ES2959683T3 - Células manipuladas para terapia celular adoptiva - Google Patents

Abstract

Se proporcionan células diseñadas para terapia adoptiva, incluidas células NK y células T. También se proporcionan composiciones para diseñar y producir las células, composiciones que contienen las células y métodos para su administración a los sujetos. En algunos aspectos, las características de las células y los métodos proporcionan especificidad y/o eficacia. En algunas realizaciones, las células contienen receptores de antígenos diseñados genéticamente que se unen específicamente a antígenos, tales como receptores de antígenos quiméricos (CAR) y receptores coestimuladores. En algunas realizaciones, las células incluyen receptores que se dirigen a múltiples antígenos. En algunas realizaciones, las células incluyen la represión de uno o más productos génicos, por ejemplo, mediante alteración de un gen que codifica el producto génico. En algunas realizaciones, un gen que codifica un antígeno reconocido por el receptor de antígeno diseñado se altera, lo que reduce la probabilidad de atacar las células diseñadas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Células manipuladas para terapia celular adoptiva

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica prioridad de la solicitud provisional de Estados Unidos N° 62/025.006, presentada el 15 de julio de 2014.

Listado de secuencias

La presente solicitud se presenta junto con un listado de secuencias en formato electrónico. El listado de secuencias se presenta como un archivo titulado 735042000540seqlist.txt, creado el 15 de julio de 2015, que tiene un tamaño de 43 kilobytes.

Campo

La presente divulgación se refiere en algunos aspectos a células manipuladas para terapia adoptiva, incluyendo células NKy células T. En algunos aspectos, la divulgación se refiere además a métodos y composiciones para la manipulación y producción de las células, composiciones que contienen las células, y métodos para su administración a sujetos. En algunos aspectos, las características de las células y los métodos proporcionan especificidad y/o eficacia. En algunas realizaciones, las células contienen receptores de antígenos manipulados genéticamente que se unen específicamente a antígenos, como receptores de antígenos quiméricos (CAR) y receptores coestimuladores. En algunas realizaciones, las células incluyen receptores dirigidos a múltiples antígenos. Las células pueden incluir la represión de uno o más productos génicos, por ejemplo, mediante la alteración de un gen que codifica el producto génico. Un gen que codifica un antígeno reconocido por el receptor de antígeno manipulado puede estar alterado, lo que reduce la probabilidad de que las células manipuladas se dirijan al mismo.

Antecedentes

Hay disponibles varias estrategias para producir y administrar células manipuladas para terapia adoptiva. Por ejemplo, hay disponibles estrategias para diseñar células inmunitarias que expresen receptores de antígenos manipulados genéticamente, como los CAR, y para suprimir o reprimir la expresión génica en las células. Se necesitan estrategias mejoradas, por ejemplo, para proporcionar un intervalo más amplio de antígenos objetivo y enfermedades que puedan tratarse usando tales células, para mejorar la especificidad o selectividad de las células, por ejemplo, para evitar efectos fuera de objetivo, y para mejorar la eficacia de las células, por ejemplo, evitando la supresión de funciones efectoras y mejorando la actividad y/o supervivencia de las células tras la administración a sujetos. Se divulgan métodos, células, composiciones, kits y sistemas que satisfacen tales necesidades.

Mihara et al., J. Immunother. (2009) 32:737-743 describe inmunoterapia mediada por células T activadas con un receptor quimérico contra CD38 en el linfoma no Hodgkin de células B.

Sumario

La invención proporciona una célula inmunitaria manipulada que comprende: un receptor de antígeno manipulado genéticamente que se une específicamente a un antígeno objetivo, en donde el antígeno objetivo es ciclina D1; y una alteración genética en un gen que codifica el antígeno objetivo, en donde la alteración genética se selecciona entre una inserción, una mutación de desplazamiento de marco, una mutación sin sentido, una deleción, una activación, y una desactivación del gen o parte del gen, o la deleción de todo el gen, y da como resultado la ausencia completa de expresión de un producto de tipo salvaje codificado por el gen en comparación con la expresión en la célula inmunitaria en ausencia de dicha alteración genética. La invención también proporciona un métodoin vitropara producir una célula inmunitaria manipulada genéticamente, que comprende: (a) introducir en una célula inmunitaria un receptor de antígeno manipulado genéticamente que se une específicamente a un antígeno objetivo, en donde el antígeno objetivo es ciclina D1; y (b) efectuar la represión de la expresión del antígeno objetivo en la célula inmunitaria, en donde la represión de la expresión comprende la alteración de un gen que codifica el antígeno objetivo, produciendo de este modo una célula inmunitaria manipulada genéticamente en la que se reprime la expresión del antígeno objetivo, dando como resultado la ausencia completa de expresión del producto de tipo salvaje codificado por el gen en comparación con la expresión en la célula inmunitaria en ausencia de dicha alteración genética, en donde los pasos (a) y (b) se llevan a cabo simultánea o secuencialmente en cualquier orden. La invención también proporciona una célula producida por el método de la invención. La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende la célula inmunitaria manipulada de la invención o la célula producida por el método de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable. La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende la célula inmunitaria manipulada la invención, la célula producida por el método de la invención, o la composición farmacéutica de la invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afección en un sujeto.

Se proporcionan células, incluyendo células manipuladas, como células inmunitarias o inmunoestimuladoras manipuladas, así como métodos para producir y usar las células, como en terapia adoptiva, y composiciones, como composiciones farmacéuticas, que contienen las células, de acuerdo con las reivindicaciones. Entre las células se encuentran aquellas que tienen una o más características, como características de direccionamiento de antígeno dual y/o alteraciones genéticas, que por sí solas o colectivamente proporcionan una seguridad, especificidad, selectividad y/o eficacia mejoradas, y/o permiten el direccionamiento de una variedad más amplia de antígenos o enfermedades mediante terapia celular adoptiva.

En algunas realizaciones, las células son células inmunitarias manipuladas genéticamente que incluyen: un receptor de antígeno manipulado genéticamente que se une específicamente a un antígeno objetivo, en donde el antígeno objetivo es ciclina D1; y una alteración genética en un gen que codifica el antígeno objetivo, en donde la alteración genética se selecciona entre una inserción, una mutación de desplazamiento de marco, una mutación sin sentido, una deleción, una activación, y una desactivación del gen o parte del gen, o la deleción de todo el gen, y da como resultado la ausencia completa de expresión de un producto de tipo salvaje codificado por el gen en comparación con la expresión en la célula inmunitaria en ausencia de dicha alteración genética. En algunos aspectos, el antígeno objetivo es un antígeno expresado en la superficie de células T en reposo, células T activadas, o ambas. En algunos aspectos, el antígeno objetivo se expresa en la superficie celular en un cáncer, como un cáncer hematológico, un cáncer inmunitario, una leucemia, un linfoma y/o un mieloma, como el mieloma múltiple.

En algunos aspectos, como cuando el receptor de antígeno induce una señal activadora o que provoca una respuesta inmunitaria dirigida a las células que expresan el antígeno objetivo, el antígeno objetivo es uno que se expresa en una enfermedad o afección que se va a tratar, como el cáncer, pero que también se expresa normalmente en la célula que se manipula o se presenta para la terapia celular adoptiva. En algunos aspectos, ese antígeno objetivo es un antígeno tumoral universal, en algunos aspectos uno que se expresa de manera natural sobre o en las células manipuladas y/o se expresa sobre o en o la expresión del cual se regula por incremento sobre o en células T activadas. En la invención reivindicada, el antígeno tumoral universal es la ciclina D1.

En algunas realizaciones, el antígeno es un producto génico que se expresa de manera natural en el tipo celular de la célula manipulada. En algunas realizaciones, la alteración comprende una deleción de por lo menos una parte de por lo menos un exón del gen; comprende una deleción, mutación y/o inserción en el gen que da como resultado la presencia de un codón de parada prematuro en el gen; y/o comprende una deleción, mutación y/o inserción dentro de un primer o segundo exón del gen.

Entre los tipos celulares se encuentran las células T, las células NK, las células T CD4+, las células T CD8+ y las células madre, como las células madre pluripotentes inducidas (células iPS).

En algunas realizaciones, el receptor de antígeno manipulado genéticamente es capaz de inducir una señal activadora a la célula. En algunos aspectos, el receptor de antígeno manipulado genéticamente comprende un dominio intracelular con un motivo que contiene ITAM. En algunos aspectos, el receptor de antígeno manipulado genéticamente es un receptor de células T (TCR) o un receptor de reconocimiento de antígeno no TCR funcional. En algunos aspectos, es un receptor de antígeno quimérico (CAR), como un CAR activador o estimulador, un CAR inhibidor y/o un CAR coestimulador. Entre los CAR están los que tienen un dominio extracelular de reconocimiento de antígeno que se une específicamente al antígeno objetivo y un dominio de señalización intracelular que comprende un ITAM, como un dominio intracelular de una cadena CD3-zeta (CD3Z) los que comprenden además una región de señalización coestimuladora, como un dominio de señalización de CD28 o 41BB. En algunos aspectos, el CAR comprende un dominio extracelular de reconocimiento de antígeno que se une específicamente al antígeno objetivo y un dominio de señalización intracelular que comprende una parte de señalización de una molécula de punto de control inmunitario, como PD-1 o CTLA4.

En algunos aspectos, la célula comprende otro receptor de antígeno manipulado genéticamente, como un receptor coestimulador, como un receptor coestimulador quimérico, que se une específicamente a otro antígeno y es capaz de inducir una señal coestimuladora a la célula. En algunos aspectos, dicho otro antígeno objetivo y el primer antígeno objetivo reconocido por el primer receptor son distintos. En algunas realizaciones, por lo menos uno de tales antígenos es ciclina D1; y el otro es otro antígeno expresado en un tumor o cáncer, y en algunos casos se expresa en un tipo particular de tumor o cáncer, y no en uno o más de ciertos otros tipos de cáncer. En algunos aspectos, dicho otro antígeno es un antígeno asociado a mieloma múltiple o específico de mieloma múltiple, como CD38 o CD138 o BCMA o CS-1; en algunos aspectos, dicho otro antígeno se expresa en uno o más cánceres de la sangre o en uno o más tipos de tumores sólidos. En algunos de tales aspectos, la célula comprende además un receptor de antígeno adicional manipulado genéticamente que reconoce un antígeno expresado en una enfermedad o afección a tratar e induce una señal estimuladora o activadora, que es amortiguada por el primer receptor de antígeno manipulado genéticamente.

También se proporcionan métodosin vitropara producir las células y las células producidas por tales métodos. En algunas realizaciones, los métodos se llevan a cabo (a) introduciendo en una célula inmunitaria un receptor de antígeno manipulado genéticamente que se une específicamente a un antígeno objetivo, en donde el antígeno objetivo es ciclina D1; y (b) efectuando la represión de la expresión del antígeno objetivo en la célula inmunitaria, en donde la represión de la expresión comprende interrumpir un gen que codifica el antígeno objetivo, produciendo de este modo una célula inmunitaria manipulada genéticamente en la que se reprime la expresión del antígeno objetivo, lo que da como resultado la ausencia completa de expresión del producto de tipo salvaje codificado por el gen en comparación con la expresión en la célula inmunitaria en ausencia de dicha alteración genética. En la invención reivindicada, los pasos (a) y (b) se llevan a cabo simultánea o secuencialmente en cualquier orden.

En la invención reivindicada, la realización en (b) comprende la alteración de un gen que codifica el antígeno objetivo. En algunas realizaciones, la alteración comprende alterar el gen a nivel del ADN y/o la alteración no es reversible; y/o la alteración no es transitoria. En algunos aspectos, la alteración comprende introducir en la célula inmunitaria una proteína de unión al ADN o un ácido nucleico de unión al ADN que se une específicamente al gen o hibrida con el mismo.

En algunas realizaciones, la alteración comprende la introducción de: (a) una proteína de fusión que comprende una proteína dirigida al ADN y una nucleasa o (b) una nucleasa guiada por ARN. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la proteína dirigida al ADN o la nucleasa guiada por ARN comprende una proteína de dedo de zinc (ZFP), una proteína TAL o un ácido nucleico palindrómico corto agrupado y regularmente interespaciado (CRISPR) específico para el gen. En algunas realizaciones, la alteración comprende la introducción de una nucleasa de dedos de zinc (ZFN), una nucleasa de efecto TAL (TALEN) o una combinación de CRISPR-Cas9 que se une, reconoce o hibrida específicamente con el gen. En algunas realizaciones, la introducción se lleva a cabo introduciendo en la célula un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica la proteína de unión al ADN, el nucleótido de unión al ADN, y/o el complejo que comprende la proteína de unión al ADN o el nucleótido de unión al ADN. En algunas realizaciones, el ácido nucleico es un vector viral.

En algunas realizaciones, la unión específica al gen está dentro de un exón del gen y/o está dentro de una parte del gen que codifica un extremo N-terminal del antígeno objetivo. En algunas realizaciones, la introducción de este modo efectúa una mutación de desplazamiento de marco en el gen y/o una inserción de un codón de parada temprana dentro de la región codificante del gen.

En algunas realizaciones, los métodos incluyen además (c) introducir otro receptor de antígeno manipulado genéticamente, que es un receptor coestimulador quimérico que se une específicamente a otro antígeno y es capaz de inducir una señal coestimuladora a la célula, en donde los pasos (a), (b) y (c) se llevan a cabo simultánea o secuencialmente en cualquier orden. También se proporcionan células producidas por los métodos.

Las células manipuladas genéticamente también pueden comprender: (a) un primer receptor de antígeno manipulado genéticamente, que se une específicamente a un primer antígeno y es capaz de inducir una señal activadora a la célula; (b) un segundo receptor de antígeno manipulado genéticamente, que es un receptor coestimulador como un receptor coestimulador quimérico que se une específicamente a un segundo antígeno y es capaz de inducir una señal coestimuladora a la célula (como una que es necesaria para la activación completa de la célula o una función efectora particular de la misma tras la unión del primer receptor a su antígeno), de acuerdo con las reivindicaciones. En algunos de tales casos, el primer y el segundo antígenos son distintos y, por lo menos uno se selecciona del grupo que consiste en transcriptasa inversa de telomerasa humana (hTERT), survivina, homólogo de minuto 2 doble de ratón (MDM2), citocromo P450 1B1 (CYP1B), HER2/neu, gen 1 del tumor de Wilms (WT1), livina, alfafetoproteína (AFP), antígeno carcinoembrionario (CEA), mucina 16 (MUC16), MUC1, antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA), p53 y ciclina (D1).

En algunas realizaciones, las células manipuladas comprenden: (a) un primer receptor de antígeno manipulado genéticamente, que se une específicamente a un primer antígeno y es capaz de inducir una señal activadora a la célula; (b) un segundo receptor de antígeno manipulado genéticamente, que es un receptor coestimulador como un receptor coestimulador quimérico que se une específicamente a un segundo antígeno y es capaz de inducir una señal coestimuladora a la célula (como una que es necesaria para la activación completa de la célula o una función efectora particular de la misma tras la unión del primer receptor a su antígeno), de acuerdo con las reivindicaciones.

En algunas realizaciones, la célula inmunitaria manipulada comprende (a) un primer receptor de antígeno manipulado genéticamente que se une específicamente a un primer antígeno y es capaz de inducir una señal activadora a la célula; y (b) un segundo receptor de antígeno manipulado genéticamente que es un receptor coestimulador quimérico que se une específicamente a un segundo antígeno y es capaz de inducir una señal coestimuladora a la célula, en donde el primer y el segundo antígenos son distintos y el primer o el segundo antígeno es CS-1, de acuerdo con las reivindicaciones.

En algunas realizaciones, el segundo antígeno es un antígeno expresado en el mieloma múltiple.

En algunas realizaciones, el primer receptor de antígeno manipulado genéticamente comprende una secuencia que contiene ITAM, el primer receptor de antígeno manipulado genéticamente comprende un dominio de señalización intracelular de una cadena CD3-zeta (CD3Z), y/o el primer receptor de antígeno manipulado genéticamente no comprende un dominio de señalización de una molécula coestimuladora de células T, como una que tenga un dominio de señalización intracelular de una molécula coestimuladora de células T, tales una o más moléculas seleccionadas del grupo que consiste en CD28 y 41BB.

En algunos casos, la célula comprende además un tercer receptor de antígeno manipulado genéticamente que reconoce un tercer antígeno.

En algunos aspectos, el primer receptor de antígeno manipulado genéticamente contiene un dominio de reconocimiento de antígeno extracelular que se une específicamente al primer antígeno objetivo a una constante de disociación (K<d>) de por lo menos 10-8 M, por lo menos 10-7 M, por lo menos 10-6 M, por lo menos 10-5 M, 10-5 M, o 10 4 M. En algunos aspectos, la ligadura del primer receptor de antígeno manipulado genéticamente y la ligadura del segundo receptor de antígeno manipulado genéticamente induce una respuesta en la célula, dicha respuesta no es inducida por la ligadura de cualquiera de los receptores de antígeno manipulados genéticamente solos.

En algunas realizaciones, la respuesta se selecciona del grupo que consiste en proliferación, secreción de una citoquina y actividad citotóxica. En algunas realizaciones, la célula comprende además una alteración en un gen que codifica el primer antígeno, y/o en un gen que codifica el segundo antígeno, dicha alteración resultando en una expresión reducida del primer y/o el segundo antígeno en la célula inmunitaria manipulada, como por alteración como se describe en la presente, por ejemplo, cuando el gen alterado codifica CD38, de acuerdo con las reivindicaciones.

También se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden las células de la invención, y un portador farmacéuticamente aceptable, de acuerdo con las reivindicaciones. La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende la célula inmunitaria manipulada de la invención, la célula producida por el método de la invención, o la composición farmacéutica de la invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afección en un sujeto. La enfermedad o afección incluye cánceres y enfermedades infecciosas, como cánceres hematológicos, leucemias, linfomas y mieloma múltiple.

Descripción detallada

Las realizaciones de la invención se describen en algunos de los casos y aspectos divulgados a continuación. Cualquier referencia a métodos para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia en la presente se refiere a las composiciones farmacéuticas de la invención para su uso en dichos métodos.

I. Composiciones y métodos que proporcionan especificidad y/o eficacia en terapia celular adoptiva

Se divulgan células para terapia celular adoptiva, por ejemplo, inmunoterapia adoptiva. Las células incluyen células inmunitarias como células T y células NK, y generalmente expresan receptores de antígenos manipulados genéticamente como TCR manipulados y/o receptores de antígenos quiméricos (CAR). También se divulgan métodos y usos de las células, como en la terapia adoptiva en el tratamiento de cánceres, incluyendo el mieloma múltiple (MM). También se divulgan métodos para la manipulación, preparación y producción de las células, composiciones que contienen las células, y kits y dispositivos que contienen y para usar, producir y administrar las células. En algunos casos, los casos proporcionan una selectividad, especificidad y/o eficacia mejoradas de la terapia celular adoptiva específica de antígeno, y/o amplían el alcance de las enfermedades, afecciones y/o antígenos objetivo a los que puede dirigirse la terapia celular adoptiva.

Por lo general, las células se manipulan introduciendo uno o más ácidos nucleicos manipulados genéticamente o productos derivados. Entre estos productos se encuentran los receptores de antígenos manipulados genéticamente, incluyendo los receptores de células T (TCR) manipulados genéticamente y los receptores de antígenos no TCR funcionales, como los receptores de antígenos quiméricos (CAR), incluyendo CAR activadores, estimuladores y coestimuladores, y combinaciones de los mismos.

También entre las células se encuentran aquellas en las que se han alterado ciertos genes, incluyendo los genes que codifican el antígeno reconocido por un receptor antigénico quimérico (CAR) u otros receptores de antígenos manipulados expresados por las células. En algunos casos, el gen reprimido es un gen que codifica un antígeno al que se dirige el receptor de antígeno manipulado genéticamente, como un CAR activador, inhibidor o coestimulador. Por tanto, también se divulgan ácidos nucleicos que efectúan la represión de la expresión y/o la alteración de genes endógenos, como por edición de genes. También se divulgan células con expresión reducida de un gen o genes y métodos para efectuar la represión.

En algunos casos, por ejemplo, en el contexto de un receptor de antígeno activador o coestimulador, por ejemplo, CAR activador o CAR coestimulador, la represión de un gen que codifica un antígeno expresado en las células manipuladas evita o reduce la probabilidad de que las propias células manipuladas se conviertan en objetivo para su destrucción o inhibición, mejorando de este modo la eficacia de la terapia celular adoptiva y/o la persistencia o expansión de las células en la misma. Por tanto, en algunos aspectos, dicha alteración evita o reduce la probabilidad de que las células manipuladas se conviertan en objetivo de las propias células manipuladas.

Por ejemplo, las células específicas de antígenos, como las células T específicas de antígenos, dirigidas contra antígenos también expresados por tales células, pueden inducir la muerte fratricida de las células. En algunos casos, se observa la muerte fratricida de células T en cultivos de células T específicas de antígenos contra survivina, hTERT, p53 y otros, que son antígenos proteicos expresados en células T activadas (Turksma et al. (2013) Journal of Translational Medicine, 11:152; Leisegang et al. (2010) J Clin. Invest., 120:3869-3877; Chen et al. (2007) Cancer Biol Ther., 6:1991-1996; Theoret et al. (2008) Hum Gene Ther., 19:1219-1232). Los métodos para detectar el fratricidio, como la autodestrucción, de las células inmunitarias pueden incluir, por ejemplo, métodos en los que las células T manipuladas genéticamente con un receptor de antígeno (por ejemplo, TCR o CAR u otro receptor de antígeno) se cultivanin vitro,por ejemplo, durante hasta 2 semanas, y se monitorizan a lo largo del tiempo usando cualquiera de una variedad de ensayos de proliferación, viabilidad y/o citotoxicidad celular. En algunos casos, las células cultivadas pueden teñirse con 7-AAD u otro colorante u otro reactivo usado para discriminar la viabilidad y la muerte celular o la apoptosis o la activación de vías apoptóticas. En algunos ejemplos, la citotoxicidad inducida por la muerte fratricida de células inmunitarias específicas de antígenos puede evaluarse usando un ensayo de citotoxicidad, como un ensayo para evaluar la liberación de cromo. En algunos casos, la autodestrucción de las propias células inmunitarias que expresan el receptor de antígeno manipulado genéticamente puede limitar los métodos de uso de determinadas células inmunitarias específicas de antígeno en terapia celular adoptiva, ya que dichas células pueden eliminarse mediante la destrucción fratricidaex vivoantes de la administración y/o se eliminan tras la administraciónin vivo.La autodestrucción de células manipuladas genéticamente dentro de una población puede producirse por la destrucción de una sola célula dentro de dicha población de células manipuladas genéticamente por la misma célula o por células dentro de la población que se destruyen unas a otras.

Se divulgan células y métodos que superan tales problemas. Por ejemplo, en algunos casos, se reprime en la célula la expresión de un gen que codifica un antígeno específicamente unido por uno o más de los receptores de antígeno manipulados genéticamente. Al reprimir el antígeno específico en la célula inmunitaria, se evita o reduce la muerte fratricida de las propias células inmunitarias. En algunos casos, la muerte fratricida (por ejemplo, evaluada mediante un ensayo de proliferación, viabilidad y/o citotoxicidad) se reduce en por lo menos un 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más, en comparación con una célula o población celular en la que las células expresan el receptor de antígeno manipulado, pero en la que no se ha alterado el gen o antígeno al que se dirige o la expresión del mismo. Tales características confieren en algunos aspectos una especificidad y/o eficacia mejoradas en el contexto de la terapia celular adoptiva.

Entre tales antígenos se encuentran los expresados en cánceres del sistema inmunitario, como leucemias, linfomas y/o mielomas, como el mieloma múltiple, y/o expresados en células T y/o células NK, incluyendo células T activadas. Los antígenos ejemplares son los expresados en células T o células NK activadas o estimuladas, y subconjuntos de las mismas, en particular células activadas producidas por condiciones de estimulación usadas para promover la introducción del ácido nucleico que codifica el<c>A<r>u otro receptor manipulado. Por ejemplo, entre dichos antígenos se encuentran aquellos que generalmente no se expresan en células T en reposo pero cuya expresión se induce tras la activación de células T y/o que se expresan en células T activadas. En algunos casos, el gen codifica un antígeno tumoral universal, como hTERT, survivina, MDM2, CYP1B, HER2/neu, WT1, livina, AFP, CEA, MUC16, MUC1, PSMA, p53 o ciclina (D1). Por ejemplo, el gen codifica hTERT o survivina. En algunos casos, el gen codifica el antígeno CD38. En algunos casos, el gen codifica el antígeno CD33 o TIM-3; en algunos casos, codifica el antígeno CD26, CD30, CD53, CD92, CD100, CD148, CD150, CD200, CD261, CD262 o CD362.

En algunos casos, la represión se efectúa a través de la alteración del gen que codifica el antígeno, como por deleción, por ejemplo, deleción de un gen entero, exón, o región, y/o sustitución con una secuencia exógena, y/o por mutación, por ejemplo, cambio de marco o mutación sin sentido, dentro del gen, típicamente dentro de un exón del gen. En algunos casos, la alteración da lugar a la incorporación de un codón de parada prematuro en el gen, de tal manera que el antígeno no se expresa o no se expresa en una forma que sea reconocida por el receptor del antígeno. La alteración se produce generalmente a nivel del ADN. La alteración generalmente es permanente, irreversible o no transitoria. En otros casos, se emplean estrategias de represión transitoria o reversible, como la eliminación de genes mediante ARNi. En algunos casos, al alterar o reprimir de otro modo la expresión del antígeno en las células manipuladas, los métodos y composiciones divulgados en la presente evitan o reducen la probabilidad de destrucción de las células manipuladas por las propias células manipuladas, promoviendo de este modo la eficacia.

En algunos casos, las células incluyen características para aumentar la eficacia de las células y los métodos se proporcionan mediante la alteración de la expresión génica en las células manipuladas. En algunos aspectos, el gen alterado codifica una molécula de punto de control, una molécula inmunosupresora, como un receptor que envía una señal inmunosupresora a la célula, y/o cualquier molécula que pueda reducir la robustez de la respuesta de la célula manipulada, por ejemplo, tras la administración en relación con la inmunoterapia.

En algunos casos, por ejemplo, en el contexto de un antígeno reconocido por un CAR inhibidor, la alteración genética impide o reduce la probabilidad de que el CAR inhibidor expresado por la célula manipulada se una a una molécula también expresada por las células manipuladas, induciendo de este modo un efecto amortiguador en la señalización o respuesta inmunitaria dirigida por las células manipuladas. Ejemplos de tales antígenos son los expresados en células normales o no objetivo o fuera de objetivo (de manera que se incluye una molécula CAR inhibidora para evitar efectos fuera de objetivo), pero que también se expresa en el tipo celular usado para la ingeniería genética, como la célula T o la célula NK. Los antígenos ejemplares son las moléculas MHC, como las moléculas MHC de clase I, que en algunos casos pueden estar reguladas por disminución en el contexto de la evasión inmunitaria, el cáncer o la infección, pero que generalmente se expresan en células nucleadas. Otros ejemplos son cualquier objetivo inhibidor de CAR que también se exprese en células T, células NK u otras células manipuladas para terapia celular.

En otros casos, el gen o genes alterados son genes distintos del que codifica el antígeno, como un gen que codifica una molécula inmunosupresora, por ejemplo, una molécula de punto de control o un receptor de adenosina, por ejemplo, A2AR.

En algunos aspectos, la alteración se lleva a cabo mediante edición de genes, por ejemplo, usando una proteína de unión al ADN o un ácido nucleico de unión al ADN, que se une o hibrida específicamente con el gen en una región objetivo de la alteración. En algunos aspectos, la proteína o el ácido nucleico se acopla o forma un complejo con una nucleasa, como en una proteína quimérica o de fusión. Por ejemplo, en algunos casos, la alteración se efectúa usando una fusión que comprende una proteína dirigida al ADN y una nucleasa, como una nucleasa de dedos de zinc (ZFN) o una nucleasa efectora TAL (TALEN), o una nucleasa guiada por ARN, como un sistema de ácido nucleico palindrómico corto agrupado y regularmente intercalado (CRISPR)-Cas, como el sistema CRISPR-Cas9, específico para el gen que se está alterando.

En algunos casos, la selectividad y especificidad mejoradas se logran mediante estrategias dirigidas a múltiples antígenos. Tales estrategias generalmente implican múltiples dominios de unión a antígenos, que típicamente están presentes en distintos receptores de antígenos manipulados genéticamente y se unen específicamente a distintos antígenos. Por tanto, en algunos casos, las células se manipulan con la capacidad de unirse a más de un antígeno. En algunos aspectos, se introducen en la célula una pluralidad de receptores de antígenos manipulados genéticamente, que se unen específicamente a antígenos diferentes, cada uno de los cuales se expresa en la enfermedad o afección a la que se dirigen las células o tejidos o células de los mismos. Tales características pueden, en algunos aspectos, abordar o reducir la probabilidad de efectos fuera del objetivo. Por ejemplo, cuando un único antígeno expresado en una enfermedad o afección también se expresa en células normales o no enfermas, estos enfoques multiobjetivo pueden proporcionar selectividad para los tipos celulares deseados al requerir la unión a través de múltiples receptores de antígenos para activar la célula o inducir una función efectora particular.

En algunos casos, la célula expresa un primer receptor de antígeno manipulado genéticamente que reconoce un primer antígeno y un segundo receptor de antígeno manipulado genéticamente, como un receptor coestimulador, que reconoce un segundo antígeno; en algunos casos, receptores adicionales reconocen un tercer antígeno o más antígenos. En algunos aspectos, cada uno de los antígenos se expresa en el contexto de una célula, enfermedad o afección objetivo, como en una neoplasia, cáncer, enfermedad maligna o enfermedad infecciosa. En algunos aspectos, uno o más de los antígenos también se expresan en células o en tejidos o entornos a los que no se desea dirigir la terapia celular, como en tejidos normales o no enfermos. En algunos casos, la presencia de múltiples receptores y/o múltiples componentes de reconocimiento de antígenos evita o reduce la probabilidad de efectos no deseados en tales tejidos, células o entornos. Por tanto, en algunos aspectos, las características de las células y métodos proporcionados evitan o reducen la probabilidad de activación o respuesta inapropiadas de las células dirigidas a células, tejidos o entornos distintos de aquellos a los que se dirige la terapia celular. Por ejemplo, en algunos casos, evitan o reducen la probabilidad de efectos fuera del objetivo.

En algunos aspectos, por lo menos uno de los receptores de antígenos manipulados genéticamente es específico para un antígeno objetivo que es un antígeno tumoral universal expresado en más de un tipo de tumor. Por ejemplo, entre las células se encuentran las que se dirigen a múltiples antígenos donde por lo menos uno de los antígenos objetivo es hTERT, survivina, MDM2, CYP1B, HER2/neu, WT1, livina, AFP, CEA, MUC16, MUC1, PSMA, p53 o ciclina (D1). En algunos casos, el uno u otros antígenos a los que se dirigen uno o más receptores de antígenos manipulados genéticamente en las células es uno que se expresa en un tumor o cáncer.

En algunos aspectos, la enfermedad o afección es mieloma múltiple, la célula objetivo es una célula de mieloma múltiple, y/o los antígenos objetivo son antígenos expresados en mieloma múltiple. Entre las células se encuentran las que se dirigen a antígenos múltiples, como antígenos múltiples expresados en una enfermedad o afección como el mieloma múltiple, como combinaciones de CD38, CD138 y/o CS-1. Combinaciones ejemplares de antígenos a los que dirigirse incluyen dos o más de CD38, CD 138, y/o CS-1. En algunos aspectos, las células reconocen dos o más antígenos expresados en el mieloma múltiple, uno o más de los cuales también pueden expresarse en células normales o no cancerosas. En algunos casos, los antígenos incluyen dos o más de CD38, CD138 y CS-1.

En algunos casos, los múltiples dominios de reconocimiento de antígeno o los múltiples receptores de antígeno están diseñados o manipulados de tal manera que se induce una respuesta en la célula sólo tras la unión o ligadura específica de la pluralidad de receptores o dominios de reconocimiento de antígeno, y no tras la ligadura o unión al antígeno por un único receptor o dominio. En algunos aspectos, el primer receptor incluye un dominio de activación, como un motivo que contiene ITAM, como un dominio inmunoestimulador de una cadena CD3-zeta. En algunos aspectos, el segundo receptor es un receptor coestimulador, que no incluye tal dominio de activación pero incluye un dominio coestimulador, por ejemplo, que potencia la señal inducida por la ligadura del primer receptor. En algunos aspectos, las células normales también expresan o pueden expresar el antígeno reconocido por el receptor activador.

En algunos casos, la célula incluye múltiples receptores de antígenos manipulados genéticamente que reconocen diferentes antígenos y también incluye una alteración genética, por ejemplo, la alteración de un gen que codifica el antígeno al que se dirige uno o más de los receptores de antígenos. En algunos casos, la alteración genética se lleva a cabo antes de la introducción del receptor o receptores de antígeno; en algunos casos, se lleva a cabo simultáneamente a la introducción del receptor o receptores de antígeno. En algunos aspectos, la introducción del receptor o receptores de antígenos efectúa la alteración génica, como por ejemplo mediante la inserción en el locus génico alterado por recombinación homóloga.

También se divulgan métodos, compuestos y composiciones para producir las células manipuladas. Se divulgan métodos para el aislamiento celular, la ingeniería genética y la alteración génica. Se divulgan ácidos nucleicos, como constructos, por ejemplo, vectores virales que codifican los receptores de antígenos manipulados genéticamente y/o codifican ácidos nucleicos y/o proteínas para la alteración dirigida de genes, y métodos para introducir tales ácidos nucleicos en las células, como por transducción. También se divulgan composiciones que contienen las células manipuladas, y métodos, kits y dispositivos para administrar las células y composiciones a sujetos, como para terapia celular adoptiva. En algunos aspectos, las células se aíslan de un sujeto, se manipulan y se administran al mismo sujeto. En otros aspectos, se aíslan de un sujeto, se manipulan y se administran a otro sujeto.

A. Células, preparación celular y cultivo

En algunos casos, las células, por ejemplo, las células manipuladas, son células eucariotas, como células de mamíferos, por ejemplo, células humanas. En algunos casos, las células se derivan de la sangre, médula ósea, linfa u órganos linfoides, son células del sistema inmunitario, como células de la inmunidad innata o adaptativa, por ejemplo, células mieloides o linfoides, incluyendo linfocitos, típicamente células T y/o células NK. Otras células ejemplares son las células madre, como las células madre multipotentes y pluripotentes, incluyendo las células madre pluripotentes inducidas (iPSC). En algunos aspectos, las células son células humanas. Las células son típicamente células primarias, como las aisladas directamente de un sujeto y/o aisladas de un sujeto y congeladas. En algunos casos, las células incluyen uno o más subconjuntos de células T u otros tipos celulares, como poblaciones de células T completas, células CD4+, células CD8+ y subpoblaciones de las mismas, como las definidas por función, estado de activación, madurez, potencial de diferenciación, expansión, recirculación, localización y/o capacidades de persistencia, especificidad antigénica, tipo de receptor antigénico, presencia en un órgano o compartimento particular, perfil de secreción de marcadores o citoquinas y/o grado de diferenciación. Con referencia al sujeto a tratar, las células pueden ser alogénicas y/o autólogas. Entre los métodos se incluyen métodos disponibles en el mercado. En algunos aspectos, como para tecnologías disponibles en el mercado, las células son pluripotentes y/o multipotentes, como células madre, como células madre pluripotentes inducidas (iPSCs). En algunos casos, los métodos incluyen aislar las células del sujeto, prepararlas, procesarlas, cultivarlas y/o manipularlas, como se describe en la presente, y reintroducirlas en el mismo paciente, antes o después de la crioconservación.

Entre los subtipos y subpoblaciones de células T y/o de células T CD4+ y/o CD8+ se encuentran las células T vírgenes (Tn), células T efectoras (Teff), células T de memoria y subtipos de las mismas, como células T de memoria de células madre (Tscm), células T de memoria central (Tcm), células T de memoria efectoras (Tem), o células T de memoria efectoras diferenciadas terminalmente, células infiltrantes de tumores (TIL), células T inmaduras, células T maduras, células T auxiliares, células T citotóxicas, células T invariantes asociadas a mucosas (MAIT), células T reguladoras (Treg) naturales y adaptativas, células T auxiliares, como células TH1, células TH2, células TH3, células TH17, células TH9, células<t>H22, células T auxiliares foliculares, células T alfa/beta y células T delta/gamma.

En algunos casos, una o más de las poblaciones de células T se enriquecen o agotan de células que son positivas para (marcador*) o expresan niveles altos (marcadoralto) de uno o más marcadores particulares, como marcadores de superficie, o que son negativas para (marcador-) o expresan niveles relativamente bajos (marcadorbajo) de uno o más marcadores. En algunos casos, tales marcadores son los que están ausentes o se expresan a niveles relativamente bajos en ciertas poblaciones de células T (como las células no de memoria) pero están presentes o se expresan a niveles relativamente más altos en ciertas otras poblaciones de células T (como las células de memoria). En un caso, las células (como las células CD8+ o las células T, por ejemplo, las células CD3+) se enriquecen para (es decir, se seleccionan positivamente para) células que son positivas para o que expresan altos niveles de superficie de CD45RO, CCR7, c D28, CD27, CD44, CD127, y/o CD62L y/o se agotan de (por ejemplo, se seleccionan negativamente para) células que son positivas para o expresan altos niveles de superficie de CD45RA. En algunos casos, las células se enriquecen para o se agotan de células positivas o que expresan altos niveles superficiales de CD122, CD95, CD25, CD27, y/o lL7-Ra (CD127). En algunos ejemplos, las células T CD8+ se enriquecen para células positivas para CD45RO (o negativas para CD45RA) y para CD62L.

En algunos casos, una población de células T CD4+ y una subpoblación de células T CD8+, por ejemplo, una subpoblación enriquecida para células de memoria central (Tcm).

En algunos casos, las células son células asesinas naturales (NK). En algunos casos, las células son monocitos o granulocitos, por ejemplo, células mieloides, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas, mastocitos, eosinófilos y/o basófilos.

Preparación de las células

Las células y las composiciones que contienen las células para manipulación típicamente se aíslan de una muestra, como una muestra biológica, por ejemplo, una obtenida de o derivada de un sujeto. En algunos casos, el sujeto del que se aísla la célula es un sujeto que padece una enfermedad o afección particular o que necesita una terapia celular o al que se le administrará una terapia celular. En algunos casos, el sujeto es un mamífero, como un humano, como un sujeto que necesita una intervención terapéutica particular, como terapia celular adoptiva para la que se aíslan, procesan y/o diseñan las células.

Por consiguiente, las células en algunos casos son células primarias, por ejemplo, células humanas primarias. Las muestras incluyen tejidos, fluidos y otras muestras tomadas directamente del sujeto, así como muestras resultantes de uno o más pasos de procesamiento, como separación, centrifugación, ingeniería genética (por ejemplo, transducción con vector viral), lavado y/o incubación. La muestra biológica puede ser una muestra obtenida directamente de una fuente biológica o una muestra procesada. Las muestras biológicas incluyen, entre otras, fluidos corporales, como sangre, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, líquido sinovial, orina y sudor, muestras de tejidos y órganos, incluyendo las muestras procesadas derivadas de los mismos.

En algunos aspectos, la muestra de la que se derivan o aíslan las células es sangre o una muestra derivada de sangre, o es o se deriva de un producto de aféresis o leucaféresis. Las muestras ejemplares incluyen sangre completa, células mononucleares de sangre periférica (PBMC), leucocitos, médula ósea, timo, biopsia de tejido, tumor, leucemia, linfoma, ganglio linfático, tejido linfoide asociado a la mucosa, tejido linfoide asociado a mucosa, bazo, otros tejidos linfoides, hígado, pulmón, estómago, intestino, colon, riñón, páncreas, mama, hueso, próstata, cuello uterino, testículos, ovarios, amígdala u otro órgano, y/o células derivadas de los mismos. Las muestras incluyen, en el contexto de la terapia celular, por ejemplo, la terapia celular adoptiva, muestras de fuentes autólogas y alogénicas.

En algunos casos, las células se derivan de líneas celulares, por ejemplo, líneas de células T. En algunos casos, las células se obtienen de una fuente xenogénica, por ejemplo, de ratón, rata, primate no humano y cerdo.

Procesamiento, preparación y separación no basada en afinidad de células

En algunos casos, el aislamiento de las células incluye uno o más pasos de preparación y/o separación celular no basada en afinidad. En algunos ejemplos, las células se lavan, centrifugan y/o incuban en presencia de uno o más reactivos, por ejemplo, para eliminar componentes no deseados, enriquecer para componentes deseados, lisar o eliminar células sensibles a reactivos particulares. En algunos ejemplos, las células se separan sobre la base de una o más propiedades, como la densidad, las propiedades adherentes, el tamaño, la sensibilidad y/o la resistencia a componentes particulares.

En algunos ejemplos, se obtienen células de la sangre circulante de un sujeto, por ejemplo, mediante aféresis o leucaféresis. Las muestras, en algunos aspectos, contienen linfocitos, incluyendo células T, monocitos, granulocitos, células B, otros glóbulos blancos nucleados, glóbulos rojos y/o plaquetas, y en algunos aspectos contiene células distintas de los glóbulos rojos y las plaquetas.

En algunos casos, las células sanguíneas recogidas del sujeto se lavan, por ejemplo, para eliminar la fracción de plasma y colocar las células en un tampón o medio apropiado para los pasos de procesamiento posteriores. En algunos casos, las células se lavan con solución salina tamponada con fosfato (PBS). En algunos casos, la solución de lavado carece de calcio y/o magnesio y/o muchos o todos los cationes divalentes. En algunos aspectos, un paso de lavado se realiza en una centrifugadora semiautomática de "flujo continuo" (por ejemplo, el procesador celular Cobe 2991, Baxter) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En algunos aspectos, el paso de lavado se realiza mediante filtración de flujo tangencial (TFF) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En algunos casos, las células se vuelven a suspender en una variedad de tampones biocompatibles después del lavado, como, por ejemplo, PBS libre de Ca++/Mg++. En algunos casos, los componentes de una muestra de células sanguíneas se eliminan y las células se vuelven a suspender directamente en medios de cultivo.

En algunos casos, los métodos incluyen métodos de separación celular basados en la densidad, como la preparación de glóbulos blancos a partir de sangre periférica mediante lisis de los glóbulos rojos y centrifugación a través de un gradiente Percoll o Ficoll.

Separación basada en la afinidad y/o el perfil del marcador

En algunos casos, los métodos de aislamiento incluyen la separación de diferentes tipos celulares basada en la expresión o presencia en la célula de una o más moléculas específicas, como marcadores de superficie, por ejemplo, proteínas de superficie, marcadores intracelulares o ácido nucleico. En algunos casos, puede usarse cualquier método conocido de separación basado en tales marcadores. En algunos casos, la separación se basa en afinidad o inmunoafinidad. Por ejemplo, el aislamiento en algunos aspectos incluye la separación de células y poblaciones celulares basada en la expresión de las células o el nivel de expresión de uno o más marcadores, típicamente marcadores de superficie celular, por ejemplo, por incubación con un anticuerpo o compañero de unión que se une específicamente a tales marcadores, seguido generalmente por pasos de lavado y separación de las células que se han unido al anticuerpo o compañero de unión, de aquellas células que no se han unido al anticuerpo o compañero de unión.

Tales pasos de separación pueden basarse en la selección positiva, en la que las células que se han unido a los reactivos se retienen para su uso posterior, y/o en la selección negativa, en la que se retienen las células que no se han unido al anticuerpo o al compañero de unión. En algunos ejemplos, se retienen ambas fracciones para su uso posterior. En algunos aspectos, la selección negativa puede ser particularmente útil cuando no se dispone de ningún anticuerpo que identifique específicamente un tipo de célula en una población heterogénea, de tal manera que la separación se realiza mejor basándose en marcadores expresados por células distintas de la población deseada.

No es necesario que la separación dé lugar a un enriquecimiento o eliminación del 100% de una población celular concreta o de células que expresen un marcador concreto. Por ejemplo, la selección positiva o el enriquecimiento de células de un tipo particular, como las que expresan un marcador, se refiere al aumento del número o porcentaje de tales células, pero no tiene por qué dar lugar a una ausencia total de células que no expresen el marcador. De igual manera, la selección negativa, eliminación o agotamiento de células de un tipo particular, como las que expresan un marcador, se refiere a la disminución del número o porcentaje de dichas células, pero no tiene por qué dar como resultado una eliminación completa de todas esas células.

En algunos ejemplos, se llevan a cabo múltiples rondas de pasos de separación, donde la fracción seleccionada positiva o negativamente de un paso se somete a otro paso de separación, como una selección positiva o negativa posterior. En algunos ejemplos, un único paso de separación puede agotar las células que expresan múltiples marcadores simultáneamente, por ejemplo incubando las células con una pluralidad de anticuerpos o compañeros de unión, cada uno específico para un marcador objeto de selección negativa. De igual manera, pueden seleccionarse positivamente varios tipos celulares al mismo tiempo incubando las células con una pluralidad de anticuerpos o compañeros de unión expresados en los varios tipos celulares.

Por ejemplo, en algunos aspectos, subpoblaciones específicas de células T, como células positivas o que expresan niveles altos de uno o más marcadores de superficie, por ejemplo, células T CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+, y/o CD45RO+, se aíslan mediante técnicas de selección positiva o negativa.

Por ejemplo, las células T CD3+, CD28+ pueden seleccionarse positivamente usando perlas magnéticas conjugadas<c>D3/CD28 (por ejemplo, expansor de células T CD3/CD28 D<y>N<a>BEADS® M-450).

En algunos casos, el aislamiento se lleva a cabo por enriquecimiento para una población celular particular mediante selección positiva, o agotamiento de una población celular particular, mediante selección negativa. En algunos casos, la selección positiva o negativa se lleva a cabo incubando células con uno o más anticuerpos u otro agente de unión que se unen específicamente a uno o más marcadores de superficie expresados o expresados (marcador+) a un nivel relativamente más alto (marcadoralto) en las células seleccionadas positiva o negativamente, respectivamente.

En algunos casos, las células T se separan de una muestra de PBMC mediante selección negativa de marcadores expresados en células no T, como células B, monocitos u otros glóbulos blancos, como CD14. En algunos aspectos, se usa un paso de selección de CD4+ o CD8+ para separar las células T auxiliares CD4+ y citotóxicas CD8+. Tales poblaciones de CD4+ y CD8+ pueden clasificarse además en subpoblaciones mediante selección positiva o negativa para marcadores expresados o expresados en un grado relativamente mayor en una o más subpoblaciones de células T vírgenes, de memoria y/o efectoras.

En algunos casos, las células CD8+ se enriquecen o eliminan adicionalmente de las células madre vírgenes, de memoria central, de memoria efectora y/o de memoria central, por ejemplo mediante selección positiva o negativa basada en antígenos de superficie asociados con la subpoblación respectiva. En algunos casos, se lleva a cabo el enriquecimiento para células T de memoria central (Tcm) para aumentar la eficacia, como para mejorar la supervivencia a largo plazo, la expansión y/o el injerto tras la administración, que en algunos aspectos es particularmente robusto en tales subpoblaciones. Ver Terakuraet al. (2012) Blood. 1:72-82; Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701. En algunos casos, la combinación de células T CD8+ enriquecidas con T<cm>y células T CD4+ mejora aún más la eficacia.

En algunos casos, las células T de memoria están presentes en los subconjuntos CD62L+ y CD62L- de los linfocitos CD8+ de la sangre periférica. Las PBMC pueden enriquecerse o eliminarse de las fracciones CD62L-CD8+ y/o CD62L+CD8+, por ejemplo usando anticuerpos anti-CD8 y anti-CD62L.

En algunos casos, el enriquecimiento para células T de memoria central (T<cm>) se basa en la expresión superficial positiva o alta de CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3, y/o CD 127; en algunos aspectos, se basa en la selección negativa para células que expresan o expresan altamente CD45RA y/o granzima B. En algunos aspectos, el aislamiento de una población de CD8+ enriquecida para células T<cm>se lleva a cabo por agotamiento de células que expresan CD4, CD14, CD45RA, y selección positiva o enriquecimiento para células que expresan CD62L. En un aspecto, el enriquecimiento para células T de memoria central (Tcm) se lleva a cabo comenzando con una fracción negativa de células seleccionadas basándose en la expresión de CD4, que se somete a una selección negativa basada en la expresión de CD14 y CD45RA, y una selección positiva basada en CD62L. Tales selecciones en algunos aspectos se llevan a cabo simultáneamente y en otros aspectos se llevan a cabo secuencialmente, en cualquier orden. En algunos aspectos, también se usa el mismo paso de selección basado en la expresión de CD4 usado en la preparación de la población o subpoblación de células CD8+ para generar la población o subpoblación de células CD4+, de tal manera que tanto las fracciones positivas como las negativas de la separación basada en CD4 se retienen y usan en pasos posteriores de los métodos, opcionalmente después de uno o más pasos de selección positiva o negativa adicionales.

En un ejemplo particular, una muestra de PBMC u otra muestra de glóbulos blancos se somete a selección de células CD4+, donde se retienen tanto la fracción negativa como la positiva. A continuación, la fracción negativa se somete a selección negativa basada en la expresión de CD14 y CD45RA o CD19, y a selección positiva basada en un marcador característico de células T de memoria central, como CD62L o CCR7, donde las selecciones positiva y negativa se llevan a cabo en cualquier orden.

Las células T auxiliares CD4+ se clasifican en vírgenes, de memoria central y efectoras mediante la identificación de poblaciones celulares que tienen antígenos de superficie celular. Los linfocitos CD4+ pueden obtenerse por métodos estándar. En algunos casos, los linfocitos T CD4+ vírgenes son células T CD45RO-, CD45RA+, CD62L+, CD4+. En algunos casos, las células CD4+ de memoria central son CD62L+ y CD45RO+. En algunos casos, las células efectoras CD4 son CD62L- y CD45RO-.

En un ejemplo, para enriquecer las células CD4+ mediante selección negativa, un cóctel de anticuerpos monoclonales incluye típicamente anticuerpos contra CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR y CD8. En algunos casos, el anticuerpo o compañero de unión está unido a un soporte sólido o matriz, como una perla magnética o paramagnética, para permitir la separación de las células para la selección positiva y/o negativa. Por ejemplo, en algunos casos, las células y poblaciones celulares se separan o aíslan usando técnicas de separación inmunomagnéticas (o afinimagnéticas) (revisado en Methods in Molecular Medicine, vol. 58: Metastasis Research Protocols, Vol. 2: Cell Behavior In Vitro and In Vivo, p 17-25 editado por: S.A. Brooks y U. Schumacher© Humana Press Inc., Totowa, NJ).

En algunos aspectos, la muestra o composición de células a separar se incuba con material pequeño, magnetizable o magnéticamente sensible, como partículas o micropartículas magnéticamente sensibles, como perlas paramagnéticas (por ejemplo, como Dynalbeads o perlas MACS). El material magnéticamente sensible, por ejemplo, la partícula, generalmente está unido directa o indirectamente a un compañero de unión, por ejemplo, un anticuerpo, que se une específicamente a una molécula, por ejemplo, un marcador de superficie, presente en la célula, células o población de células que se desea separar, por ejemplo, que se desea seleccionar negativa o positivamente.

En algunos casos, la partícula o perla magnética comprende un material magnéticamente sensible unido a un miembro de unión específico, como un anticuerpo u otro compañero de unión. Hay muchos materiales magnéticos bien conocidos que se usan en los métodos de separación magnética. Entre las partículas magnéticas adecuadas se incluyen las descritas en Molday, Patente de Estados Unidos N° 4.452.773, y la Memoria descriptiva de la Patente Europea EP 452342 B. Las partículas de tamaño coloidal, como las descritas en Owen Patente de Estados Unidos N° 4.795.698, y Liberti et al., Patente de Estados Unidos N° 5.200.084 son otros ejemplos.

Por lo general, la incubación se lleva a cabo en condiciones en las que los anticuerpos o las moléculas de unión, como los anticuerpos secundarios u otros reactivos, que se unen específicamente a dichos anticuerpos o moléculas de unión, que están adheridos a la partícula o perla magnética, se unen específicamente a las moléculas de la superficie celular si están presentes en las células dentro de la muestra.

En algunos aspectos, la muestra se coloca en un campo magnético, y las células que tengan adheridas partículas magnetizables o magnéticamente sensibles serán atraídas por el imán y separadas de las células no marcadas. Para la selección positiva, se retienen las células que son atraídas por el imán; para la selección negativa, se retienen las células que no son atraídas (células no marcadas). En algunos aspectos, se realiza una combinación de selección positiva y negativa durante el mismo paso de selección, en el que se retienen las fracciones positivas y negativas y se procesan o someten a otros pasos de separación.

En ciertos casos, las partículas magnéticamente sensibles están recubiertas de anticuerpos primarios u otros compañeros de unión, anticuerpos secundarios, lectinas, enzimas o estreptavidina. En ciertos casos, las partículas magnéticas se unen a las células mediante un recubrimiento de anticuerpos primarios específicos para uno o más marcadores. En ciertos casos, las células, en lugar de las perlas, se marcan con un anticuerpo primario o un compañero de unión y, a continuación, se añaden partículas magnéticas recubiertas de anticuerpos secundarios específicos del tipo celular u otro compañero de unión (por ejemplo, estreptavidina). En ciertos casos, las partículas magnéticas recubiertas con estreptavidina se usan junto con anticuerpos primarios o secundarios biotinilados.

En algunos casos, las partículas magnéticamente sensibles se dejan adheridas a las células que se van a incubar, cultivar y/o manipular posteriormente; en algunos aspectos, las partículas se dejan adheridas a las células para su administración a un paciente. En algunos casos, las partículas magnetizables o magnéticamente sensibles se retiran de las células. Los métodos para eliminar las partículas magnetizables de las células son conocidos e incluyen, por ejemplo, el uso de anticuerpos no marcados competidores, partículas magnetizables o anticuerpos conjugados con conectores escindibles, etc. En algunos casos, las partículas magnetizables son biodegradables.

En algunos casos, la selección basada en la afinidad se realiza mediante la selección celular activada magnéticamente (MACS) (Miltenyi Biotech, Auburn, CA). Los sistemas de selección celular activada magnéticamente (MACS) son capaces de seleccionar células de gran pureza con partículas magnetizadas adheridas a las mismas. En ciertos casos, la MACS funciona en un modo en el que las especies objetivo y no objetivo se eluyen secuencialmente tras la aplicación del campo magnético externo. Es decir, las células adheridas a las partículas magnetizadas se mantienen en su lugar mientras se eluyen las especies no adheridas. Luego, después de que se haya completado este primer paso de elución, las especies que quedaron atrapadas en el campo magnético y no pudieron ser eluidas se liberan de alguna manera para que puedan ser eluidas y recuperadas. En ciertos casos, las células no objetivo se marcan y se agotan de la población heterogénea de células.

En ciertos casos, el aislamiento o separación se lleva a cabo usando un sistema, dispositivo o aparato que lleva a cabo uno o más de los pasos de aislamiento, preparación celular, separación, procesamiento, incubación, cultivo y/o formulación de los métodos. En algunos aspectos, el sistema se usa para llevar a cabo cada uno de estos pasos en un entorno cerrado o estéril, por ejemplo, para minimizar los errores, la manipulación por parte del usuario y/o la contaminación. En un ejemplo, el sistema es un sistema como el descrito en la Solicitud de Patente Internacional, Número de Publicación WO2009/072003, o US 20110003380 A1.

En algunos casos, el sistema o aparato lleva a cabo uno o más, por ejemplo, todos los pasos de aislamiento, procesamiento, manipulación y formulación en un sistema integrado o autónomo, y/o de manera automatizada o programable. En algunos aspectos, el sistema o aparato incluye un ordenador y/o un programa informático en comunicación con el sistema o aparato, que permite a un usuario programar, controlar, evaluar el resultado y/o ajustar diversos aspectos de los pasos de procesamiento, aislamiento, manipulación y formulación.

En algunos aspectos, la separación y/u otros pasos se llevan a cabo usando el sistema CliniMACS (Miltenyi Biotic), por ejemplo, para la separación automatizada de células a nivel de escala clínica en un sistema cerrado y estéril. Los componentes pueden incluir un microordenador integrado, una unidad de separación magnética, una bomba peristáltica y varias válvulas de pellizco. El ordenador integrado en algunos aspectos controla todos los componentes del instrumento y dirige el sistema para realizar procedimientos repetidos en una secuencia estandarizada. En algunos aspectos, la unidad de separación magnética incluye un imán permanente móvil y un soporte para la columna de selección. La bomba peristáltica controla el caudal en todo el conjunto de tubos y, junto con las válvulas de pinza, garantiza el flujo controlado de tampón a través del sistema y la suspensión continua de las células.

En algunos aspectos, el sistema CliniMACS usa partículas magnetizables acopladas a anticuerpos que se suministran en una solución estéril no pirogénica. En algunos casos, tras marcar las células con partículas magnéticas, éstas se lavaron para eliminar el exceso de partículas. Luego, se conecta una bolsa de preparación celular al conjunto de tubos, que a su vez está conectado a una bolsa que contiene tampón y a una bolsa de recogida de células. El conjunto de tubos consiste en tubos estériles premontados, que incluyen una precolumna y una columna de separación, y son de un solo uso. Una vez iniciado el programa de separación, el sistema aplica automáticamente la muestra celular en la columna de separación. Las células marcadas se retienen dentro de la columna, mientras que las células no marcadas se eliminan mediante una serie de pasos de lavado. En algunos casos, las poblaciones celulares para su uso con los métodos descritos en la presente no están marcadas y no se retienen en la columna. En algunos casos, las poblaciones celulares para su uso con los métodos descritos en la presente están marcadas y se retienen en la columna. En algunos casos, las poblaciones celulares para su uso con los métodos descritos en la presente se eluyen de la columna después de la eliminación del campo magnético, y se recogen dentro de la bolsa de recogida de células.

En ciertos casos, la separación y/u otros pasos se llevan a cabo usando el sistema CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec). En algunos aspectos, el sistema CliniMACS Prodigy está equipado con una unidad de procesamiento celular que permite el lavado y fraccionamiento automatizado de las células mediante centrifugación. El sistema CliniMACS Prodigy también puede incluir una cámara incorporada y un software de reconocimiento de imágenes que determina el criterio de valoración óptimo de fraccionamiento celular discerniendo las capas macroscópicas del producto celular fuente. Por ejemplo, la sangre periférica se separa automáticamente en capas de eritrocitos, leucocitos y plasma. El sistema CliniMACS Prodigy también puede incluir una cámara de cultivo celular integrada que realiza protocolos de cultivo celular como, por ejemplo, diferenciación y expansión celular, carga de antígenos y cultivo celular a largo plazo. Los puertos de entrada pueden permitir la extracción y reposición estéril de medios y las células pueden monitorizarse usando un microscopio integrado. Ver, por ejemplo, Klebanoff et al.(2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakuraet al. (2012) Blood.1:72-82, y Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701.

En algunos casos, una población celular descrita en la presente se recoge y enriquece (o agota) mediante citometría de flujo, en la que las células teñidas para múltiples marcadores de superficie celular se transportan en una corriente fluídica. En algunos casos, una población celular descrita en la presente se recoge y enriquece (o agota) mediante clasificación a escala preparativa (FACS). En ciertos casos, una población celular descrita en la presente se recoge y enriquece (o agota) mediante el uso de chips de sistemas microelectromecánicos (MEMS) en combinación con un sistema de detección basado en FACS (ver, por ejemplo, la WO 2010/033140, Cho et al. (2010) Lab Chip 10, 1567-1573; y Godin et al. (2008) J Biophoton. 1(5):355-376. En ambos casos, las células pueden marcarse con múltiples marcadores, lo que permite aislar subconjuntos de células T bien definidos con gran pureza.

En algunos casos, los anticuerpos o compañeros de unión están marcados con uno o más marcadores detectables, para facilitar la separación para la selección positiva y/o negativa. Por ejemplo, la separación puede basarse en la unión a anticuerpos marcados con fluorescencia. En algunos ejemplos, la separación de células basada en la unión de anticuerpos u otros compañeros de unión específicos para uno o más marcadores de la superficie celular se lleva a cabo en una corriente fluídica, como por ejemplo mediante clasificación de células activada por fluorescencia (FACS), incluyendo chips a escala preparativa (FACS) y/o sistemas microelectromecánicos (MEMS), por ejemplo, en combinación con un sistema de detección citométrica de flujo. Tales métodos permiten la selección positiva y negativa basada en múltiples marcadores simultáneamente.

Crioconservadón

En algunos casos, los métodos de preparación incluyen pasos para congelar, por ejemplo, crioconservar, las células, ya sea antes o después del aislamiento, incubación y/o manipulación. En algunos casos, el paso de congelación y posterior descongelación elimina los granulocitos y, en cierta medida, los monocitos de la población celular. En algunos casos, las células se suspenden en una solución de congelación, por ejemplo, después de un paso de lavado para eliminar el plasma y las plaquetas. En algunos aspectos puede usarse cualquiera de una variedad de soluciones y parámetros de congelación conocidos. Un ejemplo implica usar PBS con un 20% de DMSO y un 8% de albúmina sérica humana (HSA), u otro medio de congelación celular adecuado. Luego, se diluye 1:1 con medio de tal manera que la concentración final de DMSO y HSA sea del 10% y 4%, respectivamente. A continuación, las células se congelan a -80° C. a una tasa de 1° por minuto y se almacenan en la fase de vapor de un tanque de almacenamiento de nitrógeno líquido.

En algunos casos, los métodos divulgados incluyen pasos de cultivo, incubación, cultivo y/o ingeniería genética. Por ejemplo, en algunos casos, se divulgan métodos para la incubación y/o manipulación de las poblaciones celulares agotadas y composiciones iniciadoras del cultivo.

Por tanto, en algunos casos, las poblaciones celulares se incuban en una composición iniciadora de cultivo. La incubación y/o la manipulación pueden llevarse a cabo en un recipiente de cultivo, como una unidad, cámara, pocillo, columna, tubo, conjunto de tubos, válvula, vial, placa de cultivo, bolsa u otro recipiente para el cultivo de células.

Incubación y cultivo

En algunos casos, las células se incuban y/o cultivan antes o en relación con la ingeniería genética. Los pasos de incubación pueden incluir el cultivo, la estimulación, la activación y/o la propagación. En algunos casos, las composiciones o células se incuban en presencia de condiciones estimulantes o de un agente estimulante. Tales condiciones incluyen aquellas diseñadas para inducir la proliferación, expansión, activación y/o supervivencia de las células de la población, para imitar la exposición al antígeno y/o para preparar las células para la manipulación genética, como por ejemplo para la introducción de un receptor de antígeno manipulado genéticamente.

Las condiciones pueden incluir uno o más de los medios, temperatura, contenido de oxígeno, contenido de dióxido de carbono, tiempo, agentes, por ejemplo, nutrientes, aminoácidos, antibióticos, iones, y/o factores estimulantes particulares, como citoquinas, quimioquinas, antígenos, compañeros de unión, proteínas de fusión, receptores solubles recombinantes, y cualquier otro agente diseñado para activar las células.

En algunos casos, las condiciones o agentes estimulantes incluyen uno o más agentes, por ejemplo, ligando, que es capaz de activar un dominio de señalización intracelular de un complejo TCR. En algunos aspectos, el agente activa o inicia la cascada de señalización intracelular TCR/CD3 en una célula T. Tales agentes pueden incluir anticuerpos, como los específicos para un componente de TCR y/o receptor coestimulador, por ejemplo, anti-CD3, anti-CD28, por ejemplo, unidos a un soporte sólido como una perla, y/o una o más citoquinas. Opcionalmente, el método de expansión puede comprender además el paso de añadir anticuerpos anti-CD3 y/o anti CD28 al medio de cultivo (por ejemplo, a una concentración de por lo menos aproximadamente 0,5 ng/ml). En algunos casos, los agentes estimulantes incluyen 1L-2 y/o IL-15, por ejemplo, una concentración de IL-2 de por lo menos unas 10 unidades/ml.

En algunos aspectos, la incubación se lleva a cabo de acuerdo con técnicas como las descritas en la Patente de Estados Unidos N° 6.040.77 de Riddell et al., Klebanoff et al.(2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakuraet al. (2012) Blood.1:72-82, y/o Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701.

En algunos casos, las células T se expanden añadiendo a la composición iniciadora del cultivo células alimentadoras, como células mononucleares de sangre periférica (PBMC) no divididas (por ejemplo, de tal manera que la población resultante de células contenga por lo menos unas 5, 10, 20 o 40 o más células alimentadoras de PBMC por cada linfocito T de la población inicial que se va a expandir); e incubando el cultivo (por ejemplo, durante un tiempo suficiente para expandir el número de células T). En algunos aspectos, las células alimentadoras que no se dividen pueden comprender células alimentadoras PBMC irradiadas con rayos gamma. En algunos casos, las PBMC se irradian con rayos gamma en un intervalo de aproximadamente 3000 a 3600 rads para impedir la división celular. En algunos aspectos, las células alimentadoras se añaden al medio de cultivo antes de la adición de las poblaciones de células T.

En algunos casos, las condiciones de estimulación incluyen una temperatura adecuada para el crecimiento de linfocitos T humanos, por ejemplo, por lo menos aproximadamente 25 grados Celsius, generalmente por lo menos aproximadamente 30 grados, y generalmente de o de aproximadamente 37 grados Celsius. Opcionalmente, la incubación puede comprender además la adición de células linfoblastoides (LCL) no divididas transformadas por VEB como células alimentadoras. Las LCL pueden irradiarse con rayos gamma en un intervalo de aproximadamente 6000 a 10.000 rads. Las células alimentadoras LCL en algunos aspectos se proporcionan en cualquier cantidad adecuada, como una proporción de células alimentadoras LCL a linfocitos T iniciales de por lo menos aproximadamente 10:1.

En algunos casos, las células T específicas de antígeno, como las células T CD4+ y/o CD8+ específicas de antígeno, se obtienen estimulando linfocitos T vírgenes o específicos de antígeno con antígeno. Por ejemplo, pueden generarse líneas o clones de células T específicas de antígeno para antígenos de citomegalovirus aislando células T de sujetos infectados y estimulando las células in vitro con el mismo antígeno.

En algunos aspectos, los métodos incluyen evaluar la expresión de uno o más marcadores en la superficie de las células manipuladas o de las células que se están manipulando. En un caso, los métodos incluyen evaluar la expresión en superficie de uno o más antígenos objetivo (por ejemplo, antígeno reconocido por el receptor de antígeno manipulado genéticamente) a los que se pretende dirigir la terapia celular adoptiva, por ejemplo, mediante métodos de detección basados en afinidad, como la citometría de flujo. En algunos aspectos, cuando el método revela la expresión superficial del antígeno u otro marcador, se interrumpe el gen que codifica el antígeno u otro marcador o se reprime de otro modo la expresión, por ejemplo, usando los métodos descritos en la presente.

B. Receptores de antígenos manipulados genéticamente

En algunos casos, las células comprenden uno o más ácidos nucleicos introducidos mediante manipulación genética que codifican uno o más receptores de antígenos, y productos manipulados genéticamente de tales ácidos nucleicos. En algunos casos, los ácidos nucleicos son heterólogos, es decir, normalmente no están presentes en una célula o muestra obtenida de la célula, como una obtenida de otro organismo o célula que, por ejemplo, no se encuentra normalmente en la célula que se está manipulando y/o en un organismo del que se deriva dicha célula. En algunos casos, los ácidos nucleicos no son de origen natural, como un ácido nucleico que no se encuentra en la naturaleza, incluyendo uno que comprende combinaciones quiméricas de ácidos nucleicos que codifican varios dominios de múltiples tipos de células diferentes.

Entre los productos manipulados genéticamente se encuentran los receptores de antígenos manipulados genéticamente. Entre tales receptores de antígenos se encuentran los receptores de células T (TCR) manipulados genéticamente y componentes de los mismos, y los receptores de antígenos funcionales que no son TCR, como los receptores de antígenos quiméricos (CAR), incluyendo los receptores activadores quiméricos y los receptores coestimuladores quiméricos. En algunos casos, el CAR contiene un dominio extracelular de reconocimiento de antígenos que se une específicamente a un antígeno. En algunos casos, el antígeno es una proteína expresada en la superficie de las células. En algunos casos, el CAR es un CAR similar al TCR y el antígeno es un antígeno peptídico procesado, como un antígeno peptídico de una proteína intracelular, que, como un TCR, se reconoce en la superficie celular en el contexto de una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC).

Entre los receptores de antígenos ejemplares, incluidos los CAR y los TCR recombinantes, así como los métodos para manipular e introducir los receptores en las células, se incluyen los descritos, por ejemplo, en los números de publicación de solicitud de patente internacional WO200014257, WO2013126726, WO2012/129514, WO2014031687, WO2013/166321, WO2013/071154, WO2013/123061, números de publicación de solicitud de patente de Estados Unidos US2002131960, US2013287748, US20130149337, Patentes de Estados Unidos N°: 6.451.995, 7.446.190, 8.252.592,, 8.339.645, 8.398.282, 7.446.179, 6.410.319, 7.070.995, 7.265.209, 7.354.762, 7.446.191, 8.324.353, y 8.479.118, y número de solicitud de patente europea EP2537416,y/o los descritos por Sadelain et al., Cancer Discov. abril de 2013; 3(4): 388-398; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., octubre de 2012; 24(5): 633-39; Wu et al., Cancer, marzo de 2012 18(2): 160-75. En algunos aspectos, los receptores de antígenos manipulados genéticamente incluyen un CAR como el descrito en la Patente de Estados Unidos N°: 7.446.190, y los descritos en la Publicación de Solicitud de Patente Internacional N°: WO/2014055668 A1.

Receptores de antígenos quiméricos (CAR)

En algunos casos, los receptores de antígenos manipulados incluyen receptores de antígenos quiméricos (CAR), incluyendo CAR activadores o estimuladores, CAR coestimuladores (consultar la WO2014/055668) y/o CAR inhibidores (iCAR, consultar Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215) (diciembre de 2013). Los CAR generalmente incluyen un dominio de unión a antígeno (o ligando) extracelular enlazado a uno o más componentes de señalización intracelular, en algunos aspectos mediante conectores y/o dominio o dominios transmembrana. Tales moléculas típicamente imitan o se aproximan a una señal a través de un receptor de antígeno natural, una señal a través de dicho receptor en combinación con un receptor coestimulador, y/o una señal a través de un receptor coestimulador solo.

En algunos casos, el CAR se construye con una especificidad para un antígeno particular (o marcador o ligando), como un antígeno expresado en un tipo de célula particular al que se dirige la terapia adoptiva, por ejemplo, un marcador de cáncer, y/o un antígeno destinado a inducir una respuesta amortiguadora, como un antígeno expresado en un tipo de célula normal o no enferma. Por tanto, el CAR incluye típicamente en su parte extracelular una o más moléculas de unión a antígeno, como uno o más fragmentos, dominios o partes de unión a antígeno, o uno o más dominios variables de anticuerpo, y/o moléculas de anticuerpo. En algunos casos, el CAR incluye una parte o partes de unión a antígeno de una molécula de anticuerpo, como un fragmento de anticuerpo de cadena sencilla (scFv) derivado de las cadenas variable pesada (VH) y variable ligera (VL) de un anticuerpo monoclonal (mAb).

El término "anticuerpo" se usa en la presente en el sentido más amplio e incluye anticuerpos policlonales y monoclonales, incluyendo anticuerpos intactos y fragmentos de anticuerpos funcionales (de unión a antígeno), incluyendo fragmentos de unión a antígeno (Fab), fragmentos F(ab')2, fragmentos Fab', fragmentos Fv, fragmentos de IgG recombinante (rIgG), regiones de cadena pesada variable (V<h>) capaces de unirse específicamente al antígeno, fragmentos de anticuerpos de cadena sencilla, incluyendo fragmentos variables de cadena sencilla (scFv), y anticuerpos de dominio simple (por ejemplo, sdAb, sdFv, nanocuerpos). El término abarca formas de inmunoglobulinas manipuladas genéticamente y/o de otro modo, como intracuerpos, pepticuerpos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos completamente humanos, anticuerpos humanizados y anticuerpos heteroconjugados, anticuerpos multiespecíficos, por ejemplo, biespecíficos, diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos, di-scFv en tándem, tri-scFv en tándem. A menos que se indique lo contrario, debe entenderse que el término "anticuerpo" abarca los fragmentos funcionales del anticuerpo del mismo. El término también abarca anticuerpos intactos o de longitud completa, incluyendo anticuerpos de cualquier clase o subclase, incluyendo IgG y sus subclases, IgM, IgE, IgA e IgD.

En algunos casos, las proteínas de unión a antígeno, los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos reconocen específicamente un antígeno de un anticuerpo de longitud completa. En algunos casos, las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo pueden ser de longitud completa o pueden ser una parte de unión a antígeno (un Fab, F(ab')2, Fv o un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv)). En otros casos, la región constante de la cadena pesada del anticuerpo se elige entre, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD, e IgE, particularmente se elige entre, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4, más particularmente, IgG1 (por ejemplo, IgG1 humana). En otro caso, la región constante de la cadena ligera del anticuerpo se elige entre, por ejemplo, kappa o lambda, en particular kappa.

Entre los anticuerpos divulgados hay fragmentos de anticuerpos. Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una parte de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; diacuerpos; anticuerpos lineales; regiones de cadena pesada variable (Vh), moléculas de anticuerpo de cadena sencilla como scFvs y anticuerpos sencillos Vh de dominio único; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. En casos particulares, los anticuerpos son fragmentos de anticuerpo de cadena sencilla que comprenden una región de cadena pesada variable y/o una región de cadena ligera variable, como scFvs.

El término "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de la cadena pesada o ligera de un anticuerpo que interviene en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y de la cadena ligera (Vh y Vl, respectivamente) de un anticuerpo nativo generalmente tienen estructuras similares, y cada dominio comprende cuatro regiones marco conservadas (FR) y tres CDR. (Ver, por ejemplo, Kindt et al. Kuby Immunology, 6a ed., W.H. Freeman and Co., página 91 (2007). Un solo dominio de Vh o Vl puede ser suficiente para conferir especificidad de unión al antígeno. Además, los anticuerpos que se unen a un antígeno particular pueden aislarse usando un dominio de Vh o Vl de un anticuerpo que se une al antígeno para seleccionar una biblioteca de dominios de V<l>o V<h>complementarios, respectivamente. Ver, por ejemplo, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson etal., Nature 352:624-628 (1991).

Los anticuerpos de dominio único son fragmentos de anticuerpos que comprenden todo o parte del dominio variable de cadena pesada o todo o parte del dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo. En ciertos casos, un anticuerpo de dominio único es un anticuerpo humano de dominio único. En algunos casos, el CAR comprende un dominio de cadena pesada de anticuerpo que se une específicamente al antígeno, como un marcador de cáncer o un antígeno de superficie celular de una célula o enfermedad a la que se dirige, como una célula tumoral o una célula cancerosa, como cualquiera de los antígenos objetivo descritos en la presente o conocidos en la técnica.

Los fragmentos de anticuerpos pueden elaborarse mediante varias técnicas que incluyen, pero no se limitan a, la digestión proteolítica de un anticuerpo intacto, así como la producción mediante células huésped recombinantes. En algunos casos, los anticuerpos son fragmentos producidos recombinantemente, como fragmentos que comprenden disposiciones que no se producen de manera natural, como aquellos con dos o más regiones o cadenas de anticuerpos unidas por conectores sintéticos, por ejemplo, conectores peptídicos, y/o que no pueden producirse por digestión enzimática de un anticuerpo intacto que se produce de manera natural. En algunos aspectos, los fragmentos de anticuerpo son scFvs.

Un anticuerpo "humanizado" es un anticuerpo en el que todos o sustancialmente todos los residuos de aminoácidos de la CDR proceden de CDR no humanas y todos o casi todos los residuos de aminoácidos de la FR proceden de FR humanas. Un anticuerpo humanizado puede incluir opcionalmente por lo menos una parte de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una "forma humanizada" de un anticuerpo no humano se refiere a una variante del anticuerpo no humano que se ha humanizado, típicamente para reducir la inmunogenicidad para los humanos, conservando la especificidad y afinidad del anticuerpo no humano parental. En algunos casos, algunos residuos de FR en un anticuerpo humanizado se sustituyen por residuos correspondientes de un anticuerpo no humano (por ejemplo, el anticuerpo del que se derivan los residuos de CDR), por ejemplo, para restaurar o mejorar la especificidad o afinidad del anticuerpo.

En algunos casos, el CAR contiene un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno (por ejemplo, scFv) que reconoce específicamente un antígeno, como un antígeno intacto, expresado en la superficie de una célula.

En algunos casos, el CAR contiene un anticuerpo similar al TCR, como un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno (por ejemplo, scFv) que reconoce específicamente un antígeno intracelular, como un antígeno asociado a tumores, presentado en la superficie celular como un complejo MHC-péptido. En algunos casos, un anticuerpo o una parte de unión a antígeno del mismo que reconoce un complejo MHC-péptido puede expresarse en células como parte de un receptor recombinante, como un receptor de antígeno. Entre los receptores de antígenos se encuentran los receptores de antígenos funcionales no TCR, como los receptores de antígenos quiméricos (CAR). En general, un CAR que contiene un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que muestra una especificidad similar al TCR dirigida contra complejos péptido-MHC también puede denominarse CAR similar al TCR.

La referencia al "complejo mayor de histocompatibilidad" (MHC) se refiere a una proteína, generalmente una glicoproteína, que contiene un sitio de unión a péptidos polimórficos o surco de unión que puede, en algunos casos, formar complejos con antígenos peptídicos de polipéptidos, incluyendo antígenos peptídicos procesados por la maquinaria celular. En algunos casos, las moléculas MHC pueden mostrarse o expresarse en la superficie celular, incluso como un complejo con un péptido, es decir, complejo MHC-péptido, para la presentación de un antígeno en una conformación reconocible por un receptor de antígeno en células T, como un TCR o anticuerpo similar al TCR. Generalmente, las moléculas MHC de clase I son heterodímeros que tienen una cadena a que abarca toda la membrana, en algunos casos con tres dominios a, y una microglobulina p2 asociada de no covalentemente. Por lo general, las moléculas MHC de clase II están compuestas por dos glicoproteínas transmembrana, a y p, ambas de las cuales suelen abarcar la membrana. Una molécula del MHC puede incluir una parte efectiva de un MHC que contenga un sitio o sitios de unión a antígeno para unir un péptido y las secuencias necesarias para el reconocimiento por el receptor de antígeno apropiado. En algunos casos, las moléculas de MHC de clase I transportan péptidos originados en el citosol a la superficie celular, donde un complejo MHC-péptido es reconocido por células T, como generalmente células T CD8+, pero en algunos casos células T CD4+. En algunos casos, las moléculas de MHC de clase II transportan péptidos originados en el sistema vesicular a la superficie celular, donde son reconocidos típicamente por las células T CD4+. Generalmente, las moléculas MHC están codificadas por un grupo de loci enlazados, que se denominan colectivamente H-2 en el antígeno leucocitario de ratón y humano (HLA) en humanos. Por lo tanto, el MHC típicamente humano también puede denominarse antígeno leucocitario humano (HLA).

El término "complejo MHC-péptido" o "complejo péptido-MHC", o variaciones del mismo, se refiere a un complejo o asociación de un antígeno peptídico y una molécula de MHC, por ejemplo, generalmente, mediante interacciones no covalentes del péptido en el surco o hendidura de unión de la molécula de MHC. En algunos casos, el complejo MHC-péptido está presente o se muestra en la superficie de las células. En algunos casos, el complejo MHC-péptido puede ser reconocido específicamente por un receptor de antígeno, como un TCR, un CAR tipo t Cr o partes de unión a antígeno del mismo.

El término "antígeno peptídico" o "epítopo peptídico" se refiere a un péptido de un polipéptido que puede asociarse con una molécula del MHC, por ejemplo para ser reconocido por un receptor de antígeno. Generalmente, el péptido se deriva o se basa en un fragmento de una molécula biológica más larga, como un polipéptido o una proteína. En algunos casos, el péptido tiene típicamente entre 8 y 24 aminoácidos de longitud. En algunos casos, un péptido tiene una longitud de o de aproximadamente 9 a 22 aminoácidos para su reconocimiento en el complejo MHC Clase II. En algunos casos, un péptido tiene una longitud de 8 a 13 aminoácidos para su reconocimiento en el complejo MHC de clase I. En algunos casos, tras el reconocimiento del péptido por el complejo MHC de clase I, el péptido tiene una longitud de 24 aminoácidos. En algunos casos, tras el reconocimiento del péptido en el contexto de una molécula MHC, como el complejo MHC-péptido, el receptor de antígeno, como TCR o<c>A<r>tipo TCR, produce o desencadena una señal de activación a la célula T que induce una respuesta de célula T, como proliferación de célula T, producción de citoquinas, una respuesta de célula T citotóxica u otra respuesta.

En algunos casos, un anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un complejo MHC-péptido, puede producirse inmunizando a un huésped con una cantidad eficaz de un inmunógeno que contenga un complejo MHC-péptido específico. En algunos casos, el péptido del complejo MHC-péptido es un epítopo de antígeno capaz de unirse al MHC, como un antígeno tumoral, por ejemplo un antígeno tumoral universal, antígeno de mieloma u otro antígeno como se describe a continuación. En algunos casos, se administra luego una cantidad eficaz del inmunógeno a un huésped para provocar una respuesta inmunitaria, en donde el inmunógeno retiene una forma tridimensional del mismo durante un periodo de tiempo suficiente para provocar una respuesta inmunitaria contra la presentación tridimensional del péptido en el surco de unión de la molécula del MHC. A continuación, se analiza el suero recogido del huésped para determinar si se producen anticuerpos deseados que reconozcan la presentación tridimensional del péptido en el surco de unión de la molécula del MHC. En algunos casos, los anticuerpos producidos pueden evaluarse para confirmar que el anticuerpo puede diferenciar el complejo MHC-péptido de la molécula de MHC sola, el péptido de interés solo, y un complejo de MHC y péptido irrelevante. Luego, pueden aislarse los anticuerpos deseados.

En algunos casos, un anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un complejo MHC-péptido puede producirse empleando métodos de presentación en bibliotecas de anticuerpos, como bibliotecas de anticuerpos fago. En algunos casos, pueden generarse bibliotecas de presentación de fagos de Fab mutante, scFV u otras formas de anticuerpo, por ejemplo, en las que los miembros de la biblioteca están mutados en uno o más residuos de una CDR o varias CDR. Los ejemplos de tales métodos son conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, la solicitud publicada de Estados Unidos N° US20020150914, US2014/0294841; y Cohen CJ. et al. (2003) J Mol. Recogn. 16:324-332).

En algunos aspectos, el componente de unión o reconocimiento específico de antígeno está enlazado a uno o más dominios de señalización transmembrana e intracelular. En algunos casos, el CAR incluye un dominio transmembrana fusionado con el dominio extracelular del CAR. En un caso, se usa el dominio transmembrana que se asocia de manera natural con uno de los dominios del CAR. En algunos casos, el dominio transmembrana se selecciona o modifica mediante sustitución de aminoácidos para evitar la unión de tales dominios a los dominios transmembrana de las mismas proteínas de membrana de superficie o unas diferentes para minimizar las interacciones con otros miembros del complejo receptor.

En algunos casos, el dominio transmembrana se deriva de una fuente natural o sintética. Cuando la fuente es natural, el dominio en algunos aspectos se deriva de cualquier proteína unida a la membrana o transmembrana. Las regiones transmembrana incluyen las derivadas de (es decir, comprenden por lo menos la región o regiones transmembrana de) la cadena alfa, beta o zeta del receptor de células T, CD28,<c>D3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CDS, CD9, CD 16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD 154. Alternativamente, en algunos casos el dominio transmembrana es sintético. En algunos aspectos, el dominio transmembrana sintético comprende residuos predominantemente hidrófobos como leucina y valina. En algunos aspectos, se encontrará un triplete de fenilalanina, triptófano y valina en cada extremo de un dominio transmembrana sintético.

En algunos casos, está presente un conector oligo- polipeptídico corto, por ejemplo, un conector de entre 2 y 10 aminoácidos de longitud, como uno que contenga glicinas y serinas, por ejemplo, un doblete glicina-serina, y forma un enlace entre el dominio transmembrana y el dominio de señalización citoplasmática del CAR.

El CAR generalmente incluye por lo menos un componente o componentes de señalización intracelular. En algunos casos, la CAR incluye un componente intracelular del complejo TCR, como una cadena TCR CD3+ que media la activación de células T y la citotoxicidad, por ejemplo, la cadena CD3 zeta. Por tanto, en algunos aspectos, la molécula de unión a antígeno está enlazada a uno o más módulos de señalización celular. En algunos casos, los módulos de señalización celular incluyen el dominio transmembrana CD3, dominios de señalización intracelular CD3 y/u otros dominios transmembrana CD. En algunos casos, el CAR incluye además una parte de una o más moléculas adicionales como el receptor Fc y, CD8, CD4, CD25, o CD16. Por ejemplo, en algunos aspectos, la CAR incluye una molécula quimérica entre CD3-zeta (CD3-Z) o receptor Fc y y CD8, Cd 4, CD25 o CD16.

En algunos casos, tras la ligadura de la CAR, el dominio citoplasmático o el dominio de señalización intracelular de la CAR activa por lo menos una de las funciones o respuestas efectoras normales de la célula inmunitaria, por ejemplo, la célula T manipulada para expresar la célula. Por ejemplo, en algunos contextos, el CAR induce una función de una célula T, como la actividad citolítica o la actividad T auxiliar, como la secreción de citoquinas u otros factores. En algunos casos, una parte truncada de un dominio de señalización intracelular de un componente receptor de antígeno o molécula coestimuladora. En algunos aspectos, dicha parte truncada se usa en lugar de una cadena inmunoestimuladora intacta, por ejemplo, si transduce la señal de función efectora. En algunos casos, el dominio o dominios de señalización intracelular incluyen las secuencias citoplasmáticas del receptor de células T (TCR), y en algunos aspectos también las de los correceptores que en el contexto natural actúan en concierto con dicho receptor para iniciar la transducción de la señal tras el acoplamiento del receptor de antígeno, y/o cualquier derivado o variante de tales moléculas, y/o cualquier secuencia sintética que tenga la misma capacidad funcional.

En el contexto de un TCR natural, la activación completa generalmente requiere no sólo la señalización a través del TCR, sino también una señal coestimuladora. Por tanto, en algunos casos, para promover la activación completa, también se incluye en el CAR un componente para generar una señal secundaria o coestimuladora. En otros casos, el CAR no incluye un componente para generar una señal coestimuladora. En algunos aspectos, se expresa un CAR adicional en la misma célula y proporciona el componente para generar la señal secundaria o coestimuladora. En algunos aspectos, la célula comprende un primer CAR que contiene dominios de señalización para inducir la señal primaria y un segundo CAR que se une a un segundo antígeno y contiene el componente para generar una señal coestimuladora. Por ejemplo, un primer CAR puede ser un CAR activador y el segundo CAR puede ser un CAR coestimulador. En algunos aspectos, ambos CAR deben ligarse para inducir una función efectora particular en la célula, lo que puede proporcionar especificidad y selectividad para el tipo de célula al que se dirige.

En algunos aspectos, la activación de células T se describe como mediada por dos clases de secuencias de señalización citoplasmática: las que inician la activación primaria dependiente del antígeno a través del TCR (secuencias de señalización citoplasmática primaria), y las que actúan de manera independiente del antígeno para proporcionar una señal secundaria o coestimuladora (secuencias de señalización citoplasmática secundaria). En algunos aspectos, el CAR incluye uno o ambos de tales componentes de señalización.

En algunos aspectos, el CAR incluye una secuencia de señalización citoplasmática primaria que regula la activación primaria del complejo TCR de manera estimuladora o de manera inhibidora. Las secuencias de señalización citoplasmática primaria que actúan de manera estimuladora pueden contener motivos de señalización que se conocen como motivos de activación basados en tirosina inmunorreceptora o ITAM. Los ejemplos de ITAM que contienen secuencias de señalización citoplasmáticas primarias incluyen las derivadas de t Cr zeta, FcR gamma, FcR beta, CD3 gamma, CD3 delta, CD3 epsilon, CDS, CD22, CD79a, CD79b y CD66d. En algunos casos, la molécula o moléculas de señalización citoplasmática en la CAR contienen un dominio de señalización citoplasmática, una parte del mismo o una secuencia derivada de CD3 zeta.

En algunos casos, el CAR incluye un dominio de señalización y/o una parte transmembrana de un receptor coestimulador, como CD28, 4-1BB, OX40, DAP10 e ICOS. En algunos aspectos, el mismo CAR incluye los componentes activador y coestimulador; en otros aspectos, el dominio activador es proporcionado por un CAR mientras que el componente coestimulador es proporcionado por otro CAR que reconoce otro antígeno.

En ciertos casos, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio transmembrana y de señalización CD28 enlazado a un dominio intracelular CD3 (por ejemplo, CD3-zeta). En algunos casos, el dominio de señalización intracelular comprende unos dominios coestimuladores quiméricos CD28 y CD137 (4-1BB, TNFRSF9), enlazados a un dominio intracelular CD3 zeta.

En algunos casos, el CAR abarca dos o más dominios coestimuladores combinados con un dominio de activación, por ejemplo, un dominio de activación primario, en la parte citoplasmática. Un ejemplo es un receptor que incluye componentes intracelulares de CD3-zeta, CD28 y 4-1BB.

En algunos casos, el CAR u otro receptor de antígeno incluye además un marcador para confirmar la transducción o manipulación de la célula para expresar el receptor, como una versión truncada de un receptor de superficie celular, como EGFR truncado, tEGFR).

En algunos casos, los CAR se denominan CAR de primera, segunda y/o tercera generación. En algunos aspectos, un CAR de primera generación es aquel que únicamente proporciona una señal inducida por la cadena CD3 tras la unión al antígeno; en algunos aspectos, un CAR de segunda generación es aquel que proporciona dicha señal y una señal coestimuladora, como la que incluye un dominio de señalización intracelular de un receptor coestimulador como CD28 o CD137; en algunos aspectos, un CAR de tercera generación en algunos aspectos es aquel que incluye múltiples dominios coestimuladores de diferentes receptores coestimuladores.

En algunos aspectos, el CAR u otro receptor de antígeno es un CAR inhibidor (por ejemplo, iCAR) e incluye componentes intracelulares que amortiguan o suprimen una respuesta, como una respuesta inmunitaria, como una respuesta promovida por ITAM y/o coestimuladores en la célula. Los ejemplos de tales componentes de señalización intracelular son los que se encuentran en moléculas de punto de control inmunitario, incluyendo receptores de PD-1, CTLA4, LAG3, BTLA, OX2R, TIM-3, TIGIT, LAIR-1, PGE2, receptores de adenosina EP2/4, incluyendo A2AR. En algunos aspectos, la célula manipulada incluye un CAR inhibidor que incluye un dominio de señalización de o derivado de dicha molécula inhibidora, de tal manera que sirve para amortiguar la respuesta de la célula, por ejemplo, la inducida por un CAR activador y/o coestimulador. Tales CAR se usan, por ejemplo, para reducir la probabilidad de efectos fuera de objetivo en el contexto en el que el antígeno reconocido por el receptor activador, por ejemplo, CAR, también se expresa o también puede expresarse en la superficie de células normales. En algunos aspectos, se introduce un receptor inhibidor, por ejemplo, iCAR, que reconoce un marcador específico para la célula normal. En algunos aspectos, cuando dicho antígeno también se expresa en la célula manipulada, el antígeno es el objetivo de los enfoques de edición o alteración génica divulgados en la presente. En algunos aspectos, dicha alteración evita la amortiguación de la respuesta de las células manipuladas inducida por las propias células manipuladas.

TCRs

En algunos casos, los receptores de antígenos manipulados genéticamente incluyen receptores de células T recombinantes (TCR) y/o TCR clonados a partir de células T de origen natural.

Un "receptor de células T" o "TCR" se refiere a una molécula que contiene cadenas a y p variables (también conocidas como TCRa y TCRp, respectivamente) o cadenas y y 6 variables (también conocidas como TCRy y TCR6, respectivamente) y que es capaz de unirse específicamente a un péptido de antígeno unido a un receptor del MHC. En algunos casos, el TCR tiene la forma ap. Típicamente, los t Cr que existen en las formas ap y y6 suelen ser estructuralmente similares, pero las células T que los expresan pueden tener funciones o localizaciones anatómicas distintas. Un TCR puede encontrarse en la superficie de una célula o en forma soluble. Generalmente, un TCR se encuentra en la superficie de las células T (o linfocitos T), donde generalmente es responsable de reconocer antígenos unidos a moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). En algunos casos, un TCR también puede contener un dominio constante, un dominio transmembrana y/o una cola citoplasmática corta (ver, por ejemplo, Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3a Ed., Current Biology Publications, p.

4:33, 1997). Por ejemplo, en algunos aspectos, cada cadena del TCR puede poseer un dominio variable de inmunoglobulina N-terminal, un dominio constante de inmunoglobulina, una región transmembrana y una cola citoplasmática corta en el extremo C-terminal. En algunos casos, un TCR se asocia con proteínas invariantes del complejo CD3 implicadas en la mediación de la transducción de señales. A menos que se indique lo contrario, debe entenderse que el término "TCR" abarca fragmentos funcionales del TCR. El término también abarca los TCR intactos o de longitud completa, incluyendo los TCR en forma ap o y6.

Por tanto, a efectos de la presente, la referencia a un TCR incluye cualquier TCR o fragmento funcional, como una parte de unión a antígeno de un TCR que se une a un péptido antigénico específico unido en una molécula MHC, es decir, complejo MHC-péptido. Una "parte de unión a antígeno" o "fragmento de unión a antígeno" de un TCR, que pueden usarse indistintamente, se refiere a una molécula que contiene una parte de los dominios estructurales de un TCR, pero que se une al antígeno (por ejemplo, complejo MHC-péptido) al que se une el TCR completo. En algunos casos, una parte de unión a antígeno contiene los dominios variables de un TCR, como la cadena a variable y la cadena p variable de un TCR, suficientes para formar un sitio de unión para unirse a un complejo MHC-péptido específico, como generalmente cuando cada cadena contiene tres regiones determinantes de la complementariedad.

En algunos casos, los dominios variables de las cadenas del TCR se asocian para formar giros, o regiones determinantes de la complementariedad (CDR) análogas a las inmunoglobulinas, que confieren el reconocimiento del antígeno y determinan la especificidad del péptido formando el sitio de unión de la molécula del TCR y determinan la especificidad del péptido. Típicamente, al igual que las inmunoglobulinas, las CDR están separadas por regiones marco (FR) (ver, por ejemplo, Jores et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 87:9138, 1990; Chothia et al., Em Bo J. 7:3745, 1988; ver también Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27:55, 2003). En algunos casos, la CDR3 es la principal CDR responsable de reconocer el antígeno procesado, aunque también se ha demostrado que la CDRl de la cadena alfa interactúa con la parte N-terminal del péptido antigénico, mientras que la CDRl de la cadena beta interactúa con la parte C-terminal del péptido. Se cree que la CDR2 reconoce la molécula MHC. En algunos casos, la región variable de la cadena p puede contener otra región de hipervariabilidad (HV4).

En algunos casos, las cadenas de TCR contienen un dominio constante. Por ejemplo, como las inmunoglobulinas, la parte extracelular de las cadenas de TCR (por ejemplo, cadena a, cadena p) puede contener dos dominios de inmunoglobulina, un dominio variable (por ejemplo, Va o Vp; típicamente aminoácidos 1 a 116 basados en la numeración de Kabat, Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5a ed.) en el extremo N-terminal, y un dominio constante (por ejemplo, dominio constante de cadena a o Ca, típicamente aminoácidos 117 a 259 basado en Kabat, dominio constante de cadena p o Cp, típicamente aminoácidos 117 a 295 basado en Kabat) adyacente a la membrana celular. Por ejemplo, en algunos casos, la parte extracelular del TCR formada por las dos cadenas contiene dos dominios constantes proximales a la membrana y dos dominios variables distales a la membrana que contienen las CDR. El dominio constante del TCR contiene secuencias de conexión cortas en las que un residuo de cisteína forma un enlace disulfuro, estableciendo un enlace entre las dos cadenas. En algunos casos, un TCR puede tener un residuo de cisteína adicional en cada una de las cadenas a y p, de tal manera que el TCR contiene dos enlaces disulfuro en los dominios constantes.

En algunos casos, las cadenas TCR pueden contener un dominio transmembrana. En algunos casos, el dominio transmembrana está cargado positivamente. En algunos casos, las cadenas del TCR contienen una cola citoplasmática. En algunos casos, la estructura permite que el TCR se asocie con otras moléculas como CD3. Por ejemplo, un TCR que contenga dominios constantes con una región transmembrana puede anclar la proteína en la membrana celular y asociarse con subunidades invariantes del aparato o complejo de señalización CD3.

En general, CD3 es un complejo multiproteico que puede poseer tres cadenas distintas (y, 8 y £) en mamíferos y la cadena Z. Por ejemplo, en los mamíferos el complejo puede contener una cadena CD3y, una cadena CD38, dos cadenas CD3e y un homodímero de cadenas CD3Z. Las cadenas CD3y, CD38 y CD3e son proteínas de superficie celular altamente relacionadas de la superfamilia de las inmunoglobulinas que contienen un único dominio de inmunoglobulina. Las regiones transmembrana de las cadenas CD3y, CD38 y CD3e están cargadas negativamente, característica que les permite asociarse con las cadenas de receptores de células T cargadas positivamente. Las colas intracelulares de las cadenas CD3<y>, CD38 y CD3<e>contienen cada una un único motivo conservado conocido como motivo de activación basado en tirosina inmunorreceptora o ITAM, mientras que cada cadena CD3Z tiene tres. En general, los ITAM están implicados en la capacidad de señalización del complejo TCR. Estas moléculas accesorias tienen regiones transmembrana cargadas negativamente y desempeñan un papel en la propagación de la señal del TCR a la célula. Las cadenas CD3- y Z, junto con el TCR, forman lo que se conoce como complejo receptor de células T.

En algunos casos, el TCR puede ser un heterodímero de dos cadenas a y p (u opcionalmente<y>y 8) o puede ser un constructo de TCR de cadena sencilla. En algunos casos, el TCR es un heterodímero que contiene dos cadenas separadas (cadenas a y p o cadenas y y 8) que están enlazadas, por ejemplo mediante un enlace disulfuro o enlaces disulfuro.

En algunos casos, se identifica un TCR para un antígeno objetivo (por ejemplo, un antígeno cancerígeno) y se introduce en las células. En algunos casos, el ácido nucleico que codifica el TCR puede obtenerse de una variedad de fuentes, como por amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de secuencias de ADN de TCR disponibles públicamente. En algunos casos, el TCR se obtiene a partir de una fuente biológica, como por ejemplo de células, como por ejemplo de una célula T (por ejemplo, célula T citotóxica), hibridomas de células T u otra fuente disponible públicamente. En algunos casos, las células T pueden obtenerse a partir de células aisladasin vivo.En algunos casos, puede aislarse un clon de células T de alta afinidad de un paciente y aislar el TCR. En algunos casos, las células T pueden ser un hibridoma o clon de células T cultivadas. En algunos casos, el clon de TCR para un antígeno objetivo se ha generado en ratones transgénicos manipulados genéticamente con genes del sistema inmunitario humano (por ejemplo, el sistema de antígenos leucocitarios humanos, o HLA). Consultar, por ejemplo, los antígenos tumorales (ver, por ejemplo, Parkhurst et al. (2009) Clin Cancer Res. 15:169-180 y Cohen et al. (2005) J Immunol. 175:5799-5808. En algunos casos, se usa la presentación de fagos para aislar TCR contra un antígeno objetivo (ver, por ejemplo, Varela-Rohena et al. (2008) NatMed. 14:1390-1395 y Li (2005) Nat Biotechnol. 23:349-354. En algunos casos, el TCR o la parte de unión a antígeno del mismo puede generarse sintéticamente a partir del conocimiento de la secuencia del TCR.

En algunos casos, una vez obtenido el clon de células T, las cadenas TCR alfa y beta se aíslan y clonan en un vector de expresión génica. En algunos casos, los genes TCR alfa y beta se enlazan mediante un péptido de omisión ribosomal de picornavirus 2A de tal manera que ambas cadenas se coexpresen. En algunos casos, la transferencia genética del TCR se realiza mediante vectores retrovirales o lentivirales, o mediante transposones (ver, por ejemplo, Baum et al. (2006) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13:1050-1063; Frecha et al. (2010) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 18:1748-1757; y Hackett et al. (2010) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 18:674-683.

Antígenos

Entre los antígenos a los que se dirigen los receptores de antígenos manipulados genéticamente se encuentran los expresados en el contexto de una enfermedad, afección o tipo de célula a la que se dirige la terapia celular adoptiva. Entre las enfermedades y afecciones se encuentran enfermedades y trastornos proliferativos, neoplásicos y malignos, incluyendo cánceres y tumores, incluyendo cánceres hematológicos, cánceres del sistema inmunitario, como linfomas, leucemias y/o mielomas, como leucemias B, T y mieloides, linfomas y mielomas múltiples.

En algunos casos, el antígeno es un polipéptido. En algunos casos, es un carbohidrato u otra molécula. En algunos casos, el antígeno se expresa selectivamente o se sobreexpresa en las células de la enfermedad o afección, por ejemplo, el tumor o las células patógenas, en comparación con las células o tejidos normales o no objetivo. En otros casos, el antígeno se expresa en las células normales y/o en las células manipuladas. En algunos casos, para mejorar la especificidad y/o la eficacia, se usa un enfoque multiobjetivo y/o de alteración génica, como se divulga en la presente.

En algunos casos, el antígeno es un antígeno tumoral universal. El término "antígeno tumoral universal" se refiere a una molécula inmunogénica, como una proteína, que, por lo general, se expresa a un nivel más alto en las células tumorales que en las no tumorales y también se expresa en tumores de diferentes orígenes. En algunos casos, el antígeno tumoral universal se expresa en más del 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o más de los cánceres humanos. En algunos casos, el antígeno tumoral universal se expresa en por lo menos tres, por lo menos cuatro, por lo menos cinco, por lo menos seis, por lo menos siete, por lo menos ocho o más tipos diferentes de tumores. En algunos casos, el antígeno tumoral universal puede expresarse en células no tumorales, como células normales, pero a niveles inferiores a los que se expresa en células tumorales. En algunos casos, el antígeno tumoral universal no se expresa en absoluto en células no tumorales, al igual que no se expresa en células normales. Los antígenos tumorales universales ejemplares incluyen, por ejemplo, la transcriptasa inversa telomerasa humana (hTERT), la survivina, el homólogo doble minuto 2 de ratón (MDM2), el citocromo P450 1B1 (CYP1B), HER2/neu, gen 1 del tumor de Wilms (WT1), livina, alfafetoproteína (AFP), antígeno carcinoembrionario (CEA), mucina 16 (MUC16), MUC1, antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA), p53 o ciclina (D1). Los epítopos peptídicos de antígenos tumorales, incluyendo los antígenos tumorales universales, se conocen en la técnica y, en algunos aspectos, pueden usarse para generar receptores de antígenos restringidos por el MHC, como TCR o CAR similares a TCR (ver, por ejemplo, la solicitud PCT publicada N° WO2011009173 o WO2012135854 y la solicitud estadounidense publicada N° US20140065708).

Por ejemplo, en algunos casos, el antígeno es hTERT. El hTERT es un antígeno tumoral que se expresa ampliamente en varios tipos de cáncer. En algunos aspectos, hTERT tiene o contiene una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:3 (N° de Registro de GenBank NP_937983.2) y codificada por una secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO:4 (N° de Registro de GenBank NM_198253.2). En general, el hTERT es una transcriptasa inversa que forma parte del complejo de la telomerasa humana, que es un complejo que puede mantener los extremos teloméricos de los cromosomas lineales y, en algunos casos, protege los cromosomas de la degradación y la fusión de extremo a extremo. En algunos aspectos, la expresión de hTERT da lugar a la síntesis de teleómeros a partir de una plantilla de ARN, y su expresión puede correlacionarse con la actividad de la telomerasa porque es el componente limitador de la velocidad del complejo. En general, el hTERT no se expresa en la mayoría de las células humanas, incluyendo las células normales, pero se expresa o se regula por incremento en tumores y células cancerosas. Por ejemplo, más del 85% de los tumores humanos expresan hTERT. Por tanto, en algunos aspectos, el hTERT puede ser un antígeno tumoral universal. Se conocen epítopos peptídicos de hTERT restringidos por HLA (ver, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 7.718.777 y las solicitudes de PCT publicadas N° WO2000025813 y WO2013135553) y, en algunos aspectos, pueden usarse para generar o identificar receptores de antígenos contra hTERT. Ejemplos no limitativos de epítopos peptídicos de hTERT incluyen cualquiera de las SEQ ID NO: 7-19. Se han generado receptores de antígenos contra hTERT, como TCR o anticuerpos similares a TCR, y se conocen en la técnica (ver, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 7.718.777 y las solicitudes de patente de Estados Unidos publicadas US20090226474 y US20030223994; vertambién Ugel et al. (2010) Blood, 115:1374-1384).

En algunos casos, el antígeno es survivina (también denominada inhibidor baculoviral de la apoptosis que contiene la repetición 5, BIRC5). En algunos aspectos, la survivina tiene o contiene una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:5 (N° de Registro de GenBank NP_001159) y codificada por una secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO:6 (N° de Registro de GenBank NM_001168.2). En algunos casos, pueden existir otras isoformas de transcripción, como las que tienen o contienen una secuencia de aminoácidos o nucleótidos referenciada en N° de Registro de GenBank Np_001012270 o NM_001012270, respectivamente, o NP_001012271.1 o NM_001012271.1, respectivamente. En general, la survivina es un miembro de la familia de las proteínas inhibidoras de la apoptosis (IAP). En algunos casos, la survivina está regulada por incremento en muchos tipos de cáncer, como pulmón, colon, mama, páncreas, próstata, melanoma y otros, pero generalmente no se expresa o regula por incremento en células o tejidos normales. En algunos aspectos, la expresión de survivina en el cáncer puede estar relacionada con un papel general de inhibición de la apoptosis en la progresión tumoral. Por tanto, en algunos aspectos, la survivina puede ser un antígeno tumoral universal. Se conocen epítopos peptídicos de survivina restringidos por HLA (ver, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 7.892.559 y la solicitud de patente de Estados Unidos publicada N° US20090004214), y, en algunos casos, tales epítopos peptídicos pueden usarse para generar o identificar receptores de antígenos contra survivina, incluyendo TCR o CAR similares a TCR. Ejemplos no limitativos de epítopos peptídicos de survivina incluyen cualquiera de las SEQ ID NO: 20-30. Se han generado receptores de antígeno contra survivina, como TCR o anticuerpos similares a TCR, y se conocen en la técnica (ver, por ejemplo, la solicitud de PCT publicada N° WO2010075417).

En algunos aspectos, el antígeno se expresa en el mieloma múltiple, como CD38, CD138, y/o CS-1. Otros antígenos de mieloma múltiple ejemplares incluyen CD56, TIM-3, CD33, CD123, y/o CD44. Se conocen los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno dirigidos contra tales antígenos e incluyen, por ejemplo, los descritos en las Patentes de Estados Unidos N° 8.153.765; 8.603477, 8.008.450; la solicitud de Estados Unidos publicada N° US20120189622; y las solicitudes internacionales de PCT publicadas N° WO2006099875, WO2009080829 o WO2012092612. En algunos casos, pueden usarse tales anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos (por ejemplo, scFv) para generar un CAR.

En algunos casos, el antígeno es un antígeno CD38 que es un CD38 humano. En algunos aspectos, el CD38 tiene o contiene una secuencia de aminoácidos referenciada en el N° de registro de GenBank: BAA18966, por ejemplo, en BAA18966.1, o que está referenciada en GI:1911103. En algunos aspectos, tiene o contiene la siguiente secuencia: mancefspvs gdkpccrlsr raqlclgvsi lvlilvwla vvvprwrqqw sgpgttkrfp etvlarcvky teihpemrhv dcqsvwdafk gafiskhpcn iteedyqplm klgtqtvpcn killwsrikd lahqftqvqr dmftledtll gyladdltwc gefntskiny qscpdwrkdc snnpvsvfwk tvsrrfaeaa cdwhvmlng srskifdkns tfgsvevhnl qpekvqtlea wvihggreds rdlcqdptik elesiiskrn iqfsckniyr pdkflqcvkn pedssctsei (SEQ ID NO:1). En algunos aspectos, el antígeno CD38 puede estar codificado por la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO:2. En algunos casos, la parte del antígeno a la que se une específicamente el dominio de unión a antígeno se encuentra típicamente dentro de la región extracelular del antígeno. Por ejemplo, con referencia a la SEQ ID NO:1, la región extracelular corresponde a los residuos de aminoácidos 43-300 de la SEQ ID NO:1, En algunos casos, el antígeno puede ser uno que se exprese o regule por incremento en células cancerosas o tumorales, pero que también puede expresarse en una célula inmunitaria, como una célula T en reposo o activada. Por ejemplo, en algunos casos, se ha notificado que la expresión de hTERT, survivina y otros antígenos tumorales universales está presente en linfocitos, incluyendo linfocitos T activados (ver, por ejemplo, Weng et al. (1996) J Exp. Med., 183:2471-2479; Hathcock et al. (1998) J Immunol., 160:5702-5706; Liu et al. (1999) Proc. Natl Acad Sci., 96:5147-5152; Turksma et al. (2013) Journal of Translational Medicine, 11:152). De igual manera, en algunos casos, CD38 y otros antígenos tumorales también pueden expresarse en células inmunitarias, como células T, como las reguladas por incremento en células T activadas. Por ejemplo, en algunos aspectos, CD38 es un marcador de activación de células T conocido. En algunos casos, como se divulga en la presente, una célula inmunitaria, como una célula T, puede modificarse para reprimir o alterar el gen que codifica el antígeno en la célula inmunitaria, de tal manera que el receptor de antígeno manipulado genéticamente expresado no se una específicamente al antígeno en el contexto de su expresión en la propia célula inmunitaria. Por tanto, en algunos aspectos, esto puede evitar efectos fuera del objetivo, como la unión de las células inmunitarias manipuladas a sí mismas, lo que puede reducir la eficacia de la manipulación en las células inmunitarias, por ejemplo, en relación con la terapia celular adoptiva.

En algunos casos, como en el caso de un CAR inhibidor, el objetivo es un marcador no objetivo, como un antígeno no expresado en la célula enferma o en la célula objetivo, pero que se expresa en una célula normal o no enferma que también expresa un objetivo específico de la enfermedad a la que se dirige un receptor activador o estimulador en la misma célula manipulada. Ejemplos de tales antígenos son las moléculas MHC, como las moléculas MHC de clase I, por ejemplo, en relación con el tratamiento de enfermedades o afecciones en las que tales moléculas se desregulan pero permanecen expresadas en células no objetivo.

En algunos casos, las células inmunitarias manipuladas pueden contener un antígeno que se dirige a uno o más de otros antígenos. En algunos casos, el uno o más de otros antígenos son antígenos tumorales o marcadores de cáncer. Otros antígenos a los que se dirigen los receptores de antígenos en las células inmunitarias divulgadas pueden, en algunos casos, incluir el receptor huérfano de tirosina quinasa ROR1, tEGFR, Her2, Ll-CAM, CD19, CD20, CD22, mesotelina, CEA, y antígeno de superficie de la hepatitis B, receptor antifolato, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, 3, o 4, FBP, receptor fetal de la aceticolina e, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-alfa, IL-13R-alfa2, kdr, cadena ligera kappa, Lewis Y, molécula de adhesión celular L1, MAGE-A1, mesotelina, MUC1, MUC16, PSCA, ligandos NKG2D, NY-ESO-1, MART-1, gp100, antígeno oncofetal, ROR1, TAG72, VEGF-R2, antígeno carcinoembrionario (CEA), antígeno prostático específico, PSMA, Her2/neu, receptor de estrógenos, receptor de progesterona, efrinaB2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2, y MAGE A3, CE7, tumor de Wilms 1 (WT-1), una ciclina, como la ciclina A1 (CCNA1), y/o moléculas biotiniladas, y/o moléculas expresadas por el VIH, el VHC, el VHB u otros patógenos.

En algunos casos, el CAR se une a un antígeno específico de patógeno. En algunos casos, el CAR es específico para antígenos víricos (como VIH, VHC, VHB, etc.), antígenos bacterianos y/o antígenos parasitarios.

Multiobjetivo

En algunos casos, las células y los métodos incluyen estrategias multiobjetivo, como la expresión de dos o más receptores manipulados genéticamente en la célula, cada uno de los cuales reconoce un antígeno diferente y típicamente cada uno incluye un componente de señalización intracelular diferente. Tales estrategias multiobjetivo se describen, por ejemplo, en la Solicitud de Patente Internacional, N° de Publicación: WO 2014055668 A1 (que describe combinaciones de CAR activadores y coestimuladores, por ejemplo, dirigidos a dos antígenos diferentes presentes individualmente en células no objetivo, por ejemplo, normales, pero presentes juntos solo en células de la enfermedad o afección que se va a tratar) y Fedorovet al., Sci. Transl. Medicine, 5(215) (diciembre de 2013) (que describen células que expresan un CAR activador y uno inhibidor, como aquellas en las que el CAR activador se une a un antígeno expresado tanto en células normales o no enfermas como en células de la enfermedad o afección que se desea tratar, y el CAR inhibidor se une a otro antígeno expresado únicamente en las células normales o en las células que no se desea tratar).

En algunos casos, la estrategia multiobjetivo se emplea en un caso en el que un antígeno asociado a una enfermedad o afección particular se expresa en una célula no enferma y/o se expresa en la propia célula manipulada, ya sea de forma transitoria (por ejemplo, tras la estimulación asociada a la ingeniería genética) o permanente. En tales casos, al requerir la ligadura de dos receptores de antígenos separados e individualmente específicos, puede mejorarse la especificidad, selectividad y/o eficacia.

Por ejemplo, en algunos casos, las células incluyen un receptor que expresa un primer receptor de antígeno manipulado genéticamente (por ejemplo, CAR o TCR) que es capaz de inducir una señal activadora a la célula, generalmente tras la unión específica al antígeno reconocido por el primer receptor, por ejemplo, el primer antígeno. En algunos casos, la célula incluye además un segundo receptor de antígeno manipulado genéticamente (por ejemplo, CAR o TCR), por ejemplo, un receptor coestimulador quimérico, que es capaz de inducir una señal coestimuladora a la célula inmunitaria, generalmente tras la unión específica a un segundo antígeno reconocido por el segundo receptor. En algunos aspectos, el primer receptor incluye un componente de señalización intracelular que contiene ITAM o motivos similares a ITAM. En algunos aspectos, el segundo receptor incluye dominios de señalización intracelular de receptores coestimuladores como CD28, CD137 (4-1 BB), OX40, y/o ICOS.

En algunos casos, la activación inducida por el primer receptor implica una transducción de señales o un cambio en la expresión de proteínas en la célula que da como resultado el inicio de una respuesta inmunitaria, como la fosforilación de ITAM y/o el inicio de la cascada de transducción de señales mediada por ITAM, la formación de una sinapsis inmunológica y/o la agrupación de moléculas cerca del receptor unido (por ejemplo CD4 o CD8, etc.), activación de uno o más factores de transcripción, como NF-kB y/o AP-1, y/o inducción de la expresión génica de factores como citoquinas, proliferación y/o supervivencia.

En algunos casos, la señal coestimuladora inducida por el segundo receptor, en combinación con la señal inducida por el primer receptor, es una señal que da como resultado una respuesta inmunitaria, como una respuesta inmunitaria robusta y sostenida, como el aumento de la expresión génica, la secreción de citoquinas y otros factores, y funciones efectoras mediadas por células T, como la destrucción celular.

En algunos casos, ni la ligadura del primer receptor solo ni la ligadura del segundo receptor solo inducen una respuesta inmunitaria robusta. En algunos aspectos, si sólo se liga un receptor, la célula se tolera o no responde al antígeno, o se inhibe, y/o no se induce a proliferar o secretar factores o llevar a cabo funciones efectoras. En algunos de tales casos, sin embargo, cuando la pluralidad de receptores está ligada, como en el encuentro de una célula que expresa el primer y el segundo antígenos, se consigue una respuesta deseada, como la activación o estimulación inmunitaria completa, por ejemplo, como indica la secreción de una o más citoquinas, la proliferación, la persistencia y/o la realización de una función efectora inmunitaria como la destrucción citotóxica de una célula objetivo.

En algunos casos, la pluralidad de antígenos, por ejemplo, el primer y el segundo antígenos, se expresan en la célula, tejido, enfermedad o afección a la que se dirigen, como en la célula cancerosa. En algunos aspectos, la célula, tejido, enfermedad o afección es mieloma múltiple o una célula de mieloma múltiple. Uno o más de la pluralidad de antígenos generalmente también se expresan en una célula a la que no se desea dirigir la terapia celular, como una célula o tejido normal o no enfermo, y/o las propias células manipuladas. En tales casos, al requerir la ligadura de múltiples receptores para lograr una respuesta de la célula, se consigue especificidad y/o eficacia.

En algunos casos, entre las combinaciones de antígenos para estrategias multiobjetivo se incluyen aquellas en las que por lo menos uno de los antígenos es un antígeno tumoral universal, como hTERT, survivina, MDM2, CYP1B, HER2/neu, WT1, livina, AFP, CEA, MUC16, MUC1, PSMA, p53 o ciclina (D1), cada uno individualmente en combinación con un segundo antígeno que también se dirige a un antígeno expresado en un tumor. En algunos casos, el antígeno tumoral universal y el segundo antígeno se dirigen a un antígeno del mismo tipo de tumor. En algunos casos, el segundo antígeno también puede ser otro antígeno tumoral universal diferente o puede ser un antígeno tumoral específico del tipo de tumor. En algunos casos, el segundo antígeno puede ser un antígeno tumoral, como RORl, tEGFR, Her2, Ll-CAM, CD19, CD20, CD22, mesotelina, CEA, y antígeno de superficie de la hepatitis B, receptor antifolato, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, 3, o 4, FBP, receptor fetal de acetolina e, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-alfa, IL-13R-alfa2, kdr, cadena ligera kappa, Lewis Y, molécula de adhesión celular L1, MAGE-A1, mesotelina, MUC1, MUC16, PSCA, ligandos NKG2D, NY-ESO-1, MART-1, gp100, antígeno oncofetal, ROR1, TAG72, VEGF-R2, antígeno carcinoembrionario (CEA), antígeno prostático específico, PSMA, Her2/neu, receptor de estrógenos, receptor de progesterona, efrinaB2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2, y MAGE A3, CE7, tumor de Wilms 1 (WT-1), una ciclina, como la ciclina A1 (CCNA1), y/o moléculas biotiniladas, y/o moléculas expresadas por el VIH, el VHC, el VHB u otros patógenos

En algunos casos, entre las combinaciones de antígenos para estrategias multiobjetivo se incluyen los expresados en el mieloma múltiple, como CD38 (ADP ribosa hidrolasa cíclica), CD138 (syndecan-1, syndecan, SYN-1) y CS-1 (CS1, subconjunto 1 de CD2, CRACC, SLAMF7, CD319 y 19A24), cada uno individualmente en combinación con un segundo antígeno que también se expresa en el mieloma múltiple. En algunos casos, la pluralidad de antígenos, como los reconocidos por receptores manipuladas activadores y coestimuladores, respectivamente, son CD38 y CD138, CD38 y CS-1, CD138 y CD38, CD138 y CS-1, CS-1 y CD38, y/o CS-1 y CD138. Antígenos específicos de mieloma múltiple adicionales son CD20, CD40, CD56, CD74, CD200, EGFR, BCMA y p2-Microglobulina, HM1.24, IGF-1R, IL-6R, TRAIL-R1 y el receptor de activina tipo IIA (ActRIIA). Ver Benson y Byrd, Journal of Clinical Oncology, 1 de junio de 2012, 30(l6): 2013-15; Tao y Anderson, Bone Marrow Research, volumen 2011 (2011), artículo ID 924058, 14 páginas; Chu et al., Leukemia (26 de septiembre de 2013) abril 2014;28(4):917-27; Garfall et al., DiscovMed. enero 2014;17(91):37-46. En algunos casos, los antígenos incluyen los presentes en tumores linfoides, mieloma, linfoma asociado al sida y/o linfoproliferaciones postrasplante, como CD38.

En algunos casos, uno o más de los receptores de antígenos múltiples reconocen o se unen a su antígeno con una afinidad relativamente baja. En algunos aspectos, el receptor se une a su antígeno con una constante de disociación (Kd) de por lo menos o aproximadamente 10-8 M, por lo menos o aproximadamente 10-7 M, por lo menos o aproximadamente 10-6 M, por lo menos o aproximadamente 10-5 M, y/o por lo menos o aproximadamente 10-4 M. En algunos de tales casos, una afinidad relativamente más baja del receptor de antígeno por el antígeno ayuda a asegurar que no se consigue una respuesta completa mediante la ligadura de sólo uno de los múltiples receptores de antígenos genéticamente manipulados. En algunos casos, el receptor dirigido a CD38 incluye un dominio de unión a antígeno como se divulga, por ejemplo, en la Solicitud de Patente de Estados Unidos, N° de Publicación: US20120189622 A1, como la parte o partes de unión a antígeno del anticuerpo designado como OKT10 y de otros anticuerpos descritos en la Tabla 1 de la solicitud, y de anticuerpos que se unen a epítopos similares o iguales.

En algunos casos, los dos receptores inducen, respectivamente, una señal activadora y una señal inhibidora para la célula, de tal manera que la unión de uno de los receptores a su antígeno activa la célula o induce una respuesta, pero la unión del segundo receptor inhibidor a su antígeno induce una señal que suprime o amortigua esa respuesta. Los ejemplos son las combinaciones de CAR activadores y CAR inhibidores o ícA r . Puede usarse una estrategia de este tipo, por ejemplo, en la que el CAR activador se une a un antígeno expresado en una enfermedad o afección pero que también se expresa en células normales, y el receptor inhibidor se une a un antígeno distinto que se expresa en las células normales pero no en las células de la enfermedad o afección.

Vectores y métodos para manipulación genética

También se divulgan métodos, ácidos nucleicos, composiciones y kits para producir las células manipuladas genéticamente. En algunos aspectos, la manipulación genética implica la introducción de un ácido nucleico que codifica el componente manipulado genéticamente u otro componente para su introducción en la célula, como un componente que codifica una proteína o ácido nucleico de alteración génica.

En algunos casos, la transferencia génica se consigue estimulando primero el crecimiento celular, por ejemplo, el crecimiento, proliferación y/o activación de células T, seguido de la transducción de las células activadas y la expansión en cultivo hasta alcanzar un número suficiente para aplicaciones clínicas.

En algunos contextos, la sobreexpresión de un factor estimulador (por ejemplo, una linfoquina o una citoquina) puede ser tóxica para un sujeto. Por tanto, en algunos contextos, las células manipuladas incluyen segmentos génicos que hacen que las células sean susceptibles a la selección negativa in vivo, como en el caso de la administración en inmunoterapia adoptiva. Por ejemplo, en algunos aspectos, las células están manipuladas para que puedan eliminarse como resultado de un cambio en el estado in vivo del paciente al que se administran. El fenotipo seleccionable negativo puede ser el resultado de la inserción de un gen que confiere sensibilidad para un agente administrado, por ejemplo, un compuesto. Los genes seleccionables negativos incluyen el gen de la timidina quinasa del virus del herpes simple tipo I (HSV-I TK) (Wigler et al., Cell II:223, I977) que confiere sensibilidad al ganciclovir; el gen de la hipoxantina fosfribosiltransferasa celular (HPRT), el gen de la adenina fosforribosiltransferasa celular (APRT), la citosina deaminasa bacteriana, (Mullen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:33 (1992)).

En algunos aspectos, las células se manipulan además para promover la expresión de citoquinas u otros factores. Se conocen bien varios métodos para la introducción de componentes manipulados genéticamente, por ejemplo, receptores de antígenos, por ejemplo, CAR, y pueden usarse con los métodos y composiciones divulgados. Los métodos ejemplares incluyen aquellos para la transferencia de ácidos nucleicos que codifican los receptores, incluyendo vía viral, por ejemplo, retroviral o lentiviral, transducción, transposones y electroporación.

En algunos casos, los ácidos nucleicos recombinantes se transfieren a las células usando partículas de virus infecciosos recombinantes, como, por ejemplo, vectores derivados del virus de simio 40 (SV40), adenovirus, virus adeno-asociados (AAV). En algunos casos, los ácidos nucleicos recombinantes se transfieren a las células T usando vectores lentivirales recombinantes o vectores retrovirales, como los vectores gamma-retrovirales (ver, por ejemplo, Koste et al. (2014) Gene Therapy 3 de abril de 2014. doi: 10.1038/gt.2014.25; Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park et al., Trends Biotechnol. 2011 noviembre; 29(11): 550-557.

En algunos casos, el vector retroviral tiene una secuencia de repetición terminal larga (LTR), por ejemplo, un vector retroviral derivado del virus de la leucemia murina de Moloney (MoMLV), el virus del sarcoma mieloproliferativo (MPSV), el virus de las células madre embrionarias murinas (MESV), el virus de las células madre murinas (MSCV), el virus formador de focos en el bazo (SFFV) o el virus adenoasociado (AAV). La mayoría de los vectores retrovirales derivan de retrovirus murinos. En algunos casos, los retrovirus incluyen los derivados de cualquier fuente celular aviar o mamífera. Los retrovirus suelen ser anfotrópicos, lo que significa que son capaces de infectar células huésped de varias especies, incluyendo la humana. En un caso, el gen a expresar sustituye a las secuencias retrovirales gag, pol y/o env. Se han descrito una serie de sistemas retrovirales ilustrativos (por ejemplo, Patentes de Estados Unidos N° 5.219.740; 6.207.453; 5.219.740; Miller y Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa et al. (1991) Virology 180:849-852; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037; y Boris-Lawrie y Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109.

Se conocen métodos de transducción lentiviral. Se describen métodos ejemplares en, por ejemplo, Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; Cooperetal. (2003) Blood. 101:1637-1644; Verhoeyen et al. (2009) Methods Mol Biol. 506: 97-114; y Cavalieri et al. (2003) Blood. 102(2): 497-505.

En algunos casos, los ácidos nucleicos recombinantes se transfieren a las células T mediante electroporación (ver,porejemplo, Chicaybam et al, (2013) PLoS ONE 8(3): e60298 y Van Tedeloo et al. (2000) Gene Therapy 7(16): 1431-1437). En algunos casos, los ácidos nucleicos recombinantes se transfieren a las células T mediante transposición (ver, por ejemplo, Manuri et al. (2010) Hum Gene Ther 21(4): 427-437; Sharma et al. (2013) Molec Ther Nucl Acids 2, e74; y Huang et al. (2009) Methods Mol Biol 506: 115-126). Otros métodos para introducir y expresar material genético en células inmunitarias incluyen la transfección con fosfato de calcio (por ejemplo, como se describe en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N.Y.), la fusión de protoplastos, la transfección mediada por liposomas catiónicos; el bombardeo de micropartículas facilitado por partículas de tungsteno (Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)); y coprecipitación de ADN con fosfato de estroncio (Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987)).

En otros casos, las células, por ejemplo, células T, no se manipulan para que expresen receptores recombinantes, sino que incluyen receptores de antígenos naturales específicos para los antígenos deseados, como linfocitos infiltrantes de tumores y/o células T cultivadas in vitro o ex vivo, por ejemplo, durante el paso o pasos de incubación, para promover la expansión de células que tienen una especificidad de antígeno particular. Por ejemplo, en algunos casos, las células se producen para la terapia celular adoptiva mediante el aislamiento de células T específicas de tumores, por ejemplo, linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) autólogos. El direccionamiento directo a tumores humanos usando linfocitos infiltrantes de tumores autólogos puede, en algunos casos, provocar la regresión del tumor (ver Rosenberg SA, et al.(1988) N Engl J Med. 319:1676-1680). En algunos casos, los linfocitos se extraen de tumores resecados. En algunos casos, tales linfocitos se expanden in vitro. En algunos casos, tales linfocitos se cultivan con linfoquinas (por ejemplo, IL-2). En algunos casos, tales linfocitos median en la lisis específica de células tumorales autólogas pero no de células tumorales alogénicas o células normales autólogas.

Otros enfoques y vectores para la transferencia de los ácidos nucleicos manipulados genéticamente que codifican los productos manipulados genéticamente son los descritos, por ejemplo, en la solicitud de patente internacional, N° de Publicación: WO2014055668, y en la Patente de Estados Unidos N° 7.446.190.

Entre los ácidos nucleicos adicionales, por ejemplo, los genes para introducción son aquellos para mejorar la eficacia de la terapia, como por ejemplo promoviendo la viabilidad y/o función de las células transferidas; genes para proporcionar un marcador genético para la selección y/o evaluación de las células, como por ejemplo para evaluar la supervivencia o localizaciónin vivo;genes para mejorar la seguridad, por ejemplo, haciendo que la célula sea susceptible a la selección negativa in vivo como se describe por Lupton S. D. et al., Mol. and Cell Biol., 11:6 (1991); y Riddell et al., Human Gene Therapy 3:319-338 (1992); ver también las publicaciones PCT/US91/08442 y PCT/US94/05601 de Lupton et al. que describen el uso de genes de fusión seleccionables bifuncionales derivados de la fusión de un marcador seleccionable positivo dominante con un marcador seleccionable negativo. Ver, por ejemplo, Riddell et al., Patente de Estados Unidos N° 6,040,177, en las columnas 14-17.

C. Represión de la expresión, actividad o función génica

Entre las células inmunitarias divulgadas se encuentran las células inmunitarias en las que la expresión, actividad y/o función de uno o más genes que codifican un antígeno de un receptor de antígeno manipulado genéticamente está reprimida en la célula. En algunos casos, un antígeno de interés particular puede ser uno que se expresa en una enfermedad o afección, como un tumor o cáncer, pero que también puede ser expresado por la célula inmunitaria, como una célula T o célula T activada. En algunos aspectos, la expresión del antígeno por la célula inmunitaria puede ser indeseable, como en el contexto de la manipulación de la célula inmunitaria con un receptor de antígeno manipulado genéticamente para el antígeno, por ejemplo, en el contexto de la inmunoterapia adoptiva. Por tanto, en algunos casos, se divulgan células inmunitarias, como células T, que contienen un receptor de antígeno manipulado genéticamente específico para un antígeno objetivo en una enfermedad o afección, por ejemplo un tumor o cáncer, y que también contiene una alteración o represión de un gen endógeno en la célula que codifica el antígeno.

También se divulgan métodos para efectuar dicha represión génica. En algunos casos, la represión génica se lleva a cabo efectuando una alteración en el gen, como una mutación de desactivación, de inserción, de sentido erróneo o de cambio de marco, como una mutación bialélica de cambio de marco, deleción de todo o parte del gen, por ejemplo, uno o más exones o partes del mismo, y/o activación. En algunos casos, tales alteraciones se llevan a cabo mediante nucleasas específicas de secuencia o dirigidas, incluidas nucleasas dirigidas de unión al ADN, como nucleasas de dedos de zinc (ZFN) y nucleasas efectoras similares a activadores de la transcripción (TALEN), y nucleasas guiadas por ARN, como una nucleasa asociada a CRISPR (Cas), diseñadas específicamente para dirigirse a la secuencia de un gen o a una parte del mismo.

En algunos casos, los métodos de represión o alteración de un gen en la célula pueden realizarse antes, simultáneamente o después de los métodos de introducción de una molécula de ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno manipulado genéticamente en las células. Por ejemplo, en algunos casos, los métodos de reprimir o interrumpir un gen en la célula se realizan antes de introducir una molécula de ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno manipulado genéticamente en la célula.

Genes reprimidos/alterados

En algunos casos, el gen reprimido y/o alterado codifica un producto capaz de tener o contribuir a un efecto inhibidor sobre la célula manipulada, como inhibir una respuesta inmunitaria de la célula. Por ejemplo, en algunos casos, el gen reprimido y/o alterado codifica un antígeno reconocido por un receptor de antígeno manipulado genéticamente que se expresa o se prevé que se exprese en las células inmunitarias, como las células T.

En algunos casos, el gen codifica un antígeno objetivo unido específicamente por un receptor de antígeno en la célula manipulada, como un receptor de antígeno manipulado genéticamente, por ejemplo, CAR. Por tanto, en algunos aspectos, el gen que se reprime codifica el antígeno objetivo de un CAR u otro receptor de antígeno. Tales aspectos surgen típicamente en el caso de un antígeno objetivo expresado en una enfermedad o afección particular, pero que se expresa en el tipo de célula que se está manipulando, o en un subconjunto de la misma, como en la activación de la célula manipulada. Los antígenos ejemplares son los expresados en células T o células NK activadas o estimuladas, y subconjuntos de las mismas, en particular células activadas producidas por condiciones de estimulación usadas para promover la introducción del ácido nucleico que codifica el CAR u otro receptor manipulado. En algunos casos, al alterar o reprimir de otro modo la expresión del antígeno en las células manipuladas, los métodos y composiciones divulgados en la presente evitan o reducen la probabilidad de destrucción de las células manipuladas por las propias células manipuladas, promoviendo de este modo la eficacia.

En algunos casos, el gen codifica un antígeno que es un objetivo de CAR activador y/o coestimulador. En algunos casos, el gen codifica un antígeno que es un objetivo en una estrategia multiobjetivo que emplea dos o más receptores de antígenos manipulados genéticamente, donde por lo menos uno de los receptores es específico para un antígeno que puede estar o se expresa en la célula inmunitaria, como la célula T o la célula T activada.

En algunos casos, el gen alterado o cuya expresión o función se reprime de otra manera es cualquiera que codifique un antígeno tumoral universal, y en particular un antígeno tumoral universal que se exprese o regule por incremento en la célula inmunitaria, como en una célula T o en células T activadas. En algunos casos, el gen alterado o reprimido es uno que codifica hTERT o survivina. En algunos casos, otros genes ejemplares que pueden alterarse o reprimirse incluyen los que codifican los antígenos MDM2, CYP1B, HER2/neu, WT1, livina, Af P, CEA, MUC16, MUC1, PSMA, p53 o ciclina (D1). En algunos casos, una nucleasa dirigida se dirige a un gen que codifica hTERT, survivina, p53 u otro antígeno tumoral universal. En algunos aspectos, la nucleasa objetivo altera el gen, por ejemplo, disminuye o suprime la expresión de hTERT, survivina, p53 u otro antígeno tumoral universal objetivo en la célula.

Por ejemplo, en algunos aspectos, se divulgan células inmunitarias, como células T, que contienen un receptor de antígeno manipulado genéticamente que se une específicamente a un antígeno de entre hTERT, survivina Md M2, CYP1B, HER2/neu, WT1, livina, AFP, CeA, MUC16, MUC1, PSMA, p53 o ciclina (D1) y que contiene alteración o represión del gen endógeno correspondiente en las células inmunitarias. En algunos aspectos, se divulgan células inmunitarias, como células T, que contienen un receptor de antígeno manipulado genéticamente que se une específicamente a un antígeno hTERT y que contiene alteración o represión del gen hTERT endógeno correspondiente en la célula. En otros aspectos, se divulgan células inmunitarias, como células T, que contienen un receptor de antígeno manipulado genéticamente que se une específicamente a un gen de survivina y que contiene alteración o represión del gen de survivina correspondiente endógeno en la célula.

En casos particulares, el gen alterado o cuya expresión o función se reprime de otro modo codifica CD38, como en una célula que expresa un receptor manipulado anti-CD38, como un CAR anti-CD38. Otros genes ejemplares incluyen los que codifican los antígenos CD33 y TIM-3. Ver Mardiros e tal., Blood 122 (18) (31 de octubre de 2013). Otros genes ejemplares incluyen los que codifican los antígenos CD26, CD30, CD53, CD92, CD100, CD148, CD150, CD200, CD261, CD262 y CD362. En algunos casos, una nucleasa dirigida se dirige a un gen CD38 de la célula manipulada. En algunos aspectos, la nucleasa dirigida altera el gen CD38, por ejemplo, disminuye o suprime la expresión de CD38 en la célula manipulada. En algunos aspectos, se divulgan células inmunitarias, como células T, que contienen un receptor de antígeno manipulado genéticamente que se une específicamente al antígeno CD38 y que contiene la alteración o represión del gen CD38 endógeno correspondiente en la célula.

En algunos casos, el gen es un objetivo inhibidor de CAR. Por ejemplo, en el contexto de un antígeno que se une a un CAR inhibidor, la alteración del gen en algunos contextos evita o reduce la probabilidad de que una molécula expresada por las propias células manipuladas induzca un efecto amortiguador en la respuesta de las células manipuladas. Los ejemplos de tales antígenos son los expresados en células normales o no objetivo o fuera de objetivo (de tal manera que se incluye una molécula CAR inhibidora para evitar efectos fuera de objetivo), pero también se expresa en el tipo celular usado para la manipulación genética, como la célula T o la célula NK. Los antígenos ejemplares son las moléculas MHC, como las moléculas MHC de clase I, que en algunos casos pueden estar reguladas por disminución en el contexto de la evasión inmunitaria, el cáncer o la infección, pero que generalmente se expresan en células nucleadas. Otros ejemplos son cualquier objetivo inhibidor de CAR que también se exprese en células T, células NK u otras células manipuladas para terapia celular.

En algunos casos, el gen codifica una molécula inmunoinhibidora u otro producto que amortigua o impide la activación o estimulación u otra función efectora de la célula manipulada, como su capacidad para proliferar, sobrevivir, secretar uno o más factores, o reclutar o llevar a cabo la destrucción celular, por ejemplo, en respuesta a la unión a través del receptor de antígeno manipulado.

En algunos casos, el gen reprimido codifica una proteína que suprime el sistema inmunitario. En algunos casos, la represión reduce los efectos supresores del producto génico sobre el sistema inmunitario. En algunos aspectos, esto aumenta la respuesta inmunitaria a las células tumorales. En algunos casos, el gen codifica un receptor de adenosina, como A2AR. Por tanto, en algunos casos, se reprime la expresión, actividad y/o función de A2AR.

Técnicas para la represión génica

En algunos casos, la represión de la expresión, actividad y/o función del gen se lleva a cabo alterando el gen.

En algunos casos, la alteración génica se lleva a cabo mediante la inducción de una o más roturas de cadena doble y/o una o más roturas de cadena sencilla en el gen, típicamente de manera dirigida. En algunos casos, las roturas de cadena doble o cadena sencilla se producen mediante una nucleasa, por ejemplo una endonucleasa, como una nucleasa dirigida al gen. En algunos aspectos, las roturas se inducen en la región codificante del gen, por ejemplo, en un exón. Por ejemplo, en algunos casos, la inducción se produce cerca de la parte N-terminal de la región codificante, por ejemplo, en el primer exón, en el segundo exón o en un exón posterior.

En algunos aspectos, las roturas de cadena doble o de cadena sencilla se reparan mediante un proceso de reparación celular, como la unión de extremos no homólogos (NHEJ) o la reparación dirigida por homología (HDR). En algunos aspectos, el proceso de reparación es propenso a errores y da lugar a la alteración del gen, como una mutación de cambio de marco, por ejemplo, mutación de cambio de marco bialélica, que puede dar lugar a la inactivación completa del gen. Por ejemplo, en algunos aspectos, la alteración comprende la inducción de una deleción, mutación y/o inserción. En algunos casos, la alteración da como resultado la presencia de un codón de parada temprano. En algunos aspectos, la presencia de una inserción, deleción, translocación, mutación de cambio de marco, y/o un codón de parada prematuro da como resultado la represión de la expresión, actividad, y/o función del gen.

En algunos casos, la represión es transitoria o reversible, de tal manera que la expresión del gen se restablece posteriormente. En otros casos, la represión no es reversible o transitoria, por ejemplo, es permanente.

En algunos casos, la represión génica se logra usando técnicas antisentido, como por ejemplo mediante ARN de interferencia (ARNi), ARN de interferencia corto (ARNip), horquilla corta (ARNhc), y/o se usan ribozimas para suprimir o reprimir selectivamente la expresión del gen. La tecnología de ARNip incluye la basada en ARNi que usa una molécula de ARN de cadena doble que tiene una secuencia homóloga con la secuencia de nucleótidos del ARNm que se transcribe a partir del gen, y una secuencia complementaria con la secuencia de nucleótidos. El ARNip generalmente es homólogo/complementario con una región del ARNm que se transcribe a partir del gen, o puede ser ARNip que incluye una pluralidad de moléculas de ARN que son homólogas/complementarias con diferentes regiones.

Moléculas y complejos dirigidos al ADN; endonucleasas dirigidas

En algunos casos, la represión se logra usando una molécula dirigida a ADN, como una proteína de unión al ADN o un ácido nucleico de unión al ADN, o un complejo, compuesto o composición que contenga la misma, que se une específicamente o hibrida con el gen. En algunos casos, la molécula de ADN objetivo comprende un dominio de unión al ADN, por ejemplo, un dominio de unión al ADN de una proteína de dedos de zinc (ZFP), un dominio de unión al ADN de una proteína similar a un activador de la transcripción (TAL) o un efector de TAL (TALE), un dominio de unión al ADN de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (CRISPR), o un dominio de unión al ADN de una meganucleasa.

Los dominios de unión a sistemas de dedos de zinc, TALE y CRISPR pueden "manipularse" para que se unan a una secuencia de nucleótidos predeterminada, por ejemplo mediante manipulación (alterando uno o más aminoácidos) de la región de la hélice de reconocimiento de un dedo de zinc o una proteína TALE de origen natural. Las proteínas manipuladas de unión al ADN (dedos de zinc o TALE) son proteínas que no se producen de manera natural. Los criterios racionales para el diseño incluyen la aplicación de reglas de sustitución y algoritmos informatizados para procesar la información de una base de datos que almacena información de diseños existentes de ZFP y/o Ta Le y datos de unión. Vere, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N°. 6.140.081; 6.453.242; y 6.534.261; ver también las WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 y WO 03/016496 y la Publicación de Estados Unidos N° 20110301073.

En algunos casos, la molécula, complejo o combinación dirigida al ADN contiene una molécula de unión al ADN y uno o más dominios adicionales, como un dominio efector para facilitar la represión o alteración del gen. Por ejemplo, en algunos casos, la alteración del gen se lleva a cabo mediante proteínas de fusión que comprenden proteínas de unión al ADN y un dominio regulador heterólogo o un fragmento funcional del mismo. En algunos aspectos, los dominios incluyen, por ejemplo, dominios de factores de transcripción, como activadores, represores, coactivadores, correpresores, silenciadores, oncogenes, enzimas de reparación del ADN y sus factores y modificadores asociados, enzimas de reordenación del ADN y sus factores y modificadores asociados, proteínas asociadas a la cromatina y sus modificadores, por ejemplo, quinasas, acetilasasas y sus modificadores. por ejemplo quinasas, acetilasas y desacetilasas, y enzimas modificadoras del ADN, por ejemplo metiltransferasas, topoisomerasas, helicasas, ligasas, quinasas, fosfatasas, polimerasas, endonucleasas, y sus factores y modificadores asociados. Ver, por ejemplo, las Publicaciones de Solicitud de Patente de Estados Unidos N° 20050064474; 20060188987 y 2007/0218528, para detalles sobre fusiones de dominios de unión a ADN y dominios de escisión de nucleasas. En algunos aspectos, el dominio adicional es un dominio nucleasa. Por tanto, en algunos casos, la alteración génica se facilita mediante la edición génica o genómica, usando proteínas manipuladas, como nucleasas y complejos que contienen nucleasas o proteínas de fusión, compuestas de dominios de unión a ADN específicos de secuencia fusionados o que forman complejos con moléculas de escisión de ADN no específicas, como nucleasas.

En algunos aspectos, estas nucleasas quiméricas dirigidas o complejos que contienen nucleasas llevan a cabo modificaciones genéticas precisas induciendo roturas de cadena doble o de cadena sencilla dirigidas, estimulando los mecanismos celulares de reparación del ADN, incluyendo la unión de extremos no homólogos (NHEJ) propensa a errores y la reparación dirigida por homología (HDR). En algunos casos, la nucleasa es una endonucleasa, como una nucleasa de dedos dezinc(ZFN), una nucleasa TALE (TALEN), una endonucleasa guiada por ARN (RGEN), como una proteína asociada a CRISPR (Cas), o una meganucleasa.

En algunos casos, se proporciona un ácido nucleico donante, por ejemplo, un plásmido donante o un ácido nucleico que codifica el receptor de antígeno manipulado genéticamente, y se inserta mediante HDR en el sitio de edición del gen tras la introducción de los DSB. Por tanto, en algunos casos, la alteración del gen y la introducción del receptor de antígeno, por ejemplo, CAR, se llevan a cabo simultáneamente, por lo que el gen se altera en parte por activación o inserción del ácido nucleico que codifica CAR.

En algunos casos, no se proporciona ácido nucleico donante. En algunos aspectos, la reparación mediada por NHEJ tras la introducción de d Sb da lugar a mutaciones de inserción o deleción que pueden provocar la alteración del gen, por ejemplo, creando mutaciones sin sentido o cambios de marco.

ZFPyZFN; TAL, TALE y TALEN

En algunos casos, la molécula dirigida al ADN incluye una proteína de unión al ADN, como una o varias proteínas de dedos de zinc (ZFP) o proteínas similares a activadores de la transcripción (TAL), fusionadas a una proteína efectora, como una endonucleasa. Algunos ejemplos son las ZFN, las TALE y las TALEN. Ver Lloyd et al., Fronteirs in Immunology, 4(221), 1-7 (2013).

En algunos casos, la molécula dirigida al ADN comprende una o más proteínas de dedos de zinc (ZFP) o dominios de las mismas que se unen al ADN de una manera específica para la secuencia. Una ZFP o un dominio de la misma es una proteína o dominio dentro de una proteína más grande, que se une al ADN de una manera específica de la secuencia a través de uno o más dedos de zinc, regiones de la secuencia de aminoácidos dentro del dominio de unión cuya estructura se estabiliza a través de la coordinación de un ion de zinc. El término proteína de unión a ADN de dedos de zinc se abrevia a menudo como proteína de dedos de zinc o ZFP.

Entre las ZFP se encuentran dominios de ZFP artificiales dirigidos a secuencias de ADN específicas, típicamente de 9-18 nucleótidos de longitud, generados por ensamblaje de dedos individuales.

Las ZFP incluyen aquellas en las que un único dominio de dedos tiene aproximadamente 30 aminoácidos de longitud y contiene una hélice alfa que contiene dos residuos invariantes de histidina coordinados mediante zinc con dos cisteínas de un único giro beta, y que tiene dos, tres, cuatro, cinco o seis dedos. Generalmente, la especificidad de secuencia de una ZFP puede alterarse haciendo sustituciones de aminoácidos en las cuatro posiciones de la hélice (-1, 2, 3 y 6) en una hélice de reconocimiento de dedos de zinc. Por tanto, en algunos casos, la ZFP o la molécula que contiene ZFP no se produce de manera natural, por ejemplo, está diseñada para unirse a un sitio objetivo de elección. Ver, por ejemplo, Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416; Patentes de Estados Unidos N° 6.453.242; 6.534.261; 6.599.692; 6.503.717; 6.689.558; 7.030.215; 6.794.136; 7.067.317; 7.262.054; 7.070.934; 7.361.635; 7.253.273; y las Publicaciones de Patente de Estados Unidos N° 2005/0064474; 2007/0218528; 2005/0267061.

En algunos aspectos, la represión del gen se lleva a cabo poniendo en contacto un primer sitio objetivo en el gen con una primera ZFP, reprimiendo de este modo el gen. En algunos casos, el sitio objetivo en el gen se pone en contacto con una ZFP de fusión que comprende seis dedos y el dominio regulador, inhibiendo de este modo la expresión del gen.

En algunos casos, el paso de poner en contacto comprende además poner en contacto un segundo sitio objetivo en el gen con una segunda ZFP. En algunos aspectos, el primer y el segundo sitios objetivo son adyacentes. En algunos casos, la primera y la segunda ZFP están unidas covalentemente. En algunos aspectos, la primera ZFP es una proteína de fusión que comprende un dominio regulador o por lo menos dos dominios reguladores. En algunos casos, la primera y la segunda ZFP son proteínas de fusión, cada una de las cuales comprende un dominio regulador o por lo menos dos dominios reguladores. En algunos casos, el dominio reguladores un represortranscripcional, un activador transcripcional, una endonucleasa, una metiltransferasa, una histona acetiltransferasa o una histona desacetilasa.

En algunos casos, la ZFP está codificada por un ácido nucleico de ZFP enlazado operativamente a un promotor. En algunos aspectos, el método comprende además el paso de administrar primero el ácido nucleico a la célula en un lípido: complejo de ácido nucleico o como ácido nucleico desnudo. En algunos casos, la ZFP está codificada por un vector de expresión que comprende un ácido nucleico de ZFP enlazado operativamente a un promotor. En algunos casos, la ZFP está codificada por un ácido nucleico enlazado operativamente a un promotor inducible. En algunos aspectos, la ZFP está codificada por un ácido nucleico enlazado operativamente a un promotor débil.

En algunos casos, el sitio objetivo se encuentra en sentido ascendente de un sitio de inicio de la transcripción del gen. En algunos aspectos, el sitio objetivo es adyacente a un sitio de inicio de la transcripción del gen. En algunos aspectos, el sitio objetivo es adyacente a un sitio de pausa de la ARN polimerasa en sentido descendente de un sitio de inicio de la transcripción del gen.

En algunos casos, la molécula de direccionamiento de ADN es o comprende un dominio de unión a ADN de dedos de zinc fusionado a un dominio de escisión de ADN para formar una nucleasa de dedos de zinc (ZFN). En algunos casos, las proteínas de fusión comprenden el dominio de escisión (o el semidominio de escisión) de por lo menos una enzima de restricción de tipo IIS y uno o más dominios de unión de dedos de zinc, que pueden o no estar manipulados. En algunos casos, el dominio de escisión es de la endonucleasa de restricción de tipo IIS Fok I. Fok I cataliza generalmente la escisión de cadena doble de ADN, a 9 nucleótidos de su sitio de reconocimiento en una cadena y a 13 nucleótidos de su sitio de reconocimiento en la otra. Ver, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos N° 5,356,802; 5,436,150 y 5,487,994; así como Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31,978-31,982.]

En algunos casos, los ZFN se dirigen a un gen presente en la célula manipulada. En algunos aspectos, los ZFN generan eficazmente una rotura de cadena doble (DSB), por ejemplo en un sitio predeterminado de la región codificante del gen. Las regiones objetivo típicas incluyen exones, regiones que codifican regiones N-terminales, primer exón, segundo exón y regiones promotoras o potenciadoras. En algunos casos, la expresión transitoria de los ZFN promueve la alteración altamente eficaz y permanente del gen objetivo en las células manipuladas. En particular, en algunos casos, la administración de los ZFN produce la alteración permanente del gen con una eficacia superior al 50%.

Muchos dedos de zinc manipulados para genes específicos están disponibles en el mercado. Por ejemplo, Sangamo Biosciences (Richmond, CA, USA) ha desarrollado una plataforma (CompoZr) para la construcción de dedos de zinc en colaboración con Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA), lo que permite a los investigadores evitar la construcción y validación de dedos de zinc y proporciona dedos de zinc específicos para miles de proteínas. Gaj et al., Trends in Biotechnology, 2013, 31(7), 397-405. En algunos casos, se usan dedos de zinc disponibles comercialmente o se diseñan a medida. (Ver, por ejemplo, los números de catálogo de Sigma-Aldrich CSTZFND, CSTZFN, CTI1-1KT y PZD0020).

TALE y TALEN

En algunos casos, la molécula de direccionamiento del ADN comprende un dominio de unión al ADN de una proteína similar a un activador de la transcripción (TAL) de origen natural o manipulada (de origen no natural), como en una proteína efectora de una proteína similar a un activador de la transcripción (TALE), ver, por ejemplo, la publicación de Patente de Estados Unidos N° 20110301073.

Un dominio de unión al ADN de TALE o TALE es un polipéptido que comprende uno o más dominios/unidades de repetición de TALE. Los dominios de repetición intervienen en la unión de la TALE a su secuencia de ADN objetivo afín. Una única "unidad de repetición" (también denominada "repetición") tiene típicamente una longitud de 33-35 aminoácidos y presenta por lo menos cierta homología de secuencia con otras secuencias de repetición de TALE dentro de una proteína de TALE natural. Cada unidad de repetición de TALE incluye 1 o 2 residuos de unión al ADN que constituyen el Diresiduo Variable de Repetición (RVD), típicamente en las posiciones 12 y/o 13 de la repetición. El código natural (canónico) para el reconocimiento del ADN de estas TALE se ha determinado de tal manera que una secuencia HD en las posiciones 12 y 13 lleva a una unión a citosina (C), NG se une a T, NI a A, NN se une a G o A, y NG se une a T y también se conocen RVD no canónicos (atípicos). Ver la publicación de Patente de Estados Unidos N° 20110301073. En algunos casos, los TALE pueden dirigirse a cualquier gen mediante el diseño de matrices TAL con especificidad para la secuencia de ADN objetivo. La secuencia objetivo generalmente comienza con unatimidina.

En algunos casos, la molécula es una endonucleasa de unión a ADN, como una TALE-nucleasa (TALEN). En algunos aspectos, el TALEN es una proteína de fusión que comprende un dominio de unión al ADN derivado de un TALE y un dominio catalítico de nucleasa para escindir una secuencia objetivo de ácido nucleico. En algunos casos, el dominio de unión al ADN de TALE se ha manipulado para unirse a una secuencia objetivo dentro de genes que codifican el antígeno objetivo y/o la molécula inmunosupresora. Por ejemplo, en algunos aspectos, el dominio de unión al ADN de TALE puede dirigirse a CD38 y/o a un receptor de adenosina, como A2AR.

En algunos casos, el TALEN reconoce y escinde la secuencia objetivo en el gen. En algunos aspectos, la escisión del ADN produce roturas de cadena doble. En algunos aspectos, las roturas estimulan la tasa de recombinación homóloga o unión de extremos no homólogos (NHEJ). Generalmente, la NHEJ es un proceso de reparación imperfecto que a menudo provoca cambios en la secuencia de ADN en el sitio de la escisión. En algunos aspectos, los mecanismos de reparación implican volver a unir lo que queda de los dos extremos del ADN mediante la religación directa (Critchlow y Jackson, Trends Biochem Sci. 1998 Oct;23(10):394-8) o a través de la denominada unión de extremos mediada por microhomología. En algunos casos, la reparación mediante NHEJ da lugar a pequeñas inserciones o deleciones y puede usarse para alterar y de este modo reprimir el gen. En algunos casos, la modificación puede ser una sustitución, deleción o adición de por lo menos un nucleótido. En algunos aspectos, las células en las que se ha producido un evento de mutagénesis inducida por escisión, es decir, un evento de mutagénesis consecutivo a un evento NHEJ, pueden identificarse y/o seleccionarse mediante métodos bien conocidos en la técnica.

En algunos casos, las repeticiones de TALE se ensamblan para que se dirijan específicamente a un gen. (Gaj et al., Trends in Biotechnology, 2013, 31(7), 397-405). Se ha construido una biblioteca de TALEN dirigidos a 18.740 genes humanos codificadores de proteínas (Kim et al., Nature Biotechnology. 31,251-258 (2013)). Las matrices TALE diseñadas a medida están disponibles comercialmente de Cellectis Bioresearch (París, Francia), Transposagen Biopharmaceuticals (Lexington, KY, USA) y Life Technologies (Grand Island, NY, USA). Específicamente, los TALEN dirigidos a CD38 están disponibles comercialmente (ver Gencopoeia, números de catálogo HTN222870-1, HTN222870-2 y HTN222870-3, disponibles en la Red Mundial en www.genecopoeia.com/product/search/detail.php?prt=26&cid=&key=HTN222870). Se describen moléculas ejemplares, por ejemplo, en las Publicaciones de Patente de Estados Unidos N° Us 2014/0120622, y 2013/0315884.

En algunos casos, los TALEN se introducen como transgenes codificados por uno o más vectores plasmídicos. En algunos aspectos, el vector plasmídico puede contener un marcador de selección que permite identificar y/o seleccionar las células que han recibido dicho vector.

RGEN (sistemas CRISPR/Cas)

En algunos casos, la represión se lleva a cabo usando uno o más ácidos nucleicos de unión al ADN, como la alteración mediante una endonucleasa guiada por ARN (RGEN), u otra forma de represión mediante otra molécula efectora guiada por ARN. Por ejemplo, en algunos casos, la represión se lleva a cabo usando repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR) y proteínas asociadas a CRISPR (Cas). Ver Sander y Joung, Nature Biotechnology, 32(4): 347-355.

En general, "sistema CRISPR" se refiere colectivamente a los transcritos y otros elementos implicados en la expresión o dirección de la actividad de los genes asociados a CRISPR ("Cas"), incluyendo las secuencias que codifican un gen Cas, una secuencia tracr (CRISPR transactivador) (por ejemplo tracrARN o un tracrARN parcial activo), una secuencia tracr-mate (que abarca una "repetición directa" y una repetición directa parcial procesada por tracrARN en el contexto de un sistema CRISPR endógeno), una secuencia guía (también denominada "espaciador" en el contexto de un sistema CRISPR endógeno), y/u otras secuencias y transcritos de un locus CRISPR.

En algunos casos, la nucleasa CRISPR/Cas o el sistema de nucleasas CRISPR/Cas incluye una molécula de ARN no codificante (ARN guía), que se une específicamente de la secuencia al ADN, y una proteína Cas (por ejemplo, Cas9), con funcionalidad de nucleasa (por ejemplo, dos dominios de nucleasa).

En algunos casos, uno o más elementos de un sistema CRISPR se derivan de un sistema CRISPR de tipo I, tipo II o tipo III. En algunos casos, uno o más elementos de un sistema CRISPR se derivan de un organismo particular que comprende un sistema CRISPR endógeno, comoStreptococcus pyogenes.

En algunos casos, se introducen en la célula una nucleasa Cas y un ARNg (incluyendo una fusión de ARNcr específico para la secuencia objetivo y un ARNtracr fijo). En general, los sitios objetivo en el extremo 5' del ARNg dirigen la nucleasa Cas al sitio objetivo, por ejemplo, el gen, usando emparejamiento de bases complementarias. En algunos casos, el sitio objetivo se selecciona sobre la base de su localización inmediatamente 5' de una secuencia de motivo adyacente al protoespaciador (PAM), como típicamente NGG, o NAG. En este sentido, el ARNg se dirige a la secuencia deseada modificando los primeros 20 nucleótidos del ARN guía para que se correspondan con la secuencia de ADN objetivo.

En algunos casos, el sistema CRISPR induce DSB en el sitio objetivo, seguidos de alteraciones, como se analiza en la presente. En otros casos, las variantes de Cas9, denominadas "nickasas", se usan para mellar una única cadena en el sitio objetivo. En algunos aspectos, se usan nickasas emparejadas, por ejemplo, para mejorar la especificidad, cada una dirigida por un par de ARNg diferentes que se dirigen a secuencias tales que tras introducir las mellas simultáneamente, se introduce un saliente 5'. En otros casos, la Cas9 catalíticamente inactiva se fusiona con un dominio efector heterólogo, como un represor o activador transcripcional, para afectar a la expresión génica.

En general, un sistema CRISPR se caracteriza por elementos que promueven la formación de un complejo CRISPR en el sitio de una secuencia objetivo. Típicamente, en el contexto de la formación de un complejo CRISPR, "secuencia objetivo" se refiere de manera general a una secuencia con la que una secuencia guía está diseñada para que tenga complementariedad, donde la hibridación entre la secuencia objetivo y una secuencia guía promueve la formación de un complejo CRISPR. No se requiere necesariamente una complementariedad completa, siempre que haya suficiente complementariedad para provocar la hibridación y promover la formación de un complejo CRISPR.

La secuencia objetivo puede comprender cualquier polinucleótido, como polinucleótidos de ADN o ARN. En algunos casos, la secuencia objetivo se localiza en el núcleo o en el citoplasma de la célula. En algunos casos, la secuencia objetivo puede estar dentro de un orgánulo de la célula. Generalmente, una secuencia o plantilla que puede usarse para la recombinación en el locus objetivo que comprende las secuencias objetivo se denomina "plantilla de edición" o "polinucleótido de edición" o "secuencia de edición". En algunos aspectos, un polinucleótido de plantilla exógeno puede denominarse plantilla de edición. En algunos aspectos, la recombinación es recombinación homóloga.

Típicamente, en el contexto de un sistema CRISPR endógeno, la formación del complejo CRISPR (que comprende la secuencia guía hibridada con la secuencia objetivo y formando complejo con una o más proteínas Cas) da como resultado la escisión de una o ambas cadenas en o cerca (por ejemplo, dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50 o más pares de bases desde) la secuencia objetivo. Sin querer estar limitado por la teoría, la secuencia tracr, que puede comprender o consistir en la totalidad o una parte de una secuencia tracr de tipo silvestre (por ejemplo, de aproximadamente o más de aproximadamente 20, 26, 32, 45, 48, 54, 63, 67, 85, o más nucleótidos de una secuencia tracr de tipo silvestre), también puede formar parte del complejo CRISPR, como por hibridación a lo largo de por lo menos una parte de la secuencia tracr a la totalidad o una parte de una secuencia tracr coincidente que está operativamente unida a la secuencia guía. En algunos casos, la secuencia tracr tiene suficiente complementariedad con una secuencia tracr coincidente para hibridar y participar en la formación del complejo CRISPR.

Al igual que con la secuencia objetivo, en algunos casos no es necesaria una complementariedad completa. En algunos casos, la secuencia tracr tiene por lo menos un 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de complementariedad de secuencia a lo largo de la longitud de la secuencia tracr coincidente cuando está óptimamente alineada. En algunos casos, uno o más vectores que impulsan la expresión de uno o más elementos del sistema CRISPR se introducen en la célula de tal manera que la expresión de los elementos del sistema CRISPR dirige la formación del complejo CRISPR en uno o más sitios objetivo. Por ejemplo, una enzima Cas, una secuencia guía enlazada a una secuencia tracr coincidente y una secuencia tracr podrían estar enlazadas operativamente a elementos reguladores separados en vectores separados. Alternativamente, dos o más de los elementos expresados a partir de los mismos elementos reguladores o unos diferentes, pueden combinarse en un único vector, con uno o más vectores adicionales que proporcionen cualquier componente del sistema CRISPR no incluido en el primer vector. En algunos casos, los elementos del sistema CRISPR que se combinan en un único vector pueden disponerse en cualquier orientación adecuada, como un elemento localizado 5' con respecto a ("en sentido ascendente" de) o 3' con respecto a ("en sentido descendente" de) un segundo elemento. La secuencia codificante de un elemento puede estar localizada en la misma cadena o en la cadena opuesta de la secuencia codificante de un segundo elemento, y orientada en la misma dirección o en una dirección opuesta. En algunos casos, un único promotor impulsa la expresión de un transcrito que codifica una enzima CRISPR y una o más de la secuencia guía, la secuencia tracr coincidente (opcionalmente enlazada operativamente a la secuencia guía), y una secuencia traer incrustada dentro de una o más secuencias intrón (por ejemplo, cada una en un intrón diferente, dos o más en por lo menos un intrón, o todas en un único intrón). En algunos casos, la enzima CRISPR, la secuencia guía, la secuencia tracr coincidente y la secuencia tracr están enlazadas operativamente y se expresan a partir del mismo promotor.

En algunos casos, un vector comprende uno o más sitios de inserción, como una secuencia de reconocimiento de endonucleasas de restricción (también denominada "sitio de clonación"). En algunos casos, uno o más sitios de inserción (por ejemplo, de aproximadamente o más de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10, o más sitios de inserción) están localizados en sentido ascendente y/o en sentido descendente de uno o más elementos de secuencia de uno o más vectores. En algunos casos, un vector comprende un sitio de inserción en sentido ascendente de una secuencia tracr coincidente, y opcionalmente en sentido descendente de un elemento regulador enlazado operativamente a la secuencia tracr coincidente, de manera que tras la inserción de una secuencia guía en el sitio de inserción y tras la expresión, la secuencia guía dirige la unión específica de secuencia del complejo CRISPR a una secuencia objetivo en una célula eucariota. En algunos casos, un vector comprende dos o más sitios de inserción, cada sitio de inserción estando situado entre dos secuencias tracr coincidentes para permitir la inserción de una secuencia guía en cada sitio. En tal disposición, las dos o más secuencias guía pueden comprender dos o más copias de una única secuencia guía, dos o más secuencias guía diferentes, o combinaciones de las mismas. Cuando se usan múltiples secuencias guía diferentes, puede usarse un único constructo de expresión para dirigir la actividad CRISPR a múltiples secuencias objetivo diferentes y correspondientes dentro de una célula. Por ejemplo, un único vector puede comprender aproximadamente o más de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10, 15, 20 o más secuencias guía. En algunos casos, pueden proporcionarse aproximadamente o más de aproximadamente 1 , 2 , 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más vectores que contengan secuencias guía y, opcionalmente, suministrarse a la célula.

En algunos casos, un vector comprende un elemento regulador enlazado operativamente a una secuencia codificadora de enzimas que codifica la enzima CRISPR, como una proteína Cas. Los ejemplos no limitativos de proteínas Cas incluyen Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6 , Cas7, Cas8, Cas9 (también conocidas como Csn1 y Csx12), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, homólogos de los mismos o versiones modificadas de los mismos. Estas enzimas son conocidas; por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la proteína Cas9 de S. pyogenes puede encontrarse en la base de datos SwissProt con el número de registro Q99ZW2. En algunos casos, la enzima CRlSPR no modificada tiene actividad de escisión de ADN, como Cas9. En algunos casos, la enzima CRISPR es Cas9, y puede ser Cas9 de S. pyogenes o S. pneumoniae. En algunos casos, la enzima CRISPR dirige la escisión de una o ambas cadenas en la localización de una secuencia objetivo, como dentro de la secuencia objetivo y/o dentro del complemento de la secuencia objetivo. En algunos casos, la enzima CRISPR dirige la escisión de una o ambas cadenas dentro de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500 o más pares de bases desde el primer o último nucleótido de una secuencia objetivo. En algunos casos, un vector codifica una enzima CRISPR que está mutada con respecto a una enzima de tipo salvaje correspondiente, de tal manera que la enzima CRISPR mutada carece de la capacidad de escindir una o ambas cadenas de un polinucleótido objetivo que contiene una secuencia objetivo. Por ejemplo, una sustitución de aspartato por alanina (D10A) en el dominio catalítico RuvC I de Cas9 de S. pyogenes convierte a Cas9 de una nucleasa que escinde ambas cadenas a una nickasa (escinde una sola cadena). En algunos casos, una nickasa Cas9 puede usarse en combinación con una secuencia o secuencias guía, por ejemplo, dos secuencias guía, dirigidas respectivamente a las cadenas sentido y antisentido del ADN objetivo. Esta combinación permite mellar ambas cadenas y usarlas para inducir la NHEJ.

En algunos casos, una secuencia de codificación enzimática que codifica la enzima CRISPR está optimizada por codones para su expresión en células particulares, como células eucariotas. Las células eucariotas pueden ser las o derivarse de un organismo particular, como un mamífero, incluyendo pero no limitado a humano, ratón, rata, conejo, perro o primate no humano. En general, la optimización de codones se refiere a un proceso de modificación de una secuencia de ácidos nucleicos para mejorar la expresión en las células huésped de interés mediante la sustitución de por lo menos un codón (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 o más codones) de la secuencia nativa por codones que se usan más frecuentemente o con la mayor frecuencia en los genes de esa célula huésped, manteniendo al mismo tiempo la secuencia nativa de aminoácidos. Varias especies muestran un sesgo particular por ciertos codones de un aminoácido concreto. El sesgo de codones (diferencias en el uso de codones entre organismos) a menudo se correlaciona con la eficiencia de la traducción del ARN mensajero (ARNm), que a su vez se cree que depende, entre otras cosas, de las propiedades de los codones que se traducen y de la disponibilidad de moléculas particulares de ARN de transferencia (ARNt). El predominio de ARNt seleccionados en una célula suele ser un reflejo de los codones usados con más frecuencia en la síntesis de péptidos. Por consiguiente, los genes pueden adaptarse para una expresión óptima en un organismo dado basándose en la optimización de codones. En algunos casos, uno o más codones (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50, o más, o todos los codones) en una secuencia que codifica la enzima CRISPR corresponden al codón más frecuentemente usado para un aminoácido particular.

En general, una secuencia guía es cualquier secuencia de polinucleótidos que tenga suficiente complementariedad con una secuencia de polinucleótidos objetivo para hibridar con la secuencia objetivo y dirigir la unión específica de secuencia del complejo CRISPR a la secuencia objetivo. En algunos casos, el grado de complementariedad entre una secuencia guía y su correspondiente secuencia objetivo, cuando se alinean óptimamente usando un algoritmo de alineación adecuado, es de aproximadamente o más del 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97,5%, 99%, o más.

La alineación óptima puede determinarse mediante el uso de cualquier algoritmo adecuado para alinear secuencias, entre los que se incluyen el algoritmo de Smith-Waterman, el algoritmo de Needleman-Wunsch, algoritmos basados en la transformada de Burrows-Wheeler (por ejemplo, el alineador de Burrows Wheeler), ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign (Novocraft Technologies), ELAND (Illumina, San Diego, California), SOAP (disponible en soap.genomics.org.cn) y Maq (disponible en maq.sourceforge.net). En algunos casos, una secuencia guía tiene aproximadamente 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75 o más nucleótidos de longitud. En algunos casos, una secuencia guía tiene menos de 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12 o menos nucleótidos de longitud. La capacidad de una secuencia guía para dirigir la unión específica de secuencia del complejo CRISPR a una secuencia objetivo puede evaluarse mediante cualquier ensayo adecuado. Por ejemplo, los componentes del sistema CRISPR suficientes para formar el complejo CRISPR, incluyendo la secuencia guía a probar, pueden proporcionarse a la célula que tiene la secuencia objetivo correspondiente, como por transfección con vectores que codifican los componentes de la secuencia CRISPR, seguido de una evaluación de la escisión preferencial dentro de la secuencia objetivo, como por ensayo Surveyor como se describe en la presente. De manera similar, la escisión de una secuencia de polinucleótidos objetivo puede evaluarse en un tubo de ensayo proporcionando la secuencia objetivo, los componentes del complejo CRISPR, incluyendo la secuencia guía a probar y una secuencia guía de control diferente de la secuencia guía de ensayo, y comparando la unión o la tasa de escisión en la secuencia objetivo entre las reacciones de las secuencias guía de ensayo y de control.

Una secuencia guía puede seleccionarse para dirigirse a cualquier secuencia objetivo. En algunos casos, la secuencia objetivo es una secuencia dentro del genoma de una célula. Las secuencias objetivo ejemplares incluyen aquellas que son únicas en el genoma objetivo. En algunos casos, se selecciona una secuencia guía para reducir el grado de estructura secundaria dentro de la secuencia guía. La estructura secundaria puede determinarse mediante cualquier algoritmo adecuado de plegamiento de polinucleótidos.

En general, una secuencia tracr coincidente incluye cualquier secuencia que tenga suficiente complementariedad con una secuencia tracr para promover una o más de las siguientes: (1 ) escisión de una secuencia guía flanqueada por secuencias tracr coincidentes en una célula que contenga la secuencia tracr correspondiente; y (2) formación de un complejo CRISPR en una secuencia objetivo, en donde el complejo CRISPR comprende la secuencia tracr coincidente hibridada con la secuencia tracr. En general, el grado de complementariedad se refiere al alineamiento óptimo de la secuencia tracr coincidente y la secuencia tracr, a lo largo de la longitud de la más corta de las dos secuencias.

La alineación óptima puede determinarse mediante cualquier algoritmo de alineación adecuado, y puede tener en cuenta además las estructuras secundarias, como la autocomplementariedad dentro de la secuencia tracr o la secuencia tracr coincidente. En algunos casos, el grado de complementariedad entre la secuencia tracr y la secuencia tracr coincidente a lo largo de la longitud de la más corta de las dos cuando están alineadas óptimamente es de aproximadamente o de más de aproximadamente el 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97,5%, 99%, o más. En algunos casos, la secuencia tracr tiene aproximadamente o más de aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50 o más nucleótidos de longitud. En algunos casos, la secuencia tracr y la secuencia tracr coincidente están contenidas dentro de un único transcrito, de tal manera que la hibridación entre ambas produce un transcrito que tiene una estructura secundaria, como una horquilla. En algunos aspectos, las secuencias formadoras de giros para su uso en estructuras de horquilla tienen cuatro nucleótidos de longitud, y tienen la secuencia GAAA. Sin embargo, pueden usarse secuencias de giro más largas o más cortas, así como secuencias alternativas. En algunos casos, las secuencias incluyen un triplete de nucleótidos (por ejemplo, AAA) y un nucleótido adicional (por ejemplo, C o G). Los ejemplos de secuencias que forman giros incluyen c Aa A y AAAG. En algunos casos, el transcrito o secuencia de polinucleótidos transcrita tiene por lo menos dos o más horquillas. En algunos casos, el transcrito tiene dos, tres, cuatro o cinco horquillas. En un caso adicional, el transcrito tiene como máximo cinco horquillas. En algunos casos, el único transcrito incluye además una secuencia de terminación de la transcripción, como una secuencia poliT, por ejemplo seis nucleótidos T.

En algunos casos, la enzima CRISPR forma parte de una proteína de fusión que comprende uno o más dominios proteicos heterólogos (por ejemplo, aproximadamente o más de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10, o más dominios además de la enzima CRISPR). Una proteína de fusión de enzima CRISPR puede comprender cualquier secuencia proteica adicional y, opcionalmente, una secuencia conectora entre dos dominios cualquiera. Los ejemplos de dominios proteicos que pueden fusionarse con una enzima CRISPR incluyen, sin limitación, etiquetas de epítopos, secuencias de genes informadores y dominios proteicos que tienen una o más de las siguientes actividades: actividad de metilasa, actividad de desmetilasa, actividad de activación de la transcripción, actividad de represión de la transcripción, actividad de factor de liberación de la transcripción, actividad de modificación de histonas, actividad de escisión de ARN y actividad de unión de ácidos nucleicos. Ejemplos no limitativos de etiquetas de epítopos incluyen etiquetas de histidina (His), etiquetas V5, etiquetas FLAG, etiquetas de hemaglutinina de la gripe (HA), etiquetas Myc, etiquetas VSV-G y etiquetas de tiorredoxina (Trx). Algunos ejemplos de genes informadores son, pero no se limitan a, glutatión-5-transferasa (GST), peroxidasa de rábano picante (HRP), cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), betagalactosidasa, beta-glucuronidasa, luciferasa, proteína verde fluorescente (GFP), HcRed, DsRed, proteína cian fluorescente (CFP), proteína amarilla fluorescente (YFP) y proteínas autofluorescentes, incluyendo la proteína azul fluorescente (BFP). Una enzima CRISPR puede fusionarse a una secuencia genética que codifique una proteína o un fragmento de una proteína que se una a moléculas de ADN o que se una a otras moléculas celulares incluyendo, entre otras, proteína de unión a maltosa (MBP), etiqueta S, fusiones del dominio de unión a ADN (DBD) Lex A, fusiones del dominio de unión a ADN GAL4A y fusiones de la proteína BP16 del virus del herpes simple (VHS). En la US20110059502 se describen dominios adicionales que pueden formar parte de una proteína de fusión que comprende una enzima CR ISPR. En algunos casos, se usa una enzima CRISPR marcada para identificar la localización de una secuencia objetivo.

En algunos casos, se administra a la célula una enzima CRISPR en combinación con una secuencia guía (y opcionalmente formando complejo con ella). Por ejemplo, la tecnología CRISPR/Cas9 puede usarse para desactivar la expresión génica del antígeno objetivo en las células manipuladas. En un método ejemplar, la nucleasa Cas9 (por ejemplo, la codificada por ARNm deStaphylococcus aureuso deStretpococcus pyogenes,por ejemplo pCW-Cas9, Addgene N° 50661, Wang et al. (2014) Science, 3:343-80-4; o vectores lentivirales de nucleasa o nickasa disponibles de Applied Biological Materials (A<b>M; Canadá) como el N° de Cat. K002, K003, K005 o K006) y un ARN guía específico del gen del antígeno objetivo se introducen en las células, por ejemplo, usando vectores de administración lentivirales o cualquiera de una serie de métodos o vehículos de administración conocidos para la transferencia a las células, como cualquiera de una serie de métodos o vehículos conocidos para la administración de moléculas Cas9 y ARN guía. También se generan células T de control no específicas o con vectores vacíos. El grado de desactivación de un gen (por ejemplo, de 24 a 72 horas después de la transferencia) se evalúa usando cualquiera de los ensayos bien conocidos para evaluar la alteración génica en células.

Hay disponibles kits, vectores de ARNg y vectores donantes disponibles en el mercado, para la desactivación de un antígeno tumoral universal, como uno o más de MDM2, CYP1B, HER2/neu, WT1, livina, AFP, CEA, MUC16, MUC1, PSMA, p53 o ciclina (D1), por ejemplo, de Origene (Rockville, MD), GenScript (Atlanta, GA), Applied Biological Materials (ABM; Richmond, British Colombia), BioCat (Heidelberg, Alemania) u otros. Por ejemplo, los kits disponibles comercialmente para la desactivación de hTERT mediante CRISPR incluyen, por ejemplo, los disponibles con los números de catálogo K0009801, K0009802, K009803 y/o K0009804, cada uno disponible en ABM. Los kits disponibles comercialmente para la desactivación de survivina mediante CRISPR incluyen, por ejemplo, los números de catálogo KN205935 disponibles en Origene y los números de catálogo K0184401, K0184402, K0184403, K0184404 disponibles en ABM. Los kits disponibles comercialmente para la desactivación de MDM2 mediante CRISPR incluyen, por ejemplo, KN219518 de Origene y el número de catálogo K1283521 de ABM. Los kits disponibles en el mercado para la desactivación de Her2/neu mediante CRISPR incluyen, por ejemplo, KN212583 de Origene. Los kits disponibles en el mercado para la desactivación de Cyp1B1 mediante CRISPR incluyen, por ejemplo, KN204074-OR de BioCat. Los kits disponibles en el mercado para la desactivación de WT1 mediante CRISPR incluyen, por ejemplo, KN220079 de Origene.

Los kits, vectores de ARNg y vectores donantes comercialmente disponibles, para la desactivación de CD38 mediante CRISPR están disponibles, por ejemplo, de OriGene. Véase www.origene.com/CRISPR-CAS9/Product.aspx?SKU=KN203179; números de catálogo KN203179G1, KN203179G2, KN203179D.

En algunos aspectos, los polinucleótidos objetivo se modifican en una célula eucariota. En algunos casos, el método comprende permitir que el complejo CRISPR se una al polinucleótido objetivo para efectuar la escisión de dicho polinucleótido objetivo modificando de este modo el polinucleótido objetivo, en donde el complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR que forma complejo con una secuencia guía hibridada a una secuencia objetivo dentro de dicho polinucleótido objetivo, en donde dicha secuencia guía está unida a una secuencia tracr coincidente que a su vez hibrida a una secuencia tracr.

En algunos aspectos, los métodos incluyen modificar la expresión de un polinucleótido en una célula eucariota. En algunos casos, el método comprende permitir que el complejo CRISPR se una al polinucleótido de tal manera que dicha unión resulte en un aumento o disminución de la expresión de dicho polinucleótido; en donde el complejo CRISPR comprende una enzima CRISPR que forma complejo con una secuencia guía hibridada a una secuencia objetivo dentro de dicho polinucleótido, en donde dicha secuencia guía está unida a una secuencia tracr coincidente que a su vez hibrida con una secuencia tracr.

Administración de ácidos nucleicos que codifican las moléculas y complejos de alteración génica

En algunos aspectos, se administra o introduce en la célula un ácido nucleico que codifica la molécula, complejo o combinación de ADN objetivo. El ácido nucleico se administra típicamente en forma de un vector de expresión, como un vector de expresión viral. En algunos aspectos, el vector de expresión es un vector de expresión retroviral, un vector de expresión adenoviral, un vector de expresión de plásmido de ADN o un vector de expresión AAV. En algunos aspectos, se administran a la célula uno o más polinucleótidos que codifican la molécula o complejo de alteración, como la molécula dirigida al ADN. En algunos aspectos, la administración se realiza mediante la administración de uno o más vectores, uno o más transcritos de los mismos, y/o una o más proteínas transcritas de los mismos, a la célula.

En algunos casos, los polipéptidos se sintetizan in situ en la célula como resultado de la introducción de polinucleótidos que codifican los polipéptidos en la célula. En algunos aspectos, los polipéptidos podrían producirse fuera de la célula y luego introducirse en la misma. Los métodos para introducir un constructo de polinucleótidos en células animales son conocidos e incluyen, como ejemplos no limitativos, métodos de transformación estable en los que el constructo de polinucleótidos se integra en el genoma de la célula, métodos de transformación transitoria en los que el constructo de polinucleótidos no se integra en el genoma de la célula, y métodos mediados por virus. En algunos casos, los polinucleótidos pueden introducirse en la célula mediante, por ejemplo, vectores virales recombinantes (por ejemplo, retrovirus, adenovirus), liposomas y similares. Por ejemplo, en algunos aspectos, los métodos de transformación transitoria incluyen microinyección, electroporación o bombardeo de partículas. En algunos casos, los polinucleótidos pueden incluirse en vectores, más particularmente plásmidos o virus, con vistas a su expresión en las células.

En algunos casos, pueden usarse métodos de transferencia génica basados en virus y no virales para introducir ácidos nucleicos en células de mamíferos o tejidos objetivo. Tales métodos pueden usarse para administrar ácidos nucleicos que codifican componentes de un sistema CRISPR, ZFP, ZFN, TALE y/o TALEN a células en cultivo o en un organismo huésped. Los sistemas de administración de vectores no virales incluyen plásmidos de ADN, ARN (por ejemplo, un transcrito de un vector descrito en la presente), ácido nucleico desnudo y ácido nucleico que forma complejo con un vehículo de administración, como un liposoma. Los sistemas de administración de vectores virales incluyen virus de ADN y ARN, que tienen genomas episomales o integrados tras su administración a la célula. Para una revisión de los procedimientos de terapia génica, consultar Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel & Felgner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon. TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10): 1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995); Haddada et al., in Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Bohm (eds) (1995); y Yu et al., Gene Therapy 1:13-26 (1994).

Los métodos de administración no viral de ácidos nucleicos incluyen la lipofección, la nucleofección, la microinyección, la biolística, los virosomas, los liposomas, los inmunoliposomas, los conjugados de ácido nucleico con policationes o lípidos, el ADN desnudo, los viriones artificiales y la captación de ADN potenciada por agentes. La lipofección se describe, por ejemplo, en las Patente de Estados Unidos N° 5.049.386, 4.946.787; y 4.897.355) y los reactivos de lipofección se venden comercialmente (por ejemplo, Transfectam™ y Lipofectin™). Los lípidos catiónicos y neutros que son adecuados para la lipofección eficiente de polinucleótidos con reconocimiento de receptor incluyen los de Felgner, WO 91/17424; WO 91/16024. La administración puede realizarse en células (por ejemplo, administración in vitro o ex vivo) o en tejidos objetivo (por ejemplo, administración in vivo).

En algunos casos, la administración se realiza mediante el uso de sistemas virales basados en ARN o ADN para la administración de ácidos nucleicos. En algunos aspectos, los vectores virales pueden administrarse directamente a los pacientes (in vivo) o pueden usarse para tratar células in vitro o ex vivo, y luego administrarse a los pacientes. En algunos casos, los sistemas basados en virus incluyen vectores retrovirales, lentivirus, adenovirales, adenoasociados y del virus del herpes simple para la transferencia de genes.

En algunos aspectos, puede introducirse en la célula un gen informador que incluye, entre otros, glutatión-5-transferasa (GST), peroxidasa de rábano picante (HRP), cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) beta-galactosidasa, beta-glucuronidasa, luciferasa, proteína verde fluorescente (GFP), HcRed, DsRed, proteína cian fluorescente (CFP), proteína amarilla fluorescente (YFP) y proteínas autofluorescentes que incluyen la proteína azul fluorescente (BFP), para codificar un producto génico que sirva como marcador para medir la alteración o modificación de la expresión del producto génico. En otro caso, puede introducirse la molécula de ADN que codifica el producto génico en la célula a través de un vector. En algunos casos, el producto génico es luciferasa. En otro caso, disminuye la expresión del producto génico.

II. Composiciones, formulaciones, kits, dispositivos, métodos y usos

También se divulgan células, poblaciones celulares y composiciones que contienen las células producidas mediante los métodos divulgados. Entre las composiciones se encuentran composiciones y formulaciones farmacéuticas para administración, como por ejemplo para terapia celular adoptiva. También se divulgan métodos terapéuticos para administrar las células y composiciones a sujetos, por ejemplo, pacientes.

Se divulgan métodos y usos de las células, incluidos métodos y usos terapéuticos, como en la terapia celular adoptiva. En algunos casos, los métodos incluyen la administración de las células o de una composición que contenga las células a un sujeto, tejido o célula, como uno que padezca, esté en riesgo de padecer o se sospeche que padece una enfermedad, afección o trastorno. En algunos casos, los métodos tratan cánceres y otras enfermedades, afecciones y trastornos. En algunos casos, las células, poblaciones y composiciones se administran a un sujeto que tiene la enfermedad o afección particular que se va a tratar, por ejemplo, mediante terapia celular adoptiva, como terapia de células T adoptiva. En algunos casos, las células o composiciones se administran al sujeto, como un sujeto que tiene o está en riesgo de tener la enfermedad o afección. En algunos aspectos, los métodos tratan de este modo, por ejemplo, mejoran uno o más síntomas de la enfermedad o afección, como por ejemplo disminuyendo la carga tumoral en un cáncer que expresa un antígeno reconocido por la célula manipulada.

Los métodos de administración de células para terapia celular adoptiva son conocidos y pueden usarse en relación con los métodos y composiciones divulgados. Por ejemplo, los métodos de terapia de células T adoptiva se describen, por ejemplo, en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos N° 2003/0170238 de Gruenberg et al; Patente de Estados Unidos N° 4.690.915 de Rosenberg; Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8(10):577-85). Ver, por ejemplo, Themeli et al. (2013) NatBiotechnol. 31(10): 928-933; Tsukahara et al. (2013) Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338.

En algunos casos divulgados, la terapia celular, por ejemplo, la terapia celular adoptiva, por ejemplo, la terapia celular T adoptiva, se lleva a cabo mediante transferencia autóloga, en la que las células se aíslan y/o se preparan de otro modo a partir del sujeto que va a recibir la terapia celular, o a partir de una muestra derivada de dicho sujeto. Por tanto, en algunos aspectos divulgados, las células se derivan de un sujeto, por ejemplo, un paciente, que necesita un tratamiento y las células, tras su aislamiento y procesamiento, se administran al mismo sujeto.

En algunos casos divulgados, la terapia celular, por ejemplo, la terapia celular adoptiva, por ejemplo, la terapia celular T adoptiva, se lleva a cabo mediante transferencia alogénica, en la que las células se aíslan y/o se preparan de otro modo a partir de un sujeto distinto del sujeto que va a recibir o que finalmente recibe la terapia celular, por ejemplo, un primer sujeto. En tales casos divulgados, las células se administran a un sujeto diferente, por ejemplo, un segundo sujeto, de la misma especie. En algunos casos divulgados, el primer y el segundo sujeto son genéticamente idénticos. En algunos casos divulgados, el primer y el segundo sujeto son genéticamente similares. En algunos casos divulgados, el segundo sujeto expresa la misma clase o supertipo de HLA que el primer sujeto.

En algunos casos divulgados, el sujeto, por ejemplo, el paciente, al que se administran las células, poblaciones celulares o composiciones es un mamífero, típicamente un primate, como un humano. En algunos casos divulgados, el primate es un mono o un simio. El sujeto puede ser macho o hembra y puede tener cualquier edad adecuada, incluyendo sujetos infantiles, juveniles, adolescentes, adultos y geriátricos. En algunos casos divulgados, el sujeto es un mamífero no primate, como un roedor. En algunos ejemplos, el paciente o el sujeto es un modelo animal validado para enfermedad, terapia celular adoptiva y/o para evaluar resultados tóxicos como el síndrome de liberación de citoquinas (CRS).

También se proporcionan composiciones farmacéuticas para su uso en tales métodos.

Entre las enfermedades, afecciones y trastornos se encuentran los tumores, incluyendo tumores sólidos, enfermedades hematológicas y melanomas, y enfermedades infecciosas, como infección por un virus u otro patógeno, por ejemplo, el VIH, el VHC, el VHB, el CMV y enfermedades parasitarias. En algunos casos, la enfermedad o afección es un tumor, cáncer, enfermedad maligna, neoplasia u otra enfermedad proliferativa. Tales enfermedades incluyen, pero no se limitan a, cánceres del sistema inmunitario, leucemia, linfoma, por ejemplo, leucemia linfocítica crónica (CLC), ALL, linfoma no Hodgkin, leucemia mieloide aguda, mieloma múltiple, linfoma folicular refractario, linfoma de células del manto, linfoma indolente de células B, enfermedades malignas de células B, cánceres de colon, pulmón, hígado, mama, próstata, ovario, piel (incluido el melanoma), cáncer óseo y cerebral, cáncer de ovario, cánceres epiteliales, carcinoma de células renales, adenocarcinoma pancreático, linfoma de Hodgkin, carcinoma cervical, cáncer colorrectal, glioblastoma, neuroblastoma, sarcoma de Ewing, meduloblastoma, osteosarcoma, sarcoma sinovial y/o mesotelioma. En un caso, la enfermedad o afección es o está asociada con el mieloma múltiple.

En algunos casos, la enfermedad o afección es una enfermedad o afección infecciosa como, pero no limitada a, infecciones virales, retrovirales, bacterianas y protozoarias, inmunodeficiencia, citomegalovirus (CMV), virus de Epstein-Barr (EBV), adenovirus, poliomavirus BK. En algunos casos, la enfermedad o afección es una enfermedad o afección autoinmune o inflamatoria, como la artritis, por ejemplo, la artritis reumatoide (AR), la diabetes de tipo I, el lupus eritematoso sistémico (LES), la enfermedad inflamatoria intestinal, la psoriasis, la esclerodermia, la enfermedad tiroidea autoinmune, la enfermedad de Grave, la enfermedad de Crohn, la esclerosis múltiple, el asma y/o una enfermedad o afección asociada a un trasplante.

En algunos casos, el uno o más receptores de antígenos manipulados genéticamente se unen específicamente a un antígeno objetivo asociado con la enfermedad o trastorno. En algunos casos, dos o más receptores de antígenos manipulados genéticamente se unen a dos o más antígenos diferentes asociados con la enfermedad o trastorno. En algunos casos, por lo menos un antígeno asociado con la enfermedad o trastorno es un antígeno tumoral universal. Por ejemplo, en algunos casos el antígeno es hTERT, survivina, MDM2, CYP1B, HER2/neu, WT1, livina, AFP, CEA, MUC16, MUC1, PSMA, p53 o ciclina (D1). Por ejemplo, el antígeno tumoral universal es hTERT o survivina. En algunos casos, por lo menos un antígeno asociado con la enfermedad o trastorno es un antígeno de mieloma. Por ejemplo, en algunos casos, el antígeno de mieloma es CD38, CD138, CS-1, CD56, TIM-3, CD33, CD123 o CD44. Por ejemplo, el antígeno del mieloma es CD38.

En algunos casos, uno o más antígenos asociados con la enfermedad o trastorno se seleccionan del grupo que consiste en receptor huérfano de tirosina quinasa ROR1, tEGFR, Her2, Ll-CAM, CD 19, CD20, CD22, mesotelina, C<e a>, y antígeno de superficie de la hepatitis B, receptor antifolato, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, 0EPHa2, ErbB2, 3, o 4, FBP, receptor fetal de aceticolina e, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-alfa, IL-13R-alfa2, kdr, cadena ligera kappa, Lewis Y, molécula de adhesión celular L1, MAGE-A1, mesotelina, MUC1, MUC16, PSCA, ligandos NKG2D, NY-ESO-1, MART-1, gp100, antígeno oncofetal, ROR1, TAG72, VEGF-R2, antígeno carcinoembrionario (CEA), antígeno prostático específico, PSMA, Her2/neu, receptor de estrógenos, receptor de progesterona, efrinaB2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2, y MAGE A3, CE7, tumor de Wilms 1 (WT-1), una ciclina, como la ciclina A1 (CCNA1), y/o moléculas biotiniladas, y/o moléculas expresadas por el VIH, el VHC, el VHB u otros patógenos. Los antígenos incluyen proteínas, carbohidratos y otras moléculas.

En algunos casos, las células y poblaciones celulares se administran a un sujeto en forma de una composición, como una composición farmacéutica. En algunos casos, la composición farmacéutica comprende además otros agentes o fármacos farmacéuticamente activos, como agentes quimioterapéuticos, por ejemplo, asparaginasa, busulfano, carboplatino, cisplatino, daunorrubicina, doxorrubicina, fluorouracilo, gemcitabina, hidroxiurea, metotrexato, paclitaxel, rituximab, vinblastina, vincristina, etc. En algunos casos, las poblaciones celulares se administran en forma de sal, por ejemplo, una sal farmacéuticamente aceptable. Las sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables adecuadas incluyen las derivadas de ácidos minerales, como los ácidos clorhídrico, bromhídrico, fosfórico, metafosfórico, nítrico y sulfúrico, y ácidos orgánicos, como los ácidos tartárico, acético, cítrico, málico, láctico, fumárico, benzoico, glicólico, glucónico, succínico y arilsulfónico, por ejemplo, el ácido ptoluenosulfónico.

En algunos aspectos, la elección del receptáculo portador en la composición farmacéutica viene determinada en parte por el CAR o TCR manipulados particulares, el vector o las células que expresan el CAR o TCR, así como por el método particular usado para administrar el vector o las células huésped que expresan el CAR. Por consiguiente, hay una variedad de formulaciones adecuadas. Por ejemplo, la composición farmacéutica puede contener conservantes. Los conservantes adecuados pueden incluir, por ejemplo, metilparabeno, propilparabeno, benzoato sódico y cloruro de benzalconio. En algunos aspectos, se usa una mezcla de dos o más conservantes. El conservante o las mezclas de los mismos están típicamente presentes en una cantidad comprendida entre el 0,0001% y el 2% en peso de la composición total.

Además, en algunos aspectos en la composición se incluyen agentes tampón. Entre los agentes tampón adecuados se incluyen, por ejemplo, ácido cítrico, citrato de sodio, ácido fosfórico, fosfato potásico y otros ácidos y sales. En algunos aspectos, se usa una mezcla de dos o más agentes tampón. El agente tampón o las mezclas de los mismos están típicamente presentes en una cantidad de aproximadamente el 0,001 % a aproximadamente el 4% en peso de la composición total. Se conocen métodos para preparar composiciones farmacéuticas administrables. Los métodos ejemplares se describen con más detalle en, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21a ed. (1 de mayo de 2005).

En ciertos casos, una composición farmacéutica que comprende una población celular descrita en la presente puede formularse como un complejo de inclusión, como un complejo de inclusión de ciclodextrina, o como un liposoma. Los liposomas pueden servir para dirigir las células huésped (por ejemplo, células T o células NK) a un tejido concreto. Existen muchos métodos para preparar liposomas, como los descritos, por ejemplo, en Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9: 467 (1980), y las Patentes de Estados Unidos 4.235.871, 4.501.728, 4.837.028 y 5.019.369.

En algunos aspectos, la composición farmacéutica puede emplear sistemas de liberación prolongada, liberación retardada o liberación sostenida, de tal manera que la administración de la composición se produzca antes y con tiempo suficiente para provocar la sensibilización de la zona a tratar. Hay muchos tipos de sistemas de liberación disponibles y conocidos por los expertos en la materia. Tales sistemas pueden evitar la administración repetida de la composición, aumentando de este modo la comodidad para el sujeto y el médico.

En algunos casos, la composición farmacéutica comprende las células en cantidades eficaces para tratar o prevenir la enfermedad o afección, como una cantidad terapéuticamente eficaz o profilácticamente eficaz. En algunos casos, la eficacia terapéutica o profiláctica se controla mediante la evaluación periódica de los sujetos tratados. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, el tratamiento se repite hasta que se produzca una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, pueden ser útiles y pueden determinarse otros regímenes de dosificación. La dosificación deseada puede administrarse mediante una única administración en bolo de la composición, mediante múltiples administraciones en bolo de la composición o mediante la administración de la composición en infusión continua.

En ciertos casos divulgados, se administra a un sujeto el intervalo de aproximadamente un millón a aproximadamente 100 mil millones de células, como, por ejemplo, de 1 millón a aproximadamente 50 mil millones de células (por ejemplo, aproximadamente 5 millones de células, aproximadamente 25 millones de células, aproximadamente 500 millones de células, aproximadamente 1 mil millones de células, aproximadamente 5 mil millones de células, aproximadamente 20 mil millones de células, aproximadamente 30 mil millones de células, aproximadamente 40 mil millones de células, o un intervalo definido por dos cualquiera de los valores anteriores), como aproximadamente 1de 0 millones a aproximadamente 100 mil millones de células (por ejemplo, aproximadamente 20 millones de células, aproximadamente 30 millones de células, aproximadamente 40 millones de células, aproximadamente 60 millones de células, aproximadamente 70 millones de células, aproximadamente 80 millones de células, aproximadamente 90 millones de células, aproximadamente 10.000 millones de células, aproximadamente 25.000 millones de células, aproximadamente 50.000 millones de células, aproximadamente 75.000 millones de células, aproximadamente 90.000 millones de células, o un intervalo definido por dos cualquiera de los valores anteriores), y en algunos casos entre aproximadamente 100 millones de células y aproximadamente 50.000 millones de células (por ejemplo, aproximadamente 120 millones de células, aproximadamente 250 millones de células, aproximadamente 350 millones de células, aproximadamente 450 millones de células, aproximadamente 650 millones de células, aproximadamente 800 millones de células, aproximadamente 900 millones de células, aproximadamente 3.000 millones de células, aproximadamente 30.000 millones de células, aproximadamente 45.000 millones de células) o cualquier valor entre estos intervalos.

En algunos casos, las células y las composiciones se administran usando técnicas, formulaciones y/o dispositivos de administración estándar. Se divulgan formulaciones y dispositivos, como jeringuillas y viales, para el almacenamiento y la administración de las composiciones. La administración puede ser autóloga o heteróloga. Por ejemplo, las células o progenitores inmunosensibles pueden obtenerse de un sujeto y administrarse al mismo sujeto o a un sujeto diferente compatible. Las células inmunosensibles derivadas de sangre periférica de la divulgación o su progenie (por ejemplo, derivadas in vivo, ex vivo o in vitro) pueden administrarse mediante inyección localizada, incluyendo la administración por catéter, inyección sistémica, inyección localizada, inyección intravenosa o administración parenteral. Cuando se administra una composición terapéutica de la presente divulgación (por ejemplo, una composición farmacéutica que contiene una célula inmunosensible manipulada genéticamente), generalmente se formulará en una forma inyectable de dosis unitaria (solución, suspensión, emulsión).

Las formulaciones incluyen las de administración oral, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, pulmonar, transdérmica, intramuscular, intranasal, bucal, sublingual o en supositorios. En algunos casos, las poblaciones celulares se administran por vía parenteral. El término "parenteral", como se usa en la presente, incluye la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, rectal, vaginal e intraperitoneal. En algunos casos, las poblaciones celulares se administran a un sujeto mediante administración sistémica periférica por inyección intravenosa, intraperitoneal o subcutánea.

En algunos casos, las composiciones de las células se suministran como preparaciones líquidas estériles, por ejemplo, soluciones acuosas isotónicas, suspensiones, emulsiones, dispersiones o composiciones viscosas, que en algunos aspectos pueden estar tamponadas a un pH seleccionado. Las preparaciones líquidas son normalmente más fáciles de preparar que los geles, otras composiciones viscosas y composiciones sólidas. Además, las composiciones líquidas son algo más cómodas de administrar, especialmente por inyección. Por otra parte, las composiciones viscosas pueden formularse dentro del intervalo de viscosidad adecuado para proporcionar periodos de contacto más prolongados con tejidos específicos. Las composiciones líquidas o viscosas pueden comprender portadores, que pueden ser un solvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido) y mezclas adecuadas de los mismos.

Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando la manipulación genética en un solvente, por ejemplo en mezcla con un portador, diluyente o excipiente adecuado, como agua estéril, solución salina fisiológica, glucosa, dextrosa o similares. Las composiciones también pueden liofilizarse. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares como agentes humectantes, dispersantes o emulsionantes (por ejemplo, metilcelulosa), agentes de tamponamiento del pH, aditivos gelificantes o potenciadores de la viscosidad, conservantes, aromatizantes, colorantes y similares, dependiendo de la vía de administración y de la preparación deseada. En algunos aspectos, pueden consultarse textos estándar para preparar las preparaciones adecuadas.

Pueden añadirse varios aditivos que mejoran la estabilidad y esterilidad de las composiciones, como conservantes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y tampones. La prevención de la acción de microorganismos puede garantizarse mediante varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. La absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede conseguirse mediante el uso de agentes retardadores de la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

En algunos casos, las células se coadministran con uno o más agentes terapéuticos adicionales o en conexión con otra intervención terapéutica, ya sea simultánea o secuencialmente en cualquier orden. En algunos contextos, las células se coadministran con otra terapia lo suficientemente cerca en el tiempo como para que las poblaciones celulares potencien el efecto de uno o más agentes terapéuticos adicionales, o viceversa. En algunos casos, las poblaciones celulares se administran antes de uno o más agentes terapéuticos adicionales. En algunos casos, las poblaciones celulares se administran después del uno o más agentes terapéuticos adicionales.

Una vez que las células se administran a un mamífero (por ejemplo, un humano), la actividad biológica de las poblaciones de células modificadas en algunos aspectos se mide mediante cualquiera de los métodos conocidos. Los parámetros a evaluar incluyen la unión específica de una célula T natural o manipulada u otra célula inmunitaria al antígeno,in vivo,por ejemplo, mediante imágenes, oex vivo,por ejemplo, mediante ELISA o citometría de flujo. En ciertos casos, la capacidad de las células manipuladas para destruir células objetivo puede medirse usando cualquier método adecuado conocido en la técnica, como los ensayos de citotoxicidad descritos, por ejemplo, en Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009), y Herman et al. J. Immunological Methods, 285(1): 25-40 (2004). En ciertos casos, la actividad biológica de las células también puede medirse analizando la expresión y/o secreción de ciertas citoquinas, como CD 107a, IFNy, IL-2 y TNF. En algunos aspectos, la actividad biológica se mide evaluando el resultado clínico, como la reducción de la carga tumoral.

En ciertos casos, las células manipuladas se modifican de varias maneras para aumentar su eficacia terapéutica o profiláctica. Por ejemplo, el CAR o TCR manipulado expresado por la población puede conjugarse directa o indirectamente a través de un conector con una fracción objetivo. La práctica de conjugar compuestos, por ejemplo, el CAR o el TCR, con elementos objetivo es conocida en la técnica. Ver, por ejemplo, Wadwa et al., J. Drug Targeting 3: 111 (1995), y la Patente de Estados Unidos 5.087.616.

MI. Definiciones

Como se usa en la presente, la "represión" de la expresión génica se refiere a la eliminación o reducción de la expresión de uno o más productos génicos codificados por el gen en cuestión en una célula, en comparación con el nivel de expresión del producto génico en ausencia de la represión. Los productos génicos ejemplares incluyen ARNm y productos proteicos codificados por el gen. La represión en algunos casos es transitoria o reversible y en otros casos es permanente. En algunos casos, la represión es de una proteína o ARNm funcional o de longitud completa, a pesar de que pueda producirse un producto truncado o no funcional. En algunos casos, se reprime la actividad o función génica, en contraposición a la expresión. La represión génica se induce generalmente mediante métodos artificiales, es decir, por adición o introducción de un compuesto, molécula, complejo o composición, y/o por alteración del ácido nucleico del gen o asociado al mismo, por ejemplo a nivel del ADN. Los métodos ejemplares para la represión génica incluyen técnicas de silenciamiento génico, activación, desactivación y/o alteración génica, como la edición génica. Los ejemplos incluyen tecnología antisentido, como ARNi, ARNip, ARNhc y/o ribozimas, que generalmente dan lugar a una reducción transitoria de la expresión, así como técnicas de edición génica que dan lugar a la inactivación o alteración génica dirigida, por ejemplo, por inducción de roturas y/o recombinación homóloga.

Como se usa en la presente, una "alteración" de un gen se refiere a un cambio en la secuencia del gen, a nivel del ADN. Los ejemplos incluyen inserciones, mutaciones y deleciones. Las alteraciones típicamente dan como resultado la represión y/o ausencia total de expresión de un producto normal o "de tipo salvaje" codificado por el gen. Los ejemplos de tales alteraciones genéticas son inserciones, mutaciones de cambio de marco y de sentido erróneo, deleciones, activaciones y desactivaciones del gen o de parte del gen, incluyendo deleciones de todo el gen. Tales alteraciones pueden producirse en la región codificante, por ejemplo, en uno o más exones, lo que da como resultado la incapacidad de producir un producto de longitud completa, producto funcional, o cualquier producto, como por la inserción de un codón de parada. Tales alteraciones también pueden producirse por alteraciones en el promotor o potenciador u otra región que afecte a la activación de la transcripción, de tal manera que se impida la transcripción del gen. Las alteraciones génicas incluyen el direccionamiento génico, incluyendo la inactivación génica dirigida por recombinación homóloga.

Como se usan en la presente, las formas singulares "un", "uno" y "el" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, "un" o "uno" significa "por lo menos uno" o "uno o más".

A lo largo de esta divulgación, varios aspectos de la materia reivindicada se presentan en un formato de intervalo. Debe entenderse que la descripción en formato de intervalo es meramente por conveniencia y brevedad y no debe interpretarse como una limitación inflexible en el alcance de la materia reivindicada. Por consiguiente, debe considerarse que la descripción de un intervalo ha divulgado específicamente todos los posibles subintervalos, así como los valores numéricos individuales dentro de ese intervalo. Por ejemplo, cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, entre el límite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor declarado o intermedio en ese intervalo declarado está incluido en la materia reivindicada. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden incluirse independientemente en los intervalos más pequeños, y también se incluyen en la materia reivindicada, sin perjuicio de cualquier límite específicamente excluido en el intervalo expuesto. Cuando el intervalo expuesto incluya uno o ambos límites, los intervalos que excluyan uno cualquiera o ambos de esos límites incluidos también se incluyen en la materia reivindicada. Esto se aplica independientemente de la amplitud del intervalo.

El término "aproximadamente", como se usa en la presente, se refiere al intervalo de error habitual para el valor respectivo fácilmente conocido por los experto en este campo técnico. La referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro incluye (y describe) casos dirigidos a ese valor o parámetroper se.

Como se usa en la presente, un sujeto incluye cualquier organismo vivo, como humanos y otros mamíferos. Los mamíferos incluyen, entre otros, humanos y animales no humanos, incluyendo los animales de granja, los animales de deporte, los roedores y los animales de compañía.

Como se usa en la presente, una composición se refiere a cualquier mezcla de dos o más productos, sustancias o compuestos, incluyendo las células. Puede ser una solución, una suspensión, un líquido, un polvo, una pasta, acuosa, no acuosa o cualquier combinación de los mismos.

Como se usan en la presente, los términos "tratamiento", "tratar" y "que trata" se refieren a la mejora o reducción completa o parcial de una enfermedad, afección o trastorno, o de un síntoma, efecto adverso o resultado, o fenotipo asociado a los mismos. En algunos casos, el efecto es terapéutico, es decir, cura parcial o totalmente una enfermedad o afección o un síntoma adverso atribuible a la misma.

Como se usa en la presente, una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un compuesto o composición o combinación se refiere a una cantidad eficaz, a las dosificaciones y durante los periodos de tiempo necesarios, para lograr un resultado terapéutico deseado, como para el tratamiento de una enfermedad, afección o trastorno, y/o el efecto farmacocinético o farmacodinámico del tratamiento. La cantidad terapéuticamente eficaz puede variar de acuerdo con factores como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del sujeto, y las poblaciones de células administradas.

Como se usa en la presente, una afirmación de que una célula o población de células es "positiva" para un marcador concreto se refiere a la presencia detectable sobre o dentro de la célula de un marcador concreto, típicamente un marcador de superficie. Cuando se hace referencia a un marcador de superficie, el término se refiere a la presencia de expresión de superficie detectada por citometría de flujo, por ejemplo, mediante tinción con un anticuerpo que se une específicamente al marcador y detección de dicho anticuerpo, en donde la tinción es detectable por citometría de flujo a un nivel sustancialmente superior a la tinción detectada llevando a cabo el mismo procedimiento con un control de isotipo coincidente en condiciones por lo demás idénticas y/o a un nivel sustancialmente similar al de la célula que se sabe que es positiva para el marcador, y/o a un nivel sustancialmente superior al de una célula que se sabe que es negativa para el marcador.

Como se usa en la presente, la afirmación de que una célula o población de células es "negativa" para un marcador particular se refiere a la ausencia de presencia detectable sustancial sobre o en la célula de un marcador particular, típicamente un marcador de superficie. Cuando se hace referencia a un marcador de superficie, el término se refiere a la ausencia de expresión de superficie detectada por citometría de flujo, por ejemplo, mediante tinción con un anticuerpo que se une específicamente al marcador y detección de dicho anticuerpo, en donde la tinción no se detecta por citometría de flujo a un nivel sustancialmente superior a la tinción detectada llevando a cabo el mismo procedimiento con un control de isotipo coincidente en condiciones por lo demás idénticas, y/o a un nivel sustancialmente inferior al de la célula que se sabe que es positiva para el marcador, y/o a un nivel sustancialmente similar en comparación con el de una célula que se sabe que es negativa para el marcador.

En algunos casos, una disminución en la expresión de uno o varios marcadores se refiere a la pérdida de 1 log10 en la intensidad media de fluorescencia y/o disminución del porcentaje de células que muestran el marcador de por lo menos aproximadamente el 20% de las células, el 25% de las células, el 30% de las células, el 35% de las células, el 40% de las células, el 45% de las células, el 50% de las células, el 55% de las células, el 60% de las células, el 65% de las células, el 70% de las células, el 75% de las células, el 80% de las células, el 85% de las células, el 90% de las células, el 95% de las células y el 100% de las células y cualquier % entre el 20 y el 100% en comparación con una población celular de referencia. En algunos casos, una población celular positiva para uno o varios marcadores se refiere a un porcentaje de células que presentan el marcador de por lo menos aproximadamente el 50% de las células, el 55% de las células, el 60% de las células, el 65% de las células, el 70% de las células, el 75% de las células, el 80% de las células, el 85% de las células, el 90% de las células, el 95% de las células y el 100% de las células y cualquier % entre el 50 y el 100% cuando se compara con una población celular de referencia.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos de la técnica, anotaciones y otros términos o terminología técnica y científica usados en la presente tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece la materia reivindicada. En algunos casos, los términos con significados comúnmente entendidos se definen en la presente por mayor claridad y/o para facilitar la referencia, y la inclusión de tales definiciones en la presente no debe interpretarse necesariamente como una diferencia sustancial con respecto a lo que se entiende generalmente en la técnica.

Los títulos de las secciones que se usan en la presente tienen únicamente propósitos organizativos y no deben interpretarse como una limitación de la materia descrita.

V. EJEMPLOS

Ejemplo 1: Evaluación de la actividad citotóxica de células T manipuladas con un receptor de antígeno quimérico (CAR) específico para hTERT en presencia o ausencia de represión endógena de hTERT.

Se llevaron a cabo estudios ejemplares para evaluar las células T que expresan un receptor de antígeno manipulado específico para un antígeno particular, que se expresa en o sobre las células T, tras la represión de la expresión de y/o la alteración genética o desactivación de dicho antígeno en las células T. Este estudio ejemplar se llevó a cabo alterando la expresión del antígeno proteico tumoral universal, la transcriptasa inversa de telomerasa humana (hTERT). En otros estudios, se llevaron a cabo métodos similares alterando otros objetivos antigénicos de interés (en células que expresan un receptor antigénico manipulado genéticamente que reconoce dicho antígeno), como otros antígenos proteicos universales (por ejemplo, survivina) y/u otros antígenos de interés, incluyendo los expresados de manera natural en células T y/o células T activadas (por ejemplo, CD38).

Las células T se aíslan por selección basada en inmunoafinidad a partir de una muestra de producto de aféresis humana de un sujeto que expresa el alelo HLA-A*0201 como, en algunos casos, un sujeto que tiene un cáncer. Las células resultantes se activan usando un reactivo anti-CD3/anti-CD28 en presencia de IL-2 (100 UI/ml), por ejemplo, durante 72 horas a 37° C.

La tecnología CRISPR/Cas9 se usa para silenciar la expresión génica de hTERT en las células T activadas. En un método ejemplar, se introducen en las células la nucleasa Cas9 (por ejemplo, la codificada por ARNm deStaphylococcus aureuso deStretpococcus pyogenes,por ejemplo, pCW-Cas9, Addgene N° 50661, Wang et al. (2014) Science, 3:343-80-4; o vectores lentivirales de nucleasa o nickasa disponibles en Applied Biological Materials (ABM; Canadá) como el N° de Cat. K002, K003, K005 o K006) y ARN guía de hTERT (ARNg, por ejemplo, vector de ARNg ejemplar disponible de ABM, N° Cat. K0009811), por ejemplo, usando vectores de administración lentivirales o cualquiera de una serie de métodos o vehículos de administración conocidos para la transferencia a las células, como cualquiera de una serie de métodos o vehículos conocidos para la administración de moléculas Cas9 y ARN guía. También se generan células T de control no específicas o con vectores vacíos. El grado de inactivación de hTERT (por ejemplo, 24 a 72 horas después de la transferencia) se evalúa usando cualquiera de los ensayos conocidos para evaluar la alteración génica en células.

Entre 24 y 96 horas después de la transducción del sistema CRISPR/Cas9, las células (silenciamiento de hTERT y células de control) se transducen con un vector vacío o con un vector viral que codifica un receptor de antígeno de hTERT, como un receptor de células T (TCR) o un anticuerpo quimérico anti-hTERT similar a TCR o un fragmento de unión del mismo (por ejemplo, scFv) que se une específicamente a un epítopo peptídico derivado de hTERT en el contexto del HLA-A*0201, por ejemplo, como se describe en la Patente de Estados Unidos N° 7.718.777, incluyendo moléculas de unión al anticuerpos específicas para cualquiera de los péptidos expuestos en las SEQ ID NO: 7, 8 o 10-14. Por tanto, en total, se generan cuatro grupos de células de la siguiente manera 1) inactivación de hTERT (sin receptor manipulado genéticamente); 2) inactivación de hTERT/receptor de antígeno hTERT manipulado genéticamente; 3) células T hTERT de tipo salvaje/receptor de antígeno hTERT manipulado genéticamente; y hTERT de tipo salvaje (sin receptor manipulado genéticamente) (control).

Después de la introducción, las células se siguen cultivando, generalmente a 37 grados C, por ejemplo, para permitir la expansión celular. La citotoxicidad inducida por antígeno y/o la activación de las células en el cultivo de cada grupo se evalúa realizando un ensayo de proliferación celular, un ensayo de liberación de cromo, un ensayo ELISPOT para IFN-y, granzima B y/o perforina y/o un ensayo de viabilidad celular, como por ejemplo usando el ensayo CellTiter-Glo® (CTG) u otro ensayo que mida la proliferación, viabilidad y/o citotoxicidad de las células. La citotoxicidad de las células se compara entre los diferentes grupos de células generadas. Como control positivo de citotoxicidad o activación u otra función, se incluyen células que se sabe que expresan hTERT y/o presentan un péptido derivado del mismo reconocido por la célula, para confirmar la función o funciones específicas de hTERT de las células generadas evaluadas.

En estudios adicionales, las células de los varios grupos de condiciones se administran a sujetos animales y su persistencia se sigue a lo largo del tiempo y se compara, para evaluar los impactos de la inactivación en la autodestrucción por dichas células y la persistencia de tales células a lo largo del tiempo, y la eficacia en el direccionamiento de las células que expresan el antígeno objetivo, como las células tumorales.

Opcionalmente, las células T de inactivación de hTERT/específicas del antígeno hTERT autólogas, manipuladas según lo anterior, que evitan o muestran un potencial reducido de autodestrucción en cultivo, se administran al sujeto para tratar el cáncer a una dosis de, por ejemplo, 1 x 107células7 a 5 x 1010 células.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Una célula inmunitaria manipulada que comprende:

un receptor de antígeno manipulado genéticamente que se une específicamente a un antígeno objetivo, en donde el antígeno objetivo es la ciclina D1; y

una alteración genética en un gen que codifica el antígeno objetivo, en donde la alteración genética se selecciona de entre una inserción, una mutación con desplazamiento de marco, una mutación sin sentido, una deleción, una activación y una inactivación del gen o parte del gen, o la deleción de todo el gen, y da como resultado la ausencia completa de expresión de un producto de tipo salvaje codificado por el gen en comparación con la expresión en la célula inmunitaria en ausencia de dicha alteración genética.

2. La célula inmunitaria manipulada de la reivindicación 1, que comprende además otro receptor de antígeno manipulado genéticamente, que es un receptor coestimulador quimérico que se une específicamente a otro antígeno y es capaz de inducir una señal coestimuladora en la célula.

3. La célula inmunitaria manipulada de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la célula inmunitaria es una célula T o una célula NK, opcionalmente en donde la célula T es una célula T CD4+ o una célula T CD8+.

4. La célula inmunitaria manipulada de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el receptor de antígeno manipulado genéticamente es un receptor de antígeno quimérico similar al TCR (CAR similar a TCR) que comprende un dominio extracelular de reconocimiento de antígeno que se une específicamente a un péptido del antígeno objetivo en el contexto de una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC).

5. La célula inmunitaria manipulada de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el receptor de antígeno manipulado genéticamente es un receptor de células T (TCR).

6. Un métodoin vitropara la producción de una célula inmunitaria manipulada genéticamente, que comprende:

(a) introducir en una célula inmunitaria un receptor de antígeno manipulado genéticamente que se une específicamente a un antígeno objetivo, en donde el antígeno objetivo es la ciclina D1; y

(b) efectuar la represión de la expresión del antígeno objetivo en la célula inmunitaria, en donde la represión de la expresión comprende la alteración de un gen que codifica el antígeno objetivo,

produciendo de este modo una célula inmunitaria manipulada genéticamente en la que se reprime la expresión del antígeno objetivo, lo que da como resultado la ausencia total de expresión del producto de tipo salvaje codificado por el gen en comparación con la expresión en la célula inmunitaria en ausencia de dicha alteración genética,

en donde los pasos (a) y (b) se llevan a cabo simultánea o secuencialmente en cualquier orden.

7. El método de la reivindicación 6, en donde la alteración comprende introducir en la célula inmunitaria una proteína de unión al ADN o un ácido nucleico de unión al ADN que se une específicamente o hibrida con el gen, u opcionalmente introducir una nucleasa de dedos de zinc (ZFN), una nucleasa efectora TAL (TALEN), o y una combinación CRISPR-Cas9 que se une específicamente, reconoce o hibrida con el gen.

8. El método de la reivindicación 6 o de la reivindicación 7, en donde la célula inmunitaria es una célula T o una célula NK, opcionalmente en donde la célula T es una célula T CD4+ o una célula T CD8+.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 6-8, en donde el receptor de antígeno manipulado genéticamente es un receptor de antígeno quimérico similar al TCR (CAR similar a TCR) que comprende un dominio extracelular de reconocimiento de antígeno que se une específicamente a un péptido del antígeno objetivo en el contexto de una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC).

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 6-8, en donde el receptor de antígeno manipulado genéticamente es un receptor de células T (TCR).

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 6-10, que comprende además:

(c) introducir en la célula inmunitaria otro receptor de antígeno manipulado genéticamente, que es un receptor coestimulador quimérico que se une específicamente a otro antígeno y es capaz de inducir una señal coestimuladora en la célula, en donde los pasos (a), (b) y (c) se llevan a cabo simultánea o secuencialmente en cualquier orden.

12. Una célula producida por el método de cualquiera de las reivindicaciones 6. 11.

13. Una composición farmacéutica que comprende la célula inmunitaria manipulada de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o la célula de la reivindicación 12 y un portador farmacéuticamente aceptable.

14. Una composición farmacéutica que comprende la célula inmunitaria manipulada de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o la célula de la reivindicación 12 o la composición farmacéutica de la reivindicación 13 para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afección en un sujeto.