ES2963307T3 - Composición nutricional que comprende 2'-fucosil-lactosa y 3'-galactosil-lactosa - Google Patents

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Abstract

La invención se refiere a una composición nutricional para bebés o niños pequeños que comprende 2'fucosillactosa y 3'galactosilactosa, y preferiblemente ácido butírico dietético. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Composición nutricional que comprende 2'-fucosil-lactosa y 3'-galactosil-lactosa
CAMPO DE LA INVENCIÓN
[0001] La presente invención se refiere al campo de las fórmulas para bebés y para niños y a la mejora de la salud intestinal.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
[0002] La leche humana es el alimento preferido para los bebés. La leche humana proporciona varios factores bioactivos que benefician al sistema inmunitario relativamente inmaduro y a la salud intestinal de los neonatos en una etapa temprana de la vida. Los bebés alimentados con leche humana tienen una menor incidencia de infecciones que los bebés alimentados con fórmula. Se cree que muchos componentes de la leche humana, que incluyen inmunoglobulinas (como slgA), interleucina (IL)-1, IL-6, IL-8, IL-10, interferón-Y (IFN-<y>), células inmunocompetentes, factor de crecimiento transfomador-p (TGF-P), lactoferrina, nucleótidos y oligosacáridos de la leche humana (OLHs) desempeñan un papel en la protección contra la infección por patógenos.
[0003] Además, la maduración intestinal y el desarrollo de la microbiota en bebés alimentados con leche humana se consideran óptimos.
[0004] Sin embargo, no siempre es posible o deseable amamantar a un bebé. En dichos casos, las fórmulas para bebés o las fórmulas de continuación son una buena alternativa. Estas fórmulas deberían tener una composición óptima para imitar los efectos beneficiosos de la leche humana de la forma más similar posible.
[0005] La WO 2005/122790 divulga un método para estimular la integridad de la barrera mediante la administración de una composición que comprende ácido eicosapentaenoico (EPA), ácido docosahexaenoico (DHA) y ácido araquidónico (ARA), y al menos dos oligosacáridos diferentes. Los oligosacáridos actúan indirectamente al ser fermentados a ácidos grasos de cadena corta (AGCC) por la microbiota intestinal.
[0006] La WO 2016/013935 divulga el uso de un oligosacárido no digerible en la producción de una composición para proporcionar nutrición a un bebé que sufre un mayor riesgo de alergia alimentaria. Es preferible que el bebé tenga un mayor riesgo de exposición a las micotoxinas tricotecenas, por ejemplo, al comer muchos cereales. En los ejemplos, Vivinal GOS es la fuente de galactooligosacáridos.
[0007] La WO 2010/023422 divulga el uso de galactooligosacáridos para la prevención o el tratamiento de la inflamación. Se ha probado una mezcla de galactooligosacáridos.
[0008] La WO 2004/112509 divulga una composición para inducir un patrón de maduración de la barrera intestinal similar al observado con la lactancia. La composición ayuda a mejorar la maduración de la barrera intestinal, por ejemplo, durante el estrés neonatal. Se describe que la separación materna en ratas aumenta la permeabilidad intestinal y que una mezcla que contiene AGPICL,Lactobacillus paracaseiy oligosacáridos no digeribles puede restaurar la permeabilidad intestinal a niveles normales.
[0009] La US 2019/0029306 divulga composiciones para la promoción de la salud de la piel, como la prevención y el tratamiento de la dermatitis atópica, que comprenden al menos un oligosacárido fucosilado y al menos un oligosacárido N-acetilado, con una combinación de 2'-fucosil-lactosa y lacto-N-neotetraosa.
[0010] Aun existe la necesidad de mejorar las fórmulas para bebés y las composiciones para que los niños se acerquen más a la leche humana en estructura y función.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
[0011] Los inventores han descubierto que una combinación de los ingredientes nutricionales 2'-FL y 3'-GL tiene un efecto beneficioso sobre la función de barrera intestinal. También se ha descubierto que la respuesta del sistema inmunitario y la microbiota es diferente cuando están presentes tanto 2'-FL como 3'-GL en comparación con la presencia de uno solo de estos ingredientes. Se ha demostrado que la mezcla de 2'-FL y 3'-GL tiene un efecto beneficioso sobre la expresión de la fosfatasa alcalina, lo que es indicativo de una mejor maduración de la función de barrera intestinal y una mejor defensa contra las bacterias patógenas intestinales. Estos efectos se mejoraron aun más por la presencia de ácido butirato dietético. Por lo tanto, una composición nutricional que comprenda tanto 3'-GL como 2'-FL y, preferiblemente, además, ácido butírico, tendrá mejorados efectos sobre la salud de los bebés y niños.
LISTA DE FORMAS DE REALIZACIÓN
[0012]
1. Composición nutricional para bebés o niños, que es una alimentación con fórmula y que no es leche humana, que comprende:
a. 2'fructosil-lactosa (2'FL) en una cantidad de (i) 0,01 a 1 g de 2'FL por 100 ml de composición nutricional, (ii) 0,075 a 7,5 % en peso en base al peso seco; y/o 0,015 a 1,5 g/100 kcal, y b. beta 3'galactosil-lactosa (3'GL) en una cantidad de (i) 0,010 a 0,500 g por 100 ml; (ii) 0,075 a 3,75 % en peso en base al peso seco y/o (iii) 0,015 a 0,75 g por 100 kcal.
2. Composición nutricional según la forma de realización 1 comprende además butirato dietético.
3. Composición nutricional según una cualquiera de las formas de realización precedentes, donde la composición está al menos parcialmente fermentada, por bacterias productoras de ácido láctico y comprende del 0,1 al 1,5 % en peso de la suma de ácido láctico y lactato en base al peso seco de la composición nutricional, y donde al menos el 90 % en peso de la suma de ácido láctico y lactato es ácido L-láctico y L-lactato.
4. Composición nutricional según una cualquiera de las formas de realización precedentes, donde la composición comprende además AGPICL seleccionados del grupo de DHA, ARA y EPA, preferiblemente DHA y EPA, preferiblemente DHA, EPA y ARA, comprendiendo más preferiblemente al menos un 1 % en peso de la suma de DHA, ARA y EPA en base a los ácidos grasos totales.
5. Composición nutricional según cualquiera de las formas de realización precedentes, donde la fórmula comprende además galactooligosacáridos y/o fructooligosacáridos.
6. Composición nutricional según una cualquiera de las formas de realización precedentes, donde la composición nutricional se selecciona del grupo que consta de una fórmula para bebés, una fórmula de continuación o una fórmula para niños, preferiblemente una fórmula para bebés.
7. Composición nutricional según una cualquiera de las formas de realización precedentes, que comprende (i) del 0,3 al 5 % en peso de ácido butírico basado en los ácidos grasos totales; (ii) de 10 mg a 175 mg por 100 ml; (iii) de 15 a 250 mg por 100 kcal; y/o (iv) del 0,075 al 1,3 % en peso en base al peso seco.
8. Composición nutricional según cualquiera de las formas de realización precedentes, que comprende (i) de 0,2 a 0,5 g de la suma de galactooligosacáridos y fructooligosacáridos por 100 ml; (ii) de 0,3 a 7,5 g por 100 kcal; y/o (iii) del 1,5 al 35 % en peso en base al peso seco.
9. Composición nutricional según cualquiera de las formas de realización precedentes para usar en la mejora de la función de barrera intestinal y/o para usar en la mejora del sistema inmunitario y/o para usar en la mejora de la microbiota intestinal y/o para usar en el tratamiento o la prevención de infecciones, en particular infecciones intestinales.
10. Composición nutricional según cualquiera de las formas de realización precedentes para usar en el tratamiento y/o la prevención de alergias, para usar en la inducción de tolerancia a alérgenos, y/o para usar en la prevención y/o el tratamiento de la dermatitis atópica.
11. Composición nutricional para usar según la forma de realización 9 o 10 donde la composición nutricional se administra a bebés o niños, preferiblemente bebés.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
[0013] La presente invención se define por las reivindicaciones y se refiere a una composición nutricional para bebés o niños que comprende:
a. 2'-fucosil-lactosa
b. 3'galactosil-lactosa
[0014] Dicha 2'-fucosil-lactosa y la 3'galactosil-lactosa están presentes en las cantidades definidas en la reivindicación 1.
[0015] En una forma de realización preferida, la composición nutricional comprende, además, butirato dietético.
[0016] En otra forma de realización o una forma de realización más preferida, la composición nutricional es fermentada al menos parcialmente por bacterias productoras de ácido láctico y comprende del 0,1 al 1,5 % en peso de la suma de ácido láctico y lactato en base al peso seco de la composición nutricional, y donde al menos el 90 % en peso de la suma de ácido láctico y lactato es ácido L-láctico y L-lactato.
[0017] La composición nutricional se utiliza preferiblemente para mejorar la función de barrera intestinal, para mejorar el sistema inmunitario, para mejorar la microbiota intestinal, para tratar o prevenir infecciones, en particular infecciones intestinales, y/o para el tratamiento o la prevención de alergias, preferiblemente para inducir tolerancia oral a alérgenos.
Definiciones
[0018] En el contexto de la presente invención, el término "prevención" significa "reducir el riesgo de (ocurrencia)" o "reducir la gravedad de". El término "prevención de una cierta afección" también incluye "tratamiento de una persona con riesgo (aumentado) de dicha afección".
[0019] En este documento y en sus reivindicaciones, el verbo "comprender" y sus conjugaciones se usan en su sentido no limitativo para indicar que se incluyen los elementos que siguen a la palabra, pero no se excluyen los elementos que no se mencionan específicamente. Además, la referencia a un elemento mediante el artículo indefinido "un" o "una" no excluye la posibilidad de que esté presente más de uno de los elementos, a menos que el contexto requiera claramente que haya solo uno de los elementos. El artículo indefinido "un" o "una" generalmente significa "al menos un/a".
2 '-Fucosil-lactosa
[0020] La composición nutricional de la presente invención comprende 2'-fucosil-lactosa (2-'FL). Se descubrió que 2'-FL mejora la función de barrera intestinal. También se descubrió que 2'-FL mejora el sistema inmunitario. La fucosil-lactosa (FL) es un oligosacárido no digerible presente en la leche humana. No está presente en la leche bovina. Consiste en tres unidades de monosa, fucosa, galactosa y glucosa unidas entre sí. La lactosa es una unidad de galactosa unida a una unidad de glucosa a través de un enlace beta 1,4. Una unidad de fucosa está unida a una unidad de galactosa de una molécula de lactosa a través de un enlace alfa 1,2 (2'-fucosillactosa, 2'-FL) o a través de un enlace alfa-1,3 a la unidad de glucosa de una lactosa (3-fucosil-lactosa, 3-FL).
[0021] 2'-FL, preferiblemente a-L-Fuc-(1^-2)-p-D-Gal-(1^4)-D-Glc, está disponible comercialmente, por ejemplo, de Sigma-Aldrich. Alternativamente, se puede aislar de la leche humana, por ejemplo, como se describe en Andersson y Donald, 1981, J Chromatogr. 211:170-1744, o se puede producir mediante microorganismos modificados genéticamente, por ejemplo, como se describe en Albermannet al,2001,Carbohydrate Res.
334:97-103.
[0022] La composición nutricional según la invención comprende de 10 mg a 1 g de 2'-FL por 100 ml, más preferiblemente de 20 mg a 0,5 g, incluso más preferiblemente de 40 mg a 0,2 g de 2'-FL por 100 ml. En base al peso seco, la presente composición nutricional comprende del 0,075 % en peso al 7,5 % en peso de 2'-FL, más preferiblemente del 0,15 % en peso al 3,75 % en peso de 2'-FL, incluso más preferiblemente del 0,3 % en peso al 1,5 % en peso de 2'-FL. En base a la energía, la presente composición nutricional comprende de 0,015 a 1,5 g de 2'-FL por 100 kcal, más preferiblemente de 0,03 a 0,075 g de 2'-FL por 100 kcal, incluso más preferiblemente de 0,06 a 0,3 g de 2'-FL por 100 kcal. Una cantidad inferior de fucosil-lactosa será menos eficaz para estimular el sistema inmunitario o mejorar la función de barrera intestinal, mientras que una cantidad demasiado alta dará lugar a altos costos innecesarios del producto.
3 'galactosil-lactosa
[0023] La composición nutricional de la presente invención comprende 3'-galactosil-lactosa. Preferiblemente, la 3'-galactosil-lactosa es el trisacárido Gal-(beta 1,3)-Gal-(beta 1,4)-Glc. En el contexto de la invención, todas las menciones de 3-'GL se refieren a beta1,3'-galactosil-lactosa o beta3'-GL, a menos que se indique específicamente que este no es el caso. Este trisacárido se puede administrar en una matriz adecuada o en una composición nutricional. El trisacárido puede ser, por ejemplo, parte de una mezcla de galactooligosacáridos (GOS), preferiblemente beta-galactooligosacáridos (betaGoS). Se descubrió que beta3'-GL mejora la función de barrera intestinal.
[0024] Cuando se basa en el peso seco, la composición nutricional según la presente invención comprende del 0,07 al 3,75 % en peso de Gal (beta 1-3) - Gal (beta 1-4) - Glc, en base al peso seco de la composición nutricional. En una forma de realización preferida, la composición nutricional comprende del 0,07 al 0,375 % en peso de Gal (beta 1-3) - Gal (beta 1-4) - Glc, en base al peso seco de la composición nutricional. En otra forma de realización preferida, la composición nutricional comprende del 1,125 al 1,725 % en peso de Gal (beta 1-3) -Gal (beta 1-4) - Glc, en base al peso seco de la composición nutricional.
[0025] Cuando se basa en la energía, la composición nutricional según la presente invención comprende de 15 a 750 mg de Gal (beta 1-3) - Gal (beta 1-4) - Glc, por 100 kcal de la composición nutricional. En una forma de realización preferida, la composición nutricional comprende de 15 a 75 mg de Gal (beta 1-3) - Gal (beta 1-4) -Glc, por 100 kcal de la composición nutricional. En otra forma de realización preferida, la composición nutricional comprende de 225 a 375 mg de Gal (beta 1-3) - Gal (beta 1-4) - Glc, por 100 kcal de la composición nutricional.
[0026] Cuando se basa en el volumen, la composición nutricional según la presente invención comprende de 10 a 500 mg de Gal (beta 1-3) - Gal (beta 1-4) - Glc, por 100 ml de la composición nutricional. En una forma de realización preferida, la composición nutricional comprende de 10 a 50 mg de Gal (beta 1-3) - Gal (beta 1-4) -Glc, por 100 ml de la composición nutricional. En otra forma de realización preferida, la composición nutricional comprende de 150 a 250 mg de Gal (beta 1-3) - Gal (beta 1-4) - Glc, por 100 ml de la composición nutricional. Se sabe que la leche humana contiene niveles bajos de 3'-GL, en particular no superan los 5 mg/100 ml.
[0027] En una forma de realización preferida, la proporción en peso de 2'-FL a 3'-GL está en el rango de 10:1 a 1:10, preferiblemente de 5:1 a 1:5, más preferiblemente de 3:1 a 1:3.
Otros oligosacáridos
[0028] La beta1,3'-galactosil-lactosa puede ser parte de una mezcla de galactooligosacáridos (GOS), preferiblemente beta-galactooligosacáridos (BGOS). Es ventajoso añadir GOS a la presente composición nutricional, además de beta1,3'-galactosil-lactosa (beta3'-GL) específicamente. Una mezcla de GOS con diferentes tamaños y enlaces tendrá un mayor efecto beneficioso sobre la microbiota y una mejor producción de ácidos grasos de cadena corta, que, a su vez, tienen un efecto de mejora adicional sobre el sistema inmunitario y/o sobre el tratamiento o la prevención de infecciones, en particular infecciones intestinales. La presencia de GOS distintos de beta3'-GL tendrá, en particular, un efecto adicional sobre la función de barrera intestinal en el intestino grueso y el final del intestino delgado, mientras que la beta3'-GL será también y, sobre todo, eficaz en el intestino delgado. Por lo tanto, la combinación de 2'-FL y 3'-GL y GOS tendrá un efecto adicional mejorado sobre la salud, en particular sobre la mejora de la función de barrera intestinal, sobre la mejora del sistema inmunitario, sobre la mejora de la microbiota intestinal y/o sobre el tratamiento o la prevención de infecciones, en particular infecciones intestinales.
[0029] En el contexto de la invención, una forma adecuada de formar GOS es tratar la lactosa con betagalactosidasas. Según la especificidad de la enzima utilizada, una unidad de galactosa se hidroliza a partir de lactosa y se acopla a otra unidad de lactosa a través de un enlace beta para formar un trisacárido. Una unidad de galactosa también se puede acoplar a otra unidad de galactosa única para formar un disacárido. Las unidades de galactosa posteriores se acoplan para formar oligosacáridos. La mayoría de dichos oligosacáridos formados tienen un grado de polimerización (GP) de 7 o inferior. Dependiendo de la enzima, estos enlaces entre los residuos de galactosa pueden ser predominantemente beta1,4', beta1,6' o beta1,3'.
[0030] Una forma adecuada de preparar beta1,6' y/o beta1,4' GOS es utilizando la beta-galactosidasa deBacillus circulans.Una fuente disponible comercialmente de BGOS es Vivinal GOS de FrieslandCampina Domo (Amersfoort, Países Bajos). Vivinal GOS comprende BGOS principalmente con DP2-8 (pico en DP3) y principalmente con enlaces beta1,4' y beta1,6', donde los enlaces beta1,4' son más predominantes. Beta1,4'- y beta1,6'-galactosil-actosa se pueden enriquecer o purificar a partir de estas mezclas de GOS, como se conoce en la técnica, por ejemplo, mediante la cromatografía de exclusión por tamaño. Otra fuente comercialmente disponible de BGOS con enlaces predominantemente beta1,4' y/o beta 1,6' son Oligomate 55 y 50 de Yakult y Cup Oligo de Nissin Sugar. Alternativamente, beta1,4'- y beta1,6'-galactosil-lactosa están disponibles comercialmente como componentes únicos (Carbosynth).
[0031] Una forma adecuada de producir beta1,3' GOS es mediante el uso de una beta-galactosidasa de S.Thermophilus.Especialmente adecuado es el uso de beta-galactosidasa de la cepa CNCM I-1470 y/o CNCM I-1620 en un proceso, como se describe en el ejemplo 4 de FR2723960 o en el ejemplo 6 de EP0778885. S.thermophilusCNCM I-1620 fue depositado en virtud del Tratado de Budapest el 23 de agosto de 1995 en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos, ubicada en el Instituto Pasteur de París, Francia, por Compagnie Gervais Danone. La cepa S.thermophilusCNCM I-1620 también se denomina cepa S.thermophilusST065. S.thermophilusCNCM I-1470 fue depositada bajo el Tratado de Budapest el 25 de agosto de 1994 en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos, ubicada en el Instituto Pasteur de París, Francia, por Compagnie Gervais Danone. La composición de este GOS también se describe con más detalle en LeForestieret. al.,2009 Eur J Nutr, 48:457-464. Ambas cepas también se han publicado en la WO 96/06924. Otro GOS rico en beta1,3 y beta1,6 galactooligosacáridos disponible comercialmente es Bimuno de Clasado o Purimune de GTC Nutrition. Beta1,6'- y beta1,3'-galactosil-lactosa se pueden enriquecer o purificar a partir de estas mezclas de GOS, como se conoce en la técnica, por ejemplo, mediante cromatografía de exclusión por tamaño. Alternativamente, la beta1,3'-galactosil-lactosa pura está disponible comercialmente (Carbosynth).
[0032] Los GOS, incluidos los BGOS, no son digeribles. Las enzimas digestivas humanas (incluida la lactasa humana) no pueden hidrolizar GOS. Por lo tanto, cuando se consume, el GOS alcanza el intestino grueso intacto y está disponible para la fermentación por parte de la microbiota intestinal.
[0033] Preferiblemente, la composición nutricional comprende al menos 250 mg de GOS por 100 ml, más preferiblemente al menos 400, incluso más preferiblemente al menos 600 mg por 100 ml. Preferiblemente, la composición nutricional no comprende más de 2500 mg de GOS por 100 ml, preferiblemente no más de 1500 mg, más preferiblemente no más de 1000 mg. Más preferiblemente, la composición nutricional según la presente invención comprende GOS en una cantidad de 250 a 2500 mg/100 ml, incluso más preferiblemente en una cantidad de 400 a 1500 mg/100ml, incluso más preferiblemente en una cantidad de 600 a 1000 mg/100 ml.
[0034] Preferiblemente, la composición nutricional comprende al menos el 1,75 % en peso de GOS en base al peso seco de la composición total, más preferiblemente al menos el 2,8 % en peso, incluso más preferiblemente al menos el 4,2 % en peso, todo en base al peso seco de la composición total. Preferiblemente, la composición nutricional no comprende más del 17,5%en peso de GOS en base al peso seco de la composición total, más preferiblemente no más del 10,5 % en peso, incluso más preferiblemente no más del 7 % en peso. La composición nutricional según la presente invención comprende preferiblemente GOS en una cantidad del 1,75 al 17,5 % en peso, más preferiblemente en una cantidad del 2,8 al 10,5 % en peso, de la manera más preferible, en una cantidad del 4,2 al 7 % en peso, todo en base al peso seco de la composición total.
[0035] Preferiblemente, la composición nutricional según la presente invención comprende al menos 0,35 g de GOS por 100 kcal, más preferiblemente al menos 0,6 g, incluso más preferiblemente al menos 0,8 g por 100 kcal. Preferiblemente, la composición nutricional no comprende más de 3,7 g de GOS por 100 kcal, preferiblemente no más de 2,5 g por 100 kcal, más preferiblemente no más de 1,5 g por 100 kcal. Más preferiblemente, la composición nutricional según la presente invención comprende GOS en una cantidad de 0,35 a 3,7 g por 100 kcal, incluso más preferiblemente en una cantidad de 0,6 a 2,5 g por 100ml, incluso más preferiblemente en una cantidad de 0,8 a 1,5 g por 100 ml.
[0036] Las cantidades inferiores dan como resultado una composición menos eficaz, mientras que la presencia de cantidades mayores de GOS puede dar lugar a efectos secundarios, como alteraciones osmóticas, dolor abdominal, hinchazón, formación de gases y/o flatulencia.
[0037] La cantidad total de GOS, tal y como se define para la presente composición nutricional, incluye la cantidad de beta1,3'-galactosil-lactosa.
[0038] En una forma de realización preferida, la composición nutricional comprende de 0,25 a 2,5 g de galactooligosacáridos por 100 ml, donde de 10 mg a 500 mg por 100 ml de los galactooligosacáridos es Gal (beta 1-3) - Gal (beta 1-4) - Glc. En otra forma de realización preferida, la composición nutricional comprende de 0,25 a 2,5 g de galactooligosacáridos por 100 ml, donde la cantidad de Gal (beta 1-3) - Gal (beta 1-4) - Glc es superior al 20 % en peso en base a los galactooligosacáridos totales. En otra forma de realización preferida, la composición nutricional comprende de 0,25 a 2,5 g de galactooligosacáridos por 100 ml, donde la cantidad de Gal (beta 1-3) - Gal (beta 1-4) - Glc está comprendida entre 10-500 mg por 100 ml. En otra forma de realización preferida, la composición nutricional comprende de 0,25 a 2,5 g de galactooligosacáridos por 100 ml, donde la cantidad de Gal (beta 1-3) - Gal (beta 1-4) - Glc es superior al 20 % en peso en base a los galactooligosacáridos totales y donde la cantidad de Gal (beta 1-3) - Gal (beta 1-4) - Glc está comprendida entre 150 mg y 250 mg por 100 ml.
[0039] En otra forma de realización preferida, la composición nutricional comprende de 0,25 a 2,5 g de galactooligosacáridos por 100 ml, donde la cantidad de Gal (beta 1-3) - Gal (beta 1-4) - Glc está comprendida entre 10 mg y 50 mg por 100 ml.
[0040] La cantidad de beta1,3'-galactosil-lactosa en esta preparación de GOS está preferiblemente en el rango del 60-65 % en peso, en base a los galactooligosacáridos totales (excluida la lactosa, la galactosa y la glucosa). Otras fuentes preferidas de beta1,3'-galactosil-lactosa incluyen Bimuno (Clasado) o Purimune (GTC Nutrition). Preferiblemente, como se explica más adelante, la composición nutricional según la actual invención también comprende fructooligosacáridos (FOS).
Butirato dietético
[0041] Preferiblemente, la presente composición nutricional contiene butirato dietético. Se descubrió que el butirato mejora la función de barrera intestinal. La composición nutricional comprende preferiblemente entre el 0,3 y el 5 % en peso de ácido butírico en base al peso de cadenas de acilo graso totales, preferiblemente entre el 0,6 y el 5 % en peso, incluso más preferiblemente entre el 1 y el 5 % en peso. La presente composición nutricional contiene preferiblemente tributirina (es decir, un triglicérido con 3 cadenas de ácido butírico unidas al esqueleto de glicerol a través de enlaces éster). Preferiblemente, la composición nutricional contiene del 0,075 al 1,3 % en peso en base al peso seco de butirato de la composición, preferiblemente entre el 0,15 y el 1,3 % en peso y más preferiblemente entre el 0,25 y el 1,3 % en peso.
[0042] Alternativamente, la composición nutricional comprende de 0,015 a 0,25 g de butirato por 100 kcal, preferiblemente de 0,03 a 0,25 g de butirato por 100 kcal e incluso preferiblemente de 0,05 a 0,25 g de butirato por 100 kcal. Cuando la composición nutricional es un líquido, la composición contiene preferiblemente de 0,01 a 0,175 g de butirato por 100 ml, más preferiblemente de 0,02 a 0,175 g de butirato por 100 ml y más preferiblemente de 0,035 a 0,175 g de butirato por 100 ml. Se sabe que la leche humana contiene niveles muy bajos de butirato, en particular < 0,1 % en peso en base a los ácidos grasos totales.
[0043] El butirato dietético puede ser suministrado por cualquier fuente adecuada conocida en la técnica. Las fuentes no limitativas de butirato dietético incluyen grasas de origen animal y productos derivados, tales como, entre otros, leche, grasa láctea, grasa de mantequilla, aceite de mantequilla, mantequilla, suero de leche, suero de mantequilla, crema; productos derivados de la fermentación microbiana, tales como, entre otros, yogur y suero de leche fermentado; y productos de aceite de semillas derivados de plantas, tales como piña y/o aceite de piña, albaricoque y/o aceite de albaricoque, cebada, avena, arroz integral, salvado, judías verdes, legumbres, verduras de hojas verdes, manzanas, kiwi, naranjas. En algunas formas de realización, el butirato dietético se produce sintéticamente. La fuente preferida de butirato dietético es la grasa láctea de rumiantes, preferiblemente la grasa láctea bovina.
[0044] En formas de realización en las que el butirato dietético se produce sintéticamente, la estructura química del butirato dietético se puede modificar según sea necesario. Además, el butirato dietético producido sintéticamente se puede purificar mediante cualquiera de los medios conocidos en la técnica para producir un aditivo de butirato dietético purificado que se puede incorporar a las composiciones nutricionales descritas en el presente documento. El butirato dietético puede ser proporcionado por lípidos de productos lácteos y/o formas de butirato unidas a triglicéridos.
[0045] En algunas formas de realización, el butirato dietético puede comprender sales de butirato, por ejemplo, butirato de sodio, butirato de potasio, butirato de calcio, butirato de magnesio y combinaciones de los mismos. En determinadas formas de realización, el butirato dietético comprende una sal de butirato adecuada que se ha recubierto con una o más grasas o lípidos. En determinadas formas de realización donde el butirato dietético comprende una sal de butirato recubierta de grasa, la composición nutricional puede ser una composición en polvo seco en la que se incorpora el butirato dietético. Preferiblemente el butirato dietético se suministra como parte de un triglicérido. Esto es ventajoso porque el butirato es volátil (y maloliente) cuando se proporciona en forma libre o de sal. En forma de triglicéridos, el butirato se liberará en y después del estómago debido a la acción de las lipasas.
[0046] La combinación de 2'-FL, butirato y 3'-GL tendrá un efecto adicional mejorado sobre la salud, en particular sobre la mejora de la función de barrera intestinal, sobre la mejora del sistema inmunitario, sobre la mejora de la microbiota intestinal y/o sobre el tratamiento o la prevención de infecciones, en particular infecciones intestinales.
[0047] En una forma de realización preferida, la proporción en peso de 2'-FL a butirato dietético está en el rango de 10:1 a 1:10, preferiblemente de 5:1 a 1:5, más preferiblemente de 3:1 a 1:3.
Composición fermentada
[0048] La presente composición nutricional preferiblemente está al menos parcialmente fermentada. Una composición nutricional parcialmente fermentada comprende al menos en parte una composición que fue fermentada por bacterias productoras de ácido láctico. Se demostró que una fórmula parcialmente fermentada tiene un efecto protector sobre el mantenimiento de la permeabilidad intestinal cuando se expone a estrés físico o psicológico.
[0049] La fermentación preferiblemente tiene lugar durante el proceso de producción de la composición nutricional. Preferiblemente, la composición nutricional no contiene cantidades significativas de bacterias viables en el producto final, y esto se puede lograr mediante inactivación por calor después de la fermentación o inactivación por otros medios. Preferiblemente, la composición fermentada es un producto derivado de la leche, que es un sustrato de leche que es fermentado por bacterias productoras de ácido láctico, donde el sustrato de leche comprende al menos uno seleccionado del grupo que consta de leche, suero de leche, proteína de suero de leche, hidrolizado de proteína de suero de leche, caseína, hidrolizado de caseína o mezclas de los mismos. Adecuadamente, las composiciones nutricionales que comprenden composiciones fermentadas y oligosacáridos no digeribles y su forma de producirlos se describen en la WO 2009/151330, la WO 2009/151331 y la WO 2013/187764.
[0050] La composición fermentada preferiblemente comprende fragmentos de células bacterianas, como glicoproteínas, glicolípidos, peptidoglicano, ácido lipoteicoico (LTA), lipoproteínas, nucleótidos y/o polisacáridos capsulares. Es ventajoso usar la composición fermentada que comprende bacterias inactivadas y/o fragmentos de células directamente como parte del producto nutricional final, ya que esto dará como resultado una mayor concentración de fragmentos de células bacterianas. Cuando se utilizan preparaciones comerciales de bacterias productoras de ácido láctico, normalmente se lavan y el material se separa del medio de crecimiento acuoso que comprende los fragmentos de células bacterianas, por lo que se reduce o elimina la presencia de fragmentos de células bacterianas. Además, tras la fermentación y/u otras interacciones de las bacterias productoras de ácido láctico con el sustrato de leche, se pueden formar compuestos bioactivos adicionales, tales como ácidos grasos de cadena corta, péptidos bioactivos y/u oligosacáridos, y otros metabolitos, que también pueden dar como resultado una función de la microbiota intestinal más parecida a la función de la microbiota intestinal de los bebés lactantes. Dichos compuestos bioactivos que se producen durante la fermentación por bacterias productoras de ácido láctico también se pueden denominar posbióticos. Una composición que comprende dichos posbióticos es ventajosamente más parecida a la lecha materna, ya que la leche materna no es una fórmula sintética limpia, sino que contiene metabolitos, células bacterianas, fragmentos de células y similares. Por lo tanto, se cree que la composición fermentada, en particular el producto derivado de la leche fermentada, tiene un efecto mejorado en comparación con el producto derivado de la leche no fermentado sin o con bacterias productoras de ácido láctico simplemente añadidas en la prevención de la maduración precoz del intestino en un bebé, e induce, en un bebé, un patrón de maduración intestinal que es más similar al patrón de maduración intestinal observado en bebés alimentados con leche humana.
[0051] Preferiblemente, la composición nutricional final comprende del 5 al 97,5 % en peso de la composición fermentada, más preferiblemente del 10 al 90 % en peso, más preferiblemente del 20 al 80 % en peso, incluso más preferiblemente del 25 al 60 % en peso. Como una forma de especificar que la composición nutricional final comprende al menos parcialmente una composición fermentada y de especificar el grado de fermentación, se puede tomar el nivel de la suma de ácido láctico y lactato en la composición nutricional final, ya que este es el producto final metabólico producido por las bacterias productoras de ácido láctico tras la fermentación. La presente composición nutricional final comprende preferiblemente del 0,1 al 1,5 % en peso de la suma de ácido láctico y lactato en base al peso seco de la composición, más preferiblemente del 0,15 a 1,0 % en peso, incluso más preferiblemente del 0,2 al 0,5 % en peso. Alternativamente, la composición nutricional comprende de 0,02 a 0,3 g de la suma de ácido láctico y lactato por 100 kcal, preferiblemente de 0,03 a 0,2 de la suma de ácido láctico y lactato por 100 kcal, preferiblemente de 0,04 a 0,1 de la suma de ácido láctico y lactato por 100 kcal. Alternativamente, cuando la composición es un líquido, la suma de ácido láctico y lactato es de 0,0125 a 0,2 g por 100 ml, preferiblemente de 0,02 a 0,125 g por 100 ml, preferiblemente de 0,03 a 0,07 g por 100 ml.
[0052] Preferiblemente, al menos el 50 % en peso, incluso más preferiblemente al menos el 90 % en peso, de la suma de ácido láctico y lactato está en forma L(+)-isómero. Por lo tanto, en una forma de realización, la suma de ácido L(+)-láctico y L(+)-lactato es más del 50 % en peso, más preferiblemente más del 90 % en peso, en base a la suma de ácido láctico total y lactato. En el presente documento, L(+)-lactato y ácido L(+)-láctico también se denominan L-lactato y ácido L-láctico.
[0053] La combinación de 2'-FL, 3'-GL y butirato opcional y la fórmula parcialmente fermentada tendrá un efecto adicional mejorado sobre la salud, en particular sobre la mejora de la función de barrera intestinal, sobre la mejora del sistema inmunitario, sobre la mejora de la microbiota intestinal y/o sobre el tratamiento o la prevención de infecciones, en particular infecciones intestinales.
AGPICL
[0054] La presente composición nutricional comprende preferiblemente ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (AGPICL). Los AGPICL son ácidos grasos o cadenas de acilos grasos con una longitud de 20 a 24 átomos de carbono, preferiblemente de 20 o 22 átomos de carbono, que comprenden dos o más enlaces insaturados. Preferiblemente, la composición nutricional comprende al menos uno, preferiblemente dos, más preferiblemente tres AGPICL seleccionados de entre ácido docosahexaenoico (DHA), ácido eicosapentaenoico (EPA) y ácido araquidónico (ARA). Se descubrió que estos AGPICL mejoran la función de barrera intestinal y, por lo tanto, pueden combinarse particularmente de manera ventajosa con 2-'FL, 3'-GL y butirato opcional para mejorar aun más la barrera intestinal. Esta combinación tiene efectos ventajosos inesperados y funciona preferiblemente de manera sinérgica. Preferiblemente, la composición nutricional comprende una cantidad elevada de dichos AGPICL. Las fórmulas para bebés actuales, en el caso de que comprendan estos AGPICL, normalmente tienen una cantidad de la suma de DHA, ARA y EPA del 0,4 al 0,9 % en peso en base a los ácidos grasos totales. En la composición nutricional según la presente invención, preferiblemente la cantidad de estos AGPICL es superior al 1 % en peso, preferiblemente superior al 1,1 % en peso, en base a los ácidos grasos totales. Preferiblemente, la cantidad de estos AGPICL no es más del 15 % en peso, preferiblemente no más del 5 % en peso, en base a los ácidos grasos totales, preferiblemente no más del 2,5 % en peso, en base a los ácidos grasos totales. Se prefiere, además, que la cantidad de estos AGPICL esté en el rango del 1-15 % en peso, preferiblemente del 1,1 5 % en peso, más preferiblemente del 1,5-2,5 % en peso en base a los ácidos grasos totales. Esto se considera el rango más óptimo para usarse en fórmulas para bebés para mejorar la función de barrera intestinal. Preferiblemente, la cantidad de DHA es de al menos el 0,4, preferiblemente al menos el 0,5 % en peso, en base a los ácidos grasos totales. Preferiblemente, la cantidad de DHA no es más del 1 % en peso, preferiblemente no más del 0,7 % en peso, en base a los ácidos grasos totales. Preferiblemente, la composición nutricional comprende una cantidad de DHA de al menos el 0,5 % en peso, preferiblemente de al menos el 0,7 % en peso, más preferiblemente de al menos el 1 % en peso, en base a los ácidos grasos totales. Preferiblemente, la composición nutricional comprende una cantidad de DHA del 0,4 al 1 % en peso, más preferiblemente del 0,5 al 0,7 % en peso. Preferiblemente, la composición nutricional comprende una cantidad de EPA de al menos el 0,09 % en peso, preferiblemente de al menos el 0,1 % en peso, en base a los ácidos grasos totales, y preferiblemente no más del 0,4 % en peso, más preferiblemente no más del 0,1 % en peso. Preferiblemente, la composición nutricional comprende una cantidad de EPA del 0,09 al 0,4 % en peso, más preferiblemente del 0,1 al 0,2 % en peso.
[0055] Preferiblemente, la composición nutricional comprende una cantidad de ARA de al menos el 0,25 % en peso en base a los ácidos grasos totales, más preferiblemente de al menos el 0,5 % en peso y preferiblemente no más del 1 % en peso. Preferiblemente, la composición nutricional comprende una cantidad de ARA del 0,4 al 1 % en peso, más preferiblemente del 0,5 al 0,7 % en peso. Preferiblemente, la composición nutricional comprende DHA en una cantidad del 0,4 al 1,0 % en peso en base a los ácidos grasos totales y EPA en una cantidad del 0,09 al 0,4 % en peso en base a los ácidos grasos totales. Más preferiblemente, la composición nutricional comprende DHA en una cantidad del 0,5 al 0,7%en peso en base a los ácidos grasos totales y EPA en una cantidad del 0,1 al 0,2 % en peso en base a los ácidos grasos totales. Se prefiere particularmente que la composición nutricional comprenda DHA en una cantidad superior al 0,5 % en peso en base a los ácidos grasos totales y EPA en una cantidad superior al 0,1 % en peso en base a los ácidos grasos totales. Preferiblemente, la composición nutricional comprende DHA, EPA y ARA en una cantidad del 0,4 al 1,0 % en peso, del 0,09 al 0,4 % en peso y del 0,25 al 1,0 % en peso en base a los ácidos grasos totales, respectivamente. Más preferiblemente, la composición nutricional comprende DHA, EPA y ARA en una cantidad del 0,5 al 0,7 % en peso, del 0,1 al 0,2 % en peso y del 0,5 al 0,7 % en peso en base a los ácidos grasos totales, respectivamente.
[0056] Preferiblemente, la composición nutricional comprende DHA en una cantidad de 20 a 50 mg/100 kcal y EPA en una cantidad de 4,3 a 10,8 mg/100 kcal. Más preferiblemente, la composición nutricional comprende DHA en una cantidad de 25 a 33,5 mg/100 kcal y EPA en una cantidad de 5,4 a 7,2 mg/100 kcal. De la manera más preferible, la composición nutricional comprende DHA en una cantidad de aproximadamente 25 mg/100 kcal y EPA en una cantidad de aproximadamente 5,4 mg/100 kcal. En estas formas de realización, la presencia de ARA es opcional. Si está presente, la cantidad de ARA es preferiblemente de 12,5 a 50 mg, más preferiblemente de 25 a 33.5 mg y, de la manera más preferible, aproximadamente de 25 mg por 100 kcal. Preferiblemente, la proporción en peso de DHA/ARA es de 0,9 a 2.
[0057] Preferiblemente, la proporción en peso de DHA/EPA/ARA es 1: (0,19-0,7): (0,9-2,0). Dichas cantidades y/o proporciones de DHA, EPA y ARA son óptimas para mejorar aun más la función de barrera intestinal, para mejorar aun más la microbiota intestinal y/o para el tratamiento o la prevención de infecciones, en particular infecciones intestinales. Los AGPICL pueden proporcionarse como ácidos grasos libres, en forma de triglicéridos, en forma de diglicéridos, en forma de monoglicéridos, en forma de fosfolípidos, o como una mezcla de uno o más de los anteriores. Las fuentes adecuadas de estos AGPICL son, por ejemplo, aceite de pescado y aceite de Mortierella alpina.
[0058] Preferiblemente, la composición nutricional según la presente invención comprende lípido, donde el lípido comprende AGPICL seleccionados del grupo que consta de DHA, EPA y ARA, y donde la suma de DHA,<a>R<a>y EPA es al menos el 1 % en peso en base a los ácidos grasos totales, y donde el lípido comprende DHA en una cantidad del 0,4 al 1,0 % en peso en base a los ácidos grasos totales, EPA en una cantidad del 0,09 al 0,4 % en peso en base a los ácidos grasos totales y ARA en una cantidad del 0,25 al 1 % en peso en base a los ácidos grasos totales. En esta forma de realización, se prefiere, además, que el lípido comprenda DHA en una cantidad del 0,5 al 0,7 % en peso en base a los ácidos grasos totales, EPA en una cantidad del 0,1 al 0,2 % en peso en base a los ácidos grasos totales y ARA en una cantidad del 0,5 al 0,7 % en peso en base a los ácidos grasos totales. Más preferiblemente, el lípido comprende DHA en una cantidad de al menos el 0,5 % en peso, EPA en una cantidad de al menos el 0,1 % en peso y ARA en una cantidad de al menos el 0,5 % en peso, todos en base a los ácidos grasos totales.
[0059] La combinación de 2'-FL, 3'-GL, butirato opcional y AGPICL, en particular EPA, DHA y/o ARA, tendrá un efecto mejorado adicional sobre la salud, en particular sobre la mejora de la función de barrera intestinal, sobre la mejora del sistema inmunitario, sobre la mejora de la microbiota intestinal y/o sobre el tratamiento o la prevención de infecciones, en particular infecciones intestinales.
Composición nutricional
[0060] La composición nutricional según la presente invención no es leche humana.
[0061] La composición nutricional según la presente invención está destinada a usarse en bebés o niños.
[0062] La presente composición nutricional comprende preferiblemente lípido, proteínas y carbohidratos y se administra preferiblemente en forma líquida. La presente composición nutricional también puede presentarse en forma de alimento seco, preferiblemente en forma de polvo que se acompaña de instrucciones para mezclar dicho alimento seco, preferiblemente en polvo, con un líquido adecuado, preferiblemente agua. Por lo tanto, la presente composición nutricional puede estar en forma de polvo, adecuado para reconstituir con agua para proporcionar una composición nutricional lista para beber, preferiblemente una fórmula para bebés lista para beber, una fórmula de continuación o una fórmula para niños, más preferiblemente una fórmula para bebés lista para beber o una fórmula de continuación. La composición nutricional según la invención comprende preferiblemente otras partes, tales como vitaminas, minerales, oligoelementos y otros micronutrientes para hacer de ella una composición nutricional completa. Preferiblemente, las fórmulas para bebés y las fórmulas de continuación comprenden vitaminas, minerales, oligoelementos y otros micronutrientes según las directivas internacionales.
[0063] La presente composición nutricional comprende preferiblemente lípido, proteína y carbohidrato digerible, donde el lípido proporciona del 25 al 65 % de las calorías totales, la proteína proporciona del 6,5 al 16 % de las calorías totales y el carbohidrato digerible proporciona del 20 al 80 % de las calorías totales. Preferiblemente, en la presente composición nutricional, el lípido proporciona del 30 al 55 % de las calorías totales, la proteína proporciona del 7 al 9%de las calorías totales y el carbohidrato digerible proporciona del 35 al 60%de las calorías totales. Para el cálculo del % de calorías totales de la proteína, se debe tener en cuenta el total de energía proporcionada por proteínas, péptidos y aminoácidos.
[0064] Preferiblemente, el lípido proporciona de 3 a 7 g de lípido por 100 kcal, preferiblemente de 3,5 a 6 g por 100 kcal, la proteína proporciona de 1,6 a 4 g por 100 kcal, preferiblemente de 1,7 a 2,3 g por 100 kcal y el carbohidrato digerible proporciona de 5 a 20 g por 100 kcal, preferiblemente de 8 a 15 g por 100 kcal de la composición nutricional. Preferiblemente, la presente composición nutricional comprende lípido que proporciona de 3,5 a 6 g por 100 kcal, proteína que proporciona de 1,7 a 2,3 g por 100 kcal y carbohidrato digerible que proporciona de 8 a 15 g por 100 kcal de la composición nutricional.
[0065] Preferiblemente, el lípido proporciona de 2,5 a 6,5 g de lípido por 100 ml, preferiblemente de 2,5 a 4 g por 100 ml, la proteína proporciona de 1 a 3 g por 100 ml, preferiblemente de 1 a 1,5 g por 100 ml y el carbohidrato digerible proporciona de 3 a 13 g por 100 ml, preferiblemente de 5 a 10 g por 100 ml de la composición nutricional. Preferiblemente, la presente composición nutricional comprende lípido que proporciona de 2,0 a 6,5 g por 100 ml, proteína que proporciona de 1 a 3 g por 100 ml y carbohidrato digerible que proporciona de 5 a 10 g por 100 ml de la composición nutricional. Preferiblemente, el lípido proporciona del 15 al 45 % en peso, preferiblemente del 20 al 30 % en peso, en base al peso seco de la composición, la proteína proporciona del 8 al 20 % en peso, preferiblemente del 8,5 al 11,5 % en peso, en base al peso seco de la composición y los carbohidratos digeribles comprenden del 25 al 90 % en peso, preferiblemente del 40 al 75 % en peso, en base al peso seco de la composición. Preferiblemente, la presente composición nutricional comprende lípido que proporciona del 20 al 30 % en peso, proteína que proporciona del 8,5 al 11,5 % en peso y carbohidrato digerible que proporciona del 40 al 75 % en peso, todo en base al peso seco de la composición.
[0066] La presente composición comprende preferiblemente lípidos. Preferiblemente, la presente composición comprende al menos un lípido seleccionado del grupo que consta de lípidos vegetales. Preferiblemente, la presente composición comprende una combinación de lípidos vegetales y al menos un aceite seleccionado del grupo que consta de aceite de pescado, aceite de algas, aceite fúngico y aceite bacteriano. El lípido de la presente composición nutricional proporciona preferiblemente de 3 a 7 g por 100 kcal de la composición nutricional, preferiblemente el lípido proporciona de 3,5 a 6 g por 100 kcal. Cuando está en forma líquida, por ejemplo, como líquido listo para el consumo, la composición nutricional comprende preferiblemente de 2,0 a 6,5 g de lípido por 100 ml, más preferiblemente de 2,5 a 4,0 g por 100 ml. En base al peso seco, la presente composición nutricional comprende preferiblemente del 15 al 45 % en peso de lípido, más preferiblemente de 20 a 30 % en peso. Preferiblemente, la presente composición nutricional comprende al menos una, preferiblemente al menos dos fuentes de lípidos seleccionadas del grupo que consta de aceite de semilla de colza (como aceite de colza, aceite de semilla de colza bajo en ácido erúcico y aceite de canola), aceite de girasol alto oleico, aceite de alazor alto oleico, aceite de oliva, aceites marinos, aceites microbianos, aceite de coco, aceite de palmiste.
[0067] La presente composición nutricional comprende preferiblemente proteína. La proteína usada en la composición nutricional se selecciona preferiblemente del grupo que consta de proteínas animales no humanas, preferiblemente proteínas de leche, proteínas vegetales, tales como preferiblemente proteína de soja y/o proteína de arroz, y mezclas de las mismas. La presente composición nutricional contiene preferiblemente caseína y/o proteína de suero de leche, más preferiblemente proteínas de suero de leche bovina y/o caseína de vaca. Por lo tanto, en una forma de realización, la proteína en la presente composición nutricional comprende proteína seleccionada del grupo que consta de proteína de suero de leche y caseína, preferiblemente proteína de suero de leche y caseína, preferiblemente la proteína de suero de leche y/o la caseína es de leche de vaca. Preferiblemente, la proteína comprende menos del 5 % en peso en base a la proteína total de aminoácidos libres, dipéptidos, tripéptidos o proteína hidrolizada. La presente composición nutricional comprende preferiblemente caseína y proteínas de suero de leche en una proporción en peso de caseína: proteína de suero de leche de 10: 90 a 90: 10, más preferiblemente de 20: 80 a 80: 20, incluso más preferiblemente de 35: 65 a 55: 45.
[0068] En una forma de realización, la proteína usada en la composición nutricional comprende proteína hidrolizada, preferiblemente, la proteína usada en la composición nutricional es proteína hidrolizada o, en otras palabras, consta de proteína hidrolizada. La proteína hidrolizada también puede comprender aminoácidos libres. Preferiblemente, la proteína hidrolizada comprende proteína de suero de leche hidrolizada. En una forma de realización, la proteína usada en la composición nutricional son aminoácidos libres o, en otras palabras, consta de aminoácidos libres. Por lo tanto, en una forma de realización preferida, la composición nutricional según la invención que comprende 2'-FL y butirato dietético y opcionalmente también 3'GL, comprende, además, proteína hidrolizada y/o aminoácidos libres. Dichas composiciones se usan preferiblemente para la prevención o el tratamiento de la alergia, más preferiblemente para la prevención o el tratamiento de la alergia a la proteína de la leche de vaca.
[0069] El % en peso de proteína en base al peso seco de la presente composición nutricional se calcula según el método Kjeldahl midiendo el nitrógeno total y usando un factor de conversión de 6,38 en el caso de la caseína, o un factor de conversión de 6,25 para otras proteínas diferentes de la caseína. El término "proteína" o "componente proteico", como se usa en la presente invención, se refiere a la suma de proteínas, péptidos y aminoácidos libres.
[0070] La presente composición nutricional comprende preferiblemente proteína que proporciona de 1,6 a 4,0 g de proteína por 100 kcal de la composición nutricional, preferiblemente que proporciona de 11,7 a 2,3 g por 100 kcal de la composición nutricional. Un contenido de proteína demasiado bajo en base a las calorías totales dará lugar a un crecimiento y desarrollo menos adecuado en bebés y niños. Una cantidad demasiado alta supondrá una carga metabólica, por ejemplo, en los riñones de bebés y niños. Cuando está en forma líquida, como un líquido listo para el consumo, la composición nutricional comprende preferiblemente de 1,0 a 3,0 g, más preferiblemente de 1,0 a 1,5 g de proteína por 100 ml. En base al peso seco, la presente composición nutricional comprende preferiblemente del 8 al 20 % en peso de proteína, más preferiblemente del 8,5 al 11,5 % en peso, en base al peso seco de la composición nutricional total.
[0071] La presente composición nutricional comprende preferiblemente carbohidrato digerible que proporciona de 5 a 20 g por 100 kcal, preferiblemente de 8 a 15 g por 100 kcal. Preferiblemente, la cantidad de carbohidrato digerible en la presente composición nutricional es del 25 al 90 % en peso, más preferiblemente del 8,5 al 11,5 % en peso, en base al peso seco total de la composición. Los carbohidratos digeribles preferidos son lactosa, glucosa, sacarosa, fructosa, galactosa, maltosa, almidón y maltodextrina. La lactosa es el principal carbohidrato digerible presente en la leche humana. La presente composición nutricional comprende preferiblemente lactosa. Preferiblemente, la presente composición nutricional no comprende altas cantidades de carbohidratos distintos de la lactosa. En comparación con los carbohidratos digeribles, tales como maltodextrina, sacarosa, glucosa, maltosa y otros carbohidratos digeribles con un índice glucémico alto, la lactosa tiene un índice glucémico más bajo y, por lo tanto, se prefiere. La presente composición nutricional comprende preferiblemente carbohidrato digerible, donde al menos el 35 % en peso, más preferiblemente al menos el 50 % en peso, más preferiblemente al menos el 60 % en peso, más preferiblemente al menos el 75 % en peso, incluso más preferiblemente al menos el 90 % en peso, de la manera más preferible, al menos el 95 % en peso del carbohidrato digerible es lactosa. En base al peso seco, la presente composición nutricional comprende preferiblemente al menos el 25 % en peso de lactosa, preferiblemente al menos el 40 % en peso, más preferiblemente al menos el 50 % en peso de lactosa.
[0072] La presente composición nutricional comprende preferiblemente oligosacáridos no digeribles (OND). El término "oligosacáridos", como se utiliza en el presente documento, se refiere a sacáridos con un grado de polimerización (GP) de 2 a 250, preferiblemente un GP de 2 a 100, más preferiblemente de 2 a 60, incluso más preferiblemente de 2 a 10. Si se incluye un oligosacárido con un GP de 2 a 100 en la presente composición nutricional, esto da como resultado composiciones que pueden contener oligosacáridos con un GP de 2 a 5, un GP de 50 a 70 y/o un GP de 7 a 60. El término "oligosacáridos no digeribles" (OND), como se usa en la presente invención, se refiere a oligosacáridos que no se digieren en el intestino por la acción de ácidos o enzimas digestivas presentes en el tracto digestivo superior humano, por ejemplo, intestino delgado y estómago, pero que preferiblemente son fermentados por la microbiota intestinal humana. Por ejemplo, se considera que la sacarosa, la lactosa, la maltosa y las maltodextrinas son digeribles.
[0073] Preferiblemente, los presentes oligosacáridos no digeribles son solubles. El término "soluble", como se utiliza en este caso, cuando hace referencia a polisacáridos, fibras u oligosacáridos, significa que la sustancia es al menos soluble según el método descrito por L. Proskyet al.,J. Assoc. Off. Anal. Chem. 71, 1017-1023 (1988).
[0074] La beta1,3'-galactosil-lactosa puede estar presente en la composición nutricional según la invención como tal o como parte de una mezcla de galactooligosacáridos (GOS), preferiblemente beta-galactooligosacáridos (BGOS). En una forma de realización preferida, la beta1,3'-galactosil-lactosa está presente como parte de una mezcla de galactooligosacáridos. En una forma de realización, la cantidad de Gal (beta 1-3) - Gal (beta 1-4) - Glc es superior al 20 % en peso en base a los galactooligosacáridos totales.
[0075] Preferiblemente, la presente composición nutricional también comprende fructooligosacáridos (FOS). El término "fructooligosacáridos", como se usa en la presente invención, se refiere a carbohidratos compuestos por más del 50 %, preferiblemente más del 65 % de unidades de fructosa en base a subunidades monoméricas, donde al menos el 50 %, más preferiblemente al menos el 75 %, incluso más preferiblemente al menos el 90 %, de las unidades de fructosa están unidas entre sí a través de un enlace glicosídico beta, preferiblemente un enlace glicosídico beta-2,1. Una unidad de glucosa puede estar presente en el extremo reductor de la cadena de unidades de fructosa. Preferiblemente los fructooligosacáridos tienen un GP o GP promedio en el rango de 2 a 250, más preferiblemente de 2 a 100, incluso más preferiblemente de 10 a 60. El término "fructooligosacáridos" comprende leván, leván hidrolizado, inulina, inulina hidrolizada y fructooligosacáridos sintetizados. Preferiblemente, la preparación comprende fructooligosacáridos de cadena corta con un grado de polimerización (GP) promedio de 3 a 6, más preferiblemente, inulina hidrolizada o fructooligosacárido sintético. Preferiblemente, la preparación comprende fructooligosacáridos de cadena larga con un GP promedio superior a 20. Preferiblemente, la preparación comprende fructooligosacáridos tanto de cadena corta como de cadena larga. El fructooligosacárido adecuado para su uso en la composición de la invención también está fácilmente disponible en el mercado, por ejemplo, RaftilineHP (Orafti). Preferiblemente, la composición nutricional según la presente invención comprende al menos 25 mg de FOS por 100 ml, más preferiblemente al menos 40, incluso más preferiblemente al menos 60 mg. Preferiblemente, la composición no comprende más de 250 mg de FOS por 100 ml, más preferiblemente no más de 150 mg por 100 ml y, de la manera más preferible, no más de 100 mg por 100 ml. La cantidad de FOS es preferiblemente de 25 a 250 g de fructooligosacáridos por 100 ml, preferiblemente de 40 a 150 g por 100 ml, más preferiblemente de 60 a 100 g por 100 ml. Preferiblemente, la composición nutricional según la presente invención comprende al menos el 0,15 % en peso en base al peso seco de FOS, más preferiblemente al menos el 0,25 % en peso, incluso más preferiblemente al menos el 0,4 % en peso. Preferiblemente, la composición no comprende más del 1,5 % en peso en base al peso seco de FOS de la composición total, más preferiblemente no más del 2 % en peso. La presencia de FOS muestra un efecto mejorado adicional sobre la microbiota y su producción de AGCC.
[0076] Preferiblemente, la presente composición nutricional comprende una mezcla de galactooligosacáridos (incluida la beta1,3'-galactosil-lactosa) y fructooligosacáridos. Preferiblemente, la mezcla de galactooligosacáridos y fructooligosacáridos está presente en una proporción en peso de 1/99 a 99/1, más preferiblemente de 1/19 a 19/1, más preferiblemente de 1/1 a 19/1, más preferiblemente de 2/1 a 15/1, más preferiblemente de 5/1 a 12/1, incluso más preferiblemente de 8/1 a 10/1, incluso más preferiblemente en una proporción de aproximadamente 9/1. Esta proporción en peso es particularmente ventajosa cuando los galactooligosacáridos tienen un GP promedio bajo y los fructooligosacáridos tienen un GP relativamente alto. La más preferida es una mezcla de galactooligosacáridos con un GP promedio inferior a 10, preferiblemente inferior a 6, y fructooligosacáridos con un GP promedio superior a 7, preferiblemente superior a 11, incluso más preferiblemente superior a 20.
[0077] En una forma de realización preferida, la presente composición nutricional comprende una mezcla de fructooligosacáridos de cadena corta (cc) y fructooligosacáridos de cadena larga (cl). Preferiblemente, la mezcla de fructooligosacáridos de cadena corta y los fructooligosacáridos de cadena larga está presente en una proporción en peso de 1/99 a 99/1, más preferiblemente de 1/19 a 19/1, incluso más preferiblemente de 1/10 a 19/1, más preferiblemente de 1/5 a 15/1, más preferiblemente de 1/1 a 10/1. Se prefiere una mezcla de fructooligosacáridos de cadena corta con un GP promedio inferior a 10, preferiblemente inferior a 6 y fructooligosacáridos con un GP promedio superior a 7, preferiblemente superior a 11, incluso más preferiblemente superior a 20.
[0078] En otra forma de realización preferida, la presente composición nutricional comprende una mezcla de fructooligosacáridos de cadena corta (cc) y galactooligosacáridos de cadena corta (cc). Preferiblemente, la mezcla de fructooligosacáridos de cadena corta y galactooligosacáridos de cadena corta está presente en una proporción en peso de 1/99 a 99/1, más preferiblemente de 1/19 a 19/1, incluso más preferiblemente de 1/10 a 19/1, más preferiblemente de 1/5 a 15/1, más preferiblemente de 1/1 a 10/1. Se prefiere una mezcla de fructooligosacáridos de cadena corta y galactooligosacáridos de cadena corta con un GP promedio inferior a 10, preferiblemente inferior a 6.
[0079] La presente composición nutricional comprende preferiblemente del 1,75 al 17,5 % en peso de oligosacáridos no digeribles totales, más preferiblemente del 2,8 al 10,5 % en peso, de la manera más preferible, del 4,2 al 7 % en peso, en base al peso seco de la composición nutricional. En base a 100 ml, la presente composición nutricional preferiblemente comprende de 0,25 a 2,5 g de oligosacáridos no digeribles totales, más preferiblemente de 0,4 a 1,5 g, de la manera más preferible, de 0,6 a 1 g, en base a 100 ml de la composición nutricional. Una cantidad menor de oligosacáridos no digeribles será menos eficaz para mejorar la función de barrera intestinal, mientras que una cantidad demasiado alta dará lugar a efectos secundarios de hinchazón y molestias abdominales. La cantidad total de oligosacáridos no digeribles incluye galactooligosacáridos, incluida la beta3'-GL, fructooligosacáridos y cualquiera de los oligosacáridos no digeribles adicionales que pueda estar presente, además, en la composición.
[0080] También es importante que la composición nutricional según la presente invención no tenga una densidad calórica excesiva, sin embargo, todavía proporciona calorías suficientes para alimentar al sujeto. Por lo tanto, el alimento líquido tiene preferiblemente una densidad calórica de entre 0,1 y 2,5 kcal/ml, más preferiblemente una densidad calórica de entre 0,5 y 1,5 kcal/ml, incluso más preferiblemente de entre 0,6 y 0,8 kcal/ml y, de la manera más preferible, de entre 0,65 y 0,7 kcal/ml.
Aplicación
[0081] La presente composición nutricional es preferiblemente una fórmula para bebés, una fórmula de continuación o una fórmula para niños. Los ejemplos de una fórmula para niños son la leche para niños pequeños, la fórmula para niños pequeños y la leche de crecimiento. Más preferiblemente, la composición nutricional es una fórmula para bebés o una fórmula de continuación. La presente composición nutricional se puede aplicar ventajosamente como nutrición completa para bebés. Una fórmula para bebés se define como una fórmula destinada a usarse en bebés y puede ser, por ejemplo, una fórmula de inicio, destinada a bebés de 0 a 6 o de 0 a 4 meses de edad. Una fórmula de continuación está destinada a bebés de 4 o 6 meses hasta 12 meses de edad. A esta edad, los bebés comienzan a destetarse con otros alimentos. Una fórmula para niños, o una leche o fórmula para niños pequeños o de crecimiento está destinada a niños de 12 a 36 meses de edad. Preferiblemente, la presente composición nutricional es una fórmula para bebés.
[0082] La fórmula para bebés, la fórmula de continuación o la fórmula para niños puede estar en forma de líquido, preferiblemente un líquido listo para beber, o en forma de polvo. En una forma de realización, la fórmula para bebés, la fórmula de continuación o la fórmula para niños está en forma de polvo, adecuado para reconstituir con agua para proporcionar una fórmula para bebés, una fórmula de continuación o una fórmula para niños lista para beber. Se debe entender que, cuando la fórmula para bebés, la fórmula de continuación o la fórmula para niños según la invención está en forma de polvo, las cantidades de todos los ingredientes, incluidos los oligosacáridos no digeribles, 2'-FL y 3'-GL en dicha fórmula se definen como las cantidades que estarían presentes después de la reconstitución del polvo con agua, es decir, las cantidades se definen en mg por 100 ml de una fórmula lista para beber.
[0083] La composición nutricional según la invención puede usarse para proporcionar nutrición a un bebé o niño, preferiblemente un bebé, preferiblemente hasta los 12 meses de edad.
[0084] La fórmula para bebés, la fórmula de continuación o la fórmula para niños según la invención puede usarse para proporcionar nutrición a un bebé o niño, preferiblemente un bebé, preferiblemente hasta los 12 meses de edad.
[0085] Las formas de realización preferidas anteriormente descritas para la fórmula para bebés, la fórmula de continuación y la fórmula para niños según la invención también se aplican a la presente fórmula para bebés para su uso, la fórmula de continuación para su uso y la fórmula para niños para su uso.
[0086] La invención se refiere, además, a una composición según las reivindicaciones destinada a usarse en la mejora de la salud intestinal de bebés, en particular la función de barrera intestinal y la maduración intestinal, para usarse en la mejora de la fisiología intestinal, para usarse en la mejora de la barrera intestinal, para usarse en la mejora de la microbiota intestinal, en particular para usarse en la reducción de bacterias patógenas intestinales, para usarse en el tratamiento o la prevención de infecciones, en particular infecciones intestinales y/o para usarse en el tratamiento y/o prevención de alergias, y/o para usarse en la inducción de tolerancia oral a alérgenos.
[0087] Preferiblemente, dicha composición se utiliza para mejorar el sistema inmunitario, preferiblemente para usarse en la reducción de la respuesta Th2.
[0088] Como la composición nutricional de la invención tiene un efecto mejorado sobre la función de barrera intestinal, reducirá la translocación de alérgenos, toxinas y/o patógenos y, por lo tanto, evitará y/o tratará las alergias, y/o evitará o tratará las infecciones. Como también se descubrió un efecto mejorado sobre la actividad de la fosfatasa alcalina intestinal, la composición nutricional reducirá los patógenos intestinales, por lo que evitará y/o tratará infecciones, en particular infecciones intestinales. La mejora de la maduración de la lactasa y la proliferación de células intestinales es, además, indicativa de una maduración mejorada de la barrera intestinal. Se observó una mejora en la microbiota, un aumento de bifidobacterias, una mayor acidificación por fermentación y una reducción de patógenos. Además, la mejora de la microbiota intestinal y/o del sistema inmunitario evitará y/o tratará beneficiosamente alergias, e infecciones, en particular infecciones intestinales. Los efectos sobre el sistema inmunitario tendrán un efecto sobre la inducción de tolerancia oral a los alérgenos.
[0089] Los efectos tanto en IL-10 como con los niveles de CCL20 indicaron una modulación mejorada inesperada en la capacidad de respuesta de la CMSP humana en presencia de una combinación de 2'-FL y butirato, que mejora aun más cuando está presente 3'-GL.
[0090] Como la composición nutricional de la invención tiene un efecto mejorado sobre la disminución de la respuesta Th2, por lo tanto, evitará y/o tratará la alergia.
[0091] La composición nutricional según la invención se usa preferiblemente para proporcionar nutrición a un bebé o niño, preferiblemente un bebé, que padece alergia o tiene un mayor riesgo de padecer alergia.
[0092] La composición nutricional según la presente invención puede usarse para proporcionar nutrición a bebés o niños, preferiblemente para proporcionar nutrición a bebés.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
[0093]
Figura 1:
Efectos de diferentes galactosil-lactosas (GLs) sobre el deterioro inducido por DON de la integridad de la monocapa de células Caco-2. Las figuras 1A y 1B muestran la resistencia eléctrica transepitelial (RET) para diferentes GLs. Las figuras 1C y 1D muestran la translocación del amarillo de Lucifer (FAL) al compartimento basolateral. RET se expresó como porcentaje del valor inicial y FAL se expresó en ng/cm2 x h, es decir, en ng/ml. Alfa3'-GL es Gal (alfa 1-3) - Gal (beta 1-4) - Glc; beta3'-GL es Gal (beta 1-3) - Gal (beta 1-4) - Glc; beta4'-GL es Gal (beta 1-4) - Gal (beta 1-4) - Glc; beta6'-GL es Gal (beta 1-6) - Gal (beta 1-4) - Glc. Los datos son la media ± s.e. *: p < 0,05 en comparación con el control, **: p < 0,01 en comparación con el control, ***: p < 0,001 en comparación con el control, A: p < 0,05 en comparación con el control con DON, AA p< 0,01 en comparación con el control con DON, AAA p< 0,001 en comparación con el control con DON.
Figura 2:
Diferentes efectos de GLs sobre el aumento inducido por DON en la liberación de IL8 por las células Caco-2. La secreción de IL-8 se expresa como pg/ml como media ± s.e. Alfa3'-GL es Gal (alfa 1-3) - Gal (beta 1-4) -Glc; beta3'-GL es Gal (beta 1-3) - Gal (beta 1-4) - Glc, beta4'-GL es Gal (beta 1-4) - Gal (beta 1-4) - Glc, beta6'-GL es Gal (beta 1-6) - Gal (beta 1-4) - Glc. Los datos son la media ± s.e. *: p < 0,05 en comparación con el control, **: p < 0,01 en comparación con el control, ***: p < 0,001 en comparación con el control, A: p < 0,05 en comparación con el control con DON, aa p< 0,01 en comparación con el control con DON, aaa p< 0,001 en comparación con el control con DON.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: La fórmula para bebés con 2'-FL y butirato dietético mejora la expresión de la fosfatasa alcalina intestinal
[0094] Dos fórmulas para bebés se sometieron a un paso de digestiónin vitroy, después del paso de digestiónin vitro, se examinó el efecto sobre la maduración de barrera intestinal, en particular la maduración de fosfato alcalino (FA). FA es una enzima intestinal que es expresada y segregada por los enterocitos y se usa como marcador de diferenciación. FA desempeña un papel fundamental en la homeostasis intestinal y la defensa inmunitaria innata al desfosforilar sustancias nocivas, como el ligando microbiano lipopolisacárido (endotoxina).
[0095] La fórmula para bebés de control era una fórmula para bebés no fermentada suplementada con oligosacáridos no digeribles (Goscc/FOScl) en una cantidad de 0,8 mg/100 ml cuando estaba lista para beber. Los GOScc se derivan de Vivinal GOS y los FOScl se derivan de RaftilineHP. El componente de grasa es principalmente aceites vegetales, aceite de pescado y aceite microbiano (fuente de ácido araquidónico). La cantidad de ácido butírico estaba por debajo del 0,05 % en peso en base a la grasa total.
[0096] La fórmula para bebés activa era la fórmula para bebés parcialmente fermentada similar al ejemplo 8, es decir, que contenía adicionalmente 0,1 g de 2'-FL, donde el componente lipídico comprendía aproximadamente el 50 % en peso de grasa de leche bovina, y que tenía aproximadamente el 1,5 % en peso de ácido butírico en base a los ácidos grasos totales, aproximadamente 3,4 g de grasa por 100 ml, aproximadamente el 0,28 % en base al peso seco de ácido láctico, y aproximadamente 25 mg de 3'-Gl por 100 ml cuando está listo para beber.Digestión in vitro:
[0097] Las fórmulas para bebés se prepararon al 13,7 % (p/v) en agua MiliQ y se transfirieron 35 ml a bioreactores en un modelo gastrointestinal semidinámico controlado por ordenador que simulaba las condiciones de los bebés. Cada reactor estaba equipado con un electrodo de pH y cuatro líneas de dosificación. Cada línea de dosificación estaba conectada a una bomba que añadía: a) 0,25 M de ácido clorhídrico y b) 0,5 M de bicarbonato de sodio para el control del pH o c) fluido gástrico simulado (FGS), d) fluido Intestinal simulado (FIS). El pH se controló estandarizándolo a 6,8 al principio de la digestión y luego se redujo el pH gradualmente durante una fase gástrica de 2 horas a 4,3. En la fase intestinal de la digestión, el pH se eleva gradualmente de 6,5 a 7,2 durante 2 horas. En t=0 (el inicio de la digestión), se añadieron 5,8 ml de fluido salival simulado (100 mM de NaCl, 30 mM de KCI, 1,4 mM de CaCl2, 14 mM de NaHCO3, 0,6 mg/ml de a-amilasa deAspergillus oryzae(SIGMA, A9857)) como un bolo. A partir de t=0, se añadieron gradualmente 12,25 ml de FGS (100 mM de NaCl, 30 mM de KCI, 1,4 mM de CaCl2, 50 mM de acetato de sodio, 0,125 mg/ml de pepsina de mucosa gástrica porcina (SIGMA, P7012) y 0,05 mg/ml de lipasa deRhizopus oryzae,Amano) hasta t=120 (el final de la fase gástrica). La fase intestinal consecutiva comenzó con el aumento del pH a 6,5, y la adición gradual de 31,5 ml de FIS (100 mM de NaCl, 10 mM de KCI, 1,7 mM de CaCl2, 0,17 mg/ml de tripsina de páncreas bovino (SIGMA, T9201), 0,18 mg/ml de quimotripsina de páncreas bovino (SIGMA, C4129), 0,09 mg/ml de lipasa pancreática de páncreas porcino (SiGmA, L0382), 1,42 mg/ml de taurocolato (SIGMA, 86339) y 0,6 mg/ml de tauroursodesoxicolato (SIGMA, T0266)). Al final de la digestión gastrointestinal simulada se tomó una muestra de 5 ml, se mezcló con 5 ml de tampón inhibidor de enzimas (0,1 M de fosfato de sodio, pH 5,5, 0,58 mg/ml de inhibidor de tripsina-quimotripsina deGlycine max(SIGMA, T9777), 34,5 pg/ml de Orlistat (SIGMA, O4139)) se congeló instantáneamente y se almacenó a -20 °C hasta su uso posterior.
Diferenciación celular
[0098] Las células de tipo enterocitos y borde en cepillo que expresan la línea celular intestinal humana C2BBe1 (ATCC® CRL-2102 ™) se sembraron a 5000 células/pocillo en placas Nunc™ Edge de 96 pocillos y crecieron hasta la confluencia en el medio Eagle modificado de Dulbecco, (n.° de catálogo 30-2002) con suero de ternera fetal al 10 %, penicilina/estreptomicina al 1 % y 0,01 mg/ml de transferrina humana. Después de alcanzar la confluencia, el medio de cultivo fue sustituido por una fórmula para bebés predigerida diluida en el medio de cultivo sin suero de ternera fetal a concentraciones finales del 0,34 %, 0,17 % y 0,08, 5 % (p/v) en cuadriplicados y se incubó a 37 °C, 5 % de CO2 durante 96 horas, por lo que se refrescó con la fórmula para bebés predigerida diluida después de 48 horas. Al final del periodo de incubación, se recogieron 50 |_il por pocillo del medio de cultivo, los cuadriplicados se combinaron y almacenaron a -20 °C hasta la medición de la actividad del FA. A continuación, todos los pocillos se lavaron con solución salina tamponada con fosfato enfriada con hielo y a cada pocillo se le añadieron 100 |_il de 50 mM de Tris-HCL, 150 mM de NaCl, triton-100 al 0,5 % a pH 7,0. Después de 30 min de incubación en hielo, se recogieron lisados celulares y se determinó el contenido de proteínas usando el kit de ensayo de proteínas Thermo Fischer Pierce BCA según las instrucciones del fabricante. La actividad de FA se determinó mediante el kit de ensayo colorimétrico de actividad de fosfatasa alcalina Biovision según las instrucciones del fabricante. La actividad de FA se expresó como unidades/mg de proteína
Resultados
[0099] La actividad del FA aumentó de forma estadísticamente significativa (p<0,05; prueba t) en los enterocitos que se trataron con la fórmula para bebés predigerida de la invención, en comparación con los enterocitos tratados con la fórmula de control predigerida. Este efecto fue dependiente de la dosis y significativamente diferente en todas las concentraciones probadas. El aumento de la actividad del FA extracelular en comparación con la fórmula de control fue del 43 %, 36 % y 32 % en concentraciones de fórmula para bebés del 0,34, 0,17 y 0,085 % (p/v), respectivamente, véase la tabla 1. Este aumento en la actividad del FA extracelular es indicativo de una mejor maduración de la función de barrera intestinal y una mejor defensa contra las bacterias patógenas intestinales.
Tabla 1: Actividad del FA de enterocitos intestinales expuestos a fórmula de control o experimental predigerida en mU/m de roteína.
Ejemplo 2: La fórmula para bebés con 2-FL y 3'GL mejora la expresión de la lactasa intestinal y la proliferación celular
[0100] Las composiciones nutricionales del ejemplo 1 se probaron en un experimento similar al del ejemplo 1. En vez de 13,7, se usó el 13,6% (p/v) de la fórmula. En vez de lipasa de Rhizopus oryzae, se usó lipasa de conejo a 16,6 mg/ml (Germ, REG.340) en la fase gástrica. Durante la fase intestinal, se utilizaron 0,06 mg/ml de lipasa pancreática de páncreas porcino (SIGMA, L0382) y 3,5 mg/ml de lipasa pancreática porcina (SIGMA, L0126) en vez de 0,09 mg/ml de lipasa pancreática de páncreas porcino (SIGMA, L0382).
[0101] La actividad de la lactasa se midió mezclando 30 |_il de lisado celular con 30 |_il de tampón de ensayo (0,625 M de ácido maleico, 0,12 M de lactosa, pH 6,0) y se incubó a 37 °C durante 4 horas; la glucosa resultante se cuantificó. La actividad de la lactasa se expresó como |_imol de glucosa/min/mg.
[0102] Se descubrió que la actividad de la lactasa aumentó significativamente cuando las células se trataron con la fórmula para bebés de prueba experimental predigerida en comparación con la fórmula de control predigerida, véase la tabla 2.
Tabla 2: Actividad de la lactasa de enterocitos intestinales expuestos a la fórmula de control o experimental
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[0103] La actividad de la lactasa aumenta en los enterocitos en diferenciación, seguida de un aumento en la actividad de la sacarosa, después de lo cual la actividad de la lactasa en el borde en cepillo comienza a disminuir. Dado que las células no mostraron actividad de la sacarosa en el momento de la medición (datos no mostrados), un aumento de la actividad de la lactasa es, por lo tanto, indicativo de un estado celular más diferenciado.
Prueba de proliferación celular
[0104] Se sembraron células HT-29 de carcinoma de colon humano de tipo cripta a 5,104 en placas Nunc™ Edge de 96 pocillos en DMEM con SBF al 10 %, penicilina/estreptomicina al 1 % y 1 g/l de galactosa. Se permitió que las células se adhirieran durante 30 horas, después de lo cual el medio se reemplazó por FI digerido diluido en un medio de cultivo sin suero de ternera fetal a concentraciones finales del 0,23 %, 0,17 % y 0,085 % (p/v) por triplicado. Las diferentes tasas de proliferación celular dieron como resultado diferentes contenidos de proteína celular después de 72 horas de incubación, estos se midieron mediante lisis celular seguido de la determinación del contenido de proteína con el kit de ensayo de proteína Thermo Fischer Pierce BCA según las instrucciones del fabricante.
[0105] La proliferación celular aumentó significativamente, como se muestra por un mayor contenido de proteína celular de las células tratadas con la fórmula para bebés de prueba experimental predigerida en comparación con la fórmula de control predigerida (Tabla 3).
Tabla 3: Proliferación (proteína celular pg/pocillo) de enterocitos intestinales expuestos a fórmula experimental o
[0106] Para lograr su función como barrera al entorno externo, el epitelio intestinal debe renovarse continuamente. El crecimiento y la renovación de las células epiteliales intestinales dependen de la proliferación de células en las criptas intestinales. Por lo tanto, se espera que la estimulación de la tasa de proliferación celular apoye la función de barrera intestinal.
Ejemplo 3: beta1.3'-galactosil-lactosa y 2'-fucosil-lactosa protegen contra la disrupción de la barrera intestinal y evitan el aumento de la permeabilidad.
[0107] La beta1,3'-galactosil-lactosa (beta3'-GL), la beta1,4'-galactosil-lactosa (beta4'-GL) y la beta1,6'-galactosillactosa (beta6'-GL) se obtuvieron de Carbosynth (Berkshire, Reino Unido). La alfa1,3'-galactosil-lactosa (alfa3'-GL) se obtuvo de Elicityl (Crolles, Francia). El desoxidivalenol purificado (DON) (D0156; Sigma Aldrich, St Luis, MO, EE. UU.) se disolvió en etanol puro y se almacenó a -20 °C. Se obtuvieron células de adenocarcinoma colorrectal epitelial humano (Caco-2) de American Type Tissue Collection (código HTB-37) (Manasse, VA, EE. UU., fragmento 90-102).
[0108] Se usaron células Caco-2 según los métodos establecidos. En resumen: las células se cultivaron en un medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) y se sembraron a una densidad de 0,3*105 células en insertos de 0,3 cm2 de alta densidad de poros (0,4 pm) con una membrana de tereftalato de polietileno (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EE. UU.) situada en una placa de 24 pocillos. Las células Caco-2 se mantuvieron en una atmósfera humidificada de 95 % de aire y 5 % de CO2 a 37 °C. Después de 17-19 días de cultivo, se obtuvo una monocapa confluente con una resistencia eléctrica transepitelial media (RET) superior a 400 Q cm2 medida con un voltímetro-ohmímetro Millicell-Electrical Resistance System (Millipore, Temecula, CA, EE. UU.).
[0109] Por lo tanto, las monocapas de células Caco-2 crecieron en un sistema transwell, que es un modelo para la función de barrera intestinal. Las monocapas se pretrataron durante 24 h con diferentes GLs, incluidas beta3'-GL, alfa3'-GL, beta4'-GL y beta6'-GL en una concentración del 0,75 % en peso de la GL, antes de exponerlas a la toxina fúngica deoxinivalenol (DON), que es un desencadenante y un compuesto modelo para dañar la barrera intestinal. El DON se diluyó hasta una concentración final de 4,2 pM en un medio celular completo y se añadió al lado apical, así como al lado basolateral de los insertos transwell. Esta concentración de DON no afectó a la viabilidad de las células Caco-2. La incubación con DON fue de 24 h.
[0110] Se realizaron mediciones de la resistencia eléctrica transepitelial (RET) y la permeabilidad del amarillo de Lucifer (AL) para investigar la integridad de la barrera. Para las mediciones de RET, se usó un voltímetroohmímetro Millicel-ERS conectado a un par de electrodos de palillos para medir los valores de RET. Los resultados se expresan como un porcentaje del valor inicial. Para el ensayo del flujo de trazador paracelular, se añadió amarillo de Lucifer (AL) impermeable a la membrana (Sigma, St Luis, MO, EE. UU.) en una concentración de 16 |jg/ml al compartimento apical en la placa transwell durante 4 h, y el flujo paracelular se determinó midiendo la intensidad de fluorescencia en el compartimento basolateral con un espectrofotofluorímetro (FLUOstar Optima, BMG Labtech, Offenburg, Alemania) ajustado a longitudes de onda de excitación y emisión de 410 y 520 nm, respectivamente. La liberación de interleucina 8 (IL-8 o CXCL8), que es un marcador típico de inflamación, se cuantificó en el medio del lado apical y el lado basolateral de los insertos transwell de Caco-2 en respuesta a los tratamientos. Las concentraciones de CXCL8 se midieron utilizando el ensayo ELISA de IL-8 humana (BD Biosciences, Pharmingem, San Diego, CA, EE. UU.) según las instrucciones del fabricante. Para obtener más detalles sobre materiales y métodos, véase Akbariet al,2016, Eur J Nutr. 56(5):1919-1930.
[0111] Los resultados se muestran en las figuras 1 A, B, C y D y en la figura 2. La figura 1 muestra los efectos de diferentes galactosil-lactosas (GLs) en el deterioro inducido por DON de la integridad de la monocapa de células Caco-2. Las figuras 1A y 1B muestran la resistencia eléctrica transepitelial (RET) para diferentes GLs. Las figuras 1C y 1D muestran la translocación de amarillo de Lucifer (FAL) al compartimento basolateral. La RET se expresó como un porcentaje del valor inicial y AL se expresó en ng/cm2*h. Alfa3'-GL es Gal (alfa 1-3) - Gal (beta 1-4) -Glc; beta3'-GL es Gal (beta 1-3) - Gal (beta 1-4) - Glc; beta4'-GL es Gal (beta 1-4) - Gal (beta 1-4) - Glc; beta6'-GL es Gal (beta 1-6) - Gal (beta 1-4) - Glc. Los datos son la media ± s.e. *: p < 0,05 en comparación con el control, **: p < 0,01 en comparación con el control, ***: p < 0,001 en comparación con el control, A: p < 0,05 en comparación con el control con DON, AA p< 0,01 en comparación con el control con DON, AAA p< 0,001 en comparación con el control con DON.
[0112] Como se puede observar a partir de las figuras 1A-D, la presencia de DON interrumpió la función de barrera, como se muestra por un valor de RET reducido y un flujo de AL aumentado para las muestras de control con DON. Adicionalmente, la presencia de DON aumentó la liberación de CXCL8 (IL-8), como se muestra en la figura 2. Las figuras 1A-D muestran, además, que la presencia de beta3'-GL evitó la pérdida de integridad de la barrera epitelial inducida por DON, medida por valores de RET aumentados y una reducción en el flujo de AL afectado por DON a través de la monocapa epitelial intestinal. Beta4'-GL y beta6'-GL no mostraron un efecto significativo sobre la función de barrera epitelial intestinal. Curiosamente, beta3'-GL, es decir, la galactosil-lactosa con un enlace glicosídico (31-3, fue eficaz a la hora de proteger la función de barrera intestinal, mientras que alfa3'-GL, es decir, la galactosil-lactosa con un enlace glicosídico a1-3, no impidió la alteración de la barrera intestinal inducida por DON. En cambio, todas las galactosil-lactosas pudieron disminuir la liberación de IL-8 inducida por DON, como se muestra en la figura 2. Estos resultados son indicativos del efecto específico de beta3'-GL (también denominados aquí beta1,3'-galactosil-lactosa o Gal (beta 1-3) - Gal (beta 1-4) - Glc) en la protección de la función de barrera epitelial intestinal, en particular en condiciones de desafíos, que va más allá y/o es independiente de un efecto sobre la prevención de una respuesta inflamatoria y/o de un efecto sobre o a través de la microbiota. Por lo tanto, estos resultados son indicativos de un efecto que beta3'-GL tiene sobre el aumento de la función de barrera intestinal y/o sobre la prevención y/o el tratamiento de la disrupción de la barrera intestinal. Además, estos resultados son indicativos de un efecto de beta3'-GL sobre el tratamiento, la prevención y/o el alivio de una condición asociada a la exposición de toxina en un sujeto, en particular cuando la toxina es una toxina de tricoteceno y, más en particular, cuando la toxina es un deoxinivalenol.
[0113] En un experimento separado, se determinó el efecto de la 2'fucosil-lactosa en RET y en el flujo de FAL en el mismo modelo. 2'-FL se evaluó en una concentración de 1 mg/ml y se descubrió que previene de manera estadísticamente significativa la reducción de RET inducida por DON y el aumento de FAL, véase la tabla 4. Esto es indicativo del efecto ventajoso que tiene 2'FL sobre la función de barrera intestinal. Por lo tanto, este ejemplo es indicativo de un efecto mejorado adicional sobre la función de barrera intestinal en una composición, cuando se combinan 2'FL y beta3'-GL.
'- -
Ejemplo 4: El butirato mejora la función de barrera intestinal
[0114] Se examinó el efecto del butirato sobre la función de barrera intestinal
Métodos
[0115] Las células epiteliales intestinales humanas T84 se usan comúnmente para estudiar la integridad de la barrera intestinalin vitro.Se cultivaron células T84 (ATCC, EE. UU.) en insertos transwell de 12 mm (0,4 |_im, Corning Costrar, EE. UU.) en DMEM-F12 glutamax con penicilina-estreptomicina (100 lU/ml), suplementadas con FBS-HI al 5 %. Se usaron células T84 14 días después de alcanzar la confluencia. Las monocapas de T84 cultivadas en filtros transwell se preincubaron durante 48 h con o sin butirato. Estas muestras se incubaron posteriormente durante 48 h más en presencia de IL-4 (25 ng/ml). IL-4 se añadió al compartimento basolateral; el medio y los aditivos se cambiaron cada 24 h.
[0116] La integridad de la barrera epitelial se evaluó midiendo la resistencia transepitelial (RET; Q x cm2) con el voltímetro-ohmímetro epitelial (EVOM; World Precision Instruments, Alemania).
[0117] Los resultados se muestran en la tabla 5, donde se presentan los valores de RET relativos. La columna de 48h y 96h es el aumento de RET relativo al valor t=0. El tratamiento con IL-4 interrumpió la función de barrera intestinal; sin embargo, en presencia de butirato, esta disrupción mejoró.
Tabla 5: Efecto del butirato sobre la función de barrera intestinal.
[0118] Por lo tanto, este ejemplo es indicativo de un efecto mejorado adicional sobre la función de barrera intestinal en una composición cuando se combinan beta3'-GL, 2'-FL y, butirato dietético opcionalmente,.
Ejemplo 5: 2'-FL y (3-GL y/o butirato) afectan al sistema inmunitario de manera diferente
[0119] La activación y las respuestas de las células inmunitarias se determinaron mediante el cultivo de células mononucleares de sangre periférica humana (CMSP) en presencia o ausencia de 2'-FL, 3'-GL y ácido butírico con y sin estimulación específica de células T.
Material y métodos
[0120] Aislamiento de CMSP de donantes sanos: Se aislaron células mononucleares de sangre periférica humana (CMSP) de donantes sanos de capas leucocitarias (Sanquin, Ámsterdam, Países Bajos). Las CMSP se obtuvieron mediante centrifugación usando tubos Leucosep (Greiner Bio-One). Las CMSP se recogieron y lavaron en SSTF (Gibco, Thermo Fisher Technologies) SBF al 2 % inactivado por calor (Invitrogen), seguido de lisis hipotónica de eritrocitos con tampón de lisis estéril (0,15 M de NH4Cl, 0,01 M de KHCOs y 0,1 mM de EDTA, pH de 7,4 a 4 °C, todos de Merck, Darmstadt, Alemania). Después de la lisis, las CMSP se resuspendieron en el medio de congelación (medio RPMI 1640 al 70 % (Gibco, Thermo Fisher Technologies) suplementado con SBF al 10 % inactivado por calor y 100 U/ml de penicilina-estreptomicina, SBF al 20 % inactivado por calor y DMSO al 10 % (Sigma)) y se crioconservaron.
[0121] Modelo de activación de CMSP: Las CMSP (0,2-10® células/pocillo) se cultivaron en placas de fondo plano de 96 pocillos (Corning). Durante 24 horas, las células se preincubaron con 2'-FL (Jennewein), 3'-GL (0-0,3% p/v; Carbosynth) o butirato de sodio (0,2 mM; Sigma Aldrich) y combinaciones de los mismos. Posteriormente, las células se activaron con CD3/CD28 (Pelicluster CD3 y Pelicluster CD28, Sanquin) durante 24 horas más. Después de la incubación, se midió IFN y mediante ELlSA en los sobrenadantes (ver a continuación). Para determinar la actividad celular después de la estimulación, se incubaron CMSP con reactivo de proliferación celular WST-1 (10 |_il; Roche) y/o Triton al 10 % (5 |_il; control negativo). Después de 3 horas, se midió la absorbancia a OD450 nm y OD650 nm y se calculó la actividad celular según las instrucciones del fabricante.
[0122] Producción de IFN<y>de CMSP: Las CMSP se incubaron con los reactivos indicados y, después de la incubación, se recogieron los sobrenadantes y se midieron los niveles de mediadores usando kits ELlSA de IFNy humano (R&D Systems Europe Ltd.) según las instrucciones del fabricante.
[0123] Producción de citoquinas de CMSP: Las CMSP se incubaron con los reactivos indicados. Después de la incubación, los sobrenadantes se recogieron y se midieron los niveles de IL2, IL6, IL10, IL13, IL21, TNFa, IFNy, MIF, CCL1, CCL13, CCL17, CCL20, CCL22 y CXCL8-11 mediante la realización de un inmunoensayo multiplex validado basado en la tecnología Luminex (xMAP, Luminex Austin TX, EE. UU.). La adquisición se realizó con Biorad FlexMAP3D (Biorad laboratories, Hercules, EE. UU.) en combinación con el software xPONENT versión 4.2 (Luminex). Los datos se analizaron mediante el ajuste de curvas de 5 parámetros utilizando elsoftwareBio-Plex Manager, versión 6.1.1 (Biorad).
[0124] Después de la estimulación con CMSP, se recogieron los sobrenadantes del cultivo celular, después de lo cual se midieron las respuestas de citoquinas para probar la capacidad de respuesta inmunitaria de las células. Los niveles de citoquinas medidos en condiciones estimuladas fueron corregidos por los niveles (bajos) de las citoquinas medidas en condiciones no estimuladas. Además, dado que cada donante reacciona con su propia eficiencia sobre el estímulo de las células T, calculamos el índice individual de respuesta de las citoquinas dividiendo la respuesta inducida por la intervención entre la respuesta estimulada basal.
[0125] En general, se considera que IL2, IL6, TNF-alfa, CCL1, CCL17 y CCL20 están asociados con la inflamación y/o proliferación. Se considera que IFN-gamma, CXCL9, CXCL10 y CXCL11 están asociados a una respuesta Th1. Se considera que IL13, CCL13 y CCL22 están asociados a una respuesta Th2. Se considera que IL10 y Galectina-9 están asociados a un efecto Treg e IL21 está asociada a un efecto de células B.
[0126] Análisis estadístico: La comparación entre los estimulados con CD3/CD28 y los controles se realizó usando la prueba t de una cola pareada (Wilcoxon), p <0,05 se consideró significativamente diferente.
[0127] La media relativa ± SEM de los valores medidos y calculados en condiciones estimuladas se probó estadísticamente usando la prueba t de dos colas pareada (Wilcoxon), p <0,05 se consideró significativamente diferente. Los valores de cálculo del efecto combinado de los ingredientes únicos se basaron en los valores medidos por donante.
[0128] La actividad de las células inmunitarias, medida por WST, aumentó significativamente después de 24 h mediante la adición de 2'-FL, mientras que se detectó una disminución en la activación con la adición de 3'-GL. La adición de butirato no influyó en la actividad metabólica de células inmunitarias ni en condiciones no estimuladas ni en condiciones estimuladas por las células T (CD3/CD28).
[0129] La adición de 2'-FL alteró la respuesta de citoquinas, mientras que la adición de 3'-GL no dio como resultado los mismos cambios. Curiosamente, la adición de 3'-GL con 2'-FL pareció aumentar significativamente el rendimiento de 2'-FL. Además, la diferencia que se descubrió entre la respuesta derivada de 3'-GL y 2'-FL sobre la actividad metabólica de las células frente a la producción de IFN-gamma, es indicativa de que se imputan otras respuestas inmunitarias.
[0130] En general, se concluye que el grupo total de CMSP humanas aisladas es un grupo diverso de células inmunitarias, que responden directamente y de manera diferente a los OLHs proporcionados. Aunque las células se vuelven metabólicamente más activas, la producción de citoquinas en presencia de 2'-FL no es igual a la producción de citoquinas en presencia de 3'-GL, lo que sugiere respuestas reactivas inmunitarias diferenciales.Resultados en 2-'FL, 3'-GL y su combinación
[0131] Se estudió el efecto de cocultivo con 2'FL y 3'GL y su combinación en cultivos de CMSP de 10 donantes humanos. En primer lugar, se determinó el efecto de la estimulación específica de células T a través de CD3/CD28.
[0132] Después de la estimulación de las CMSP humanas, se recogieron los sobrenadantes del cultivo celular, después de lo cual se midieron las respuestas de citoquinas para probar la capacidad de respuesta inmunitaria de las células. Tras la estimulación específica de células T con CD3/CD28, se detectaron varias citoquinas<dentro de los sobrenadantes de células usando la tecnología Luminex. El tipo Th2 de citoquinas IL-4 e i>L-13 y quimioquinas CCL17 aumentaron significativamente mostrando una fuerte estimulación de células T (tabla 6). Tabla 6. Niveles de citoquina IL-4, IL-13 y quimioquina CCL17 (pg/ml) medidos en sobrenadantes de cultivos celulares de CMSP después de la estimulación con CD3/CD28 en comparación con las condiciones no estimuladas.
[0133] Posteriormente, para probar el efecto directo de los compuestos específicos sobre la actividad de CMSP, las células se activaron con CD3/CD28 durante 24 horas después de preincubarlas durante 24 h con 2'-FL, 3'-GL y combinaciones de los mismos. Además, dado que cada donante reacciona con su propia eficiencia al estímulo de células T, el índice individual de respuesta de citoquina se calculó dividiendo la respuesta inducida por la intervención entre la respuesta estimulada basal (el blanco se establece en 1). De esta manera, se ha estudiado la intervención dentro de 10 donantes diferentes.
[0134] IL-4 e IL-13 son citoquinas estrechamente relacionadas, conocidas por regular muchos aspectos de la inflamación alérgica. Desempeñan un papel importante en la regulación de las respuestas de los linfocitos, las células mieloides y las células no hematopoyéticas. Por ejemplo, en las células T, la IL-4 induce la diferenciación de las células T CD4 vírgenes en células T de tipo Th2, en las células B, la IL-4 impulsa el cambio de clase de inmunoglobulina (Ig) a IgG1 e IgE, y en los macrófagos, la IL-4 y la IL-13 inducen una activación alternativa de macrófagos.
Tabla 7: Nivel relativo de IL-4, IL-13 y CCL17 en condiciones estimuladas con CD3/CD28 con 2'-FL y 3'-GL, o la combinación.
[0135] La estimulación de células T de las CMSP humanas dio como resultado un aumento significativo de IL-4 e IL-13. La preincubación de las células con 2'-FL no tuvo ningún efecto sobre los niveles de IL-4 e IL-13 en comparación con los controles. Sin embargo, se detectó una reducción en presencia de 3'-GL en comparación con el control. Además, la combinación de 2'-FL y 3'-GL indujo niveles significativamente más bajos de IL-4 e IL-13 en comparación con el control y 2'-FL. Curiosamente, estos niveles reducidos de IL-4 e IL-13 fueron significativamente más bajos de lo que cabría esperar según los cálculos de los efectos individuales de 2'-FL y 3'-GL, véase la tabla 7.
[0136] Estos datos muestran un tipo Th2 reducido inesperado de la capacidad de respuesta tras la estimulación de células T dentro de la población de CMSP total cuando las células están en presencia de una combinación de 2'-FL y 3-GL', en comparación con 3'-GL o 2'FL solas.
[0137] Las citoquinas regulan las respuestas celulares a nivel transcripcional, mientras que las quimioquinas desempeñan un papel en el reclutamiento de células inflamatorias en los sitios de inflamación. La quimioquina CCL17 (timo y quimioquina regulada por activación) es un quimioatrayente potente para los linfocitos Th2 y se cree que desempeña un papel importante en enfermedades inflamatorias, como la alergia. En el ejemplo, los niveles séricos de CCL17 reflejan claramente la actividad de la enfermedad de la dermatitis atópica, que se considera una enfermedad inflamatoria de la piel con dominancia Th2, especialmente en la fase aguda.
[0138] La estimulación de células T humanas dio como resultado un aumento significativo en CCL17, véase la tabla 7. Aunque la preincubación con 2'-FL o 3'-GL no tuvo un efecto significativo sobre los niveles de CCL17 dentro de las CMSP estimuladas con células T, se detectó una reducción significativa en los niveles de CCL17 cuando las CMSP activadas se preincubaron con 2'-FL y 3'-GL en comparación con 2'-FL y 3'-GL únicas. En base a los cambios inducidos por los componentes individuales en comparación con los niveles de control, se puede calcular el cambio esperado al combinar las intervenciones. Curiosamente, cuando se cultivaron las CMSP estimuladas con células T en presencia de la combinación de 2'-FL y 3'-GL, se indujeron niveles de CCL17 más bajos de lo esperado. Los cambios en los niveles de CCL17 indican una reducción adicional inesperada de la capacidad de respuesta de tipo Th2 tras la estimulación de células T dentro de la población total de CMSP cuando las células están en presencia de una combinación de 2'-FL y 3'-GL. Estos datos de CCL17 están en línea con los datos de IL-4 e IL-13.
[0139] El grupo total de CMPs humanas aisladas es un grupo diverso de células inmunitarias, que pueden responder directamente y de manera diferente a los OLHs proporcionados. Aunque las células se vuelven más activas metabólicamente, los niveles de IL-4, IL-13 y CCL17 de los mediadores Th2 no se vieron afectados significativamente por la exposición única de 2'-FL, mientras que la exposición única de 3'-GL dio como resultado una reducción de estos niveles de mediadores. Curiosamente, la exposición simultánea de 2'-FL y 3'-GL redujo de manera estadísticamente significativa los niveles de IL-4, IL-13 y CCL17, lo que redujo el tipo de respuestas Th2. Estos datos indican que la adición de 3'-GL a 2'-FL tiene el potencial para reducir el desarrollo de alergias.Resultados sobre 2'-FLyácido butírico
[0140] La interleucina-10 (IL10) no es una citoquina específica del tipo celular, pero muchas células inmunitarias la expresan ampliamente. La inducción de IL10 a menudo ocurre junto con otras citoquinas proinflamatorias, aunque las vías que inducen IL10 pueden regular negativamente estas citoquinas proinflamatorias. IL10 tiene un papel central en la infección al limitar/regular la respuesta inmunitaria a los patógenos y, por lo tanto, prevenir el daño al huésped. Por lo tanto, la IL10 se considera generalmente una citoquina reguladora. Los niveles de IL 10 se midieron en cultivos de células mononucleares de sangre periférica (CMSP) de 10 donantes humanos.
Tabla 8: Niveles de IL10 en CMSP en condiciones no estimuladas, representados como valores relativos n rm liz n m r i n n l l n r l rri l v ri i n l n n
[0141] En CMSP humanas cocultivadas con 2'-FL al 0,2 %, se detectó un nivel significativamente mayor (p<0,05) de IL10 en comparación con el control con blanco, mientras que la adición de butirato no tuvo un efecto sobre los niveles de IL10. La combinación de 2'-FL al 0,2 % y 0,2 mM de butirato aumentó significativamente los niveles de IL10 en comparación con el control con blanco y con 0,2 mM de butirato. Curiosamente, la combinación de 2'-FL y butirato aumentó la IL10 a niveles más altos de lo que teóricamente se pueden esperar en función de los componentes individuales, véase la tabla 8. Esto es indicativo de una capacidad reguladora aumentada inesperada y beneficiosa de la CMSP humana en presencia de una combinación de 2'-FL y butirato en comparación con los únicos ingredientes.
[0142] En general, CCL20 y CCR6 desempeñan un papel en el reclutamiento de DCs inmaduras y sus precursores en sitios de posible entrada de antígeno. Dependiendo del microambiente del tejido (por ejemplo, presencia local de TGF-beta, IL10 o IL15), las células inmunitarias pueden adquirir CCR6 funcional y, por lo tanto, migrar a sitios de producción de CCL20. Se muestra que CCL20 induce rápidamente la adhesión firme de subconjuntos de linfocitos T recién aislados a la molécula-1 de adhesión intercelular. Por lo tanto, la regulación puede obtenerse mediante la modulación de CCL20 en condiciones no estimuladas.
Tabla 9. Niveles de CCL-20 en condiciones no estimuladas representados como valores relativos, por lo que se corri e la variación del donante
[0143] En CMSP humanas expuestas a 2'-FL, se detectó un nivel aumentado de CCL20 en comparación con el control con blanco, mientras que la adición de butirato o 3'-GL solo no tuvo un efecto estadísticamente significativo en los niveles de CCL20. La incubación de CMSP humanas con la combinación de 2'-FL y butirato indujo niveles significativamente más altos de CCL20 en comparación con el blanco y el butirato solos. La presencia adicional de 3'-GL en esta combinación de 2'-FL y butirato mejoró aun más los niveles de CCL20. De forma inesperada, los niveles observados de la combinación de 2'-FL y butirato fueron significativamente más altos de lo que se puede calcular en función de los únicos ingredientes. Este también fue el caso en el que se comparó el valor observado de la combinación de 2'-FL, butirato y 3'-GL con el valor teóricamente calculado en función de los únicos ingredientes. Véase la tabla 9.
[0144] Estos datos indican que la adición de 2'-FL y butirato influye en la respuesta inmunitaria de las CMSP humanas. La presencia adicional de 3'-GL mejora aun más la respuesta inmunitaria. El grupo total de CMSP humanas aisladas es un grupo diverso de células inmunitarias, que responden directamente y de manera diferente a los OLHs proporcionados. Los cambios detectados tanto en IL-10 como en los niveles de CCL20 sugieren una modulación mejorada inesperada en la capacidad de respuesta de la CMSP humana en presencia de una combinación de 2'FL y butirato, que mejora aun más cuando 3'GL está presente.
Ejemplo 6: 2'-FL aumenta la formación de butirato por parte de la microbiota, en particular si también está presente GOS
[0145] Se usó una muestra fecal de un bebé sano de 3 meses nacido por cesárea, alimentado exclusivamente con leche materna sin antecedentes de uso de antibióticos, como inóculo para simular la microbiota intestinal de bebés en los compartimentos del colon de un quad-SHIME®, un modelo dinámico del tracto gastrointestinal humano comprende 4 unidades SHIME® que funcionan en paralelo y cada unidad SHIME® está compuesta por 3 reactores que simulan el estómago y el intestino delgado, el colon proximal y el distal.
[0146] Los perfiles de AGCC mostraron que el acetato es el más abundante en el colon distal, seguido del propionato (tabla 10). Las concentraciones de acetato y propionato fueron mayores en presencia de GOScc/FOScl y GOScc/FOScl/2'-FL que en las unidades de control y suplementadas con 2'-FL. También se vieron observaciones similares en los dos puntos proximales (datos no mostrados). Curiosamente, el butirato se generó antes en el colon distal y a una concentración más alta en presencia de 2'-FL y GOScc/FOScl/2'-FL con respecto a los grupos de control y GOScc/FOScl. El nivel de isobutirato, un AGCC ramificado resultante de la fermentación proteolítica, se redujo en el colon distal en presencia de GOScc/FOScl/2'-FL y GOScc/FOScl.
[0147] Los datos del glicoperfil revelaron que 2'-FL no se metabolizaba cuando se complementaba sola, sino que solo se utilizaba en presencia de GOScc/FOScl, donde se metabolizaba lentamente en el colon proximal y distal. Todos los demás carbohidratos, incluido el GOScc, se agotaron en la primera hora en el colon proximal. Se demostró que 2'-FL solo se fermentaba en presencia de otro GOS, en particular GOS/FOScl, lo que da como resultado un ecosistema microbiano que se sugiere que confiere beneficios para la salud.
[0148] GOScc/FOScl/2'-FL mejoró la producción de butirato, un AGCC importante para la función de barrera intestinal. GOScc/FOScl/2'-FL dio como resultado un nivel sorprendentemente más bajo de isobutirato, lo que es una indicación de una menor actividad proteolítica en el colon.
Ejemplo 7: Inhibición de patógenos en la microbiota por parte de 2'-FL, 3'-GL y butirato
[0149] La fermentación anaeróbica de muestras de lodo fecal se probó en un minimultifermentador de microfluidos BioLector Pro. Se recogieron muestras de lodo fecal de bebés alimentados con leche materna y de bebés alimentados con fórmula. Estas muestras de lodo fecal se procesaron añadiendo 0,6 gramos de heces en 40 ml del medio Baby Reichardt V.6 moco sulfato amónico lactato y acetato. Las soluciones resultantes se insertaron en el minimultifermentador de microfluidos BioLector Pro. Las piernas de prueba se complementaron con 3-GL, 2'-FL, 3'-GL 2'-FL y GOS/FOS. La pierna de control se complementó con agua esterilizada.
[0150] Además, las piernas de prueba se complementaron conClostridium difficileC153 (agar difficile),Salmonella enteriditisS29 (agar XLD),Cronobacter sakasakiiE71 (agar cromogénico) oKlebsiella pneumoniaK2 (agar citrato inositol de Simons). Para cada OND y para el control también se preparó un cultivo libre de patógenos.
[0151] Después de la fermentación, se analizó el contenido de AGCC de las soluciones fermentadas (en particular, ácido acético, ácido propiónico, ácido butírico y ácido isobutírico), el contenido de amoníaco, el contenido de lactato y la concentración de patógenos. También se realizó aislamiento de ADN identificación y secuenciación de 16s para determinar la composición de la microbiota.
[0152] Se usó una placa de 32 pocillos que puede manejar un pH baja. Los pocillos de esta placa se llenaron con solución fecal. A la suspensión fecal se le añadió 2,5 % (p/v) de las diferentes soluciones estériles de carbohidratos (3'-GL, 2'-<f>L, 2'-FL/3'-GL (2,0+0,5%) y glucosa según una plantilla.
[0153] Se inició el experimento, y el punto de referencia del pH fue 5,5 (inóculo facial del bebé 1, nacido por vía vaginal amamantado, 5 meses de edad) o pH 6,0 (inóculo del bebé 2, nacido por vía vaginal, amamantado, 5 meses de edad) con regulación continua de pH, y temperatura 37 °C, humedad 85 %, control con OD. A las 4, 8 y 24 horas se toma una muestra para la determinación de UFC en agar TOS-propionato MUP (bifidobacterias totales), agar XLD paraSalmonella enteriditisS29 y agar citrato inositol de Simons paraKlebsiella pneumoniaK2 y para AGCC, D- y L Lactato y análisis de amoníaco. Se usó sedimento fecal para la secuenciación del ADN 16s. Para ambos inóculos, el grado de fermentación, medido por el consumo de NaOH, es decir, la producción de ácido fue mayor con la combinación de 3'-GL/2'-FL, cuando se compara con 3'-GL o 2'-FL solas. La tasa de acidificación inicial fue alta para 3'-GL y para 3'-GL/2'-FL. En general, 2'-FL solo dio como resultado una acidificación más lenta y más baja. Como la cantidad de carbohidratos que se pueden fermentar es la misma en los recipientes de reacción, la mayor acidificación total con la combinación es indicativa de un efecto inesperado sinérgico de la combinación de 2'-FL y 3'-GL. LOS AGCC que se produjeron fueron en su mayor parte ácido acético. También se produjo ácido L-láctico.
[0154] Se observó el crecimiento de las bifidobacterias con 3'-GL, 2'-FL y con la mezcla de 2'-FL/3'-GL y la estimulación del crecimiento fue en general muy similar. Sin embargo, a las 24 h se observó el nivel más alto con la mezcla de 3'-GL/2'-FL para el bebé 1. También se observó el crecimiento de Enterobacteriaceae, y fue muy similar bajo las condiciones probadas, pero fue más bajo a las 8 h para la combinación de 2'-FL/3'-GL para el inóculo del bebé 1. Los datos de secuenciación de la microbiota de 16s en este momento mostraron una disminución relativa del filo de Proteobacteria (donde el principal contribuyente es el género Escherichia). Al final de la fermentación, cuando se agotaron los carbohidratos, la microbiota alimentada con 2'-FL/3'-GL pudo retener una composición de microbiota más positiva que los controles (glucosa y blanco). Para el inóculo del bebé 2, el efecto sobre las bifidobacterias fue mayor en presencia de 3'-GL, y el efecto reductor del crecimiento sobre las enterobacterias fue mejor cuando se usó una combinación de 3'-GL/2'-FL.
[0155] En condiciones en las que los recipientes se enriquecieron con la mezcla de patógenos, en general se observó una acidificación ligeramente reducida en comparación con las condiciones en las que no hubo ningún enriquecimiento con patógenos. Sin embargo, los efectos de 2'-FL, 3'-GL y 2'-FL/3'-GL sobre la acidificación, según lo determinado por el consumo de NaOH, no se vieron afectados, y nuevamente fueron más altos con 3'-GL/2'-FL para ambos inóculos. Para el inóculo del bebé 1, el crecimiento de Salmonella fue más restringido por 2'-FL, mientras que el crecimiento de Klebsiella fue más inhibido por la combinación de 3'-GL/2-'FL. Para el inóculo del bebé 2, el crecimiento de Salmonella fue más restringido por 2'-FL, mientras que el crecimiento de Klebsiella fue más inhibido por 3'-GL o la combinación de 3'-GL/2'-FL. Para ambos inóculos, el crecimiento de C difficile se restringió en todas las condiciones.
[0156] Estos resultados son indicativos de un efecto mejorado sobre la función de microbiota intestinal y la combinación de la composición de 2'-FL y 3'-GL que va más allá de los efectos de 2'-FL sola o 3'-GL sola.
Ejemplo 8: Fórmula para bebés
[0157] La fórmula para bebés, destinada a bebés de 0 a 6 meses de edad, que comprende por 100 ml, después de reconstituir 13,7 g de polvo hasta un volumen final de 100 ml:
• 66 kcal,
• 1,3 g de proteína (proporción en peso de proteína de suero de leche/caseína 1/1),
• 7,3 g de carbohidratos digeribles (principalmente lactosa),
• 3,4 gramos de grasa (de los cuales aproximadamente el 50 % en peso es grasa de leche bovina, donde el resto son aceites vegetales, aceite de pescado y aceite microbiano). En base a los ácidos grasos totales, la cantidad de ácido butírico es del 1,48 % en peso, la cantidad de ácido araquidónico es del 0,52 % en peso, la cantidad de ácido eicosapentaenoico es del 0,11 % en peso, la cantidad de ácido docosahexaenoico es del 0,52 % en peso,
• 0,9 g de oligosacáridos no digeribles, de los cuales 0,1 g es 2'-FL (fuente Jennewein), 0,08 g son fructooligosacáridos de cadena larga (fuente RaftilineHP), 0,72 g son galactooligosacáridos (de los cuales aproximadamente 25 mg es 3'galactosil-lactosa obtenida por fermentación, donde el resto son galactooligosacáridos de Vivinal GOS),
• Minerales, vitaminas, oligoelementos y otros micronutrientes según las directivas para fórmula para lactantes,
• Parte de la fórmula, aproximadamente el 26 % en peso en base al peso seco, se deriva del producto Lactofidus fermentado por cepas de S. thermophilus y B. breve, lo que da como resultado alrededor del 0,28 % en peso de ácido láctico en base al peso seco de la composición, del cual más del 95 % en peso está en forma de L.
Ejemplo 9: Fórmula de continuación
[0158] La fórmula de continuación, destinada a bebés mayores de 6 meses de edad, que comprende por 100 ml, después de reconstituir 14,55 g de polvo hasta un volumen final de 100 ml:
• 68 kcal,
• 1,36 g de proteína (proporción en peso de proteína de suero de leche/caseína 4/6),
• 8,1 g de carbohidratos digeribles (principalmente lactosa),
• 3,2 gramos de grasa (de los cuales aproximadamente el 50 % en peso es grasa de leche bovina, el resto son aceites vegetales, aceite de pescado y aceite microbiano). En base a los ácidos grasos totales, la cantidad de ácido butírico es del 1,47 % en peso, la cantidad de ácido araquidónico es del 0,29 % en peso, la cantidad de ácido eicosapentaenoico es del 0,12 % en peso, la cantidad de ácido docosahexaenoico es del 0,56 % en peso,
• 0,85 g de oligosacáridos no digeribles, de los cuales 0,05 g es 2'-FL (fuente Jennewein, ¿nombre?), 0,08 g son fructooligosacáridos de cadena larga (fuente RaftilineHP), 0,72 g son galactooligosacáridos (de los cuales aproximadamente 25 mg es 3'galactosil-lactosa obtenida por fermentación, el resto son galactooligosacáridos de Vivinal GOS),
• Minerales, vitaminas, oligoelementos y otros micronutrientes según las directivas para fórmulas para bebés,
• Parte de la fórmula, aproximadamente el 26 % en peso en base al peso en seco, se deriva del producto Lactofidus fermentado por cepas de S. thermophilus y B. breve, lo que da como resultado aproximadamente el 0,28 % en peso de ácido láctico en base al peso seco de la composición, del cual más del 95 % en peso está en forma de L.
Ejemplo 10: Fórmula para niños
[0159] La fórmula de continuación, destinada a niños mayores de 12 meses de edad hasta los 36 meses de edad, que comprende por 100 ml, después de reconstituir 15,07 g de polvo hasta un volumen final de 100 ml:
• 65 kcal,
• 1,3 g de proteína (proporción en peso de proteína de suero de leche/caseína 4/6),
• 8,7 g de carbohidratos digeribles (principalmente lactosa),
• 2,6 gramos de grasa (de los cuales aproximadamente el 10 % en peso es grasa de leche bovina, el resto son aceites vegetales, aceite de pescado). En base a los ácidos grasos totales, la cantidad de ácido butírico es aproximadamente del 0,35%en peso, la cantidad de ácido eicosapentaenoico es del 0,42 % en peso, la cantidad de ácido docosahexaenoico es del 0,63 % en peso,
• 1,22 g de oligosacáridos no digeribles, de los cuales 0,02 g es 2'-FL (fuente Jennewein, ¿nombre?), 0,12 g son fructooligosacáridos de cadena larga (fuente RaftilineHP), 1,08 g son galactooligosacáridos (de los cuales aproximadamente 17 mg es 3'galactosil-lactosa obtenida por fermentación, el resto son galactooligosacáridos de Vivinal GOS),
• Minerales, vitaminas, oligoelementos y otros micronutrientes según las directivas para fórmulas para bebés,
• Parte de la fórmula, aproximadamente el 18 % en peso en base al peso en seco, se deriva del producto Lactofidus fermentado por cepas de S. thermophilus y B. breve, lo que da como resultado aproximadamente el 0,2 % en peso de ácido láctico en base al peso seco de la composición, del cual más del 95 % en peso está en forma de L.

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Composición nutricional para bebés o niños, que es una alimentación con fórmula y que no es leche humana, que comprende:
a. 2'fructosil-lactosa (2'FL) en una cantidad de (i) 0,01 a 1 g por 100 ml de composición nutricional, (ii) 0,075 a 7,5 % en peso en base al peso seco; y/o (iii) 0,015 a 1,5 g/100 kcal, y b. beta 3'galactosil-lactosa (beta3GL) en una cantidad de (i) 0,010 a 0,500 g por 100 ml; (ii) 0,075 a 3,75 % en peso en base al peso seco y/o (iii) 0,015 a 0,75 g por 100 kcal.
2. Composición nutricional según la reivindicación 1, que comprende, además, butirato dietético.
3. Composición nutricional según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la composición está al menos fermentada parcialmente por bacterias productoras de ácido láctico y comprende del 0,1 al 1,5 % en peso de la suma de ácido láctico y lactato en base al peso seco de la composición nutricional, y donde al menos el 90 % en peso de la suma de ácido láctico y lactato es ácido L-láctico y L-lactato.
4. Composición nutricional según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la composición comprende, además, AGPICL seleccionados del grupo de DHA, ARA y EPA, preferiblemente DHA y EPA, preferiblemente DHA, EPA y ARA, comprendiendo más preferiblemente al menos el 1 % en peso de la suma de DHA, ARA y EPA en base a los ácidos grasos totales.
5. Composición nutricional según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la fórmula comprende, además, galactooligosacáridos y/o fructooligosacáridos.
6. Composición nutricional según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la composición nutricional se selecciona del grupo que consta de una fórmula para bebés, una fórmula de continuación o una fórmula para niños, preferiblemente una fórmula para bebés.
7. Composición nutricional según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende (i) del 0,3 al 5 % en peso de butirato dietético en base a los ácidos grasos totales; (ii) de 10 mg a 175 mg por 100 ml; (iii) de 15 a 250 mg por 100 kcal; y/o (iv) del 0,075 al 1,3 % en peso en base al peso seco.
8. Composición nutricional según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende (i) de 0,2 a 5 g de la suma de galactooligosacáridos y fructooligosacáridos por 100 ml; (ii) de 0,3 a 7,5 g por 100 kcal, y/o (iii) del 1,5 al 35 % en peso en base al peso seco.
9. Composición nutricional según cualquiera de las reivindicaciones precedentes para usar en la mejora de la función de barrera intestinal y/o para usar en la mejora del sistema inmunitario y/o para usar en la mejora de la microbiota intestinal y/o para usar en el tratamiento o la prevención de infecciones, en particular infecciones intestinales.
10. Composición nutricional según cualquiera de las reivindicaciones precedentes para usar en el tratamiento y/o la prevención de alergias, para usar en la inducción de tolerancia a alérgenos, y/o para usar en la prevención y/o el tratamiento de la dermatitis atópica.
11. Composición nutricional para usar según la reivindicación 9 o 10, donde la composición nutricional se administra a bebés o niños, preferiblemente bebés.
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