ES2958416T3 - Detección de moléculas distintas utilizando sensores de fibra óptica - Google Patents

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Abstract

La invención se refiere a un método (10) para detectar distintas moléculas diana (21) en una muestra (26). El método comprende proporcionar (11) un sensor de fibra óptica (23) funcionalizado con distintas sondas de afinidad (24) inmovilizadas en una superficie de detección (25), uniéndose cada sonda específicamente a una molécula correspondiente (21) a detectar. El método comprende además proporcionar (12) fluidos reactivos (26), comprendiendo cada uno uno o varios reactivos de afinidad (27) para unirse simultáneamente con una sonda (24) correspondiente a la molécula (21) correspondiente. Cada reactivo está unido a una nanopartícula metálica (28). Cada fluido (26) tiene una composición diferente para permitir la unión de los reactivos de afinidad (27) en cada fluido (26) a una combinación diferente de moléculas diana (21). El método también comprende exponer (13) el(los) sensor(es) (23) a la muestra (22), exponer (14) un sensor (23) a un primer fluido reactivo (30) y detectar una primera señal para determinar si alguno de una primera combinación de moléculas estaba presente en la muestra (22), y exponer (15) un sensor a un segundo fluido reactivo (31) y detectar una segunda señal para determinar si alguna de una segunda combinación de moléculas objetivo estaba presente. Si la primera señal indica la presencia de cualquiera de la primera combinación de moléculas diana, la(s) molécula(s) diana específica(s) de la primera combinación que están presentes en el fluido de muestra (22) se determina además mediante la segunda señal, en la que la afinidad Los reactivos en el segundo fluido reactivo (31) forman un primer subconjunto adecuado de los reactivos de afinidad en el primer fluido reactivo (30). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Detección de moléculas distintas utilizando sensores de fibra óptica
Campo de la invención
La invención se refiere al campo de la detección de moléculas en una muestra utilizando un sensor sensible a la masa. Más específicamente, se refiere a un método para detectar una pluralidad de moléculas diana distintas en un fluido de muestra usando al menos un sensor de fibra óptica, un sensor de fibra óptica adaptado para detectar una pluralidad de moléculas distintas en una muestra.
Antecedentes de la invención
En aplicaciones clínicas y de investigación puede resultar importante un análisis rápido, sencillo y fiable de moléculas, p. ej., de biomoléculas, tal como la detección y/o cuantificación de varias proteínas en una muestra. Las pruebas de diagnóstico de alérgenos, contaminantes o enfermedades pueden basarse en este tipo de análisis. Por ejemplo, la presencia de pequeñas cantidades de biomoléculas específicas puede ser indicativa de una dolencia patológica. Son conocidos en la técnica los ensayos múltiplex para detectar y/o cuantificar una pluralidad de diferentes analitos en una muestra mediante una sola operación de prueba.
Para el análisis de ácidos nucleicos, se utilizan técnicas tales como el análisis de fusión de ADN utilizando instrumentación de alta resolución y tintes fluorescentes especializados de unión de ADN, para determinar la presencia y la identidad de diferentes ácidos nucleicos en la misma solución. Otra técnica a base de PCR cuantitativa combina con fuerza la detección sensible de ácidos nucleicos en tiempo real con la capacidad de multiplexación, p. ej., como se describe en el documento de Espy y col., Clin Microbiol Rev, 2006, 19, págs. 165-256. Sin embargo, estas técnicas requieren el uso de múltiples tintes fluorescentes para monitorear la amplificación de los ácidos nucleicos diana en tiempo real. Debido a que la transferencia de energía de resonancia se produce entre los tintes, la sensibilidad de estas reacciones se ve obstaculizada y la mayoría de los ensayos de PCR cuantitativa pueden detectar simultáneamente solo 2 o 3 dianas. La PCR convencional, que se efectúa sin tintes, podría admitir muchas más dianas, como lo demuestran los experimentos en los que se usó la temperatura de fusión característica (Tf) de amplicones de PCR como etiqueta secundaria en la PCR cuantitativa, lo que condujo a la identificación de 50 secuencias de ADN diferentes en una muestra, por ejemplo, como describen Mackay y col. en el documento Nucleic acids res., 2002, 30, págs. 1292-1305.
Por ejemplo, es conocido en la técnica el llevar a cabo una reacción de PCR en fase sólida utilizando un primer cebador que se fija a una superficie sensible del sensor y un segundo cebador que se fija a una partícula de oro. En tal acercamiento de la técnica anterior, las reacciones de PCR múltiplex pueden lograrse usando múltiples sondas de sensor, p. ej., una sonda de fibra óptica funcionalizada individualmente para cada reacción de amplificación a estudiar.
Sin embargo, sigue existiendo la necesidad de técnicas que permitan la identificación y cuantificación rápidas, sensibles y precisas de moléculas, p. ej., biomoléculas tales como las proteínas.
Además, es conocido en la técnica el monitoreo de la fusión de ADN en tiempo real usando dispositivos de resonancia de plasmones superficiales (SPR). Por ejemplo, Fiche y col., Analytical Chemistry, 2008, 80, 1049-1057, utilizaron un dispositivo de formación de imágenes por SPR para discriminar entre polimorfismos de nucleótido único (SNP) en secuencias diana cortas, mientras que se utilizó la hibridación de nanopartículas de oro (NP Au) en la superficie de los dispositivos SPR para mejorar la resolución, de modo que se discriminaran los SNP en dianas más largas, tal como lo describen Knez y col., Small, 2012, 8, 868-872.
También se conoce en la técnica el uso de un dispositivo SPR de fibra óptica (FO-SPR) a modo de “ sonda de inmersión” para probar diferentes soluciones. Puede utilizarse un dispositivo FO-SPR para controlar las reacciones de amplificación por PCR en fase sólida, p. ej., como describen Pollet y col. en Small, 2011, 7, 1003-1006. En este método, se lleva a cabo una reacción de PCR en fase sólida utilizando un cebador que se fija al sensor y un cebador que se fija a una partícula de oro. Las sondas en la superficie pueden extenderse durante la PCR y, por lo tanto, la determinación del punto de fusión puede estar dictada por el comportamiento de todo el amplicón y no solo por la hibridación de la plantilla del cebador. Sin embargo, según este acercamiento, las reacciones de PCR múltiplex se lograrían utilizando fibras múltiples, p. ej., una fibra funcionalizada individualmente para cada reacción de amplificación.
Otro sensor de resonancia de plasmones de superficie de fibra óptica fue descrito por Pollet y col. en “ Fiber optic SPR biosensing of DNA hybridization and DNA-protein interactions” , publicado en Biosens. Bioelectron. 25(4), págs. 864 869. Este biosensor de SPR de fibra óptica, reutilizable y sin etiquetas, puede utilizarse para medir la hibridación del ADN y las interacciones entre ADN y proteínas. En particular, un sistema de SPR a base de fibra se combina con biorreceptores de aptámeros de ADN.
Además, en el documento “ Fiber optic-SPR platform for fast and sensitive infliximab detection in serum of inflammatory bowel disease patients” ; Biosens Bioelectron, 79, págs. 173-179, Lu y col. describieron un bioensayo rápido para determinar la concentración de infliximab en suero utilizando un biosensor de resonancia de plasmón de superficie de fibra óptica (FO-SPR), en el que se inmoviliza covalentemente un anticuerpo específico de infliximab en la superficie del sensor del biosensor de FO-SPR.
Además, se conoce en la técnica el hecho de detectar múltiples proteínas en un único punto mediante espectrometría de masas de plasma acoplada inductivamente por ablación láser (LA-ICPMS). Por ejemplo, en el documento “ Detection of Multiple Proteins on One Spot by Laser Ablation Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry and Application to Immuno-Microarray with Element-Tagged Antibodies” , Anal. Chem. 2007, 79, págs. 923-929, Hu y col. describieron un método de detección a base de LA-ICPS que permite detectar múltiples analitos biológicos de cada punto de una micromatriz usando inmunorreacciones de tipo sándwich en una micromatriz con anticuerpos marcados con elementos, p. ej., anticuerpos conjugados a diferentes iones o nanopartículas metálicos.
El documento WO2015/071338 A1 describe la detección de un ácido nucleico diana en una muestra utilizando un sensor sensible a la masa funcionalizado con una primera sonda de ácido nucleico que se hibrida con el ácido nucleico diana, y nanopartículas metálicas funcionalizadas con una segunda sonda de ácido nucleico que se hibrida con el ácido nucleico diana. Se lleva a cabo una amplificación del ácido nucleico diana utilizando sondas no inmovilizadas complementarias al ADN nucleico diana.
Resumen de la invención
Un objeto de las realizaciones de la presente invención es proporcionar métodos y medios adecuados y eficientes para la detección y/o cuantificación de diferentes moléculas diana, p. ej., biomoléculas, en una muestra utilizando un sensor de fibra óptica, p. ej., un sensor de fibra óptica, p. ej., un biosensor de fibra óptica, p. ej., para la detección múltiplex de analitos utilizando un biosensor de fibra óptica.
El objetivo anterior se logra mediante un método según se define en la reivindicación 1 independiente adjunta.
El sensor de fibra óptica puede comprender una configuración conocida en la técnica, p. ej., según se describe en Sensors & Bioelectronics vol. 12 n.° 4, págs. 329-336, 1997.
Una de las ventajas de las realizaciones de la presente invención es que las moléculas diana que no estén presentes en el fluido de muestra pueden eliminarse rápidamente mediante ensayos por etapas.
Un método según realizaciones de la presente invención puede comprender además exponer el o cualquiera del al menos un sensor de fibra óptica a un fluido reactivo adicional de la pluralidad de fluidos reactivos, y detectar una señal adicional generada por el sensor de fibra óptica así expuesto para determinar si al menos una molécula diana adicional, o cualquiera de una combinación adicional de moléculas diana, estaba presente en el fluido de muestra.
En un método según las realizaciones de la presente invención, el uno o más reactivos de afinidad en el fluido reactivo adicional pueden formar un segundo subconjunto propio de los reactivos de afinidad en el primer fluido reactivo, en el que este segundo subconjunto propio es complementario al primer subconjunto propio.
En un método según realizaciones de la presente invención, el número de reactivos de afinidad en el segundo subconjunto propio puede estar en el intervalo de un 50 % a un 150 % del número de reactivos de afinidad en el primer subconjunto propio.
Una de las ventajas de las realizaciones de la presente invención es que las moléculas que no estén presentes en el fluido de muestra pueden eliminarse rápidamente mediante ensayos por etapas para conjuntos complementarios de aproximadamente el mismo tamaño.
Una de las ventajas de las realizaciones de la presente invención es que puede reutilizarse un sensor de fibra óptica fácilmente para pruebas adicionales si no se observara unión a las moléculas de ensayo.
En un método según realizaciones de la presente invención, el al menos un sensor de fibra óptica puede comprender una pluralidad de sensores de fibra óptica, en donde el segundo sensor de fibra óptica se expone al segundo fluido reactivo si la primera señal fuera indicativa de la presencia de la primera molécula diana o de cualquier molécula diana de la primera combinación de moléculas diana.
Una de las ventajas de las realizaciones de la presente invención es que pueden usarse sensores de fibra óptica idénticos al tiempo que se permite el ensayo específico de una pluralidad de moléculas de interés en un procedimiento por etapas. Una ventaja adicional es que no resulta necesario fabricar y funcionalizar sensores de fibra óptica distintos específicamente para ensayos en diferentes moléculas.
En un método según realizaciones de la presente invención, el primer fluido reactivo puede comprender, para cada molécula diana de la pluralidad de moléculas diana, un correspondiente reactivo de afinidad para la unión simultánea con una correspondiente sonda de afinidad de la pluralidad de sondas de afinidad distintas con la molécula diana, de tal modo que la primera señal detectada forme una señal de exploración general indicativa de la presencia de cualquiera de la pluralidad de moléculas diana en el líquido de muestra.
Una de las ventajas de las realizaciones de la presente invención es que puede obtenerse una exploración rápida para un gran número de moléculas diana al tiempo que se permite una identificación eficaz de las moléculas diana presentes en un acercamiento por etapas.
En un método según realizaciones de la presente invención, las moléculas diana pueden comprender proteínas a detectar en el fluido de muestra.
Una de las ventajas de las realizaciones de la presente invención es que se proporciona una detección eficaz y específica de proteínas utilizando sondas de sensor de fibra óptica, p. ej., cuando pueda resultar difícil la desambiguación de la unión de diferentes proteínas diana en el sensor utilizando diferentes características de curva de fusión.
En el método según la presente invención, se monitorea la señal óptica mientras se aumenta la temperatura de la superficie de detección (directa o indirectamente, por ejemplo, calentando un fluido, por ejemplo, el fluido de muestra, en el que se sumerge la superficie de detección) y se detecta un cambio en la señal óptica monitoreada, siendo dicho cambio representativo de una liberación inducida por la temperatura de moléculas diana desde la superficie de detección, para determinar si las moléculas diana estaban presentes en la muestra y estaban unidas a la superficie de detección por una sonda de afinidad y un reactivo de afinidad correspondientes.
En un método según realizaciones de la presente invención, la superficie de detección del al menos un sensor de fibra óptica puede estar provista de una estructura de texturización superficial para permitir la unión de las moléculas diana en las correspondientes sondas de afinidad en una orientación predeterminada.
En un método según realizaciones de la presente invención, la estructura de texturización superficial puede comprender estructuras de ADN autoensambladas, p. ej., nanoestructuras de ADN autoensambladas u origami de ADN autoensamblado, tales como estructuras de tetraedro y/o estructuras de pilar.
En un método según realizaciones de la presente invención, la exposición del sensor de fibra óptica al fluido de muestra puede comprender poner en contacto el sensor de fibra óptica con el fluido de muestra en una cámara de reacción. Por ejemplo, poner en contacto el sensor sensible a la masa con el fluido de muestra en una cámara de reacción puede comprender sumergir en el fluido de muestra el sensor sensible a la masa, p. ej., la sonda de fibra óptica.
En un método según realizaciones de la presente invención, la exposición del sensor de fibra óptica al fluido de muestra puede comprender llevar a cabo una amplificación de ácidos nucleicos de la pluralidad de diferentes moléculas diana, de modo que los ácidos nucleicos diana amplificados de la pluralidad de diferentes moléculas diana formen complejos con la correspondiente pluralidad de sondas de afinidad distintas.
En un método según realizaciones de la presente invención, la amplificación de ácidos nucleicos puede comprender una reacción en cadena de polimerasa, una reacción en cadena de ligadura, una amplificación de círculo rodante y/o una amplificación de MNAzima.
Las realizaciones particulares y preferidas de la invención se exponen en las reivindicaciones dependientes adjuntas. Las características de las reivindicaciones dependientes pueden combinarse con las características de la reivindicación independiente y con las características de otras reivindicaciones dependientes, según corresponda, dentro del alcance de las reivindicaciones.
Estos y otros aspectos de la invención serán evidentes y se aclararán con referencia a la una o más realizaciones descritas a continuación.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1 ilustra un método ilustrativo según realizaciones de la presente invención.
La FIG. 2 ilustra esquemáticamente un método según realizaciones de la presente invención.
La FIG. 3 muestra una configuración de sensor ilustrativa para su uso en realizaciones de la presente invención.
Las figuras son solo esquemáticas y no son limitantes. En las figuras, el tamaño de algunos de los elementos puede haberse exagerado y no haberse dibujado a escala con fines ilustrativos.
Ninguno de los signos de referencia en las reivindicaciones debe interpretarse como una limitación del alcance.
En las diferentes figuras, los mismos signos de referencia se refieren a elementos iguales o correspondientes.
Descripción detallada de realizaciones ilustrativas
La presente invención se describirá con respecto a realizaciones particulares y haciendo referencia a ciertas figuras, pero la invención no está limitada a las mismas sino solo a las reivindicaciones. Las figuras descritas son solo esquemáticas y no son limitantes. En las figuras, el tamaño de algunos de los elementos puede haberse exagerado y no haberse dibujado a escala con fines ilustrativos. Las dimensiones y las dimensiones relativas no corresponden a las reducciones reales para la práctica de la invención.
Además, los términos primer, segundo, y similares, en la descripción y en las reivindicaciones se utilizan para distinguir entre elementos similares y no necesariamente para describir una secuencia, ya sea temporal o espacial, de orden o de cualquier otro tipo. Debe comprenderse que los términos así utilizados son intercambiables en circunstancias apropiadas y que las realizaciones de la invención descritas en la presente memoria pueden funcionar en otras secuencias que las descritas o ilustradas en la presente memoria.
Además, los términos superior, debajo, y similares, en la descripción y las reivindicaciones se utilizan con fines descriptivos y no necesariamente para describir posiciones relativas. Debe comprenderse que los términos así utilizados son intercambiables en circunstancias apropiadas y que las realizaciones de la invención descritas en la presente memoria pueden funcionar en otras orientaciones que las descritas o ilustradas en la presente memoria.
Cabe señalar que la expresión “ que comprende” , tal como se utiliza en las reivindicaciones, no debe interpretarse como restringida a los medios enumerados a continuación; no excluye otros elementos o etapas. Así, debe interpretarse como que especifica la presencia de las características, números enteros, etapas o componentes indicados a los que se hace referencia, pero no excluye la presencia o adición de una o más características, números enteros, etapas o componentes, o grupos de los mismos. Por lo tanto, el alcance de la expresión “ un dispositivo que comprende unos medios A y B” no debe limitarse a dispositivos que consisten en solo los componentes A y B. Esto significa que, con respecto a la presente invención, los únicos componentes relevantes del dispositivo son A y B.
La referencia a lo largo de la presente memoria descriptiva a “ una realización” o “ una realización” significa que un rasgo, estructura o característica particular descrito en relación con la realización se incluye en al menos una realización de la presente invención. Así, las apariciones de la expresión “ en una realización” en varios lugares a lo largo de la presente memoria descriptiva no se refieren necesariamente a la misma realización, pero pueden. Por otra parte, los rasgos, estructuras o características particulares pueden combinarse de cualquier manera adecuada, como resultaría evidente para un experto en la materia a partir de la presente divulgación, en una o más realizaciones.
De manera similar, debe apreciarse que en la descripción de las realizaciones ilustrativas de la invención, varios rasgos de la invención se agrupan a veces en una única realización, figura o descripción de la misma con el fin de simplificar la presente divulgación y ayudar a comprender la invención.
Además, aunque algunas realizaciones descritas en el presente documento incluyen algunas pero no otras características incluidas en otras realizaciones, las combinaciones de características de diferentes realizaciones están destinadas a estar dentro del alcance de la invención y forman diferentes realizaciones, como entenderán los expertos en la materia. Por ejemplo, en las siguientes reivindicaciones, puede utilizarse cualquiera de las realizaciones reivindicadas en cualquier combinación.
En la descripción proporcionada en el presente documento se exponen numerosos detalles específicos. Sin embargo, se entiende que las realizaciones de la invención pueden ponerse en práctica sin estos detalles específicos. En otros casos, no se han mostrado los métodos, estructuras y técnicas bien conocidos en detalle para no oscurecer la comprensión de esta descripción.
Cuando en la presente descripción se hace referencia a un “ sensor” , esto se refiere a un dispositivo de detección, o a una pieza de detección del mismo, al que las moléculas diana de interés puedan unirse de modo que pueda determinarse la presencia o ausencia de estas moléculas unidas. En particular, “ sensor” puede referirse específicamente a un sensor sensible a la masa, es decir, un dispositivo para medir una propiedad que esté relacionada funcionalmente, p. ej., que esté relacionada de forma biyectiva, p. ej., que esté proporcionalmente en escala, con la masa asociada o unida a una superficie sensible del mismo, p. ej., una superficie de detección ensamblada con sondas de captura. El sensor puede estar adaptado para su inmersión en una cámara de reacción cuando se produzca la reacción de unión con tales moléculas diana en una muestra de fluido que se vaya a analizar. En la presente descripción, el término “ sensor” se refiere específicamente a un sensor utilizado para el análisis o detección de moléculas mediante el cual un analito diana interactúa con una sonda de afinidad y las señales generadas por esta interacción se transforman, mediante un mecanismo de detección fisicoquímico, a una forma que pueda medirse y cuantificarse. Un ejemplo de sensor puede ser un sensor óptico, p. ej., un biosensor óptico, que se base en el principio de resonancia de plasmón superficial (SPR), p. ej., un dispositivo de SPR de fibra óptica (FO-SPR). Así, el sensor de fibra óptica puede comprender un dispositivo de resonancia de plasmón de superficie de fibra óptica.
Cuando en lo sucesivo se hace referencia a moléculas diana “ distintas” y a sondas de afinidad “ distintas” , esto se refiere a diferentes entidades de este tipo que tienen una estructura química diferente, p. ej., sustancialmente diferentes en composición química y/o estructura química.
La presente invención se refiere a un método para detectar una pluralidad de moléculas diana distintas en un fluido de muestra.
Con referencia a la FIG. 1 y la FIG. 2, se ilustra un método 10 ilustrativo para detectar una pluralidad de moléculas diana 21 distintas en un fluido 22 de muestra según realizaciones de la presente invención. Este método puede ser un método para el análisis múltiplex de dianas, para identificar las moléculas diana de la pluralidad de moléculas diana distintas que están presentes en el fluido de muestra.
Por ejemplo, las moléculas diana pueden comprender biomoléculas, p. ej., entidades químicas producidas por procesos biológicos y sus análogos semisintéticos o sintéticos. Dichas biomoléculas pueden comprender grandes macromoléculas, tales como proteínas (por ejemplo, proteínas recombinantes y/o naturales), carbohidratos, lípidos y/o ácidos nucleicos. Tales biomoléculas pueden comprender moléculas pequeñas, tales como metabolitos primarios, metabolitos secundarios y productos naturales. Las biomoléculas pueden ser endógenas o exógenas, p. ej., las moléculas diana pueden comprender productos sintéticos, semisintéticos y/o naturales, p. ej., productos farmacéuticos y/o biofarmacéuticos sintéticos.
En un método según realizaciones de la presente invención, las moléculas diana pueden comprender proteínas a detectar en el fluido de muestra. Una de las ventajas de las realizaciones de la presente invención es que se proporciona una detección eficaz y específica de proteínas utilizando sondas de sensor de fibra óptica, p. ej., cuando pueda resultar difícil la desambiguación de la unión de diferentes proteínas diana en el sensor utilizando diferentes características de curva de fusión.
El método 10 comprende la etapa 11 de proporcionar al menos un sensor 23 de fibra óptica, funcionalizado con una pluralidad de distintas sondas 24 de afinidad inmovilizadas sobre una superficie 25 de detección del sensor 23 de fibra óptica. Dicho sensor 23 puede combinar sondas de afinidad, que p. ej. comprendan materiales de origen biológico, con un detector fisicoquímico. Los analitos diana pueden interactuar con las sondas de afinidad, y las señales generadas por esta interacción pueden medirse utilizando un sensor óptico que se base en el principio de resonancia de plasmones superficiales (SPR), p. ej., un dispositivo de SPR de fibra óptica (FO-SPR). Así, el sensor de fibra óptica puede comprender un dispositivo de resonancia de plasmón de superficie de fibra óptica. El sensor puede ser un sensor que se base en la masa.
Por ejemplo, las moléculas diana pueden identificarse mediante el análisis del pico de fusión del ADN utilizando dicho sensor basado en la masa, como se conoce en la técnica. Por ejemplo, proporcionar al menos un sensor 11 de fibra óptica puede comprender proporcionar un sensor de fibra óptica configurado para detectar una señal óptica sensible a la resonancia de plasmones superficiales en la superficie de detección debido a la unión simultánea de las moléculas diana 21 con las correspondientes distintas sondas 24 de afinidad y los correspondientes reactivos de afinidad, analizados más adelante en el presente documento, p. ej., pueden unirse anticuerpos al ADN y este ADN puede hibridarse en la superficie de detección. Puede generarse una señal 29, p. ej., la primera señal, la segunda señal y/o cualquier otra señal a la que se haga referencia más adelante, aumentando la temperatura del sensor de fibra óptica, p. ej., un sensor de resonancia de plasmones superficiales de fibra óptica, y determinar un cambio en la señal óptica representativa de una liberación inducida por la temperatura de las moléculas diana 21 desde la superficie 25 de detección, p. ej., una fusión del ADN hibridado. Este aumento de la temperatura del sensor de fibra óptica puede utilizarse además ventajosamente para regenerar la superficie de detección del sensor de fibra óptica, p. ej., de modo que pueda usarse el mismo sensor de fibra óptica en un etapa de detección adicional.
En un método según realizaciones de la presente invención, la superficie 25 de detección del al menos un sensor de fibra óptica puede estar provista de una estructura de texturización superficial para permitir la unión de las moléculas diana en las correspondientes sondas de afinidad en una orientación predeterminada. Dicha estructura de texturización superficial puede comprender estructuras de ADN autoensambladas, p. ej., nanoestructuras de ADN autoensambladas u origami de ADN autoensamblado, tales como estructuras de tetraedro y/o estructuras de pilar.
Cada sonda 24 de afinidad se une específicamente a una correspondiente molécula diana 21 de la pluralidad de moléculas diana distintas que se detectarán en el fluido 22 de muestra. En realizaciones en las que el al menos un sensor 23 de fibra óptica comprende una pluralidad de sensores de fibra óptica, cada uno de la pluralidad de sensores 23 de fibra óptica está funcionalizado con la misma pluralidad de sondas de afinidad distintas, p. ej., comprende el mismo conjunto de sondas de afinidad distintas para unirse específicamente al mismo conjunto correspondientes de moléculas diana. Una de las ventajas de las realizaciones de la presente invención que pueden usarse sensores 23 de fibra óptica fabricados de manera idéntica para probar una pluralidad posiblemente grande de moléculas diana de manera específica para una diana.
En el método según la presente invención, proporcionar al menos un sensor de fibra óptica comprende proporcionar al menos un sensor de fibra óptica funcionalizado con una pluralidad de sondas de afinidad distintas que comprenden un anticuerpo, un anticuerpo monoclonal, un aptámero, un afímero, un péptido, un ácido nucleico y/u otra molécula pequeña que se una específicamente a una molécula diana de la pluralidad de moléculas diana.
Una de las ventajas de las realizaciones de la presente invención es que puede lograrse una alta eficiencia debido al uso de polivalentes, p. ej., sensores fabricados de manera idéntica, y/o mediante el uso de una única muestra de fluido para analizar una pluralidad posiblemente grande de moléculas diana diferentes. Por ejemplo, una de las ventajas de usar una sola muestra de fluido para analizar una pluralidad de diferentes moléculas diana es que pueden evitarse errores de medición y/o errores sistemáticos inducidos por la preparación de diferentes muestras del mismo material. Una ventaja adicional es que, según realizaciones de la presente invención, puede llevarse a cabo una medición de referencia y/o un control positivo dentro de la misma medición.
Por ejemplo, la FIG. 3 ilustra un sensor ilustrativo para su uso en realizaciones de la presente invención. Este sensor comprende una punta 35 de resonancia de plasmón de superficie de fibra óptica (FO-SPR) a exponer al fluido de muestra, p. ej., mediante inmersión en un depósito. Esta punta 35 puede estar conectada a una fibra óptica 36 bifurcada, estando conectada una bifurcación de dicha fibra a una fuente 37 de luz y la otra bifurcación de dicha fibra a un detector para generar una señal 29 de detección, p. ej., un espectrómetro 38. La punta 35 puede estar en contacto térmico directo o indirecto, p. ej., a través de un medio fluido, con una fuente de calor controlada, p. ej., un termociclador 39, p. ej. de cara a obtener una detección y/o medición cuantitativa por análisis de la curva de fusión.
El método comprende además proporcionar, en la etapa 12, una pluralidad de fluidos reactivos 26. Cada fluido reactivo 26 comprende al menos un reactivo 27 de afinidad para unirse, simultáneamente con una correspondiente sonda 24 de afinidad de la pluralidad de sondas de afinidad distintas, a la correspondiente molécula diana 21. Así, el reactivo 27 de afinidad puede unirse a una correspondiente molécula diana 21, mientras que esta molécula diana 21 puede unirse en paralelo a una correspondiente sonda 24 de afinidad inmovilizada en la superficie 25 de detección del sensor 23.
Cada reactivo 27 de afinidad se une a una nanopartícula metálica 28 para influir en una señal 29 generada por el sensor 23 de fibra óptica cuando el reactivo 27 de afinidad y la correspondiente sonda 24 de afinidad en la superficie 25 de detección del sensor 23 de fibra óptica se unen simultáneamente a la correspondiente molécula diana 21.
Dicha nanopartícula 28 puede ser un elemento de masa adaptado para aumentar la sensibilidad de un ensayo de unión. Por ejemplo, la nanopartícula 28 puede mejorar la señal 29 a detectar por el sensor. Por ejemplo, la nanopartícula puede comprender una nanopartícula de oro (NP Au) que puede resultar ventajosa para mejorar una señal generada por un sensor de resonancia de plasmón de superficie de fibra óptica. Otros materiales de nanopartículas ilustrativos, que también pueden usarse ventajosamente en combinación con un sensor de SPR de fibra óptica, comprenden plata, cobre, platino, rutenio, paladio o una aleación o combinación de dichos metales. La nanopartícula puede tener un diámetro en el intervalo de 2 nm a 100 nm.
En un método según la presente invención, el al menos un reactivo de afinidad comprende un anticuerpo, un anticuerpo monoclonal, un aptámero, un afímero, un péptido, un ácido nucleico y/u otra molécula pequeña que se una específicamente a una molécula diana de la pluralidad de moléculas diana en paralelo con la unión de una correspondiente sonda de afinidad de la pluralidad de sondas de afinidad distintas a la molécula diana.
Cada fluido reactivo 26 tiene una composición diferente que cualquier otro fluido reactivo para permitir la unión del reactivo 27 de afinidad o los reactivos de afinidad en cada fluido reactivo 26 a una molécula diana 21 diferente, o a una combinación diferente de moléculas diana.
El método 10 también comprende exponer, en la etapa 13, el o cada sensor 23 de fibra óptica al fluido 22 de muestra para unir las diferentes moléculas diana 21, cuando estén presentes en el fluido 22 de muestra, a la correspondiente pluralidad de distintas sondas 24 de afinidad inmovilizadas en la superficie 25 de detección del sensor 23 de fibra óptica. En la etapa 13, exponer el sensor de fibra óptica al fluido de muestra puede comprender poner en contacto el sensor de fibra óptica con el fluido de muestra en una cámara de reacción. Por ejemplo, poner en contacto el sensor con el fluido de muestra en una cámara de reacción puede comprender sumergir en el fluido de muestra el sensor de fibra óptica, p. ej., un sensor sensible a la masa tal como un sensor de resonancia de plasmón de superficie de fibra óptica.
En un método según realizaciones de la presente invención, la exposición del sensor de fibra óptica al fluido de muestra puede comprender llevar a cabo una amplificación de ácidos nucleicos de la pluralidad de diferentes moléculas diana, de modo que los ácidos nucleicos diana amplificados de la pluralidad de diferentes moléculas diana formen complejos con la correspondiente pluralidad de sondas de afinidad distintas. Por ejemplo, tal amplificación de ácido nucleico puede comprender una reacción en cadena de polimerasa, una reacción en cadena de ligadura, una amplificación de círculo rodante y/o una amplificación de MNAzima.
El método 10 comprende además en la etapa 14 exponer un primer sensor de fibra óptica del al menos un sensor 23 de fibra óptica a un primer fluido reactivo 30 de la pluralidad de fluidos reactivos 26, y detectar una primera señal 29 generada por el primer sensor 27 de fibra óptica para determinar si una primera molécula diana o cualquiera de una primera combinación de moléculas diana estaba presente en el fluido 26 de muestra. Esta etapa 14 de exponer el primer sensor al primer fluido reactivo puede llevarse a cabo tras la etapa 13 de exponer al menos el primer sensor al fluido de muestra.
En el método según la presente invención, el primer fluido reactivo comprende, para cada molécula diana de la pluralidad de moléculas diana, un correspondiente reactivo de afinidad para la unión simultánea con una correspondiente sonda de afinidad de la pluralidad de sondas de afinidad distintas con la molécula diana, de tal modo que la primera señal detectada forme una señal indicativa de la presencia de cualquiera de la pluralidad de moléculas diana en el líquido de muestra. Una de las ventajas de las realizaciones de la presente invención es que puede obtenerse una exploración rápida para un gran número de moléculas diana al tiempo que se permite una identificación eficaz de las moléculas diana presentes en un acercamiento por etapas.
El método también comprende una etapa 15 de exponer el primer sensor de fibra óptica, o un segundo sensor de fibra óptica del al menos un sensor 23 de fibra óptica, p. ej., el mismo sensor de fibra óptica que se expuso en la etapa 14 al primer fluido reactivo 30, o uno idéntico, a un segundo fluido reactivo 31 de la pluralidad de fluidos reactivos 26, y detectar una segunda señal 29 generada por ese sensor óptico, p. ej., el primer sensor de fibra óptica o respectivamente el segundo sensor de fibra óptica, para determinar si una segunda molécula diana o cualquiera de una segunda combinación de moléculas diana estaba presente en el fluido de muestra.
La etapa 14 de exposición al primer fluido reactivo y la etapa 15 de exposición al segundo fluido reactivo pueden llevarse a cabo consecutivamente. Por ejemplo, las etapas de exponer el sensor o sensores al fluido de muestra, exponiendo en la etapa 14 el primer sensor al primer fluido reactivo y exponiendo en la etapa 15 el primer o segundo sensor al segundo fluido reactivo, pueden llevarse a cabo consecutivamente. En particular, la etapa 15 de exponer el primer o segundo sensor al segundo fluido reactivo puede tener en cuenta la primera señal generada al exponer el primer sensor al primer fluido reactivo, por ejemplo para determinar si el mismo sensor u otro sensor idéntico está expuesto al segundo fluido reactivo, y/o para seleccionar el segundo fluido reactivo de la pluralidad de fluidos reactivos teniendo en cuenta la primera señal.
En el método según la presente invención, si la primera señal indica la presencia de cualquiera de la primera combinación de moléculas diana, la molécula o moléculas diana específicas de la primera combinación que estén presentes en el fluido de muestra pueden determinarse además mediante la segunda señal, en donde el reactivo de afinidad o los reactivos de afinidad en el segundo fluido reactivo forman un primer subconjunto propio de los reactivos de afinidad en el primer fluido reactivo. En la presente divulgación, un subconjunto propio se refiere al concepto matemático por el que cada reactivo de afinidad de componentes presente en el segundo fluido reactivo también estaba presente en el primer fluido reactivo, pero existe al menos un reactivo de afinidad de componentes en el primer fluido reactivo que no está presente en el segundo fluido reactivo. Una de las ventajas de las realizaciones de la presente invención es que las moléculas que no estén presentes en el fluido de muestra pueden eliminarse rápidamente mediante ensayos por etapas.
Según la presente invención, el primer sensor de fibra óptica, o respectivamente el segundo sensor de fibra óptica, puede exponerse al segundo fluido reactivo si, p. ej., si y solo si, la primera señal indica la presencia de la primera molécula diana o de cualquiera de las moléculas diana de la primera combinación de moléculas diana, p. ej., para determinar las moléculas diana presentes en la muestra con mayor precisión.
En un método según realizaciones de la presente invención, el al menos un sensor de fibra óptica puede comprender una pluralidad de sensores de fibra óptica, en donde el segundo sensor de fibra óptica se expone al segundo fluido reactivo si la primera señal fuera indicativa de la presencia de la primera molécula diana o de cualquier molécula diana de la primera combinación de moléculas diana.
En otro método según realizaciones de la presente invención, el primer sensor de fibra óptica puede exponerse al segundo fluido reactivo si, p. ej., si y solo si, la primera señal fuera indicativa de la ausencia de la primera molécula diana o de todas las moléculas diana de la primera combinación de moléculas diana. Por ejemplo, una de las ventajas de las realizaciones de la presente invención es que puede reutilizarse un sensor de fibra óptica fácilmente para pruebas adicionales si no se observara unión a las moléculas de ensayo. Además, esto puede aplicarse igualmente a la exposición a otro fluido reactivo como se describe más adelante en el presente documento.
Por ejemplo, el primer sensor de fibra óptica puede exponerse al segundo fluido reactivo si, p. ej., si y solo si, la primera señal indica la presencia de la primera molécula diana o de cualquiera de las moléculas diana de la primera combinación de moléculas diana, p. ej., para determinar las moléculas diana presentes en la muestra con mayor precisión. Suponiendo la presencia de cualquier primera molécula diana, el segundo fluido reactivo puede contener un subconjunto propio de los reactivos de afinidad presentes en el primer fluido reactivo. Suponiendo la presencia de cualquier segunda molécula diana, un fluido reactivo adicional puede contener un subconjunto propio de los reactivos de afinidad presentes en el segundo fluido reactivo. Sin embargo, en ausencia de todas las segundas moléculas diana, un fluido reactivo adicional puede contener un subconjunto propio complementario de los reactivos de afinidad presentes en el primer fluido reactivo, p. ej., complementario al primer subconjunto propio formado por los reactivos de afinidad presentes en el segundo fluido reactivo. Este principio de eliminación por etapas y/o de ensayo más específico puede aplicarse en otras etapas adicionales de ensayo de fluidos reactivos adicionales.
En un método según realizaciones de la presente invención, el primer fluido reactivo puede comprender, para cada molécula diana de la pluralidad de moléculas diana, un correspondiente reactivo de afinidad para la unión simultánea con una correspondiente sonda de afinidad de la pluralidad de sondas de afinidad distintas con la molécula diana, de tal modo que la primera señal detectada forme una señal de exploración general indicativa de la presencia de cualquiera de la pluralidad de moléculas diana en el líquido de muestra.
Un método según realizaciones de la presente invención puede comprender además la etapa 16 de exponer el o cualquiera del al menos un sensor de fibra óptica a un fluido reactivo 32 adicional de la pluralidad de fluidos reactivos, y detectar una señal 29 adicional generada por el sensor de fibra óptica así expuesto para determinar si al menos una molécula diana adicional, o cualquiera de una combinación adicional de moléculas diana, estaba presente en el fluido de muestra. Esta etapa adicional puede llevarse a cabo tras la etapa 15 de exponer el sensor al segundo fluido reactivo. Nuevamente, en un método según realizaciones de la presente invención, si la segunda señal fuera indicativa de la presencia de cualquiera de la segunda combinación de moléculas diana, la molécula o moléculas diana específicas de la segunda combinación que estén presentes en el fluido de muestra pueden determinarse además mediante la señal adicional, en la que el reactivo de afinidad o los reactivos de afinidad en el fluido reactivo adicional forman un segundo subconjunto propio de los reactivos de afinidad en el segundo fluido reactivo.
Por lo tanto, en un método según realizaciones de la presente invención, el uno o más reactivos de afinidad en el fluido reactivo adicional pueden formar un segundo subconjunto propio de los reactivos de afinidad en el primer fluido reactivo, en el que este segundo subconjunto propio es complementario al primer subconjunto propio.
En un método según realizaciones de la presente invención, el número de reactivos de afinidad en el segundo subconjunto propio puede estar en el intervalo de un 50 % a un 150 % del número de reactivos de afinidad en el primer subconjunto propio. Por ejemplo, si se detectara la ausencia de todos los reactivos de afinidad en la segunda combinación de moléculas diana, el segundo subconjunto propio formado por los reactivos de afinidad en el fluido reactivo adicional puede seleccionarse como un subconjunto propio complementario de los reactivos de afinidad en el primer líquido reactivo. En tal caso, cada uno del primer subconjunto propio y el segundo subconjunto propio puede consistir en subconjuntos complementarios de los reactivos de afinidad presentes en el primer fluido reactivo, en el que el primer subconjunto propio y el segundo subconjunto propio contienen un número aproximadamente igual de reactivos de afinidad.
Por lo tanto, una de las ventajas de las realizaciones de la presente invención es que las moléculas que no estén presentes en el fluido de muestra pueden eliminarse rápidamente mediante ensayos por etapas para conjuntos complementarios de aproximadamente el mismo tamaño.
Una de las ventajas de las realizaciones de la presente invención es que pueden usarse sensores de fibra óptica idénticos al tiempo que se permite el ensayo específico de una pluralidad de moléculas de interés en un procedimiento por etapas. Una ventaja adicional es que no resulta necesario fabricar y funcionalizar sensores de fibra óptica distintos específicamente para ensayos en diferentes moléculas.
En un método según realizaciones de la presente invención, el sensor de fibra óptica, p. ej., que comprende una punta de fibra óptica que tiene una superficie de detección en la que se inmovilizan la pluralidad de sondas de afinidad distintas, puede exponerse al fluido de muestra para unir las diferentes moléculas diana, p. ej., para que las moléculas diana en el fluido de muestra se unan a las sondas de afinidad distintas al exponer la punta de la fibra óptica al fluido de muestra.
En ejemplos que no están dentro del alcance de la presente invención, el método puede comprender, después de exponer el sensor de fibra óptica al fluido de muestra, p. ej., sumergiendo la punta de fibra óptica en el fluido de muestra, una etapa de mover el sensor de fibra óptica, p. ej., la punta de fibra óptica, al primer fluido reactivo y exponer el sensor de fibra óptica, p. ej., la punta de fibra óptica, al primer fluido reactivo. Este movimiento y exposición pueden comprender una exposición secuencial del sensor de fibra óptica a una pluralidad de fluidos reactivos diferentes.
Por ejemplo, este movimiento y exposición pueden llevarse a cabo utilizando un sistema de posicionamiento tridimensional, p. ej., un bastidor accionado que tenga al menos tres grados de libertad, p. ej., tres grados de traslación. Dicho sistema de posicionamiento puede comprender un controlador, que controle el movimiento del sensor de fibra óptica desde el fluido de muestra hasta el fluido reactivo o a lo largo de una secuencia de fluidos reactivos. Sin embargo, simultáneamente puede moverse otro sensor de fibra óptica entre la muestra (u otra muestra) y los fluidos reactivos, y exponerlo a los mismos de manera sincronizada, p. ej., para evitar la colisión del anterior sensor de fibra óptica y el otro sensor de fibra óptica. Por lo tanto, puede controlarse un sistema de posicionamiento tridimensional, p. ej., un robot de posicionamiento, para mover uno o más sensores de fibra óptica. Así, puede lograrse un uso eficiente y flexible de una pluralidad de fluidos de muestra, sensores de fibra óptica y fluidos reactivos, p. ej., mediante el control optimizado del tiempo de ejecución de la secuencia de movimiento de uno o más sensores de fibra óptica.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    Un método (10) para detectar una pluralidad de moléculas diana (21) distintas en un fluido (26) de muestra, comprendiendo el método:
    -proporcionar (11) al menos un sensor (23) de fibra óptica que tiene una superficie (25) de detección, estando configurado el sensor para detectar una señal óptica (29) sensible a la resonancia de plasmón superficial en la superficie (25) de detección, y funcionalizado con una pluralidad de sondas (24) de afinidad distintas seleccionadas de un anticuerpo, un anticuerpo monoclonal, un aptámero, un afímero, un péptido, un ácido nucleico y/u otra molécula pequeña que se una específicamente a una molécula diana de la pluralidad de moléculas diana (21) distintas, inmovilizándose dichas sondas (24) de afinidad sobre la superficie (25) de detección de dicho sensor (23) de fibra óptica, uniéndose específicamente cada sonda (24) de afinidad a una correspondiente molécula diana de dicha pluralidad de moléculas diana (21) distintas a detectar en dicho fluido (26) de muestra, en donde, si el al menos un sensor (23) de fibra óptica comprende una pluralidad de sensores de fibra óptica, cada uno de dicha pluralidad de sensores de fibra óptica está funcionalizado con una misma pluralidad de sondas (24) de afinidad distintas;
    -proporcionar (12) una pluralidad de fluidos reactivos (26), comprendiendo cada fluido reactivo una pluralidad de reactivos (27) de afinidad a seleccionar de entre un anticuerpo, un anticuerpo monoclonal, un aptámero, un afímero, un péptido, un ácido nucleico y/u otra molécula pequeña que se una específicamente a una molécula diana de la pluralidad de moléculas diana (21) distintas en paralelo con dicha unión de una correspondiente sonda de afinidad de la pluralidad de sondas (24) de afinidad distintas a dicha molécula diana (21), uniéndose cada reactivo de afinidad a una nanopartícula metálica (28) para mejorar la señal óptica (29) debido a la unión simultánea de una molécula diana (21) con una correspondiente sonda (24) de afinidad distinta y al menos uno de los correspondientes reactivos (27) de afinidad, en donde cada fluido reactivo (26) tiene una composición diferente a la de los demás fluidos reactivos para permitir la unión del reactivo de afinidad o los reactivos (27) de afinidad de cada fluido reactivo (26) a una diferente molécula diana (21) o a una diferente combinación de moléculas diana;
    -exponer (13) el o cada sensor (23) de fibra óptica a dicho fluido (22) de muestra para unir dichas diferentes moléculas diana (21), cuando estén presentes en el fluido de muestra, a dicha correspondiente pluralidad de sondas (24) de afinidad distintas;
    -exponer (14) un primer sensor de fibra óptica del al menos un sensor (23) de fibra óptica a un primer fluido reactivo (30) de dicha pluralidad de fluidos reactivos (26), y detectar una primera señal óptica generada por dicho primer sensor (23) de fibra óptica para determinar si una primera molécula diana o cualquiera de una primera combinación de moléculas diana está presente en el fluido (22) de muestra; y
    -exponer (15) el mismo primer sensor de fibra óptica, o un segundo sensor de fibra óptica idéntico del al menos un sensor (23) de fibra óptica, a un segundo fluido reactivo (31) de dicha pluralidad de fluidos reactivos (26), y detectar una segunda señal óptica generada por el primer sensor de fibra óptica, o respectivamente por el segundo sensor de fibra óptica, para determinar si una segunda molécula diana o cualquiera de una segunda combinación de moléculas diana está presente en el fluido (22) de muestra,
    en donde los fluidos reactivos (30, 31) están en contacto térmico con una fuente (39) de calor controlada y dichas señales ópticas (29) se monitorean mientras se aumenta la temperatura de dicha superficie (25) de detección, y en donde se detecta un cambio en la señal óptica monitoreada (29), que es representativo de una liberación inducida por la temperatura de las moléculas diana (21) desde la superficie (25) de detección, para determinar si las moléculas diana están presentes en el fluido (22) de muestra y están unidas a la superficie de detección por sondas de afinidad y reactivos de afinidad,
    en donde, si dicha primera señal indica la presencia de cualquiera de dicha primera combinación de moléculas diana, se determina además la molécula o moléculas diana específicas de dicha primera combinación presente en el fluido (22) de muestra mediante dicha segunda señal, en donde los reactivos de afinidad del segundo fluido reactivo (31) forman un primer subconjunto propio de los reactivos de afinidad del primer fluido reactivo (30).
    El método según la reivindicación 1, que comprende además exponer el o cualquiera del al menos un sensor (23) de fibra óptica a otro fluido reactivo (32) de dicha pluralidad de fluidos reactivos, y detectar una señal óptica adicional generada por el sensor de fibra óptica así expuesto para determinar si al menos una molécula diana adicional, o cualquiera de una combinación adicional de moléculas diana, está presente en el fluido (22) de muestra.
    El método según la reivindicación 2, en donde los reactivos de afinidad en el fluido reactivo (32) adicional forman un segundo subconjunto propio de los reactivos de afinidad en el primer fluido reactivo (30), siendo dicho segundo subconjunto propio complementario a dicho primer subconjunto propio.
    4. El método según la reivindicación 3, en donde el número de reactivos de afinidad en dicho segundo subconjunto propio está en el intervalo del 50 % al 150 % del número de reactivos de afinidad en el primer subconjunto propio.
    5. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el primer fluido reactivo (30) comprende, para cada molécula diana de la pluralidad de moléculas diana (21), un correspondiente reactivo de afinidad para la unión simultánea con una correspondiente sonda de afinidad de la pluralidad de sondas (24) de afinidad distintas a dicha molécula diana, de tal modo que la primera señal detectada forme una señal indicativa de la presencia de cualquiera de la pluralidad de moléculas diana (21) en el líquido (22) de muestra.
    6. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dichas moléculas diana (21) comprenden proteínas a detectar en dicho fluido (22) de muestra.
    7. El método según la reivindicación 1, en donde dicha superficie (25) de detección del al menos un sensor (23) de fibra óptica está provista de una estructura de texturización superficial para permitir la unión de las moléculas diana (21) sobre las correspondientes sondas (24) de afinidad en una orientación predeterminada.
    8. El método según la reivindicación 7, en donde dicha estructura de texturización superficial comprende estructuras de ADN autoensambladas.
    9. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha exposición (13) del sensor (23) de fibra óptica a dicho fluido (22) de muestra comprende poner en contacto el sensor (23) de fibra óptica con el fluido (22) de muestra en una cámara de reacción.
    10. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha exposición (13) del sensor (23) de fibra óptica a dicho fluido (22) de muestra comprende llevar a cabo una amplificación de ácido nucleico de la pluralidad de diferentes moléculas diana, de tal modo que los ácidos nucleicos diana amplificados de la pluralidad de diferentes moléculas diana (21) forme complejos con dicha correspondiente pluralidad de sondas (24) de afinidad distintas.
    11. El método según la reivindicación 10, en donde dicha amplificación de ácido nucleico comprende una reacción en cadena de polimerasa, una reacción en cadena de ligadura, una amplificación de círculo rodante y/o una amplificación de MNAzima.
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