes y después del tratamiento, mostró una significación estadística entre los tres grupos (P = 6,5 x 10-4, F [2, 21] = 11,07, ANOVA). Las pruebas post-hoc también demostraron que las respuestas máximas a TNF e IL-1p fueron significativamente diferentes de la solución salina (TNF, P = 0,002, U = 0; IL-1p, P = 0,003, U = 3, prueba de MW). Adicionalmente, los cambios de frecuencia máxima de CAP entre las citocinas proinflamatorias no fueron significativamente diferentes (P = 0,95, U = 23, prueba de MW). Los perfiles temporales de activación del neurograma con los tratamientos con TNF e IL-1p se compararon definiendo el comienzo de la respuesta como el momento en que la frecuencia de CAP aumentó a 3x la velocidad previa a la inyección, y la terminación de la respuesta como el momento en que la frecuencia disminuyó por debajo del mismo valor. Usando estas definiciones, se analizaron la latencia, la duración y la frecuencia media de CAP para las respuestas (Fig. 4C). Los neurogramas inducidos por TNF (N = 6) e IL-1p (N = 7) tuvieron latencias diferentes (TNF, l56,2 ± 40,4, IL-1p, 47,6 ± 15,2 s, P = 0,043, T = 2,52, prueba t). En cambio, la duración de la respuesta (TNF, 185,2 ± 47,2, IL-1p, 222,6 ± 73,8 s, P = 0,68, T = 0,43, prueba t) y frecuencia media de CAP (TNF, 35,92 ± 5,2, IL-ip, 42,7 ± 4,6 Hz, P = 0,35, T = 0,97, prueba t) no fueron diferentes.

Requisito de receptores para los neurogramas inducidos por TNF e IL-1p. Se ha demostrado previamente que los trímeros de TNF pueden formar canales transmembrana independientes del receptor (19). En este caso, la administración de TNF podría, en teoría, activar directamente las neuronas sin involucrar a su receptor. Para probar si las respuestas inducidas por citocinas requerían señalización del receptor de citocinas, se registraron los neurogramas del nervio vago de ratones con inactivación (KO) para receptores. La inyección de TNF en ratones KO para TNFR2 no condujo a un cambio en el neurograma (Fig. 5A), lo que implica una interacción ligando-receptor en la mejora de la respuesta observada. A continuación, se probó el requisito del receptor de IL-1p (IL-1R) en la activación del neurograma inducida por IL-1p. La IL-1p exógena no estimuló el nervio vago cervical en ratones KO para IL-1R (Fig. 5B). En todos los experimentos con ratones KO en los que no se observó una respuesta clara, se aplicó KCl (4 mM) al nervio al final de los experimentos para asegurar la viabilidad del nervio vago (datos no mostrados). Adicionalmente, en estudios cruzados complementarios, la administración i.p. de IL-1 en ratones doble KO para TNFR1/R2 indujo un aumento en la señalización del nervio vago (datos no mostrados). De manera similar, los ratones KO para IL-1R respondieron a la administración i.p. de TNF con actividad del nervio vago aumentada (datos no mostrados).

Para probar el requisito de TNF de longitud completa para la activación del nervio vago, el TNF humano recombinante se digirió en tripsina al 0,05 % durante la noche a 37 °C. La tripsina se inactivó con calor incubando la solución a 95 °C durante 7 minutos. Se confirmó una digestión de aproximadamente el 90 % mediante gel de SDS-PAGE. Se inyectó TNF digerido o de longitud completa (50 μg/animal) en el peritoneo mientras se registraba continuamente desde el nervio vago cervical. Como se esperaba, el TNF digerido con tripsina no reprodujo los efectos del TNF de longitud completa sobre la activación del nervio vago (datos no mostrados).

Potencia espectral de las señales del NVinducidas por TNF e IL-1p. Dado que TNF e IL-1p desencadenan mejoras similares, pero no idénticos, en los neurogramas del nervio vago y que estas señales dependientes del receptor de citocinas involucraban fibras aferentes, se examinó si el nervio vago es capaz de enviar distintas señales en relación con TNF e IL-1p al SNC. Para investigar esta posibilidad, se analizaron las densidades espectrales de potencia (PSD) de las respuestas a TNF e IL-1p, usando registros de neurogramas sin filtrar. Como anteriormente, la respuesta se definió como el primer intervalo de tiempo en el que la frecuencia de CAP residía en 3x el nivel de referencia. PSD representativas para TNF e IL-1p se muestran en la Fig. 6A. A continuación, cada PSD filtrada se integró (de 20 a 400 Hz) para comparar las áreas individuales de las respuestas de TNF e IL-1p (Fig. 6B). El análisis estadístico reveló una diferencia significativa entre los grupos de TNF e IL-1p (N = 7, P = 0,05, D = 0,71, prueba de Kolmogorov-Smirnov). En conjunto, la diferencia en las características temporales de la respuesta y los análisis de potencia en el dominio de la frecuencia demostraron una señalización sensorial neuronal de citocina selectiva a través del nervio vago.

Análisis

El trabajo presentado aquí se suma a la literatura en rápida expansión que describe la interfaz entre la neurociencia y la inmunología, delineando por primera vez el arco aferente del reflejo inflamatorio. El uso de vagotomías quirúrgicas verificó el postulado de que las fibras aferentes del nervio vago pueden funcionar como sensores de citocina que transmiten información al SNC (5-7). Por otra parte, el análisis de neurogramas para TNF e IL-1p revela señalización aferente específica y selectiva del nervio vago en respuesta a citocinas proinflamatorias respectivas.

Se usaron ratones con inactivación (KO) para estudiar la dependencia del receptor del componente sensorial del reflejo inflamatorio. La ausencia total de mejora del neurograma en los animales KO para receptores emparejados con la citocina administrada (pero no en los animales KO para receptores emparejados incorrectamente con la citocina administrada) implica al receptor de citocina correspondiente en la activación específica del nervio vago inducida por citocina. En resumen, las interacciones citocina-receptor median la respuesta del neurograma. A nivel celular, el mecanismo por el cual las citocinas sistémicas desencadenan la activación neuronal en el nervio vago sigue siendo un área activa de investigación. Varios estudios han demostrado la presencia de receptores de citocina funcionales dentro de las poblaciones neuronales, de manera que la activación de estos receptores es capaz de modular la excitabilidad neuronal (10-12). Un informe reciente ha demostrado que los productos bacterianos pueden activar directamente una población específica de neuronas sensoriales (13). De ello se deduce que las citocinas proinflamatorias pueden activar directamente las fibras del nervio vago sensorial dentro del peritoneo. De forma alternativa, es posible que se requieran poblaciones intermedias de células somáticas que expresan receptores para detectar la citocina y, a su vez, estimular las neuronas.

Notablemente, las diferencias entre TNF e IL-1p indican que el SNC puede discriminar entre un conjunto diverso de mediadores inflamatorios. Esta noción tiene una fuerte base teleológica porque el SNC recibe un flujo sensorial continuo perteneciente al entorno interno del cuerpo, del cual las señales que transmiten la inflamación sistémica deben constituir un elemento clave para la homeostasis y la supervivencia de un animal. Con el suministro rápido de señales sobre el estado inflamatorio (e inflamatorio) periférico, un organismo sería más capaz de iniciar respuestas fisiológicas y conductuales apropiadas a los desafíos inmunológicos y ambientales.

Además de las diferencias temporales observadas en la mejora del neurograma entre TNF e IL-1p, las densidades espectrales de las respuestas individuales (Fig. 6) proporcionan evidencia adicional de la existencia de características discriminatorias entre las actividades del nervio vago desencadenadas por citocina que podrían ser interpretadas por los centros del SNC, tales como el núcleo del tracto solitario. Existe amplia evidencia de que muchas estructuras corticales y subcorticales dentro del SNC pueden distinguir las características espectrales de las señales y usarlas en procesos tan diversos como la codificación de la memoria, la toma de decisiones y el cambio entre estados de sueño (14-16). Ya sea solas o en combinación, las diferencias observadas en las métricas de dominio de tiempo y frecuencia pueden representar el sustrato biológico para la discriminación de citocinas periféricas por parte del s Nc .

La interfaz entre la neurociencia, la inmunología y la medicina clínica está cada vez más en primer plano, especialmente a medida que el uso de dispositivos eléctricos como agentes terapéuticos para enfermedades se convierte en una realidad y da forma al campo emergente de la medicina bioelectrónica (17). Por ejemplo, un ensayo clínico reciente que usó la estimulación del nervio vago para tratar la artritis reumatoide resultó exitoso (18).

EJEMPLO 2. La estimulación acústica usando neurograma mediado por IL1p induce niveles aumentados de citocinas inflamatorias circulantes. Actualmente no se reivindican realizaciones del ejemplo 2 relativas a citocinas, pero son útiles para comprender la invención

El paradigma para inducir un fenotipo inflamatorio en ratones no tratados anteriormente mediante estimulación acústica usando una señal específica de IL1p se ilustra en la Fig. 7. Se registraron neurogramas específicos de interleucina-1p (IL-1p) y de referencia a partir del nervio vago cervical de ratones adultos. Se extrajo la señal de referencia o específica de IL1 p del neurograma de nervio vago obtenido del ratón A y se convirtió en un archivo'Wav'. La señal de referencia o específica de IL1p se transfirió a otro ratón receptor B no tratado anteriormente mediante estimulación acústica (activación en serie 1^xo 3X). Los niveles de citocinas circulantes se analizaron en el ratón B después de 1 h. La señal específica de IL1p pero no la de referencia indujo un fenotipo inflamatorio en ratones receptores no tratados anteriormente (Fig. 8).

EJEMPLO 3. Neurogramas del nervio vago específicos para estados de euglucemia, hiperglucemia e hipoglucemia.

Registro de neurograma hipoglucémico. Los ratones no tratados anteriormente recibieron una inyección en embolada de insulina (6 mg/kg) y se registró la actividad del nervio vago a lo largo del tiempo (Fig. 9). Los niveles de glucosa en sangre se monitorizaron después de cada 2,5 minutos. La insulina indujo un estado hipoglucémico en ratones. Los niveles de glucosa en sangre se indican en la línea superior de la Fig. 11 en mg/dl.

Registro de neurograma euglucémico. Los ratones no tratados anteriormente recibieron una inyección en embolada de glucagón (1 mg/kg) y se registró la actividad del nervio vago a lo largo del tiempo (Fig. 10). Los niveles de glucosa en sangre se monitorizaron cada 2,5 minutos. Los niveles de glucosa en sangre se indican en la línea superior de la Fig. 11 en mg/dl.

Registro de neurograma hiperglucémico. Los ratones no tratados anteriormente recibieron una inyección en embolada de glucosa, y se registró la actividad del nervio vago a lo largo del tiempo (Fig. 11). Los niveles de glucosa en sangre se monitorizaron cada 2,5 minutos. La glucosa indujo un estado hiperglucémico en ratones. Los niveles de glucosa en sangre se indican en la línea superior de la Fig. 13 en mg/dl.

EJEMPLO 4. Control de los niveles de glucosa en sangre en sujetos humanos mediante reproducción acústica de neurogramas vagales específicos para estados de hiperglucemia o hipoglucemia

Los efectos sobre los niveles de glucosa en sangre en sujetos humanos sanos se determinaron en respuesta a la reproducción acústica de neurogramas específicos de hipoglucemia, neurogramas específicos de hiperglucemia o neurogramas específicos de euglucemia.

La Fig. 12 ilustra un paradigma para aumentar los niveles de glucosa en sangre en sujetos humanos sanos mediante estimulación acústica usando una señal específica de hipoglucemia registrada a partir del nervio vago. Los ratones no tratados anteriormente recibieron una inyección en embolada de insulina (6 mg/kg) y se registró la actividad del nervio vago a lo largo del tiempo. La insulina indujo un estado hipoglucémico en ratones. La señal se convirtió en un archivo 'wav' y se transfirió como salida de audio a sujetos humanos sanos. Los niveles de glucosa en sangre se monitorizaron en sujetos humanos a intervalos de tiempo regulares. La reproducción acústica del neurograma específico de hipoglucemia indujo hiperglucemia en sujetos humanos sanos (Fig. 13).

En otro conjunto de experimentos, se registraron neurogramas del nervio vago de ratones no tratados anteriormente que recibieron una inyección en embolada de glucosa, y se registró la actividad del nervio vago a lo largo del tiempo. Los niveles de glucosa en sangre aumentaron en los ratones que recibieron glucosa. El neurograma del nervio vago se convirtió en un archivo 'wav' y se transfirió como salida de audio a sujetos humanos sanos. Los niveles de glucosa en sangre se monitorizaron a lo largo del tiempo (n=3/grupo). La reproducción acústica del neurograma específico de hiperglucemia indujo hipoglucemia en sujetos humanos sanos (Fig. 14).

En un conjunto de experimentos de control, se registraron neurogramas del nervio vago de ratones no tratados anteriormente que recibieron una inyección en embolada de glucagón (1mg/kg) y se registró la actividad del nervio vago a lo largo del tiempo. Los niveles de glucosa en sangre no cambiaron en ratones que recibieron glucagón. A continuación, el neurograma se reprodujo como un archivo 'wav' para sujetos humanos sanos y los niveles de glucosa en sangre se monitorizaron a lo largo del tiempo (n=5/grupo). La reproducción acústica del neurograma específico de euglucemia no indujo un cambio en los niveles de glucosa en sangre en sujetos humanos sanos (Fig. 15).

EJEMPLO 5. La reproducción acústica en sujetos humanos usando neurograma vagal específico de cortisol induce hiperglucemia

Registro de neurograma inducido por hidrocortisona de ratón. La inyección de una embolada de hidrocortisona (cortisol) (10 mg/ratón) en ratones no tratados anteriormente indujo un neurograma específico que se registró a partir del nervio vago (Fig. 16).

La administración de cortisol induce hipoglucemia en ratones. Los ratones no tratados anteriormente recibieron solución salina o cortisol mediante administración intraperitoneal. Los niveles de glucosa en sangre se monitorizaron a lo largo del tiempo. La administración de cortisol, pero no la administración de solución salina, indujo hipoglucemia (Fig. 17).

La reproducción acústica del neurograma específico de cortisol indujo hiperglucemia en sujetos humanos sanos. Se extrajo una señal específica de cortisol de un neurograma obtenido a partir del nervio vago de un ratón después de administración i.p. de cortisol. Para generar una señal de control, la señal específica de cortisol se transformó en una señal codificada usando un código matlab que genera una señal aleatorizada con las mismas amplitudes, pero frecuencias aleatorias, manteniendo la potencia total de la señal. La señal específica de cortisol o codificada se convirtió en un archivo 'wav' y se transfirió como salida de audio a sujetos humanos sanos. Los niveles de glucosa en sangre se monitorizaron en sujetos humanos a intervalos de tiempo regulares. La reproducción acústica del neurograma específico de cortisol indujo hiperglucemia en sujetos humanos sanos (Fig. 18).

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18. Koopman FA et al. (2012) Pilot study of stimulation of the cholinergic anti-inflammatory pathway with an implantable vagus nerve stimulation device in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 64(10 Suppl):S195.

19. Kagan BL, Baldwin RL, Munoz D, Wisnieski BJ (1992) Formation of ion-permeable channels by tumor necrosis factor-alpha. Science 255(5050):1427-1430.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para producir un archivo .wav en donde el archivo .wav se puede reproducir como un estímulo de energía acústica para su uso posterior en el tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad o trastorno, en donde la enfermedad o trastorno es hiperglucemia o hipoglucemia, comprendiendo el método generar el archivo .wav basándose en un neurograma del nervio vago específico de un mediador endógeno o específico de un agente farmacológico, método que comprende extraer una porción del neurograma previamente registrado a partir de un nervio vago y convertirlo en el archivo ".wav", en donde

- el estímulo de energía acústica es para su uso posterior para aumentar los niveles de glucosa en sangre en el sujeto en donde el neurograma es un neurograma específico de insulina o específico de cortisol que se ha registrado a partir del nervio vago después de la administración de insulina o cortisol, o

- el estímulo de energía acústica es para su uso posterior para disminuir los niveles de glucosa en sangre en un sujeto en donde el neurograma es un neurograma específico de glucosa que se ha registrado a partir del nervio vago después de la administración de glucosa.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el neurograma específico de un mediador endógeno o específico de un agente farmacológico se obtiene usando un modelo animal o a partir de un paciente humano.

3. El método de la reivindicación 1, en donde el neurograma específico de un mediador endógeno o específico de un agente farmacológico es uno que se ha obtenido desde una rama del nervio vago hasta un órgano específico o porción de un órgano.