ES2955834T3

ES2955834T3 - Variantes de plantaricina nc8alphabeta

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Publication number: ES2955834T3
Application number: ES19708960T
Authority: ES
Original assignee: Curenc AB
Current assignee: Curenc AB
Priority date: 2018-02-20
Filing date: 2019-02-20
Publication date: 2023-12-07
Anticipated expiration: 2039-02-20
Also published as: EP4056195C0; US20210162001A1; EP4056195A1; CA3096807A1; WO2019162301A1; EP3755363A1; EP3755363C0; EP3755363B9; EP3755363B1; PL3755363T3; EP4056195B1; CN112004548A; US12064464B2

Abstract

En la invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un primer y un segundo péptido. El primer péptido es un péptido de la bacteriocina PLNC8 αβ, en el que el péptido de la bacteriocina PLNC8 αβ es un péptido A que tiene al menos un 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia (%SI). con SEQ ID NO 1, o un péptido B que tiene al menos 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia (%SI) con SEQ ID NO 2. Cuando el primer péptido es el péptido A, teniendo el segundo péptido B' de 14 a 34 aminoácidos y que comprende un péptido que tiene al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia (%SI) con SEQ ID NO 3. Cuando el primer péptido es el péptido B, el segundo péptido A' tiene de 15 a 29 aminoácidos y comprende un péptido que tiene al menos 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia (%SI) con SEQ ID NO 4. La composición farmacéutica comprende además al menos un antibiótico. La composición farmacéutica se puede utilizar en el tratamiento o profilaxis de una infección bacteriana. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Variantes de plantaricina nc8alphabeta

Campo de la invención

Esta invención pertenece en general al campo del tratamiento de infecciones. Más particularmente, la invención se refiere a un uso de una composición farmacéutica que comprende bacteriocina PLNC8 ap para la prevención y/o tratamiento de infecciones en las que la composición farmacéutica comprende además al menos un antibiótico.

Antecedentes de la invención

La infección hospitalaria (HAI), también conocida como infección nosocomial, es una infección que se adquiere en un hospital u otro centro sanitario. Dicha infección puede adquirirse en un hospital, una residencia de ancianos, un centro de rehabilitación, una clínica ambulatoria u otros entornos clínicos. La infección se transmite al paciente susceptible en el entorno clínico por diversos medios. El personal sanitario puede propagar la infección, además de por equipos, ropa de cama o gotitas de aire contaminados. Se calcula que 6 millones de pacientes en la UE y EE.UU. contraen una HAI al año, lo que provoca hasta 150.000 muertes anuales. La prevención de las HAI suele incluir protocolos de saneamiento hospitalario relativos a uniformes, esterilización de equipos, lavado y otras medidas preventivas. Una de las formas más eficaces de combatir las infecciones nosocomiales es que todo el personal médico se lave las manos a conciencia o se frote con alcohol antes y después de cada contacto con el paciente. También se considera vital un uso más cuidadoso de los agentes antimicrobianos, como los antibióticos.

Entre las categorías de bacterias más conocidas por infectar a los pacientes se encuentran los patógenos ESKAPE (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiellapneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa y Enterobacter), entre los que se encuentran el SARM (Staphylococcus aureus resistente a la meticilina) y el ERV (Enterococcus resistente a la vancomicina), Streptococcus spp y Escherichia coli. El desarrollo de nuevas estrategias antimicrobianas eficaces en el tratamiento de infecciones causadas por bacterias resistentes a los antibióticos representa uno de los principales retos de la medicina actual. Dado que la mayoría de las infecciones están causadas por patógenos que viven protegidos en biopelículas complejas, las sustancias antibacterianas necesitan una buena capacidad para penetrar o disolver la biopelícula. Esta capacidad suele ser limitada o inexistente en los antibióticos tradicionales, por lo que deben compensarse con concentraciones muy elevadas, a menudo 100 1000 veces superiores a las dosis necesarias para obtener efectos bactericidas sobre las bacterias planctónicas. Esta sobredosis contribuye a acelerar el desarrollo de resistencias a los antibióticos y a provocar graves efectos citotóxicos. Además, las infecciones suelen ir asociadas a una elevada actividad proteolítica provocada tanto por las bacterias como por el sistema inmunitario del organismo, lo que significa que los agentes antimicrobianos pueden inactivarse rápidamente.

Hazem et al., 2016 (https://doi.org/10.1186/s12866-016-0810-8) describe los efectos antibacterianos de Lactobacillus y la bacteriocina PLNC8 alfa beta sobre el patógeno periodontal Porphyromonas gingivalis. Torbjóm et al., 2017 (https://doi.org/10.1093/femspd/ftx064) describe una acción dual de la bacteriocina PLNC8 ap a través de la inhibición de la infección por Porphyromonas gingivalis y la promoción de la proliferación celular.

Se sabe que las bacteriocinas constituyen una prometedora alternativa o complemento potencial a los antibióticos tradicionales y presentan varias ventajas, como un bajo riesgo de desarrollo de resistencias, efectos limitados sobre la flora normal y efectos beneficiosos sobre los tejidos humanos. Las bacteriocinas son un grupo de péptidos producidos por bacterias que se utilizan para combatir otras bacterias. Las bacteriocinas pueden tener una carga neta positiva y expresar estructuras anfipáticas que interactúan con membranas microbianas cargadas negativamente y matan a los microbios normalmente mediante mecanismos de formación de poros. Estos mecanismos son más difíciles de eludir mediante el desarrollo de resistencias, en comparación con las enzimas metabólicas, que suelen ser los objetivos de los antibióticos convencionales.

Así pues, existe la necesidad de un método alternativo de terapia antibiótica en la prevención o el tratamiento de bacterias e infecciones bacterianas, especialmente la propagación de la resistencia a los antibióticos en la atención sanitaria (por ejemplo, Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM), Staphylococcus epidermidis resistente a la meticilina (SARM) y Enterococcus resistente a la vancomicina (ERV)).

Resumen de la invención

Por consiguiente, la presente invención pretende preferentemente mitigar, aliviar o eliminar una o más de las deficiencias identificadas anteriormente en la técnica y desventajas individualmente o en cualquier combinación y resuelve al menos los problemas mencionados anteriormente proporcionando una composición farmacéutica que comprende un primer péptido y un segundo péptido, en el que el primer péptido es un péptido de la bacteriocina PLNC8 ap, en el que el péptido de la bacteriocina PLNC8 ap es SVPTSVYTLGIKILWSAYKHRKTIEKSFNKGFYH SEQ con n° de ID 2, y en el que el segundo péptido es DLTTKLWSSWGYYLGKKARWNL SEQ con n° de ID 31, y en el que la composición farmacéutica comprende además al menos un antibiótico.

El péptido o péptidos y el antibiótico actúan de forma sinérgica y potencian el efecto del otro.

Se proporciona una composición farmacéutica en la que al menos el 90% de los aminoácidos del primer péptido y/o del segundo péptido son residuos de D-aminoácidos.

Estos péptidos son más estables y menos sensibles a la escisión proteolítica que sus correspondientes variantes L. Se proporciona una composición farmacéutica en la que el antibiótico se selecciona del grupo que consiste en antibióticos que inhiben la síntesis de la pared celular bacteriana, antibióticos que inhiben la síntesis de ácidos nucleicos y antibióticos que inhiben la síntesis de proteínas.

Se proporciona una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento o profilaxis de una infección bacteriana. También se proporciona el uso de una composición farmacéutica en el recubrimiento de al menos parte de un dispositivo para limitar la colonización de bacterias en la superficie del dispositivo.

Breve descripción de los dibujos

Estos y otros aspectos, características y ventajas de las que es capaz la invención serán evidentes y se dilucidarán a partir de la siguiente descripción de las realizaciones de la presente invención, haciendo referencia a los dibujos adjuntos, en los que:

La figura 1 muestra que PLNC8 ap inhibe notablemente el crecimiento y la supervivencia de diferentes cepas de S. aureus y S. epidermidis. Se cultivaron diferentes especies de Staphylococcus durante 20 h en presencia de concentraciones crecientes de PLNC8 ap (1:1). En general, S. epidermidis fue más susceptible a PLNC8 ap que S. aureus. Concentración inhibitoria mínima (CIM) y concentración bactericida mínima (CBM) para especies de Staphylococcus en respuesta a PLNC8 ap.

Figura 2. La relación molar de PLNC8 a y PLNC8 p es crítica para una actividad antimicrobiana óptima. S. epidermidis ATCC 12228 se expuso a diferentes proporciones molares de PLNC8 a y p durante 20 h. Una proporción molar de 1:1 entre PLNC8 a y PLNC8 p es la más eficaz para inhibir y matar a S. epidermidis. Concentración inhibitoria mínima (CIM) y concentración bactericida mínima (CBM) para diferentes proporciones molares de PLNC8 a y p. *La concentración total máxima de los péptidos se mantuvo constante en 50 μm, mientras que las concentraciones de PLNC8 a y p se modificaron individualmente para obtener diferentes proporciones molares.

Figura 3. PLNC8 ap es eficaz para interrumpir las biopelículas de S. epidermidis. Se dejó que la cepa positiva para biopelículas S. epidermidis RP62A formara biopelículas y, a continuación, se retiraron las bacterias en suspensión y se incubaron con PLNC8 ap, PLNC8 a o PLNC8 p durante 1 h. A- Medición de la absorbancia de las biopelículas desprendidas. B- Tinción con violeta de cristal de las biopelículas adheridas restantes. PLNC8 ap es más eficaz y rápido en la desintegración de biopelículas de S. epidermidis.

Figura 4. Alteración de la membrana y actividad antimicrobiana de PLNC8 a y p con aminoácidos L- o D-.

Se registró la liberación de A-CF tras la exposición de liposomas con concentraciones crecientes de las variantes L o D de PLNC8 a, p o ap (1:1). B- S. epidermidis ATCC 12228 se incubó con concentraciones crecientes de PLNC8 a y p, solas o en combinación (1:1), durante 20 h. Se indican la concentración inhibitoria mínima (CIM) y la concentración bactericida mínima (CBM) para 35 PLNC8 a, p y ap.

Figura 5. Las variantes L y D de PLNC8 ap permeabilizan rápidamente la membrana plasmática de S. epidermidis. Captación de Sytox Green por S. epidermidis ATCC 12228 tras el tratamiento con 5 gm de L-PLNC8 ap, D-PLNC8 ap 0 PLNC8 ap codificada durante 2 min, en comparación con bacterias no tratadas (C).

Figura 6. La forma D de PLNC8 ap es más estable y menos sensible a la escisión proteolítica. Los péptidos (100 gM) a) L-PLNC8a b) D-PLNC8a c) L-PLNC8p d) D-PLNC8p fueron tratados con tripsina (5 gM) en tampón de bicarbonato amónico (50 mM) durante 16 h a 37 °C antes de ser acidificados (2,5% TFA), secados, suspendidos en H20 0,1% TFA, desalados (ZipTip) y analizados por MALDI-ToF MS. Los números sobre los picos indican los pesos moleculares (Da) y el número entre paréntesis las secuencias de aminoácidos. Péptido a y p de longitud completa, 1-29 y 1-34, respectivamente.

Figura 7. (A) Tanto la forma L como la forma D de PLNC8 ap muestran una baja actividad hemolítica. Se incubaron eritrocitos humanos con diferentes concentraciones (0,5-50 gm) de la variante L o D de PLNC8 a, p o ap (1:1) durante 1 h. En (B) se muestra para las formas truncadas a1 -15, a1 -22, p7-20, p1 -20, p7-34.

Figura 8. Secuencias de aminoácidos de péptidos truncados de PLNC8 a y PLNC8 p.

Figura 9. Actividades antimicrobianas de las formas truncadas de PLNC8 p. Actividades antimicrobianas de las formas truncadas de PLNC8 p. En A. se obtuvo disrupción de la membrana y liberación de (6)-carboxifluoresceína (CF) de los liposomas con los péptidos p 1-34 (longitud completa), 7-34, 1-20 y 7-20. En B. cuando se combinaron con un péptido PLNC8 a de longitud completa, también se obtuvieron efectos con los otros péptidos truncados, aunque a concentraciones más altas. En C. cuando se combinó con un péptido PLNC8 a de longitud completa, también se obtuvieron efectos con los otros péptidos truncados, aunque a concentraciones más elevadas. En C, secuencias de aminoácidos de los péptidos truncados de L-PLNC8 p. En D, cuantificación de la liberación del 50% de CF con L-PLNC8 p truncado, con y sin L-PLNC8 a. En E, concentración inhibitoria mínima (CIM) y concentración bactericida mínima (CBM) de PLNC8 p truncado, en ausencia o presencia del péptido a de longitud completa, frente a S. epidermidis ATCC 12228. El crecimiento de S. epidermidis fue inhibido por los péptidos p 1 -34, p7-34, p1 -20 y p7-20 de longitud completa.

Figura 10. Actividades antimicrobianas de las formas truncadas de PLNC8 a. (A) La liberación de (6)-carboxifluoresceína (CF) a partir de liposomas se obtuvo con a1-22 y a1-29 de longitud completa. Cuando se combinó con un péptido PLNC8 p de longitud completa, también se obtuvieron efectos con los otros péptidos truncados, aunque a concentraciones más elevadas. (C) Secuencias de aminoácidos de los péptidos truncados de L-PLNC8 a. (D) Cuantificación de la liberación del 50% de CF por los péptidos truncados de L-PLNC8 a, con y sin L-PLNC8 p. (E) Concentración inhibitoria mínima (CIM) y concentración bactericida mínima (CBM) de PLNC8 a truncado frente a S. epidermidis ATCC 12228. El crecimiento y la supervivencia de S. epidermidis fueron inhibidos por a1-29 y a1-22 en combinación con el péptido p.

Figura 11. Actividad antimicrobiana de una combinación de PLNC8 a truncada y PLNC8 p. Concentración inhibitoria mínima (CIM) y concentración bactericida mínima (CBM) de una combinación de PLNC8 a truncada y PLNC8 p frente a S. epidermidis ATCC 12228. La inhibición del crecimiento y la supervivencia de S. epidermidis por p 1 -20 y p7-20, respectivamente, no se vio reforzada por una coincubación con a 1 -22 o a 1 -15.

Figura 12. Efectos morfológicos de PLNC8 ap sobre S. epidermidis mediante MET y SEM. PLNC8 a causó la formación masiva de vesículas y PLNC8 p indujo la lisis bacteriana mostrada por una liberación extracelular del contenido intracelular. PLNC8 ap fue el más eficaz, causando la lisis bacteriana completa. Las formas truncadas de PLNC8 p, p 1 -20 y p7-20, indujeron la fragmentación de la pared celular bacteriana y en combinación con PLNC8 a S. epidermidis pasó por lisis.

Figura 13. PLNC8 ap en una fórmula es eficaz contra S. epidermidis y conserva su actividad tras un almacenamiento prolongado. La lisis bacteriana se visualizó estudiando la captación de Sytox Green por S. epidermidis ATCC 12228 expuesta a un gel que contenía diferentes concentraciones (5- 100 gm) de PLNC8 ap. También se probó la actividad de la fórmula con 100 gm de PLNC8 ap en placas de agar sangre con S. epidermidis, a tiempo cero y tras un almacenamiento prolongado a 4 °C. Se creó un gradiente de PLNC8 ap extendiendo el gel sobre la superficie del agar con un asa plástica. La inhibición del crecimiento bacteriano queda demostrada por las zonas translúcidas.

Figura 14. PLNC8 ap es eficaz contra cepas heterogéneas de S. epidermidis. S. epidermidis aislado de infecciones de articulaciones protésicas, incluido S. epidermidis heterogéneo glicopéptido intermedio (hGISE), se expuso a L-PLNC8 ap durante 20 h y se determinaron la CMI (concentración inhibitoria mínima) y la CBM (concentración bactericida mínima).

Figura 15. PLNC8 ap actúa sinérgicamente con antibióticos. Efectos antimicrobianos sinérgicos entre antibióticos y L o D-PLNC8 ap. S. epidermidis (cepa 154) se expuso a L- PLNC8 ap o D-PLNC8 ap (3,1 gm), una dilución en serie de teicoplanina, vancomicina, rifampicina y gentamicina, solas o en su combinación con 3,1 gm de L-PLNC8 ap o D-PLNC8 ap.

Figura 16. Efectos antimicrobianos sinérgicos entre teicoplanina y PLNC8 ap.

PLNC8 p y PLNC8 a truncada amplifican notablemente los efectos inhibidores de la teicoplanina contra S. epidermidis. S. epidermidis (cepa 154) se expuso a una dilución en serie de teicoplanina o PLNC8 ap de longitud completa/truncada sola o en su combinación (dilución en serie de teicoplanina y 6,25 gm de PLNC8 ap de longitud completa/truncada), Figura 17. PLNC8 ap permeabiliza y mata marcadamente diferentes especies de Streptococcus. Streptococcus spp (S. mutans (Sm), S. constellatus (Se) y S. anginosus (Sa)) fueron tratados con 5 gM de PLNC8 ap durante 2 min, seguido de un análisis de captación de Sytox Green. S. constellatus y S. anginosus fueron más susceptibles a PLNC8 ap que S. mutans,

Figura 18. PLNC8 ap provoca la lisis rápida de S. aureus, independientemente de su resistencia a los antibióticos. (A) Aumento dependiente de la dosis en la lisis bacteriana, como indica la tinción verde Sytox, tras la exposición a PLNC8 ap durante 5 min. (B) Se indican los valores MIC y MBC para MSSA y MRSA. (C) El ensayo de tiempo de destrucción indicó que PLNC8 ap mata rápidamente las bacterias de forma dependiente de la dosis,

Figura 19. PLNC8 ap favorece la cicatrización de heridas en queratinocitos humanos. Se expusieron células HaCaT a diferentes concentraciones de PLNC8 ap o MSSA durante 24 horas. (A) PLNC8 ap promovió la cicatrización de heridas, que se determinó in vitro mediante el ensayo de rascado. Mientras que (B) IL-6 y (C) CXCL8 aumentaron por S. aureus, estos mediadores inflamatorios no se vieron alterados por PLNC8 ap,

Figura 20. PLNC8 ap antagoniza la citotoxicidad mediada por S. aureus y las respuestas inflamatorias de los queratinocitos humanos. Las células HaCaT se infectaron con MSSA durante 1 hora y luego se les añadió PLNC8 ap durante 6 horas. (A) PLNC8 ap antagonizó la citotoxicidad mediada por S. aureus, que se determinó mediante la actividad LDH, y promovió la viabilidad celular. Los péptidos redujeron significativamente la secreción de (B) IL-6 y (C) CXCL8. (D) El análisis de la expresión génica de il-6 y cxcl8 confirmó los efectos de PLNC8 ap al prevenir la infección de queratinocitos por S. aureus. Además, los eventos de señalización intracelular implican a c-jun y c-fos, lo que sugiere un papel del factor de transcripción AP-1 a través de MAPK,

Figura 21. PLNC8 ap promueve la cicatrización de heridas y reduce las respuestas inflamatorias de los queratinocitos humanos. Se infectaron células HaCaT con MSSA, en presencia o ausencia de PLNC8 ap durante 24h. (A) PLNC8 promueve la cicatrización de heridas tras una infección con S. aureus. El aumento de la secreción de (B) IL-6 y (C) CXCL8 por S. aureus se redujo significativamente por los péptidos,

Figura 22. PLNC8 ap inhibe la infección y favorece la cicatrización de heridas in vivo. La cicatrización de heridas se evaluó in vivo utilizando un modelo porcino de cicatrización de heridas. Las heridas se dejaron sin exponer o se infectaron con S. aureus (108CFU/ml) durante 3 días. Se añadió gentamicina (100 μg/ml) y/o PLNC8 ap (50 μM) una vez cada dos días y se controlaron las heridas durante 7 días (un total de 4 dosis). El péptido, solo o en combinación con gentamicina, antagonizó la infección y favoreció la cicatrización de las heridas,

Figura 23. Agregación (línea de puntos) y liberación de ATP (línea continua) Se registraron la agregación (línea de puntos) y la liberación de ATP (línea continua) para determinar la lisis bacteriana por L-PLNC8 ap,

Figura 24. PLNC8 ap causa una rápida permeabilización de la membrana en liposomas. PLNC8 p y PLNC8 ap (1:1), pero no PLNC8 a, tanto de (A) la forma L como de (B) la forma D, provocaron la lisis completa de los liposomas al cabo de 2 min,

Figura 25. Espectroscopia CD de PLNC8 ap. Mediciones de CD de (A) L-PLNC8 ap y (B) D-PLNC8 ap (100 μM cada uno) sin (discontinuo) y con (sólido) liposomas (0,5 mg/ml, ~660 μM) en PBS. Tres repeticiones con PBS como fondo. Las muestras con liposomas se incubaron durante al menos 30 minutos antes de las mediciones,

Figura 26. Análisis de células vivas IncuCyte de queratinocitos infectados, en presencia o ausencia de PLNC8 ap. S. aureus MOI:1 causó la muerte celular al cabo de 8 h. Una dosis única de PLNC8 ap impidió el crecimiento bacteriano y protegió las células hasta 32 h. La combinación PLNC8 ap/gentamicina (5 μg/ml) eliminó eficazmente S. aureus y evitó una infección, y la posterior muerte celular, durante todo el periodo experimental (72 h), y

Figura 27. Análisis de células vivas de incuCyte, en presencia o ausencia de queratinocitos infectados, en presencia o ausencia de PLNC8 ap. Análisis de células vivas IncuCyte de queratinocitos infectados, en presencia o ausencia de PLNC8 ap. A- S. aureus MOI:0.1 causó la muerte celular al cabo de 10 h. Una dosis única de PLNC8 ap impidió el crecimiento bacteriano y protegió las células hasta 42 h. La combinación PLNC8 ap/gentamicina (5 μg/ml) eliminó eficazmente S. aureus e impidió la infección, y la posterior muerte celular, durante todo el periodo experimental (72 h). B- El crecimiento bacteriano, medido mediante la cuantificación de la fluorescencia GFP de las bacterias, alcanzó niveles máximos tras 8-9 h. PLNC8 ap impidió y retrasó el crecimiento bacteriano hasta 38 h, y la combinación PLNC8 ap/gentamicina eliminó eficazmente todas las bacterias.

Descripción de las realizaciones

La siguiente descripción se centra en una realización de la presente divulgación aplicable a la lucha contra la infección, y especialmente la infección adquirida en el hospital (HAI) (pero también otros tipos de infecciones) utilizando péptidos derivados de una bacteriocina L. plantarum NC8 utilizada junto con antibióticos. Sin embargo, se apreciará que la divulgación no se limita a esta aplicación, sino que estos péptidos pueden aplicarse a muchos otros usos, incluyendo por ejemplo la desinfección y el recubrimiento de superficies.

La lucha contra las infecciones, como las adquiridas en los hospitales, plantea varios problemas. Entre ellos destacan: Estrategias de tratamiento inadecuadas para muchas infecciones bacterianas graves y serias; Desarrollo y propagación de la resistencia a los antibióticos en la asistencia sanitaria (por ejemplo, Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM) y Staphylococcus epidermidis (MRSE)); Grandes costes para la sociedad por la prevención y el tratamiento de enfermedades infecciosas (por ejemplo, los costes hospitalarios anuales del tratamiento de infecciones asociadas a la asistencia sanitaria (HAI) en EE.UU. se estiman en 40 mil millones de dólares y en Suecia en 6,5 mil millones de coronas suecas): Sufrimiento humano a causa de las enfermedades infecciosas (cada año, aproximadamente 6 millones de pacientes con HAI en EE.UU. y la UE y 150.000 mueren).

Estos problemas no son triviales de abordar, ya que incluyen aspectos como infecciones intratables en forma de biopelículas, alta actividad proteolítica en infecciones que antagonizan la acción de los agentes antibacterianos, estabilidad y actividad limitadas de los agentes antibacterianos, infección e inflamación crónicas, y cicatrización lenta y complicada de las heridas.

Los presentes inventores previeron que determinadas especies de Lactobacillus podrían contribuir a resolver estos problemas, gracias a su capacidad para suprimir patógenos, principalmente mediante la expresión y secreción de determinadas bacteriocinas.

Lactobacillus plantarum es una bacteria láctica muy versátil que se encuentra en la saliva y el tracto gastrointestinal, así como en verduras fermentadas, carne y productos lácteos. L. plantarum NC8 se ha utilizado como cepa modelo en muchos laboratorios de todo el mundo, y es una cepa de L. plantarum naturalmente libre de plásmidos. Se ha demostrado previamente que L. plantarum NC8 produce una bacteriocina de dos péptidos, PLNC8 ap, clasificada como una bacteriocina de clase Ilb. Los inventores han demostrado previamente que PLNC8 ap es eficaz contra el patógeno periodontal Porphyromonas gingivalis y estimula la proliferación celular (1,2).

La idea de la divulgación es explotar los efectos antibacterianos de la bacteriocina PLNC8 ap, sin modificar o truncada, en forma soluble o inmovilizada, junto con antibióticos, para la prevención y el tratamiento de infecciones agudas y crónicas, como periodontitis, infecciones de heridas, infecciones asociadas a implantes e infecciones del tracto urinario. Los productos basados en bacteriocinas junto con los antibióticos tradicionales pueden tener una enorme importancia en la atención sanitaria, con una mejora Dado que el desarrollo y la propagación de la resistencia a los antibióticos en la atención sanitaria concierne principalmente al Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM) y al Staphylococcus epidermidis (MRSE), se estudió el efecto de PLNC8 ap sobre diferentes cepas de S. aureus y S. epidermidis. Como puede verse en la Fig. 1 y la Tabla 1, PLNC8 ap inhibió notablemente el crecimiento y la supervivencia de todas las cepas bacterianas (Fig. 1). de la salud pública y un impacto positivo en la economía social.

Tabla 1

Además, se sondeó si el efecto antimicrobiano podía potenciarse utilizando una terapia combinada. En la terapia combinada, se utilizan combinaciones de agentes antimicrobianos para prevenir el desarrollo de resistencias y acortar el tiempo de tratamiento. Se investigó si las combinaciones de PLNC8 ap junto con diferentes antibióticos tradicionales serían eficaces en el tratamiento de S. epidermidis. En la Fig. 15 se resumen los resultados de PLNC8 ap junto con rifampicina, vancomicina, gentamicina o teicoplanina. Aquí se encontró sorprendentemente que PLNC8 ap disminuyó la CMI (concentración inhibitoria mínima) y la CBM (concentración bactericida mínima) de teicoplanina más de 15 veces frente a S. epidermidis (Fig. 15). La combinación de PLNC8 ap y rifampicina resultó aún más eficaz.

La CMI (concentración inhibitoria mínima) y la CBM (concentración bactericida mínima) de la rifampicina se redujeron más de 100 veces al tratar S. epidermidis en presencia de L-PLNC8 ap o D-PLNC8 ap. Además, la L-PLNC8 ap disminuyó la CMI y la CBM de la gentamicina entre 15 y 30 veces frente a S. epidermidis. L-PLNC8 ap o D-PLNC8 ap disminuyeron la CMI y la CBM de la vancomicina 2 veces. (Fig. 15 y Tabla 2).

Tabla 2. El efecto antimicrobiano se potencia utilizando la terapia combinada PLNC8 ap.

S. epidermidis

ATCC 12228

Esto demostró un efecto sinérgico sorprendentemente fuerte, con una disminución de hasta cien veces de la CIM y CBM del antibiótico contra bacterias específicas. Sin estar atado a la teoría, esto puede deberse al efecto permeabilizante de la membrana de PLNC8 ap, que puede dañar las membranas bacterianas y facilitar así el paso de los antibióticos, que de este modo alcanzan más fácilmente sus objetivos intracelulares (por ejemplo, ribosomas, ARN polimerasa). La consecuencia es que la concentración de antibióticos puede reducirse significativamente con menos problemas tanto de resistencia a los antibióticos como de efectos secundarios citotóxicos.

El efecto permeabilizante de la membrana se muestra en la figura 23, donde L-PLNC8 ap lisan eficazmente S. epidermidis, lo que se demuestra por una liberación de ATP dependiente de la dosis. También se demuestra que las bacterias se agregan cuando se exponen a bajas concentraciones de L-PLNC8 ap. Asimismo, en la figura 24, se muestra que PLNC8 ap provoca una rápida permeabilización de la membrana de los liposomas. PLNC8 p y PLNC8 ap (1:1), pero no PLNC8 a, tanto de la forma L como de la forma D, provocaron la lisis completa de los liposomas al cabo de 2 min.

El efecto antimicrobiano sinérgico entre PLNC8 ap y los antibióticos tradicionales contra cepas resistentes de Staphylococcus se muestra en la tabla 3 a continuación. Aquí se muestran los efectos de vancomicina o teicoplanina combinados con L-PLNC8 ap contra Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM) y Staphylococcus epidermidis resistente a meticilina (SARM).

En la figura 25, la espectroscopia CD muestra que tanto L- como D-PLNC8 ap tienen una estructura secundaria ordenada en liposomas, lo que indica que las a-hélices están dispuestas en un orden definido para que el péptido sea activo.

Tabla 3. Efecto antimicrobiano sinérgico entre PLNC8 ap y antibióticos tradicionales contra cepas resistentes de Staphylococcus.

S. epidermidis

MRSA 154 126* 157*

( )

Cepas de hGISE

Esto demuestra que la terapia combinada con PLNC8 ap y antibióticos es una estrategia de tratamiento eficaz. Esto se demostró además durante ensayos utilizando patógenos ESKAPE y Escherichia coli, una de las principales causas de infecciones nosocomiales en todo el mundo. El acrónimo ESKAPE incluye seis especies bacterianas patógenas (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiellapneumoniae, Acinetobacte rbaumannii, Pseudomonas aeruginosa y Enterobacter). Estas bacterias se han vuelto resistentes a múltiples antibióticos y se asocian a mayores tasas de morbilidad y mortalidad, lo que indica la necesidad de nuevas estrategias para prevenir y tratar este tipo de infecciones. Los patógenos ESKAPE son prioritarios para la OMS a la hora de promover la investigación y el desarrollo de nuevos antimicrobianos, ya que la multirresistencia es una grave amenaza para la salud pública mundial. Las infecciones causadas por estos patógenos suelen ser hospitalarias y suponen una amenaza especial para los pacientes que necesitan dispositivos médicos, como catéteres, respiradores e implantes.

Como puede observarse en la tabla 4, PLNC8 ap por sí solo no afecta al crecimiento de E.coli, sin embargo una concentración sub-MIC de los péptidos potenció significativamente los efectos de diferentes antibióticos.

Del mismo modo, PLNC8 ap por sí solo es inhibidor y bactericida frente a Enterococcus faecium, y la adición de concentraciones sub-MIC mejoró significativamente los efectos de los diferentes antibióticos. Esto se muestra en la tabla 5.

Asimismo, en la tabla 6, se muestra que, aunque PLNC8 ap por sí solo no afecta al crecimiento de Pseudomonas aeruginosa, la adición de una concentración sub-MIC de los péptidos potenció los efectos de los diferentes antibióticos.

Tabla 4. PLNC8 ap potencia notablemente los efectos inhibidores y bactericidas de los antibióticos contra Escherichia coli

*La concentración de péptidos en combinación con antibióticos es de 10 μM.

Tabla 5. PLNC8 ap potencia notablemente los efectos inhibidores y bactericidas de 5 antibióticos contra Enterococcus faecium.

* La concentración del péptido en combinación con antibióticos es de 1,5 μM

* La concentración del péptido en combinación con antibióticos es de 15 μM

Tabla 6. PLNC8 ap potencia notablemente los efectos inhibidores y bactericidas de los antibióticos contra Pseudomonas aeruginosa.

Muchas infecciones bacterianas adquiridas en el hospital se dan en infecciones superficiales e infecciones graves asociadas a heridas crónicas y a la inserción de dispositivos médicos, como catéteres e implantes de prótesis articulares. Esto puede aumentar posteriormente el riesgo de desarrollo de afecciones potencialmente mortales, como la sepsis.

Los queratinocitos constituyen el tipo celular predominante en la epidermis. Aunque la función principal de los queratinocitos es formar una barrera física contra los microorganismos, estas células también participan en el inicio de una respuesta inflamatoria contra los microorganismos invasores.

En la figura 18, se muestra que PLNC8 ap es inhibidor y bactericida frente a S. aureus, independientemente de sus patrones de resistencia frente a antibióticos.

En la figura 19, se muestra que PLNC8 ap promueve la cicatrización de heridas de queratinocitos humanos, lo que se determinó in vitro mediante el ensayo de rascado. Mientras que S. aureus aumentó IL-6 y CXCL8, estos mediadores inflamatorios no se vieron alterados por PLNC8 ap.

En la figura 20, se muestra que los péptidos contrarrestan eficazmente los efectos citotóxicos e inflamatorios de S. aureus sobre los queratinocitos humanos.

Las células infectadas resultan dañadas, lo que provoca un aumento de la secreción de IL-6 y CXCL8. En este caso, puede atribuirse a los péptidos una reducción significativa de estas secreciones. En la figura 21, se muestra que PLNC8 favorece la cicatrización de heridas tras una infección por S. aureus.

Utilizando un modelo porcino de cicatrización de heridas, también se demostró que PLNC8 ap inhibe la infección y promueve la cicatrización de heridas in vivo. En la figura 22, el péptido, solo o en combinación con gentamicina, antagonizó la infección por S. aureus y promovió la cicatrización de heridas.

En la figura 26, análisis de células vivas IncuCyte de queratinocitos infectados por S. aureus, (MOI:1) en presencia o ausencia de PLNC8 ap. Una dosis única de PLNC8 ap impidió el crecimiento bacteriano y protegió las células hasta 32 h. El crecimiento bacteriano sin péptidos alcanzó niveles máximos tras 8-9 h. La combinación PLNC8 ap/gentamicina (5gg/ml) eliminó eficazmente S. aureus y evitó una infección, y la subsiguiente muerte celular, durante todo el periodo experimental (72 h).

Figura 27. Análisis de células vivas IncuCyte de queratinocitos infectados por S. aureus, (MOI:0,1) en presencia o ausencia de PLNC8 ap. Una dosis única de PLNC8 ap impidió el crecimiento bacteriano y protegió las células hasta 42 h. El crecimiento bacteriano sin péptidos alcanzó niveles máximos tras 10 h. La combinación PLNC8 ap/gentamicina (5gg/ml) eliminó eficazmente S. aureus e impidió la infección, y la posterior muerte celular, durante todo el periodo experimental (72 h).

Otro aspecto de la defensa bacteriana contra los antibióticos es la formación de biopelículas bacterianas. Las biopelículas bacterianas parecen crear resistencia a los antibióticos, a los productos químicos desinfectantes y a la fagocitosis y otros componentes del sistema de defensa inflamatorio innato y adaptativo. Por ello, es vital que un tratamiento pueda combatir la formación de biopelículas bacterianas, pero también interrumpir una biopelícula ya existente.

Por lo tanto, las bacteriocinas no sólo se probaron con bacterias en estado planctónico, sino también con biopelículas formadas por S. epidermidis. Se observó que PLNC8 ap interrumpía eficazmente las biopelículas y mataba a las bacterias (véase la figura 3). Asimismo, los péptidos a y p de PLNC8 ejercieron por sí mismos, aunque a concentraciones más elevadas, efectos disruptivos sobre las biopelículas.

Una biopelícula es un consorcio estructurado de bacterias incrustadas en una matriz polimérica autoproducida formada por polisacáridos, proteínas y ADN extracelular. Existen gradientes de nutrientes y oxígeno desde la parte superior a la inferior de las biopelículas, y las células bacterianas situadas en zonas pobres en nutrientes tienen una menor actividad metabólica y un mayor tiempo de duplicación. Estas células más o menos latentes son, por tanto, responsables de parte de la tolerancia a los antibióticos. Por lo tanto, es importante que el agente antimicrobiano pueda penetrar en la biopelícula para exponer las bacterias de la biopelícula al antibiótico o al agente antimicrobiano y ejercer así un efecto antibacteriano.

Sin embargo, hay indicios de que, por ejemplo, las biopelículas de Staphylococcus no son totalmente impermeables a los antibióticos, y se ha demostrado que ciertos antimicrobianos marcados con fluorescencia (como la daptomicina) penetran en las biopelículas de S. aureus y S. epidermidis por difusión.

En la divulgación, se planteó la hipótesis de que la penetración en biopelícula de PLNC8 ap podría aumentarse modificando las bacteriocinas. Así, se desarrollaron formas truncadas de PLNC8 ap. Estas formas acortadas de las bacteriocinas se difunden más rápidamente en la biopelícula debido a su tamaño limitado. A continuación, se investigó si estas formas truncadas expresan actividades antibacterianas similares a las de la bacteriocina nativa o si son incluso más eficaces.

Se construyeron péptidos truncados de PLNC8 a y PLNC8 p, respectivamente, en 10 secuencias de 6-7 aminoácidos, para corresponder al número de aminoácidos necesarios para la formación de una hélice alfa (mostrados en la Fig. 8). Los efectos de las PLNC8 a y PLNC8 p truncadas se probaron tanto en un sistema de liposomas (parecido a una bacteria) como en S. epidermidis. La disrupción de las membranas liposomales, revelada por la liberación de (6)-carboxifluoresceína (CF), se obtuvo con los péptidos p 1-34 (longitud completa), 7-34, 1-20 y 7-20 (Fig. 9). Cuando se combinó con un péptido PLNC8 a de longitud completa, también se obtuvieron efectos con los otros péptidos truncados, aunque a concentraciones más elevadas. Así, sorprendentemente, se observó que el crecimiento de S. epidermidis se inhibía más eficazmente con la secuencia p1 -20 y P7-20, respectivamente, y que estos péptidos truncados eran tan eficaces, o incluso más, que el PLNC8 p (1-34) nativo de longitud completa (Fig. 9).

Además, se descubrió que las secuencias p del péptido p7-13 y p14-20 son cruciales para los efectos de PLNC8 p y son más eficaces cuando se combinan con p1-6. Así, el péptido p1 -20 es el más eficaz para inhibir S. epidermidis. Así, el péptido p 1 -20 es el más eficaz en la inhibición de S. epidermidis. Además, se comprobó que los efectos de p1 -20 y p7-20 no se potenciaban más en combinación con el péptido a de longitud completa.

Las actividades antimicrobianas de las formas truncadas de PLNC8 a se probaron más a fondo, como se muestra en la Fig. 10 y la Tabla 2. La forma truncada 1-22 del péptido a y el péptido a de longitud completa (1-29) alteraron la membrana de los liposomas, lo que se puso de manifiesto por la liberación de carboxifluoresceína. En combinación con el péptido p, el a 1-22 ejerció efectos inhibitorios y bactericidas sobre S. epidermidis (Fig. 10).

En la figura 11 se muestra la combinación de a1-22 truncado o a1-15 con p1 -20 o p7-20 y el efecto sobre la CMI y la CBM frente a S. epidermidis. a1-22 y a1-15 no potenciaron los efectos inhibidores de p1 -20 y p7-20.

Como tal, la innovación se refiere a una combinación de PLNC8 ap y antibióticos para obtener efectos sinérgicos, con una disminución de varias veces de la MIC y MBC del antibiótico contra bacterias específicas. Además, al truncar PLNC8 ap) en péptidos a y p más cortos (por ejemplo, a1-22, p1 -20 y p7-20), se conservan las propiedades antibacterianas sinérgicas, al tiempo que se obtienen mayores coeficientes de difusión en biopelículas bacterianas. Esto se debe a que los coeficientes de difusión aumentan fuertemente a medida que aumenta el tamaño del sistema. En un gel, como una biopelícula bacteriana, la difusión se ve aún más afectada por el tamaño de las partículas, ya que las partióles más grandes también tendrán un mayor riesgo de quedar atrapadas en los poros del gel.

Así, en una realización, una composición farmacéutica que comprende un primer y un segundo péptido, en donde el primer péptido es un péptido de PLNC8 ap, en donde el péptido de PLNC8 ap es SVPTSVYTLGIKILWSAYKHRKTIEKSFNKGFYH (SEQ con n2 de ID 2), y en donde cuando el segundo péptido es DLTTKLWSSWGYYLGKKARWNL (SEQ con n° de ID 31)" y en donde la composición farmacéutica comprende además al menos un antibiótico.

Así, según la divulgación que no forma parte de la invención, una composición que comprende una combinación de a de longitud completa a y p truncada o de longitud completa junto con antibióticos o p de longitud completa y a truncada o de longitud completa junto con antibióticos o a de longitud completa a y p de longitud completa proporciona un efecto antimicrobiano sorprendentemente elevado, como puede verse en la Tabla 2 (efectos sinérgicos elevados, con una disminución de varias veces de MIC y MBC). Además, las combinaciones que comprenden a y/o p truncados también tienen la ventaja de una mayor velocidad de difusión, lo que se traduce en un mejor efecto de actividad contra las biopelículas bacterianas.

Según una realización p que no forma parte de la invención el péptido B' tiene al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia (%SI) con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ con n2 de ID 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24 y 2.

En una realización que no forma parte de la invención el péptido B' es una secuencia seleccionada del grupo formado por la SEQ con n2 de ID 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, y 2.

En una realización que no forma parte de la invención el péptido A' tiene al menos un 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia (%SI) con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por la SEQ con n2 de ID 1,25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37 y 4.

En una realización que no forma parte de la invención el péptido A' tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ con n2 de ID 1,25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37 y 4.

En una realización que no forma parte de la invención el péptido A' tiene al menos un 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia (%SI) con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por la SEQ con n2 de ID 1,25, 26, 27, 28, 29, 30, y 31.

En una realización que no forma parte de la invención el péptido A' tiene una secuencia seleccionada del grupo formado por la SEQ con n° de ID 1,25, 26, 27, 28, 29, 30, y 31.

En una realización que no forma parte de la invención el primer péptido es DLTTKLWSSWGYYLGKKARWNLKHPYVQF (SEQ con n2 de ID 1), y el segundo péptido se elige de SVPTSVYTLGIKILWSAYKHRKTIEKSFNKGFYH (SEQ con n2 de ID 2), SVPTSVYTLGIKILWSAYKH (SEQ con n2de ID 5), y YTLGIKILWSAYKH (SEQ con n2 de ID 3).

En una realización que no forma parte de la invención el primer péptido es DLTTKLWSSWGYYLGKKARWNLKHPYVQF (SEQ con n2 de ID 1), _yel segundo péptido es SVPTSVYTLGIKILWSAYKHRKTIEKSFNKGFYH (SEQ con n2 de ID 2).

En una realización que no forma parte de la invención el primer péptido es DLTTKLWSSWGYYLGKKARWNLKHPYVQF (SEQ con n2 de ID 1), _yel segundo péptido es SVPTSVYTLGIKILWSAYKH (SEQ con n2 de ID 5).

En una realización que no forma parte de la invención el primer péptido es DLTTKLWSSWGYYLGKKARWNLKHPYVQF (SEQ con n2 de ID 1), y el segundo péptido es YTLGIKILWSAYKH (SEQ con n° de ID 3).

En una realización que no forma parte de la invención el primer péptido es SVPTSVYTLGIKILWSAYKHRKTIEKSFNKGFYH (SEQ con n2 de ID 2), y el segundo péptido se elige de DLTTKLWSSWGYYLGKKARWNL (SEQ con n2 de ID 31).

En una realización que no forma parte de la invención el primer péptido es SVPTSVYTLGIKILWSAYKHRKTIEKSFNKGFYH (SEQ con n2 de ID 2), y el segundo péptido se elige de DLTTKLWSSWGYYLG (SEQ con n2 de ID 4).

La identidad de secuencias (%SI) descrita en el presente documento puede evaluarse mediante cualquier método adecuado. Para ello pueden utilizarse programas que comparan y alinean pares de secuencias, como ALIGN (Myers y Miller, CABIOS, 4:11-17, 1988), FASTA (Pearson, Methods in Enzymology, 183:63-98, 1990) y gapped BLAST (Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402, 1997), o BLASTP (Devereux et al., Nucleic Acids Res., 12:387,

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica que comprende un primer y un segundo péptido, en el que el primer péptido es un péptido de la bacteriocina PLNC8 ap,

en la que el péptido de la bacteriocina PLNC8 ap es

SVPTSVYTLGIKILWSAYKHRKTIEKSFNKGFYH SEQ con n2 de ID 2,

en la que el segundo péptido es

DLTTKLWSSWGYYLGKKARWNL SEQ con n2 de ID 31,

y en el que la composición farmacéutica comprende además al menos un antibiótico.

2. La composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que el antibiótico se selecciona del grupo que consiste en antibióticos que inhiben la síntesis de la pared celular bacteriana, antibióticos que inhiben la síntesis de ácidos nucleicos y antibióticos que inhiben la síntesis de proteínas.

3. La composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el antibiótico se selecciona del grupo que consiste en gentamicina, rifampicina, ciprofloxacina, teicoplanina, levofloxacina, meropenem y vancomicina.

4. La composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que al menos el 90% de los aminoácidos del primer péptido y/o del segundo péptido son residuos de D-aminoácidos.

5. La composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el primer y el segundo péptidos están presentes en una proporción molar de entre 5:1 y 1:20, preferentemente de 1:1 a 1:7, más preferentemente de 1 :1.

6. La composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la composición farmacéutica comprende entre 100 nM y 50 μM del primer péptido y/o del segundo péptido.

7. La composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la composición farmacéutica comprende el antibiótico en una cantidad de entre 0,002 μg/ml a 50 μg/ml, tal como al menos 0,01 μg/ml a 5 μg/ml, tal como al menos 0,1 μg/ml a 1 μg/ml, tal como al menos 0,8 μg/ml.

8. La composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la composición está formulada como solución, crema, gel o pomada o formulada en forma inmovilizada como recubrimiento de un dispositivo.

9. La composición farmacéutica según la reivindicación 8, en la que la composición está formulada:

en forma de gel, en el que el gel comprende además gelatina y glicerol, o en forma inmovilizada como revestimiento de un dispositivo, en el que el dispositivo se elige del grupo que consiste en un apósito para heridas, un implante ortopédico, un implante dental, un catéter urinario y una endoprótesis urinaria.

10. Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento o profilaxis de una infección bacteriana, en la que la composición farmacéutica es una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9.

11. La composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 10, en la que la infección bacteriana está causada por Staphylococcus spp (incluyendo MRSA, MRSE), Streptococcus spp (por ejemplo S. mutans, S. constellatus, S. anginosus), Enterococcus faecium (incluyendo VRE), Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter spp y/o Escherichia coli.

12. La composición farmacéutica para uso según la reivindicación 10 u 11, en la que la composición se administra localmente en el lugar de la infección, como por vía tópica.

13. Uso de una composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en el recubrimiento de al menos una parte de un dispositivo para limitar la colonización de bacterias en la superficie del dispositivo.

14. Uso de una composición farmacéutica según la reivindicación 13, en la que el dispositivo es un producto sanitario, como una prótesis o un apósito para heridas.

15. Uso de una composición farmacéutica según la reivindicación 13 o 14, en la que las bacterias son Staphylococcus spp (incluyendo MRSA, MRSE), Streptococcus spp (por ejemplo S. mutans, S. constellatus, S. anginosus), Enterococcus faecium (incluyendo VRE), Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter spp y/o Escherichia coli.