ES2955045T3 - Métodos y composiciones para inhibir la expresión de ldha - Google Patents

Métodos y composiciones para inhibir la expresión de ldha Download PDF

Info

Publication number
ES2955045T3
ES2955045T3 ES18867097T ES18867097T ES2955045T3 ES 2955045 T3 ES2955045 T3 ES 2955045T3 ES 18867097 T ES18867097 T ES 18867097T ES 18867097 T ES18867097 T ES 18867097T ES 2955045 T3 ES2955045 T3 ES 2955045T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
oligonucleotide
ldha
positions
antisense strand
strand
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES18867097T
Other languages
English (en)
Inventor
Bob Brown
Henryk Dudek
Utsav Saxena
Natalie Pursell
Cheng Lai
Weimin Wang
Rachel Storr
Naim Nazef
Boyoung Kim
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Novo Nordisk Health Care AG
Original Assignee
Novo Nordisk Health Care AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=66101691&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2955045(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Novo Nordisk Health Care AG filed Critical Novo Nordisk Health Care AG
Application granted granted Critical
Publication of ES2955045T3 publication Critical patent/ES2955045T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/04—Drugs for disorders of the urinary system for urolithiasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01027—L-Lactate dehydrogenase (1.1.1.27)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/344—Position-specific modifications, e.g. on every purine, at the 3'-end
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3515—Lipophilic moiety, e.g. cholesterol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3521—Methyl
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/353—Nature of the modification linked to the nucleic acid via an atom other than carbon
    • C12N2310/3533—Halogen

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Esta divulgación se refiere a oligonucleótidos, composiciones y métodos útiles para reducir la expresión de LDHA, particularmente en hepatocitos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos y composiciones para inhibir la expresión de Idha
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un oligonucleótido de ARNi y composiciones que comprenden el oligonucleótido para reducir la expresión de LDHA.
Antecedentes de la invención
Las hiperoxalurias primarias (PH) son trastornos autosómicos recesivos causados por la sobreproducción de oxalato que conduce a la precipitación del oxalato de calcio en el riñón y, finalmente, a la enfermedad renal en etapa terminal. Hay tres formas de PH designadas como PH tipos 1 (PH1), 2 (PH2) y 3 (PH3) así como también hiperoxaluria idiopática. La lactato deshidrogenasa (LDH) se ha identificado como una diana para reducir la producción de oxalato hepático, ya que es la enzima clave responsable de convertir el glicoxilato en oxalato, la última etapa del metabolismo del oxalato en el hígado. Se han desarrollado oligonucleótidos de ARNi dirigidos a genes que codifican subunidades de LDH. El documento WO2016/057932 (Dicerna Pharmaceuticals, Inc.) describe varios oligonucleótidos de ARNi para reducir la expresión de LDHA, que incluyen los sustratos de Dicer denominados ARNisD.
Breve resumen de la invención
La presente invención proporciona un nuevo oligonucleótido de ARNi que comprende una estructura de tetrabucle mellada a la que se conjugan restos de N-acetilgalactosamina (GalNAc) para suministrar específicamente el oligonucleótido a los hepatocitos para dirigirse a la expresión de LDHA, de esta manera se evita o minimiza los efectos no deseados potenciales en otros tejidos, tales como músculo, piel o útero. Un oligonucleótido de ARNi de este tipo es útil para reducir la producción de oxalato hepático en un sujeto, por ejemplo, un paciente que tiene una hiperoxaluria primaria. Un oligonucleótido de ARNi de este tipo es útil para reducir los niveles de oxalato en orina. Es útil para tratar la hiperoxaluria primaria, que incluye PH1, PH2 y/o PH3, así como también la hiperoxaluria idiopática.
Más particularmente ahora se proporciona un oligonucleótido para reducir la expresión de LDHA, el oligonucleótido comprende una hebra antisentido que tiene una secuencia expuesta como UCAGAUAAAAAGGACAACAUGG (SEQ ID NO: 1) y una hebra sentido que tiene una secuencia expuesta como AUGUUGUCCUUUUUAUCUGAGCAGCCGAAAGGCUGC (SEQ ID NO: 2) en donde todas las siguientes posiciones se modifican con un 2-O-metilo: posiciones 1, 2, 4, 6, 7, 12, 14, 16, 18-26 y 31-36 de la hebra sentido y las posiciones 1, 6, 8, 11-13, 15, 17 y 19-22 de la hebra antisentido. Adicionalmente, todas las siguientes posiciones se modifican con un 2-fluoro: las posiciones 3, 5, 8-11,13, 15 y 17 de la hebra sentido y las posiciones 2-5, 7, 9, 10, 14, 16 y 18 de la hebra antisentido.
Además el oligonucleótido tiene un enlace fosforotioato entre cada una de: posiciones 1 y 2 de la hebra sentido, posiciones 1 y 2 de la hebra antisentido, posiciones 2 y 3 de la hebra antisentido, posiciones 3 y 4 de la hebra antisentido, posiciones 20 y 21 de la hebra antisentido, y las posiciones 21 y 22 de la hebra antisentido.
Además, la uridina en la primera posición de la hebra antisentido comprende un análogo de fosfato. Más particularmente, el oligonucleótido comprende la siguiente estructura en la posición 1 de la hebra antisentido:
Figure imgf000002_0001
Adicionalmente, cada uno de los nucleótidos de la secuencia -G AA A- en la hebra sentido se conjuga con un resto de GalNac monovalente de manera que el motivo -G AA A- comprende la estructura:
Figure imgf000003_0001
Adicionalmente, ahora se proporciona una composición que comprende el oligonucleótido de la invención como se describió anteriormente y contraiones de Na+. Ver la Figura 3.
En otro aspecto, la invención proporciona un oligonucleótido o composición de la invención para su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene o está en riesgo de tener PH1, PH2, PH3 y/o hiperoxaluria idiopática, el método comprende reducir la expresión de la proteína LDHA en hepatocitos en el sujeto mediante la administración del oligonucleótido o composición al sujeto.
Por lo tanto, en una modalidad de la invención, se proporciona un oligonucleótido o composición de la invención para su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene o en riesgo de tener una hiperoxaluria primaria, el tratamiento comprende administrar el oligonucleótido o composición al sujeto. En algunas modalidades, el oligonucleótido o composición se administra al sujeto por vía intravenosa o subcutánea.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1A es un esquema que muestra el oligonucleótido de ARNi de la invención que tiene una hebra guía (antisentido) con una región de complementariedad con el ARNm de LDHA menos los restos de GalNac.
La Figura 1B es una representación de la secuencia de bucle presente en las posiciones 27-30 de la hebra pasajera (sentido) mostrada en la Figura 1A.
La Figura 1C es una representación de la estructura química de la uridina modificada mostrada en la posición 1 de la hebra guía (antisentido) mostrada en la Figura 1A. En la fórmula química, =■= o es un enlace simple en el que no se especifica la estereoquímica de los restos inmediatamente unidos a la misma.
La Figura 2A es un esquema que muestra una línea de tiempo para la evaluación in vivo del oligonucleótido específico mostrado en la Figura 1A mediante el uso de un modelo de ratón de AAV de LDHA. La inyección de AAV se realizó en la semana -1, y las dosis únicas del oligonucleótido se inyectaron por vía subcutánea a 0,5, 1, 3 o 6 mg/kg como se muestra. A las 1,2, 4, 6, 8 y 10 semanas se recogió un sacabocados de biopsia de 4 mm y se congeló rápidamente en un bloque y en RNAlater para los análisis de atenuación del ARNm.
La Figura 2B es un gráfico que demuestra un subconjunto de los resultados del estudio descrito en el Ejemplo 1. El porcentaje de ARNm de hLDHA restante se muestra en las semanas después de la dosis después de las dosis de 1, 3 o 6 mg/kg. Estos resultados se normalizaron respecto a PBS a los mismos tiempos. La reducción dependiente de la dosis del ARNm de LDHA humano se mantuvo durante cuatro semanas después de la dosis.
La Figura 3 muestra la estructura química de un oligonucleótido de ARNi de la invención que tiene una hebra guía (antisentido) con una región de complementariedad con ARNm de LDHA y una hebra pasajera (sentido) que tiene una estructura de tetrabucle mellada con contraiones Na+.
La Figura 4 es un gráfico que muestra la reducción del ARNm de LDHA (paneles superiores), la proteína LDH (paneles intermedios) y la actividad de LDH (% restante, paneles inferiores) después de dos dosis del oligonucleótido como se muestra en la Figura 3 en macacos cangrejeros (menores y adultos jóvenes) en los días 28 y 56 después de la primera dosis.
La Figura 5 es un gráfico que muestra la reducción de los niveles de proteína LDH (como se detecta mediante transferencia Western) después de dos dosis del oligonucleótido como se muestra en la Figura 3 en macacos cangrejeros.
La Figura 6 es un gráfico que muestra la reducción de la expresión del ARNm de LDHA (% restante) después de diez dosis del oligonucleótido como se muestra en la Figura 3 en macacos cangrejeros.
La Figura 7 es un gráfico que muestra las concentraciones del oligonucleótido incorporado en Ago2/RISC después de diez dosis del oligonucleótido como se muestra en la Figura 3 en macacos cangrejeros.
Las Figuras 8A-8B son gráficos que muestran el efecto del oligonucleótido como se muestra en la Figura 3 a diferentes dosis (1,5 mg/kg, 3 mg/kg o 6 mg/kg) en pacientes con PH en un estudio sin ocultación y multicéntrico. La Figura 8A muestra los cambios en el valor absoluto del contenido de oxalato urinario (UOX) en estos pacientes a lo largo del estudio. Para el grupo con dosis de 1,5 mg/kg, n = 2 después del D57. Para el grupo con dosis de 3 mg/kg n=2 después del D57. Para el grupo con dosis de 6 mg/kg, n=2 y n=1 después del D15. La Figura 8B muestra el cambio del % de oxalato urinario (UOX) en 24 h con respecto al valor inicial en pacientes del grupo con dosis de 1,5 mg/kg y del grupo con dosis de 3 mg/kg a lo largo del estudio.
Descripción detallada de la invención
Como se indicó anteriormente, la descripción proporciona un oligonucleótido de ARNi útil para la reducción de LDHA en, por ejemplo, células hepáticas (por ejemplo, hepatocitos). Tal represión de la actividad de LDH hepática proporciona un enfoque terapéuti
también la hiperoxaluria idiopática.
I. Definiciones
Aproximadamente: Como se usa en la presente descripción, el término "aproximadamente" o "alrededor de", cuando se aplica a uno o más valores de interés, se refiere a un valor que es similar a un valor de referencia indicado. En ciertas modalidades, el término "aproximadamente" o "alrededor de" se refiere a un intervalo de valores que se encuentran dentro de 25 %, 20 %, 19 %, 18 %, 17 %, 16 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % o menos en cualquier dirección (mayor o menor que) el valor de referencia indicado a menos que se indique de cualquier otra manera o sea evidente de cualquier otra manera a partir del contexto (excepto cuando tal número exceda el 100 % de un valor posible).
Administrar: Como se usa en la presente descripción, "administrar" o "administración" significa proporcionar una sustancia (por ejemplo, un oligonucleótido) a un sujeto de una manera que sea farmacológicamente útil (por ejemplo, para tratar una afección en el sujeto).
Receptor de asialoglicoproteína (ASGPR): Como se usa en la presente descripción, el término “receptor de asialoglicoproteína” o “ASGPR” se refiere a una lectina bipartita de tipo C formada por una subunidad mayor de 48 kDa (ASGPR-1) y una menor de 40 kDa (ASGPR-2). El ASGPR se expresa principalmente en la superficie sinusoidal de los hepatocitos y tiene un papel importante en la unión, internalización y eliminación posterior de glicoproteínas circulantes que contienen residuos terminales de galactosa o N-acetilgalactosamina (asialoglicoproteínas).
Atenúa: Como se usa en la presente descripción, el término “atenúa” significa que reduce o detiene de manera efectiva. Como ejemplo no limitante, uno o más de los tratamientos proporcionados en la presente descripción pueden reducir o detener de manera efectiva la acumulación de oxalato en un sujeto. Esta atenuación puede ejemplificarse, por ejemplo, mediante una disminución en uno o más aspectos (por ejemplo, síntomas, características de los tejidos y células etc.) de la acumulación de oxalato o los síntomas resultantes de tal acumulación, ausencia de progresión detectable (empeoramiento) de uno o más aspectos de la acumulación de oxalato o los síntomas resultantes de dicha acumulación, o ausencia de acumulación de oxalato detectable o síntomas resultantes de tal acumulación en un sujeto cuando de cualquier otra manera podrían esperarse.
Complementario: Como se usa en la presente descripción, el término "complementario" se refiere a una relación estructural entre dos nucleótidos (por ejemplo, en dos ácidos nucleicos opuestos o en regiones opuestas de una sola hebra de ácido nucleico) que permite que los dos nucleótidos formen pares de bases entre sí. Por ejemplo, un nucleótido de purina de un ácido nucleico que es complementario a un nucleótido de pirimidina de un ácido nucleico opuesto puede aparearse formando enlaces de hidrógeno entre sí. En algunas modalidades, los nucleótidos complementarios pueden aparearse a la manera de Watson-Crick o de cualquier otra manera que permita la formación de híbridos estables. En algunas modalidades, dos ácidos nucleicos pueden tener regiones de múltiples nucleótidos que son complementarias entre sí de manera que forman regiones de complementariedad, como se describe en la presente descripción.
Desoxirribonucleótido: Como se usa en la presente descripción, el término "desoxirribonucleótido" se refiere a un nucleótido que tiene un hidrógeno en lugar de un hidroxilo en la posición 2' de su azúcar pentosa cuando se compara con un ribonucleótido. Un desoxirribonucleótido modificado es un desoxirribonucleótido que tiene una o más modificaciones o sustituciones de átomos distintos de los de la posición 2', que incluyen modificaciones o sustituciones en o del azúcar, el grupo fosfato o la base.
Oligonucleótido bicatenario: Como se usa en la presente descripción, el término "oligonucleótido bicatenario" se refiere a un oligonucleótido que está sustancialmente en una forma de dúplex. En algunas modalidades, el apareamiento de bases complementarias de la(s) región(es) de dúplex de un oligonucleótido bicatenario se forma entre secuencias antiparalelas de nucleótidos de hebras de ácido nucleico separadas covalentemente. En algunas modalidades, el apareamiento de bases complementarias de la(s) región(es) híbrida(s) de un oligonucleótido bicatenario se forma entre secuencias antiparalelas de nucleótidos de hebras de ácido nucleico que están unidas covalentemente. En algunas modalidades, el apareamiento de bases complementarias de la(s) región(es) de dúplex de un oligonucleótido bicatenario se forma a partir de una sola hebra de ácido nucleico que se pliega (por ejemplo, por medio de una horquilla) para proporcionar secuencias antiparalelas complementarias de nucleótidos que forman pares de bases. En algunas modalidades, un oligonucleótido bicatenario comprende dos hebras de ácido nucleico separadas covalentemente que forman un híbrido completamente entre sí. Sin embargo, en algunas modalidades, un oligonucleótido bicatenario comprende dos hebras de ácido nucleico separadas covalentemente que forman un dúplex parcialmente (por ejemplo, con salientes en uno o ambos extremos). En algunas modalidades, un oligonucleótido bicatenario comprende secuencias antiparalelas de nucleótidos que son parcialmente complementarios y, por lo tanto, pueden tener uno o más errores de apareamiento, que pueden incluir errores de apareamiento internos o errores de apareamiento en los extremos.
Dúplex: Como se usa en la presente descripción, el término "dúplex" en referencia a los ácidos nucleicos (por ejemplo, oligonucleótidos), se refiere a una estructura formada a través del apareamiento de bases complementarias de dos secuencias antiparalelas de nucleótidos.
Excipiente: Como se usa en la presente descripción, el término "excipiente" se refiere a un agente no terapéutico que puede incluirse en una composición, por ejemplo, para proporcionar o contribuir a una consistencia o un efecto estabilizador deseados.
Hepatocito: Como se usa en la presente descripción, el término "hepatocito" o "hepatocitos" se refiere a las células de los tejidos parenquimatosos del hígado. Estas células constituyen aproximadamente 70-85 % de la masa del hígado y producen albúmina sérica, fibrinógeno y el grupo protrombina de los factores de coagulación (excepto los factores 3 y 4). Los marcadores de las células del linaje de hepatocitos incluyen, pero no se limitan a, transtiretina (Ttr), glutamina sintetasa (Glul), factor nuclear de hepatocitos 1a (Hnf1a) y factor nuclear de hepatocitos 4a (Hnf4a). Los marcadores de hepatocitos maduros pueden incluir, pero no se limitan a, citocromo P450 (Cyp3a11), fumarilacetoacetato hidrolasa (Fah), glucosa 6-fosfato (G6p), albúmina (Alb) y OC2-2F8. Ver, por ejemplo, Huch y otros, (2013), Nature, 494(7436): 247-250.
Lactato deshidrogenasa (LDH): Como se usa en la presente descripción, el término “ lactato deshidrogenasa” o “LDH” se refiere a una enzima que regula la homeostasis del metabolismo de lactato/piruvato, hidroxipiruvato/glicerato y glicoxilato/oxalato. La LDH funcional está compuesta por cuatro cadenas polipeptídicas monoméricas para formar un tetrámero. Las dos subunidades más comunes, conocidas como las formas muscular (M) o cardíaca (H) de LDH, están codificadas por los genes LDHA y LDHB, respectivamente. Se han identificado cinco isozimas diferentes en base a su composición de subunidades (4H, 3H1M, 2H2M, 1H3M, 4M), que muestran actividades enzimáticas similares pero diferentes comportamientos cinéticos y distribuciones en tejidos. La principal isozima del hígado y el músculo esquelético, LDH5, tiene subunidades 4M.
Lactato deshidrogenasa A (LDHA): Como se usa en la presente descripción, el término “ lactato deshidrogenasa A” o “LDHA" se refiere a un monómero de la enzima LDH codificado por el gen LDHA (ID del gen Entrez: 3939), del cual existen al menos cinco variantes transcripcionales de ARNm (por ejemplo, secuencia de referencia del NCBI: NM_005566.3, NM_001135239.1, NM_001165414.1, NM_001165415.1 y NM_001165416.1) que codifican isoformas diferentes.
Lactato deshidrogenasa B (LDHB): Como se usa en la presente descripción el término “ lactato deshidrogenasa B” o “LDHB" se refiere a un monómero de la enzima LDH codificado por el gen LDHB (ID del gen de Entrez: 3945), del cual existen al menos dos variantes transcripcionales de ARNm (por ejemplo, secuencia de referencia del NCBI: NM_001174097.2 y NM_001315537.1) que codifican isoformas diferentes.
Bucle: Como se usa en la presente descripción, el término "bucle" se refiere a una región no apareada de un ácido nucleico (por ejemplo, oligonucleótido) que está flanqueada por dos regiones antiparalelas del ácido nucleico que son suficientemente complementarias entre sí, de manera que en condiciones de hibridación apropiadas (por ejemplo, en un tampón de fosfato, en unas células), las dos regiones antiparalelas, que flanquean la región no apareada, se hibridan para formar un dúplex (denominado "tallo").
Enlace internucleotídico modificado: Como se usa en la presente descripción, el término "enlace internucleotídico modificado" se refiere a un enlace internucleotídico que tiene una o más modificaciones químicas en comparación con un enlace internucleotídico de referencia que comprende un enlace fosfodiéster. En algunas modalidades, un nucleótido modificado es un enlace que no se produce de forma natural. En algunas modalidades, un enlace internucleotídico modificado confiere una o más propiedades convenientes a un ácido nucleico en el que está presente el enlace internucleotídico modificado.
Nucleótido modificado: Como se usa en la presente descripción, el término "nucleótido modificado" se refiere a un nucleótido que tiene una o más modificaciones químicas en comparación con un nucleótido de referencia correspondiente seleccionado de: ribonucleótido de adenina, ribonucleótido de guanina, ribonucleótido de citosina, ribonucleótido de uracilo, desoxirribonucleótido de adenina, desoxirribonucleótido de guanina, desoxirribonucleótido de citosina y desoxirribonucleótido de timidina. En algunas modalidades, un nucleótido modificado es un nucleótido de origen no natural. En algunas modalidades, un nucleótido modificado tiene una o más modificaciones químicas en su azúcar, nucleobase y/o grupo fosfato. En algunas modalidades, un nucleótido modificado tiene uno o más restos químicos conjugados con un nucleótido de referencia correspondiente. En algunas modalidades, un nucleótido modificado proporcionado en la presente descripción puede contribuir a mejorar la estabilidad térmica, la resistencia a la degradación, la resistencia a las nucleasas, la solubilidad, la biodisponibilidad, la bioactividad, reducir la inmunogenicidad, etc.
Estructura de tetrabucle mellada: Una "estructura de tetrabucle mellada" es una estructura de un oligonucleótido de ARNi caracterizada por la presencia de hebras sentido (pasajera) y antisentido (guía) separadas, en las que la hebra sentido tiene una región de complementariedad con la hebra antisentido, y en las que al menos una de las hebras, generalmente la hebra sentido, tiene un tetrabucle configurado para estabilizar una región de tallo adyacente formada dentro de la al menos una hebra.
Oligonucleótido: Como se usa en la presente descripción, el término "oligonucleótido" se refiere a un ácido nucleico corto (por ejemplo, de menos de aproximadamente 100 nucleótidos de longitud. Un oligonucleótido puede ser monocatenario o bicatenario. Un oligonucleótido puede tener o no regiones híbridas. Como un conjunto de ejemplos no limitantes, un oligonucleótido puede ser, pero no se limita a, un ARN de interferencia pequeño (ARNip), microARN (miARN), ARN de horquilla corto (ARNhc), ARN de interferencia sustrato de Dicer (ARNisd), oligonucleótido antisentido, ARNip corto o ARNip monocatenario. En algunas modalidades, un oligonucleótido bicatenario es un oligonucleótido de ARNi.
Saliente: Como se usa en la presente descripción, el término "saliente" se refiere a nucleótido(s) terminal(es) sin apareamiento de bases resultante de una hebra o región que se extiende más allá del extremo terminal de una hebra complementaria con la que la hebra o región forma un dúplex. En algunas modalidades, un saliente comprende uno o más nucleótidos no apareados que se extienden desde una región dúplex en el extremo terminal 5' o el extremo terminal 3' de un oligonucleótido. En ciertas modalidades, el saliente es un saliente 3' o 5' en la hebra antisentido o hebra sentido de un oligonucleótido bicatenario.
Análogo de fosfato: Como se usa en la presente descripción, el término "análogo de fosfato" se refiere a un resto químico que imita las propiedades electrostáticas y/o estéricas de un grupo fosfato. En algunas modalidades, un oligonucleótido tiene un análogo de fosfato en una posición de carbono 4' del azúcar (denominado "análogo de 4'-fosfato") en un nucleótido del extremo terminal 5'. Un ejemplo de un análogo de 4'-fosfato es el oximetilfosfonato, en el que el átomo de oxígeno del grupo oximetilo se une al resto de azúcar (por ejemplo, en su carbono 4') o análogo de este.
Expresión reducida: Como se usa en la presente descripción, el término “expresión reducida” de un gen se refiere a una disminución en la cantidad de transcrito de ARN o proteína codificada por el gen y/o una disminución en la cantidad de actividad del gen en una célula o sujeto, en comparación con una célula o sujeto de referencia apropiado. Por ejemplo, la acción de tratar una célula con un oligonucleótido bicatenario (por ejemplo, uno que tiene una hebra antisentido que es complementaria a la secuencia de ARNm de LDHA) puede dar como resultado una disminución en la cantidad de transcrito de ARNm, proteína y/o actividad enzimática (por ejemplo, codificada por el gen LDHA) en comparación con una célula que no se trata con el oligonucleótido bicatenario. De manera similar, como se usa en la presente descripción, "reducir la expresión" se refiere a una acción que da como resultado la expresión reducida de un gen (por ejemplo, LDHA).
Región de complementariedad: Como se usa en la presente descripción, el término "región de complementariedad" se refiere a una secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico (por ejemplo, un oligonucleótido bicatenario) que es suficientemente complementaria a una secuencia antiparalela de nucleótidos para permitir la hibridación entre las dos secuencias de nucleótidos en condiciones de hibridación apropiadas, por ejemplo, en un tampón de fosfato, en una célula, etc.
Ribonucleótido: Como se usa en la presente descripción, el término "ribonucleótido" se refiere a un nucleótido que tiene una ribosa como su azúcar pentosa, que contiene un grupo hidroxilo en su posición 2'. Un ribonucleótido modificado es un ribonucleótido que tiene una o más modificaciones o sustituciones de átomos distintos de los de la posición 2', que incluyen modificaciones o sustituciones en o de la ribosa, el grupo fosfato o la base.
Oligonucleótido de ARNi: Como se usa en la presente descripción, el término "oligonucleótido de ARNi" se refiere a (a) un oligonucleótido bicatenario que tiene una hebra sentido (pasajera) y una hebra antisentido (guía), en el que la endonucleasa Argonauta 2 (Ago2) usa la hebra antisentido o parte de la hebra antisentido en la escisión de un ARNm diana o (b) un oligonucleótido monocatenario que tiene una sola hebra antisentido, donde la endonucleasa Ago2 usa esa hebra antisentido (o parte de esa hebra antisentido) en la escisión de un ARNm diana.
Hebra: Como se usa en la presente descripción, el término "hebra" se refiere a una sola secuencia contigua de nucleótidos unidos entre sí a través de enlaces internucleotídicos (por ejemplo, enlaces fosfodiéster o enlaces fosforotioato). En algunas modalidades, una hebra tiene dos extremos libres, por ejemplo, un extremo 5' y un extremo 3'.
Sujeto: Como se usa en la presente descripción, el término "sujeto" significa cualquier mamífero, que incluye ratones, conejos y seres humanos. En una modalidad, el sujeto es un ser humano o un primate no humano. Los términos "individuo" o "paciente" pueden usarse indistintamente con "sujeto".
Sintético: Como se usa en la presente descripción, el término "sintético" se refiere a un ácido nucleico u otra molécula que se sintetiza artificialmente (por ejemplo, mediante el uso de una máquina (por ejemplo, un sintetizador de ácidos nucleicos en estado sólido)) o que de cualquier otra manera no provenga de una fuente natural (por ejemplo, una célula u organismo) que normalmente produce la molécula.
Ligando de direccionamiento: Como se usa en la presente descripción, el término "ligando de direccionamiento" se refiere a una molécula (por ejemplo, un carbohidrato, aminoazúcar, colesterol, polipéptido o lípido) que se une selectivamente a una molécula afín (por ejemplo, un receptor) de un tejido o célula de interés y que puede conjugarse con otra sustancia con el propósito de dirigir la otra sustancia al tejido o célula de interés. En algunas modalidades, un ligando de direccionamiento comprende un resto GalNac.
Tetrabucle: Como se usa en la presente descripción, el término "tetrabucle" se refiere a un bucle que aumenta la estabilidad de un dúplex adyacente formado por hibridación de secuencias flanqueantes de nucleótidos. El aumento de la estabilidad es detectable como un aumento de la temperatura de fusión (Tm) de un dúplex de tallo adyacente que es más alta que la Tm del dúplex de tallo adyacente que se espera, en promedio, de un conjunto de bucles de longitud comparable que consiste en secuencias de nucleótidos seleccionadas al azar. Por ejemplo, un tetrabucle puede conferir una temperatura de fusión de al menos 50 °C, al menos 55 °C, al menos 56 °C, al menos 58 °C, al menos 60 °C, al menos 65 °C o al menos 75 °C en NaHPO410 mM a una horquilla que comprende un dúplex de al menos 2 pares de bases de longitud. Un tetrabucle puede estabilizar un par de bases en un dúplex de tallo adyacente mediante interacciones de apilamiento. Además, las interacciones entre los nucleótidos en un tetrabucle incluyen, pero no se limitan a, apareamiento de bases que no son del tipo Watson-Crick, interacciones de apilamiento, enlaces de hidrógeno e interacciones de contacto (Cheong y otros, Nature 16 de agosto de 1990; 346(6285):680-2; Heus y Pardi, Science 12 de julio de 1991; 253(5016):191-4). Como se indicó anteriormente, en un oligonucleótido de ARNi de la invención el tetrabucle consiste en los cuatro nucleótidos GAAA. Pueden usarse símbolos estándar IUPAC-IUB para referirse a nucleótidos de tetrabucle como se describe en Cornish-Bowden (1985) Nucl. Acids Res. 13: 3021-3030. Por ejemplo, la letra "N" puede usarse para indicar que cualquier base puede estar en esa posición, la letra "R" puede usarse para mostrar que A (adenina) o G (guanina) pueden estar en esa posición, y "B" puede usarse para mostrar que C (citosina), G (guanina) o T (timina) pueden estar en esa posición. Los ejemplos de tetrabucles incluyen la familia de tetrabucles Un CG (por ejemplo, UUc G), la familia de tetrabucles GNRA (por ejemplo, GAAA) y el tetrabucle CUUG (Woese y otros, Proc Natl Acad Sci USA. 1990 noviembre; 87(21):8467-71; Antao y otros, Nucleic Acids Res. 11 de noviembre de 1991; 19(21):5901-5). Ejemplos de tetrabucles de ADN incluyen la familia de tetrabucles d(GNNA) (por ejemplo, d(GTTA)), la familia de tetrabucles d(GNRA), la familia de tetrabucles d(GNAB), la familia de tetrabucles d(CNNG) y la familia de tetrabucles d(TNCG) (porejemplo, d(TTCG)). Ver, por ejemplo: Nakano y otros Biochemistry, 41 (48), 14281-14292, 2002. SHINJI y otros Nippon Kagakkai Koen Yokoshu VOL. 78mo; NÚM. 2; PÁGINA. 731 (2000). Como se indicó anteriormente en un oligonucleótido de ARNi de la invención el tetrabucle está contenido dentro de una estructura de tetrabucle mellada.
Tratar: Como se usa en la presente descripción, el término "tratar" se refiere a la acción de proporcionar atención a un sujeto que lo necesita, por ejemplo, mediante la administración de un agente terapéutico (por ejemplo, un oligonucleótido) al sujeto, con el propósito de mejorar la salud y/o el bienestar del sujeto con respecto a una afección existente (por ejemplo, una enfermedad, trastorno) o para prevenir o disminuir la posibilidad de que ocurra una afección. En algunas modalidades, el tratamiento implica reducir la frecuencia o la gravedad de al menos un signo, síntoma o factor contribuyente de una afección (por ejemplo, enfermedad, trastorno) que experimenta un sujeto. II. Inhibidor basado en oligonucleótidos de la expresión de LDHA
i. Secuencia de oligonucleótidos
Un oligonucleótido de la invención como se indicó anteriormente tiene una hebra guía (antisentido) que tiene una secuencia UCAGAUAAAAAGGACAACAUGG (SEQ ID NO: 1). La hebra sentido forma un dúplex con la hebra antisentido. La hebra sentido comprende un tallo-bucle en su extremo 3'. Más particularmente, la hebra sentido comprende en su extremo 3' un tallo-bucle expuesto como: S1-L-S2, en el que S1 es complementaria a S2, y en el que L forma un bucle entre S1 y S2 de 4 nucleótidos de longitud. El dúplex formado entre S1 y S2 es de 6 pares de bases de longitud. El bucle (L) del tallo-bucle es un tetrabucle dentro de una estructura de tetrabucle mellada. El tetrabucle contiene nucleótidos modificados como se indicó anteriormente y se analiza en más detalle a continuación.
El oligonucleótido tiene una hebra sentido de secuencia AUGUUGUCCUUUUUAUCUGAGCAGCCGAAAGGCUGC (SEQ ID NO: 2). Por lo tanto, como se indicó anteriormente, el oligonucleótido comprende una hebra antisentido de secuencia UCAGAUAAAAAGGACAACAUGG (SEQ ID NO: 1) y una hebra sentido de secuencia AUGUUGUCCUUUUUAUCUGAGCAGCCGAAAGGCUGC (SEQ ID NO: 2).
ii. Modificaciones de los oligonucleótidos
El oligonucleótido de la presente descripción incluye modificaciones de nucleótidos adecuadas. Un nucleótido modificado puede tener una modificación en su base (o nucleobase), el azúcar (por ejemplo, ribosa, desoxirribosa) o el grupo fosfato. El oligonucleótido de la invención tiene todos los nucleótidos modificados.
a. Modificaciones del azúcar
Un azúcar modificado (también denominado en la presente descripción un análogo de azúcar) incluye un resto de desoxirribosa o ribosa modificado. Una modificación de nucleótidos en un azúcar puede ser una modificación de 2'. Una modificación de 2' puede ser 2'-aminoetilo, 2'-fluoro, 2'-O-metilo, 2'-O-metoxietilo, o ácido 2'-desoxi-2'-fluoro-p-darabinonucleico. En un oligonucleótido de la invención, tal modificación es 2'-fluoro o 2'-O-metilo. Por lo tanto, todas las posiciones 1, 2, 4, 6, 7, 12, 14, 16, 18-26 y 31-36 de la hebra sentido y todas las posiciones 1, 6, 8, 11-13, 15, 17 y 19-22 de la hebra antisentido se modifican con un 2'-O-metilo. Adicionalmente, todas las posiciones 3, 5, 8-11, 13, 15 y 17 de la hebra sentido y todas las posiciones 2-5, 7, 9, 10, 14, 16, y 18 de la hebra antisentido se modifican con un 2'-fluoro.
b. Fosfatos en el extremo terminal 5'
Los grupos fosfato del extremo terminal 5' de los oligonucleótidos mejoran la interacción con Argonauta 2. Sin embargo, los oligonucleótidos que comprenden un grupo fosfato 5' pueden ser susceptibles a la degradación por medio de fosfatasas u otras enzimas, que pueden limitar su biodisponibilidad in vivo. Estos oligonucleótidos pueden incluir análogos de fosfatos en 5' que son resistentes a dicha degradación
Un oligonucleótido puede tener un análogo de fosfato en una posición de carbono 4' del azúcar (denominado "análogo 4'-fosfato"). Ver, por ejemplo, la solicitud internacional núm. PCT/US2017/049909, titulada 4-Phosphate Analogs and Oligonucleotides Comprising the Same, presentada el 1 de septiembre de 2017.
Como se indicó anteriormente, un oligonucleótido de la invención tiene un análogo 4'-fosfato en un nucleótido 5'-terminal, más particularmente la posición 1 de la hebra antisentido. Este análogo de fosfato unido al oligonucleótido es un metoxifosfonato (MOP), un MOP protegido con monometilo en 5'. Por lo tanto, se usa el siguiente nucleótido de uridina que comprende un análogo de fosfato, en la primera posición de la hebra guía (antisentido):
Figure imgf000008_0001
cuyo nucleótido modificado se denomina [MeFosfonato-4O-mU] o 5'-Metoxi, Fosfonato-4'oxi- 2'-O-metiluridina. Esto es junto con el uso de un enlace internucleotídico modificado entre la posición 1 y 2 de la hebra antisentido como se destaca más adelante.
c. Enlaces internucleotídicos modificados
El oligonucleótido de la invención tiene un enlace fosforotioato entre cada una de: las posiciones 1 y 2 de la hebra sentido, las posiciones 1 y 2 de la hebra antisentido, las posiciones 2 y 3 de la hebra antisentido, las posiciones 3 y 4 de la hebra antisentido, las posiciones 20 y 21 de la hebra antisentido, y las posiciones 21 y 22 de la hebra antisentido. Por lo tanto, el oligonucleótido comprende la siguiente estructura en la posición 1 de la hebra antisentido:
Figure imgf000009_0001
iii. Ligandos de direccionamiento
El oligonucleótido de la invención reivindicada se modifica para facilitar el suministro del oligonucleótido a los hepatocitos del hígado.
Por lo tanto, el oligonucleótido comprende nucleótidos que se conjugan con ligandos de direccionamiento cada uno de los cuales es un resto de GalNAc. GalNAc es un ligando de alta afinidad por el receptor de asialoglicoproteína (ASGPR), que se expresa principalmente en la superficie sinusoidal de los hepatocitos y tiene un papel importante en la unión, internalización y eliminación subsecuente de glicoproteínas circulantes que contienen residuos terminales de galactosa o N-acetilgalactosamina (asialoglicoproteínas).
Por lo tanto, como se indicó anteriormente, un oligonucleótido de la invención reivindicada tiene una GalNac monovalente unida a un nucleótido de guanidina, denominado [ademG-GalNAc] o 2-aminodietoximetanol-Guanidina-GalNAc, como se representa a continuación:
Figure imgf000009_0002
El oligonucleótido en la invención reivindicada también tiene una GalNAc monovalente unida a un nucleótido de adenina, denominado [ademA-GalNAc] o 2'-aminodietoximetanol-Adenina-GalNAc, como se representa a continuación.
Figure imgf000009_0003
Más particularmente, cada uno de los 4 nucleótidos del bucle (L) del tallo-bucle se conjugan cada uno con un resto de GalNAc monovalente separado. A continuación se muestra dicha conjugación para un bucle que comprende de 5' a 3' la secuencia de nucleótidos GAAA (L = enlazador, X = heteroátomo), se muestran los puntos de unión del tallo. Un bucle de este tipo puede estar presente, por ejemplo, en las posiciones 27-30 de la molécula mostrada en la Figura
1A. En la fórmula química, ^ y es un punto de unión a la hebra del oligonucleótido.
Figure imgf000010_0001
Los métodos o la química apropiados (por ejemplo, química clic) pueden usarse para unir un ligando de direccionamiento a un nucleótido. Los enlazadores basados en acetal se describen, por ejemplo, en la publicación de solicitud de patente internacional número WO2016100401 A1, que se publicó el 23 de junio de 2016 y este tipo de enlazador se emplea en el oligonucleótido de la invención reivindicada.
A continuación se muestra un ejemplo de un bucle que comprende de 5' a 3' los nucleótidos GAAA, en el que los restos de GalNAc se unen a los nucleótidos del bucle mediante el uso de un enlazador de acetal. Un bucle de este tipo puede estar presente, por ejemplo, en las posiciones 27-30 de la molécula mostrada en la Figura 1A y es una
característica del oligonucleótido de la invención reivindicada. En la fórmula química, V es un punto de unión a la hebra del oligonucleótido.
Figure imgf000011_0001
III. Formulaciones
En la presente descripción se proporcionan formulaciones para facilitar el uso de oligonucleótidos. Por ejemplo, en la presente descripción se proporcionan composiciones que comprenden un oligonucleótido de la invención para su uso en la reducción de la expresión de LDHA. Dichas composiciones pueden formularse adecuadamente de manera que cuando se administren a un sujeto, ya sea en el entorno inmediato de una célula diana o sistémicamente, una porción suficiente de los oligonucleótidos ingresa a la célula para reducir la expresión de LDHA. En algunas modalidades, las formulaciones descritas en la presente descripción comprenden un excipiente.
En algunas modalidades, una composición farmacéutica se formula para que sea compatible con su vía de administración prevista. Los ejemplos de vías de administración incluyen, pero no se limitan a, administración subcutánea, intradérmica, transmucosa, intravenosa y rectal.
Los métodos de uso de las composiciones de la invención se analizan en más detalle a continuación, pero se apreciará que no forman parte de la invención reivindicada como tal.
IV. Métodos de uso
i. Reducción de la expresión de LDHA en las células
En la presente descripción se describen métodos para suministrar a una célula una cantidad efectiva de un oligonucleótido con el propósito de reducir la expresión de LDHA en la célula. Los métodos proporcionados en la presente descripción son útiles en cualquier tipo celular apropiado que exprese LDHA. Una célula a la que se suministra el oligonucleótido puede estar ex vivo o in vitro (es decir, puede suministrarse a una célula en cultivo o a un organismo en el que reside la célula). Se describen métodos para suministrar a una célula una cantidad efectiva de un oligonucleótido con el propósito de reducir la expresión de LDHA en hepatocitos.
Las consecuencias de la inhibición pueden confirmarse mediante un ensayo apropiado para evaluar una o más propiedades de una célula o sujeto, o mediante técnicas bioquímicas que evalúan moléculas indicativas de la expresión de LDHA (por ejemplo, ARN, proteína, actividad enzimática, niveles de metabolitos, niveles de oxalato, etc.). La medida en que un oligonucleótido proporcionado en la presente descripción reduce los niveles de expresión de LDHA se evalúa mediante la comparación de los niveles de expresión (por ejemplo, los niveles de ARNm o proteína de LDHA con un control apropiado (por ejemplo, un nivel de expresión de LDHA en una célula o población de células a las que no se ha suministrado un oligonucleótido o a las que se ha suministrado un control negativo). Un nivel de control apropiado de la expresión de LDHA puede ser un nivel o valor predeterminado, de manera que no es necesario medir un nivel de control cada vez. El nivel o valor predeterminado puede tomar una variedad de formas. Un nivel o valor predeterminado puede ser un valor de corte único, tal como una mediana o una media.
La administración de un oligonucleótido como se describe en la presente descripción da como resultado una reducción en el nivel de expresión de LDHA en una célula. En algunas modalidades, la reducción en los niveles de expresión de LDHA puede ser una reducción al 1 % o menor, 5 % o menor, 10 % o menor, 15 % o menor, 20 % o menor, 25 % o menor, 30 % o menor, 35 % o menor, 40 % o menor, 45 % o menor, 50 % o menor, 55 % o menor, 60 % o menor, 70 % o menor, 80 % o menor, o 90 % o menor en comparación con un nivel de control apropiado de LDHA. El nivel de control apropiado puede ser un nivel de expresión de LDHA en una célula o población de células que no se ha puesto en contacto con un oligonucleótido como se describe en la presente descripción. En algunas modalidades, el efecto del suministro de un oligonucleótido a una célula de acuerdo con un método descrito en la presente descripción se evalúa después de un período de tiempo finito. Por ejemplo, los niveles de LDHA pueden analizarse en una célula al menos 8 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas; o al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, catorce, veintiún, veintiocho, treinta y cinco o más días después de la introducción del oligonucleótido en la célula.
ii. Métodos de tratamiento
El oligonucleótido de ARNi de la invención reivindicada es útil para reducir la producción de oxalato hepático en un sujeto, por ejemplo, un paciente que tiene una hiperoxaluria primaria. Un oligonucleótido de ARNi de este tipo es útil para reducir los niveles de oxalato en orina. Un oligonucleótido de ARNi de este tipo es útil para tratar la hiperoxaluria primaria, que incluye PH1, PH2 y/o PH3, así como también la hiperoxaluria idiopática. Dicho tratamiento podría usarse, por ejemplo, para atenuar o detener la acumulación de oxalato. La presente descripción proporciona métodos tanto profilácticos como terapéuticos para tratar a un sujeto en riesgo de (o susceptible a) una enfermedad o trastorno asociado con la acumulación de oxalato.
El sujeto a tratar puede ser cualquier sujeto que se beneficie terapéuticamente de una reducción en la acumulación de oxalato, por ejemplo, en el hígado. Por lo tanto, el sujeto a tratar puede ser un sujeto que tiene o se sospecha que tiene una afección que da como resultado la acumulación de oxalato, enfermedad renal, o una hiperoxaluria primaria, que incluye PH1, p H2 y/o PH3, así como también hiperoxaluria idiopática.
Típicamente, un oligonucleótido como se describe en la presente descripción puede administrarse por vía intravenosa o subcutánea.
Como un conjunto no limitante de ejemplos, el oligonucleótido de la presente descripción se administraría típicamente trimestralmente (una vez cada tres meses), bimensualmente (una vez cada dos meses), mensual o semanalmente. Por ejemplo, el oligonucleótido puede administrarse cada una, dos o tres semanas. El oligonucleótido puede administrarse mensualmente en algunos casos.
El sujeto a tratar puede ser un ser humano. El sujeto a tratar puede ser un primate no humano u otro sujeto mamífero (por ejemplo, un ratón o una rata). El sujeto a tratar puede ser un primate no humano u otro sujeto de mamífero modificado genéticamente para expresar un transcrito de LDHA humano (por ejemplo, a partir de un vector de expresión suministrado por AAV).
Ejemplos
Ejemplo 1: Oligonucleótido de ARNi específico útil en la atenuación específica de LDHA
Se evaluó un oligonucleótido de ARNi que tiene una hebra antisentido de secuencia UCAGAUAAAAAGGACAACAUGG (SEQ ID NO: 1) y una hebra sentido de secuencia AUGUUGUCCUUUUUAUCUGAGCAGCCGAAAGGCUGC (SEQ ID NO: 2) en cuanto a su capacidad de atenuar la expresión del ARNm de LDHA. En el oligonucleótido de ARNi, las siguientes posiciones se modifican con un 2'-O-metilo (mostrado como 2'-OMe): las posiciones 1, 2, 4, 6, 7, 12, 14, 16, 18-26 y 31-36 de la hebra sentido y las posiciones 1, 6, 8, 11-13, 15, 17 y 19-22 de la hebra antisentido. Las siguientes posiciones se modifican con un 2'-fluoro (mostrado como 2'-F): las posiciones 3, 5, 8-11, 13, 15 y 17 de la hebra sentido y las posiciones 2-5, 7, 9, 10, 14, 16 y 18 de la hebra antisentido. El oligonucleótido de ARNi tiene un enlace fosforotioato entre cada una de: las posiciones 1 y 2 de la hebra sentido, las posiciones 1 y 2 de la hebra antisentido, las posiciones 2 y 3 de la hebra antisentido, las posiciones 3 y 4 de la hebra antisentido, las posiciones 20 y 21 de la hebra antisentido y las posiciones 21 y 22 de la hebra antisentido. La Figura 1B es una representación de la estructura química de las posiciones 27-30 de la cadena pasajera (sentido) mostrada en la Figura 1A y la Figura 1C es una representación de la estructura química de la uridina modificada mostrada en la posición 1 de la hebra guía (antisentido) en la misma molécula. La Figura 3 es una estructura química del oligonucleótido de ARNi. Un oligonucleótido de ARNi de esta estructura química se ha denominado LDHA-1. Los azúcares GalNAc se conjugan con los nucleótidos que comprenden las posiciones 27 a 30 en la cadena sentido.La respuesta a la dosis y la duración de la atenuación del ARNm de LDHA por parte de LDHA-1 en los hígados de ratones hembra sanos se evaluó in vivo mediante el uso de un modelo de ratón de AAV de LDHA humano. El ARNm de LDHA humano se expresó bajo el control del promotor de la globulina de unión a hormona tiroidea a través de la transducción del virus AAV9. Para establecer un modelo de ratón, se administraron dosis intravenosas (i.v.) a ratones CD-1 hembra de 4-6 semanas de edad con un título controlado del virus AAV9 para generar una expresión estable del ARNm de LDHA humano. La Figura 2A es un esquema que muestra el calendario de esta evaluación. La inyección de AAV (a una dosis de 7,5 x 1011 copias genómicas en 100 j l) se produjo en la semana -1, y las dosis únicas de LDHA-1 se inyectaron por vía subcutánea una semana después a 0,5 mg/kg (n = 20 ratones), 1 mg/kg (n = 30 ratones), 3 mg/kg (n = 30 ratones) o 6 mg/kg (n = 30 ratones) como se muestra. A las 1, 2, 4, 6, 8 y 10 semanas se recogió un sacabocados de biopsia de hígado de 4 mm y se congeló rápidamente en un bloque y en RNAlater (ThermoFisher Scientific) para los análisis de atenuación del ARNm.
La Figura 2B es un gráfico que demuestra un subconjunto de los resultados del estudio descrito en la Figura 2A. El porcentaje de ARNm de hLDHA restante se muestra en las semanas después de la dosis para las dosis de 1, 3 o 6 mg/kg. Estos resultados se normalizaron respecto a PBS a los mismos tiempos (n = 40 ratones). Los resultados muestran que la atenuación rápida y mantenida del ARNm de LDHA expresado de forma ectópica se logró después de una dosis SC única de 1, 3 o 6 mg/kg de LDHA-1 en ratones sanos que expresan LDHA humano.
Una dosis SC única de 6 mg/kg de LDHA-1 redujo la expresión del ARNm de LDHA humano en el hígado en un 90 % en comparación con el control de PBS una semana después de la dosis (p < 0,05). La reducción dependiente de la dosis del ARNm de LDHA humano se mantuvo durante cuatro semanas después de la dosis única. La expresión de LDHA se recuperó 6 semanas después de la dosis única.
Una dosis SC única de 3 mg/kg de LDHA-1 redujo la expresión del ARNm de LDHA humano en el hígado en un 63 % en comparación con el control de PBS una semana después de la dosis. El grado de atenuación del ARNm de LDHA humano permaneció constante durante cuatro semanas después de la dosis única con la recuperación de la expresión de LDHA inicial 6 semanas después de la dosis única.
Una dosis SC única de 1 mg/kg de LDHA-1 redujo la expresión del ARNm de LDHA humano en el hígado en un 50 % en comparación con el control de PBS una semana después de la dosis. El grado de atenuación del ARNm de LDHA humano se mantuvo con una atenuación del 45 % cuatro semanas después de la dosis. La expresión del ARNm de LDHA volvió al valor inicial 6 semanas después de la dosis única.
Materiales y métodos para el Ejemplo 1
Animales: Los ratones CD-1 hembras (fecha de nacimiento 8/9/2016, fecha de recepción 9/13/2016) se compraron a Charles River Laboratories (Kingston, NY, código de la cepa 022). Se permitió que los ratones se aclimataran durante al menos 3 días antes de iniciar la administración de la dosis. Los ratones se mantuvieron en condiciones específicas de cría sin patógenos, con acceso a comida de laboratorio y agua ad libitum.
Oligonucleótido de ARNi LDHA-1: un oligonucleótido de ARN dúplex de doble hebra sintetizado químicamente con funcionalidad GalNAc en solución salina tamponada con fosfato (PBS) estéril. Los oligonucleótidos se almacenaron a -20 °C. Antes del uso, los oligonucleótidos se descongelaron y se mezclaron bien (mezcla en vórtice suave) y después se equilibraron a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos.
Medición del ARNm de LDHA mediante RT-qPCR: Se homogenizaron aproximadamente 50 mg de muestra en 0,75 ml de reactivo de lisis QIAzol basado en fenol/guanidina (Qiagen, Valencia, CA) mediante el uso de un instrumento Tissuelyser II (Qiagen, Valencia, CA). El homogeneizado se extrajo con 1-bromo-3-cloropropano (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). El ARN se extrajo a partir de 0,2 ml de la fase acuosa mediante el uso de la tecnología MagMax (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN se cuantificó mediante el uso de espectrometría a 260 y 280 nm. Los ensayos de RT-qPCR de Integrated DNA Technologies (Coralville, IA) y los reactivos de ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) y BioRad Laboratories (Hercules, CA) se usaron para medir el nivel de ARNm de LDHA con normalización respecto a los niveles de plásmido AA V9. El grado de reducción del ARNm de LDHA en los grupos de tratamiento con LDHA-1 se calculó como el por ciento de expresión (normalizado respecto a los números de copias de plásmido AAV9 determinados por qPCR de ADN) con relación al nivel de expresión promedio del grupo de control de PBS en el mismo día, donde la expresión del ARNm de LDHA en el grupo de control de PBS se estableció como 100 %. Se generaron gráficos y los datos se analizaron mediante el uso de GraphPad Prism. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA) unidireccional mediante el uso de la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett para comparar los niveles de ARNm de LDHA (normalizado respecto a los números de copias de AAV9) en los grupos tratados con LDHA-1 con relación al grupo de control de PBS del mismo punto temporal.
Ejemplo 2: Estudio de toxicidad y toxicocinética de LDHA-1 dirigido a LDHA en macacos cangrejeros jóvenes y adultos jóvenes
Se diseñó un estudio de toxicidad y toxicocinética de dosis subcutáneas repetidas de 5 semanas para demostrar el efecto de los oligonucleótidos dirigidos a LDHA en macacos cangrejeros jóvenes y adultos jóvenes que recibieron dos administraciones subcutáneas de 30, 100 o 300 mg/kg de LDHA-1 descrito en el Ejemplo 1 (ver también la Figura 3). Los macacos cangrejeros machos y hembras, jóvenes y adultos jóvenes recibieron inyecciones subcutáneas (SC) de 0 (agua estéril para inyección, SWFI el Día 1, solución salina estéril el Día 29), 30, 100 o 300 mg/kg de LDHA-1 los Días 1 y 29. El tejido hepático se recogió en el sacrificio terminal (Día 31) y el sacrificio de recuperación (Día 57) para el análisis de los niveles de ARNm de LDHA mediante RT-qPCR, los niveles de proteína LDH mediante análisis occidental y la actividad de LDH mediante análisis enzimático.
El diseño del estudio se muestra en la Tabla 1. Los tejidos hepáticos se recogieron de macacos cangrejeros en el sacrificio terminal (Día 31) y el sacrificio de recuperación (Día 57) y se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido para el ensayo de transferencia Western y actividad de LDH, o se incubaron en RNAlater y se congelaron para el análisis de RT-qPCR.
Después de la administración de dos dosis de 30, 100 o 300 mg/kg de LDHA-1, la expresión de ARNm de LDHA de mono, las concentraciones de proteína LDH y la actividad de LDH se redujeron significativamente en el sacrificio terminal el Día 31 (p< 0,0001) en todos los niveles de dosis sin respuesta a la dosis evidente. Se observaron resultados similares en el sacrificio de recuperación el día 57 (p< 0,0001, p<0,001, p<0,01 como se indica, significación estadística calculada mediante el uso de una prueba de t para datos independientes); no se observó recuperación de la atenuación del ARNm de LDHA, la proteína LDH y la actividad de LDH (Figura 4). Los efectos de la dosis sobre los niveles de proteína LDH hepática medidos por transferencia Western se muestran en la Figura 5. Los niveles de proteína LDH se redujeron notablemente en todos los niveles de dosis tanto en el sacrificio terminal (Día 31) como en el sacrificio de recuperación (Día 57).
El resultado demostró que el día 31, LDHA-1 presentó una actividad potente en la reducción de la expresión de ARNm de LDHA de mono, las concentraciones de proteína LDH y la actividad de LDH en todos los niveles de dosis en comparación con los controles sin respuesta a la dosis evidente. La reducción persistió hasta el día 57 sin que fuera evidente la recuperación de la atenuación de la diana.
Tabla 1. Diseño del estudio del estudio de toxicidad toxicocinética
Figure imgf000014_0001
a. el volumen total de la dosis se calculará en base al peso corporal más reciente
b. Necropsia terminal el día 31
c. Necropsia de recuperación el día 57
Además, se llevó a cabo un estudio de toxicidad y toxicocinética de dosis subcutáneas repetidas de 39 semanas de oligonucleótidos dirigidos a LDHA en macacos cangrejeros jóvenes y adultos jóvenes que recibieron diez administraciones SC de 30, 100 o 300 mg/kg de LDHA-1 descritas en el Ejemplo 1 para evaluar la reducción de los niveles de ARNm de LDHA y para cuantificar la concentración de LDHA-1 incorporado en el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC). Los monos jóvenes recibieron inyecciones subcutáneas (SC) de 0 (solución salina), 30, 100 o 300 mg/kg de LDHA-1 y los monos adultos jóvenes recibieron inyecciones SC de 0 (solución salina) o 300 mg/kg de LDHA-1 en los días del estudio 1,29, 57, 85, 113, 141, 169, 197, 225 y 253. El tejido hepático se recogió en el sacrificio terminal (Día 255, 2 días después de la última dosis) y el sacrificio de recuperación (día 309, 8 semanas después de la última dosis) para el análisis de los niveles de ARNm de LDHA mediante RT-qPCR. Las muestras de hígado recogidas en el día 255 también se usaron para cuantificar la concentración de LDHA-1 incorporada en el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), medida por inmunoprecipitación de la proteína Argonauta 2 (Ago2) seguido de RT-PCR-q de tallo-bucle (SL).
La actividad farmacodinámica potente de LDHA-1 fue evidente al final del período de administración de las dosis (Día 255). La expresión del ARNm de LDHA de mono se redujo (reducción de 91,4 % a 86,1 %, P < 0,0001) en todos los niveles de dosis. La concentración de LDHA-1 cargada en el complejo RISC se relacionó con la dosis con concentraciones significativamente más altas a un nivel de dosis de 300 mg/kg (5,6 ng/g) en comparación con 30 mg/kg (2,1 ng/g) (P < 0,05). Los efectos farmacodinámicos de LDHA-1, como se indica por la reducción significativa (92,0 % a 86,2 %) de la expresión de ARNm de LDHA, persistieron durante al menos 8 semanas después de la dosis sin que se observara recuperación (Figura 6). La determinación de la reducción del ARNm de LDHA en el Día 309 se consideró suficiente para la evaluación de la recuperación farmacodinámica, por lo que no se evaluaron las concentraciones de LDHA-1 cargada en el complejo RISC en el Día 309.
La cuantificación de LDHA-1 incorporada en RISC en el Día 255 del estudio se informa en la Figura 7. Representación gráfica de la media ± SD para cada grupo de dosis. El Día 255, las concentraciones de LDHA-1 incorporada en RISC en el hígado aumentaron con el aumento de la dosis. Las concentraciones de LDHA-1 aumentaron significativamente (P < 0,05 a la dosis de 300 mg/kg en comparación con la dosis de 30 mg/kg. Las concentraciones de LDHA-1 incorporada en el complejo RISC fueron comparables entre los monos jóvenes y adultos jóvenes que recibieron dosis de 300 mg/kg.
La actividad farmacodinámica potente de LDHA-1 fue evidente al final del período de administración de las dosis (Día 255). La expresión del ARNm de LDHA de mono se redujo en todos los niveles de dosis en comparación con los controles. Por el contrario, la concentración de LDHA-1 incorporada en el complejo RISC se relacionó con la dosis, con concentraciones significativamente más altas a un nivel de dosis de 300 mg/kg en comparación con 30 mg/kg. Los efectos farmacodinámicos de LDHA-1, medidos mediante la reducción del ARNm de LDHa , persistieron hasta el Día 309 (8 semanas después de la dosis) sin recuperación evidente.
Materiales y métodos para el Ejemplo 2
Medición del ARNm de LDHA mediante RT-qPCR: Se homogenizaron aproximadamente 50 mg de cada muestra en 0,75 ml de reactivo de lisis QIAzol basado en fenol/guanidina (Qiagen, Valencia, CA) mediante el uso de un instrumento Tissuelyser II (Qiagen, Valencia, CA). El homogeneizado se extrajo con 1-bromo-3-cloropropano (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). El ARN se extrajo a partir de 0,2 ml de la fase acuosa mediante el uso de la tecnología MagMax (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN se cuantificó mediante el uso de espectrometría a 260 y 280 nm. Los ensayos de RT-qPCR y los reactivos de ThermoFisher Scientific (Waltham, mA) se usaron para medir el nivel de ARNm de LDHA con normalización respecto a los niveles de ARNm de peptidil-prolil cis-trans isomerasa B (PPIB). El grado de reducción del ARNm de LDHA en los grupos tratados con LDHA-1 se calculó como el por ciento de expresión (normalizado respecto a los niveles de ARNm de PPIB) con relación al nivel de expresión promedio del grupo de control en el mismo día, donde la expresión del ARNm de LDHA en el grupo de control se estableció como 100 %.
Transferencia Western de LDH: Los lisados tisulares se prepararon mediante el uso del instrumento TissueLyser II (Qiagen, Valencia, CA) con el reactivo de extracción de proteínas tisulares T-PER y el cóctel de inhibidores de proteasas (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA). La concentración de proteína total se midió mediante el ensayo BCA de proteínas (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) y las concentraciones de proteína iguales se resolvieron mediante SDS-PAGE NuPAGE con 4-12 % de Bis-Tris (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA). Las proteínas separadas por electroforesis se transfirieron a membranas de nitrocelulosa mediante el uso del sistema de transferencia en seco iBlot (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) y se bloquearon con el tampón de bloqueo de Odyssey (PBS) (Li-Cor Biosciences, Lincoln, NE). Después las membranas se incubaron con anticuerpo anti-LDHA de conejo (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) y con anticuerpo anti-gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa de ratón (Abeam, Cambridge, MA). Se usaron anticuerpos secundarios anticonejo IRDye 680 y anti-ratón IRDye 800 (Li­ Cor Biosciences, Lincoln, NE) para la detección y se midió la intensidad de la señal mediante el uso del sistema de imágenes por infrarrojos Odyssey (Li-Cor Biosciences, Lincoln, NE). La intensidad integrada (una medida de la magnitud de la señal y las áreas sobre las que se distribuye) se midió para cada banda. Los métodos de “fondo promedio o mediano” se usaron para corregir las señales de ruido. El grado de reducción de la proteína LDH en los grupos tratados con LDHA-1 se calculó como el por ciento de expresión (normalizado respecto a los niveles de proteína GAPDH) con relación al nivel de expresión promedio del grupo de control en el mismo día, donde la expresión de la proteína LDH en el grupo de control se estableció como 100 %.
Ensayo de actividad de LDH: Las concentraciones de proteínas normalizadas de los extractos de tejido preparados para la transferencia Western de LDH en la Sección 6.2.2 se evaluaron en cuanto a la actividad de LDH mediante el uso de un kit de ensayo de lactato deshidrogenasa (Abeam, Inc., Cambridge, MA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, los extractos de tejido se diluyeron a una concentración de 50 μg/ml en el reactivo de extracción de proteínas tisulares T-PER y después se diluyeron 5 veces en una placa de 96 pocillos por duplicado mediante la adición de 10 μl de muestra a 40 μl de tampón de ensayo de LDH. Se prepararon una serie de soluciones patrón de dinucleótido de nicotinamida y adenina (NADH) y un control positivo de lDh de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La placa se mezcló, se protegió de la luz y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. La absorbancia a 450 nanómetros se midió 0 y 30 minutos después de la adición de la mezcla de reacción mediante el uso de un lector de placas SpectraMax MS (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). El grado de reducción de la actividad de LDH en los grupos tratados con LDHA-1 se calculó como el por ciento de actividad con relación al nivel de actividad promedio del grupo de control en el mismo día, donde la actividad de LDH en el grupo de control se estableció como 100 %.
Medición del oligonucleótido asociado a Ago2 mediante el uso de Sl-RT-qPCR: Se realizó la inmunoprecipitación de la proteína Ago2 a partir de muestras de hígado de mono congeladas instantáneamente mediante el uso de proteína G en Dynabeads. Tras el aislamiento de la proteína Ago2 en las muestras, se usó un método de SL-RT-qPCR basado en investigación para cuantificar la concentración de LDHA-1 asociada con el complejo Ago2. Para controlar la variabilidad entre muestras en la inmunoprecipitación, se usó miR-16, un microARN endógeno que se carga en el complejo Ago2, como un normalizador. Los detalles del procedimiento se presentan en el Apéndice 10,2. Solo se analizaron las muestras del Día 255 para obtener información sobre la proporcionalidad de la dosis de LDHA-1 cargada en RISC a dosis altas donde la reducción del ARNm de LDHA se satura. La determinación de la reducción del ARNm de LDHA en el Día 309 se consideró suficiente para la evaluación de la recuperación farmacodinámica.
Análisis de datos: Se generaron gráficos y los datos se analizaron mediante el uso de GraphPad Prism. Se realizó ANOVA unidireccional mediante el uso de la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett para comparar los niveles de ARNm de LDHA (normalizados respecto a los niveles de ARNm de PPIB), los niveles de proteína LDH (normalizados respecto a los niveles de proteína GAPDH) y los niveles de actividad de LDH en los grupos tratados con LDHA-1 con el del grupo de control del mismo punto temporal. Se usó ANOVA unidireccional con comparaciones múltiples para comparar las concentraciones de LDHA-1 incorporada en RISC, con a = 0,05. Se realizó un análisis de los valores atípicos de ROUT de los datos de animales individuales para LDHA- normalizada con miR-16 y se identificó y excluyó de todos los análisis 1 valor atípico.
Ejemplo 3: Prueba de concepto en el estudio en seres humanos para el oligonucleótido de ARNi dirigido a LDHA en el tratamiento de la hiperoxaluria primaria
El objetivo de este estudio fue evaluar la seguridad, la tolerabilidad, la farmacocinética y la farmacodinámica en seres humanos de dosis únicas crecientes del oligonucleótido de ARNi LDHA-1 del Ejemplo 1. Los criterios de valoración secundarios incluyeron la evaluación del cambio en la excreción de oxalato urinario de 24 horas respecto al valor inicial, definido como la media de dos recogidas de 24 horas durante el cribado. El estudio se dividió en dos grupos: El grupo A se diseñó como un estudio de fase 1, con ocultamiento simple y controlado con placebo en 25 voluntarios sanos normales (NHV) inscritos en un único centro en el Reino Unido. El grupo B se diseñó como un estudio sin ocultamiento y multicéntrico del oligonucleótido de LDHA-1 descrito en el Ejemplo 1 en 16 pacientes con PH, que incluye tres cohortes de pacientes con PH1 en dosis de 1,5, 3 y 6 mg/kg, y una cuarta cohorte de solo PH2 con administración de dosis flexible. Los pacientes del grupo B se inscribían en cinco centros de la Unión Europea (UE) y en un centro de los Estados Unidos.
En la primera cohorte del grupo B (1,5 mg/kg), los resultados iniciales después de una sola administración del oligonucleótido de ARNi demostraron que tres de cuatro pacientes adultos hasta la fecha alcanzaron concentraciones casi normales (<60 mmol/24 h) de oxalato urinario entre los Días 43 y 57. El cuarto adulto, cuyo nivel inicial de oxalato urinario fue de 2,28 mmol/24 h, exhibió reducciones sustanciales, con una observación después del día 71 que mostró una reducción significativa para ese paciente (oxalato urinario (UOX) < 1,0 mmol/24 h). Los resultados se resumen en las Figuras 8A y 8B.
En la segunda cohorte del grupo B (3 mg/kg), dos de cuatro pacientes adultos hasta la fecha alcanzaron concentraciones normales de oxalato urinario (<0,46 mmol/24 h) entre los Días 29 y 43. Ambos de los otros pacientes también tuvieron reducciones sustanciales de oxalato. Un paciente de este grupo tenía niveles elevados de oxalato en plasma. Sin embargo, durante el tratamiento con LDHA-1, el oxalato en plasma se redujo a niveles normales. Los resultados se resumen en las Figuras 8A y 8B.
Un paciente adulto con PH2 en la cuarta cohorte del grupo B también experimentó una reducción sustancial en la excreción de oxalato urinario de 24 horas (más del 35 %) en al menos uno de los días de muestreo (día 57).
Además, solo se observaron tres reacciones en el lugar de la inyección de leves a moderadas. Todas fueron transitorias (<72 horas) y se resolvieron sin intervención.
En resumen, la administración de LDHA-1 llevó los niveles de oxalato urinario a un intervalo normal (definido como una excreción de 24 horas <0,46 mmol) o un intervalo casi normal (definido como una excreción de 24 horas <0,6 mmol) en la mayoría de los 8 pacientes evaluados con hiperoxaluria primaria de tipo 1 y tipo 2 (PH1 y PH2). Todos los pacientes evaluados experimentaron reducciones sustanciales y clínicamente significativas en el oxalato urinario (definidas como una reducción >30 % en comparación con el valor inicial). Los pacientes evaluados son aquellos pacientes para los que se dispone de datos hasta la Semana 6 o el Día 43. Todos los pacientes evaluados son adultos e incluyen siete pacientes con PH1 y un paciente con PH2.
Estos datos anteriores constituyen una prueba de concepto clínica para el oligonucleótido de ARNi LDHA-1 del Ejemplo 1 en seres humanos y también demuestran que LDHA-1 fue seguro y bien tolerado. Los resultados demuestran potencia y duración de la acción después de la administración de una dosis única, y son consistentes y respaldan la administración trimestral a los sujetos.
La magnitud de la reducción del oxalato urinario, junto con la duración de la acción, validan el direccionamiento terapéutico a la lactasa deshidrogenasa, que está involucrada en la etapa final de la producción de oxalato hepático. En base a este mecanismo de acción, LDHA-1 puede usarse en el tratamiento de todos los tipos de hiperoxaluria primaria. Las reducciones sustanciales en oxalato urinario confirman que la plataforma puede reducir de manera efectiva la expresión del gen diana en seres humanos y el uso de tales ARNi terapéuticos para tratar múltiples formas de hiperoxaluria primaria.
Materiales y métodos para el Ejemplo 3
Estructura molecular de LDHA-1 (ver también el Ejemplo 1, la Figura 1A y la Figura 3)
Hebra sentido:
5' mA-S-mU-fG-mU-fU-mG-mU-fC-fC-fU-fU-mU-fU-mU-fA-mU-fC-mU-mG-mA-mG-mC-mA-mG-mC-mC-[ademG-GalNAc]-[ademA-GalNAc]-[ademA-GalNAc]-[ademA-GalNAc]-mG-mG-mC-mU-mG-mC 3'
Hibridada a:
Hebra antisentido:5' [MeFosfonato-4O-iriU]-S-fC-S-fA-S-fG-fA-iTiU-fA-iTiA-fA-fA-iTiA-iTiG-iTiG-fA-iTiC-fA-iTiA-fC-iTiA-itiU-S-itiG-S-itiG 3'
Leyenda:
mX: 2'-O-metil ribonucleósido
fX 2'-fluoro-desoxirribonucleósido
[ademA-GalNAc]: adenosina modificada con 2'-O-GalNAc
[ademG-GalNAc]: guanosina modificada con 2'-O-GalNAc
[MePhosphonate-4O-mU]: 4'-O-monometilfosfonato-2'-O-metil uridina
Enlaces: “-“indica fosfodiéster
"-S-“ indica fosforotioato
Desarrollo farmacéutico
El producto farmacéutico era un producto farmacéutico líquido estéril que consistía en LDHA-1 como solución en WFI (agua para inyección) para administración SC. La formulación usada (concentración de 170 mg/ml de LDHA-1 en WFI a pH 6,2-8,2) se seleccionó en base al pH, la osmolalidad (200-300 mOsm/kg), la viscosidad y la compatibilidad con la vía de administración.
Diagnóstico y criterios de inclusión/exclusión
Criterios de inclusión del Grupo A:
1. El sujeto debe haber entendido la naturaleza y el propósito completos del estudio, incluidos los posibles riesgos y efectos secundarios, y estar dispuesto y ser capaz de cumplir con todos los procedimientos y restricciones del estudio.
2. Sujetos masculinos y femeninos de entre 18 y 55 años de edad, incluidos.
3. El sujeto debe haber tenido un índice de masa corporal (IMC) de 19,0 a 32 kg/m2, incluidos.
4. No fumadores, libres de tabaco durante al menos 1 mes y dispuestos a permanecer libres de tabaco a través de EOS. Los sujetos también deben haber estado libres de productos que contengan nicotina (por ejemplo, parches de nicotina).
5. Los sujetos deben haber estado sanos por lo demás. El estado saludable se definió en función de la opinión del PI por la ausencia de indicios de cualquier enfermedad clínicamente significativa, activa o crónica después de una anamnesis médica y quirúrgica detallada, una exploración física completa que incluye constantes vitales, ECG de 12 derivaciones, hematología, bioquímica sanguínea, serología y análisis de orina.
6. Los sujetos deben someterse a pruebas de hematología y bioquímica clínica y análisis de orina dentro del intervalo normal, a menos que el investigador o la persona designada cualificada hayan clasificado las anomalías como clínicamente no significativas (NCS). Las pruebas del perfil hepático (ALT y AST) deben haber sido normales. Podrían haberse realizado pruebas repetidas una vez para los resultados del panel hepático.
7. Las mujeres y los hombres, así como la(s) pareja(s) de sexo femenino de los sujetos masculinos en edad fértil deben haber estado dispuestos a usar un(os) método(s) anticonceptivo(s) altamente efectivo(s) y aprobado(s) desde la fecha del consentimiento informado hasta 12 semanas después de la última dosis del IMP. Un método anticonceptivo altamente efectivo se definió como el que cumple al menos uno de los siguientes:
a. Abstinencia estricta: Cuando esto estaba en consonancia con el estilo de vida preferido y habitual del paciente. [La abstinencia periódica (por ejemplo, métodos de calendario, ovulación, síntomas térmicos, posovulación) y la retirada no fueron métodos anticonceptivos aceptables.]
b. Estéril quirúrgicamente (se ha sometido a uno de los siguientes procedimientos quirúrgicos: histerectomía, ligadura de trompas bilateral, ovariectomía bilateral o salpingectomía bilateral) y al menos 6 semanas después de la esterilización.
c. Anticonceptivo oral hormonal combinado (estrógeno y progesterona), anticonceptivo implantado o inyectable en una dosis estable durante al menos 1 mes antes de la visita de cribado más un método de barrera. Los anticonceptivos hormonales combinados se consideraron un método anticonceptivo altamente efectivo solo si se asociaban con la inhibición de la ovulación. Si se asocian con la inhibición de la ovulación, los anticonceptivos hormonales solo con progesterona también se consideran un método anticonceptivo altamente efectivo.
d. Dispositivos intrauterinos más condones. Dispositivo intrauterino (DIU) hormonal insertado al menos 1 mes antes de la visita de cribado.
e. Métodos de doble barrera [por ejemplo, condones y cápsula oclusiva (diafragma o cápsula cervical/bóveda) con espuma/gel/película/crema/supositorio espermicida]. Cabe destacar que un condón femenino y un condón masculino, o dos condones masculinos, no deben haberse usado juntos, ya que la fricción entre ambos puede dar como resultado el fallo de cualquiera de los productos.
f. Pareja con vasectomía (al menos 6 meses después del procedimiento) antes de la visita de cribado.
8. Mujeres posmenopáusicas: se define como 12 meses sin menstruación antes del cribado y una FSH en suero > 26 UI/l en la visita de cribado.
9. Para las mujeres: una prueba de embarazo negativa en el cribado y en la visita del Día 0.
Grupo B - Criterios de inclusión de pacientes con PH
Los pacientes con PH deben haber cumplido todos los criterios siguientes para ser idóneos para participar en este estudio.
1. El paciente y/o el padre, madre o tutor del paciente si el paciente fuera menor de edad (definido como paciente < 18 años de edad, o menor de la mayoría de edad, de acuerdo con las regulaciones locales),
a. Debe haber entendido la naturaleza y el propósito completos del estudio, incluidos los posibles riesgos y efectos secundarios.
b. Debe haber estado dispuesto y ser capaz de cumplir con todos los procedimientos del estudio, incluida la recogida de muestras de orina de 24 horas.
c. Debe haber proporcionado su consentimiento informado. Los adolescentes (12 a < 18 años de edad, o mayores de 12 años pero menores de la mayoría de edad, de acuerdo con las regulaciones locales) deben haber podido proporcionar un consentimiento escrito para participar. Para los niños menores de 12 años, el consentimiento se habría basado en las regulaciones locales.
2. Hombre o mujer, de al menos 6 años de edad en el momento de obtener el consentimiento informado.
3. El paciente debe haber tenido un peso corporal mínimo de 25 kg.
4. Diagnóstico documentado de PH1 o PH2, confirmado mediante genotipado (la información de genotipos disponible históricamente es aceptable para la idoneidad para el estudio).
5. Excreción de oxalato en orina de 24 horas >0,7 mmol para pacientes mayores de 18 años, o >0,7 mmol por 1,73 m2 de área de superficie corporal (BSA) para pacientes menores de 18 años de edad, en al menos una de las dos evaluaciones realizadas en el período de cribado, con menos del 30 % de variación entre ambas mediciones de oxalato.
6. eGFR >30 ml/min normalizada respecto a 1,73 m2 de BSA calculada mediante el uso de la fórmula de modificación de la dieta en la enfermedad renal (MDRD) en adultos (edad >18 años), o la fórmula de Schwartz en pacientes de 6 a <18 años de edad
7. Los hombres, las pacientes femeninas en edad fértil y las parejas de los pacientes masculinos en edad fértil deben haber estado dispuestos a usar un(os) método(s) anticonceptivos altamente efectivos y aprobados desde la fecha del consentimiento informado hasta 12 semanas después de la última dosis de IMP. Un método anticonceptivo altamente efectivo se habrá definido como el que cumple al menos uno de los siguientes:
a. Abstinencia estricta: Cuando esto estaba en consonancia con el estilo de vida preferido y habitual del paciente. [La abstinencia periódica (por ejemplo, métodos de calendario, ovulación, síntomas térmicos, posovulación) y la retirada no habrían sido métodos anticonceptivos aceptables.]
b. Estéril quirúrgicamente (se ha sometido a uno de los siguientes procedimientos quirúrgicos: histerectomía, ligadura de trompas bilateral, ovariectomía bilateral o salpingectomía bilateral) y al menos 6 semanas después de la esterilización.
c. Anticonceptivo oral hormonal combinado (estrógeno y progesterona), anticonceptivo implantado o inyectable en una dosis estable durante al menos 1 mes antes de la visita de cribado más un método de barrera. Los anticonceptivos hormonales combinados se habrían considerado un método anticonceptivo altamente efectivo solo si se asociaban con la inhibición de la ovulación. Si se asociaban con la inhibición de la ovulación, los anticonceptivos hormonales solo con progesterona también se habrían considerado un método anticonceptivo altamente efectivo.
d. Dispositivos intrauterinos más condones. DIU hormonal insertado al menos 1 mes antes de la visita de cribado. e. Métodos de doble barrera [por ejemplo, condones y cápsula oclusiva (diafragma o cápsula cervical/bóveda) con espuma/gel/película/crema/supositorio espermicida]. Cabe destacar que un condón femenino y un condón masculino, o dos condones masculinos, no deben haberse usado juntos, ya que la fricción entre ambos puede dar como resultado el fallo de cualquiera de los productos.
f. Pareja con vasectomía (al menos 6 meses después del procedimiento) antes de la visita de cribado.
8. Mujeres posmenopáusicas: se define como 12 meses sin menstruación antes del cribado y una FSH en suero >26 UI/l en el cribado.
9. Para WOCP: una prueba de embarazo negativa en el cribado y el Día 0
10. Los pacientes con PH1 que reciben piridoxina a dosis estables al menos 4 semanas antes de la entrada en el estudio deben haber estado dispuestos a permanecer con la misma dosis estable durante el estudio. En el improbable caso de que un paciente con PH2 estuviese recibiendo piridoxina, debería haberse interrumpido al menos 4 semanas antes de la entrada en el estudio
Grupo A - Criterios de exclusión de NHV
Se habrían excluido de este estudio a los voluntarios sanos normales que cumplían cualquiera de los siguientes criterios:
1. Presencia de cualquier afección médica o comorbilidades que interfieran con el cumplimiento del estudio o la interpretación de los datos, o que potencialmente afecten a la seguridad del sujeto, incluidos, entre otros:
a. enfermedad intercurrente grave
b. vacunación rutinaria en los 30 días previos a la administración de la dosis y hasta la visita de EOS
c. causas conocidas de enfermedad hepática activa/lesión o elevación de las transaminasas (por ejemplo, enfermedad hepática alcohólica, enfermedad hepática grasa no alcohólica/esteatohepatitis (NAFLD/NASH))
d. inquietudes del médico sobre el consumo excesivo de alcohol
e. uso habitual o crónico de más de 3 gramos de paracetamol al día.
2. Antecedentes de cálculos renales.
3. Mujeres que estaban embarazadas, en período de lactancia o que planeaban quedarse embarazadas durante este estudio o dentro de los 90 días después de la última administración de dosis de IMP.
4. Hombres con parejas femeninas que estuvieran planeando quedarse embarazadas durante este estudio o dentro de los 90 días después de la última administración de dosis de IMP.
5. Uso de cualquier agente en investigación dentro de los 90 días antes de la primera dosis del medicamento del estudio. Si un sujeto ha participado en estudios previos con ARNip o anticuerpos, se habría requerido un período de reposo farmacológico de al menos 6 meses antes de la primera dosis administrada en este estudio.
6. Actividad intensa, tomar el sol y practicar deportes de contacto dentro de las 48 horas (2 días) previas a la administración de la dosis y hasta la visita de EOS o el día 29.
7. Antecedentes de donación de más de 450 ml de sangre dentro de los 90 días previos a la administración de la dosis en el centro de investigación clínica o donación prevista menos de 30 días después de recibir IMP.
8. Donación de plasma o plaquetas dentro de los 7 días previos a la administración de la dosis y a lo largo de todo el estudio.
9. Antecedentes de consumo de alcohol superior a 21 unidades en hombres, 14 unidades en mujeres, a la semana según lo determinado por el investigador. Se habría prohibido el consumo de alcohol 48 horas antes del ingreso en el centro clínico y hasta el final del estudio.
10. Prueba de cribado positiva para el antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg), anticuerpos contra el virus de la hepatitis C (VHC) o anticuerpos contra el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) 1 y 2. Si el sujeto se ha sometido a pruebas en los últimos 3 meses, es posible que se hayan usado datos históricos.
11. Antecedentes de una o más de las siguientes reacciones a una terapia basada en oligonudeótidos a. Trombocitopenia grave
b. Hepatotoxicidad
c. Síntomas gripales graves que provocan la interrupción de la terapia
d. Reacción cutánea localizada por la inyección (Grado 3 o superior) que provoca la interrupción de la terapia. e. Coagulopatía/prolongación clínicamente importante del tiempo de coagulación
Otras restricciones:
Todos los medicamentos no tópicos y no regulares (incluidos los medicamentos de venta sin receta, los suplementos para la salud y la administración crónica de remedios a base de plantas medicinales tales como el extracto de hierba de San Juan) deben haberse detenido al menos 14 días antes del ingreso en el centro de investigación clínica hasta y que incluye la visita de EOS. Se habría hecho una excepción para paracetamol (acetaminofén), que se habría permitido hasta el ingreso en el centro de investigación clínica. Sin embargo, los AINE tales como el ibuprofeno, la aspirina, el naproxeno, etc. deben haberse interrumpido al menos 14 días antes del ingreso en el centro de investigación clínica. Los sujetos no deben haber realizado ejercicio intenso durante la participación en el estudio (es decir, entre las visitas de cribado y de EOS). A lo largo del estudio, los sujetos habrían tenido que evitar los alimentos ricos en oxalato y comer cantidades moderadas de proteínas y calcio, sin superar las directrices dietéticas nacionales. Deben haberse evitado los batidos de proteínas.
Grupo B - Criterios de exclusión de pacientes con PH
Los pacientes con PH que cumplían cualquiera de los siguientes criterios habrían sido excluidos de este estudio: 1. Trasplante renal y/o hepático previo.
2. Actualmente está recibiendo diálisis.
3. Indicios documentados de manifestaciones clínicas de oxalosis sistémica.
4. Participación en cualquier estudio clínico en el que hayan recibido un producto médico en investigación dentro de los 4 meses anteriores a la inscripción. En el caso de los IMP con potencial para reducir Uox y/u oxalato en plasma, estas concentraciones deben haber vuelto a los niveles iniciales históricos.
a. Si el paciente participó en una cohorte anterior en este estudio, debe haber transcurrido un mínimo de 8 semanas antes de la reinscripción y la excreción de oxalato urinario debe haber vuelto a >80 % del valor inicial.
5. Presencia de cualquier afección médica o comorbilidades que interfieran con el cumplimiento del estudio o la interpretación de los datos, o que potencialmente afecten a la seguridad del paciente, incluidos, entre otros:
a. enfermedad intercurrente grave
b. vacunación rutinaria en los 30 días previos a la administración de la dosis y hasta la visita de EOS
c. causas conocidas de enfermedad hepática activa/lesión o elevación de las transaminasas (por ejemplo, enfermedad hepática alcohólica, enfermedad hepática grasa no alcohólica/esteatohepatitis (NAFLD/NASH)
d. inquietudes del médico sobre el consumo excesivo de alcohol
e. uso habitual o crónico de más de 3 gramos de paracetamol al día.
6. Antecedentes de consumo de alcohol superior a 21 unidades en hombres, 14 unidades en mujeres, a la semana según lo determinado por el investigador.
7. Mujeres embarazadas, en período de lactancia o que tengan previsto quedarse embarazadas durante este estudio o dentro de los 90 días después de la última administración de dosis de iMp .
8. Anomalías en la prueba de función hepática (PFH): ALT y/o AST >1,5 veces el LSN para la edad y el sexo.
9. Antecedentes de una o más de las siguientes reacciones a una terapia basada en oligonucleótidos
a. Trombocitopenia grave
b. Hepatotoxicidad
c. Síntomas gripales graves que provocan la interrupción de la terapia
d. Reacción cutánea localizada por la inyección (Grado 3 o superior) que provoca la interrupción de la terapia. e. Coagulopatía/prolongación clínicamente importante del tiempo de coagulación
Otras restricciones:
Los pacientes también deben haber evitado tomar suplementos de vitamina C durante 24 h antes y durante las recogidas de muestras de orina de 24 horas y durante 24 horas antes de las recogidas de sangre para PD. Los pacientes no deben haber realizado ejercicio intenso durante la participación en el estudio (es decir, entre las visitas de cribado y EOS). A lo largo del estudio, los pacientes deben haber tenido que evitar los alimentos ricos en oxalato y comer cantidades moderadas de proteínas y calcio, sin superar las directrices dietéticas nacionales. Deben haberse evitado los batidos de proteínas.
Medición de los niveles de oxalato urinario (UOX)
Se obtuvo una muestra de orina de 24 horas del paciente y se acidificó una alícuota para mejorar la solubilidad del oxalato. Generalmente, el oxalato es insoluble y forma cristales que pueden solubilizarse en condiciones ácidas. El UOX solubilizado se sometió a análisis de HPLC para determinar su nivel.

Claims (6)

REIVINDICACIONES
1. Un oligonucleótido para reducir la expresión de lactato deshidrogenasa A (LDHA), el oligonucleótido comprende una hebra antisentido que tiene una secuencia expuesta como UCAGAUAAAAAGGACAACAUGG (SEQ ID NO: 1) y una hebra sentido que tiene una secuencia expuesta como AUGUUGUCCUUUUUAUCUGAGCAGCCGAAAGGCUGC (SEQ ID NO: 2),
en donde todas las posiciones 1, 2, 4, 6, 7, 12, 14, 16, 18-26 y 31-36 de la hebra sentido y las posiciones 1, 6, 8, 11­ 13, 15, 17, y 19-22 de la hebra antisentido se modifican con un 2-O-metilo, y todas las posiciones 3, 5, 8-11, 13, 15 y 17 de la hebra sentido y las posiciones 2-5, 7, 9, 10, 14, 16 y 18 de la hebra antisentido se modifican con un 2-fluoro; en donde el oligonucleótido tiene un enlace fosforotioato entre cada una de: las posiciones 1 y 2 de la hebra sentido, las posiciones 1 y 2 de la hebra antisentido, las posiciones 2 y 3 de la hebra antisentido, las posiciones 3 y 4 de la hebra antisentido, las posiciones 20 y 21 de la hebra antisentido, y las posiciones 21 y 22 de la hebra antisentido; en donde el oligonucleótido comprende la siguiente estructura en la posición 1 de la hebra antisentido:
Figure imgf000023_0001
en donde cada uno de los nucleótidos de la secuencia -G AAA- en la hebra sentido se conjuga a un resto de GalNac monovalente para comprender la estructura:
Figure imgf000023_0002
2. Una composición farmacéutica que comprende el oligonucleótido de acuerdo con la reivindicación 1 para reducir la expresión de LDHA.
3. Una composición que comprende el oligonucleótido de acuerdo con la reivindicación 1 y que comprende además contraiones Na+.
4. Un oligonucleótido como se reivindicó en la reivindicación 1 o composición como se reivindicó en la reivindicación 2 o la reivindicación 3 para su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene o está en riesgo de tener una hiperoxaluria primaria seleccionada de PH1, PH2, PH3 y/o hiperoxaluria idiopática, el método comprende reducir la expresión de la proteína LDHA en hepatocitos en el sujeto mediante la administración del oligonucleótido o la composición.
5. Un oligonucleótido o composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 4 en donde dicho sujeto tiene o está en riesgo de tener una hiperoxaluria primaria.
6. Un oligonucleótido o composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 4 o la reivindicación 5 en donde el oligonucleótido o composición se administra al sujeto por vía intravenosa o subcutánea.
ES18867097T 2017-10-13 2018-10-12 Métodos y composiciones para inhibir la expresión de ldha Active ES2955045T3 (es)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762572403P 2017-10-13 2017-10-13
US201762572398P 2017-10-13 2017-10-13
US201862726950P 2018-09-04 2018-09-04
PCT/US2018/055735 WO2019075419A1 (en) 2017-10-13 2018-10-12 METHODS AND COMPOSITIONS FOR INHIBITING LDHA EXPRESSION

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2955045T3 true ES2955045T3 (es) 2023-11-28

Family

ID=66101691

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES18867097T Active ES2955045T3 (es) 2017-10-13 2018-10-12 Métodos y composiciones para inhibir la expresión de ldha

Country Status (15)

Country Link
US (4) US11286488B2 (es)
EP (2) EP3679141B1 (es)
JP (2) JP7308213B2 (es)
KR (2) KR102609396B1 (es)
CN (3) CN111448319B (es)
AU (1) AU2018346971B2 (es)
CA (1) CA3078933A1 (es)
ES (1) ES2955045T3 (es)
HR (1) HRP20231063T1 (es)
HU (1) HUE063026T2 (es)
IL (1) IL273875B2 (es)
MX (1) MX428940B (es)
PL (1) PL3679141T3 (es)
RS (1) RS64483B1 (es)
WO (1) WO2019075419A1 (es)

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10351854B2 (en) 2014-10-10 2019-07-16 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic inhibition of lactate dehydrogenase and agents therefor
EP3929293A3 (en) 2015-04-03 2022-03-16 University Of Massachusetts Fully stabilized asymmetric sirna
WO2017030973A1 (en) 2015-08-14 2017-02-23 University Of Massachusetts Bioactive conjugates for oligonucleotide delivery
HRP20231063T1 (hr) 2017-10-13 2023-12-22 Novo Nordisk Health Care Ag Postupci i pripravci namijenjeni inhibiranju eksprimiranja ldha
EP3684377B1 (en) * 2017-10-20 2022-12-07 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hepatitis b infection
EP3710588A4 (en) 2018-01-16 2021-08-18 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS TO INHIBIT ALDH2 EXPRESSION
BR112021002440A2 (pt) 2018-08-10 2021-05-04 University Of Massachusetts oligonucleotídeos modificados visando snps
WO2020041769A1 (en) 2018-08-23 2020-02-27 University Of Massachusetts O-methyl rich fully stabilized oligonucleotides
CN113614232A (zh) 2019-01-18 2021-11-05 马萨诸塞大学 动态药代动力学修饰锚
KR20220047989A (ko) 2019-08-09 2022-04-19 유니버시티 오브 매사추세츠 Snp를 표적화하는 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오타이드
US20210115442A1 (en) * 2019-08-23 2021-04-22 University Of Massachusetts O-methyl rich fully stabilized oligonucleotides
US12365894B2 (en) 2019-09-16 2025-07-22 University Of Massachusetts Branched lipid conjugates of siRNA for specific tissue delivery
US20220389430A1 (en) * 2019-10-02 2022-12-08 Dicema Pharmaceuticals, Inc. Chemical modifications of small interfering rna with minimal fluorine content
EP4121534A1 (en) 2020-03-18 2023-01-25 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating subjects having a heterozygous alanine-glyoxylate aminotransferase gene (agxt) variant
WO2021234543A1 (en) * 2020-05-18 2021-11-25 Chinook Therapeutics Canada, Inc. Substituted pyrazolyl compounds and methods of use thereof
CA3174079A1 (en) 2020-05-26 2021-12-02 Anastasia Khvorova Synthetic oligonucleotides having regions of block and cluster modifications
TW202233839A (zh) * 2020-11-13 2022-09-01 美商戴瑟納製藥股份有限公司 用於抑制ａｌｄｈ２表現之化學修飾
EP4276104A3 (en) 2021-03-19 2024-05-22 Bachem Holding AG Improved oligonucleotide synthesis suppressing depurination
US20250282813A1 (en) 2021-04-09 2025-09-11 Bachem Holding Ag Pseudo solid phase protecting group and methods for the synthesis of oligonucleotides and oligonucleotide conjugates
IL307154A (en) * 2021-04-19 2023-11-01 Novo Nordisk As Compositions and methods for inhibiting nuclear receptor subfamily 1 group h member 3 (nr1h3) expression
JP2024518564A (ja) * 2021-05-11 2024-05-01 ディセルナ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 中枢神経系のニューロンを標的とするための脂質コンジュゲーション
CN117836307A (zh) 2021-06-18 2024-04-05 弘景生物科技有限公司 功能化的n-乙酰基半乳糖胺核苷
JP2024528659A (ja) 2021-07-19 2024-07-30 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 非原発性高シュウ酸尿症疾患または障害を有するまたは発症するリスクがある対象を治療するための方法および組成物
KR20240046843A (ko) * 2021-08-25 2024-04-11 노보 노르디스크 에이/에스 알파-1 항트립신 발현을 억제하기 위한 조성물 및 방법
EP4396193A4 (en) 2021-08-30 2025-07-02 Hongene Biotech Corp FUNCTIONALIZED N-ACETYLGALACTOSAMINE ANALOGUES
WO2023060141A2 (en) * 2021-10-05 2023-04-13 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting melanocortin 2 receptor and cytochrome p450 11b1 expression
JP7877458B2 (ja) * 2021-12-01 2026-06-22 ディセルナ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド Ａｐｏｃ３発現を調節するための組成物及び方法
CN118401539A (zh) 2021-12-15 2024-07-26 兆维生物科技公司 官能化的n-乙酰半乳糖胺类似物
JP2025531341A (ja) * 2022-09-19 2025-09-19 カイロンノヴァ （シャーメン） バイオファーマ カンパニー，リミテッド 炭水化物－オリゴヌクレオチド複合体、薬物組成物および治療への応用
WO2024061842A1 (en) 2022-09-19 2024-03-28 Bachem Holding Ag Improved oligonucleotide synthesis
WO2024083746A1 (en) 2022-10-17 2024-04-25 Bachem Holding Ag Method and composition for oligonucleotide synthesis
US12116382B2 (en) 2022-11-28 2024-10-15 Hongene Biotech Corporation Functionalized N-acetylgalactosamine analogs
EP4695265A1 (en) 2023-10-16 2026-02-18 Bachem Holding AG Method and composition for oligonucleotide synthesis
WO2025196505A2 (en) 2024-03-22 2025-09-25 Takeda Pharmaceutical Company Limited Compositions and methods for inhibiting cytochrome p450 family 7 subfamily a member 1 (cyp7a1) expression
CN118460650B (zh) * 2024-07-10 2025-02-14 凯莱英医药集团（天津）股份有限公司 一种Nedosiran的制备方法

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10920226B2 (en) 2002-11-14 2021-02-16 Thermo Fisher Scientific Inc. siRNA targeting LDHA
WO2006006948A2 (en) 2002-11-14 2006-01-19 Dharmacon, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR SELECTING siRNA OF IMPROVED FUNCTIONALITY
US20050014692A1 (en) 2003-01-21 2005-01-20 Newgard Christopher B. Lactate dehydrogenase as a novel target and reagent for diabetes therapy
CA2559955C (en) 2004-03-15 2016-02-16 City Of Hope Methods and compositions for the specific inhibition of gene expression by double-stranded rna
US20070265220A1 (en) 2004-03-15 2007-11-15 City Of Hope Methods and compositions for the specific inhibition of gene expression by double-stranded RNA
CA2566286A1 (en) 2004-05-11 2005-12-08 Rnai Co., Ltd. Polynucleotide causing rna interfere and method of regulating gene expression with the use of the same
JP2011516065A (ja) * 2008-04-04 2011-05-26 カランド ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド Ｅｐａｓ１阻害剤の組成物および使用
US20120003156A1 (en) 2008-07-01 2012-01-05 The Johns Hopkins University Methods for treating neoplasia by inhibiting lactate dehydrogenase and/or nicotinamide phosphoribosyltransferase
US20110288147A1 (en) 2008-09-22 2011-11-24 Bob Dale Brown Compositions and methods for the specific inhibition of gene expression by DSRNA containing a tetraloop
WO2010033225A2 (en) 2008-09-22 2010-03-25 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the specific inhibition of gene expression by dsrna possessing modifications
US20100173973A1 (en) 2008-12-18 2010-07-08 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Extended dicer substrate agents and methods for the specific inhibition of gene expression
CN102985557B (zh) 2009-03-13 2018-06-15 安吉奥斯医药品有限公司 用于细胞增殖相关病症的方法和组合物
PH12012501596A1 (en) 2010-02-24 2017-02-03 Arrowhead Res Corporation Compositions for targeted delivery of sirna
JP6050226B2 (ja) 2010-05-28 2016-12-21 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｌｄｈ及びｐｄｈｋ発現を下方制御することによる乳酸レベルの低下及びポリペプチド生産の増加
JP2014518626A (ja) 2011-05-18 2014-08-07 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル 被験者が慢性腎疾患を有する、または発症するリスクがあるかどうかを決定するための方法
US9796974B2 (en) 2011-11-18 2017-10-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modified RNAi agents
TWI595885B (zh) 2012-05-02 2017-08-21 喜納製藥公司 包含四ｇａｌｎａｃ之新穎結合物及傳送寡核苷酸之方法
US10351854B2 (en) 2014-10-10 2019-07-16 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic inhibition of lactate dehydrogenase and agents therefor
EP3865576A1 (en) * 2014-12-15 2021-08-18 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Ligand-modified double-stranded nucleic acids
US20180051316A1 (en) * 2014-12-18 2018-02-22 The Regents Of The University Of California Detection of nucleic acid polymerase conformational changes using a nanotube
TWI761305B (zh) * 2015-05-29 2022-04-21 美商愛羅海德製藥公司 抑制Ｈｉｆ２α基因表現之組合物及方法
HRP20231063T1 (hr) * 2017-10-13 2023-12-22 Novo Nordisk Health Care Ag Postupci i pripravci namijenjeni inhibiranju eksprimiranja ldha

Also Published As

Publication number Publication date
KR102609396B1 (ko) 2023-12-01
EP4265261A2 (en) 2023-10-25
JP7674420B2 (ja) 2025-05-09
EP3679141B1 (en) 2023-06-07
IL273875A (en) 2020-05-31
KR102609396B9 (ko) 2025-04-10
CN118440940A (zh) 2024-08-06
AU2018346971A1 (en) 2020-04-23
CN118530989A (zh) 2024-08-23
JP7308213B2 (ja) 2023-07-13
HUE063026T2 (hu) 2023-12-28
EP3679141C0 (en) 2023-06-07
KR20200078530A (ko) 2020-07-01
IL273875B2 (en) 2025-07-01
MX2020003836A (es) 2020-11-06
CN111448319A (zh) 2020-07-24
US20240182901A1 (en) 2024-06-06
CA3078933A1 (en) 2019-04-18
US20250283091A1 (en) 2025-09-11
PL3679141T3 (pl) 2023-10-02
EP3679141A1 (en) 2020-07-15
JP2020536587A (ja) 2020-12-17
IL273875B1 (en) 2025-03-01
US11661604B2 (en) 2023-05-30
US20210062199A1 (en) 2021-03-04
US11286488B2 (en) 2022-03-29
CN111448319B (zh) 2024-05-17
RS64483B1 (sr) 2023-09-29
US20200283775A1 (en) 2020-09-10
AU2018346971B2 (en) 2025-01-09
KR20230169413A (ko) 2023-12-15
EP4265261A3 (en) 2024-01-24
EP3679141A4 (en) 2021-06-16
WO2019075419A1 (en) 2019-04-18
JP2023139014A (ja) 2023-10-03
MX428940B (es) 2025-11-13
HRP20231063T1 (hr) 2023-12-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7674420B2 (ja) Ｌｄｈａの発現を阻害するための方法及び組成物
ES2936863T3 (es) Métodos para tratar infección por hepatitis B
US20230107967A1 (en) Compositions and methods for inhibiting alpha-1 antitrypsin expression
US11634715B2 (en) Methods and compositions for treating bile duct paucity-associated conditions
US20220186229A1 (en) Methods and compositions for inhibiting expression of cyp27a1
HK40115827A (en) Methods and compositions for inhibiting expression of ldha
HK40026540A (en) Methods and compositions for inhibiting expression of ldha
HK40026540B (en) Methods and compositions for inhibiting expression of ldha