ES2955523T3 - Modelo in vivo para infección por gusanos parasitarios y procedimientos para evaluar compuestos antiparasitarios, que incluyen compuestos activos contra el gusano del corazón canino - Google Patents
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Abstract
Lo siguiente describe un nuevo modelo para la infección por gusanos parásitos, que es útil para detectar y evaluar la eficacia de agentes antiparasitarios. En particular, la divulgación proporciona un modelo de ratón inmunocomprometido que, por primera vez, respalda el desarrollo avanzado de parásitos Dirofilaria immitis (Di) fuera de sus huéspedes definitivos. Como se describe en este documento, las formas larvarias en etapa temprana de Di, el agente causante de la enfermedad del gusano del corazón canino, no solo persisten en este modelo, sino que se convierten en gusanos maduros. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Modelo in vivo para infección por gusanos parasitarios y procedimientos para evaluar compuestos antiparasitarios, que incluyen compuestos activos contra el gusano del corazón canino
CAMPO DE LA INVENCIÓN
[0001] La presente invención se refiere al modelado de infecciones por gusanos parasitarios utilizando roedores inmunodeficientes, con o sin células inmunes injertadas a partir de un huésped del gusano parasitario definitivo. Adicionalmente la presente invención se refiere al uso de tales sistemas de modelos en el cribado y la evaluación de la eficacia de agentes antiparasitarios.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
[0002] La filariasis es una enfermedad parasitaria causada por nematodos o ascárides filáricos similares a hilos. La filariasis se transmite a través de mordeduras de insectos y se puede introducir larvas filáricas infecciosas en animales, incluyendo perros y humanos, a través de mordeduras de insectos chupasangre que incluyen a mosquitos o moscas. En perros, dirofilariasis cardiopulmonar, (es decir, enfermedad del gusano del corazón (HW)) está causada por nematodos Dirofílaria immitis (D. immitis) y Dirofilaria repens (D. repens). En el caso de D. repens, adultos son subcutáneos, así que mientras no causan la enfermedad del gusano del corazón per se, sí que causan enfermedad/patología y se previenen con dosis de ivermectina (IVM) comparables con aquellas utilizadas para prevenir HW. La dirofilariasis es una helmintiasis transmitida por vectores de perros y gatos a nivel mundial. Se transmite por mordeduras de Culicidae (es decir, mosquito) y está causada por el desarrollo de D. immitis en las arterias pulmonares y el corazón. Clínicamente, provoca insuficiencia cardíaca irreversible que puede llevar a la muerte del animal. El tratamiento es difícil y la prevención es crítica para el control de la dirofilariasis. En los seres humanos, entre los nematodos filáricos clínicamente importantes se incluyen especies de Wuchereria bancrofti, Brugia malayi, Brugia timori, Onchocerca volvulus y Mansonella. Las infecciones causadas por W. bancrofti y B. malayi pueden desarrollarse en filariasis linfática, que se presenta a menudo como hidrocele y/o linfedema, y (en casos extremos), elefantiasis. Las infecciones causadas por O. volvulus pueden desarrollarse en oncocercosis, el deterioro visual que atribuye a la enfermedad su nombre común Ceguera del Río. Los nematodos son receptores forzosos de bacterias intracelulares del género Wolbachia. Estas endobacterias son imprescindibles para la embriogénesis, desarrollo de larvas y supervivencia de gusanos adultos. Por consiguiente, un esfuerzo alternativo que tiene como objetivo eliminar los nematodos incluye la eliminación de las bacterias con agentes antibacterianos.
[0003] El desarrollo de estos tipos de gusanos parasitarios, en particular Dirofilaria, a menudo está muy restringido en relación con huésped (mamífero) definitivo, excluyendo el desarrollo de modelos de animales/roedores intermedios. Las consecuencias de ello son evidentes en vista de la falta de nuevos agentes farmacéuticos para combatir estos patógenos. Por ejemplo, las lactonas macrocíclicas (LM) se introdujeron hace más de 25 años, todavía siguen siendo la única clase química aprobada para la prevención de enfermedad causada por HW. Para la mayoría de los investigadores, los estudios en caninos son simplemente demasiado largos - como mínimo seis meses - y caros para justificar estudios experimentales fuera de esta clase de compuestos comprobados. Por lo tanto, un modelo intermedio de infección por filarias en roedores podría abrir las compuertas de exploración, permitiendo a los investigadores examinar y evaluar rápidamente agentes parasiticidas innovadores. En lo que se refiere a la presentación de esta solicitud, nadie ha modelado con éxito tales infecciones por filarias fuera del huésped definitivo.
[0004] H. L. Rotman et al, Experimental Parasitology, 81, 136-139, 1995 describe el ciclo de vida de Strongyloides stercoralis en ratones SCID.
[0005] T. Mendes et al, «Strongyloidiasis Current Status with Emphasis in Diagnosis and Drug Research», Journal Of Parasitology Research, (20170101), volumen 2017, páginas 1 - 13, es un artículo de análisis que trata del estado actual de diagnóstico de Strongyloidiasis e investigación de fármacos.
[0006] D. Kulke et al, «Efficacy of Cyclooctadepsipeptides and Aminophenylamidines against Larval, Immature and Mature Adult Stages of a Parasitologically Characterized Trichurosis Model in Mice», PLOS Neglected Tropical Diseases, (20140201), volumen 8, número 2, página e2698, da a conocer ratones C57BL/10 ScSnOlaHsd infectados por la vía oral con huevos de Trichus muris.
[0007] J. Keiser et al, «Evaluation of an FDA approved library against laboratory models of human intestinal nematode infections», Parasites & Vectors, 2016, volumen 9, número 1 da a conocer el uso de modelos animales de infecciones por nematodos intestinales en humanos y pruebas de la actividad de una librería de fármacos aprobada por FDA.
[0008] L. D. Shultz et al, «Humanized mice in translational biomedical research», The Journal Of Immunology, 2007, volumen 7, número 2, páginas 118 - 130 es un artículo de análisis que trata del uso de ratones humanizados en la investigación biomédica de traslación.
[0009] H. Sjoberg et al, «Development of murine models of Ioiasis to assess microfilaricidal activity of pre-clinical
candidate anti-filarial drugs», BSP Spring Meeting 2016, Londres, Reino Unido, URL: https://www.myeventflo.com/event-lec- ture.asp?lectID=10186, es un abstracto de conferencia, que da a conocer el desarrollo de modelos de ratón con Ioiasis con el objetivo de su evaluación como pruebas de fármacos microfilaricidas in vivo.
CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN
[0010] Los solicitantes han descubierto, de una manera bastante inesperada, que ratones inmunodeficientes NOD scid gamma (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ; de aquí en adelante, “NSG”) resisten la infección completa y el desarrollo de determinados gusanos parasitarios, que incluyen a HW caninos. Estos ratones resisten la infección completa y el desarrollo de gusanos parasitarios filáricos, tales como aquellos mencionados en la Tabla 1, así como otros nematodos parasitarios, tales como Haemonchus contortus. Adicionalmente, los Solicitantes descubrieron que NRG (NOD-Rag1null IL2rgnull, NOD rag gamma), un ratón inmunodeficiente de manera similar es vulnerable a HW, considerando que otros ratones inmunodeficientes sean resistentes.
Tabla 1. Ratón inmunocomprometido resiste de manera inesperada la infección completa por algunas especies de n m r n r r .
[0011] Por consiguiente, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento de determinación de la eficacia de un compuesto o combinación de compuestos para el tratamiento o la prevención de una infección por gusanos parasitarios, que comprende:
(a) infectar a un roedor inmunocomprometido con un número específico de larvas de gusanos parasitarios; (b) tratar el roedor infectado con el compuesto o la combinación de compuestos de prueba; y
(c) realizar una necropsia al roedor y determinar el número de gusanos parasitarios, opcionalmente gusanos parasitarios adultos, presentes en un tejido de roedor;
en el que el roedor es un ratón knockout para la cadena gamma del receptor de IL2 NOD scid (NSG) (NOD-SCID-IL2Ry -/-) o un ratón inmunodeficiente NRG (NOD-Rag1nullIL2rgnuN); y en donde el gusano parasitario es un nematodo y el gusano parasitario es Dirofilaria immitis, Strongyloides stercoralis o Haemonchus contortus.
[0012] Se describe un modelo de roedor inmunocomprometido para resistir la infección y el desarrollo de gusanos parasitarios (por ejemplo, parásitos nematodos tales como parásitos filáricos) fuera de sus huéspedes definitivos. Tales modelos de roedores inmunocomprometidos pueden resistir la infección completa y el desarrollo de parásitos filáricos (por ejemplo, hasta la etapa de gusanos adultos) fuera de sus huéspedes definitivos. Tales modelos de roedores inmunocomprometidos pueden utilizarse en los procedimientos de modelado de infección completa de un gusano parasitario fuera del huésped definitivo de gusano, los procedimientos de determinación de la eficacia de un compuesto en el tratamiento o la prevención de una infección por gusano parasitario, los procedimientos de pruebas de fármacos para fármacos con eficacia en el tratamiento o la prevención de una infección por gusanos parasitarios, o los procedimientos de caracterización de cambios en la sensibilidad a un agente parasiticida durante la infección por gusanos parasitarios (por ejemplo, un agente filaricida durante una infección por gusanos filáricos).
[0013] En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento de determinación del número de gusanos parasitarios en una o más muestras de tejido aisladas de un roedor inmunocomprometido, preferiblemente, roedor inmunocomprometido necropsiado, infectado con un número específico de larvas de gusanos parasitarios y tratado con un compuesto o una combinación de compuestos de prueba, en donde el procedimiento comprende la determinación del número de gusanos parasitarios, opcionalmente gusanos parasitarios adultos, presentes en la(las) muestra(s) de tejido aisladas; en donde el gusano parasitario es un nematodo y el gusano parasitario es Dirofilaria immitis, Strongyloides stercoralis o Haemonchus contortus y en donde el roedor es un ratón knockout para la cadena gamma del receptor de IL2 NOD scid (NSG) (NOD-SCID-IL2Ry -/-) o un ratón inmunodeficiente NRG (NOD-Rag1nullIL2rgnuN).
[0014] En un tercer aspecto, la presente invención proporciona uno o más compuesto(s) filaricidas identificado(s) mediante el procedimiento del primero o el segundo aspecto mencionado anteriormente, seleccionado entre el grupo
para ser utilizado en un procedimiento de tratamiento de filariasis en un sujeto que lo necesita, en donde la filariasis es dirofilariasis.
[0015] En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona un roedor inmunocomprometido infectado por uno o más gusanos parasitarios adultos, en donde el gusano parasitario es un nematodo y en donde el gusano parasitario es Dirofilaria immitis, Strongyloides stercoralis o Haemonchus contortus y el roedor es un ratón knockout para la cadena gamma del receptor de IL2 NOD scid (NSG) (NOD-SCID-IL2Ry -/-) o un ratón inmunodeficiente NRG (NOD-Rag1nuNIL2rgnu").
[0016] En un quinto aspecto, la presente invención proporciona el uso de un roedor inmunocomprometido del cuarto aspecto mencionado anteriormente para el modelado de la infección completa de un gusano parasitario fuera del huésped definitivo de gusano o para la caracterización de cambios en la sensibilidad de un agente parasiticida o filaricida durante una infección por gusanos parasitarios o filáricos.
[0017] En un sexto aspecto, la presente invención proporciona el uso de un roedor inmunocomprometido para el modelado de infección completa de un gusano parasitario fuera del huésped definitivo de gusano, en donde el roedor es un ratón knockout para la cadena gamma del receptor de IL2 NOD scid IL2 (NSG) (NOD-SCID-IL2Ry -/-) o un ratón inmunodeficiente NRG (NOD-Rag1nullIL2rgnuN) y el gusano parasitario es un nematodo y el gusano parasitario es Dirofilaria immitis, Strongyloides stercoralis o Haemonchus contortus.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0018] La siguiente descripción detallada se puede comprender mejor en conjunto con los dibujos adjuntos, en los que:
La Figura 1 es un gráfico que muestra el crecimiento de D. immitis recuperado de ratones NSG en puntos de tiempo indicados después de la infección con 100 L3 por ratón NSG.
La Figura 2 es un gráfico que muestra el porcentaje normalizado de recuperación de larvas (día 42/6 semanas) después de la administración de una dosis de 1 mg/kg de emodepsida o 3 mg/kg de ivermectina a ratones NSG (Des infectados con D. immitis, los Días 1, 15 y 30 después de la infección.
La Figura 3 es un gráfico que muestra las longitudes de Di recuperados en los Días 41 y 43, después de la infección, de ratones NSG a los que se les administró Control, EMO o 8800 el Día 30, después de la infección.
La Figura 4 es un gráfico que muestra las longitudes de Di recuperados los Días 83 y 84. Se administraron los tratamientos de Control, EMO, o 8800 a ratones infectados con Di los Días 30 y 60.
La Figura 5 es un gráfico que muestra las longitudes de Di recuperados en un periodo entre los Días 41 y 43. Se administraron control y diferentes concentraciones de 8800, EMO o IVM a ratones Desinfectados los Días 30 y 60. La Figura 6 es un gráfico que muestra la longitud de Di recuperados en un periodo entre los Días 41 y 43. Se administró control, EMO, 8800, 4838, 8914 o 6557 a ratones infectados con Di los Días 1, 15 y 30 después de la infección. La Figura 7 es un gráfico que muestra las longitudes de Di recuperados en un periodo entre los Días 41 y 43. Se administró control, EMO, 8800, 4838 o IVM a los ratones infectados con Di los Días 1, 15 y 30 después de la infección. La Figura 8 es un gráfico que muestra las longitudes de Di recuperados en un periodo entre los Días 41 y 42. Se administró control, EMO, 8800 o 4838 a los ratones infectados con Di los Días 1, 15 y 30 después de la infección. La Figura 9 es un gráfico que muestra las longitudes de Di recuperados en un periodo entre los Días 41 y 42. Se administró control, EMO, 8800 o 4838 a los ratones infectados con Di los Días 1, 15 y 30 después de la infección. La Figura 10 es un gráfico que muestra las longitudes de Di recuperados en un periodo entre los Días 40 y 42. Se administró control, EMO, 8800 o 4838 a los ratones infectados con Di los Días 1, 15 y 30 después de la infección. La Figura 11 es un gráfico que muestra las longitudes de Di recuperados en un periodo entre los Días 41 y 42. Se administró control, IVM, 8800 o 4838 a los ratones infectados con Di los Días 1, 15 y 30 después de la infección. La Figura 12 es un gráfico que muestra las longitudes de Di recuperados en un periodo entre los Días 41 y 42. Se administró control o IVM a los ratones infectados con Di los Días 1, 15 y 30 después de la infección. Se pusieron a prueba las cepas Missouri y JYD de Di.
La Figura 13 muestra las localizaciones de recuperación de gusanos en ratones infectados con Di a los que se les administró control o IVM los Días 1, 15 y 30 después de la infección.
La Figura 14 es un gráfico que muestra las longitudes de Di recuperados en un periodo entre los Días 41 y 42 después de la infección de ratones C57BL/6, SCID, NOD, NOD/SCID, NSG y NRG.
La Figura 15 es un gráfico que muestra las longitudes de Di recuperados en un periodo entre los Días 41 y 42. Se administró control o 4838 a los ratones infectados con Di los Días 1, 15 y 30 después de la infección.
La Figura 16 es un gráfico que muestra las longitudes de Di recuperados en un periodo entre los Días 41 y 42. Se administró control, 3615, 5010, 7823, 2677 o 8800 a ratones infectados con Di los Días 1, 15 y 30 después de la
infección.
La Figura 17 es un gráfico que muestra las longitudes de Di recuperados en un periodo entre los Días 40 y 42. Se administró control o IVM a los ratones infectados con Di los Días 1, 15 y 30 después de la infección.
La Figura 18 es un gráfico que muestra las longitudes de Di recuperados en un periodo entre los Días 40 y 42. Se administró control o 7823 a los ratones infectados con Di los Días 1, 15 y 30 después de la infección.
La Figura 19 es un gráfico que muestra las longitudes de Di recuperados en un periodo entre los Días 40 y 42. Se administró control o IVM a los ratones infectados con Di los Días 1, 15 y 30 después de la infección.
La Figura 20 es un gráfico que muestra las longitudes de Di recuperados en un periodo entre los Días 40 y 42. Se administró control o IVM a los ratones infectados con Di los Días 1, 15 y 30 después de la infección.
La Figura 21 es un gráfico que muestra las longitudes de Di recuperados en un periodo entre los Días 40 y 42 después de la infección de ratones con células de sangre de cordón umbilical CD34+ caninas.
La Figura 22 es un gráfico que muestra el número de gusanos recuperados en ratones de control y NSG tratados con MPA infectados con 500 L3 H. contortus.
La Figura 23 es un gráfico que muestra el número de gusanos recuperados en ratones de control y NSG tratados con MPA infectados con 1000 L3 H. contortus.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
[0019] La presente invención se basa en el sorprendente descubrimiento que roedores inmunocomprometidos, con o sin células inmunes injertadas de una especie diferente (por ejemplo, las especies de un huésped determinado de un gusano parasitario), se pueden utilizar para modelar infecciones por parásitos filáricos e infecciones por otros gusanos parasitarios tales como parásitos nematodos fuera de sus huéspedes definitivos. Los solicitantes han descubierto, de una manera bastante inesperada, que ratones inmunodeficientes NSG y NRG resisten la infección y el desarrollo de determinados gusanos parasitarios, que incluyen a HW caninos.
[0020] Los ratones NSG y NRG se encuentran entre los ratones más inmunocomprometidos descritos hasta la fecha, que carecen de células T maduras, células B y células asesinas naturales (NK). Es más, los ratones NSG carecen de varias secuencias de señalización de citocinas y tienen muchos defectos en inmunidad innata. Tal como se indica en la Tabla 1, los Solicitantes descubrieron que los ratones NSG y NRG muestran una capacidad sorprendente de albergar parásitos que hasta ahora normalmente han generado solamente infecciones completas en huéspedes definitivos, pero no han generado infecciones completas en animales no diana (es decir, huéspedes no definitivos) que tienen sistemas inmunes no comprometidos (Tabla 1). Del mismo modo, los Solicitantes descubrieron que los ratones NSG con células inmunes injertadas del huésped definitivo de un gusano parasitario muestra una capacidad asombrosa de albergar parásitos que hasta ahora normalmente han generado solamente infecciones completas en huéspedes definitivos. Tal como se utiliza en el presente documento, «infección completa» significa que una forma de larva en etapa temprana determinada (por ejemplo, L3) resiste y se desarrolla en gusanos maduros (por ejemplo, gusanos adultos). En el caso de parásitos filáricos, la forma de larvas en etapa temprana determinada (por ejemplo, L3) continua y se desarrolla en gusanos maduros que pueden ser capaces de liberar microfilarias en el torrente sanguíneo del huésped infectado/infestado. Las microfilarias por sí solas no generan infección. En cambio, estas formas de larvas en etapa más temprana aparecen en un mamífero infectado a través de una picadura de un artrópodo chupasangre (por ejemplo, mosquito). En el vector, las microfilarias se desarrollan en larvas L3, que se introducen en huéspedes mamíferos posteriores cuando un vector infectado con L3 pica y se alimenta sobre el mamífero.
[0021] Este descubrimiento es inesperado, en parte, debido a que un experto no habría tenido expectativa razonable de que las larvas L3 resistiesen en un huésped no definitivo durante los largos periodos de tiempo observados (meses). Por lo tanto, antes de esta divulgación, podría darse el caso de que el ratón inmunocomprometido era adecuado para albergar la etapa L3, pero solamente durante un periodo de tiempo limitado. Dicho modelo podría ser suficiente para poner a prueba agentes terapéuticos para su capacidad de destruir larvas L3. Sin embargo, con muchas sorpresas para los Solicitantes, las larvas L3 se desarrollaron en larvas L4 y los adultos se introdujeron en el roedor inmunocomprometido. En el caso de Dirofilaria immitis, por ejemplo, esto proporciona un modelo excelente de dirofilariasis cardiopulmonar canina. La creación de este modelo por parte de Solicitantes permite el cribado rápido de APIs por su capacidad de dirigirse a una o más etapas específicas de un ciclo de vida de nematodo filárico. La creación de este modelo por parte de Solicitantes permite el cribado rápido de APIs por su capacidad de dirigirse a una o más etapas específicas del ciclo de vida de otros gusanos parasitarios o parásitos nematodos. Esta característica posee el beneficio obvio de facilitar a los investigadores el direccionamiento de etapas de ciclo de vida de parásitos que hasta ahora eran extremadamente caras y difíciles de afrontar debido a la condición de un huésped definitivo. Por otra parte, la idea de los Solicitantes de que este modelo proporcionará una herramienta indispensable para analizar la naturaleza de las señales que facilitan a los roedores inmunocomprometidos simular infección y desarrollo de filarias en caninos. Finalmente, la idea de los Solicitantes de que cuando se introducen las microfilarias en los roedores
inmunocomprometidos, pueden permanecer durante un periodo de tiempo, particularmente en circulación, cuando se introducen por la vía IV. Dicha permanencia permitiría los ensayos de APIs que son específicamente activos contra microfilarias in vivo. Del mismo modo, la idea de los Solicitantes de que cuando se introducen las larvas infectadas (por ejemplo, L3) de parásitos nematodos en los roedores inmunocomprometidos, pueden permanecer durante un periodo de tiempo y, por ejemplo, desarrollarse en gusanos adultos, facilitando los ensayos de API.
[0022] En un primer aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento de determinación de la eficacia de un compuesto o combinación de compuestos para el tratamiento o la prevención de una infección por gusanos parasitarios, que comprende:
(a) infectar a un roedor inmunocomprometido con un número específico de larvas de gusanos parasitarios; (b) tratar el roedor infectado con el compuesto o la combinación de compuestos de prueba; y
(c) realizar una necropsia al roedor y determinar el número de gusanos parasitarios, opcionalmente gusanos parasitarios adultos, presentes en un tejido de roedor;
en el que el roedor es un ratón knockout para la cadena gamma del receptor de IL2 NOD scid (NSG) (NOD-SCID-IL2Ry -/-) o un ratón inmunodeficiente NRG (NOD-Rag1nullIL2rgnuN); y en el que el gusano parasitario es un nematodo y el gusano parasitario es Dirofilaria immitis, Strongyloides stercoralis o Haemonchus contortus.
[0023] El modelo de roedor inmunocomprometido puede resistir la infección completa y el desarrollo de parásitos filáricos (por ejemplo, hasta gusanos filáricos adultos) fuera de sus huéspedes definitivos. Tales modelos de roedores inmunocomprometidos pueden utilizarse en los procedimientos de modelado de infección completa de un gusano parasitario fuera del huésped definitivo de gusano, los procedimientos de determinación de la eficacia de un compuesto en el tratamiento o la prevención de una infección por gusano parasitario, los procedimientos de pruebas de fármacos para fármacos con eficacia en el tratamiento o la prevención de una infección por gusanos parasitarios, o los procedimientos de caracterización de cambios en la sensibilidad a un agente parasiticida durante la infección por gusanos parasitarios (por ejemplo, un agente filaricida durante una infección por gusanos filáricos).
[0024] El modelo comprende la infección de un ratón que carece de células T maduras o funcionales, células B y células asesinas naturales (NK, natural killer cells). En algunos ejemplos, el modelo comprende la infección de un ratón que carece de células T maduras, células B y células asesinas naturales (NK); y, en donde el ratón carece también de algunas secuencias de señalización de citocinas y comprende muchos defectos en inmunidad innata. El modelo es un ratón NSG o un ratón NRG tal como se describe en otra parte en el presente documento. En el presente documento se describen también, pero no forman parte de la presente invención, los ratones que se pueden diseñar genéticamente para que carezcan de uno o más o todos elementos funcionales comprables que carece un ratón NSG, con relación a un ratón correspondiente que posee un sistema inmune intacto.
[0025] NSG (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ) es una de las cepas de ratones más inmunodeficientes. Los antecedentes genéticos de diabéticos no obesos (NOD) contienen alelos que reducen la función de la rama innata del sistema inmune. Por consiguiente, los macrófagos y las células dendríticas son defectuosos. Scid es una mutación de pérdida de función del gen Prkdc que impide el desarrollo de las células T y B. Prkdc codifica la subunidad catalítica de una proteína cinasa dependiente de ADN con un papel en la resolución de rupturas de cadena doble de ADN que tienen lugar durante la recombinación V(D)J (es decir, a través de unión de extremos no homólogos (NHEJ)). En ausencia de recombinación V(D)J, el gen del receptor de las células T (TCR) e las células T y el gen de inmunoglobulina (Ig) en las células B no se expresan, y las células T y B no pueden madurar. Debido al defecto de NHEJ en mutantes con scid, los ratones con scid carecen tanto de células T como B maduras. La cadena gamma del receptor de interleucina 2 (Il2rg) es un componente común de los receptores de superficie de células para seis interleucinas diferentes (IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 e IL-21). Los ratones NSG tienen una mutación nula completa (knockout) de este gen. Las secuencias de señalización para estas citocinas se bloquean en ratones knockout Il2rg, aunque las citocinas por sí misma están todavía presentes. La consecuencia principal de la deficiencia de Il2rg es la ausencia de células NK funcionales, que requieren la señalización de IL15 para su desarrollo. Los ratones NSG tiene las siguientes características: células B maduras: ausentes; células T maduras: ausentes; células dendríticas: defectuosas; macrófagos: defectuosos; células asesinas naturales: ausentes; y complemento: ausente.
[0026] Los ratones NSG y NRG (NOD rag gamma; NOD.Cg-Rag1tm1Mom Il2rgtm1Wjl/SzJ; NOD Rag1nuN Il2rgnuN) son cepas muy similares. Los ratones NRG sustituyen la mutación de desactivación de Rag1 por la mutación scid. La desactivación de Rag1 tiene un fenotipo muy similar en el sistema inmune (eliminación de células T y B), pero no tiene el efecto secundario de scid de sensibilidad a radiación/quimioterapia. Los ratones NRG llevan dos mutaciones en los antecedentes genéticos de NOD/ShiLtJ: una mutación knockout dirigida en el gen 1 que activa la recombinación (Rag1), y un alelo nulo completo de la cadena gamma común del receptor de IL2 (Il2rg). La mutación Rag1nun hace que las células T y B de ratón sean deficientes, y la mutación IL2rgnul impide la señalización de citocinas a través de receptores múltiples, lo que provoca una deficiencia en células NK funcionales.
[0027] En el presente documento se describe también, pero no forma parte de la presente invención, un modelo que comprende un mamífero cuyo sistema inmune ha sido genéticamente diseñado para carecer de elementos funcionales comprables que carece un ratón NSG, con relación a un ratón correspondiente que posee un sistema inmune intacto.
Tales modelos pueden tener, por ejemplo, una o más o todas de las siguientes características: (1) ausencia de células T y B funcionales (es decir, carencia de células T y B maduras); (2) ausencia de células NK funcionales; y (3) función reducida de la rama innata del sistema inmune. Algunos modelos carecen de células T y B maduras. Esto puede estar causado, por ejemplo, por una mutación de pérdida de función en el gen Prkdc, tal como la mutación Scid. Esto puede estar causado, por ejemplo, por una mutación de pérdida de función en el gen Rag1. Tales modelos carecen de células NK funcionales. Esto puede estar causado, por ejemplo, por una mutación de pérdida de función en el gen Il2rg, que puede provocar deficiente señalización de IL15. Algunos modelos tienen producción de citocinas deficiente, tales como, secuencias de señalización de interleucina (por ejemplo, aquello afectados por el bloqueo de Il2rg, tal como señalización de IL15). Algunos modelos tienen función reducida de la rama innata del sistema inmune. Por ejemplo, los macrófagos y/o las células dendríticas pueden estar defectuosos en algunos modelos. Esto puede estar causado, por ejemplo, por los antecedentes genéticos de NOD. Algunos modelos carecen de células T y B maduras y carecen de células n K funcionales. Algunos modelos carecen de células T y B maduras y tienen función reducida de la rama innata del sistema inmune. Algunos modelos carecen de células n K funcionales y tienen función reducida de la rama innata del sistema inmune. Algunos modelos carecen de células T y B maduras, carecen de células NK funcionales y tienen función reducida de la rama innata del sistema inmune.
[0028] En algunas realizaciones, el mamífero puede comprender células inmunes injertadas de otras especies, tales como células inmunes injertadas de un huésped definitivo de un gusano parasitario particular. En algunas realizaciones, el mamífero puede comprender células madre hematopoyéticas injertadas. En algunas realizaciones, el mamífero puede comprender células inmunes maduras injertadas. En algunas realizaciones, el mamífero puede comprender células madre caninas injertadas. En otras realizaciones, el mamífero puede comprender células inmunes maduras caninas injertadas. Tales mamíferos pueden carecer de células NK f carecer de células T y B maduras (por ejemplo, tener la mutación scid). En algunos casos, se puede irradiar al mamífero antes de la realización de injerto. El mamífero es un ratón. La inmunodeficiencia grave de ratones NSG y NRG facilita su caninización mediante un injerto de células madre hematopoyéticas CD34+ caninas (HSCs) y xenoinjertos derivados de caninos de alta eficiencia.
Tales mamíferos con injertos pueden llevar células inmunes caninas que han sido generadas en el mamífero (por ejemplo, después de las inyecciones de células madre hematopoyéticas caninas CD34+) o generadas en un donante canino e injertadas en el mamífero (PBMCs). CD34 es un marcador de células madre/progenitoras que son capaces de generar cada linaje hematopoyético. Cuando se inyectan en un mamífero inmunocomprometido (por ejemplo, un ratón NSG), migran de manera natural a la médula ósea y se diferencian en tipos de células maduras del sistema inmune, a lo largo de las secuencias progenitoras establecidas. Las células CD34+ pueden aislarse fácilmente de sangre periférica movilizada, sangre de cordón umbilical o médula ósea. PBMCs («células mononucleares de sangre periférica») incluyen linfocitos maduros (células B, T y NK), monocitos y macrófagos. Cuando se introducen en el mamífero inmunocomprometido (por ejemplo, un ratón NSG), PBMCs o permanecen en la circulación (por ejemplo, células T) o mueren/migran a otros tejidos (por ejemplo, otros tipos de células).
[0029] El gusano parásito utilizado en la presente invención es un gusano filárico o un parásito gastrointestinal que es Dirofilaria immitis, Strongyloides stercoralis o Haemonchus contortus. Las infecciones por gusanos filáricos parasitarios causan condiciones de enfermedad conocidas genéricamente como filariasis. Los parásitos filáricos y su ciclo de vida se describen con más detalle en otra parte del presente documento. Están vectorizados por artrópodos, maduros y que se reproducen en tejidos de huésped específicos y producen microfilarias. La Filarioidea incluye varias familias, tales como Aproctidae, Creagrocercidae, Drilonematidae, Filariidae, Homungellidae, Mesidionematidae, Onchocercidae, Scolecophilidae, Setariidae, y Ungellidae. Los ejemplos de géneros de estas familias incluyen a Wuchereria, Brugia, Onchocerca, Mansonella, Dirofilaria, Parafilaria, Stenofilaria y Loa. Los ejemplos de parásitos filáricos incluyen los siguientes: Wuchereria bancrofti; especies Brugia (por ejemplo, Brugia malayi y Brugia timori); especies Mansonella (por ejemplo, Mansonella ozzardi, Mansonella perstans, Mansonella streptocerca y Mansonella semiclarum o Mansonella perstans); Dirofilaria immitis; Dirofilaria repens; especies Parafilaria (por ejemplo, Parafilaria bovicola y Parafilaria multipapillosa); especies Onchocerca (por ejemplo, Onchocerca volvulus, Onchocerca dermata, Onchocerca ochengi y Onchocerca dukei); Stenofilaria assamensis; y Loa loa. En una realización de la presente invención, el parásito filárico es Dirofilaria immitis.
[0030] En otro ejemplo, el parásito nematodo puede ser un parásito gastrointestinal. Un parásito gastrointestinal se refiere a un parásito que afecta al tracto gastrointestinal. Por ejemplo, el nematodo puede ser del orden Strongylida o la superfamilia Trichostrongyloidea (por ejemplo, el género Haemonchus). Trichostrongyloidea se dividen en 14 familias y 24 subfamilias. Estos gusanos tienen bocas muy pequeñas y se encuentran en un gran número de huéspedes. De manera general afectan al estómago o el intestino. En una realización de la presente invención, el parásito es Haemonchus contortus (gusano palo de barberías (barber's pole), que se describe con más detalle en otra parte del presente documento. Los gusanos adultos se adhieren a la mucosa abdominal y se alimentan de sangre. La enfermedad causada por los gusanos Haemonchus se denomina haemonchosis. En otro ejemplo, el parásito nematodo puede proceder del orden Rhabditida (por ejemplo, la familia Strongyloididae o el género Strongyloides). En una realización de la presente invención, el parásito nematodo es Strongyloides stercoralis (lombriz intestinal), que es un ascáride parasitario patógeno humano que provoca la enfermedad de estrongiloidiasis. La etapa de parásitos adultos habita en túneles de la mucosa del intestino delgado. Se ha informado de S. stereoralis en otros animales, que incluyen a gatos y perros.
[0031] En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento de determinación del número de
gusanos parasitarios en una o más muestras de tejido aisladas de un roedor inmunocomprometido, preferiblemente, roedor inmunocomprometido necropsiado, infectado con un número específico de larvas de gusanos parasitarios y tratado con un compuesto o una combinación de compuestos de prueba, en donde el procedimiento comprende la determinación del número de gusanos parasitarios, opcionalmente gusanos parasitarios adultos, presentes en la muestra o muestras de tejido aislado, en donde el gusano parasitario es un nematodo y el gusano parasitario es Dirofilaria immitis, Strongyloides stercoralis or Haemonchus contortus y en donde el roedor es un ratón knockout para la cadena gamma del receptor NOD scid (NSG) (NOD-SCID-IL2Ry -/-) o un ratón inmunodeficiente NRG (NOD-Rag1nullIL2rgnuN).
[0032] Por tejido infectado se entiende un tejido en el que se encuentra aquel tipo de gusano en un roedor inmunocomprometido infectado, pero no tratado.
[0033] Los gusanos contados en el tejido pueden ser de cualquier etapa de gusano (por ejemplo, microfilarias (Mf), L3, L4, L5 o gusanos adultos). Del mismo modo, se puede contar huevos. En una realización, se cuenta el número de gusanos adultos. Preferiblemente, el tejido en el que se cuentan los gusanos es un tejido en el que típicamente se encuentra aquel tipo de gusano en un huésped definitivo infectado o un tejido en el que se encuentra aquel tipo de gusano en un roedor inmunocomprometido infectado, pero no tratado. Por ejemplo, para D. immitis, el tejido puede ser un músculo o la piel. Como otro ejemplo, el tejido para un parásito gastrointestinal, tal como Strongyloides stercoralis o Haemonchus contortus puede ser el estómago, el intestino delgado u otro tejido del tracto gastrointestinal.
[0034] Los gusanos pueden contarse en puntos de tiempo diferentes después de la infección. Por ejemplo, los gusanos pueden contarse a aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más semanas después de la infección. En algunas realizaciones, los gusanos pueden contarse a aproximadamente 2-10, 3-9, 4-8, 5-7, 6 semanas después de la infección.
[0035] En algunas realizaciones, el ratón inmunocomprometido utilizado en los procedimientos del segundo aspecto comprende células inmunes injertadas. Las células inmunes injertadas pueden ser de otras especies, tales como células inmunes injertadas de un huésped definitivo de un gusano parasitario particular. En algunas realizaciones, el roedor inmunocomprometido puede comprender células madre hematopoyéticas injertadas. En algunas realizaciones, el roedor inmunocomprometido puede comprender células madre maduras injertadas. Por ejemplo, el roedor inmunocomprometido puede comprender células inmunes caninas injertadas. Las células inmunes injertadas pueden ser células CD34+ o células madre hematopoyéticas (por ejemplo, de sangre de cordón umbilical o médula ósea). Por ejemplo, aproximadamente 10.000, 20.000, 30.000, 40.000, 50.000, 60.000, 70.000, 80.000, 90.000, 100.000, 10.000 100.000, 20.000-100.000, 30.000-100.000, 40.000-100.000 o 50.000-100.000 o más células CD34+ pueden injertarse en el modelo de roedor inmunocomprometido. Alternativamente, las células inmunes injertadas pueden ser células inmunes maduras, tales como PBMCs («células mononucleares de sangre periférica») que incluyen, por ejemplo, linfocitos maduros (células B, T y NK), monocitos y macrófagos. Por ejemplo, aproximadamente 1 x 106, 2 x 106, 3 x 106, 4 x 106, 5 x 106, 6 x 106, 7 x 106, 8 x 106, 9 x 106, 10 x 106, 15 x 106, 20 x 106, 5 x 106 - 10 x 106, 1 x 106-20 x 106, 2 x 106 - 20 x 106, 3 x 106 - 20 x 106, 4 x 106 - 20 x 106, o 5 x 106 - 20 x 106 o más PBMCs pueden injertarse en el roedor inmunocomprometido.
[0036] El ratón inmunocomprometido puede estar infectado en los procedimientos de la presente invención mediante cualquier método adecuado. Los ejemplos de procedimientos adecuados incluyen inyección subcutánea, inyección intraperitoneal y administración oral. Por ejemplo, en el caso de gusanos filáricos tales como D. immitis, la infección puede producirse a través de la administración de las larvas mediante la inyección subcutánea o la inyección intraperitoneal. En el caso de parásitos gastrointestinales, la infección puede realizarse, por ejemplo, a través de la administración de las larvas mediante la sonda oral.
[0037] El número de larvas de gusano parasitario utilizadas para la infección de roedor inmunocomprometido en los procedimientos del segundo o el tercer aspecto puede ser cualquier número suficiente para crear una infección completa. Por ejemplo, se puede utilizar aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 300, 400, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 25-5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 1000-10000, 2000-9000, 3000-8000, 4000-7000, 5000-6000, 1000-5000, 5000-10000, 25-4000, 25-3000, 25-2000, 25 1000, 100-5000, 200-4000, 300-3000, 400-2000, 500-1000, 25-500, 50-200 o 50-100 larvas de gusano parasitario. En una realización, se utilizan aproximadamente 50-100 larvas de gusano parasitario (por ejemplo, larvas de D. immitis). En una realización, se utilizan 500-1000 larvas de gusano parasitario (por ejemplo, larvas de Haemonchus contortus). En una realización, se utilizan 1000-5000 larvas de gusano parasitario (por ejemplo, larvas de Strongyloides stereoralis). Las larvas de gusano parasitario pueden ser de cualquier etapa, tal como cualquier etapa suficiente para la infección del roedor. Por ejemplo, la etapa de gusano parasitario (por ejemplo, gusano nematodo o filárico) utilizada puede ser microfilaria, larva L3, larva L4, larva L5 o gusanos adultos jóvenes. En una realización, se utilizan larvas L3.
[0038] En algunas realizaciones, el procedimiento puede comprender adicionalmente la infección de un roedor inmunocomprometido de control con un número específico de larvas de gusanos parasitarios, la necropsia del roedor inmunocomprometido de control y la determinación del número de gusanos presentes en un tejido de roedor y la comparación del número de gusanos en el tejido de roedor del roedor inmunocomprometido de control (es decir, no tratado) con el número de gusanos en el tejido de roedor del roedor inmunocomprometido tratado. Preferiblemente,
los roedores de control y tratados se infectan con el mismo número de larvas de gusanos parasitarios mediante los mismos procedimientos de infección. Preferiblemente, las muestras de tejidos de los roedores de control y tratados son el mismo tipo de tejido aislado en el mismo punto de tiempo después de la infección.
[0039] En algunas realizaciones, el procedimiento puede comprender adicionalmente la comparación de la eficacia parasiticida del (los) compuesto(s) de prueba con la eficacia parasiticida de un compuesto conocido por tener actividad parasiticida contra el gusano parasitario que se trata. Por ejemplo, el procedimiento puede comprender adicionalmente la comparación de la eficacia parasiticida del(los) compuesto(s) de prueba con la eficacia parasiticida de cualquiera de los dos o ambos de un compuesto parasiticida de lactona macrocíclica (LM) o un compuesto parasiticida de depsipéptido. Los ejemplos de compuestos parasiticidas de LM incluyen avermectina, ivermectina, doramectina, abamectina, milbemicina y moxidectina. Los ejemplos de compuesto parasiticida de depsipéptido incluyen emodepsida.
[0040] En algunos ejemplos, la eficacia de compuestos parasiticidas putativos contra un parásito diana se puede probar hasta aproximadamente 95 % más rápido que en los estudios de eficacia en perros u otros animales huéspedes definitivos. En algunos ejemplos, la eficacia de compuestos filaricidas y/o microfilaricidas putativos contra un parásito diana se puede probar hasta aproximadamente 95 % más rápido que en los estudios de eficacia en perros. En algunas realizaciones, emodepsida e ivermectina eliminan a parásitos HW, cuando dichos ingredientes farmacéuticamente activos (APIs) se administraron por la vía oral a ratones NSG infectados con HW. Para la información de Solicitante, los datos dados a conocer en el presente documento son los primeros en demostrar que cualquier roedor inmunocomprometido es capaz de albergar y fomentar el desarrollo de HW.
[0041] Tal como se utiliza en el presente documento, un agente «parasiticida» es aquel que destruye gusanos parasitarios en cualquier etapa de desarrollo, a menos que se especifique lo contrario. Tal como se utiliza en el presente documento, un agente «filaricida» es aquel que destruye gusanos filáricos en cualquier etapa de desarrollo, a menos que se especifique lo contrario. De manera similar, un agente «microfilaricida» es aquel que destruye microfilarias. En algunos casos, se puede describir un agente como «selectivo» para una o más etapa(s) de desarrollo de gusanos parasitarios o nematodos o gusanos filáricos. En tales casos, «selectivo» significa que el agente muestra mayor eficacia frente a una etapa de desarrollo en comparación con su eficacia frente a otra etapa de desarrollo. En realizaciones particulares, los agentes selectivos son como mínimo aproximadamente 3, 10, 30, 100, 300 o 1000 veces más eficaces en la destrucción de una etapa de gusano parasitario o nematodo o gusano filárico frente a otra etapa. En algunas realizaciones, los agentes selectivos no muestran ninguna eficacia detectable frente a etapas de desarrollo no diana.
[0042] En un ejemplo, las microfilarias se administran a los roedores inmunocomprometidos, para facilitar las pruebas y la evaluación de APIs que se dirigen de manera selectiva a esta etapa más temprana de los parásitos filáricos. Los nematodos filáricos adultos viven en un tejido o el sistema circulatorio de vertebrados (los «huéspedes definitivos»). Estos gusanos maduros liberan microfilarias en el torrente sanguíneo del huésped vertebrado. A continuación, estas microfilarias se absorben por los vectores artrópodos que se alimentan de sangre (los «huéspedes intermedios»). En un huésped intermedio, las microfilarias se desarrollan en larvas infecciosas (por ejemplo, larvas de D. immitis L3), que pueden transmitirse a un nuevo huésped definitivo. La presencia de microfilarias en el torrente sanguíneo del huésped se denomina «microfilaremia». Aunque los procedimientos del ejemplo especifican que las microfilarias se administran más que otras etapas de gusano filárico, el tipo de roedores inmunocomprometidos utilizado, el tipo de gusanos filáricos utilizado, los procedimientos de la infección, el número de microfilarias utilizado para infectar al roedor inmunocomprometido, la etapa de gusanos contados en tejido infectado, el uso de roedores inmunocomprometidos de control, la comparación de eficacia parasitaria (eficacia filárica) con relación a otros compuestos y cualquier otra característica de los procedimientos todos pueden ser tales como se describen en el tercer aspecto.
[0043] En otras realizaciones de cualquiera de los procedimientos descritos, se puede estudiar y/o dirigir cualquier etapa de larvas que incluye, pero no se limita a, Mf, L3, L4, L5 y adultos jóvenes. En una realización, se utiliza la etapa de larva L3.
[0044] En un tercer aspecto, la presente invención proporciona uno o más compuesto(s) filaricidas identificado(s) mediante el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 9 seleccionadas entre el grupo que consiste en
para ser utilizado en un procedimiento de tratamiento de filariasis en un sujeto que lo necesita, en donde la filariasis es dirofilariasis.
[0045] El sujeto puede ser, por ejemplo, un humano, un animal no humano, un mamífero no humano, un perro, una oveja, una cabra o una vaca. En un ejemplo, el gusano parasitario es un nematodo. El gusano filárico puede ser D. immitis, y el sujeto puede ser un perro. En otro ejemplo, el nematodo puede ser un parásito gastrointestinal. Como otro ejemplo, el nematodo puede ser Strongyloides stercoralis (lombriz intestinal), y el sujeto puede ser un humano o un perro. Como otro ejemplo, el nematodo puede ser Haemonchus contortus y el sujeto puede ser un rumiante. Un rumiante es un mamífero que mastica el bolo alimenticio regurgitado de su rumen, tal como una oveja, una cabra o una vaca.
Definiciones
[0046] El término «aproximadamente», tal como se utiliza en el presente documento, significa aproximadamente, en la región de, más o menos o en torno a. Cuando el término «aproximadamente» se utiliza en conjunto con un intervalo numérico, modifica aquel intervalo extendiendo los límites por encima y por debajo de los valores numéricos establecidos. De manera general, el término «aproximadamente» se utiliza en el presente documento para modificar un valor numérico por encima y por debajo del valor declarado mediante una variación de 10 %. En un aspecto, el término «aproximadamente» significa más o menos 20 % del valor numérico del número con el que se está utilizando.
Por consiguiente, aproximadamente 50 % significa el intervalo de 45 % - 55 %. Los intervalos numéricos enumerados en el presente documento mediante los extremos incluyen todos los números y fracciones comprendidos dentro de aquel intervalo (por ejemplo, desde 1 hasta 5 incluye 1, 1,5, 2, 2,75, 3, 3,90, 4 y 5). También se debe entiende que todos los números y fracciones del mismo supuestamente se modifican mediante el término «aproximadamente».
[0047] Por «animal» se entiende mamíferos, pájaros y similares. Animal o huésped incluye a mamíferos y humano. El animal se puede seleccionar entre el grupo que consiste en, pero no se limita a: equinos, caninos, felinos, ovinos, bovinos, porcinos, caprinos, aves, primates y peces. El término «animal» incluye también a un animal individual en todas las etapas de desarrollo, incluyendo las etapas embrionaria y fetal.
[0048] A menos que se explique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente se entiende por un experto en la técnica a la que pertenece esta divulgación. Los términos singulares «un», «una» y «el/la» incluyen referencias plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Asimismo, la palabra "o" pretende incluir "y" a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
[0049] El término «filariasis» tal como se utiliza en el presente documento hace referencia a infecciones por helmintos que están causadas por nematodos filáricos. Una infección es la colonización de un organismo huésped por especies parasitarias. Las infecciones por nematodos filáricos en humanos pueden causar filariasis linfática u oncocercosis. El término «filariasis linfática» hace referencia a una infección por nematodos Wuchereria bancrofti, Brugia malayi o Brugia timori. El término «oncocercosis»" hace referencia a una infección con el nematodo Onchocerca volvulus. La filariasis linfática puede causar hidrocele, linfedema y elefantiasis. Oncocercosis puede causar inflamación cutánea y ceguera, denominada ceguera del río. En perros, una infección por especies de nematodos denominadas Dirofilaria immitis (D. immitis) y Dirofilaria repens (D. repens) causa dirofilariasis. Las especies anteriores de nematodos causan enfermedad de HW, mientras que las últimas causan dirofilariasis subcutánea. Como tal, cuando se utiliza el término «gusano del corazón» para hacer referencia al nematodo, se refiere a D. immitis, no a D. repens.
[0050] Tal como se utiliza en el presente documento, el término «tratamiento profiláctico» hace referencia a cualquiera de los dos o la prevención o la inhibición del desarrollo de una condición o un trastorno clínico o el retraso del comienzo de una etapa evidente preclínicamente de una condición o un trastorno clínico. El término «tratamiento profiláctico» de acuerdo con la presente invención se debe entender como el que significa que las composiciones de acuerdo con la presente invención pueden aplicarse antes de que se manifiesten los síntomas de la infección. El término «tratamiento profiláctico» se debe entender como el que significa un tratamiento médico. Los compuestos identificados que se utilizan en el modelo de roedor inmunocomprometido, de acuerdo con la presente invención pueden, por ejemplo, ser utilizados en un tratamiento profiláctico.
[0051] El término «cantidad terapéuticamente eficaz» se utiliza en el presente documento para indicar una cantidad o una dosis suficiente para causar una mejoría en una condición importante clínicamente en el sujeto.
[0052] Tal como se utiliza en el presente documento, «IVM» es ivermectina; «EMO» es emodepsida; «8800» es depsipéptido 0798800; «4838» es depsipéptido 0804838; y «8914» es luxabendazol; y «6557» es un análogo de DI3. «3615», «8800», «4838», «7823», «5010» y «2677» son análogos de depsipéptido descritos en US 2017/0022253 A1 y US 2017/0233438 A1. Las estructuras de estos compuestos se proporcionan a continuación.
[0053] A menos que se define lo contrario, los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente se entiende por un experto en la técnica a la que pertenece la presente divulgación.
[0054] En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona un roedor inmunocomprometido infectado con uno o más gusanos parasitarios adultos, en donde el gusano parasitario es un nematodo y en donde el gusano parasitario es Dirofílaria immitis, Strongyloides stercoralis o Haemonchus contortus y el roedor es un ratón knockout para la cadena gamma del receptor de IL2 NOD scid (NSG) (NOD-SCID-IL2Ry -/-) o un ratón inmunodeficiente NRG (NOD-Rag1nullIL2rgnuN). En un quinto aspecto, se proporciona el uso de un roedor inmunocomprometido del cuarto aspecto mencionado anteriormente para el modelado de la infección completa de un gusano parasitario fuera del huésped definitivo de gusano o para la caracterización de cambios en la sensibilidad de un agente parasiticida o filaricida durante una infección por gusanos parasitarios o filáricos.
[0055] En un sexto aspecto, la presente invención proporciona el uso de un roedor inmunocomprometido para el modelado de infección completa de un gusano parasitario fuera del huésped definitivo de gusano, en donde el roedor es un ratón knockout para la cadena gamma del receptor de IL2 NOD scid (NSG) (NOD-SCID-IL2Ry -/-) o un ratón inmunodeficiente NRG (NOD-Rag1nullIL2rgnuN) y el gusano parasitario es un nematodo y el gusano parasitario es Dirofílaria immitis, Strongyloides stercoralis o Haemonchus contortus.
[0056] Los siguientes ejemplos están destinados simplemente a ilustrar y explicar adicionalmente la presente invención.
EJEMPLOS
[0057] Para los siguientes estudios, se obtuvieron D. immitis a partir de FR3, el criadero de insectos Merial y el grupo Joe Prullage de MRC. Tal como se utiliza en el presente documento, «FR3» hace referencia al Centro de Recursos de Reactivos de Investigación de Filariasis en la Universidad de Georgia Vet School, que proporciono a los Solicitantes la cepa Di de Missouri 2005 sensible a ML. De manera general, los gusanos se recuperaron de mosquitos y se enviaron durante la noche en caldos de cultivos y antibióticos. Los gusanos se lavaron y se contaron para ser utilizados en ratones.
[0058] Los ratones se inyectaron por la vía subcutánea o por la vía intraperitoneal. Para la recuperación de parásitos, los ratones se sometieron a sangrado para recoger el suero, se les quitó la piel y se marcó la fascia, se extrajeron las vísceras (extracción) y se marcó la fascia muscular. Todas las partes se dejaron en remojo durante la noche a temperatura ambiente en un medio de RPMI suplementado con 10 % de FBS y antibióticos Pen/strep. A la mañana siguiente, aproximadamente 18 horas más tarde, se contaron los gusanos y se fijaron en 95% de etanol/5 % de glicerol. Los gusanos se fijaron en gelatina de glicerina y, a continuación, se midieron utilizando el software cellSens.
Ejemplo 7 - Desarrollo y Validación de un Intermedio en Modelo in Vivo de Infección por Gusano del Corazón Canino
[0059] El gusano del corazón canino (HW), D. immitis, que tiene relación con el parásito O. volvulus de ceguera del río humano, se transmite a través de un vector de mosquito que transmite larvas L3 a huéspedes. Los parásitos maduran durante diferentes etapas de larvas, que migran a través de tejido de huésped hasta las arterias pulmonares y el corazón. Los gusanos del corazón adultos crecen hasta 20-30 cm de longitud. Los adultos producen microfilarias circulantes que se transfieren al mosquito durante el consumo de sangre. Cuando se asimilan, las microfilarias maduran hasta convertirse en larvas L3 infecciosas, completando el ciclo.
[0060] Sin embargo, antes de la presente divulgación, para biólogos traslacionales existió un desafío importante: Las larvas Dirofílaria immitis (Di) no lograban desarrollarse en roedores inmunocompetentes (véanse Tabla 2). «Ratón #» se refiere al identificador de un ratón particular. Los números en las columnas «Extracción», «Músculos Superiores», «Músculos Inferiores», «Piel», «Total» y «Recuperación Promedio» hacen referencia al número de Di recuperados. Por consiguiente, las líneas de tiempo, el coste y el riesgo debido a la dependencia única de estudios caninos aumentaron.
Tabla 2. Larvas D. immitis no sobreviven en ratones C57BL6 com arativos .
[0061] De manera sorprendente, los Solicitantes descubrieron que los ratones NSG inmunodeficientes eran sensibles a la infección causada por D. immitis y el desarrollo completo. Después de la infección por la vía subcutánea (SQ) con 100 larvas infecciosas en etapa L3, se puede recuperar a D. immitis de tejidos de ratón NSG (Tabla 3), indicando la migración a través del huésped murino similar a la que tiene lugar durante las infecciones en caninos.
T l . R r i n ^D. immii r n N m n l inf i n r l ví .
[0062] Tal como se da a conocer en el presente documento, el modelo de ratón con infección por HW canino promete agilizar el descubrimiento de nuevos tratamientos farmacéuticos reduciendo los plazos (6 semanas en ratones en comparación a 6 meses en caninos) y los costes.
[0063] Se obtuvieron resultados similares cuando se introdujeron larvas L3 de D. immitis en ratones NSG o C57BL6 por la vía intraperitoneal (IP) (Tabla 4).
T l 4. R r i n D. immii r n N m n l inf i n r l ví IP.
[0064] Para determinar el efecto de variación de la dosis, los ratones NSG se inyectaron por la vía SQ tal como se describe anteriormente, esta vez con 25, 50 o 100 de larvas L3 de D. immitis (Tabla 5). «Ratón #» se refiere al identificador de un ratón particular. Los números en las columnas «Extracción», «Músculos Superiores», «Músculos Inferiores», «Piel», «Total» y «Recuperación Promedio» hacen referencia al número de Di recuperados. « % de Recuperación» hace referencia al porcentaje de los 25, 50, o 100 Di originales recuperados del ratón. Y mientras existía un aumento dependiente de la dosis estadísticamente importante en Recuperación Promedio, el porcentaje de recuperación no cambiaba de manera importante en las dosis de prueba.
Tabla 5. Recuperación de D. immitis de ratones NSG 6 semanas después de la infección por la vía SQ con 25, 50 o 100 larvas L3.
[0065] Para poner a prueba la linealidad del modelo de ratón NSG con la infección por D. immitis, los ratones NSG se infectaron con 100 L3 por ratón, utilizando los procedimientos descritos anteriormente. Se llevaron a cabo la recuperación y las mediciones tal como se indica anteriormente y las longitudes se presentaron como una función de tiempo después de la infección (La Figura 1). Tal como se indica, el modelo es considerablemente y sorprendentemente lineal, con un valor R2 calculado de 0,9884.
[0066] Para analizar si se pudiera eliminar a HW del modelo de ratón NSG mediante compuestos farmacéuticos, los Solicitantes pusieron a prueba compuestos filaricidas conocidos, emodepsida (EMO) e ivermectina (IVM). Se les administró una dosis a ratones NSG por la vía oral de 1 mg/kg de EMO o 3 mg/kg de IVM, los Días 1, 15 y 30 después de la infección. Tal como se indica en la La Figura 2, ambos compuestos redujeron de manera importante la carga parasitaria de HW. En vista de estos datos prometedores, los Solicitantes contemplan que el modelo de roedor inmunocomprometido puede aplicarse con éxito a un amplio rango de parásitos filáricos para predecir la eficacia de compuestos en animales, que incluyen a caninos. Los Solicitantes prevén adicionalmente que los parásitos HW en ratones NSG pueden ser fisiológicamente similares a aquellos de sus huéspedes caninos normales, definitivos.
[0067] En otro ejemplo, los ratones NSG se infectaron el Día 0 con 50 larvas L3 de Di. A continuación, los ratones se trataron con 1 mg/kg de EMO o 8800 el Día 30, y se llevó a cabo la recuperación entre los Días 41 y 43. La Figura 3 muestra la longitud de Di recuperados de los ratones los Días 41 y 43, y la Tabla 6 proporciona datos de supervivencia, datos de recuperación y estadísticas de resumen. «#» se refiere al identificador de ratón de un ratón particular. «Supervivencia» hace referencia al número de Di recuperados del ratón. « % de Rec» hace referencia al porcentaje de los 50 Di originales recuperados del ratón. « % de Red» hace referencia al porcentaje de reducción en el percentil de Di recuperados en comparación con el control.
T l . D l r m n r ^r n N inf n Di r n n r l EM 0.
[0068] En otro ejemplo, los ratones NSG se infectaron el Día 0 con 50 larvas L3 de Di. A continuación, los ratones se trataron con Control; 1mg/kg de EMO; o 8800 los Días 30 y 60. La Figura 4 muestra las longitudes de Di recuperados los Días 83 y 84, y la Tabla 7 expone los datos de supervivencia, datos de recuperación y estadísticas de resumen.
Tabla 7. Datos del resumen para ratones NSG infectados con Di tratados con Control, EMO o 8800.
[0069] En otro ejemplo, los ratones NSG se infectaron con 50 L3 de Di por ratón, a continuación, se trataron de acuerdo con lo siguiente: Control; 2X 8800 (1 mg/kg) los Días 1 y 30; 1X EMO (1 mg/kg) el Día 30; 2X EMO (1 mg/kg) los Días 1 y 30; 3X EMO (1 mg/kg) los Días 1, 15 y 30; o 3X IVM (3 mg/kg) los Días 1, 15 y 30. La Figura 5 es un gráfico que muestra la longitud de Di recuperados entre los Días 41 y 43, y la Tabla 8 expone los datos de supervivencia, datos de recuperación y estadísticas de resumen.
[0070] En otro ejemplo, los ratones NSG se infectaron con 50 L3 de Di por ratón, a continuación, se trataron de acuerdo con lo siguiente: EMO (1 mg/kg); 8800 (1 mg/kg); 4838 (1 mg/kg); 8914 (1 mg/kg); y 6557 (3 mg/kg). La Figura 6 es un gráfico que muestra las longitudes de Di recuperados entre los Días 41 y 43, y la Tabla 9 expone los datos de supervivencia, datos de recuperación y estadísticas de resumen.
[0071] En otro ejemplo, los ratones NSG se infectaron con 50 gusanos Merial L3 de Di (no gusanos FR3) por ratón, a continuación, se trataron los Días 1, 15 y 30 de acuerdo con lo siguiente: EMO (1 mg/kg); EMO (5 mg/kg); 8800 (1 mg/kg); 4838 (1 mg/kg); o IVM (3 mg/kg). La Figura 7 es un gráfico que muestra las longitudes de Di recuperados entre los Días 41 y 43, y la Tabla 10 expone los datos de supervivencia, datos de recuperación y estadísticas de resumen.
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[0072] En otro ejemplo, los ratones NSG se infectaron con 50 L3 de Di por ratón, a continuación, se trataron los Días 1, 15 y 30 de acuerdo con lo siguiente: EMO (5 mg/kg); 8800 (0,3 mg/kg); 8800 (1 mg/kg); 4838 (1 mg/kg); o 4838 (5 mg/kg). La Figura 8 es un gráfico que muestra las longitudes de Di recuperados entre los Días 41 y 42, y la Tabla 11 expone los datos de supervivencia, datos de recuperación y estadísticas de resumen.
[0073] En otro ejemplo, los ratones NSG se infectaron con 50 L3 de Di (cepa UC, extraída del criadero de insectos Merial) por ratón, a continuación, se trataron los Días 1, 15 y 30 de acuerdo con lo siguiente: EMO (5 mg/kg); 8800 (1 mg/kg); 8800 (2 mg/kg); 4838 (1 mg/kg); o 4838 (5 mg/kg). La Figura 9 es un gráfico que muestra las longitudes de Di recuperados entre los Días 41 y 42, y la Tabla 12 expone los datos de supervivencia, datos de recuperación (Días 41 y 42) y estadísticas de resumen.
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[0074] En otro ejemplo, los ratones NSG se infectaron con 50 L3 de Di (Cepa UC) por ratón, a continuación, se trataron los Días 1, 15 y 30 de acuerdo con lo siguiente: EMO (1 mg/kg); 8800 (1 mg/kg); 8800 (2 mg/kg); 4838 (1 mg/kg); o 4838 (5 mg/kg). La Figura 10 es un gráfico que muestra las longitudes de Di recuperados entre los Días 40 y 42, y la Tabla 13 expone los datos de supervivencia, datos de recuperación (Días 41 hasta 43) y estadísticas de resumen.
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[0075] En otro ejemplo, los ratones NSG se infectaron con 50 L3 de Di por ratón, a continuación, se trataron los Días 1, 15 y 30 de acuerdo con lo siguiente: 8800 (5 mg/kg); 4838 (10 mg/kg); IVM (3 mg/kg); o IVM (0,3 mg/kg). La Figura 11 es un gráfico que muestra las longitudes de Di recuperados entre los Días 41 y 42, y la Tabla 14 expone los datos de supervivencia, datos de recuperación y estadísticas de resumen.
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[0076] En otro ejemplo, los ratones NSG se infectaron el Día 0 con 50 L3 de Di (gusanos FR3) por ratón, a continuación, se trataron los Días 1, 15 y 30 de acuerdo con lo siguiente: MO Control; MO IVM (1 mg/kg); MO IVM (3 mg/kg); JYD Control; JYD IVM (1 mg/kg); JYD IVM (3 mg/kg); 4838 (10 mg/kg); IVM (3 mg/kg); o IVM (0.3 mg/kg). Se utilizaron cualquiera de las dos la cepa Missouri «sensible a ivermectina» o la cepa JYD «resistente a ivermectina». La cepa Missouri (es decir, aislado de Missouri) y la cepa JYD (es decir, aislado JYD-27) se describen, por ejemplo, en Maclean et al. (2017) Parasit. Vectors 10(Suppl 2):480. La cepa Missouri también se describe, por ejemplo, en Bourguinat et al. (2011) Vet. Parasitol. 176(4):368-373. La Figura 12 es un gráfico que muestra las longitudes de Di recuperados entre los Días 41 y 42, y la Tabla 15 expone los datos de supervivencia, datos de recuperación (Días 41 y 42) y estadísticas de resumen. La Figura 13 muestra las localizaciones de recuperación de gusanos.
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[0077] En otro ejemplo, varias cepas de ratones se infectaron el Día 0 con 50 L3 de Di (gusanos FR3) por ratón, pero no se trataron posteriormente. La Figura 14 es un gráfico que muestra las longitudes de Di recuperados entre los Días 41 y 42, y la Tabla 16 expone los datos de supervivencia, datos de recuperación (Días 41 y 42) y estadísticas de resumen.
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[0078] En otro ejemplo, los ratones NSG se infectaron el Día 0 con 50 L3 de Di (gusanos FR3) por ratón, y se trataron los Días 1, 15 y 30 tal como sigue: 4838 (0,5 mg/kg); 4838 (1 mg/kg); 4838 (2,5 mg/kg); 4838 (5 mg/kg); 4838 (10 mg/kg). La Figura 15 es un gráfico que muestra las longitudes de Di recuperados entre los Días 41 y 42, y la Tabla 17 expone los datos de supervivencia, datos de recuperación (Días 41 y 42) y estadísticas de resumen.
[0079] En otro ejemplo, los ratones NSG se infectaron el Día 0 con 50 L3 de JYD Di (gusanos FR3) por ratón, a continuación, se trataron los Días 1, 15 y 30 de acuerdo con lo siguiente: Control; 3615 (1 mg/kg); 5010 (1 mg/kg); 7823 (1 mg/kg); 2677 (1 mg/kg); o 8800 (1 mg/kg). La Figura 16 es un gráfico que muestra las longitudes de Di recuperados entre los Días 41 y 42, y la Tabla 18 expone los datos de supervivencia, datos de recuperación (Días 41 y 42) y estadísticas de resumen.
[0080] En otro ejemplo, los ratones NSG se infectaron el Día 0 con 50 L3 de JYD Di (gusanos FR3) por ratón, a continuación, se trataron los Días 1, 15 y 30 de acuerdo con lo siguiente: Control; IVM (0,01 mg/kg); IVM (0,25 mg/kg); IVM (0,5 mg/kg); IVM (1 mg/kg); o IVM (5 mg/kg). La Figura 17 es un gráfico que muestra las longitudes de Di recuperados entre los Días 40 y 42, y la Tabla 19 expone los datos de supervivencia, datos de recuperación (Días 40 42) y estadísticas de resumen.
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[0081] En otro ejemplo, los ratones NSG se infectaron el Día 0 con 50 L3 de JYD Di (gusanos FR3) por ratón, a continuación, se trataron los Días 1, 15 y 30 de acuerdo con lo siguiente: Control; 7823 (0,1 mg/kg); 7823 (0,25 mg/kg); 7823 (0,5 mg/kg); 7823 (1 mg/kg); o 7823 (5 mg/kg). La Figura 18 es un gráfico que muestra las longitudes de Di recuperados entre los Días 40 y 42, y la Tabla 20 expone los datos de supervivencia, datos de recuperación (Días 40 42) y estadísticas de resumen.
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[0082] En otro ejemplo, los ratones NSG se infectaron el Día 0 con 50 L3 de JYD Di (gusanos FR3) por ratón, a continuación, se trataron los Días 1, 15 y 30 de acuerdo con lo siguiente: Control; IVM (0,01 mg/kg); IVM (0,25 mg/kg); IVM (0,5 mg/kg); IVM (1 mg/kg); o IVM (5 mg/kg). La Figura 19 es un gráfico que muestra las longitudes de Di recuperados entre los Días 40 y 42, y la Tabla 21 expone los datos de supervivencia, datos de recuperación (Días 40 42) y estadísticas de resumen.
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[0083] En otro ejemplo, los ratones NSG se infectaron el Día 0 con 50 L3 de Di JYD (gusanos FR3) por ratón, a continuación, se trataron los Días 1, 15 y 30 de acuerdo con lo siguiente: Control; IVM (0,25 mg/kg); IVM (0,01 mg/kg); o IVM (0,005 mg/kg). La Figura 20 es un gráfico que muestra las longitudes de Di recuperados entre los Días 40 y 42, y la Tabla 22 expone los datos de supervivencia, datos de recuperación (Días 40-42) y estadísticas de resumen.
T l 22. L l r m n r r n N inf n FR Di ri rm n r n IVM.
[0084] Se llevó a cabo un único experimento en el que los ratones NSG se infectaron con aproximadamente 200.000 microfilarias D. immitis de cepa JYD mediante la infección retro-orbital. Las microfilarias se recuperaron sistemáticamente de la sangre retro-orbital 4 semanas después de la infección. Véase la Tabla 23. Con este experimento se demostró que el ratón NSG también era un huésped adecuado para la etapa de microfilarias de D. immitis.
Tabla 23. Infección de ratones NSG con microfilarias Di.
Ejemplo 2 - Infección de Ratones Inmunocomprometidos con Cepas Resistentes a Ivermectina (IVMR) de D. immitis para la Investigación de Nuevos Compuestos para Tratar Cepas Resistentes
[0085] Los ratones NSG infectados con HW resistentes se exponen a compuestos nuevos para determinar la eficacia de estos compuestos en la destrucción de parásitos resistentes. La fuente de los nuevos compuestos puede proceder de bibliotecas farmacéuticas y se administrarían a los ratones con un intervalo de dosis para medir la eficacia y la destrucción de cepas resistentes a IVM y sensibles a IVM de HW.
[0086] Una de dichas cepas que es resistente (es decir, menos sensible) a ivermectina es la cepa JYD tal como se ha descrito anteriormente. La cepa JYD (es decir, aislado JYD-27) se describe, por ejemplo, en Maclean et al. (2017) Parasit. Vectors 10(Suppl 2):480. Los experimentos en los que los compuestos se pusieron a pruebas frente a la cepa
JYD en ratones inmunocomprometidos NSG se describen en el Ejemplo 1. Véanse, por ejemplo, las La FiguraS 12, 13 y 16-20 y las Tablas 15 y 18-22. Véanse también la La Figura 21 y la Tabla 25 en el Ejemplo 3.
Ejemplo 3 - Desarrollo y Validación de un Modelo in Vivo Inmunocompetente, Intermedio, de Infección por Gusano del Corazón Canino con Células Inmunes Caninas Injertadas
[0087] Se realizó un experimento inicial utilizando células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) purificadas de sangre entera. Las PBMCs caninas se aislaron de 10 ml de sangre entera utilizando un gradiente de Ficoll según las instrucciones del fabricante para el aislamiento de PBMC humana. Seis ratones NSG se inyectaron por la vía intraperitoneal (IP) con 5,0 x 106 de PBMCs de un donante animal único y se analizaron mediante la citometría de flujo 4 y 8 semanas después. 4 semanas después del injerto, todos los ratones eran positivos para células B caninas y células T CD4 y c D8 T, junto con un número de otras células CD45+ caninas presentes que el panel de identificó (Tabla 24 y los datos no se muestran). Se calculó el porcentaje del injerto mediante las células CD45+ caninas totales en la puerta de linfocito/granulocito, que se determina basándose en el tamaño de la célula y la granularidad celular.
8 semanas después del injerto 3 ratones padecieron la enfermedad de injerto contra huésped (EICH), y de los 3 ratones restantes, solamente uno tuvo niveles importantes de PBMCs caninas restantes. Este estudio muestra que los ratones NSG son capaces de soportar células inmunes caninas y debería proporcionar una plataforma adecuada para el injerto de células madre CD34+.
Tabla 24. Niveles de células caninas en ratones NSG 3 semanas des ués del injerto.
[0088] Para confirmar adicionalmente los descubrimientos de PBMC iniciales, las PBMCs se purificaron de 100 ml de sagre entera canina. Quince ratones NSG se sometieron a injertos con cualquiera de las dos 5 x 106 (10 ratones) o 10 x 106 (5 ratones) de PBMCs de un animal donante. Los ratones que recibieron 5 x 106 de células tuvieron un injerto de CD45+ caninas medio de 16 ± 16 %, y los ratones que recibieron 10 x 106 de células tuvieron un injerto medio de 28 ± 13 %. Todos los ratones padecieron EICH entre 3 y 6 semanas después del injerto.
[0089] A continuación, dos grupos de células madre CD34+ se purificaron de dos recogidas de sangre de cordón umbilical canino diferentes. Las células madre CD34+ caninas se purificaron utilizando un anticuerpo CD34+ anticanino marcado con biotina, junto con un kit de clasificación de células magnéticamente marcadas (MACS) que reconoce de manera específica el anticuerpo marcado con biotina. Debido a la cantidad pequeña de la sangre de cordón obtenida de un cachorro, es imposible purificar células madre de un donante único. Dos lotes de células CD34+ purificadas de donantes mixtos se purificaron con recuentos celulares de 2,65 x 105 y 2,2 x 105 y purezas celulares de 74 y 77 %, respectivamente. A continuación, 50.000 células CD34+ caninas aisladas de la sangre de cordón umbilical se injertaron en cinco cachorros NSG de 48 horas de edad irradiados con 150 RAD. Su estatus del injerto se verificó a las 8 semanas. Basándose en la experiencia con ratones humanizados, se pronosticó que los ratones se someterían al injerto de manera óptima a las 12 semanas. 12 semanas después del injerto, los 5 ratones tenían niveles medios de células CD45+ de 58 ± 6 %. A continuación, los ratones caninizados (CnMice) se infectaron con 50 L3 de JYD Di aproximadamente una semana después (Día 0) en combinación con una infección en ratones NSG. Los ratones se sometieron a necropsia entre los Días 40 y 42 después de la infección. Se concluyó que no hubo diferencia en la supervivencia y el crecimiento de parásitos en los ratones CnMice frente a los ratones NSG. La Figura 21 es un gráfico que muestra las longitudes de Di recuperados entre los Días 40 y 42 en los ratones caninos, y la Tabla 25 expone los datos de supervivencia y los datos recuperación (Días 40- 42). No hubo diferencia en la supervivencia y el crecimiento de parásitos en los ratones CnMice frente a los ratones NSG.
T l 2 . D ^ r m n r r i n Di r r n nMi nr l N inf n Di FR .
[0090] Debido a los números bajos de células madre CD34+ que están disponibles en la sangre de cordón, se intentó aislar las células madre de la médula ósea recogida de cachorros recién nacidos. Las células madre CD34+ se aislaron
de la médula ósea utilizando un procedimiento similar al del protocolo de aislamiento de la sangre del cordón. Utilizando la médula ósea de tres perros donantes mixtos y después de microesferas MACS y aislamiento en columna, se consiguió aislar 4,4 x 105 de células CD34+. Estas células se injertaron a 7 ratones NSG. 12 semanas después del injerto los ratones tenían niveles de células CD45+ caninas de 21 ± 19 % de la población de linfocitos/granulocitos totales.
[0091] A continuación, CnMice con procedencia de células CD34+ de la médula ósea se infectaron con 100 JYD L3 Di. Estos ratones se sometieron a necropsia entre los Días 40 y 42 después de la infección. Los datos de recuperación se muestran en la Tabla 26. No se observó ninguna diferencia importante entre los dos grupos. La ausencia de diferencia importante en las recuperaciones de parásitos entre los controles y cualquier modelo CnMouse sugiere que son modelos viables para empezar a entender la relación entre el sistema inmune canino y el desarrollo de D. immitis.
T l 2 . D l r m n r r i n Di r nMi r n nr l N inf n Di FR .
Ejemplo 4 - Desarrollo y Validación de un Modelo in Vivo de Infección por Nematodo Gastrointestinal
[0092] Haemonchus contortus es un gusano gastrointestinal que afecta principalmente a ovejas y cabras, y también a ganado. Estos gusanos no afectan a perros y gatos. La enfermedad causada por los gusanos Haemonchus se denomina haemonchosis. Los gusanos Haemonchus tienen un ciclo de vida directo (no existen huéspedes intermedios implicados). Las hembras adultas ponen huevos en el estómago del huésped que se desprenden con las heces. Cuando se encuentren en el ambiente, los huevos liberan la larva L1 que completa el desarrollo hasta la larva L3 infecciosa en aproximadamente 4 hasta 7 días. El ganado se vuelve infectado después de ingerir a las larvas infecciosas. Estas larvas entran en la fosa de las glándulas gástricas y se alimentan de sangre que sale de las lesiones que ellos causan al revestimiento de estómago. Más adelante, completan el desarrollo hasta gusanos adultos y las hembras empieza a producir huevos.
[0093] En un experimento piloto, los ratones se infectaron o con 500 o 1.000 larvas de H. contortus. Adicionalmente, algunos de los ratones se inmunocomprometieron adicionalmente mediante el tratamiento con el acetato de metilprednisolona esteroide. Después de la infección, los ratones mostraron una caída de peso de 10-20%, y, a continuación, o volvieron a ganar o permanecieron con el mismo peso a lo largo del resto del experimento. Los ratones se sometieron a necropsia de manera periódica durante 8 semanas, en búsqueda de gusanos adultos en el estómago y huevos en los contenidos intestinales. Se descubrió que las larvas H. contortus se desarrollan hasta adultos que contienen sangre en sus intestinos. De manera importante, los huevos se observaron en los contenidos intestinales 28 días después de la infección. El tratamiento con esteroides para comprometer adicionalmente la respuesta inmune
no aumento las recuperaciones de gusanos.
[0094] Los ratones NSG se trataron previamente con acetato de metilprednisolona (MPA) una semana antes de la infección. L3 de H. contortus se limpiaron tanto con agar y/o como se limpiaron con el medio de NCTC/IMDM (NI) con antibióticos. Se administraron 500 y 1000 L3 para ratones de control y tratados con MPA mediante la sonda gástrica oral. Durante la administración, los ratones se pesaron y se les asignó una puntuación de salud general. Los ratones se examinaron cada dos semanas para la puntuación de salud y se pesaron una vez a la semana durante la administración de MPA (inyecciones de MPA son semanales). En total se infectaron cuarenta ratones: 20 con MPA y 20 con controles, con 10 en cada grupo para las dosis de 500 y 1000.
[0095] El día antes de la necropsia, los ratones se pusieron en ayunas. A continuación, se extrajeron los estómagos y los intestinos delgados. El estómago se abrió y se colgó en un cono de 40 ml de PBS. Los intestinos delgados se abrieron y se colgaron alrededor de un clip de papel en un cono de 50 ml de PBS. A continuación, los tejidos se incubaron a 50°C durante 2,5 horas, después de lo cual los tejidos se desecharon. Los tubos se agitaron y se vertieron a través de un tamiz con malla de 200 μm y se enjuagaron. Se recogieron los gusanos mediante el lavado a contracorriente del tamiz y se contaron. Los gusanos se fijaron con seguridad con glicerol/alcohol para su medición.
[0096] La recuperación de H. contortus representa 500 y 1000 infecciones iniciales que se muestran en las Tablas 27 y 28, respectivamente, y en las La FiguraS 22 y 23, respectivamente. «Recuperación» hace referencia al número de gusanos Hc recuperados de un ratón. Los huevos recogidos del contenido fecal entre los Días 23-31 después de la infección (día 28 después de la infección) en cuatro de los ratones infectados se muestran en la Tabla 29.
Tabla 27. Recuentos de recu eración de Hc de los ratones con infección inicial de 500 Hc L3.
Tabla 28. Recuentos de recu eración de Hc de los ratones con infección inicial de 1000 Hc L3.
Tabla 29. Huevos encontrados durante la semana cuatro en cuatro ratones infectados con cualquiera de los dos de 500 o 1000 Hc L3.
[0097] Los ratones se controlaron cada dos semanas durante el periodo de infección mediante un examen de salud visual y siempre se puntuó 0 según la evaluación de salud (puntuación 8 es un indicador de eutanasia). Los ratones se pesaron cada semana para controlar la pérdida de peso excesiva (los datos no se muestran).
[0098] En un segundo experimento, 43 ratones NSG se infectaron con 1000 L3 tal como se describe anteriormente. Los recuentos de recuperación de H. contortus durante diferentes puntos de tiempo se muestran en la Tabla 30. Los huevos se recuperaron de los ratones 26 días después de la infección y se incubaron a 26°C durante 18 días. Se recuperaron veinte larvas L1.
Tabla 30. Recuentos de recu eración de Hc de los ratones con infección inicial de 1000 Hc L3.
[0099] Strongyloides stercoralis (lombriz intestinal) es una ascáride parasitario patógeno humano que provoca la enfermedad de estrongiloidiasis. La etapa de parásitos adultos habita en túneles de la mucosa del intestino delgado. Se ha informado de S. stercoralis en otros mamíferos, que incluyen a gatos y perros. S. stercoralis infecta a aproximadamente 100 milliones de personas. Su capacidad de auntoinfección en el huésped le ayuda a permanecer durante décadas no detectado y desarrollarse hasta una hiperinfección potencialmente fatal que a menudo se induce mediante el tratamiento con glucocorticoides. El modelo de ratón descrito en el presente documento recapitula todas las formas de estrongiloidiasis humana. El tratamiento con acetato de metilprednisolona (MPA), un glucocorticoide sintético, induce hiperinfección en ratones NSG.
[0100] Los ratones NSG infectados mediante inyección subcutánea con 5000 larvas L3 de S. stercoralis, o con o sin MPA. Los ratones se trataron con 2,5 mg/kg de EMO o 3 mg/kg de IVM, los días 1, 15 y 30 después de la infección. Se contaron los gusanos adultos, larvas L1 o larvas L3 en los ratones 6 semanas después de la infección. Tal como se muestra en las Tablas 31 y 32, EMO e IVM controlaron claramente la infección intestinal, eliminando a los gusanos adultos y larvas L1, respectivamente, en modelos tanto con infección normal, crónica (control) como hiperinfección
(MPA). Tal como se muestran en la Tabla 33, EVO e IVM redujeron las L3 en circulación en los modelos tanto con infección normal, crónica (control) como hiperinfección (MPA), pero todavía se quedaban algunas L3 en circulación en el cuerpo.
Tabla 31. Recuentos de recu eración de S. stereoralis adultos en ratones 6 semanas des ués de la infección.
Tabla 32. Recuentos de recu eración de L1 de S. stereoralis en ratones^ 6 semanas des ués de la infección.
Tabla 33. Recuentos de recu eración de L3 de S. stereoralis en ratones 6 semanas des ués de la infección.
Claims (14)
1. Procedimiento de determinación de la eficacia de un compuesto o una combinación de compuestos para el tratamiento o la prevención de una infección por gusanos parasitarios, que comprende:
(a) infectar a un roedor inmunocomprometido con un número específico de larvas de gusanos parasitarios; (b) tratar el roedor infectado con el compuesto o la combinación de compuestos de prueba; y
(c) realizar una necropsia al roedor y determinar el número de gusanos parasitarios, opcionalmente gusanos parasitarios adultos, presentes en un tejido de roedor;
en el que el roedor es un ratón knockout para la cadena gamma del receptor de IL2 NOD scid (NSG) (NOD-SCID-IL2Ry -/-) o un ratón inmunodeficiente NRG (NOD-Rag1nullIL2rgnuN); y en el que el gusano parasitario es un nematodo y el gusano parasitario es Dirofilaria immitis, Strongyloides stercoralis o Haemonchus contortus.
2. Procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además:
(d) infectar a un roedor inmunocomprometido de control con un número específico de larvas de gusanos parasitarios; (e) realizar una necropsia al roedor inmunocomprometido de control y determinar el número de gusanos, opcionalmente gusanos parasitarios adultos, presentes en un tejido de roedor; y
(f) comparar el número de gusanos en el tejido de roedor de la etapa (c) con el número de gusanos en el tejido de roedor de la etapa (e).
3. Procedimiento de determinación de gusanos parasitarios en una o más muestras de tejido asiladas de un roedor inmunocomprometido, preferiblemente un roedor inmunocomprometido necropsiado, infectado con un número específico de larvas de gusanos parasitarios y tratado con un compuesto o una combinación de compuestos de prueba, en el que el procedimiento comprende la determinación del número de gusanos parasitarios, opcionalmente gusanos parasitarios adultos, presentes en la muestra o muestras de tejido aisladas; en el que el gusano parasitario es un nematodo y el gusano parasitario es Dirofilaria immitis, Strongyloides stercoralis o Haemonchus contortus y en el que el roedor es un ratón knockout para la cadena gamma del receptor de IL2 NOD scid (NSG) (NOD-SCID-IL2Ry -/-) o un ratón inmunodeficiente NRG (NOD-Rag1nullIL2rgnuN).
4. Procedimiento de la reivindicación 3, que comprende además la determinación del número de gusanos parasitarios en una o más muestras de tejido aisladas de un roedor inmunocomprometido no tratado, preferiblemente un roedor inmunocomprometido necropsiado, infectado con un número específico de larvas de gusanos parasitarios, en el que el procedimiento comprende la determinación del número de gusanos parasitarios, opcionalmente gusanos parasitarios adultos, presentes en la muestra o muestras de tejido aisladas del roedor inmunocomprometido no tratado, y la comparación del número de gusanos parasitarios presentes en la muestra o muestras de tejido aisladas del roedor inmunocomprometido no tratado con el número de gusanos parasitarios presentes en la muestra o muestras de tejido aisladas del roedor inmunocomprometido tratado.
5. Procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que las larvas de gusanos parasitarios se seleccionan entre el grupo que consiste en microfilarias, larvas L3 y larvas L4.
6. Procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el roedor inmunocomprometido no comprende células inmunes injertadas de una especie diferente.
7. Procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el roedor inmunocomprometido comprende células inmunes injertadas de un huésped definitivo del gusano parasitario, opcionalmente, en el que las células inmunes injertadas son células inmunes caninas.
8. Procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 que comprende además la comparación de la eficacia parasiticida del compuesto o la combinación de compuestos con la eficacia parasiticida de cada uno de los dos o ambos de un compuesto parasiticida de lactona macrocíclica (LM), preferiblemente, en el que el compuesto de LM se selecciona entre avermectina, ivermectina, doramectina, abamectina, milbemicina y moxidectina y/o un compuesto parasiticida de depsipéptido, preferiblemente en el que el compuesto parasiticida de depsipéptido es emodepsida.
9. Procedimiento de la reivindicación 1 o 3, en el que el roedor inmunocomprometido es un ratón NSG o NRG, y en el que el gusano parasitario es Dirofilaria immitis; o en el que el roedor inmunocomprometido es un ratón NSG o NRG injertado con células inmunes caninas, y en el que el gusano parasitario es Dirofilaria immitis.
10. Uno o más compuestos filaricidas identificados mediante el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 seleccionados entre el grupo que consiste en
para ser utilizado en un procedimiento de tratamiento de filariasis en un sujeto que lo necesita, en el que la filariasis es dirofilariasis.
11. Roedor inmunocomprometido infectado con uno o más gusanos parasitarios adultos,
en el que el gusano parasitario es un nematodo y en el que el gusano parasitario es Dirofilaria immitis, Strongyloides stercoralis o Haemonchus contortus
y el roedor es un ratón knockout para la cadena gamma del receptor de IL2 NOD scid (NSG) (NOD-SCID-IL2Ry -/-) o un ratón inmunodeficiente NRG (NOD-Rag1nullIL2rgnuN).
12. Ratón inmunocomprometido de la reivindicación 11, en el que el roedor inmunocomprometido es un ratón NSG o un ratón NRG, y en el que el gusano parasitario es Dirofilaria immitis; o
el roedor inmunocomprometido es un ratón NSG o un ratón NRG que comprende células inmunes caninas injertadas, y en el que el gusano parasitario es Dirofilaria immitis.
13. Uso de un roedor inmunocomprometido de la reivindicación 11 o 12 para el modelado de la infección completa de un gusano parasitario fuera del huésped definitivo del gusano o para la caracterización de cambios en la sensibilidad de un agente parasiticida o filaricida durante una infección por gusanos parasitarios o filáricos.
14. Uso de un roedor inmunocomprometido para el modelado de la infección completa de un gusano parasitario fuera del huésped definitivo del gusano, en el que:
el roedor es un ratón knockout para la cadena gamma del receptor de IL2 NOD scid (NSG) (NOD-SCID-IL2Ry -/-) o un ratón inmunodeficiente NRG (NOD-Rag1nullIL2rgnuN) y el gusano parasitario es un nematodo y el gusano parasitario es Dirofilaria immitis, Strongyloides stercoralis o Haemonchus contortus.
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