ES2955819T3 - Linfocitos T modificados para inmunoterapia adoptiva - Google Patents

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Abstract

La presente invención se refiere a una población de células T con expresión reducida de SIGLEC15, en la que las células T derivan de ganglios linfáticos centinela en un sujeto que tiene cáncer. La invención también se refiere a métodos para obtener dichas células T, así como a su uso en terapia y a composiciones farmacéuticas que comprenden dichas células T. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Linfocitos T modificados para inmunoterapia adoptiva
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo del tratamiento terapéutico. En particular, se refiere a la terapia contra el cáncer basada en la administración de células autólogas a un paciente que lo necesite, a células útiles en dicha terapia y a métodos para preparar dichas células.
Antecedentes
La inmunoterapia adoptiva, usando linfocitos autólogos expandidos in vitro aislados de un ganglio linfático centinela de drenaje tumoral se conoce en la técnica (1). La inmunoterapia adoptiva, incluyendo la recogida y expansión de linfocitos reactivos a tumores autólogos con retransfusión al paciente, también se ha explorado en el melanoma maligno (2).
El documento WO2018/234516 enseña un método para expandir linfocitos T antitumorales, junto con una partícula fagocitable, que tienen una o más construcciones neoantigénicas tumorales asociados estrechamente a los mismos. La terapia de transferencia adoptiva de linfocitos T, en la que se infunden linfocitos T autólogos o alógenos en pacientes con cáncer, ha mostrado una promesa considerable en los últimos años (3).
Los siglecs son receptores de superficie celular de vertebrados que reconocen glucanos sialilados. SIGLEC15 es una proteína transmembrana de tipo I que consiste en: (i) dos dominios similares a inmunoglobulina (Ig), (ii) un dominio transmembrana que contiene un resto de lisina y (iii) una cola citoplasmática corta. SIGLEC15 se expresa en macrófagos y/o células dendríticas de bazo y ganglios linfáticos humanos (4). La expresión de ARN mensajero de SIGLEC15 es mínima en la mayoría de los tejidos humanos normales y en diversos subconjuntos de células inmunitarias, pero puede encontrarse en macrófagos, la mayoría en macrófagos M2 (4). SIGLEC15 no sólo puede regular la diferenciación de osteoclastos, pero también suprime las respuestas de los linfocitos T (5).
Se ha sugerido en el documento US2019/202912 usar anticuerpos que se unen a SIGLEC15 en la terapia contra el cáncer.
Sumario de la invención
Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que la regulación negativa de SIGLEC15 en linfocitos T derivados de ganglios linfáticos centinela puede mitigar el compromiso inmunitario generado por factores inmunosupresores derivados del cáncer, mitigando de este modo la capacidad del tumor para invadir y hacer metástasis.
Por lo tanto, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método para obtener una población de linfocitos T que tiene una expresión reducida de SIGLEC15, que comprende
S1'. Proporcionar un linfocito T que contiene tejido de ganglio linfático extirpado de un sujeto, obteniéndose dicho tejido de ganglio linfático de un ganglio linfático identificado como un ganglio linfático que drena fluido linfático de un tumor canceroso en dicho sujeto;
52. Extraer células del ganglio linfático identificado;
53. Reducir la expresión de SIGLEC15 en las células extraídas; y
54. Expandir las células extraídas con expresión reducida de SIGLEC15 en condiciones que favorezcan la expansión de linfocitos T.
La expresión de SIGLEC15 se reduce mediante regulación negativa de la expresión de un gen que codifica SIGLEC15 mediante transfección de ARNpi, transfección de ARNhc o edición génica mediada por CRISPR.
En algunas realizaciones, la expresión de SIGLEC15 se reduce mediante regulación negativa de la expresión de un gen que codifica SIGLEC15 mediante transfección de ARNpi usando una molécula de ARNpi que tiene una secuencia de nucleótidos de acuerdo con SEQ, ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6.
En algunas realizaciones, las condiciones que favorecen la expansión de linfocitos T comprenden el mantenimiento de los linfocitos en presencia de interleucina-2.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una población de linfocitos T con expresión reducida de SIGLEC15 obtenible mediante el método de acuerdo con la invención para su uso en medicina.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una población de linfocitos T de acuerdo con la invención para su uso en un método para el tratamiento de un cáncer.
En algunas realizaciones, el cáncer es un tumor sólido.
En algunas realizaciones, el cáncer es el tumor canceroso del sujeto a partir del que se originan los linfocitos T, o una metástasis del mismo.
En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona del grupo de cáncer colorrectal, melanoma maligno, carcinoma de cuello uterino, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (CCECC), cáncer de pulmón no microcítico (CPNM).
También se desvela el uso de una población de linfocitos T de acuerdo con la invención en la preparación de una composición farmacéutica para su uso en un método de tratamiento de acuerdo con la invención.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende una población de linfocitos T de acuerdo con la invención y, opcionalmente, excipientes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1: Un diagrama de flujo que ilustra un método para obtener una población de linfocitos T de acuerdo con la presente invención.
Figura 2: Un diagrama de flujo que ilustra un método de tratamiento de acuerdo con la presente invención.
Figura 3: A: Expresión relativa de SIGLEC15 en ganglios linfáticos centinela y no centinela, respectivamente.
B: Expresión relativa de SIGLEC15 en ganglios linfáticos centinela antes y después de la atenuación de ARNpi Figura 4: Expresión proteica de SIGLEC15 en diferentes tipos celulares. A: Comparación entre ganglios linfáticos centinela (SN, del inglés Sentinel Nodes) y ganglios linfáticos no centinela (NSN, del inglés Non-Sentinel Nodes) en todos los tipos celulares; B: Comparación entre tipos celulares para ganglios linfáticos centinela (SN).
Figura 5: Liberación de citocinas funcionales de linfocitos T después de la atenuación de SIGLEC15.
Descripción detallada de la invención
Los ganglios linfáticos que drenan el tumor primario son esenciales para el inicio de una respuesta inmunitaria antitumoral de linfocitos T eficaz. Sin embargo, los factores inmunosupresores derivados del cáncer hacen que los ganglios linfáticos centinela (SN) estén inmunocomprometidos, permitiendo que los tumores invadan y hagan metástasis.
Los presentes inventores han estudiado diferentes mecanismos subyacentes a este escape inmunitario para idear estrategias de intervención terapéutica para detener la propagación tumoral en fases clínicas precoces. Por lo tanto, la presente invención se basa en la comprensión de las regulaciones del microambiente sobre el nivel de transcripción en los ganglios linfáticos de los pacientes con cáncer, tales como los pacientes con cáncer colorrectal.
Varias citocinas limitan el crecimiento de las células tumorales mediante una actividad antiproliferativa o proapoptótica directa, o indirectamente mediante la estimulación de la actividad citotóxica de las células inmunitarias contra las células tumorales. La interleucina-2 (IL-2) 2 se considera una citocina clave para promover la expansión de los linfocitos citolíticos naturales (NK) y los linfocitos T. Los linfocitos NK y los linfocitos T son los subconjuntos de linfocitos primarios que destruyen los tumores. El factor de necrosis tumoral a (TNF-a) se considera principalmente un mediador de las respuestas inmunitarias antitumorales. El interferón y (IFN-y) es una molécula pleiotrópica con mecanismos antiproliferativos, proapoptóticos y antitumorales asociados. La liberación de IFN-y es, por ejemplo, un indicador de potencia clave en la evaluación de la calidad del producto de linfocitos T-CAR tisagenlecleucel (6).
Se ha descubierto que los linfocitos T que se han aislado de ganglios linfáticos de drenaje tumoral y se han tratado para reducir la expresión de SIGLEC15 tienen un efecto antitumoral mejorado, según se evaluó mediante el perfil de liberación de las citocinas efectoras analizadas anteriormente. Como se desvela en la sección experimental a continuación, los linfocitos T con expresión reducida de SIGLEC15 muestran una liberación aumentada de las citocinas IL-2, TNF-a e IFN-y.
En consecuencia, la presente invención se refiere en parte al uso de linfocitos T autólogos que se han tratado para reducir la expresión de SIGLEC15 en la terapia contra el cáncer, y a métodos de tratamiento correspondientes. La invención también se refiere a métodos para preparar y obtener dichos linfocitos T, a linfocitos T obtenidos u obtenibles mediante dichos métodos, y a composiciones farmacéuticas que comprenden dichos linfocitos T.
Por lo tanto, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método que no implica ninguna etapa quirúrgica realizada en un cuerpo humano o animal, dicho método para obtener una población de linfocitos T que tienen una expresión reducida de SIGLEC15, comprende
S1'. Proporcionar un linfocito T que contiene tejido de ganglio linfático extirpado de un sujeto, obteniéndose dicho tejido de ganglio linfático de un ganglio linfático identificado como un ganglio linfático que drena fluido linfático de un tumor canceroso en dicho sujeto;
52. Extraer células del ganglio linfático identificado;
53. Reducir la expresión de SIGLEC15 en las células extraídas; y
54. Expandir las células extraídas con expresión reducida de SIGLEC15 en condiciones que favorezcan la expansión de linfocitos T.
El método anterior se ilustra esquemáticamente en la Figura 1.
La identificación de un ganglio linfático como un ganglio linfático que drena fluido linfático de un tumor canceroso puede realizarse como se sabe en la técnica, por ejemplo, como describen Dahl y colaboradores (7). En resumen, se inyecta un colorante detectable y fisiológicamente aceptable en o alrededor del tumor. El fluido linfático transporta el colorante del sitio de la inyección a un ganglio linfático de drenaje que, por lo tanto, se tiñe con el colorante y se identifica como un ganglio linfático de drenaje. Son colorantes de ejemplo azul patente, azul Evans y el colorante Alexa Fluor® 488.
La extracción de células del ganglio linfático identificado como un ganglio linfático de drenaje puede realizarse de diversas maneras. Puede extirparse todo el ganglio linfático del paciente mediante escisión. También es posible obtener sólo un trozo de tejido de ganglio linfático, por ejemplo, a través de una biopsia. Las células extraídas del tejido de ganglio linfático pueden convertirse en una suspensión de células individuales como se sabe en la técnica (8).
Entonces, la expresión de SIGLEC15 en las células extraídas se reduce.
En algunas realizaciones, la expresión de SIGLEC15 se reduce mediante regulación negativa de la expresión de un gen que codifica SIGLEC15 mediante transfección de ARNpi. Resumiendo, puede realizarse la transfección de células individuales de ganglios linfáticos con ARNpi. Puede transfectarse ARNpi 1 μmol/l en una placa de cultivo tisular de 96 pocillos con medios de suministro de ARNpi Accell (GE Dharmacon) durante 72 horas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Normalmente se usa RT-PCR para evaluar la expresión de ARNm de SIGLEC15 en los grupos transfectados y no transfectados con ARNpi. En la técnica se conocen bien otros protocolos (9) y no se describirán en detalle en el presente documento. También hay disponibles en el marcado protocolos y reactivos para regular negativamente la expresión de un gen específico mediante ARNpi en varias compañías, incluyendo, sin perjuicio, ThermoFisher Scientific, Sigma-Aldrich, Qiagen y GE Dharmacon.
En algunas realizaciones, la expresión de SIGLEC15 se reduce mediante la regulación negativa de la expresión de un gen que codifica SIGLEC15 mediante transfección de ARN de horquilla corta (ARNhc). En la técnica se conocen bien dichos protocolos (10) y no se describirán en detalle en el presente documento. En resumen, pueden transfectarse vectores pGPU6 que portan ARNhc de SIGLEC15 en células individuales de ganglios linfáticos obtenidas como se ha indicado anteriormente usando un kit de transfección, por ejemplo, de Shanghai GenePharma Company (Shanghai, China), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de cuarenta y ocho horas de incubación, la atenuación de la expresión de d SIGLEC15 se confirma mediante RT-PCR. También hay disponibles en el marcado otros protocolos así como reactivos para regular negativamente la expresión de un gen específico mediante ARNhc en varias compañías, incluyendo, sin perjuicio, ThermoFisher Scientific y Sigma-Aldrich.
En algunas realizaciones, la expresión de SIGLEC15 se reduce mediante regulación negativa de la expresión de un gen que codifica SIGLEC15 mediante edición génica mediada por CRISPR. Se construyen vectores CRISPR/Cas9 para el direccionamiento a los sitios y regiones específicos seleccionados dentro del gen SIGLEC15. Se diseñan ARNgu usando CRISPRdirect (http://crispr.dbcls.jp/). Los oligómeros de ARNgu se sintetizan y clonan en el vector pU6gRNACas9EGFP. Las células individuales de ganglios linfáticos se siembran en primer lugar en placas de 6 pocillos y después se transfectan usando Lipofectamine 2000 (ThermoFisher Scientific) siguiendo las instrucciones del fabricante. Después de incubar las células durante 48 horas más, la inactivación de la expresión de SIGLEC15 se confirmó mediante RT-PCR y citometría de flujo.
Después de haber reducido la expresión de SIGLEC15, las células extraídas se cultivan ex-vivo en condiciones que favorecen la expansión de linfocitos T. Dichos protocolos y reactivos para los mismos se conocen en sí, y están disponibles, entre otros, con los nombres comerciales Gibco™ CTS™ OpTmizer™, medio CTS AIM V y CTS Immune Cell SR (ThermoFisher Scientific), y en Stem Cell Technologies Inc. (Cambridge, MA, EE.UU.) como se desvela en el Boletín técnico n.° 27143). También se desvelan protocolos para la expansión de los linfocitos T en el documento WO2018234516 y la solicitud de patente china CN108220234.
En general, se resuspenden suspensiones de células individuales con expresión reducida de SIGLEC15 en un medio de cultivo celular sin suero en presencia de interleucina-2 y/u otras citocinas, y se transfieren a un recipiente de crecimiento, tal como un matraz o una placa. Después, las células se expanden en una atmósfera rica en CO2 al 5 % a 37 °C y son reestimuladas por los antígenos tumorales junto con células presentadoras de antígenos durante los cultivos celulares.
El siguiente protocolo (8) se proporciona como un posible protocolo. Se resuspenden suspensiones de células individuales obtenidas de SLN (ganglios linfáticos centinela, por sus siglas en inglés) en medio de cultivo celular sin suero X-VIVO™ 15 (LONZA) a una densidad de 4 x 106 células/ml en presencia de 1000 UI/ml de interleucina-2 humana recombinante (Shuanglu, China). Estas células se siembran en matraces o placas y se mantienen en una atmósfera humidificada que contiene CO2 al 5 % a 37 °C. El lisado de tumor autólogo se añade al cultivo inicial a una dilución de 1/100 (v/v) como se ha descrito anteriormente (1). Para inducir células T-SLN altamente específicas de tumores, la reestimulación se realiza añadiendo lisado de tumor autólogo junto con CMSP autólogas irradiadas durante los cultivos de células T-SLN. Una semana antes de la transfusión, se retiran 5 ml de medio de cultivo para un ensayo de contaminación bacteriana y fúngica usando BACTEC 9120 (Becton-Dickinson), y se miden los niveles de endotoxinas basándose en la reacción de Limulus. El día de la transfusión, estos ensayos se repiten para detectar cualquier contaminación bacteriana, fúngica o por endotoxinas. Se analizan los subconjuntos de linfocitos de las células T-SLN.
Además, se usaron 1 x 106 células para el análisis por citometría de flujo de la molécula de adhesión de células epiteliales marcadoras de superficie tumoral (EpCAM) para excluir la presencia de células tumorales.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una población de linfocitos T con expresión reducida de SIGLEC15 obtenida u obtenible mediante el método de acuerdo con los aspectos anteriores.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una población de linfocitos T con expresión reducida de SIGLEC15 obtenida u obtenible mediante el método de acuerdo con la invención para su uso en medicina.
En una realización de este aspecto, la invención se refiere a una población de linfocitos T con expresión reducida de SIGLEC15 obtenida u obtenible mediante el método de acuerdo con los aspectos anteriores para su uso en el tratamiento del cáncer, tal como el tratamiento de tumores sólidos.
En una realización, la invención se refiere al uso de linfocitos T autólogos en un método para el tratamiento de un tumor canceroso. De acuerdo con la presente realización, puede usarse una población de linfocitos T obtenida u obtenible mediante un método de acuerdo con los aspectos anteriores en el tratamiento del tumor canceroso ubicado en la proximidad del ganglio linfático identificado como un ganglio linfático de drenaje tumoral de acuerdo con los métodos analizados anteriormente, en el sujeto del que se obtiene el ganglio linfático de drenaje tumoral.
El tumor canceroso puede ser cualquier forma de cáncer sólido. Un cáncer sólido de acuerdo con la presente invención es una masa anómala de tejido que se origina en un órgano. Un cáncer sólido por lo general no contiene quistes ni áreas líquidas. El cáncer sólido puede ser maligno. Los diferentes tipos de cánceres sólidos se nombran por el tipo de células que los forman. Los tipos de cáncer sólido incluyen sarcomas, carcinomas y linfomas. La presente invención proporciona una composición que comprende linfocitos T obtenidos u obtenibles mediante el método de la invención.
Los ejemplos de cánceres sólidos incluyen cáncer suprarrenal, cáncer anal, linfoma anaplásico de células grandes, linfoma angioinmunoblástico de linfocitos T, linfoma de linfocitos B, cáncer de las vías biliares, cáncer de vejiga urinaria, tumores cerebrales/del SNC, cáncer de mama, cáncer de cuello uterino, cáncer de colon, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, familia de tumores de Ewing, cáncer de ojo, cáncer de vesícula biliar, tumores carcinoides gastrointestinales, tumor del estroma gastrointestinal (GIST, del inglés gastrointestinal stromal tumor), enfermedad trofoblástica gestacional, linfoma hepatoesplénico de linfocitos T, linfoma de Hodgkin, linfoma intravascular de lifoncitos B grandes, cáncer de riñón, cáncer de laringe e hipofaringe, cáncer de hígado, cáncer de pulmón (no microcítico y microcítico), tumor carcinoide de pulmón, granulomatosis linfomatoide, mesotelioma maligno, cáncer de la cavidad nasal y del seno paranasal, cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma, linfoma de linfocitos B de la zona marginal ganglionar, linfoma no Hodgkin, cáncer de cavidad oral y orofaríngeo, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de pene, tumores de hipófisis, linfoma de efusión primaria, cáncer de próstata, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de glándulas salivales, sarcoma, cáncer de piel (células basales y escamosas, melanoma y células de Merkel), cáncer del intestino delgado, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer de timo, cáncer de tiroides, sarcoma uterino, cáncer de vagina, cáncer de vulva, macroglobulinemia de Waldenstrom y tumor de Wilms. Los linfocitos T de la invención son especialmente eficaces en el tratamiento de cánceres sólidos. De esta manera, el sujeto que ha de tratarse con el método terapéutico de la invención puede tener un cáncer sólido. Los linfocitos T de la invención son particularmente eficaces en el tratamiento de cánceres sólidos seleccionados del grupo que consiste en: cáncer anal, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de mama, cáncer de cuello uterino, cáncer de colon, cáncer de hígado, cáncer de pulmón (no microcítico y microcítico), tumor carcinoide pulmonar, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de pene, cáncer de próstata, cáncer de estómago, cáncer testicular, sarcoma uterino, cáncer de vagina, cáncer de vulva, e incluso más especialmente para el tratamiento del cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de hígado, cáncer de pulmón (no microcítico y microcítico), tumor carcinoide pulmonar, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de ovario y cáncer de vejiga urinaria.
En una realización, el cáncer se selecciona del grupo de cáncer colorrectal, melanoma maligno, carcinoma de cuello uterino, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (CCECC), cáncer de pulmón no microcítico (CPNM). En el presente documento también se desvela un método, que no forma parte de la invención reivindicada, de tratamiento de un tumor canceroso en un sujeto, comprendiendo dicho método
51. Identificar un ganglio linfático que drena fluido linfático del tumor canceroso de dicho sujeto;
52. Extraer células del ganglio linfático identificado;
53. Reducir la expresión de SIGLEC15 en las células extraídas;
54. Expandir las células extraídas con expresión reducida de SIGLEC15 en condiciones que favorezcan la expansión de linfocitos T; y
55. Administrar los linfocitos T expandidos con expresión reducida de SIGLEC15.
La etapa S1 puede cambiarse por la etapa S1' como se ha analizado anteriormente.
El método de tratamiento de acuerdo con la divulgación se ilustra esquemáticamente en la Figura 2.
Las etapas S1, S2, S3 y S4 pueden realizarse como se ha descrito anteriormente.
La administración de los linfocitos T expandidos puede realizarse mediante administración intravenosa como se sabe en la técnica (11). La administración también puede ser intraarterial, intratecal o intraperitoneal.
El siguiente protocolo (8) se proporciona como un protocolo útil para la administración de linfocitos T. Las células T-SLN finales se recogen, se lavan dos veces en solución salina y se transfieren a una bolsa de plástico estéril que contiene 200 ml de solución salina y albúmina sérica humana al 1 % (CSL Behring GmbH, Alemania). Las células se transfunden por vía intravenosa durante un intervalo de 60 minutos de acuerdo con las directrices de transfusión de sangre del hospital. La toxicidad relacionada con la transfusión se evalúa después de la transfusión de células usando los Criterios de terminología común para eventos adversos (CTCAE, por sus siglas en inglés) 3.0.
En el presente documento también se desvela el uso de una población de linfocitos T obtenidos u obtenibles de acuerdo con los métodos descritos anteriormente en la fabricación de una composición farmacéutica. En una realización, la composición farmacéutica es para su uso en el tratamiento del cáncer, tal como el tratamiento de tumores sólidos.
La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende una población de linfocitos T obtenidos u obtenibles de acuerdo con los métodos descritos anteriormente. En una realización, la composición farmacéutica es para su uso en medicina como se ha descrito anteriormente, tal como en el tratamiento del cáncer, tal como el tratamiento de tumores sólidos.
Dichas composiciones farmacéuticas pueden comprender excipientes farmacéuticamente aceptables como es común en la técnica. Las composiciones farmacéuticas se formulan preferentemente en forma líquida adecuada para inyección, tal como administración intravenosa, intraarterial, intratecal o intraperitoneal.
Un "excipiente farmacéutico" o un "excipiente farmacéuticamente aceptable" es un vehículo, por lo general un líquido, en el que se formula un agente terapéutico activo. En una realización de la invención, el agente terapéutico activo es una población de linfocitos T obtenida u obtenible mediante los métodos de acuerdo con la invención. El excipiente generalmente no proporciona ninguna actividad farmacológica a la formulación, aunque puede proporcionar estabilidad química y/o biológica. Pueden encontrarse formulaciones de ejemplo, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, 19a ed., Grennaro, A., Ed., 1995.
Como se usa en el presente documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" o "excipiente" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción que sean fisiológicamente compatibles. En una realización, el vehículo es adecuado para la administración parenteral. Como alternativa, el vehículo debe ser adecuado para la administración intravenosa, intraperitoneal, intramuscular o sublingual. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En la técnica se conoce bien el uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas. Excepto en el caso de que cualquier agente o medio convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso del mismo en las composiciones farmacéuticas de la invención. También pueden incorporarse compuestos activos complementarios en las composiciones.
En la realización de la presente invención, el experto puede usar métodos y protocolos conocidos en la técnica, incluyendo, pero no exclusivamente, como se desvela en documentos de patentes y artículos científicos a los que se hace referencia en el presente documento, así como en referencias de dichos documentos.
Parte experimental
Análisis de expresión génica
Se identificaron ganglios linfáticos centinela y no centinela como se ha descrito anteriormente (7). En resumen, se inyectó un colorante linfotrópico (azul patente, Sigma-Aldrich) debajo de la serosa que rodea el tumor primario. Los ganglios linfáticos de drenaje tumoral, es decir, ganglios centinela, se tiñeron de color azul. Los ganglios linfáticos no teñidos se consideraron ganglios no centinela.
Se obtuvieron dos ganglios linfáticos, un ganglio linfático centinela (SN) no metastásico y un ganglio linfático no centinela (NSN), de cada uno de los veintitrés pacientes diagnosticados con cáncer colorrectal y se usaron para obtener los perfiles de expresión génica mediante tecnología de secuenciación de ARN de alto rendimiento y análisis bioinformático.
Se obtuvieron datos de expresión génica mediante la secuenciación de tejidos de ganglios linfáticos usando la técnica de RNA-SEQ de ilumina.
Se expresó diferencialmente un total de 16 genes, incluyendo 9 regulados positivamente y 7 regulados negativamente, en los ganglios linfáticos centinela en comparación con los ganglios linfáticos no centinela. Se encontró que IL1RL1, STON2, TPSAB1, GATA2, DNAJB4, n R2F1, y DIPK2A estaban regulados negativamente y se encontró que PLA2G2D, ZBED6CL, SIGLEC15, KCNC3, ATP2A1, MMP2-AS1, FBXO41, DSC2, y TFEC estaban regulados positivamente.
Validación a través de RT-PCR
El ARN total se extrajo de pares de SN y NSN de ocho pacientes seleccionados aleatoriamente de los 23 pacientes anteriores, usando el reactivo TRIzol siguiendo las instrucciones del fabricante. La síntesis de ADNc se realizó usando el kit de reactivos de RT PrimeScript™ con gDNA Eraser (Takara, Japón). Los cebadores de SIGLEC15 y el gen de referencia endógeno p-actina se diseñaron usando el software Primer5. Se usó TB Green® Premix Ex Taq™ II (Takara, Japón) para realizar la RT-qPCR siguiendo las instrucciones del fabricante. El análisis de la curva de fusión se realizó después de la PCR para confirmar la especificidad del cebador y el nivel relativo de SIGLEC15 se calculó usando el método 2-AACt (12). Expresión relativa de SIGLEC15 en ganglios linfáticos centinela antes y después de que se analizara la atenuación de ARNpi en tres ganglios linfáticos centinela. Los resultados se muestran en la Tabla 1 y 2 y en la Figura 3.
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Tabla 1: Expresión relativa de SIGLEC15 en ganglios linfáticos centinela y no centinela, respectivamente.
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Tabla 2: Expresión relativa de SIGLEC15 en ganglios linfáticos centinela antes y después de la atenuación de ARNpi. Hibridación in situ RNAscope
Para explorar adicionalmente el patrón de expresión de SIGLEC15 en ganglios linfáticos, los presentes inventores investigaron la expresión de SIGLEC15 y CD163 en pares de SN y NSN de cuatro pacientes usando la tecnología de hibridación in situ RNAscope (13), que puede proporcionar información sobre la expresión espacial de ARN en células tisulares. Los resultados se desvelan en la Tabla 3 y muestran que la expresión de ARNm es superior en los ganglios linfáticos centinela (p = 0,042, ensayo de t de Student).
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Tabla 3: ARNm de SIGLEC15 expresado analizado mediante RNAscope.
De acuerdo con los resultados de la doble tinción de SIGLEC15 y CD163 en los cortes de ganglios linfáticos centinela y no centinela, se puede confirmar además que SIGLEC15 se expresa altamente en SN en comparación con NSN. Además, el SIGLEC15 no solamente se expresó en macrófagos M2 sino también en otro tipo celular.
A partir de este resultado, se puede confirmar además que SIGLEC15 se expresa altamente en SN en comparación con NSN, SIGLEC15 no solamente se expresó en macrófagos M2 sino que también se expresó en otras células. Análisis por citometría de flujo
Los presentes inventores detectaron la expresión de la proteína SIGLEC15 en la superficie de diferentes subconjuntos de células mediante citometría de flujo.
Se obtuvieron suspensiones de células individuales de SN o NSN y tejido tumoral inmediatamente después de la cirugía aplicando una presión suave usando un homogeneizador de vidrio de ajuste holgado.
Para el análisis de SIGLEC15 de las células de SN o NSN, se usaron anticuerpos monoclonales (mAb) marcados con fluorescencia contra CD45, CD86, CD11c, CD163, CD11b, CD15, CD14, CD3, CD4, CD8, CD16, CD56, CD19 y SIGLEC15 (Biolegend). Se incubaron células en presencia de mAb de acuerdo con las recomendaciones del fabricante durante 20 min a temperatura ambiente (18-25 °C) y protegidas de la luz. Después de la incubación, las suspensiones celulares se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y los sedimentos celulares se resuspendieron en 0,5 ml de PBS para su análisis. Las muestras se analizaron adicionalmente usando un citómetro de flujo Navios (Beckman Coulter). Se recopilaron y analizaron al menos 50.000 eventos en total usando el software Flowjo (Flowjo LCC).
SIGLEC15 se expresó de forma relativamente alta en casi todos los subgrupos de ganglios linfáticos centinela (Figura 4A). Para los ganglios linfáticos centinela, SIGLEC15 se expresó de forma relativamente alta en macrófagos M2 (Figura 4B) y se observó la misma tendencia para los ganglios linfáticos no centinela (datos no mostrados).
Análisis de función de SIGLEC15
Para evaluar el papel de SIGLEC15 en los ganglios linfáticos centinela, los presentes inventores atenuaron la expresión de SIGLEC15 a través de tecnología de ARNpi en ganglios linfáticos centinela. Resumiendo, se realizó la transfección de células individuales de ganglios linfáticos con ARNpi de acuerdo con las instrucciones del fabricante (GE Dharmacon).
Para confirmar el efecto de inactivación, los presentes inventores sintetizaron un total de 3 secuencias de ARNpi. Los ARNpi se diseñaron de acuerdo con la secuencia de ARN del gen diana, (SIGLEC15), y usando el software de diseño de ARNpi (Invivogen, https://www.invivogen.com/sirnawizard/guidelines.php) siguiendo los principios de diseño de ARNpi.
Se diseñaron las siguientes secuencias de ARNpi (incluyendo las cadenas complementarias y el saliente 3'-TT para evitar la degradación por 3'-exonucleasas):
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Tabla 4: Secuencias de ARNpi
Se transfectó 1 μmol/l de ARNpi en una placa de cultivo tisular de 96 pocillos con medios de suministro de ARNpi Accell durante 72 horas. Se usó RT-PCR para evaluar la expresión de ARNm de SIGLEC15 en los grupos transfectados y no transfectados con ARNpi.
Se usó citometría de flujo para detectar la intensidad de fluorescencia media (IFM) de la proteína SIGLEC15 en la superficie de todas las células vivas en los ganglios linfáticos para evaluar el efecto de la interferencia del ARNpi sobre la reducción de la expresión de la proteína SIGLEC15. Los resultados se muestran en la Tabla 5.
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Tabla 5: Intensidad de fluorescencia media (IFM) de la expresión de SIGLEC15 en células vivas de ganglios linfáticos
Los datos de citometría de flujo demostraron que las citocinas funcionales antitumorales liberadas por los linfocitos T, tales como IL-2, TNFα e IFNy en las células de ganglios linfáticos centinela se regularon positivamente después de la atenuación de SIGLEC15. (Tabla 6 y Figura 5).
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Tabla 6: Liberación de citocinas funcionales de linfocitos T después de la atenuación de SIGLEC15
Después del bloqueo de SIGLEC15, las citocinas de linfocitos T funcionales aumentaron, que se reconoce como un efecto antitumoral potenciado de los linfocitos T.
La IL2 fue secretada principalmente por linfocitos T Th1. La IL2 es el marcador de linfocitos Th activados y linfocitos T citotóxicos y linfocitos NK, también es el elemento necesario para la proliferación de linfocitos T activados.
El TNFα es producido principalmente por linfocitos T activados y linfocitos citolíticos naturales (NK). Induce necrosis hemorrágica en un determinado conjunto de tipos de tumores y se utiliza en el tratamiento regional de sarcomas de tejidos blandos localmente avanzados y melanomas metastásicos. TNFα también provoca una respuesta inflamatoria, que induce más células inmunitarias a destruir el tumor.
IFNy desempeña una función clave en la activación de la inmunidad celular y, posteriormente, la estimulación de la respuesta inmunitaria antitumoral. Actúa como una citocina citotóxica junto con la granzima B y la perforina para iniciar la apoptosis en las células tumorales, pero también permite la síntesis de moléculas inhibidoras del punto de control inmunitario e indoleamina-2,3-dioxigenasa (IDO), estimulando de este modo otros mecanismos inmunosupresores. En consecuencia, el perfil de liberación de citocinas es indicativo de un efecto antitumoral de los linfocitos T expandidos con expresión reducida de SIGLEC15.
Referencias
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13. RNAscope: A novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, Paraffin-embedded tissues. Wang, F., et al. 1, 2012, The Journal of Molecular Diagnostics, Vol. 14, págs. 22-29.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un método para obtener una población de linfocitos T que tienen una expresión reducida de SIGLEC15, que comprende
    S1'. Proporcionar un linfocito T que contiene tejido de ganglio linfático extirpado de un sujeto, obteniéndose dicho tejido de ganglio linfático de un ganglio linfático identificado como un ganglio linfático que drena fluido linfático de un tumor canceroso en dicho sujeto;
    52. Extraer células del ganglio linfático identificado;
    53. Reducir la expresión de SIGLEC15 en las células extraídas; y
    54. Expandir las células extraídas con expresión reducida de SIGLEC15 en condiciones que favorezcan la expansión de linfocitos T,
    en donde la expresión de SIGLEC15 se reduce mediante regulación negativa de la expresión de un gen que codifica SIGLEC15 mediante transfección de ARNpi, transfección de ARNhc o edición génica mediada por CRISPR.
    2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la expresión de SIGLEC15 se reduce mediante regulación negativa de la expresión de un gen que codifica SIGLEC15 mediante transfección de ARNpi usando una molécula de ARNpi que tiene una secuencia de nucleótidos de acuerdo con SEQ. ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6.
    3. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde las condiciones que favorecen la expansión de linfocitos T comprenden el mantenimiento de los linfocitos en presencia de interleucina-2.
    4. Una población de linfocitos T con expresión reducida de SIGLEC15 obtenible mediante el método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, para su uso en medicina.
    5. La población de linfocitos T para su uso de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el uso es en un método para el tratamiento de un cáncer.
    6. La población de linfocitos T para su uso de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el cáncer es un tumor sólido.
    7. La población de linfocitos T para su uso de acuerdo con la reivindicación 5 o 6, en donde el cáncer es el tumor canceroso del sujeto a partir del que se originan los linfocitos T, o una metástasis del mismo.
    8. La población de linfocitos T para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5-7, en donde el cáncer se selecciona del grupo de cáncer colorrectal, melanoma maligno, carcinoma de cuello uterino, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (CCECC), cáncer de pulmón no microcítico (CPNM).
    9. Una composición farmacéutica que comprende una población de linfocitos T con expresión reducida de SIGLEC15 obtenible mediante el método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y, opcionalmente, excipientes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables.
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