ES2961107T3

ES2961107T3 - Polvo hemostático

Info

Publication number: ES2961107T3
Application number: ES20736383T
Authority: ES
Inventors: Abraham Reinier Keereweer; Lanao Rosa Pilar Felix; Joost Opsteen; Johannes Caspar Mathias Elizabeth Bender
Original assignee: Cilag GmbH International
Current assignee: Cilag GmbH International
Priority date: 2019-07-12
Filing date: 2020-07-09
Publication date: 2024-03-08
Anticipated expiration: 2040-07-09
Also published as: EP4218839A1; US20220133949A1; CN114126672B; WO2021009014A1; EP4218839B1; BR112022000515A2; CN114126672A; EP3996758B1; JP2022540043A; EP3996758A1; KR20220035430A; EP3996758C0; AU2020312629A1; JP7571065B2; EP4218839C0; PL4218839T3; ES2994191T3; KR102861222B1; CA3146680A1; AU2020312629B2

Abstract

La presente invención se refiere a un polvo hemostático que comprende al menos un 10 % en peso de aglomerados de partículas, teniendo dichos aglomerados de partículas un diámetro en el intervalo de 1 a 500 μm y que comprenden: - partículas de polioxazolina electrófila que contienen polioxazolina electrófila que porta al menos 3 grupos electrófilos reactivos. que son capaces de reaccionar con grupos amina en la sangre bajo la formación de un enlace covalente; y - partículas de polímero nucleofílico que contienen un polímero nucleofílico soluble en agua que porta al menos 3 grupos nucleofílicos reactivos que, en presencia de agua, son capaces de reaccionar con los grupos electrófilos reactivos de la polioxazolina electrófila bajo la formación de un enlace covalente entre los grupos electrofílicos. polioxazolina y el polímero nucleofílico. Cuando se aplica en un lugar de hemorragia, el polvo hemostático de la presente invención se convierte en un gel y al mismo tiempo se une a las proteínas presentes en la sangre y en el tejido circundante. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Polvo hemostático

CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

[0001] La presente invención se refiere a un polvo hemostático que comprende al menos un 10 % en peso de aglomerados de partículas que comprende:

• partículas de polioxazolina electrofílica que contienen polioxazolina electrofílica que porta al menos 3 grupos electrofílicos reactivos que son capaces de reaccionar con grupos amino en sangre bajo la formación de un enlace covalente; y

• partículas de polímero nucleofílico que contienen un polímero nucleofílico que porta al menos 3 grupos nucleofílicos reactivos que, en presencia de agua, son capaces de reaccionar con los grupos electrofílicos reactivos de la polioxazolina electrofílica bajo la formación de un enlace covalente entre la polioxazolina electrofílica y el polímero nucleofílico.

[0002] Cuando el polvo hemostático de la presente invención se aplica en un lugar de sangrado, la partícula se aglomera rápidamente y forma un gel al mismo tiempo que se une a las proteínas presentes en la sangre y en el tejido circundante, acelerando así la hemostasia.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0003] La hemostasia es un proceso estrechamente regulado que mantiene el flujo de sangre a través de la vasculatura al mismo tiempo que se produce una respuesta trombótica al daño tisular. El mantenimiento de la hemostasia requiere una interacción compleja de la pared del vaso, las plaquetas y los sistemas de coagulación y fibrinolíticos. Hay dos fases principales de la hemostasia: primaria (es decir, la fase celular) y secundaria (es decir, la fase humoral).

[0004] La hemostasia primaria comienza inmediatamente después de la disrupción endotelial y se caracteriza por vasoconstricción, adhesión de plaquetas y formación de un tapón agregado blando. Después de producirse la lesión, hay una contracción local temporal del músculo liso vascular y el flujo sanguíneo se vuelve más lento, lo que promueve la adhesión y activación plaquetaria. A los 20 segundos de la lesión, el factor de von Willebrand circulante se une al subendotelio en el sitio de la lesión y se adhiere a las glicoproteínas en la superficie de las plaquetas. A medida que las plaquetas se adhieren a la superficie lesionada, se activan al entrar en contacto con los receptores que exponen al colágeno y que se unen al fibrinógeno circulante. Se forma un tapón blando de plaquetas agregadas y fibrinógeno. Esta fase de la hemostasia es de corta duración y el tapón blando puede desprenderse fácilmente de la superficie lesionada.

[0005] El tapón de plaquetas blandas se estabiliza durante la hemostasia secundaria para formar un coágulo. La vasoconstricción y la reducción resultante del flujo sanguíneo se mantienen mediante la secreción plaquetaria de serotonina, prostaglandina y tromboxano mientras se inicia la cascada de la coagulación. La cascada de la coagulación es una serie de reacciones dependientes que involucran varias proteínas plasmáticas, iones de calcio y plaquetas sanguíneas que conducen a la conversión de fibrinógeno en fibrina. Los factores de coagulación son producidos por el hígado y circulan en forma inactiva hasta que se inicia la cascada de coagulación. Luego, cada paso de la cascada se inicia y se completa a través de una serie de reacciones de activación del factor de coagulación secuenciales y dependientes. En los pasos finales, la trombina convierte la proteína plasmática soluble fibrinógeno en la proteína insoluble fibrina, al mismo tiempo que convierte el factor XIII en factor Xllla. Esta conversión de factor estabiliza la fibrina y da como resultado la reticulación de los monómeros de fibrina, produciendo un coágulo estable.

[0006] Durante la cirugía, es importante mantener un buen equilibrio entre el sangrado y la coagulación, de modo que la sangre continúe fluyendo hacia los tejidos en el sitio quirúrgico sin una pérdida excesiva de sangre, para optimizar el éxito quirúrgico y el resultado del paciente. El sangrado continuo de capilares menores difusos o vénulas pequeñas durante la cirugía puede oscurecer el campo quirúrgico, prolongar el tiempo de operación, aumentar el riesgo de complicaciones fisiológicas y exponer al paciente a los riesgos asociados con la transfusión de sangre.

[0007] Los cirujanos tienen una variedad de opciones para controlar el sangrado, incluidas técnicas y dispositivos mecánicos y térmicos, así como farmacoterapias y agentes tópicos.

[0008] Uno de los primeros agentes hemostáticos tópicos fue el algodón, en forma de esponjas de gasa. Aunque dichos materiales concentran la sangre y los productos de la coagulación a través de la adsorción física, no son absorbidos por el cuerpo y, al retirarlos, el coágulo puede desprenderse y provocar más sangrado. Desde entonces, se han desarrollado agentes hemostáticos tópicos absorbibles que proporcionan una terapia adyuvante útil cuando los métodos convencionales de hemostasia son ineficaces o poco prácticos. Los agentes hemostáticos tópicos se pueden aplicar directamente en el sitio del sangrado y pueden evitar el sangrado continuo e incesante. La hemostasia con agentes tópicos también puede evitar los efectos adversos de los medicamentos hemostáticos sistémicos, como coágulos de sangre "no deseados". Además, en los procedimientos quirúrgicos en los que la cantidad de sangre que se pierde es impredecible, los agentes hemostáticos tópicos se pueden usar con moderación cuando la pérdida de sangre es mínima y con más libertad durante una hemorragia grave.

[0009] Actualmente se encuentran disponibles varios agentes hemostáticos tópicos para su uso en cirugía. Se pueden dividir en dos categorías: los que aportan su mecanismo de acción sobre la cascada de la coagulación de forma biológicamente activa y los que actúan de forma pasiva mediante activación por contacto y promoción de la agregación plaquetaria. Los agentes hemostáticos tópicos pasivos incluyen colágenos, celulosa y gelatinas, mientras que los agentes activos incluyen trombina y productos en los que la trombina se combina con un agente pasivo para proporcionar un producto global activo.

[0010] EE. UU. 2003/0064109 describe un polvo hemostático seco que se prepara mediante un método que comprende: proporcionar una solución acuosa que comprende gelatina combinada con al menos un coadyuvante de rehidratación; secar la solución para producir sólidos; moler los sólidos para producir un polvo; reticular el polvo; eliminar al menos el 50 % (p/p) de la ayuda de rehidratación; y secar la gelatina reticulada para producir un polvo. El coadyuvante de rehidratación puede comprender al menos un material seleccionado del grupo que consiste en polietilenglicol (PEG), polivinilpirrolidona (PVP) y dextrano.

[0011] WO 2010/059280 describe una lámina fibrosa anhidra que comprende un primer componente de polímero fibroso, el cual contiene grupos electrofílicos o nucleofílicos, y un segundo componente capaz de reticular el primer componente cuando dicha lámina se expone a un medio acuoso en contacto con tejido biológico para formar un hidrogel reticulado adhesivo al tejido biológico; donde:

a) donde el segundo componente es un polímero fibroso que tiene un esqueleto igual o diferente a la del polímero fibroso del primer componente y que contiene grupos electrofílicos si el primer componente contiene grupos nucleofílicos o que contiene grupos nucleofílicos si el primer componente contiene grupos electrofílicos;

b) el segundo componente es un revestimiento sobre el polímero fibroso del primer componente y donde dicho revestimiento contiene grupos electrofílicos si el primer componente contiene grupos nucleofílicos o grupos nucleofílicos si el primer componente contiene grupos electrofílicos; o

c) el segundo componente es un polvo seco disperso y atrapado dentro de los intersticios del polímero fibroso del primer componente, donde dicho polvo contiene grupos electrofílicos si el primer componente contiene grupos nucleofílicos o grupos nucleofílicos si el primer componente contiene grupos electrofílicos.

[0012] EE. UU. 2012/0021058 describe un proceso para hacer una composición hemostática, donde dicho proceso comprende: a) proporcionar una preparación granular seca de un polímero biocompatible; y b) recubrir los gránulos de dicha preparación granular seca con una preparación de un agente inductor de la coagulación como, por ejemplo, una solución de trombina. El polímero biocompatible puede seleccionarse entre gelatina, colágeno soluble, albúmina, hemoglobina, fibrinógeno, fibrina, caseína, fibronectina, elastina, queratina, laminina y derivados o combinaciones de los mismos.

[0013] EE. UU. 2013/0316974 describe un material hemostático que comprende un polvo de ORC compactado que comprende partículas que tienen una relación de aspecto promedio de aproximadamente 1 a aproximadamente 18. El material hemostático puede comprender además un aditivo seleccionado de polisacáridos, sal de calcio, agente antiinfeccioso, agente promotor de la hemostasia, gelatina y colágeno.

[0014] EE. UU. 2016/0271228 describe una composición hemostática que comprende:

• un polímero biocompatible hemostático en forma de partículas seleccionado del grupo que consiste en una proteína, un polisacárido, un polímero biológico, un polímero no biológico y derivados y combinaciones de los mismos, donde el polímero biocompatible hemostático en forma de partículas está presente como partículas granulares que tienen un intervalo de diámetro medio de 50-700 |_im; • un reticulante hidrófilo que comprende grupos reactivos electrofílicos, donde los grupos reactivos electrofílicos conservan su reactividad hasta que la composición se expone a la sangre del paciente, donde los grupos reactivos electrofílicos están configurados para reticularse con proteínas sanguíneas del paciente para formar un gel con propiedades de sellado y hemostáticas; y

• un aglutinante que no reacciona con los grupos reactivos electrofílicos del reticulante hidrófilo; donde la composición hemostática está en forma de pasta.

[0015] WO 2012/057628 describe un kit para producir un polímero reticulado biocompatible, donde dicho kit comprende una polioxazolina activada electrofílicamente (EL-POx), la cual comprende m grupos electrofílicos; y dicho agente de reticulación nucleofílico que comprende n grupos nucleofílicos, donde los m grupos electrofílicos son capaces de reaccionar con los n grupos nucleofílicos para formar enlaces covalentes; donde m>2, n>2 y m+n>5; donde e al menos uno de los m grupos electrofílicos es un grupo electrofílico colgante.

[0016] WO 2016/056901 describe un producto hemostático adhesivo seleccionado entre una malla recubierta, una espuma recubierta o un polvo recubierto, donde dicho producto hemostático comprende:

• un sustrato sólido poroso que tiene una porosidad de al menos un 5 % en volumen y que comprende una superficie exterior que comprende un polímero nucleofílico que contiene grupos nucleofílicos reactivos;

• un recubrimiento adhesivo que cubre al menos una parte del sustrato sólido, donde dicho recubrimiento comprende una polioxazolina activada electrofílicamente (EL-POX), la cual comprende en promedio al menos un grupo electrofílico reactivo.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0017] Los inventores han desarrollado un polvo hemostático que puede usarse convenientemente para controlar el sangrado durante la cirugía, incluso para sangre anticoagulada.

[0018] El polvo hemostático de la presente invención comprende al menos un 10 % en peso de aglomerados de partículas, donde dichos aglomerados de partículas tienen un diámetro en el rango de 1-500 |_im y comprenden:

• partículas de polímero nucleofílico que contienen un polímero nucleofílico soluble en agua que lleva al menos 3 grupos nucleofílicos reactivos que, en presencia de agua, son capaces de reaccionar con los grupos electrofílicos reactivos de la polioxazolina electrofílica bajo la formación de un enlace covalente entre la polioxazolina electrofílica y el polímero nucleofílico.

[0019] Cuando se aplica en un lugar de sangrado, el polvo hemostático de la presente invención se convierte en un gel y al mismo tiempo se une a las proteínas presentes en la sangre y en el tejido circundante. La extraordinaria capacidad del polvo hemostático para detener el sangrado se debe a la coagulación de la sangre inducida altamente activa y a la formación de un fuerte coágulo de sangre gelificado que se adhiere al tejido. El polvo hemostático se puede distribuir fácilmente sobre un sitio de sangrado. Se puede agregar polvo adicional si es necesario, ya que esto formará una nueva capa de coágulo de sangre gelificado que se adherirá a la capa subyacente de coágulos de sangre gelificados.

[0020] Aunque los inventores no desean limitarse a la teoría, se cree que cuando el polvo hemostático entra en contacto con la sangre, las partículas de polioxazolina electrofílica que contienen polioxazolina electrofílica se disuelven rápidamente y reaccionan simultáneamente con las proteínas en la sangre y los grupos nucleofílicos reactivos del polímero nucleofílico soluble en agua en las partículas de polímero nucleofílico. Como resultado, se forma una capa de coágulo de sangre gelificado. La polioxazolina electrofílica disuelta también reaccionará con las proteínas del tejido circundante en el sitio del sangrado, fijando así la capa de coágulo de sangre gelificado al tejido y sellando el área sangrante.

[0021] En comparación con las partículas que comprenden una mezcla molecular de la polioxazolina electrofílica y el polímero nucleofílico soluble en agua, los aglomerados de partículas de la presente invención ofrecen la ventaja de que proporcionan mejores propiedades de sellado. Se cree que esto se debe al hecho de que, cuando los aglomerados de partículas entran en contacto con la sangre, la polioxazolina electrofílica reacciona con el polímero nucleofílico soluble en agua a una velocidad relativamente lenta, lo que permite que la polioxazolina electrofílica no solo reaccione con el polímero nucleofílico soluble en agua, sino también con proteínas en la sangre y en el tejido en el sitio de sangrado.

[0022] En comparación con una mezcla de polvos que consta de partículas de polioxazolina electrofílica y partículas de polímero nucleofílico soluble en agua, los aglomerados de partículas de la presente invención ofrecen la ventaja de que se forma un gel fuerte más homogéneo. Se cree que se forma una dispersión muy homogénea de polioxazolina electrofílica y polímero nucleofílico soluble en agua cuando los aglomerados de partículas entran en contacto con la sangre, y que se forma un gel fuerte homogéneo cuando los componentes poliméricos se disuelven en ella y comienzan a reaccionar.

[0023] La invención también proporciona un método para preparar aglomerados de partículas hemostáticas de: (a) partículas de polioxazolina electrofílica que contienen polioxazolina electrofílica que lleva al menos 3 grupos electrofílicos reactivos que son capaces de reaccionar con grupos amino en sangre bajo la formación de un enlace covalente; y

(b) partículas de polímero nucleofílico que contienen un polímero nucleofílico soluble en agua que lleva al menos 3 grupos nucleofílicos reactivos que son capaces de reaccionar con los grupos electrofílicos reactivos de la polioxazolina electrofílica bajo la formación de un enlace covalente entre la polioxazolina electrofílica y el polímero nucleofílico;

donde dicho método comprende el paso de combinar 100 partes en peso de partículas de polioxazolina electrofílica con 10 a 1000 partes en peso de partículas de polímero nucleofílico en presencia de líquido de granulación no acuoso.

[0024] Los inventores han descubierto inesperadamente que es posible combinar la polioxazolina electrofílica y el polímero nucleofílico soluble en agua en una sola partícula con reacciones de reticulación mínimas entre ellos y una degradación mínima de la polioxazolina electrofílica, usando un líquido de granulación no acuoso en el que la polioxazolina electrofílica es insoluble y en el que el polímero nucleofílico es ligeramente soluble. Aunque los inventores no desean limitarse a la teoría, se cree que el uso de un líquido de granulación no acuoso en el que la polioxazolina electrofílica es insoluble garantiza que durante la granulación no se producirán reacciones de reticulación entre la polioxazolina electrofílica y el polímero nucleofílico. También se minimiza de esta manera la degradación (hidrólisis) de la polioxazolina electrofílica. A diferencia de la polioxazolina electrofílica, parte del polímero nucleofílico se disolverá en el líquido de granulación no acuoso, formando así una masa pegajosa que es capaz de unir las partículas de polioxazolina electrofílica y las partículas de polímero nucleofílico.

[0025] Además se proporciona una lámina hemostática, flexible y biocompatible que comprende:

• una estructura portadora fibrosa cohesiva que comprende un espacio intersticial tridimensional interconectado; y

• distribuido dentro del espacio intersticial, el polvo hemostático de la presente invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0026] Por consiguiente, un primer aspecto de la invención se refiere a un polvo hemostático que comprende al menos un 10 % en peso de aglomerados de partículas, donde dichos aglomerados de partículas tienen un diámetro en el rango de 1-500 |_im y comprenden:

[0027] El término "aglomerado de partículas", como se usa en el presente documento, se refiere a un gránulo que comprende dos o más partículas que están unidas entre sí.

[0028] El término "polioxazolina", como se usa en el presente documento, se refiere a una poli(N-acilalquilenimina) o una poli(aroilalquilenimina) y se denomina además POx. Un ejemplo de POx es la poli(2-etil-2-oxazolina). El término "polioxazolina" también abarca copolímeros de POx.

[0029] El término "polímero nucleofílico soluble en agua" como se usa en el presente documento se refiere a un polímero nucleofílico que tiene una solubilidad en agua desmineralizada de 20 °C, a un pH en el intervalo de 3 a 7, de al menos 50 g/l. El quitosano es un ejemplo de un polímero nucleofílico soluble en agua. El quitosano es soluble en agua a pH<6. Para determinar la solubilidad en agua de un polímero nucleofílico a diferentes pH, el pH del agua desmineralizada se ajusta utilizando ácido clorhídrico.

[0030] El término "colágeno", como se usa en el presente documento, se refiere a la proteína estructural principal en el espacio extracelular de varios tejidos conectivos en los cuerpos de los animales. El colágeno forma una triple hélice característica de tres cadenas polipeptídicas. Dependiendo del grado de mineralización, los tejidos de colágeno pueden ser rígidos (hueso) o flexibles (tendones) o tener un gradiente de rígido a flexible (cartílago).

A menos que se indique lo contrario, el término "colágeno" también abarca colágenos modificados distintos de la gelatina (por ejemplo, colágeno reticulado).

[0031] El término "gelatina", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una mezcla de péptidos y proteínas producida por hidrólisis parcial de colágeno extraído de la piel, huesos y tejidos conectivos de animales tales como ganado, pollo, cerdos y pescado domésticos. Durante la hidrólisis, los enlaces moleculares naturales entre las hebras de colágeno individuales se descomponen en una forma que se reorganiza más fácilmente. El término "gelatina", tal como se usa en el presente documento, también abarca gelatinas modificadas, tales como gelatinas reticuladas y gelatinas reticuladas reducidas.

[0032] El término "gelatinas reticuladas reducidas" tal como se usa en el presente documento se refiere a una gelatina reticulada que ha sido parcialmente hidrolizada. La hidrólisis parcial de los enlaces peptídicos en la gelatina reticulada puede lograrse, p. ej., mediante tratamiento alcalino. La hidrólisis de la gelatina reticulada da como resultado una mayor densidad de grupos carboxilo libres y amina libres y una mayor solubilidad en agua.

[0033] El término "lámina hemostática", tal como se usa en este documento, a menos que se indique lo contrario, se refiere a una lámina que tiene la capacidad de detener el sangrado del tejido dañado. La lámina hemostática de la presente invención puede lograr la hemostasia convirtiendo la sangre en un gel y/o formando un sello que cierra el sitio de la herida.

[0034] El término "resistente al agua", tal como se usa en el presente documento en relación con la estructura portadora fibrosa, significa que esta estructura no es soluble en agua y no se desintegra en agua para formar una dispersión coloidal, en condiciones de pH neutro (pH 7) y a una temperatura de 37 °C.

[0035] El término "espacio intersticial", tal como se usa en el presente documento, se refiere al espacio hueco ("vacío") dentro de la estructura fibrosa portadora. El espacio intersticial dentro de la estructura portadora fibrosa permite la introducción de polvo hemostático en la estructura. También la sangre y otros fluidos corporales pueden entrar en el espacio intersticial, permitiendo así que el polvo hemostático ejerza su efecto hemostático y/o proporcione adhesividad del tejido a la lámina hemostática.

[0036] El término "proteína", tal como se usa en el presente documento, a menos que se indique lo contrario, también abarca proteínas reticuladas e hidrolizadas. Asimismo, a menos que se indique lo contrario, siempre que se haga referencia a una especie de proteína en particular, como la gelatina o el colágeno, también se incluyen las versiones hidrolizadas y reticuladas de esa especie de proteína.

[0037] La distribución del diámetro del polvo hemostático, de los aglomerados de partículas, de las partículas electrofílicas de polioxazolina y de las partículas de polímero nucleofílico puede determinarse adecuadamente por medio de difracción láser usando un Malvern Mastersizer 2000 en combinación con la unidad de dispersión de muestras de acero inoxidable. La unidad de dispersión de muestras se llena con aprox. 120 ml de ciclohexano, que se estabiliza durante 5 a 10 minutos a una velocidad de agitación de 1800 rpm, y a continuación se realizó de una medición de fondo (medición de blanco). El tubo de muestra se agita y gira horizontalmente 20 veces. A continuación, se dispersan aproximadamente 50 mg en la unidad de dispersión de muestra que contiene el ciclohexano. Después de introducir la muestra en la unidad de dispersión, la muestra se agita durante un minuto y medio a 1800 rpm para garantizar que todas las partículas se dispersen correctamente, antes de realizar la medición. No se realiza ningún tratamiento ultrasónico sobre las partículas dispersas. El tamaño medio de partícula se expresa como D [4,3], el diámetro medio ponderado por volumen (ZniDi4)/(ZniDi3).

[0038] Además de los aglomerados de partículas que comprenden las partículas electrofílicas de polioxazolina y las partículas de polímero nucleofílico, el polvo hemostático de la presente invención puede contener otros componentes particulados, p. ej., (bio)polímeros biocompatibles como gelfoam o almidón. Preferiblemente, el polvo hemostático contiene al menos un 30 % en peso, más preferiblemente al menos un 60 % en peso y lo más preferiblemente al menos un 80 % en peso de los aglomerados de partículas.

[0039] Los aglomerados de partículas en el polvo hemostático contienen preferiblemente al menos un 10 % en peso, más preferiblemente al menos un 25 % en peso y lo más preferiblemente al menos un 40 % en peso de polioxazolina electrofílica.

[0040] El polímero nucleofílico está contenido preferiblemente en los aglomerados de partículas en una concentración de al menos un 10 % en peso, más preferiblemente de al menos un 12 % en peso y lo más preferiblemente de al menos un 30 % en peso.

[0041] La combinación de la polioxazolina electrofílica y el polímero nucleofílico constituye típicamente al menos el 10 % en peso de los aglomerados de partículas. Más preferiblemente, la combinación de estos dos polímeros constituye al menos el 50 % en peso, lo más preferiblemente al menos el 75 % en peso de los aglomerados de partículas.

[0042] Además de la polioxazolina electrofílica y el polímero nucleofílico, los aglomerados de partículas pueden contener uno o varios componentes, p. ej., polisacáridos. Los ejemplos de polisacáridos que se pueden emplear incluyen amilosa, maltodextrina, amilopectina, almidón, dextrano, ácido hialurónico, heparina, condroitín sulfato, dermatán sulfato, heparán sulfato, queratán sulfato, sulfato de dextrano, pentosán polisulfato, alginato y combinaciones de los mismos. Típicamente, la cantidad de polisacárido en los aglomerados de partículas no supera el 50 % en peso. Si los aglomerados de partículas contienen polisacáridos, la combinación de la polioxazolina electrofílica, el polímero nucleofílico y el polisacárido constituye preferiblemente al menos el 60 % en peso, más preferiblemente al menos el 80 % en peso y lo más preferiblemente al menos el 90 % en peso del aglomerados de partículas.

[0043] Según otra realización beneficiosa, los aglomerados de partículas contienen un sistema tampón seco. Preferiblemente, el sistema tampón tiene un pH de tamponamiento en el intervalo de 7 a 11, más preferiblemente en el intervalo de 8 a 10. Preferiblemente, el sistema tampón tiene una capacidad de tampón de al menos 10 mmol.l-1.pH-1. Más preferentemente, la capacidad de tampón es de al menos 25 mmol.l-1.pH-1, lo más preferiblemente, la capacidad de tampón es de al menos 50 mmol.l-1.pH-1. Los ejemplos de sistemas tampón biocompatibles que pueden emplearse en los aglomerados de partículas incluyen tampón de fosfato de sodio/carbonato de sodio; tampón de sodio borato decahidrato; proteína tamponada con tris; solución salina tamponada con HEPES y tampón de bicarbonato/carbonato de sodio.

[0044] Como se explicará a continuación, los aglomerados de partículas de la presente invención se pueden preparar sin el uso de un aglutinante de granulación, es decir, un componente que se emplea durante la granulación para proporcionar adhesión entre las partículas electrofílicas de polioxazolina y las partículas nucleofílicas de polímero. Por consiguiente, en una realización preferida, los aglomerados de partículas no contienen un aglutinante de granulación.

[0045] El polvo hemostático de la presente invención contiene preferiblemente al menos un 10 % en peso de aglomerados de partículas que tienen un diámetro en el intervalo de 1-200 |_im, más preferiblemente al menos un 10 % en peso de aglomerados de partículas que tienen un diámetro en el intervalo de 1-100 |_im, y lo más preferiblemente al menos un 10 % en peso de los aglomerados de partículas que tienen un diámetro en el intervalo de 1-75 |_im

[0046] El polvo hemostático tiene preferiblemente un diámetro medio ponderado por volumen (D [4,3], (IniD 4)/(IniD3)) en el intervalo de 10-1000 |_im, más preferiblemente en el intervalo de 15-500 |_im, lo más preferiblemente en el intervalo de 30-300 |_im.

[0047] Los aglomerados de partículas en el polvo hemostático tienen preferiblemente un D [4,3] en el intervalo de 10-200 |_im, más preferiblemente en el intervalo de 15-100 |_im, lo más preferiblemente en el intervalo de 30-60 l_im.

[0048] Las partículas electrofílicas de polioxazolina en los aglomerados de partículas tienen preferiblemente un diámetro medio ponderado por volumen (D [4,3]) en el intervalo de 1-100 |_im, más preferiblemente en el intervalo de 50-50 |_im, lo más preferiblemente en el intervalo de 10 -40 |_im.

[0049] Las partículas de polímero nucleofílico en los aglomerados de partículas tienen preferiblemente un diámetro medio ponderado por volumen (D [4,3]) que está en el intervalo de 10-300 |_im, más preferiblemente en el intervalo de 15-200 |_im, lo más preferiblemente en el intervalo de 20-100 |_im.

[0050] Las partículas de polioxazolina electrofílica contienen preferiblemente al menos un 30 % en peso, más preferiblemente al menos un 50 % en peso y lo más preferiblemente al menos un 80 % en peso de polioxazolina electrofílica.

[0051] La polioxazolina electrofílica tiene preferiblemente una solubilidad en agua destilada a 20 °C de al menos 100 g/l, más preferiblemente de al menos 300 g/l.

[0052] La polioxazolina electrofílica tiene preferiblemente una solubilidad en alcohol isopropílico a 20 °C de menos de 10 mg/l, más preferiblemente de menos de 5 mg/l y lo más preferiblemente de menos de 1 mg/l.

[0053] La polioxazolina electrofílica tiene preferiblemente un peso molecular de al menos 2 kDa. Más preferiblemente, la polioxazolina electrofílica tiene un peso molecular de 5 a 200 kDa, lo más preferiblemente de 10 a 100 kDa.

[0054] Como se ha explicado anteriormente en el presente documento, los inventores han encontrado una forma de combinar la polioxazolina electrofílica y el polímero nucleofílico soluble en agua en una única partícula con reacciones de reticulación mínimas entre ellos y degradación mínima de la polioxazolina electrofílica. Por consiguiente, en una realización muy preferida de la invención, la polioxazolina electrofílica de los aglomerados de partículas tienen un índice de polidispersión (PDI) de menos de 2.0, más preferiblemente de menos de 1.8 y lo más preferiblemente de menos de 1.5.

[0055] La polioxazolina electrofílica contiene preferiblemente al menos 4 grupos electrofílicos reactivos, más preferiblemente al menos 8 grupos electrofílicos reactivos, aún más preferiblemente al menos 16 grupos electrofílicos reactivos y lo más preferiblemente al menos 32 grupos electrofílicos reactivos.

[0056] La polioxazolina electrofílica típicamente porta en promedio al menos 10, más preferiblemente al menos 20 grupos electrofílicos reactivos.

[0057] La polioxazolina electrofílica se deriva preferentemente de una polioxazolina cuyas unidades repetitivas están representadas por la siguiente fórmula (I):

(CRH1)mNCOR2

donde R2 y cada uno de los R1 se seleccionan de manera independiente de H, alquilo C<1-22>opcionalmente sustituido, cicloalquilo opcionalmente sustituido, aralquilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido; y m es 2 o 3.

[0058] Preferiblemente, R1 y R2 en la fórmula (I) se seleccionan entre H y alquilo C<1>-<8>, incluso más preferiblemente entre H y alquilo C<1>-<4>. R<1>más preferiblemente es H. El número entero m en la fórmula (I) es preferiblemente igual a 2.

[0059] Según una realización preferida, la polioxazolina es un polímero, incluso más preferiblemente un homopolímero de 2-alquil-2-oxazolina, donde dicha 2-alquil-2-oxazolina se selecciona entre 2-metil-2- oxazolina, 2-etil-2-oxazolina, 2-propil-2-oxazolina, 2-butil-2-oxazolina y combinaciones de las mismas. Preferiblemente, la polioxazolina es un homopolímero de 2-propil-2-oxazolina o 2-etil-oxazolina. Lo más preferiblemente, la polioxazolina es un homopolímero de 2-etil-oxazolina.

[0060] Según una realización particularmente preferida, la polioxazolina electrofílica comprende al menos 20 unidades de oxazolina, más preferiblemente al menos 30 unidades de oxazolina y lo más preferiblemente al menos 80 unidades de oxazolina. La polioxazolina electrofílica preferiblemente comprende en promedio al menos 0.05 grupos electrofílicos reactivos por residuo de oxazolina. Aún más preferiblemente, la polioxazolina electrofílica comprende en promedio al menos 0.1 grupos electrofílicos reactivos por residuo de oxazolina. Lo más preferiblemente, la polioxazolina electrofílica comprende en promedio 0.12-0.5 grupos electrofílicos reactivos por residuo de oxazolina.

[0061] La polioxazolina puede portar grupos electrofílicos reactivos en sus cadenas laterales (grupos electrofílicos reactivos colgantes), en sus extremos, o en ambos. La polioxazolina electrofílica que se emplea de acuerdo con la presente invención contiene convenientemente uno o varios grupos electrofílicos reactivos colgantes. Normalmente, la polioxazolina electrofílica contiene 0.03-0.5 grupos electrofílicos reactivos colgantes por monómero, más preferentemente 0.04-0.35 grupos electrofílicos reactivos colgantes por monómero, incluso más preferentemente 0.05-0.25 grupos electrofílicos reactivos colgantes por monómero.

[0062] Según una realización preferida, los grupos electrofílicos reactivos de la polioxazolina electrofílica se seleccionan entre ésteres de ácido carboxílico, ésteres de sulfonato, ésteres de fosfonato, ésteres de pentafluorofenilo, ésteres de p-nitrofenilo, ésteres de p-nitrotiofenilo, grupos haluro de ácido, anhídridos, cetonas, aldehídos, isocianato, tioisocianato, isociano, epóxidos, grupos hidroxilo activados, olefinas, éteres de glicidilo, carboxilo, ésteres de succinimidilo, ésteres de sulfo succinimidilo, maleimido (maleimidilo), etenosulfonilo, ésteres de imido, acetoacetato, haloacetal, disulfuro de ortopiridilo, derivados de dihidroxifenilo, vinilo, acrilato, acrilamida, yodoacetamida y combinaciones de los mismos. Más preferiblemente, los grupos electrofílicos reactivos se seleccionan entre ésteres de ácido carboxílico, ésteres de sulfonato, ésteres de fosfonato, ésteres de pentafluorofenilo, ésteres de p-nitrofenilo, ésteres de p-nitrotiofenilo, grupos haluro de ácido, anhídridos, cetonas, aldehídos, isocianato, tioisocianato, isociano, epóxidos , grupos hidroxilo activados, glicidil éteres, carboxilo, ésteres de succinimidilo, ésteres de sulfo succinimidilo, ésteres de imido, derivados de dihidroxifenilo y combinaciones de los mismos. Incluso más preferiblemente, los grupos electrofílicos reactivos se seleccionan entre haloacetales, disulfuro de ortopiridilo, maleimidas, vinilsulfona, derivados de dihidroxifenilo, vinilo, acrilato, acrilamida, yodoacetamida, ésteres de succinimidilo y combinaciones de los mismos. Lo más preferiblemente, los grupos electrofílicos reactivos se seleccionan de maleimidas, vinilo, acrilato, acrilamida, ésteres de succinimidilo, ésteres de sulfo succinimidilo y combinaciones de los mismos.

[0063] Los ejemplos de ésteres de succinimidilo que pueden emplearse incluyen glutarato de succinimidilo, propionato de succinimidilo, succinamida de succinimidilo, carbonato de succinimidilo, suberato de disuccinimidilo, suberato de bis(sulfosuccinimidilo), ditiobis(succinimidilpropionato), bis(2-succinimidooxicarboniloxi) etilsulfona, 3,3'-ditiobis (sulfosuccinimidil-propionato), succinimidil carbamato, sulfosuccinimidil(4-yodoacetil)aminobenzoato, bis(sulfosuccinimidil) suberato, sulfosuccinimidil-4-(Nmaleimidometil)-cidohexano-l-carboxilato, ditiobis-sulfosuccinimidil propionato, disulfo-succinimidil-tartrato; bis[2-(sulfosuccinimidiloxicarboniloxietilsulfona)], bis(sulfosuccinimiclilsuccinato) de etilenglicol, ditiobis-(propionato de succinimidilo).

[0064] Los ejemplos de derivados de dihidroxifenilo que pueden emplearse incluyen dihidroxifenilalanina, 3,4-dihidroxifenilalanina (DOPA), dopamina, ácido 3,4-dihidroxihidrocinámico (DOHA), norepinefrina, epinefrina y catecol.

[0065] El polímero nucleofílico soluble en agua que está contenido en las partículas de polímero nucleofílico tiene preferiblemente una solubilidad en agua desmineralizada a 20 °C, a un pH en el intervalo de 3 a 7, de al menos 100 g/l, más preferiblemente de al menos 150 g/l y lo más preferiblemente de al menos 200 g/l. La presente invención puede emplear adecuadamente un polímero nucleofílico soluble a pH ácido si la polioxazolina electrofílica libera sustancias ácidas cuando reacciona con los componentes sanguíneos, el tejido y/o el polímero nucleofílico. Este es el caso, por ejemplo, cuando la polioxazolina electrofílica contiene grupos N-hidroxisuccinimida.

[0066] Las partículas de polímero nucleofílico contienen preferiblemente al menos un 30 % en peso, más preferiblemente al menos un 50 % en peso y lo más preferiblemente al menos un 80 % en peso de polímero nucleofílico.

[0067] Según una realización particularmente preferida, el polímero nucleofílico soluble en agua que se emplea en las partículas de aglomerado se disuelve en agua de manera relativamente lenta. Como se explicó anteriormente en el presente documento, se cree que cuando la polioxazolina electrofílica reacciona con el polímero nucleofílico soluble en agua a una velocidad relativamente lenta, la polioxazolina electrofílica también puede reaccionar con las proteínas de la sangre y el tejido en el lugar de la hemorragia. Mediante el empleo de un polímero nucleofílico soluble en agua que se disuelve con relativa lentitud, la polioxazolina electrofílica disuelta tiene la oportunidad de reaccionar con las proteínas de la sangre y los tejidos, así como con el polímero nucleofílico soluble en agua (lento), creando así un fuerte gel de sellado homogéneo.

[0068] Los polímeros nucleofílicos solubles en agua que tienen un alto peso molecular tienden a disolverse en agua con relativa lentitud. Por consiguiente, en una realización muy preferida, el polímero nucleofílico soluble en agua que está contenido en las partículas de polímero nucleofílico tiene un peso molecular de al menos 3 kDa, más preferiblemente de al menos 10 kDa y lo más preferiblemente de 20 a 3000 kDa.

[0069] El polímero nucleofílico contiene preferiblemente al menos 4 grupos nucleofílicos reactivos, más preferiblemente al menos 8 grupos nucleofílicos reactivos y lo más preferiblemente al menos 10 grupos nucleofílicos reactivos. Lo más preferible, estos grupos nucleofílicos reactivos son grupos amina, lo más preferiblemente grupos amina primaria.

[0070] Los ejemplos de polímeros nucleofílicos solubles en agua que pueden usarse adecuadamente en las partículas de polímero nucleofílico incluyen proteína, quitosano, polioxazolina nucleofílica, polietilenglicol nucleofílico, polietilenimina y combinaciones de los mismos. Más preferiblemente, el polímero nucleofílico se selecciona entre gelatina, colágeno, quitosano, polioxazolina nucleofílica y combinaciones de los mismos.

[0071] Según una realización particularmente conveniente, las partículas de polímero nucleofílico empleadas según la invención garantizan la hemostasia acelerando el proceso de coagulación. El colágeno es capaz de activar la vía intrínseca de la cascada de la coagulación. El colágeno tiene una gran superficie, que actúa como matriz para la activación, agregación y formación de trombos plaquetarios. Las partículas de gelatina tienen la capacidad de restringir el flujo sanguíneo y proporcionar una matriz para la formación de coágulos. En consecuencia, en una realización muy preferida, el polímero nucleofílico se selecciona entre gelatina, colágeno y combinaciones de los mismos. Lo más preferiblemente, el polímero nucleofílico es gelatina, incluso más preferiblemente gelatina reticulada.

[0072] La gelatina reticulada tiene preferiblemente un peso molecular en el intervalo de 30-3000 kDa, más preferiblemente en el intervalo de 400 a 2000 kDa, más preferiblemente en el intervalo de 500 a 1500 kDa.

[0073] El contenido promedio de amina primaria de la gelatina reticulada está en el intervalo de 5 x 10-4 a 2 x 10-2 l_imol, más preferiblemente de 1.0 x 10-3 a 1.0 x 10-2 pmol de amina primaria por pg de gelatina reticulada reducida.

[0074] Según otra realización conveniente, el polímero nucleofílico es el polietilenglicol (PEG) nucleofílico. Preferiblemente, el PEG nucleofílico contiene al menos 3, más preferiblemente al menos 5 y lo más preferiblemente 8 grupos nucleofílicos reactivos.

[0075] Según otra realización preferida, el polímero nucleofílico es quitosano. El quitosano es un carbohidrato complejo biodegradable, no tóxico, derivado de la quitina (poli-N-acetil-D-glucosamina), una sustancia natural. El quitosano es la forma desacetilada de la quitina. El quitosano aplicado de acuerdo con la presente invención tiene preferentemente un grado de desacetilación superior al 70 %. El quitosano empleado de acuerdo con la presente invención tiene preferiblemente un peso molecular de al menos 5 kDa, más preferiblemente de 10-10 000 kDa.

[0076] Según otra realización muy conveniente, el polímero nucleofílico es la polioxazolina nucleofílica. Preferiblemente, el polioxazolina nucleofílica contiene al menos 3, más preferiblemente al menos 5 y lo más preferiblemente de 8 a 20 grupos nucleofílicos reactivos.

[0077] En comparación con los biopolímeros nucleofílicos naturales como la gelatina, el colágeno y el quitosano, el uso de polímeros nucleofílicos sintéticos, como la polioxazolina nucleofílica y el PEG nucleofílico, ofrece la ventaja de que los aglomerados de partículas que contienen estos polímeros nucleofílicos sintéticos exhiben propiedades hemostáticas más predecibles (reproducibles). .

[0078] Los grupos nucleofílicos reactivos del polímero nucleofílico soluble en agua se seleccionan preferiblemente entre grupos amino, grupos tiol y combinaciones de los mismos.

[0079] Según una realización preferida, el polímero nucleofílico soluble en agua contiene dos o más grupos amina y los grupos electrofílicos reactivos en la polioxazolina electrofílica se seleccionan entre ésteres de ácido carboxílico, ésteres de sulfonato, ésteres de fosfonato, ésteres de pentafluorofenilo, ésteres de p-nitrofenilo, ésteres de p-nitrotiofenilo, grupos de haluro de ácido, anhídridos, cetonas, aldehídos, isocianato, tioisocianato, isociano, epóxidos, grupos hidroxilo activados, éteres de glicidilo, ésteres de carboxilo, succinimidilo, ésteres de sulfosuccinimidilo, ésteres de imido, derivados de dihidroxifenilo y combinaciones de los mismos.

[0080] Según otra realización preferida, el polímero nucleofílico hidrosoluble contiene dos o más grupos tiol y los grupos electrofílicos reactivos de la polioxazolina electrofílica se seleccionan entre haloacetales, disulfuro de ortopiridilo, maleimidas, vinilsulfona, derivados de dihidroxifenilo, vinilo, acrilato, acrilamida, yodoacetamida, ésteres de succinimidilo, ésteres de sulfosuccinimidilo y combinaciones de los mismos. Más preferiblemente, los grupos electrofílicos reactivos se seleccionan entre ésteres de succinimidilo, ésteres de sulfosuccinimidilo, haloacetales, maleimidas o derivados de dihidroxifenilo y combinaciones de los mismos. Lo más preferiblemente, los grupos electrofílicos reactivos se seleccionan entre maleimidas o derivados dihidroxifenilo y combinaciones de los mismos.

[0081] Según una realización particularmente preferida, la relación entre el número total de grupos electrofílicos reactivos proporcionados por la polioxazolina electrofílica y el número total de grupos nucleofílicos reactivos proporcionados por el polímero nucleofílico se encuentra en el intervalo de 1:1.5 a 1.5:1, más preferiblemente en el intervalo de 1:1.2 a 1.2:1 y lo más preferiblemente en el intervalo de 1:1.1 a 1.1:1.

[0082] Los inventores han descubierto inesperadamente que se pueden obtener aglomerados de partículas que muestran una excelente adhesión a órganos como el bazo y el riñón si los aglomerados de partículas contienen del 1 al 20 % en peso, más preferiblemente del 2.5 al 15 % en peso y lo más preferiblemente del 5 al 10 % en peso de un polímero no iónico no reactivo. Este polímero no iónico no reactivo no contiene grupos electrofílicos reactivos ni grupos nucleofílicos reactivos.

[0083] En una realización muy preferida, las partículas aglomeradas se recubren con el polímero no iónico no reactivo.

[0084] El polímero no iónico no reactivo tiene preferiblemente un punto de fusión en el intervalo de 40-70 °C, más preferiblemente en el intervalo de 45-65 °C y lo más preferiblemente en el intervalo de 50-60 °C. Aquí, el punto de fusión se refiere a la temperatura a la que el polímero se funde por completo.

[0085] Los ejemplos de polímeros no iónicos no reactivos que pueden aplicarse adecuadamente en las partículas de aglomerado de la presente invención incluyen poloxámeros, polietilenglicoles y combinaciones de los mismos. El poloxámero es un copolímero tribloque no iónico compuesto por una cadena hidrofóbica central de polioxipropileno (óxido de polipropileno) flanqueada por dos cadenas hidrofílicas de polioxietileno (óxido de polietileno) y está representado por la fórmula (I)

donde a es un número entero de 10 a 110 y b es un número entero de 20 a 60. Cuando a es 80 y b es 27, este polímero se conoce como poloxámero 188. Otros poloxámeros conocidos útiles en la presente invención son poloxámero 237 (a = 64 y b = 37), poloxámero 338 (a = 141 y b = 44) y poloxámero 407 (a = 101 y b = 56). Otros poloxámeros que se conocen y pueden ser útiles en la presente invención incluyen poloxámero 108, poloxámero 182, poloxámero 183, poloxámero 212, poloxámero 217, poloxámero 238, poloxámero 288, poloxámero 331, poloxámero 338 y poloxámero 335.

[0086] Según una realización particularmente preferida, el polímero no iónico no reactivo es un poloxámero, incluso más preferiblemente un poloxámero que tiene una masa molecular promedio de 2000-18 000, más preferiblemente un poloxámero que tiene una masa molecular promedio de 7000-10000.

[0087] El poloxámero aplicado en los aglomerados de partículas es preferiblemente un sólido a temperatura ambiente.

[0088] En otra realización conveniente, el polvo hemostático de la presente invención es biorreabsorbible, lo que permite utilizar el polvo en cirugía abdominal.

[0089] Otro aspecto de la invención se refiere a un método para preparar aglomerados de partículas hemostáticas de:

(a) partículas de polioxazolina electrofílica que contienen polioxazolina electrofílica que lleva al menos 3 grupos electrofílicos reactivos que son capaces de reaccionar con grupos amino en sangre bajo la formación de un enlace covalente; y

donde dicho método comprende combinar 100 partes en peso de partículas de polioxazolina electrofílica con 10 a 1000 partes en peso de partículas de polímero nucleofílico en presencia de líquido de granulación no acuoso.

[0090] Las partículas de polioxazolina electrofílica que se emplean en el presente método son preferiblemente idénticas a las partículas de polímero electrofílicas descritas anteriormente en este documento. Asimismo, las partículas de polímero nucleofílico que se emplean son preferiblemente idénticas a las partículas de polímero nucleofílico descritas anteriormente en el presente documento.

[0091] Según una realización preferida, tanto las partículas de polioxazolina electrofílica como las partículas de polímero nucleofílico que se emplean en el presente método tienen un contenido de agua de menos del 2 % en peso, más preferiblemente de menos del 1 % en peso. Para lograr un contenido de agua tan bajo, puede ser necesario secar las partículas de polímero antes de la granulación.

[0092] La polioxazolina electrofílica tiene preferiblemente una solubilidad en el líquido de granulación no acuoso a 20 °C de menos de 1 mg/l, más preferiblemente de menos de 0.5 mg/l, incluso más preferiblemente de menos de 0.2 mg/l y lo más preferiblemente de menos de 0.1 mg/l.

[0093] El polímero nucleofílico preferiblemente tiene una solubilidad en el líquido de granulación no acuoso a 20 °C de al menos 5 mg/l, más preferiblemente de al menos 10 mg/l, aún más preferiblemente de 20-200 mg/l y lo más preferiblemente de 40-150 mg/l.

[0094] En una realización preferida, el método comprende combinar 100 partes en peso de partículas de polioxazolina electrofílica con una cantidad de 20 a 400 partes en peso, más preferiblemente 50 a 200 partes en peso de partículas de polímero nucleofílico, en presencia del líquido de granulación no acuoso. .

[0095] La cantidad de líquido de granulación no acuoso empleada en el presente método está preferiblemente en el intervalo del 0.5-5 % en peso de la cantidad combinada de partículas de polioxazolina electrofílica y partículas de polímero nucleofílico que se usa en el método. Más preferiblemente, la cantidad de líquido de granulación no acuoso empleada está en el intervalo del 1-4 %, lo más preferiblemente del 1.5-3 % en peso de la cantidad combinada de partículas de polioxazolina electrofílica y partículas de polímero nucleofílico.

[0096] Según una realización particularmente preferida, el método comprende el paso de humedecer las partículas de polioxazolina electrofílica con el líquido de granulación no acuoso, seguido por el paso de combinar las partículas de polioxazolina humedecidas con las partículas de polímero nucleofílico. Esta realización particular ofrece la ventaja de que proporciona un granulado muy homogéneo en cuanto a tamaño de partícula y composición.

[0097] Las partículas de polioxazolina electrofílica usadas en la preparación de la mezcla en polvo tienen preferiblemente un diámetro medio ponderado por volumen (D [4,3]) en el intervalo de 1-100 |_im, más preferiblemente en el intervalo de 50-50 |_im, lo más preferiblemente en el intervalo de 10-40 |_im.

[0098] El diámetro medio ponderado por volumen (D [4,3]) de las partículas de polímero nucleofílico utilizadas en la preparación de la mezcla en polvo está preferiblemente en el intervalo de 10-300 |_im, más preferiblemente en el intervalo de 15-200 |_im, lo más preferiblemente en el intervalo de 20-100 |_im.

[0099] El polvo aglomerado que se obtiene mediante el presente método tiene preferiblemente un diámetro medio ponderado por volumen (D [4,3]) en el intervalo de 12-1000 |_im, más preferiblemente en el intervalo de 20 500 |_im, lo más preferiblemente en el intervalo de 30-300 |_im.

[0100] El líquido de granulación no acuoso empleado en la granulación húmeda contiene preferiblemente al menos un 60 % en peso de un disolvente orgánico seleccionado entre alcohol isopropílico, etanol, metanol, éter dietílico, heptano, hexano, pentano, ciclohexano, diclorometano, acetona y mezclas de los mismos. Más preferiblemente, el líquido de granulación no acuoso contiene al menos un 60 % en peso, lo más preferiblemente al menos un 85 % en peso de un disolvente orgánico seleccionado entre alcohol isopropílico, etanol y mezclas de los mismos. Más preferiblemente, el líquido de granulación no acuoso contiene al menos un 60 % en peso, lo más preferiblemente al menos un 85 % en peso de alcohol isopropílico.

[0101] El líquido de granulación no acuoso contiene preferiblemente no más del 1 % en peso de agua, más preferiblemente no más del 0.1 % en peso de agua.

[0102] El presente método ofrece la ventaja de que no requiere el uso de aglutinante de granulación. En consecuencia, en una realización preferida del método, no se usa aglutinante de granulación. De acuerdo con una realización particularmente preferida, los únicos materiales utilizados en el método de preparación son las partículas de polioxazolina electrofílica, las partículas de polímero nucleofílico y el líquido de granulación no acuoso.

[0103] Los aglomerados de partículas de la presente invención se pueden aplicar convenientemente en láminas hemostáticas para mejorar sus propiedades hemostáticas. En consecuencia, otro aspecto más (que no forma parte de la invención reivindicada) se refiere a una lámina hemostática, flexible y biocompatible que comprende:

• distribuido dentro del espacio intersticial, un polvo hemostático como se ha descrito anteriormente en este documento.

[0104] Según una realización particularmente preferida, la estructura portadora fibrosa cohesiva es resistente al agua.

[0105] La polioxazolina electrofílica del polvo hemostático que se distribuye por toda la estructura fibrosa portadora se disuelve rápidamente cuando la lámina entra en contacto con la sangre u otros fluidos corporales acuosos que pueden penetrar en el espacio intersticial. Por lo tanto, tras la aplicación de la lámina en el sitio de una herida, se produce una rápida reticulación covalente entre, por un lado, la polioxazolina electrofílica y, por otro lado, el polímero nucleofílico en las partículas de polímero nucleofílico, las proteínas sanguíneas y el tejido, lo que lleva a la formación de un gel que sella la superficie de la herida y detiene el sangrado y conduce además a una fuerte adhesión de la lámina hemostática al tejido. El quitosano aplicado de acuerdo con la presente invención tiene preferiblemente un grado de desacetilación superior al 70 %. La estructura portadora fibrosa resistente al agua proporciona resistencia mecánica durante y después de la aplicación y evita la hinchazón excesiva.

[0106] Dado que la polioxazolina electrofílica y el polímero nucleofílico están contenidos en una sola partícula, se garantiza que estos dos componentes reactivos puedan distribuirse homogéneamente por toda la lámina hemostática, que no se produzca segregación durante el transporte y la manipulación, y que estos componentes puedan reaccionar inmediatamente entre sí cuando los aglomerados de partículas entran en contacto con la sangre.

[0107] Según una realización particularmente preferida, la lámina hemostática de la presente invención es biorreabsorbible, lo que significa que la estructura portadora, los aglomerados de partículas y cualquier otro componente de la lámina hemostática son finalmente absorbidos por el cuerpo. La absorción de la estructura portadora y los aglomerados de partículas normalmente requiere la descomposición química (p. ej., hidrólisis) de los polímeros que contiene. La biorreabsorción completa de la lámina hemostática por parte del cuerpo humano se logra típicamente en un periodo de 1 a 10 semanas, preferiblemente de 2 a 8 semanas.

[0108] La lámina hemostática de la presente invención tiene típicamente un grosor medio sin comprimir de 0.5 a 25 mm. Más preferiblemente, el grosor medio sin comprimir está en el intervalo de 1 a 10 mm, lo más preferiblemente en el intervalo de 1.5 a 5 mm.

[0109] Las dimensiones de la lámina hemostática preferiblemente son tales que la parte superior e inferior de la lámina tienen cada una un área superficial de al menos 2 cm2, más preferiblemente de al menos 10 cm2 y lo más preferiblemente de 25-50 cm2. Típicamente, la lámina es de forma rectangular y tiene una longitud de 25-200 mm y una anchura de 25-200 mm.

[0110] La lámina hemostática preferiblemente tiene una densidad no comprimida de menos de 200 mg/cm3, más preferiblemente de menos de 150 mg/cm3 y lo más preferiblemente de 10-100 mg/cm3.

[0111] La lámina hemostática preferiblemente es esencialmente anhidra. Típicamente, la lámina hemostática tiene un contenido de agua de no más del 5 % en peso, más preferiblemente de no más del 2 % en peso y lo más preferiblemente de no más del 1 % en peso.

[0112] La capacidad de absorción de agua de la lámina hemostática preferiblemente es de al menos el 50 %, más preferiblemente se encuentra en el intervalo del 100 % al 800 %, lo más preferiblemente en el intervalo del 200 % al 500 %.

[0113] La lámina hemostática es preferiblemente estéril.

[0114] El uso de una estructura portadora fibrosa en la lámina hemostática ofrece la ventaja de que el polvo hemostático puede distribuirse homogéneamente por toda esta estructura portadora sin dificultad. Dicha distribución homogénea es mucho más difícil de lograr, por ejemplo, en estructuras portadoras de espuma.

[0115] Las fibras en la estructura portadora fibrosa tienen preferiblemente un diámetro medio de 1 a 500 |_im, más preferiblemente de 2 a 300 |_im y lo más preferiblemente de 5 a 200 |_im. El diámetro medio de las fibras se puede determinar adecuadamente usando un microscopio.

[0116] Típicamente, al menos el 50 % en peso, más preferiblemente al menos el 80 % en peso de las fibras en la estructura fibrosa portadora tienen un diámetro de 1-300 |_im y una longitud de al menos 1 mm.

[0117] Preferiblemente, al menos el 50 % en peso, más preferiblemente al menos el 80 % en peso de las fibras en la estructura fibrosa portadora tienen una relación de aspecto (relación entre la longitud y el diámetro) de al menos 1000.

[0118] La estructura fibrosa portadora que se emplea preferiblemente es una estructura de fieltro, una estructura tejida o una estructura tricotada. Lo más preferible, la estructura portadora fibrosa es una estructura de fieltro. Aquí, el término "estructura de fieltro" se refiere a una estructura que se produce uniendo y presionando las fibras para formar un material cohesivo.

[0119] La estructura portadora fibrosa preferiblemente comprende al menos un 50 % en peso, más preferiblemente al menos un 80 % en peso y lo más preferible al menos un 90 % en peso de fibras que contienen gelatina, colágeno, celulosa, celulosa modificada, carboximetildextrano, PLGA, hialuronato de sodio/carboximetilcelulosa, alcohol polivinílico, quitosano o una combinación de los mismos.

[0120] En una realización de la invención, la estructura portadora fibrosa no comprende celulosa regenerada oxidada.

[0121] Las estructuras portadoras fibrosas preferidas tienen una estructura de poros abiertos con una permeabilidad al aire de al menos 0.1 l/min x cm2, más preferiblemente de al menos 0.5 l/min x cm2. La permeabilidad al aire se determina de acuerdo con EN ISO 9237:1995 (Textiles - Determinación de la permeabilidad al aire de los tejidos).

[0122] Las fibras en la estructura portadora fibrosa se pueden producir por medio de métodos conocidos en la técnica, tales como hilatura eléctrica, hilatura por electrosoplado e hilatura con rociador rotatorio de alta velocidad. La producción de una estructura portadora fibrosa por medio de hilatura con rociador rotatorio de alta velocidad se describe en EE. UU. 2015/0010612. También es posible utilizar láminas fibrosas hemostáticas disponibles en el mercado como estructura portadora fibrosa.

[0123] El polvo hemostático está preferiblemente presente en la lámina hemostática de la presente invención en una cantidad del 5-90 %, más preferiblemente del 10-80 %, aún más preferiblemente del 20-75 % y lo más preferiblemente del 50-70 % en peso de la estructura portadora fibrosa.

[0124] La invención se ilustra además mediante los siguientes ejemplos no limitantes.

EJEMPLOS(los ejemplos que no comprenden un polvo según la reivindicación 1 no forman parte de la invención reivindicada)

[0125] En general: siempre que no se mencione explícitamente la humedad residual (es decir, agua residual en el polvo seco, el granulado y/o las estructuras portadoras fibrosas cohesivas) después del secado, los niveles están por debajo del 2.0 % p/p.

Preparación de NHS-POx

[0126] El terpolímero de poli[2-(etil/hidroxi-etil-amida-etil/NHS-éster-etilo-éster-etil-amida-etil)-2-oxazolina] activado con cadena lateral NHS que contiene un 20 % de grupos NHS-éster (= EL-POx, 20 % NHS) se sintetizó de la siguiente manera: se sintetizó un copolímero de poli[2-(etil/metoxi-carbonil-etil)-2-oxazolina] (Gp = /-100) mediante CROP usando 2- etil-2-oxazolina (EtOx) al 60 % y 2-metoxicarbonil-etil-2-oxazolina (MestOx) al 40 %. Un copolímero estadístico que contiene un 40 % de grupos 2-metoxicarbonil-etilo (1H-RMN). En segundo lugar, el polímero que contenía un 40 % de grupos 2-metoxicarbonil-etilo se hizo reaccionar con etanolamina dando un copolímero con un 40 % de grupos 2-hidroxi-etil-amida-etilo (1H-RMN). Después de eso, la mitad de los grupos 2-hidroxi-etil-amida-etilo se hizo reaccionar con anhídrido succínico produciendo un terpolímero con un 60 % de grupos 2-etilo, un 20 % de grupos 2-hidroxi-etil-amida-etilo y un 20 % de grupos 2-carboxi-etil-éster-etil-amidaetilo según 1H-RMN. Por último, los grupos 2-carboxi-etil-éster-etil-amida-etilo se activaron con N-hidroxisuccinimida (NHS) y diisopropilcarbodiimida (DIC), produciendo EL-POx, NHS al 20 %. El NHS-POx contenía un 20 % de grupos éster de NHS según 1H-RMN. Se disolvió NHS-POx a una temperatura entre 2 y 8 °C en agua (60 g en 300 ml), se enfrió a menos 80 °C durante media hora y se liofilizó. El polvo liofilizado así obtenido se secó en un Rotavap a 40 °C hasta que el contenido de agua estuvo por debajo del 0.8 % p/p según se determinó mediante titulación de Karl Fischer. Este polvo seco (blanco) se trituró usando un molino de bolas (Retch MM400) hasta que el tamaño de partícula promedio no superara los 40 pm (D [4,3]) y se selló al vacío en bolsas de aluminio.

Teñido del polvo NHS-POx

[0127] 20 g de polvo de NHS-POx se disolvieron en agua y se mezclaron con 50 mg de azul brillante FCF (Sigma Aldrich) utilizando un instrumento de dispersión de alto rendimiento (Ultra-Turrax, IKA). Directamente después de mezclar (2 minutos), la solución se congeló a -78 °C y posteriormente se liofilizó durante la noche. El polvo liofilizado así obtenido se secó en un Rotavap a 40 °C hasta que el contenido de agua residual estuvo por debajo del 0.8 % p/p según se determinó mediante titulación de Karl Fischer. A continuación, el polvo seco (azul) se molió usando un molino de bolas (Retch MM400) hasta obtener un polvo de NHS-POx teñido de azul con un tamaño de partícula promedio de no más de 40 pm (D [4,3]) y sellado al vacío en bolsas de aluminio.

Efecto de la reticulación de NHS-POx en PDI (índice de polidispersión)

[0128] Se preparó una solución de 80 pg/ml de 2,2'-(etilendioxi)-bis-(etilamina) (EDEA, Aldrich, Mw 148.2) en una mezcla de diclorometano (DCM) e isopropanol (I<p>A) disolviendo 80 mg de EDEA en 10 ml de DCM/IPA 95:5 (v/v). Esta solución se diluyó 10 veces con DCM/IPA 95:5 (v/v) y se añadieron 26.8 pl de la solución de EDEA a 100 pl de una solución de 0.5 g/ml de NHS-POx en DCM/IPA 95:5 (v /v) lo que corresponde a un 0.05 % molar de grupos amina con respecto a los grupos NHS. Inmediatamente después de la adición de la solución de EDEA, la mezcla de reacción se mezcló a fondo usando un mezclador de vórtice. La mezcla de reacción se agitó a 40 °C durante 3 horas y todos los volátiles se eliminaron por evaporación rotatoria a presión reducida.

[0129] La muestra seca se reconstituyó en la fase móvil cromatográfica de exclusión por tamaño (SEC) deN,N-dimetilacetamida que contiene cloruro de litio 50 mM. La SEC se midió frente a estándares de poli(metil metacrilato). A partir del cromatograma de exclusión por tamaño obtenido se determinaron el Mn, el Mw y el PDI. El PDI fue superior a 2.5. Una solución de 0.5 g/ml de NHS-POx en DCM/IPA 95:5 (v/v), sin la adición de EDEA, siguiendo el mismo procedimiento SEC dio como resultado un PDI de 1.5, lo que indica que solo la reticulación del 0.05 % molar de los grupos NHS ya da como resultado un aumento significativo en el PDI del polímero.

Preparación de NU-POx

[0130] La polioxazolina que contiene grupos etilo y amina en la cadena lateral alquilo se sintetizó mediante CROP de EtOx y MestOx y la posterior amidación de las cadenas laterales del éster metílico con etilendiamina para producir un copolímero de poli(2-etil/aminoetilamidoetil-2-oxazolina) (NU-POx). El NU-POx contenía un NH<2>al 10 % de acuerdo con 1H-RMN. Se disolvió NU-POx a una temperatura entre 2 y 8 °C en agua (60 g en 300 ml), se enfrió a menos 80 °C durante media hora y se liofilizó. El polvo liofilizado así obtenido se secó en un Rotavap a 40 °C hasta que el contenido de agua estuvo por debajo del 0.8 % p/p según se determinó mediante titulación de Karl Fischer. Este polvo seco se trituró en una máquina trituradora de mesa hasta que el tamaño de partícula promedio no superara los 100 |_im (D [4,3]) y se selló al vacío en bolsas de aluminio.

Preparación de gránulos reactivos de NHS-POx/NU-POx

[0131] Se humedeció polvo de NHS-POx azul o blanco (sin teñir) con alcohol isopropílico (IPA) en un mezclador de alto cizallamiento hasta que se obtuvo un polvo homogéneo similar a la nieve que contenía aproximadamente un 1-2 % p/p de IPA. Después de esto, se añadió polvo NU-POx y se mezcló. El polvo de NHS-POx azul humedecido se mezcló con polvo de NU-POx en una relación molar de 1:0.6, dicha relación molar se refiere a la relación entre el número de grupos NHS proporcionados por NHS-POx y el número de grupos amino proporcionados por el NU-POx. El polvo de NHS-POx humedecido sin teñir también se mezcló con polvo de NU-POx en otras proporciones molares (1:0.8; 1:1 y 1:1.2).

[0132] Después de mezclar, los granulados húmedos se secaron a presión reducida hasta que el contenido de IPA fue inferior al 0.1 % p/p según lo determinado mediante 1H-RMN. Los granulados secos se trituraron utilizando un molino de bolas (Retch MM400) hasta que el tamaño de partícula promedio no superara los 50 |_im (D [4,3]) y se sellaron al vacío en bolsas de aluminio.

[0133] La distribución del tamaño de partícula de los granulados así obtenidos era aproximadamente: 90 % en volumen < 90 |_im, 50 % en volumen < 45 |_im y 10 % en volumen < 15 |_im.

[0134] El granulado NHS-POX/NU-POx (1:1) se analizó utilizando espectroscopía 1H-RMN. Se disolvieron 25 mg de granulado en ácido trifluoroacético (0.20 ml) sometiéndolo a ultrasonidos durante 20 minutos. Después de la disolución completa del granulado, la muestra se diluyó con dimetilsulfóxido deuterado (DMSO-de) que contenía ácido maleico (2.5 mg/ml) como estándar interno (0.80 ml), transferido a un tubo de RMN y se registró un espectro 1H-RMN. A partir del espectro adquirido, se puede calcular la cantidad de NHS unido a NHS-POx, junto con la proporción molar de NHS y grupos amino presentes en el granulado. La cantidad de NHS unida a NHS-POx en el granulado fue igual a la cantidad de NHS unida a NHS-POx como material de partida, lo que indica que no se descompuso ni se reticuló durante la granulación.

[0135] La recuperación total de polímeros,es decir,la combinación de NHS-POx y NU-POx en la muestra de RMN se determinó usando una cantidad conocida de estándar interno (ácido maleico) y una curva de calibración construida a partir de espectros 1H-RMN registrados de NHS-POx y NU-POx en diferentes concentraciones. Se midió que la recuperación total de polímero era del 99 por ciento, lo que indica que no se formó material reticulado insoluble.

[0136] El granulado de NHS-POX/NU-POx (1:1) se analizó adicionalmente mediante cromatografía de exclusión por tamaño. Se trataron 20 mg del granulado con anhídrido acético (1.00 ml) durante 1 hora a 50 °C. Posteriormente, se añadió metanol (2.00 ml) y la mezcla se agitó durante una hora más a 50 °C. Se tomó una alícuota (0.75 ml) y se eliminaron todos los volátiles a presión reducida. La muestra fue tomada enN,N-dimetilacetamida con contenido de cloruro de litio 50 mM (2.50 ml), que fue el eluyente para el análisis SEC. La SEC se midió frente a estándares de poli(metil metacrilato) y a partir del cromatograma de exclusión por tamaño obtenido, se determinaron la Mn, la Mw y el PDI. El PDI no fue superior a 1.5, lo que indica que no se había producido reticulación durante la granulación. La validación analítica de este método cromatográfico de exclusión por tamaño indicó que el reticulado intencional de NHS-POx con NU-POx a un nivel de 0.05 % molar aumentó el PDI hasta más de 2.5.

Preparación de mezclas NHS-POx/NU-POx por coliofilización

[0137] Se prepararon polvos de NHS-POx/NU-POx liofilizados de la siguiente manera: se disolvieron 2.4 g de NU-POx en 40 ml de ácido acético glacial. Después de la disolución completa del polímero, se añadieron 2.0 g de NHS-POx y la muestra se sometió a ultrasonidos durante 30 minutos. La solución se congeló instantáneamente en nitrógeno líquido y se liofilizó. El sólido pegajoso resultante se secó adicionalmente a presión reducida (< 1 kPa) y se selló al vacío en una bolsa de aluminio.

[0138] Las muestras de NHS-POx/NU-POx liofilizadas no se pudieron analizar mediante espectroscopía 1H-RMN y cromatografía de exclusión por tamaño porque las muestras no eran solubles en ácido trifluoroacético ni en anhídrido acético debido al alto grado de reticulación entre NHS-POx y NU-POx.

Preparación de mezclas NHS-POx/NU-POx por mezcla en seco

[0139] Las mezclas de NHS-POx/NU-POx se prepararon de la siguiente manera: 2 g de NHS-POx y 2 g de NU-POx se mezclaron en seco mediante agitación en tambor durante 30 minutos. El polvo resultante se secó a presión reducida (< 1 kPa) y se selló al vacío en una bolsa de aluminio.

[0140] El polvo se analizó utilizando espectroscopia 1H-RMN. Se disolvieron 25 mg de polvo en ácido trifluoroacético (0.20 ml) sometiéndolo a ultrasonidos durante 20 minutos. Después de la disolución completa del polvo, la muestra se diluyó con dimetilsulfóxido deuterado (DMSO-cfe) que contenía ácido maleico (2.5 mg/ml) como estándar interno (0.80 ml), transferido a un tubo RMN y se registró un espectro 1H-RMN. A partir del espectro obtenido, se calculó que la cantidad de NHS sin reaccionar era del 99 por ciento en comparación con el NHS-POx.

[0141] La recuperación total de polímeros,es decir,la combinación de NHS-POx y NU-POx en la muestra de RMN se determinó usando una cantidad conocida de estándar interno (ácido maleico) y una curva de calibración construida a partir de espectros 1H-RMN registrados de NHS-POx y NU-POx en diferentes concentraciones. Se midió que la recuperación total de polímero era del 101 por ciento, lo que indica que no se formó material reticulado insoluble.

[0142] El polvo se analizó adicionalmente por medio de cromatografía de exclusión por tamaño. Se trataron 20 mg del polvo con anhídrido acético (1.00 ml) durante 1 hora a 50 °C. Posteriormente, se añadió metanol (2.00 ml) y la mezcla se agitó durante una hora más a 50 °C. Se tomó una alícuota (0.75 ml) y se eliminaron todos los volátiles a presión reducida. La muestra fue tomada en N,N-dimetilacetamida con contenido de cloruro de litio 50 mM (2.50 ml), que fue el eluyente para el análisis SEC. La SEC se midió frente a estándares de poli(metil metacrilato) y a partir del cromatograma de exclusión por tamaño obtenido, se determinaron la Mn, la Mw y el PDI. El PDI no fue superior a 1.5, lo que indica que no se había producido ningún reticulado durante la mezcla en seco.

Preparación de gránulos (aislados) de NHS-POx/NU-POx

[0143] Los siguientes polvos se produjeron por liofilización:

Polvo de fosfato

[0144] 42.66 g de fosfato de sodio dibásico dihidrato y 26.56 g de fosfato de sodio monobásico monohidrato se disolvieron en 170 ml de agua ultrapura. Después de la disolución completa, el pH se ajustó a 7 mediante la adición de 62 ml de una solución acuosa de hidróxido de sodio 0.1 molar. La solución se congeló en nitrógeno líquido y se liofilizó. El polvo resultante se secó a presión reducida y se selló al vacío en una bolsa de aluminio. Polvo de carbonato

[0145] Se preparó una mezcla 1:1 mol/mol de carbonato de sodio e hidrogenocarbonato de sodio disolviendo 25.31 g de carbonato de sodio y 20.06 g de hidrogenocarbonato de sodio en 350 ml de agua ultrapura. La solución se congeló instantáneamente en nitrógeno líquido y se liofilizó. El polvo resultante se secó a presión reducida y se selló al vacío en una bolsa de aluminio.

Polvo de NHS-POx/ácido cítrico

[0146] 3.08 g de ácido cítrico se disolvieron en 10 ml de agua ultrapura. La solución se enfrió a una temperatura entre 2-8°C. Posteriormente, se añadieron 7.00 g de NHS-POx y se disolvieron con la ayuda de un instrumento de dispersión de alto rendimiento (Ultra-Turrax, IKA). Directamente después de mezclar (2 minutos), la solución se congeló instantáneamente usando nitrógeno líquido y se liofilizó durante la noche. El polvo resultante se secó a presión reducida y se selló al vacío en una bolsa de aluminio.

Polvo de NU-POx/carbonato

[0147] A continuación, se produjo un polvo de NU-POx que contenía carbonato de la siguiente manera: se disolvieron 9.60 g de NU-POx y 0.80 g del polvo de carbonato en 40 ml de agua ultrapura. La solución se congeló instantáneamente usando nitrógeno líquido y se liofilizó. El polvo resultante se secó a presión reducida y se selló al vacío en una bolsa de aluminio.

[0148] El granulado de NHS-POx/NU-POx (aislado) se preparó de la siguiente manera: se mezclaron 6.50 g de polvo de NHS-POx/ácido cítrico y 5.50 g del polvo de fosfato en un mezclador de alto cizallamiento. Después de obtener una mezcla homogénea, se añadieron lentamente 0.40 ml de IPA, mientras se continuaba mezclando, hasta que se formó un polvo homogéneo similar a la nieve. A continuación, se añadieron 5.41 g del polvo de NU-POx/Carbonato y se detuvo la mezcla una vez que se formó un granulado homogéneo. El granulado se secó a presión reducida hasta que el contenido de IPA fue inferior al 0.1 % p/p. El granulado seco se molió en un molinillo de café hasta que el tamaño de partícula promedio no superara los 100 |_im (D [4,3]) y se selló al vacío en bolsas de aluminio.

Preparación de gránulos reactivos de NHS-POx/NU-POx/P188

[0149] Los gránulos de NHS-POx/NU-POx reactivos, como se ha descrito anteriormente, se recubrieron con Pluronic P188. El granulado de NHS-POx/NU-POx reactivo recubierto con P188 al 2.5 % p/p se preparó calentando el granulado de NHS-POx/NU-POx junto con el polvo de P188 en un mezclador de alto cizallamiento a 65 °C durante 10 minutos, seguido de enfriamiento en condiciones ambientales. El granulado recubierto se molió utilizando un molino de bolas (Retch MM400) hasta que el tamaño de partícula promedio no superara los 40 |_im (D [4,3]) y se selló al vacío en bolsas de doble laminado de aluminio.

[0150] La distribución del tamaño de partícula de los granulados así obtenidos era aproximadamente: 90 % en volumen < 80 |_im, 50 % en volumen < 40 |_im y 10 % en volumen < 10 |_im.

[0151] El granulado NHS-POx/NU-POx/P188 se analizó utilizando espectroscopía 1H-RMN. Se disolvieron 25 mg de polvo en ácido trifluoroacético (0.20 ml) sometiéndolo a ultrasonidos durante 20 minutos. Después de la disolución completa del granulado, la muestra se diluyó con dimetilsulfóxido deuterado (DMSO-de) (0.80 ml), transferido a un tubo de RMN y se registró un espectro 1H-RMN. A partir del espectro obtenido, se calculó que la cantidad de NHS sin reaccionar era del 98 por ciento en comparación con el NHS-POx.

[0152] El granulado de NHS-POx/NU-POx/P188 se analizó adicionalmente mediante cromatografía de exclusión por tamaño. Se trataron 20 mg del granulado con anhídrido acético (1.00 ml) durante 1 hora a 50 °C. Posteriormente, se añadió metanol (2.00 ml) y la mezcla se agitó durante una hora más a 50 °C. Se tomó una alícuota (0.75 ml) y se eliminaron todos los volátiles a presión reducida. La muestra fue tomada enN,N-dimetilacetamida con contenido de cloruro de litio 50 mM (2.50 ml), que fue el eluyente para el análisis SEC. La SEC se midió frente a estándares de poli(metil metacrilato) y a partir del cromatograma de exclusión por tamaño obtenido, se determinaron la Mn, la Mw y el PDI. El PDI no fue superior a 1.5, lo que indica que no se había producido ninguna reticulación durante la granulación.

Preparación de gelatina reticulada reducida (RXL)

[0153] La gelatina reticulada reducida (RXL) se preparó de acuerdo con tres procedimientos:

• Se disolvieron 12 g de polvo de gelatina (Gelita-SPONO, Gelita Medical GmbH) en 350 ml de una solución acuosa de hidróxido de sodio 0.1 molar agitando durante 2 horas a 40°C. Después de obtener una solución transparente, la mezcla se dejó enfriar a temperatura ambiente y el pH se ajustó a 7 mediante la adición de 32.5 ml de una solución acuosa de ácido clorhídrico 1.0 molar. La solución se congeló instantáneamente usando nitrógeno líquido y se liofilizó. Posteriormente, el polvo se molió en un molinillo de café, secado a presión reducida y sellado al vacío en una bolsa de aluminio. De ahora en adelante, esta gelatina reticulada reducida se denominará RXL-LS (bajo contenido en sal).

• Se disolvieron 12 g de polvo de gelatina (Gelita-SPONO, Gelita Medical GmbH) en 360 ml de una solución acuosa de hidróxido de sodio 1.0 molar agitando durante 10 minutos a 40°C. La solución transparente obtenida se enfrió a temperatura ambiente y el pH se redujo a 7 mediante la adición de 30 ml de una solución concentrada de ácido clorhídrico (37 % p/p). La solución se congeló instantáneamente usando nitrógeno líquido y se liofilizó. Posteriormente, el polvo se molió en un molinillo de café, secado a presión reducida y sellado al vacío en una bolsa de aluminio. De ahora en adelante, esta gelatina reticulada reducida se denominará RXL-HS (alto contenido en sal).

• Se disolvieron 12 g de polvo de gelatina (Gelita-SPONO, Gelita Medical GmbH) en 350 ml de una solución acuosa de hidróxido de sodio 0.1 molar agitando durante 2 horas a 40°C. Después de obtener una solución transparente, la mezcla se dejó enfriar a temperatura ambiente y el pH se ajustó a 7 mediante la adición de 32.5 ml de una solución acuosa de ácido clorhídrico 1.0 molar. Posteriormente, se añadieron 400 ml de metanol a la solución, que se colocó en un congelador a -20 °C durante 16 horas dando como resultado la precipitación de RXL, el cual se aisló por decantación de la fase líquida. El RXL se lavó tres veces con porciones de 100 ml de metanol y después se secó al vacío. El producto bruto se disolvió en 200 ml de agua ultrapura, se congeló rápidamente en nitrógeno líquido y se liofilizó. El polvo se molió en un molinillo de café, se secó a presión reducida y se selló al vacío en una bolsa de aluminio. En lo sucesivo, esta gelatina reticulada reducida se denominará RXL (sin sal).

Preparación de gránulos reactivos de NHS-POx/RXL (sin sal, bajo contenido en sal y alto contenido en sal)

[0154] Los gránulos reactivos de NHS-POx/RXL se prepararon como sigue: se humedecieron 5 g de polvo azul de NHS-POx con IPA en un mezclador de alto cizallamiento hasta que se obtuvo un polvo homogéneo similar a la nieve que contenía aproximadamente un 1-2%p/p de IPA. Después de esto, se añadieron y mezclaron 5 g de polvo RXL, RXL-LS o RXL-HS. Después de mezclar, los granulados húmedos se secaron a presión reducida hasta que el contenido de IPA fue inferior al 0.1 % p/p según lo determinado mediante 1H-RMN. Los granulados secos se molieron en un molinillo de café hasta que el tamaño de partícula promedio no superara los 90 |_im (D [4,3]) y se sellaron al vacío en bolsas de aluminio.

[0155] La distribución del tamaño de partícula de los granulados así obtenidos era aproximadamente: 90 % en volumen < 190 |_im, 50 % en volumen < 60 |_im y 10 % en volumen < 15 |_im.

[0156] El granulado que contenía RXL se analizó mediante análisis de espectroscopía 1H-RMN. Con este fin, a 25 mg del granulado se añadió cloroformo deuterado (CDCl3) que contenía ácido acético al 5 % (v/v) (1.0 ml). El NHS-POx se extrajo selectivamente sometiendo la muestra a ultrasonidos durante 20 minutos. La dispersión se hizo pasar a través de un filtro de 0.22 |_im, se transfirió a un tubo de RMN y se registró un espectro 1H-RMN. A partir del espectro obtenido, se calculó que la cantidad de NHS sin reaccionar era del 98 por ciento en comparación con el NHS-POx.

[0157] La recuperación de NHS-POx en la muestra de RMN se determinó usando trimetilsilano como estándar interno y una curva de calibración construida a partir de espectros 1H-RMN de NHS-POx en diferentes concentraciones. Se midió que la recuperación total de NHS-POx era del 100 por ciento, lo que indica que no se formó material reticulado insoluble.

[0158] El granulado de NHS-POx/RXL se analizó adicionalmente mediante cromatografía de exclusión por tamaño. Por lo tanto, se tomó una alícuota (0.15 ml) de la solución utilizada para el análisis de espectroscopía 1 H-RMN. Esta solución se diluyó con N,N-dimetilacetamida con contenido de cloruro de litio 50 mM (1.00 ml), que fue el eluyente para el análisis SEC. La SEC se midió frente a estándares de poli(metil metacrilato) y a partir del cromatograma de exclusión por tamaño obtenido, se determinaron la Mn, la Mw y el PDI. El PDI no fue superior a 1.5, lo que de nuevo indica que no se había producido reticulación durante la granulación.

Preparación de mezclas NHS-POx/RXL por coliofilización

[0159] Los polvos de NHS-POx/RXL coliofilizados se prepararon de la siguiente manera: se disolvieron 2.5 g de polvo de RXL en 200 ml de agua ultrapura. El pH se ajustó a 4.5 mediante la adición de ácido acético y la solución se enfrió a 4°C. Posteriormente, se añadieron 2.5 g de NHS-POx y se disolvieron con ayuda de agitación de alto cizallamiento. Inmediatamente después de la disolución completa del NHS-POx, la solución se congeló instantáneamente en nitrógeno líquido y se liofilizó. El polvo resultante se secó a presión reducida y se selló al vacío en una bolsa de aluminio.

[0160] El polvo coliofilizado de NHS-POx/RXL se analizó mediante análisis de espectroscopía 1 H-RMN. Para ello se añadió cloroformo deuterado (CDCh) que contenía ácido acético al 5 % (v/v) (1.0 ml) a 25 mg del granulado. El NHS-POx se extrajo selectivamente sometiendo la muestra a ultrasonidos durante 20 minutos. La dispersión se hizo pasar a través de un filtro de 0.22 |_im, se transfirió a un tubo de RMN y se registró un espectro 1H-RMN. A partir del espectro obtenido, se calculó que la cantidad de NHS sin reaccionar era del 93 por ciento en comparación con el NHS-POx.

[0161] La recuperación de NHS-POx en la muestra de RMN se determinó usando trimetilsilano como estándar interno y una curva de calibración construida a partir de espectros 1H-RMN de NHS-POx en diferentes concentraciones. Se midió que la recuperación total de NHS-POx era del 81 por ciento, lo que indica que en cierta medida se formó material reticulado insoluble.

[0162] El polvo de NHS-POx/RXL se analizó adicionalmente mediante cromatografía de exclusión por tamaño. Se tomó una alícuota (0.15 ml) de la solución utilizada para el análisis de espectroscopía 1 H-RMN. Esta solución se diluyó con N,N-dimetilacetamida con contenido de cloruro de litio 50 mM (1.00 ml), que fue el eluyente para el análisis SEC. La SEC se midió frente a estándares de poli(metil metacrilato) y a partir del cromatograma de exclusión por tamaño obtenido, se determinaron la Mn, la Mw y el PDI. El PDI fue de 3.3, lo que indica que se había producido una reticulación durante el coliofilizado de ambos componentes.

Preparación de mezclas NHS-POx/RXL por mezcla en seco

[0163] Las mezclas de NHS-POx/RXL se prepararon de la siguiente manera: 2 g de polvo de RXL y 2 g de NHS-POx se mezclaron en seco mediante agitación en tambor durante 30 minutos. El polvo resultante se secó a presión reducida y se selló al vacío en una bolsa de aluminio.

[0164] El polvo se analizó mediante análisis de espectroscopía 1H-RMN. Para ello se añadió cloroformo deuterado (CDCh) que contenía ácido acético al 5 % (v/v) (1.0 ml) a 25 mg del granulado. El NHS-POx se extrajo selectivamente sometiendo la muestra a ultrasonidos durante 20 minutos. La dispersión se hizo pasar a través de un filtro de 0.22 |_im, se transfirió a un tubo de RMN y se registró un espectro 1H-RMN. A partir del espectro obtenido, se calculó que la cantidad de NHS sin reaccionar era del 100 por ciento en comparación con el NHS-POx.

[0165] La recuperación de NHS-POx en la muestra de RMN se determinó usando trimetilsilano como estándar interno y una curva de calibración construida a partir de espectros 1H-RMN de NHS-POx en diferentes concentraciones. Se midió que la recuperación total de NHS-POx era del 104 por ciento, lo que indica que no se formó material reticulado insoluble.

[0166] El polvo de NHS-POx/RXL se analizó adicionalmente mediante cromatografía de exclusión por tamaño. Por lo tanto, se tomó una alícuota (0.15 ml) de la solución utilizada para el análisis de espectroscopia 1 H-RMN. Esta solución se diluyó con N,N-dimetilacetamida con contenido de cloruro de litio 50 mM (1.00 ml), que fue el eluyente para el análisis SEC. La SEC se midió frente a estándares de poli(metil metacrilato) y a partir del cromatograma de exclusión por tamaño obtenido, se determinaron la Mn, la Mw y el PDI. El PDI no fue superior a 1.5, lo que indica que no se había producido ningún reticulado durante la mezcla en seco.

Preparación de gránulos reactivos de NHS-POx/RXL con contenido de carbonato

[0167] Primero, se preparó una mezcla 1:1 mol/mol de carbonato de sodio e hidrogenocarbonato de sodio disolviendo 25.31 g de carbonato de sodio y 20.06 g de hidrogenocarbonato de sodio en 350 ml de agua ultrapura. La solución se congeló instantáneamente en nitrógeno líquido y se liofilizó. El polvo resultante se secó a presión reducida y se selló al vacío en una bolsa de aluminio.

[0168] Los granulados de NHS-POx/RXL/carbonato se prepararon de la siguiente manera: se mezclaron 5 g de RXL-LS o RXL-HS y 0.178 g de carbonato de sodio/carbonato ácido de sodio utilizando un mezclador de alto cizallamiento. A continuación, se añadieron 5 g de NHS-POx azul que contenía aproximadamente 1-2 % p/p de IPA y se mezcló hasta obtener un polvo homogéneo. Después de mezclar, los granulados húmedos se secaron a presión reducida hasta que el contenido de IPA fue inferior al 0.1 % p/p según lo determinado mediante 1H-RMN. Los granulados secos se molieron en un molinillo de café hasta que el tamaño de partícula promedio no superara los 100 |_im (D [4,3]) y se sellaron al vacío en bolsas de aluminio.

Preparación de gránulos reactivos de NHS-POx/NH2-PEG

[0169] Se humedeció NHS-POx (6,9 g) con IPA en un mezclador de alto cizallamiento hasta que se obtuvo un polvo homogéneo similar a la nieve que contenía aproximadamente un 1-2 % p/p de IPA. Posteriormente, se añadieron 8.1 g de amina-PEG-amina, 2 brazos, MW 2k (de Creative PEGWorks) (relación molar de 1:1.16, refiriéndose dicha relación molar a la relación entre el número de grupos NHS proporcionados por NHS-POx y número de grupos amino proporcionados por la PEG-amina). El granulado formado se secó a presión reducida hasta que el contenido de IPA fue inferior al 0.1 % p/p según lo determinado mediante 1H-RMN. El granulado seco se molió en un molinillo de café hasta que el tamaño de partícula promedio no superara los 100 |_im (D [4,3]) y se selló al vacío en bolsas de aluminio.

[0170] El granulado NHS-POX/NH2-PEG se analizó utilizando espectroscopía 1H-RMN. Se disolvieron 25 mg de granulado en ácido trifluoroacético (0.20 ml) sometiéndolo a ultrasonidos durante 20 minutos. Después de la disolución completa del granulado, la muestra se diluyó con dimetilsulfóxido deuterado (DMSO-de) (0.80 ml), transferido a un tubo de RMN y se registró un espectro 1H-RMN. A partir del espectro obtenido, se calculó que la cantidad de NHS sin reaccionar era del 97 por ciento en comparación con el NHS-POx.

[0171] El granulado de NHS-POx/NH2-PEG se analizó adicionalmente mediante cromatografía de exclusión por tamaño. Se trataron 20 mg del granulado con anhídrido acético (1.00 ml) durante 1 hora a 50 °C. Posteriormente, se añadió metanol (2.00 ml) y la mezcla se agitó durante una hora más a 50 °C. Se tomó una alícuota (0.75 ml) y se eliminaron todos los volátiles a presión reducida. La muestra fue tomada en N,N-dimetilacetamida con contenido de cloruro de litio 50 mM (2.50 ml), que fue el eluyente para el análisis SEC. La SEC se midió frente a estándares de poli(metil metacrilato) y a partir del cromatograma de exclusión por tamaño obtenido, se determinaron la Mn, la Mw y el PDI. El PDI no fue superior a 1.5, lo que indica que no se produjo ninguna reticulación durante la granulación.

Preparación de gránulos de almidón/NHS-POx/NU-POx

[0172] Los siguientes polvos de almidón se produjeron mediante liofilización:

Polvo de NHS-POx/almidón

[0173] 2.79 g de almidón (Arista™ AH, BARD) se dispersaron en 50 ml de agua ultrapura utilizando un mezclador de alto cizallamiento. La dispersión se enfrió entre 2-8 °C y se añadieron 0.71 g de NHS-POx y se disolvieron con la ayuda de una mezcla de alto cizallamiento.

[0174] Inmediatamente después de la disolución del NHS-POx, la solución se congeló instantáneamente usando nitrógeno líquido y se liofilizó. El polvo resultante se secó a presión reducida y se selló al vacío en una bolsa de aluminio.

Polvo de NU-POx/almidón

[0175] 1.45 g de almidón (Arista™ AH, BARD) se dispersaron en 30 ml de agua ultrapura utilizando un mezclador de alto cizallamiento. Posteriormente, se añadieron 0.36 g de NU-POx y se dejaron disolver. Después de la disolución completa de NU-POx, la dispersión se congeló rápidamente usando nitrógeno líquido y se liofilizó. El polvo resultante se secó a presión reducida y se selló al vacío en una bolsa de aluminio.

Polvo de NU-POx/almidón/carbonato de sodio

[0176] 2.25 g de almidón (Arista™ AH, BARD) se dispersaron en 50 ml de agua ultrapura utilizando un mezclador de alto cizallamiento. Posteriormente, se añadieron 0.58 g de NU-POx y 0.25 g de carbonato de sodio y se dejaron disolver. Después de la disolución completa de NU-POx, la dispersión se congeló rápidamente usando nitrógeno líquido y se liofilizó. El polvo resultante se secó a presión reducida y se selló al vacío en una bolsa de aluminio.

[0177] Se prepararon dos granulados a partir de estos tres polvos. Los granulados de almidón/NHS-POx/NU-POx se prepararon de la siguiente manera:

Granulado de almidón 1:

[0178] 1.41 g de polvo de NHS-POx/almidón, 1.68 g de polvo de NU-POx/almidón y 0.20 ml de IPA se mezclaron utilizando un mortero. Después de obtener un granulado homogéneo, el IPA residual se eliminó a presión reducida hasta que el contenido de IPA fue inferior al 0.1 % p/p. El granulado seco se molió en un molinillo de café hasta que el tamaño de partícula promedio no superara los 100 |_im (D [4,3]) y se selló al vacío en bolsas de aluminio.

Granulado de almidón 2:

[0179] 1.20 g de polvo de NHS-POx/almidón, 1.45 g del NU-POx/almidón/carbonato de sodio en polvo 3 y 0.15 ml de IPA se mezclaron utilizando un mortero. Después de formar un granulado homogéneo, se eliminó el IPA residual a presión reducida hasta que el contenido de IPA fue inferior al 0.1 % p/p. El granulado seco se molió en un molinillo de café hasta que el tamaño de partícula promedio no superara los 100 |_im (D [4,3]) y se selló al vacío en bolsas de aluminio.

Preparación de gránulos reactivos de NHS-POx/Gelita Spon

[0180] 7.01 g de polvo de gelatina presecado (Gelita-SPONO, de Gelita Medical GmbH), con un contenido de agua inferior al 0.2 % p/p, se dispersaron en diclorometano (200 ml) utilizando un mezclador de alto cizallamiento que funcionaba a 20 000 rpm durante 20 minutos. Posteriormente, se añadió NHS-POx (7.02 g) y se continuó agitando durante 5 minutos. El NHS-POx no se disolvió. Todos los volátiles se eliminaron de la suspensión bajo presión reducida. El polvo obtenido se molió utilizando un molinillo de café hasta que el tamaño de partícula promedio no superara los 95 |_im (D [4,3]) y se selló al vacío en bolsas de aluminio, luego se secó bajo presión reducida y se selló al vacío en una bolsa de aluminio.

[0181] La distribución del tamaño de partícula de los granulados así obtenidos era aproximadamente: 90 % en volumen < 190 |_im, 50 % en volumen < 80 |_im y 10 % en volumen < 15 |_im.

[0182] El granulado se analizó mediante análisis de espectroscopía 1H-RMN. Para ello se añadió cloroformo deuterado (CDCh) que contenía ácido acético al 5 % (v/v) (1.0 ml) a 25 mg del granulado. El NHS-POx se extrajo selectivamente sometiendo la muestra a ultrasonidos durante 20 minutos. La dispersión se hizo pasar a través de un filtro de 0.22 |_im, se transfirió a un tubo de RMN y se registró un espectro 1H-RMN. A partir del espectro obtenido, se calculó que la cantidad de NHS sin reaccionar era del 97 por ciento en comparación con el NHS-POx.

[0183] El granulado se analizó adicionalmente por medio de análisis de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). Una alícuota (0.15 ml) del extracto NHS-POx filtrado descrito anteriormente se diluyó conN,N-dimetilacetamida con contenido de cloruro de litio 50 mM (1.00 ml), que fue el eluyente para el análisis SEC. La muestra fue analizada por SEC frente a estándares de poli(metil metacrilato) y el PDI fue de 1.45, lo que indica que no se había producido ninguna reticulación.

Preparación de gránulos reactivos de NHS-POx/quitosano

[0184] Los gránulos reactivos de NHS-POx/quitosano se prepararon como sigue: se humedecieron 5 g de polvo de NHS-POx con IPA en un mezclador de alto cizallamiento hasta que se obtuvo un polvo homogéneo similar a la nieve que contenía aproximadamente un 1-2 % p/p de IPA. Después de ello, se agregaron y mezclaron 5 g de polvo de quitosano (Shanghai Waseta International, grado DAC del 85 %). Después de mezclar, los granulados húmedos se secaron a presión reducida hasta que el contenido de IPA fue inferior al 0.1 % p/p según lo determinado mediante 1H-RMN. Los granulados secos se molieron en un molinillo de café hasta que el tamaño de partícula promedio no superara los 200 |_im (D [4,3]) y se sellaron al vacío en bolsas de aluminio. La distribución del tamaño de partícula de los granulados así obtenidos era aproximadamente: 90 % en volumen < 350 |_im, 50 % en volumen < 180 |_im y 10 % en volumen < 60 |_im.

[0185] El granulado se analizó mediante análisis de espectroscopía 1H-RMN. Para ello se añadió cloroformo deuterado (CDCh) que contenía ácido acético al 5 % (v/v) (1.0 ml) a 25 mg del granulado. El NHS-POx se extrajo selectivamente sometiendo la muestra a ultrasonidos durante 20 minutos. La dispersión se hizo pasar a través de un filtro de 0.22 |_im, se transfirió a un tubo de RMN y se registró un espectro 1H-RMN. A partir del espectro obtenido, se calculó que la cantidad de NHS sin reaccionar era del 95 por ciento en comparación con el NHS-POx.

[0186] La recuperación de NHS-POx en la muestra de RMN se determinó usando trimetilsilano como estándar interno y una curva de calibración construida a partir de espectros 1H-RMN de NHS-POx en diferentes concentraciones. Se midió que la recuperación total de NHS-POx era del 103 por ciento, lo que indica que no se formó material reticulado insoluble.

[0187] El granulado de NHS-POx/quitosano se analizó adicionalmente mediante cromatografía de exclusión por tamaño. Por lo tanto, se tomó una alícuota (0.15 ml) de la solución utilizada para el análisis de espectroscopía 1 H-RMN. Esta solución se diluyó con N,N-dimetilacetamida con contenido de cloruro de litio 50 mM (1.00 ml), que fue el eluyente para el análisis SEC. La SEC se midió frente a estándares de poli(metil metacrilato) y a partir del cromatograma de exclusión por tamaño obtenido, se determinaron la Mn, la Mw y el PDI. El PDI no fue superior a 1.5, lo que indica que no se había producido ninguna reticulación durante la granulación.

Preparación de mezclas NHS-POx/quitosano por coliofilización

[0188] Los polvos de NHS-POx/quitosano coliofilizados se prepararon de la siguiente manera: se disolvieron 2.5 g de polvo de quitosano (Shanghai Waseta International, grado DAC del 85 %) en 200 ml de una solución de ácido acético al 0.2 % v/v en agua ultrapura. El pH se ajustó a 4.5 mediante la adición de ácido acético y la solución se enfrió a 4°C. Posteriormente, se añadieron 2.5 g de NHS-POx y se disolvieron con ayuda de agitación de alto cizallamiento. Inmediatamente después de la disolución completa del NHS-POx, la solución se congeló instantáneamente en nitrógeno líquido y se liofilizó. El polvo resultante se secó a presión reducida y se selló al vacío en una bolsa de aluminio.

[0189] El granulado se analizó mediante análisis de espectroscopía 1H-RMN. Para ello se añadió cloroformo deuterado (CDCh) que contenía ácido acético al 5 % (v/v) (1.0 ml) a 25 mg del granulado. El NHS-POx se extrajo selectivamente sometiendo la muestra a ultrasonidos durante 20 minutos. La dispersión se hizo pasar a través de un filtro de 0.22 |_im, se transfirió a un tubo de RMN y se registró un espectro 1H-RMN. A partir del espectro obtenido, se calculó que la cantidad de NHS sin reaccionar era del 12 por ciento en comparación con el NHS-POx, lo que implica que se produjo reticulación y/o hidrólisis.

[0190] La recuperación de NHS-POx en la muestra de RMN se determinó usando trimetilsilano como estándar interno y una curva de calibración construida a partir de espectros 1H-RMN de NHS-POx en diferentes concentraciones. Se midió que la recuperación total de NHS-POx era del 11 por ciento (en consonancia con los resultados de RMN), lo que indica que se formó material reticulado insoluble.

[0191] El granulado de NHS-POx/quitosano se analizó adicionalmente mediante cromatografía de exclusión por tamaño. Por lo tanto, se tomó una alícuota (0.15 ml) de la solución utilizada para el análisis de espectroscopía 1 H-RMN. Esta solución se diluyó con N,N-dimetilacetamida con contenido de cloruro de litio 50 mM (1.00 ml), que fue el eluyente para el análisis SEC. La SEC se midió frente a estándares de poli(metil metacrilato) y a partir del cromatograma de exclusión por tamaño obtenido, se determinaron la Mn, la Mw y el PDI. Se determinó que el PDI era 5.4, lo que indica que tuvo lugar la reticulación.

Preparación de mezclas NHS-POx/quitosano por mezcla en seco

[0192] Las mezclas de NHS-POx/quitosano se prepararon de la siguiente manera: 2 g de polvo de quitosano (Shanghai Waseta International, grado DAC del 85 %) y 2 g de NHS-POx se mezclaron en seco mediante agitación en tambor durante 30 minutos. El polvo resultante se secó a presión reducida y se selló al vacío en una bolsa de aluminio.

[0193] El polvo se analizó mediante análisis de espectroscopía 1H-RMN. Para ello se añadió cloroformo deuterado (CDCh) que contenía ácido acético al 5 % (v/v) (1.0 ml) a 25 mg del granulado. El NHS-POx se extrajo selectivamente sometiendo la muestra a ultrasonidos durante 20 minutos. La dispersión se hizo pasar a través de un filtro de 0.22 |_im, se transfirió a un tubo de RMN y se registró un espectro 1H-RMN. A partir del espectro obtenido, se calculó que la cantidad de NHS sin reaccionar era del 99 por ciento en comparación con el NHS-POx.

[0194] La recuperación de NHS-POx en la muestra de RMN se determinó usando trimetilsilano como estándar interno y una curva de calibración construida a partir de espectros 1H-RMN de NHS-POx en diferentes concentraciones. Se midió que la recuperación total de NHS-POx era del 96 por ciento, lo que indica que no se formó material reticulado insoluble.

[0195] El polvo de NHS-POX/quitosano se analizó adicionalmente por medio de cromatografía de exclusión por tamaño. Por lo tanto, se tomó una alícuota (0.15 ml) de la solución utilizada para el análisis de espectroscopía 1 H-RMN. Esta solución se diluyó con N,N-dimetilacetamida con contenido de cloruro de litio 50 mM (1.00 ml), que fue el eluyente para el análisis SEC. La SEC se midió frente a estándares de poli(metil metacrilato) y a partir del cromatograma de exclusión por tamaño obtenido, se determinaron la Mn, la Mw y el PDI. El PDI no fue superior a 1.5, lo que indica que no se había producido ningún reticulado durante la mezcla en seco.

Estructuras portadoras fibrosas cohesivas

[0196] Se seleccionó el siguiente producto hemostático comercialmente disponible para su uso como estructuras portadoras fibrosas en la preparación de láminas adhesivas para tejidos (no según la invención reivindicada):

• Gelita Tuft-It®: Una estructura portadora fibrosa cohesiva que consta de ocho capas de fibras de gelfoam reticuladas reducidas. Las ocho capas, de aproximadamente 2 mm de espesor cada una, tienen unas dimensiones de 50 mm por 75 mm. El contenido de agua de Gelita Tuft-It® no es más del 15 %. El producto se secó en un horno de vacío durante varias horas a 40 °C para reducir el contenido de agua a no más del 2.0 % p/p (determinado gravimétricamente), antes de impregnarlo con partículas de aglomerado.

Experimentos de sangrado

[0197] Se utilizaron modelos de sangrado porcinoex vivoein vivoestandarizados para evaluar la eficacia hemostática. Todos los modelos utilizan heparina para aumentar el tiempo de coagulación de la sangre hasta aproximadamente 2 o 3 veces el tiempo de coagulación activada (ACT).

[0198]Modeloex vivo: modelo porcinoex vivoen tiempo real con un hígado fresco, perfundido con sangre fresca heparinizada procedente del matadero para imitarin vivosituaciones reales lo más fielmente posible. Los hígados se montan en una máquina de perfusión mediante la cual la oxigenación, el pH de la sangre, la temperatura y la presión arterial se mantienen dentro de los límitesin vivo. En el matadero se recogen dos hígados y 10 litros de sangre heparinizada (5000 unidades/l). Los hígados se transportan en hielo; la sangre a temperatura ambiente. En las dos horas posteriores a la recolección, se inspeccionan los hígados en busca de lesiones, que se cierran usando guantes y pegamento de cianoacrilato.

• Parámetros de perfusión: flujo 600 ml/min; presión 10-12 mmHg; temperatura 37 °C (+/- 1 °C);

carbógeno 0.25 litros por minuto

• Mediante una herramienta de abrasión plana, redonda y giratoria, se crea una herida sangrante circular (8 mm de diámetro) en la superficie del hígado, con una capa de goma para que la profundidad del sangrado perforado sea siempre de 3 mm.

• Después de perfundir adecuadamente el hígado (se verifica el color y la temperatura), las muestras se analizan de acuerdo con el siguiente procedimiento: cortar la muestra al tamaño correcto (2.7 por 2.7 cm); encender la cámara; marcar número de sitio en la cámara; realizar punción de biopsia de 8 mm; cortar la biopsia; eliminar la sangre de la hemorragia con gasas (2x); recoger la sangre durante 30 segundos en gasa prepesada; puntuar el sangrado (2 investigadores); aplicar polvo hemostático en el sitio de sangrado y usar una espátula de acero inoxidable para distribuir el polvo de manera uniforme; observar durante 5 min (comprobar y puntuar la adherencia y la coagulación) y repetir después de 30 minutos.

[0199]Modeloin vivo: La ruptura penetrante combinada estandarizada del bazo se inflige en cerdos anestesiados (cerdo doméstico, macho, intervalo de peso corporal: 40 kg, adulto). Se realiza una laparotomía de línea media para acceder al bazo y otros órganos. Mediante un bisturí se realizan n=3 (S1...S3) lesiones subcapsulares estandarizadas (10 mm x 10 mm). Los productos hemostáticos se aplican con presión suave mediante una gasa prehumedecida (solución salina) y se mantienen durante 1 min. Después de la aplicación del producto, se evalúa el tiempo hasta la hemostasia (TTH). Si TTH es igual a cero, significa que después de 1 minuto ya se ha logrado la hemostasia por presión.

Sistema de puntuación para granulados: Coagulación

[0200]

++++ Conseguida inmediatamente después de la aplicación

++ Conseguida <10 segundos después de la aplicación

+ Conseguida <30 segundos después de la aplicación

Conseguida en los 3 minutos posteriores a la aplicación.

- No conseguida

Sistema de puntuación para granulados: Adhesión 10 minutos después de la aplicación

[0201]

++++ Adhesión muy fuerte (los granulados coagulados apenas se pueden eliminar)

++ Fuerte adhesión (granulados coagulados difíciles de eliminar)

+ Fuerte adhesión (los granulados coagulados se pueden eliminar)

Adhesión moderada (granulados coagulados fáciles de eliminar)

/- Adhesión leve (granulados coagulados eliminados por el flujo sanguíneo)

- No conseguida

Sistema de puntuación para parches: Coagulación

[0202]

++++ Conseguida inmediatamente después del taponamiento

++ Conseguida <10 segundos después del taponamiento

+ Conseguida <30 segundos después del taponamiento

Conseguida en los 3 minutos posteriores al taponamiento.

/- Conseguida después de 3 minutos, segundo taponamiento aplicado

- No conseguida

Sistema de puntuación para parches: Adhesión 10 minutos después de la aplicación

[0203]

+++ Adhesión muy fuerte (el parche se rompe al quitarlo)

++ Adhesión fuerte (el parche se rompe al quitarlo)

+ Adhesión fuerte (el parche se puede quitar sin romperse)

Adhesión moderada (el parche se puede quitar sin romperse)

/- Adhesión leve (el parche se puede quitar sin romperse)

- No conseguida

Ejemplo 1

[0204] Las propiedades hemostáticas de los diferentes granulados reactivos se evaluaron en las pruebas de sangradoex vivoein vivodescritas anteriormente. Los resultados se resumen en la tabla 1 y la tabla 2.

Tabla 1

Tabla 2

Ejemplo 2

Impregnación de la estructura de los portadores con los aglomerados de partículas.

[0205] Mediante agitación mecánica, los parches Gelita Tuft-It® (50x75 mm, aproximadamente 0.71 g) se impregnaron con granulado de NHS-POx/NU-POx (1:0.6) teñido de azul. Se usó una máquina agitadora de pintura (VIBA PRO V de Collomix GmbH) para introducir el polvo (aprox. 0.75 g) en el parche. La matriz con el soporte de estructuras de portadoras se fijó en la máquina. La matriz se hizo vibrar verticalmente.

[0206] Las muestras impregnadas se colocaron en una placa de PMMA y se situaron en un horno en el que las muestras se sometieron a diferentes tratamientos térmicos. Para evaluar la fijación del polvo, las muestras se marcaron dos veces en la placa blanca de PMMA. Si no se liberaba polvo azul, el resultado se consideraba fijado. Los resultados se muestran en la tabla 3.

Tabla 3

[0207] El granulado NHS-POx/NU-POx es higroscópico. A temperatura ambiente y humedad relativa (HR) inferior al 40 %, las estructuras portadoras fibrosas se pueden impregnar en media hora de exposición, de forma reproducible. Sin embargo, si la impregnación se realiza, por ejemplo, a una HR del 75 % y a 25 °C, el granulado se vuelve pegajoso en cuestión de minutos, lo que da lugar a características de impregnación no homogéneas y no reproducibles.

Ejemplo 3 (no es según la invención reivindicada)

[0208] Se impregnaron parches hemostáticos (Gelita Tuft-It®; 50 x 75 mm, aprox. 0.7 g) con el granulado reactivo NHS-POx/NU-POx (1:0.6) descrito anteriormente. Se distribuyó un gramo del granulado por los parches como se describe en el ejemplo 2. A continuación, los parches hemostáticos se empaquetaron en bolsas de aluminio que contenían 1 g de sílice y se sellaron al vacío.

[0209] Los parches se cortaron en piezas de 2 cm x 2 cm y se probaron por triplicado en el modelo de perfusión hepáticaex vivo.El tiempo hasta la hemostasia (TTH) fue 0 (después de 1 minuto de presión) y no se observó resangrado durante los 30 minutos de tiempo de observación. También se encontró que el parche tenía una gran flexibilidad y propiedades de flexión.

[0210] Los parches también se evaluaron en el modelo porcino heparinizadoin vivo.Se encontró que tenían muy buenas propiedades de coagulación y adherencia. Las hemorragias activas se detuvieron de manera eficiente en resecciones de varios órganos: bazo, hígado y riñón. Un resumen de los resultados se muestra en la tabla 3.

Tabla 3

Ejemplo 4

[0211] Se impregnaron parches hemostáticos (Gelita Tuft-It®; 50 x 75 mm, aprox. 0.7 g) con NHS-POx/NU-POx/Pl88 2.5 %. Se distribuyó un gramo del granulado por los parches como se describe en el ejemplo 2. A continuación, los parches hemostáticos se empaquetaron en bolsas de aluminio que contenían 1 g de sílice y se sellaron al vacío.

[0212] Los parches se evaluaron en el modelo porcino heparinizadoin vivo.Se encontró que tenían muy buena coagulación y suficientes propiedades adhesivas: las propiedades adhesivas reducidas permitieron que el parche se quitara en una sola pieza, a diferencia de los parches idénticos que no incluían P188. Las hemorragias activas se detuvieron de manera eficiente en resecciones de varios órganos: bazo, hígado y riñón. Un resumen de los resultados se muestra en la tabla 4.

Tabla 4

Ejemplo 5 (no es según la invención reivindicada)

[0213] Gelita Tuft-It® (50 x 75 mm, aprox. 0.7 g) se impregnó con diferentes polvos de polímeros reactivos. Las propiedades hemostáticas de los parches así obtenidos se probaron en modelos de sangrado porcinoex vivoein vivodescritos anteriormente en este documento.

[0214] Las estructuras portadoras fibrosas se impregnaron con 1.4 g de polvo utilizando un dispositivo de agitación neumático. La lámina portadora fibrosa se hizo vibrar verticalmente. El motor del tipo de carrera larga (NTK 25 AL L, de Netter Vibration GmbH) se hizo funcionar a 6 bar, 11 Hz y una amplitud de 30 mm. Se usaron cuatro ciclos de 15 segundos para dispersar el polvo en la lámina. Los granulados se distribuyeron por todo el espesor de las láminas. También la distribución sobre la superficie de las láminas fue homogénea.

[0215] Se probaron siete granulados reactivos diferentes. Estos granulados contenían NHS-POx en combinación con un polímero nucleofílico soluble en agua. La preparación de estos granulados se ha descrito anteriormente en este documento.

[0216] Los granulados que se probaron se enumeran a continuación:

• NHS-POx/Gelita Spon

• NHS-POx/RXL (alto contenido de sal)

• NHS-POx/RXL (alto contenido de sal) que contiene carbonato

• NHS-POx/RXL (bajo contenido de sal)

• NHS-POx/NH2-PEG

[0217] Las diferentes combinaciones de estructura portadora fibrosa y polvos de polímeros reactivos que se probaron se muestran en la tabla 5.

Tabla 5

[0218] Los resultados obtenidos con estos parches en los modelos de sangrado porcinoex vivo e in vivose resumen en la tabla 6.

Tabla 6

Ejemplo comparativo A

[0219] Se dispersaron 7.03 g de NHS-POx en 50 ml de diclorometano (DCM). Se formó una mezcla turbia y se añadió lentamente IPA (4 ml) para obtener una solución transparente; se dispersaron 7.00 g de gelatina presecada (Gelita-SPONO, Gelita Medical GmbH) en DCM/IPA (150 ml/12 ml) utilizando un mezclador de alto cizallamiento que funcionaba a 20000 rpm a temperatura ambiente durante 20 minutos. Se añadió la solución de NHS-POx preparada y la dispersión se agitó a 20000 rpm durante 5 minutos. Posteriormente, todos los volátiles se eliminaron a presión reducida. El granulado formado se molió utilizando molinillo de café, se secó a presión reducida y se selló al vacío en una bolsa de aluminio.

[0220] El granulado se analizó mediante espectroscopía 1H-RMN y cromatografía de exclusión por tamaño. Los resultados así obtenidos mostraron que no había NHS-POx presente en el granulado de gelatina/NHS-POx, lo que indica que se había producido una reticulación completa entre el NHS-POx y la gelatina.

Ejemplo 6 (no es según la invención reivindicada)

[0221] Se realizaron experimentos para determinar el efecto del contenido de NU-POx del granulado reactivo de NHS-POx/NU-POx en el rendimientoin vivodel parche hemostático.

Método de impregnación

[0222] Se impregnaron parches hemostáticos (Gelita Tuft-ItO; 50 x 75 mm, aprox. 0.7 g) con gránulos reactivos de NHS-POx/NU-POx elaborados mediante granulación de acetona en proporciones molares de 1:0,10, 1:0.20 y 1:0.40, donde dicha proporción molar se refiere a la proporción entre el número de grupos NHS proporcionados por NHS-POx y el número de grupos amina proporcionados por NU-POx. Los mismos parches hemostáticos también se impregnaron con polvo NHS-POx reactivo.

[0223] Se distribuyó un gramo del granulado/polvo por los parches usando la máquina de laboratorio Fibroline SL-Preg. A continuación, los parches hemostáticos se fijaron, secaron y envasaron en bolsas de aluminio que contenían 1 g de sílice y se sellaron al vacío.

Máquina

[0224] La máquina de laboratorio Fibroline SL-Preg mueve partículas entre electrodos aplicando voltajes de hasta 40 kV a frecuencias de hasta 200 Hz durante un período de hasta 60 segundos. Las dos placas de electrodos tienen un tamaño de aproximadamente 50x40 cm. La placa superior está conectada a tierra.

[0225] Se utilizaron los siguientes ajustes estándar: 40 kV, 100 Hz, 20 segundos.

Matrices

[0226] Los polvos se dosificaron gravimétricamente en una matriz de PMMA impresa en 3D después de montar la matriz en la placa de electrodo inferior. La matriz se llenó con polvos de polímero reactivo utilizando una espátula de cartón o metal para raspar. La matriz medía 50 x 75 x 4 mm y contenía 22 x 33 = 726 pocillos cuadrados (dimensiones internas de cada pocillo: 2 x 2 x 2 mm). El volumen combinado de los 726 pocillos era de aproximadamente 5.8 ml.

Espaciador

[0227] Se colocó una máscara espaciadora encima de la matriz. El espaciador se utilizó para permitir que las partículas se movieran hacia arriba y hacia abajo cuando se sometían al campo eléctrico alterno. Si no se usa un espaciador, la penetración y la distribución a través del portador son limitadas. Para TUFT-IT se trataba de una máscara de 3 mm. Esto da como resultado una distancia de 3 4 mm = 7 mm de los electrodos.

[0228] El rendimientoin vivode los parches hemostáticos que contienen granulado NHS-POx:NU-POx (0, 10, 20 y 40 por ciento de grupos amina de NU-POx, el porcentaje se calcula sobre la base del número de grupos NHS proporcionados por el NHS-POx) o polvo NHS-POx se evaluó en un modelo porcino no heparinizadoin vivo.Los detalles de los parches que se probaron se muestran en la tabla 7.

Tabla 7

Pruebas in vivo

[0229] Las pruebas se realizaron en cerdos domésticos hembra adultos (40-50 kg). No se aplicó ningún agente anticoagulante. El rendimiento del parche se probó tanto en el bazo como en el hígado. El bazo o el hígado se localizaron y exteriorizaron según fue necesario a medida que avanzaba el periodo de prueba y se mantuvo su humedad natural cubriéndolos con esponjas empapadas en solución salina.

[0230] Se crearon diferentes tipos de lesiones:

• Hígado: abrasiones, punciones de biopsia y resecciones

• Bazo: Resecciones

[0231] Una sección del tamaño apropiado del parénquima hepático fue raspada/perforada para causar sangrado de moderado a severo. Las abrasiones hepáticas se crearon con bisturí quirúrgico y una plantilla de 1 x<1>cm2 y los punzones circulares con un punción de biopsia circular de 8 mm. Se crearon resecciones de hígado y bazo usando un bisturí quirúrgico.

[0232] El parche se aplicó inmediatamente después de la resección o escarificación del tejido:

• 2 piezas de x 2 cm para punciones de biopsia y abrasiones

• Parche completo de 7.5 x 5 cm para resecciones

[0233] Los parches probados se aplicaron sobre el tejido sangrante y se presionaron suavemente hacia abajo mediante compresión utilizando una gasa prehumedecida con solución salina. El taponamiento se aplicó durante un periodo inicial de 10 segundos seguido de intervalos posteriores de 30 segundos hasta un total de 5 minutos.

[0234] Se utilizó como referencia un parche TUFT-IT que no había sido impregnado (denominado TUFT-IT).

[0235] Los resultados de las pruebasin vivose resumen en la tabla 8.

Tabla 8

[0236] Los parches 1 a 4 mostraron una adhesión tisular muy fuerte, mientras que solo se observó una adhesión leve para el parche TUFT-IT.

[0237] Los parches 1 y 2 no mostraron más que una hinchazón muy limitada después de la aplicación. Los parches 3 a 4 mostraron más hinchazón, pero aún aceptable.

Ejemplo 7 (no es según la invención reivindicada)

[0238] Se impregnaron parches hemostáticos (Gelita Tuft-ItO; 50 x 75 mm, aprox. 0.7 g) con una solución de NHS-POx, polvo de NHS-POx o granulado de NHS-POx/NU-POx. El granulado de NHS-POx/NU-POx utilizado se preparó mediante granulación con acetona en una relación molar de 1:0.20 (véase el ejemplo 8).

[0239] Se preparó una solución de rociado que contenía NHS-POx disolviendo NHS-POx en una mezcla 1:1 de alcohol isopropílico y diclorometano (200 g/l). Los parches se impregnaron con 5 ml de esta solución de rociado usando un rociador de laboratorio de vidrio y aire a presión en un solo ciclo de rociado. La cantidad total de NHS-POx administrada de esta forma fue de 1 gramo por parche. Después de la impregnación, los parches se dejaron secar dentro de un horno a 40 °C durante 2 horas, después de lo cual se almacenaron en un desecador durante 2 días antes de envasarlos en bolsas de aluminio que contenían 1 g de sílice y se sellaron al vacío.

[0240] Además, los parches se impregnaron con 1 gramo de polvo de NHS-POx o 1 gramo del granulado de NHS-POx/NU-POx usando el procedimiento descrito en el ejemplo 8.

[0241] El rendimiento de los parches así preparados se probó por triplicado en el modelo de perfusión hepáticaex vivoen condiciones de sangrado leve (<20 ml/min) y grave (>50 ml/min). Mediante una herramienta de abrasión plana, redonda y giratoria, se creó una herida sangrante circular (8 mm de diámetro) en la superficie del hígado, con una capa de goma para que la profundidad del sangrado perforado fuera siempre de 3 mm. Los resultados se muestran en la tabla 9.

Tabla 9

Ejemplo 8

[0242] Los polvos hemostáticos se prepararon mezclando granulado de NHS-POx/NU-POx con un polvo de almidón hemostático (Arista™ AH, de<b>A<r>D). El granulado de NHS-POx/NU-POx utilizado se preparó mediante granulación con acetona en una relación molar de 1:0.20 (véase el ejemplo 8).

[0243] El granulado de NHS-POx/NU-POx se mezcló en un mortero con el polvo de almidón en una proporción de 80/20 y 90/10 p/p.

[0244] La capacidad de formación de gel de estas mezclas de polvo, el polvo de almidón puro y el granulado NHS-POx/NU-POx puro se evaluó de la siguiente manera:

• Los tubos de ensayo se cargaron con 20 mg de muestra de polvo.

• Se añadieron 250 |_il de sangre de oveja heparinizada y la mezcla se agitó inmediatamente durante 10 segundos usando un mezclador vórtex.

• Después de 2 minutos, los tubos de ensayo se colocaron boca abajo para determinar si se había formado un gel.

• En caso de que se hubiera formado un gel, se añadió 1 ml de agua al gel y después de 30 minutos se determinó si el gel aún estaba intacto.

[0245] Los resultados se muestran en la tabla 10.

Tabla 10

Claims

REIVINDICACIONES

1. Polvo hemostático que comprende al menos un 10 % en peso de aglomerados de partículas, donde dichos aglomerados de partículas tienen un diámetro en el rango de 1-500 |_im y comprenden:

(a) partículas de polioxazolina electrofílica que contienen polioxazolina electrofílica que porta al menos 3 grupos electrofílicos reactivos que son capaces de reaccionar con grupos amino en sangre bajo la formación de un enlace covalente; y

(b) partículas de polímero nucleofílico que contienen un polímero nucleofílico soluble en agua que porta al menos 3 grupos nucleofílicos reactivos que, en presencia de agua, son capaces de reaccionar con los grupos electrofílicos reactivos de la polioxazolina electrofílica bajo la formación de un enlace covalente entre la polioxazolina electrofílica y el polímero nucleofílico.

2. Polvo hemostático según la reivindicación 1, donde el polímero nucleofílico se selecciona entre proteína, quitosano, polioxazolina nucleofílica, polietilenglicol nucleofílico, polietilenimina y combinaciones de los mismos.

3. Polvo hemostático según la reivindicación 2, donde el polímero nucleofílico se selecciona entre gelatina, colágeno y combinaciones de los mismos.

4. Polvo hemostático según la reivindicación 3, donde el polímero nucleofílico es gelatina, preferentemente gelatina reticulada reducida.

5. Polvo hemostático según la reivindicación 2, donde el polímero nucleofílico es polioxazolina nucleofílica.

6. Polvo hemostático según la reivindicación 2, donde el polímero nucleofílico es el quitosano.

7. Polvo hemostático según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la polioxazolina electrofílica contiene al menos 8 grupos electrofílicos reactivos.

8. Polvo hemostático según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde los grupos electrofílicos reactivos de la polioxazolina electrofílica se seleccionan entre ésteres de ácido carboxílico, ésteres de sulfonato, ésteres de fosfonato, ésteres de pentafluorofenilo, ésteres de p-nitrofenilo, ésteres de p-nitrotiofenilo, grupos haluro de ácido, anhídridos, cetonas, aldehídos , isocianato, tioisocianato, isociano, epóxidos, grupos hidroxilo activados, olefinas, éteres de glicidilo, carboxilo, ésteres de succinimidilo, ésteres de sulfo succinimidilo, maleimido (maleimidilo), etenosulfonilo, ésteres de imido, acetoacetato, haloacetal, disulfuro de ortopiridilo, derivados de dihidroxifenilo, vinilo, acrilato, acrilamida, yodoacetamida y combinaciones de los mismos

9. Polvo hemostático según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde los aglomerados de partículas contienen al menos un 10 % en peso de la polioxazolina electrofílica y al menos un 10 % en peso del polímero nucleofílico.

10. Polvo hemostático según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la combinación de la polioxazolina electrofílica y el polímero nucleofílico constituye al menos el 50 % en peso de los aglomerados de partículas.

11. Polvo hemostático según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la relación entre el número total de grupos electrofílicos reactivos aportados por la polioxazolina electrofílica y el número total de grupos nucleofílicos reactivos aportados por el polímero nucleofílico se encuentra en el intervalo de 1:1.5 a 1.5 :1.

12. Método para preparar aglomerados de partículas hemostáticas de:

13. Método según la reivindicación 12, donde el líquido de granulación no acuoso contiene al menos un 60 % en peso de un disolvente orgánico seleccionado entre alcohol isopropílico, etanol, metanol, éter dietílico, heptano, hexano, pentano, ciclohexano, diclorometano, acetona y mezclas de los mismos.

14. Método según las reivindicaciones 12 o 13, donde el método comprende el paso de humedecer las partículas de polioxazolina electrofílica con el líquido de granulación no acuoso, seguido del paso de combinar las partículas de polioxazolina electrofílica humedecidas con las partículas de polímero nucleofílico.