ES2959972T3 - Uso de células germinales para preparar un microfolículo piloso - Google Patents

Abstract

La invención se refiere al uso de células germinales para la obtención de un microfolículo piloso y a su uso para evaluar el efecto de productos cosméticos, farmacéuticos o dermatológicos y también para el tratamiento profiláctico o terapéutico del estado de pilosidad reducida. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Uso de células germinales para preparar un microfolículo piloso

La presente invención se refiere a un procedimiento“in vitro"para producir un microfolículo piloso mediante cultivo y amplificación de células germinales.

También se refiere a los microfolículos pilosos producidos mediante el procedimiento mencionado anteriormente, y al uso de los mismos para el tratamiento de la alopecia y también para la evaluación del efecto de productos cosméticos, farmacéuticos y dermatológicos.

La alopecia está condicionada por diversos factores: genéticos, hormonales y ambientales, por la dieta, y por la actividad física. El cabello tiene un papel estético e identitario esencial. La alopecia en las mujeres o en los hombres puede ser así responsable de un sufrimiento psicológico considerable.

Por lo tanto, un cabello saludable, fuerte, y una cabellera densa durante toda la vida es una ambición de la mayoría de las mujeres y de los hombres.

Se conocen muchas técnicas para el tratamiento de la alopecia, tal como la terapia celular, la terapia con láser, o bien los implantes sin cirugía. Esta última da un resultado inmediato y es mucho menos invasiva que la cirugía.

Para obtener implantes, los folículos pilosos humanos se obtienen cultivando diversos tipos celulares presentes en el bulbo piloso.

El bulbo piloso tiene forma de pera, y está compuesto:

- de la papila, que es un brote de origen dérmico, situado en la base del folículo. Es un sitio altamente vascularizado que participa en la nutrición y regulación del crecimiento del cabello a través de su reserva de factores de crecimiento y proteínas de la matriz extracelular;

- de la matriz, que es una zona que recubre la papila dérmica, constituida por un grupo de células de la matriz muy poco diferenciadas. Es el asiento de una intensa actividad mitótica. Las células de la matriz, que se localizan en el bulbo piloso y que forman un pequeño cúmulo celular alrededor de la papila dérmica, están constituidas principalmente por precursores de queratinocitos que constituyen un estrato germinativo y que proliferan rápidamente hasta diferenciarse para formar el tallo piloso, desempeñando así un papel esencial en el ciclo del cabello. Desde el comienzo de la fase anágena hasta el final de dicha fase, estas células de la matriz proliferarán hasta la fase catágena, y después desaparecerán en la fase telógena. (Ebling FJ. The biology of hair.Dermatol Clin. julio 1987;5(3):467-81. Revisión; Saitoh M, Uzuka M, Sakamoto M. Human hair cycle. J Invest Dermatol. 1970, enero 54, páginas 65-32. La diferenciación celular permitirá la formación de los diversos tipos de células de la vaina epitelial externa (ORS), de la vaina epitelial interna (IRS), y después del tallo piloso. Es también esta matriz la que condiciona la forma del cabello. La matriz se distribuye uniformemente alrededor de un eje de simetría para el cabello liso, mientras que será mayor en un lado para el cabello rizado (Sitio web de Voyage 3d au Coeur du cheveu [Viaje 3D al Corazón del Cabello] -URL: www.hair-science.com; Melissopoulos A y Levacher C. Les annexes cutanees [Los apéndices pilosos]. En: La peau: structure et physiologie [La piel: estructura y fisiología], publicado por Lavoisier; 1998. págs. 57-99). La matriz también comprende melanocitos foliculares que son responsables de la pigmentación del cabello. La proliferación y diferenciación de estas células de la matriz están controladas por la papila dérmica (Botchkarev VA, Kishimoto J. Molecular control of epithelial-mesenchymal interactions during hair follicle cycling. J Invest Dermatol Symp Proc. junio 2003;8(l):46-55. Revisión);

- de las vainas epiteliales externa e interna, que son producidas por la matriz superior del bulbo piloso, también conocido como la zona de queratinización. La vaina epitelial externa constituye la envoltura externa del folículo: es una invaginación de la epidermis. Aloja en particular células madre a partir de las cuales se regenerará cíclicamente el folículo piloso. La vaina epitelial interna separa la vaina epitelial externa del tallo piloso. Esta vaina está constituida por tres tipos celulares organizados en capas concéntricas queratinizadas que acompañan el crecimiento del cabello. Se distinguen la capa de Henle, la capa de Huxley, y la cutícula, que se forma a partir de células aplanadas, dirigidas hacia la matriz del cabello;

- del tallo piloso, que es parcialmente visible; este es el cabello. La estructura del tallo piloso se compone de tres capas distintas desde el exterior hacia el interior. Está la cutícula, la corteza, y la médula, todas compuestas por células queratinizadas.

Con el tiempo, el cabello pasa por tres fases de desarrollo de duraciones muy desiguales:

- La fase anágena es la fase activa del cabello, aquella durante la cual vive y crece regularmente. Tiene una duración de 4 a 7 años. Las células germinales que rodean la papila del bulbo de la raíz del cabello producen continuamente el material que permite que el cabello viva y crezca. A continuación, la multiplicación de las células germinales se detiene en el fondo del folículo. Entonces se termina la fase activa del cabello; comienza otra, que es mucho más corta.

- La fase catágena: en apenas 15 días, el bulbo piloso desaparece (puesto que ya no se alimenta por la interrupción de las células germinativas) y se transforma a una velocidad acelerada. La papila desaparece, es decir, que el bulbo hueco se solidifica; se queratiniza, se endurece y se cornifica. El cabello entonces está muerto; el folículo se estrecha para expulsar el cabello muerto.

La fase telógena es la fase que dura aproximadamente tres meses y durante la cual el cabello muerto está a la espera de caer. Para que caiga, el cabello debe ser empujado hacia fuera por el cabello nuevo, que a su vez crece en el mismo folículo y que expulsará el cabello viejo.

La regeneración del folículo piloso se produce entonces a partir de las células madre, denominadas células germinales, situadas en la “protuberancia”.

La “protuberancia” está formada por una subpoblación celular de la vaina epitelial externa, denominadas células germinales, situadas en la porción media del folículo piloso, y más exactamente en la zona de inserción del músculo erector del cabello. Estas células representan la parte más baja de la porción permanente del folículo. En la “protuberancia”, los queratinocitos están relativamente no diferenciados, bioquímica y ultraestructuralmente.

Esta “protuberancia” está en una posición estratégica para interactuar durante la fase telógena tardía, con la papila dérmica ascendente, y para iniciar un nuevo folículo en la anágena. Las células germinales son así células esenciales para la renovación del cabello. Las células germinales (células germinativas o células pluripotentes o células madre) del cabello telógeno están implicadas en la salida del folículo piloso de la fase latente, y por lo tanto en el recrecimiento del cabello.

Para los fines de la invención, la expresión “células germinales” pretende significar las células madre presentes en la “protuberancia”.

Durante varios años, se han cultivado células de folículo piloso de los compartimentos que son de fácil acceso mediante microdisección; documentos EP 2274419, EP 2447357.

Sin embargo, la disección del folículo telógeno es particularmente difícil, en particular por su rareza, que representa menos de 15% de todos los folículos presentes en el cuero cabelludo. Además, la disección del folículo telógeno es particularmente difícil debido en particular a su entorno dérmico. Una de las dificultades es así obtener las células germinales en cantidad suficiente para regenerar un folículo piloso capaz de renovarse. El equipo de S. Lyle, en 2005, llevó a cabo un cultivo primario de estas células mediante una amplificación a partir de un folículo telógeno preparado por digestión con dispasa y después arrancado, lo que no permite extraer todas las células germinales en cantidad suficiente para ponerlas en cultivo y mantener,in vitro,la expresión de marcadores específicos de células germinales a fin de regenerar un folículo piloso (Roh C, Tao Q, Photopoulos C, Lyle S. J Invest Dermatol. 2005, 125: 1099-1105).

En cuanto a la terapia celular, la compañía Replicel usa células de la vaina del tejido conjuntivo para obtener un tallo fino, no pigmentado y que no se recicla; debido a que las células de la vaina del tejido conjuntivo reclutarán los queratinocitos de la piel (método usado por Jahoda, 1999; Higgins, 2013).

Ninguno de estos modelos contiene células germinales, cuya presencia y cantidad son esenciales para la formación de un microfolículo que tiene la mayoría de las características de un microfolículo humano, y en particular su capacidad de renovación.

Sorprendentemente, los inventores han conseguido obtener células germinales en cantidad suficiente para que, cuando se ponen en contacto con los fibroblastos de la papila dérmica y también con los fibroblastos de la vaina del tejido conjuntivo, se forme una estructura tubular responsable de un microfolículo piloso y, debido a la presencia de las células germinales, es capaz de reciclarse.

En efecto, la solicitante ha demostrado que el cultivo de células germinales en presencia del inhibidor Rock Y27632 permite una proliferación considerable de estas células y su diferenciación en queratinocitos que son positivos para los marcadores CD200, CD29 y K15. Además, se puede observar que estas células son células pequeñas, que tienen una relación nuclear/citoplasmática alta, y un fenotipo homogéneo.

Cuando estas células se ponen en contacto con los fibroblastos de la vaina del tejido conjuntivo y también con los fibroblastos de la papila dérmica, se observa la formación de una estructura tubular que será la responsable de la formación de un microfolículo piloso.

El mezclamiento de las células obtenidas con los fibroblastos de la vaina del tejido conjuntivo y también con los fibroblastos de la familia dérmica colocados en cultivo 3D permite obtener, inesperadamente, la formación de un botón a partir de los esferoides mixtos constituidos por las células germinales y por los fibroblastos de la papila dérmica y también los fibroblastos de la vaina del tejido conjuntivo. Este botón tiene la forma de una estructura tubular que será la responsable de la formación del folículo piloso.

Para los fines de la invención, la expresión “estructura tubular” pretende significar un botón que se forma a partir de los esferoides mixtos.

Para los fines de la invención, la expresión “esferoides mixtos” pretende significar el cultivo 3D de las células germinales y de los fibroblastos de la papila dérmica, así como de los fibroblastos de la vaina del tejido conjuntivo. Para los fines de la invención, la expresión “estructura tubular” pretende significar la formación de un botón observada tras el cultivo 3D de las células germinales y de los fibroblastos de la papila dérmica o de los fibroblastos de la vaina del tejido conjuntivo. Esta estructura tubular constituida, por un lado, por las células madre epiteliales del cabello y, por otro lado, por las células mesenquimatosas del cabello será la responsable de la formación del microfolículo. El procedimiento según la invención resulta por lo tanto ventajoso debido a que permite obtener un folículo piloso a partir de los fibroblastos del cabello y de las células germinales necesarias para la formación de un folículo piloso que tiene la mayoría de las características de un microfolículo humano, y en particular capaz de regenerarse.

La presente descripción se refiere al uso de células germinales para obtener un folículo piloso.

Procedimiento para preparar un microfolículo piloso

Las células germinales se pueden muestrear según el siguiente procedimiento: los folículos pilosos en la fase telógena se colocan en una placa de Petri que contiene un medio de cultivo mínimo suplementado con un 2% de antibióticos y aminoácidos no esenciales.

La región de las células germinales, denominada protuberancia, se extrae de la vaina del tejido conjuntivo, y después se coloca en una placa de Petri que contiene una capa alimentadora de fibroblastos 3T3i.

Con el fin de obtener una cantidad suficiente de células germinales para obtener un microfolículo piloso, el solicitante ha desarrollado un método de amplificación de estas células para que se diferencien en queratinocitos CD200, CD29 y K15.

Así, el solicitante ha desarrollado un procedimiento para preparar un microfolículo piloso, que comprende al menos una etapa de amplificar las células germinales en presencia de una cantidad eficaz de un inhibidor de ROCK durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la diferenciación de dichas células en queratinocitos positivos para los marcadores CD200, CD29 y K15.

Este procedimiento para preparar el microfolículo piloso se caracteriza por que comprende las siguientes etapas: a- aislar un folículo piloso en la fase telógena a partir de una muestra de cuero cabelludo;

b- separar las células germinales de la vaina del tejido conjuntivo;

c- depositar el agregado celular sobre una capa alimentadora de fibroblastos 3T3i, que se han irradiado o bloqueado con mitomicina, en medio Green 7F;

d- amplificar las células germinales en la superficie de dicho soporte en presencia de un inhibidor de ROCK; e- recuperar los queratinocitos que exhiben los marcadores CD200, CD29 y K15;

f- cultivar los queratinocitos obtenidos en la etapa e) en cultivo 3D en presencia de fibroblastos de la vaina del tejido conjuntivo y/o de la papila dérmica.

El cultivo de las células germinales en cultivo 3D en presencia de fibroblastos de la vaina del tejido conjuntivo y/o de la papila dérmica permite obtener una estructura capilar responsable del microfolículo piloso, capaz de renovarse en virtud de la presencia de las células germinales.

El microfolículo piloso obtenido del cultivo de las células germinales es, por tanto, capaz de renovarse.

En particular, el microfolículo piloso obtenido del cultivo de las células germinales en presencia de fibroblastos de la vaina del tejido conjuntivo y/o de la papila dérmica es capaz de renovarse.

Microdisección

Una de las dificultades a superar radica en la obtención de folículos pilosos en la fase telógena mediante microdisección.

Esto se debe a que, en condiciones normales, cuando se cae un cabello, el compartimento de la protuberancia que contiene las células madre, denominadas células germinales, permitirá iniciar el desarrollo de un nuevo ciclo capilar y volverá a dar un nuevo folículo.

Así, arrancar un cabello telógeno no permite obtener estas células germinales; por lo tanto, será necesario realizar una biopsia del cuero cabelludo, y después aislar estas células mediante microdisección.

Según la invención, las células germinales se obtienen mediante una novedosa técnica de microdisección que preserva la cantidad y la integridad de las células, ya que no se separan entre sí. En efecto, el cabello en la fase telógena se aísla sobre un soporte, y se extrae el tallo telógeno que contiene las células germinales situadas en la protuberancia. Esta microdisección permite aislar y conservar todas las células germinales.

Para los fines de la invención, el término “telógeno” pretende significar el folículo que contenía el cabello en la fase telógena.

Amplificación

Además de ser difíciles de aislar, las células germinales también son difíciles de cultivar, al menos por las siguientes razones:

a) el número de las mismas es particularmente bajo;

b) son difíciles de amplificar.

El solicitante ha aislado las células germinales y ha desarrollado un procedimiento para cultivar estas células Específicamente, en presencia del factor de crecimiento Y27632, que es un inhibidor de ROCK, estas células proliferan rápidamente y se diferencian en queratinocitos CD200, CD29 y K15 hasta alcanzar la confluencia.

Las células se amplifican según la técnica de Rheinwald y Green (Cell, vol. 6, 331 -344, 1975) mediante cultivo sobre un soporte alimentador constituido por fibroblastos en un medio adecuado conocido por el experto en la técnica, en presencia de factores de crecimiento, en particular aminoácidos, suero, toxina del cólera, insulina, triyodotironina, y disolución amortiguadora del pH. En particular, tal medio de cultivo puede contener en particular al menos un factor de crecimiento mitogénico para queratinocitos (por ejemplo factor de crecimiento epidérmico (EGF) y/o factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), en particular KGF), insulina, hidrocortisona, y opcionalmente un antibiótico (por ejemplo: gentamicina, anfotericina B), al que se ha añadido un inhibidor de ROCK, Y27632.

Ventajosamente, dicho medio también puede comprender suero o un extracto de hipófisis, por ejemplo de origen bovino, epinefrina, transferrina, y/o aminoácidos no esenciales.

Los fibroblastos usados para este cultivo serán preferentemente fibroblastos 3T3. Los fibroblastos 3T3 son bien conocidos por los expertos en la técnica. Es una línea celular de fibroblastos que se conoce desde 1962. “3T3” significa “transferencia de 3 días, inóculo de 3 x 105 células”.

El cultivo celular es preferiblemente un cultivo sobre fibroblastos (preferentemente fibroblastos 3T3), cuya proliferación se ha detenido previamente, preferentemente habiéndolos irradiado previamente (por ejemplo con radiación gamma) o habiéndolos tratado previamente con mitomicina. La mitomicina (en particular la mitomicina C) bloquea la proliferación de estas células sin impedir, sin embargo, que produzcan sustancias nutritivas útiles para la proliferación de queratinocitos.

Con esta técnica, las células germinales proliferan sobre el soporte en el que se han separado de los otros tipos celulares. Esto permite conservar un número suficiente de células germinales. Las células proliferan rápidamente en presencia de Y27632 hasta la confluencia, y se diferencian en células positivas para los marcadores CD200, CD29 y K15.

Según la invención, la expresión “cantidad eficaz” denota una cantidad necesaria para obtener un cultivo de queratinocitos CD200, CD29 y K15 en la confluencia.

Según la invención, la cantidad eficaz del inhibidor de ROCK, Y27632, está entre 1 y 100 pM, y preferiblemente entre 5 y 25 pM, y preferiblemente 10 pM.

Según la invención, las células germinales se cultivan en presencia del inhibidor de ROCK, Y27632, durante al menos 2 días, y preferiblemente durante al menos 3 días.

Preferiblemente, las células se cultivan en un número de células comprendido entre 1000 y 4000 células, y preferiblemente en un número de 3000 células por cm2.

La expresión “en la confluencia” pretende significar una capa celular que no tiene intersticio entre cada célula adherente cultivada en monocapa sobre un soporte apropiado, tal como una placa de cultivo.

Cultivo de células CD200, CD29, K15 en cultivo 3D para obtener microfolículos pilosos

Las esferas 3D se obtienen sembrando las células en microplacas de 96 pocillos de tipo Insphero por el método de gota colgante o método con microplacas para cultivo de células no adherentes (sistema GravityPLUS White paper). Las células germinales y los fibroblastos de la vaina del tejido conjuntivo y/o de la papila dérmica se cultivan entonces en medio Green a 37°C; la aparición del microfolículo piloso se observa después de al menos 3 días de cultivo. Según una realización, las células se mantienen en cultivo durante al menos 3 días, y preferiblemente al menos 5 días. Preferiblemente, el número de células puestas en cultivo está entre 1000 y 4000 células, y es preferiblemente 3000 células por cm2.

Otro objeto de la invención es un microfolículo piloso que puede obtenerse mediante el procedimiento según la invención.

Estos microfolículos pilosos permiten, por un lado, usarlos para el tratamiento profiláctico o terapéutico de un estado de pilosidad reducida, en particular la alopecia, y constituyen, por otro lado, ensayos predictivos de la actividad de agentes activos cosméticos y/o farmacéuticos, o también de los efectos secundarios de los ingredientes tópicos. Tratamiento profiláctico o terapéutico de un estado de pilosidad reducida, en particular la alopecia

Dado que el microfolículo piloso tiene las características de un folículo pilosoin vivo,puede usarse como implante, opcionalmente combinado con sustitutos de piel.

Por lo tanto, el microfolículo piloso según la invención también tendrá usos para preparar implantes y/o un sustituto de piel para tratar un trastorno cutáneo tal como una quemadura, un defecto de cicatrización, o un cabello que se ha vuelto blanco o gris.

Un efecto terapéutico se define como el retorno al estado normal de pilosidad, ya sea total o parcialmente.

Para los fines de la invención, se recomienda un tratamiento profiláctico si el sujeto tiene una condición previa de pérdida de cabello, tal como una disposición familiar.

Las condiciones de una cantidad reducida de cabello pueden ser el resultado de alopecia, calvicie hereditaria, cicatrices, quemaduras, o lesiones accidentales.

Ensayos predictivos de la actividad de agentes activos cosméticos y/o farmacéuticos

Los equivalentes de microfolículos pilosos según la invención permiten realizar, en particular, cursos temporales de crecimiento del vello corporal o del cabello y, por lo tanto, cualquier estudio que requiera numerosos cabellos vivos y lo más completos posible en un contextoin vivo,tal como el estudio del ciclo capilar y de los factores capaces de influir en este ciclo, llegando hasta el estudio de los agentes activos que favorecen el crecimiento del cabello, de los agentes activos que permiten combatir la caída del cabello, o también de los agentes activos que frenan el crecimiento del vello corporal.

Los procedimientos de cribado de productos con el fin de identificar nuevos agentes activos comprenden una etapa (a) de poner en contacto dicho producto de ensayo con un microfolículo piloso según la invención, después una etapa (b) de analizar el efecto de dicho producto sobre al menos un parámetro del microfolículo piloso, y una etapa (c) de seleccionar el producto que modifica dicho parámetro.

Preferiblemente, para llevar a cabo la etapa (a), el producto de ensayo se aplica tópicamente, por ejemplo formulado en formulaciones tópicas convencionales, o bien introducido en el medio de cultivo.

La etapa (b) puede llevarse a cabo, en particular, analizando la expresión, la producción y/o la actividad de marcadores asociados con la calidad y/o con la homeostasis del microfolículo piloso, por ejemplo marcadores foliculares para las proteínas estructurales. Como ejemplo de proteínas estructurales, se pueden citar las queratinas del cabello.

Para ello, se analizará el efecto del producto sobre el crecimiento del tallo piloso en la etapa (b) del procedimiento de cribado.

La etapa (b) de analizar el efecto del producto será preferentemente una comparación de al menos un parámetro medido en el microfolículo piloso según la invención puesto en contacto con el producto de ensayo con el o los medidos en un microfolículo piloso de control cultivado en las mismas condiciones pero que no ha recibido el producto de ensayo.

La etapa (c) de seleccionar el producto que modifica el parámetro del microfolículo piloso se llevará a cabo en función de un criterio previamente determinado.

La modificación de este parámetro puede ser una estimulación, una disminución, o una inhibición total o parcial de la expresión, de la producción y/o de la actividad de marcadores y/o del crecimiento del tallo piloso.

El criterio para seleccionar dicho producto será por ejemplo que este producto tenga un efecto estimulador o inhibidor sobre el parámetro medido.

El microfolículo piloso según la invención también se puede usar en procedimientos automatizados para cribar compuestos cosméticos, farmacéuticos o dermatológicos para identificar nuevos agentes activos.

Descripción de las figuras:

Las figuras permiten ilustrar mejor la invención, sin por ello limitar el alcance de la misma.

Figura 1: Localización de células germinales

Figura 2: Separación de las células de la vaina del tejido conjuntivo y de las células germinales con una aguja Figura 3: Aislamiento de un folículo telógeno que contiene las células germinales

Figura 4: Folículo telógeno depositado en una capa alimentadora de 3T3, y migración de las primeras células germinales alrededor del folículo telógeno

Figura 5: Células germinales en la confluencia después de 10 días de cultivo

Figura 6: Caracterización de las células en la confluencia, queratinocitos K15+, CD29+ y CD200+

Figura 7: Proliferación de las células germinales con inhibidor de Rock (Figura 7a) y sin inhibidor de Rock (Figura 7b) Figura 8: Formación de la estructura tubular responsable del folículo piloso después de 3, 7 y 10 días de cultivo. Los ejemplos dados a continuación se presentan como ilustraciones no limitativas de la invención.

Ejemplo 1 - Preparación de células germinales

Protocolo experimental

La región de las células germinales, denominada la protuberancia (Figura 1), se extrae de la vaina del tejido conjuntivo (Figura 2), y después se coloca en una placa de Petri que contiene células 3T3i (Figura 3).

i. Microdisección de células germinales

Los folículos pilosos se extraen de un residuo quirúrgico del cuero cabelludo. Dicho residuo se corta primero en porciones de 5 mm2, y después se secciona con un bisturí entre la dermis y la hipodermis.

Los folículos se extraen con pinzas de cirugía oftálmica, y después se seccionan justo por encima de la papila con un bisturí. Después se recupera el bulbo. En esta etapa, el bulbo comprende dos compartimentos: el compartimento dérmico (papila dérmica y vaina del tejido conjuntivo), y las células de la matriz que forman una masa celular.

La parte epitelial se separa de la parte dérmica usando agujas de perfusión. Sólo se cultiva la parte epitelial.

ii. Condiciones de cultivo:

Las condiciones de cultivo tienen tres componentes principales:

• El medio de base:

A menos que se indique lo contrario, todos los medios y amortiguadores usados en los ejemplos se describen en Bell et al. 1979, (P.N.A.S. USA, 76, 1274-1278), Asselineau y Prunieras, 1984, (British J. of Derm., I l, 219-222) o Asselineau et al, 1987, (Models in dermato., vol.III, Ed. Lowe & Maibach, 1-7).

El medio MEM 10% de FCS 7F (denominado medio Green 7F) tiene la siguiente composición:

• los suplementos de cultivo: factores de crecimiento y, por ejemplo, 10 pM de Y27632.

• la superficie de adhesión: las células germinales proliferan en el medio basado en Green en presencia de una capa alimentadora de fibroblastos 3T3 murinos detenidos en el ciclo celular por tratamiento con mitomicina.

Cultivo-Amplificación de queratinocitos

Después de la microdisección, los folículos pilosos en la fase telógena se depositan en placas de Petri de 60 mm de diámetro, sembradas previamente con 1 millón de células 3T3, y cubiertas con el medio de cultivo Green 7F completo; se obtiene un cultivo de células germinales en la confluencia.

A fin de generar las esferas, las células se recuperan en la etapa subconfluente por tratamiento enzimático. Las esferas se pueden obtener de diversas formas con las técnicas convencionales ya descritas (gota colgante, centrifugación, soporte no adhesivo). En el caso de la gota colgante, se colocan 3000 células en las placasin sphero.Se recuperan en placas de 96 pocillos después de 48 h para monitorizar su progresión.

El cabello telógeno con el grupo de células germinales no disociadas se aísla y se deposita en una capa alimentadora 3T3 (Figura 3). Después de 3 días de cultivo, las células comienzan a proliferar en forma de colonia alrededor del grupo germinal (Figura 4). Las células alcanzan la subconfluencia en 7 días (Figura 5). Se caracterizan por un tamaño muy pequeño y una fuerte capacidad proliferativa. A continuación, para garantizar la amplificación, las células se siembran en un matraz T75. Así, después de 3 semanas de cultivo de 3 bulbos, es posible generar aproximadamente 40 millones de células germinales en la pasada 1.

Se pudo observar que las células germinales son capaces de alcanzar muy rápidamente la confluencia en el medio Green 7F en presencia del inhibidor de Rock Y27632 a una concentración de 10 pM (Figura 7a)), mientras que, en el mismo medio sin adición del inhibidor de rock, las células no proliferan (Figura 7b)).

Así, las células germinales cultivadas en medio 7F que contiene el inhibidor de rock permiten obtener queratinocitos positivos para los marcadores K15, CD29 y CD200 (Figura 6) en cantidades suficientes. Además, estas células son de pequeño tamaño, con una elevada relación nuclear/citoplasmática, y un fenotipo homogéneo.

Las células que se obtienen en cantidad suficiente y que tienen los marcadores K15, CD29 y CD200, de forma homogénea y reproducible, se colocan a continuación en cultivo 3D en presencia de los fibroblastos de la vaina del tejido conjuntivo y/o de la papila dérmica. Estas células forman esferas después de 3 días de cultivo.

Después de unos 3 días adicionales de cultivo, estas esferas cambian de conformación, mostrando una organización polarizada. Aparece un brote, que parece indicar la diferenciación de las esferas en una estructura tubular responsable de la formación del folículo piloso.

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento in vitro para preparar un microfolículo piloso, que comprende al menos una etapa de cultivar las células germinales ubicadas en la protuberancia de un folículo piloso en la fase telógena en presencia de una cantidad eficaz de un inhibidor de ROCK durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la diferenciación de dichas células en queratinocitos positivos para los marcadores CD200, CD29 y K15, poniéndose en contacto dichos queratinocitos positivos para los marcadores CD200, CD29 y K15 con los fibroblastos de la vaina del tejido conjuntivo y/o los fibroblastos de la papila dérmica.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el inhibidor de ROCK es Y27632.

3. Procedimiento según las reivindicaciones 1 y 2, en el que la cantidad eficaz del inhibidor de ROCK es de 1 a 100 pM.

4. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 3, en el que la cantidad eficaz del inhibidor de ROCK es de 5 a 25 pM.

5. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 4, en el que la cantidad eficaz del inhibidor de ROCK es 10 pM.

6. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que las células germinales se cultivan en presencia del inhibidor de ROCK durante al menos 2 días, y preferiblemente durante al menos 3 días.

7. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por que comprende las siguientes etapas:

a- aislar un folículo piloso en la fase telógena a partir de una muestra de cuero cabelludo;

b- separar las células germinales de la vaina del tejido conjuntivo;

c- depositar el agregado celular sobre una capa alimentadora de fibroblastos 3T3i que se han bloqueado con mitomicina, en medio Green 7F;

d- amplificar las células germinales en la superficie de dicho soporte en presencia de un inhibidor de ROCK; e- recuperar los queratinocitos positivos para los marcadores CD200, CD29 y K15;

f- cultivar los queratinocitos obtenidos en la etapa e) en cultivo 3D con fibroblastos de la vaina del tejido conjuntivo y/o fibroblastos de la papila dérmica.

8. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que los dichos queratinocitos positivos para los marcadores CD200, CD29 y K15 se recuperan cuando alcanzan la confluencia al tiempo que forman agrupaciones regulares.

9. Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado por que, en la etapa f), el número de queratinocitos puestos en cultivo está comprendido entre 1000 y 4000 células por cm2, y es preferiblemente 3000 células por cm2.

10. Microfolículo piloso obtenido por medio del procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por que está constituido por queratinocitos que resultan de la amplificación y diferenciación de células germinales ubicadas en la protuberancia de un folículo piloso en la fase telógena en presencia de un inhibidor de ROCK, en el que dichos queratinocitos son positivos para los marcadores CD200, CD29 y K15 y se han puesto en contacto con fibroblastos de la papila dérmica y/o fibroblastos de la vaina del tejido conjuntivo formando una estructura tubular.

11. Microfolículo piloso según la reivindicación 10, caracterizado por que el inhibidor de ROCK es Y27632.

12. Microfolículo piloso según una de las reivindicaciones 10 a 11, para el tratamiento profiláctico o terapéutico de un estado de pilosidad reducida.

13. Microfolículo piloso según una de las reivindicaciones 10 a 11, para tratar la alopecia.

14. Uso de un microfolículo piloso según una de las reivindicaciones 10 a 11, para el ensayoin vitrode los efectos de los agentes activos sobre las propiedades del cabello.

15. Uso de un microfolículo piloso según la reivindicación 14, para identificar un compuesto que modula el crecimiento del vello corporal y/o del cabello.

16. Procedimiento de cribado de productos con el fin de identificar nuevos agentes activos, que comprende una etapa (a) de poner dicho producto de ensayo en contacto con un microfolículo piloso como se define según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 11, posteriormente una etapa (b) de analizar el efecto de dicho producto sobre al menos un parámetro del microfolículo piloso, y una etapa (c) de seleccionar el producto que modifica dicho parámetro.