ES2963242T3 - Conjunto de sondas para analizar una muestra de ADN y método para utilizar el mismo - Google Patents
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Abstract
Esta divulgación proporciona, entre otras cosas, un complejo ligable de fórmula XABZ, en donde en el complejo las secuencias X, A, B y Z están ligablemente adyacentes entre sí y se mantienen en posición mediante un oligonucleótido de férula, y en donde la secuencia A es un fragmento diana de En un genoma, la secuencia B identifica el locus del que se deriva la secuencia A adyacente. El complejo ligable se puede utilizar para identificar una aneuploidía cromosómica en ADN libre de células, por ejemplo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Conjunto de sondas para analizar una muestra de ADN y método para utilizar el mismo
Antecedentes
El ADN libre circulante ("ADNlc"; en inglés, cfDNA) se puede analizar para proporcionar un pronóstico, diagnóstico o una predicción de una respuesta a un tratamiento para una variedad de enfermedades y afecciones, incluyendo diversos tipos de cáncer, fracaso o éxito de trasplantes, enfermedades inflamatorias, enfermedades infecciosas y aneuploidías fetales.
El ADN fetal libre circulante (ADNflc; en inglés, cffDNA) está presente en la sangre de una mujer embarazada. Este descubrimiento condujo a la posibilidad de realizar pruebas prenatales no invasivas (PPNI; en inglés, NIPT) de un feto, utilizando una muestra de sangre de la mujer embarazada. Las pruebas prenatales invasivas (por ejemplo, amniocentesis o muestreo de vellosidades coriónicas (CVS, por sus siglas en inglés)) pueden resultar estresantes para la madre y algunos creen que tales procedimientos pueden aumentar el riesgo de aborto espontáneo. Las PPNI pueden proporcionar información relacionada con una variedad de defectos genéticos, incluyendo síndrome de Down (trisomía cromosoma 21), síndrome de Patau (trisomía 13) y síndrome de Edwards (trisomía 18). Tales métodos deben ser muy sólidos, dado que un falso positivo puede dar lugar a procedimientos médicos innecesarios y un falso negativo puede privar a la futura madre de la comprensión de las opciones médicas disponibles.
Hay muchos obstáculos técnicos asociados con la implementación de una prueba prenatal no invasiva a escala clínica. Por ejemplo, muchos esfuerzos de PPNI se han centrado en el análisis de ADNflc para identificar cambios en el número de copias en secuencias particulares (por ejemplo, secuencias del cromosoma 21). Sin embargo, tales métodos son difíciles de implementar de manera robusta porque, en parte, la gran mayoría de ADNlc en una muestra de sangre es de origen materno y en muchos casos solo una cantidad muy pequeña (por ejemplo, en promedio ~ 10 % y hasta alrededor de un 3 %) proviene del feto. Por ejemplo, la presencia o ausencia de una copia adicional de un cromosoma (tal como el cromosoma 21) en el feto puede determinarse comparando el número de copias de las secuencias correspondientes al cromosoma 21 con el número de copias de las secuencias correspondientes a un cromosoma autosómico. Si bien estos métodos suenan atractivos, de hecho, son un desafío porque la concentración fraccionaria de ADN fetal en relación con el ADN materno en la sangre materna puede ser tan baja como un 3 %. De este modo, por cada 1000 secuencias correspondientes al cromosoma 21 que se encuentran en el torrente sanguíneo materno, sólo un pequeño porcentaje de esas secuencias (por ejemplo, 30 secuencias si la fracción fetal es de un 3 %) son del feto. Por tanto, una copia adicional de un cromosoma en el feto solo conducirá a un aumento relativamente pequeño en el número de secuencias correspondientes a ese cromosoma en el torrente sanguíneo materno. Por ejemplo, si la fracción fetal es 4, la trisomía 21 fetal solo dará lugar a un aumento de un 1,5% en el número de fragmentos correspondientes al cromosoma 21 en el torrente sanguíneo materno. Como resultado de este problema, el rigor estadístico solo se puede lograr contando un gran número de secuencias correspondientes a una región cromosómica que se sospecha que tiene una diferencia en el número de copias (por ejemplo, al menos 1000 y a veces, al menos 5000 o más secuencias) y comparar ese número con un número similar para otra región cromosómica que no se sospeche que tenga una diferencia en el número de copias. Ser capaz de contar fragmentos de forma coherente y precisa es primordial para el éxito de muchos métodos de PPNI.
Algunos métodos de PPNI utilizan la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) para amplificar el ADN. La PCR es ampliamente utilizada, pero adolece de diversas limitaciones que pueden afectar negativamente la precisión de los resultados. La PCR puede introducir artefactos de secuencia y crear un sesgo de amplificación en una muestra. Los artefactos de secuencia de PCR son errores introducidos en la secuencia de ADN del producto amplificado de PCR por la reacción de PCR. Los artefactos de la secuencia de PCR pueden ser causados por diversos eventos, tales como por la formación de moléculas quiméricas (por ejemplo, dos piezas diferentes de ADN unidas de extremo a extremo), la formación de ADN heterodúplex (por ejemplo, la hibridación de dos moléculas de ADN diferentes entre sí) y por errores cometidos por la enzima de amplificación (por ejemplo, por la Taq ADN polimerasa colocando un nucleótido desapareado en el molde de ADN). El sesgo de secuencia de la PCR es un sesgo de la distribución de los productos de la PCR en comparación con la muestra original. Diversos eventos pueden provocar el sesgo de secuencia de la PCR, tales como las diferencias intrínsecas en la eficiencia de amplificación de los moldes o la inhibición de la amplificación debido a la autohibridación de los moldes de ADN. Los errores de la PCR dan como resultado una amplificación desigual de las diferentes moléculas de ADN, de modo que la muestra amplificada ya no es representativa de la muestra original. La PCR también es notoriamente sensible a la contaminación de ADN exógeno del medio ambiente. Debido a la amplificación exponencial del ADN durante la PCR, incluso cantidades muy pequeñas de contaminación de ADN exógeno en una reacción de PCR pueden generar resultados muy inexactos. La contaminación por ADN exógeno puede introducirse a partir de gotas en aerosol que flotan en el aire o puede transferirse a una reacción desde un equipo contaminado.
El uso de amplificación de círculo rodante (RCA, por sus siglas en inglés) para analizar ADNlc en sangre materna evita muchos de los problemas asociados con la PCR. Sin embargo, los productos de RCA no son muy fáciles de cuantificar de una manera que proporcione robustez estadística. A nivel práctico, aunque las cifras absolutas de productos en una reacción de RCA pueden ser lo suficientemente altas como para proporcionar robustez estadística, pueden amplificarse y detectarse diferentes productos de RCA con diferentes eficacias y de este modo, ha sido un desafío la detección de forma coherente de decenas o cientos de miles de productos de RCA de manera uniforme.
El documento WO2014/165267 divulga composiciones y métodos para la prueba y el análisis de alteraciones genéticas de una muestra que comprende polinucleótidos maternos y fetales. Generalmente, la composición y los métodos del documento WO2014/165267 pretenden proporcionar el aislamiento de una mezcla de polinucleótidos maternos y fetales a partir de una muestra, generalmente de la madre. Los polinucleótidos se aíslan y purifican y a continuación, se analizan para determinar la presencia o ausencia de alteraciones genéticas, tal como la variación del número de copias o de las variantes causales en uno o más loci de la muestra.
El documento WO2012/019200 divulga sistemas de ensayo y métodos para la detección de la variación del número de copias en uno o más loci y para la detección de polimorfismos en uno o más loci en una muestra mixta de un individuo.
El documento WO 97/10364 divulga una reacción de amplificación continua que pretende proporcionar un método para amplificar un ácido nucleico específico sin necesidad de realizar una reacción en ciclo. El método produce transcritos de ARN que pueden detectarse mediante una diversidad de métodos. También se divulgan kits de amplificación y de detección.
Sumario
En el presente documento se describe, entre otras cosas, un complejo de ácido nucleico que puede ligarse de fórmula X-A-B-Z, en donde en el complejo las secuencias X, A, B y Z adyacentes entre sí pueden ligarse y se mantienen en posición mediante un oligonucleótido de férula y en donde la secuencia A es un fragmento diana de un genoma, la secuencia B identifica el locus del que se deriva la secuencia A adyacente y en donde el oligonucleótido de férula tiene la fórmula X'-A'-B'-Z'. En las reivindicaciones se describen realizaciones adicionales.
La presente divulgación también describe, pero no reivindica, un sistema de sondas para analizar una muestra de ácido nucleico. Las sondas pueden diseñarse de tal manera que puedan ligarse a fragmentos diana de ADN genómico (también denominados en el presente documento "secuencias diana" o simplemente "fragmentos") de diferentes loci (por ejemplo, diferentes cromosomas) para producir moléculas de ADN circulares. Las moléculas de ADN circulares, incluso si contienen fragmentos de diferentes cromosomas, contienen todas la misma secuencia de "estructura principal". Además, en algunas realizaciones, todas las moléculas circulares de ADN que contienen un fragmento del mismo locus contienen la misma secuencia identificadora específica del locus, es decir, un código de barras específico del locus. En estas realizaciones, las moléculas circulares de ADN pueden amplificarse utilizando un cebador que hibrida con una secuencia en la estructura principal y el locus del que se deriva el fragmento clonado se puede detectar mediante la hibridación de los productos de Rc A con un oligonucleótido marcado que hibrida con la secuencia identificadora específica del locus. Como sería evidente, esta realización del método se puede multiplexar utilizando múltiples secuencias identificadoras específicas de locus y oligonucleótidos marcados de forma distinguible que hibridan con esas secuencias. Debido a que todos los productos circulares tienen la misma estructura principal y solo se diferencian entre sí por la secuencia del fragmento clonado y por el código de barras específico del locus, pueden detectarse con precisión los productos de RCA amplificados a partir de esos productos amplificados de forma coherente y del locus al que corresponden esos productos de RCA. También se describe, pero no se reclama, un método que emplea el sistema de sondas, así como un kit para la práctica del mismo.
Como se analizará con mayor detalle a continuación, en ciertos casos, el método puede usarse para detectar anomalías cromosómicas (por ejemplo, trisomía 21) en un feto usando una muestra de ADNlc de una mujer embarazada que porta el feto.
La presente divulgación describe, pero no reivindica, un sistema de sondas para analizar una muestra de ácido nucleico. En algunas realizaciones, el sistema de sondas puede comprender: (a) un conjunto de oligonucleótidos identificadores de secuencia B; (b) un conjunto de oligonucleótidos de férula de fórmula X'-A'-B'-Z', en donde: dentro del conjunto: (i) las secuencias A' y B' varían y (ii) las secuencias X' y Z' son diferentes entre sí y no son variables; y dentro de cada oligonucleótido de férula: (i) la secuencia A' es complementaria a un fragmento genómico de la muestra de ácido nucleico y (ii) la secuencia B' es complementaria a al menos un miembro del conjunto de oligonucleótidos identificadores; y (c) una o más secuencias de sondas que comprenden X y Z, donde las secuencias X y Z no son (ii) un miembro del conjunto de oligonucleótidos identificadores y (iii) el fragmento genómico, produciendo así un complejo que puede ligarse de fórmula X-A-B-Z. En algunas realizaciones, los diferentes oligonucleótidos identificadores y sus secuencias complementarias B' identifican diferentes cromosomas, por ejemplo, cromosomas 21, 18 y 13.
En algunas realizaciones, el conjunto de oligonucleótidos identificadores puede comprender al menos dos (por ejemplo, dos, tres o cuatro o más) oligonucleótidos identificadores de secuencia B diferentes y dentro del conjunto de oligonucleótidos de férula, hay al menos 100 secuencias A' diferentes y al menos dos secuencias B' diferentes que son complementarias a al menos dos oligonucleótidos identificadores diferentes.
En algunas realizaciones, cada oligonucleótido identificador o su secuencia B' complementaria en un oligonucleótido de férula puede corresponder al fragmento genómico.
En algunas realizaciones, cada oligonucleótido identificador o su secuencia B' complementaria en un oligonucleótido de férula puede indicar un locus en un genoma del que se deriva el fragmento genómico.
En algunas realizaciones, cada oligonucleótido identificador o su secuencia B' complementaria en un oligonucleótido de férula puede indicar el cromosoma del que se deriva el fragmento genómico.
En algunas realizaciones, el fragmento genómico es de un genoma de mamífero.
En algunas realizaciones, cada oligonucleótido identificador o su secuencia B' complementaria en un oligonucleótido de férula puede identificar uno o más del cromosoma 21, cromosoma 18 y cromosoma 13.
En algunas realizaciones, el fragmento genómico puede ser un fragmento de restricción.
En algunas realizaciones, dichas una o más secuencias de sonda de (c) pueden comprender además un oligonucleótido que comprende la secuencia Y y en donde el complejo que puede ligarse es lineal.
En algunas realizaciones, el sistema de sondas puede comprender además un par de cebadores de PCR que hibridan con dichas una o más sondas de (c).
En algunas realizaciones, dichas una o más secuencias de sonda de (c) pueden comprender una sonda de la estructura principal de fórmula X-Y-Z, donde Y comprende una secuencia de oligonucleótidos, de modo que el complejo que puede ligarse es un complejo que puede ligarse circular de fórmula X-A-B-Z-Y, donde la secuencia Y une las secuencias X y Z.
En algunas realizaciones, el sistema de sondas puede comprender además un cebador de amplificación de círculo rodante que hibrida con una secuencia en la sonda de la estructura principal.
En algunas realizaciones, el sistema de sondas puede comprender además (A) un cebador de amplificación de círculo rodante que hibrida una secuencia con la sonda de la estructura principal; y (B) hasta cuatro oligonucleótidos de detección marcados de forma distinguible, en donde cada uno de los oligonucleótidos de detección marcados que pueden distinguirse hibrida con una secuencia B'.
También se divulga un método de análisis de muestras, pero no forma parte de la invención. En algunas realizaciones, el método puede comprender: (a) hibridar cualquier realización del sistema de sondas resumido anteriormente con una muestra genómica de prueba que comprende fragmentos genómicos para producir complejos que pueden ligarse de fórmula X-A-B-Z; (b) ligar los complejos que pueden ligarse para producir moléculas de ADN producto de fórmula X-A-B-Z; y (c) contar las moléculas de ADN producto correspondientes a cada identificador de locus de la secuencia B.
En algunas realizaciones, el recuento se puede realizar secuenciando moléculas de ADN producto o productos de amplificación de las mismas, para producir lecturas de secuencias y contar el número de lecturas de secuencias que comprenden cada secuencia de B o complemento de la misma.
En algunas realizaciones, las moléculas de ADN producto pueden ser circulares y el recuento puede comprender amplificar las moléculas de ADN producto mediante amplificación de círculo rodante y contar el número de productos de amplificación que comprenden cada secuencia de B o complemento de la misma. En estas realizaciones, el método puede comprender marcar los productos de RCA utilizando sondas marcadas de forma distinguible que hibridan con la secuencia B' y el recuento se realiza contando el número de productos de RCA para cada marcador distinguible.
En algunas realizaciones, el método puede comprender: i. depositar los productos de RCA sobre un soporte plano; y ii. contar el número de productos de RCA individuales marcados en un área del soporte. En estas realizaciones, el soporte puede ser un portaobjetos de vidrio o una membrana capilar transparente porosa, por ejemplo.
En algunas realizaciones, las diferentes secuencias de B y sus secuencias complementarias B' identifican diferentes cromosomas y el método comprende además comparar el número de moléculas de ADN producto que comprenden una primera secuencia de B o B' con el número de moléculas de ADN producto que comprenden una segunda secuencia de B o B' para determinar si la muestra genómica presenta aneuploidía.
En algunas realizaciones, el método puede comprender comparar los resultados del recuento de la etapa (c) con los resultados del recuento obtenidos de una o más muestras de referencia.
En algunas realizaciones, la muestra genómica de prueba puede ser de una paciente que se sospecha que tiene o que está en riesgo de tener una enfermedad o afección y los resultados del recuento de la etapa (c) proporcionan una indicación de si la paciente o el feto de la misma, tiene la enfermedad o la afección.
En algunas realizaciones, la enfermedad o la afección puede ser un cáncer, una enfermedad infecciosa, una enfermedad inflamatoria, un rechazo de trasplante o una trisomía.
En algunas realizaciones, los fragmentos son fragmentos de restricción.
Breve descripción de las figuras
El experto en la técnica comprenderá que los dibujos, descritos a continuación, sirven solo para fines ilustrativos. Los dibujos no pretenden limitar el alcance de las presentes enseñanzas de ninguna manera.
La Figura 1 ilustra esquemáticamente algunas de las características del presente sistema de sondas y del complejo que puede ligarse.
La Figura 2 ilustra esquemáticamente cómo la secuencia B sirve para identificar el locus de la secuencia A.
La Figura 3 ilustra esquemáticamente algunas configuraciones del sistema de sondas ilustrativas.
La Figura 4 ilustra esquemáticamente algunas de las características de una realización de un método objeto.
La Figura 5 ilustra esquemáticamente algunas de las características de una implementación de un método objeto. La figura 6 ilustra esquemáticamente el diseño de los sistemas de sondas.
La Figura 7 muestra los datos obtenidos utilizando dos sistemas de sondas diferentes.
La Figura 8 muestra los datos obtenidos del análisis de muestras clínicas.
Definiciones
Antes de describir realizaciones ilustrativas en mayor detalle, las siguientes definiciones se exponen para ilustrar y definir el significado y el alcance de los términos utilizados en la descripción.
Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo. Salvo que se indique lo contrario, los ácidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha en orientación de 5' a 3'; y las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en orientación de amino a carboxi, respectivamente.
A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y/o científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende habitualmente un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente invención. Singleton,et al.,DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2° Ed., John Wiley and Sons, Nueva York (1994) y Hale & Markham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, Nueva York (1991), proporcionan a los expertos el significado general de muchos de los términos usados en el presente documento. No obstante, ciertos términos se definen a continuación en aras de la claridad y la facilidad de referencia.
Cabe señalar que, según se utilizan en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una" y "el/la" incluyen referencias plurales salvo que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, la expresión "un cebador" se refiere a uno o más cebadores, es decir, un solo cebador y múltiples cebadores. Se destaca, además, que las reivindicaciones se pueden redactar de modo que excluyan cualquier elemento opcional. De este modo, esta afirmación pretende servir como base antecedente para el uso de terminología excluyente tal como "solamente", "únicamente" y similares, en relación con la mención de elementos reivindicativos o el uso de una limitación "negativa".
El término "nucleótido" pretende incluir los restos que contienen no solo las bases conocidas de purina y pirimidina, sino también otras bases heterocíclicas que se han modificado. Tales modificaciones incluyen purinas o pirimidinas metiladas, purinas o pirimidinas aciladas, ribosas alquiladas u otros heterociclos. Además, el término "nucleótido" incluye los restos que contienen hapteno o marcadores fluorescentes y puede contener no solo azúcares ribosa y desoxirribosa convencionales, sino también otros azúcares. Los nucleósidos o nucleótidos modificados también incluyen modificaciones en el resto de azúcar, por ejemplo, en donde uno o más de los grupos hidroxilo se reemplaza(n) con átomos de halógeno o grupos alifáticos, se funcionalizan como éteres, aminas o similares.
Los términos "ácido nucleico" y "polinucleótido" se usan indistintamente en el presente documento para describir un polímero de cualquier longitud, por ejemplo, mayor que aproximadamente 2 bases, mayor que aproximadamente 10 bases, mayor que aproximadamente 100 bases, mayor que aproximadamente 500 bases, mayor que aproximadamente 1000 bases, hasta aproximadamente 10.000 o más bases compuestas de nucleótidos, por ejemplo, desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y pueden producirse enzimática o sintéticamente (por ejemplo, PNA como se describe en la patente de Estados Unidos n.° 5.948.902 y en las referencias citadas en la misma), los cuales pueden hibridarse con ácidos nucleicos de origen natural en una secuencia específica análoga a la de dos ácidos nucleicos de origen natural, por ejemplo, pueden participar en las interacciones de emparejamiento de bases de Watson-Crick. Los nucleótidos de origen natural incluyen guanina, citosina, adenina, timina, uracilo (G, C, A, T y U respectivamente). El ADN y el ARN tienen una estructura principal de azúcar de desoxirribosa y de ribosa, respectivamente, mientras que la estructura principal de PNA se compone de unidades repetidas de N-(2-aminoetil)-glicina unidas por enlaces peptídicos. En PNA, se unen diversas bases de purina y pirimidina a la estructura principal mediante enlaces metileno carbonilo. Un ácido nucleico bloqueado (LNA, por sus siglas en inglés), a menudo denominado ARN inaccesible, es un nucleótido de ARN modificado. El resto de ribosa de un nucleótido de LNA se modifica con un puente adicional que conecta el oxígeno 2' y el carbono 4'. El puente "bloquea" la ribosa en la conformación de 3'-endo (Norte), que se encuentra a menudo en los dúplex en forma de A. Los nucleótidos de LNA se pueden mezclar con restos de ADN o de ARN en el oligonucleótido siempre que se desee. La expresión "ácido nucleico no estructurado" o "UNA" (por sus siglas en inglés), es un ácido nucleico que contiene nucleótidos de origen no natural que se unen entre sí con una estabilidad reducida. Por ejemplo, un ácido nucleico no estructurado puede contener un resto G' y un resto C', cuando estos restos corresponden a formas de origen no natural, es decir, análogos de G y de C que forman pares de bases entre sí con una estabilidad reducida, pero conservan la capacidad de formar pares de bases con restos C y G de origen natural, respectivamente. El ácido nucleico no estructurado se describe en el documento US20050233340.
El término "oligonucleótido", como se utiliza en el presente documento, denota un multímero monocatenario de nucleótidos de aproximadamente 2 a 200 nucleótidos, hasta 500 nucleótidos de longitud. Los oligonucleótidos pueden ser sintéticos o pueden fabricarse enzimáticamente y en algunas realizaciones, tienen de 30 a 150 nucleótidos de longitud. Los oligonucleótidos pueden contener monómeros de ribonucleótidos (es decir, pueden ser oligorribonucleótidos) o monómeros de desoxirribonucleótidos. Un oligonucleótido puede tener de 10 a 20, de 21 a 30, de 31 a 40, de 41 a 50, de 51 a 60, de 61 a 70, de 71 a 80, de 80 a 100, de 100 a 150 o de 150 a 200 nucleótidos de longitud, por ejemplo.
El término "cebador", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un oligonucleótido que es capaz de actuar como punto de inicio de una síntesis cuando se sitúa en condiciones en las que se induce la síntesis de un producto de extensión del cebador, que es complementario a una cadena de ácido nucleico, es decir, en presencia de nucleótidos y de un agente inductor tal como una ADN polimerasa y a una temperatura y pH adecuados. El cebador puede ser monocatenario y debe ser lo suficientemente largo para cebar la síntesis del producto de extensión deseado en presencia del agente inductor. La longitud exacta del cebador dependerá de muchos factores, incluyendo la temperatura, de la fuente del cebador y del uso del método. Por ejemplo, para aplicaciones de diagnóstico, dependiendo de la complejidad de la secuencia o del fragmento diana, el cebador de oligonucleótidos normalmente contiene 15-25 o más nucleótidos, aunque puede contener menos nucleótidos. Los cebadores del presente documento se seleccionan para que sean sustancialmente complementarios a diferentes cadenas de una secuencia de ADN diana particular. Esto significa que los cebadores deben ser suficientemente complementarios para hibridar con sus respectivas cadenas. Por tanto, la secuencia del cebador no necesita reflejar la secuencia exacta del molde. Por ejemplo, se puede unir un fragmento de nucleótido no complementario al extremo 5' del cebador, siendo el resto de la secuencia del cebador complementario a la cadena. Como alternativa, se pueden intercalar bases no complementarias o secuencias más largas en el cebador, siempre que la secuencia del cebador tenga suficiente complementariedad con la secuencia de la cadena para hibridar con la misma y formar así el molde para la síntesis del producto de extensión.
El término "hibridación" o "hibrida" se refiere a un proceso en el que una cadena de ácido nucleico hibrida y forma un dúplex estable, un homodúplex o un heterodúplex, en condiciones normales de hibridación con una segunda cadena de ácido nucleico complementaria y no forma un dúplex estable con moléculas de ácido nucleico no relacionadas en las mismas condiciones normales de hibridación. La formación de un dúplex se logra hibridando dos cadenas de ácido nucleico complementarias en una reacción de hibridación. Se puede hacer que la reacción de hibridación sea altamente específica mediante el ajuste de las condiciones de hibridación (a menudo denominadas rigurosidad de hibridación) en las que tiene lugar la reacción de hibridación, de modo que la hibridación entre dos cadenas de ácido nucleico no formará un dúplex estable, por ejemplo, un dúplex que conserve una región de doble cadena en condiciones de rigurosidad normales, a menos que las dos cadenas de ácido nucleico contengan un cierto número de nucleótidos en secuencias específicas que son sustancial o completamente complementarias. Las "condiciones de hibridación normales o de rigurosidad normales" se determinan fácilmente para cualquier reacción de hibridación dada. Véase, por ejemplo, Ausubelet al.,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York o Sambrooket al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "que hibrida" o "hibridación" se refiere a cualquier proceso mediante el cual una cadena de ácido nucleico se une a una cadena complementaria a través del apareamiento de bases.
Se considera que un ácido nucleico "puede hibridarse selectivamente" con una secuencia de ácido nucleico de referencia si las dos secuencias hibridan específicamente entre sí en condiciones de lavado e hibridación de moderadas a alta rigurosidad. Se conocen condiciones de hibridación de rigurosidad moderada y alta (véase, por ejemplo, Ausubel,et al.,Short Protocols in Molecular Biology, 3a Ed., Wiley & Sons 1995 y Sambrooket al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Tercera edición, 2001 Cold Spring Harbor, Nueva York). Un ejemplo de condiciones de alta rigurosidad incluye la hibridación a aproximadamente 42 °C en formamida al 50 %, 5X SSC, 5X solución de Denhardt, SDS al 0,5%y 100 ug/ml de ADN vehículo desnaturalizado seguido de lavado dos veces en 2X SSC y SDS al 0,5 % a temperatura ambiente y dos veces adicionales en 0,1X SSC y SDS al 0,5 % a 42 °C.
La expresión "secuencia de código de barras" o "código de barras molecular", como se utiliza en el presente documento, se refiere a una secuencia única de nucleótidos utilizada para a) identificar y/o rastrear la fuente de un polinucleótido en una reacción y/o b) contar cuántas veces se secuencia una molécula inicial (por ejemplo, en los casos en los que sustancialmente cada molécula de una muestra se etiqueta con una secuencia diferente y a continuación, se amplifica la muestra). Una secuencia de código de barras puede estar en el extremo 5', el extremo 3' o en el medio de un oligonucleótido. Las secuencias de códigos de barras pueden variar mucho en tamaño y composición; las siguientes referencias brindan orientación para seleccionar conjuntos de secuencias de códigos de barras adecuados para realizaciones particulares: Casbon (Nuc. Acids Res. 2011, 22 e81), Brenner, patente de Estados Unidos n.° 5.635.400; Brenneret al.,Proc. Natl. Acad. Sci., 97: 1665-1670 (2000); Shoemakeret al.,Nature Genetics, 14: 450-456 (1996); Morriset al.,solicitud de patente europea 0799897A1; Wallace, patente de Estados Unidos n.° 5.981.179; y similares. En realizaciones particulares, una secuencia de código de barras puede tener una longitud en el intervalo de 4 a 36 nucleótidos o de 6 a 30 nucleótidos o de 8 a 20 nucleótidos.
El término "secuenciación", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un método por el cual la identidad de al menos 10 nucleótidos consecutivos (por ejemplo, la identidad de al menos 20, al menos 50, al menos 100 o al menos 200 o más nucleótidos consecutivos) se obtiene de un polinucleótido.
La expresión "secuenciación de nueva generación" se refiere a las denominadas plataformas de secuenciación mediante síntesis o de secuenciación por ligadura en paralelo empleadas actualmente, por ejemplo, por Illumina, Life Technologies, Roche, etc. Los métodos de secuenciación de nueva generación también pueden incluir métodos de secuenciación de nanoporos o métodos basados en detección electrónica, tales como, por ejemplo, la tecnología de Ion Torrent comercializada por Life Technologies.
El término "dúplex", o "bicatenario", como se utiliza en el presente documento, describe dos polinucleótidos complementarios que forman pares de bases, es decir, hibridan juntos.
Los términos "determinar", "medir", "evaluar", "calcular", "ensayar", y "analizar" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a formas de medición e incluyen determinar si un elemento está presente o no. Estos términos incluyen determinaciones tanto cuantitativas como cualitativas. El cálculo puede ser relativo o absoluto.
La expresión "etiqueta de afinidad", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un resto que se puede usar para separar una molécula a la que está unida la etiqueta de afinidad de otras moléculas que no contienen la etiqueta de afinidad. Una "etiqueta de afinidad" es un miembro de un par de unión específico, es decir, dos moléculas donde una de las moléculas se une específicamente a través de medios químicos o físicos a la otra molécula. El miembro complementario del par de unión específico, referido en el presente documento como un "agente de captura" puede estar inmovilizado (por ejemplo, en un soporte de cromatografía, una perla o una superficie plana) para producir un soporte de cromatografía de afinidad que se une específicamente a la etiqueta de afinidad. Dicho de otro modo, una "etiqueta de afinidad" puede unirse a un "agente de captura", donde la etiqueta de afinidad se une específicamente al agente de captura, facilitando así la separación de la molécula a la que se une la etiqueta de afinidad de otras moléculas que no contienen la etiqueta de afinidad.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "resto de biotina" se refiere a un agente de afinidad que incluye biotina o un análogo de biotina, tal como destiobiotina, oxibiotina, 2'-iminobiotina, diaminobiotina, sulfóxido de biotina, biocitina, etc. Los restos de biotina se unen a la estreptavidina con una afinidad de al menos 10'8 M. Un agente de afinidad de biotina también puede incluir un enlazador, por ejemplo, — LC-biotina, — LC-LC-biotina, —SLC-biotina o — PEGn-biotina donde n es 3-12.
La expresión "nucleótido terminal", como se utiliza en el presente documento, se refiere al nucleótido en el extremo 5' o 3' de una molécula de ácido nucleico. La molécula de ácido nucleico puede estar en forma de doble cadena (es decir, bicatenaria) o en forma monocatenaria.
El término "ligadura", como se utiliza en el presente documento, se refiere a la unión catalizada enzimáticamente del nucleótido terminal en el extremo 5' de una primera molécula de ADN con el nucleótido terminal en el extremo 3' de una segunda molécula de ADN.
Los términos "pluralidad", "conjunto" y "población" se usan indistintamente para referirse a algo que contiene al menos 2 miembros. En determinados casos, una pluralidad puede tener al menos 10, al menos 100, al menos 100, al menos 10.000, al menos 100.000, al menos 106, al menos 107, al menos 108 o al menos 109 o más miembros.
El término "digerir" pretende indicar un proceso mediante el cual una enzima de restricción escinde un ácido nucleico. Para digerir un ácido nucleico, una enzima de restricción y un ácido nucleico que contiene un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción se ponen en contacto en condiciones adecuadas para que trabaje la enzima de restricción. Las condiciones adecuadas para la actividad de las enzimas de restricción disponibles comercialmente son conocidas y se suministran con esas enzimas en el momento de la compra.
Un "sitio de unión de oligonucleótidos" se refiere a un sitio con el que un oligonucleótido híbrida en un polinucleótido o fragmento diana. Si un oligonucleótido "proporciona" un sitio de unión para un cebador, a continuación, el cebador puede hibridarse con ese oligonucleótido o su complemento.
El término "separar", como se utiliza en el presente documento, se refiere a la separación física de dos elementos (por ejemplo, por tamaño o afinidad, etc.), así como la degradación de un elemento, dejando el otro intacto.
La expresión "región cromosómica de referencia", como se utiliza en el presente documento se refiere a una región cromosómica de secuencia de nucleótidos conocida, por ejemplo, una región cromosómica cuya secuencia está depositada en la base de datos Genbank del NCBI u otras bases de datos, por ejemplo.
El término "cadena", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un ácido nucleico formado por nucleótidos unidos covalentemente mediante enlaces covalentes, por ejemplo, enlaces fosfodiéster.
En una célula, el ADN suele existir en forma de doble cadena y de este modo, tiene dos cadenas complementarias de ácido nucleico denominadas en el presente documento cadenas "superior" e "inferior". En determinados casos, las cadenas complementarias de una región cromosómica pueden denominarse cadenas "más" y "menos", cadenas "primera" y "segunda", cadenas "codificante" y "no codificante", cadenas "Watson" y "Crick" o cadenas "sentido" y "antisentido". La asignación de una cadena como cadena superior o inferior es arbitraria y no implica ninguna orientación, función o estructura particulares. Las secuencias de nucleótidos de la primera cadena de varias regiones cromosómicas ilustrativas de mamíferos (por ejemplo, BAC, ensamblajes, cromosomas, etc.) son conocidas y se pueden encontrar en la base de datos Genbank del NCBI, por ejemplo.
La expresión "cadena superior", como se utiliza en el presente documento, se refiere a cualquiera de las cadenas de un ácido nucleico pero no a ambas cadenas de un ácido nucleico. Cuando un oligonucleótido o un cebador se une o hibrida "solo con una cadena superior", se une a una sola cadena pero no a la otra. La expresión "cadena inferior", como se utiliza en el presente documento, se refiere a la cadena que es complementaria a la "cadena superior". Cuando un oligonucleótido se une o hibrida "solo a una cadena", se une a una sola cadena, por ejemplo, la primera o segunda cadena, pero no a la otra cadena.
La expresión "enlace covalente" se refiere a la producción de un enlace covalente entre dos moléculas separadas, por ejemplo, las cadenas superior e inferior de un ácido nucleico de doble cadena. La ligadura es un tipo de enlace covalente.
El término "desnaturalización", como se utiliza en el presente documento, se refiere a la separación de al menos una parte de los pares de bases de un dúplex de ácido nucleico colocando el dúplex en condiciones desnaturalizantes adecuadas. Las condiciones de desnaturalización son bien conocidas en la técnica. En una realización, para desnaturalizar un dúplex de ácido nucleico, puede exponerse el dúplex a una temperatura superior a la temperatura de fusión del dúplex, liberando así una cadena del dúplex de la otra. En ciertas realizaciones, un ácido nucleico puede desnaturalizarse exponiéndolo a una temperatura de al menos 90 °C durante un período de tiempo adecuado (por ejemplo, al menos 30 segundos, hasta 30 minutos). Los ácidos nucleicos también pueden desnaturalizarse químicamente (por ejemplo, utilizando urea o NaOH).
Como se utiliza en el presente documento, el término "marcador" se refiere a cualquier átomo o molécula que pueda usarse para proporcionar un efecto detectable (preferiblemente cuantificable) y que pueda unirse a un ácido nucleico o proteína. Los marcadores incluyen, pero sin limitación, colorantes y radiomarcadores como 32P; restos de unión, tales como biotina; haptenos, tales como digoxigenina; restos luminogénicos, fosforescentes o fluorogénicos; y colorantes fluorescentes solos o junto con restos que pueden suprimir o cambiar los espectros de emisión por transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (TERF; en inglés, FRET). Los marcadores pueden proporcionar señales detectables por fluorescencia, radiactividad, colorimetría, gravimetría, difracción o absorción de rayos X, magnetismo, actividad enzimática y similares. Un marcador puede ser un grupo funcional cargado (carga positiva o negativa) o como alternativa, puede ser de carga neutra. Los marcadores pueden incluir o consistir en un ácido nucleico o una secuencia de proteína, siempre que la secuencia que comprende el marcador sea detectable.
Las expresiones "oligonucleótido marcado" y "sonda marcada" como se utilizan en el presente documento, se refieren a un oligonucleótido que tiene una etiqueta de afinidad (por ejemplo, un resto de biotina), a un oligonucleótido modificado con átomos o grupos que permiten la separación o detección (por ejemplo, bromo-desoxiuridina o partículas de oro coloidal que confieren diferente densidad) y a un oligonucleótido modificado con un marcador detectable ópticamente (por ejemplo, un marcador de fluorescencia u otro tipo de marcador emisor de luz). Los oligonucleótidos que contienen solo nucleótidos de origen natural no son oligonucleótidos marcados.
El término "extender", como se utiliza en el presente documento, se refiere a la extensión de un cebador mediante la adición de nucleótidos utilizando una polimerasa. Si se extiende un cebador que está hibridado con un ácido nucleico, el ácido nucleico actúa como molde para una reacción de extensión.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "extremos respectivos", se pretende que en la expresión "ligar un primer y un segundo oligonucleótido a los respectivos extremos de un fragmento" signifique que se añade un oligonucleótido a un extremo del fragmento y otro oligonucleótido al otro extremo del fragmento diana.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "adyacente que puede ligarse" en el contexto de dos secuencias de oligonucleótidos adyacentes que pueden ligarse entre sí, significa que no hay nucleótidos intermedios entre dos oligonucleótidos y que pueden ligarse entre sí.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "oligonucleótido de férula", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un oligonucleótido que, cuando hibrida con otros dos o más polinucleótidos, actúa como una "férula" para colocar los polinucleótidos uno al lado del otro para que se puedan ligar entre sí, como se ilustra en la Fig. 1.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "una molécula de ácido nucleico circular" se refiere a una cadena que tiene la forma de un círculo cerrado que no tiene extremos libres 3' o 5'.
La expresión "se corresponde con" y equivalentes gramaticales, por ejemplo, "correspondiente", como se utiliza en el presente documento, se refiere a una relación específica entre los elementos a los que se refiere el término. Por ejemplo, un RCA que se corresponde con una secuencia en un genoma contiene la misma secuencia de nucleótidos que la secuencia en el genoma.
Ciertos polinucleótidos descritos en el presente documento pueden denominarse mediante una fórmula (por ejemplo, "X'-A'-B'-Z'"). A menos que se indique lo contrario, los polinucleótidos definidos por una fórmula pueden orientarse en la dirección 5' a 3' o en la dirección 5' a 3'. Por ejemplo, los polinucleótidos definidos por la fórmula "X'-A'-B'-Z" pueden ser "5'-X'-A'-B'-Z'-3'" o "3'-X'-A'-B'- Z'-5'". Los componentes de la fórmula, por ejemplo, "A", "X" y "B", etc., se refieren a secuencias definibles por separado de nucleótidos dentro de un polinucleótido, donde, a menos que esté implícito en el contexto (por ejemplo, en el caso de un complejo "que puede ligarse" de una fórmula particular), las secuencias están unidas entre sí covalentemente, de manera que un polinucleótido descrito por una fórmula es una sola molécula. En muchos casos, los componentes de la fórmula son inmediatamente adyacentes entre sí en la molécula individual. Siguiendo la convención, el complemento de una secuencia mostrada en una fórmula se indicará con una prima (') de modo que el complemento de la secuencia "A" será "A'". Asimismo, a menos que se indique lo contrario o esté implícito en el contexto, un polinucleótido definido por una fórmula puede tener una secuencia adicional, un sitio de unión del cebador, un código de barras molecular, un promotor o un espaciador, etc., en su extremo 3', en su extremo 5' o en ambos extremos 3' y 5'. Si un polinucleótido definido por una fórmula se describe como circular, a continuación, los extremos de esas moléculas se unen, directa o indirectamente. Por ejemplo, en el caso de complejos circulares de fórmula X-A-B-Z-Y, a continuación, se une el extremo 5' de la molécula, directa o indirectamente, al extremo 3' de la molécula para producir un círculo. Como sería evidente, las diversas secuencias componentes de un polinucleótido (por ejemplo, A, B, C, X, Y, Z, etc.) pueden ser de cualquier longitud deseada independientemente, siempre que sean capaces de realizar la función deseada (por ejemplo, hibridando con otra secuencia). Por ejemplo, las diversas secuencias componentes de un polinucleótido pueden tener, independientemente, una longitud en el intervalo de 8 80 nucleótidos, por ejemplo, 10-50 nucleótidos o 12-30 nucleótidos.
La expresión "complejo que puede ligarse", por ejemplo, de fórmula X-A-B-Z, se refiere a un complejo en el que los diversos oligonucleótidos adyacentes pueden ligarse entre sí (en forma circular o lineal), unidos por un oligonucleótido de férula, como se muestra en la Fig. 1.
La expresión "complejo circular que puede ligarse", por ejemplo, de fórmula X-A-B-Z-Y, se refiere a un complejo circular en el que los diversos oligonucleótidos pueden ligarse entre sí en un círculo, unidos por un oligonucleótido de férula.
Las expresiones "locus", "locus genómico", como se utilizan en el presente documento, se refieren a una región definida de un genoma, por ejemplo, un genoma animal o vegetal, tal como el genoma de un ser humano, mono, rata, pez, insecto o planta. Un locus puede ser una región de un cromosoma que es tan corta como 100 kb y que puede ser tan larga como un brazo cromosómico o como un cromosoma completo.
Las expresiones "primer locus" y "segundo locus" se refieren a diferentes loci, es decir, diferentes regiones en un genoma, por ejemplo, a diferentes brazos cromosómicos o a diferentes cromosomas.
La expresión "fragmentos de un locus" se refiere a una población de fragmentos definidos (que pueden fabricarse usando una enzima de restricción o reprogramando una endonucleasa guiada por ARN, tal como CAS9) de un locus particular. No es necesario analizar todos los fragmentos de un locus. Debido a que se han publicado las secuencias de diversos genomas, el diseño de oligonucleótidos que hibridan con un fragmento de un locus es rutinario.
La expresión "complementario a un fragmento" se refiere a una secuencia que es complementaria a una cadena (ya sea la cadena superior o inferior) de un fragmento.
La expresión "secuencia genómica", como se utiliza en el presente documento, se refiere a una secuencia que se produce en un genoma.
El término "variable", en el contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos que son variables, se refiere a dos o más ácidos nucleicos que tienen diferentes secuencias de nucleótidos entre sí. Dicho de otro modo, si los polinucleótidos de una población tienen una secuencia variable o una secuencia particular "varía", a continuación, la secuencia de nucleótidos de las moléculas polinucleotídicas de la población varía de molécula a molécula. El término "variable" no debe interpretarse como que requiere que cada molécula en una población tenga una secuencia diferente a las otras moléculas en una población.
Si dos ácidos nucleicos (por ejemplo, secuencias A y A') son "complementarios", hibridan entre sí en condiciones de alta rigurosidad. En muchos casos, dos secuencias que son complementarias tienen al menos 10, por ejemplo, al menos 12, al menos 15, al menos 20 o al menos 25 nucleótidos de complementariedad y en ciertos casos puede tener una, dos o tres bases no complementarias.
El término "identifica", en el contexto de una secuencia que identifica un locus, se refiere a un código de barras molecular que es único para el locus. Tal secuencia no es del locus en sí mismo, sino que es un código de barras molecular (que generalmente tiene una secuencia que no está presente en la muestra que se analiza), que se añade a los fragmentos de un locus que se analizan y que identifica esos fragmentos como pertenecientes al locus. Por ejemplo, si los fragmentos de un primer locus se ligan a una primera secuencia identificadora y los fragmentos de un segundo locus se ligan a una segunda secuencia identificadora, a continuación, la fuente de esos fragmentos (el locus al que corresponden) puede determinarse detectando qué secuencia identificadora se ha ligado a esos fragmentos.
La expresión "orientación invertida" en el contexto de dos secuencias que hibridan con otras secuencias en una orientación invertida, se refiere a una estructura en la que los extremos 5' y 3' de una de las secuencias hibridan entre sí de manera que los extremos se enfrentan entre sí, como se ilustra en la parte superior de la Fig. 3B.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "amplificación de círculo rodante" o "RCA", para abreviar, se refiere a una amplificación isotérmica que genera copias concatemerizadas lineales de un molde de ácido nucleico circular utilizando una polimerasa de desplazamiento de cadena. La RCA es bien conocida en las técnicas de biología molecular y se describe en una variedad de publicaciones que incluyen, pero no limitadas a, Lizardiet al.(Nat. Genet.
1998 19:225-232), Schweitzeret al.(Proc. Natl. Acad. Set 2000 97:10113-10119), Wiltshireet al.(Clin. Chem. 2000 46:1990-1993) y Schweitzeret al.(Curr. Opin. Biotech 2001 12:21-27).
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "productos de amplificación de círculo rodante" se refiere a los productos concatemerizados de una reacción de amplificación de círculo rodante. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "productos de amplificación de círculo rodante marcados con fluorescencia" se refiere a productos de amplificación de círculo rodante que se han marcado con fluorescencia mediante, por ejemplo, hibridación de un oligonucleótido marcado con fluorescencia con los productos de amplificación de círculo rodante u otros medios (por ejemplo, mediante la incorporación de un nucleótido fluorescente en el producto durante la amplificación).
Como se utiliza en el presente documento, el término "área", en el contexto de un área de un soporte o de un área de una imagen, se refiere a un área contigua o no contigua. Por ejemplo, si un método implica contar el número de productos de RCA marcados en un área, el área en la que se cuentan los productos de RCA puede ser un espacio solo, contiguo o múltiples espacios no contiguos.
Como se utiliza en el presente documento, el término "imagen" se refiere a un proceso mediante el cual las señales ópticas de la superficie de un objeto se detectan y almacenan como datos junto con una localización (es decir, un "píxel"). A partir de estos datos se puede reconstruir una imagen digital del objeto. Se pueden formar imágenes de un área de un soporte usando una sola imagen o una o más imágenes.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "productos de RCA marcados individualmente" se refiere a moléculas de RCA individuales que están marcadas.
Como se utiliza en el presente documento, el término "contar" se refiere a determinar el número de objetos individuales en una colección mayor. "Contar" requiere detectar señales separadas de objetos individuales en una pluralidad (no una señal colectiva de la pluralidad de objetos) y a continuación, determinar cuántos objetos hay en la pluralidad contando las señales individuales. En el contexto del presente método, el "recuento" se realiza determinando el número de señales individuales en una matriz de señales.
Como se utiliza en el presente documento, el término "matriz" con referencia a una matriz de productos de RCA se refiere a una colección de productos de RCA individuales en una superficie plana, donde los productos de RCA están espacialmente separados entre sí en el plano de la superficie (en la medida permitida por la distribución de Poisson si la matriz es realmente aleatoria). Una matriz "aleatoria" es una matriz en la que los elementos, por ejemplo, productos de RCA, se distribuyen sobre la superficie de un sustrato en posiciones que no están predeterminadas. En algunos casos, la distribución de productos de RCA en una matriz aleatoria puede describirse mediante los estadísticos de Poisson, de modo que, por ejemplo, la distribución de distancias entre los productos de RCA de una matriz aleatoria se aproxima mediante una distribución de Poisson.
Otras definiciones de términos pueden aparecer a lo largo de la especificación.
Descripción de las realizaciones ilustrativas
Antes de que se describan las diversas realizaciones, debe entenderse que las enseñanzas de esta divulgación no se limitan a las realizaciones particulares descritas y de este modo, pueden variar, evidentemente. También debe entenderse que la terminología utilizada en el presente documento solo tiene el fin de describir realizaciones particulares y no está concebida para ser limitante, dado que el ámbito de la invención está limitado por las reivindicaciones adjuntas.
A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y/o científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto habitual en la materia a la que pertenece la divulgación. Aunque también pueden utilizarse cualesquier métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento para poner en práctica o a prueba las presentes enseñanzas, a continuación se describen algunos métodos y materiales ilustrativos.
La cita de cualquier publicación es para su divulgación antes de la fecha de presentación y no debe interpretarse como una admisión de que las presentes reivindicaciones no tienen derecho a ser anteriores a tal publicación en virtud de una invención anterior. Además, las fechas de publicación facilitadas pueden ser diferentes de las fechas de publicación reales, las cuales pueden necesitar confirmarse independientemente.
Composiciones de sondas
Algunas realizaciones del sistema de sondas pueden comprender: (a) un conjunto de oligonucleótidos identificadores de secuencia B; (b) un conjunto de oligonucleótidos de férula de fórmula X'-A'-B'-Z', en donde: dentro del conjunto: (i) las secuencias A' y B' varían y (ii) las secuencias X' y Z' son diferentes entre sí y no son variables; y dentro de cada oligonucleótido de férula: (i) la secuencia A' es complementaria a un fragmento genómico de la muestra de ácido nucleico y (ii) la secuencia B' es complementaria a al menos un miembro del conjunto de oligonucleótidos identificadores; y (c) una o más secuencias de sondas que comprenden X y Z, donde las secuencias X y Z no son variables e hibridan con las secuencias X' y Z'; donde cada oligonucleótido de férula es capaz de hibridar con: (i) las secuencias de la sonda, (ii) un miembro del conjunto de oligonucleótidos identificadores y (iii) el fragmento genómico, produciendo así un complejo que puede ligarse de fórmula X-A-B-Z. Como se describirá con mayor detalle a continuación, en algunas realizaciones, los diferentes oligonucleótidos identificadores y sus secuencias complementarias B' identifican diferentes cromosomas, por ejemplo, cromosomas 21, 18 y 13.
La Fig. 1 muestra el complejo que puede ligarse de fórmula X-A-B-Z, cuya estructura caracteriza el presente sistema de sondas. Como se muestra en la Fig. 1, en el complejo las secuencias X, A, B y Z adyacentes pueden ligarse entre sí, mantenidas en posición por un oligonucleótido de férula. Como se observa en la Fig. 1, la secuencia A es un fragmento diana de un genoma (por ejemplo, una cadena de un fragmento de restricción) y la secuencia B identifica el locus (por ejemplo, una región particular en un cromosoma, un brazo cromosómico particular o un cromosoma particular, etc.) de la que se deriva la secuencia A adyacente. La relación entre las secuencias A y B se ilustra en la Fig. 2, que ilustra un conjunto de sondas simple, hibridadas con diversos fragmentos genómicos (A<1>a A6). Como se muestra en la Fig. 2, los fragmentos genómicos en los tres complejos superiores (de secuencia A<1>, A<2>y A<3>) son de un primer locus (por ejemplo, cromosoma 21) y los fragmentos genómicos en los tres complejos inferiores (de secuencia A<4>, A<5>y Ae) son de un segundo locus (por ejemplo, cromosoma 18). El locus del que se derivan los fragmentos genómicos en los tres complejos superiores se identifica mediante una única secuencia (B<1>) y el locus del que se derivan los fragmentos genómicos en los tres complejos inferiores se identifica mediante una secuencia diferente (B<2>). Las secuencias X y Z son las mismas en todos los complejos ilustrados.
Como sería evidente, el conjunto de oligonucleótidos de férula puede ser tan complejo como se desee y en algunas realizaciones, la secuencia A' puede tener una complejidad de al menos 100, al menos 1.000, al menos 5.000, al menos 10.000 o al menos 50.000 o más, lo que significa que los oligonucleótidos de la férula pueden hibridar, colectivamente, con al menos 100, al menos 1.000, al menos 5.000, al menos 10.000 o al menos 50.000 o más fragmentos de ADN genómico. La secuencia B' en el conjunto de oligonucleótidos de férula puede ser mucho menos diversa, porque simplemente sirve como identificador de locus. De este modo, en el conjunto de oligonucleótidos de férula, la secuencia B' puede tener una complejidad de al menos 2, por ejemplo, 3 o 4, aunque la secuencia B' puede tener una complejidad de al menos 10, al menos 100 o al menos 1000 en algunas implementaciones. Como sería evidente, dado que la secuencia B' es complementaria a la secuencia B, la complejidad del conjunto de oligonucleótidos específicos de locus puede ser la misma que la complejidad de la secuencia B'. Por ejemplo, si hay tres oligonucleótidos identificadores, puede haber tres secuencias B' diferentes. El número de oligonucleótidos de férula en un conjunto puede variar mucho, dependiendo de la longitud del locus y del número de fragmentos de destino. En algunas realizaciones, cada conjunto de oligonucleótidos de férula puede contener al menos 10, al menos 50, al menos 100, al menos 500, al menos 1.000, al menos 5.000, al menos 10.000 o al menos 50.000 oligonucleótidos de férula diferentes.
Por ejemplo, en algunas realizaciones, un conjunto de oligonucleótidos de férula puede contener: (i) una primera subpoblación de oligonucleótidos de férula que contiene al menos 100 secuencias A', por ejemplo, conjunto de A<i>,<x>', x=1-100+, que son complementarias a diferentes fragmentos de un primer locus (por ejemplo, fragmentos del cromosoma 21 o por ejemplo, conjunto de A i ,x, x=1-100+), donde cada una de esta subpoblación de oligonucleótidos de férula tiene la misma secuencia B', por ejemplo, B-T (ii) una segunda subpoblación de oligonucleótidos de férula que contienen al menos 100 secuencias A', por ejemplo, conjunto de A<2>,<x>', x=1-100+, que son complementarias a diferentes fragmentos de un segundo locus (por ejemplo, fragmentos del cromosoma 18 o, por ejemplo, conjunto de A<2>X, x=l-100+), donde cada una de esta subpoblación de oligonucleótidos de férula tiene la misma secuencia B', por ejemplo, B<2>', que es diferente de la secuencia B' de la primera subpoblación (o de cualquier otra); (iii) una tercera subpoblación de oligonucleótidos de férula que contiene al menos l00 secuencias A', por ejemplo, conjunto de A<3>,x', x=1-100+, que son complementarias a diferentes fragmentos de un tercer locus (por ejemplo, fragmentos del cromosoma 18 o por ejemplo, conjunto de A<3>X, x=1-100+), donde cada una de esta subpoblación de oligonucleótidos de férula tiene la misma secuencia B', por ejemplo, B<3>', que es diferente de la secuencia B' de cualquier otra subpoblación; (iv) una cuarta subpoblación opcional de oligonucleótidos de férula que contengan al menos 100 secuencias A', por ejemplo, conjunto de A<x>', x=1-100+, que son complementarias a diferentes fragmentos de un cuarto locus (por ejemplo, fragmentos de otro cromosoma o por ejemplo, conjunto de A<4>, x, x=1-100+) donde cada una de esta subpoblación de oligonucleótidos de férula tiene una secuencia B', por ejemplo, B<4>', que es diferente de la secuencia B' de cualquier otra subpoblación.
Como se ilustra en la Fig. 3, el sistema de sondas puede configurarse de diversas formas dependiendo de cómo se vaya a utilizar. Por ejemplo, como se ilustra en las Figs. 3A, C y D, las secuencias X y Z pueden estar en diferentes moléculas y como resultado, el complejo que puede ligarse es lineal. En estas realizaciones, dichas una o más sondas que contienen las secuencias X e Y pueden comprender un primer oligonucleótido que comprende la secuencia X y un segundo oligonucleótido que comprende la secuencia Y. En estas realizaciones, el primer y segundo oligonucleótidos no necesitan cola, como se muestra en la Fig. 1A. En estas realizaciones, después de la ligadura, los productos de ligadura se pueden amplificar usando, por ejemplo, los cebadores de PCR comentados que hibridan con las secuencias X y Z. En algunas realizaciones (como se muestra en las Figs. 3C y D), los oligonucleótidos primero y/o segundo pueden tener una cola para proporcionar un sitio de unión al cebador para facilitar la amplificación y el recuento. En algunas realizaciones, una cola puede contener un indexador molecular (por ejemplo, una secuencia aleatoria) que permite contar el número de productos de ligadura originales después de que esas moléculas se hayan amplificado y secuenciado. En realizaciones alternativas y como se muestra en la Fig. 3B, dichas una o más sondas que contienen las secuencias X e Y pueden ser una sola sonda de la estructura principal de fórmula X-Y-Z. En estas realizaciones y como se muestra, el complejo que puede ligarse es un complejo que puede ligarse circular de fórmula X-A-B-Z-Y, donde la secuencia Y une las secuencias X y Z. En otra realización ilustrada en la Fig. 3E, dichas una o más sondas que contienen las secuencias X y Z pueden ser parte del propio oligonucleótido de férula. En estas realizaciones, el producto de ligadura puede tener forma de "mancuerna", como se muestra en la figura 3E.
En estas realizaciones, el sistema de sondas puede comprender además un par de cebadores de PCR que hibridan con dichas una o más sondas que comprenden las secuencias X y Z, lo que permite de este modo que se amplifique la parte central del producto de ligadura (es decir, la parte que contiene las secuencias A y B). En algunas realizaciones, por ejemplo, la realización mostrada en la Fig. 3B, el sistema de sondas puede comprender además un cebador de amplificación de círculo rodante que hibrida con una secuencia en la sonda de la estructura principal, facilitando así la amplificación de esos productos mediante la amplificación de círculo rodante. En algunas realizaciones, el sistema de sondas puede comprender un cebador de amplificación de círculo rodante que hibrida con una secuencia con la sonda de la estructura principal y hasta cuatro oligonucleótidos marcados de forma distinguible, en donde cada uno de los oligonucleótidos marcados que pueden distinguirse hibrida con el complemento de una secuencia B'. Esto se explicará con mayor detalle a continuación.
De este modo, algunas realizaciones del sistema de sondas pueden comprender oligonucleótidos de férula, una sonda de la estructura principal y uno o más oligonucleótidos específicos de locus. El sistema de sondas también puede comprender uno o más cebadores de amplificación, tal como un cebador de amplificación de círculo rodante que hibrida con una secuencia en la sonda de la estructura principal o un par de cebadores de PCR que hibridan con sitios en la sonda de la estructura principal y opcionalmente, una o más sondas marcadas que hibridan con el complemento del oligonucleótido específico de locus.
Como se ha indicado anteriormente, la secuencia A' varía entre los diferentes miembros del conjunto y cada una de las secuencias de A' se diseña para ser complementaria a un fragmento diana diferente de un genoma. Las secuencias de A' pueden variar independientemente en longitud y secuencia y en algunos casos, puede estar en el intervalo de 8 a 80 nucleótidos, por ejemplo, 10 a 60 nucleótidos, en longitud, dependiendo de la longitud y de la secuencia de los fragmentos diana. La secuencia B' identifica el locus del que se deriva el fragmento adyacente (por ejemplo, un cromosoma en particular, tal como el cromosoma 18 o 21, etc.). La secuencia B' puede tener cualquier longitud adecuada, pero en algunas realizaciones está en el intervalo de 8 a 30 nucleótidos de longitud. Dentro de cualquier ensayo individual, las secuencias X' y Z' son diferentes entre sí y no son variables. Las secuencias X' y Z' pueden tener cualquier longitud adecuada, pero en algunas realizaciones están independientemente en el intervalo de 8 a 30 nucleótidos de longitud, aunque pueden usarse secuencias más largas o más cortas. La longitud total de los oligonucleótidos de férula puede estar en el intervalo de 50 a 200 nucleótidos. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos de férula pueden estar biotinilados, permitiendo de este modo que los productos de ligadura (analizados a continuación) se aíslen de otros productos, sin ligar, antes de la amplificación. Como sería evidente, las secuencias X y Z (que pueden ser de cualquier longitud adecuada pero que en algunas realizaciones están independiente en el intervalo de 8 a 30 nucleótidos de longitud) no son variables e hibridan con las secuencias X' y Z'. El oligonucleótido específico de locus es de secuencia B que puede ser, de nuevo, de cualquier longitud adecuada, por ejemplo, en el intervalo de 8 a 30 nucleótidos de longitud.
Como se ha indicado anteriormente, los complejos producidos utilizando el sistema de sondas descrito anteriormente pueden ser lineales o circulares (como se muestra en la Fig. 3). La figura 4 ilustra algunas de las características de la realización circular ilustrada en la figura 3B.
Como se muestra en la Fig. 4, en algunas realizaciones, el sistema de sondas puede comprender el conjunto de oligonucleótidos de férula2(de fórmula X'-A'-B'-Z', que puede estar en la orientación de 5' a 3' o de 3' a 5'), una sonda de la estructura principal6de fórmula X-Y-Z, donde las secuencias X y Z no son variables e hibridan con las secuencias X' y Z' en una orientación invertida (es decir, de modo que los extremos de la estructura principal apunten uno hacia el otro, como se muestra) y un conjunto de oligonucleótidos específicos de locus8es de secuencia B. La secuencia Y en la sonda de la estructura principal puede tener cualquier longitud conveniente, por ejemplo, 20 a 100 nucleótidos. La longitud global de la sonda de la estructura principal6puede estar en el intervalo de 50 a 300 nucleótidos de longitud o más en ciertos casos.
Como se muestra en la Fig. 4, el conjunto de sondas que se caracteriza en los diversos oligonucleótidos puede hibridar con fragmentos genómicos para producir un primer conjunto de complejos circulares que pueden ligarse10(es decir, un complejo en el que los extremos de la sonda de la estructura principal6, un oligonucleótido específico de locus8y un fragmento genómico4adyacentes pueden ligarse entre sí y se mantienen adyacentes que pueden ligarse entre sí mediante un oligonucleótido de férula2).Como se muestra en el ejemplo ilustrado, la sonda de la estructura principal6,el oligonucleótido específico del locus8y el fragmento4hibridan con los primeros oligonucleótidos de férula2para producir un conjunto de complejos circulares que pueden ligarse10de fórmula X-A-B-Z-Y, donde la secuencia Y une las secuencias X y Z. Los fragmentos4que están presentes en este conjunto de complejos circulares que puede ligarse10pueden ser de al menos 2, al menos 5, al menos 10 o al menos 50 o más loci diferentes (por ejemplo, cromosomas diferentes) y la identidad del locus del que se deriva un fragmento adyacente (por ejemplo, los cromosomas particulares) se proporciona por el oligonucleótido específico de locus8,que tiene la misma secuencia para cada locus. En este ejemplo, la secuencia A y la A' (que corresponden a las secuencias de diferentes fragmentos genómicos) varían, la B y la B' (el identificador de locus) varían y las secuencias X, Y y Z no varían.
Como se describirá con mayor detalle a continuación, en esta realización, el sistema de sondas (que comprende un primer conjunto de oligonucleótidos de férula2,una sonda de la estructura principal6y un oligonucleótido específico de locus8)puede hibridar con una muestra que comprende fragmentos de un genoma4para producir un primer conjunto de complejos circulares que pueden ligarse de fórmula X-A-B-Z-Y10,como se muestra. Después de la ligadura de los complejos circulares que pueden ligarse para producir un primer conjunto de moléculas circulares de ADN12de fórmula X-A-B-Z-Y, el primer conjunto de moléculas circulares de ADN se puede amplificar mediante amplificación de círculo rodante (RCA) para producir un primer conjunto de productos de RCA16.La RCA se puede hacer usando un cebador de amplificación de círculo rodante14que hibrida con una secuencia en la sonda de la estructura principal6,como se ilustra en la Fig. 4 o usando cebadores de PCR que hibridan con sitios que flanquean el fragmento ligado. De este modo, en ciertas realizaciones, el sistema de sondas puede comprender adicionalmente un cebador de amplificación de círculo rodante14,cebador que hibrida con una secuencia en la sonda de la estructura principal6o un par de cebadores de PCR que hibridan con sitios que flanquean el fragmento ligado. Tras la RCA, la "fuente" del fragmento clonado en un producto de RCA particular16(es decir, el locus, por ejemplo, el cromosoma particular, del que se deriva el fragmento genómico clonado) puede determinarse hibridando un primer oligonucleótido marcado18con el complemento de la secuencia B (es decir, B') o mediante secuenciación. Como sería evidente, el oligonucleótido marcado18puede comprender al menos algo de la secuencia B. De este modo, en ciertas realizaciones, el sistema de sondas puede comprender adicionalmente un oligonucleótido marcado que hibrida con el complemento del primer oligonucleótido específico de locus8.
Como sería evidente, si tienen que detectarse secuencias de dos o más loci diferentes en la misma reacción, el sistema de sondas puede comprender oligonucleótidos adicionales marcados de forma distinguible, uno para cada identificador de locus B, para que ambos conjuntos de productos de RCA puedan identificarse al mismo tiempo. En estas realizaciones, el sistema de sondas puede comprender además hasta cuatro oligonucleótidos marcados de forma distinguible (por ejemplo, B<1>, B<2>, B<3>, B<4>), donde cada uno de los oligonucleótidos marcados que pueden distinguirse hibrida con el complemento de una secuencia B' (por ejemplo, B<1>', B<2>', B<3>', B<4>').
Como sería evidente, los fragmentos con los que hibridan los oligonucleótidos de férula son fragmentos de restricción del genoma que se analiza. Además, cualquiera de las sondas, oligonucleótidos o cebadores descritos anteriormente (por ejemplo, la sonda de la estructura principal) puede contener un código de barras molecular (por ejemplo, una secuencia de indexación, tal como una secuencia aleatoria o semialeatoria), de modo que cada molécula circular de ADN pueda distinguirse por la combinación del fragmento clonado y el código de barras, lo que permite contar cuántas moléculas iniciales se secuenciaron, incluso después de que las moléculas se hayan amplificado (véase, por ejemplo, Casbonet al.).
También se divulgan métodos que, sin embargo, no forman parte de la invención reivindicada
En el presente documento se divulga un método que comprende: (a) hibridar un sistema de sondas como se ha descrito anteriormente, con una muestra genómica de prueba que comprende fragmentos de un genoma para producir complejos que puede ligarse de fórmula X-A-B-Z; (b) ligar los complejos que pueden ligarse para producir moléculas de A<d>N producto de fórmula X-A-B-Z; y (c) contar las moléculas de<a>D<n>producto correspondientes a cada identificador de locus de la secuencia B. En algunas realizaciones, el recuento se puede realizar secuenciando las moléculas de ADN producto o los productos de amplificación de las mismas, para producir lecturas de secuencias y contar el número de lecturas de secuencias que comprende cada secuencia de B.
En realizaciones en las que las moléculas de ADN producto son circulares, el recuento puede comprender la amplificación de las moléculas de ADN producto mediante amplificación de círculo rodante y el recuento del número de productos de amplificación que comprenden cada secuencia de B. En estas realizaciones, el método puede comprender marcar los productos de r Ca utilizando sondas marcadas de forma distinguible que hibridan con la secuencia B y el recuento se realiza contando el número de productos de RCA para cada marcador distinguible. Los principios generales de una implementación de este método se muestran en la Fig. 4. Como sería evidente, los fragmentos con los que hibridan los oligonucleótidos de férula pueden ser (independientemente) fragmentos de restricción de las cadenas superior o inferior del genoma que se está analizando. Estos fragmentos se pueden generar digiriendo el genoma con una o más enzimas de restricción (por ejemplo, una combinación de enzimas que tienen una secuencia de reconocimiento de cuatro bases) y a continuación, desnaturalizar la muestra digerida. De este modo, los fragmentos que se clonan tienen extremos definidos, permitiendo así el diseño de oligonucleótidos de férula para clonar esos fragmentos. Hay otras formas de generar fragmentos que tienen extremos definidos (por ejemplo, métodos que usan endonucleasa flap, exonucleasa, relleno de hueco, etc.).
Como se ha indicado anteriormente, este método se puede multiplexar para proporcionar una forma de analizar dos o más loci diferentes, como se muestra en la Fig. 5. Con referencia a la Fig. 5, una muestra que contiene fragmentos de ADN genómico40puede: a) hibridar con un sistema de sondas42que comprende: (i) un primer juego de sondas de férula, como se ha descrito anteriormente; (ii) un oligonucleótido específico del primer locus, como se ha descrito anteriormente; (iii) un segundo juego de sondas de férula, como se ha descrito anteriormente; (iv) un segundo oligonucleótido específico de locus, como se ha descrito anteriormente; y (v) una sonda de la estructura principal, como se ha descrito anteriormente, para producir una mezcla44que comprende el primer conjunto de complejos circulares que pueden ligarse de fórmula XABZY (que contienen fragmentos del primer locus, por ejemplo, un primer cromosoma, así como fragmentos de un segundo locus, por ejemplo, un segundo cromosoma). A continuación, el método comprende (b) ligar los complejos circulares que pueden ligarse para producir una mezcla de moléculas circulares de ADN46(que contiene el primer y el segundo conjunto de moléculas circulares de ADN) y después de tratar la muestra con una exonucleasa para eliminar las moléculas de ácidos nucleicos lineales, (c) amplificar las moléculas circulares de ADN46mediante amplificación de círculo rodante utilizando un cebador único que hibrida con la sonda de la estructura principal, para producir productos de RCA48.El locus de cada uno de los fragmentos contenidos dentro de cada producto de RCA, a continuación, puede identificarse mediante la hibridación de los productos de RCA con la primera y la segunda sonda de oligonucleótido marcadas de forma distinguible, que hibridan con el complemento del oligonucleótido específico del locus que está presente en cada uno de los productos, para producir una muestra marcada50. En estas realizaciones, el método puede comprender: (d) detectar por separado: (i) productos de RCA que contienen fragmentos de un primer locus utilizando una sonda marcada que hibrida con una secuencia identificadora del primer locus y (ii) productos de RCA que contienen fragmentos de un segundo locus utilizando una sonda marcada que hibrida con una secuencia identificadora del segundo locus, en donde las sondas marcadas están marcadas de forma distinguible. Como se ha indicado anteriormente, después de la ligadura, si los oligonucleótidos de férula están biotinilados, los productos circulares pueden aislarse de los productos no ligados utilizando, por ejemplo, perlas de estreptavidina. En cualquier caso, la muestra ligada puede tratarse con una exonucleasa, eliminando así moléculas de ADN lineales de la reacción. Este principio puede ampliarse para contar el número de productos de ligadura producidos para cualquier número de loci (por ejemplo, 3, 4, hasta 10 o hasta 100 o más loci).
En algunas realizaciones, la etapa de detección (d) puede comprender: (i) depositar los productos de RCA en un soporte; y (ii) contar por separado el número de productos de RCA marcados individuales que están marcados con un marcador y el número de productos de RCA marcados individuales marcados con otro marcador en un área del soporte. Como se entendería, la hibridación de los oligonucleótidos marcados se puede realizar antes de que los productos de RCA se distribuyan sobre el soporte o después de que los productos de RCA se distribuyan sobre el soporte.
Dicho de otro modo, el número de productos de amplificación de círculo rodante correspondiente a cada locus se puede estimar mediante, por ejemplo, la distribución de los productos de RCA sobre la superficie de un soporte (un portaobjetos o una membrana porosa), la hibridación de los productos de RCA usando oligonucleótidos marcados (por ejemplo, oligonucleótidos marcados con fluorescencia) y a continuación, contar el número de señales discretas en un área del soporte, por ejemplo, utilizando un lector de fluorescencia. El marcaje puede realizarse antes o después de que los productos se hayan distribuido en el soporte y dado que cada producto de RCA contiene miles de copias de las mismas secuencias, debe haber miles de sitios de unión para los oligonucleótidos marcados, aumentando así la señal. En realizaciones de multiplexado (por ejemplo, en las que se cuentan los productos de RCA correspondientes a dos locus diferentes), los productos de RCA correspondientes a un locus pueden marcarse con un fluoróforo y los productos de RCA correspondientes a otro locus pueden marcarse con un fluoróforo diferente, permitiendo así que los diferentes productos de RCA se cuenten por separado.
En ciertas realizaciones, el método puede comprender (a) filtrar una muestra líquida que contiene los productos de amplificación de círculo rodante (RCA) a través de una membrana capilar transparente porosa, concentrando así los productos de RCA y produciendo una serie de productos de RCA sobre la membrana; (b) marcar con fluorescencia los productos de RCA antes o después de la etapa (a); y (c) contar el número de productos de RCA individuales marcados en un área de la membrana, proporcionando así una estimación del número de productos de RCA marcados en la muestra. En algunas realizaciones, la membrana capilar transparente porosa puede ser una membrana de óxido de aluminio anódico poroso. En estas realizaciones, la etapa de marcaje (b) se puede realizar mediante la hibridación de oligonucleótidos marcados con fluorescencia con los productos de RCA, antes o después de la etapa (a). En ciertas realizaciones, el método puede comprender la formación de imágenes de un área de la membrana para producir una o más imágenes y contar el número de productos de RCA marcados individuales en dichas una o más imágenes. Los ejemplos de dichos métodos se describen en PCT/IB2016/052495, presentada el 2 de mayo de 2016.
La cuantificación de señales de productos de RCA individuales es importante porque en muchas aplicaciones (por ejemplo, diagnóstico prenatal no invasivo mediante análisis de ADNlc), el número de fragmentos correspondientes a cromosomas particulares (por ejemplo, cromosoma 21) debe determinarse con precisión y sin sesgos. Los métodos de análisis típicos utilizan PCR que, como es bien sabido, es un procedimiento muy sesgado, en el sentido de que algunas secuencias se amplifican con eficiencias mucho mayores que otras. Esto hace que las estrategias basadas en PCR no sean prácticas para muchos esfuerzos de diagnóstico.
En realizaciones particulares, la muestra puede contener múltiples poblaciones de productos de RCA (por ejemplo, dos, tres o cuatro o más poblaciones de productos de RCA, tal como una primera población de productos de RCA marcados y una segunda población de productos de RCA), donde las diferentes poblaciones de productos de RCA están marcadas de forma distinguible, lo que significa que los miembros individuales de cada una de las poblaciones de marcadores de productos de RCA se pueden detectar y contar de forma independiente, incluso cuando las poblaciones son mixtas. Los pares de marcadores fluorescentes que pueden distinguirse adecuados útiles en los métodos en cuestión incluyen, por ejemplo, Cy-3 y Cy-5 (Amersham Inc., Piscataway, Nueva Jersey), Quasar 570 y Quasar 670 (tecnología Biosearch, Novato, California), Alexafluor555 y Alexafluor647 (Molecular Probes, Eugene, Oregón), BODIPY V-1002 y BODIPY V1005 (Molecular Probes, Eugene, Oregón), POPO-3 y TOTO-3 (Molecular Probes, Eugene, Oregón) y POPRO3 TOPRO3 (Molecular Probes, Eugene, Oregón). Otros marcadores detectables que pueden distinguirse adecuados se pueden encontrar en, por ejemplo, Krickaet al.(Ann Clin Biochem. 39:114-29, 2002). Por ejemplo, los productos de RCA pueden marcarse con cualquier combinación de ATTO, ALEXA, CY o colorantes diméricos de cianina, tal como YOYO, TOTO, etc. También se pueden utilizar otros marcadores.
En algunos casos, una población de productos de RCA se puede marcar de forma distinguible marcándola con múltiples marcadores, aumentando así las posibilidades de multiplexado. Por ejemplo, en algunos casos, una población puede marcarse con dos colorantes que pueden distinguirse (por ejemplo, Cy3 y Cy5), que cuando se lea, se podrá distinguir de las poblaciones que están marcadas con los colorantes individuales (por ejemplo, Cy3 o Cy5). En algunas realizaciones, una primera población de productos de RCA representa una población de "prueba" de productos de RCA marcados y una segunda población de productos de RCA representa una población de "referencia" de productos de RCA con la que se puede comparar el número de los primeros productos de RCA. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una primera población de productos de RCA puede corresponder a una primera región cromosómica (por ejemplo, un primer cromosoma, tal como el cromosoma 21) y una segunda población de productos de RCA puede corresponder a una segunda región cromosómica (por ejemplo, un segundo cromosoma, tal como el cromosoma 13 o 18 o una región diferente del primer cromosoma) y el número de la primera población de productos de RCA y la segunda población de productos de RCA se pueden contar y comparar para determinar si hay una diferencia en número de copias de las regiones (indicando que hay duplicación o deleción de la región de prueba). En algunas realizaciones, la muestra contiene al menos una primera población de productos de RCA y una segunda población de productos de RCA, en donde la primera y la segunda población de productos de RCA marcados se marcan de forma distinguible en la etapa de marcado (etapa (b)). En estas realizaciones, el método comprende contar el número de los primeros productos de RCA marcados en un área de la membrana y contar el número de los segundos productos de RCA marcados en un área (la misma área o un área diferente) de la membrana, proporcionando así una estimación del número de las poblaciones primera y segunda de productos de RCA en la muestra. Esta realización puede implicar además comparar el número de los primeros productos de RCA en la muestra con el número de los segundos productos de RCA en la muestra.
En algunas de estas realizaciones del método, el método puede comprender la obtención de imágenes de la primera y la segunda población de productos de RCA marcados para producir una o más imágenes (por ejemplo, una primera imagen y una segunda imagen, respectivamente) y opcionalmente, (i) contar el número de productos de RCA marcados en dichas una o más imágenes, proporcionando así una estimación del número de las poblaciones primera y segunda de productos de RCA marcados en la muestra. La primera y la segunda población de productos de RCA marcados pueden detectarse por separado usando métodos conocidos (por ejemplo, usando filtros adecuados, etc.). Estas realizaciones del método pueden comprender además comparar el número de los primeros productos de RCA marcados en la muestra con el número de los segundos productos de RCA marcados en la muestra. Esta etapa del método puede implicar contar al menos 1.000 (por ejemplo, al menos 5.000, al menos 10.000, al menos 20.000, al menos 50.000, al menos 100.000, al menos 500.000 hasta 1 millón o más) productos de RCA marcados en la primera población, al menos 1.000 (por ejemplo, al menos 5.000, al menos 10.000, al menos 20.000 o al menos 50.000, al menos 100.000, al menos 500.000 hasta 1 millón o más) productos de RCA marcados en un área de la membrana y el recuento, asegurando así que una diferencia en el número de copias puede considerarse con rigor estadístico.
En realizaciones alternativas, los fragmentos clonados en las moléculas de ADN (y opcionalmente, cualquier secuencia de indexación en las moléculas circulares de ADN) puede amplificarse por PCR utilizando cebadores de PCR que hibridan o que son los mismos que los sitios que flanquean esas secuencias. En esta realización, un producto de<p>C<r>se puede amplificar utilizando los cebadores. En esta realización, la cantidad del producto se puede cuantificar mediante cualquier ensayo de qPCR adecuado, por ejemplo, un ensayo TaqMan o similar. En otra realización, el producto se puede secuenciar (con o sin amplificación). En estas realizaciones, la cantidad de moléculas circulares correspondientes a cada locus se puede estimar contando el número de lecturas de secuencia correspondientes al locus (por ejemplo, contando cuántas lecturas de secuencia tienen una secuencia de código de barras específica de locus particular). En algunas realizaciones, si se utiliza una secuencia de indexación, el número de moléculas circulares correspondientes a cada locus se puede contar determinando cuántas secuencias de código de barras moleculares diferentes se asocian con cada secuencia de código de barras específica del locus
Como sería evidente, en esta realización, los cebadores utilizados pueden contener secuencias compatibles con su uso, por ejemplo, en el método de terminación reversible de Illumina, el método de pirosecuenciación de Roche (454), la secuenciación por ligadura de Life Technologies (la plataforma SOLiD) o la plataforma de Ion Torrent de Life Technologies. En las siguientes referencias se describen ejemplos de tales métodos: Margulieset al.(Nature 2005 437: 376-80); Ronaghiet al.(Analytical Biochemistry 1996242: 84-9); Shendure (Science 2005309: 1728); Imelfortet al.(Brief Bioinform. 2009 10:609-18); Foxet al.(Methods Mol Biol. 2009;553:79-108); Applebyet al.(Methods Mol Biol.
2009;513:19-39) y Morozova (Genomics. 2008 92:255-64), a los que se hace referencia para las descripciones generales de los métodos y las etapas particulares de los métodos, incluyendo todos los productos de partida, reactivos y productos finales para cada una de las etapas.
La muestra genómica de prueba puede ser de una paciente de la que se sospecha que tiene o que está en riesgo de tener una enfermedad o afección y los resultados de la etapa (c) pueden ser una indicación de si la paciente o el feto de la misma, tiene la enfermedad o la afección. En algunas realizaciones, la enfermedad o la afección puede ser un cáncer, una enfermedad infecciosa, una enfermedad inflamatoria, un rechazo de trasplante o un defecto cromosómico, tal como una trisomía.
Como se ha indicado anteriormente, en algunos casos, la muestra que se analiza con este método puede ser una muestra de ADNlc obtenida de sangre, por ejemplo, de la sangre de una mujer embarazada. En estas realizaciones, el método puede usarse para detectar anomalías cromosómicas en el feto en desarrollo (como se ha descrito anteriormente) o para calcular la fracción de ADN fetal en la muestra, por ejemplo.
Las anomalías del número de copias ilustrativas que pueden detectarse utilizando el método incluyen, pero sin limitación, trisomía 21, trisomía 13, trisomía 18, trisomía 16, XXY, XYY, XXX, monosomía X, monosomía 21, monosomía 22, monosomía 16 y monosomía 15. En la tabla siguiente se enumeran otras anomalías del número de copias que pueden detectarse utilizando el presente método.
Cromosoma Anomalía y asociación con enfermedades
X: XO (síndrome de Turner)
Y: XXY (síndrome de Klinefelter)
Y: XYY (síndrome de la doble Y)
Y: XXX (síndrome de Trisomía X)
Y: XXXX (síndrome de las cuatro X)
Y: deleción de Xp21 (síndrome de Duchenne/Becker, hipoplasia suprarrenal congénita, enfermedad granulomatosa crónica)
Y: deleción de Xp22 (deficiencia de la esteroide sulfatasa)
Y: deleción de Xq26 (enfermedad linfoproliferativa ligada al cromosoma X) 1: 1p, somática (neuroblastoma)
1: monosomía (neuroblastoma)
1: trisomía (neuroblastoma)
2: monosomía (retraso del crecimiento, retraso del desarrollo y mental y anomalías físicas menores)
(continuación)
Cromosoma Anomalía y asociación con enfermedades
2: trisomía 2q (retraso del crecimiento, retraso del desarrollo y mental y anomalías físicas menores)
3: monosomía (linfoma no Hodgkin)
3: trisomía somática (linfoma no Hodgkin)
4: monosomía (leucemia no linfocítica aguda (ANLL))
4: trisomía somática (leucemia no linfocítica aguda (ANLL))
5: 5p (Cri du chat; síndrome de Lejeune)
5: 5q, somática (síndrome mielodisplásico)
5: monosomía (síndrome mielodisplásico)
5: trisomía (síndrome mielodisplásico)
6: monosomía (sarcoma de células claras)
6: trisomía somática (sarcoma de células claras)
7: deleción de 7q11.23 (síndrome de William)
7: monosomía (síndrome de monosomía 7 de la infancia;
7: somática: adenomas corticales renales; síndrome mielodisplásico) trisomía (síndrome de monosomía 7 de la infancia; somática: adenomas corticales renales; síndrome mielodisplásico)
8: deleción de 8q24.1 (síndrome de Langer-Giedon)
8: monosomía (síndrome mielodisplásico; síndrome de Warkany; somática: leucemia mielógena crónica)
8: trisomía (síndrome mielodisplásico; síndrome de Warkany; somática: leucemia mielógena crónica)
9: monosomía 9p (síndrome de Alfi)
9: monosomía 9p (síndrome de Rethore)
9: trisomía parcial (síndrome de Rethore)
9: trisomía (síndrome de trisomía 9 completa; síndrome de trisomía 9 en mosaico) 10: monosomía (ALL o ANLL)
10: trisomía somática (ALL o ANLL)
11: 11p- (Aniridia; tumor de Wilms)
11: 11q- (síndrome de Jacobsen)
11: monosomía (linaje mieloide afectado (ANLL, SMD))
11: trisomía somática (linajes mieloides afectados (ANLL, MDS))
12: monosomía (CLL, tumor de células de la granulosa juvenil (JGCT))
12: trisomía somática (CLL, tumor de células de la granulosa juvenil (JGCT))
13: 13q- (síndrome de 13q; síndrome de Orbeli)
13: deleción de 13q14 (retinoblastoma)
13: monosomía (síndrome de Patau)
13: trisomía (síndrome de Patau)
14: monosomía (trastornos mieloides (MDS, ANLL, CML atípica)
14: trisomía somática (trastornos mieloides (MDS, ANLL, c Ml atípica)
15: deleción de 15q11 -q13 (Prader-Willi, síndrome de Angelman)
15: monosomía (Prader-Willi, síndrome de Angelman)
15: trisomía somática (linaje mieloide y linfoide afectado, por ejemplo, MDS, ANLL, ALL, CLL)
16: deleción de 16q13.3 (Rubenstein-Taybi)
16: monosomía (carcinomas de células renales papilares (malignos))
16: trisomía somática (carcinomas de células renales papilares (malignos))
17: 17p- somática (síndrome de 17p en neoplasias malignas mieloides)
17: deleción de 17q11.2 (Smith-Magenis)
17: 17q13.3 (Miller-Dieker)
17: monosomía (adenomas corticales renales)
17: trisomía, somática (adenomas corticales renales)
17: 17p11.2-12 (síndrome de Charcot-Marie Tooth tipo 1; HNPP)
18: trisomía (síndrome de Charcot-Marie Tooth tipo 1; HNPP)
18: 18p- (síndrome de monosomía parcial 18p o síndrome de Grouchy Lamy Thieffry) 18: 18q- (síndrome de Grouchy Lamy Salmon Landry)
18: monosomía (síndrome de Edwards)
19: trisomía (síndrome de Edwards)
19: monosomía (síndrome de Edwards)
20: trisomía (síndrome de Edwards)
20: 20p- (síndrome de trisomía 20p)
20: deleción de 20p11.2-12 (Alagille)
20: 20q- (somática: MDS, ANLL, policitemia vera, leucemia neutrofílica crónica) (continuación)
Cromosoma Anomalía y asociación con enfermedades
20: monosomía (carcinomas de células renales papilares (malignos))
20: trisomía somática (carcinomas de células renales papilares (malignos)) 21: monosomía (síndrome de Down)
21: trisomía (síndrome de Down)
22: deleción de 22q11.2 (síndrome de DiGeorge, síndrome velocardiofacial, síndrome de anomalía conotruncal de la cara, síndrome de Opitz G/BBB autosómico dominante, síndrome cardiofacial de Caylor)
22: monosomía (síndrome de trisomía 22 completa)
22: trisomía (síndrome de trisomía 22 completa)
El método descrito en el presente documento se puede emplear para analizar el ADN genómico de prácticamente cualquier organismo, incluyendo, aunque sin limitación, plantas, animales (por ejemplo, reptiles, mamíferos, insectos, gusanos, peces, etc.), muestras de tejido, bacterias, hongos (por ejemplo, levaduras), fagos, virus, tejido cadavérico, muestras arqueológicas/antiguas, etc. En ciertas realizaciones, el ADN genómico utilizado en el método puede proceder de un mamífero, donde en ciertas realizaciones el mamífero es un ser humano. En realizaciones ilustrativas, la muestra genómica puede contener ADN genómico de una célula de mamífero, tal como, una célula de ser humano, de ratón, de rata o de mono. La muestra puede estar hecha de células cultivadas o células de una muestra clínica, por ejemplo, una biopsia de tejido, raspado o lavado o células de una muestra forense (es decir, células de una muestra recogida en una escena de un crimen). En realizaciones particulares, la muestra de ácido nucleico puede obtenerse de una muestra biológica, tal como células, tejidos, fluidos corporales y heces. Los fluidos corporales de interés incluyen, pero sin limitación, sangre, suero, plasma, saliva, secreciones mucosas, flema, líquido cefalorraquídeo, líquido pleural, lágrimas, líquido del conducto lactal, linfa, esputo, líquido cefalorraquídeo, líquido sinovial, orina, líquido amniótico y semen. En realizaciones particulares, se puede obtener una muestra de un sujeto, por ejemplo, un ser humano. En algunas realizaciones, la muestra analizada puede ser una muestra de ADNlc obtenida de sangre, por ejemplo, de la sangre de una mujer embarazada.
Por ejemplo, en algunas realizaciones, se puede obtener una muestra de ADN y digerir la muestra con una o más enzimas de restricción (o una endonucleasa guiada por ARN, tal como cas9) para producir fragmentos predecibles (cuyo tamaño medio puede estar en el intervalo de 20-100 bases). El método descrito anteriormente se puede realizar sobre el ADN digerido y el número de fragmentos correspondientes a un locus (por ejemplo, un cromosoma) se puede comparar con el número de fragmentos correspondientes a otro locus (por ejemplo, otro cromosoma) utilizando el método descrito en el presente documento. Como se observa, el método puede usarse para identificar diferencias en el número de copias, por ejemplo, aneuploidías cromosómicas, que se asocian con una enfermedad o afección.
Como se ha indicado anteriormente, en algunos casos, la muestra analizada puede ser una muestra de ADNlc obtenida de sangre, por ejemplo, de la sangre de una mujer embarazada. En estas realizaciones, el método puede utilizarse para detectar anomalías cromosómicas en el feto en desarrollo o para calcular la fracción de ADN fetal en la muestra, por ejemplo.
KitsSe divulgan pero no forman parte de la invención reivindicada
Se divulgan kits para poner en práctica los métodos objeto, como se ha descrito anteriormente. En ciertas realizaciones, el kit puede comprender: (a) un conjunto de oligonucleótidos de férula de fórmula X'-A'-B'-Z', en donde: dentro del conjunto: (i) la secuencia de A' y de B' varía y (ii) las secuencias de X' y de Z' son diferentes entre sí y no son variables; y dentro de cada molécula: (i) la secuencia A' es complementaria a un fragmento de un genoma y (ii) la secuencia B' identifica el locus del que se deriva el fragmento genómico que hibrida con la secuencia A' adyacente; (b) una o más sondas que comprenden las secuencias X y Z, en donde: i. las secuencias X y Z no son variables e hibridan con la secuencia X' y la Z'; y (c) un conjunto de oligonucleótidos específicos de locus de secuencia B; y en donde: cada oligonucleótido de férula de (a) es capaz de hibridar con (i) las secuencias de sonda de (b); (ii) un oligonucleótido específico de locus de (c); y (iii) un fragmento genómico de (a), para producir un complejo que puede ligarse de fórmula X-A-B-Z, en el que la secuencia B identifica el locus de la secuencia A adyacente. En algunas realizaciones, dichas una o más sondas de (b) comprenden un primer oligonucleótido que comprende la secuencia X y un segundo oligonucleótido que comprende la secuencia Y. En algunas realizaciones, el kit puede comprender además un par de cebadores de PCR que hibridan con dichas una o más sondas que comprenden las secuencias X e Y. En ciertas realizaciones, dichas una o más sondas de (b) son unas sondas de la estructura principal de fórmula X-Y-Z y el complejo que puede ligarse es un complejo que puede ligarse circular de fórmula X-A-B-Z-Y, donde la secuencia Y une las secuencias X y Z y la secuencia B identifica el locus de la secuencia A adyacente. En estas realizaciones, el kit puede comprender además un cebador de amplificación de círculo rodante que hibrida con una secuencia en la sonda de la estructura principal. En estas realizaciones, el kit puede comprender una pluralidad de oligonucleótidos marcados de forma distinguible, en donde cada uno de los oligonucleótidos marcados que pueden distinguirse hibrida con el complemento de una secuencia B'. El kit puede contener adicionalmente una ligasa y/o una polimerasa de desplazamiento de cadena para realizar la amplificación de círculo rodante.
Los diversos componentes del kit pueden estar presentes en envases separados o ciertos componentes compatibles (por ejemplo, el primer y el segundo conjunto de sondas de férula y las sondas específicas de locus primera y segunda) pueden combinarse previamente en un solo envase, según se desee.
Además de los componentes antes mencionados, el kit objeto puede incluir además instrucciones para usar los componentes del kit para poner en práctica el método en cuestión.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar a los expertos en la materia una divulgación adicional y una descripción de cómo hacer y usar la presente invención y no están destinados a limitar el alcance de lo que los inventores consideran su invención ni están destinados a representar que los experimentos a continuación son todos o los únicos experimentos realizados.
EJEMPLO I
Método de validación de datos iniciales
El propósito de este experimento es comparar los métodos que utilizan oligonucleótidos de la estructura principal que son específicos de cromosoma (por ejemplo, el oligonucleótido de la estructura principal utilizado para capturar fragmentos de un primer cromosoma, por ejemplo, cromosoma 21, es diferente del oligonucleótido de la estructura principal utilizado para capturar fragmentos de un segundo cromosoma, por ejemplo, cromosoma 18, como se describe en los documentos WO2015083001 y WO2015083002), con métodos en los que se usa el mismo oligonucleótido de la estructura principal para todos los cromosomas examinados. Esto se ilustra en la Fig. 6. Como se muestra, en el diseño "nuevo", la fuente de un fragmento clonado se determina utilizando una secuencia específica de cromosoma (por ejemplo, A o B) que se clona en el mismo producto circular que el fragmento diana. En el método nuevo, se usa un solo oligonucleótido de estructura principal (en comparación con los múltiples oligonucleótidos de estructura principal en el método anterior) y los fragmentos clonados de todos los cromosomas se pueden amplificar utilizando el mismo cebador de RCA o un solo par de cebadores de PCR.
El ADN de la línea celular (10 ng) se digirió, se desnaturalizó e hibridó con los diseños "antiguo" y "nuevo" de sondas. Después de la hibridación y la ligadura, las reacciones de ligadura se sometieron a tratamiento con exonucleasa para eliminar cualquier ADN no circularizado en la solución. Los productos circulares restantes sirvieron como moldes en una reacción de RCA, que produjo copias concateméricas de los productos circulares. Estos productos de RCA se marcaron con oligonucleótidos marcados con fluorescencia complementarios a la secuencia de "férula" y se depositaron en un soporte sólido para su detección.
Se sometieron trece muestras de ADNlc de mujeres embarazadas a la misma reacción, como se ha descrito anteriormente.
Para todas las reacciones, se contó el número de objetos individuales (productos de RCA) en cada color. Se calculó la relación del número de objetos de color A/B para cada muestra y se calculó el coeficiente de variación como medida de precisión del ensayo. El bajo coeficiente de variación permite mediciones precisas de muestras con fracción fetal baja. Esto se ilustró añadiendo muestras que contenían una cantidad de adición (del inglés, "spike-in") baja de muestra de línea celular de trisomía 21.
De acuerdo con los datos mostrados en la Fig. 7, el diseño nuevo genera un CV más bajo tanto para el ADN de la línea celular como para el ADNlc, permitiendo una medición más precisa del ADN fetal con anomalías cromosómicas.
Sin pretender quedar ligado a teoría alguna, se cree que este método puede ser menos sensible a las impurezas en la muestra.
EJEMPLO II
Análisis de muestras clínicas
Se prepararon muestras de ADNlc de 26 personas embarazadas normales y de 4 portadoras de un feto con trisomía 21. La sangre (10 ml) de cada paciente se centrifugó para separar el plasma de los glóbulos rojos y de la capa leucocítica. El plasma correspondiente (~3-5 ml/paciente) se sometió a un protocolo de extracción de ADN basado en perlas, dando como resultado ADNlc extraído diluido en 50 ul de tampón.
A continuación, el ADNlc se sometió al método descrito en el presente documento anteriormente y se analizó mediante el recuento digital de productos de círculo rodante utilizando un microscopio de fluorescencia. Los 4 casos positivos se detectaron por encima de una puntuación z superior a 3. El CV de las muestras normales se calculó en un 0,49 %, lo que demuestra la alta precisión del ensayo.
Claims (12)
1. Un complejo de ácido nucleico que puede ligarse de fórmula X-A-B-Z, en donde en el complejo las secuencias X, A, B y Z adyacentes entre sí pueden ligarse y se mantienen en posición mediante un oligonucleótido de férula y en donde la secuencia A es un fragmento diana de un genoma, la secuencia B identifica el locus del que se deriva la secuencia A adyacente y en donde el oligonucleótido de férula tiene la fórmula X-A-B-Z'.
2. El complejo que puede ligarse de la reivindicación 1, en donde la secuencia A es un fragmento diana del genoma humano.
3. El complejo que puede ligarse de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde el fragmento diana es una cadena de fragmento de restricción.
4. El complejo que puede ligarse de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la secuencia B identifica una región en un cromosoma.
5. El complejo que puede ligarse de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la secuencia B identifica un brazo cromosómico particular.
6. El complejo que puede ligarse de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la secuencia B identifica un cromosoma particular.
7. El complejo que puede ligarse de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde la secuencia B indica que la secuencia A adyacente es del cromosoma 21.
8. El complejo que puede ligarse de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el complejo es un complejo que puede ligarse circular de fórmula X-A-B-Z-Y, donde la secuencia Y une las secuencias X y Z.
9. El complejo que puede ligarse de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el complejo es lineal.
10. El complejo que puede ligarse de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde el oligonucleótido de férula tiene la fórmula X'-A'-B'-Z' y en donde la secuencia A' está en el intervalo de 8 a 80 nucleótidos.
11. El complejo que puede ligarse de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde el oligonucleótido de férula tiene la fórmula X'-A'-B'-Z' y en donde la secuencia B' está en el intervalo de 8 a 30 nucleótidos de longitud.
12. El complejo que puede ligarse de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde, las secuencias X y Z están independientemente en el intervalo de 8 a 30 nucleótidos de longitud.
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