ES2957546T3 - Producción de mono- y di-PEG-IL10; y usos - Google Patents

Abstract

Se proporcionan métodos para producir una mezcla de interleucina-10 mono y dipegilada (IL-10). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Producción de mono- y di-PEG-ILI 0; y usos

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención abarca composiciones y métodos de uso de IL-10 monopegilada (PEG) y di-PEG.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La citoquina interleucina-10 (IL-10) es un dímero que se vuelve biológicamente inactivo tras la alteración de las interacciones no covalentes que conectan sus dos subunidades monoméricas. La IL-10 se identificó por primera vez como un producto de la célula T auxiliar de tipo 2 y luego se demostró que la producían otros tipos de células, incluyendo las células B y los macrófagos. También inhibe la síntesis de varias citoquinas producidas por las células T auxiliares tipo 1, como el interferón γ, la IL-2 y el factor de necrosis tumoral a (TNF-a). La capacidad de la IL-10 para inhibir los moduladores de la respuesta inmunitaria mediada por células y suprimir las respuestas de células T dependientes de células presentadoras de antígeno demuestra que la IL-10 tiene propiedades inmunosupresoras. Esta citoquina también inhibe la producción de monocitos/macrófagos de otras citoquinas como IL-1, IL-6, IL-8, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) y TNF-α. Como resultado de su actividad pleiotrópica, la IL-10 está bajo investigación para numerosas aplicaciones clínicas, como el tratamiento de afecciones inflamatorias, sepsis bacteriana, shock letal inducido por enterotoxinas y enfermedades autoinmunes, por ejemplo, artritis reumatoide, rechazo de aloinjertos y diabetes.

Los cánceres y tumores pueden ser controlados o erradicados por el sistema inmunitario. El sistema inmunitario incluye varios tipos de células linfoides y mieloides, por ejemplo, monocitos, macrófagos, células dendríticas (DC), eosinófilos, células T, células B y neutrófilos. Estas células linfoides y mieloides producen proteínas de señalización secretadas conocidas como citoquinas. Las citoquinas incluyen, por ejemplo, interleucina-10 (IL-10), interferón-gamma (IFNy), IL-12 e IL-23. La respuesta inmunitaria incluye la inflamación, es decir, la acumulación de células inmunitarias sistémicamente o en un lugar particular del cuerpo. En respuesta a un agente infeccioso o a una sustancia extraña, las células inmunitarias secretan citoquinas que, a su vez, modulan la proliferación, el desarrollo, la diferenciación o la migración de las células inmunitarias. Una respuesta inmunitaria excesiva puede producir consecuencias patológicas, como trastornos autoinmunes, mientras que una respuesta inmunitaria alterada puede dar como resultado un cáncer. La respuesta antitumoral del sistema inmunitario incluye inmunidad innata, por ejemplo, mediada por macrófagos, células NK y neutrófilos, e inmunidad adaptativa, por ejemplo, mediada por células presentadoras de antígenos (APC), células T y células B (ver, por ejemplo, Abbas, et al. (eds.) (2000) Cellular and Molecular Immunology, W.B. Saunders Co., Filadelfia, PA; Oppenheim y Feldmann (eds.) (2001) Cytokine Reference, Academic Press, San Diego, CA; von Andrian y Mackay (2000) New Engl. J. Med. 343:1020-1034; Davidson y Diamond (2001) New Engl. J. Med. 345:340-350)..

Se han usado métodos para modular la respuesta inmunitaria en el tratamiento de cánceres, por ejemplo, melanoma. Estos métodos incluyen el tratamiento con citoquinas como IL-2, IL-10, IL-12, factor de necrosis tumoral alfa (TNFαlfa), IFNy, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) y factor de crecimiento transformante (TGF), o con antagonistas de citoquinas (por ejemplo, anticuerpos). La interleucina-10 se caracterizó por primera vez como un factor inhibidor de la síntesis de citoquinas (CSIF; consultar, por ejemplo, Fiorentino, et al (1989) J. Exp. Med. 170:2081-2095). IL-10 es una citoquina pleiotrópica producida por células T, células B, monocitos, que puede funcionar como inmunosupresor e inmunoestimulante (ver, por ejemplo, Groux, et al. (1998) J. Immunol.

160: 3188-3193; y Hagenbaugh et al. (1997) J. Exp. Med. 185:2101 -2110).

Los modelos animales sugieren que la IL-10 puede inducir la activación de las células NK y facilitar la destrucción de las células objetivo de una manera dependiente de la dosis (ver, por ejemplo, Zheng, et al. (1996) J. Exp. Med. 184:579-584; Kundu et al. (1996) J. Natl. Cancer Inst. 88:536-541). Estudios adicionales indican que la presencia de IL-10 en el microambiente del tumor se correlaciona con una mejor supervivencia del paciente (ver, por ejemplo, Lu, et al. (2004) J. Clin. Oncol. 22: 4575-4583).

Debido a su vida media relativamente corta, la IL-10 se ha conjugado con varios socios, incluyendo el polietilenglicol. La US2002044921 divulga un método para producir IL-10 monopegilada. También se han pegilado otras citoquinas, generalmente mediante monopegilación, por ejemplo, moléculas de PEG unidas a un único residuo en la proteína de citoquina. Desafortunadamente, la monopegilación en una subunidad de IL-10 lleva a una mezcla no homogénea de moléculas de IL-10 dipegiladas, monopegiladas y no pegiladas debido a la transposición de subunidades. Permitir que una reacción de pegilación continúe hasta su finalización también permitirá proteínas objetivo no específicas y multipegiladas, reduciendo por tanto la bioactividad de estas proteínas. Por tanto, existe una necesidad de producir de manera más eficiente IL-10 correctamente pegilada con mayores rendimientos de producción. La presente invención satisface esta necesidad proporcionando métodos para producir una mezcla de IL-10 monopegilada y dipegilada.

BREVE DESCRIPCIÓN DEL DIBUJO

La Figura 1 muestra la cinética de reacción para producir mono- y di-PEG-IL-10.

La Figura 2 muestra la eficacia de varios prototipos de mono y diPEG-IL-10 (murinos) en carcinomas de células escamosas PDV6 implantados.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se basa en el descubrimiento de que una reacción controlada producirá una mezcla de mono- y di-PEG-IL-10 pegiladas selectivamente que, a su vez, mejora el rendimiento del producto final pegilado y tiene una eficacia comparable a otras especies de PEG-IL-10.

La presente invención proporciona un método para producir una mezcla de IL-10 monopegilada y dipegilada, en donde por lo menos una molécula de PEG se une covalentemente a por lo menos un residuo de aminoácido de por lo menos una subunidad de IL-10, que comprende: un) hacer reaccionar de 1 mg/ml a 12 mg/ml de proteína IL-10 con un conector de PEG activado de tal manera que la proporción de IL-10 a conector de PEG es de 1:1 a 1:7,7, en presencia de 0,75 mM a 35 mM de un agente reductor, a un pH de aproximadamente 5,0 a 7,4 y a una temperatura de 5° C a 30° C, durante 12-15 horas; y b) purificar la mezcla de IL-10 monopegilada y dipegilada. En ciertas realizaciones, el conector de PEG se selecciona del grupo que consiste en succinimidilcarbonato-PEG, PEG-butiraldehído, PEG-pentaldehído, PEG-amido-propionaldehído, PEG-uretano-propioaldehído y PEG-propilaldehído, el conector de PEG es de 5.000 daltons a 12.000 daltons, o el agente reductor se selecciona del grupo que consiste en borohidruro, cianoborohidruro de sodio, amina borano y picolina borano. En otra realización más, la mezcla de monoy di-PEG se purifica mediante cromatografía seleccionada del grupo que consiste en intercambio catiónico, intercambio aniónico, exclusión por tamaño e interacción hidrófoba. También se incluye una composición farmacéutica que comprende la mono- y di-PEG-IL-10 producida por este método de reacción y un portadro farmacéuticamente aceptable.

La presente invención abarca un método para producir una mezcla de IL-10 monopegilada y dipegilada, en la que por lo menos una molécula de PEG está unida covalentemente a por lo menos un residuo de aminoácido de por lo menos una subunidad de IL-10, que comprende a) hacer reaccionar 7,5 mg/ml de IL-10 con un conector de PEG activado de tal manera que la relación de IL-10 a conector de PEG sea de 1:3,5, en presencia de 25 mM de un agente reductor, a un pH de 6,3 y a una temperatura de 15° C, durante 15 horas; y b) purificar la mezcla de IL-10 monopegilada y dipegilada. En ciertas realizaciones, el conector de PEG se selecciona del grupo que consiste en succinimidilcarbonato-PEG, PEG-butiraldehído, PEG-pentaldehído, PEG-amido-propionaldehído, PEG-uretanopropioaldehído y PEG-propilaldehído. La masa molecular del PEG que comprende el conector de PEG es de 5.000 daltons a 20.000 daltons, el agente reductor se selecciona del grupo que consiste en borohidruro, cianoborohidruro de sodio, amina borano y picolina borano o la mezcla de mono y di-PEG se purifica mediante cromatografía seleccionada del grupo que consiste en intercambio catiónico, intercambio aniónico, exclusión por tamaño, e interacción hidrófoba. También se incluye una composición farmacéutica que comprende la mono- y di-PEG-IL-10 producida por este método de reacción y un portador farmacéuticamente aceptable.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Como se usa en la presente, incluyendo las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares de palabras como "un", "uno" y "el", incluyen sus referencias en plural correspondientes a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

I. Definiciones.

"Activación", "estimulación" y "tratamiento", cuando se aplica a células o a receptores, pueden tener el mismo significado, por ejemplo, activación, estimulación o tratamiento de una célula o receptor con un ligando, a menos que se indique lo contrario en el contexto o explícitamente. "Ligando" abarca ligandos naturales y sintéticos, por ejemplo, citoquinas, variantes de citoquinas, análogos, muteínas y composiciones de unión derivadas de anticuerpos. "Ligando" también abarca moléculas pequeñas, por ejemplo, péptidos miméticos de citoquinas y péptidos miméticos de anticuerpos. "Activación" puede referirse a la activación celular regulada por mecanismos internos así como por factores externos o ambientales. "Respuesta", por ejemplo, de una célula, tejido, órgano u organismo, abarca un cambio en el comportamiento bioquímico o fisiológico, por ejemplo, concentración, densidad, adhesión o migración dentro de un compartimento biológico, tasa de expresión génica o estado de diferenciación, donde el cambio se correlaciona con la activación, estimulación o tratamiento, o con mecanismos internos como la programación genética.

"Actividad" de una molécula puede describir o referirse a la unión de la molécula a un ligando o a un receptor, a la actividad catalítica; a la capacidad de estimular la expresión génica o la señalización, diferenciación o maduración celular; a la actividad antigénica, a la modulación de actividades de otras moléculas, y similares. "Actividad" de una molécula también puede referirse a la actividad en la modulación o mantenimiento de interacciones célula a célula, por ejemplo, adhesión, o actividad en el mantenimiento de una estructura de una célula, por ejemplo, membranas celulares o citoesqueleto. "Actividad" también puede significar actividad específica, por ejemplo, [actividad catalítica]/[mg de proteína], o [actividad inmunológica]/[mg de proteína], concentración en un compartimento biológico, o similares. La "actividad proliferativa" abarca una actividad que promueve, que es necesaria para, o que está específicamente asociada con, por ejemplo, la división celular normal, como cáncer, tumores, displasia, transformación celular, metástasis y angiogénesis.

"Administración" y "tratamiento", como se aplica a un animal, humano, sujeto experimental, célula, tejido, órgano o fluido biológico, se refiere al contacto de un producto farmacéutico exógeno, agente terapéutico, agente de diagnóstico, compuesto o composición al animal. humano, sujeto, célula, tejido, órgano o fluido biológico. "Administración" y "tratamiento" pueden referirse, por ejemplo, a métodos terapéuticos, placebo, farmacocinéticos, diagnósticos, de investigación y experimentales. El "tratamiento de una célula" abarca el contacto de un reactivo con la célula, así como el contacto de un reactivo con un fluido, donde el fluido está en contacto con la célula. "Administración" y "tratamiento" también significa tratamientosin vitroyex vivo,por ejemplo, de una célula, mediante un reactivo, una composición de unión o de diagnóstico, o mediante otra célula. "Tratamiento", como se aplica a un sujeto humano, veterinario o de investigación, se refiere al tratamiento terapéutico, medidas profilácticas o preventivas, a aplicaciones de investigación y diagnóstico. El "tratamiento", tal como se aplica a un sujeto humano, veterinario o de investigación, o célula, tejido u órgano, abarca el contacto de PEG-IL-10 con un sujeto humano o animal, una célula, tejido, compartimento fisiológico o fluido fisiológico. El "tratamiento de una célula" también abarca situaciones en las que PEG-IL-10 entra en contacto con el receptor de IL-10 (heterodímero de IL-10R1 e IL-10R2), por ejemplo, en la fase fluida o coloidal, así como situaciones en las que una IL-10 agonista o antagonista entra en contacto con un fluido, por ejemplo, cuando el fluido está en contacto con una célula o receptor.

La "caquexia" es un síndrome de desgaste que implica la pérdida de músculo (desgaste muscular) y grasa, como resultado de un trastorno en el metabolismo. La caquexia se produce en varios tipos de cáncer ("caquexia por cáncer"), trastorno obstructivo pulmonar crónico (EPOC), insuficiencia orgánica avanzada y SIDA. La caquexia del cáncer se caracteriza, por ejemplo, por una marcada pérdida de peso, anorexia, astenia y anemia. La anorexia es un trastorno que resulta de la falta de motivación para comer, por ejemplo, aversión a la comida (ver, por ejemplo, MacDonald, et al. (2003) J. Am. Coll. Surg. 197: 143-161; Rubin (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:5384-5389; Tisdale (2002) Nature Reviews Cancer 2:862-871; Argiles, et al. (2003) Drug Discovery Today 8:838-844; Lelli, et al. (2003) J. Chemother 15:220-225;Argilés, et al. (2003) Corriente. Opinión clin. Nutrición metab. Care 6:401-406).

Las "variantes conservadoramente modificadas de PEG-IL-10" se aplican tanto a secuencias de aminoácidos como de ácidos nucleicos. Con respecto a secuencias de ácidos nucleicos particulares, las variantes modificadas conservadoramente se refieren a aquellos ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas o, cuando el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, a secuencias de ácidos nucleicos esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, una gran cantidad de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos pueden codificar cualquier proteína determinada.

En cuanto a las secuencias de aminoácidos, un experto reconocerá que una sustitución individual de una secuencia de ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína que sustituye un aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia codificada por un aminoácido conservado es una "variante modificada conservadoramente". Las tablas de sustitución conservadoras que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. Un ejemplo de sustitución conservadora es el intercambio de un aminoácido en uno de los siguientes grupos por otro aminoácido del mismo grupo (Patente de Estados Unidos N° 5.767.063 concedida a Lee, et al.; Kyte y Doolittle (1982) J. Mol. Biol. 157: 105-132):

(1) Hidrófoba: norleucina, Ile, Val, Leu, Phe, Cys o Met;

(2) Hidrófila neutra: Cys, Ser, Thr;

(3) Ácida: Asp, Glu;

(4) Básica: Asn, Gln, His, Lys, Arg;

(5) Residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro;

(6) Aromática: Trp, Tyr, Phe;

(7) Aminoácidos pequeños: Gly, Ala, Ser.

"Cantidad eficaz" abarca una cantidad suficiente para mejorar o prevenir un síntoma o signo de la afección médica. Cantidad eficaz también significa una cantidad suficiente para permitir o facilitar el diagnóstico. Una cantidad eficaz para un paciente o sujeto veterinario en particular puede variar dependiendo de factores como la afección que se está tratando, la salud general del paciente, la vía del método y la dosis de administración y la gravedad de los efectos secundarios (ver, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N° 5.888.530 concedida a Netti, et al.). Una cantidad eficaz puede ser la dosis máxima o el protocolo de dosificación que evita efectos secundarios significativos o efectos tóxicos. El efecto dará como resultado una mejora de una medida o parámetro de diagnóstico en por lo menos un 5%, generalmente en por lo menos un 10%, más generalmente por lo menos un 20%, más generalmente por lo menos un 30%, preferiblemente por lo menos un 40%, más preferiblemente por lo menos 50%, lo más preferiblemente por lo menos un 60%, idealmente por lo menos un 70%, más idealmente por lo menos un 80% y lo más idealmente por lo menos un 90%, donde el 100% se define como el parámetro de diagnóstico mostrado por un sujeto normal (ver, por ejemplo, Maynard, et al (1996) A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boca Raton, FL, Dent (2001) Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch Publ., Londres, Reino Unido). Una cantidad eficaz de PEG-IL-10 sería una cantidad suficiente para reducir el volumen del tumor, inhibir el crecimiento del tumor, prevenir la metástasis o aumentar la infiltración de células T CD8+ en el sitio del tumor.

"Exógeno" se refiere a sustancias que se producen fuera de un organismo, célula o cuerpo humano, dependiendo del contexto. "Endógeno" se refiere a sustancias que se producen dentro de una célula, organismo o cuerpo humano, dependiendo del contexto.

"Condición inmunitaria" o "trastorno inmunitario" incluye, por ejemplo, una inflamación patológica, un trastorno inflamatorio y un trastorno o enfermedad autoinmune. Estado inmunitario también se refiere a infecciones, infecciones persistentes y estados proliferativos como cáncer, tumores y angiogénesis, incluyendo infecciones, tumores y cánceres que resisten la irradiación del sistema inmunitario. “Condición cancerosa” incluye, por ejemplo, cáncer, células cancerosas, tumores, angiogénesis y condiciones precancerosas como displasia.

"Inhibidores" y "antagonistas" o "activadores" y "agonistas" se refieren a moléculas inhibidoras o activadoras, respectivamente, por ejemplo, para la activación de, por ejemplo, un ligando, receptor, cofactor, gen, célula, tejido u órgano. Un modulador de, por ejemplo, un gen, un receptor, un ligando o una célula, es una molécula que altera la actividad del gen, receptor, ligando o célula, donde la actividad puede activarse, inhibirse o alterarse en sus propiedades reguladoras. El modulador puede actuar solo o puede usar un cofactor, por ejemplo, una proteína, un ion metálico o una molécula pequeña. Los inhibidores son compuestos que disminuyen, bloquean, previenen, retrasan la activación, inactivan, desensibilizan o regulan por disminución, por ejemplo, un gen, proteína, ligando, receptor o célula. Los activadores son compuestos que aumentan, activan, facilitan, mejoran la activación, sensibilizan o regulan por incremento, por ejemplo, un gen, proteína, ligando, receptor o célula. Un inhibidor también puede definirse como una composición que reduce, bloquea o inactiva una actividad constitutiva. Un "agonista" es un compuesto que interactúa con un objetivo para provocar o promover un aumento en la activación del objetivo. Un "antagonista" es un compuesto que se opone a las acciones de un agonista. Un antagonista previene, reduce, inhibe o neutraliza la actividad de un agonista. Un antagonista también puede prevenir, inhibir o reducir la actividad constitutiva de un objetivo, por ejemplo, un receptor objetivo, incluso cuando no hay un agonista identificado.

Para examinar el alcance de la inhibición, por ejemplo, muestras o ensayos que comprenden una proteína, gen, célula u organismo dado, se tratan con un activador o inhibidor potencial y se comparan con muestras de control sin el inhibidor. A las muestras de control, es decir, no tratadas con antagonista, se les asigna un valor de actividad relativa del 100%. La inhibición se logra cuando el valor de actividad en relación con el control es de aproximadamente el 90% o menos, típicamente del 85% o menos, más típicamente del 80% o menos, más típicamente del 75% o menos, habitualmente del 70% o menos, más habitualmente del 65% o menos, más habitualmente del 60% o menos, típicamente del 55% o menos, habitualmente del 50% o menos, más habitualmente del 45% o menos, más habitualmente del 40% o menos, preferiblemente del 35% o menos, más preferiblemente del 30% o menos, aún más preferiblemente del 25% o menos, y lo más preferiblemente de menos del 25%. La activación se logra cuando el valor de actividad con respecto al control es de aproximadamente el 110%, generalmente por lo menos del 120%, más generalmente por lo menos del 140%, más generalmente por lo menos del 160%, a menudo por lo menos del 180%, más a menudo por lo menos 2 veces, más a menudo por lo menos 2,5 veces, habitualmente por lo menos 5 veces, más habitualmente por lo menos 10 veces, preferiblemente por lo menos 20 veces, más preferiblemente por lo menos 40 veces, y lo más preferible más de 40 veces más.

Los puntos finales en activación o inhibición pueden monitorizarse de la siguiente manera. La activación, la inhibición y la respuesta al tratamiento, por ejemplo, de una célula, un fluido fisiológico, un tejido, un órgano y un sujeto animal o humano, pueden monitorizarse mediante un criterio de valoración. El criterio de valoración puede comprender una cantidad o porcentaje predeterminado de, por ejemplo, una indicación de inflamación, oncogenicidad o desgranulación o secreción celular, como la liberación de una citoquina, oxígeno tóxico o una proteasa. El criterio de valoración puede comprender, por ejemplo, una cantidad predeterminada de flujo o transporte de iones; migración celular; adhesión celular; proliferación celular; potencial de metástasis; diferenciación celular; y cambio en el fenotipo, por ejemplo, cambio en la expresión del gen relacionado con la inflamación, apoptosis, transformación, ciclo celular o metástasis (ver, por ejemplo, Knight (2000) Ann. Clin. Lab. Sci. 30:145-158; Hood y Cheresh (2002) Nature Rev. Cancer 2:91-100; Timme, et al. (2003) Curr. Drug Targets 4:251-261; Robbins e Itzkowitz (2002) Med. Clin. North Am .86:1467-1495; Grady y Markowitz (2002) Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3:101-128; Bauer, et al. (2001) Glia 36:235-243; Stanimirovic y Satoh (2000) Brain Pathol. 10:113-126).

Un criterio de valoración de inhibición es generalmente el 75% del control o menos, preferiblemente el 50% del control o menos, más preferiblemente el 25% del control o menos, y lo más preferible del 10% del control o menos. Generalmente, un criterio de valoración de activación es de por lo menos el 150% del control, preferiblemente por lo menos dos veces el control, más preferiblemente por lo menos cuatro veces el control y lo más preferible por lo menos 10 veces el control.

Una composición que está "marcada" es detectable, ya sea directa o indirectamente, por métodos espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, isotópicos o químicos. Por ejemplo, los marcadores útiles incluyen 32P, 33P, 35S, 14C, 3H, 125I, isótopos estables, colorantes fluorescentes, reactivos densos en electrones, sustratos, etiquetas de epítopos o enzimas, por ejemplo, como se usa en inmunoensayos ligados a enzimas, o fluoretas (consultar, por ejemplo, Rozinov y Nolan (1998) Chem. Biol. 5:713-728).

"Ligando" se refiere, por ejemplo, a una molécula pequeña, péptido, polipéptido y molécula asociada a membrana o unida a membrana, o complejo de la misma, que puede actuar como agonista o antagonista de un receptor. "Ligando" también abarca un agente que no es un agonista o antagonista, pero que puede unirse al receptor sin influir significativamente en sus propiedades biológicas, por ejemplo, señalización o adhesión. Además, "ligando" incluye un ligando unido a la membrana que se ha cambiado, por ejemplo, mediante métodos químicos o recombinantes, a una versión soluble del ligando unido a la membrana. Por convención, cuando un ligando está unido a la membrana de una primera célula, el receptor habitualmente se encuentra en una segunda célula. La segunda célula puede tener la misma identidad que la primera célula o una diferente. Un ligando o receptor puede ser enteramente intracelular, es decir, puede residir en el citosol, el núcleo o algún otro compartimento intracelular. El ligando o receptor puede cambiar su localización, por ejemplo, de un compartimento intracelular a la cara exterior de la membrana plasmática. El complejo de un ligando y receptor se denomina "complejo de receptor de ligando". Cuando un ligando y un receptor están implicados en una vía de señalización, el ligando aparece en una posición en sentido ascendente y el receptor aparece en una posición en sentido descendente de la vía de señalización.

Se proporcionan "moléculas pequeñas" para el tratamiento de la fisiología y los trastornos de tumores y cánceres. "Molécula pequeña" se define como una molécula con un peso molecular de menos de 10 kD, típicamente de menos de 2 kD y preferiblemente de menos de 1 kD. Las moléculas pequeñas incluyen, pero no se limitan a, moléculas inorgánicas, moléculas orgánicas, moléculas orgánicas que contienen un componente inorgánico, moléculas que comprenden un átomo radiactivo, moléculas sintéticas, miméticos de péptidos y miméticos de anticuerpos. Como agente terapéutico, una molécula pequeña puede ser más permeable a las células, menos susceptible a la degradación y menos apta para provocar una respuesta inmunitaria que las moléculas grandes. Se describen moléculas pequeñas, como péptidos miméticos de anticuerpos y citoquinas, así como toxinas de molécula pequeña (ver, por ejemplo, Casset, et al. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 307:198-205; Muyldermans (2001) J. Biotechnol. 74:277-302; Li (2000) Nat. Biotechnol. 18:1251-1256; Apostolopoulos, et al. (2002) Curr. Med. Chem.

9:411 -420; Monfardini, et al. (2002) Curr. Pharm. Des. 8:2185-2199; Domingues, et al. (1999) Nat. Struct. Biol. 6:652-656; Sato y Sone (2003) Biochem. J. 371 :603-608; Patente de Estados Unidos N° 6,326,482 concedida a Stewart, et al.).

Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes como tiotepa y ciclosfosfamida (CYTOXAN™); sulfonatos de alquilo como busulfano, improsulfano y piposulfano; aziridinas como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas, incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosfaoramida y trimetilolomelamima mostazas nitrogenadas como chiorambucilo, cloramafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos como aclacinomicina, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicina, cactinomicina, caliqueamicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptongrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabolitos como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5- FU; andrógenos como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antisuprarrenales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedor de ácido fólico como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defamina; demecolcina; diazicuona; elfomitina; acetato de eliptinio; etoglucido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinán; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK®; razoxano; sizofirán; espiro germanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo, paclitaxel (TAXOL® Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) y doxetaxel (Taxotere™, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Francia); clorambucilo; gemcitabina; 6- tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido (VP- 16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; tenipósido; daunomicina; aminopterina; Xeloda® Roche, Suiza; ibandronato; CPT11; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilomitina (DMFO); ácido retinoico; esperamicinas; capecitabina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. También se incluyen en esta definición los agentes antihormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal sobre los tumores, como los antiestrógenos, incluyendo, por ejemplo, tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazoles inhibidores de la aromatasa, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY1 17018, onapristona y toremifeno (Fareston); y antiandrógenos como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores

Se une "específicamente" o "selectivamente", cuando se hace referencia a un ligando/receptor, anticuerpo/antígeno u otro par de unión, indica una reacción de unión que determina la presencia de la proteína en una población heterogénea de proteínas y otros productos biológicos. Por tanto, bajo las condiciones designadas, un ligando específico se une a un receptor particular y no se une en una cantidad significativa a otras proteínas presentes en la muestra. El anticuerpo, o la composición de unión derivada del sitio de unión al antígeno de un anticuerpo, del método contemplado se une a su antígeno, o una variante o muteína del mismo, con una afinidad que es por lo menos dos veces mayor, preferiblemente por lo menos diez veces mayor, más preferiblemente por lo menos 20 veces mayor, y lo más preferiblemente por lo menos 100 veces mayor que la afinidad con cualquier otro anticuerpo, o composición de unión derivada del mismo. En una realización preferida, el anticuerpo tendrá una afinidad de más de aproximadamente 109 litros/mol, según se determina, por ejemplo, mediante análisis de Scatchard (Munsen, et al. (1980) Analyt. Biochem. 107:220-239).

"Interleucina-10" o "IL-10", como se usa en la presente, ya sea conjugado con un polietilenglicol o en una forma no conjugada, es una proteína que comprende dos subunidades unidas de manera no covalente para formar un homodímero. Como se usa en la presente, a menos que se indique lo contrario, "interleucina-10" e "IL-10" pueden referirse a IL-10 humana o de ratón (n ° de Registro de Genbank n P_000563; M37897; o US 6,217,857) que también se denominan "hIL-10" o "mIL-10".

"IL-10 pegilada" o "PEG-IL-10" es una molécula de IL-10 que tiene una o más moléculas de polietilenglicol unidas covalentemente a uno o más de un residuo de aminoácido de la proteína IL-10 a través de un conector, de tal manera que la unión es estable. Los términos "IL-10 monopegilada" y "mono-PEG-IL-10" significan que por lo menos una molécula de polietilenglicol está unida covalentemente a un único residuo de aminoácido en una subunidad del dímero de IL-10 a través de un conector. Los términos "IL-10 dipegilada" y "di-PEG-IL-10" significan que por lo menos una molécula de PEG está unida a un solo residuo en cada subunidad del dímero de IL-10 a través de un conector. El peso molecular medio de la fracción de PEG está preferiblemente entre 5.000 y 50.000 daltons. El método o sitio de unión de PEG a IL-10 no es crítico, pero preferiblemente la pegilación no altera, o sólo altera mínimamente, la actividad de la molécula biológicamente activa. Preferiblemente, el aumento de la vida media es mayor que cualquier disminución de la actividad biológica. Para PEG-IL-10, la actividad biológica típicamente se mide evaluando los niveles de citoquinas inflamatorias (por ejemplo, TNFα, IFNy) en el suero de sujetos desafiados con un antígeno bacteriano (lipopolisacárido, LPS) y tratados con PEG-IL-10, como se describe en la US 7,052,686.

Como se usa en la presente, "vida media sérica", abreviado "t1/2 ", significa vida media de eliminación, es decir, el tiempo en el que la concentración sérica de un agente ha alcanzado la mitad de su valor inicial o máximo. El término "vida media sérica aumentada" usado en la presente en referencia a un agente sintético significa que el agente sintético se depura a una velocidad más lenta que el agente endógeno no sintético o la versión producida recombinantemente del mismo.

II. General.

La presente invención proporciona métodos para producir una mezcla de mono- y di-PEG. Se ha demostrado que la IL-10 pegilada es más eficaz en un entorno tumoral, consultar, por ejemplo, la US20080081031. La presente invención proporciona un método para aumentar los rendimientos de IL-10 pegilada mediante la purificación tanto de IL-10 monopegilada (por lo menos una molécula de PEG en una subunidad del homodímero de IL-10) como dipegilada (por lo menos una molécula de PEG en cada subunidad del homodímero de IL-10).

III. Polietilenglicol ("PEG")

El polietilenglicol ("PEG") es una fracción química que se ha usado en la preparación de productos proteicos terapéuticos. El verbo "pegilar" significa unir por lo menos una molécula de PEG a otra molécula, por ejemplo, una proteína terapéutica. Por ejemplo, el Adagen, una formulación pegilada de adenosina desaminasa, está aprobada para tratar la enfermedad de inmunodeficiencia combinada grave; la superóxido dismutasa pegilada ha estado en ensayos clínicos para el tratamiento de lesiones en la cabeza; el interferón alfa pegilado se ha probado en ensayos clínicos de fase I para el tratamiento de la hepatitis; Se informa que la glucocerebrosidasa pegilada y la hemoglobina pegilada han estado en pruebas preclínicas. Se ha demostrado que la unión de polietilenglicol protege contra la proteólisis (ver, por ejemplo, Sada, et al., (1991) J. Fermentation Bioengineering 71:137-139).

En su forma más común, el PEG es un poliéter lineal o ramificado terminado en grupos hidroxilo y que tiene la estructura general:

HO-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH

Para acoplar PEG a una molécula (polipéptidos, polisacáridos, polinucleótidos y moléculas orgánicas pequeñas) es necesario activar el PEG preparando un derivado del PEG que tenga un grupo funcional en uno o ambos extremos terminales. La ruta más común para la conjugación de proteínas con PEG ha sido activar el PEG con grupos funcionales adecuados para reaccionar con lisina y grupos de aminoácidos N-terminales. En particular, los grupos reactivos más comunes implicados en el acoplamiento de PEG a polipéptidos son los grupos alfa o épsilon amino de la lisina.

La reacción de un conector de pegilación con una proteína lleva a la unión de la fracción de PEG predominantemente en los siguientes sitios: el grupo amino alfa en el extremo N-terminal de la proteína, el grupo amino épsilon en la cadena lateral de los residuos de lisina y el grupo imidazol en la cadena lateral de los residuos de histidina. Como la mayoría de las proteínas recombinantes poseen un solo alfa y varios grupos épsilon amino e imidazol, pueden generarse numerosos isómeros posicionales dependiendo de la química del conector.

Dos monometoxi PEG activados (mPEG) de primera generación ampliamente usados fueron PEG de carbonato de succinimdilo (SC-PEG; consultar, por ejemplo, Zalipsky, et al. (1992) Biotehnol. Appl. Biochem 15:100-114; y Miron y Wilcheck (1993) Bioconjug. Chem. 4:568-569) y PEG de carbonato de benzotriazol (BTC-PEG; consultar, por ejemplo, Dolence, et al. Patente de Estados Unidos N° 5.650.234), que reaccionan preferiblemente con residuos de lisina para formar un enlace carbamato, pero también se sabe que reaccionan con residuos de histidina y tirosina. Se ha demostrado que el enlace a los residuos de histidina en IFNa es un enlace imidazolcarbamato hidrolíticamente inestable (ver, por ejemplo, Lee y McNemar, Patente de Estados Unidos N° 5,985,263).

La tecnología de PEGilación de segunda generación se ha diseñado para evitar estos enlaces inestables, así como la falta de selectividad en la reactividad de los residuos. El uso de un conector de PEG-aldehído se dirige a un solo sitio en el extremo N-terminal de una subunidad polipeptídica y/o proteica a través de la aminación reductora. La IL-10 puede pegilarse usando diferentes tipos de conectores y pH para llegar a varias formas de una molécula pegilada (ver, por ejemplo, US 5,252,714, US 5, 643,575, US 5,919,455, US 5,932,462,US 5,985,263, US 7,052,686).

IV. Actividad biológica de PEG-IL-10

La IL-10 humana induce el desarrollo rápido de anticuerpos neutralizantes cuando se administra a ratones inmunocompetentes. Para evitar este tipo de neutralización, se administró la administración subcutánea de PEG-hIL-10 a ratones deficientes en células B, es decir, ratones incapaces de generar una respuesta de anticuerpos. Los tumores singénicos bien establecidos en estos ratones inmunodeficientes se retrasaron significativamente en el crecimiento o fueron rechazados por completo por PEG-hIL-10. La restricción o inhibición del crecimiento tumoral dependía de las células T CD4 y CD8. Tras el agotamiento de las células CD8, el efecto inhibidor de PEG-hIL-10 se anuló por completo. Por lo tanto, PEG-hIL-10 induce respuestas citotóxicas mediadas por CD8.

Un análisis adicional del tejido tumoral mostró que la PEG-IL-10 aumentaba la infiltración de células T CD8+ en el tumor a un nivel mayor que el de la IL-10 no pegilada. El nivel de expresión de citoquinas inflamatorias por parte de las células CD8 infiltrantes también fue mayor con el tratamiento con PEG-IL-10 en comparación con el tratamiento con IL-10 no pegilada. El tratamiento de pacientes con tumores con PEG-IL-10 debe inducir una respuesta antitumoral significativa y conferir un beneficio terapéutico significativo (ver, por ejemplo,.

Una proteína IL-10 usada en la presente invención contiene una secuencia de aminoácidos que comparte una homología observada de por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo menos el 85% y lo más preferible por lo menos el 90% o más, por ejemplo, por lo menos el 95%, con la secuencia de una proteína IL-10 madura, es decir, que carece de cualquier secuencia líder. Consultar, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 6.217.857. La homología de la secuencia de aminoácidos, o la identidad de la secuencia, se determina optimizando las coincidencias de residuos y, si es necesario, introduciendo huecos según se requiera. Las secuencias homólogas de aminoácidos típicamente pretenden incluir variaciones alélicas, polimórficas e interespecies naturales en cada secuencia respectiva. Las proteínas o péptidos homólogos típicos tendrán del 25-100% de homología (si se pueden introducir huecos) al 50-100% de homología (si se incluyen sustituciones conservadoras) con la secuencia de aminoácidos del polipéptido IL-10. Consultar Needleham et al., J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970); Sankoff et al. en Time Warps, String Edits, y Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison, 1983, Addison-Wesley, Reading, Mass.; y paquetes de software de IntelliGenetics, Mountain View, Calif., y el University of Wisconsin Genetics Computer Group, Madison, Wis.

La fracción de IL-10 en los conjugados de PEG-IL-10 puede glicosilarse o modificarse con muteínas no glicosiladas u otros análogos, incluyendo la proteína BCRF1 (IL-10 viral del virus de Epstein Barr). Las modificaciones de las secuencias que codifican IL-10 pueden elaborarse usando una variedad de técnicas, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio [Gillman et al., Gene 8: 81-97 (1979); Roberts et al., Nature 328:731-734 (1987)], y puede evaluarse mediante selección rutinaria en un ensayo adecuado para la actividad de IL-10. Las proteínas de IL-10 modificadas, por ejemplo, las variantes, pueden variar de la secuencia natural al nivel de la estructura primaria. Tales modificaciones pueden realizarse mediante inserciones, sustituciones, deleciones y fusiones de aminoácidos. Las variantes de IL-10 pueden prepararse con varios objetivos en mente, incluyendo el aumento de la vida media en suero, la reducción de una respuesta inmunitaria contra la IL-10, la facilitación de la purificación o preparación, la disminución de la conversión de IL-10 en sus subunidades monoméricas, la mejora de la eficacia terapéutica, y disminución de la gravedad o la aparición de efectos secundarios durante el uso terapéutico. Las variantes de la secuencia de aminoácidos son habitualmente variantes predeterminadas que no se encuentran en la naturaleza, aunque otras pueden ser variantes postraduccionales, por ejemplo, variantes glicosiladas. En esta invención puede usarse cualquier variante de IL-10 siempre que conserve un nivel adecuado de actividad de IL-10. En el contexto del tumor, la actividad adecuada de IL-10 sería, por ejemplo, el infiltrado de células T CD8+ en los sitios del tumor, la expresión de citoquinas inflamatorias como IFNy, IL-4, IL-6, IL-10 y RANK-L, a partir de estas células infiltrantes, aumento de los niveles de TNFα o IFNy en muestras biológicas,

La IL-10 usada en esta invención puede proceder de un mamífero, por ejemplo, un humano o un ratón. Se prefiere la IL-10 humana (hIL-10) para el tratamiento de seres humanos con necesidad de tratamiento con IL-10. La IL-10 usada en esta invención es preferiblemente una IL-10 recombinante. Los métodos que describen la preparación de IL-10 humana y de ratón pueden encontrarse en la Patente de Estados Unidos N° 5.231.012. También se incluyen variantes de origen natural o sustituidas de manera conservadora de IL-10 humana y de ratón. En otra realización de la presente invención, la IL-10 puede ser de origen viral. La clonación y expresión de una IL-10 viral del virus Epstein Barr (proteína BCRF1) se divulga en Moore et al., Science 248:1230 (1990).

La IL-10 puede obtenerse de varias maneras usando técnicas estándar conocidas en la técnica, por ejemplo, aisladas y purificadas a partir de medios de cultivo de células activadas capaces de secretar la proteína (por ejemplo, células T), sintetizadas químicamente o técnicas recombinantes. (ver, por ejemplo, Merrifield, Science 233:341-47 (1986); Atherton et al., Solid Phase Peptide Synthesis, A Practical Approach, 1989, IRL Press, Oxford; Patente de Estados Unidos N° 5.231.012 que enseña métodos para la producción de proteínas que tienen actividad de IL-10, incluyendo técnicas recombinantes y otras técnicas sintéticas). Preferiblemente, la proteína de IL-10 se obtiene a partir de ácidos nucleicos que codifican el polipéptido IL-10 usando técnicas recombinantes. La IL-10 humana recombinante también está disponible comercialmente, por ejemplo, de PeproTech, Inc., Rocky Hill, NJ

La PEG-IL-10 puede elaborarse usando técnicas bien conocidas en la técnica. El polietilenglicol (PEG) puede sintetizarse como se describe, por ejemplo, en Lundblad, R.L. et al. (1988) Chemical Reagents for Protein Modification CRC Press, Inc., vol. 1, págs. 105-125. El PEG puede conjugarse con IL-10 mediante el uso de un conector como se ha descrito anteriormente. En ciertas realizaciones, la mono-PEG-IL-10 comprende de una a nueve moléculas de PEG unidas covalentemente a través de un conector al grupo amino alfa del residuo de aminoácido en el extremo N-terminal de una subunidad del dímero de IL-10. IV. Composiciones Terapéuticas, Métodos.

La PEG-IL-10 puede formularse en una composición farmacéutica que comprenda una cantidad terapéuticamente eficaz de IL-10 y un portador farmacéutico. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" es una cantidad suficiente para proporcionar el resultado terapéutico deseado. Preferiblemente, tal cantidad tiene efectos secundarios negativos mínimos. La cantidad de PEG-IL-10 administrada para tratar una afección tratable con IL-10 se basa en la actividad de IL-10 de la proteína conjugada, que puede determinarse mediante ensayos de actividad de IL-10 conocidos en la técnica. La cantidad terapéuticamente eficaz para un paciente particular que necesita dicho tratamiento puede determinarse considerando varios factores, como la afección tratada, la salud general del paciente, el método de administración, la gravedad de los efectos secundarios y similares. En el contexto del tumor, la actividad de IL-10 adecuada sería, por ejemplo, infiltración de células T CD8 en sitios tumorales, expresión de citoquinas inflamatorias como IFNy, IL-4, IL-6, IL-10 y RANK-L, de estas células infiltrantes, aumento de los niveles de TNFα o IFNy en muestras biológicas.

La cantidad terapéuticamente eficaz de IL-10 pegilada puede variar de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100 gg de proteína por kg de peso corporal al día. Preferiblemente, la cantidad de IL-10 pegilada varía de aproximadamente 0,1 a 20 gg de proteína por kg de peso corporal al día, más preferiblemente de aproximadamente 0,5 a 10 gg de proteína por kg de peso corporal al día, y más preferiblemente de aproximadamente 1 a 4 gg de proteína por kg de peso corporal al día. Pueden emplearse programas de administración menos frecuentes usando la PEG-IL-10 de la invención ya que esta forma conjugada tiene una acción más prolongada que la IL-10. La IL-10 pegilada se formula de manera purificada y sustancialmente libre de agregados y otras proteínas. Preferiblemente, la PEG-IL-10 se administra por infusión continua de tal manera que se administre una cantidad en el intervalo de aproximadamente 50 a 800 gg de proteína por día (es decir, aproximadamente de 1 a 16 gg de proteína por kg de peso corporal al día de PEG-IL-10). La tasa de infusión diaria puede variar sobre la base de la monitorización de los efectos secundarios y los recuentos de células sanguíneas.

Para preparar composiciones farmacéuticas que contienen mono-PEG-IL-10, se mezcla una cantidad terapéuticamente eficaz de PEG-IL-10 con un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, el portador o excipiente es inerte. Un portador farmacéutico puede ser cualquier sustancia no tóxica compatible adecuada para administrar las composiciones de IL-10 de la invención a un paciente. Los ejemplos de portadores adecuados incluyen solución salina normal, solución de Ringer, solución de dextrosa y solución de Hank. También pueden usarse portadores no acuosos como aceites fijos y oleato de etilo. Un portador preferido es dextrosa al 5%/solución salina. El portador puede contener cantidades menores de aditivos, como sustancias que mejoran la isotonicidad y la estabilidad química, por ejemplo, tampones y conservantes, consultar, por ejemplo,Remington's Pharmaceutical Sciencesy la Farmacopea de Estados Unidos: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984). Las formulaciones de agentes terapéuticos y de diagnóstico pueden prepararse mezclándolas con portadores, excipientes o estabilizadores fisiológicamente aceptables en forma de, por ejemplo, polvos liofilizados, lechadas, soluciones acuosas o suspensiones (ver, por ejemplo, Hardman, et al. (2001) Goodman y The Pharmacological Basis of Therapeutics de Gilman, McGraw-Hill, Nueva York, NY; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, y Wilkins, New York, NY; Avis, et al. (eds. (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner y Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, Ny ).

Las composiciones de la invención pueden administrarse por vía oral o inyectarse en el cuerpo. Las formulaciones para uso oral también pueden incluir compuestos para proteger adicionalmente la IL-10 de las proteasas en el tracto gastrointestinal. Las inyecciones suelen ser intramusculares, subcutáneas, intradérmicas o intravenosas. Alternativamente, podrían usarse inyección intraarticular u otras vías en circunstancias apropiadas.

Cuando se administra por vía parenteral, la IL-10 pegilada se formula preferiblemente en una forma inyectable de dosificación unitaria (solución, suspensión, emulsión) en asociación con un portador farmacéutico. Consultar, por ejemplo, Avis et al., eds., Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Dekker, NY (1993); Lieberman et al., eds., Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Dekker, N.Y. (1990); and Lieberman et al., eds., Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Dekker, N.Y. (1990). Alternativamente, las composiciones de la invención pueden introducirse en el cuerpo de un paciente mediante un sistema de administración de fármacos implantable o inyectable, por ejemplo, Urquhart et al. Ana. Rev. Pharmacol. Toxicol. 24:199-236, (1984); Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals Plenum Press, New York (1981); Patentes de Estados Unidos N° 3,773,919; 3,270,960; y similares. La IL-10 pegilada puede administrarse en vehículos acuosos como agua, solución salina o vehículos tamponados con o sin varios aditivos y/o agentes diluyentes.

Una cantidad eficaz para un paciente en particular puede variar dependiendo de factores como la afección que se está tratando, la salud general del paciente, la vía del método y la dosis de administración y la gravedad de los efectos secundarios (consultar, por ejemplo, Maynard, et al. (1996) A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boca Raton, FL; Dent (2001) Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch Publ., Londres, Reino Unido).

Los sujetos veterinarios, experimentales o de investigación típicos incluyen monos, perros, gatos, ratas, ratones, conejos, cobayas, caballos y humanos.

La determinación de la dosis apropiada la realiza el médico, por ejemplo, usando parámetros o factores conocidos o que se sospecha en la técnica que afectan al tratamiento o se prevé que afectarán al tratamiento. Generalmente, la dosis comienza con una cantidad algo menor que la dosis óptima y luego se aumenta en pequeños incrementos hasta que se logra el efecto deseado u óptimo con respecto a cualquier efecto secundario negativo. Las medidas de diagnóstico importantes incluyen las de los síntomas de, por ejemplo, la inflamación o el nivel de citoquinas inflamatorias producidas. Preferiblemente, un agente biológico que se usará se deriva de la misma especie que el animal objetivo para el tratamiento, minimizando de este modo una respuesta humoral al reactivo. Los métodos para la coadministración o tratamiento con un segundo agente terapéutico, por ejemplo, una citoquina, esteroide, agente quimioterapéutico, antibiótico o radiación, son bien conocidos en la técnica (consultar, por ejemplo, Hardman, et al. (eds.) (2001) Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10a ed., McGraw-Hill, New York, NY; Poole and Peterson (eds.) (2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice:A Practical Approach, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PA; Chabner and Longo (eds.) (2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PA). Una cantidad eficaz de agente terapéutico disminuirá los síntomas, por ejemplo, el tamaño del tumor o la inhibición del crecimiento del tumor, típicamente en por lo menos un 10%; habitualmente en por lo menos un 20%; preferiblemente por lo menos aproximadamente un 30%; más preferiblemente por lo menos el 40%, y lo más preferible por lo menos el 50%. VI. Usos.

La presente invención proporciona composiciones farmacéuticas para su uso en métodos de tratamiento de una afección o trastorno proliferativo, por ejemplo, cáncer de útero, cuello uterino, mama, próstata, testículos, pene, tracto gastrointestinal, por ejemplo, esófago, orofaringe, estómago, intestino delgado o grueso, colon o recto, riñón, célula renal, vejiga, hueso, médula ósea, piel, cabeza o cuello, piel, hígado, vesícula biliar, corazón, pulmón, páncreas, glándula salival, glándula suprarrenal, tiroides, cerebro, por ejemplo, gliomas, ganglios, sistema nervioso central (SNC) y sistema nervioso periférico (SNP), y sistema inmunitario, por ejemplo, bazo o timo. La presente invención proporciona composiciones farmacéuticas para su uso en métodos de tratamiento, por ejemplo, tumores inmunogénicos, tumores no inmunogénicos, tumores latentes, cánceres inducidos por virus, por ejemplo, cánceres de células epiteliales, cánceres de células endoteliales, carcinomas de células escamosas, papilomavirus, adenocarcinomas, linfomas, carcinomas, melanomas, leucemias, mielomas, sarcomas, teratocarcinomas, cánceres inducidos químicamente, metástasis y angiogénesis. La invención también contempla la reducción de la tolerancia a una célula tumoral o al antígeno de una célula cancerosa, por ejemplo, mediante la modulación de la actividad de una célula T reguladora (Treg) y/o una célula T CD8 (ver, por ejemplo, Ramirez-Montagut, et al. (2003) Oncogene 22:3180-3187; Sawaya, et al. (2003) New Engl. J. Med. 349:1501-1509; Farrar, et al. (1999) J. Immunol. 162:2842-2849; Le, et al. (2001) J. Immunol. 167:6765-6772; Cannistra and Niloff (1996) New Engl. J. Med. 334:1030-1038; Osborne (1998) New Engl. J. Med. 339:1609-1618; Lynch and Chapelle (2003) New Engl. J. Med. 348:919-932; Enzinger and Mayer (2003) New Engl. J. Med. 349:2241-2252; Forastiere, et al. (2001) New Engl. J. Med. 345:1890-1900; Izbicki, et al. (1997) New Engl. J. Med. 337:1188-1194; Holland, et al. (eds.) (1996) Cancer Medicine Encyclopedia of Cancer, 4a ed., Academic Press, San

Diego, CA).

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas para su uso en métodos para tratar una afección proliferativa, cáncer, tumor o afección precancerosa como una displasia, con PEG-IL-10 y por lo menos un agente terapéutico o de diagnóstico adicional. El agente terapéutico adicional puede ser, por ejemplo, una citoquina o un antagonista de citoquina, como IL-12, interferón-alfa o receptor del factor de crecimiento antiepidérmico, doxorrubicina, epirrubicina, un antifolato, por ejemplo, metotrexato o fluoruracilo, irinotecán, ciclofosfamida, radioterapia, terapia hormonal o antihormonal, por ejemplo, andrógenos, estrógenos, antiestrógenos, flutamida o dietilestilbestrol, cirugía, tamoxifeno, ifosfamida, mitolactol, un agente alquilante, por ejemplo, melfalán o cisplatino, etopósido, vinorelbina, vinblastina, vindesina, un glucocorticoide, un antagonista del receptor de histamina, un inhibidor de la angiogénesis, radiación, un sensibilizador a la radiación, antraciclina, alcaloide de la vinca, taxano, por ejemplo, paclitaxel y docetaxel, un inhibidor del ciclo celular, por ejemplo, un inhibidor de la cinasa dependiente de ciclina, un anticuerpo monoclonal contra otro antígeno tumoral, un complejo de anticuerpo monoclonal y toxina, un adyuvante de células T, trasplante de médula ósea o células presentadoras de antígenos, por ejemplo, terapia con células dendríticas. Las vacunas pueden proporcionarse, por ejemplo, como una proteína soluble o como un ácido nucleico que codifica la proteína (por ejemplo, Le, et al., supra; Greco and Zellefsky (eds.) (2000) Radiotherapy of Prostate Cancer, Harwood Academic, Amsterdam; Shapiro and Recht (2001) New Engl. J. Med. 344:1997-2008; Hortobagyi (1998) New Engl. J. Med. 339:974-984; Catalona (1994) New Engl. J. Med. 331:996-1004; Naylor and Hadden (2003) Int. Immunopharmacol. 3:1205-1215; The Int. Adjuvant Lung Cancer Trial Collaborative Group (2004) New Engl. J. Med. 350:351-360; Slamon, et al. (2001) New Engl. J. Med. 344:783-792; Kudelka, et al. (1998) New Engl. J. Med. 338:991-992; van Netten, et al. (1996) New Engl. J. Med. 334:920-921).

También se proporcionan composiciones farmacéuticas para su uso en métodos de tratamiento de la hematopoyesis extramedular (EMH) del cáncer. Se describe EMH (ver, por ejemplo, Rao, et al. (2003) Leuk. Lymphoma 44:715-718; Lane, et al. (2002) J. Cutan. Pathol. 29:608-612).

El amplio alcance de esta invención se comprenderá mejor con referencia a los siguientes ejemplos.

EJEMPLOS

I. Métodos Generales.

Se describen métodos estándar en biología molecular (Maniatis, et al. (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning, 3aed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, Wu (1993) Recombinant DNA, Vol. 217, Academic Press, San Diego, CA). Los métodos estándar también aparecen en Ausubel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vols. 1-4, John Wiley and Sons, Inc. New York, NY, que describe la clonación en células bacterianas y la mutagénesis del ADN (Vol. 1), la clonación en células de mamíferos y levaduras (Vol. 2), glicoconjugados y expresión de proteínas (Vol. 3), y bioinformática (Vol. 4).

Se describen métodos para la purificación de proteínas que incluyen inmunoprecipitación, cromatografía, electroforesis, centrifugación y cristalización (Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., Nueva York). Se describen el análisis químico, la modificación química, la modificación postraduccional, la producción de proteínas de fusión, la glicosilación de proteínas (ver, por ejemplo, Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 2, John Wiley and Sons, Inc., Nueva York; Ausubel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 3, John Wiley and Sons, Inc., NY, NY, págs. 16.0.5-16.22.17; Sigma-Aldrich, Co (2001) Products for Life Science Research, St. Louis, MO, págs. 45-89; Amersham Pharmacia Biotech (2001) BioDirectory, Piscataway, NJ, págs. 384-391). Se describe la producción, purificación y fragmentación de anticuerpos policlonales y monoclonales (Coligan, et al. (2001) Current Protcols in Immunology, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York; Harlow and Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Harlow and Lane,supra).Están disponibles técnicas estándar para caracterizar las interacciones ligando/receptor (ver, por ejemplo, Coligan, et al. (2001) Current Protcols in Immunology, Vol. 4, John Wiley, Inc., Nueva York). Los métodos para elaborar PEG-IL-10 se describen, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos N° 7.052.686.

Hay disponibles métodos para la citometría de flujo, incluyendo la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) (ver, por ejemplo, Owens, et al. (1994) Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice, John Wiley and Sons, Hoboken, n J; Givan (2001) Flow Cytometry, 2a ed.; Wiley-Liss, Hoboken, NJ; Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ).Hay disponibles reactivos fluorescentes adecuados para modificar ácidos nucleicos, incluyendo cebadores y sondas de ácidos nucleicos, polipéptidos y anticuerpos, para su uso, por ejemplo, como reactivos de diagnóstico (Molecular Probes (2003) Catalogue, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR; Sigma -Aldrich (2003) Catálogo, St. Louis, MO).

Se describen métodos estándar de histología del sistema inmunitario (ver, por ejemplo, Muller-Harmelink (ed.) (1986) Human Thymus: Histopathology and Pathology, Springer Verlag, New York, NY; Hiatt, et al. (2000) Color Atlas of Histology, Lippincott, Williams y Wilkins, Phila, PA, Louis y otros (2002) Basic Histology: Text and Atlas, McGraw-Hill, Nueva York, NY).

Se describen métodos para el tratamiento y diagnóstico del cáncer (ver, por ejemplo, Alison (ed.) (2001) The Cancer Handbook, Grove's Dictionaries, Inc., St. Louis, MO; Oldham (ed.) (1998) Principles of Cancer) Biotherapy, 3a ed., Kluwer Academic Publ., Hingham, MA; Thompson, et al. (eds.) (2001) Textbook of Melanoma, Martin Dunitz, Ltd., Londres, Reino Unido; Devita, et al. (eds. (2001) Cancer: Principles and Practice of Oncology, 6a ed., Lippincott, Phila, PA; Holland, et al. (eds.) (2000) Holland-Frei Cancer Medicine, BC Decker, Phila., PA; Garrett and Sell (eds.) (1995) Cellular Cancer Markers, Humana Press, Totowa, NJ; MacKie (1996) Skin Cancer, 2nd ed., Mosby, St. Louis; Moertel (1994) New Engl. J. Med. 330:1136-1142; Engleman (2003) Semin. Oncol. 30(3 Suppl. 8):23-29; Mohr, et al. (2003) Onkologie 26:227-233).

Hay disponibles paquetes de software y bases de datos para determinar, por ejemplo, fragmentos antigénicos, secuencias líder, plegamiento de proteínas, dominios funcionales, sitios de glicosilación y alineamientos de secuencias (ver, por ejemplo, GenBank, Vector NTI® Suite (Informax, Inc, Bethesda, MD); GCG Wisconsin Package (Accelrys, Inc., San Diego, CA); DeCypher® (TimeLogic Corp., Crystal Bay, Nevada); Menne, et al. (2000) Bioinformatics 16: 741-742; Menne, et al. (2000) Bioinformatics Applications Note 16:741-742; Wren, et al. (2002) Comput. Methods Programs Biomed. 68:177-181; von Heijne (1983) Eur. J. Biochem. 133:17-21; von Heijne (1986) Nucleic Acids Res. 14:4683-4690).

II. IL-10 pegilada

La IL-10 (por ejemplo, roedor o primate) se dializó frente a fosfato sódico 50 mM, cloruro sódico 100 mM en intervalos de pH de 5 a 7,4. Se hizo reaccionar una proporción molar de 1:1-1:7 de PEG-propilaldehído 5K con IL-10 a una concentración de 1-12 mg/ml en presencia de cianoborohidruro de sodio 0,75-30 mM. Alternativamente, de manera similar la reacción puede activarse con picolina borano. La reacción se incubó a 5-30° C durante 3-24 horas.

En particular, el pH de la reacción de pegilación se ajustó a 6,3, se hicieron reaccionar 7,5 mg/ml de hIL-10 con PEG para hacer que la proporción de IL-10 a conector de PEG fuera de 1:3,5. La concentración final de cianoborohidruro fue de 25 mM y la reacción se llevó a cabo a 15° C durante 12-15 horas. La Figura 1 muestra la cinética de reacción de mono- y di-PEG-IL-10. La mono- y di-PEG IL-10 son los productos más grandes de la reacción, con una concentración de cada uno del 50% al final.

La reacción se inactivó usando un aminoácido como glicina y lisina o, alternativamente, tampones Tris. Se han empleado múltiples métodos de purificación, como filtración en gel, cromatografías de intercambio de aniones y cationes y exclusión por tamaño para aislar los prototipos PEGilados deseados.

Alternativamente, la IL-10 se dializa frente a fosfato de sodio 10 mM, pH 7,0, NaCl 100 mM. La IL-10 dializada se diluyó 3,2 veces hasta una concentración de aproximadamente 0,5 a 12 mg/ml usando el tampón de diálisis. Antes de añadir el conector, SC-PEG-12K (Delmar Scientific Laboratories, Maywood, IL), se añade 1 volumen de tetraborato de sodio 100 mM a pH 9,1 a 9 volúmenes de IL-10 diluida para elevar el pH de la solución de IL-10 a 8,6. El conector SC-PEG-12K se disuelve en el tampón de diálisis y se añade el volumen adecuado de la solución conectora (1,8 a 3,6 moles de conector por mol de IL-10) a la solución de IL-10 diluida para iniciar la reacción de pegilación. La reacción se lleva a cabo a 5° C para controlar la velocidad de la reacción. La solución de reacción se agita suavemente durante la reacción de pegilación. Cuando el rendimiento de mono-PEG-IL-10 determinado por HPLC de exclusión por tamaño (SE-HPLC) es cercano al 40%, la reacción se detuvo añadiendo solución de glicina 1 M hasta una concentración final de 30 mM. El pH de la solución de reacción se ajusta lentamente a 7,0 usando una solución de HCl y la reacción se filtra a 0,2 micras y se almacena a -80° C.

III. Comparaciones de eficacia

Para comparar varios prototipos de PEG-IL-10, a 10 ratones por grupo de tratamiento se les implantaron subcutáneamente 106 carcinomas de células escamosas PDV6 en matrigel, en el flanco derecho, en un volumen de 100 μl. Una vez que el tamaño medio del tumor alcanzó los 100 mm3 (aproximadamente 2-3 semanas desde la implantación), se inició el tratamiento con los siguientes prototipos murinos de PEG-IL-10 o control, una vez al día (a menos que se especifique, el conector fue PPA):

Los criterios de valoración medidos incluyeron el tamaño del tumor (medido 2 veces por semana), pesos (medidos 1 vez por semana) y concentraciones séricas (medidas al inicio, a la mitad y al final del tratamiento). La Figura 2 muestra las eficacias de los varios prototipos descritos anteriormente.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Un método para aumentar los rendimientos de IL-10 PEGilada mediante la purificación de IL-10 tanto monopegilada como dipegilada, en donde la IL-10 monopegilada tiene por lo menos una molécula de PEG unida covalentemente a través de un conector a un único aminoácido en una subunidad del homodímero de IL-10 y la IL-10 dipegilada tiene por lo menos una molécula de PEG unida covalentemente a través de un conector a un único aminoácido en cada subunidad del homodímero de IL-10.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el peso molecular medio del PEG está entre aproximadamente 5.000 y aproximadamente 50.000 daltons.

3. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la IL-10 es IL-10 humana.

4. El método de la reivindicación 3, en donde la IL-10 humana es IL-10 humana recombinante.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde cada una de las moléculas de PEG se une mediante un conector al grupo amino alfa en el extremo N-terminal de una de las subunidades de IL-10.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para producir una mezcla de IL-10 monopegilada y dipegilada, que comprende: (a) hacer reaccionar de 1 mg/ml a 12 mg/ml de proteína de IL-10 con un conector PEG activado de tal manera que la proporción de IL-10 a PEG-conector es de 1:1 a 1:7,7, en presencia de 0,75 mM a 35 mM de un agente reductor, a un pH de aproximadamente 5,0 a 7,4 y una temperatura de 5° C a 30° C, durante 12-15 horas; y (b) purificar la mezcla de IL-10 monopegilada y dipegilada.

7. Una composición farmacéutica que comprende una mezcla de IL-10 monopegilada y dipegilada que puede obtenerse mediante el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, y un portador farmacéuticamente aceptable.

8. La composición farmacéutica de la reivindicación 7 para su uso en el tratamiento de una afección o trastorno proliferativo.

9. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la afección o trastorno proliferativo es cáncer de útero, cuello uterino, mama, próstata, testículos, pene, tracto gastrointestinal, colon, recto, riñón, células renales, vejiga, hueso, médula ósea, piel, cabeza o cuello, hígado, vesícula biliar, corazón, pulmón, páncreas, glándula salival, glándula suprarrenal, tiroides, cerebro, sistema nervioso central, sistema nervioso periférico o sistema inmunitario.

10. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la afección o trastorno proliferativo es un cáncer de células epiteliales, cáncer de células endoteliales, carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma, linfoma, carcinoma, melanoma, leucemia, mieloma, sarcoma, teratocarcinoma, cánceres inducidos químicamente, metástasis o angiogénesis.

11. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en donde la composición se administra con por lo menos un agente terapéutico adicional.

12. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el agente terapéutico adicional es una citoquina, un antagonista de citoquina, doxorrubicina, epirrubicina, un antifolato, irinotecán, ciclofosfamida, radioterapia, terapia hormonal, terapia antihormonal, tamoxifeno, ifosfamida, mitolactol, un agente alquilante, etopósido, vinorelbina, vinblastina, vindesina, un glucocorticoide, un antagonista del receptor de histamina, un inhibidor de la angiogénesis, un sensibilizador a la radiación, antraciclina, alcaloide de la vinca, taxano, un inhibidor del ciclo celular o un anticuerpo monoclonal contra un antígeno tumoral.