ES2956510T3 - Péptido penetrante celular, conjugado que lo comprende y composición que comprende el conjugado - Google Patents

Péptido penetrante celular, conjugado que lo comprende y composición que comprende el conjugado Download PDF

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Abstract

Se describen un péptido que penetra en las células, un conjugado que es un ingrediente activo y un uso del mismo. Más específicamente, se divulga el péptido que penetra en las células que tiene una secuencia de entre SEQ ID NO. 1 a SEQ ID NO. 156, un conjugado que comprende un péptido que es un fragmento de una secuencia de SEQ ID NO. 1 a SEQ ID NO. 156 o un péptido que tiene una secuencia que es al menos 80 % homóloga con la secuencia peptídica, y una composición que comprende el conjugado. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Péptido penetrante celular, conjugado que lo comprende y composición que comprende el conjugado
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a péptidos portadores de penetración celular derivados de la enzima telomerasa transcriptasa inversa humana (hTERT), a conjugados de los péptidos portadores de penetración celular y a principios activos y a composiciones que comprenden el conjugado.
ANTECEDENTES
Aunque las sustancias de bajo peso molecular, ácidos nucleicos, proteínas, nanopartículas, etc., tienen grandes potenciales como sustancias terapéuticas a nivel molecular, sus usos son limitados debido a la incompetencia para penetrar en los tejidos y la membrana celular. El desarrollo de un sistema para suministrar tales sustancias a la célula ha sido el área activa de investigación en las últimas dos décadas. El transporte de las sustancias dentro de la célula ha sido un tema de conversación en un tratamiento de procedimiento molecular. Las sustancias de bajo peso molecular, los ácidos nucleicos o las nanopartículas se transportaron dentro de la célula por diversos reactivos, electroporación o choque térmico. Sin embargo, fue difícil encontrar un procedimiento adecuado de suministro de proteínas dentro de la célula sin interrumpir la actividad y la integridad de las proteínas. En la década de 1980, en la investigación llevada a cabo sobre el estudio de la capacidad de penetración celular del VIH, se descubrió que la proteína VIH-TAT que consiste en 11 aminoácidos específicos desempeñan un papel importante en un proceso de transporte dentro de la célula. Por lo tanto, en la década de 1990, los estudios sobre cómo encontrar el procedimiento correcto para transportar proteínas dentro de la célula han sido el área intensa de investigación.
Se sabe que un telómero es una secuencia repetitiva de material genético encontrado en los extremos de cromosomas que evita que los cromosomas se dañen o se unan a otros cromosomas. La longitud del telómero se acorta en cada división celular y, después de un determinado número de divisiones celulares, la longitud del telómero se acorta extremadamente en la medida que la célula deja de dividirse y muere. Por otro lado, se sabe que el alargamiento de los telómeros amplía el lapso de vida de una célula. Por ejemplo, las células cancerosas excretan una enzima denominada telomerasa, que evita el acortamiento de los telómeros, lo que da como resultado de esta manera la proliferación de células cancerosas.
El Documento US 2003/0225027 A1 y EBI núm. de acceso GSP:ADG85224 desvelan un péptido que comprende las secuencias de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 98 y 153.
Un objetivo de esta invención es proporcionar un péptido portador de penetración celular.
Otro objetivo de la presente invención es proporcionar el polinucleótido que codifica el péptido novedoso.
Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un conjugado de un péptido de penetración celular y un principio activo.
Otro objetivo de la presente invención es proporcionar una composición que comprende un conjugado de un principio activo y un péptido de penetración celular.
Otro objetivo de la presente invención es proporcionar una composición farmacéutica que comprende un conjugado de un principio activo y un péptido de penetración celular.
Otro objetivo de la presente invención es proporcionar una composición que comprende un conjugado de un principio activo y un péptido de penetración celular.
Otro objetivo de la presente invención es proporcionar una composición de alimentación saludable que comprende un conjugado de un principio activo y un péptido de penetración celular.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La invención se refiere a un conjugado de un péptido portador de penetración celular y un principio activo, en el que el péptido portador es un péptido que comprende la secuencia de aminoácido 98 o 153, un fragmento de cualquiera de dichos péptidos, o un péptido que consiste en 30 o menos aminoácidos la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 98 o 153, en la que el péptido que tiene al menos un 80% de homología con los péptidos mencionados anteriormente; en el que el péptido que tiene al menos un 80% de homología y el fragmento conserven la capacidad de penetración celular del péptido con la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 98 o 153 y en la que el principio activo no es una proteína o un péptido.
En una realización, el péptido portador consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 98 o 153.
En una realización, el principio activo es al menos uno seleccionado de una proteína, un ácido nucleico, un péptido, un lípido, un glucolípido, un mineral, un azúcar, una nanopartícula, un producto biológico, un agente de contraste, un fármaco y compuestos químicos.
En una realización, el péptido portador y el principio activo son conjugados a través de a) un enlace covalente, opcionalmente mediado por un enlazador; o b) un enlace no covalente.
En una realización, el principio activo es un agente de contraste.
En una realización, el agente de contraste se selecciona de un grupo que consiste en agente de contraste radioopaco, agente de contraste paramagnético, agente de contraste superparamagnético y agente de contraste CT.
En una realización, el agente de contraste se basa en hierro, opcionalmente un carboxilato de ferroceno.
La presente invención también se refiere al conjugado para su uso en contrastar una célula, opcionalmente una célula madre.
La invención también se refiere a una composición, que es una composición farmacéutica, una composición cosmética, o una composición alimenticia saludable que comprende un conjugado de un péptido portador de penetración celular y un principio activo, en el que el péptido portador es un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 98 o 153, un péptido compuesto por 30 o menos aminoácidos y que tiene al menos un 80% de homología con el péptido anteriormente mencionado o un fragmento de uno cualquiera de los péptidos anteriormente mencionados, en el que el péptido que tiene al menos un 80% de homología y el fragmento retienen la capacidad de penetración celular de la s Ec . ID Núm.: 98 o 153 y en la que el principio activo no es una proteína o un péptido.
La presente invención también se refiere a la composición farmacéutica para su uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad.
La presente invención también se refiere a la composición farmacéutica para el tratamiento o la prevención de una enfermedad neuronal degenerativa o cáncer.
La invención también se refiere a un procedimiento para suministrar un principio activo en una célula, opcionalmente en mitocondrias dentro de una célula, que comprende administrar un conjugado a una célula in vitro, en el que el conjugado es un conjugado de un péptido portador de penetración celular y un principio activo, en el que el péptido portador es un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 98 o 153, un péptido que consiste en 30 aminoácidos o menos y que tenga al menos un 80% de homología con el péptido anteriormente mencionado, o un fragmento de los péptidos anteriormente mencionados, en los que el péptido que tiene al menos un 80% de homología y el fragmento conservan la capacidad de penetración celular del péptido con la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 98 o 153, y en el que el principio activo no es una proteína o péptido, en el que el péptido portador es un péptido de penetración celular que logra la administración del principio activo en la célula. La invención también se refiere a un péptido portador de penetración celular, en el que el péptido portador consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 98 o 153.
La invención también se refiere a un polinucleótido que codifica un péptido portador que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 98 o 153.
La invención también se refiere a una célula transformada que comprende un vector que comprende un polinucleótido que codifica un péptido portador que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 98 o 153.
APLICABILIDAD INDUSTRIAL
Los principios activos que son difíciles de transportar dentro de una célula se pueden transportar fácilmente dentro de una célula mediante el uso del péptido o el conjugado del péptido y los principios activos, desvelados en la presente invención. Esto significa que la efectividad de los principios activos se puede aumentar y por lo tanto la dosificación se puede reducir. Como resultado, los efectos secundarios debidos a la administración de fármacos se pueden minimizar y se puede aumentar la eficacia del tratamiento. Especialmente, como se administran los fármacos localmente en las mitocondrias, se pueden mejorar las enfermedades o los trastornos relacionados con las mitocondrias y se puede aumentar la eficacia de la profilaxis y el tratamiento de enfermedades. En un caso de cosméticos, con una pequeña cantidad de principios activos, puede crear un efecto excepcional. Por medio de la conjugación de un péptido con una sustancia de contraste, se puede usar como sustancia de contraste para monitorizar un procedimiento de trasplante celular o células trasplantadas en un tratamiento celular. Especialmente, se puede usar eficazmente como sustancia de contraste para las células madre inyectadas dentro de un cuerpo.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Fig. 1 a la Fig. 23 representan e ilustran que la captación celular de los números de células de una célula HeLa tratada después de que FITC se fusionó con el péptido de la SEC ID Núm.: 1 a la SEC. ID Núm.: 156 y se analizó por FACS. Las células de control se trataron solo con FITC.
La Fig. 24 a la Fig.43 representan que la captación celular de los números de célula de una célula Hur7 tratada con después del FITC fusionado al péptido de la SEC ID Núm.: 1 a la SEC. ID Núm.: 156 y se analizó por FACS. Las células de control se trataron solo con FITC.
La Fig. 44 a la Fig. 58 representan e ilustran que la captación celular de los números de células de una línea celular humana de linfocitos T (Jurkat) tratada después de que FITC se fusionó con el péptido de la SEC. ID Núm. 1 a la SEC. ID Núm.: 156 y se analizó por FACS. Las células de control se trataron solo con FITC.
La Fig. 59 a la Fig. 72 representan e ilustran que el resultado de la toxicidad y la viabilidad celular de una célula HeLa tratada después de que FITC se fusionó con el péptido de la SEC. ID Núm.: 1 a la SEC. ID Núm.: 156 y se analizó por citometría de flujo (Citometría de flujo). Las células de control se trataron sólo con FITC.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Las proteínas, los ácidos nucleicos, los péptidos o los virus, etc. tienen un gran potencial para usarse como sustancias terapéuticas. Sin embargo, sus usos son limitados porque no pueden penetrar en los tejidos y en la membrana celular debido a su tamaño a nivel molecular. Aunque, el tamaño de las moléculas es pequeño, no pueden penetrar la bicapa lipídica debido a la estructura o características de las moléculas. Por lo tanto, mediante el uso de electroporación, choque térmico, etc., hubo intentos de transportar proteínas, ácidos nucleicos, péptidos o virus dentro de la célula; fue difícil transferirlos sin dañar la membrana celular ni mantener los estados activos de las moléculas anteriores. Se han llevado a cabo muchos estudios dado que la proteína TAT (el activador Trans-Activador de la Transcripción) derivada del VIH (Virus de Inmunodeficiencia Humana) ha demostrado funcionar como péptido penetrador celular que puede transportar enormes sustancias activas dentro de la célula. Específicamente, se han llevado a cabo estudios sobre sustancias que pueden transportar moléculas enormes tales como proteínas, ácidos nucleicos, péptidos o virus dentro de la célula sin provocar ninguna toxicidad, a diferencia de la proteína TAT que provoca toxicidad dentro de la célula. Por lo tanto, la presente invención se completó dado que los presentes inventores han descubierto que los péptidos derivados de la telomerasa tienen una efectividad sobresaliente como péptido de penetración celular sin una toxicidad notable.
Los péptidos se desvelan en la SEC. ID Núm.: 1 a la SEC. ID Núm.: 156 mostradas en la Tabla 1 a continuación. La SEC. ID Núm.: 157 es una secuencia de longitud completa de la proteína de la telomerasa humana. El “nombre” en la Tabla 1 a continuación se usó para la distinción de los péptidos. Más de un péptido de los péptidos mencionados en la SEC. ID Núm.: 1 a la SEC. ID Núm.: 156 puede comprender un “péptido sintético”, un péptido sintetizado de áreas seleccionadas de la telomerasa. En la presente memoria descriptiva, el término “pep” en la presente memoria se refiere a un péptido que tiene una cualquiera de las secuencias de aminoácidos entre la SEC. ID Núm.: 1 a la SEC. ID Núm.: 156 o un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos por encima del 80% de homología con las secuencias anteriormente mencionadas o un fragmento peptídico de los péptidos anteriormente mencionados.
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Un polinucleótido puede codificar un péptido que comprende al menos una secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 1 a la SEC. ID Núm.: 156, un péptido que tiene por encima del 80% de homología con las secuencias anteriormente mencionadas o un péptido que es un fragmento de los péptidos anteriormente mencionados. El polinucleótido anteriormente mencionado permite la producción de los péptidos en grandes cantidades. Por ejemplo, el cultivo de vectores que incluyen péptidos que codifican polinucleótidos permite la producción de péptidos en grandes cantidades.
Los péptidos desvelados en la presente memoria pueden incluir un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos superior al 80%, superior al 85%, superior al 90%, superior al 95%, superior al 96%, superior al 97%, superior al 98% o superior al 99% de homología. Además, los péptidos desvelados pueden incluir un péptido que comprende una cualquiera de la secuencia de aminoácidos entre la SEC. ID Núm.: 1 a la SEC. ID Núm.: 156 o sus fragmentos, y un péptido con más de 1 aminoácido transformado, más de 2 aminoácidos transformados, más de 3 aminoácidos transformados, más de 4 aminoácidos transformados, más de 5 aminoácidos transformados, más de 6 aminoácidos transformados o más de 7 aminoácidos transformados.
Los cambios en la secuencia de aminoácidos pertenecen a las características físicas y químicas de los péptidos. Por ejemplo, la transformación de aminoácidos se puede llevar a cabos por medio de la mejora de la estabilidad térmica del péptido, la alteración de la especificidad del sustrato y el cambio del pH óptimo.
El término “aminoácido” en la presente memoria incluye no solamente los 22 aminoácidos convencionales que se integran de forma natural en el péptido sino también los isómeros D y los aminoácidos transformados. Por lo tanto, en una realización específica de la presente invención, un péptido en la presente memoria incluye un péptido con D-aminoácidos. Por otro lado, un péptido puede incluir aminoácidos no convencionales tales como los que se han modificado post-traduccionalmente. Los ejemplos de modificación post-traduccional incluyen fosforilación, glicosilación, acilación (que incluyen acetilación, miristorilación, plamoilación), alquilación, carboxilación, hidroxilación, glicosilación, biotinilación, ubiquitinilación, transformación en las propiedades químicas (por ejemplo, desimidación que elimina 13, desamidación) y transformación estructural (por ejemplo, formación de puente disulfuro). Además, se incluyen cambios de aminoácidos y los cambios de aminoácidos se producen debido a una reacción química durante el procedimiento de combinación con reticuladores para la formación de un conjugado peptídico.
Un péptido desvelado en la presente memoria puede ser un péptido de tipo silvestre que se ha identificado y aislado de fuentes naturales. Por otro lado, cuando se compara con los fragmentos peptídicos de una cualquiera de entre la secuencia amino de la SEC. ID Núm.: 1 a la SEC. ID Núm.: 156, los péptidos desvelados en la presente memoria pueden ser mutantes artificiales que comprenden uno o más aminoácidos sustituidos, eliminados y/o insertados. La alteración de aminoácidos en el polipéptido de tipo silvestre - no solo en mutantes artificiales - comprende la sustitución conservativa de aminoácidos que no influyen en el plegamiento y o la activación de proteínas. Los ejemplos de sustitución conservativa pertenecen al grupo que consiste en aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina y asparaginas), aminoácidos hidrófobos (leucina, isoleucina, valina y metionina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina) y aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina y treonina). Las sustituciones de aminoácidos que generalmente no alteran la actividad específica se conocen en la técnica de la presente invención. Las alteraciones más comunes son Ala/Ser, Val/lle, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly y las alteraciones opuestas. Otro ejemplo de sustituciones conservativas se muestra en la siguiente Tabla 2.
[TABLA 2]
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La transformación sustancial de las propiedades biológicas de los péptidos se lleva a cabo por medio de la selección de una sustitución significativamente diferente en las siguientes efectividades: (a) la efectividad en el mantenimiento de la estructura del esqueleto del polipéptido en el área de sustitución, tales como láminas o estructuras helicoidales tridimensionales, (b) la efectividad en el mantenimiento de la carga eléctrica o la hidrofobicidad de la molécula en el área diana o (c) la efectividad en el mantenimiento de la mayor parte de la cadena lateral.
Los restos naturales se dividen en grupos por las propiedades generales de la cadena lateral como las siguientes:
(1) hidrofobicidad: Norleucina, met, ala, val, leu, ile;
(2) hidrofilidad neutra: cys, ser, thr;
(3) acidez: asp, glu;
(4) basicidad: asn, gln, his, lys arg;
(5) resto que afecta la orientación de la cadena: gly, pro; y
(6) aromaticidad: trp, tyr, phe.
Las sustituciones no conservativas se pueden llevar a cabo por medio del intercambio de un miembro de las clases anteriores por diferentes clases. Cualquier resto de cisteína que no esté relacionado con el mantenimiento de la estructura tridimensional adecuada del péptido se puede sustituir típicamente por serina, para de ese modo aumentar la estabilidad oxidativa de la molécula y evitar la reticulación inapropiada. Por el contrario, se puede lograr una mejora de la estabilidad por medio de la adición de enlace o enlaces cisteína al péptido.
Los tipos alterados de variantes de aminoácidos de los péptidos son aquellos que cambiaron el patrón de glucosilación de anticuerpos. El término “cambio” en la presente memoria se refiere a la eliminación de al menos un resto de carbohidrato que se encuentra en un péptido y/o la adición de al menos un resto glucosilado que no existe dentro de un péptido.
La glicosilación en los péptidos es típicamente una glicosilación ligada a N u O. El término “conectado a N” se refiere en la presente memoria a que los residuos de carbohidratos están unidos a la cadena lateral de los residuos de asparagina. Como secuencias tripéptidas, la asparagina-X-serina y la asparagina-X-treonina (en la que la X es cualquier aminoácido excepto la prolina) son la secuencia de reconocimiento para unir enzimáticamente residuos de carbohidratos a la cadena lateral de la asparagina. Por lo tanto, con la presencia de una de estas secuencias de tripéptidos en un polipéptido, se crean los posibles sitios de glucosilación. “Glucosilación conectada a O” significa unir uno de azúcar N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a aminoácidos de hidroxilo. Los aminoácidos de hidroxilo son más típicamente serina o treonina, pero se pueden usar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.
La adición del sitio de glucosilación a un péptido se lleva a cabo convenientemente por medio del cambio de la secuencia de aminoácidos para que contenga la secuencia de tripéptidos mencionada anteriormente (para sitios de glucosilación enlazada a N). Estos cambios se pueden llevar a cabo por medio de la adición de al menos un resto de serina o treonina a la primera secuencia de anticuerpos o por medio de sustitución con esos restos (para sitios de glucosilación enlazados a O).
Un péptido que comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 98, la SEC. ID Núm.: 153, un fragmento del péptido anteriormente mencionado, o un péptido que consiste en 30 aminoácidos o menos y que tenga una homología superior al 80% con la secuencia anteriormente mencionada, que conserve la capacidad de penetración celular del péptido con la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 98 o 153, es seguro y tiene una eficacia excepcional como péptido de penetración celular. Por lo tanto, el péptido se puede conjugar con un fármaco para transportar el fármaco dentro de la célula.
En una realización de la presente invención, se proporciona un conjugado de un péptido y un principio activo para transportarse, en el que el péptido consiste en la SEC. ID Núm.: 98 o la SEC. ID Núm.: 153, el péptido es un fragmento del péptido anteriormente mencionado o el péptido está compuesto por 30 o menos aminoácidos y tiene más de un 80% de homología con el péptido mencionado anteriormente, en la que el péptido que tiene al menos un 80% de homología de secuencia y el fragmento retienen la actividad de penetración celular de la SEC. ID Núm.: En una realización de la presente invención, un principio activo puede ser al menos uno seleccionado de ácidos nucleicos, lípidos, glucolípidos, minerales, azúcares, sustancias de contraste, fármacos y compuestos químicos.
Un péptido de penetración celular desvelado en la presente memoria significa un péptido que puede transportar carga desde in vitro y/o in vivo hacia el interior de la célula. Una “carga” desvelada en la presente memoria comprende todas las sustancias que se pueden transportar dentro de la célula por medio de conjugación con un péptido de penetración celular. Por ejemplo, todas las sustancias que desean aumentar la efectividad de penetración celular, específicamente fármacos, cosméticos o principios activos de alimentos saludables, más específicamente sustancias que no se pueden transportar dentro de la célula por la vía general, más específicamente, azúcares, nanopartículas, formulación biológica, virus, sustancias de contraste u otros compuestos químicos que pueden tener proteínas, ácidos nucleicos, un péptido, minerales, glucosa como un ejemplo, pero no se limita a esos. Un “fármaco” desvelado en la presente memoria es un concepto amplio que incluye una sustancia que se transportará para el alivio, la profilaxis, el tratamiento o el diagnóstico de enfermedades, heridas o un síntoma específico.
Un “péptido portador” desvelado en la presente memoria es un péptido que puede transportar principios activos a un sitio diana a través de la conjugación con principios activos.
En una realización de la presente invención, un ácido nucleico es una molécula que pueden ser moléculas de ADN o de ARN espontáneas o artificiales, ya sean monocatenarias o bicatenarias. La molécula de ácido nucleico puede ser una o más ácidos nucleicos del mismo tipo (por ejemplo, que tienen una misma secuencia de nucleótidos) o ácidos nucleicos de diferentes tipos. Las moléculas de ácido nucleico comprenden uno o más ADN, ADNc, ADN señuelo, ARN, ARNip, miARN ARNhp, ARNtp, ARNnop, ARNnp PNA, oligómero antisentido, plásmidos y otros ácidos nucleicos modificados, pero no se limita a esos. En una realización de la presente invención, el virus comprende el virus entero o el núcleo del virus que incluye los ácidos nucleicos del virus. En una realización de la presente invención, una sustancia química es una indicación amplia que comprende una sustancia natural o sintética que puede actuar como un fármaco.
En una realización de la presente invención, el fármaco a administrar dentro de las células por un péptido permeable a células son liposomas, micelas, nanopartículas o puntos cuánticos como una administración de fármacos.
La expresión “sustancia de contraste” desvelada en la presente memoria es una indicación amplia que comprende todas las sustancias usadas para contrastar estructuras o fluidos dentro del cuerpo en formaciones de imágenes médicas. Una sustancia de contraste adecuada comprende un agente de contraste radioopaco, un agente de contraste paramagnético, un agente de contraste superparamagnético, CT (tomografía computarizada) y otras sustancias de contraste, pero no se limita a esos. Por ejemplo, un agente de contraste radioopaco (para formación de imágenes de rayos X) comprenderá un compuesto de yodo inorgánico y un compuesto de yodo orgánico (por ejemplo, diatrizoato), metales radioopacos y sus sales (por ejemplo, plata, oro, platino, etc.) y otros compuestos radioopacos (por ejemplo, sales de calcio, sales de bario tales como sulfato de bario, tántalo y tántalo oxidado). Una sustancia de contraste paramagnética adecuada (para la obtención de imágenes por RM) comprende el ácido dietilentriaminopentaacético de gadolinio (Gd-DTPA) y sus derivados, otros complejos de gadolinio, manganeso, hierro, disprosio, cobre, europio, erbio, cromo, níquel y cobalto, por ejemplo, el ácido tetraazaciclododecano-N,N',N”,N”'-tetraacético (DOTA), ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), 1,4,7,10-tetraaciclododecan-N,-N',N”-ácido triacético (DO3A), 1,4,7-triazaciclononano-N,N' ÁC iDo N”-TRIACÉTICO (NOTA), ácido 1 ,4,8, 10-tetraaciclotetradecano-N,N' N” N”'-tetraacético (TETA), ácido hidroxibencileno-diamina diacético (HBED). Una sustancia de contraste superparamagnética apropiada (para formación de imágenes de RM) comprende magnetita, óxido de hierro súper paramagnético (SPIO), óxido de hierro superparamagnético ultrapequeño (USPIO) y óxido de hierro monocristalino. Otras sustancias de contraste apropiadas son agentes de contraste CT yodados, no yodados, iónicos y no iónicos, una sustancia de contraste como etiqueta rotativa o agente eficaz para el diagnóstico.
Otros ejemplos de sustancias de contraste son la 13-galactosidasa, Proteína Fluorescente Verde, Proteína Fluorescente Cian, luciferasa, pero sin limitarse a ellas, y un gen marcador que codifica una proteína fácilmente detectable cuando se expresa en las células. Se pueden usar varios marcadores tales como radionúclidos, harina, enzima, enzima-sustrato, cofactores enzimáticos, inhibidores enzimáticos, ligandos (especialmente hapteno).
En un ejemplo de la presente invención, una sustancia de contraste es el ácido ferrocenocarboxílico de la fórmula química 2 a continuación. La estructura del ferroceno se muestra en la fórmula química 1.
[Fórmula química 1]
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[Fórmula química 2]
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En un ejemplo de la presente invención, un conjugado de péptido de penetración celular y una sustancia de contraste es Ferrocenocarboxílico-pep (Ferrocenocarboxílico-pep) que se muestra en la fórmula química 3 a continuación.
[Fórmula química 3]
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En una realización de la presente invención, un péptido o composición se puede fusionar con uno o más marcadores detectables. Los marcadores pueden ser compuestos que se pueden detectar en respuestas químicas, físicas o enzimáticas, o compuestos que generan señales directa o indirectamente en las respuestas. El marcaje y la detección después de eso se pueden llevar a cabo de acuerdo con el procedimiento conocido en la técnica (por ejemplo, Sambrook, J. y Russel, D.W.(2001); y Lottspeich, F. y Zorbas H. (1998) Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg/Berlín, Alemania). Los marcadores comprenden marcador fluorescente, marcador enzimático, marcador cromogénico, marcador luminiscente, marcador de radiación, hapteno, biotina, complejo de metal, oro metal y coloidal, pero no se limita a esos. Todas las formas de estos marcadores son muy conocidas en este campo de trabajo, se pueden obtener comercialmente de diversos proveedores.
En una realización de la presente invención, una carga se puede combinar directamente con el péptido. En otra realización de la presente divulgación, una carga se puede combinar con el péptido a través de diversos tipos de enlaces tales como enlaces covalentes o no covalentes. Una carga, por ejemplo, se puede combinar con el N-terminal o C-terminal del péptido en una realización de la presente invención. Por ejemplo, una carga puede estar unida al péptido por medio de enlaces disulfuro o enlaces covalentes. Los enlaces covalentes son los enlaces que una carga se puede unir a la a-amina del glutamato N-terminal, o la amina de los restos de lisina C-terminales. Además, un péptido y una carga se pueden combinar por medio de un enlace no covalente, que puede tener un péptido o una carga puede encapsular al otro en forma de cápsula.
En otra realización de la presente invención, un péptido se puede combinar con una carga a través de un enlazador. Por ejemplo, un péptido se puede combinar con una carga uniendo una carga a un conector después de introducir un conector tales como el conector Hynic (ácido 6-hidrazinopiridin-3-carboxílico), a la a-amina del glutamato N-terminal, o la amina de los restos de lisina C-terminales.
En otra realización de la presente invención, cuando una carga es ADN o ARN, el grupo SH (grupo tiol) se introduce en el péptido y el grupo maleimida se introduce en el ADN o ARN, después, el grupo SH del péptido y el grupo maleimida de ADN o ARN se combinan, para de ese modo crear un enlace entre la carga y el péptido.
En una realización de la presente invención, un péptido portador se combina con sustancias de tinción, sustancias fluorescentes, específicamente FITC (isotiocianato de fluoresceína). En una realización de la presente invención, FITC se combina con el grupo amino (NH3+) de lisina en el N-terminal o C-terminal de un péptido portador. En el caso de un péptido, en el que la lisina no existe en su extremo, el péptido se puede combinar con FITC a través de un conector que incluye lisina.
El péptido portador desvelado en la presente memoria que es el péptido que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC. ID Núm.: 98, o la SEC. ID Núm.: 153, o el péptido que consiste en 30 aminoácidos o menos y que tiene una homología de secuencia de aminoácidos superior al 80% con los péptidos anteriormente mencionados, o un fragmento del péptido anteriormente mencionado, se puede combinar con una carga en una fracción molar de 1: 1, pero se puede combinar en fracciones molares diferentes de 1:1. Por ejemplo, una fracción molar de CPP y una carga puede ser más de 2: 1, concretamente, más de 2: 1, más de 3: 1 , más de 4: 1 , más de 5: 1, más de 6: 1, más de 7: 1, más de 8: 1, más de 9:1 o más de 10:1. Esto significa que numerosas moléculas de péptidos portador se pueden combinar con una molécula de carga. Las numerosas moléculas de péptidos portador se pueden combinar en serie o en paralelo. “Combinado en serie” significa que un péptido portador y una molécula de carga se han de combinar en los aminoácidos terminales. “Combinado en paralelo” significa que se han de combinar en un sitio diferente de los aminoácidos terminales. Por otro lado, la fracción molar de un péptido portador y una carga puede ser más de 1:2. Esto significa que una molécula de péptido portador se puede combinar con numerosos números de una molécula de carga. Por otro lado, la fracción molar de un péptido portador y una carga puede ser más de 1:2, concretamente, más de 1:2, más de 1:3, más de 1:4, más de 1 :5, más de 1:6, más de 1: 7, más de 1:8, más de 1:9 o más de 1 :10.
Se puede encontrar fácilmente una vía de movimiento del péptido combinado con isotiocianato de fluoresceína. Por lo tanto, un péptido portador en una realización de la presente invención se usará para obtener imágenes celulares o detectar una trayectoria de suministro de fármacos dentro de una célula.
En una realización, la presente invención permite un uso del péptido portador de penetración celular como un portador de fármacos para transportar más de un principio activo, en el que el péptido portador de penetración celular consiste en la SEC. ID Núm.: 98 a la SEC. ID Núm.: 153. El uso puede indicar un uso terapéutico o no terapéutico.
En una realización, la presente invención permite un péptido portador de penetración celular que consiste en la SEC. ID Núm.: 98 o 153 para su uso en un procedimiento de administración de fármacos en el interior de una célula de un sujeto que comprende una etapa de administración de una composición que comprende un fármaco; y se proporciona el péptido.
En una realización la presente invención permite un péptido portador de penetración celular que consiste en la SEC. ID Núm.: 98 o 153 para su uso en un procedimiento para detectar la trayectoria de administración del fármaco que comprende una etapa de aplicación del conjugado del péptido y una sustancia de contraste a un sujeto.
En una realización la presente invención permite un péptido portador de penetración celular que consiste en la SEC. ID Núm.: 98 o 153 para su uso en un procedimiento para detectar la trayectoria de administración del fármaco que comprende una etapa de aplicación del conjugado del péptido y una sustancia de contraste a un sujeto.
En una realización la presente invención permite un kit para la administración de fármacos a una célula de un sujeto que contiene la composición e instrucciones, en el que la composición comprende un conjugado de un péptido de la invención y un fármaco para administración, en el que el péptido, un péptido portador de penetración celular que consiste en la SEC. ID Núm.: 98 o 153, en la que la instrucción incluye al menos una dosis de administración, vía de administración, frecuencia de administración e indicación de la composición.
En una realización, la presente invención permite la composición cosmética o alimentaria que comprende un principio activo; y el péptido; en el que el péptido es un péptido portador de penetración celular que consiste en la SEC. ID Núm.: 98 o 153.
Las mitocondrias, como un orgánulo central en el metabolismo energético de una célula eucariota, es un primer orgánulo intracelular que se sabe que está relacionado con enfermedades humanas (Luft R., Ikkos D., Palmieri G., Ernster L., Afzelius B.: A case of severe hypermetabolism of non thyroid origin with a defect in the maintenance of mitochondrial respiratory control: a correlated clinical, biochemical, and morphological study, J. Clin. Invest. 41: 1776 a 1804, 1962).
Dado que las mitocondrias juegan un papel importante en el control del metabolismo energético de las células y la apoptosis, actúan como una diana principal para diversos fármacos terapéuticos. Además, este orgánulo está implicado en el control de la concentración de calcio dentro de la célula, la cadena respiratoria mitocondrial actúa como un sistema de transporte de electrones que es importante en la producción de energía y provoca la producción de especies reactivas de oxígeno. Como resultado, la función mitocondrial anormal tiene una estrecha relación con enfermedades de adultos tales como la diabetes, cardiomiopatía, infertilidad, ceguera, enfermedades renales/hepáticas, e ictus (Modica-Napolitano K. S., Singh K.K.: April mitochondria as targets for detection and treatment of cancer. Expert. Rev. Mol. Med. 11:1 a 19, 2002). Además, se está sugiriendo que las mutaciones genéticas mitocondriales estén implicadas en el estallido del envejecimiento, enfermedad neuronal degenerativa y cáncer, etc.
El sistema de administración dirigido a las mitocondrias se puede proporcionar de acuerdo con una realización de la presente invención puede comprender uno cualquiera de los conjugados de acuerdo con la invención, en el que el péptido portador se desplaza a la mitocondria intracelular localmente y desempeña un papel de mitocondria intracelular local que entrega los principios activos mencionados.
Una composición de ajuste de la actividad mitocondrial de acuerdo con una realización de la presente invención, en la que la composición para el tratamiento de enfermedades o trastornos relacionados con las mitocondrias, la prevención, la inhibición del progreso o el alivio de los síntomas como una composición farmacéutica, en la que el principio activo se tratará para una enfermedad o trastorno relacionado con las mitocondrias, la prevención, la inhibición del progreso o el alivio de los síntomas.
Las “enfermedades relacionadas con las mitocondrias” desveladas en la presente memoria comprenden la enfermedad de Huntington, la esclerosis lateral amiotrófica, la MELAS (encefalomiopatía mitocondrial con acidemia láctica y episodios similares a accidentes cerebrovasculares), la MERRF (mioclonía, epilepsia y miopatía con fibras rojas irregulares), la NARP/MILS (debilidad muscular neurogénica, ataxia, retinosis pigmentaria/síndrome de Leigh hereditario por vía materna); LHON (neuropatía óptica hereditaria de Lebers); KSS (síndrome de Kearns-Sayre); PMPS (síndrome de Médula-Páncreas de Pearson-Sayre); CPEO (Oftalnoplejia externa progresiva crónica); Síndrome de Reye; Síndrome de Alper; Síndrome de deleción múltiple de ADNmt; Síndrome de depleción de ADNmt; Deficiencia de Complejo I; Deficiencia de Complejo Il (SDH); Complejo de Deficiencia Ill; Deficiencia de citocromo c oxidasa (COX, complejo IV); Deficiencia de complejo V; Deficiencia de translocador de nucleótidos de adenina (ANT); Deficiencia de piruvato deshidrogenasa (PDH); aciduria de ácido etil malónico con acidemia ácido láctica; aciduria de ácido 3-metil glutacónico con acidemia ácido láctica; epilepsia refractaria que representa un declive durante la infección; síndrome de Asperger que representa un declive durante la infección; autismo que representa un declive durante la infección; trastorno por déficit de atención con hiperactividad (TDAH); parálisis cerebral que representa una disminución durante la infección; Alexia que representa una disminución durante la infección; Trombocitopenia hereditaria materna; Leucemia; MNGIE (miopatía mitocondrial, neuropatía periférica y autonómica, disfunción gastrointestinal y epilepsia); Síndrome MARIAHS (ataxia mitocondrial, infección recrudeciente, afasia, hipouricemia/hipomielinización, convulsiones y aciduria dicarboxílica); distonía ND6; Síndrome de vómitos cíclicos que representa una disminución durante la infección; aciduria 3-hidroxiisobutírica que presenta acidemia láctica; diabetes que presenta acidemia láctica; síndrome neuronal reactivo a la uridina (URNS); necrosis familiar bilateral del cuerpo estriado (FBSN); Pérdida de audición relacionada con aminoglucósidos; Miocardiopatía relajada; Linfoma de bazo; Síndrome de Wolframs; Síndrome de deleciones múltiples 20 del ADN mitocondrial; y Síndrome de acidosis/diabetes/ataxia tubular renal, pero sin limitarse a ellos.
En otra realización de la presente invención, se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican un péptido portador de penetración celular consistente en la SEC. ID Núm.: 98 o 153. Las moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, tienen secuencias de bases de GAA GCG CCC CCC GCG CTG CTG ACC AGC CCC CTG CCC TTT ATT CCC AAA (SECUENCIA Núm.: 181). Los ácidos nucleicos se pueden introducir en la célula hospedadora de acuerdo con un procedimiento conocido por los expertos en la técnica. Por ejemplo, los procedimientos conocidos pueden ser el procedimiento de transformación por medio de fosfato cálcico, liposomas, electroporación, contacto entre un virus y una célula, o microinyección directamente en la célula, etc. La célula huésped es una célula eucariota superior, por ejemplo, células de mamífero, o células eucariotas inferiores, tales como una célula de levadura, o células procariotas, tal como una célula bacteriana. Las células hospedadoras procariotas apropiadas para la transformación pueden ser las especies que pertenecen a E. coli, Bacillus subtillis, Salmonella typhimurium, Pseudomonas, Streptomyces y especies de microbacterias, como ejemplos.
El vector que incluye las moléculas de ácido nucleico mencionadas anteriormente es generalmente un vector de expresión recombinante y comprende, el origen de replicación que permite una transformación de la célula hospedadora y un marcador seleccionable (por ejemplo, dihidrofolato reductasa para el cultivo de células eucariotas o tolerancia a neomicina, tolerancia a tetraciclina o a ampicilina en E. coli o el gen TRP1 de S. cerevisiae) y el promotor para controlar la transcripción de secuencias de recubrimiento de proteínas. Los vectores de expresión disponibles son, por ejemplo, plásmidos bacterianos conocidos tales como SV40, derivados de pcADN, y plásmidos bacterianos conocidos tales como colE1, pCR1, pBR322, μMal-C2, PET, pGEX (Smith, et al., Gen 67: 31 a 40 (1988)), plásmidos tales como μMB9 y su derivado RP4, ADN de fagos que es el mismo que numerosos derivados del fago I tales como NM989, ADN de fago tales como M13 y ADN de fago monocatenario de tipo filamento; plásmido de levadura, por ejemplo, ADN fago o vector inducido a partir de una combinación de plásmido modificado para usar secuencias de supresión de expresión y ADN fago. Los vectores de expresión de mamíferos comprenden el origen de replicación, un promotor apropiado y un potenciador. Además, pueden comprender sitios obligatorios de unión a ribosomas, sitios de poliadenilación, donador de empalme y parte del receptor, secuencias de terminación de la transcripción y secuencias no transcripcionales de entablado 5'. Los vectores de expresión de mamíferos pueden comprender un promotor inducible, por ejemplo, un vector que contiene el promotor de dihidrofolato reductasa, cualquier vector de expresión que contenga casete de expresión DHFR o vector de coamplificación DHFR/metotrexato tales como pED (Randal J, kaufman, 1991, Randal J. Kaufman, Current Protocols in Molycular Biology, 16, 12 (1991)). O, el vector de co-amplificación de glutamina sintetasa/metionina sulfoximina, por ejemplo, pEE14 (Celltech), Virus Epstein-Barr (VEB) o un vector que dirige la expresión episómica bajo el control del antígeno nuclear (EBNA), por ejemplo, se pueden usar pREP4 (Invitrogen), pCEP4 (Invitrogen), μMEP4 (Invitrogen), pREP8 (Invitrogen), pREP9 (Invitrogen) y pEBVHis (Invitrogen). Los vectores de expresión de mamíferos seleccionables son Rc/CMV (Invitrogen) y pRc/RSV (Invitrogen), etc. Los vectores de expresión de mamíferos del virus vacuna que se pueden usar en la presente invención son pSC11, μMJ601, pTKgptF1S, etc.
El sistema de vector de expresión de levadura que se usará es el vector pYES2 sin fusión (Invitrogen), pYESHisA, B, C de fusión (Invitrogen), vector pRS, etc.
Los vectores mencionados anteriormente se pueden introducir en diversas células, tales como células de mamíferos que son especialmente las células derivadas de humanos, o bacterias, levaduras, hongos, insectos, nematodos y células vegetales. Los ejemplos de células apropiadas son la célula VERO, la célula HELA, por ejemplo, ATCC Núm. CCL2, la línea celular CHO, por ejemplo, ATCC Núm. CCL61, célula COS, por ejemplo, célula COS-7 y célula ATCC Núm. CRL 1650, WI 38, BHK, HepG2, 3T3, por ejemplo, ATCC Núm. CRL6361 , A549, PC12, célula K562, célula 293, célula Sf9, por ejemplo, ATCC Núm. CRL1711 y célula cvl, tales como ATCC Núm. CCL70, etc.
Otras células apropiadas para su uso son cepas de células hospedadoras procariotas, por ejemplo, las cepas pertenecientes a E. coli (por ejemplo, cepa DH5-a), Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus.
En una realización de la presente invención, la composición de acuerdo con la invención puede contener de 0,1 μg/mg a 1 mg/mg, específicamente de 1 μg/mg a 0,5 mg/mg, más específicamente de 10 μg/mg a 0,1 mg/mg del péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 98, o la SEC. ID Núm.: 153, o, un péptido que consiste en 30 o menos aminoácidos y por encima de 80% de homología de la secuencia de aminoácidos anterior con las secuencias anteriormente mencionadas, o un fragmento peptídico de los péptidos anteriormente mencionados. Cuando el péptido está contenido en el intervalo mencionado anteriormente, toda la seguridad y estabilidad de la composición se puede satisfacer y ser apropiada en términos de rentabilidad.
En una realización de la presente invención, la composición puede tener aplicación con todos los animales que incluyen humano, perro, pollo, cerdo, vaca, oveja, cobaya y mono.
En una realización de la presente invención, la composición farmacéutica se puede administrar por medio de medios orales, rectales, transdérmicos, intravenosos, intramusculares, intraperitoneales, en la médula ósea, epidurales o subcutáneos.
Las formas de administración oral pueden ser, pero no se limitan a, comprimidos, píldoras, cápsulas blandas o duras, gránulos, polvos, solución o emulsión. Las formas de administración no oral pueden ser, pero no se limitan a, inyecciones, goteos, lociones, pomadas, geles, cremas, suspensiones, emulsiones, supositorio, parche o pulverizador.
En una realización de la presente invención, la composición farmacéutica, si es necesario, puede contener aditivos, tales como diluyentes, excipientes, lubricantes, aglutinantes, disgregantes, tampones, dispersantes, tensioactivos, agentes colorantes, aromáticos o edulcorantes. En una realización de la presente invención, la composición farmacéutica se puede fabricar por procedimientos convencionales de la industria en la técnica.
En una realización de la presente invención, el principio activo de la composición médica puede variar de acuerdo con la edad del paciente, el sexo, el peso, la patología y el estado, la vía de administración o el juicio del prescriptor. La dosificación basada en estos factores se determina dentro de los niveles de los expertos en la técnica, y la dosis diaria por ejemplo puede ser, pero no se limita a, 0,1 |jg / kg / día a 1 g / kg / día, específicamente 1 |jg / kg / día a 10 mg / kg / día, más específicamente 10 jg / kg / día a 1 mg / kg / día, más específicamente el 50 jg / kg / día a 100 jg / kg / día. En una realización de la presente invención, la composición farmacéutica se puede administrar, pero no se limita a, 1 a 3 veces al día.
En una realización de la presente invención, la composición cosmética se puede suministrar en todas las formas apropiadas para aplicaciones tópicas. Por ejemplo, las formas se pueden proporcionar como soluciones, emulsiones obtenidas por dispersión de fase oleaginosa en agua, emulsión obtenida por dispersión de agua en fase oleaginosa, suspensión, sólido, gel, polvo, pasta, espuma o aerosol. Estas formas se pueden fabricar por procedimientos convencionales de la industria en la técnica.
En una realización de la presente invención, la composición cosmética puede incluir, dentro de niveles que no dañarán el efecto principal, otros ingredientes que pueden aumentar deseablemente el efecto principal. En una realización de la presente invención, la composición cosmética puede incluir adicionalmente humectante, agentes emolientes, tensioactivos, absorbentes de UV, conservantes, fungicidas, antioxidantes, agente de ajuste de pH, pigmentos orgánicos o inorgánicos, aromáticos, agente refrigerante o antitranspirante. Los expertos en la técnica pueden decidir la proporción de formulación de los ingredientes mencionados anteriormente dentro de niveles que no perjudiquen el fin y los efectos de la presente invención, y la proporción de formulación basada en el peso total de la composición cosmética puede ser del 0,01 al 5% en peso, específicamente del 0,01 al 3% en peso.
En una realización de la presente invención, la composición alimentaria no se limita a formas, sino que por ejemplo puede estar en forma de gránulos, polvo, líquidos, y formas sólidas. Cada forma se puede formar con ingredientes de uso común en la industria seleccionados adecuadamente por los expertos en la técnica, además del principio activo, y puede aumentar el efecto con otros ingredientes.
La decisión sobre la dosificación del principio activo anteriormente mencionado está al alcance de los expertos en la técnica, y la dosificación diaria, por ejemplo, puede ser de 1 jg / kg / día a 10 mg / kg / día, más específicamente 10 jg / kg / día a 1 mg / kg / día, más específicamente 50 jg / kg / día a 100 jg / kg / día, pero no se limita a estos números y puede variar de acuerdo con la edad, estado de salud, complicaciones y otros factores diversos.
Los términos usados en la presente memoria se pretenden usar para describir las realizaciones, no para limitar la presente invención. Los términos sin números delante no son para limitar la cantidad, sino para mostrar que puede haber más de una cosa del término usado. Las expresiones “que incluye”, “que tiene” y “que comprende” se interpretarán abiertamente (es decir, “que incluye pero no se limita a”).
Se usa la mención del intervalo de números en lugar de indicar números separados dentro del intervalo, así que a menos que se indique explícitamente, cada número se puede leer como números separados integrados en la presente memoria. Los valores finales de todos los intervalos se incluyen en el intervalo y se pueden combinar de forma independiente.
A menos que se indique lo contrario o se contradiga claramente en contexto, todos los procedimientos mencionados en la presente memoria se pueden llevar a cabo en el orden apropiado. El uso de cualquier realización y de todas las realizaciones, o el lenguaje ejemplar (por ejemplo, que usen “como ~”), a menos que se incluya en las reivindicaciones, se usa para describir más claramente la presente invención, no para limitar el alcance de la misma. Cualquier lenguaje en la presente memoria fuera de las reivindicaciones no se debe interpretar como una necesidad de la presente invención. A menos que se defina de otra manera, los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen un significado normalmente entendido por los expertos en la técnica a la que pertenece la presente invención.
Las realizaciones preferidas de la presente invención son el mejor modo conocido por los inventores para llevar a cabo la presente invención. Puede resultar claro para los expertos en la técnica después de leer las declaraciones antes de las variaciones en las realizaciones preferidas. Los presentes inventores esperan que aquellos expertos en la técnica puedan usar las variaciones adecuadamente y que la presente invención se lleve a cabo de otras maneras diferentes a las listadas en la presente memoria. Por lo tanto, la presente invención, de acuerdo con lo permitido por la ley de patentes, incluye equivalentes y variaciones de los mismos, de los puntos clave de la invención establecidos en las reivindicaciones adjuntas. Además, todas las variaciones posibles dentro de cualquier combinación de los componentes anteriormente mencionados se incluyen en la presente invención, salvo que se indique explícitamente de otra manera o se contradiga en el contexto.
Ejemplo 1: Síntesis de péptido
Los péptidos de la SEC. ID Núm.: 1 a la SEC. ID Núm.: 156 se sintetizaron de acuerdo con el procedimiento existente de síntesis de péptidos en fase sólida. En detalle, los péptidos se sintetizaron acoplando cada aminoácido del C-terminal a través de la síntesis de péptidos en fase sólida Fmoc, SPPS, mediante el uso de ASP48S (Peptron, Inc., Daejeon ROK). Los péptidos con su primer aminoácido en el C-terminal uniéndose a la resina se usaron de la siguiente manera:
Resina de NH2-Lys(Boc)-2-cloro-Tritilo
Resina de NH2-Ala-2-cloro-Tritilo
Resina de NH2-Arg(Pbf)-2-cloro-Tritilo
Todos los materiales de aminoácidos para sintetizar el péptido estaban protegidos por Fmoc en el N-terminal y los restos de aminoácidos estaban protegidos por Trt, Boc, t-Bu (t-butiléster), Pbf (2,2,4,6,7-pentametil dihidro-benzofuran-5-sulfonilo) que se pueden disolver en ácido. Tales como:
Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-lle-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ahx-OH, Trt-Ácido mercaptoacético.
HBTU[2-(1H-Benzotriazol-1-il)1,3,3-tetametilaminio hexafluorofosfato]/HOBt [N-hidroxibenzotriazol]/NMM [4-metilmorfolina] se usaron como reactivos de acoplamiento. En el 20% de DMF, se usó piperidina para retirar Fmoc. A fin de retirar la protección del resto o para separar el péptido sintetizado de la resina, se usó cóctel de escisión [FA (ácido trifluoroacético)/TIS (triisopropilsilano)/EDT (etanoditiol)/H2O = 92,5/2,5/2,5/2,5].
Los péptidos se sintetizaron mediante el uso del andamiaje en fase sólida por medio de la adición de cada aminoácido con los siguientes procesos secuenciales: protección del aminoácido, reacción de acoplamiento, lavado y desprotección. Después de cortar el péptido sintetizado de la resina, se purificó por HPLC y se verificó la síntesis por MS y después se secó por congelación.
El procedimiento de síntesis de péptidos específico se describe por medio de lo siguiente con el ejemplo de Pep1 de la SEC. ID Núm.: 164 (EARPALLTSRLRFIPK):
1) Acoplamiento
El aminoácido (equivalente 8) protegido con la resina de NH2-Lys(Boc)-2-cloro-Tritilo se fundió en el agente de acoplamiento HBTU (8 equiv.)/HOBt (8 equiv.)/NMM (16 equiv.) y tras la adición de DMF, la mezcla de reacción se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas, después se lavó secuencialmente con DMF, MeOH y DMF.
2) Desprotección de Fmoc
Después de la adición de piperidina al 20% en DMF, la mezcla de reacción se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos 2 veces, después se lavó secuencialmente con DMF, MeOH y DMF.
3) Fabricar el marco básico del péptido por medio de la repetición de las reacciones 1 y 2 repetidamente.
4) Escisión: Añadir el Cóctel de Escisión al péptido completamente sintetizado y separar el péptido de la resina.
5) Añadir éter dietílico pre-enfriado a la mezcla y después centrifugar la mezcla de reacción para precipitar los péptidos.
6) Después de la purificación por Prep-HPLC, comprobar el peso molecular por CL/EM y liofilizar para obtener los péptidos en forma de polvo.
Ejemplo 2: Preparación de conjugado pep(CPP)-FITC
(1) Preparación del conjugado ATC-CPP
Un conjugado de los péptidos con la SEC. ID Núm.: 1 a la SEC. ID Núm.: 156 combinado con FITC se fabricó de la siguiente manera, por ejemplo, un conjugado de pep1 (SEC. ID Núm.: 157) y FITC, en otras palabras, se fabricó FITC-enlazador-pep1 de la siguiente manera.
El marco básico del péptido, Resina de NH2-enlazador-E(OtBu)-A-R(Pbf)-P-A-L-L-T(tBu)-S(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf-F-I-P-K(Boc)-2-cloro-Tritilo) que se obtuvo de acuerdo con los procedimientos de fabricación descritos en el Ejemplo 1 , se hizo reaccionar con FITC. En concreto, FITC (fluoresceína-5isotiocianato) (8 equivalente) y DIPEA (N,N-Diisopropiletilamina) (16 equivalentes) se fundieron en DMF. Se añadió la solución de DMF y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 2 horas, después se lavó secuencialmente con DMF, MeOH y DMF. Como resultado, se obtuvo una Resina de FITC-enlazador-E(OtBu)-A-R(Pbf)-P-A-L-L-T(tBu)-S(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf)-F-I-P-K(Boc)-2-cloro-Tritilo. El enlazador en la presente memoria es ácido 6-aminohexanoico, Ahx. Se añadió TFA/TIS/H2O = 95/2,5/2,5 al péptido fabricado sobre la resina y el conjugado se separó de la resina. Se añadió un éter dietílico pre­ enfriado a la mezcla obtenida y se usó centrifugación para precipitar los conjugados peptídicos. Después de la purificación por Prep-HPLC, la pureza se confirmó con la HPLC analítica y el peso molecular se determinó por CL/EM. El péptido sintetizado como se describió anteriormente se verificó como FITC-pep1 por medio de la confirmación del peso molecular por CL/EM. Después los conjugados se liofilizaron. La SEC. ID Núm.: 1 a la SEC. ID Núm.: 156 de péptidos fusionados FITC con conjugado también se prepararon de la misma manera que pep 1 de la SEC. ID Núm.: 157.
(2) Preparación de un conjugado CPP-FITC
El marco básico del péptido, (Resina NH2-E(OtBu)-A-R(Pbf)-P-A-L-L-T(tBu)-S(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf)-F-I-P-K(Dde)-2-cloro-Tritilo) se generó de acuerdo con los procedimientos de fabricación descritos en el Ejemplo 21 (1). Para introducir selectivamente FITC al C-terminal del péptido, el N-terminal del péptido estaba protegido de Boc. Después, el di-tercdicarbonato de butilo (30 equivalentes) y DIPEA (30 equivalentes) se fundieron en DMF. La solución de DMF se añadió al péptido y se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas y el péptido se lavó secuencialmente con DMF, MeOH y DMF. Como resultado, se obtuvo una Resina de Boc-E(OtBu)-A-R(Pbf)-P-A-L-L-T(tBu)-S(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf)-F-I-P-K(Dde)-2-cloro-Tritilo. Se usó hidrazina en 2% de DMF para retirar Dde, que es el grupo protector del resto Lys C-terminal a fin de añadir FITC al C-terminal de Lys. Después, FITC (8 equivalentes) y DIPEA (16 equivalentes) se fundieron en DMF que se añadió a la mezcla de reacción peptídica y la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas, después se lavó secuencialmente con DMF, MeOH, DMF. Como resultado, se obtuvo una Resina de Boc-E(OtBu)-A-R(Pbf)-P-A-L-L-T(tBu)-S(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf)-F-I-P-K(FITC)-2-cloro-tritilo. Se añadió TFA/TIS/H2O = 95/2,5/2,5 para separar el péptido de la resina. Se añadió éter dietílico preenfriado a la mezcla, y se usó centrifugación para precipitar los péptidos. Después de la purificación por Prep-HPLC, la pureza se confirmó con la HPLC analítica y el peso molecular se confirmó con CL/EM. Las sustancias obtenidas se verificaron como pep1-FITC por medio de la confirmación del peso molecular por CL/EM. Después los conjugados se liofilizaron. La SEC. ID Núm.: 1 a la SEC. ID Núm.: 156 de conjugados péptido-FITC también se prepararon de la misma manera que pep1-FITC descrito anteriormente.
Ejemplo 3: Penetración celular experimental del conjugado pep(CPP)-FITC
(1) Penetración celular experimental de la línea celular HeLa
Cultivo celular
Línea celular de adenocarcinoma de cuello uterino Homo sapiens como líneas celulares HeLa se adquirieron a ATCC (American Type Cell Culture). Las células se cultivaron en MEM suplementado con suero bovino fetal al 10% (Invitrogen, e E.UU.), EarleSA), las líneas Huh7 de Earle se obtuvieron de AT piruvato y 100 μg/ml de penicilina y 10 unidades/ml de estreptomicina y se cultivaron a 37 °C, en una incubadora de CO2 al 5%.
Análisis de citometría de flujo y microscopía confocal de penetración celular
La citometría de flujo y el análisis de microscopio confocal se llevaron a cabo para comparar el grado de captación celular de las células que se trataron con la SEC. ID Núm.: 1 a la SEC. ID Núm.: 156, pep (CPP) y control.
La línea celular se dividió en una placa de 6 pocillos y se cultivó en un medio que contenía
10% de suero bovino fetal (Invitrogen, EE.UU.), 100 μg/ml de penicilina, 100 unidades/ml de estreptomicina a 37 °C, incubadora al 5% de CO2 durante 12 horas. Después de lavar la línea celular con PBS, se indujeron ayunas en Medio Esencial Mínimo durante una hora. Se trataron 20 μM de cada péptido portador y se cultivaron a 37 °C durante una hora. Después de repetir la etapa de lavar las células con PBS por tres veces, se trató la forma Trypsin-EDTA 10 min a 37 °C para separar el péptido portador en el exterior de la célula. Las células se recolectaron con PBS refrigerado y se centrifugaron para repetir la etapa de lavado de las células por tres veces. Después de eso, las células se suspendieron en 0,5 ml de PBS que contenía 4% de paraformaldehído y se analizó la fluorescencia de las células mediante el uso de FACS Calibur (Becton Dickinson). Se comparó el aspecto de la captación celular del control y diversos péptidos combinados con FITC y se analizó por IFM (Intensidad de fluorescencia media).
Los resultados son como se muestra en las Figs. 1 a 23. Los resultados del análisis mostrado en la Fig. 1 a la Fig. 23 se dan con detalle en la Tabla 3 a continuación.
[TABLA 3]
Figure imgf000018_0001
Figure imgf000019_0001
(2) Propiedad de penetración celular de la línea celular Huh7
Cultivo celular
La línea celular de carcinoma hepatocelular humano como líneas Huh7 se adquirió de ATCC (American Type Cell Culture) y se usó como células suspendidas. Las células se cultivaron en MEM suplementado con suero bovino fetal al 10% (Invitrogen, EE.UU.), EarleSA), las líneas Huh7 de Earle se obtuvieron de a T piruvato y 100 μg/ml de penicilina y 10 unidades/ml de estreptomicina y se cultivaron a 37 °C, en una incubadora de CO2 al 5%.
El análisis de detección de penetración celular usado por citometría de flujo
Para confirmar la penetración celular de los péptidos, las líneas celulares Huh7 se trataron con la SEC. ID Núm.: 1 a la SEC. ID Núm.: 156 y se analizaron por citometría de flujo. El procedimiento analizado también se confirmó de la misma manera que se describió anteriormente en el ejemplo (1) en líneas celulares Hela. Además, el resultado se mostró en la Fig. 24 a la Fig. 43.
(3) Penetración celular experimental en líneas celulares de linfocitos T humanos
Cultivo celular
La línea celular humana de leucemia de células T como Jurket se adquirió de ATCC (American Type Cell Culture) y se usaron como células en suspensión. Las células se cultivaron en RPMI 1640 suplementado con un 10% de suero bovino fetal (Invitrogen, EE.UU.), EarleSA), EarleC (American Type Cell Culture) y piruvato y 100 om ATCC (American Type unidades/ml de estreptomicina y se cultivaron a 37 °C, incubadora al 5% de CO2. Los linfocitos derivados de humanos (linfocitos) se separaron de la sangre humana sana (50 ml) y después se recolectó la capa de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y los linfocitos se usaron por medio de solución de separación Biocoll (Biochrom AG, Berlín, Alemania).
El análisis de detección de penetración celular usado por citometría de flujo
Para confirmar la penetración celular de los péptidos, las líneas celulares de leucemia de linfocitos T humanos se trataron con la SEC. ID Núm.: 1 a la SEC. ID Núm.: 156 y se analizaron por citometría de flujo. El procedimiento analizado también se confirmó de la misma manera que se describió anteriormente en el ejemplo (1) en líneas celulares Hela. Además, el resultado se mostró en la Fig. 44 a la Fig. 58.
(4) Análisis de viabilidad celular y toxicidad
La línea celular se dividió en una placa de 96 pocillos y se cultivaron en un medio que contenía suero bovino fetal al 10% (Invitrogen, EE.UU.), 100 μg/ml de penicilina, 100 unidades/ml de estreptomicina a 37 °C, incubadora al 5% de CO2 durante 12 horas. Después de lavar la línea celular con PBS, se indujeron ayunas en Medio Esencial Mínimo durante una hora. Se trataron 20 uM de cada péptido portador y se cultivaron a 37 °C durante una hora. Después de cultivar las células, se analizó la viabilidad celular y la toxicidad usada por el ensayo MTT. Los resultados se mostraron en la Fig. 59 a la Fig. 72.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un conjugado de un péptido portador de penetración celular y un principio activo, en el que el péptido portador es un péptido que consiste en la SEC. ID Núm.: 98 o 153, un fragmento de cualquiera de dicho péptidos, o un péptido compuesto por 30 o menos aminoácidos y que tenga al menos un 80% de homología con la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 98 o 153, en el que el péptido que tiene al menos un 80% de homología y el fragmento retienen la capacidad de penetración celular de la SEC. ID Núm.: 98 o 153 y en el que el principio activo no es una proteína o un péptido.
2. El conjugado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el péptido portador consiste en la SEC. ID Núm.: 98 o 153.
3. El conjugado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el principio activo es al menos uno seleccionado entre un ácido nucleico, un lípido, un glicolípido, un mineral, un azúcar, una nanopartícula, productos biológicos, un agente de contraste, fármacos y compuestos químicos.
4. El conjugado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el péptido portador y el principio activo están conjugados a través de
a) un enlace covalente, opcionalmente mediado por un enlazador; o
b) un enlace no covalente.
5. El conjugado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el principio activo es un agente de contraste.
6. El conjugado de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el agente de contraste se selecciona del grupo que consiste en agente de contraste radioopaco, agente de contraste paramagnético, agente de contraste superparamagnético y agente de contraste CT.
7. El conjugado de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el agente de contraste se basa en hierro, opcionalmente un carboxilato de ferroceno.
8. El conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, para su uso en el contraste de una célula, opcionalmente una célula madre.
9. Una composición que comprende el conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que es una composición farmacéutica, una composición cosmética o una composición alimenticia saludable.
10. La composición farmacéutica de la reivindicación 9, para su uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad.
11. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 10, para el tratamiento o la prevención de una enfermedad neuronal degenerativa o cáncer.
12. Un procedimiento para administrar un principio activo a una célula, opcionalmente a la mitocondria dentro de una célula, que comprende administrar el conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 a una célula in vitro, en el que el péptido portador es un péptido de penetración celular que logra la administración del principio activo a la célula.
13. Un péptido portador de penetración celular, en el que el péptido portador consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 98 o 153.
14. Un polinucleótido que codifica el péptido de acuerdo con la reivindicación 13.
15. Una célula transformada que comprende un vector que comprende un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 14.
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Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101997757B1 (ko) 2012-05-11 2019-07-08 주식회사 젬백스앤카엘 악액질 예방 또는 치료용 조성물
CN115927242A (zh) 2012-05-11 2023-04-07 珍白斯凯尔有限公司 具有抗炎活性的肽及其在制备抗炎组合物中的应用
EP2873678B8 (en) 2012-07-11 2024-07-17 Gemvax & Kael Co., Ltd. Conjugate comprising a cell-penetrating peptide and compositions comprising same
US20150125438A1 (en) 2012-07-20 2015-05-07 Sang Jae Kim Anti-Inflammatory Peptides and Composition Comprising the Same
TWI616530B (zh) * 2012-09-19 2018-03-01 傑姆維克斯＆凱爾有限公司 穿膜胜肽以及包含該胜肽之共軛物及組成物（一）
JP6352923B2 (ja) 2012-09-19 2018-07-04 ジェムバックス アンド カエル カンパニー，リミティド 細胞透過性ペプチド、それを含んだコンジュゲート、及びそれを含んだ組成物
KR102201430B1 (ko) 2012-09-19 2021-01-12 주식회사 젬백스앤카엘 세포 투과성 펩티드, 그를 포함한 컨쥬게이트 및 그를 포함한 조성물
TWI616531B (zh) 2012-09-19 2018-03-01 傑姆維克斯＆凱爾有限公司 穿膜胜肽以及包含該胜肽之共軛物及組成物（二）
ES2716870T3 (es) 2013-04-19 2019-06-17 Gemvax & Kael Co Ltd Composición para el tratamiento y prevención de lesión isquémica
BR112015030627A2 (pt) 2013-06-07 2017-07-25 Gemvax & Kael Co Ltd marcadores biológicos úteis na imunoterapia contra o câncer
US10561703B2 (en) 2013-06-21 2020-02-18 Gemvax & Kael Co., Ltd. Method of modulating sex hormone levels using a sex hormone secretion modulator
WO2015060673A1 (ko) 2013-10-23 2015-04-30 주식회사 카엘젬백스 전립선 비대증 치료 및 예방용 조성물
US10034922B2 (en) 2013-11-22 2018-07-31 Gemvax & Kael Co., Ltd. Peptide having angiogenesis inhibitory activity and composition containing same
KR102314231B1 (ko) 2013-12-17 2021-10-19 주식회사 젬백스앤카엘 전립선 암 치료용 조성물
KR102373603B1 (ko) * 2014-04-11 2022-03-14 주식회사 젬백스앤카엘 섬유증 억제 활성을 가지는 펩티드 및 이를 포함하는 조성물
WO2015167067A1 (ko) 2014-04-30 2015-11-05 주식회사 카엘젬백스 장기, 조직 또는 세포 이식용 조성물, 키트 및 이식 방법
KR102413243B1 (ko) 2014-12-23 2022-06-27 주식회사 젬백스앤카엘 안질환 치료 펩티드 및 이를 포함하는 안질환 치료용 조성물
KR102636129B1 (ko) 2015-02-27 2024-02-14 주식회사 젬백스앤카엘 청력 손상 방어용 펩타이드 및 이를 포함하는 조성물
WO2016190660A1 (ko) 2015-05-26 2016-12-01 주식회사 젬백스앤카엘 신규 펩티드 및 이를 포함한 조성물
KR101647804B1 (ko) * 2015-06-24 2016-08-11 한국과학기술연구원 신규 세포투과 펩타이드 및 이의 용도
EP3318265B1 (en) 2015-07-02 2021-08-18 Gemvax & Kael Co., Ltd. Peptide having anti-viral effect and composition containing same
JP2018532381A (ja) * 2015-08-28 2018-11-08 ザ メディカル カレッジ オブ ウィスコンシン インクＴｈｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， Ｉｎｃ． テロメラーゼ移行のペプチド阻害剤およびその治療的使用
ES2949697T3 (es) 2016-04-07 2023-10-02 Gemvax & Kael Co Ltd Péptido que tiene efectos de aumento de la actividad telomerasa y de extensión de los telómeros, y composición que contienen el mismo
KR101710186B1 (ko) * 2016-09-01 2017-03-10 (주)에이씨티 6-아미노헥사노산 유도체 및 그 유도체를 함유하는 광반응성 화장료 조성물
KR101843830B1 (ko) * 2016-09-27 2018-04-02 (주)라온크리에이트 피부 상태 개선 장치 및 그의 사용 방법
CN107168012A (zh) * 2017-07-11 2017-09-15 深圳市华星光电技术有限公司 一种彩色光刻胶及其制备方法
JP7262105B2 (ja) 2019-03-29 2023-04-21 国立研究開発法人理化学研究所 細胞透過性配列を有するポリペプチド及びそれを含む組成物
CN118754948A (zh) * 2020-09-03 2024-10-11 深圳厚存纳米药业有限公司 一种多肽及其多肽复合物纳米粒、核酸疫苗和应用
EP4324841A4 (en) 2021-04-15 2025-05-07 Onecuregen Co., Ltd. Cell-penetrating peptide, anticancer peptide and pharmaceutical composition for preventing or treating cancer therewith
KR102713418B1 (ko) * 2021-07-27 2024-10-07 ㈜에빅스젠 세포막 투과 펩티드 및 이를 포함하는 세포내 전달체
KR102415717B1 (ko) * 2021-12-29 2022-07-05 주식회사 펩스젠 혈액뇌장벽 투과능을 가지는 신규한 펩타이드 및 이의 용도
WO2023128122A1 (ko) * 2021-12-29 2023-07-06 주식회사 펩스젠 혈액뇌장벽 투과능을 가지는 펩타이드 및 이의 용도
KR102541402B1 (ko) * 2022-02-18 2023-06-14 주식회사 레메디 아토피 피부염 예방 또는 치료 활성을 가지는 펩타이드
WO2024117321A1 (ko) * 2022-12-01 2024-06-06 ㈜에빅스젠 세포막 투과 펩티드 및 이를 포함하는 세포내 전달체
CN119552212B (zh) * 2025-01-26 2025-04-25 杭州康源食品科技有限公司 一种具有降尿酸活性的三肽lfp及其应用

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7585622B1 (en) * 1996-10-01 2009-09-08 Geron Corporation Increasing the proliferative capacity of cells using telomerase reverse transcriptase
US6475789B1 (en) * 1996-10-01 2002-11-05 University Technology Corporation Human telomerase catalytic subunit: diagnostic and therapeutic methods
US6610839B1 (en) * 1997-08-14 2003-08-26 Geron Corporation Promoter for telomerase reverse transcriptase
EP0954585B1 (en) * 1996-10-01 2009-11-25 Geron Corporation Human telomerase reverse transcriptase promoter
US6093809A (en) * 1996-10-01 2000-07-25 University Technology Corporation Telomerase
US7030211B1 (en) 1998-07-08 2006-04-18 Gemvax As Antigenic peptides derived from telomerase
US7078491B1 (en) 2000-09-21 2006-07-18 Amgen Inc. Selective binding agents of telomerase
US7294708B2 (en) * 2002-05-31 2007-11-13 Beijing Institute Of Biotechnology Telomerase reverse transcriptase fragments and uses thereof
US8128908B2 (en) 2004-04-30 2012-03-06 University Of Florida Research Foundation, Inc. Nanoparticles and their use for multifunctional bioimaging
EP1994942A1 (en) * 2007-05-25 2008-11-26 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Pharmaceutical compositions comprising telomerase, and uses thereof
US8362209B2 (en) 2007-08-23 2013-01-29 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Telomerase reverse transcriptase variant
CN102015755A (zh) * 2007-09-25 2011-04-13 田园温室气体研究有限公司 用于抑制微生物细胞的疫苗和疫苗组分
HUE030984T2 (en) * 2008-06-16 2017-06-28 Mediolanum Farm S P A Antitumor immunotherapy
US8252282B2 (en) * 2008-06-19 2012-08-28 University Of Medicine & Dentistry Of New Jersey Nuclear telomerase reverse transcriptase variant
IT1393509B1 (it) * 2008-07-08 2012-04-27 Advanced Accelerator Applications S A Peptidi e loro uso come carrier in cellule cancerose
US20110318380A1 (en) 2008-10-01 2011-12-29 Dako Denmark A/S MHC Multimers in Cancer Vaccines and Immune Monitoring
KR101169030B1 (ko) * 2009-01-21 2012-07-26 애니젠 주식회사 신규한 세포막 투과 도메인 및 이를 포함하는 세포내 전달 시스템
LT2536830T (lt) * 2010-02-16 2019-11-11 Ultimovacs Asa Polipeptidai
CN115927242A (zh) 2012-05-11 2023-04-07 珍白斯凯尔有限公司 具有抗炎活性的肽及其在制备抗炎组合物中的应用
EP2873678B8 (en) * 2012-07-11 2024-07-17 Gemvax & Kael Co., Ltd. Conjugate comprising a cell-penetrating peptide and compositions comprising same
US20150125438A1 (en) 2012-07-20 2015-05-07 Sang Jae Kim Anti-Inflammatory Peptides and Composition Comprising the Same
US20170327802A1 (en) 2012-07-20 2017-11-16 Gemvax & Kael Co., Ltd. Anti-Inflammatory Peptides and Composition Comprising the Same
KR102201430B1 (ko) 2012-09-19 2021-01-12 주식회사 젬백스앤카엘 세포 투과성 펩티드, 그를 포함한 컨쥬게이트 및 그를 포함한 조성물
TWI616531B (zh) 2012-09-19 2018-03-01 傑姆維克斯＆凱爾有限公司 穿膜胜肽以及包含該胜肽之共軛物及組成物（二）
JP6352923B2 (ja) * 2012-09-19 2018-07-04 ジェムバックス アンド カエル カンパニー，リミティド 細胞透過性ペプチド、それを含んだコンジュゲート、及びそれを含んだ組成物
BR112015030627A2 (pt) 2013-06-07 2017-07-25 Gemvax & Kael Co Ltd marcadores biológicos úteis na imunoterapia contra o câncer
KR102224965B1 (ko) 2013-07-12 2021-03-09 주식회사 젬백스앤카엘 세포 투과성 펩티드 및 이를 포함하는 컨쥬게이트
TW201718028A (zh) 2015-10-13 2017-06-01 賽米克Ｉｐ有限責任公司 Ve-鈣黏蛋白結合性生物結合物
CN106749537A (zh) * 2017-02-04 2017-05-31 北京大学第医院 一种多肽及其作为siRNA递送载体的应用

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