ES2953471T3 - Proceso fermentativo para la fabricación de maltosil-isomaltooligosacáridos (MIMO) - Google Patents

Abstract

En el presente documento se describen métodos eficientes y de bajo costo para preparar prebióticos que contienen maltosil-isomaltooligosacáridos (MIMO), así como composiciones preparadas mediante tales métodos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Proceso fermentativo para la fabricación de maltosil-isomaltooligosacáridos (MIMO)

Campo de la invención

Esta solicitud se refiere a composiciones que contienen maltosil-isomaltooligosacáridos (MIMO), a alimentos para animales que contienen dichas composiciones y a composiciones o alimentos para animales para usar en el tratamiento de animales para la generación de un microbioma que inhiba la invasión de patógenos.

Antecedentes

Con el aumento de bacterias resistentes a los antibióticos, la eliminación del uso de antibióticos en el ganado se ha convertido en una necesidad. T radicionalmente, los antibióticos se han utilizado para mantener el ganado sano y libre de patógenos humanos, incluidos Salmonela (typhimurium), Campylobacter (jejuni) y Escherichia (coli) spp. (Swartz, M., Clin. Infect. Dis., 2002, 34:S111-S112; Bergeron, C.R. y col., Emerging Infectious Diseases, 2012, 18:415-421). Sin embargo, la aplicación generalizada de antibióticos en bovinos, porcinos y pollos puede dar lugar a la creación de especies bacterianas resistentes a los antibióticos. Esto se ha observado en pollos, especialmente donde se encontró que las Salmonella spp. eran particularmente resistentes a la oxitetraciclina (Evangelisti, D.G. y col., Antimicrob. Agents Chemother., 1975, 8:664-672). Los mismos antibióticos que se utilizan en alimentos para animales también se utilizan para tratar enfermedades en el hombre (Phillips, I. y col., J. Antimicrob. Chemother., 2004, 53:28-52), lo que conduce a la propagación de bacterias resistentes en poblaciones humanas.

Los prebióticos ofrecen una alternativa viable a los antibióticos en la materia prima. Tanto en seres humanos como en animales, se ha demostrado que la salud del huésped está íntimamente relacionada con la microbiota intestinal (Stanley, D. y col., Appl. Microbiol. Biotechnol. 2014, 98:4301-4310). Un microbioma sano y equilibrado actúa como una barrera contra los patógenos invasores y produce sustratos metabólicos (en particular, ácidos grasos de cadena corta) que favorecen el crecimiento de las células epiteliales intestinales, mejorando la absorción de calorías nutritivas, vitaminas, minerales, etc. Los prebióticos que están mejor documentados son fructooligosacáridos y derivados de los mismos, pero hay otros oligosacáridos no digeribles que han demostrado tener resultados similares y, por lo tanto, también debería hacerlo un isomaltooligosacárido (Hu, Y. y col., Lett. Appl. Microbiol., 2013, 57:108-114).

Sin embargo, algunos de los mejores prebióticos son costosos de fabricar y sería necesario tratar a muchos animales para reducir la incidencia de la resistencia a los antibióticos. Por lo tanto, actualmente la fabricación y el uso de tales prebióticos para animales es prohibitivamente caro.

El documento WO 2016/029198 (Masden y col., Isothrive) describe un método para la preparación de oligosacáridos que comprende: (a) poner en contacto una materia prima que comprende una relación fija de sacarosa a maltosa con un microorganismo productor de dextransacarasa en un medio de cultivo acuoso; (b) fermentar la materia prima con las células bacterianas a un pH entre 4 y 8; (c) eliminar las células bacterianas; y (d) depurar; en donde la composición final de los oligosacáridos producidos varía según el pH seleccionado y la relación de materia prima inicial empleada. Los microorganismos empleados en los ejemplos incluyen L. citreum, Leuconostoc mesenteroides, especies mixtas de Leuconostoc y Pediococcus pentosaceus. La depuración puede implicar la eliminación de impurezas insolubles, la decoloración o eliminación de cenizas y los oligosacáridos finales producidos pueden estar esencialmente exentos de cenizas, ácidos minerales, proteínas residuales, alcoholes de azúcar y ácidos orgánicos.

Descripción de las Figuras

La Figura 1 ilustra la evolución de la distribución del peso molecular promedio en masa (MWD) de maltosilisomaltooligosacáridos (MIMO) a lo largo del tiempo, donde los MIMO se formaron por fermentación de jarabe con alto contenido en maltosa Satin Sweet™ y azúcar blanco refinado (sacarosa) de caña de azúcar. La MWD es similar a la observada cuando se utiliza monohidrato de maltosa de alta pureza en una relación similar de sacarosa:maltosa.

La Figura 2 muestra una comparación de cromatogramas de HPAEC-PAD de lo siguiente: 1. Caldo de MIMO de calidad alimentaria, 2. Satin Sweet™ reducido en un factor de 5 y 3. Caldo de MIMO de calidad para alimentación de animales hecho de jarabe con alto contenido en maltosa Satin Sweet™ y azúcar blanco refinado (sacarosa) de caña. El pico A corresponde a D-leucrosa, el pico B corresponde a sacarosa; el pico C corresponde a maltosa; los picos D­ I corresponden a MIMO DP 3-8 y los picos J-L corresponden a maltodextrinas DP 3-5. Con la excepción de las maltodextrinas con DP 3-5, el producto se conformó, cromatográficamente, con un producto de MIMO de calidad alimentaria apto para el consumo humano.

La Figura 3 muestra una comparación de cromatogramas de HPAEC-PAD de lo siguiente: 1. Caldo de MIMO de calidad alimentaria, 2. Satin Sweet™ reducido en un factor de 5 y 3. Caldo de MIMO de calidad para alimentación de animales hecho de jarabe con alto contenido en maltosa Satin Sweet™ y azúcar sin refinar de calidad comercial (sacarosa) de caña. El pico A corresponde a D-leucrosa; el pico B corresponde a sacarosa; el pico C corresponde a maltosa; los picos D-I corresponden a MIMO DP 3-8; y los picos J-M corresponden a maltodextrinas con DP 3-6. Con la excepción de las maltodextrinas DP 3-6, el producto se conformó, cromatográficamente, con un producto de calidad alimentaria apto para el consumo humano.

La Figura 4 muestra dos cromatogramas, inferior y superior, de lo siguiente: 1. medios previos al inóculo de sacarosa y almidón de patata sacarificado, y 2. caldo de fermentación final. A modo de comparación, el cromatograma 3 es un caldo decolorado de calidad alimentaria elaborado como se describe por Madsen y Oswald (PCT/US2017/013957 presentada el 18 de enero de 2017 y solicitud provisional US-62/280.026, presentada el 18 de enero de 2016). El pico A corresponde a D-leucrosa; el pico B corresponde a sacarosa; el pico C corresponde a maltosa; los picos D-I corresponden a MIMO DP 3-8; y los picos J-L corresponden a maltodextrinas con D^p 3-5. Con la excepción de las maltodextrinas DP 3-5, el producto se conformó, cromatográficamente, con un producto de MIMO de calidad alimentaria apto para el consumo humano.

La Figura 5 muestra dos cromatogramas de HPAEC, donde el cromatograma superior (designado 1) ilustra la composición del caldo de medios de un cultivo de W. confusa NRRL B-1064, y el cromatograma inferior (designado 2) ilustra un producto elaborado mediante fermentación con L. citreum NRRL B-742. El pico A corresponde a glicerol, el pico B corresponde a manitol, el pico C corresponde a L-arabinosa (IS), el pico D corresponde a glucosa, el pico E corresponde a fructosa, el pico F corresponde a sacarosa, el pico G corresponde a maltosa y los picos H-X corresponden a MIMO con valores DP de DP3 a D19.

Descripción detallada

La solicitud describe métodos eficientes y de bajo costo para fabricar prebióticos que contienen maltosilisomaltooligosacáridos (MIMO). Dichos prebióticos son útiles como una alternativa viable a los antibióticos para la administración a animales. Las composiciones prebióticas de MIMO descritas en el presente documento ayudan a generar un microbioma saludable y equilibrado dentro del sistema digestivo de los animales, incluidos mamíferos, aves y peces. Por ejemplo, dicho microbioma actúa como una barrera para los patógenos invasores y produce sustratos metabólicos (por ejemplo, ácidos grasos de cadena corta) que favorecen el crecimiento de las células epiteliales intestinales, mejoran la absorción de calorías nutritivas, vitaminas y minerales, y proporcionan una inmunomodulación beneficiosa. Por ejemplo, la administración de un probiótico (p. ej., que contiene Lactobacillus salivarius) a pollitos de un día puede protegerlos de enfermedades por un tiempo. Dicha administración de un día de un probiótico más la administración de niveles bajos de las composiciones preparadas como se describe en el presente documento a lo largo del tiempo proporciona una protección sostenida. Si los animales tienen un microbioma razonablemente sano y equilibrado dentro de sus sistemas digestivos, la administración de las composiciones descritas en el presente documento puede mantener e incluso mejorar el funcionamiento de dichos microbiomas y de los sistemas digestivos de los animales.

Maltosil-isomaltooligosacáridos (MIMO)

“ Maltosil-isomaltooligosacáridos” , o MIMO, se refiere a oligosacáridos, glucanos de isomaltooligosacáridos, de menos de 30 (a veces menos de 10) grados de polimerización compuestos por enlaces a-(1—6) terminados mediante un enlace a-(1—4) en el extremo reductor. El grupo terminal a-(1—4) está compuesto por maltosa. Por lo tanto, el maltosilisomaltooligosacárido, o MIMO (o IMOM/IMOG, según la convención de la IUPAC), se produce mediante una reacción aceptora, donde el aceptor es típicamente maltosa u otro isomaltooligosacárido. Un ejemplo de un MIMO con un solo enlace maltosilo [-O-a-(1,4)-] en el extremo reductor es la maltosil-isomaltotriosa, que tiene la siguiente estructura química:

Los MIMO pueden generarse mediante los métodos descritos en el presente documento a partir de una mezcla de fermentación que incluye una fuente impura de un donante de glucosilo (p. ej., una fuente de azúcar sin refinar de glucosa o sacarosa) y un aceptor de azúcar. Los ejemplos de aceptores de azúcar incluyen residuos de azúcar tales como maltosa, isomaltosa, lactosa, alfa metil glucósidos, ácido a-d-glucopiranosil-(1—5)-d-arabinónico, a-dglucopiranosil-(1 —>4)-d-glucitol, a-d-glucopiranosil-(1 —>6)-d-glucitol, a-d-glucopiranosil-(1 —6)-d-manitol, a-dfructofuranosil-p-d-fructofuranosil-(1,2 ':2,3')-dianhídrido, 1,5-anhidro-2-desoxi-d-arabino-hex-1-enitol ('d-glucal') y combinaciones de los mismos. En muchos casos, la maltosa o la isomaltosa son buenos aceptores

Los métodos para generar MIMO pueden implicar el uso de una mezcla de fermentación que contiene un microorganismo productor de dextransacarasa en un medio de cultivo acuoso, donde el medio puede tener una relación de sacarosa a maltosa que varía, por ejemplo, de aproximadamente 0,20 a 7,0, o de aproximadamente 0,5 a 4,0, o de 2,0 a aproximadamente 4,0 en el momento de la inoculación, y donde la sacarosa y/o la maltosa pueden ser sacarosa impura y/o maltosa impura. La mezcla de fermentación se incuba durante un tiempo y en condiciones suficientes para generar una composición que contiene maltosil-isomaltooligosacárido con una distribución de peso molecular promedio en masa de aproximadamente 650 a 1000 daltons, o de 650 a 1500 daltons, o de 650-2000 daltons.

Los MIMO se preparan utilizando fuentes impuras de sacarosa y maltosa. Una fuente “ impura” de sacarosa o maltosa no contiene niveles detectables de compuestos tóxicos. Por ejemplo, los MIMO no contienen compuestos tóxicos, metales pesados o materiales tóxicos detectables por HPAEC-PAD, HPLC, espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente (ICP-MS) o HPLC-RID.

Sin embargo, tales fuentes impuras pueden contener menos del 100 % de sacarosa o maltosa. Por ejemplo, las fuentes impuras de sacarosa o maltosa pueden contener menos del 99 %, menos del 99,5 %, menos del 98 %, menos del 98,5 %, menos del 98 %, menos del 97 % o menos del 96 %, o menos del 95 %, o menos del 90 %, o menos del 85 %, o menos del 80 %, o menos del 75 %, o menos del 70 %, o menos del 67 %, o menos del 66 %, o menos del 65 % de sacarosa o maltosa.

Las fuentes impuras de sacarosa y maltosa típicamente contienen más del 30 %, o más del 35 %, o más del 40 %, o más del 45 %, o más del 50 %, o más del 55 %, o más del 60 %, o más del 63 %, o más del 65 %, o más del 66 %, o más del 68 %, o más del 70 %, o más del 75 %, o más del 80 %, o más del 85 %, o más del 90 %, o más del 93 %, más del 94 %, o más del 95 %, o más del 96 %, o más del 97 %, o más del 97,5 %, o más del 98 %, o más del 98,5 % de sacarosa o maltosa.

En algunos casos, la pureza de la fuente de sacarosa es mayor que la pureza de la maltosa. Por ejemplo, la sacarosa de calidad no alimentaria puede tener más del 90 %, o más del 93 %, más del 94 %, o más del 95 %, o más del 96 %, o más del 97 %, o más del 97,5 %, o más del 98 %, o más del 98,5 % de sacarosa. Por el contrario, la fuente de maltosa de calidad no alimentaria puede tener menos del 95 %, menos del 90 %, menos del 85 %, menos del 80 %, menos del 75 %, menos del 70 % o menos del 67 %, o menos del 66 %, o menos del 65 % de maltosa, o menos del 60 %, o menos del 55 %, o menos del 50 %, o menos del 45 %, o menos del 40 %, o menos del 35 %, o menos del 30 % de maltosa.

Las impurezas en las fuentes de maltosa pueden incluir agua, dextrosa, oligosacáridos de tipo maltodextrina y sus polímeros superiores, p. ej., almidón, y mezclas de los mismos. Por ejemplo, las fuentes impuras (p. ej., de calidad no alimentaria) de maltosa pueden incluir almidón y/o dextrano, y mezclas de los mismos. Además, la fuente de maltosa de calidad no alimentaria también puede contener oligosacáridos de maltodextrina como impurezas.

La fuente impura de sacarosa también puede incluir agua, dextrosa, fructosa, maltosa, isomaltosa, oligosacáridos de maltosa, oligosacáridos de isomaltosa, polímeros de maltosa, polímeros de isomaltosa y/o combinaciones de los mismos. La fuente impura de sacarosa también puede incluir maltosa, isomaltosa y/u oligosacáridos que contienen sacarosa o maltosa como impurezas.

Aunque los métodos de fermentación descritos en el presente documento pueden generar eficientemente MIMO a partir de una variedad de fuentes impuras de sacarosa y un aceptor (p. ej., maltosa), es recomendable evaluar la composición de estas fuentes de sacarosa y maltosa de calidad no alimentaria para que las cantidades utilizadas puedan ajustarse dentro de la mezcla de fermentación para proporcionar una relación de sacarosa a maltosa que varíe de aproximadamente 0,20 a 7,0, o de aproximadamente 0,5 a 4,0, o de 2,0 a aproximadamente 4,0 en el momento de la inoculación.

Los ejemplos de fuentes de sacarosa impuras (p. ej., de calidad no alimentaria) incluyen, por ejemplo, azúcar sin refinar (p. ej., disponible comercialmente a partir de caña de azúcar), melaza, jarabe de caña de azúcar, sorgo dulce y/o caña silvestre, pastos, azúcar de remolacha, melaza de remolacha, hojas de remolacha azucarera, jarabe de arce, fuentes de algas (p. ej., Neochloris oleoabundans), caña silvestre y/o cualquier combinación de los mismos. Dichas fuentes impuras de sacarosa se pueden obtener de diversas partes de las plantas, incluidas las hojas, brotes, puntas, tallos, semillas o combinaciones de las mismas. En algunos casos, la sacarosa se puede obtener de toda la planta. La caña silvestre (Sacharum spontaneum) es caña de azúcar que ha sido criada y seleccionada para la producción de biomasa o fibra sobre sacarosa

Los ejemplos de fuentes de maltosa impuras (p. ej., de calidad no alimentaria) incluyen, por ejemplo, jarabe de maltosa, jarabe con alto contenido en maltosa, malta, almidón sacarificado y combinaciones de los mismos. El almidón puede incluir almidón de choclo/maíz, almidón de patata, almidón de tapioca, almidón de trigo, almidón de avena, almidón de mijo/sorgo, almidón de arroz, almidón de amaranta, almidón de taro, almidón de kudzu, almidón de ñame y/o cualquier combinación de los mismos.

La fuente de maltosa utilizada para el proceso de fermentación (p. ej., Satin Sweet™) puede contener algo de glucosa. Por ejemplo, las fuentes de maltosa pueden incluir de aproximadamente el 0,1 a aproximadamente el 15 % de glucosa, o de aproximadamente el 0,1 a aproximadamente el 12 % de glucosa, o de aproximadamente el 0,1 a aproximadamente el 10 % de glucosa, o de aproximadamente el 0,1 a aproximadamente el 5 % de glucosa, o de aproximadamente el 0,2 % a aproximadamente el 4 % de glucosa, o de aproximadamente el 0,5 % a aproximadamente el 3 % de glucosa. Las fuentes de maltosa pueden incluir oligosacáridos. Por ejemplo, las fuentes de maltosa de calidad no alimentaria pueden incluir oligosacáridos con aproximadamente 3 a aproximadamente 8 unidades de azúcar.

En algunos casos, la fuente de maltosa para una calidad no alimentaria puede incluir Satin Sweet™, que típicamente tiene al menos el 50 % de maltosa o al menos el 60 % de maltosa. Un ejemplo de una composición de un lote de Satin Sweet™, que se puede utilizar como fuente de maltosa, tiene la siguiente composición:

Brix g/100 g de DS 82,7

glucosa, %/brix 2,21

maltosa, %/brix 65,70

DP 3, %/brix 16,24

DP 4, %/brix 2,29

DP 5, %/brix 0,76

DP 6, %/brix 0,39

DP 7, %/brix 0,09

Los términos DP 3, DP 4, DP 5, DP 6 y DP 7 en la lista anterior se refieren a maltodextrinas con diferentes grados de polimerización (DP 3-7).

Las fuentes impuras de maltosa más complejas, tales como el almidón, pueden tratarse para liberar maltosa. Por ejemplo, el almidón se puede incubar con a-amilasa, con o sin isoamilasa, pululanasa y/o dextranasa añadidas para sacarificar el almidón y, por lo tanto, liberar maltosa. Dicha incubación se puede realizar hasta que el brix de la mezcla de incubación indique que la mayor parte de la maltosa se ha liberado del almidón. El grado de sacarificación puede confirmarse mediante análisis HPAEC-PAD/HPLC-RID antes de su uso en la fermentación. El producto de maltosa resultante también se puede filtrar y/o concentrar antes de su uso en el proceso de fermentación.

En el presente documento se describen tres ejemplos que detallan fermentaciones utilizando (1) Sustitución de monohidrato de maltosa (>95 %) con jarabe de maltosa al 65 %, (2) Sustitución de monohidrato de maltosa (>95 %) con jarabe de maltosa al 65 % y sustitución de azúcar blanco refinado con un producto comercial de azúcar sin refinar, y (3) Sustitución de monohidrato de maltosa (>95 %) con almidón de patata sacarificado para demostrar la flexibilidad que es posible con respecto a la materia prima en relación con una distribución uniforme de productos de MIMO.

La fermentación es un método fiable para la fabricación industrial de composiciones reproducibles de MIMO. El tamaño y la composición de los productos de MIMO pueden controlarse estrechamente durante la fermentación. Al iniciar el proceso de fermentación, todo el sistema del equipo se puede enjuagar, limpiar y esterilizar. Después, se puede cargar un tanque de fermentación con los componentes del medio (p. ej., con vitaminas, sulfatos, fosfatos, sales y otros materiales utilizados para el crecimiento bacteriano, tales como los medios recomendados por la ATCC para utilizarlos en el crecimiento del microorganismo que se está cultivando, incluidos, por ejemplo, ingredientes y medios de cultivo deshidratados DIFCO®) y con sacarosa y maltosa en una relación definida. En algunos casos, se puede utilizar cualquier medio complejo, químicamente definido o rico que se haya demostrado que facilita la fermentación, incluidos los medios que contienen sólidos/licor de maíz macerado, por ejemplo, en lugar de extracto de levadura y otros ingredientes.

Por ejemplo, una mezcla de fermentación puede incluir sacarosa (p. ej., de una fuente de sacarosa de calidad no alimentaria), maltosa (de una fuente de maltosa de calidad no alimentaria), sal de manganeso (p. ej., MnSO₄ o MnCb), sal de magnesio (p. ej., MgSO₄ o MgCb), sal de hierro (p. ej., FeSO₄ o FeCb), sal de potasio (p. ej., KH₂PO₄), cloruro de sodio, sal de calcio (p. ej., CaCb) y extracto de levadura.

El extracto de levadura es una fuente de nitrógeno. Otras fuentes de nitrógeno incluyen licor de maíz macerado, peptona, triptona, extracto de carne, casaminoácidos, caseína, harina de soja y mezclas de los mismos. El licor de maíz macerado es un subproducto de la molienda húmeda del maíz. Por lo general, es un concentrado viscoso de solubles de maíz, que puede contener aminoácidos, vitaminas y minerales. Cualquier fuente de nitrógeno de este tipo puede usarse en algunos casos en los medios de fermentación.

Por separado, se puede cultivar un inóculo del microorganismo de fermentación seleccionado (en el enfoque preferido, ATCC 13146) hasta lograr una OD-1 (densidad óptica o absorbancia a 660 nm medida de aproximadamente 1 con un espectrofotómetro UV-visible). Este inóculo se puede añadir a la fermentación en un volumen en el intervalo de aproximadamente el 0,5 % a aproximadamente el 20 % del volumen de fermentación, o de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 10 % del volumen de fermentación.

En la fermentación se puede utilizar cualquier especie de microorganismo capaz de producir MIMO, incluidos Leuconostoc mesenteroides. Por ejemplo, puede usarse L. citreum ATCC 13146. Esta bacteria es conocida por otras denominaciones por los expertos en la técnica, incluida la designación Leuconostoc citreum ATCC 13146, la designación NRRL B-742 y la designación PWSA-L. citreum B742, la designación Leuconostoc citreum Farrow y la designación L. amelibiosum. También se puede emplear la bacteria Leuconostoc mesenteroides subesp. mesenteroides (Tsenkovskii) van Tieghem (ATCC® 11449™) y/o Leuconostoc citreum NRRL B-1299. Otros microorganismos productores de MIMO útiles incluyen, aunque no de forma limitativa, Leuconostoc spp (específicamente mesenteroides, citreum, gasicomitatum y kimchi), Weissella spp (por ejemplo, Weissella confusa, tal como NRRL # B 1064), Lactococcus spp., Streptococcus spp. (por ejemplo, Streptococcus mutans), Lactobacillis spp. (p. ej., Lactobacillis reuteri, Lactobacillis hilgardii, Lactobacillis acidophilus, Lactobacillis plantarum, Lactobacillis fermentum, Lactobacillis sakei,), Pediococcus pentosaceus spp. (p. ej., Pediococcus pentosaceus (ATCC #33316), Pediococcus acidilactici), y ciertas cepas mutantes de E. coli.

También se pueden aislar microorganismos útiles de fuentes naturales que incluyen, aunque no de forma limitativa, masa fermentada silvestre (la mezcla de bioorganismos utilizada en la producción de pan de masa fermentada) y kimchi (un plato tradicional coreano fermentado hecho de verduras y condimentos). Para muchos procesos de fermentación, Leuconostoc citreum ATCC 13146 es un microorganismo útil.

Se pueden utilizar condiciones de alimentación por lotes para generar los MIMO. En condiciones de alimentación por lotes, el proceso de generación de MIMO puede ejecutarse de forma continua o semicontinua. También se pueden emplear fermentaciones por lotes simultáneas escalonadas. Se puede introducir materia prima adicional para mantener la fermentación y gestionar la relación sacarosa:maltosa. El pH puede controlarse durante la fermentación extendida al mismo tiempo mediante la adición de hidróxido de sodio, cal, sucrato de cal u otra base adecuada como se describe a continuación. A medida que se consume la materia prima inicial, al medio de cultivo se le pueden añadir materias primas adicionales, ya sea sacarosa o maltosa, o ambas. Dichas adiciones de materias primas se pueden usar (a) para mantener la relación sacarosa:maltosa fija inicial o (b) para cambiar la relación sacarosa:maltosa a medida que avanza la fermentación. En una realización, la sacarosa se añade por separado de la maltosa para lograr una relación específica de sacarosa:maltosa. En otra realización, la maltosa se añade por separado de la sacarosa como un medio para ajustar la relación sacarosa:maltosa. Dicha adición de maltosa sola también puede evitar su degradación por el contacto continuo con la base fuerte antes de la adición al cultivo. Cualquiera de los enfoques se puede utilizar para producir un producto final de MIMO de primer orden con la composición química deseada.

La relación sacarosa:maltosa (S/M) proporciona un tipo de control de la composición del producto, ya que puede afectar o determinar el grado de polimerización (DP) de la distribución del producto con respecto al peso molecular.

El organismo usado para la fermentación puede afectar tanto el peso molecular promedio en masa como el patrón de ramificación del producto de MIMO. Por ejemplo, Leuconostoc mesenteroides B512F generalmente produce a-1,6 MIMO lineal mientras que Leuconostoc citreum NRRL B-1299 generalmente produce una mezcla de MIMO a-1,6 y a-1,6 lineales con glucanos de MIMO a-1,2 ramificados. El(los) organismo(s) empleado(s) también puede(n) crear una distribución bimodal de oligosacáridos (p. ej., MIMO) que varía de DP2 a DP30. Dicha distribución bimodal puede incluir una primera distribución de MIMO que comprende principalmente MIMO lineal y una segunda distribución IMO que puede incluir MIMO ramificados. El primer grupo de MIMO puede estar hecho por organismos tales como, por ejemplo, Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512f , Weissella confusa NRRL B-1064 y similares. La segunda distribución que puede incluir MIMO ramificados puede estar hecha de organismos tales como, por ejemplo, Leuconostoc citreum NRRL B-742, Leuconostoc citreum NRRL B-1299 y similares. Otros organismos tales como Leuconostoc mesenteroides NRRL B-1355 (o mezclas de otros organismos con NRRL B-1355) puede producir una distribución de estructuras alternas tales como alternano. El alternano tiene dos monosacáridos en su unidad repetitiva, [Glc(a1-3)Glc(a1-6)], pero también puede contener alguna ramificación Glc(a1-3).

En condiciones por lotes, las bacterias se pueden cultivar en una mezcla de nutrientes (medio de cultivo) adecuada para soportar el crecimiento de las bacterias y, por ejemplo, una relación fija de sacarosa:maltosa en el momento de la inoculación.

Se deja que continúe la fermentación, por ejemplo, hasta que se completa la producción de oligosacáridos. La producción de oligosacáridos se completa, por ejemplo, cuando se agota la sacarosa. El tiempo de fermentación adicional puede dar como resultado la reorganización de los MIMO por recombinación química que puede cambiar la distribución de DP. En algunos casos, se forman cadenas más largas, posiblemente a partir de la actividad enzimática residual continua. La continuación hasta que la fructosa se convierte en manitol también simplifica la purificación del producto final. Después, se pueden llevar a cabo la eliminación de las células bacterianas utilizadas y otras etapas de purificación.

La relación de sacarosa:maltosa en el momento de la inoculación puede variar de aproximadamente 0,20 a aproximadamente 7,0, o de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 6,0, o de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 5,0, o de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 4,5, o de aproximadamente 2 a aproximadamente 2,2 a aproximadamente 4,3, o de aproximadamente 2,3 a aproximadamente 4,0, o de aproximadamente 2,4 a aproximadamente 4,0, o de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 3,75, o de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 3,5, o de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 3,0, o a aproximadamente 2,75. Todas estas relaciones de sacarosa:maltosa, o cualquier relación entre aproximadamente 0,2 y aproximadamente 7,0, se pueden utilizar en el presente proceso para proporcionar productos de MIMO comercialmente deseables para el consumo de mamíferos, aves y/o peces, por ejemplo, a través de suplementos de alimentación animal.

Por ejemplo, en algunos casos, Weissella spp (p. ej., Weissella confusa B-1064) puede funcionar de manera diferente a Leuconostoc citreum (tal como Leuconostoc citreum ATCC 13146, también denominado NRRL B-742). El uso de Leuconostoc citreum puede producir MIMO con una distribución de peso molecular promedio en masa de aproximadamente 780 Da cuando se utiliza una sacarosa:maltosa de aproximadamente 2,75. Sin embargo, el uso de Weissella confusa puede producir una distribución de peso molecular promedio en masa similar cuando se utiliza una sacarosa:maltosa de aproximadamente 2,00 (o menos).

Además del microorganismo de fermentación y la relación sacarosa:maltosa (S/M), las condiciones de fermentación pueden influir en el rendimiento de los MIMO. Tales condiciones incluyen una temperatura, un pH y un tiempo de fermentación suficientes para generar una composición que comprenda maltosil-isomaltooligosacárido con una distribución de peso molecular promedio en masa de aproximadamente 650 a 2000 daltons, o de aproximadamente 650 a aproximadamente 1500, o de aproximadamente 900 a aproximadamente 2000.

La temperatura de fermentación puede variar, por ejemplo, dependiendo del organismo empleado para la fermentación. Las temperaturas que se pueden emplear incluyen las que varían de aproximadamente 10 °C a aproximadamente 50 °C, o de aproximadamente 15 °C a aproximadamente 45 °C, o de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 40 °C, o de aproximadamente 22 °C a aproximadamente 37 °C, o de aproximadamente 23 °C a aproximadamente 33 °C, o de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 30 °C, o de aproximadamente 27 °C a aproximadamente 29 °C. La fermentación se puede realizar, por ejemplo, a una temperatura de aproximadamente 28 °C.

El pH para la fermentación también puede variar un poco. Por ejemplo, el pH de la mezcla de fermentación durante la fermentación puede variar dentro del intervalo de 4 a 8. El pH de la fermentación cae naturalmente desde su pH inicial a medida que el organismo de fermentación crece en cultivo en presencia de una materia prima apropiada. El control estricto del pH de la mezcla de fermentación durante la fermentación permite el refinamiento de la composición del producto. Por ejemplo, cuando el intervalo de pH es de aproximadamente 6,5 a 5,5, la curva de campana de la composición del producto cambia a un DP más alto a medida que disminuye el pH. Por el contrario, cuando el intervalo de pH es de aproximadamente 6,0 a 7,0, la curva de campana de la composición del producto cambia a un DP más bajo a medida que aumenta el pH. Un pH óptimo para el crecimiento de la mayoría de las células es de aproximadamente 6,5 a 6,8. Sin embargo, la(s) enzima(s) dextransacarasa utilizada(s) por Leuconostoc citreum ATCC 13146 funciona(n) de manera óptima a un pH de 5,5 ± 0,3. La producción y la actividad óptimas de la enzima están en el intervalo de 5,5 a 6,0. Se puede mantener un pH deseable de 5,5 mediante la adición de un material alcalino tal como hidróxido de sodio. El pH de la mezcla de fermentación se puede ajustar inicialmente a aproximadamente pH 6.5 con hidróxido de sodio acuoso al 50 % o ácido clorhídrico al 37 %, y se puede mantener a aproximadamente pH 5.5 durante el periodo de tiempo seleccionado para la fermentación.

La fermentación se puede llevar a cabo hasta su finalización en aproximadamente 60 horas en caldos que contienen menos del 40 % de azúcares totales (p. ej., un máximo de aproximadamente 28 %/brix), prefiriéndose el intervalo del 18-35 % de azúcares totales.

En algunos casos, la producción total de MIMO se puede aumentar mediante la adición continua de un alimento para animales de sacarosa/maltosa en la relación deseada de sacarosa a maltosa. Este aumento en la salida y composición del producto se puede realizar independientemente del control del pH si el control del pH se logra mediante la adición de un material alcalino tal como hidróxido de sodio o de potasio, o se puede realizar junto con el control del pH.

La mezcla de fermentación se puede incubar durante periodos de tiempo variables. Por ejemplo, la mezcla de fermentación se puede incubar durante de aproximadamente 20 a aproximadamente 120 horas, o de aproximadamente 25 a aproximadamente 100 horas, o de aproximadamente 30 a aproximadamente 90 horas, o de aproximadamente 35 a aproximadamente 80 horas, o de aproximadamente 40 a aproximadamente 70 horas. En algunos casos, la mezcla de fermentación se puede continuar hasta que no haya fructosa presente, por ejemplo, un periodo de tiempo de aproximadamente 25 a 60 horas. En algunos casos, la mezcla de fermentación se puede incubar indefinidamente mientras se añade al menos una de la sacarosa y la maltosa a la mezcla de fermentación y se elimina el maltosil-isomaltooligosacárido de la misma.

Las células se pueden separar del caldo por una diversidad de métodos. Por ejemplo, los métodos adecuados para eliminar las células bacterianas incluyen centrifugación, filtración o aclaración química. En una realización, se emplea centrifugación. Los tipos de separación incluyen centrifugación líquida continua o por lotes, uso de un decantador horizontal, separador de crema/centrifugación de disco y/o aclaración química seguida de decantación y/o filtración. Los tipos de filtración incluyen, aunque no de forma limitativa, ultrafiltración, microfiltración o filtración en gel.

El caldo de fermentación puede quedar libre de células (mediante microfiltración, centrifugación, etc.) o no, antes de la reducción de volumen (p. ej., mediante evaporación o vaporización) para producir un aditivo de jarabe o para producir una forma adecuada para el secado por pulverización para producir un material en polvo. Para formas de aditivos líquidos, una etapa de cristalización similar a la descrita por Madsen y Oswald (U.S. Ser. N.° 62/280026 presentada el 18 de enero de 2016) se puede realizar. Para formas de aditivos en polvo, esta etapa no es necesaria.

En algunos casos, las células utilizadas durante la fermentación se pueden dejar en la composición final. En otros casos, las células pueden eliminarse. El producto final puede emplearse como prebiótico para administración a animales. Por ejemplo, típicamente no es necesaria más purificación del producto de MIMO.

Sin embargo, si se desea, el caldo de fermentación que contiene los MIMO también se puede decolorar mediante el uso de carbón activado granulado o carbón activado en polvo. Dicha decoloración se puede realizar a una temperatura de aproximadamente 70 a aproximadamente 80 °C. El carbón activado se puede eliminar por filtración. Alternativamente, el producto de MIMO se puede separar del caldo decolorado utilizando cromatografía de lecho móvil simulada o pulsada de aproximadamente 60 a aproximadamente 65 °C. Después, el extracto se puede concentrar según se desee y las impurezas insolubles no deseadas se pueden eliminar, por ejemplo, mediante centrifugación o microfiltración. Si se desea, el producto se puede secar por pulverización o liofilizar si la intención es producir un producto en polvo.

Los métodos adecuados para la decoloración incluyen, aunque no de forma limitativa, el uso de carbón activado en forma granulada o de polvo, con o sin tampón de pH (p. ej., magnesita), y pueden realizarse en modo por lotes o continuo (p. ej., columna). También se puede utilizar carbón activado. Un carbón activado adecuado incluye Carbochem c A-50 (Carbochem Inc., Wynnewood, PA) o un carbón activado equivalente. En el modo por lotes, se puede añadir carbón decolorante a una temperatura de aproximadamente 60 a aproximadamente 70 °C, se puede dejar que la mezcla a granel se enfríe a una temperatura de aproximadamente 40 °C y, después de la agitación, se añade un auxiliar de filtro. La mezcla a granel se filtra para producir licor decolorado.

En el modo continuo, el licor de fermentación libre de células a granel se puede pasar a través de una columna cargada con carbón activado granulado a una temperatura de aproximadamente 65 a aproximadamente 70 °C. Una vez saturado, el carbón se puede hornear o regenerar en el lugar mediante tratamiento con etanol alcalino o equivalente (Bento). Los ejemplos de auxiliares de filtro adecuados incluyen, aunque no de forma limitativa, dióxido de silicio, tierra de diatomeas, diatomita y kieselguhr. Las marcas adecuadas incluyen Celite® 545 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y Celatom® (Sigma-Aldrich). La calidad de filtro se selecciona según el tiempo deseado para que la filtración ocurra a una velocidad óptima, ya que las calidades más finas ralentizarán la filtración de manera significativa.

En algunas realizaciones, la mayor parte del producto secundario manitol se puede eliminar concentrando la mezcla y enfriándola hasta que se produce la cristalización. A continuación, los cristales se pueden separar mediante decantación, filtración o uso de una centrífuga de cesta. Alternativamente, la precipitación fraccionada de productos se puede realizar utilizando disolventes orgánicos tales como etanol.

En otra realización, el manitol y los ácidos orgánicos pueden eliminarse además mediante cromatografía continua o pulsada. Por ejemplo, se puede utilizar una resina de intercambio de ácido fuerte (SAC) de tipo gel de calidad cromatográfica en forma de calcio (SAC-Ca) mantenida a 45-70 °C. Dos fracciones principales resultan de la cromatografía: 1) MIMO más ácido acético; y 2) manitol más ácido láctico. Algo de ácido láctico, ácido fórmico y/o algo de ácido acético pueden permanecer en la fracción de MIMO después de completar la cromatografía sin interferir con el procesamiento posterior.

Si se desea eliminar las cenizas, se puede utilizar una resina de intercambio de aniones en forma de base libre parcial, por ejemplo, como describen Saska y Chen (patente US-6.451.123). Alternativamente, la fracción que contiene el producto de MIMO se puede purificar además mediante la eliminación de cualquier ion de metal pesado presente utilizando una combinación de ácido/base de resinas de intercambio iónico. Los ejemplos de combinaciones incluyen, aunque no de forma limitativa, intercambio de ácido fuerte (SAC), intercambio de aniones de base fuerte (SBA), intercambio de cationes de ácido fuerte (SAC), intercambio de aniones de base débil (WBA), intercambio de cationes de ácido débil (WAC), intercambio de aniones de base fuerte, sistemas de lecho mixto y combinaciones de los mismos realizados en serie.

Composiciones

La solicitud describe composiciones y métodos para la producción de las mismas que incluyen, por ejemplo, maltosilisomaltooligosacáridos con una distribución de peso molecular promedio en masa de aproximadamente 650 a 1000 daltons, o de 650 a 1500 daltons, o de 650 a 2000 daltons. En algunos casos, la distribución del peso molecular promedio en masa de los maltosil-isomaltooligosacáridos es de aproximadamente 730 a 850 daltons, o de aproximadamente 800 a 1200 daltons, o de 900 a 2000 daltons.

Los maltosil-isomaltooligosacáridos en las composiciones generalmente contienen más enlaces a-(1-6) glucosilo que enlaces a-(1,2), a-(1,3) o a-(1,4) glucosa. Por ejemplo, una composición de oligosacáridos (maltosilisomaltooligosacáridos) puede incluir al menos el 50 % de los oligosacáridos con enlaces a-(1,6) glucosilo, o al menos el 52 % con enlaces a-(1,6) glucosilo, o al menos al menos el 55 % con enlaces a-(1,6) glucosilo, o al menos el 60 % con enlaces a-(1,6) glucosilo, o al menos el 65 % con enlaces a-(1,6) glucosilo, o al menos el 70 % con enlaces a-(1.6) glucosilo, o al menos el 75 % con enlaces a-(1,6) glucosilo, o al menos el 80 % con enlaces a-(1,6) glucosilo, o al menos el 83 % con enlaces a-(1,6) glucosilo, o al menos el 85 % con enlaces a-(1,6) glucosilo, o al menos el 87 % con enlaces a-(1,6) glucosilo, o al menos el 88 % con enlaces a-(1,6) glucosilo, o al menos el 89 % con enlaces a-(1.6) glucosilo, o al menos el 90 % con enlaces a-(1,6) glucosilo.

Si bien todos los MIMO tendrán un enlace alfa-(1,4) glucosilo, algunos de los maltosil-isomaltooligosacáridos de la composición pueden tener opcionalmente uno o más enlaces a-(1,4) glucosilo, o uno o más enlaces a-(1,2) glucosilo, o uno o más enlaces a-(1,3) glucosilo. Por lo tanto, los maltosil-isomaltooligosacáridos son generalmente glucooligosacáridos a-(1,6) lineales, terminados a través de un enlace glucosídico a-(1,4) a un extremo reductor de glucosa (extremo maltosilo). Los maltosil-isomaltooligosacáridos de las composiciones generalmente no tienen más de aproximadamente 40 unidades de glucosa, no más de aproximadamente 35 unidades de glucosa, no más de aproximadamente 30 unidades de glucosa, no más de aproximadamente 28 unidades de glucosa, no más de aproximadamente 25 unidades de glucosa, no más de aproximadamente 23 unidades de glucosa, no más de aproximadamente 20 unidades de glucosa, no más de aproximadamente 18 unidades de glucosa, o no más de aproximadamente 17 unidades de glucosa, o no más de aproximadamente 16 unidades de glucosa, o no más de aproximadamente 15 unidades de glucosa, o no más de aproximadamente 14 unidades de glucosa, o no más de aproximadamente 13 unidades de glucosa, o no más de aproximadamente 12 unidades de glucosa, o no más de aproximadamente 11 unidades de glucosa, o no más de aproximadamente 10 unidades de glucosa según lo detectado por HPAEC-PAD o HPLC-RID.

Las composiciones pueden contener algo de fructosa y/o manitol. Por ejemplo, en algunos casos, las composiciones pueden tener más del 5 %/brix de manitol, o más del 7 %/brix de manitol, o más del 8 %/brix de manitol, o más del 9 %/brix de manitol según lo detectado por HPLC-RID o HPAEC-PAD refractiva. Generalmente, la cantidad de manitol en las composiciones es inferior al 40 %/brix de manitol, o inferior al 35 %/brix de manitol, o inferior al 30 %/brix de manitol, o inferior al 28 %/brix de manitol, o inferior al 26 %/brix de manitol, o inferior al 25 %/brix de manitol, según lo detectado por HPAEC-PAD o HPLC-RID. Por ejemplo, las composiciones pueden tener de aproximadamente el 10 %/brix a aproximadamente el 40 %/brix de manitol, o de aproximadamente el 20 %/brix a aproximadamente el 40 %/brix de manitol. La fructosa puede estar presente en cantidades similares, típicamente en el intervalo de aproximadamente el 0 al 40 %/brix, o de aproximadamente el 0 al 30 %/brix, o de aproximadamente el 0 al 25 %/brix, o de aproximadamente el 0 al 20 %/brix.

Aunque las composiciones generadas por los métodos descritos en el presente documento pueden tener el mismo contenido de MIMO que los MIMO de calidad alimentaria descritos de la solicitud de EE.UU. con N.° de serie 62/280026, las composiciones proporcionadas en el presente documento pueden tener otros ingredientes. Por ejemplo, las presentes composiciones pueden tener uno o más ácidos que no se encuentran en los MIMO de calidad alimentaria. Dichos ácidos pueden incluir uno o más de los siguientes: ácido láctico, ácido fórmico y ácido acético. Por ejemplo, las presentes composiciones pueden tener del 0 al 40 % de ácido láctico o lactato de sodio, o de aproximadamente el 0,5 a aproximadamente el 15 % de ácido láctico. Las composiciones descritas en el presente documento pueden tener, por ejemplo, de aproximadamente el 0 a aproximadamente el 10 % de ácido acético. Además, las composiciones descritas en el presente documento pueden tener, por ejemplo, de aproximadamente el 0 a aproximadamente el 0,5 % de ácido fórmico. Las presentes composiciones también pueden contener entre el 0 y el 17 %/brix (hasta aproximadamente el 2 % p/p) de etanol.

Además, las composiciones generadas por los métodos descritos en el presente documento también pueden contener maltodextrinas (p. ej., maltodextrinas con DP 3-17), que pueden originarse de la sacarificación incompleta de la fuente de maltosa. Estas maltodextrinas serán específicas para, y podrán referenciarse a, el sacarificado de almidón de partida. Esto sirve como medio para diferenciar fácilmente los productos de calidad alimentaria de los alimentos para animales/productos de calidad para alimentación de animales, y proporciona trazabilidad hasta el proceso de origen, la fábrica, el número de lote y los tipos de enzima/almidón empleados.

Las composiciones pueden ser composiciones líquidas o secas.

La concentración de los componentes en la composición así preparada puede ser composiciones líquidas, por ejemplo, del 10 %brix al 75 %brix, o del 20 %brix al 75 %brix, o del 40 %brix al 75 %brix, o al 59-68 %/brix. En algunos casos, la composición puede ser un polvo secado por pulverización/liofilizado. La distribución del peso molecular promedio (MWD) en masa puede estar, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 650 a 1000 dalton, o de 650 a 1500 dalton, o de 650 a 2000 dalton, o en el intervalo de 730 a 900 dalton (promedio en masa).

Las composiciones pueden tener un grado de polimerización (DP) que varía de aproximadamente DP 3 a aproximadamente y Dp 30, o de aproximadamente DP 3 a aproximadamente DP 25, o de aproximadamente DP 3 a aproximadamente DP 20, o de aproximadamente DP 3 a aproximadamente DP 15. En algunos casos, el DP puede ser de aproximadamente DP 3 a aproximadamente DP 12, o de aproximadamente DP 3 a aproximadamente D^p 10, o de aproximadamente DP 3 a aproximadamente DP 9.

Los ejemplos de composiciones que pueden generarse mediante los métodos descritos en el presente documento incluyen las siguientes.

a) Una composición generada con jarabe rico en maltosa y sacarosa como se describe en el Ejemplo 1 contiene MIMO (DP 3 - DP 9); manitol; fructosa; sacarosa; maltosa; oligosacárido(s) 1,4-DP 3; lactato; glicerol; formiato; y acetato, donde los valores mostrados se dan como %/brix, o % de sólidos refractivos secos.

donde 1,4-DP3 y 1,4-DP4 son maltodextrinas.

b) Una composición generada con jarabe rico en maltosa y azúcar sin refinar como se describe en el Ejemplo 2 contiene MIMO (DP 3 - DP 9); manitol; fructosa; sacarosa; maltosa; oligosacárido(s) 1,4-DP 3; oligosacárido(s) 1,4­ DP 4; lactato; glicerol; y acetato, donde los valores mostrados se dan como %/brix, o % de sólidos refractivos secos.

c) Una composición generada con jarabe rico en maltosa y almidón de patata como se describe en el Ejemplo 3 contiene MIMO (DP 4 - DP 9); manitol; glucosa; sacarosa; maltosa; panosa; oligosacárido(s) 1,4-DP 3; oligosacárido(s) 1,4-DP 4; lactato; glicerol; formiato; y acetato, donde los valores mostrados se dan como %/brix, o % de sólidos refractivos secos, y donde el resto de la masa es principalmente maltodextrina.

Los métodos descritos en el presente documento pueden generar composiciones con una gama más amplia de MIMO. Por ejemplo, las composiciones pueden contener MIMO con un grado de polimerización de hasta, e incluyendo, DP30. Por lo tanto, los MIMO pueden tener un intervalo de DP de aproximadamente DP3 a aproximadamente DP30, o de aproximadamente DP3 a aproximadamente DP27, o de aproximadamente DP3 a aproximadamente DP25, o de aproximadamente DP3 a aproximadamente DP20, o de aproximadamente DP3 a aproximadamente DP17 u otros intervalos entre aproximadamente DP3 y aproximadamente DP30.

En algunos casos, los métodos descritos en el presente documento pueden proporcionar una composición de MIMO que tiene una distribución bimodal de dos poblaciones de oligosacáridos MIMO, una población de MIMO más corta con un intervalo de DP de aproximadamente DP3 a aproximadamente DP7, y una población de MIMO más larga con un intervalo de DP de aproximadamente DP9 a aproximadamente DP25. En algunos casos, por lo tanto, puede haber dos curvas de campana o picos de distribuciones de DP, con un “valle” de MIMO de DP más bajos entre los dos picos de DP.

Definiciones

Tal como se utilizan según la presente descripción, los siguientes términos, salvo que se indique lo contrario, se entenderán con los siguientes significados: “ Brix” , también conocido como grados Brix (símbolo °Bx), se refiere al contenido de azúcar de una solución acuosa. Un grado Brix (« bx) es 1 gramo de sacarosa en 100 gramos de solución y representa la concentración de la solución como porcentaje en peso (% p/p). Brix también representa sales disueltas, ácidos orgánicos y otros solutos que aumentan el índice de refracción de la solución. Como tal, es menos útil como medida cuantitativa del contenido de sacáridos en caldos complejos (mezclas de fermentación), pero es bastante precisa con respecto al producto refinado. Así, 1 grado brix = 1 g de sólidos refractivos secos por 100 g de material. Si la solución contiene sólidos disueltos que no sean sacarosa pura, entonces el °Bx solo se aproxima al contenido de sólidos disueltos. Sin embargo, cuando los componentes constituyentes de las composiciones a comparar son similares y/o dentro de intervalos similares, los valores Brix son reproducibles y brindan una aproximación que, en este caso, es una medición precisa (en relación con los sólidos secos verdaderos a través de la evaporación) de sólidos secos relativos por cada composición. Los porcentajes citados en el presente documento son %/brix, o % de sólidos refractivos secos, salvo que se defina lo contrario.

“ Distribución de peso molecular” o “ MWD” se refiere al peso molecular promedio en masa de una distribución de oligosacáridos.

“ Oligosacáridos” se refiere a glicanos de todo tipo, generalmente con un grado de polimerización (DP) mayor o igual a 3 y menor o igual a 18.

“ Densidad óptica” u “ OD” se refiere a una estimación de la densidad celular en una fermentación. Normalmente se utiliza para determinar el progreso de una fermentación, se determina a través de la absorbancia de la luz a 600 nm y se puede hacer referencia a la masa celular seca.

“ DE” se refiere a “ equivalentes de dextrosa” y, a veces, se usa para definir la distribución de peso molecular promedio (MWD) de almidón, maltodextrina o jarabes de los mismos, creados a través de la sacarificación de almidón con ácido y/o enzimas, en términos de glucosa liberada si está completamente hidrolizada. También se usa con frecuencia para describir el equivalente de glucosa de una mezcla de maltodextrina, en promedio, y es un indicador del peso molecular promedio/DP. Se determina por medición o poder reductor, p. ej., una mezcla de maltodextrina DE = 10 tendría 1/10 del poder reductor de una cantidad equivalente de glucosa (u otro azúcar reductor constituyente).

DP se refiere al grado de polimerización. El grado de polimerización, o DP, generalmente se define como el número de unidades monoméricas en una macromolécula o molécula de polímero u oligómero. Por lo tanto, el “ DP” , como se usa en el presente documento, se refiere al número de unidades de azúcar en un oligosacárido dado.

“ HPAEC-PAD” se refiere a una técnica analítica instrumental compuesta conocida como cromatografía líquida de intercambio de aniones de alta presión (HPAEC) (ThermoDionex ICS-5000+) con un detector amperométrico pulsado (PAD). En el marco de este trabajo, este instrumento se utiliza únicamente para la separación de alta resolución (ThermoDionex Carbopac PA-100, pH >12,5, elución en gradiente de acetato) de alcoholes de azúcar, mono y disacáridos y oligosacáridos. La cuantificación se realiza a través de un patrón interno utilizando L-arabinosa y factores de respuesta relativos al compuesto puro o a una maltodextrina purificada de peso molecular equivalente.

“ HPLC-RID” se refiere a una técnica analítica instrumental compuesta conocida como cromatografía líquida de alta presión (HPLC, Agilent 1100) con un detector de índice de refracción (RID). En el marco de este trabajo, este instrumento se utiliza para separar (BioRad Aminex HPX-87H, H2SO₄ isocrático 0,008 N) y cuantificar ácidos orgánicos (carboxílicos) que resultan de la fermentación bacteriana. Este instrumento también se utiliza para confirmar el DP 3, la maltosa y el manitol. La cuantificación se realiza mediante un método de patrón externo frente a un patrón mixto elaborado a partir de compuestos objetivo de pureza conocida.

Los aditivos minerales y los nutrientes pueden ser de calidad reactiva y pueden provenir de las mismas fuentes que se indican aquí:

El almidón se refiere a la amilosa/amilopectina derivada de una o más plantas. Un ejemplo de un almidón que se puede emplear es el almidón de patata (p. ej., Sigma-Aldrich n.° S4251, lote n.° BCBQ4413V). También se pueden emplear otras fuentes de almidón vegetal, incluidas las derivadas de trigo, maíz, tapioca, mandioca, etc. En algunos casos, el almidón que se emplea produce un DE (p. ej., DE 15-100) y brix apropiados usando a-amilasa y/o p-amilasa, isoamilasa o cualquier mezcla de las mismas.

La amilasa se refiere a una gran cantidad de enzimas que, comercialmente, se producen típicamente a partir de bacterias u hongos. Estas enzimas catalizan la hidrólisis de enlaces de carbohidratos específicos, a-(1,4) en este caso, para descomponer el almidón en moléculas más pequeñas que pueden consumirse metabólicamente. Existen varios tipos de enzimas amilasa, incluidas amilasas a-(1,4-a-D-glucano glucanohidrolasa), p-(1,4-a-D-glucano maltohidrolasa) y Y-(1,4-a-D-glucano glucohidrolasa). Debido a que el tipo a actúa en ubicaciones aleatorias en las moléculas de almidón, la cinética de licuefacción es mucho más rápida que la observada en el tipo p, que libera moléculas de maltosa de una en una comenzando con el extremo no reductor. Mientras que el tipo p es más eficiente en la producción de maltosa, las mezclas de almidón gelatinizado en concentraciones suficientes para producir el brix objetivo son intratables (en términos de viscosidad y gelificación). Las amilasas de tipo ^y, también conocidas como glucoamilasas, también pueden escindir los enlaces a-(1,6) y también producirán glucosa a partir de la maltosa. Debido a que nuestro producto contiene enlaces a-(1,6) y nuestra molécula objetivo es la maltosa, las actividades residuales de este tipo de amilasa deben evitarse rigurosamente al seleccionar una enzima para usar en este proceso. Dependiendo del organismo del que se obtenga la enzima, puede haber una diferencia significativa en términos de estabilidad térmica y pH óptimo.

Termamyl® se refiere a la a-amilasa derivada de Bacillus lichenformis. Es una a-amilasa particularmente estable a altas temperaturas (una fracción significativa de una dosis añadida sigue siendo amilolítica a 100 °C). Debido a que la temperatura de gelificación del almidón tiende a estar entre 75 y 90 °C, dependiendo de la fuente, y las enzimas tienen velocidades de rotación que dependen de la temperatura, el almidón puede gelatinizarse y convertirse en maltosa simultáneamente, lo que permite preparar soluciones concentradas. Se demostró que la fuente de esta enzima, Sigma A3403, lote n.° SLBK3081V, no tiene actividad de glucoamilasa. Cualquier amilasa termoestable de este tipo puede ser adecuada para usar en el proceso de producción de la composición descrita en el presente documento.

“ Enzima desramificadora” o “ isoamilasa” se refieren a una clase de enzimas, similares a la amilasa, pero con especificidad por los enlaces glucosídicos a-(1,6). Los ejemplos incluyen dextranasa, pulalanasa, etc. Los rendimientos de maltosa del almidón pueden mejorarse significativamente mediante el uso de estas enzimas porque la amilopectina desramificada hace que el poliglucano esté disponible, estéricamente, para la a-amilasa.

La sacarificación se refiere al proceso mediante el cual los almidones vegetales (u otros poliglucanos con enlaces a-(1,4)) se hidrolizan mediante catálisis ácida o con enzimas, en componentes solubles más pequeños. En este caso, la maltosa es el producto más deseado, por lo que se prefiere una enzima a-amilasa, exenta de actividad de glucoamilasa.

El sacarificado se refiere al producto de un proceso de sacarificación.

La maltodextrina se refiere a una mezcla de glucooligosacáridos con enlaces a-(1,4) (lineales y ramificados o “ dextrinas límite” ) en el sacarificado de almidón. El DE típicamente varía entre 13 y 17. En el trabajo descrito en el presente documento, el término también se usa para describir los oligosacáridos lineales entre DP 3-30, que se usan con fines de calibración de instrumentos y se encuentran típicamente en nuestros productos elaborados con jarabe y/o almidón con alto contenido en maltosa.

La sacarosa se refiere a a-D-glucopiranosil-(1^2)-p-D-fructofuranósido, dos calidades: primera, azúcar blanca refinada de caña de calidad alimentaria (lote de Market Pantry n.° 45114A) y, segunda, azúcar sin refinar de calidad comercial (no apta para el consumo humano directo) obtenido de Lula Sugar Factory, 351 Hwy. 999 Belle Rose, La.

70544. Todos los azúcares blancos refinados de caña son equivalentes para los fines aquí establecidos. Todos los azúcares sin refinar comerciales de caña de muy alta pureza (VHP) son equivalentes para los propósitos establecidos en el presente documento. Se pueden usar calidades menores de azúcar sin refinar, incluida la melaza. Sin embargo, es aconsejable analizar estas fuentes de azúcar sin refinar de menor calidad antes del uso, por ejemplo, para identificar su composición y/o evaluar su rendimiento en una fermentación de lotes pequeños. El conocimiento de la composición del azúcar sin refinar aclara qué cantidad de azúcar sin refinar usar en relación con la maltosa de calidad no alimentaria para que la relación de sacarosa:maltosa se mantenga dentro de un intervalo aceptable.

Satin Sweet™ se refiere a un jarabe con alto contenido en maltosa producido por Cargill (lote n.° E154766, 17540 Monroe Wapello Rd. Eddyville, IA. 52553) con una certificación de análisis (COA) declarada que especifica 80,5 % de sólidos secos, pH 3,99, fructosa, 0,0 %; dextrosa, 2,8 %; maltosa, 66,4 %; triosa, 20,6 % y 10,2 % de azúcares superiores. La verificación interna a través de HPAEC-PAD definió la composición del lote como:

Brix g/100 g de DS 82,7

glucosa, %/brix 2,21

maltosa, %/brix 65,70

DP 3, %/brix 16,24

DP 4, %/brix 2,29

DP 5, %/brix 0,76

DP 6, %/brix 0,39

DP 7, %/brix 0,09

Otros jarabes ricos en maltosa que cumplan estas especificaciones, p. ej., Hi Maltose 65 (Batory Foods, 1881 Touhy Ave. Elk Grove, IL. 60007) son igualmente adecuados.

Los Ejemplos ilustran parte del trabajo experimental realizado en el desarrollo de la invención.

Ejemplo 1: Generación de maltosil-isomaltooligosacáridos (MIMO) usando Satin Sweet™ como fuente de maltosa

Satin Sweet™ es un jarabe rico en maltosa preparado a partir de almidón de maíz. Es menos costoso que la maltosa de alta pureza (p. ej., >93 %). Este ejemplo ilustra que Satin Sweet™ es un sustituto adecuado de la maltosa de alta pureza cuando se elaboran MIMO para alimentos para animales, proporcionando un producto de MIMO con una distribución de oligosacáridos MIMO que, con la excepción de las maltodextrinas DP 3-5, era similar al producto ISOThrive™ de calidad alimentaria con respecto al Mw D para MIMO.

Métodos

La pureza de la materia prima de Satin Sweet™ se midió mediante HPLC. Se diluyó Satin Sweet™ y analizó para determinar la glucosa, maltosa y oligómeros superiores mediante cromatografía de intercambio de aniones de alta presión (HPAEC, ThermoDionex ICS-5000+) mediante columna Carbopac PA-100 eluida con un gradiente de acetato de sodio a pH constante (<12,7 NaOH) y detección amperométrica pulsada (PAD). Los componentes se cuantificaron mediante el método de patrón interno utilizando L-arabinosa.

La pureza determinada se utilizó para calcular la cantidad de Satin Sweet™ necesaria para tener una relación sacarosa:maltosa (S/M, p/p) de 2,75 en el momento de la inoculación. La relación sacarosa:maltosa del medio de partida se confirmó mediante HPLC-RID usando una columna BioRad Aminex HPX-87P estandarizada con los compuestos puros (Sigma Aldrich).

Procedimientos de fermentación similares a los descritos en la solicitud provisional US-62/280.026, excepto por el uso de Satin Sweet™ como fuente de maltosa.

Los componentes del medio de fermentación enumerados en la siguiente tabla se añadieron a un biorreactor de dos litros (Eppendorf Celligen 115).

Componentes de fermentación

El contenido del fermentador se ajustó a pH 7,00 usando NaOH (50 %^(ac.)). Se tomaron muestras del licor (muestra previa al autoclave). La sonda de pH se volvió a calibrar, el fermentador se selló y el conjunto se sometió a autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Se volvieron a tomar muestras del licor (aguja estéril, muestra posterior al autoclave). Las muestras se analizaron por HPLC [BioRad Aminex HPX-87P, eluido con agua, isocrático, HPLC Agilent 1100 con detector de índice de refracción (RID)] a través de un método de patrón externo para detectar una posible inversión de sacarosa. No se observó una inversión significativa de la sacarosa, pero el brix aumentó un 0,9 %:

Por separado, se preparó un medio de inóculo que contenía los componentes enumerados en la siguiente tabla en un matraz Erlenmeyer de 500 ml utilizando sacarosa (99,9 % de azúcar de caña blanca refinada) para el crecimiento inicial del microorganismo utilizado para la fermentación (Leuconostoc citreum NRRL B-742 (ATCC 13146)). Debe apreciarse que Satin Sweet® fue la única fuente de maltosa en el medio que se muestra a continuación, y que al emplear 12,22 g de Satin Sweet®, la cantidad de maltosa añadida al medio iniciador previo al inóculo fue de 6,606 g.

Cantidad de medio iniciador previo al inóculo (en autoclave) Satin Sweet®: 12,22 g

El crecimiento del organismo de fermentación se inició mediante la adición de 0,5 ml de cultivo en matraz de fase de crecimiento estacionario [Leuconostoc citreum NRRL B-742 (ATCC 13146) en medios ricos] y 0,5 ml de glicerol al 40 % p/p^(ac.) (mantenido a -75 °C) al matraz de inóculo. A continuación, el matraz se incubó con agitación durante 16 h a 27 °C.

Se calculó que la cantidad de Satin Sweet^® requerida para la fermentación a granel (para tener en cuenta cualquier pérdida de sacarosa) era de 0,209 kg. El Satin Sweet^® se fluidizó en aproximadamente 50 ml de agua estéril y la mezcla se vertió rápidamente en el biorreactor a través de un embudo esterilizado. El conjunto se agitó hasta que cesaron los patrones de muaré (lo que indica una mezcla completa).

Se tomaron muestras del medio previo al inóculo y se analizaron mediante HPLC-RID (BioRad Aminex HPX-87P, agua isocrática, HPLC Agilent 1100) mediante un método de patrón externo para determinar la relación sacarosa:maltosa inicial (S/M, p/p). Los resultados se muestran en la tabla a continuación.

Contenido de sacarosa y maltosa del medio previo al inóculo

Se transfirió un inóculo de veinticinco (25) ml al biorreactor de 2 l a través de una aguja estéril. Se midió el pH, la sonda se puso a cero en consecuencia y el pH se ajustó a 6,5 utilizando HCl (37 %) o NaOH (50 % p/p). El pH se ajustó a control a pH 5,5 usando NaOH (40 % p/p).

Se tomaron muestras del reactor a las 24 horas, 29 horas y 48 horas. El pH se comparó con un medidor de banco y la sonda se puso a cero según fuera necesario. Las muestras se centrifugaron, se filtraron (filtro de 0,2 μm) y se analizaron para determinar los carbohidratos/manitol mediante HPAEC-PAD y los ácidos orgánicos mediante HPLC-RID (BioRad Aminex HPX-87H, H²SO⁴ isocrático 0,008 mM).

Resultados

La composición del caldo de fermentación resultante, en relación con el intervalo de muestreo, se muestra en la siguiente tabla. Los valores mostrados son %/brix (sólidos secos refractivos).

Composición de fermentación a lo largo del tiempo

La iniciación del crecimiento logarítmico tomó 6 horas después de la inoculación (Figura 1). El crecimiento logarítmico se correlacionó con un fuerte aumento en la distribución del peso molecular promedio en masa (MWD) de los MIMO entre 24 y 29 horas, como se muestra en la Figura 1.

Como se muestra en la Figura 2, el perfil cromatográfico del producto es similar al producto de MIMO ISOThrive™ de calidad alimentaria. La Figura 2 muestra una comparación de cromatogramas HPAEC-PAD de:

1. Caldo de MIMO de calidad alimentaria,

2. Satin Sweet™ reducido en un factor de 5, y

3. Caldo de MIMO de calidad para alimentación de animales hecho de jarabe con alto contenido en maltosa Satin Sweet™ y azúcar blanco refinado (sacarosa) de caña.

Los picos mostrados corresponden a: (A) D-leucrosa; (B) sacarosa; (C) maltosa; (D)-(I) MIMO DP 3-8; y (J)-(L) maltodextrinas DP 3-5. Con la excepción de las maltodextrinas DP 3-5 adicionales, el componente del producto de MIMO, con respecto al MWD, se conformó cromatográficamente con un producto de calidad alimentaria apto para el consumo humano.

Ejemplo 2: Generación de maltosil-isomaltooligosacáridos (MIMO) usando Satin Sweet™ como fuente de maltosa y azúcar sin refinar como fuente de sacarosa

Con el fin de reconocer mayores ahorros en los costos de las materias primas, el azúcar blanco refinado se reemplazó por azúcar sin refinar comercial. Los azúcares sin refinar comerciales no son aptos para el uso alimentario humano porque contienen diversas impurezas, pero son significativamente menos costosos que el azúcar blanco refinado apto para el uso alimentario (~$0,09/lb en el mercado mundial, ~$0,22/lb en el mercado estadounidense frente a $0,42/lb del blanco refinado). Este ejemplo ilustra que el azúcar sin refinar es un sustituto apropiado del azúcar blanco (y Satin Sweet® para maltosa) en la producción de un producto de MIMO adecuado para usar en alimentos para animales, proporcionando un producto de MIMO con una distribución de oligosacáridos MIMO que, con la excepción de las maltodextrinas DP 3-5, era similar al producto ISOThrive™ de calidad alimentaria.

Métodos

La pureza de la muestra aleatoria de azúcar de caña sin refinar (fábrica de azúcar de Lula, Luisiana) se midió mediante HPLC [BioRad Aminex HPX-87P, eluida con agua, HPLC isocrático Agilent 1100 con detector de índice de refracción (RID)] mediante el método de patrón externo descrito en la solicitud provisional US-62/280.026, presentada el 18 de enero de 2016 por Madsen y Oswald. El material contenía 98,5 % p/p de sacarosa y tenía sólidos secos, donde el resto es humedad. La pureza de la muestra analizada no fue inferior al 99 %.

Se emplearon procedimientos de fermentación similares a los descritos en la solicitud provisional US-62/280.026, excepto por el uso de Satin Sweet™ como fuente de maltosa y azúcar sin refinar como fuente de sacarosa.

Los componentes del medio previo al inóculo se muestran en la siguiente tabla. A continuación, el medio previo al inóculo se esterilizó en un autoclave. Tenga en cuenta que Satin Sweet® fue la única fuente de maltosa en el medio que se muestra a continuación, y que al emplear 12,22 g de Satin Sweet®, la cantidad de maltosa añadida al medio iniciador previo al inóculo fue de 6,61 g. De manera similar, el azúcar sin refinar era la única fuente de sacarosa en el medio iniciador previo al inóculo, por lo que aunque se emplearon 12,755 g de azúcar sin refinar, la cantidad de sacarosa en el medio iniciador previo al inóculo fue de 12,56 g.

Medio iniciador previo al inóculo (antes del autoclave)

El crecimiento del organismo de fermentación en el medio previo al inóculo se inició mediante la adición de 0,5 ml de cultivo en matraz de fase de crecimiento estacionario [Leuconostoc citreum NRRL B-742 (ATCC 13146) en medios ricos] y 0,5 ml de glicerol al 40 % p/p^(ac.) (mantenido a -75 °C) al matraz de inóculo. A continuación, el matraz se incubó con agitación durante 16 h a 27 °C.

Los componentes del medio de fermentación enumerados en la siguiente tabla se añadieron a un biorreactor de dos litros (Eppendorf Celligen 115).

Medio de fermentación

El contenido del medio iniciador de fermentación se ajustó a pH 7,00 usando NaOH (50 %^(ac.)) y se tomaron muestras del licor (muestra previa al autoclave). Se volvió a calibrar la sonda de pH, se selló el fermentador y se dejó reposar el contenido con agitación durante 1 h. A continuación, la mezcla completa se sometió a autoclave a 121 °C durante 30 minutos. Se volvieron a tomar muestras del licor (aguja estéril, muestra posterior al autoclave). Las muestras se analizaron por HPLC [BioRad Aminex HPX-87P, eluido con agua, isocrático, HPLC Agilent 1100 con detector de índice de refracción (RID)] a través de un método de patrón externo para verificar la posible inversión de sacarosa. Como antes, tuvo lugar muy poca o ninguna inversión de sacarosa; el A de sacarosa fue de sólo el -0,1 %.

Se calculó que la cantidad de Satin Sweet^® requerida para la fermentación a granel (para tener en cuenta cualquier pérdida de sacarosa) era de 0,208 kg. El Satin Sweet se fluidizó (en aproximadamente 100 g de agua estéril) y se vertió rápidamente en el biorreactor a través de un embudo esterilizado. Se agitó toda la mezcla hasta que cesaron los patrones de muaré (lo que indica una mezcla completa).

Se transfirió un inóculo de veinticinco (25) ml al biorreactor de 2 l mediante una aguja estéril. Se midió el pH y se ajustó el pH a 6,5 utilizando HCl (37 %) o NaOH (50 % p/p).

Se tomaron muestras de la mezcla posterior al inóculo y se analizaron por HPLC-RID (BioRad Aminex HPX-87P, agua isocrática, HPLC Agilent 1100) mediante un método de patrón externo para determinar la relación sacarosa:maltosa inicial (S/M), que se muestra en la siguiente tabla.

Resultados

Se tomaron muestras del contenido del reactor una vez que se completó la fermentación. La muestra se centrifugó, se filtró (0,2 μm) y se analizó para determinar los carbohidratos/manitol mediante HPAEC-PAD y los ácidos orgánicos mediante HPLC-RlD (BioRad Aminex HPX-87H, H²SO⁴ isocrático 0,008 mM).

La composición del caldo final resultante (final) en comparación con los medios previos al inóculo (Pre) se muestra en la siguiente tabla. Los valores mostrados son %/brix (sólidos secos refractivos).

Como se muestra en la Figura 3, el perfil cromatográfico del producto es similar al producto de MIMO ISOThrive™ de calidad alimentaria. La Figura 3 muestra una comparación de cromatogramas de HPAEC-PAD de lo siguiente: 1. Caldo de MIMO de calidad alimentaria;

2. Satin Sweet™ reducido en un factor de 5; y

3. Caldo de MIMO de calidad para alimentación de animales hecho de jarabe de Satin Sweet™ con alto contenido en maltosa y azúcar sin refinar de calidad comercial (sacarosa) de caña de azúcar como se describe en este ejemplo.

Los picos mostrados en la Figura 3 están etiquetados con letras correspondientes a los siguientes azúcares y oligosacáridos: (A) D-leucrosa; (B) sacarosa; (C) maltosa; (D)-(I) MIMO DP 3-8 y (J)-(M) maltodextrinas DP 3-6. Con la excepción de las maltodextrinas DP 3-6, el producto se conformó, cromatográficamente, con un producto de calidad alimentaria apto para el consumo humano.

Ejemplo 3: Generación de maltosil-isomaltooligosacáridos (MIMO) utilizando almidón de patata como fuente de maltosa y azúcar sin refinar como fuente de sacarosa

Este ejemplo ilustra que el almidón de patata es una fuente buena y económica de maltosa para la preparación de MIMO.

Preparación de almidón de patata sacarificado

Se introdujo almidón de patata en suspensión (Sigma Aldrich n.° S4251, lote n.° BCBJ6787V) (50-56 % p/p en agua) en 2 l de agua de 18 Mü a 83 °C con pH 5,5, que contenía 1000 U de a-amilasa termoestable (Termamyl, B. lichenformis, tipo XII-A, Sigma n.° A3403, lote n.° SLBK3081V). Se repitió la adición de más alícuotas de almidón y enzima hasta que el brix (g de sólidos refractivos secos/100 g de material) determinado por el índice de refracción fue de 26,8 y la pureza fue suficiente para proporcionar 0,091 kg de maltosa (detectada por HPLC-RID, Aminex HPX-87H).

El licor resultante se filtró (papel de filtro Whatman n.° 3 con prerrevestimiento auxiliar de filtro de diatomita Celite 545) y se concentró a 51,85 brix mediante evaporación (70 °C, 26” Hg).

Preparación de oligosacáridos

La fermentación por lotes se realizó en un Fermentador BioFlow® de 2 l/CelliGen® 115 (New Brunswick Scientific Co.). El pH del medio se ajustó a 7,00 con NaOH (ac.) al 50 % p/p. A continuación, el fermentador se selló y toda la mezcla se sometió a autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Una vez enfriado, se transfirieron al fermentador 0,829 kg de jarabe de maltosa derivado de fécula de patata (51,85 % brix, 21,1 % maltosa, relación sacarosa: maltosa = 2,758) para obtener una composición media final de:

sacarosa (9,63 %),

jarabe de maltosa (3,49 %),

MnSO₄H₂O (0,0008 %),

MgSO₄ (0,0096 %),

FeSO₄-7H₂O (0,0008 %),

KH₂PO₄ (0,2138 %),

NaCl (0,0008 %),

CaCb-2H₂O (0,0046 %), y

extracto de levadura (0,4022 %).

El pH del medio se ajustó a 6,5 con HCl al 37 % y después se inoculó con 50 ml de L. citreum de fase logarítmica tardía (ATCC 13146). Se permitió que prosiguiera la fermentación con la adición de álcali según fuera necesario para mantener el pH a 5,5 hasta que la fermentación se completó. Las muestras de medios previos a la inoculación, licor de fermentación de 48 horas y caldo de fermentación final se centrifugaron a 10 kRPM durante 10 minutos y el sobrenadante se filtró a través de un filtro de jeringa de nailon de 0,2 μm antes del análisis mediante HPLC-RID y HPAEC-PAD.

Análisis de oligosacáridos

El análisis de los medios de fermentación finales mostró que la distribución de oligosacáridos era muy similar al MIMO de calidad alimentaria para seres humanos generada como se describe en la solicitud provisional US-62/280.026. El peso molecular promedio en masa del MIMO de calidad para alimentación de animales (GR para alimentación de animales) fue de 790,16 Da, mientras que el control de MIMO de calidad alimentaria para seres humanos (GR alimentario) fue de 789,46 Da. Esta conclusión es visualmente evidente en la Figura 4, donde se puede ver que la superposición del cromatograma normalizado de MIMO de calidad alimentaria (15-01A) sobre el cromatograma de calidad para alimentación de animales (final) muestra que el producto final de calidad para alimentación de animales tiene un perfil similar en comparación con el producto de MIMO de calidad alimentaria.

El caldo final así obtenido contenía los componentes que se muestran en la siguiente tabla, donde se muestra un producto comercial de calidad alimentaria (para consumo humano), 15-01A, para comparación. Los valores mostrados son %/brix (sólidos secos refractivos).

Ejemplo 4: Producción de MIMO con Weissella confusa

Este ejemplo ilustra que también se puede emplear Weissella confusa como microorganismo productor de dextransacarasa útil para preparar MIMO.

Métodos

A un fermentador de 20 l se le añadieron 10,022 kg de agua desionizada, 1,963 kg de sacarosa, 75,0000 g de extracto de levadura, 0,15045 g de MnSO₄, 1,47794 g de MgSO₄, 0,15564 g de FeSO₄, 40,11177 g de KH₂PO₄, 0,15521 g de NaCl y 0,63645 g de CaCb. El pH se ajustó a 5,62 utilizando 15,99257 g de NaOH (50 %). El conjunto se esterilizó in situ y se disolvieron 0,790 kg de monohidrato de maltosa en 2000 kg de agua desionizada recién esterilizada en autoclave. Esto último se transfirió al fermentador a través de una membrana de 0,2 micras. El conjunto se inoculó con 150 ml de un cultivo logarítmico tardío de Weissella confusa NRRL B-1064 en medios MRS. Durante la incubación, la temperatura se mantuvo entre 27 y 30 °C y el pH se controló a 5,00 usando NaOH (40 %). Se permitió que la fermentación prosiguiera durante 60 horas. El caldo resultante se centrifugó para eliminar las células (9000 r Pm /20 min) y se analizó mediante UPAEC-PAD y HPLC-DRI.

Resultados

La composición del caldo de fermentación final se muestra a continuación. Los valores mostrados son %/brix (sólidos secos refractivos).

La Figura 5 ilustra la composición del caldo de fermentación de Weissella confusa detectada por análisis HPAEC, lo que demuestra que Weissella confusa es un microorganismo productor de dextransacarasa útil para preparar MIMO. Referencias:

1. Swartz, M.N. (2002) Human Diseases Caused by Foodborne Pathogens of Animal Origin. Human Disease and Foodbourne Pathogens, Clin. Infect. Dis. 2002:34 págs. S111-S122 (véase el sitio web cid.oxfordjournals.org/content/34/Supplement_3/S111.full.pdf+html).

2. Bergeron, C.R., Prussing, C., Boerlin, P., Daignault, D., Dutil, L., Reid-Smith, R.J., Zhanel, G.G. y Manges, A.R. (2012) Chickens as Reservoir for Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli in Humans, Canada. Emerging Infectious Diseases 18 (3), págs. 415-421 (véase el sitio web CDC.gov/eid).

3. Evangelisti, D.G., English, A.R., Girard, A.E., Lynch, J.E. y Solomons, I.A. (1975) Influence of Subtherapeutic Levels of Oxytetracycline on Salmonella typhimurium in Swine, Calves, and chickens, Antimicrob. Agents Chemother. 8(6), págs. 664-672 (véase el sitio web www.ncbi.nlm.nih.gov/μmc/articles/PMC429444/).

4. Phillips, I., Casewell, M., Cox, T., De Groot, B., Friis, C., Jones, R., Nightingale, C., Preston, R. y Waddell, J. (2004) Does the use of antibiotics in food animals pose a risk to human health? Una revisión crítica de los datos publicados. J. Antimicrob. Chemother. 53, págs. 28-52 (véase el sitio web jac.oxfordjournals.org/content/53/1/28.full.pdf+html).

5. National Research Coucil (US) Committee to Study the Human Health Effects of Subtherapeutic Antibiotic use in Animal Feeds. Washington (DC). (1980). The Effects on Human Health of Subtherapeutic Use of Antimicrobials in Animal Feeds. Appendix K Antibiotics in Animal Feeds. (véase el sitio web www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK₂16502/).

6. Hu, Y., Ketabi, A., Buchko, A. y Ganzle. (2013) Metabolism of Isomaltooligosaccharides by Lactobacillus reuteri and bifidobacteria. Lett. Appl. Microbiol. 57, págs. 108-114.

7. Bounaix M-S., Robert H., Gabriel V., Morel S., Remaud-Simeon M., Gabriel B, y Fontagne-Faucher C. (2010). Characterization of dextran-producing Weissella strains isolated from sourdoughs and evidence of constitutive dextransucrase expression. FEMS Microbiol Lett 311 (1), págs. 18-26. DOI: 10.1111/j. 1574-6968.2010.02067.x.

8. Shi Q., Hou Y, Juvonen M, Tuomainen P, Kajala I, Shulka S, Goyal A, Maaheimo H, Katina K y Tenkanen M. (2016). Optimization of isomaltooligosaccharide size distribution by acceptor reaction of Weissella confusa Dextransucrase and characterization of novel a-(1^-2)-branched isomaltooligosaccharides. J Agric Food Chem 64, págs. 3276-3286. Doi: 10.1021/acs.jafc.6b01356.

9. Torino M I., Font de Valdez G y Mozzi F. (2015). Biopolymers from lactic acid bacteria. Novel applications in foods and beverages. Front Microbiol. 6 (834) págs. 1 -16. doi: 10.3389/fmicb.2015.00834

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende una o más maltodextrinas; lactato; glicerol; acetato; y maltosilisomaltooligosacáridos (MIMO) con una distribución de peso molecular promedio en masa de 650 a 2000 daltons, en donde los MIMO tienen un grado de polimerización que varía de DP 3 a DP 30, fabricada por un método que comprende:

(a) poner en contacto células de microorganismos productores de dextransacarasa naturales con un medio de cultivo acuoso que comprende una relación de sacarosa a maltosa que varía de 2,0 a 4,5 para formar una mezcla de fermentación, donde al menos una fuente de la sacarosa y la maltosa en la mezcla de fermentación es una fuente de sacarosa de calidad no alimentaria o una fuente de maltosa de calidad no alimentaria; y

(b) fermentar la mezcla de fermentación durante un tiempo y en condiciones para generar una composición que comprenda maltosil-isomaltooligosacáridos (MIMO) con una distribución de peso molecular promedio en masa de 650 a 2000 daltons.

2. La composición de la reivindicación 1, donde la fuente de sacarosa de calidad no alimentaria es azúcar sin refinar, melaza, jarabe de caña de azúcar, sorgo dulce, jarabe de caña silvestre, azúcar de remolacha, melaza de remolacha, hojas de remolacha azucarera, jarabe de arce, algas o cualquier combinación de los mismos.

3. La composición de la reivindicación 1 o 2, donde la fuente de maltosa de calidad no alimentaria es, o se deriva de, jarabe de maltosa, jarabe con alto contenido en maltosa, malta, almidón sacarificado, almidón de maíz, almidón de patata, almidón de tapioca, almidón de trigo, almidón de avena, almidón de mijo, almidón de sorgo, almidón de arroz, almidón de amaranta, almidón de taro, almidón de kudzu, almidón de ñame o cualquier combinación de los mismos.

4. La composición de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la fuente de sacarosa o maltosa no contiene compuestos tóxicos, metales pesados o materiales tóxicos detectables por HPAEC-PAD, HPLC, ICP-MS o HPLC-RID.

5. La composición de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el microorganismo productor de dextransacarasa natural es Leuconostoc mesenteroides, Leuconostoc citreum, Leuconostoc gasicomitatum, Leuconostoc kimchi, Leuconostoc amelibiosum, Weissella confusa, Weissella cibaria, Lactococcus spp., Streptococcus mutans, Lactobacillis spp. Pediococcus pentosaceus spp. o una mezcla de los mismos.

6. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde el microorganismo productor de dextransacarasa es Leuconostoc citreum ATCC 13146 (NRRL B-742), Weissella confusa o una combinación de los mismos.

7. La composición de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la composición comprende al menos 3 % de una o más maltodextrinas.

8. La composición de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además manitol; glucosa; sacarosa; maltosa; panosa; oligosacárido(s) 1,4-DP 3; oligosacárido(s) 1,4-DP 4 y formiato.

9. La composición de la reivindicación 1, que comprende la composición 1 o la composición 2 de la siguiente tabla, donde los valores mostrados se dan como %/brix o % de sólidos refractivos secos.

donde 1,4-DP3 y 1,4-DP4 son maltodextrinas.

10. La composición de la reivindicación 1, que comprende la composición 3 de la siguiente tabla, donde los valores mostrados se dan como %/brix o % de sólidos refractivos secos.

donde 1,4-DP3 y 1,4-DP4 son maltodextrinas.

11. La composición de la reivindicación 1, que comprende la composición 4 o la composición 5 de la siguiente tabla, donde los valores mostrados se dan como %/brix o % de sólidos refractivos secos.

12. Un alimento para animales que comprende la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-11.

13. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-11 o el alimento para animales de la reivindicación 12 para usar en el tratamiento de animales como una alternativa a los antibióticos para la generación de un microbioma que inhibe la invasión de patógenos.

14. La composición para usar de la reivindicación 13, en donde los animales son pollitos de un día.