ES2957399T3

ES2957399T3 - Método de síntesis de péptidos

Info

Publication number: ES2957399T3
Application number: ES19785772T
Authority: ES
Inventors: Hideaki Suzuki; Susumu Muto; Shuji Fujita; Daisuke Kubo
Original assignee: Jitsubo Co Ltd
Current assignee: Jitsubo Co Ltd
Priority date: 2018-04-13
Filing date: 2019-04-13
Publication date: 2024-01-18
Anticipated expiration: 2039-04-13
Also published as: US11420997B2; JPWO2019198833A1; EP3778621B1; DK3778621T5; EP3778621A1; CN111971293A; US20210139532A1; JP6703668B2; DK3778621T3; WO2019198833A1; CN111971293B; EP3778621A4

Abstract

La presente invención es un método de síntesis de péptidos en fase líquida que, en un método Fmoc que utiliza un vehículo (Tag), tiene el propósito de reducir el tiempo de procesamiento y recortar el uso de solventes pobres para la solidificación de un constituyente de péptido Tag mediante la eliminación de impurezas. sin realizar la separación sólido/líquido (concentración, separación sólido/líquido y operaciones de secado) del constituyente del péptido etiqueta. Se proporciona el método de síntesis de péptidos que incluye los siguientes pasos: a. una etapa en la que, en un disolvente orgánico o una mezcla de disolventes orgánicos, un aminoácido protegido por portador, un péptido protegido por portador, o una amida de aminoácido protegida por portador y un aminoácido protegido por N-Fmoc o un N- El péptido protegido con Fmoc se condensa para obtener un péptido N-Fmoc/protegido por portador; b. una etapa en la que se añade una amina soluble en agua a la solución de reacción después de la reacción de condensación; C. una etapa en la que se desprotege Fmoc de una base amino protegida en presencia de la amina soluble en agua; y d. una etapa en la que la solución de reacción se neutraliza añadiendo ácido y se lava añadiendo una solución acuosa de agua ácida, después de lo cual se realiza la separación y se elimina una capa de agua para obtener una capa orgánica. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Método de síntesis de péptidos

Campo técnico

La presente invención se refiere a un método para eliminar de manera eficaz un éster activo de aminoácido que permanece durante una reacción de condensación y dibenzofulveno (DBF) generado durante una reacción de desprotección de grupo Fmoc (9-fluorenilmetiloxicarbonilo), en síntesis de péptidos en fase líquida.

Antecedentes de la técnica

Las técnicas de síntesis de péptidos incluyen un método de síntesis de péptidos en fase sólida (método SPPS) y un método de síntesis de péptidos en fase líquida (método LPPS). En el método de síntesis de péptidos en fase sólida, en principio, la purificación no puede realizarse en cada etapa de la reacción de extensión de aminoácidos. Además, el coste de síntesis es elevado, por lo que es adecuado para la producción a pequeña escala. Por el contrario, el método de síntesis de péptidos en fase líquida se usa generalmente para la producción en masa, pero cuando la cadena peptídica se vuelve larga, la reacción de extensión de péptidos se vuelve difícil y existe un problema en la síntesis de un péptido de cadena larga.

Por tanto, se ha propuesto realizar la síntesis de péptidos usando un portador que pueda repetir de manera reversible una condición disuelta y una condición insolubilizada (cristalizada). Se han propuesto diversos compuestos como portador que puede repetir de manera reversible una condición disuelta y una condición insolubilizada. Los ejemplos de los mismos incluyen compuestos de bencilo obtenidos mediante la introducción de un ácido graso de cadena larga propuesto por los presentes inventores (documentos de patente 1 a 4: (1) JP-A 2003-183298, (2) JP-A 2004-059509, (3) WO2007/034812, (4) WO2007/122847), o un compuesto de bencilo en el que se introduce además silicio en el terminal de un ácido graso de cadena larga para mejorar la solubilidad en un disolvente orgánico (documento de patente 5: WO2017/038650), o un compuesto de fluoreno en el que se introduce un ácido graso de cadena larga (documento de patente 6: WO2010/104169), un compuesto de difenilmetano en el que se introduce un ácido graso de cadena larga (documento de patente 7: WO2010/113939), un compuesto de tipo bencilo (documento de patente 8: WO2011/078295) y un compuesto ramificado (documento de patente 9: WO2012/029794).

En la síntesis de péptidos, existe el problema de que faltan residuos de aminoácidos en la reacción de extensión de péptidos, lo cual es el problema incluso cuando se usa el portador. Como solución para contrarrestar la falta de residuos de aminoácidos, se realiza un aumento de los equivalentes de un aminoácido y un agente de condensación. Sin embargo, como resultado se produce el problema de que el éster activo de aminoácido permanece esencialmente durante la reacción de condensación de aminoácidos. Un problema es que el exceso de éster activo de aminoácido que permanece en la disolución de reacción provoca un doble impacto cuando se produce la desprotección del extremo terminal N. El doble impacto significa que se insertan uno o más residuos de aminoácidos adicionales en el péptido objetivo. Como resultado del doble impacto, surge el problema de que se produce la subproducción de un péptido de impureza y se reduce la pureza del péptido diana. Además, generalmente es un proceso difícil y complicado eliminar el péptido de impureza generado por el doble impacto y aislar y purificar el péptido objetivo. Como resultado, existe el problema de que se reduce el rendimiento del péptido objetivo.

Para resolver el problema del éster activo de aminoácido, existen métodos en los que el péptido se cristaliza con un portador después de la reacción de condensación de aminoácidos y antes de la desprotección, y las impurezas se eliminan mediante separación sólido-líquido (por ejemplo, documentos de patente 1 a 5). Sin embargo, la separación sólido-líquido tiene el problema de que las etapas son complicadas y requieren mucho tiempo ya que se incluye una etapa de cristalización y, además, se requiere una gran cantidad de disolvente de lavado en la etapa de lavado. Además, en la operación de cristalización para cristalizar el portador, es posible que el éster activo no se elimine completamente mediante lavado. Además, en los métodos descritos en los documentos de patente 1 a 5, la separación sólido-líquido se lleva a cabo incluso después de la desprotección de Fmoc.

Como otro método para eliminar el éster activo de aminoácido del sistema de reacción mediante lavado antes de la desprotección, se ha sugerido un método de síntesis de péptidos en fase líquida usando un grupo benciloxicarbonilo (Cbz o Z) o un grupo t-butiloxicarbonilo (Boc) como grupo protector, en el que se añade una amina que tiene un componente aniónico tal como p-alanina-OBz como captador para eliminar el éster activo que permanece en el sistema de reacción (documento de patente 10: JP-A 2003-55396). Sin embargo, cuando se usa Cbz como grupo protector, si Met o Cys están presentes en la secuencia peptídica, el catalizador de desprotección se desactivará y no se podrá aplicar. Además, en este método, dado que es difícil eliminar el dibenzofulveno (DBF) generado mediante un método que usa Fmoc como grupo protector (a continuación en el presente documento, puede denominarse simplemente método Fmoc), es difícil aplicarlo al método Fmoc.

Para eliminar el éster activo de aminoácido que permanece en el sistema de reacción en el método de síntesis de péptidos en fase líquida usando Boc como grupo protector, se ha propuesto un método para eliminar un componente de aminoácido mediante extracción líquido-líquido mientras se hidroliza el éster activo con agua alcalina (por ejemplo, disolución acuosa de carbonato de sodio al 5 %) (documento de patente 11: WO2007/099656). Sin embargo, bajo la condición de un álcali fuerte de pH = 11 o más en este método, es posible que se produzca epimerización; además, la inactivación del éster activo mediante hidrólisis alcalina es difícil dependiendo de la especie de éster activo, lo que sigue siendo una posibilidad de doble impacto. Por tanto, la síntesis de alta pureza resulta difícil con este método. Además, dado que es difícil eliminar el DBF generado en el método Fmoc mediante este método, es difícil aplicarlo al método Fmoc.

Además, los presentes inventores han propuesto un método en el que se añade una alquilamina primaria o secundaria que tiene de 1 a 14 átomos de carbono o una amina aromática, o una hidroxilamina como captador al sistema de reacción después de la reacción de condensación, inactivando así el éster activo de aminoácido (documento de patente 12: WO2016/140232).

En la reacción de síntesis de péptidos usando Fmoc, el DBF se genera durante la reacción de desprotección del grupo Fmoc. Cuando se usan un reactivo de eliminación de Fmoc (por ejemplo, piperidina o DBU, otras aminas) y un captador, se genera un conjugado que se compone de DBF y piperidina, o de DBF y un captador de DBF (cuerpo capturado de DBF) como derivado de DBF. Cuando el DBF permanece en el sistema de reacción, se producen reacciones secundarias en la síntesis de péptidos posterior, por lo que se desea captarlo de manera eficiente.

Se ha informado de un método en el que, durante la desprotección de Fmoc, se permite que coexista un alquiltiol o un tiol en fase sólida y se capta el DBF, luego, el componente peptídico cristalizado se somete a separación sólido-líquido usando un éter, eliminando así el DBF o derivados de DBF como impurezas (documento no de patente 1: James E. Sheppeck IIet al,,Tetrahedron Letters 41 (28): 5329-5333 (2000)). Sin embargo, este método se limita al método para captar el DBF generado durante la desprotección de Fmoc y no puede aplicarse directamente a la síntesis de péptidos continua.

Además, se ha informado de un método en el que un cuerpo captado de DBF-piperidina generado por piperidina se convierte en un carbonato poniendo en contacto una mezcla de reacción obtenida después de la desprotección de Fmoc con dióxido de carbono, antes de eliminarlo (documento de patente 13: WO2010/016551). Sin embargo, requiere una etapa tal como filtración y similares y no es adecuado para la síntesis en un solo recipiente.

Además, se ha informado que, en el método Fmoc que usa un portador (Tag) que no solidifica, el éster activo de aminoácido se capta mediante una sílice de tiol o se descompone mediante un agua alcalina, luego, se permite que coexista un ácido o-tiolcarboxílico durante la desprotección de la reacción de Fmoc y se le permitió captar el DBF para lograr la solubilidad en agua alcalina, eliminando así las impurezas mediante lavado con agua alcalina (documento de patente 14: WO2013/089241). Sin embargo, en este método, se produce el mismo problema que en el documento de patente 11 cuando el éster activo de aminoácido se somete a hidrólisis alcalina. Además, cuando el éster activo lo capta un tiol, el éster tiólico del cuerpo captado es un tipo de éster activo, por lo que posiblemente ataca a un grupo amino generado después de la desprotección de Fmoc, para formar un cuerpo de doble impacto. Además, en la separación de líquidos alcalinos, un cuerpo captado de aminoácidos que tiene un grupo protector de cadena lateral liposoluble muestra una solubilidad deficiente y es difícil de eliminar, lo que posiblemente lleve a la generación de impurezas tales como un cuerpo de doble impacto, un condensado de un cuerpo captado de ácido o-tiolcarboxílico de un aminoácido, y similares.

Se ha informado de un método en el que la neutralización se realiza después de la desprotección de Fmoc, los aminoácidos se condensan tal como están y las sustancias innecesarias se eliminan mediante separación sólidolíquido (documento de patente 15: WO2012/165546). En este método, es necesario eliminar sustancias innecesarias mediante separación sólido-líquido después de la reacción de condensación. Además, en el documento de patente 16 (US 8314208 B2) se da a conocer un método de síntesis de péptidos que comprende desproteger un aminoácido protegido con Fmoc con piperazina mientras se aplica radiación de microondas a la reacción de desprotección.

Lista de referencias

Documentos de patentes

Documento de patente 1: JP-A 2003-183298

Documento de patente 2: JP-A 2004-059509

Documento de patente 3: WO 2007/034812

Documento de patente 4: WO 2007/122847

Documento de patente 5: WO 2017/038650

Documento de patente 6: WO 2010/104169

Documento de patente 7: WO 2011/078295 / US 8,859,732 B2

Documento de patente 8: WO 2012/029794

Documento de patente 9: WO 2010/113939 / US 2010/24974 A1

Documento de patente 10: JP-A 2003-55396

Documento de patente 11: WO 2007/099656

Documento de patente 12: WO 2016/140232 / EP 3266792 A1

Documento de patente 13: WO 2010/016551

Documento de patente 14: WO 2013/089241

Documento de patente 15: WO 2012/165546

Documento de patente 16: US 8,314,208 B2

Documento no de patente

Documento no de patente 1: James E. Sheppeck IIet al,,Tetrahedron Letters 41(28):5329-5333 (2000)Sumario de la invención

Problema técnico

La presente invención tiene el objetivo de acortar el tiempo de procedimiento y reducir el uso de un disolvente deficiente para solidificar un componente de péptido Tag, eliminando las purezas sin realizar una separación sólido-líquido (concentración, separación sólido-líquido y operación de secado) de un componente de péptido Tag, en un método Fmoc que usa un portador (Tag) para la síntesis de péptidos en fase líquida.

Solución al problema

Los presentes inventores han realizado estudios intensivos en vista del problema y, como resultado, descubrieron que es posible desactivar un éster activo de aminoácido generado durante la reacción de condensación para evitar el doble impacto de un aminoácido en el momento de la desprotección de Fmoc, para capturar el DBF generado en el momento de la desprotección de Fmoc, y eliminar sus impurezas (éster activo desactivado y DBF capturado) del sistema de reacción sin usar una operación de separación sólido-líquido, mediante el uso de un captador específico, lo que lleva a la finalización de la presente invención. La presente invención incluye lo siguiente.

[1]. Un método de síntesis de péptidos en fase líquida, que comprende las siguientes etapas a a d:

etapa a: se condensan en un disolvente orgánico o una disolución mixta de disolventes orgánicos un aminoácido protegido con un portador para la síntesis de péptidos en fase líquida (a continuación en el presente documento denominado aminoácido “protegido con portador”), un péptido protegido con portador o una amida de aminoácido protegida con portador y un aminoácido en el que se protege un grupo amino con un grupo 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) (a continuación en el presente documento denominado aminoácido “protegido con N-Fmoc”) o un péptido protegido con N-Fmoc, para obtener un péptido protegido con portador-N-Fmoc (a continuación en el presente documento puede denominarse “etapa de reacción de condensación” de la presente invención),

etapa b: se añade a la disolución de reacción una amina soluble en agua que tiene dos o más grupos amino y que tiene al menos un grupo amino primario o secundario después de la reacción de condensación (a continuación en el presente documento puede denominarse “etapa de reacción de captación” de la presente invención),

etapa c: se desprotege el grupo Fmoc del grupo amino protegido añadiendo reactivo de desprotección de N Fmoc en presencia de una amina soluble en agua que tiene dos o más grupos amino y que tiene al menos un grupo amino primario o secundario (a continuación en el presente documento puede denominarse “etapa de reacción de desprotección de Fmoc” de la presente invención), y

etapa d: se añade a la disolución de reacción un ácido para neutralizar, y además, se añade una disolución acuosa ácida para lavar la disolución, luego, se separa la disolución, y se elimina una fase acuosa para obtener una fase orgánica (a continuación en el presente documento puede denominarse “etapa de lavado con disolución acuosa ácida” de la presente invención),

en el que

el aminoácido, el péptido o la amida de aminoácido protegidos con portador es un aminoácido, un péptido o una amida de aminoácido en el que el portador se une directamente o mediante un grupo de unión a un grupo cualquiera seleccionado del grupo que consiste en uno o varios grupos amino, uno o varios grupos carboxilo, uno o varios grupos tiol y uno o varios grupos hidroxilo portados en el aminoácido, el péptido o la amida de aminoácido,

las aminas solubles en agua que tienen dos o más grupos amino y que tienen al menos un grupo amino primario o secundario en la etapa b y la etapa c pueden ser iguales o diferentes, y

el portador para la síntesis de péptidos en fase líquida es

(i) un compuesto seleccionado del grupo que consiste en

[Fórmula química 36]

(alcohol 3,4,5-trioctadeciloxibencílico),

[Fórmula química 37]

(alcohol 2,4-didocosiloxibencílico),

(2,4-didocosiloxibenzaldehído),

(2,4-didocosiloxibencilamina),

(N-etil-2,4-didocosiloxibencilamina),

(alcohol 3,5-didocosiloxibencílico),

(alcohol 2,4-di(11’-triisopropilsililoxiundeciloxi)bencílico),

(alcohol 2,4-di(11 ’-t-butildifenilsililoxiundeciloxi)bencílico),

en la que X es F o Cl,

(alcohol 2-(3’,4’,5’-trioctadeciloxibencil)-4-metoxibencílico),

(bis(4-docosiloxifenil)metilamina),

(alcohol 2,4-di(2’,3’-dihidrofitiloxi)bencílico),

(alcohol 3,4,5-tri (2’,3’-dihidrofitiloxi)bencílico),

(bis[4-(2’,3’-dihidrofitiloxi)fenil]metilamina), y

(N-etil-bis[4-(2’,3’-dihidrofitiloxi)fenil]metilamina),

en el que cada fórmula se muestra en la condición antes de unirse a un grupo carboxilo, un grupo amino, un grupo tiol o un grupo hidroxilo de un aminoácido, un péptido o una amida de aminoácido o a un grupo de unión; o (ii) un compuesto seleccionado del grupo que consiste en

en la que X es F o Cl,

(N-etil-2,4-di(11’-triisopropilsililoxiundeciloxi)bencilamina),

(N-etil-2,4-di(11’-t-butildifenilsililoxiundeciloxi)bencilamina),

(N-etil-2-(3’,4’,5’-trioctadeciloxibenciloxi)-4-metoxibencilamina),

(N-etil-bis(4-docosiloxifenil)metilamina),

(2,4-di(2’,3’-dihidrofitiloxi)bencilamina), y

(N-etil-2,4-di(2’,3’-dihidrofitiloxi)bencilamina),

en el que cada fórmula se muestra en la condición antes de unirse a un grupo carboxilo de un aminoácido o un péptido.

[2] El método de síntesis de péptidos según el punto [1], en el que la reacción de condensación en la etapa a se lleva a cabo en presencia de un agente de condensación.

[3] El método de síntesis de péptidos según uno cualquiera de los puntos [1] a [2], en el que el disolvente orgánico o disolución mixta de disolventes orgánicos es al menos un disolvente orgánico seleccionado del grupo que consiste en THF, DMF, ciclohexano, CPME, MTBE, 2-metilTHF, 4-metilTHP, acetato de isopropilo, DCM y N-metilpirrolidona, o una disolución mixta que se compone de dos o más de los mismos.

[4] El método de síntesis de péptidos según uno cualquiera de los puntos [1] a [3], en el que la amina soluble en agua se selecciona del grupo que consiste en 1-metilpiperazina, 4-aminopiperidina, dietilentriamina, triaminoetilamina, 1 -etilpiperazina, N,N-dimetiletilendiamina, etilendiamina y piperazina, más preferiblemente 1-metilpiperazina, 4-aminopiperidina, N,N-dimetiletilendiamina y dietilentriamina, y además preferiblemente 1-metilpiperazina.

[5] El método de síntesis de péptidos según uno cualquiera de los puntos [1] a [4] anteriores, en el que el equivalente de amina de la amina soluble en agua en la etapa b es de 1 a 10 equivalentes (preferiblemente de 1 a 6 equivalentes, más preferiblemente de 1 a 4 equivalentes) con respecto al equivalente de aminoácido que permanece teóricamente después de la reacción de condensación en la etapa a.

[6] El método de síntesis de péptidos según uno cualquiera de los puntos [1] a [5] anteriores, en el que el equivalente de amina de la amina soluble en agua en la etapa c es de 5 a 30 equivalentes (preferiblemente de 5 a 20 equivalentes, más preferiblemente de 10 a 20 equivalentes) con respecto a la cantidad del grupo Fmoc que existe en el sistema.

[7] El método de síntesis de péptidos según uno cualquiera de los puntos [1] a [6] anteriores, en el que el pH de la disolución acuosa ácida en la etapa d es de 1 a 5 (preferiblemente de 1 a 4, más preferiblemente de 1 a 3).

[8] El método de síntesis de péptidos según uno cualquiera de los puntos [1] a [7] anteriores, que comprende realizar la repetición de las etapas una vez o más veces usando el péptido protegido con portador obtenido mediante las etapas.

[9] El método de síntesis de péptidos según uno cualquiera de los puntos [1] a [8] anteriores, en el que las etapas se llevan a cabo en un recipiente.

El método de síntesis de péptidos según uno cualquiera de los puntos [1] a [9] anteriores puede usarse para sintetizar un péptido que tiene la siguiente secuencia: H-dArg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-dTic-Oic-Arg-OH (SEQ ID NO: 1).

Efecto ventajoso de la invención

El método de síntesis de péptidos de la presente invención puede resolver simultáneamente el problema de un éster activo de aminoácido y el problema del DBF existente en el sistema de reacción y puede reducir los trabajos de operación de separación sólido-líquido, por medios sencillos. Según la presente invención, puede acortarse el tiempo del procedimiento de síntesis de péptidos y puede reducirse el uso de un disolvente reduciendo los trabajos de operación de separación sólido-líquido.

Descripción de realizaciones

A continuación en el presente documento, la presente invención se ilustrará y describirá en detalle con referencia a las realizaciones a modo de ejemplo, junto con los métodos y materiales preferidos que pueden usarse en la práctica de la presente invención.

A menos que se especifique lo contrario en las oraciones, cualquier término técnico y científico usado en la presente memoria descriptiva tiene el mismo significado que el entendido generalmente por aquellos expertos en la técnica a la que pertenece la presente invención.

Cuando se usa la expresión “de X a Y” en la presente memoria descriptiva, se usa para incluir X como límite inferior e Y como límite superior. En la presente memoria descriptiva, “aproximadamente” se usa en el sentido de permitir ± 10 %.

El aminoácido que sirve como unidad estructural del péptido sintetizado mediante el método de la presente invención puede ser un aminoácido natural o un aminoácido no natural, puede ser un aminoácido de tipo L o un aminoácido de tipo D, y también puede ser una mezcla de estos aminoácidos. El aminoácido no natural no está particularmente limitado, y puede usarse cualquier aminoácido no natural conocido o un aminoácido al que se le aplica cualquier modificación haciendo referencia a una técnica conocida.

Los aminoácidos no naturales conocidos incluyen, por ejemplo, aminoácidos modificados con N-metilo, aminoácidos modificados con N-2,4-dimetoxibencilo, a-metilalanina, ácido D-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico y ácido L-octahidroindolin-2-carboxílico.

Los aminoácidos obtenidos aplicando cualquier modificación a aminoácidos naturales o no naturales también pueden usarse en el método de la presente invención. Cualquier modificación no está particularmente limitada, y cualquier modificación que pueda aplicarse a un aminoácido usando una técnica conocida o común en el campo técnico relacionado con la síntesis de aminoácidos puede usarse sin limitación. Los ejemplos de los mismos incluyen la adición de un compuesto orgánico de bajo peso molecular, fosforilación, biotinilación, pegilación, glicosilación y modificación fluorescente.

La presente invención es un método de síntesis de péptidos que comprende una etapa de condensar un aminoácido, un péptido o una amida de aminoácido protegido con un portador específico para la síntesis de péptidos en fase líquida con un aminoácido o péptido protegido con N-Fmoc, una etapa de extinción de un éster activo que permanece después de la reacción de condensación, una etapa de desprotección del grupo Fmoc del péptido protegido con portador-N-Fmoc, y una etapa de neutralización de la disolución de reacción con un ácido antes de lavar con una disolución acuosa ácida, en el que la amina soluble en agua que tiene dos o más grupos amino y que tiene al menos un grupo amino primario o secundario se usa después de la etapa de condensación y durante la etapa de desprotección del grupo Fmoc.

El método de síntesis de péptidos puede llevarse a cabo en un recipiente.

El método de síntesis de péptidos puede llevarse a cabo de forma continua.

El método de síntesis de péptidos puede usarse para obtener un péptido en el que el grupo carboxilo terminal está amidado, usando un portador que tiene un grupo reactivo que contiene un grupo amino como grupo reactivo que puede unirse a un grupo carboxilo de un aminoácido o un péptido, en el método de síntesis de péptidos. El método de síntesis de péptidos de la presente invención se describirá a continuación.

1. Aminoácido y péptido protegidos con N-Fmoc

El aminoácido en el que un grupo amino está protegido con un grupo 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) (aminoácido protegido con N-Fmoc) o péptido protegido con N-Fmoc significa un aminoácido o péptido en el que un grupo amino de un aminoácido o péptido está protegido con un grupo Fmoc, mientras que el grupo carboxilo no está protegido y es reactivo. Cuando un aminoácido o péptido tiene uno o más grupos amino, al menos un grupo amino puede protegerse con un grupo Fmoc.

Cuando el aminoácido o péptido protegido con N-Fmoc tiene un grupo funcional rico en reactividad tal como un grupo hidroxilo, un grupo amino, un grupo guanidilo, un grupo carboxilo, un grupo tiol, un grupo indol, un grupo imidazol, puede introducirse un grupo protector general usado en la síntesis de péptidos en estos grupos funcionales, luego, el grupo protector puede eliminarse si es necesario en cualquier momento después de completar la reacción, para obtener un compuesto objetivo.

El grupo protector para un grupo hidroxilo incluye un grupo tBu, un grupo Trt, un grupo Bz, un grupo acetilo, un grupo sililo, el grupo protector para un grupo amino incluye un grupo Boc, un grupo Fmoc, un grupo Cbz, un grupo Trt, un grupo Mmt, un grupo ivDde, el grupo protector para un grupo guanidilo incluye un grupo Pbf, un grupo Pmc, un grupo nitro, el grupo protector para un grupo carboxilo incluye un grupo tBu, un grupo metilo, un grupo etilo, un grupo Bz, el grupo protector para un grupo tiol incluye un grupo Trt, un grupo Acm, un grupo tBu, un grupo S-tBu, el grupo protector para un grupo indol incluye un grupo Boc y el grupo protector para un grupo imidazol incluye un grupo Boc, un grupo Bom, un grupo Bum, un grupo Trt.

2. Aminoácido, péptido y amida de aminoácido protegidos con portador

El aminoácido protegido con un portador para la síntesis de péptidos en fase líquida (aminoácido protegido con portador) o péptido protegido con portador significa una amida o péptido de aminoácido en el que un grupo reactivo de un aminoácido o péptido está protegido con un portador para la síntesis de péptidos en fase líquida descrita a continuación directamente o mediante un grupo de unión, y al menos un grupo amino está en estado reactivo. En una realización preferible, un grupo carboxilo de un aminoácido o péptido está protegido con un portador para la síntesis de péptidos en fase líquida descrita a continuación, mientras que el grupo amino no está protegido ni es reactivo.

La amida de aminoácido protegida con portador significa una amida de aminoácido en la que al menos un grupo amida de una amida de aminoácido está protegido con un portador para la síntesis de péptidos en fase líquida descrita a continuación directamente o mediante un grupo, y al menos un grupo amino no está protegido ni es reactivo.

Cuando el aminoácido protegido con portador, el péptido protegido con portador o la amida de aminoácido protegida con portador tiene un grupo funcional rico en reactividad tal como un grupo hidroxilo, un grupo amino, un grupo guanidilo, un grupo carboxilo, un grupo tiol, un grupo indol, un grupo imidazol, en estos grupos funcionales puede introducirse un grupo protector general usado en la síntesis de péptidos, y el grupo protector puede eliminarse si es necesario después de completar la reacción, para obtener un compuesto objetivo.

El grupo protector para un grupo hidroxilo incluye un grupo tBu, un grupo Trt, un grupo Bz, un grupo acetilo, un grupo sililo, el grupo protector para un grupo amino incluye un grupo Boc, un grupo Fmoc, un grupo Cbz, un Trt. grupo, un grupo Mmt, un grupo ivDde, el grupo protector para un grupo guanidilo incluye un grupo Pbf, un grupo Pmc, un grupo nitro, el grupo protector para un grupo carboxilo incluye un grupo tBu, un grupo metilo, un grupo etilo, un grupo Bz, el grupo protector para un grupo tiol incluye un grupo Trt, un grupo Acm, un grupo tBu, un grupo S-tBu, el grupo protector para un grupo indol incluye un grupo Boc y el grupo protector para un grupo imidazol incluye un grupo Boc, un grupo Bom, un grupo Bum y un grupo Trt.

3. Portador para la síntesis de péptidos en fase líquida

El portador para la síntesis de péptidos en fase líquida usado en la presente invención es un compuesto que se une a un aminoácido, un péptido o una amida de aminoácido directamente o mediante un grupo de unión para hacerlos insolubles en agua. El portador usado en la presente invención es preferiblemente un compuesto que tiene una propiedad en la que una condición disuelta y una condición insolubilizada (cristalizada o en aceite) cambian reversiblemente dependiendo de un cambio de la composición de un disolvente en el que se disuelve el portador. En realizaciones del método de síntesis de péptidos de la presente invención, no es necesario que el portador esté insolubilizado y, además, no es necesario cambiar la composición del disolvente para que el portador se vuelva insoluble.

En la etapa de preparar el aminoácido protegido con portador, el péptido protegido con portador o la amida de aminoácido protegida con portador usados en el método de síntesis de péptidos de la presente invención, el portador puede solidificarse (por ejemplo, cristalizarse), y además , en la etapa de recuperar el péptido protegido con portador disuelto en una fase orgánica (una fase de un disolvente orgánico o una mezcla de disolventes orgánicos) obtenida mediante el método de síntesis de péptidos de la presente invención, el soporte puede solidificarse (por ejemplo, cristalizado).

El portador para la síntesis de péptidos en fase líquida usado en la presente invención es un portador según la reivindicación 1. A continuación en el presente documento, la estructura del portador que puede usarse en la presente invención se explicará en la condición antes de unirse a un grupo carboxilo, un grupo amino, un grupo tiol o un grupo hidroxilo de un aminoácido, un péptido o una amida de aminoácido o a un grupo de unión.

3-1. Compuesto portador A

Un compuesto que tiene la siguiente estructura (en la presente memoria descriptiva, denominado “Ka” en algunos casos):

Para la unión del compuesto (Ka) a un grupo carboxilo, un grupo amino o un grupo hidroxilo de un aminoácido, un péptido o una amida de aminoácido o a un grupo de unión, también pueden usarse métodos generalmente usados en la síntesis de péptidos en la presente invención sin limitación, y por ejemplo, puede llevarse a cabo mediante esterificación usando DIPCI.

3-2. Compuesto portador B

Un compuesto que tiene una de las siguientes estructuras (en la presente memoria descriptiva, denominado “Kb” en algunos casos):

alcohol 2,4-didocosiloxibencílico representado por la siguiente fórmula:

2,4-didocosiloxibencilamina representado por la siguiente fórmula:

o N-etil-2,4-didocosiloxibencilamina representada por la siguiente fórmula.

Para la unión del compuesto (Kb) a un grupo carboxilo, un grupo amino o un grupo hidroxilo de un aminoácido, un péptido o una amida de aminoácido o a un grupo de unión, también pueden usarse métodos generalmente usados en la síntesis de péptidos en la presente invención sin limitación, y por ejemplo, puede llevarse a cabo mediante esterificación usando DIPCI.

3-3. Compuesto portador C

Un compuesto que tiene la siguiente estructura (en la presente memoria descriptiva, denominado “Kc” en algunos casos):

alcohol 3,5-didocosiloxibencílico representado por la siguiente fórmula:

Para la unión del compuesto (Kc) a un grupo carboxilo, un grupo amino o un grupo hidroxilo de un aminoácido, un péptido o una amida de aminoácido o a un grupo de unión, también pueden usarse métodos generalmente usados en la síntesis de péptidos en la presente invención sin limitación, y por ejemplo, puede llevarse a cabo mediante esterificación usando DIPCI.

3-4. Compuesto portador D

Un compuesto que tiene una de las siguientes estructuras (en la presente memoria descriptiva, denominado “KS” en algunos casos):

alcohol 2,4-di(11’-triisopropilsililoxiundeciloxi)bencílico, alcohol 2,4-di(11’-t-butildifenilsililoxiundeciloxi)bencílico, N-etil-2,4-di(11’-triisopropilsililoxiundeciloxi)bencilamina o N-etil-2,4-di(11’-tbutildifenilsililoxiundeciloxi)bencilamina representados por las siguientes fórmulas:

Para la unión del compuesto (KS) a un grupo carboxilo, un grupo amino o un grupo hidroxilo de un aminoácido, un péptido o una amida de aminoácido o a un grupo de unión, también pueden usarse métodos generalmente usados en la síntesis de péptidos en la presente invención sin limitación, y por ejemplo, puede llevarse a cabo mediante esterificación usando DIPCI.

3-5. Compuesto portador E

Un compuesto que tiene una de las siguientes estructuras (en la presente memoria descriptiva, denominado “KJ1” en algunos casos):

en la que X es F o Cl, o

en la que X es F o Cl.

Para la unión del compuesto (KJ1) a un grupo carboxilo, un grupo amino, un grupo tiol o un grupo hidroxilo de un aminoácido, un péptido o una amida de aminoácido o a un grupo de unión, también pueden usarse métodos generalmente usados en la síntesis de péptidos en la presente invención sin limitación, y por ejemplo, puede llevarse a cabo mediante esterificación usando un catalizador de base.

3-5.Compuesto portador F

Un compuesto que tiene una de las siguientes estructuras (en la presente memoria descriptiva, denominado “KJ2” en algunos casos):

alcohol 2-(3’,4’,5’-trioctadeciloxibencil)-4-metoxibencílico o N-etil-2(3’,4’,5’-trioctadeciloxibenciloxi)-4-metoxibencilamina representados por las siguientes fórmulas:

Para la unión del compuesto (KJ2) a un grupo carboxilo, un grupo amino o un grupo hidroxilo de un aminoácido, un péptido o una amida de aminoácido o a un grupo de unión, también pueden usarse métodos generalmente usados en la síntesis de péptidos en la presente invención sin limitación, y por ejemplo, puede llevarse a cabo mediante esterificación usando DIPCI.

3-6. Compuesto portador G

Un compuesto que tiene una de las siguientes estructuras (en la presente memoria descriptiva, denominado “KJ3” en algunos casos):

Bis(4-docosiloxifenil)metilamina o N-etil-bis(4-docosiloxifenil)metilamina representadas por las siguientes fórmulas:

Para la unión del compuesto (KJ3) a un grupo carboxilo de un aminoácido, un péptido o una amida de aminoácido, también pueden usarse métodos generalmente usados en la síntesis de péptidos en la presente invención sin limitación, y por ejemplo, puede llevarse a cabo mediante amidación usando DIPCI/HOBt.

3-7. Compuesto portador H

Un compuesto que tiene una de las siguientes estructuras (en la presente memoria descriptiva, denominado “KJ4” en algunos casos):

alcohol 2,4-di(2’,3’-dihidrofitiloxi)bencílico representado por la siguiente fórmula:

alcohol 3,4,5-tri(2’,3’-dihidrofitiloxi)bencílico representado por la siguiente fórmula:

2,4-di(2’,3’-dihidrofitiloxi)bencilamina representada por la siguiente fórmula:

N-etil-2,4-di(2’,3’-dihidrofitiloxi)bencilamina representada por la siguiente fórmula:

bis[4-(2’,3’-dihidrofitiloxi)fenil]metilamina representada por la siguiente fórmula:

o N-etil-bis[4-(2’,3’-dihidrofitiloxi)fenil]metilamina representada por la siguiente fórmula:

Para la unión del compuesto (KJ4) a un grupo carboxilo de un aminoácido, un péptido o una amida de aminoácido, también pueden usarse métodos generalmente usados en la síntesis de péptidos en la presente invención sin limitación, y por ejemplo, puede llevarse a cabo mediante amidación usando DIPCI/HOBt.

4. Grupo de unión

En el aminoácido, el péptido o la amida de aminoácido protegidos con portador usados en la presente invención, el portador se une directamente o mediante un grupo de unión a un grupo amino, un grupo carboxilo, un grupo tiol o un grupo hidroxilo de un aminoácido, un péptido o una amida de aminoácido.

El grupo de unión al que se hace referencia en el presente documento es un grupo orgánico que tiene dos grupos reactivos uno de los cuales se une a un grupo cualquiera seleccionado del grupo que consiste en uno o varios grupos amino, uno o varios grupos carboxilo, uno o varios grupos tiol y uno o varios grupos hidroxilo de un aminoácido, un péptido o una amida de aminoácido, y el otro de los cuales se une al portador. En una realización preferible, el grupo de unión que puede usarse en la presente invención es un grupo orgánico que tiene un peso molecular de aproximadamente 2000 o menos (preferiblemente de aproximadamente 1500 o menos, más preferiblemente de aproximadamente 1000 o menos) y es un compuesto que tiene en la molécula al menos dos grupos que pueden ser iguales o diferentes y seleccionarse del grupo que consiste en un grupo amino, un grupo carboxilo y un grupo halometilo, como grupo reactivo. Los ejemplos de los mismos incluyen los siguientes compuestos.

en la que Y es un número entero de 1 a 6, preferiblemente de 1 a 4, en la que X es un átomo de halógeno, preferiblemente Cl o Br.

en la que Z es un número entero de 2 a 40, preferiblemente de 2 a 35, más preferiblemente de 2 a 28.

La fórmula estructural del grupo de unión se muestra en la condición antes de unirse a un grupo carboxilo, un grupo amino, un grupo tiol o un grupo hidroxilo de un aminoácido, un péptido o una amida de aminoácido y antes de unirse a un portador.

En la preparación del aminoácido, el péptido o la amida de aminoácido protegidos con portador que contienen el grupo de unión, el orden de unión al grupo de unión no está particularmente limitado, y un grupo reactivo del grupo de unión puede unirse a un aminoácido, un péptido o una amida de aminoácido antes de unir el otro grupo reactivo al portador, alternativamente, un grupo reactivo del grupo de unión puede unirse al portador antes de unir el otro grupo reactivo a un aminoácido, un péptido o una amida de aminoácido.

La unión de un grupo reactivo del grupo de unión a un aminoácido, un péptido o una amida de aminoácido puede llevarse a cabo con referencia adecuadamente a métodos conocidos dependiendo del grupo del grupo de unión y el grupo de un aminoácido, un péptido o una amida de aminoácido que va a unirse mutuamente. Los ejemplos de los mismos incluyen amidación usando DIPCI/HOBt.

La unión de un grupo reactivo del grupo de unión al portador puede llevarse a cabo con referencia adecuadamente a métodos conocidos dependiendo del grupo del grupo de unión y el grupo del portador que va a unirse mutuamente. Los ejemplos de los ismos incluyen esterificación usando DIPCI.

5. Disolvente

El disolvente usado en el método de la presente invención no está particularmente limitado y pueden usarse disolventes usados en la síntesis de péptidos en fase líquida. El disolvente incluye, por ejemplo, THF, DMF, ciclohexano, CPME, MTBE, 2-metilTHF, 4-metilTHP, acetato de isopropilo, cloroformo, diclorometano y N-metilpirrolidona, preferiblemente, THF, DMF, ciclohexano, CPME, MTBE, 2-metilTHF, 4-metilTHP, acetato de isopropilo y N-metilpirrolidona. Además, puede usarse un disolvente mixto que se compone de dos o más de los disolventes.

Cuando el portador se solidifica (cristaliza) para preparar las sustancias de partida usadas en el método de síntesis de péptidos de la presente invención o para recuperar el péptido sintetizado usando el método de síntesis de péptidos de la presente invención, se usa un disolvente polar. El disolvente polar que va a usarse incluye, por ejemplo, metanol, etanol, isopropanol, acetonitrilo, propionitrilo,<d>M<f>, dimetilacetamida, dimetilsulfóxido, agua y un disolvente mixto que se compone de dos o más de los mismos. En particular, se usa adecuadamente metanol o acetonitrilo.

6. Método de síntesis de péptidos

En el método de síntesis de péptidos de la presente invención, pueden llevarse a cabo a cabo de manera continua una serie de etapas desde la etapa de reacción de condensación, la etapa de desprotección del grupo Fmoc y la etapa de recuperación del péptido protegido con portador sin llevar a cabo una operación de separación sólido-líquido y, además, las impurezas que se generan en la etapa de síntesis pueden reducirse o eliminarse mediante separación líquido-líquido. Por tanto, es adecuado como método de síntesis de péptidos continua.

La síntesis de un péptido mediante el método de síntesis de péptidos de la presente invención incluye las siguientes etapas.

(a) Etapa de reacción de condensación

Una etapa en la que un aminoácido protegido con portador, un péptido protegido con portador o una amida de aminoácido protegida con portador se condensa con un aminoácido protegido con N-Fmoc o un péptido protegido con N-Fmoc, en un disolvente orgánico o una disolución mixta de disolventes orgánicos, preferiblemente en presencia de un agente de condensación, para obtener un péptido protegido con portador-N-Fmoc,

(b) Etapa de reacción de captación

Una etapa en la que se añade una amina soluble en agua que tiene dos o más grupos amino y que tiene al menos un grupo amino primario o secundario (a continuación en el presente documento, denominado captador de amina en algunos casos) a la disolución de reacción después de la reacción de condensación, para formar un cuerpo captado de un éster activo de aminoácido,

(c) Etapa de desprotección de Fmoc

Una etapa en la que un grupo Fmoc se separa del extremo terminal N protegido mediante la adición de un reactivo de desprotección de Fmoc, en presencia de una amina soluble en agua que tiene dos o más grupos amino y que tiene al menos un grupo amino primario o secundario, y

(d) Etapa de lavado con disolución acuosa ácida

Una etapa en la que se añade un ácido a la disolución de reacción para neutralizarla y, además, se añade una disolución acuosa ácida y la disolución se lava, luego se separa y se elimina la fase acuosa.

La etapa puede llevarse a cabo en un recipiente ya que no necesita una operación de separación sólido-líquido acompañada de solidificación (cristalización) de un aminoácido protegido con portador, un péptido protegido con portador o una amida de aminoácido protegida con portador, y un péptido protegido con portador-N-Fmoc.

Además, al llevar a cabo la etapa, puede recuperarse un péptido protegido con portador con un aminoácido o péptido añadido en comparación con el inicio de la reacción de síntesis en la condición disuelta en una fase orgánica. Además, dado que las impurezas se reducen o se eliminan de la fase orgánica que contiene el péptido protegido con portador disuelto, la siguiente reacción de síntesis de péptidos puede realizarse de manera continua en ese estado.

Como resultado, una realización del método de síntesis de péptidos de la presente invención incluye un método de síntesis de péptidos que comprende repetir las etapas (a) a (d) un número requerido de veces. Usando el método de la presente invención, la síntesis de péptidos continua puede llevarse a cabo en un recipiente.

El aminoácido protegido con portador, el péptido protegido con portador o la amida de aminoácido protegida con portador en la etapa (a) del método de síntesis de péptidos de la presente invención pueden producirse haciendo referencia apropiadamente a métodos conocidos usados en la síntesis de péptidos, dependiendo del portador que va a usarse. El método se describirá a continuación tomando como ejemplo un aminoácido protegido con portador. Por ejemplo, el portador puede estar unido directamente o mediante un grupo de unión a un grupo carboxilo, un grupo amino, un grupo tiol o un grupo hidroxilo de un aminoácido. Por ejemplo, un aminoácido protegido con portador-N-Fmoc que es un producto intermedio en el que el portador está unido a un grupo carboxilo de un aminoácido puede producirse disolviendo un compuesto portador en un disolvente tal como THF, añadiendo un aminoácido protegido con N-Fmoc y un agente de condensación, por ejemplo, DIPCI y realizando la condensación de los mismos. Alternativamente, puede producirse un aminoácido protegido con portador-N-Boc que es un producto intermedio en el que el portador está unido a un grupo carboxilo de un aminoácido disolviendo un compuesto portador en un disolvente tal como THF, añadiendo un aminoácido protegido con Boc y un agente de condensación, por ejemplo, DIPCI y realizar la condensación de los mismos.

El aminoácido protegido con portador-N-Fmoc o el aminoácido protegido con portador-N-Boc producidos pueden obtenerse con gran pureza preferiblemente mediante solidificación (cristalización) antes de la recuperación. Por ejemplo, una disolución de reacción que contiene un aminoácido protegido con portador-N-Fmoc/Boc se elimina por destilación a presión reducida, luego, se añade un disolvente en el que se solidifica (cristaliza) un aminoácido protegido con portador-N-Fmoc o un aminoácido protegido con portador-N-Boc, por ejemplo, metanol o acetonitrilo al residuo para provocar la deposición, y el precipitado se filtra, luego, se suspende y se lava con un disolvente, y el sólido resultante se seca, con lo que puede obtenerse un aminoácido protegido con portador-N-Fmoc/Boc.

Puede producirse un aminoácido protegido con portador eliminando el grupo protector N terminal del aminoácido protegido con portador-N-Fmoc o del aminoácido protegido con portador-N-Boc así obtenido, haciendo referencia apropiadamente a métodos conocidos usados en la síntesis de péptidos. Por ejemplo, puede producirse disolviendo el aminoácido protegido con portador-N-Fmoc en un disolvente tal como THF, añadiendo un reactivo de desprotección de Fmoc tal como d Bu o piperazina y realizando la reacción de desprotección de Fmoc. Alternativamente, puede producirse un aminoácido protegido con portador disolviendo un aminoácido protegido con portador-N-Boc en un disolvente tal como CPME, añadiendo un reactivo de desprotección de Boc tal como TFA y realizando la reacción de desprotección de Boc.

Un aminoácido protegido con portador en el que un portador está unido a un grupo amino de un aminoácido puede producirse disolviendo un compuesto portador en un disolvente tal como THF, añadiendo un aminoácido en el que un grupo carboxilo se ha protegido previamente, y un agente reductor, por ejemplo, triacetoxiborohidruro de sodio, y realizar una reacción de aminación reductora, aunque el método para unir un portador a un grupo amino de un aminoácido no se limita a esto.

Dado que el aminoácido protegido con portador así obtenido puede prepararse en estado de disolución, puede someterse a la misma etapa de lavado en disolución acuosa ácida que en la etapa (d) de la presente invención en ese estado, y el aminoácido protegido con portador después de realizar el lavado en disolución acuosa ácida puede usarse en el método de la presente invención como materia prima para la etapa (a) del método de la presente invención. En tal caso, la síntesis de péptidos es posible en un solo recipiente, incluyendo también la etapa de preparación del aminoácido protegido con portador.

Además, el aminoácido resultante protegido con portador también puede solidificarse (cristalizarse) antes de recuperarlo, y de este modo puede obtenerse con alta pureza. Por ejemplo, se elimina por destilación a presión reducida una disolución de reacción que contiene un aminoácido protegido con portador, luego, se añade al residuo un disolvente en el que se solidifica (cristaliza) el portador, por ejemplo, metanol o acetonitrilo para provocar la deposición, y el precipitado se filtra, luego se suspende y se lava con un disolvente, y el sólido resultante se seca, de esta manera puede obtenerse un aminoácido protegido con portador.

El aminoácido protegido con portador así obtenido puede usarse como sustancia de partida en el método de síntesis de péptidos de la presente invención.

Por consiguiente, una realización del método de síntesis de péptidos de la presente invención incluye un método de síntesis de péptidos que comprende además una etapa de preparación de un aminoácido protegido con portador, antes de las etapas (a) a (d).

El péptido protegido con portador obtenido usando el método de síntesis de péptidos de la presente invención puede recuperarse usando métodos conocidos usados en el campo de la síntesis de péptidos. Por ejemplo, el péptido puede recuperarse a partir de un disolvente cristalizándolo. Por ejemplo, una fase orgánica que contiene el péptido protegido con portador resultante se destila a presión reducida para eliminar un disolvente, luego, se añade al residuo un disolvente deficiente, por ejemplo, acetonitrilo frío para provocar la deposición, y se filtra el precipitado, luego, se suspende y se lava con un disolvente, y el sólido resultante se seca, de esta manera puede obtenerse un péptido protegido con portador.

Por consiguiente, una realización del método de síntesis de péptidos de la presente invención incluye un método de síntesis de péptidos que comprende una etapa de cristalización y separación del péptido protegido con portador, después de las etapas (a) a (d).

Las etapas respectivas se explicarán a continuación. En la siguiente explicación, se describen como ejemplos un péptido protegido con portador y un aminoácido protegido con N-Fmoc; sin embargo, el péptido protegido con portador es un ejemplo del aminoácido protegido con portador, el péptido protegido con portador o la amida de aminoácido protegida con portador que pueden usarse en la presente invención, y el aminoácido protegido con N-Fmoc es un ejemplo del aminoácido protegido con N-Fmoc o del péptido protegido con N-Fmoc que pueden usarse en la presente invención.

6-1. Etapa de reacción de condensación

En esta etapa, se obtiene un péptido protegido con portador-N-Fmoc que tiene un mayor número de residuos de aminoácidos mezclando un péptido protegido con portador, y un aminoácido protegido con N-Fmoc y un agente de condensación (preferiblemente, agente de condensación y agente de activación) en un disolvente.

El método y el orden de adición de componentes no están particularmente limitados y pueden usarse métodos generalmente usados en una etapa de condensación en la síntesis de péptidos.

La cantidad de uso de un aminoácido protegido con N-Fmoc con respecto a un péptido protegido con portador es normalmente de 1,01 a 4 equivalentes, preferiblemente de 1,03 a 3 equivalentes, más preferiblemente de 1,05 a 2 equivalentes y además preferiblemente de 1,1 a 1,5 equivalentes. Cuando es menor que este intervalo, el péptido protegido con portador sin reaccionar tiende a permanecer y la pérdida de aminoácidos se produce fácilmente. En el método de síntesis de péptidos de la presente invención, el éster activo de aminoácido sin reaccionar puede ser captado (capturado) por una amina soluble en agua que va a añadirse posteriormente para desactivarlo. Por tanto, incluso si se usa una cantidad mayor de aminoácido protegido con N-Fmoc, no se produce el problema de la permanencia en comparación con los métodos convencionales.

Como agente de condensación, también pueden usarse en la presente invención agentes de condensación usados generalmente en la síntesis de péptidos, y los ejemplos de los mismos incluyen cloruro de 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolinio (DMT-M<m>), hexafluorofosfato de O-(benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (HBTU), hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (HATU), hexafluorofosfato de O-(6-clorobenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (HBTU(6-Cl)), tetrafluoroborato de O-(benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (TBTU), tetrafluoroborato de O-(6-clorobenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (TCTU), hexafluorofosfato de (1-ciano-2-etoxi-2-oxoetilidenaminooxi)dimetilamino-morfolinocarbenio (COMU), diisopropilcarbodiimida (DIPCI), diciclohexilcarbodiimida (DCC) y clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (WSC), preferiblemente, DMT-MM, HBTU,<h>A<t>U o C<o>MU . La cantidad de uso del agente de condensación es normalmente de 1 a 4 equivalentes, preferiblemente de 1 a 2 equivalentes, más preferiblemente de 1,05 a 1,3 equivalentes con respecto al péptido protegido con portador.

En la etapa de condensación, se añade preferiblemente un agente de activación para promover la reacción y para suprimir reacciones secundarias tales como la racemización. En este caso, el agente de activación es un reactivo que, cuando coexiste con un agente de condensación, guía un aminoácido hacia un éster activo correspondiente o un anhídrido de ácido simétrico para facilitar la formación de un enlace peptídico (enlace amida). Como agente de activación, también pueden usarse en la presente invención agentes de activación usados generalmente en la síntesis de péptidos, y los ejemplos de los mismos incluyen HOBt, HOCt, HOAt, HOOBt, HOSu, HOPht, HONb, pentafluorofenol, cianohidroxiiminoacetato de etilo (Oxyma), preferiblemente, HOBt, HOOBt, HOCt, HOAt, HONb, HOSu y Oxyma. La cantidad de uso del agente de activación es normalmente de 1 a 4 equivalentes, preferiblemente de 1 a 2 equivalentes y más preferiblemente de 1,05 a 1,3 equivalentes con respecto al péptido protegido con portador.

Como disolvente orgánico usado en la etapa de condensación, también pueden usarse en la presente invención disolventes usados generalmente en la síntesis de péptidos, y los ejemplos de los mismos incluyen los disolventes orgánicos descritos anteriormente. La cantidad usada del disolvente es una cantidad en la que la concentración de un péptido protegido con portador disuelto es normalmente de 0,1 mM a 1 M, y preferiblemente de 1 mM a 0,5 M.

Como temperatura de reacción, en la presente invención también se usan temperaturas generalmente usadas en la síntesis de péptidos y, por ejemplo, normalmente está en un intervalo de -20 a 40 °C, y preferiblemente de 0 a 30 °C. El tiempo de reacción (tiempo de 1 ciclo) es normalmente de 0,5 a 30 horas.

6-2. Etapa de reacción de captación

El método de síntesis de péptidos de la presente invención se caracteriza porque después de la etapa de reacción de condensación de aminoácidos, se añade al sistema de reacción una amina soluble en agua que tiene dos o más grupos amino y que tiene al menos un grupo amino primario o secundario y el éster activo de aminoácido sin reaccionar se capta (captura). La amina soluble en agua que tiene dos o más grupos amino y que tiene al menos un grupo amino primario o secundario se une a un éster activo de aminoácido para formar un cuerpo captado, para desactivar el éster activo. En la presente memoria descriptiva, la amina soluble en agua usada en la presente invención se denomina en algunos casos captador de aminas.

Los ejemplos de una amina soluble en agua que tiene dos o más grupos amino y que tiene al menos un grupo amino primario o secundario incluyen 1-metilpiperazina, 4-aminopiperidina, dietilentriamina, triaminoetilamina, 1-etilpiperazina, N,N-dimetiletilendiamina, etilendiamina y piperazina, preferiblemente 1-metilpiperazina, 4-aminopiperidina, dietilentriamina, N,N-dimetiletilendiamina y etilendiamina, más preferiblemente 1-metilpiperazina, 4-aminopiperidina, N,N-dimetiletilendiamina y dietilentriamina, y además preferiblemente 1-metilpiperazina.

La cantidad de adición de una amina soluble en agua en la etapa (b) es normalmente de 1 a 10 equivalentes, preferiblemente de 1 a 6 equivalentes, y más preferiblemente de 1 a 4 equivalentes con respecto al equivalente de aminoácido que permanece teóricamente. Cuando la cantidad de adición de amina es menor que este intervalo, la captación (captura) de un éster activo de aminoácido se vuelve insuficiente y se produce un doble impacto en el que el éster activo de aminoácido que permanece y el grupo amino regenerado en la etapa posterior (c) reaccionan juntos, para reducir la pureza y el rendimiento, mientras que cuando es mayor que este intervalo, una desprotección de la reacción de Fmoc avanza simultáneamente y se produce un doble impacto en el que el éster activo del aminoácido restante reacciona con el grupo amino regenerado, para reducir la pureza y el rendimiento.

En el método de síntesis de péptidos de la presente invención, la siguiente etapa de eliminar un grupo Fmoc de un péptido protegido con portador-N-Fmoc se lleva a cabo después de captar (capturar) un éster activo de aminoácido en el sistema de reacción mediante un captador de amina para formar un cuerpo captado. De esta manera, en el momento de la desprotección de la reacción de Fmoc, el éster activo de aminoácido en la disolución de reacción se ha desactivado, e incluso cuando no se eliminan del sistema de reacción, puede evitarse el doble impacto de los aminoácidos en el momento de la desprotección. Además, el éster activo de aminoácido capturado por una amina soluble en agua que tiene dos o más grupos amino y que tiene al menos un grupo amino primario o secundario puede eliminarse fácilmente en la etapa de lavado posterior.

6-3. Etapa de desprotección de Fmoc

En el método de síntesis de péptidos de la presente invención, la eliminación de un grupo Fmoc de un péptido protegido con portador-N-Fmoc se lleva a cabo en presencia de una amina soluble en agua que tiene dos o más grupos amino y que tiene al menos un grupo amino primario o grupo amino secundario. En esta etapa, se añade adicionalmente al sistema de reacción una amina soluble en agua que tiene dos o más grupos amino y que tiene al menos un grupo amino primario o secundario. Los ejemplos de una amina soluble en agua que tiene dos o más grupos amino y que tiene al menos un grupo amino primario o secundario incluyen 1-metilpiperazina, 4-aminopiperidina, dietilentriamina, triaminoetilamina, 1 -etilpiperazina, N,N-dimetiletilendiamina, etilendiamina y piperazina, preferiblemente 1-metilpiperazina, 4-aminopiperidina y dietilentriamina, y más preferiblemente 1-metilpiperazina. La amina soluble en agua que tiene dos o más grupos amino y que tiene al menos un grupo amino primario o secundario en esta etapa puede ser igual o diferente de la amina soluble en agua que tiene dos o más grupos amino y que tiene al menos un grupo amino primario o secundario añadido en la etapa (b) (etapa de reacción de captación).

El equivalente de una amina soluble en agua que tiene dos o más grupos amino y que tiene al menos un grupo amino primario o secundario que va a añadirse en esta etapa (c) es de 5 a 30 equivalentes, preferiblemente de 5 a 20 equivalentes, y más preferiblemente de 10 a 20 equivalentes con respecto a la cantidad de un grupo Fmoc presente en el sistema. Cuando la cantidad de adición de amina es menor que este intervalo, la captación (captura) del DBF generado por la desprotección de la reacción de Fmoc se vuelve insuficiente y las impurezas no pueden eliminarse fácilmente en la siguiente etapa de lavado con disolución acuosa ácida, mientras que cuando es mayor que este intervalo, la cantidad de un ácido necesaria para la neutralización aumenta y se producen reacciones secundarias (descomposición, racemización) mediante la etapa de neutralización que la acompaña, lo que provoca una disminución de la pureza y una reducción del rendimiento.

En esta etapa, la desprotección de la reacción de Fmoc se lleva a cabo en presencia de una amina soluble en agua que tiene dos o más grupos amino y que tiene al menos un grupo amino primario o secundario; sin embargo, cuando la amina soluble en agua que tiene dos o más grupos amino grupos y que tiene al menos un grupo amino primario o secundario presente en el sistema tiene una función como reactivo de desprotección de Fmoc, no puede añadirse al sistema otro tipo de reactivos de desprotección de Fmoc. En un aspecto diferente, pueden añadirse otros reactivos de desprotección de Fmoc al sistema para realizar la desprotección de la reacción de Fmoc de manera eficiente. La amina soluble en agua que tiene dos o más grupos amino y que tiene al menos un grupo amino primario o secundario que tiene una función como reactivo de desprotección de Fmoc incluye, por ejemplo, las aminas solubles en agua ejemplificadas anteriormente. En esta etapa, es preferible añadir un reactivo de desprotección de Fmoc junto con una amina soluble en agua que tiene dos o más grupos amino y que tiene al menos un grupo amino primario o secundario.

Cuando se añade un reactivo de desprotección de Fmoc al sistema de reacción junto con una amina soluble en agua que tiene dos o más grupos amino y que tiene al menos un grupo amino primario o secundario en esta etapa, la amina soluble en agua que tiene dos o más grupos amino y que tiene al menos un grupo amino primario o secundario y el reactivo de desprotección de Fmoc puede añadirse simultáneamente; de manera alternativa, la amina soluble en agua puede añadirse al sistema antes de añadir el reactivo de desprotección de Fmoc. “Simultáneamente” al que se hace referencia en el presente documento pretende incluir la adición de los compuestos antes y después en el intervalo que se considera simultáneo en la reacción en la técnica. Cuando la amina soluble en agua que tiene dos o más grupos amino y que tiene al menos un grupo amino primario o secundario se añade al sistema antes de añadir el reactivo de desprotección de Fmoc, el intervalo de tiempo de adición puede controlarse apropiadamente en vista de la operación y otros factores.

Para eliminar un grupo Fmoc del extremo terminal N, en la presente invención pueden usarse métodos de eliminación generalmente usados en la síntesis de péptidos, cambiándolos apropiadamente si es necesario. El reactivo de desprotección de Fmoc que puede usarse en la presente invención incluye, por ejemplo, 1,8-diazabiciclo[5.4.0]-7-undeceno (DBU), 1,5-diazabiciclo[4.3.0]-5-noneno (DBN), 1,4-diazabiciclo[2.2.2]-octano (DABCO), trietilamina y tributilamina, preferiblemente DBU.

El DBF se genera en el momento de la desprotección de la reacción de Fmoc, y la amina soluble en agua que tiene dos o más grupos amino y que tiene al menos un grupo amino primario o secundario añadido en esta etapa puede captar (capturar) estas impurezas. El DBF capturado por una amina soluble en agua que tiene dos o más grupos amino y que tiene al menos un grupo amino primario o secundario puede eliminarse fácilmente en la siguiente etapa de lavado con disolución acuosa ácida.

6-4. Etapa de lavado con disolución acuosa ácida

Mediante la etapa de neutralización (d), el exceso de bases y los cuerpos captados presentes en el sistema pueden convertirse en sales, para mejorar la solubilidad en agua de los mismos. El ácido usado para la neutralización no está particularmente limitado siempre que pueda neutralizar una base en la disolución de reacción, y los ejemplos del mismo incluyen disoluciones acuosas de cloruro de hidrógeno, ácido fosfórico, ácido acético y ácido sulfúrico. Por ejemplo, cuando se usa ácido clorhídrico, se añade ácido clorhídrico que tiene una concentración de 1 N a 12 N, preferiblemente de 2 N a 12 N, más preferiblemente de 5 N a 12 N.

En la neutralización a la que se hace referencia en el presente documento, la disolución de reacción puede tener un pH neutro y el pH puede ser de 7,0 o menos.

En la etapa (d), se añade además una disolución acuosa ácida a la disolución de reacción neutralizada con un ácido, y la disolución se lava, luego se separa líquido-líquido, se descarta la fase acuosa y se recupera la fase orgánica. De este modo, pueden eliminarse las impurezas solubles en la disolución acuosa ácida.

La disolución acuosa ácida que va a usarse no está particularmente limitada, y los ejemplos de la misma incluyen agua con ácido clorhídrico, disolución diluida de ácido sulfúrico, disolución acuosa de ácido fosfórico y disolución acuosa de ácido acético, preferiblemente agua con ácido clorhídrico. El pH de la disolución acuosa ácida es de 1 a 5, preferiblemente de 1 a 4 y más preferiblemente de 1 a 3.

La cantidad de adición de la disolución acuosa ácida usada para el lavado no está particularmente limitada siempre que muestre un efecto de lavado, y es de 0,1 a 3 veces la cantidad, preferiblemente de 0,5 a 2 veces la cantidad, y más preferiblemente de 0,8 a 1,5 veces la cantidad con respecto a la disolución de reacción.

Las etapas de lavado, separación líquido-líquido y descarte de la fase acuosa no están limitadas en el número de veces de ejecución, y pueden realizarse una o varias veces. El número de veces se selecciona adecuadamente según el tipo de compuesto y la cantidad de impurezas en el sistema de reacción y el objeto.

En la presente invención, las impurezas pueden eliminarse lavando con una disolución acuosa ácida de la etapa (d). Mediante la operación de separación líquido-líquido de la disolución acuosa ácida, es posible eliminar impurezas tales como, por ejemplo, conjugado de H<2>N-AAx-amina (captador), sustancia descompuesta de agente de condensación, base reguladora del pH, conjugado de DBF-amina (captador), amina (captador), reactivo de desprotección de Fmoc, y es posible obtener un péptido protegido con portador disuelto en la disolución de reacción en la que se reducen o eliminan las impurezas.

La operación de separación líquido-líquido usando una disolución acuosa es sencilla y contribuye a reducir el tiempo del procedimiento. Además, la operación de separación sólido-líquido no es necesaria y puede reducirse el uso de un disolvente deficiente para solidificar un péptido protegido con portador.

En el último ciclo de síntesis de péptidos continua usando el método de la presente invención, después de la etapa de desprotección de Fmoc, se realiza la neutralización con un ácido, luego, se solidifica (cristaliza) un péptido protegido con portador, y el péptido protegido con portador puede recuperarse mediante una operación de separación sólido-líquido; sin embargo, es preferible llevar a cabo el lavado con una disolución acuosa ácida, desde el punto de vista de una eliminación más completa de las impurezas.

El método de síntesis de péptidos de la presente invención incluye una etapa de lavado con una disolución acuosa ácida para reducir o eliminar las impurezas generadas en la etapa de condensación y la etapa de desprotección de Fmoc; sin embargo, pueden añadirse otras etapas de lavado siempre que no se altere la recuperación del péptido protegido con portador en estado disuelto en un disolvente orgánico. Los ejemplos de los mismos incluyen lavado con una disolución acuosa débilmente básica y lavado con solución salina. También es posible realizar la deshidratación añadiendo un agente de deshidratación tal como sulfato de sodio anhidro, en lugar de lavar con solución salina. El lavado con una disolución acuosa débilmente básica incluye lavado con, por ejemplo, una disolución acuosa de hidrogenocarbonato de sodio, una disolución acuosa de carbonato de sodio o una disolución acuosa de carbonato de potasio que tiene un pH de 8 a 12 (preferiblemente de 8 a 10).

7. Etapa de cristalización/separación de péptidos protegidos con portador

El péptido protegido con portador sintetizado mediante el método de la presente invención puede insolubilizarse (por ejemplo, cristalizarse o aceitarse) y separarse después de la neutralización con una operación de separación ácida y líquido-líquido mediante una disolución acuosa ácida de la etapa (d). Además, el péptido protegido con portador sintetizado repitiendo las etapas (a) a (d) durante los tiempos necesarios usando el método de la presente invención puede insolubilizarse y separarse después de cualquier etapa después de la etapa (a), sin realizar la etapa (c) cuando no se realiza la desprotección del extremo terminal N, después de la etapa (a). La insolubilización puede llevarse a cabo haciendo referencia apropiadamente a métodos conocidos en el campo de la síntesis de péptidos usando un portador que tiene una propiedad en la que una condición disuelta y una condición insolubilizada (cristalizada o aceitada) cambian de manera reversible dependiendo de un cambio de la composición de un disolvente en el que se disuelve el péptido protegido con portador y, por ejemplo, puede llevarse a cabo cambiando la composición de una disolución en la que se disuelve el péptido protegido con portador. Las condiciones para la insolubilización pueden seleccionarse apropiadamente dependiendo del tipo de portador que va a usarse y del tipo y longitud del péptido protegido con portador sintetizado. Los ejemplos de los mismos incluyen medios de cambio de composición de disolvente tal como se describe a continuación.

Los medios para cambiar la composición de una disolución no están particularmente limitados, siempre que sean medios que puedan cambiar la composición de una disolución en la que se disuelve un péptido protegido con portador. Los medios preferibles para cambiar la composición de una disolución incluyen, por ejemplo, un medio de adición de un disolvente deficiente a una disolución en la que se disuelve un péptido protegido con portador tal cual, o después de concentrar la disolución y cristalizarla. En este caso, condensación quiere decir que una parte o la totalidad del disolvente se elimina por destilación, por ejemplo el disolvente se elimina por destilación a presión reducida. Después de eso, el cristal depositado puede separarse, por ejemplo, mediante filtración y separación centrífuga. Lavando el cristal separado preferiblemente con un disolvente orgánico, las impurezas separadas junto con el cristal pueden eliminarse completamente del péptido cristalizado protegido con portador. Las impurezas se eliminan suficientemente del péptido protegido con portador sintetizado mediante el método de la presente invención; sin embargo, las impurezas pueden eliminarse completamente realizando estas operaciones.

El disolvente deficiente en la presente invención denota un disolvente en el que un péptido protegido con portador es poco soluble, es decir, un disolvente en el que un péptido protegido con portador es difícil de disolver o insoluble. El disolvente en el que un péptido protegido con portador es difícil de disolver o insoluble puede ser un disolvente, que es líquido a temperatura normal, en el que la solubilidad de un péptido protegido con portador es inferior al 1 % en masa a 25 °C, y es preferiblemente acetonitrilo, acetonitrilo que contiene agua en cualquier razón, metanol, metanol que contiene agua en cualquier razón o agua.

En el último ciclo de síntesis de péptidos continua usando el método de la presente invención, es posible recuperar un péptido sintetizado protegido con portador que tiene mayor pureza, llevando a cabo las etapas de cristalización y separación después de la neutralización con un ácido y la operación de separación líquido-líquido mediante una disolución acuosa ácida de la etapa (d).

8. Etapa de desprotección del portador

La desprotección del portador se realiza separando un portador unido directamente o mediante un grupo de unión a un péptido en un péptido protegido con portador sintetizado mediante el método de la presente invención.

Cuando el portador se une directamente a un péptido, la desprotección del portador puede realizarse eliminando (desprotección de) el portador unido a un grupo carboxilo, un grupo amino, un grupo amida o un grupo hidroxilo del péptido sintetizado.

El método para eliminar un portador no está particularmente limitado y pueden usarse métodos de desprotección conocidos, y se lleva a cabo preferiblemente mediante tratamiento con un ácido. Por ejemplo, puede usarse un método de desprotección usando TFA, y más específicamente, es preferible realizar la desprotección con del 50 al 100 % de ácido trifluoroacético cuando se usa Ka, con del 1 al 100 % de ácido trifluoroacético cuando se usa Kb, con del 95 al 100 % de ácido trifluoroacético cuando se usa Kc, con del 1 al 100 % de ácido trifluoroacético cuando se usa un portador D, con del 1 al 100 % de ácido trifluoroacético cuando se usa un portador E o un portador F, con del 95 al 100 % de ácido trifluoroacético cuando se usa un portador G, y con del 1 al 100 % de ácido trifluoroacético cuando se usa un portador H.

En el método de la presente invención, cuando un portador se une a un péptido a través de un grupo de unión, la desprotección del portador puede llevarse a cabo (i) cortando un enlace entre el grupo de unión y el péptido, o (ii) cortando un enlace entre el grupo de unión y el portador. En el último caso, el péptido se separa del portador en la condición que porta el grupo de unión, por lo que puede obtenerse un péptido en el que la cadena terminal o lateral está modificada con el grupo de unión.

La desprotección del portador en el caso de (i) puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante un método de desprotección usando TFA cuando un grupo de unión y un péptido están unidos mediante un enlace éster o un enlace amida.

En la desprotección del portador en el caso de (ii), es posible usar el método de desprotección en el caso de enlace directo.

9. Síntesis del péptido con modificación del extremo terminal C

La amidación del extremo terminal C es una modificación que se observa a menudo en péptidos que tienen actividad biológica, y los ejemplos de los mismos incluyen calcitonina, gastrina, secretina y factores liberadores de hormonas. Un péptido en el que el extremo terminal C está amidado puede sintetizarse eficazmente usando un portador que tiene un grupo reactivo que contiene un grupo amino, usando el método de síntesis de péptidos de la presente invención.

Por ejemplo, es posible obtener un péptido en el que el extremo terminal C está amidado, por ejemplo, modificado con un grupo amino o un grupo aminoalquilo, usando un aminoácido o péptido protegido con portador en el que un portador está unido mediante un grupo de unión que tiene como grupo reactivo un grupo amino que se une a un grupo carboxilo al terminal del grupo carboxilo de cualquier aminoácido o péptido, o cualquiera de los siguientes portadores (a continuación en el presente documento, denominado portador de amida en algunos casos) está unido como un portador protector directamente al extremo terminal, en el método de la presente invención.

El portador de amida incluye los portadores descritos anteriormente y en las reivindicaciones en los que el grupo reactivo porta un grupo amino o un grupo alquilamino.

Mediante el método de la presente invención que usa cualquiera de los portadores, es posible obtener un péptido en el que el extremo terminal C está modificado con un grupo amino o un grupo alquilamino. Por ejemplo, es posible obtener un péptido en el que la prolina en el extremo terminal C esté aminoetilada. La amidación del extremo terminal C es una modificación que se observa a menudo en péptidos que tienen actividad biológica, por lo que el método de la presente invención que usa un portador de amida como una realización de la presente invención es útil para sintetizar tales péptidos.

El péptido obtenido usando el método de síntesis de péptidos de la presente invención puede aislarse y purificarse según métodos usados generalmente en la síntesis de péptidos. Por ejemplo, el péptido deseado puede aislarse y purificarse tratando la mezcla de reacción mediante extracción y lavado, cristalización y cromatografía.

Aunque el tipo de péptido producido mediante el método de síntesis de péptidos de la presente invención no está particularmente limitado, es preferible que el número de residuos de aminoácidos del péptido sea, por ejemplo, de aproximadamente varias decenas o menos. El péptido obtenido mediante el método de síntesis de péptidos de la presente invención puede usarse en diversos campos que incluyen, por ejemplo, campos de la medicina, alimentos, cosméticos, materiales electrónicos, como péptidos sintéticos y péptidos naturales conocidos o desconocidos.

Ejemplos

El método de síntesis se describirá a continuación en el presente documento usando péptidos que tienen secuencias descritas a continuación como ejemplos.

(Péptido A) H-Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-dLeu-Leu-Arg-Pro-NHEt (SEQ ID NO: 2)

(Péptido B) H-dArg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-dTic-Oic-Arg-OH (SEQ ID NO: 1)

En la presente memoria descriptiva y los siguientes ejemplos, se usan las abreviaturas mostradas a continuación.

AAs: uno o más de cualesquiera residuos de aminoácido

AAx: cualquier residuo de aminoácido

Boc: tert-butoxicarbonilo

COMU: hexafluorofosfato de (1-ciano-2-etoxi-2-oxoetilideneaminooxi)dimetilamino-morfolino-carbenio CPME: ciclopentil metil éter

dArg: D-arginina

D-Arg: D-arginina

dLeu: D-leucina

dTic: ácido D-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina-3-carboxílico

D-Tic: ácido D-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina-3-carboxílico

DBU: 1,8-diazabiciclo[5.4.0]-7-undeceno

DCM: diclorometano

DIPCI: diisopropilcarbodiimida

DIPEA: N,N-diisopropiletilamina

DMAP: N,N-dimetil-4-aminopiridina

DMF: N,N-dimetilformamida

DMT-MM: cloruro de 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfonio

DTT: ditiotreitol

Fmoc: 9-fluorenilmetiloxicarbonilo

HATU: hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio

HBTU: hexafluorofosfato de O-(benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio

HOAt: 1-hidroxi-7-azabenzotriazol

HOBt: 1-hidroxibenzotriazol

Hyp: trans-4-hidroxi-L-prolina

Ka: 3,4,5-trioctadeciloxibencilo

Kb: 2,4-didocosiloxibencilo

Kc: 3,5-didocosiloxibencilo

Me: metilo

MTBE: metil terc-butil éter

NMP: N-metilpirrolidona

Oic: ácido L-octahidroindolina-2-carboxílico

Oxyma: cianohidroxiiminoacetato de etilo

Pbf: 2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonilo

Pyr: ácido piroglutámico

Su: succinimidilo

tBu: terc-butilo

TFA: ácido trifluoroacético

TFE: 2,2,2-trifluoroetanol

THF: tetrahidrofurano

THP: tetrahidropirano

Thi: p-(2-tienil)-L-alanina

TIS: triisopropilsilano

Trt: trifenilmetilo

El método de síntesis general para la desprotección de Fmoc usado en los presentes ejemplos se describirá a continuación. El caso en el que se usa Kb como compuesto portador se describe como un ejemplo. Además, la cantidad de adición de cada reactivo es meramente un ejemplo.

(1) Método de síntesis general para la desprotección de Fmoc

Se disolvieron los materiales de partida en una disolución mixta de THF:DMF (9/1) de modo que la proporción fue de 18 v/p, y se añadieron piperidina (1,5 equiv.) y DBU (1,0 equiv.) y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 10 minutos. Mientras se enfriaba en hielo, se añadió ácido clorhídrico 6 N (3,50 equiv.) y se eliminó por destilación el disolvente a presión reducida. Al residuo se le añadió acetonitrilo y se filtró el precipitado depositado, y además, se llevó a cabo suspensión y lavado con acetonitrilo, y se secó el sólido resultante a presión reducida, para obtener un cuerpo de desprotección de Fmoc.

El método de desprotección por condensación usado en el método de la presente invención se describirá a continuación. El caso en el que se usa Kb como compuesto portador se describe como un ejemplo. Además, la cantidad de adición de cada reactivo es meramente un ejemplo.

(2) Método de desprotección por condensación en 1 recipiente usando captador de amina (amina soluble en agua)

Se disolvieron los materiales de partida en una disolución mixta de THF:DMF (9/1) de modo que la proporción fue de 18 v/p, y se añadieron Fmoc-AAx-OH (1,30 equiv.), COMU (1,25 equiv.) y DIPEA (2,30 equiv.) y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se añadió 1-metilpiperazina (0,45 equiv.) como amina soluble en agua y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se añadieron 1-metilpiperazina (20,0 equiv.) y DBU (7,0 equiv.) y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se añadieron THF (0,8 v/p) y ácido clorhídrico 0,1 N (18 v/p) a la disolución de reacción a la que se había añadido ácido clorhídrico 6 N (49,50 equiv.), y se lavó la disolución, se separó, y se descartó la fase acuosa. Además, se añadió una disolución acuosa de hidrogenocarbonato de sodio 0,5 N (18 v/p), y se lavó y se separó la disolución, y se descartó la fase acuosa, para obtener un condensado de aminoácido en forma de una disolución.

El método de desproteger (separar) el portador de un péptido usado en el método de la presente invención se describirá a continuación. El caso en el que se usa Kb como compuesto portador se describe como un ejemplo. Además, la cantidad de adición de cada reactivo es meramente un ejemplo.

(3)Método de desprotección general del grupo protector Kb

(en la que R representa un grupo protector usado regularmente para proteger un átomo de hidrógeno o un grupo amino)

Se disolvieron las materias primas en una disolución mixta de DCM:TFE:TFA (90/9/1) de modo que la proporción fue de 19,75 v/p, y se agitó la disolución a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se filtró el precipitado, y se añadió DIPEA al filtrado de modo que su cantidad fue de 1,0 equiv. con respecto a TFA, se añadió ácido clorhídrico 0,01 N (18 v/p), y se lavó la disolución, se separó, y se descartó la fase acuosa. A la fase orgánica resultante se le añadió diisopropil éter y se eliminó por destilación el disolvente a presión reducida. Al residuo se le añadió diisopropil éter y se suspensión y se lavó el precipitado depositado, y se secó el sólido resultante a presión reducida, para obtener un cuerpo con desprotección de Kb.

La síntesis de péptidos usando el método de la presente invención se describirá a continuación.

La expresión “v/p” en la siguiente descripción de la memoria descriptiva indica la cantidad del disolvente que va a añadirse, basándose en los materiales de partida, en una serie de síntesis de péptidos reacciones.

Ejemplo 1: Síntesis de H-Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-dLeu-Leu-Arg-Pro-NHEt (SEQ ID NO: 2) usando Kb-OHSíntesis del compuesto 1 (Fmoc-Arg(Pbf)-OKb)

Se disolvió alcohol 2,4-didocosiloxibencílico (expresado como “Kb-OH”) (10,0 g, 13,20 mmol) en THF deshidratado (132 ml), y se añadieron Fmoc-Arg(Pbf)-OH (12,85 g, 19,80 mmol, 1,50 equiv.), DIPCI (3,06 ml, 19,80 mmol, 1,5 equiv.) y DMAP (80,7 mg, 0,66 mmol, 0,05 equiv.) y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se eliminó por destilación la disolución de reacción a presión reducida. Al residuo se le añadió metanol y se filtró el precipitado depositado, se llevó a cabo suspensión y lavado con metanol, y además, se llevó a cabo suspensión y lavado con acetonitrilo dos veces. Se secó el sólido resultante a presión reducida, para obtener un compuesto 1 (18,33 g, cuant).

Síntesis del compuesto 2 (HChH-Arg(Pbf)-OKb)

Se sometió el compuesto 1 al método de síntesis general para la desprotección de Fmoc, para obtener un compuesto 2 (19,85 g, cuant).

Síntesis del compuesto 3 (H-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-dLeu-Leu-Arg(Pbf)-OKb (SEQ ID NO: 3))

Se introdujeron los siguientes aminoácidos en el compuesto 2 repitiendo el método de desprotección por condensación en 1 recipiente usando un captador de amina (amina soluble en agua), para obtener un compuesto 3 en forma de una disolución.

1er residuo: Fmoc-Leu-OH

2° residuo: Fmoc-dLeu-OH

3er residuo: Fmoc-Tyr(tBu)-OH

4° residuo: Fmoc-Ser(tBu)-OH

5° residuo: Fmoc-Trp(Boc)-OH

6° residuo: Fmoc-His(Trt)-OH

Síntesis del compuesto 4 (Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-dLeu-Leu-Arg(Pbf)-OKb (SEQ ID NO: 4))

H

-

A la disolución de compuesto 3 resultante se le añadió DMF de modo que la proporción fue de 1,8 v/p con respecto al rendimiento teórico. Se añadieron H-Pyr-OH (3,30 g, 25,55 mmol), COMU (7,0 g, 16,26 mmol, 1,25 equiv.) y DIPEA (5,10 ml, 29,28 mmol, 2,25 equiv.). Se agitó la disolución mixta resultante a temperatura ambiente durante 30 minutos. A la disolución de reacción resultante se le añadió 1-metilpiperazina (0,45 equiv.) y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se añadió ácido clorhídrico 0,01 N (18 v/p), y se lavó la disolución, se separó, y se descartó la fase acuosa. Se destiló la fase orgánica resultante a presión reducida para eliminar el disolvente. Al residuo se le añadió acetonitrilo y se filtró el precipitado depositado, y además, se llevó a cabo suspensión y lavado con acetonitrilo, y se secó el sólido resultante a presión reducida, para obtener un compuesto 4 (28,78 g, 87,50 %).

Síntesis del compuesto 5 (Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-dLeu-Leu-Arg(Pbf)-OH (SEQ ID NO: 5))

Se sometió el compuesto 4 (20,0 g, 7,90 mmol) al método de desprotección general del grupo protector Kb, para obtener un compuesto 5 (14,39 g, cuant).

Síntesis del compuesto 6 (Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-dLeu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-NHEt (SEQ ID NO: 6))

Se disolvió el compuesto 5 (6,20 g, 3,45 mmol) en THF de modo que la proporción fue de 16,2 v/p, y se añadió H-Pro-NHEbHCl (0,80 g, 4,5 mmol, 1,3 equiv.) disuelto en DMF a 1,8 v/p. Se añadieron DMT-MM^2H2O (1,84 g, 6,05 mmol, 1,75 equiv.) y DIPEA (2,41 ml, 13,83 mmol, 4,0 equiv.). Se agitó la disolución mixta resultante durante 60 minutos mientras se enfriaba en hielo. A la disolución de reacción resultante se le añadió ciclohexano (18 v/p), se añadió ácido clorhídrico 0,01 N (18 v/p), y se lavó la disolución, se separó, y se descartó la fase acuosa. Se destiló la fase orgánica resultante a presión reducida para eliminar el disolvente. Al residuo se le añadió diisopropil éter y se filtró el precipitado depositado, y además, se llevó a cabo suspensión y lavado con diisopropil éter, y se secó el sólido resultante a presión reducida, para obtener un compuesto 6 (5,33 g, 80,51 %).

Síntesis del compuesto 7 (Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-dLeu-Leu-Arg-Pro-NHEt (SEQ ID NO: 2))

Se disolvió el compuesto 6 (5,33 g, 2,78 mmol) en 92 ml de una disolución mixta de TFA/TIS/agua (90/1/9), se añadió DTT (3,70 g, 40 mg/ ml), y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 3 horas. Se filtró la disolución de reacción a través de Celite, y se lavó el residuo de filtración con metanol y se filtró, al filtrado resultante se le añadió tolueno (misma cantidad que la disolución mixta), y se eliminó por destilación el disolvente a presión reducida. Al residuo se le añadió MTBE frío y se filtró el precipitado depositado, y además, se llevaron a cabo suspensión y lavado con MTBE y suspensión y lavado con hexano, y se secó el sólido resultante a presión reducida, para obtener un compuesto 7 (4,21 g, cuant, pureza de HPLC: 76,28 %).

Ejemplo 2. Síntesis de (péptido B) H-dArg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-dTic-Oic-Arg-OH (SEQ ID NO: 1)Síntesis del compuesto 1 (Fmoc-Arg(Pbf)-OKb)

Se disolvió alcohol 2,4-didocosiloxibencílico (expresado como “Kb-OH”) (1,5 g, 1,98 mmol) en THF deshidratado (20 ml), y se añadieron Fmoc-Arg(Pbf)-OH (1,93 g, 2,97 mmol, 1,5 equiv.), DIPCI (0,46 ml, 2,97 mmol, 1,5 equiv.) y DMAP (12 mg, 0,1 mmol, 0,05 equiv.) y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se eliminó por destilación la disolución de reacción a presión reducida. Al residuo se le añadió metanol y se filtró el precipitado depositado, se llevó a cabo suspensión y lavado con metanol, y además, se llevó a cabo suspensión y lavado con acetonitrilo dos veces. Se secó el sólido resultante a presión reducida, para obtener un compuesto 1 (2,75 g, cuant.).

Síntesis del compuesto 8 (H-Arq(Pbf)-OKb)

Se sometió el compuesto 1 al método de síntesis general para la desprotección de Fmoc usando 1-metilpiperazina en lugar de piperidina, y se lavó con agua de ácido clorhídrico y con una disolución acuosa de hidrogenocarbonato de sodio, para obtener un compuesto 8 en forma de una disolución.

Síntesis del compuesto 9 (H-Arg(Pbf)-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser(tBu)-dTic-Oic-Arg(Pbf)-OKb (SEQ ID NO: 7))

Se condensaron secuencialmente los siguientes aminoácidos con el compuesto 8, y se añadió un captador de amina cada vez, seguido de la operación de desprotección, y se llevaron a cabo lavado con agua de ácido clorhídrico y con una disolución acuosa de hidrogenocarbonato de sodio. Se repitió este método de desprotección por condensación en 1 recipiente, para obtener un compuesto 9 en forma de una disolución. 1er residuo: Fmoc-Oic-OH

2° residuo: Fmoc-dTic-OH

3er residuo: Fmoc-Ser(tBu)-OH

4° residuo: Fmoc-Thi-OH

5° residuo: Fmoc-Gly-OH

6° residuo: Fmoc-Hyp-OH

7° residuo: Fmoc-Pro-OH

8° residuo: Fmoc-Arg(Pbf)-OH

Síntesis del compuesto 10 (Boc-dArq(Pbf)-Arq(Pbf)-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser(tBu)-dTic-Oic-Arq(Pbf)-OKb (SEQ ID NO: 8))

A la disolución del compuesto 9 se le añadieron Boc-dArg(Pbf)-OH (1,36 g, 2,57 mmol, 1,30 equiv.), COMU (1,06 g, 2,48 mmol, 1,25 equiv.) y DIPEA (0,78 ml, 4,45 mmol, 2,25 equiv.). Se agitó la disolución mixta resultante a temperatura ambiente durante 30 minutos. A la disolución de reacción resultante se le añadió 1-metilpiperazina (0,45 equiv.) y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se llevaron a cabo lavado con agua de ácido clorhídrico 0,1 N (42 ml), posteriormente con una disolución acuosa de hidrogenocarbonato de sodio 0,5 N (42 ml) y operaciones de separación líquido-líquido de los mismos, respectivamente, y se destiló la fase orgánica resultante a presión reducida para eliminar el disolvente. Al residuo se le añadió acetonitrilo y se filtró el precipitado depositado, y además, se llevó a cabo suspensión y lavado con acetonitrilo, y se secó el sólido resultante a presión reducida, para obtener un compuesto 10 (4,77 g, 81,4 %).Síntesis del compuesto 11 (4TFA^H-dArg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-dTic-Oic-Arg-OH (SEQ ID NO: 1))Se disolvió el compuesto 10 (3,00 g, 1,01 mmol) en 50 ml de una disolución mixta de TFA/TIS/agua (90/1/9), y se agitó la disolución a temperatura ambiente durante 4 horas. Se filtró la disolución de reacción a través de Celite, se combinó con la disolución de lavado de ácido acético y se destiló a presión reducida para eliminar el disolvente. Al residuo se le añadió MTBE frío y se recogió el precipitado depositado mediante filtración, luego, se llevó a cabo suspensión y lavado con MTBE, posteriormente, se llevó a cabo suspensión y lavado con hexano, y se secó el sólido resultante a presión reducida, para obtener un compuesto 11 (1,61 g, 90,4 %, pureza de HPLC: 84,93 %).

Ejemplo 3: Síntesis de H-Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-dLeu-Leu-Arg-Pro-NHEt (SEQ ID NO: 1) usando el portador Kb-NHEt

Síntesis del compuesto 12

Se disolvió N-etil-2,4-didocosiloxibencilamina (expresada como “EtNKb”) (12,5 g, 15,23 mmol) en THF/DMF (9/1) de modo que la proporción fue de 18 v/p, y se añadieron Fmoc-Pro-OH/H<2>O (7,04 g, 19,80 mmol, 1,30 equiv.), COMU (8,15 g, 19,04 mmol, 1,25 equiv.) y DIPEA (8,62 ml, 49,49 mmol, 3,30 equiv.) y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se añadió 1-metilpiperazina (0,45 equiv.) y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se añadieron 1-metilpiperazina (20,0 equiv.) y DBU (7,0 equiv.) y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 10 minutos. Mientras se enfriaba en hielo, se añadieron ciclohexano (4,5 v/p) y ácido clorhídrico 0,1 N (18 v/p) a la disolución de reacción a la que se había añadido ácido clorhídrico<6>N (50,70 equiv.), y se lavó la disolución, se separó, y se descartó la fase acuosa. Además, se añadió una disolución acuosa de hidrogenocarbonato de sodio 0,5 N (18 v/p), se lavó y se separó la disolución, y se descartó la fase acuosa, para obtener un compuesto<12>en forma de una disolución.

Síntesis del compuesto 13 (H-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-dLeu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-EtNKb (SEQ ID NO: 9))

Se introdujeron los siguientes aminoácidos en la disolución del compuesto<12>repitiendo el método de desprotección por condensación en<1>recipiente usando un captador de amina (amina soluble en agua), para obtener un compuesto 13 en forma de una disolución.

1er residuo: Fmoc-Arg(Pbf)-OH

2° residuo: Fmoc-Leu-OH

3er residuo: Fmoc-dLeu-OH

4° residuo: Fmoc-Tyr(tBu)-OH

5° residuo: Fmoc-Ser(tBu)-OH

<6>° residuo: Fmoc-Trp(Boc)-OH

7° residuo: Fmoc-His(Trt)-OH

Síntesis del compuesto 14 (Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-dLeu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-EtNKb (SEQ ID NO: 10))

A la disolución del compuesto 13 resultante se le añadieron H-Pyr-OH (2,95 g, 22,84 mmol, 1,50 equiv.), COMU (9,46 g, 22,08 mmol, 1,45 equiv.) y DIPEA (6,50 ml, 37,31 mmol, 2,50 equiv.). Se agitó la disolución mixta resultante a temperatura ambiente durante 15 minutos. A la disolución de reacción resultante se le añadió 1-metilpiperazina (0,65 equiv.) y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 10 minutos. Mientras se enfriaba en hielo, se añadió ácido clorhídrico<6>N (3,10 equiv.) para neutralizarla, luego, se añadió ácido clorhídrico 0,1 N (18 v/p), y se lavó la disolución, se separó, y se descartó la fase acuosa. Además, se añadió una disolución acuosa de hidrogenocarbonato de sodio 0,5 N (18 v/p), y se lavó la disolución, se separó, y se descartó la fase acuosa. Se destiló la fase orgánica resultante a presión reducida para eliminar el disolvente. Al residuo se le añadió acetonitrilo frío y se filtró el precipitado depositado, y además, se llevó a cabo suspensión y lavado con acetonitrilo, y se secó el sólido resultante a presión reducida, para obtener un compuesto 14 (36,93 g, 90,83 %).

Se disolvió el compuesto 14 (5,00 g) en 93,6 ml de una disolución mixta de TFA/TIS/agua (90/1/9), se añadió DTT (1,87 g, 20 mg/ ml), y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 3 horas. Se filtró la disolución de reacción a través de Celite, se lavó el residuo de filtración con metanol y se filtró, y al residuo concentrado de filtrado resultante se le añadió MTBE frío y se filtró el precipitado depositado, y además, se llevó a cabo suspensión y lavado con MTBE dos veces y se llevó a cabo suspensión y lavado con hexano, y se secó el sólido resultante a presión reducida, para obtener un compuesto 7 (2,45 g, 93,0 %, pureza de HPLC: 95,18 %).

Ejemplo comparativo 1: Se sintetizó el siguiente péptido usando un método de separación sólido-líquido en el que se solidifica el portador después de la reacción de desprotección de Fmoc.

Síntesis de (péptido B) H-dArg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-dTic-Oic-Arg-OH (SEQ ID NO: 1)

Síntesis del compuesto 101 (Fmoc-Arg(Pbf)-OKa)

Se sintetizó un compuesto 101 según la descripción de la publicación de patente internacional WO2007/034812.

Se obtuvo un compuesto 101 (83,5 g) usando Ka-OH (50,0 g (54,7 mmol, 1,0 eq.)) y Fmoc-Arg(Pbf)-OH (53,3 g (82,1 mmol, 1,5 eq.)). Rendimiento:<9 8 , 8>%

Síntesis del compuesto 102 (HCl^H-Arg(Pbf)-OKa)

Se sintetizó un compuesto 102 a partir del compuesto 101 según la descripción de la publicación de patente internacional WO2007/034812.

Se obtuvo un compuesto 102 (73,0 g) a partir de Fmoc-Arg(Pbf)-OKa (compuesto 101) (81,6 g). Rendimiento: cuant.

Síntesis del compuesto 103 (HCl^H-Oic-Arg(Pbf)-OKa)

En un matraz de cuatro bocas de 3 l previamente lavado y secado, se añadieron y se disolvieron THF/DMF (9/1) (13 v/p) y HChH-Arg(Pbf)-OKa (compuesto 102) (71,0 g (52,3 mmol, 1,0 eq.)) y Fmoc-Oic-OH (1,50 eq.). A la disolución resultante se le añadió DMT-MM (1,45 eq.) a una temperatura interna de 30 °C o menos. Además, se añadió DIPEA (5,00 eq.) y se agitó la mezcla y se hizo reaccionar durante 30 minutos. Después de confirmar la finalización de la reacción mediante CCF, a la disolución de reacción resultante se le añadió propilamina (1,80 eq.), y se agitó la mezcla durante 30 minutos. A la disolución de reacción resultante se le añadieron piperidina (1,5 eq.) y DBU (7,0 eq.), y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 10 minutos, luego, se confirmó la desaparición de las materias primas mediante CCF. Se enfrió la disolución de reacción resultante a de 0 a 10 °C, y se añadió HCl<6>N (15,3 eq.). A la disolución resultante se le añadió THF (5,0 v/p). Además, se añadieron N-HCl 0,01 N (10,0 v/p) y acetato de etilo (5,0 v/p), y se agitó la mezcla durante 10 minutos, se dejó reposar durante 5 minutos, y se descargó la fase inferior. A la fase superior resultante se le añadió una disolución de agua:solución salina saturada = 9:1 (10,0 v/p) y se agitó la mezcla durante 10 minutos, y se detuvo la agitación, y se dejó reposar la mezcla durante 5 minutos y se descargó la fase inferior. Esta operación se repitió una vez más. A la fase orgánica resultante se le añadió sulfato de magnesio (1,0 p/p), y se agitó la mezcla durante 30 minutos. Se filtró la suspensión resultante, y se lavó el residuo con THF (5,0 v/p) dos veces. Al filtrado resultante se le añadió DMF (1,1 v/p), y se concentró la mezcla a 40 °C a presión reducida hasta que la proporción de la disolución destilada fue de 16,1 v/p. En un recipiente de 2 l lavado y secado previamente, se transfirió el residuo resultante usando THF (2,00 v/p). A la disolución resultante se le añadió acetonitrilo (10,9 v/p), y se agitó la mezcla durante 30 minutos. Se filtró la suspensión resultante, y se lavó la torta con acetonitrilo (3,00 v/p) dos veces. En un recipiente de reacción lavado previamente, se transfirió la torta resultante, se añadió acetonitrilo (10,9 v/p), y se agitó la mezcla durante 30 minutos. Se filtró la suspensión resultante, y se lavó la torta resultante con acetonitrilo (3,00 v/p) dos veces. Se secó la torta resultante a 40 °C a presión reducida durante 13 horas, para obtener un compuesto 103 (75,8 g). Rendimiento: 96,1 %.

Síntesis del compuesto 104 (HCl^H-D-Tic-Oic-Arg(Pbf)-OKa (SEQ ID NO: 11))

Se obtuvo un compuesto 104 (78,8 g) de la misma manera que en la síntesis del compuesto 103 usando HCFH-Oic-Arg(Pbf)-OKa (compuesto 103) (73,5 g (48,7 mmol, 1,0 eq.)) y Fmoc-D-Tic-OH (29,2 g (78,4 mmol, 1,50 eq.)). Rendimiento: 96,9 %.

Síntesis del compuesto 105 (HCl^H-Ser(tBu)-D-Tic-Oic-Arg(Pbf)-OKa (SEQ ID NO: 12))

Se obtuvo un compuesto 105 (83,1 g) de la misma manera que en la síntesis del compuesto 103 usando HCFH-D-Tic-Oic-Arg(Pbf)-OKa (compuesto 104) (78,5 g (47,0 mmol, 1,0 eq.)) y Fmoc-Ser(tBu)-OH (27,1 g (70,6 mmol, 1,50 eq.)). Rendimiento: 97,5 %.

Síntesis del compuesto 106 (HCl^H-Thi-Ser(tBu)-D-Tic-Oic-Arg(Pbf)-OKa (SEQ ID NO: 13))

Se obtuvo un compuesto 106 (87,7 g) de la misma manera que en la síntesis del compuesto 103 usando HCFH-Ser(tBu)-D-Tic-Oic-Arg(Pbf)-OKa (compuesto 105) (82,5 g (45,5 mmol, 1,0 eq.)) y Fmoc-Thi-OH (26,9 g (68,3 mmol, 1,50 eq.)). Rendimiento: 98,1 %.

Síntesis del compuesto 107 (HCl^H-Gly-Thi-Ser(tBu)-D-Tic-Oic-Arg(Pbf)-OKa (SEQ ID NO: 14))

Se obtuvo un compuesto 107 (87,3 g) de la misma manera que en la síntesis del compuesto 103 usando HCFH-Thi-Ser(tBu)-D-Tic-Oic-Arg(Pbf)-OKa (compuesto 106) (87,5 g (44,6 mmol, 1,0 eq.)) y Fmoc-Gly-OH (26,9 g (66,9 mmol, 1,50 eq.)). Rendimiento: 96,9 %.

Síntesis del compuesto 108 (HCl^H-Hyp-Gly-Thi-Ser(tBu)-D-Tic-Oic-Arg(Pbf)-OKa (SEQ ID NO: 15))

Se obtuvo un compuesto 108 (89,4 g) de la misma manera que en la síntesis del compuesto 103 usando HCFH-Gly-Thi-Ser(tBu)-D-Tic-Oic-Arg(Pbf)-OKa (compuesto 107) (87,0 g (43,0 mmol, 1,0 eq.)) y Fmoc-Hyp-OH (22,8 g (64,5 mmol, 1,50 eq.)). Rendimiento: 97,2 %.

Síntesis del compuesto 109 (HChH-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser(tBu)-O-Tic-Oic-Arg(Pbf)-OKa (SEQ ID NO: 16))

Se obtuvo un compuesto 109 (89,9 g) de la misma manera que en la síntesis del compuesto 103 usando HCFH-Hyp-Gly-Thi-Ser(tBu)-D-Tic-Oic-Arg(Pbf)-OKa (compuesto 108) (89,0 g (41,7 mmol, 1,0 eq.)) y Fmoc-Pro-OH (21,1 g (62,5 mmol, 1,50 eq.)). Rendimiento: 96,6 %.

Síntesis del compuesto 110 (HChH-Arg(Pbf)-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser(tBu)-D-Tic-Oic-Arq(Pbf)-OKa (SEQ ID NO: 17))

H

D

Se obtuvo un compuesto 110 (101,9 g) de la misma manera que en la síntesis del compuesto 103 usando HCFH-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser(tBu)-D-Tic-Oic-Arg(Pbf)-OKa (compuesto 109) (89,5 g (40,1 mmol, 1,0 eq.)) y Fmoc-Arg(Pbf)-OH (39,0 g (60,1 mmol, 1,50 eq.)). Rendimiento: 96,3 %.

Síntesis del compuesto 111 (HChH-D-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser(tBu)-D-Tic-Oic-Arq(Pbf)-OKa (SEQ ID NO: 18))

Se obtuvo un compuesto 111 (112,1 g) de la misma manera que en la síntesis del compuesto 103 usando HCFH-Arg(Pbf)-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser(tBu)-D-Tic-Oic-Arg(Pbf)-OKa (compuesto 110) (101 g (38,4 mmol, 1,0 eq.)) y Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH (37,4 g (57,6 mmol, 1,50 eq.)). Rendimiento: 96,0 %.

Síntesis del compuesto 11 (4TFA^H-O-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-O-Tic-Oic-Arg-OH (SEQ ID NO: 1))

En un matraz de cuatro bocas de 2 l lavado y secado previamente, se cargó una disolución mixta de TFA/TIS/H<2>O=90/1/9 (550 ml (10 v/p)) y se añadió HCFH-D-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser(tBu)-D-Tic-Oic-Arg(Pbf)-OKa (compuesto 111) (55 g (18,0 mmol, 1,0 eq.)), y se lavó a fondo la mezcla con una disolución mixta de TFA/TIS/H<2>O=90/1/9 (50 ml (0,91 v/p)). Se agitó la disolución resultante a una temperatura interna de 23,5 a 31,5 °C durante 4 horas, y se hizo reaccionar. A la disolución de reacción resultante se le añadió Hyflo Super-C6l (55g (1,00 p/p)), y se agitó la mezcla y se suspendió. Se cubrió previamente Hyflo Super-C6l (55,0 g (1,00 p/p)) en un embudo de 150^ de Kiriyama, y se filtró la disolución de reacción a través de este. Se lavó el residuo de filtración con ácido acético (193 ml (3,5 v/p)). Además, se lavó el residuo de filtración con 110 ml de ácido acético dos veces, y se concentró. Se combinaron el filtrado y la disolución de lavado, y además, se lavaron a fondo con ácido acético (13,8 ml (0,25 v/p)), y se enfriaron hasta 0 °C. A la disolución resultante, se le añadió MTBE (3440 ml (62,5 v/p)) enfriado hasta - 20 °C durante un periodo de 10 minutos, y se agitó la mezcla durante 35 minutos. Se filtró la suspensión resultante, y se lavó la torta resultante con MTBE<( 11 0>ml (<2 , 0>v/p)). Se transfirió la torta resultante a un vaso de precipitados, se añadió MTBE (1380 ml (25,0 v/p)), y se agitó la mezcla durante 10 minutos. Se filtró la suspensión resultante, y se lavó la torta resultante con Mt Be (110 ml (2,0 v/p)). Se transfirió la torta resultante a un vaso de precipitados, se añadió n-hexano (1030 ml (18,8 v/p)), y se agitó la mezcla durante 5 minutos. Se filtró la suspensión resultante, y se lavó la torta resultante con n-hexano (55 ml (2,0 v/p)). Se secó la torta resultante a temperatura ambiente a presión reducida durante 15 horas, para obtener 4TFA^H-D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-Oic-Arg-OH (SEQ ID NO: 2) (23,2 g). Rendimiento: 73,2 %. Pureza: (HPLC) 85,9 %.

En los ejemplos comparativos, un procedimiento de solidificar el péptido protegido con portador y filtrar y secar es necesario, por tanto, the operación es complicada y requiere una gran cantidad de disolvente orgánico, y además, el tiempo de procedimiento se vuelve largo debido a la etapa de secado.

Síntesis del compuesto 16 (H-Leu-Arg-Pro-NHEt (SEQ ID NO: 19)) usando el portador Kb-NHEt con diversas bases

Ejemplo 4: Síntesis del compuesto 15 (H-Leu-Arg(Pbf)-Pro-NHEt (SEQ ID NO: 20)) con 1-metilpiperazina

Los siguientes aminoácidos se introdujeron, de la misma manera que en el ejemplo 3 usando HCFH-EtNKb (1,76 g, 2,00 mmol), para obtener un compuesto 15 en forma de una disolución.

1er residuo: Fmoc-Pro-OH

2° residuo: Fmoc-Arg(Pbf)-OH

3er residuo: Fmoc-Leu-OH

A la disolución resultante se le añadió una disolución acuosa de hidrogenocarbonato de sodio 0,5 N (18 v/p), y se lavó la disolución, se separó, y se descartó la fase acuosa. Luego, se añadió agua de ácido clorhídrico 0,01 N<( 8>v/p), y además, se controló el pH hasta 3 con agua de ácido clorhídrico<6>N, luego, se separó la disolución, y se descartó la fase acuosa. Se destiló la fase orgánica resultante a presión reducida para eliminar el disolvente. Al residuo se le añadió acetonitrilo frío y se filtró el precipitado depositado, y además, se llevó a cabo suspensión y lavado con acetonitrilo, y se secó el sólido resultante a presión reducida, para obtener un compuesto 15 (2,95 g, cuant, pureza de HPLC: 96,29 %).

Ejemplo 5: Síntesis del compuesto 16 (H-Leu-Arg-Pro-NHEt (SEQ ID NO: 19))

Se disolvió el compuesto 15 (2,97 g) en 75,6 ml de una disolución mixta de TFA/TIS/agua (90/1/9), se añadió DTT (1,51 g, 20 mg/ ml), y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 3 horas. Se filtró la disolución de reacción a través de Celite, se lavó el residuo de filtración con metanol y se filtró, y al residuo concentrado de filtrado resultante se le añadió MTBE frío. Se filtró el precipitado depositado, y además, se realizó suspensión y lavado con MTBE dos veces, y se disolvió el sólido resultante en agua, y se separaron los materiales no disueltos mediante filtración. Además, se lavaron los materiales sin disolver con agua y se separaron mediante filtración. Se combinaron los filtrados resultantes y se secaron a presión reducida, para obtener un compuesto 16 (1,02 g, 93,5 %, pureza de HPLC: 93,89 %).

Ejemplo<6>: Síntesis del compuesto 16 con dietilentriamina

Se obtuvo un compuesto 15 (1,85 g, 63,6 %, pureza de HPLC: 95,54 %) a partir de HChH-EtNKb (1,76 g, 2,00 mmol) de la misma manera que en el ejemplo 4 (sin embargo, la base usada se cambió de 1-metilpiperazina a dietilentriamina). Además, se obtuvo un compuesto 16 (1,05 g, cuant, pureza de HPLC: 86,60 %) de la misma manera que en el ejemplo 5 usando el compuesto resultante 15 (2,24 g).

Ejemplo 7: Síntesis del compuesto 16 con N,N-dimetiletilendiamina

Se obtuvo un compuesto 15 (2,55 g, 87,6 %, pureza de HPLC: 95,38 %) a partir de HChH-EtNKb (1,76 g, 2,00 mmol) de la misma manera que en el ejemplo 4 (sin embargo, la base usada se cambió de 1-metilpiperazina a N,N-dimetiletilendiamina). Además, se obtuvo un compuesto 16 (1,21 g, cuant, pureza de HPLC: 81,22 %) de la misma manera que en el ejemplo 5 usando el compuesto resultante 15 (2,39 g).

Ejemplo<8>: Síntesis del compuesto 16 con 4-aminopiperidina

Se obtuvo un compuesto 15 (2,72 g, 93,5 %, pureza de HPLC: 96,63 %) a partir de HChH-EtNKb (1,76 g, 2,00 mmol) de la misma manera que en el ejemplo 4 (sin embargo, la base usada se cambió de 1-metilpiperazina a 4-aminopiperidina). Además, se obtuvo un compuesto 16 (0,96 g, 97,0 %, pureza de HPLC: 92,75 %) de la misma manera que en el ejemplo 5 usando el compuesto resultante 15 (2,63 g).

Ejemplo 9: Síntesis del compuesto 16 con etilendiamina

Se obtuvo un compuesto 15 (2,43 g, 83,5 %, pureza de HPLC: 94,85 %) a partir de HChH-EtNKb (1,76 g, 2,00 mmol) de la misma manera que en el ejemplo 4 (sin embargo, la base usada se cambió de 1-metilpiperazina a etilendiamina). Además, se obtuvo un compuesto 16 (0,93 g, cuant, pureza de HPLC: 89,93 %) de la misma manera que en el ejemplo 5 usando el compuesto resultante 15 (2,22 g).

Las diferencias entre tipos de base se resumen en la tabla a continuación.

[Tabla 1]

Síntesis del compuesto 23 (Pvr-His-Trp-Ser-Tvr-dLeu-Leu-Arq-OH (SEQ ID NO: 21)) usando alcohol 2,4-di(11’-triisopropilsililoxiundeciloxi)bencílico

Ejemplo 10: Síntesis del compuesto 17 (1-bromo-11-triisopropilsililoxiundecano)

Se obtuvo un compuesto 17 (4,07 g, 9,99 mmol, 99,9 %) de la misma manera que en la patente japonesa n.° 6116782, ejemplo (1-a) usando 1-bromoundecanol (2,51 g, 10 mmol).

Ejemplo 11: Síntesis del compuesto 18 (2,4-di(11’-triisopropilsililoxi)benzaldehído

Se obtuvo un compuesto 18 (1,78 g, 2,25 mmol, 91,5 %) de la misma manera que en la patente japonesa n.° 6116782, ejemplo (1-b) usando 2,4-dihidroxibenzaldehído (0,34 g, 2,46 mmol).

Ejemplo 12: Síntesis del compuesto 19 (alcohol 2,4-di(11’-triisopropilsililoxiundeciloxi)bencílico (“grupo 2,4-di(11’-triisopropilsililoxiundeciloxi)bencilo” se denomina a continuación en el presente documento “KST’en algunos casos)

Se obtuvo un compuesto 19 (1,65 g, 2,08 mmol, 93,7 %) de la misma manera que en la patente japonesa n.° 6116782, ejemplo (1-c) usando 2,4-di(11’-triisopropilsililoxiundeciloxibenzaldehído (1,76 g, 2,22 mmol).

Ejemplo 13: Síntesis del compuesto 20 (H-Arg(Pbf)-O-KS1)

Se obtuvo una disolución del compuesto 20 de la misma manera que en la patente japonesa n.° 6116782, ejemplo (1-c) (sin embargo, se usó Fmoc-Arg(Pbf)-OH en lugar de Fmoc-Gly-OH) usando alcohol 2,4-di(11 ’-triisopropilsililoxiundeciloxibencílico (1,00 g, 1,26 mmol). Se concentró la disolución resultante a presión reducida, y se secó a fondo, para obtener un compuesto 20 (1,515 g, 1,26 mmol, cuant).

Ejemplo 14: Síntesis del compuesto 21 (H-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-dLeu-Leu-Arg(Pbf)-O-KS1 (SEQ ID NO: 22))

Los siguientes aminoácidos se introdujeron en el compuesto 20 obtenido en el ejemplo 13 repitiendo el método de desprotección por condensación en<1>recipiente usando un captador de amina (amina soluble en agua), para obtener un compuesto<21>en forma de una disolución.

1er residuo: Fmoc-Leu-OH

2° residuo: Fmoc-dLeu-OH

3er residuo: Fmoc-Tyr(tBu)-OH

4° residuo: Fmoc-Ser(tBu)-OH

5° residuo: Fmoc-Trp(Boc)-OH

<6>° residuo: Fmoc-His(Trt)-OH

Ejemplo 15: Síntesis del compuesto 22 (Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-dLeu-Leu-Arg(Pbf)-O-KS1 (SEQ ID NO: 23))

A la disolución del compuesto 21 resultante se le añadió DMF de modo que la proporción fue de 1,8 v/p con respecto al rendimiento teórico. Se añadieron H-Pyr-OH (0,213 g, 1,64 mmol), C<o>M<u>(0,675 g, 1,58 mmol) y DIPEA (0,505 ml, 2,90 mmol). Se agitó la disolución mixta resultante a temperatura ambiente durante 30 minutos. A la disolución de reacción resultante se le añadió 1-metilpiperazina (0,45 equiv.) y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se añadió ácido clorhídrico<6>N para neutralizarla, y además, se añadió ácido clorhídrico 0,1 N de modo que la proporción fue de 18 v/p con respecto al rendimiento teórico, y se lavó la disolución, se separó, y se descartó la fase acuosa. A la fase orgánica resultante se le añadieron ácido clorhídrico 0,1 N y la misma cantidad de una disolución acuosa de bicarbonato de sodio 0,5 N, y se lavó la disolución, se separó, y se descartó la fase acuosa. Se destiló la fase orgánica resultante a presión reducida para eliminar el disolvente, obteniendo de ese modo un compuesto 22 (1,09 g, 33,7 %).

Ejemplo 16: Síntesis del compuesto 23 (Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-dLeu-Leu-Arg-OH) (SEQ ID NO: 21)

Se disolvió el compuesto 22 (1,00 g, 2,78 mmol) en 92 ml de una disolución mixta de TFA/TIS/agua (90/1/9), se añadió DTT (3,70 g, 40 mg/ ml), y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 3 horas. Se filtró la disolución de reacción a través de Celite, y se lavó el residuo de filtración con metanol y se filtró. Al filtrado resultante se le añadió tolueno (misma cantidad que la disolución mixta), y se eliminó por destilación el disolvente a presión reducida. Al residuo se le añadió MTBE frío y se filtró el precipitado depositado, y además, se llevó a cabo suspensión y lavado con MTBE, y se llevó a cabo suspensión y lavado con hexano, y se secó el sólido resultante a presión reducida, para obtener un compuesto 23 (4,21 g, cuant, pureza de HPLC: 76,28 %).

Síntesis del compuesto 23 (Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-dLeu-Leu-Arq-OH) (SEQ ID NO: 21) usando 2,7-didocosiloxi-9-(3-fluorofenil)-9-bromofluoreno

Ejemplo 17: Síntesis del compuesto 24 (2,7-didocosiloxi-9-fluorenono)

Se obtuvo un compuesto 24 (4,25 g, mezcla de bromuro de docosilo) de la misma manera que en la patente japonesa n.° 6092513, ejemplo 2, 2-1 usando 2,7-dihidroxi-9-fluorenono (1,00 g, 4,71 mmol).

Ejemplo 18: Síntesis del compuesto 25 (2,7-didocosiloxi-9-(3-fluorofenil)-9-fluorenol)

Se obtuvo un compuesto 25 (1,55 g, 1,68 mmol, 83,8 %) de la misma manera que en la patente japonesa n.° 6092513, ejemplo 1, 1-2 (sin embargo, se usó bromuro de 3-fluorofenilmagnesio en lugar de bromuro de 4-clorofenilmagnesio) usando el compuesto 24 (1,80 g, 2,00 mmol) obtenido en el ejemplo 17.

Ejemplo 19: Síntesis del compuesto 26 (2,7-didocosiloxi-9-(3-fluorofenil)-9-bromofluoreno (“grupo 2,7-didocosiloxi-9-(3-fluorofenil)-9-bromofluorenilo” se denomina a continuación en el presente documento “grupo FI” en algunos casos))

Se obtuvo un compuesto 26 (1,55 g, 1,68 mmol, 83,8 %) de la misma manera que en la patente japonesa n.° 6092513, ejemplo 1, 1-3 usando el compuesto 25 (1,80 g, 2,00 mmol) obtenido en el ejemplo 18 en lugar de 2-docosiloxi-9-(4-clorofenil)-9-fluorenol.

Ejemplo 20: Síntesis del compuesto 27 (Fmoc-Arg(Pbf)-FI)

Se obtuvo un compuesto 27 (1,03 g, 0,663 mmol, 73,0 %) de la misma manera que en la patente japonesa n.° 6092513, ejemplo<6>(sin embargo, se usó Fmoc-Arg(Pbf)-OH en lugar de Z-Ala-OH) usando 2,7-didocosiloxi-9-(3-fluorofenil)-9-bromofluoreno (0,90 g, 0,91 mmol).

Ejemplo 21: Síntesis del compuesto 28 (H-Arg(Pbf)-O-FI)

Se sometió el compuesto 27 (0,900 g, 0,578 mmol) al método de síntesis general para la desprotección de Fmoc descrito anteriormente, usando<1>-metilpiperazina en lugar de piperidina, luego, se lavó con agua de ácido clorhídrico, luego con una disolución acuosa de hidrogenocarbonato de sodio, para obtener un compuesto 28 en forma de una disolución.

Ejemplo 22: Síntesis del compuesto 29 (H-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-dLeu-Leu-Arg(Pbf)-O-FI (SEQ ID NO: 24))

Se introdujeron los siguientes aminoácidos en el compuesto 28 repitiendo el método de desprotección por condensación en<1>recipiente usando un captador de amina (amina soluble en agua), para obtener un compuesto 29 en forma de una disolución.

1er residuo: Fmoc-Leu-OH

2° residuo: Fmoc-dLeu-OH

3er residuo: Fmoc-Tyr(tBu)-OH

4° residuo: Fmoc-Ser(tBu)-OH

5° residuo: Fmoc-Trp(Boc)-OH

<6>° residuo: Fmoc-His(Trt)-OH

Ejemplo 23: Síntesis del compuesto 30 (Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-dLeu-Leu-Arg(Pbf)-O-FI (SEQ ID NO: 25))

A la disolución del compuesto 29 resultante se le añadió DMF de modo que la proporción fue de 1,8 v/p con respecto al rendimiento teórico. Se añadieron H-Pyr-OH (0,097 g, 0,75 mmol), COMU (0,310 g, 0,723 mmol) y DIPEA (0,232 ml, 1,33 mmol). Se agitó la disolución mixta resultante a temperatura ambiente durante 30 minutos. A la disolución de reacción resultante se le añadió 1-metilpiperazina (0,45 equiv.) y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se destiló la fase orgánica resultante a presión reducida para eliminar el disolvente. Al residuo se le añadió acetonitrilo y se filtró el precipitado depositado, y además, se llevó a cabo suspensión y lavado con acetonitrilo, y se secó el sólido resultante a presión reducida, para obtener un compuesto 30 (0,999 g, 0,37 mmol, 64,6 %).

Ejemplo 24: Síntesis del compuesto 23 (Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-dLeu-Leu-Arg-OH) (SEQ ID NO: 21)

Se disolvió el compuesto 30 (5,33 g, 2,78 mmol) en 92 ml de una disolución mixta de TFA/TIS/agua (90/1/9), se añadió DTT (3,70 g, 40 mg/ ml), y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 3 horas. Se filtró la disolución de reacción a través de Celite, y se lavó el residuo de filtración con metanol y se filtró. Al filtrado resultante se le añadió tolueno (misma cantidad que la disolución mixta), y se eliminó por destilación el disolvente a presión reducida. Al residuo se le añadió MTBE frío y se filtró el precipitado depositado, y además, se llevaron a cabo suspensión y lavado con MTBE y suspensión y lavado con hexano, y se secó el sólido resultante a presión reducida, para obtener un compuesto 23 (4,21 g, cuant, pureza de HPLC: 76,28 %).

Síntesis del compuesto 23 (Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-dLeu-Leu-Arq-OH) (SEQ ID NO: 21) usando alcohol 2,4-di(2’,3’-dihidrofitiloxi)bencílico

Ejemplo 25: Síntesis del compuesto 31 (2,3-dihidrofitol) (“grupo 2,3-dihidrofitilo” se denomina a continuación en el presente documento “Phy” en algunos casos)

Se disolvió fitol (10 g, 33,7 mmol) en metanol, se suspendió Pt/C (2 %, 1,00 g), y se agitó la suspensión durante la noche bajo una atmósfera de hidrógeno. Después de la finalización de la reacción, se filtró la disolución de reacción para eliminar Pt/C, y se concentró el filtrado, para obtener un compuesto 31. Esto se usó en la posterior reacción sin purificación.

Ejemplo 26: Síntesis del compuesto 32 (bromuro de 2,3-dihidrofitilo)

Se suspendió el compuesto 31 (33,7 mmol) en ácido bromhídrico al 48 % (100 ml), se goteó ácido sulfúrico concentrado (0,17 ml) y se agitó la mezcla a 100 °C durante la noche. Se enfrió la mezcla de reacción hasta temperatura ambiente, luego, se extrajo con hexano<( 2 00>ml), y se lavó con una disolución acuosa de hidrogenocarbonato de sodio al 5 % (70 ml) dos veces, y con solución salina al 20 % (25 ml) una vez. Se secó la fase orgánica sobre sulfato de sodio, se eliminó por destilación el disolvente del filtrado para obtener un residuo que se purificó luego mediante cromatografía en columna de gel de sílice (columna corta, sólo hexano), para obtener un compuesto 32 (10,41 g, 28,8 mmol, 85 % frente a fitol).

Ejemplo 27: Síntesis del compuesto 33 alcohol (2,4-di(2’,3’-dihidrofitil)bencílico (“grupo 2,4-di(2’,3’-dihidrofitil)bencilo” se denomina a continuación en el presente documento “KJ1” en algunos casos))

Se obtuvo un compuesto 33 (1,16 g, 1,66 mmol, 96,9 %) de la misma manera que en la patente japonesa n.° 5929756, ejemplo 1, usando 2,4-dihidroxibenzaldehído (237 mg, 1,716 mmol).

Ejemplo 28: Síntesis del compuesto 34 (Fmoc-Arg(Pbf)-O-KJ1)

Se obtuvo una disolución del compuesto 34 de la misma manera que en la patente japonesa n.° 5929756, ejemplo 23, usando alcohol 2,4-di(11'-triisopropilsililoxiundeciloxibencílico (1,76 g, 2,22 mmol), excepto usando Fmoc-Arg(Pbf)-OH en lugar de Fmoc-Ser(tBu)-OH. Se concentró la disolución resultante, para obtener un compuesto 34 (1,65 g, 2,08 mmol, 93,7 %).

Ejemplo 29: Síntesis del compuesto 35 (H-Arg(Pbf)-O-KJ1)

Se sometió el compuesto 34 al método de síntesis general para la desprotección de Fmoc descrito anteriormente, usando<1>-metilpiperazina en lugar de piperidina, luego, se lavó con agua de ácido clorhídrico y con una disolución acuosa de hidrogenocarbonato de sodio, para obtener un compuesto 35 en forma de una disolución.

Ejemplo 30: Síntesis del compuesto 36 (H-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-dLeu-Leu-Arg(Pbf)-O-KJ1 (SEQ ID NO: 26))

Los siguientes aminoácidos se introdujeron en el compuesto 35 repitiendo el método de desprotección por condensación en<1>recipiente usando un captador de amina (amina soluble en agua), para obtener un compuesto 36 en forma de una disolución.

1er residuo: Fmoc-Leu-OH

2° residuo: Fmoc-dLeu-OH

3er residuo: Fmoc-Tyr(tBu)-OH

4° residuo: Fmoc-Ser(tBu)-OH

5° residuo: Fmoc-Trp(Boc)-OH

<6>° residuo: Fmoc-His(Trt)-OH

Ejemplo 31: Síntesis del compuesto 37 (Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-dLeu-Leu-Arg(Pbf)-O-KJ1 (SEQ ID NO: 27))

A la disolución del compuesto 36 resultante se le añadió DMF de modo que la proporción fue de 1,8 v/p con respecto al rendimiento teórico. Se añadieron H-Pyr-OH (3,30 g, 25,55 mmol),<c>O<m>U (7,0 g, 16,26 mmol, 1,25 equiv.) y DIPEA (5,10 ml, 29,28 mmol, 2,25 equiv.). Se agitó la disolución mixta resultante a temperatura ambiente durante 30 minutos. A la disolución de reacción resultante se le añadió 1-metilpiperazina (0,45 equiv.) y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se añadió ácido clorhídrico 0,01 N (18 v/p), y se lavó la disolución, se separó, y se descartó la fase acuosa. Se destiló la fase orgánica resultante a presión reducida para eliminar el disolvente. Al residuo se le añadió acetonitrilo y se filtró el precipitado depositado, y además, se llevó a cabo suspensión y lavado con acetonitrilo, y se secó el sólido resultante a presión reducida, para obtener un compuesto 37 (28,78 g, 87,50 %).

Ejemplo 32: Síntesis del compuesto 23 (Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-dLeu-Leu-Arg-OH) (SEQ ID NO: 21)

Se disolvió el compuesto 37 (5,33 g, 2,78 mmol) en 92 ml de una disolución mixta de TFA/TIS/agua (90/1/9), se añadió DTT (3,70 g, 40 mg/ ml), y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 3 horas. Se filtró la disolución de reacción a través de Celite, y se lavó el residuo de filtración con metanol y se filtró. Al filtrado resultante se le añadió tolueno (misma cantidad que la disolución mixta), y se eliminó por destilación el disolvente a presión reducida. Al residuo se le añadió MTBE frío y se filtró el precipitado depositado, y además, se llevó a cabo suspensión y lavado con MTBE, y se llevó a cabo suspensión y lavado con hexano, y se secó el sólido resultante a presión reducida, para obtener un compuesto 23 (4,21 g, cuant, pureza de HPLC: 76,28 %).

Síntesis del compuesto 7 (Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-dLeu-Leu-Arg-Pro-NHEt) (SEQ ID NO: 2) usando (N-etil-(bis(4-docosiloxifenil))metilamina

Ejemplo 33: Síntesis del compuesto 38 (4,4’-didocosiloxibenzofenona)

Un compuesto 38 (7,91 g, 95,2 %) se obtuvo de la misma manera que en la patente japonesa n.° 5768712, ejemplo 4, 4-1, usando 4,4’-dihidroxibenzofenona (2,14 g, 10 mmol).

Ejemplo 34: Síntesis del compuesto 39 (4,4’-didocosiloxifenilbenzohidrol)

Se obtuvo un compuesto 39 (7,72 g, 9,26 mmol, 97,3 %) de la misma manera que en la patente japonesa n.° 5768712, ejemplo 4, 4-2, usando el compuesto 38 (7,91 g, 9,52 mmol).

Ejemplo 35: Síntesis del compuesto 40 (N-etil-(bis(4-docosiloxifenil))metilamina grupo (N-etil-(bis(4-docosiloxifenil))metilamino se denomina a continuación en el presente documento “NEt-KJ3” en algunos casos))

Se obtuvo un compuesto 40 (0,829 g, 96,6 %) de la misma manera que en la patente japonesa n.° 6283774, ejemplo 9, (1) y (2), usando el compuesto 39 (0,833 g, 1,00 mmol) en lugar de TIPS4-Dμm-OH (C<10>-CONH-CH(CH<2>)<2>), y además, usando clorhidrato de etilamina (5 mmol) en lugar de propilamina, y además usando DIPEA<( 8>mmol).

Ejemplo 36: Síntesis del compuesto 41 (Fmoc-Arg(Pbf)-NEt-Kj3)

Se disolvió Fmoc-Pro-OH (0,354 g, 1,05 mmol) en 14 ml de tolueno, se añadió DMF (10,8 μl, 0,14 mmol), y luego, se añadió cloruro de tionilo (91 μl, 1,26 mmol), y se calentó la mezcla a 40 °C, y se agitó durante 2 horas. Además, se añadió cloruro de tionilo (45,5 μl, 0,63 mmol) y se agitó la mezcla durante 1 hora. Se concentró la disolución de reacción resultante a presión reducida. Al residuo se le añadió 7 ml de tolueno y se concentró la mezcla a presión reducida, y se repitió esta operación dos veces. Se enfrió el residuo resultante hasta temperatura ambiente, luego, se añadieron 14 ml de diclorometano para disolverlo, y se añadió DIPEA (244 μl, 1,4 mmol) para disolución. A la disolución resultante mixta se le añadió el compuesto 40 (0,601 g, 0,7 mmol) obtenido en el ejemplo 35 y se agitó la mezcla durante 1 hora. Se concentró la disolución de reacción resultante a presión reducida, se añadió<2 0>ml de acetonitrilo, y se filtró la disolución de suspensión resultante, para obtener un compuesto en bruto 41. Se sometió el compuesto en bruto resultante 41 a cromatografía en columna de gel de sílice (fase móvil: diclorometano), y se recogieron las fracciones objetivo y se concentraron, para obtener un compuesto 41 (0,58 g, 0,53 mmol, 75,1 %).

Ejemplo 37: Síntesis del compuesto 42 (H-Pro-NEt-KJ3)

Se sometió el compuesto 41 (0,500 g, 0,424 mmol) al método de síntesis general para la desprotección de Fmoc descrito anteriormente, usando<1>-metilpiperazina en lugar de piperidina, luego, se lavó con agua de ácido clorhídrico y con una disolución acuosa de hidrogenocarbonato de sodio, para obtener el compuesto 42 en forma de una disolución.

Ejemplo 38: Síntesis del compuesto 43 (H-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-dLeu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-NEt-KJ3 (SEQ ID NO: 28))

Se introdujeron los siguientes aminoácidos en el compuesto 42 repitiendo el método de desprotección por condensación en<1>recipiente usando un captador de amina (amina soluble en agua), para obtener un compuesto 43 en forma de una disolución.

1er residuo: Fmoc-Arg(Pbf)-OH

2° residuo: Fmoc-Leu-OH

3er residuo: Fmoc-dLeu-OH

4° residuo: Fmoc-Tyr(tBu)-OH

5° residuo: Fmoc-Ser(tBu)-OH

<6>° residuo: Fmoc-Trp(Boc)-OH

7° residuo: Fmoc-His(Trt)-OH

Ejemplo 39: Síntesis del compuesto 44 (Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-dLeu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-NEt-KJ3 (SEQ ID NO: 29))

A la disolución del compuesto 43 resultante se le añadió DMF de modo que la proporción fue de 1,8 v/p con respecto al rendimiento teórico. Se añadieron H-Pyr-OH (53 mg, 0,41 mmol, 1,45 eq.), COMU (171 mg, 0,40 mmol, 1,40 equiv.) y DIPEA (0,12 ml, 0,69 mmol, 2,5 equiv.). Se agitó la disolución mixta resultante a temperatura ambiente durante 30 minutos. A la disolución de reacción resultante se le añadió 1-metilpiperazina (0,6 equiv.) y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se añadió ácido clorhídrico 0,1 N (18 v/p), y se lavó la disolución, se separó, y se descartó la fase acuosa. Se destiló la fase orgánica resultante a presión reducida para eliminar el disolvente. Al residuo se le añadió acetonitrilo y se filtró el precipitado depositado, y además, se llevó a cabo suspensión y lavado con acetonitrilo, y se secó el sólido resultante a presión reducida, para obtener un compuesto 44 (0,998 g, 64,6 %, pureza de HPLC: 86,10 %).

Ejemplo 40: Síntesis del compuesto 7 (Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-dLeu-Leu-Arg-Pro-NHEt) (SEQ ID NO: 2)

Se disolvió el compuesto 44 (0,10 g, 0,037 mmol) en 1,23 ml de una disolución mixta de TFA/TIS/agua (90/1/9), se añadió DTT (25 mg, 20 mg/ml), y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 3 horas. Se filtró la disolución de reacción a través de Celite, y se lavó el residuo de filtración con metanol y se filtró. Al filtrado resultante se le añadió tolueno (misma cantidad que la disolución mixta), y se eliminó por destilación el disolvente a presión reducida. Al residuo se le añadió MT<b>E frío y se filtró el precipitado depositado, y además, se llevaron a cabo suspensión y lavado con MTBE y suspensión y lavado con hexano, y se secó el sólido resultante a presión reducida, para obtener un compuesto 7 (19 mg, 47,5 %, pureza de HPLC: 94,93 %).

Ejemplo 41: Síntesis del compuesto 49 (TFA^H-Ser-Pro-Leu-Gln-OH (SEQ ID NO: 30))

Síntesis del compuesto 45 (Fmoc-Gln(Trt)-OKb)

Se disolvió alcohol 2,4-didocosiloxibencílico (expresado como “Kb-OH”) (1,0 g, 1,32 mmol) en THF deshidratado (13 ml), y se añadieron Fmoc-Gln(Trt)-OH (1,21 g, 1,98 mmol, 1,5 equiv.), DIPCI (0,307 ml, 1,98 mmol, 1,5 equiv.) y DMAP (8,3 mg, 0,066 mmol, 0,05 equiv.) y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se sometió la disolución a destilación a presión reducida para su eliminación. Al residuo se le añadió metanol y se filtró el precipitado depositado, se llevó a cabo suspensión y lavado con metanol, y además, se llevó a cabo suspensión y lavado con acetonitrilo con acetonitrilo dos veces. Se secó el sólido resultante a presión reducida, para obtener un compuesto 45 (1,77 g, 99,5 %).

Síntesis del compuesto 46 (H-Gln(Trt)-OKb)

Se sometió el compuesto 45 al método de síntesis general para la desprotección de Fmoc descrito anteriormente, usando NMP en lugar de DMF y usando 1-metilpiperazina en lugar de piperidina, luego, se lavó con agua de ácido clorhídrico y con una disolución acuosa de hidrogenocarbonato de sodio, para obtener un compuesto 46 en forma de una disolución.

Síntesis del compuesto 47 (H-Pro-Leu-Gln(Trt)-OKb (SEQ ID NO: 31))

Se condensaron secuencialmente los siguientes aminoácidos con el compuesto 46, y cada vez, se añadió un captador de amina, seguido de la operación de desprotección, y se llevaron a cabo lavado con agua de ácido clorhídrico y con una disolución acuosa de hidrogenocarbonato de sodio. Se repitió este método de desprotección por condensación en 1 recipiente, para obtener un compuesto 47 en forma de una disolución. 1er residuo: Fmoc-Leu-OH

2° residuo: Fmoc-Pro-OH

Síntesis del compuesto 48 (Boc-Ser(tBu)-Pro-Leu-Gln(Trt)-OKb (SEQ ID NO: 32))

A la disolución del compuesto 47 se le añadieron Boc-Ser(tBu)-OH (0,445 g, 1,70 mmol, 1,30 equiv.), COMU (0,702 g, 1,64 mmol, 1,25 equiv.) y DIPEA (0,571 ml, 3,3 mmol, 2,5 equiv.). Se agitó la disolución mixta resultante a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se realizaron operaciones de lavado con un agua de ácido clorhídrico 0,1 N (10 ml), posteriormente con una disolución acuosa de hidrogenocarbonato de sodio 0,5 N<( 10>ml) y luego de separación líquido-líquido de los mismos, respectivamente, y se destiló la fase orgánica resultante a presión reducida para eliminar el disolvente. Al residuo se le añadió acetonitrilo y se filtró el precipitado depositado, y además, se llevó a cabo suspensión y lavado con acetonitrilo, y se secó el sólido resultante a presión reducida, para obtener un compuesto 48 (1,83 g, 88,4 %).

Síntesis del compuesto 49 (TFA^H-Ser-Pro-Leu-Gln-OH (SEQ ID NO: 30))

Se disolvió el compuesto 48 (0,50 g, 0,32 mmol) en 15,8 ml de una disolución mixta de TFA/TIS/agua (95/2,5/2,5), y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 3 horas. Se filtró la disolución de reacción a través de Celite, se lavó el residuo con TFA, y se combinaron el filtrado y la disolución de lavado y se destiló a presión reducida para eliminar el disolvente. Al residuo se le añadió MTBE frío y se recogió el precipitado depositado mediante filtración, luego, se realizó suspensión y lavado con MTBE dos veces, y se secó el sólido resultante a presión reducida, para obtener un compuesto 49 (0,14 g, 78,3 %, pureza de HPLC: 84,93 %).

Aplicabilidad industrial

El método de síntesis de péptidos de la presente invención puede resolver simultáneamente el problema de un éster activo de aminoácido y el problema de DBF que existe en el sistema de reacción y puede reducir la operación de separación sólido-líquido, por medios sencillos. Según la presente invención, el tiempo de procedimiento de síntesis de péptidos puede acortarse, y el uso de un disolvente puede reducirse reduciendo la operación de separación sólido-líquido. Además, el péptido sintetizado según la presente invención tiene pocos problemas de aminoácido que faltan y dobles impactos, y según el método de la presente invención, los péptidos pueden sintetizarse con alta calidad y/o con alto rendimiento.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Método de síntesis de péptidos en fase líquida, que comprende las siguientes etapas a a d: a: condensar un aminoácido protegido con un portador para la síntesis de péptidos en fase líquida (aminoácido protegido con portador), un péptido protegido con portador o una amida de aminoácido protegida con portador, con un aminoácido en el que se protege un grupo amino con un grupo 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) (aminoácido protegido con N-Fmoc) o un péptido protegido con N-Fmoc, en un disolvente orgánico o una disolución mixta de disolventes orgánicos, para obtener un péptido protegido con portador-N-Fmoc, b: añadir una amina soluble en agua que tiene dos o más grupos amino y que tiene al menos un grupo amino primario o secundario a la disolución de reacción después de la reacción de condensación para captar un éster activo de aminoácido, c: realizar desprotección del grupo Fmoc del grupo amino protegido añadiendo un reactivo de desprotección de Fmoc en presencia de una amina soluble en agua que tiene dos o más grupos amino y que tiene al menos un grupo amino primario o secundario, y d: añadir un ácido a la disolución de reacción para neutralizar, y además, añadir y lavar la disolución con una disolución acuosa ácida, luego, separar la disolución y eliminar una fase acuosa para obtener una fase orgánica, en el que el aminoácido, el péptido o la amida de aminoácido protegidos con portador es un aminoácido, un péptido o una amida de aminoácido en el que el portador se une directamente o mediante un grupo de unión a un grupo cualquiera seleccionado del grupo que consiste en uno o varios grupos amino, uno o varios grupos carboxilo, uno o varios grupos tiol y uno o varios grupos hidroxilo portados en el aminoácido, el péptido o la amida de aminoácido, las aminas solubles en agua que tienen dos o más grupos amino y que tienen al menos un grupo amino primario o secundario en la etapa b y la etapa c pueden ser iguales o diferentes, y el portador para la síntesis de péptidos en fase líquida es (i) un compuesto seleccionado del grupo que consiste en

(alcohol 3,4,5-trioctadeciloxibencílico), [Fórmula química 37]

(alcohol 2,4-didocosiloxibencílico),

(2,4-didocosiloxibenzaldehído),

(2,4-didocosiloxibencilamina),

(N-etil-2,4-didocosiloxibencilamina),

(alcohol 3,5-didocosiloxibencílico),

(alcohol 2,4-di(11’-triisopropilsililoxiundeciloxi)bencílico),

(alcohol 2,4-di(11 ’-t-butildifenilsililoxiundeciloxi)bencílico),

en la que X es F o Cl,

(alcohol 2-(3’,4’,5’-trioctadeciloxibencil)-4-metoxibencílico),

(bis(4-docosiloxifenil)metilamina),

(alcohol 2,4-di(2’,3’-dihidrofitiloxi)bencílico),

(alcohol 3,4,5-tri(2’,3’-dihidrofitiloxi)bencílico),

(bis[4-(2’,3’-dihidrofitiloxi)fenil]metilamina), y

(N-etil-bis[4-(2’,3’-dihidrofitiloxi)fenil]metilamina), en el que cada fórmula se muestra en la condición antes de unirse a un grupo carboxilo, un grupo amino, un grupo tiol o un grupo hidroxilo de un aminoácido, un péptido o una amida de aminoácido o a un grupo de unión; o (ii) un compuesto seleccionado del grupo que consiste en

en la que X es F o Cl,

(N-etil-2,4-di(11’-triisopropilsililoxiundeciloxi)bencilamina),

(N-etil-2,4-di(11’-t-butildifenilsililoxiundeciloxi)bencilamina),

(N-etil-2-(3’,4’,5’-trioctadeciloxibenciloxi)-4-metoxibencilamina),

(N-etil-bis(4-docosiloxifenil)metilamina),

(2,4-di(2’,3’-dihidrofitiloxi)bencilamina), y

(N-etil-2,4-di(2’,3’-dihidrofitiloxi)bencilamina), en el que cada fórmula se muestra en la condición antes de unirse a un grupo carboxilo de un aminoácido o un péptido.
2. Método de síntesis de péptidos según la reivindicación 1, en el que la reacción de condensación en la etapa a se lleva a cabo en presencia de un agente de condensación.
3. Método de síntesis de péptidos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que el disolvente orgánico o la disolución mixta de disolventes orgánicos incluye un disolvente orgánico soluble en agua.
4. Método de síntesis de péptidos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el disolvente orgánico o disolución mixta de disolventes orgánicos es al menos un disolvente orgánico seleccionado del grupo que consiste en THF, DMF, ciclohexano, CPME, MTBE, 2-metilTHF, 4-metilTHP, acetato de isopropilo, N-metilpirrolidona y DCM, o una disolución mixta que se compone de dos o más de los mismos.
5. Método de síntesis de péptidos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la amina soluble en agua se selecciona del grupo que consiste en 1-metilpiperazina, 4-aminopiperidina, dietilentriamina, triaminoetilamina, 1 -etilpiperazina, N,N-dimetiletilendiamina, etilendiamina y piperazina. <6>. Método de síntesis de péptidos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el equivalente de amina de la amina soluble en agua en la etapa b es de<1>a<10>equivalentes con respecto al equivalente de aminoácido que permanece teóricamente después de la reacción de condensación en la etapa a; y/o en el que el equivalente de amina de la amina soluble en agua en la etapa c es de 5 a 30 equivalentes con respecto a la cantidad del grupo Fmoc que existe en el sistema.