ES2962588T3 - Proteínas de fusión de PD-1 y 4-1BB - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a proteínas de fusión que comprenden (a) un dominio extracelular que contiene un polipéptido derivado de PD-1 o CD40L en su extremo N; (b) un dominio transmembrana; y (c) un dominio intracelular que contiene un polipéptido derivado de 4-1 BB o CD28 en su extremo C-terminal. Además, se prevén proteínas de fusión con CD28 en el extremo N y CD40L en el extremo C. La presente invención también se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican dichas proteínas de fusión, vectores que contienen dichas moléculas de ácido nucleico y células huésped que contienen dichos vectores. La presente invención se refiere además a métodos para producir dichas células huésped. Finalmente, la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden dichas proteínas de fusión, moléculas de ácido nucleico, vectores y/o células huésped, particularmente para tratar enfermedades o trastornos asociados con la unión de PD-1/PD-L2 o CD40 y/o PD-L1. /Expresión de PD-L2 o CD40 como cáncer e infección viral crónica. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Proteínas de fusión de PD-1 y 4-1BB

La presente invención se refiere a proteínas de fusión que comprenden (a) un dominio extracelular que contiene un polipéptido derivado de PD-1 en su extremo N; (b) un dominio transmembrana derivado de PD-1, en donde dicho dominio transmembrana comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; y (c) un dominio intracelular que contiene un polipéptido derivado de 4-1BB en su extremo C, en donde dicho dominio intracelular comprende una secuencia de aminoácidos con 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácido comparada con la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 4, en donde dicha proteína de fusión es capaz de aumentar la tasa de proliferación de una célula T CD8+ cuando se transduce, transforma o introduce de otra manera en dicha célula T<c>D8+ tras estimulación de dicha célula T CD8+ con una célula diana PD-L1/L2+. La presente invención también se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican tales proteínas de fusión, vectores que contienen tales moléculas de ácido nucleico, y células huésped que contienen tales vectores. La presente invención además se refiere a métodos para producir tales células huésped. Por último, la presente invención se refiere a las proteínas de fusión, moléculas de ácido nucleico, vectores, y/o células huésped para uso en un método de tratar cáncer e infección vírica crónica.

La transferencia adoptiva de linfocitos infiltrantes de tumor (TIL) es una opción de terapia prometedora contra tumores (Rosenberg et al., Science (2015), 348: 62-68). Desafortunadamente, el aislamiento de TIL y su expansión no es posibles con todas las entidades tumorales. Por tanto, se desarrolló el concepto de ingeniería genética de células T con un receptor de células T (TCR) transgénico (Hurwitz et al., Cancer Microenviron (2014), 7: 1-9). No obstante, hasta la fecha, tales células T muestran supervivencia corta, y pierden su función en pacientes (Janicki et al., Cancer Res (2008), 68: 2993-3000; Bai et al., PNAS USA (2008), 105: 13003-13008; Bendle et al., Cancer Res (2004), 64: 8052 8056; Anderson et al., J Immunol (2007), 178: 1268-1276). La coestimulación de la cascada de señalización del TCR con receptores coestimuladores tal como CD28 puede aumentar la proliferación, supervivencia y citotoxicidad de las células T (Chen et al., Nat Rev Immunol (2013), 13: 227-242). Sin embargo, como los tumores epiteliales no expresan ligandos (CD80/86) del receptor coestimulador CD28 y las células T efectoras humanas son ellas mismas negativas para tales receptores, la coestimulación no puede tener lugar de la manera conservadora. Para proporcionar coestimulación a las células T que sea independiente de esta ruta clásica, se crearon receptores coestimuladores quiméricos. Consisten en el dominio extracelular del receptor coinhibidor PD-1 (también conocido como CD279) y el dominio de señalización de CD28 (Ankri et al., J Immunol (2013), 4121-4129; Prosser et al., Mol Immunol (2012), 263 272; documento WO 2013/019615). A este respecto, Tang et al. 2015 también especifica una proteína de fusión que comprende un dominio extracelular de PD-1 y que además comprende un dominio extracelular de 4-1BB y un dominio transmembrana de CD28 humano.

Habitualmente, la célula T específica de tumor expresa PD-1 en la superficie que después se une a su ligando PD-L1 expresado en células tumorales. Esta unión produce el bloqueo de la señalización del TCR y la activación de células T, produciendo así la inhibición de las células T específicas de tumor. Con el fin de coestimular la señalización del TCR (y, por tanto, aumentar la activación de células T), la estimulación de CD28 sería necesaria; véase anteriormente.

Los receptores coestimuladores quiméricos que comprenden dominios de PD-1 y CD28 mostrarán las funciones relevantes de ambos, la función de receptor extracelular de PD-1 por una parte, y la función de señalización intracelular de CD28, por otra parte. En tales construcciones quiméricas presentadas hasta ahora (Ankri, loc cit; Prosser, loc cit; documento WO 2013/019615), los dominios transmembrana se tomaron de la respectiva molécula de señalización.

Sin embargo, aunque se ha descrito que tales construcciones reducen la inhibición de células T mediada por PD-L1 y aumentan la activación de células T, tales construcciones aun dejan espacio para mejora adicional.

Este problema ha sido abordado por la presente invención como se describe en el presente documento y se define en las reivindicaciones.

Varias formas de realización de la invención se describen a continuación:

La presente invención se refiere en un primer aspecto a una proteína de fusión que comprende

(a) un dominio extracelular (ECD) que contiene un polipéptido derivado de PD-1 en su extremo N;

(b) un dominio transmembrana (t Md ) derivado de PD-1, en donde dicho dominio transmembrana comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; y

(c) un dominio intracelular (ICD) que contiene un polipéptido derivado de 4-1BB en su extremo C, en donde dicho dominio intracelular comprende una secuencia de aminoácidos con 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácido comparada con la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 4; en donde dicha proteína de fusión es capaz de aumentar la tasa de proliferación de una célula T CD8+ cuando se transduce, transforma o introduce de otra manera en dicha célula T CD8+ tras estimulación de dicha célula T CD8+ con una célula diana PD-L1/L2+.

La presente invención también se refiere a la proteína de fusión como se ha definido anteriormente, que además comprende un dominio CD3Z.

La presente invención también se refiere a la proteína de fusión como se ha definido anteriormente, en donde dicho dominio extracelular no comprende un enlazador o un dominio bisagra.

La presente invención también se refiere a la proteína de fusión como se ha definido anteriormente, en donde

(i) dicho polipéptido derivado de PD-1 comprendido por dicho dominio extracelular y/o por dicho dominio transmembrana es un polipéptido derivado de PD-1 humano; y/o

(ii) dicho polipéptido derivado de 4-1BB comprendido por dicho dominio intracelular es un polipéptido derivado de 4-1BB humano.

La presente invención también se refiere a la proteína de fusión como se ha definido anteriormente, en donde dicho dominio extracelular que contiene un polipéptido derivado de PD-1 comprende una secuencia de aminoácidos con 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácido comparada con la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 2, en donde dicha proteína de fusión muestra afinidad de unión a PD-L1/2, preferiblemente en donde dicho dominio extracelular comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

La presente invención además se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión como se ha definido anteriormente. Además, la invención se refiere a un vector que comprende dicha molécula de ácido nucleico, y a una célula huésped que comprende dicha molécula de ácido nucleico o dicho vector como se ha definido anteriormente. Además, la presente invención se refiere a la célula huésped como se ha definido anteriormente, en donde la célula huésped se transduce con dicha molécula de ácido nucleico o dicho vector. Además, la presente invención se refiere a dicha célula huésped como se ha definido anteriormente, en donde dicha molécula de ácido nucleico o dicho vector se integra de forma estable en el genoma de la célula huésped. En una forma de realización preferida, la presente invención se refiere a dicha célula huésped como se ha definido anteriormente que se transduce mediante transducción retrovírica. La presente invención también se refiere a dicha célula huésped como se ha definido anteriormente que expresa establemente la proteína de fusión codificada por la molécula de ácido nucleico como se ha definido anteriormente. La presente invención también se refiere a dicha célula huésped como se ha definido anteriormente que es una célula T CD8+.

En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un método de preparar la célula huésped como se ha definido anteriormente que comprende

(1 ) transducir una célula huésped con dicha molécula de ácido nucleico como se ha definido anteriormente o dicho vector como se ha definido anteriormente;

(2 ) cultivar la célula huésped transducida de la etapa (1 ) en un medio adecuado que permite el crecimiento de la célula y la expresión de la proteína de fusión codificada por dicha molécula de ácido nucleico o dicho vector; y (3) recoger la célula huésped del medio.

En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a la proteína de fusión, la molécula de ácido nucleico, el vector, la célula huésped como se ha definido anteriormente para uso en un método de tratar cáncer e infección vírica crónica.

Preferiblemente, según la presente invención, si el dominio extracelular (ECD) contiene un polipéptido derivado de PD-1 en su extremo N, el dominio intracelular (ICD) contiene un polipéptido derivado de 4-1BB en su extremo C como se ha definido anteriormente y viceversa.

Comparado con CD28, 4-1BB (CD137) es un receptor coestimulador presente en un subconjunto de células T capaz de aumentar la señalización de TCR. 4-1BB es un miembro de la superfamilia del receptor de factor de necrosis tumoral (TNFR) y está ausente en células T indiferenciadas, pero se induce después de la estimulación de células T y diferenciación a células efectoras (Cheuk at al., Cancer Gene Ther (2004), 11: 215-226). El dominio intracelular de 4-1BB contiene el motivo QEE, que, tras ligación con 4-1BBL, expresado en las CPA, recluta el factor 2 asociado a TNFR (TRAF2) (Arch et al., Mol Cell Biol (1998), 18: 558-565; Nam et al., J Immunol (2005), 174: 1898-1905). TRAF2 activa rutas de MAPK incluyendo ERK y activa la translocación nuclear de NF<k>B (Watts, Annu Rev Immunol (2005), 23: 23 68). Mediante ello aumenta la producción de citoquinas y la supervivencia de células T Según esto, la presente invención se refiere a proteínas de fusión (también denominadas en el presente documento “quiméricas”) que comprenden o consisten en el dominio extracelular (EDC) de PD-1 y el dominio de señalización intracelular (ICD) de 4-1BB definiéndose como que comprende una secuencia de aminoácidos con 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácido comparada con la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 4.

En general, en contexto con la presente invención, a menos que se especifique otra cosa en el presente documento, las proteínas de fusión que comprenden o consisten en el dominio extracelular (EDC) derivado de PD-1, un dominio transmembrana (TMD), y el dominio intracelular (ICD) derivado de 4-1BB también se denominan en el presente documento “PD-1:4-1BB” o “PD-1:BB”. Asimismo, las proteínas de fusión que comprenden o consisten en el dominio extracelular (EDC) derivado de PD-1, un dominio transmembrana (TMD), y el dominio intracelular (ICD) derivado de CD28 también se denominan en el presente documento “PD-1:CD28”. El índice "TM" o "tm" en contexto con las proteínas de fusión indica qué dominio transmembrana se usa para la respectiva construcción. Por ejemplo, “PD-1TM:BB” o “PD-1tm:BB” significa que la proteína de fusión comprende el dominio transmembrana de PD-1, mientras “PD-1:BBTM” o “PD-1:BBtm” significa la que proteína de fusión comprende el dominio transmembrana de 4-1BB.

Según la presente invención, se proporciona una proteína de fusión que comprende el dominio extracelular (ECD) de PD-1 (por ejemplo, PD-1), un dominio transmembrana (TMD) derivado de PD-1, y el dominio intracelular (ICD) de 4-1BB como se ha definido anteriormente. Como se ha encontrado sorprendentemente en contexto con la presente invención, las células T que expresan tal proteína de fusión PD-1:BB muestran tasas de proliferación aumentadas y más tempranas comparadas con células T que expresan proteínas de fusión PD-1:CD28 como se muestra ejemplarmente en xenoinjertos de melanoma humano.

Es decir, como se ha encontrado en contexto con la presente invención, un producto de fusión que comprende el ICD de 4-1BB (CD137) muestra efectos superiores en forma de tasas de proliferación aumentadas comparado con construcciones que comprenden el ICD de CD28 cuando se expresan en células T, por ejemplo, en xenoinjerto de melanoma humano.

Según esto, el ECD de la proteína de fusión descrita y proporcionada en contexto con la presente invención que tiene un ECD derivado de PD-1 preferiblemente tiene la función de unirse a PD-L1/2 en la superficie de las células tumorales que expresan PD-L1 como parte de un mecanismo de escape como se conoce en la técnica. Tras la unión del ECD de la proteína de fusión inventiva, el ICD de la proteína de fusión -que comprende un polipéptido derivado de 4-1BB-preferiblemente actúa como molécula se señalización activadora, aumentando de esta manera la proliferación de la célula huésped (por ejemplo, células T tal como célula T CD8+) y/o la secreción de citoquinas.

La proteína de fusión proporcionada según la presente invención puede además comprender un dominio CD3Z. Esto puede ser particularmente aplicable para casos donde la proteína de fusión no se expresa en una célula T o en general en una célula negativa para TCR o en casos donde TCR y/o CAR no se cotransducen (o en general coexpresan) en la célula que expresa la construcción de fusión de la presente invención. La secuencia de aminoácidos del ICD de CD3Z se puede tomar de bases de datos conocidas en la técnica (NP_932170). En general, CD3Z se puede preferiblemente introducir después del ICD de la proteína 4-1BB o CD28.

Las proteínas de fusión proporcionadas en el presente documento pueden comprender en particular en el extremo N un ECD que contiene un polipéptido derivado de PD-1, preferiblemente el ECD de PD-1 (por ejemplo, PD-1 humano o murino, preferiblemente humano). En este contexto, el término “derivado de” en particular significa que el polipéptido contenido en el ECD comprende al menos una parte de PD-1 (por ejemplo, PD-1 humano o murino, preferiblemente humano), preferiblemente el ECD de PD-1, respectivamente. Como se usa en el presente documento, el término “derivado de” PD-1 también permite que hasta 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más aminoácidos estén sustituidos, delecionados y/o insertados comparado con una secuencia nativa de PD-1 (PD-1 humano o murino, preferiblemente humano), o parte de la misma (por ejemplo, ECD). Como reconocerá fácilmente el experto en la materia, para el ECD de la proteína de fusión la secuencia del péptido señal (reconocible para los expertos en la materia y también representada en las SEQ ID NO específicas a que se hace referencia en el presente documento) habitualmente se corta en la proteína madura antes, durante o después de la integración de la proteína de fusión en la membrana. Es decir, cuando se hace referencia a proteínas de fusión o células huésped que expresan las proteínas de fusión como se describe y proporcionan en el presente documento, también siempre está abarcado según la presente invención que el ECD de la proteína de fusión pueda carecer del respectivo péptido señal.

En una forma de realización de la presente invención, la proteína de fusión comprende un ECD que contiene un polipéptido derivado de PD-1 comprende una secuencia de aminoácidos con hasta 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más sustituciones (preferiblemente sustituciones conservadoras o muy conservadoras), deleciones y/o inserciones de aminoácidos comparada con la secuencia de aminoácidos del ECD de PD-1 humano o murino, por ejemplo, de PD-1 humano como se representa en SEQ ID NO: 2 (con o sin el péptido señal como se representa en la figura 1 para SEQ ID NO: 2), en donde dicha proteína de fusión muestra afinidad de unión a PD-L1/2, respectivamente. Tal afinidad de unión se puede comparar a la afinidad de unión de PD-1 nativo (por ejemplo, PD-1 humano) a su respectivo ligando PD-L1/2. En contexto con la presente invención, con el fin de determinar si un polipéptido determinado muestra afinidad de unión a PD-L1/2 o no, un polipéptido que tiene una afinidad de unión a PD-L1/2 humano nativo que tiene al menos 0,8 veces, preferiblemente al menos 0,9 veces, o más preferiblemente al menos 1,0 veces tan alta comparada con la afinidad de unión de PD-1 humano nativo a PD-L1/2, se considera que muestra afinidad de unión a PD-L1/2, respectivamente. En este contexto, la afinidad de unión de un polipéptido determinado a PD-L1/2 se puede medir por métodos conocidos en la técnica y habitual y preferiblemente comprende la medida del valor de Kd (constante de disociación) que se expresa como una concentración molar. Tales métodos para medir interacciones de proteínas en términos de la K<d>se conocen bien en la técnica y comprenden, por ejemplo, ELISA, citometría de flujo, resonancia de plasmón de superficie, medidas de biacore, y similares.

En una forma de realización de la presente invención, la proteína de fusión comprende un ECD que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos del ECD de PD-1 según la SEQ ID NO: 2 (con o sin el péptido señal como se representa en la figura 1 para SEQ ID NO: 2).

El ECD de la proteína de fusión descrito y proporcionado en el presente documento puede además comprender una región bisagra y/o un enlazador en el extremo C del ECD (por ejemplo, entre el ECD y el TMD de la proteína de fusión, o entre el ECD y el ICD de la proteína de fusión donde el TMD está localizado C-terminal del ICD) con el fin de permitir más flexibilidad al ECD. Las regiones bisagra o enlazadoras típicas se conocen en la técnica y comprenden las derivadas de la región constante (Fc) de anticuerpos (por ejemplo, IgG1, CD8alfa) (véase, por ejemplo, Shirasu et al., Anticancer Res (2012), 32: 2377-2383 y Cartellieri et al., J Biomed Biotechnol (2010), 956304) (por ejemplo, espaciadores IgGFc), enlazadores Gly/Ser, o filamina (por ejemplo, espaciadores Fil3). Además, como tales regiones enlazadoras o bisagra también pueden producir efectos secundarios debido a la activación de células NK que secretan altas cantidades de citoquinas inflamatorias, puede ser deseable en contexto con la presente invención que las proteínas de fusión descritas y proporcionadas en el presente documento no comprendan regiones enlazadoras o bisagra. Es decir, en una forma de realización de la presente invención, el ECD de la proteína de fusión no comprende una región enlazadora o bisagra.

Las proteínas de fusión proporcionadas en el presente documento además comprenden un TMD operativamente unido entre el ECD y el ICD o unido en C-terminal del ICD. En general, el TMD no está limitado a un TMD específico. Preferiblemente, el TMD permite el anclaje estable de la proteína de fusión en la membrana de una célula que expresa la proteína de fusión (por ejemplo, una célula T) y además permite la unión del ECD a PD-L1/2, respectivamente, y, tras la unión a PD-L1/2, permite inducción de la señalización del ICD que contiene un polipéptido derivado de 4-1BB como se describe y ejemplifica en el presente documento. En contexto con la presente invención, el TMD deriva de PD-1, en donde dicho dominio transmembrana comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.

En una forma de realización de la presente invención, el TMD de la proteína de fusión no deriva de CD8(alfa), y/o ICOS. Si el ECD deriva de PD-1 y el ICD deriva de 4-1BB como se ha definido anteriormente, el TMD tampoco deriva de CD28, sino que deriva de PD-1, en donde dicho dominio transmembrana comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.

En una forma de realización de la presente invención, el TMD de la proteína de fusión comprende un polipéptido derivado de PD-1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, en particular donde el ECD es de PD-1 y el ICD es de 4-1BB como se ha definido anteriormente. En este contexto, el término “derivado de” en particular significa que el polipéptido contenido en el TMD comprende al menos una parte de PD-1 humano, en particular donde el ECD es de PD-1 y el ICD es de 4-1BB como se ha definido anteriormente. Como se usa en el presente documento, el término “derivado de” PD-1 también permite que hasta 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más aminoácidos estén sustituidos, delecionados y/o insertados comparado con una secuencia nativa de PD-1 humano o parte del mismo (por ejemplo, TMD).

Como se ha mostrado en contexto con la presente invención, las proteínas de fusión que tienen un ICD derivado de 4-1BB en general muestran tasas de proliferación superiores de las células huésped (por ejemplo, células T tal como células T CD8+) comparadas con construcciones similares que tienen un ICD derivado de CD28 y un ECD de PD-1. Además, las proteínas de fusión que comprenden un TMD derivado de PD-1 producen una tasa de secreción incluso mayor de citoquinas (por ejemplo, IFN<y>o IL-2) en células T transducidas comparadas con proteínas de fusión que comprenden un TMD derivado de 4-1BB. Según esto, en una forma de realización específica de la presente invención, el TMD de la proteína de fusión comprende o consiste en un polipéptido derivado de PD-1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.

Una proteína de fusión que comprende un TMD que contiene un polipéptido derivado de 4-1BB como se usa en la presente invención como comparación a las proteínas de fusión de la presente invención que comprenden un TMD derivado de PD-1 como se ha definido anteriormente, y además comprenden una secuencia de aminoácidos con hasta 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más sustituciones (preferiblemente sustituciones conservadoras o muy conservadoras), deleciones y/o inserciones de aminoácidos comparada con la secuencia de aminoácidos del TMD de 4-1BB humano o murino, por ejemplo, de 4-1BB humano como se representa en SEQ ID NO: 6 es capaz de aumentar la tasa de proliferación de una célula T CD8+ cuando se transduce retrovíricamente en dicha célula T CD8+ tras estimulación de dicha célula T CD8+ con una célula diana PD-L1/2+ como se describe y ejemplifica en el presente documento. La proliferación se puede cuantificar por dilución de colorante CFSE, es decir, la reducción de la intensidad de fluorescencia de CFSE medida por citometría de flujo (como se ejemplifica en la figura 5 y la descripción del método “Proliferación de células T TCR-D115...”, o cualquier otro método adecuado conocido en la técnica para determinar proliferación, por ejemplo, incorporación de H3 timidina, incorporación de BrdU, etc. Si la proliferación de la célula T CD8+ transducida retrovíricamente con la proteína de fusión determinada es mayor que 1,0, tal como al menos 1,2 veces, preferiblemente al menos 1,3 veces, más preferiblemente al menos 1,5 veces más alta comparada con la célula T CD8+ que no se transdujo con la proteína de fusión, la proteína de fusión se considera capaz de aumentar la proliferación. Usando el método de la dilución de CFSE, la diferencia en proliferación se puede calcular como la proporción de la actividad de fluorescencia media (IFM) entre las células T sin receptor quimérico (control) y células T que expresan una variante PD-1:BB o PD-1:CD28. Una proporción de IFM de 1,0 indica sin diferencia en proliferación, mientras una proporción de IFM de más de 1,0 indica proliferación.

Tal proteína de fusión usada como comparación comprende un TMD que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos del TMD de 4-1BB según SEQ ID NO: 6, en particular donde el ECD deriva de PD-1 y el ICD deriva de 4-1BB.

En una forma de realización de la presente invención, la proteína de fusión comprende un TMD que contiene un polipéptido derivado de PD-1 que comprende la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 8, en donde dicha proteína de fusión es capaz de aumentar la secreción de IFNy y/o IL-2 cuando se transduce retrovíricamente en una célula T CD8+ tras estimulación de dicha célula T CD8+ con una célula diana PD-L1/2+. La evaluación de si una proteína de fusión determinada es capaz de aumentar la secreción de IFNy y/o IL-2 cuando se transduce retrovíricamente en una célula T CD8+ tras estimulación de dicha célula T CD8+ con una célula diana PD-L1/2+ se puede realizar por métodos conocidos en la técnica y también como se describe y ejemplifica en el presente documento (cf. también “Cocultivo y ensayo de citoquinas” como se ejemplifica en el presente documento posteriormente). Con el fin de evaluar si una proteína de fusión determinada es capaz de aumentar la secreción de IFN<y>y/o IL-2, el nivel de secreción de IFN<y>y/o<i>L-2 de una célula T CD8+ transducida retrovíricamente con dicha proteína de fusión se compara con el nivel de secreción de IFN<y>y/o IL-2 de una célula T CD8+ comparable no transducida con dicha proteína de fusión. Para este fin, ambas células T CD8+ (una transducida con la proteína de fusión, la otra sin transducir) se estimulan con una célula diana PD-L1/2+ como se describe y ejemplifica en el presente documento seguido por medir el nivel de secreción de IFN<y>y/o IL-2. La célula T CD8+ transducida con la proteína de fusión y la célula T CD8+ control sin transducir habitualmente derivan del mismo donante. Por ejemplo, células T humanas transgénicas se pueden transducir retrovíricamente para expresar la proteína de fusión que contiene dicho polipéptido derivado de 4-1BB, después cultivar con células HEK/Tyr o HEK/Tyr/PD-L1 en una proporción 1:2. Los sobrenadantes del cocultivo después se pueden recoger después de 16 h y analizar por ELISA sándwich (BD) o Bio-Plex (Bio-Rad) según el protocolo del fabricante. En caso de que los TCR transducidos sean solo funcionales en células T CD8+ y la proporción de células T CD8+/CD4+ varíe, la cantidad de citoquina medida se puede normalizar al porcentaje de células T TCR+CD8+ en la suspensión celular (determinada por citometría de flujo), aplicando la siguiente fórmula:

concentración de citoquina medida citoquina producida por el 100% de células TTCR CD8+

% de células TTCR CD8 detectado por CFx<100>

Los métodos para medir el nivel de secreción de IFN<y>e IL-2 se conocen bien en la técnica y también se ejemplifican en el presente documento y comprenden, entre otros, ELISA, Bio-Plex, citometría de flujo intracelular (ICS), o similares. Si el nivel de secreción de IFN<y>y/o IL-2 de la célula T CD8+ transducida retrovíricamente con la proteína de fusión determinada es al menos 1,2 veces, preferiblemente al menos 1,3 veces, más preferiblemente al menos 1,5 veces mayor comparado con la célula T CD8+ que no se transdujo con la proteína de fusión, la proteína de fusión se considera capaz de aumentar la secreción de IFNy y/o IL-2.

Específicamente, como se ha mencionado anteriormente, en una forma de realización de la presente invención, la proteína de fusión comprende un TMD que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de PD-1 según SEQ ID NO: 8.

Las proteínas de fusión proporcionadas en el presente documento además comprenden un ICD operativamente unido al extremo C del TMD (en particular para proteínas de fusión donde el ECD es de PD-1 y el ICD es de 4-1BB), u operativamente unido al extremo C o N del TMD. El ICD de las proteínas de fusión inventivas contiene un polipéptido que deriva de 4-1BB (CD137). En este contexto, el término “derivado de” en particular significa que el polipéptido contenido en el ICD comprende al menos una parte de 4-1BB humano. Como se usa en el presente documento, el término “derivado de” 4-1BB también permite que hasta 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más aminoácidos estén sustituidos, delecionados y/o insertados comparado con una secuencia nativa de 4-1BB humano o parte de la misma (por ejemplo, ICD). Específicamente, el ICD de la proteína de fusión de la presente invención comprende un polipéptido derivado del ICD de 4-1BB, en donde dicho ICD comprende una secuencia de aminoácidos con 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos comparada con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.

Específicamente, la proteína de fusión de la presente invención comprende un ICD que contiene un polipéptido derivado de 4-1BB que comprende una secuencia de aminoácidos con hasta 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 sustituciones (preferiblemente sustituciones conservadoras o muy conservadoras), deleciones y/o inserciones de aminoácidos comparada con la secuencia de aminoácidos del ICD de 4-1BB humano representada en SEQ ID NO: 4, en donde dicha proteína de fusión es capaz de aumentar la tasa de proliferación de una célula T CD8+ cuando se transduce retrovíricamente en dicha célula T CD8+ tras estimulación de dicha célula T CD8+ con una célula diana PD-L1/2+ como se describe y ejemplifica en el presente documento.

En una forma de realización de la presente invención, la proteína de fusión comprende un ICD que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos del ICD de 4-1BB según SEQ ID NO: 4.

En una forma de realización, todos los dominios derivan de correspondientes dominios humanos. La proteína de fusión usada como comparación en la presente invención comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos con hasta 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 sustituciones (preferiblemente sustituciones conservadoras o muy conservadoras), deleciones y/o inserciones de aminoácidos comparada con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 (con o sin el péptido señal como se representa en la figura 1 para SEQ ID NO: 22), en donde dicha proteína de fusión muestra afinidad de unión a PD-L1/2 como se describe en el presente documento, y en donde dicha proteína de fusión es capaz de aumentar la tasa de proliferación de una célula T CD8+ cuando se transduce retrovíricamente en dicha célula T CD8+ tras estimulación de dicha célula T CD8+ con una célula diana PD-L1/2+ como se describe y ejemplifica en el presente documento.

En una forma de realización de la presente invención, la proteína de fusión proporcionada y descrita en el presente documento comprende o consiste en un ECD derivado de PD-1, un TMD derivado de PD-1, y un ICD derivado de 4-1BB como se define en el presente documento. En una forma de realización, todos los dominios derivan de los correspondientes dominios humanos. En una forma de realización específica, la proteína de fusión de la presente invención comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos con hasta 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 sustituciones (preferiblemente sustituciones conservadoras o muy conservadoras), deleciones y/o inserciones de aminoácidos comparada con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 (con o sin el péptido señal como se representa en la figura 1 para SEQ ID NO: 24), en donde dicha proteína de fusión muestra afinidad de unión a PD-L1/2 como se describe en el presente documento, y en donde dicha proteína de fusión es capaz de aumentar la secreción de IFN<y>y/o IL-2 cuando se transduce retrovíricamente en una célula T CD8+ tras estimulación de dicha célula T CD8+ con una célula diana PD-L1/2+ como se describe y ejemplifica en el presente documento. En este contexto, con el fin de evaluar si una proteína de fusión determinada es capaz de aumentar la tasa de proliferación de una célula T CD8+ así como aumentar el nivel de secreción de IFN<y>y/o IL-2 de dicha célula T<c>D8+ transducida retrovíricamente con dicha proteína de fusión se compara con la tasa de proliferación/el nivel de secreción de IFN<y>y/o IL-2 de una célula T CD8+ comparable no transducida con dicha proteína de fusión. Los métodos para evaluar las tasas de proliferación y secreción de IFNy y/o IL-2 se conocen en la técnica y se describen y ejemplifican en el presente documento anterior y posteriormente.

En una forma de realización específica adicional de la presente invención, la proteína de fusión comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 24 (con o sin el péptido señal como se representa en la figura 1 para SEQ ID NO: 24).

Se debe indicar que como se usa en el presente documento, las formas singulares “un”, “una”, “el” y “la”, incluyen referencias plurales a menos que el contexto claramente indique otra cosa. Así, por ejemplo, la referencia a “un reactivo” incluye uno o más de tales diferentes reactivos.

A menos que se indique de otra manera, el término “al menos” precediendo a una serie de elementos se debe entender que se refiere a cada elemento en la serie. Los expertos en la materia reconocerán, o podrán comprobar sin usar más que experimentación de rutina.

El término “y/o” siempre que se usa en el presente documento incluye el significado de “y”, “o” y “todos o cualquier otra combinación de los elementos conectados por dicho término”.

El término “alrededor de” o “aproximadamente” como se usa en el presente documento significa en el 20%, preferiblemente en el 10%, y más preferiblemente en el 5% de un valor o intervalo dado.

A lo largo de esta especificación y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera otra cosa, la palabra “comprender”, y variaciones tales como “comprende” y “que comprende”, se entenderá que implica la inclusión de un número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas enunciados, pero no la exclusión de cualquier otro número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas. Cuando se en el presente documento el término “comprender” se puede sustituir con el término “contener” o “ incluir” o algunas veces cuando se usa en el presente documento con el término “tener”.

Cuando se usa en el presente documento “consistir en” excluye cualquier elemento, etapa, o ingrediente no especificado en el elemento de reivindicación. Cuando se usa en el presente documento, “consistir esencialmente en” no excluye materiales o etapas que no afectan materialmente las características básicas y novedosas de la reivindicación.

Como se usa en el presente documento, sustituciones “conservadoras” significan sustituciones enumeradas como “Sustituciones ejemplares” en la tabla 1 a continuación. Sustituciones “muy conservadoras” como se usa en el presente documento significan sustituciones mostradas bajo el encabezamiento “Sustituciones preferidas” en la tabla I a continuación.

TABLA I. Sustituciones de aminoácidos

El término “polipéptido” se usa equitativamente en el presente documento con el término “proteína”. Las proteínas (incluyendo fragmentos de las mismas, preferiblemente fragmentos biológicamente activos, y péptidos, que habitualmente tienen menos de 30 aminoácidos) comprenden uno o más aminoácidos acoplados entre sí a través de un enlace peptídico covalente (que produce una cadena de aminoácidos). El término “polipéptido” como se usa en el presente documento describe un grupo de moléculas que típicamente comprenden más de 10 aminoácidos. Los polipéptidos pueden además formar multímeros tal como dímeros, trímeros y oligómeros superiores, es decir, consistir en más de una molécula de polipéptido. Las moléculas de polipéptidos que forman tales dímeros, trímeros etc., pueden ser idénticas o no idénticas. Las correspondientes estructuras de orden superior de tales multímeros, por consiguiente, se nombran homo- o heterodímeros, homo- o heterotrímeros, etc. Un ejemplo para un heteromultímero es una molécula de anticuerpo, que, en su forma natural, consiste en dos cadenas polipeptídicas ligeras idénticas y dos cadenas polipeptídicas pesadas idénticas. Los términos “polipéptido” y “proteína” también se refieren a polipéptidos/proteínas modificadas naturalmente en donde la modificación se efectúa, por ejemplo, por modificaciones postraduccionales como glucosilación, acetilación, fosforilación y similares. Tales modificaciones son bien conocidas en la técnica.

El término “aminoácido” o “residuo de aminoácido” como se usa en el presente documento típicamente se refiere a un aminoácido que tiene su definición reconocida en la técnica tal como aminoácido proteinogénico seleccionado del grupo que consiste en: alanina (Ala o A); arginina (Arg o R); asparragina (Asn o N); ácido aspártico (Asp o D); cisteína (Cys o C); glutamina (Gln o Q); ácido glutámico (Glu o E); glicina (Gly o G); histidina (His o H); isoleucina (He o I): leucina (Leu o L); lisina (Lys o K); metionina (Met o M); fenilalanina (Phe o F); prolina (Pro o P); serina (Ser o S); treonina (Thr o T); triptófano (Trp o W ); tirosina (Tyr o Y); y valina (Val o V), aunque se pueden usar aminoácidos modificados, sintéticos o raros según se desee. En general los aminoácidos se pueden agrupar como que tienen una cadena lateral no polar (por ejemplo, Ala, Cys, He, Leu, Met, Phe, Pro, Val); una cadena lateral cargada negativamente (por ejemplo, Asp, Glu); una cadena lateral cargada positivamente (por ejemplo, Arg, His, Lys); o una cadena lateral polar in carga (por ejemplo, Asn, Cys, Gln, Gly, His, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, y Tyr).

En general, como se usa en el presente documento, el término “proteína de fusión” se refiere a una proteína que está hecha de partes de polipéptido de diferentes fuentes. Según esto, también se puede entender como una “proteína quimérica”, una “construcción quimérica”, “construcción de fusión”, o similares. Habitualmente, las proteínas de fusión son proteínas creadas mediante la unión de dos o más genes (o preferiblemente ADNc) que originalmente codificaban proteínas separadas. La traducción de este gen de fusión (o ADNc de fusión) produce un único polipéptido, preferiblemente con propiedades funcionales derivadas de cada una de las proteínas originales. Las proteínas de fusión recombinantes se crean artificialmente por tecnología de ADN recombinante para uso en investigación biológica o terapéutica. En la técnica se conocen detalles adicionales para la producción de la proteína de fusión de la presente invención y se describen y ejemplifican en el presente documento.

La presente invención se refiere además a una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión proporcionada y descrita en el presente documento. La presente invención también se refiere a moléculas de ácido nucleico que solo codifican partes de la proteína de fusión descrita y proporcionada en el presente documento, por ejemplo, que codifican solo el ECD, el TMD, y/o el ICD de la proteína de fusión. La presente invención específicamente se refiere a moléculas de ácido nucleico según las secuencias SEQ ID NO: 1, 3, 7 o 23, o combinaciones de las mismas unidas a través de enlaces de ácido nucleico, siempre que se codifique una proteína de fusión según la presente invención o una parte de la misma (por ejemplo, el<e>C<d>, el TMD, y/o el ICD). La presente invención también se refiere a moléculas de ácido nucleico donde 30, 27, 24, 21, 18, 15, 12, 9, 6, 3, o 0 nucleótidos se han sustituido (preferiblemente mutaciones silenciosas que no producen un cambio del aminoácido traducido), delecionado o insertado comparadas con moléculas de ácido nucleico según las SEQ ID NO: 1, 3, 7 o 23, o combinaciones de las mismas unidas a través de enlaces de ácido nucleico, siempre que se codifique una proteína de fusión según la presente invención o una parte de la misma (por ejemplo, el ECD, el TMD, y/o el ICD). En principio, la presente invención preferiblemente se refiere a ácidos nucleicos que codifican proteínas de fusión específicamente descritas y representadas en el presente documento. Por ejemplo, las SEQ ID N<o>13 y 14 que no son parte de la proteína de fusión de la presente invención muestran la secuencia de ácido nucleico y aminoácidos humana de CD28, respectivamente, donde se representa el transcrito predominante de CD28. No obstante, dado que CD28 también existe en variantes de ayuste adicionales (por ejemplo, variante de donante de ayuste en el mismo marco de lectura o variantes que carecen de un exón codificante en el mismo marco de lectura), tales variantes o partes de las mismas (en particular el TMD de las mismas) también están abarcadas que son parte de la proteína de fusión descrita y proporcionada en el presente documento. En general, las SEQ ID NO 13 y 14 muestran la secuencia de ácido nucleico y aminoácidos humana de CD28, respectivamente, donde se representa el transcrito predominante de CD28.

Como se usa en el presente documento, a menos que específicamente se defina de otra manera, el término “ácido nucleico” o “molécula de ácido nucleico”, se usa de forma sinónima con “oligonucleótido”, “hebra de ácido nucleico”, “polinucleótido”, o similares, y significa un polímero que comprende uno, dos o más nucleótidos. El término “molécula de ácido nucleico” se refiere a la secuencia de bases que comprenden bases púricas y pirimidínicas que están comprendidas por polinucleótidos, por lo cual dichas bases representan la estructura primaria de una molécula de ácido nucleico. En el presente documento, el término “molécula de ácido nucleico” incluye todos los tipos de ácido nucleico, incluyendo, ADN, ADNc, ADN genómico, ARN, formas sintéticas de ADN y polímeros mezcla que comprenden dos o más de estas moléculas, y preferiblemente se refiere a ADN y ADNc. Como entienden fácilmente los expertos en la materia, las secuencias de ácido nucleico proporcionadas en el presente documento representan secuencias de ADN y también comprenden las correspondientes secuencias de ARN conde T se sustituye por U. El término “molécula de ácido nucleico” en general comprende hebras sentido y antisentido. “Molécula de ácido nucleico” puede además comprender bases de nucleótidos no naturales o derivatizadas, así como análogos de nucleótidos naturales o artificiales, por ejemplo, con el fin de proteger la molécula de ácido nucleico contra endo- y/o exonucleasas como apreciarán fácilmente los expertos en la materia.

La presente invención además se refiere a un vector que comprende la molécula de ácido nucleico descrita y proporcionada en el presente documento.

El término “vector” como se usa en el presente documento en general comprende todos los tipos de moléculas de ácido nucleico lineales o circulares que se puede replicar de forma autónoma en una célula huésped adecuada. Tales vectores comprenden, pero no están limitados a, plásmidos, cósmidos, fagos, virus (por ejemplo, vectores adeno-, adeno asociados, lenti-, o preferiblemente retrovíricos), y otros vectores o lanzaderas conocidos en la técnica que sean adecuados para transportar y transferir genes a células huésped con el fin de permitir traducción estable o transitoria y expresión constitutiva o condicional de la proteína de fusión inventiva en la célula huésped. El vector habitualmente no se integra en el genoma celular, pero también se puede integrar. Los vectores según la presente invención que comprenden moléculas de ácido nucleico como se describe y proporciona en el presente documento preferiblemente permiten la expresión estable de la proteína de fusión de la presente invención en la célula huésped (vectores de expresión). Los vectores de la presente invención pueden además comprender genes marcadores, secuencias promotoras y/o potenciadoras (operativamente unidas a la molécula de ácido nucleico de la presente invención), origen de replicación adecuado para la respectiva célula huésped, sitios de restricción, sitios de clonación múltiples, marcadores y unidades funcionales adicionales como se conoce en la técnica. Los vectores se pueden, entre otros, transferir a células huésped a través de una lanzadera tal como un virus (que puede considerarse él mismo un vector), o se pueden transformar o transducir desnudos en células huésped. El vector preferiblemente se adapta para adecuarse a la respectiva célula huésped en la se va a transformar o transducir. El experto en la materia entenderá fácilmente que diferentes células huésped requerirán diferentes tipos de vectores. Por ejemplo, como se muestra en el presente documento el vector (plásmido) pGEM es un vector adecuado para transformación en células bacterianas, mientras el vector retrovírico pMP71 es adecuado para transducción en células eucariotas (por ejemplo, células T).

En una forma de realización de la presente invención, el vector de la presente invención es un vector vírico, por ejemplo, un vector retrovírico o lentivírico, por ejemplo, un vector retrovírico. Los ejemplos para vectores retrovíricos adecuados se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, pMP71-PRE (Leisegang, K Mol Med (2008), 86(5): 573 583), SAMEN CMV/SRa, LZRS-id3-IHRES (Heemskerk et al., J. Exp. Med. 186 (1997), 1597-1602), FeLV (Neil et al., Nature 308 (1984), 814-820), SAX (Kantoff et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83 (1986), 6563-6567), pDOL (Desiderio, J. Exp. Med. 167 (1988), 372-388), N2 (Kasid et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87 (1990), 473-477), LNL6 (Tiberghien et al., Blood 84 (1994), 1333-1341), pZipNEO (Chen et al., J. lmmunol. 153 (1994), 3630-3638), LASN (Mullen et al., Hum. Gene Ther. 7 (1996), 1123- 1129), pGIXsNa (Taylor et al., J. Exp. Med. 184 (1996), 2031-2036), LCNX (Sun et al., Hum. Gene Ther. 8 (1997), 1041-1048), SFG (Gallardo et al., Blood 90 (1997), LXSN (Sun et al., Hum. Gene Ther.

8 (1997), 1041-1048), SFG (Gallardo et al., Blood 90 (1997), 952- 957), HMB-Hb-Hu (Vieillard et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94 (1997), 11595-11600), pMV7 (Cochlovius et al., Cancer Immunol. lmmunother. 46 (1998), 61-66), pSTITCH (Weitjens et al., Gene Ther 5 (1998), 1195-1203), pLZR (Yang et al., Hum. Gene Ther. 10 (1999), 123-132), pBAG (Wu et al., Hum. Gene Ther. 10 (1999), 977-982), rKat.43.267bn (Gilham et al., J. lmmunother. 25 (2002), 139-151), pLGSN (Engels et al., Hum. Gene Ther. 14 (2003), 1155-1168), pMP71 (Engels et al., Hum. Gene Ther. 14 (2003), 1155-1168), pGCSAM (Morgan et al., J. Immunol. 171 (2003), 3287-3295), pMSGV (Zhao et al., J. Immunol. 174 (2005), 4415 4423), o pMX (de Witte et al., J. Immunol. 181 (2008), 5128-5136). En una forma de realización específica de la presente invención, el vector es pMP71-PRE o pMP71.

La presente invención se refiere además a una célula huésped que comprende la molécula de ácido nucleico o el vector como se describe y proporciona en el presente documento. En una forma de realización, la célula huésped de la presente invención se transduce o transforma con la molécula de ácido nucleico o el vector como se describe y proporciona en el presente documento.

En general, como se usa en el presente documento a menos que específicamente se defina de otra manera, los términos “transducido” o “transformado” (así como “transducción” o “transformación”) o similares se pueden usar de forma intercambiable y en general significan cualquier tipo de transferencia de una molécula de ácido nucleico y/o vector a una célula huésped, independientemente del tipo de célula huésped e independientemente de la manera de transferencia (por ejemplo, transformación (química), transducción (vírica), electroporación, transfección, etc.).

La molécula de ácido nucleico y/o el vector se pueden integrar de forma estable en el genoma de la célula huésped, o ser extracromosómicos (es decir, expresión transitoria). Los ejemplos para métodos adecuados para lograr la expresión transitoria en una célula huésped se conocen en la técnica y comprenden transfección de ARNm. En una forma de realización, la molécula de ácido nucleico y/o el vector se integran establemente en el genoma.

La célula huésped descrita y proporcionada en contexto con la presente invención que comprende la molécula de ácido nucleico o el vector como se describe y proporciona en el presente documento es preferiblemente capaz de expresar (ya sea constitutiva o condicionalmente) de forma estable o transitoria (por ejemplo, estable) la proteína de fusión de la presente invención. La célula huésped en general se puede transducir o transformar por cualquier método con cualquier molécula de ácido nucleico o vector adecuado. En una forma de realización, la célula huésped se transduce con un vector retrovírico o lentivírico (por ejemplo, retrovírico) que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de la presente invención o partes de la misma (por ejemplo, ECD, TMD, y/o ICD) como se ha descrito anteriormente.

En una forma de realización, la célula huésped de la presente invención se transduce con un vector retrovírico que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de la presente invención o partes de la misma (por ejemplo, ECD, TMD, y/o ICD) como se ha descrito anteriormente y expresa (ya sea constitutiva o condicionalmente) de forma estable la proteína de fusión o parte de la misma. Preferiblemente, la célula huésped después expresa de forma estable la proteína de fusión en su membrana, con el ECD de la proteína de fusión de la presente invención dirigido hacia la superficie, el TMD está (en gran parte) embebido en la membrana, y el ICD dirigido al citoplasma.

En contexto con la presente, la célula huésped que comprende la molécula de ácido nucleico o el vector como se describe y proporciona en el presente documento se refiere a una célula genéticamente modificada en donde dicha molécula de ácido nucleico o dicho vector se transdujo, transformó o introdujo de otra manera en la célula huésped. Como ya se ha mencionado, la célula huésped de la presente invención puede ser una célula que expresa de forma transitoria o estable la proteína de fusión de la presente invención. Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de la presente invención se puede integrar de forma estable en el genoma de la célula por transducción retrovírica o lentivírica (por ejemplo, retrovírica). La proteína de fusión PD-1:BB se expresa en la membrana de la célula transducida proporcionada en el presente documento. El ECD de la parte PD-1 de la proteína de fusión se localizó en superficie celular, mientras el TMD y el ICD intracelular están unidos a la membrana, pero no son detectables en la superficie celular. La detección del ECD del polipéptido PD-1 se puede llevar a cabo usando un anticuerpo u otra molécula de unión que se une específicamente al ECD de PD-1 como se describe en el presente documento, por ejemplo, por ELISA, o por citometría de flujo, o microscopía. La célula transducida de la presente invención puede ser, por ejemplo, células T CD8+, células T c D4+, células T a/p dobles negativas, células NK (citolíticas naturales), células T y§, macrófagos, células dendríticas, así como células adecuadas para almacenar y/o reproducir la molécula de ácido nucleico o vector de la presente invención, incluyendo células bacterianas (por ejemplo,E. coli)y eucariotas adicionales. En una forma de realización, la célula huésped de la presente invención es una célula T, por ejemplo, una célula T CD8+.

La célula huésped de la presente invención se puede transducir con una molécula de ácido nucleico o un vector que codifica la proteína de fusión como se describe y proporciona en el presente documento. Preferiblemente, la célula huésped proporcionada y descrita en el presente documento se puede cotransducir con moléculas de ácido nucleico adicionales, por ejemplo, con una molécula de ácido nucleico que codifica un receptor de célula T (TCR) o un receptor de antígeno quimérico (CAR). Tal cotransducción (u otro método para introducir moléculas de ácido nucleico en células como se describe y ejemplifica en el presente documento) se conoce en la técnica y también se describe y ejemplifica en el presente documento.

Los ejemplos de células huésped adecuadas según la presente invención incluyen, pero no están limitadas a, células T, por ejemplo, células T CD8+, células T CD4+, células T TCR tal como (pero no limitadas a) TCR-T58 o TCR-D115, células T a/p dobles negativas, células NK (citolíticas naturales), células T y§, macrófagos, células dendríticas, así como células adecuadas para almacenar y/o reproducir la molécula de ácido nucleico o vector de la presente invención, incluyendo células bacterianas (por ejemplo,E. coli)y eucariotas adicionales. Las células pueden ser autólogas o no autólogas, pero preferiblemente son autólogas. Además, las células pueden ser alogénicas o no alogénicas como está enseguida claro para el experto en la materia. En una forma de realización, la célula huésped de la presente invención es una célula T, por ejemplo, una célula T CD8+.

La presente invención también se refiere a un método de preparar una célula huésped de la presente invención como se describe y proporciona en el presente documento, dicho método comprende

(1 ) transducir o transformar una célula huésped como se ha descrito anteriormente con una molécula de ácido nucleico o un vector como se describe y proporciona en el presente documento;

(2 ) cultivar la célula huésped transducida de la etapa (1 ) en un medio adecuado que permite el crecimiento de la célula y la expresión de la proteína de fusión codificada por dicha molécula de ácido nucleico o dicho vector; y (3) recoger las células huésped del medio.

En la presente invención, la célula huésped se transduce o transforma fuera del cuerpo humano. Los métodos para obtener, aislar y cultivar células (por ejemplo, células T tal como células T CD8+, células T CD4+, células T TCR tal como (pero no limitadas a) TCR-T58 o TCR-D115) de donantes (por ejemplo, donantes humanos) se conocen en la técnica y comprenden, entre otros, extracción de sangre o recogida de médula ósea.

Según el método de la presente invención, la célula huésped se puede transducir o transformar o ser provista de otra manera con una molécula de ácido nucleico o un vector como se describe y proporciona en el presente documento por cualquier método conocido en la técnica. Tales métodos comprenden, entre otros, transformación (química), transducción (vírica), electroporación, transfección, y similares. En una forma de realización la célula huésped se transduce con un vector retrovírico.

La célula huésped que se va a preparar según la presente invención puede ser cualquier célula huésped como se describe en el presente documento, En una forma de realización, la célula huésped es una célula T, por ejemplo, una célula T CD8+, célula T CD4+, célula T TCR tal como (pero no limitada a) TCR-T58 o TCR-D115.

No parte de la invención y solo presente como fines de ilustración es también una célula huésped obtenible mediante el método de preparación proporcionado en el presente documento.

La presente divulgación que no es parte de la invención y solo está presente como fines de ilustración comprende una composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión, una molécula de ácido nucleico, un vector, y/o una célula huésped como se describe y proporciona por la presente invención. Tal composición farmacéutica es adecuada para ser administrada a un paciente (preferiblemente, paciente humano), en particular al donante de las células huésped como se describe anteriormente. Según esto, la presente divulgación también comprende métodos para tratar una enfermedad o trastorno al administrar que comprende una composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión, una molécula de ácido nucleico, un vector, y/o una célula huésped como se describe y proporciona por la presente invención.

La composición farmacéutica de la presente divulgación que no es parte de la invención puede además comprender un soporte farmacéuticamente aceptable y componentes adicionales, por ejemplo, para galénica. La composición farmacéutica es particularmente útil para tratar enfermedades o trastornos asociados con la expresión de ligandos de PD-1 (por ejemplo, PD-L1 o PD-L2) y/o CD40. Tales enfermedades y trastornos los conoce el experto en la materia y comprenden en particular (pero no limitados a) diferentes tipos de cáncer tal como cáncer de pulmón, cáncer gástrico, cáncer de células renales, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer ovárico, cáncer urotelial, melanoma, cáncer pancreático, linfoma de Hodkin, retinoblastoma, leucemia, cáncer cervical, cáncer esofágico, glioma, linfoma no hodgkiniano, cáncer hepatocelular, cáncer oral, y otros. Enfermedades y trastornos adicionales que se pueden tratar por las composiciones farmacéuticas proporcionadas en el presente documento comprenden infecciones víricas (crónicas) e inflamaciones (crónicas), en particular para casos donde se expresa PD-L1/2 y/o CD40.

La presente divulgación que no es parte de la invención y está solo presente como fines de ilustración solo comprende además un kit o kit de partes que comprende una proteína de fusión, una molécula de ácido nucleico, un vector, y/o una célula huésped como se describe y proporciona en contexto con la presente invención.

Figuras

Leyenda general para secuencias a menos que se especifique otra cosa:

Negrita: péptido señal (habitualmente cortado en la proteína madura); Subrayado: TMD;Cursiva y negrita:ICD; LETRAS MAYÚSCULAS para secuencias de nucleótidos: secuencias con codones optimizados; SEQ ID NO 27-30 no son parte de la presente invención y están presentes como fines de ilustración solo.

Figura 1:

SEQ ID NO 1: secuencia de ácido nucleico de ECD de PD-1 humano

SEQ ID NO 2: secuencia de aminoácidos de ECD de PD-1 humano

SEQ ID NO 3: secuencia de ácido nucleico de ICD de 4-1BB humano

SEQ ID NO 4: secuencia de aminoácidos de ICD de 4-1BB humano

SEQ ID NO 5: secuencia de ácido nucleico de TMD de 4-1BB humano

SEQ ID NO 6: secuencia de aminoácidos de TMD de 4-1BB humano

SEQ ID NO 7: secuencia de ácido nucleico de TMD de PD-1 humano

SEQ ID NO 8: secuencia de aminoácidos de TMD de PD-1 humano

SEQ ID NO 9: secuencia de ácido nucleico de PD-1 humano

SEQ ID NO 10: secuencia de aminoácidos de PD-1 humano

SEQ ID NO 11: secuencia de ácido nucleico de 4-1BB humano

SEQ ID NO 12: secuencia de aminoácidos de 4-1BB humano

SEQ ID NO 13: secuencia de ácido nucleico de CD28 humano

SEQ ID NO 14: secuencia de aminoácidos de CD28 humano

SEQ ID NO 15: secuencia de ácido nucleico de PD-1 murino

SEQ ID NO 16: secuencia de aminoácidos de PD-1 murino

SEQ ID NO 17: secuencia de ácido nucleico de 4-1BB murino

SEQ ID NO 18: secuencia de aminoácidos de 4-1BB murino

SEQ ID NO 19: secuencia de ácido nucleico de CD28 murino

SEQ ID NO 20: secuencia de aminoácidos de CD28 murino

SEQ ID NO 21: secuencia de ácido nucleico de PD-1:BBTM humano

SEQ ID NO 22: secuencia de aminoácidos de PD-1:BBTM humano

SEQ ID NO 23: secuencia de ácido nucleico de PD-1TM:BB humano

SEQ ID NO 24: secuencia de aminoácidos de PD-1TM:BB humano

SEQ ID NO 25: secuencia de ácido nucleico de PD-1:CD28TM humano

SEQ ID NO 26: secuencia de aminoácidos de PD-1:CD28TM humano

SEQ ID NO 27: secuencia de aminoácidos de CD40L:CD28tm con enlazador Gly/Ser (G/S) y espaciador IgGFc:

PD1SP (péptido señal de PD-1, primera parte de secuencia subrayada)

EDC de CD40L (aa 113-261 de SEQ ID NO: 30)

enlazador GS (segunda parte de secuencia subrayada)

IgGFc(espaciador en negrita)

CD28TM (tercera parte de secuencia subrayada)

ICDde CD28 (aa 148-220, negrita cursiva)

SEQ ID NO 28: secuencia de aminoácidos de CD40L:CD28tm con enlazador Gly/Ser (G/S) y espaciador Fil3:

PD1SP (péptido señal de PD-1, primera parte de secuencia subrayada)

EDC de CD40L (aa 113-261 261 de SEQ ID NO: 30)

enlazador GS (segunda parte de secuencia subrayada)

Fil3(espaciador en negrita)

CD28TM (tercera parte de secuencia subrayada)

ICDde CD28 (aa 148-220, negrita cursiva)

SEQ ID NO 29: CD28:CD40Ltm con ICD de<c>D28 invertido en el extremo N, fragmento ICD de CD40 corto, TMD de CD40L y ECD de CD40L en el extremo C

CD40L (aa 14-261 de SEQ ID NO: 30)

ICDde CD28 invertido (negrita cursiva; aa 180-220)

SEQ ID NO: 30: secuencia de CD40L nativa

ICD(negrita cursiva)

TM (subrayado)

EDC

Figura 2: Diseño de receptores coestimuladores de PD-1 quiméricos

Los aminoácidos (aa) corresponden a las respectivas proteínas parentales humanas. Nótese que para el ECD de PD-1 , la secuencia del péptido señal se elimina y por tanto se representa la proteína madura.

Figura 3: Expresión de receptores quiméricos en células T TCR-T58+ CD8+ después de transducción retrovírica

Se transdujeron retrovíricamente células T humanas, que expresan de forma estable el receptor de células T específico de tirosinasa restringido a HLA.A2 TCR-T58, con vectores que codifican los receptores quiméricos indicados. Las células T se congelaron 15 días después de la transducción para uso posterior. La expresión de receptores en la superficie de células T se evaluó por citometría de flujo después de descongelar las células T y antes de que las células T se usaran en experimentos de cocultivo (3 días de cultivo en medio que contenía IL-2 50 U/ml). Se muestran histogramas de FAC<s>representativos que demuestran la expresión en superficie de PD-1:28tm, PD-1:BBtm y PD-1tm:BB determinado por tinción con anti-PD-1. Los números son el % de células positivas para el receptor y la correspondiente IFM. Los histogramas de línea negra y números negros corresponden a la tinción de isotipo, los histogramas de línea roja y números rojos corresponden a la tinción con PD-1.

Figura 4: Efecto de los receptores quiméricos sobre la secreción de citoquinas inducida por TCR

Se cocultivaron células T TCR-T58+ que expresaban los receptores quiméricos indicados (véase la figura 3) con (HEK/tyr) o HEK/tyr/PD-LI durante 16 horas. Los sobrenadantes se retiraron y el contenido de IFN<y>e IL-2 se determinó por ELISA. Los gráficos representan el efecto de la expresión de receptores quiméricos sobre la secreción de IFNy (izquierda) e IL-2 (derecha). Para cada experimento, se calculó el cambio x en veces en citoquina entre cocultivos con HEK/tyr y HEK/tyr/PD-LI. De todos los experimentos realizados (n = 2-3), se determinó la media del cambio x en veces y se presenta como diagrama de barras. Las barras de error son el EEM. El análisis estadístico empleó el análisis bifactorial de varianza (según Sidak). * p < 0,02 *** p < 0,0002; **** p < 0001; ns = no significativo.

Figura 5: Efecto de los receptores quiméricos sobre la proliferación de células T en el medio de xenoinjertos de melanoma humano en ratones NSG

Se inyectaron s.c. células de melanoma humano SK-Mel23 que expresaban el complejo péptido-MHC (pMHC) para células T TCR-D115 (HLA-A2/tirosinasa) en el flanco de ratones NSG inmunodeficientes. Células T TCR-T58+ marcadas con CFSE sin expresión de correceptor (transducidas control) y las que expresaban el receptor quimérico PD-1tm:BB o PD-1:CD28tm, respectivamente, se inyectaron por vía intratumoral en xenoinjertos establecidos (802 mm3, EEM ± 83, aprox. 17 días). 1 día, 2 días, 4 días, 6 días y 11 días después de la inyección de células T los tumores se recogieron, disociaron en suspensión de células individuales y se usaron para citometría de flujo. La intensidad de la tinción de CFSE se evaluó en células T (CD8+, CD4+ y células dobles negativas CD4-CD8- (dbl-)) como un medio para determinar su historia proliferativa en el medio tumoral. Las células T TCR-D115+ CD8+ pueden ser activadas por las células tumorales y adquieren un fenotipo dbl' debido a la activación. Las células T CD8+ y dbl' demostraron dilución de CFSE comparable y están representadas como una población. Las células T CD4+ no pueden reconocer las células de melanoma y, por tanto, no pueden experimentar proliferación específica de pMHC. La dilución de CFSE en células T CD4+ no se vio hasta 6 días después de la inyección de células T y lo más probablemente se produjo debido a las citoquinas producidas por las células T CD8+ activadas (no mostrado). Se muestran histogramas representativos de tinciones de CFSE de células T CD8+/dbl- después de 1 día y 2 días de inyección i.t. Cada histograma corresponde a un tumor de un ratón. Los números indican intensidad de fluorescencia media de CFSE. La línea vertical indica la intensidad de CFSE original indicativa para células que no habían empezado aún a proliferar. Se observó que en el día 1 y el día 2, las células T CD8+/dbl- que coexpresaban el receptor quimérico PD-1tm:BB tenían menor intensidad de CFSE comparadas con células T CD8+/dbl- sin receptor quimérico o que expresaban el receptor PD-1:CD28tm, respectivamente. El día 4, las células T CD8+/dbl- mostraron dilución de CFSE comparable independiente de la expresión de receptor quimérico (no mostrado). La dilución temprana de CFSE por células T que expresaban PD-1tm:BB indica que estas células T reaccionaban con las células tumorales más fuertemente e iniciaban la proliferación antes que las células T sin receptor quimérico o células T que expresaban el receptor PD-1:CD28tm.

2 líneas superiores (verdes) para TCR-D115/PD-1tm:BB

2 líneas centrales (rojas) para TCR-D115/PD-1:CD28tm

2 líneas inferiores (azules) para TCR-D115/control

Figura 6: Se inyectaron s.c. células de melanoma humano SK-Mel23 que expresaban el complejo péptido-MHC (pMHC) para células T TCR-D115 y TCR-T58 (HLA-A2/tirosinasa) en el flanco de ratones NSG inmunodeficientes. Células T TCR-D115 marcadas con CFSE sin expresión de correceptor (control) y las que expresaban el receptor quimérico PD-1tm:BB se inyectaron por vía intratumoral en xenoinjertos establecidos (802 mm3, EEM ± 83, aprox. 17 días). El volumen tumoral se midió antes de la inyección de células T y el día 2 y 7 después de la inyección usando un calibrador. El volumen tumoral se calculó usando la fórmula elipsoide modificada; volumen = (longitud * anchura2) * 0,52. Los ratones se sacrificaron y los tumores se disociaron en suspensión de células individuales y se contaron las células T por tumor mediante citometría de flujo (células CD45+ (g de tumor). N = 3 ratones por punto temporal y célula T. Como se muestra enA)las células T TCR-D115/PD-1tm:BB alcanzaron números celulares intratumorales mucho mayores el día 2 que las células T sin receptor quimérico, y los números eran todavía elevados el día 7. Al mismo tiempo que números celulares mayores, las células T TCR-D115/PD-1tm:BB alcanzaron buen control tumoral con reducción en el volumen del tumor comparado al volumen de partida el día 2, y todavía mejor control tumoral el día 7 (cambio en veces medio en el volumen tumoral de 1,7 comparado con 2 el día 7)(B).

Las siguientesfiguras 7 a 11no son parte de la invención y solo se presentan como fines de ilustración

Figura 7: Efectos proyectados de proteínas quiméricas CD40L:28 expresadas en células T humanas

1)Efecto de apoyo de actividad en cis sobre células T que expresan el transgén: la ligación de la proteína de fusión en células T induce señalización de CD28 y por tanto apoya señales de TCR, función efectora de LTC, y supervivencia, produciendo mejor destrucción del tumor.2)Efecto trans sobre células presentadoras de antígeno (CPA): la activación de CD40 en las CPA estimulará que las CPA secreten citoquinas (IL-12) y quimioquinas que aumentarán la función efectora de LTC.3)Efecto trans sobre el endotelio: la ligación de CD40 expresada en el endotelio tumoral producirá apoptosis endotelial, destruyendo de esta manera el soporte vascular del tumor.4)Efecto trans sobre células tumorales: la ligación de CD40 expresada en células tumorales producirá la apoptosis de células tumorales.

Figura 8: Se crean 3 construcciones con diferente enlazador y orientación de los dominios

1) CD40LFc:28; 2) CD40LFil:28; 3) CD40L:28i

Figura 9: Características de expresión de las construcciones CD40L:28 en células T humanas después de transducción retrovírica estable

Se transdujeron retrovíricamente células T humanas para expresar las proteínas quiméricas y la expresión de las proteínas en superficie se analizó el día 7 y el día 17. Mientras la expresión en superficie se detectó el día 7, la expresión desapareció hasta el día 17 concomitante con que las células T alcanzan un estado de reposo (Figura 9A). La expresión en superficie se alcanzó de nuevo después de activación específica de TCR (Figura 9B). Por tanto, estas proteínas quiméricas muestran presencia en superficie inducible de una manera que se ajusta con cuándo y dónde se requiere el soporte de la célula T

Figura 10: Las proteínas CD40L:28 quiméricas expresadas en células T pueden activar células B (efecto trans)Se cocultivaron células T con células B primarias en una proporción 1:1 durante 24 horas. Después de ello, las células se recogieron y analizaron para CD86 y Fas por citometría de flujo. Las barras representan la intensidad de fluorescencia media del marcador analizado en células B. El CD40L-ECD de las proteínas quiméricas era funcionalmente activo como se demostró por mayor expresión de CD86 y Fas observada en células B. Se vio un efecto similar para CD83, otro marcador de la activación de células B (no mostrado). Las 3 construcciones diferentes mostraron actividad escalonada, similar o mayor que la proteína CD40L nativa.

Figura 11: Las proteínas CD40L:28 quiméricas expresadas en células T TCR-T58 apoyan la función de células T (efecto cis)

Se cocultivaron células T transgénicas TCR-T58 sin proteína quimérica (crtl) o células T transgénicas TCR-T58 que expresaban CD40L nativa o proteínas quiméricas después de transducción retrovírica con líneas celulares de melanoma (SK-Mel23, FM86, positivas para el ligando de TCR y CD40). A) Se midió el IFN-<y>en sobrenadantes de cocoultivo de 48 h. B) La citotoxicidad contra células tumorales de melanoma se midió después de 4 h de cocultivo (ensayo de liberación de cromo). Los resultados representados son de una proporción efector:diana de 5:1. Como se puede ver en ambos ensayos, las células T que expresaban las proteínas quiméricas secretaron más IFN-y y mostraron mayor citotoxicidad contra las células tumorales comparadas con el ctrl. Por tanto, el CD28-ICD de las proteínas quiméricas es funcionalmente activo, es decir, aumenta la actividad efectora de las células T que expresan la proteína quimérica.

La presente invención se ilustra además mediante los siguientes ejemplos. No obstante, los ejemplos y formas de realización específicas descritas en los mismos no se deben interpretar como que limitan la invención a tales formas de realización específicas.

Ejemplos

Plásmidos que codifican receptores quiméricos

Se pidieron las secuencias de los receptores quiméricos a Geneart, Life Technologies. Se entregaron como un polvo liofilizado y se disolvieron en agua sin nucleasas a una concentración de 0,5 pg/pl. Para la amplificaciónE. coliTOP10 o MACH1 se transformaron químicamente con las construcciones de Geneart, siguiendo métodos de preparación de plásmidos estándar.

Electroporación de células T primarias humanas con ARNivt

Las secuencias de los receptores quiméricos se clonaron en pGEM para preparación de ARNitv. La clonación en el vector pGEM (proporcionado por S. Milosevic, Medigene GmbH, Martinsried, Alemania) se logró usando HindlII o HindlI y EcoRl (New England Biolabs). El ARNitv se generó de los plásmidos pGEM usando el kit mMESSAGEmMACHINE (Ambion) según el protocolo del fabricante. Las células T primarias humanas se electroporaron con 20 pg de ARNitv a 900 V durante 2,3 ms usando Gene Pulser Xcell (Bio-Rad).

Transducción retrovírica de células T primarias humanas

Las secuencias de los receptores quiméricos se clonaron en el vector pMP71-PRE (Leisegang 2008, loc. Cit, para transducción retrovírica). La transducción retrovírica de células T se logró como se ha descrito (Leisegang 2008, loc. cit.). Se sembraron CMSP humanas de donantes sanos en placas de 24 pocillos a una densidad celular de 1x106/ml por pocillo en RPMI1640 suplementado con suero humano al 10%, L-glutamina al 1%, aminoácidos no esenciales al 1%, piruvato de sodio al 1% y penicilina/estreptomicina al 1% (todos de Invitrogen) más IL-2100 U/ml (Cancernova) y se activó con OKT35 pg/ml (proporcionado por E. Kremmer, Helmholtz Center Múnich, Alemania) y anti-CD28 1 pg/ml (BD Pharmingen) durante 2 días.

Los retrovirus que codifican receptores quiméricos anfotrópicos se generaron como se ha descrito (Leisegang at al., Clin Cancer Res (2010), 16(8): 2333-2343) usando reactivo TranslT®-LT1 (Mirus) según el protocolo del fabricante. El sobrenadante de virus se recogió después de 48 h y se unió a placas recubiertas de RetroNectin® (10 |jg/mI, Takara) por centrifugación.

Se añadieron las CMSP, que se activaron durante 2 días, a placas recubiertas de virus durante 24 h, después se pasaron a placas recién recubiertas con virus y se cultivaron durante otros 3 días. Las CMSP transducidas se transfirieron a placas sin recubrir y se cultivaron durante al menos 12 días adicionales reduciendo la cantidad de IL-2 a 50 U/ml. La expresión de los receptores se determinó el día 12 después de la transducción usando un anticuerpo anti-PD-1 (BioLegend).

Cultivos celulares

Se generaron HEK/Tyr y HEK/Tyr/PD-L1 transduciendo células HEK293 HLA-A2+ para expresar tirosinasa (HEK/Tyr) o tirosinasa y PD-L1 (HEK/Tyr/PD-L1). Después de la transducción, las células HEK293 se clonaron por célula única y los clones se seleccionaron para expresión comparable de HLA-A2 y tirosinasa. Se hicieron crecer SK-Mel23 (regalo de M.C. Panelli, NIH, Bethesda, EE Uu ), HEK/Tyr y HEK/Tyr/PD-L1 en RPMI-1640 suplementado con L-glutamina al 1%, aminoácidos no esenciales al 1%, piruvato de sodio al 1% y penicilina/estreptomicina al 1% (RMPI básico) más SFT al 12%.

Citometría de flujo multiparámetro para determinar la expresión de receptores quiméricos y la proliferación de células T

El análisis de citometría de flujo se realizó en un LSRII (BD). Las células se tiñeron en PBS (Invitrogen) suplementado con suero humano al 2%, azida sódica al 0,1% y EDTA2 mM (ambos de Sigma-Aldrich). La expresión de receptores quiméricos humanos y TCR transgénicos se analizó usando anti-CD3-PE-Cy7, anti-región constante de TCRp de ratón-PB (ambos de BioLegend), anti-CD4-APC-A780, anti-PD-1-APC (ambos de eBioscience), anti-CD28-V500 (BD) y 7-AAD (Sigma-Aldrich).

Las células HEK293 se analizaron usando anti-HLA-A2 (ATCC HB54) más anti-IgG1 de ratón-A488 (Invitrogen), anti-PD-L1-FITC (BD), anti-tirosinasa (Upstate) más anti-IgG2a de ratón-A647 (Invitrogen) y 7-AAD.

Las células T después de la inyección en tumores de xenoinjerto se analizaron usando CFSE, anti-CD45-PE-Cy7, anti-CD8-PB (BD), CD4-APC-A780, anti-PD-1-APC y 7-AAD. Se seleccionaron leucocitos CD45+ y se analizó la intensidad de CFSE en células CD8+, CD4+ y dbl- después de la selección de poblaciones en células viables e individuales. Los datos se analizaron usando el software FlowJo 8.8.7.

Cocultivos y ensayos de citoquinas para evaluar los efectos de proteínas de fusión en células T

Células T humanas transgénicas TCR-T58 o TCR-D115 se electroporaron con ARNitv o se transdujeron con vectores retrovíricos para expresar receptores quiméricos, después se cultivaron con células HEK/Tyr y HEK/Tyr/PD-L1 en una proporción 1:2. Los sobrenadantes del cocultivo se recogieron después de 16 h y se analizaron por ELISA sándwich (BD) o Bio-PLex (Bio-Rad) según el protocolo del fabricante.

Puesto que los TCR transducidos T58 y D115 son solo funcionales en células T CD8+ y la proporción de células T CD8+/CD4+ variaba entre experimentos, la cantidad de citoquina medida se normalizó al porcentaje de células T TCR+CD8+ en la suspensión celular (determinado por citometría de flujo). Se aplicó la siguiente fórmula:

Ratones NSG

Los ratones NSG se obtuvieron de Charles River. Los ratones NOD/scid IL2Rgnull (NSG) se cruzaron sobre el fondo genético de ratones diabéticos no obesos (NOD) caracterizados por una inmunidad innata reducida. Los ratones NSG portan la mutación prkdcscid, una mutación de pérdida de función en el gen PRKDC, que produce reparación defectuosa de roturas de hebra de ADN durante la recombinación V(D)J en el desarrollo de células B y T. Esta inmunodeficiencia grave combinada (scid) se caracteriza por una reducción principal de células T y B. Además, los ratones NSG portan una mutación nula en la cadena gamma del receptor de IL-2 (IL2Rgnull) que bloquea la diferenciación de células NK. El deterioro de la inmunidad innata y la ausencia de inmunidad adaptativa hacen los ratones NSG un buen sistema modelo para terapia de células T adoptiva de xenoinjertos de tumores humanos.

Modelo de xenoinjerto de melanoma humano

Los experimentos con animales fueron aprobados por las autoridades locales y se realizaron según las regulaciones legales. Se inyectaron s.c. ratones macho, de 7-11 semanas de edad con 5 x 106 células de melanoma humano HLA-A2+ tirosinasa+ SK-Mel23 (regalo de Monica C. Panelli, NIH, Bethesda, EE UU). Esta línea de melanoma se seleccionó porque expresa PD-L1/2 así como HLA-A2 y tirosinasa, que se requieren para formar el ligando para TCR-D115 y TCR-T58 (Wilde et al., Blood (2009), 114: 2131-2139). Las células T que expresan TCR-D115 se seleccionaron para el experimento en ratones ya que pueden reconocer SK-Mel23 con baja avidez que no es suficiente para erradicar tumores establecidos.

Los tumores se hicieron crecer durante aproximadamente 16 días hasta que alcanzaron un tamaño de 802 mm3 (EEM = ± 83). El tamaño tumoral (mm3) se calculó usando la fórmula para determinar volúmenes elipsoidales: n /6 x longitud x anchura x altura.

Proliferación de células T TCR-D115 en el medio tumoral de xenoinjertos de SK-Mel23 humanos

Se usan colorantes rastreadores celulares, es decir, CFDA-SE, para evaluar la proliferación celular. Permean las membranas celulares y se convierten a ésteres succinimidílicos de carboxifluoresceína fluorescentes (es decir, CFSE). Con cada división celular la intensidad de fluorescencia de CFSE se reduce a la mitad lo que permite seguir la proliferación de células T

Aquí, las células T TCR-D115 con o sin expresión de receptores quiméricos se marcaron con CFDA-SE 0,15 pM durante 8 minutos a 37°C. La reacción se paró con SFT, las células T se lavaron dos veces con PBS y se resuspendieron en PBS a una concentración de 10 x 107 células por ml. Se inyectaron i.t. 50 pl de suspensión de células T en xenoinjertos de SK-Mel23 s.c. establecidos (802 mm3, EEM = ± 83).

Los tumores se recogieron 1, 2, 4, 6 y 11 días después de la inyección i.t. Se prepararon suspensiones de células individuales por digestión mecánica y enzimática (Prinz et al., J Immunol (2012), 188: 5990-6000) y se usaron para análisis de citometría de flujo.

Ensayo de liberación de cromo

Se usaron células de melanoma marcadas con 51Cr como dianas a un número de células constante de 2000 células por pocillo en placas de 96 pocillos de fondo en V. Los experimentos se realizaron con medidas duplicadas de titulaciones de cuatro etapas de células efectoras. En pocillos paralelos, las células diana se incubaron sin células T para determinar la liberación espontánea de [51Cr]. Los sobrenadantes se recogieron después de 4 h y se transfirieron a placas de conteo (PerkinElmer) para medida de cpm. Las cpm máximas se determinaron transfiriendo directamente las células diana marcadas al conteo para medidas de cpm. El porcentaje de lisis específica se calculó como sigue: % de lisis específica = (cpm experimental - cpm espontánea)/(cpm máxima - cpm espontánea) x 100.

Estadística

Las pruebas estadísticas, como se indica en las leyendas de las figuras. Se realizaron usando el software GraphPad Prism 6.

Resultados

Los resultados se muestran en las figuras.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una proteína de fusión que comprende

(a) un dominio extracelular que contiene un polipéptido derivado de PD-1 en su extremo N;

(b) un dominio transmembrana derivado de PD-1, en donde dicho dominio transmembrana comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; y

(c) un dominio intracelular que contiene un polipéptido derivado de 4-1BB en su extremo C, en donde dicho dominio intracelular comprende una secuencia de aminoácidos con 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 sustituciones, deleciones, y/o inserciones de aminoácidos comparada con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4,

en donde dicha proteína de fusión es capaz de aumentar la tasa de proliferación de una célula T CD8+ cuando se transduce, transforma o introduce de otra manera en dicha célula T CD8+ tras estimulación de dicha célula T CD8+ con una célula diana PD-L1/L2+.

2. La proteína de fusión de la reivindicación 1, que además comprende un dominio CD3Z.

3. La proteína de fusión de la reivindicación 1 o 2, en donde dicho dominio extracelular no comprende un enlazador o una región bisagra.

4. La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde

(i) dicho polipéptido derivado de PD-1 comprendido por dicho dominio extracelular y/o dicho dominio transmembrana es un polipéptido derivado de PD-1 humano; y/o

(ii) dicho polipéptido derivado de 4-1BB comprendido por dicho dominio intracelular es un polipéptido derivado de 4-1BB humano.

5. La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho dominio extracelular que contiene un polipéptido derivado de PD-1 comprende una secuencia de aminoácidos con 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 sustituciones, deleciones, y/o inserciones de aminoácidos comparada con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2,

en donde dicha proteína de fusión muestra afinidad de unión a PD-L1/2, preferiblemente en donde dicho dominio extracelular comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

6. Una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

7. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 6.

8. Una célula huésped aislada que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 6 o el vector de la reivindicación 7.

9. La célula huésped de la reivindicación 8, en donde la célula huésped se transduce con la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 6 o el vector de la reivindicación 7.

10. La célula huésped de la reivindicación 8 o 9, en donde dicha molécula de ácido nucleico o dicho vector se integra de forma estable en el genoma de la célula huésped.

11. La célula huésped de la reivindicación 9 que se transduce mediante transducción retrovírica.

12. La célula huésped de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 que expresa establemente una proteína de fusión codificada por la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 6.

13. La célula huésped de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 que es una célula T CD8+.

14. Un método de preparar una célula huésped de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 que comprende (1 ) transducir una célula huésped con una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 6 o un vector de la reivindicación 7;

(2 ) cultivar la célula huésped transducida de la etapa (1 ) en un medio adecuado que permita el crecimiento de la célula y la expresión de la proteína de fusión codificada por dicha molécula de ácido nucleico o dicho vector; y

(3) recoger la célula huésped del medio.

15. La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 6, el vector de la reivindicación 7, la célula huésped de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13 para su uso en un método de tratar cáncer e infección vírica crónica.