ES2963807T3 - Tratamiento de enfermedades relacionadas con la IgG4 con anticuerpos anti-CD19 de reticulación a CD32B - Google Patents

Tratamiento de enfermedades relacionadas con la IgG4 con anticuerpos anti-CD19 de reticulación a CD32B Download PDF

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Abstract

La presente divulgación se refiere a inmunoglobulinas que se unen a células B FcγRIIb+ y se unen conjuntamente a CD19 en la superficie de la célula y a un FcγRIIb en la superficie de la célula, métodos para su generación y métodos para usar las inmunoglobulinas para el tratamiento de una enfermedad relacionada con IgG4. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Tratamiento de enfermedades relacionadas con la IgG4 con anticuerpos anti-CD19 de reticulación a CD32B CAMPO TÉCNICO
[0001] La presente descripción se refiere a inmunoglobulinas que se unen a las células B FcyRllb+ y coacoplan CD19 sobre la superficie de la célula y a un FcyRllb en la superficie de la célula, métodos para su generación, y métodos para usar las inmunoglobulinas para el tratamiento de una enfermedad relacionada con la IgG4.
ANTECEDENTES
[0002] El reconocimiento de antígenos por parte las células B está mediado por el receptor de células B (BCR), una inmunoglobulina unida a la superficie en complejo con los componentes de señalización CD79a (Iga) y CD79b (IgP). La reticulación del BCR al entrar en contacto con el antígeno provoca la fosforilación de los motivos de activación basados en tirosinas inmunorreceptoras (ITAM) dentro de CD79a y CD79b, iniciando una cascada de eventos de señalización intracelular que reclutan moléculas aguas abajo de la membrana y estimulan la movilización del calcio. Esto conduce a la inducción de diversas respuestas de células B (p. ej., supervivencia celular, proliferación, producción de anticuerpos, presentación antigénica, diferenciación, etc.) que conducen a una respuesta inmune humoral (DeFranco, A.L., 1997, Curr. Opin. Immunol. 9, 296-308; Pierce, S.K., 2002, Nat. Rev. Immunol. 2, 96-105; Ravetch, J.V. y Lanier, L.L., 2000, Science 290, 84-89). Otros componentes del complejo correceptor BCR mejoran (p. ej., CD19, CD21, y CD81) o suprimen (p. ej., CD22 y CD72) señales de activación BCR (Doody, G.M. et al., 1996, Curr. Opin. Immunol. 8, 378-382; Li, D.H. et al., 2006, J. Immunol. 176, 5321-5328). De esta manera, el sistema inmunitario mantiene múltiples mecanismos reguladores del BCR para garantizar que las respuestas de las células B estén estrictamente controladas.
[0003] Cuando se producen anticuerpos contra un antígeno, aumenta el nivel circulante de inmunocomplejos (por ejemplo, antígeno unido a anticuerpo). Estos inmunocomplejos reducen la activación de las células B inducida por antígenos. Se cree que estos inmunocomplejos regulan a la baja la activación de las células B inducida por antígenos al coacoplar el BCR específico con el receptor inhibidor de baja afinidad FcYRIIb, el único receptor de IgG en las células B (Heyman, B., 2003, Immunol. Lett. 88, 157-161). También se cree que esta retroalimentación negativa de la producción de anticuerpos requiere la interacción del dominio Fc del anticuerpo con FcYRllb, ya que los inmunocomplejos que contienen fragmentos de anticuerpos F(ab<' ) 2>no son inhibitorios (Chan, P.L. y Sinclair, N.R., 1973, Immunology 24, 289-301). El motivo inhibidor intracelular basado en tirosina inmunorreceptora (ITIM) de FcyRllb es necesario para inhibir las señales intracelulares inducidas por BCR (Amigorena, S. et al., 1992, Science 256, 1808-1812; Muta, T., et al., 1994, Nature 368, 70-73). Este efecto inhibitorio ocurre a través de la fosforilación del FcyRllb ITIM, que recluta inositol polifosfato 5-fosfatasa que contiene SH2 (SHIP) para neutralizar la movilización de calcio intracelular inducido por ITAM (Kiener, P.A., et al., 1997, J. Biol. Chem. 272, 3838-3844; Ono, M., et al., 1996, Nature 383, 263-266; Ravetch, J.V. y Lanier, L.L., 2000, Science 290, 84-89). Además, la fosforilación de SHIP mediada por FcyRllb inhibe la vía de proliferación corriente abajo Ras-MAPK (Tridandapani, S. Et al., 1998, Immunol. 35, 1135-1146).
[0004] La enfermedad relacionada con la igG4 es una enfermedad sistémica inmunomediada rara. Su diagnóstico es complejo y comprende el nivel sérico de IgG4, plasmoblastos circulantes y características histopatológicas como infiltración linfocítica, fibrosis estoriforme, infiltración eosinofílica y flebitis obliterativa. El tratamiento de la enfermedad relacionada con la IgG4 se centra fundamentalmente en glucocorticoides, mientras que actualmente se investigan los agentes depletores de células B tales como el rituximab y el anticuerpo monoclonal homodímero no deplecionante dirigido a CD19 y Fc-gamma Rlllb (Pilar, B-Z et al., 2016, Best practice & Research Clinical Rheumatology 30(2), 261-278).
[0005] El anticuerpo X5871 es un anticuerpo monoclonal anti-CD19 que reticula el FcgRllb a través de su parte Fc. El anticuerpo inhibe una amplia gama de actividades de células B in vitro tal como la movilización de calcio, la proliferación y la diferenciación de plasma ("Antibodies by Design Xencor R&D Day Welcome", 26 de junio de 2015). Una fase 2 de ensayos de este anticuerpo en enfermedades relacionadas con la IgG4 y lupus eritematoso sistémico fue anunciada por Xencor en 2016 ("Xencor initiates two phase 2 trials on XmAb5871 in IgG4-related disease and Systemic Lupus Erythematosus", 7 de marzo de 2016). En la reunión anual de 2016 del American College of Rheumatology, se presentaron los resultados preliminares del ensayo de fase 2 de enfermedades relacionadas con la IgG4 (13 de noviembre de 2016). Nueve de los 11 pacientes en los que se evaluó el índice respondedor de IgG4-RD tras el tratamiento consiguieron una respuesta a las dos semanas de la primera dosis, con respuestas normalmente dependientes del tiempo.
[0006] WO 2014/113510 A1 se refiere a métodos de reducción rápida de la concentración de suero de un antígeno en un sujeto mediante la administración de un anticuerpo que tiene una región variable que une el antígeno y un dominio Fc variante que une el receptor FcgRIlb con afinidad aumentada en comparación con un dominio Fc no modificado.
RESUMEN DE EJEMPLOS DE REALIZACIONES
[0007] Las referencias en esta descripción a métodos para tratar una enfermedad relacionada con la IgG4 (lgG4-RD) en un paciente se deben interpretar como referencias para compuestos o composiciones de la presente invención para el uso en aquellos métodos.
[0008] La invención se presenta en las reivindicaciones anexas y proporciona una inmunoglobulina que se une a FcyRllb y se coacopla con CD19 sobre la superficie de una célula B para el uso en el tratamiento de una enfermedad relacionada con la IgG4 en un sujeto, donde dicha inmunoglobulina comprende una cadena pesada y una cadena ligera, donde dicha cadena pesada comprende la SEC ID N.°: 9, y dicha cadena ligera comprende la SEC ID N.°: 7, donde dicha inmunoglobulina se usa en una dosis terapéuticamente eficaz.
[0009] La presente divulgación proporciona métodos para usar una inmunoglobulina con el fin de inhibir células que expresan FcYRllb. Los métodos inhibitorios de células FcYRIIb+ descritos en el presente documento comprenden tratar una enfermedad relacionada con la IgG4 (lgG4-RD) en un paciente. Un método útil para entender la invención comprende administrar una inmunoglobulina que une FcyRllb y CD19 sobre la superficie de una célula B, donde dicha inmunoglobulina comprende una región Fc, donde dicha región Fc es una variante Fc de un polipéptido Fc original, que comprende al menos una sustitución de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en 234W, 235I, 235Y, 235R, 235D, 236D, 236N, 239D, 267D, 267E, 268E, 268D, 328F y 328Y, donde la numeración corresponde al índice EU como en Kabat. En algunos aspectos útiles para comprender la invención, al menos una sustitución se puede seleccionar del grupo que consiste en 267E y 328F. En otros aspectos útiles para comprender la invención, la variante Fc puede comprender al menos dos sustituciones de aminoácidos en la región Fc en comparación con el polipéptido Fc original, donde dichas dos o más sustituciones se seleccionan del grupo que consiste en 235D/267E, 235Y/267E, 235D/S267D, 235I/267E, 235I/267D, 235Y/267D, 236D/267E, 236D/267D, 267E/328F, 267D/328F, 268D/267E, 268D/267D, 268E/267E y 268E/267D. En otras realizaciones, las dos o más sustituciones pueden ser 267E/328F. En otras realizaciones, la región Fc que une FcyRllb comprende la SEC ID N.°:7 y la S<e>C ID N.°:9.
[0010] También se describe en el presente documento un método para reducir al menos un síntoma asociado a la IgG4-RD en un sujeto. Un método útil para entender la invención puede comprender administrar una inmunoglobulina que une FcyRllb y CD19 sobre la superficie de una célula B, donde dicha inmunoglobulina comprende una región Fc, donde dicha región Fc es una variante Fc de un polipéptido Fc original, que comprende al menos una sustitución de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en 234W, 235I, 235y , 235R, 235D, 236D, 236N, 239D, 267D, 267E, 268E, 268D, 328F y 328Y, donde la numeración corresponde al índice EU como en Kabat. En algunos aspectos útiles para comprender la invención, al menos una sustitución se puede seleccionar del grupo que consiste en 267E y 328F. En otros aspectos útiles para comprender la invención, la variante Fc puede comprender al menos dos sustituciones de aminoácidos en la región Fc en comparación con el polipéptido Fc original, donde dichas dos o más sustituciones se seleccionan del grupo que consiste en 235D/267E, 235Y/267E, 235D/S267D, 235I/267E, 235I/267D, 235Y/267D, 236D/267E, 236D/267D, 267E/328F, 267D/328F, 268D/267E, 268D/267D, 268E/267E y 268E/267D. En otras realizaciones, las dos o más sustituciones pueden ser 267E/328F. En otras realizaciones, la región Fc que une FcyRllb comprende la SEC ID N.°:7 y la SEC ID N.°:9.
[0011] En algunas realizaciones, el síntoma o síntomas asociados a la IgG4-RD se puede reducir en los 7 días posteriores a la administración de la inmunoglobulina. En realizaciones adicionales, el síntoma o síntomas asociados a la IgG4-RD se reducen en los 14 días posteriores a la administración de la inmunoglobulina. En otras realizaciones, el síntoma o síntomas se muestran en un órgano seleccionado entre ganglios linfáticos, glándulas submandibulares, glándulas parotídeas, glándulas lacrimales, riñón, corazón, pericardio, órbita, cavidad nasal, pulmones, conductos biliares, glándulas salivales y páncreas.
[0012] También se describe en el presente documento un método para agotar los plasmoblastos en un sujeto con una enfermedad relacionada con la IgG4. Un método útil para entender la invención puede comprender administrar una inmunoglobulina que une FcyRllb y CD19 sobre la superficie de una célula B, donde dicha inmunoglobulina comprende una región Fc, donde dicha región Fc es una variante Fc de un polipéptido Fc original, que comprende al menos una sustitución de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en 234W, 235I, 235Y, 235R, 235D, 236D, 236N, 239D, 267D, 267E, 268E, 268D, 328F y 328Y, donde la numeración corresponde al índice EU como en Kabat. En algunos aspectos útiles para comprender la invención, al menos una sustitución se puede seleccionar del grupo que consiste en 267E y 328F. En otros aspectos útiles para comprender la invención, la variante Fc puede comprender al menos dos sustituciones de aminoácidos en la región Fc en comparación con el polipéptido Fc original, donde dichas dos o más sustituciones se seleccionan del grupo que consiste en 235D/267E, 235Y/267E, 235D/S267D, 235I/267E, 235I/267D, 235Y/267D, 236D/267E, 236D/267D, 267E/328F, 267D/328F, 268D/267E, 268D/267D, 268E/267E y 268E/267D. En otras realizaciones, las dos o más sustituciones pueden ser 267E/328F. En otras realizaciones, la región Fc que une FcyRllb comprende la SEC ID N.°:7 y la SEC ID N.°:9.
[0013] Según la invención, la disminución de plasmoblastos se observa en los 7 días posteriores a la administración de la inmunoglobulina que une FcyRllb y CD19 sobre la superficie de una célula B y los plasmoblastos se pueden agotar al menos en un 80 % en relación con el número de plasmoblastos antes de la administración de inmunoglobulina.
[0014] Se describe además en el presente documento un método para reducir el número de células CD4+SLAMF7+CTL en un sujeto con una enfermedad relacionada con la IgG4. Un método útil para entender la invención puede comprender administrar una inmunoglobulina que une FcyRllb y CD19 sobre la superficie de una célula B, donde dicha inmunoglobulina comprende una región Fc, donde dicha región Fc es una variante Fc de un polipéptido Fc original, que comprende al menos una sustitución de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en 234W, 235I, 235Y, 235R, 235D, 236D, 236N, 239D, 267D, 267E, 268E, 268D, 328F y 328Y, donde la numeración corresponde al índice EU como en Kabat. En algunos aspectos útiles para comprender la invención, al menos una sustitución se puede seleccionar del grupo que consiste en 267E y 328F. En otros aspectos útiles para comprender la invención, la variante Fc puede comprender al menos dos sustituciones de aminoácidos en la región Fc en comparación con el polipéptido Fc original, donde dichas dos o más sustituciones se seleccionan del grupo que consiste en 235D/267E, 235Y/267E, 235D/S267D, 235I/267E, 235I/267D, 235Y/267D, 236D/267E, 236D/267D, 267E/328F, 267D/328F, 268D/267E, 268D/267D, 268E/267E y 268E/267D. En otras realizaciones, las dos o más sustituciones pueden ser 267E/328F. En otras realizaciones, la región Fc que une FcyRllb comprende la SEC ID N.°:7 y la SeC ID N.°:9.
[0015] En algunas realizaciones la reducción del número de células CD4+SLAMF7+CTL se puede observar dentro de los 24 días posteriores a la administración de la inmunoglobulina que une Fc Rllb y CD19 sobre la superficie de una célula B. En otras realizaciones, las células CD4+SLAMF7+CTL se reducen en al menos un 10 % en relación con el número de células CD4+SLAMF7+CTL anterior a la administración de la inmunoglobulina.
[0016] En el presente documento se describe un método para tratar una enfermedad relacionada con la IgG4 en un sujeto. Un método útil para entender la invención puede comprender administrar una inmunoglobulina que une Fc Rllb y CD19 sobre la superficie de una célula B, donde dicha inmunoglobulina comprende una región Fc, donde dicha región Fc es una variante Fc de un polipéptido Fc original, que comprende al menos una sustitución de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en 234W, 235I, 235Y, 235R, 235D, 236D, 236N, 239D, 267D, 267E, 268E, 268D, 328F y 328Y, donde la numeración corresponde al índice EU como en Kabat, y donde la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en sialoadenitis relacionada con la IgG4 (sialoadenitis esclerosante crónica, tumor de Küttner, enfermedad de Mikulicz), dacrioadenitis relacionada con la IgG4 (enfermedad de Mikulicz), enfermedad oftálmica relacionada con la IgG4 (enfermedad inflamatoria orbitaria idiopática, pseudotumor orbitario), sinusitis crónica, fibrosis angiocéntrica eosinofílica, hipofisitis relacionada con la IgG4 (panhipofisitis relacionada con la IgG4, adenohipofisitis relacionada con la IgG4, infundibuloneurohipofisitis relacionada con la IgG4, hipofisitis autoinmune), paquimeningitis relacionada con la IgG4, leptomeningitis relacionada con la IgG4 (paquimeningitis hipertrófica idiopática), pancreatitis relacionada con la IgG4 (pancreatitis autoinmune tipo 1, PAI relacionada con la IgG4, pancreatitis esclerosante linfoplasmocitaria, pancreatitis crónica con estrechamiento irregular difuso del conducto pancreático principal), enfermedad pulmonar relacionada con la IgG4 (pseudotumor inflamatorio pulmonar), pleuritis relacionada con la IgG4, hepatopatía relacionada con la IgG4, colangitis esclerosante relacionada con la IgG4, colecistitis relacionada con la IgG4, aortitis relacionada con la IgG4 (aneurisma aórtico inflamatorio), periaortitis relacionada con la IgG4 (periaortitis crónica), periarteritis relacionada con la IgG4, pericarditis relacionada con la IgG4, mediastinitis relacionada con la IgG4 (mediastinitis fibrosante), fibrosis retroperitoneal relacionada con la IgG4 (fibrosis retroperitoneal, síndrome de Albarran-Ormond, enfermedad de Ormond (fibrosis retroperitoneal)), fascitis perineal, fascitis/sindrome Gerota, periureteritis fibrosa, lipogranuloma esclerosante, granuloma retroperitoneal esclerosante, inflamación retroperitoneal no específica, retroperitonitis esclerosante, vasculitis retroperitoneal con fibrosis perivascular), mesenteritis relacionada con la IgG4 (los subtipos son: panniculitis mesentéric, lipodistrofia mesentérica y mesenteritis retráctil) (mesenteritis esclerosante, panniculitis nodular sistémica, mesenteritis lipoesclerótica, enfermedad de Weber-Christian mesentérica, lipogranuloma mesentérico, mesenteritis xantogranulomatosa), mastitis relacionada con la IgG4 (mastitis esclerosante), enfermedad renal relacionada con la IgG4 (IgG4-RKD), nefritis tubulointersticial relacionada con la IgG4 (IgG4-TIN), glomerulonefritis membranosa relacionada con la IgG4 (nefritis tubulointersticial idiopática), prostatitis relacionada con la IgG4, fibrosis perivasal relacionada con la IgG4 (orquialgia crónica), pseudotumor paratesticular relacionado con la IgG4, epididimoorquitis relacionada con la IgG4 (pseudotumor fibroso paratesticular, pseudotumor inflamatorio del cordón espermático, proliferaciones miofibroblasticas pseudosarcomatosas del cordón espermático, funiculitis proliferativa, periorquitis proliferativa crónica, periorquitis fibromatosa , periorquitis nodular, periorquitis reactiva, mesotelioma fibroso), linfadenopatía relacionada con la IgG4, enfermedad de la piel relacionada con la IgG4 (hiperplasia angiolinfoide con eosinofilia, pseudolinfoma cutáneo), enfermedad perineural relacionada con la IgG4, y enfermedad de tiroides relacionada con la IgG4 (tiroiditis de Reidel), fibrosis angiocéntrica eosinofílica (que afecta a las órbitas y al tracto respiratorio superior), pseudotumor inflamatorio y fibrosclerosis multifocal. En algunos aspectos útiles para entender la invención, la enfermedad se puede seleccionar del grupo que consiste en pancreatitis autoinmune (pancreatitis esclerosante linfoplasmocitaria), fibrosis angiocéntrica eosinofílica (que afecta a las órbitas y al tracto respiratorio superior), mediastinitis fibrosante, paquimeningitis hipertrófica idiopática, nefritis tubulointersticial idiopática, pseudotumor inflamatorio, tumor del Küttner, enfermedad de Mikulicz, fibrosclerosis, periaortitis, periarteritis, aneurisma multifocal aórtico inflamatorio, enfermedad de Ormond (fibrosis tetroperitoneal), tiroiditis de Riedel y mesenteritis esclerosante. En algunos aspectos útiles para comprender la invención, al menos una sustitución se puede seleccionar del grupo que consiste en 267E y 328F. En otros aspectos útiles para comprender la invención, la variante Fc puede comprender al menos dos sustituciones de aminoácidos en la región Fc en comparación con el polipéptido Fc original, donde dichas dos o más sustituciones se seleccionan del grupo que consiste en 235D/267E, 235Y/267E, 235D/S267D, 235I/267E, 235I/267D, 235Y/267D, 236D/267E, 236D/267D, 267E/328F, 267D/328F, 268D/267E, 268D/267D, 268E/267E y 268E/267D. En otras realizaciones, las dos o más sustituciones pueden ser 267E/328F. En otras realizaciones, la región Fc que une FcyRllb comprende la SEC ID N.°:7 y la SEC ID N.°:9.
[0017] La administración de una inmunoglobulina a un sujeto por cualquiera de los métodos descritos en el presente documento también puede comprender una reducción de la puntuación del índice respondedor de IgG4-RD (puntuación IR lgG4-RD) del sujeto. En algunas realizaciones, la puntuación IR IgG4-RD del sujeto se reduce en al menos 1 a partir de la puntuación de referencia en las 2 semanas posteriores a la administración de inmunoglobulina. En otras realizaciones, la puntuación IR IgG4-RD se reduce en > 3 dentro de las 2 semanas posteriores a la administración de la inmunoglobulina.
[0018] La administración de una inmunoglobulina a un sujeto por cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, también puede comprender la administración de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal de la inmunoglobulina al sujeto. En algunas realizaciones, se administran al sujeto aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal de la inmunoglobulina. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina se administra al sujeto cada 14 días. En otras realizaciones, la inmunoglobulina se administra al sujeto cada 14 días en al menos 2 dosis. En otras realizaciones, la inmunoglobulina se administra al sujeto cada 14 días en al menos 6 dosis. En otras realizaciones, la inmunoglobulina se administra al sujeto cada 14 días en al menos 12 dosis.
[0019] La administración de una inmunoglobulina a un sujeto por cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, puede comprender además tratamientos estándar de administración para una enfermedad relacionada con la IgG4 incluyendo fármacos antiinflamatorios analgésicos (AINE tales como aspirina, ibuprofeno, naproxeno o celebrex), paracetamol, esteroides, glucocorticoides (es decir, prednisona), agentes inmunosupresores (es decir azatioprina, micofenolato de mofetilo), e inmunosupresores biológicos (es decir rituximab, bortezomib). En realizaciones adicionales, cualquiera de los métodos que aquí se describen puede comprender además disminuir y/o interrumpir el uso de esteroides. En otras realizaciones, el sujeto de cualquiera de los métodos divulgados en el presente documento puede recaer o ser refractario a rituximab.
[0020] La célula B de cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, se puede seleccionar del grupo que consiste en un plasmocito y un plasmoblasto. En realizaciones adicionales, la célula B puede ser un plasmoblasto.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0021]
FIGS. 1A -1B. Alineamiento de las secuencias de aminoácidos de las inmunoglobulinas IgG humanas IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4. La FIG. 1A proporciona las secuencias del CH1 (Cy1) y dominios bisagra, y la FIG. 1B proporciona las secuencias de los dominios CH2 (Cy2) y CH3 (Cy3). Las posiciones se numeran según el índice EU de la secuencia IgG1, y las diferencias entre IgG 1 y las otras inmunoglobulinas IgG2, IgG3 e IgG4 se muestran en gris. Existen polimorfismos alotípicos en varias posiciones, y de este modo pueden existir diferencias ligeras entre las secuencias presentadas y las secuencias de la técnica anterior. Los posibles inicios de la región Fc se etiquetan y se definen en el presente documento como las posiciones EU 226 o 230.
FIGS. 2A - 2B. Haplotipos comunes de las cadenas gamma1 (FIG. 2A) y gamma2 (FIG. 2B) humanas.
FIG. 3. Métodos de inhibición de la activación de células B. Aquí CR representa un correceptor del complejo BCR, pero podría ser cualquier antígeno expresado en cualquier célula FcyRllb+.
FIG. 4. Sensogramas de resonancia de plasmón superficial Biacore que muestran la unión de anticuerpos anti-CD19 con variantes Fc a FcYRllb humano.
FIG. 5A - 5D. Afinidades de anticuerpos de variantes Fc para FcyRs humano tal como se determina mediante resonancia de plasmón superficial Biacore. El gráfico muestra el -log(KD) para la unión de la variante anti-CD19 y los anticuerpos WT IgG1 a FcyRI (I), R131 FcYRlla (Rlla), H131 FcYRIIa (HIIa), FcyRllb (Ilb) y V158 FcYRIIIa (Vllla) humanos. La unión de L235Y/S267E, G236D/S267E y S267E/L328F a V158 FcYRllla no fue detectable.
FIGS. 6A - 6F. La unión de anticuerpos de variantes Fc a FcyRs humano con respecto a IgG1 WT tal como se mide mediante la unión de superficies celulares. Se añadieron anticuerpos (variantes y IgG1 WT) a células HEK293T transfectadas con FcyRllb para valorar la unión de superficies celulares. Las curvas de unión se construyeron representando el MFI como función de la concentración de variante Fc.
FIG. 7. Afinidades de anticuerpos de variantes Fc para FcyRs humano tal como se determina mediante resonancia de plasmón superficial Biacore. El gráfico muestra el -log(KD) para la unión de la variante anti-CD19 y los anticuerpos IgG1 WT a FcyRI (I), R131 FcYRIIa (RIIa), H131 FcYRIIa (HIIa), FcyRllb (Ilb) y V158 FcYRllla (Villa) humanos.
FIGS. 8A - 8B. Ensayo de viabilidad de células B dependientes de ATP que demuestra la supervivencia de las células B humanas primarias tras la activación del BCR, aquí realizado por reticulación con anticuerpos anti-mu (FIG. 8A) o anti-CD79b (FIG. 8B).
FIG. 9. Inhibición de la proliferación de células B mediante anticuerpos anti-CD19 con variante Fc. El anti-VRS (virus respiratorio sincitial) S267E/L328F se usa como un control (el VRS no se expresa en las células B). Un ensayo de luminiscencia dependiente de ATP se usó para medir la proliferación de células B en presencia de 10 pg/ml del anticuerpo de activación anti-CD79b, y el efecto del anti-CD19-S267E/L328F se comparó con el anti-CD19-lgG1 (control Fv IgG1 nativa) y el anti-VRS-S267E/L328F (control Fc no CD19). Para valorar la importancia del coacoplamiento de CD19 y FcyRllb, se utilizó anti-VRS-S267E/L328F solo o en combinación con anti-CD19-lgG1.
FIG. 10. Anti-CD19-S267E/L328F inhibe los efectos antiapoptóticos de la activación del BCR en células B humanas primarias. La inhibición de las señales de supervivencia mediadas por BCR mediante el coacoplamiento de FcyRllb y CD19 se examinó mediante tinción con anexina-V en presencia de 10 pg/ml de anti-CD79b. La apoptosis de las células B fue estimulada por anti-CD19-S267E/L328F, pero no por anti-CD19-lgG1 (control Fv), anti-RSV-S267E/L328F (control Fc) o los dos controles combinados.
FIGS. 11A - 11B. Evaluación de la capacidad de coacoplamiento de CD19 y FcyRllb para inhibir la activación de células B humanas in vivo. (FIG. 11A) Representación esquemática del protocolo experimental. (FIG. 11B) Título de anticuerpos específicos antitoxoide tetánico (T<t>) en ratones huPBL-SCID después de la inmunización con T<t>y el tratamiento con vehículo (PBS), anti-CD19 IgG 1 WT, anti-CD19 con afinidad mejorada por FcyRllb (a-CD19 S267E/L328F), o anti-cD20 (Rituximab).
FIG. 12. Ensayo de luminiscencia dependiente de ATP que mide la proliferación de células B en presencia de 1 pg/ml de anticuerpo anti-CD79b-SN8-G236R/L328R y las concentraciones variables de las versiones mejoradas de la variante de FcyRllb (S267E/L328F) o de la variante knockout de FcyR (G236R/L328R o A236R/L328R) de los anticuerpos anti-CD20 (clon PRO70769), -CD52 (Campath) y -CD19 (HuAM4G7). FIG. 13. Ensayo de luminiscencia dependiente de ATP que mide la proliferación de células B en presencia de 1 pg/ml de anticuerpo anti-CD79b-SN8-G236R/L328R y las concentraciones variables de las versiones mejoradas de la variante de FcyRllb (S267E/L328F) o de la variante knockout de FcyR (G236R/L328R o A236R/L328R) de los anticuerpos anti-CD19 (clones H<d>37, 21D4 o HuAM4G7).
FIGS. 14A - 14D. La FIG. 14A enumera las secuencias de aminoácidos de varias regiones variables, regiones constantes de cadena pesada y anticuerpos de longitud completa. La FIG. 14B es una continuación de la lista de la FIG. 14A. La FIG. 14C es una continuación de la lista de la FIG. 14A y la FIG. 14B. La FIG.
14D es una continuación de las listas de las FIGS. 14A a 14C.
FIGS. 15A - 15B. La FIG. 15A es un esquema de un anticuerpo anti-CD19 S267E/L328F, una inmunoglobulina que comprende un dominio Fc que une FcyRllb y un dominio Fv que une CD19. La FIG. 15B es un esquema que muestra que el anticuerpo anti-CD19 S267E/L328F se une a las células FcyRllb+ y coacopla CD19 aumentando así el papel regulador natural de FcyRllb (inhibición de la activación de células B).
FIG. 16. Número de órganos involucrados al inicio. La mediana fue de 4 (rango de 1 a 10).
FIG. 17. Órganos activos en la línea de referencia. La implicación del sitio del órgano que se produjo con una frecuencia > 50 % incluyó ganglios linfáticos, glándulas submandibulares, glándulas parótidas y glándulas lagrimales.
FIG. 18. Índice respondedor de IgG4-RD a lo largo del tiempo. Doce de quince pacientes (80 %) han tenido una respuesta inicial a un anticuerpo anti-CD19 con modificaciones S267E/L328F de una reducción > 2 puntos en el IR de IgG4-RD dentro de las 2 semanas posteriores a la primera dosis. Cinco pacientes han conseguido un IR de IgG4-RD de 0 (ninguna actividad patológica).
FIGS. 19A - 19C. La FIG. 19A demuestra que la administración de 2 mg/kg de un anticuerpo anti-CD19 S267E/L328F da como resultado una inhibición de la expresión estimulada de CD86 que luego vuelve lentamente al valor de referencia aproximadamente 100 días después de la administración del anticuerpo anti-CD19 S267E/L328F. La FIG. 19B demuestra que la administración de 2 mg/kg del anticuerpo anti-CD19 S267E/L328F da como resultado una disminución reversible en los recuentos de células B periféricas que vuelven a la normalidad aproximadamente 40-60 días después de la administración del anticuerpo anti-CD19 S267E/L328F. La FIG. 19C demuestra que los sujetos desafiados con antígeno del tétanos y a los que luego se les administraron dosis variables del anticuerpo anti-CD19 S267E/L328F que oscilaban entre 0.03 y 10 mg/kg exhibieron una caída detectable en la IgG antitetánica en relación con los sujetos tratados con placebo.
FIGS. 20A - 20G. Estrategia de gating de citometría de flujo para células B y plasmoblastos
FIG. 21. Resumen de números de célula B durante el tratamiento. Se muestra el porcentaje del número total inicial de células B (CD79b+) de catorce pacientes. Cada línea representa un paciente individual (catorce pacientes representados).
FIGS. 22A - 22B. La FIG. 22A muestra el efecto del tratamiento con anticuerpos sobre el número de plasmoblastos CD79+ (CD79b+CD3-CD30-CD27hiCD38hi). La FIG. 22B muestra el efecto del tratamiento con anticuerpos sobre el número total de plasmoblastos (CD3-CD20-CD27hiCD38hi). Cada línea representa un paciente individual (catorce pacientes representados).
FIG. 23. Plasmoblastos circulantes de referencia. Se muestran plasmoblastos CD19+ por cada 104 células B CD19+ para once donantes sanos y catorce pacientes con IgG4-RD antes del tratamiento. Los plasmoblastos están elevados en pacientes con IgG4-RD activo en comparación con donantes sanos.
FIGS. 24A - 24G. Estrategia de gating de citometría de flujo para CD4 CTL.
FIGS. 25A-25B. La FIG. 25A muestra el efecto del anticuerpo anti-CD19 S267E/L328F sobre el número de CTL CD4 SLAMF7+ (CD4+CD45RO+CD27-SLAMF7+). La FIG. 25B muestra el efecto del anticuerpo anti-CD19 S267E/L328F sobre el número de CTL CD4 efectores (CD4+CD45RO+CD27-SLAMF7+CD57+CD28-). Cada línea representa un paciente individual.
FIGS. 26A - 26D. Estrategia de gating de citometría de flujo para ensayos de apoptosis.
FIGS. 27A - 27L. Ensayo de apoptosis. No se observó ninguna apoptosis significativa de las células B (FIGS.
27A - 27D), las células T CD4+ (FIGS. 27E - 27H) o las células T CD8+ (FIGS. 27I - 27L) en pacientes después de recibir terapia con el anticuerpo anti-CD19 S267E/L328F los días 1, 8, 15, y 29.
FIGS. 28A - 28L. El anticuerpo anti-CD19 S267E/L328F bloquea las vías de señalización vinculadas al BCR. Se examinó la fosforilación de BTK, AKT, ERK y SYK antes del tratamiento con el anticuerpo anti-CD19 S267E/L328F (FIGS. 28A - 28D), 2 horas después del tratamiento (FIGS. 28E - 28H) y 24 horas después del tratamiento (FIGS. 28I - 28L). El amarillo representa el control de FMO; el azul, la ausencia de tratamiento; y el rojo, el tratamiento con F(ab)2 (IgM IgG).
FIG. 29. Los números de CTL CD4+SLAMF7+ aumentaron en la sangre periférica de pacientes con IgG4-RD en comparación con los controles.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE EJEMPLOS DE REALIZACIONES DE LA INVENCIÓN
[0022] Las referencias en esta descripción a métodos para tratar una enfermedad relacionada con la IgG4 (lgG4-RD) en un paciente se deben interpretar como referencias para compuestos o composiciones de la presente invención para el uso en aquellos métodos.
[0023] La invención se presenta en las reivindicaciones anexas y proporciona una inmunoglobulina que se une a FcYRIIb y se coacopla con CD19 sobre la superficie de una célula B para el uso en el tratamiento de una enfermedad relacionada con la IgG4 en un sujeto, donde dicha inmunoglobulina comprende una cadena pesada y una cadena ligera, donde dicha cadena pesada comprende la SEC ID N.°: 9, y dicha cadena ligera comprende la SEC ID N.°: 7, donde dicha inmunoglobulina se usa en una dosis terapéuticamente eficaz.
[0024] La respuesta inmune humoral (p. ej., el resultado de diversas respuestas de células B) se puede iniciar cuando las células B se activan mediante un antígeno y se diferencian posteriormente en células plasmáticas. La unión del receptor de células B (BCR) unido a la membrana a las células B mediante un antígeno activa una cascada de señalización intracelular, incluida la movilización de calcio, que provoca la proliferación y diferenciación celulares. El coacoplamiento del BCR específico con el receptor Fc inhibidor (FcyRllb) inhibe las señales de activación de las células B a través de un bucle de retroalimentación negativa.
[0025] La importancia de FcYRIlb en la regulación negativa de las respuestas de las células B se ha demostrado mediante ratones con deficiencia de FcyRllb, que no consiguen regular las respuestas humorales (Wernersson, S. et al., 1999, J. Immunol. 163, 618-622), son sensibles a la artritis inducida por colágeno (Yuasa, T. et al., 1999, J. Exp. Med. 189, 187-194), y desarrollan enfermedades tipo lupus (Fukuyama, H. et al., J.V., 2005, Nat. Immunol. 6, 99-106; McGaha, T.L. et al., 2005, Science 307, 590-593) y el síndrome de Goodpasture (Nakamura, A. et al., 2000, J. Exp. Med. 191, 899-906). La desregulación de FcyRllb también se ha asociado a las enfermedades autoinmunes humanas. Por ejemplo, se han enlazado polimorfismos en el promotor (Blank, M.C. et al., 2005, Hum. Genet. 117, 220-227; Olferiev, M. et al., 2007, J. Biol. Chem. 282, 1738-1746) y el dominio transmembrana (Chen, J.Y. et al., 2006, Arthritis Rheum. 54, 3908-3917; Floto, R.A. et al., Nat. Med. 11, 1056 1058; Li, X. Et al., 2003, Arthritis Rheum. 48, 3242-3252) de FcYRllb con prevalencia aumentada de lupus eritematoso sistémico (LES). Los pacientes de LES también muestran una expresión superficial de FcyRllb reducida en las células B (Mackay, M. et al., 2006, J. Exp. Med. 203, 2157-2164; Su, K. et al., 2007, J. Immunol.
178, 3272-3280) y, como consecuencia, presentan una señalización de calcio desregulada (Mackay, M. et al., 2006, J. Exp. Med. 203, 2157-2164). El papel fundamental de FcyRllb en la regulación de las células B, respaldado por modelos en ratones y evidencias clínicas, lo convierten en un objetivo terapéutico atractivo para controlar trastornos autoinmunes e inflamatorios (Pritchard, N.R. y Smith, K.G., 2003, Immunology 108, 263-273; Ravetch, J.V. y Lanier, L.L., 2000, Science 290, 84-89; Stefanescu, R.N. et al., 2004, J. Clin. Immunol. 24, 315 326).
[0026] En el presente documento se describen anticuerpos que imitan los efectos inhibidores del coacoplamiento del BCR específico con FcyRllb en las células B. Por ejemplo, en el presente documento se describen anticuerpos anti-CD19 variantes diseñados de manera que el dominio Fc se une a FcyRllb con una afinidad hasta ~430 veces mayor. En relación con la IgG1 nativa, las variantes mejoradas con unión a FcYRllb (IIbE) inhiben fuertemente la movilización y la viabilidad del calcio inducida por en BCR en células B humanas primarias. Los efectos inhibidores involucraron la fosforilación del inositol polifosfato 5-fosfatasa (SHIP) con contenido de SH2, que se sabe que está implicada en la retroalimentación negativa inducida por FcYRIIb de la activación de las células B. El coacoplamiento del BCR y FcYRllb mediante las variantes IIbE también superó los efectos antiapoptóticos de la activación del BCR. El uso de un único anticuerpo para suprimir las funciones de las células B por coacoplamiento del BCR específico y FcyRllb puede representar un enfoque novedoso en el tratamiento de enfermedades mediadas por células B. Según la invención, las enfermedades mediadas por células B son enfermedades relacionadas con la IgG4
[0027] En el presente documento se describen varias definiciones. Se entiende que dichas definiciones abarcan sus equivalentes gramaticales.
[0028] Por "ADCC" o "citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos", tal como se usa en el presente documento, se entiende la reacción mediada por células en la que las células citotóxicas no específicas que expresan FcyR reconocen el anticuerpo unido a una célula diana y posteriormente provocan la lisis de la célula diana.
[0029] Por "ADCP" o "fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpos", tal como se usa en el presente documento, se entiende la reacción mediada por células en la que las células citotóxicas no específicas que expresan FcyR reconocen el anticuerpo unido a una célula diana y posteriormente provocan la fagocitosis de la célula diana.
[0030] Por "anticuerpo" se entiende en el presente documento una proteína consistente en uno o varios polipéptidos sustancialmente codificados por todos o parte de los genes de inmunoglobulina reconocidos. Los genes de inmunoglobulina reconocidos, por ejemplo, en humanos, incluyen los loci genéticos kappa (<k>), lambda (A) y de cadena pesada, que en conjunto comprenden innumerables genes de región variable y los genes de región constante mu (v), delta (5), gamma (<y>), sigma (a) y alfa (a) que codifican los isotipos IgM, IgD, IgG (lgG1, IgG2, IgG3 e IgG4), IgE e IgA (lgA1 e IgA2) respectivamente. En el presente documento, se pretende que el anticuerpo incluya anticuerpos de longitud completa y fragmentos de anticuerpos, y puede referirse a un anticuerpo natural de cualquier organismo, un anticuerpo diseñado o un anticuerpo generado de forma recombinante para fines experimentales, terapéuticos o de otro tipo.
[0031] Por "aminoácido" e "identidad de aminoácidos" tal como se usan en el presente documento se entiende uno de los 20 aminoácidos naturales o cualquier análogo no natural que pueda estar presente en una posición definida y específica.
[0032] Por "célula CD32b+" o "célula FcYRIIb+", tal como se usa en el presente documento, se entiende cualquier célula o tipo de célula que expresa CD32b (FcYRIIb). Las células CD32b+ incluyen, entre otras, células B, células plasmáticas, células dendríticas, macrófagos, neutrófilos, mastocitos, basófilos o eosinófilos.
[0033] Por "CDC" o "citotoxicidad dependiente del complemento", tal como se usa en el presente documento, se entiende la reacción en la que uno o más componentes de la proteína del complemento reconocen el anticuerpo unido a una célula diana y posteriormente provocan la lisis de la célula diana.
[0034] Por "región constante" de un anticuerpo tal como se define en el presente documento se entiende la región del anticuerpo que está codificada por uno de los genes de la región constante de inmunoglobulina de cadena ligera o pesada. Por "cadena ligera constante" o "región constante de cadena ligera" tal como se usa en el presente documento se entiende la región de un anticuerpo codificado por las cadenas ligeras kappa (C<k>) o lambda (CA). La cadena ligera constante normalmente comprende un dominio único y, yal como se define en el presente documento, se refiere a las posiciones 108-214 de Ck o CA, donde la numeración corresponde al índice EU. Por "cadena pesada constante" o "región constante de cadena pesada" tal como se usa en el presente documento se entiende la región de un anticuerpo codificada por los genes mu, delta, gamma, alfa o épsilon para definir el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA o IgE, respectivamente. Para los anticuerpos IgG de longitud completa, la cadena pesada constante, tal como se define en el presente documento, se refiere a la que va desde el terminal N del dominio CH1 al terminal C del dominio CH3, que comprende así las posiciones 118 447, donde la numeración corresponde al índice EU.
[0035] Por "función efectora", tal como se usa en el presente documento, se entiende un evento bioquímico que resulta de la interacción de una región Fc de un anticuerpo con un receptor o ligando de Fc. Las funciones efectoras incluyen funciones efectoras mediadas por FcyR, como, por ejemplo, ADCC y ADCP, y funciones efectoras mediadas por complemento, por ejemplo, CDC. Además, las funciones efectoras incluyen funciones efectoras mediadas por FcyRllb, tales como las funciones inhibidoras (por ejemplo, regulación a la baja, reducción, inhibición, etc., respuestas de células B, por ejemplo, una respuesta inmune humoral).
[0036] Por "célula efectora", tal como se usa en el presente documento, se entiende una célula del sistema inmunológico que expresa uno o varios Fc y/o receptores del complemento y media en una o más funciones efectoras. Las células efectoras incluyen, entre otras, monocitos, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas, eosinófilos, mastocitos, plaquetas, células B, linfocitos granulares grandes, células de Langerhans, células asesinas naturales (NK) y células T y5, y pueden venir de cualquier organismo, incluidos, entre otros, humanos, ratones, ratas, conejos y monos.
[0037] Por "Fab" o "región Fab" tal como se usa en el presente documento se entiende los polipéptidos que comprenden los dominios de inmunoglobulina Vh, CH1, Vh y Cl. Fab puede referirse a esta región de forma aislada, o a esta región en el contexto de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de longitud completa.
[0038] Por "Fc" o "región Fc", tal como se usan en el presente documento, se entiende el polipéptido que comprende la región constante de un anticuerpo excluyendo el dominio de inmunoglobulina de la primera región constante y, en algunos casos, parte de la bisagra. Por tanto, Fc se refiere a los dos últimos dominios de inmunoglobulina de región constante de IgA, IgD e IgG, y a los últimos tres dominios de inmunoglobulina de región constante de IgE e IgM, y al terminal N de bisagra flexible. Para IgA e IgM, Fc puede incluir la cadena. Para IgG, Fc comprende los dominios de inmunoglobulina Cgamma2 y Cgamma3 (Cy2 y Cy3) y la bisagra entre Cgamma1 (Cy1) y Cgamma2 (Cy2). Aunque los límites de la región Fc pueden variar, la región Fc de cadena pesada de la IgG humana normalmente se define de modo que comprende los residuos C226 o P230 en su terminal carboxilo, donde la numeración corresponde al índice EU como en Kabat. Fc puede referirse a esta región de forma aislada, o a esta región en el contexto de un polipéptido de Fc, como se describe a continuación.
[0039] Por "polipéptido de Fc", tal como se usa en el presente documento, se entiende un polipéptido que comprende toda o parte de una región Fc. Los polipéptidos de Fc incluyen anticuerpos, fusiones de Fc, Fc aisladas y fragmentos de Fc. Las inmunoglobulinas pueden ser polipéptidos de Fc.
[0040] Por "fusión de Fc", tal como se utiliza en este documento, se entiende una proteína donde uno o varios polipéptidos están operativamente enlazados a Fc. En el presente documento se entiende que la fusión de Fc es sinónimo de los términos "inmunoadhesina", "fusión de Ig", "quimera de Ig" y "globulina receptora" (a veces con guiones) tal como se usan en la técnica anterior (Chamow et al., 1996, Trends Biotechnol 14:52-60; Ashkenazi et al., 1997, Curr Opin Immunol 9:195-200). Una fusión de Fc combina la región Fc de una inmunoglobulina con un compañero de fusión, que en general puede ser cualquier proteína, polipéptido o molécula pequeña. El papel de la parte no Fc de una fusión de Fc, es decir, el compañero de fusión, es mediar la unión con el objetivo y, por lo tanto, es funcionalmente análoga a las regiones variables de un anticuerpo. Prácticamente cualquier proteína o pequeña molécula se puede enlazar a Fc para generar una fusión de Fc. Los compañeros de fusión de proteínas pueden incluir, entre otros, la región de unión al objetivo de un receptor, una molécula de adhesión, un ligando, una enzima, una citocina, una quimiocina o alguna otra proteína o dominio de proteínas. Los compañeros de fusión de las moléculas pequeñas pueden incluir cualquier agente terapéutico que dirija la fusión de Fc a una diana terapéutica. Dichas dianas pueden ser cualquier molécula, p. ej., un receptor extracelular que está implicado en la enfermedad.
[0041] Por "receptor Fc gamma" o "FcyR" tal como se usa en el presente documento se entiende cualquier miembro de la familia de proteínas que se unen a la región Fc del anticuerpo IgG y están sustancialmente codificadas por los genes FcyR. En seres humanos esta familia incluye, entre otras, FcyRI (CD64), incluyendo las isoformas FcYRIa, FcyRlb y FcyRlc; FcyRII (CD32), las isoformas FcYRlla (incluyendo los alotipos H131 y R131), FcyRllb (incluyendo FcyRllb-1 y FcyRllb-2) y FcyRllc; y F<cy>RIII (C<d>16), incluyendo las isoformas FcYRIIIa (incluyendo los alotipos V158 y F158) y FcYRIIIb (incluyendo los alotipos FcyRlllb-NA1 y FcyRlllb-NA2) (Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65), así como cualquier FcyR humano o isoformas o alotipos de FcyR no descubiertos. Un FcyR puede provenir de cualquier organismo, incluyendo, entre otros, seres humanos, ratones, ratas, conejos y monos. Los FcyR de ratón incluyen, entre otros, FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), FcyRIII (CD16) y FcyRIII-2 (CD16-2), así como cualquier FcyR de ratón o isoforma o alotipo de FcyR no descubiertos.
[0042] Por "ligando de Fc" o "receptor de Fc", tal como se usa en el presente documento, se entiende una molécula, por ejemplo, un polipéptido, de cualquier organismo que se une a la región Fc de un anticuerpo para formar un complejo Fc-ligando. Los ligandos de Fc incluyen, entre otros, FcyR, FcyR, FcyR, FcRn, C1q, C3, lectina de unión a manano, receptor de manosa, proteína A estafilocócica, proteína G estreptocócica y FcyR vírico. Los ligandos de Fc también incluyen homólogos del receptor de Fc (FcRH), que son una familia de receptores de Fc homólogos de los FcyR (Davis et al., 2002, Immunological Reviews 190:123-136). Los ligandos de Fc pueden incluir moléculas no descubiertas que se unen a Fc.
[0043] Por "anticuerpo de longitud completa" tal como se usa en el presente documento se entiende la estructura que constituye la forma biológica natural de un anticuerpo, incluyendo regiones variables y constantes. Por ejemplo, en la mayoría de los mamíferos, incluyendo humanos y ratones, el anticuerpo de longitud completa del isotipo IgG es un tetrámero y consta de dos pares idénticos de dos cadenas de inmunoglobulina, donde cada par tiene una cadena ligera y una pesada, cada cadena ligera comprende los dominios de inmunoglobulina VL y CL y cada cadena pesada comprende los dominios de inmunoglobulina VH, Cy1, Cy2 y Cy3. En algunos mamíferos, por ejemplo en camellos y llamas, los anticuerpos IgG pueden consistir solamente en dos cadenas pesadas, cada una de las cuales comprende un dominio variable unido a la región Fc.
[0044] Por "inmunoglobulina" se entiende en el presente documento una proteína que comprende uno o varios polipéptidos sustancialmente codificados por los genes de inmunoglobulina. Las inmunoglobulinas incluyen, entre otros elementos, anticuerpos (incluyendo los anticuerpos biespecíficos) y fusiones de Fc. Las inmunoglobulinas pueden tener varias formas estructurales, incluyendo, entre otras, anticuerpos de longitud total, fragmentos de anticuerpo y dominios de inmunoglobulina individuales.
[0045] Por "dominio de inmunoglobulina (Ig)", tal como se utiliza en el presente documento, se entiende una región de una inmunoglobulina que existe como una entidad estructural distinta según lo determine un experto en la técnica de la estructura de proteínas. Los dominios Ig suelen tener una topología de plegado en sándwich p característica. Los dominios de Ig conocidos en el isotipo IgG de anticuerpos son VH Cy1, Cy2, Cy3, VL y CL.
[0046] Por "IgG" o "inmunoglobulina IgG" tal como se usa en el presente documento se entiende un polipéptido que pertenece a la clase de anticuerpos que están sustancialmente codificados por un gen gamma de inmunoglobulina reconocido. En seres humanos esta clase comprende las subclases o isotipos IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4. Por "isotipo", tal como se utiliza en el presente documento, se entiende cualquiera de las subclases de inmunoglobulinas definidas por las características químicas y antigénicas de sus regiones constantes. Los isotipos de inmunoglobulina humana conocidos son IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, lgA1, IgA2, IgM IgD e IgE.
[0047] Por "modificación" en el presente documento se entiende una alteración en las propiedades físicas, químicas o de secuencia de una proteína, polipéptido, anticuerpo o inmunoglobulina. Las modificaciones descritas en el presente documento incluyen modificaciones de aminoácidos y modificaciones de glicoformas.
[0048] Por "modificación de aminoácidos" en el presente documento se entiende una sustitución, inserción y/o deleción de aminoácidos en una secuencia polipeptídica. Por "sustitución de aminoácidos" o "sustitución" en el presente documento se entiende la sustitución de un aminoácido en una posición particular en una secuencia polipeptídica original por otro aminoácido. Por ejemplo, la sustitución S267E se refiere a una variante polipeptídica, en este caso una variante de cadena pesada constante, en la que la serina en la posición 267 se reemplaza con ácido glutámico. Por "inserción de aminoácidos" o "inserción" en el presente documento se entiende la adición de un aminoácido en una posición particular en una secuencia polipeptídica original. Por "deleción de aminoácidos" o "deleción" en el presente documento se entiende la eliminación de un aminoácido en una posición particular en una secuencia polipeptídica original.
[0049] Por "modificación de glicoformas" o "glicoforma modificada" o "glicoforma diseñada" tal como se usa en el presente documento se entiende una composición de carbohidratos que está unida covalentemente a una proteína, por ejemplo un anticuerpo, donde dicha composición de carbohidratos difiere químicamente de la de una proteína original. La glicoforma modificada normalmente se refiere a diferentes carbohidratos u oligosacáridos; así, por ejemplo, una variante de Fc puede comprender una glicoforma modificada.
Alternativamente, la glicoforma modificada puede referirse a la variante Fc que comprende los diferentes carbohidratos u oligosacáridos.
[0050] Por "polipéptido original", "proteína original", "inmunoglobulina original", "polipéptido precursor", "proteína precursora" o "inmunoglobulina precursora", tal como se usan en el presente documento, se entiende un polipéptido, proteína o inmunoglobulina no modificados que se modifican posteriormente para generar una variante, por ejemplo, cualquier polipéptido, proteína o inmunoglobulina que sirva como plantilla y/o base para al menos una modificación de aminoácidos descrita en el presente documento. El polipéptido original puede ser un polipéptido de origen natural, o una variante o versión diseñada de un polipéptido de origen natural. El polipéptido original puede referirse al polipéptido mismo, las composiciones que comprenden el polipéptido original o la secuencia de aminoácidos que lo codifica. En consecuencia, por "polipéptido Fc original" tal como se usa en el presente documento se entiende un polipéptido Fc que se modifica para generar un polipéptido Fc variante, y por "anticuerpo original" tal como se usa en el presente documento se entiende un anticuerpo que se modifica para generar un anticuerpo variante (p. ej., un anticuerpo original puede incluir, entre otros, una proteína que comprende la región constante de una Ig de origen natural).
[0051] Por "posición" tal como se utiliza en el presente documento se entiende una ubicación en la secuencia de una proteína. Las posiciones se pueden numerar consecutivamente, o según un formato establecido, por ejemplo el índice EU como en Kabat. Por ejemplo, la posición 297 es una posición en el anticuerpo humano IgG1.
[0052] Por "polipéptido" o "proteína" tal como se utilizan en el presente documento se entienden al menos dos aminoácidos unidos de manera covalente, que incluyen proteínas, polipéptidos, oligopéptidos y péptidos.
[0053] Por "residuo" tal como se utiliza en el presente documento se entiende una posición en una proteína y su identidad de aminoácido asociada. Por ejemplo, la asparagina 297 (también denominada Asn297, también denominada N297) es un residuo del anticuerpo humano IgG1.
[0054] Por "antígeno diana", tal como se utiliza en el presente documento, se entiende la molécula que está unida por la región variable de un anticuerpo determinado o el compañero de fusión de una fusión de Fc. Un antígeno diana puede ser una proteína, un carbohidrato, un lípido u otro compuesto químico. Se dice que un anticuerpo o una fusión de Fc es "específico" para un determinado antígeno diana basándose en su afinidad por el antígeno diana.
[0055] Por "célula diana", tal como se utiliza en el presente documento, se entiende una célula que expresa un antígeno diana.
[0056] Por "región variable", como se usa en el presente documento, se entiende la región de una inmunoglobulina que comprende uno o varios dominios de Ig sustancialmente codificados por cualquiera de los genes Vk, VA y/o VH que constituyen los loci genéticos de las inmunoglobulinas kappa, lambda y cadena pesada, respectivamente.
[0057] Por "polipéptido variante", "variante polipeptídica" o "variante" tal como se usa en el presente documento se entiende una secuencia polipeptídica que difiere de la de una secuencia polipeptídica original en virtud de al menos una modificación de aminoácidos. El polipéptido original puede ser un polipéptido natural o de tipo salvaje (WT), o puede ser una versión modificada de un polipéptido WT. El polipéptido variante puede referirse al polipéptido mismo, una composición que comprende el polipéptido o la secuencia de aminoácidos que lo codifica. En algunas realizaciones, los polipéptidos variantes descritos en el presente documento (p. ej., inmunoglobulinas variantes) pueden tener al menos una modificación de aminoácidos en comparación con el polipéptido original, p. ej., de aproximadamente una a aproximadamente diez modificaciones de aminoácidos, de aproximadamente una a aproximadamente cinco modificaciones de aminoácidos, etc., en comparación con el original. La secuencia polipeptídica variante en el presente documento puede poseer al menos aproximadamente un 80 % de homología con una secuencia polipeptídica original, por ejemplo, al menos aproximadamente un 90 % de homología, un 95 % de homología, etc. Por consiguiente, por "Fc variante" o "variante de Fc" tal como se usa en el presente documento se entiende una secuencia de Fc que difiere de la de una secuencia de Fc original en virtud de al menos una modificación de aminoácidos. Una variante de Fc puede abarcar solo una región Fc, o puede existir en el contexto de un anticuerpo, fusión de Fc, Fc aislado, fragmento de Fc u otro polipéptido que esté sustancialmente codificado por Fc. La variante de Fc puede referirse al propio polipéptido Fc, a composiciones que comprenden el polipéptido variante de Fc o a la secuencia de aminoácidos que lo codifica. Por "variante de polipéptido Fc" o "polipéptido Fc variante" tal como se usa en el presente documento se entiende un polipéptido Fc que difiere de un polipéptido Fc original en virtud de al menos una modificación de aminoácidos. Por "variante de proteína" o "proteína variante" tal como se usa en el presente documento se entiende una proteína que difiere de una proteína original en virtud de al menos una modificación de aminoácidos. Por "variante de anticuerpo" o "anticuerpo variante" tal como se usa en el presente documento se entiende un anticuerpo que difiere de un anticuerpo original en virtud de al menos una modificación de aminoácidos. Por "variante de IcG" o "IgG variante" tal como se usa en el presente documento se entiende un anticuerpo que difiere de una IgG original en virtud de al menos una modificación de aminoácidos. Por "variante de inmunoglobulina" o "inmunoglobulina variante" tal como se usa en el presente documento se entiende una secuencia de inmunoglobulina que difiere de una secuencia de inmunoglobulina original en virtud de al menos una modificación de aminoácidos.
[0058] Por "tipo salvaje" o "WT" en el presente documento se entiende una secuencia de aminoácidos o una secuencia de nucleótidos que se encuentra en la naturaleza, incluyendo sus variaciones alélicas. Una proteína, un polipéptido, un anticuerpo, una inmunoglobulina, una IgG, etc., de tipo salvaje tienen una secuencia de aminoácidos o una secuencia de nucleótidos que no se ha modificado intencionalmente.
Inmunoglobinas
[0059] Una inmunoglobulina para el uso según la invención comprende una cadena pesada que comprende la SEC ID N.°: 9, y una cadena ligera que comprende la SEC iD N.°: 7. Otros tipos de inmunoglobulinas se describen también en esta sección y se consideran útiles para comprender la invención.
[0060] Tal como se describe en el presente documento, una inmunoglobulina puede ser un anticuerpo, una fusión de Fc, un Fc aislado, un fragmento de Fc o un polipéptido de Fc. En una realización, una inmunoglobulina es un anticuerpo.
[0061] Los anticuerpos son proteínas inmunológicas que se unen a un antígeno específico. En la mayoría de los mamíferos, incluidos los humanos y los ratones, los anticuerpos se construyen a partir de cadenas polipeptídicas ligeras y pesadas emparejadas. Las regiones variables de cadena ligera y pesada muestran una diversidad de secuencia significativa entre anticuerpos y son responsables de unirse al antígeno diana. Cada cadena está formada por dominios de inmunoglobulina (Ig) individuales y, por tanto, el término genérico inmunoglobulina se utiliza para dichas proteínas.
[0062] Las unidades estructurales de anticuerpos tradicionales normalmente comprenden un tetrámero. Cada tetrámero se compone normalmente de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, donde cada par tiene una cadena "ligera" (que normalmente tiene un peso molecular de aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (que normalmente tiene un peso molecular de aproximadamente 50-70 kDa). Las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras kappa y lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como mu, delta, gamma, alfa o épsilon y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. IgG tiene varias subclases, incluyendo, entre otras, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. IgM tiene subclases, incluyendo, entre otras, IgM1 e IgM2. IgA tiene varias subclases, incluyendo, entre otras, lgA1 e IgA2. De este modo, "isotipo", tal como se utiliza en el presente documento, se entiende cualquiera de las clases y subclases de inmunoglobulinas definidas por las características químicas y antigénicas de sus regiones constantes. Los isotipos de inmunoglobulina humana conocidos son IgG 1, IgG2, IgG3, IgG4, lgA1, IgA2, IgM1, IgM2, IgD e IgE.
[0063] Cada una de las cadenas ligeras y pesadas se compone de dos regiones diferentes, denominadas región variable y región constante. La cadena pesada de IgG está compuesta por cuatro dominios de inmunoglobulina enlazados desde el terminal N al C en el orden VH-CH1-CH2-CH3, que hace referencia al dominio variable de la cadena pesada, el dominio constante 1 de la cadena pesada, el dominio constante 2 de la cadena pesada y dominio constante 3 de cadena pesada respectivamente (también denominado VH-Cy1-Cy2-Cy3, que hace referencia al dominio variable de cadena pesada, el dominio gamma 1 constante, el dominio gamma 2 constante y el dominio gamma 3 constante respectivamente). La cadena ligera de IgG está compuesta por dos dominios de inmunoglobulina enlazados desde el terminal N al C en el orden VL-CL, que hace referencia al dominio variable de la cadena ligera y al dominio constante de la cadena ligera, respectivamente. Las regiones constantes muestran menos diversidad de secuencias y son responsables de unir una serie de proteínas naturales para provocar eventos bioquímicos importantes. Las características distintivas entre estas clases de anticuerpos son sus regiones constantes, aunque pueden existir diferencias más sutiles en la región variable.
[0064] La región variable de un anticuerpo contiene los determinantes de unión al antígeno de la molécula y, por tanto, determina la especificidad de un anticuerpo por su antígeno diana. La región variable se denomina así porque es la más diferente en secuencia respecto de otros anticuerpos dentro de la misma clase. La porción aminoterminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento de antígenos. En la región variable, se reúnen tres bucles para cada uno de los dominios V de la cadena pesada y la cadena ligera para formar un sitio de unión al antígeno. Cada uno de los bucles se denomina región determinante de la complementariedad (en lo sucesivo denominada "CDR"), en la que la variación en la secuencia de aminoácidos es más significativa. Hay seis CDR en total, tres por cada cadena pesada y ligera, denominados VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3. La región variable fuera de las CDR se denomina región marco (FR). Aunque no es tan diversa como las CDR, la variabilidad de secuencia en la región FR se produce entre diferentes anticuerpos. En general, esta arquitectura característica de los anticuerpos proporciona un andamio estable (la región FR) sobre el cual el sistema inmunológico puede explorar una diversidad sustancial de unión a antígenos (las CDR) con el fin de obtener especificidad para una amplia gama de antígenos. Se encuentran disponibles varias estructuras de alta resolución para una variedad de fragmentos de regiones variables de diferentes organismos, algunos sin unir y otros formando complejos con el antígeno. La secuencia y las características estructurales de las regiones variables de anticuerpos se describen, por ejemplo, en Morea et al., 1997, Biophys Chem 68:9-16; Morea et al., 2000, Methods 20:267-279, y las características conservadas de los anticuerpos se describen, por ejemplo, en Maynard et al., 2000, Annu Rev Biomed Eng 2:339-376.
[0065] La porción carboxilo-terminal de cada cadena define una región constante responsable principalmente de la función efectora. En la subclase de inmunoglobulinas IgG, hay varios dominios de inmunoglobulina en la cadena pesada. Por "dominio de inmunoglobulina (Ig)" en el presente documento se entiende una región de una inmunoglobulina que tiene una estructura terciaria distinta. En las realizaciones descritas en el presente documento son de interés los dominios de cadena pesada, incluidos los dominios pesados constantes (CH) y la región bisagra. En el contexto de los anticuerpos IgG, los isotipos IgG tienen cada uno tres regiones CH. En consecuencia, los dominios "CH" en el contexto de IgG son los siguientes: "CH1" se refiere a las posiciones 118 220 según el índice EU como en Kabat. "CH2" se refiere a las posiciones 237-340 según el índice EU como en Kabat y "CH3" se refiere a las posiciones 341-447 según el índice EU como en Kabat.
[0066] Otra región importante de la cadena pesada es la región bisagra. Por "bisagra" o "región bisagra" o "región bisagra del anticuerpo" o "región bisagra de inmunoglobulina" en el presente documento se entiende el polipéptido flexible que comprende los aminoácidos entre el primer y segundo dominio constante de un anticuerpo. Estructuralmente, el dominio CH1 de IgG termina en la posición EU 220 y el dominio CH2 de IgG comienza en la posición 237 del residuo EU. Por lo tanto, para IgG, la bisagra del anticuerpo se define en el presente documento de modo que incluya las posiciones 221 (D221 en IgG1) a 236 (G236 en IgG1), donde la numeración sigue el índice EU como en Kabat. En algunas realizaciones, por ejemplo en el contexto de una región Fc, se incluye la bisagra inferior, donde generalmente la "bisagra inferior" se refiere a las posiciones 226 o 230 a 236.
[0067] Son interesantes las regiones Fc en las realizaciones descritas en el presente documento. Por "Fc" o "región Fc", tal como se usan en el presente documento, se entiende el polipéptido que comprende la región constante de un anticuerpo excluyendo el dominio de inmunoglobulina de la primera región constante y, en algunos casos, parte de la bisagra. Por tanto, Fc se refiere a los dos últimos dominios de inmunoglobulina de región constante de IgA, IgD e IgG, y a los últimos tres dominios de inmunoglobulina de región constante de IgE e IgM, y al terminal N de bisagra flexible. Para IgA e IgM, Fc puede incluir la cadena. Para IgG, Fc comprende los dominios de inmunoglobulina Cgamma2 y Cgamma3 (Cy2 y Cy3) y la región bisagra inferior entre Cgamma1 (Cy1) y Cgamma2 (Cy2). Aunque los límites de la región Fc pueden variar, la región Fc de cadena pesada de la IgG humana normalmente se define de modo que incluye los residuos C226 o P230 en su terminal carboxilo, donde la numeración corresponde al índice EU como en Kabat. Fc puede referirse a esta región de forma aislada, o a esta región en el contexto de un polipéptido de Fc, como se describe a continuación. Por "polipéptido de Fc", tal como se usa en el presente documento, se entiende un polipéptido que comprende toda o parte de una región Fc. Los polipéptidos de Fc incluyen anticuerpos, fusiones de Fc, Fc aisladas y fragmentos de Fc.
[0068] La región Fc de un anticuerpo interactúa con varios receptores y ligandos de Fc, impartiendo una serie de capacidades funcionales importantes denominadas funciones efectoras. Para la IgG, la región Fc comprende los dominios de Ig Cy2 y Cy3 y la bisagra N-terminal que conduce a Cy2. Una familia importante de receptores Fc para la clase IgG son los receptores Fc gamma (FcyR). Estos receptores median la comunicación entre los anticuerpos y el brazo celular del sistema inmunológico (Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ravetch et al., 2001, Annu Rev Immunol 19:275-290). En seres humanos, esta familia de proteínas incluye FcyRI (CD64), incluyendo las isoformas FcyRla, FcYRIb y F<cy>RI<c>; F<cy>RII (CD32), incluyendo las isoformas FcYRlla (incluyendo los alotipos H131 y R131), FcyRllb (incluyendo FcYRIIb-1 y FcyRllb-2) y FcyRllc; y F<cy>RIII (CD16), incluyendo las isoformas FcYRllla (incluyendo los alotipos V158 y F158) y FcyRlllb (incluyendo los alotipos FcyRlllb-NA1 y FcyRlllb-NA2) (Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65). Estos receptores suelen tener un dominio extracelular que media la unión a Fc, una región que atraviesa la membrana y un dominio intracelular que puede mediar algún evento de señalización dentro de la célula. Estos receptores se expresan en una variedad de células inmunes, incluyendo monocitos, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas, eosinófilos, mastocitos, plaquetas, células B, linfocitos granulares grandes, células de Langerhans, células asesinas naturales (<n>K) y células T. La formación del complejo Fc/FcyR recluta estas células efectoras a los sitios donde el antígeno está unido, lo que generalmente da lugar a eventos de señalización dentro de las células e importantes respuestas inmunes posteriores, como la liberación de mediadores de la inflamación, la activación de las células B, la endocitosis, la fagocitosis y el ataque citotóxico. La capacidad de mediar funciones efectoras citotóxicas y fagocíticas es un mecanismo potencial mediante el cual los anticuerpos destruyen las células diana. La reacción mediada por células en la que las células citotóxicas no específicas que expresan FcyR reconocen el anticuerpo unido a una célula diana y posteriormente provocan la lisis de la célula diana se denomina citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) (Raghavan et al., 1996, Annu Rev. Cell Dev Biol 12:181-220; Ghetie et al., 2000, Annu Rev Immunol 18:739-766; Ravetch et al., 2001, Annu Rev Immunol 19:275-290). La reacción mediada por células en la que las células citotóxicas no específicas que expresan FcyR reconocen el anticuerpo unido a una célula diana y posteriormente causan la fagocitosis de la célula diana se denomina fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCP).
[0069] Las diferentes subclases de IgG tienen diferentes afinidades por los FcyR, típicamente IgG1 e IgG3 se unen sustancialmente mejor a los receptores que IgG2 e IgG4 (Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65). Los FcyR se unen a la región Fc de IgG con diferentes afinidades. Los dominios extracelulares de FcYRllla y FcYRIIIb son 96 % idénticos, sin embargo, FcyRlllb no tiene un dominio de señalización intracelular. Además, mientras que FcyRI, FcYRIIa/c y FcYRIIIa son reguladores positivos de la activación desencadenada por complejos inmunes, caracterizados por tener un dominio intracelular con un motivo de activación de inmunorreceptores basado en tirosina (ITAM), FcyRllb tiene un motivo de inhibición de inmunorreceptores basado en tirosina (ITIM) y, por lo tanto, es inhibidor. De este modo, los primeros se denominan receptores de activación y el FcYRllb se denomina receptor inhibidor. A pesar de estas diferencias en afinidades y actividades, todos los FcyR se unen a la misma región en Fc, en el extremo N-terminal del dominio Cy2 y la precedente bisagra. Esta interacción está bien caracterizada estructuralmente (Sondermann et al., 2001, J Mol Biol 309:737-749), y se han resuelto varias estructuras del Fc humano unido al dominio extracelular del FcyRlllb humano (código de acceso pdb 1E4K) (Sondermann et al., 2000, Nature 406:267-273) (códigos de acceso pdb 1IIS y 1IIX) (Radaev et al., 2001, J Biol Chem 276:16469-16477).
[0070] Un sitio superpuesto pero separado en Fc sirve como interfaz para la proteína del complemento C1q. De la misma manera que la unión de Fc/FcyR media en la ADCC, la unión de Fc/C1q media en la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Un sitio en Fc entre los dominios Cy2 y Cy3 media la interacción con el receptor neonatal FcRn, cuya unión recicla el anticuerpo endocitosado del endosoma de regreso al torrente sanguíneo (Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ghetie et al., 2000, Annu Rev Immunol 18:739-766). Este proceso, junto con la exclusión de la filtración renal debido al gran tamaño de la molécula de longitud completa, da como resultado semividas séricas de anticuerpos favorables que oscilan entre una y tres semanas. La unión de Fc con FcRn también desempeña un papel clave en el transporte de anticuerpos. El sitio de unión para FcRn en Fc es también el sitio al que se unen las proteínas bacterianas A y G. La estrecha unión de estas proteínas normalmente se aprovecha como un medio para purificar anticuerpos mediante el empleo de cromatografía de afinidad con proteína A o proteína G durante la purificación de proteínas. La fidelidad de estas regiones, el complemento y las regiones de unión a FcRn/proteína A son importantes tanto para las propiedades clínicas de los anticuerpos como para su desarrollo.
[0071] Una característica clave de la región Fc es la glicosilación N enlazada conservada que se produce en N297. Este carbohidrato, u oligosacárido como a veces se le denomina, desempeña un papel estructural y funcional crítico para el anticuerpo, y es una de las razones principales por las que los anticuerpos deben producirse utilizando sistemas de expresión de mamíferos. La unión eficiente de Fc a FcyR y C1q requiere esta modificación, y las alteraciones en la composición del carbohidrato N297 o su eliminación afectan la unión a estas proteínas (Umana et al., 1999, Nat Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 2001 , Biotechnol Bioeng 74:288-294; Mimura et al., 2001, J Biol Chem 276:45539-45547.; Radaev et al., 2001, J Biol Chem 276:16478-16483; Shields et al., 2001, J Biol Chem 276:6591-6604; Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Simmons et al., 2002, J Immunol Methods 263:133-147).
[0072] Las inmunoglobulinas de aspectos útiles para comprender la invención también pueden ser una proteína similar a un anticuerpo denominada fusión de Fc (Chamow et al., 1996, Trends Biotechnol 14:52-60; Ashkenazi et al., 1997, Curr Opin Immunol 9: 195-200). En el presente documento se entiende que la "fusión de Fc" es sinónimo de los términos "inmunoadhesina", "fusión de Ig", "quimera de Ig" y "globulina receptora" (a veces con guiones) tal como se usan en la técnica anterior (Chamow et al., 1996, Trends Biotechnol 14:52-60; Ashkenazi et al., 1997, Curr Opin Immunol 9:195-200). Una fusión de Fc es una proteína en la que uno o más polipéptidos, denominados en el presente documento "compañero de fusión", están operativamente enlazados a Fc. Una fusión Fc combina la región Fc de un anticuerpo y, por tanto, sus funciones efectoras y farmacocinética favorables, con la región de unión a la diana de un receptor, ligando o alguna otra proteína o dominio proteico. El papel de este último es mediar en el reconocimiento de la diana y, por tanto, es funcionalmente análogo a la región variable del anticuerpo. Debido al solapamiento estructural y funcional de las fusiones de Fc con anticuerpos, la discusión sobre anticuerpos en la presente divulgación se extiende también a las fusiones de Fc.
[0073] Prácticamente cualquier proteína o pequeña molécula se puede enlazar a Fc para generar una fusión de Fc. Los compañeros de fusión de proteínas pueden incluir, entre otros, la región variable de cualquier anticuerpo, la región de unión al objetivo de un receptor, una molécula de adhesión, un ligando, una enzima, una citocina, una quimiocina o alguna otra proteína o dominio de proteínas. Los compañeros de fusión de las moléculas pequeñas pueden incluir cualquier agente que dirija la fusión de Fc a un antígeno diana. Dicho antígeno diana puede ser cualquier molécula, p. ej., un receptor extracelular que está implicado en la enfermedad. Las fusiones Fc de las realizaciones descritas en el presente documento pueden apuntar virtualmente al antígeno que se expresa en las células CD32b+.
[0074] Los compañeros de fusión pueden estar enlazados a cualquier región de una región Fc, incluyendo los terminales N o C, o algún residuo entre los terminales. En una realización, un compañero de fusión está enlazado en los terminales N o C de la región Fc. Una variedad de enlazadores puede usarse en algunas realizaciones descritas en el presente documento para enlazar covalentemente las regiones Fc a un compañero de fusión. Por "enlazador", "secuencia enlazadora", "espaciador", "secuencia de anclaje" o equivalentes gramaticales de los mismos, en el presente documento se entiende una molécula o grupo de moléculas (por ejemplo, un monómero o polímero) que conecta dos moléculas y a menudo sirve para colocar las dos moléculas en una configuración. Los enlazadores son conocidos en la técnica; por ejemplo, los muy conocidos enlazadores homo o heterobifuncionales (véase el catálogo de Pierce Chemical Company de 1994, sección técnica sobre agentes reticulantes, páginas 155-200). Se pueden utilizar varias estrategias para enlazar moléculas de forma covalente. Estos incluyen, entre otros, enlaces polipeptídicos entre los terminales N y C de proteínas o dominios proteicos, enlaces mediante enlaces disulfuro y enlaces mediante reactivos de entrecruzamiento químicos. En un aspecto de esta realización, el enlazador es un enlace peptídico, generado mediante técnicas recombinantes o síntesis de péptidos. El péptido enlazador puede incluir predominantemente los siguientes residuos de aminoácidos: Gly, Ser, Ala o Thr. El péptido enlazador debe tener una longitud adecuada para unir dos moléculas de tal manera que asuman la conformación correcta entre sí para que conserven la actividad deseada. Las longitudes adecuadas para este fin incluyen al menos uno y no más de 50 residuos de aminoácidos. En una realización, el enlazador tiene una longitud de aproximadamente 1 a 30 aminoácidos. En una realización, se pueden usar enlazadores h de 1 a 20 aminoácidos de longitud. Los enlazadores útiles incluyen polímeros de glicina-serina (incluyendo, por ejemplo, (GS)n, (GSGGS)n (establecido como SEC ID N.°:1), (GGGGS)n (establecido como SEC ID N.°:2), y (GGGS)n (establecido como SEC ID N.°:3), donde n es un número entero con al menos valor uno), polímeros de glicina-alanina, polímeros de alanina-serina y otros enlazadores flexibles, como apreciarán los expertos en la técnica. Alternativamente, una variedad de polímeros no proteicos, que incluyen, entre otros, polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol, polioxialquilenos o copolímeros de polietilenglicol y polipropilenglicol, pueden usarse como enlazadores, es decir, pueden usarse para unir regiones Fc a un compañero de fusión.
[0075] Los polipéptidos Fc también se contemplan como compañeros de fusión y como útiles para comprender la invención. Por tanto, una inmunoglobulina tal como se describe en el presente documento puede ser un polipéptido Fc multimérico, que comprende dos o más regiones Fc. La ventaja de una molécula de este tipo es que proporciona múltiples sitios de unión para los receptores Fc con una única molécula de proteína. En una realización, las regiones Fc pueden unirse usando un enfoque de ingeniería química. Por ejemplo, los Fab y los Fc pueden estar enlazados mediante enlaces tioéter que se originan en los residuos de cisteína en las bisagras, generando moléculas como FabFc2. Las regiones Fc pueden enlazarse usando ingeniería de disulfuro y/o reticulación química. En una realización, las regiones Fc pueden estar genéticamente enlazadas. En una realización, las regiones Fc en una inmunoglobulina están genéticamente enlazadas a las regiones Fc enlazadas en tándem generadas tal como se describe en la publicación de patente EE. UU. n.° 2005/0249723. Los polipéptidos Fc enlazados en tándem pueden comprender dos o más regiones Fc, por ejemplo, de una a tres regiones Fc, dos regiones Fc. Puede ser conveniente explorar una serie de constructos de ingeniería para obtener regiones Fc unidas en homo o heterotándem con las propiedades estructurales y funcionales más favorables. Las regiones Fc enlazadas en tándem pueden ser regiones Fc unidas en homotándem, es decir, una región Fc de un isotipo está fusionada genéticamente con otra región Fc del mismo isotipo. Se anticipa que debido a que existen múltiples sitios de unión de FcyR, C1q y/o FcRn en polipéptidos Fc unidos en tándem, se pueden mejorar las funciones efectoras y/o la farmacocinética. En una realización alternativa, las regiones Fc de diferentes isotipos pueden estar enlazadas en tándem, y se denominan regiones Fc unidas en heterotándem. Por ejemplo, debido a la capacidad de apuntar a los receptores FcyR y FcaR1, una inmunoglobulina que se una tanto a FcyR como a FcaR1 puede proporcionar una mejora clínica significativa.
[0076] Las inmunoglobulinas de las realizaciones descritas en el presente documento pueden estar codificadas sustancialmente por genes de inmunoglobulinas que pertenecen a cualquiera de las clases de anticuerpos. En determinadas realizaciones, las inmunoglobulinas descritas en el presente documento se pueden usar en anticuerpos o fusiones de Fc que comprenden secuencias que pertenecen a la clase de anticuerpos IgG, que incluye IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. La FlG. 1 proporciona un alineamiento de estas secuencias de IgG humana. En realizaciones alternativas, las inmunoglobulinas descritas en el presente documento se usan en anticuerpos o fusiones de Fc que comprenden secuencias que pertenecen a las clases de anticuerpos IgA (incluidas las subclases IgA1 e IgA2), IgD, IgE, IgG o IgM. Las inmunoglobulinas descritas en el presente documento pueden comprender más de una cadena proteica, por ejemplo, pueden ser un anticuerpo o una fusión de Fc que es un monómero o un oligómero, incluyendo un homo o heterooligómero.
[0077] Las inmunoglobulinas descritas en el presente documento pueden estar codificadas sustancialmente por genes de cualquier organismo, por ejemplo, mamíferos (incluyendo, entre otros, humanos, roedores (incluyendo, entre otros, ratones y ratas), lagomorfos (incluyendo, entre otros, conejos y liebres), camélidos (incluyendo, entre otros, camellos, llamas y dromedarios) y primates no humanos, incluyendo, entre otros, prosimios, platyrrhini (monos del nuevo mundo), cercopithecoidea (monos del viejo mundo) y hominoideos, incluyendo gibones y los pequeños y grandes simios. En determinadas realizaciones, las inmunoglobulinas descritas en el presente documento pueden ser sustancialmente humanas.
[0078] Como es bien conocido en la técnica, existen polimorfismos de inmunoglobulinas en la población humana. El polimorfismo de Gm está determinado por los genes IGHG1, IGHG2 e IGHG3 que tienen alelos que codifican determinantes antigénicos alotípicos denominados alotipos G1m, G2m y G3m para marcadores de las moléculas humanas IgG1, IgG2 e IgG3 (no se han encontrado alotipos de Gm en cadena gamma 4). Los marcadores se pueden clasificar en "alotipos" e "isoalotipos". Estos se distinguen sobre diferentes bases serológicas que dependen de las fuertes homologías de secuencia entre los isotipos. Los alotipos son determinantes antigénicos especificados por formas alélicas de los genes de Ig. Los alotipos representan ligeras diferencias en las secuencias de aminoácidos de cadenas pesadas o ligeras de diferentes individuos. Incluso una única diferencia de aminoácidos puede dar lugar a un determinante alotípico, aunque en muchos casos se han producido varias sustituciones de aminoácidos. Los alotipos son diferencias de secuencia entre alelos de una subclase por lo que los antisueros reconocen solo las diferencias alélicas. Un isoalotipo es un alelo en un isotipo que produce un epítopo que se comparte con una región homóloga no polimórfica de uno o varios isotipos y debido a esto los antisueros reaccionarán tanto con los alotipos relevantes como con los isotipos homólogos relevantes (Clark, 1997, IgG effector mechanisms, Chem Immunol. 65:88-110; Gorman y Clark, 1990, Semin Immunol 2(6):457-66).
[0079] Las formas alélicas de las inmunoglobulinas humanas están bien caracterizadas (WHO Review of the notation for the allotypic and related markers of human immunoglobulins. J Immunogen 1976, 3: 357-362; WHO Review of the notation for the allotypic and related markers of human immunoglobulins. 1976, Eur. J. Immunol. 6, 599-601; Loghem E van, 1986, Allotypic Markers, Monogr Allergy 19: 40-51). Además, se han caracterizado otros polimorfismos (Kim et al., 2001, J. Mol. Evol. 54:1-9). Actualmente, se conocen 18 alotipos Gm: G1m (1, 2, 3, 17) o G1m (a, x, f, z), G2m (23) o G2m (n), G3m (5, 6, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 21, 24, 26, 27, 28) o G3m (b1, c3, b5, b0, b3, b4, s, t, g1, c5, u, v, g5) (Lefranc, et al., The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function and regulation. Pergamon, Oxford, págs. 43-78 (1990); Lefranc, G. et al., 1979, Hum. Genet.: 50, 199 211). Los alotipos que se heredan en combinaciones fijas se denominan haplotipos Gm. La FIG. 2 muestra haplotipos comunes de la cadena gamma de IgG1 (FIG. 2A) e IgG2 (FIG. 2A) humanas mostrando las posiciones y las sustituciones de aminoácidos relevantes. Las inmunoglobulinas descritas en el presente documento pueden estar codificadas sustancialmente por cualquier alotipo, isoalotipo o haplotipo de cualquier gen de inmunoglobulina.
[0080] Las inmunoglobulinas descritas en el presente documento para comprender la invención pueden componer un polipéptido Fc, que incluye, entre otros, anticuerpos, Fc aislados, fragmentos de Fc y fusiones de Fc. Según la invención, una inmunoglobulina descrita en el presente documento es un anticuerpo de longitud completa, que constituye la forma biológica natural de un anticuerpo, que incluye regiones variables y constantes. Para el anticuerpo de longitud completa del isotipo IgG es un tetrámero y consta de dos pares idénticos de dos cadenas de inmunoglobulina, donde cada par tiene una cadena ligera y una pesada, cada cadena ligera comprende los dominios de inmunoglobulina VL y CL y cada cadena pesada comprende los dominios de inmunoglobulina VH, Cy1, Cy2 y Cy3. En otra realización, las inmunoglobulinas descritas en el presente documento son regiones Fc aisladas o fragmentos de Fc.
[0081] Las inmunoglobulinas descritas en el presente documento para comprender la invención pueden ser una variedad de estructuras, que incluyen, entre otras, fragmentos de anticuerpos, anticuerpos biespecíficos, minicuerpos, anticuerpos de dominio, anticuerpos sintéticos (a veces denominados en el presente documento "miméticos de anticuerpos"), anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, fusiones de anticuerpos (a veces denominadas "conjugados de anticuerpos") y fragmentos de cada uno, respectivamente.
[0082] En un aspecto útil para comprender la invención, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpos específicos incluyen, entre otros, (i) el fragmento Fab que consta de los dominios VL, VH, CL y CH1, (ii) el fragmento Fd que consta de los dominios VH y CH1, (iii) el fragmento Fv que consta de los dominios VL y VH de un único anticuerpo; (iv) el fragmento dAb, que consta de una única variable, (v) regiones CDR aisladas, (vi) fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos, (vii) moléculas Fv de cadena sencilla (scFv), donde un dominio VH y un dominio VL están enlazados mediante un enlazador peptídico que permite que los dos dominios se asocien para formar un sitio de unión a antígeno, (viii) dímeros Fv de cadena sencilla biespecíficos y (ix) "diacuerpos" o "triacuerpos", fragmentos multivalentes o multiespecíficos construidos mediante fusión de genes. Los fragmentos de anticuerpos pueden modificarse. Por ejemplo, las moléculas pueden estabilizarse mediante la incorporación de puentes disulfuro que enlazan los dominios VH y VL. Se describen ejemplos de formatos y arquitecturas de anticuerpos en Holliger y Hudson, 2006, Nature Biotechnology 23(9):1126-1136, y Carter 2006, Nature Reviews Immunology 6:343-357 y en las referencias allí citadas.
[0083] En una realización, un anticuerpo descrito en el presente documento puede ser un anticuerpo multiespecífico y, en particular, un anticuerpo biespecífico, también denominado a veces "diacuerpo". Son anticuerpos que se unen a dos (o más) antígenos diferentes. Los diacuerpos se pueden fabricar de diversas formas conocidas en la técnica, por ejemplo, preparados químicamente o a partir de hibridomas híbridos. En una realización, el anticuerpo es un minicuerpo. Los minicuerpos son proteínas similares a anticuerpos minimizadas que comprenden un scFv unido a un dominio CH3. En algunos casos, el scFv puede unirse a la región Fc y puede incluir toda la región bisagra o parte de ella. Para obtener una descripción de anticuerpos multiespecíficos, consulte Holliger y Hudson, 2006, Nature Biotechnology 23(9):1126-1136 y las referencias allí citadas.
Anticuerpos no humanos, quiméricos, humanizados y completamente humanos
[0084] La región variable de un anticuerpo, como es bien sabido en la técnica, puede componer secuencias de una variedad de especies. En algunas realizaciones, la región variable del anticuerpo puede ser de una fuente no humana, que incluye, entre otras, ratones, ratas, conejos, camellos, llamas y monos. En algunas realizaciones, los componentes del andamio pueden ser una mezcla de diferentes especies. Como tal, un anticuerpo descrito en el presente documento puede ser un anticuerpo quimérico y/o un anticuerpo humanizado. En general, tanto los "anticuerpos quiméricos" como los "anticuerpos humanizados" se refieren a anticuerpos que combinan regiones de más de una especie. Por ejemplo, los "anticuerpos quiméricos" tradicionalmente comprenden región(es) variable(s) de un ratón u otra especie no humana y la(s) región(es) constante(s) de un ser humano.
[0085] Los "anticuerpos humanizados" generalmente se refieren a anticuerpos no humanos a los que se les han intercambiado las regiones estructurales de dominio variable por secuencias encontradas en anticuerpos humanos. Generalmente, en un anticuerpo humanizado, el anticuerpo completo, excepto las CDR, está codificado por un polinucleótido de origen humano o es idéntico a dicho anticuerpo excepto dentro de sus CDR. Las CDR, algunas o todas ellas codificadas por ácidos nucleicos que se originan en un organismo no humano, se injertan en la estructura de la hoja beta de una región variable de anticuerpo humano para crear un anticuerpo, cuya especificidad está determinada por las CDR injertadas. La creación de dichos anticuerpos se describe, por ejemplo, en WO 92/11018, Jones, 1986, Nature 321:522-525, Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536. A menudo se requiere una "retromutación" de residuos del marco aceptor seleccionados a los residuos donantes correspondientes para recuperar la afinidad que se pierde en el constructo injertado inicial ( patente EE. UU. n.° 5.693.762). De manera óptima, el anticuerpo humanizado también comprenderá al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina, típicamente la de una inmunoglobulina humana, y por tanto comprenderá típicamente una región Fc humana. También se pueden generar anticuerpos humanizados utilizando ratones con un sistema inmunológico modificado genéticamente. Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog.
20:639-654. Se conocen bien en la técnica una variedad de técnicas y métodos para humanizar y remodelar anticuerpos no humanos (véase Tsurushita y Vasquez, 2004, Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of B Cells, 533-545, Elsevier Science (EE.UU.), y referencias allí citadas). La humanización u otros métodos para reducir la inmunogenicidad de las regiones variables de anticuerpos no humanos pueden incluir métodos de rejuvenecimiento, como se describe por ejemplo en Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU 91:969-973. En una realización, el anticuerpo original ha madurado por afinidad, tal como se conoce en la técnica. Se pueden emplear métodos basados en estructuras para la humanización y la maduración de la afinidad, por ejemplo como se describe en la solicitud de patente EE. UU. n° 11/004.590. Se pueden emplear métodos basados en selección para humanizar y/o madurar la afinidad de las regiones variables de anticuerpos, es decir, para aumentar la afinidad de la región variable por su antígeno diana. Otros métodos de humanización pueden implicar el injerto solo de partes de las CDR, incluyendo, entre otros, los métodos descritos en la serie EE. UU. n° 09/810.502; Tan et al., 2002, J. Immunol. 169:1119-1125; De Pascalis et al., 2002, J. Immunol.
169:3076-3084. Se pueden emplear métodos basados en estructuras para la humanización y la maduración de la afinidad, por ejemplo como se describe en la solicitud de patente EE. UU. n° 7.117.096, y aplicaciones relacionadas. En determinadas variaciones, la inmunogenicidad del anticuerpo se reduce usando un método descrito en la patente EE. UU. n.° 7.657.380.
[0086] En una realización útil para comprender la invención, el anticuerpo es un anticuerpo completamente humano con al menos una modificación según se describe en el presente documento. "Anticuerpo completamente humano" o "anticuerpo humano completo" se refiere a un anticuerpo humano que tiene la secuencia genética de un anticuerpo derivado de un cromosoma humano con las modificaciones descritas en el presente documento. Se pueden obtener anticuerpos completamente humanos, por ejemplo, usando ratones transgénicos (Bruggemann et al., 1997, Curr Opin Biotechnol 8:455-458) o bibliotecas de anticuerpos humanos acoplados con métodos de selección (Griffiths et al., 1998, Curr Opin Biotechnol 9:102-108).
Antígeno diana
[0087] En una realización, las inmunoglobulinas descritas en el presente documento, incluyendo, entre otras, proteínas, subunidades, dominios, motivos y/o epítopos que pertenecen al CD19 diana, pueden apuntar a un antígeno.
Variantes de Fc y propiedades de unión al receptor Fc
[0088] Las inmunoglobulinas descritas en el presente documento comprenden una variante de Fc. Una inmunoglobulina para usar según la invención comprende una variante de Fc con las sustituciones S267E y L328F con respecto al polipéptido Fc original. Todos otros tipos de Fc variantes descritas en esta sección se consideran útiles para comprender la invención. Una variante de Fc comprende una o varias modificaciones de aminoácidos con respecto a un polipéptido Fc original, donde la(s) modificación(es) de aminoácidos proporcionan una o varias propiedades optimizadas. Una variante de Fc descrita en el presente documento difiere en la secuencia de aminoácidos de su original en virtud de al menos una modificación de aminoácidos. Por tanto, las variantes de Fc descritas en el presente documento tienen al menos una modificación de aminoácido en comparación con el original. Alternativamente, las variantes de Fc descritas en el presente documento pueden tener más de una modificación de aminoácidos en comparación con el original, por ejemplo, aproximadamente de dos a cincuenta modificaciones de aminoácidos, por ejemplo, aproximadamente de dos a diez modificaciones de aminoácidos, aproximadamente de dos a cinco modificaciones de aminoácidos, etc., en comparación con el original. Por tanto, las secuencias de las variantes de Fc y las del polipéptido Fc original son sustancialmente homólogas. Por ejemplo, las secuencias variantes de Fc en el presente documento poseerán aproximadamente un 80 % de homología con la secuencia variante del Fc original, p. ej., al menos aproximadamente un 90 % de homología, al menos aproximadamente un 95 % de homología, al menos aproximadamente un 98 % de homología, al menos aproximadamente un 99 % de homología, etc. Las modificaciones descritas en el presente documento incluyen modificaciones de aminoácidos, que incluyen inserciones, deleciones y sustituciones. Las modificaciones descritas en el presente documento también incluyen modificaciones de glicoformas. Las modificaciones pueden realizarse genéticamente utilizando biología molecular, o pueden realizarse de forma enzimática o química.
[0089] Las variantes de Fc descritas en el presente documento se definen según las modificaciones de aminoácidos que las componen. Así, por ejemplo, S267E es una variante de Fc con la sustitución S267E con respecto al polipéptido Fc original. Asimismo, S267E/L328F define una variante de Fc con las sustituciones S267E y L328F con respecto al polipéptido Fc original. La identidad del aminoácido WT puede no estar especificada, en cuyo caso la variante antes mencionada se denomina 267E/328F. Cabe señalar que el orden en el que se proporcionan las sustituciones es arbitrario, es decir, que, por ejemplo, 267E/328F es la misma variante de Fc que 328F/267E, y así sucesivamente. A menos que se indique lo contrario, las posiciones discutidas en el presente documento están numeradas según el índice EU como se describe en Kabat (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda). En resumen, EU es el nombre de la primera molécula de anticuerpo cuya secuencia de aminoácidos completa se determinó (Edelman et al., 1969, Proc Natl Acad Sci USA 63:78-85), y su secuencia de aminoácidos se ha convertido en el esquema de numeración estándar para regiones constantes de cadena pesada. La proteína EU se ha convertido en la referencia estándar para definir la numeración. Kabat et al. enumeran la secuencia EU en un conjunto de índices que la alinean con otras secuencias de anticuerpos, lo que sirve como una herramienta necesaria para alinear los anticuerpos con el esquema de numeración de EU. Por lo tanto, como apreciarán los expertos en la técnica, la forma estándar de hacer referencia a la numeración EU es hacer referencia al alineamiento de secuencias de Kabat et al., porque pone a EU en contexto con anticuerpos de otras longitudes de dominio variables. Como tal, según se utiliza en el presente documento, "el índice EU como en Kabat" o "la numeración sigue índice EU, como en Kabat" se refiere a la numeración del anticuerpo EU como se describe en Kabat.
[0090] En determinadas realizaciones, las variantes de Fc descritas en el presente documento se basan en secuencias de IgG humana y, por tanto, las secuencias de IgG humana se utilizan como secuencias "base" con las que se comparan otras secuencias, incluyendo, entre otras, secuencias de otros organismos, por ejemplo, secuencias de roedores y primates. Las inmunoglobulinas también pueden comprender secuencias de otras clases de inmunoglobulinas tales como IgA, IgE, IgGD, IgGM y similares. Se contempla que, aunque las variantes de Fc descritas en el presente documento se diseñan en el contexto de una IgG original, las variantes pueden diseñarse o "transferirse" al contexto de otra segunda IgG original. Esto se hace determinando los residuos y sustituciones "equivalentes" o "correspondientes" entre la primera y la segunda IgG, normalmente basándose en la secuencia o la homología estructural entre las secuencias de la primera y la segunda IgG. Para establecer la homología, la secuencia de aminoácidos de una primera IgG descrita en el presente documento se compara directamente con la secuencia de una segunda IgG. Después de alinear las secuencias, usando uno o varios de los programas de alineamiento por homología conocidos en la técnica (por ejemplo, usando residuos conservados entre especies), permitiendo las inserciones y deleciones necesarias para mantener el alineamiento (es decir, evitando la eliminación de residuos conservados mediante deleciones e inserciones arbitrarias), se definen los residuos equivalentes a aminoácidos particulares en la secuencia primaria de la primera inmunoglobulina. El alineamiento de residuos conservados puede conservar el 100 % de dichos residuos. Sin embargo, el alineamiento de más del 75 % o tan solo del 50 % de los residuos conservados también es adecuada para definir residuos equivalentes. Los residuos equivalentes también se pueden definir determinando la homología estructural entre una primera y una segunda IgG que está al nivel de la estructura terciaria para las IgG cuyas estructuras se han determinado. En este caso, los residuos equivalentes se definen como aquellos para los cuales las coordenadas atómicas de dos o más de los átomos de la cadena principal de un residuo de aminoácido particular del original o precursor (N sobre N, CA sobre CA, Con C y O sobre O ) se encuentran dentro de aproximadamente 0.13 nm, después del alineamiento. En otra realización, los residuos equivalentes se encuentran dentro de aproximadamente 0.1 nm después del alineamiento. El alineamiento se logra después de que el mejor modelo ha sido orientado y posicionado para dar la máxima superposición de las coordenadas atómicas de los átomos de las proteínas que no son de hidrógeno. Independientemente de cómo se determinen los residuos equivalentes o correspondientes, y de la identidad de la IgG original en la que se producen las IgG, lo que se pretende transmitir es que las variantes de Fc descubiertas tal como se describe en el presente documento se pueden diseñar en cualquier otra IgG original que tenga una homología de secuencia o estructural significativa con la variante de Fc. Así, por ejemplo, si se genera un anticuerpo variante en el que el anticuerpo original es IgG1 humana, utilizando los métodos descritos anteriormente u otros métodos para determinar residuos equivalentes, el anticuerpo variante se puede diseñar en otro anticuerpo original IgG1 que se une a un antígeno diferente, un anticuerpo original IgG2 humano, un anticuerpo original IgA humano, un anticuerpo original IgG2a o IgG2b de ratón, y similares. Nuevamente, como se describió anteriormente, el contexto de la variante de Fc original no afecta la capacidad de transferir las variantes de Fc descritas en el presente documento a otras IgG originales.
[0091] Las variantes de Fc descritas en el presente documento pueden optimizarse para una variedad de propiedades de unión al receptor de Fc. Una variante de Fc que está diseñada o se prevé que muestre una o más propiedades optimizadas se denomina en el presente documento "variante de Fc optimizada". Las propiedades que pueden optimizarse incluyen, entre otras, afinidad mejorada o reducida por un FcyR. En una realización, las variantes de Fc descritas en el presente documento están optimizadas para poseer una afinidad mejorada por un receptor inhibidor FcyRllb. En otras realizaciones, las inmunoglobulinas descritas en el presente documento proporcionan afinidad mejorada por FcYRllb, pero afinidad reducida por uno o más FcyR activadores, incluyendo, por ejemplo, FcyRI, FcYRlla, FcyRllla y/o F<cy>RIIIb. Los receptores FcyR pueden expresarse en células de cualquier organismo, incluyendo, entre otros, seres humanos, monos cynomolgus y ratones. Las variantes de Fc descritas en el presente documento pueden optimizarse para poseer una afinidad mejorada por el FcyRllb humano.
[0092] Por "mayor afinidad" o "afinidad mejorada" o "afinidad aumentada" o "mejor afinidad" que un polipéptido Fc original, tal como se usa en el presente documento se entiende que una variante de Fc se une a un receptor de Fc con una constante de equilibrio de asociación significativamente mayor (K<a>o Ka) o una constante de equilibrio de disociación más baja (Kd o Kd) que el polipéptido Fc original cuando las cantidades de polipéptido variante y original en el ensayo de unión son esencialmente las mismas. Por ejemplo, la variante de Fc con afinidad de unión al receptor de Fc mejorada puede presentar de aproximadamente 5 veces a aproximadamente 1000 veces, p. ej., de aproximadamente 10 veces a aproximadamente 500 veces de mejora en la afinidad de unión al receptor Fc en comparación con el polipéptido Fc original, donde la afinidad de unión al receptor Fc se determina, por ejemplo, mediante los métodos de unión descritos en el presente documento, incluyendo, entre otros, Biacore, por parte de un experto en el arte. En consecuencia, por "afinidad reducida" en comparación con un polipéptido Fc original tal como se usa en el presente documento se entiende que una variante de Fc se une a un receptor de Fc con una Ka significativamente menor o una Kd significativamente mayor que el polipéptido Fc original. También se puede definir una afinidad mayor o reducida en relación con un nivel absoluto de afinidad. Por ejemplo, según los datos del presente documento, la IgG1 WT (nativa) se une a FcyRllb con una afinidad de aproximadamente 1.5 pM o aproximadamente 1500 nM. Además, algunas variantes de Fc descritas en el presente documento se unen a FcyRllb con una afinidad aproximadamente 10 veces mayor a la de IgG 1 WT. Tal como se describe en el presente documento, una afinidad mayor o mejorada significa que tiene una K<d>inferior a aproximadamente 100 nM, por ejemplo entre aproximadamente 10 nM y aproximadamente 100 nM, entre aproximadamente 1 y aproximadamente 100 nM o menos de aproximadamente 1 nM.
[0093] En una realización, las variantes de Fc proporcionan afinidad selectivamente mejorada por FcyRllb con respecto a uno o más receptores activadores. Una Afinidad selectivamente mejorada se refiere a que la variante de Fc tiene afinidad mejorada por FcyRllb en relación con el(los) receptor(es) activador(es) en comparación con el polipéptido Fc original pero tiene afinidad reducida por el(los) receptor(es) activador(es) en comparación con el polipéptido Fc original, o significa que la variante Fc tiene afinidad mejorada tanto por FcyRllb como por los receptores activadores en comparación con el polipéptido Fc original; sin embargo, la mejora en la afinidad es mayor por FcyRllb que por los receptores activadores. En realizaciones alternativas, las variantes de Fc reducen o eliminan la unión a uno o varios FcyR activadores, reducen o eliminan la unión a una o varias proteínas del complemento, reducen o eliminan una o varias funciones efectoras mediadas por FcyR y/o reducen o eliminan una o varias funciones efectoras mediadas por el complemento.
[0094] La presencia de diferentes formas polimórficas de FcyR proporciona otro parámetro más que afecta a la utilidad terapéutica de las variantes de Fc descritas en el presente documento. Mientras que la especificidad y la selectividad de una determinada variante de Fc para las diferentes clases de FcyR afecta significativamente a la capacidad de una variante de Fc para apuntar a un antígeno determinado para el tratamiento de cierta enfermedad, la especificidad o la selectividad de una variante de Fc para diferentes formas polimórficas de estos receptores pueden determinar en parte qué investigaciones o experimentos preclínicos pueden ser apropiados para realizar pruebas y, en última instancia, qué poblaciones de pacientes pueden responder o no al tratamiento. Por lo tanto, la especificidad o la selectividad de las variantes de Fc descritas en el presente documento para los polimorfismos del receptor de Fc, incluyendo, entre otros, FcyRlla, FcyRllla y similares, se pueden utilizar para guiar la selección de experimentos preclínicos y de investigación válidos, el diseño de ensayos clínicos, la selección de pacientes, la dependencia de la dosis y/u otros aspectos relacionados con los ensayos clínicos.
[0095] Las variantes de Fc descritas en el presente documento pueden comprender modificaciones que modulan la interacción con receptores Fc distintos de los FcyR, incluyendo, entre otros, proteínas del complemento, FcRn y homólogos del receptor Fc (FcRH). Las FcRH incluyen, entre otras, FcRH1, FcRH2, FcRH3, FcRH4, FcRH5 y FcRH6 (Davis et al., 2002, Immunol. Reviews 190:123-136).
[0096] Un parámetro importante que determina la selectividad más beneficiosa de una variante de Fc determinada para tratar una enfermedad dada es el contexto de la variante de Fc. Por tanto, la selectividad o la especificidad del receptor Fc de una variante de Fc determinada proporcionará propiedades diferentes dependiendo de si compone un anticuerpo, una fusión de Fc o variantes de Fc con un compañero de fusión acoplado. En una realización, la especificidad del receptor Fc de la variante de Fc descrita en el presente documento determinará su utilidad terapéutica. La utilidad de una variante de Fc determinada con fines terapéuticos dependerá del epítopo o forma del antígeno diana y de la enfermedad o indicación que se esté tratando. Para algunas dianas e indicaciones, puede ser beneficiosa una mayor afinidad por FcyRllb y una reducción de las funciones efectoras activadoras mediadas por FcyR. Para otros antígenos diana y aplicaciones terapéuticas, puede ser beneficioso aumentar la afinidad por FcYRllb, o aumentar la afinidad tanto por FcyRllb como por los receptores activadores.
Propiedades inhibidoras y métodos de inhibición de las células CD32b+
[0097] El antígeno diana (CD19) de las inmunoglobulinas descritas en el presente documento puede expresarse en una variedad de tipos de células. En algunas realizaciones, las inmunoglobulinas descritas en el presente documento son específicas para CD19 expresado en células CD32b+. Los tipos de células a los que pueden dirigirse las inmunoglobulinas descritas en el presente documento incluyen, entre otros, células B, células plasmáticas, células dendríticas, macrófagos, neutrófilos, mastocitos, basófilos y eosinófilos.
[0098] En el presente documento se describen métodos para inhibir las células CD32b+. Sin limitarse a ello, la FIG. 3 es una representación esquemática de un mecanismo propuesto mediante el cual las inmunoglobulinas descritas en el presente documento inhiben las células CD32b+. Por consiguiente, en el presente documento se describen métodos para inhibir las células CD32b+ que comprenden poner en contacto una célula CD32b+ con una inmunoglobulina que comprende una región Fc con afinidad mejorada por FcyRllb. La inmunoglobulina se une al menos a dos proteínas de las células B, por ejemplo, al menos dos proteínas unidas a las células B de la superficie. En una realización, la primera de dichas proteínas de células B es FcyRllb. En otra realización, la segunda de dichas proteínas de células B es CD19. En algunas realizaciones, las inmunoglobulinas inhiben la liberación de calcio de las células B tras su estimulación a través del receptor de células B. En otra realización, una inmunoglobulina descrita en el presente documento se une al menos a dos proteínas de células B en la superficie de la misma célula B (véase, por ejemplo, la FIG. 3).
Modificaciones para optimizar la función inhibidora
[0099] Lo divulgado en el presente documento se dirige a inmunoglobulinas que comprenden modificaciones, donde dichas modificaciones alteran la afinidad por el receptor FcyRllb y/o alteran la capacidad de la inmunoglobulina para mediar en una o varias funciones efectoras mediadas por FcyRllb. Las modificaciones de la divulgación incluyen modificaciones de aminoácidos y modificaciones de glicoformas. Una inmunoglobulina para usar según la invención comprende una variante de Fc con las sustituciones S267E y L328F con respecto al polipéptido Fc original. Otras modificaciones de aminoácidos descritas en esta sección se consideran útiles para comprender la invención.
[0100] Tal como se describe en el presente documento, se puede utilizar el coacoplamiento simultáneo de alta afinidad del BCR específico y FcyRllb para inhibir las células FcyRllb+. Dicho coacoplamiento puede ocurrir mediante el uso de una inmunoglobulina descrita en el presente documento, por ejemplo, una inmunoglobulina usada para coacoplar tanto a FcYRllb a través de su región Fc como a un antígeno diana en la superficie de la célula FcyRllb+ (por ejemplo, CD19) a través de su región Fv. Las modificaciones de aminoácidos en las posiciones 234, 235, 236, 239, 267, 268 y 328 de la región constante de la cadena pesada permiten la modificación de las propiedades de unión de la inmunoglobulina FcyRllb, la función efectora y las propiedades potencialmente clínicas de los anticuerpos.
[0101] En una realización, las inmunoglobulinas que se unen a las células FcyRllb+ y se coacoplan a un antígeno diana en la superficie de la célula y a un FcyRllb en la superficie de la célula descritas en el presente documento pueden ser inmunoglobulinas variantes con respecto a una inmunoglobulina original. En una realización, la inmunoglobulina variante comprende una región Fc variante, donde dicha región Fc variante comprende una o varias (por ejemplo, dos o más) modificaciones en comparación con las regiones Fc originales, donde dichas modificaciones están en posiciones seleccionadas del grupo que consta de 234, 235, 236, 239, 267, 268 y 328, donde la numeración se realiza según un índice EU como en Kabat. En una realización, donde dicha región Fc variante comprende una o varias (por ejemplo, dos o más) modificaciones en comparación con las regiones Fc originales, donde dichas modificaciones están en posiciones seleccionadas del grupo que consta de 267 y 328 según el índice EU como en Kabat.
[0102] En una realización, dicha(s) modificación(es) son al menos una sustitución (por ejemplo, una o más sustituciones, dos o más sustituciones, etc.) seleccionada del grupo que consiste en 234W, 235I, 235Y, 235R, 235D, 236D, 236N, 239D, 267D, 267E, 268E, 268D, 328F y 328Y, en los que la numeración se realiza según un índice EU como en Kabat. En otra realización, dicha modificación es al menos una sustitución seleccionada del grupo que consiste en 235Y, 235R, 236D, 267D, 267E y 328F. En una realización, dicha(s) modificación(es) son al menos una sustitución seleccionada del grupo que consiste en 267E y 328F, donde la numeración se realiza según un índice EU como en Kabat. En una realización, dicha(s) modificación(es) son al menos una sustitución seleccionada del grupo que consiste en L234W, L235I, L235Y, L235R, L235D,<g>236D, G236N, S239D, S267D, S267E, H268E, H268<d>, L328F y L328Y en donde la numeración se realiza según un índice EU como en Kabat. En otra realización, dicha(s) modificación(es) son al menos una sustitución seleccionada del grupo que consiste en L235Y, L235R, G236D, S267D, S267E y L328F. En una realización, dicha(s) modificación(es) son al menos una sustitución seleccionada del grupo que consiste en S267E y L328F, donde la numeración se realiza según un índice EU como en Kabat.
[0103] En otra realización, dichas modificaciones son al menos dos modificaciones (por ejemplo, una combinación de modificaciones) en las posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 235/267, 236/267, 236/267, 267/328 y 268/267, donde la numeración se realiza según un índice EU como en Kabat. En otra realización, dicha(s) modificación(es) son al menos dos sustituciones en las posiciones 267/328, donde la numeración se realiza según un índice EU como en Kabat. En una realización adicional, dicha(s) modificación(es) son al menos dos sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en 235D/267E, 235Y/267E, 235D/S267D, 235I/267E, 235I/267D, 235Y/267D, 236D/267E, 236D. /267D, 267E/328F, 267D/328F, 268D/267E, 268D/267D, 268E/267E y 268E/267D, donde la numeración se realiza según un índice EU como en Kabat. En una realización adicional, dicha(s) modificación(es) son al menos dos sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en 235D/267E, 235Y/267E, 235Y/267D, 236D/267E, 267E/328F, 268D/267E, 268E/267E y 268E/267D, donde la numeración se realiza según un índice EU como en Kabat. En una realización, dicha(s) modificación(es) son al menos 267E/328F, donde la numeración se realiza según un índice EU como en Kabat. En una realización adicional, dicha(s) modificación(es) son al menos dos sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en L235D/S267E, L235Y/S267E, L235D/S267D, L235I/S267E, L235I/S267D, L235Y/S267D, G236D/S267E, G236D/S267D, S267E/L328F, S267D/L328F, H268D/S267E, H268D/S267D, H268E/S267E y H268E/S267D, donde la numeración se realiza según un índice EU como en Kabat. En una realización adicional, dicha(s) modificación(es) son al menos dos sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en L235D/S267E, L235Y/S267E, L235Y/S267D, G236D/S267E, S267E/L328F, H268D/S267E, H268E/S267E y H268E/S267D, donde la numeración se realiza según un índice EU como en Kabat. En una realización, dicha(s) modificación(es) son al menos S267E/L328F, donde la numeración se realiza según un índice EU como en Kabat.
[0104] En otra realización, dicha(s) modificación(es) son al menos tres sustituciones (por ejemplo, una combinación de modificaciones) en las posiciones 236/267/328, donde la numeración se realiza según un índice EU como en Kabat. En otra realización, dicha(s) modificación(es) son al menos 236D/267E/328F. En otra realización, dicho medio de sustitución es al menos G236D/S267E/L328F.
[0105] En algunas realizaciones, los anticuerpos pueden comprender modificaciones isotípicas, es decir, modificaciones en una IgG original al tipo de aminoácido en una IgG alternativa. Por ejemplo como se ilustra en la FIG. 1, se puede construir una variante híbrida de IgG1/IgG3 sustituyendo posiciones de IgG1 en la región CH2 y/o CH3 con los aminoácidos de IgG3 en posiciones en las que difieren los dos isotipos. Por lo tanto, se puede construir un anticuerpo IgG variante híbrido que comprende una o varias sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en: 274Q, 276K, 300F, 339T, 356E, 358M, 384S, 392N, 397M, 422I, 435R y 436F. En otras realizaciones de la divulgación, se puede construir una variante híbrida de IgG1/IgG2 sustituyendo posiciones de IgG2 en la región CH2 y/o CH3 con aminoácidos de IgG 1 en posiciones en las que difieren los dos isotipos. Por lo tanto, se puede construir una variante híbrida de anticuerpo IgG que comprenda una o varias modificaciones seleccionadas del grupo que consiste en 233E, 234L, 235L, -236G (refiriéndose a una inserción de una glicina en la posición 236) y 327A.
Medios para optimizar función efectora
[0106] En el presente documento se describen inmunoglobulinas que comprenden medios para alterar la afinidad por el receptor FcyRllb y/o alterar la capacidad de la inmunoglobulina para mediar en una o más funciones efectoras mediadas por FcyRllb. Los medios de la divulgación incluyen modificaciones de aminoácidos (por ejemplo, medios posicionales para optimizar la función efectora, medios de sustitución para optimizar la función efectora, etc.) y modificaciones de glicoformas (por ejemplo, medios para modificaciones de glicoformas).
Modificaciones de aminoácidos
[0107] Una inmunoglobulina para usar según la invención comprende una variante de Fc con las sustituciones S267E y L328F con respecto al polipéptido Fc original. Otras modificaciones de aminoácidos descritas en esta sección se consideran útiles para comprender la invención.
[0108] Tal como se describe en el presente documento, los medios posicionales para optimizar la función efectora incluyen, entre otros, la modificación de un aminoácido en una o más posiciones de la región constante de la cadena pesada 234, 235, 236, 239, 267, 268 y 328, que permiten la modificación de las propiedades de unión de la inmunoglobulina FcyRIlb, la función efectora y las propiedades potencialmente clínicas de los anticuerpos.
[0109] En particular, los medios de sustitución para optimizar las funciones efectoras de FcyRllb, por ejemplo, alterando la afinidad por FcYRllb, incluyen, entre otros, una sustitución de un aminoácido en una o varias posiciones de la región constante de la cadena pesada, por ejemplo, una o varias de las sustituciones de aminoácidos en las posiciones de la región constante de la cadena pesada 234, 235, 236, 239, 267, 268 y 328, en las que la numeración se realiza según un índice EU como en Kabat. En una realización, los medios de sustitución incluyen al menos una sustitución (por ejemplo, una o más sustituciones, dos o más sustituciones, etc.) en comparación con una región Fc original, en la que dichas sustituciones están en las posiciones seleccionadas del grupo formado por 267 y 328 según el índice EU como en Kabat. En una realización, dicho medio de sustitución es al menos una sustitución seleccionada del grupo que consiste en 234W, 235I, 235Y, 235R, 235D, 236D, 236N, 239D, 267D, 267E, 268E, 268D, 328F y 328Y, donde la numeración sigue un índice EU como en Kabat. En otra realización, dicho medio de sustitución es al menos una sustitución seleccionada del grupo que consiste en 235Y, 235R, 236D, 267D, 267E y 328F, donde la numeración sigue un índice EU como en Kabat. En una realización, dicho medio de sustitución es al menos una sustitución seleccionada del grupo que consiste en 267E y 328F, donde la numeración se realiza según un índice EU como en Kabat. En una realización, dicho medio de sustitución es al menos una sustitución seleccionada del grupo que consiste en L234W, L235I, L235Y, L235R, L235D, G236D, G236N, S239D, S267D, S267E, H268E, H268D, L328F y L328Y en donde la numeración se realiza según un índice EU como en Kabat. En otra realización, dicho medio de sustitución es al menos una sustitución seleccionada del grupo que consiste en L235Y, L235R, G236D, S267D, S267E y L328F, donde la numeración sigue un índice EU como en Kabat. En una realización, dicho medio de sustitución es al menos una sustitución seleccionada del grupo que consiste en S267E y L328F, donde la numeración se realiza según un índice EU como en Kabat.
[0110] En otra realización, dicho medio de sustitución se trata al menos de dos sustituciones (por ejemplo, una combinación de modificaciones) en las posiciones 235/267, 236/267, 236/267, 267/328 y 268/267, donde la numeración se realiza según un índice U<e>como en Kabat. En otra realización, dicho medio de sustitución se trata al menos de dos sustituciones en las posiciones 267/328, donde la numeración se realiza según un índice EU como en Kabat. En una realización adicional, dichos medios de sustitución son al menos dos sustituciones en las posiciones 235D/267E, 235Y/267E, 235D/S267D, 235I/267E, 235I/267D, 235Y/267D, 236D/267E, 236D. /267D, 267E/328F, 267D/328F, 268D/267E, 268D/267D, 268E/267E y 268E/267D, donde la numeración se realiza según un índice EU como en Kabat. En otra realización, dichos medios de sustitución son al menos dos sustituciones en las posiciones 235D/267E, 235Y/267E, 235Y/267D, 236D/267E, 267E/328F, 268D/267E, 268E/267E y 268E/267D, donde la numeración se realiza según un índice EU como en Kabat. En una realización, dicho medio de sustitución es al menos 267E/328F, donde la numeración se realiza según un índice EU como en Kabat. En otra realización, dichos medios de sustitución son al menos dos sustituciones en las posiciones L235D/S267E, L235Y/S267E, L235D/S267D, L235I/S267E, L235I/S267D, L235Y/S267D, G236D/S267E, G236D/S267D, S267E/L3. 28F, S267D/L328F, H268D/S267E, H268D/S267D, H268E/S267E y H268E/S267D, donde la numeración se realiza según un índice EU como en Kabat. En otra realización, dichos medios de sustitución son al menos dos sustituciones en las posiciones L235D/S267E, L235Y/S267E, L235Y/S267D, G236D/S267E, S267E/L328F, H268D/S267E, H268E/S267E y H268E/S267D, donde la numeración se realiza según un índice EU como en Kabat. En una realización, dicho medio de sustitución es al menos S267E/L328F, donde la numeración se realiza según un índice EU como en Kabat.
[0111] En otra realización, dichos medios de sustitución son al menos tres sustituciones (por ejemplo, una combinación de modificaciones) en las posiciones 236/267/328, donde la numeración se realiza según un índice EU como en Kabat. En otra realización, dicho medio de sustitución es al menos 236D/267E/328F, donde la numeración se realiza según un índice EU como en Kabat. En otra realización, dicho medio de sustitución es al menos G236D/S267E/L328F, donde la numeración se realiza según un índice EU como en Kabat.
Modificaciones de glicoformas
[0112] Muchos polipéptidos, incluidos los anticuerpos, están sujetos a una variedad de modificaciones postraduccionales que involucran restos de carbohidratos, como la glicosilación con oligosacáridos. Hay varios factores que pueden influir en la glicosilación. Se ha demostrado que la especie, el tejido y el tipo de célula son importantes en la forma en que se produce la glicosilación. Además, el entorno extracelular, a través de condiciones de cultivo alteradas tales como la concentración sérica, puede tener un efecto directo sobre la glicosilación (Lifely et al., 1995, Glycobiology 5(8): 813-822).
[0113] Todos los anticuerpos contienen carbohidratos en posiciones conservadas en las regiones constantes de la cadena pesada. Cada isotipo de anticuerpo tiene una variedad distinta de estructuras de carbohidratos N-enlazados. Aparte de los carbohidratos unidos a la cadena pesada, hasta el 30 % de las IgG humanas tienen una región Fab glicosilada. La IgG tiene un único carbohidrato biantenario N-enlazado en Asn297 del dominio CH2. Para la IgG procedente de suero o producida ex vivo en hibridomas o células modificadas genéticamente, las IgG son heterogéneas con respecto al carbohidrato enlazado a Asn297 (Jefferis et al., 1998, Immunol. Rev.
163:59-76; Wright et al., 1997, Trends Biotech 15:26-32). Para la IgG humana, el oligosacárido central normalmente consiste en GlcNAc2Man3GlcNAc, con diferentes números de residuos externos.
[0114] Los restos de carbohidratos de las inmunoglobulinas divulgadas en el presente documento se describirán haciendo referencia a la nomenclatura comúnmente utilizada para la descripción de oligosacáridos. Una revisión de la química de los carbohidratos que utiliza esta nomenclatura se encuentra en Hubbard et al. 1981, Ann. Rev. Biochem. 50:555-583. Esta nomenclatura incluye, por ejemplo, Man, que representa la manosa; GlcNAc, que representa 2-N-acetilglucosamina; Gal que representa la galactosa; Fuc por fucosa; y Glc, que representa la glucosa. Los ácidos siálicos se describen mediante la notación abreviada NeuNAc, para el ácido 5-N-acetilneuramínico y NeuNGc para el 5-glicolilneuramínico.
[0115] El término "glicosilación" significa la unión de oligosacáridos (carbohidratos que contienen dos o más azúcares simples unidos entre sí, p. ej., de dos a aproximadamente doce azúcares simples enlazados entre sí) a una glicoproteína. Las cadenas laterales de oligosacáridos suelen estar enlazadas al esqueleto de la glicoproteína mediante enlaces N u O. Los oligosacáridos de inmunoglobulinas descritos en el presente documento generalmente están unidos a un dominio CH2 de una región Fc como oligosacáridos N-enlazados. "Glicosilación N-enlazada" se refiere a la unión de la fracción de carbohidrato a un residuo de asparagina en una cadena de glicoproteína. El experto en la técnica reconocerá que, por ejemplo, cada uno de los dominios CH2 de IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3 murinas así como los dominios CH2 de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgD humanas tienen un único sitio para la glicosilación N-enlazada en el residuo de aminoácido 297 (Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 1991).
[0116] Para los fines del presente documento, una "estructura de carbohidratos central madura" se refiere a una estructura de carbohidrato central procesada unida a una región Fc que generalmente consiste en la siguiente estructura de carbohidrato GlcNAc(Fucosa)-GlcNAc-Man-(Man-GlcNAc)2 típica de oligosacáridos biantenarios. La estructura de carbohidratos central madura está unida a la región Fc de la glicoproteína, generalmente mediante enlace N a Asn297 de un dominio CH2 de la región Fc. Una "GlcNAc bisecante" es un residuo de GlcNAc unido a la (31,4 manosa de la estructura de carbohidrato central madura. La GlcNAc bisecante se puede unir enzimáticamente a la estructura de carbohidratos central madura mediante una enzima 3 (1,4) -N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII). Las células CHO normalmente no expresan GnTIII (Stanley et al., 1984, J. Biol. Chem. 261:13370-13378), pero pueden diseñarse para ello (Umana et al., 1999, Nature Biotech. 17:176-180).
[0117] En el presente documento se describen variantes de Fc que comprenden glicoformas modificadas o glicoformas diseñadas. Por "glicoforma modificada" o "glicoforma diseñada" tal como se usa en el presente documento se entiende una composición de carbohidratos que está unida covalentemente a una proteína, por ejemplo un anticuerpo, donde dicha composición de carbohidratos difiere químicamente de la de una proteína original. Las glicoformas diseñadas pueden ser útiles para una variedad de propósitos, que incluyen, entre otros, mejorar o reducir la función efectora mediada por FcyR. En una realización, las inmunoglobulinas descritas en el presente documento se modifican para controlar el nivel de oligosacáridos fucosilados y/o bisecantes unidos covalentemente a la región Fc.
[0118] Se conocen bien en la técnica una variedad de métodos para generar glicoformas modificadas (Umaña et al., 1999, Nat Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473); (EE. UU. 6.602.684; pub. EE. UU. n.° 2003/0157108; pub. EE. UU. n.° 2003/0003097; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/29246A1; PCT WO 02/31140A1; PCT WO 02/30954A1); (tecnología Potelligent™ [Biowa, Inc., Princeton, Nueva Jersey]; tecnología de ingeniería de glicosilación GlycoMAb™ [GLYCART biotechnology AG, Zúrich, Suiza]). Estas técnicas controlan el nivel de oligosacáridos fucosilados y/o bisecantes que están unidos covalentemente a la región Fc, por ejemplo expresando una IgG en diversos organismos o líneas celulares, modificadas genéticamente o de otro tipo (por ejemplo, células CHO Lec-13 o células hibridoma de rata YB2/ 0) regulando las enzimas implicadas en la vía de glicosilación (por ejemplo, FUT8 [a1,6-fucosiltransferasa] y/o 31-4-N-acetilglucosaminiltransferasa III [GnTIII]) o modificando los carbohidratos después de que la IgG se haya expresado. Otros métodos para modificar glicoformas de las inmunoglobulinas descritas en el presente documento incluyen el uso de cepas de levadura (Li et al., 2006, Nature Biotechnology 24(2):210-215), musgo (Nechansky et al., 2007, Mol Immunjol 44(7):1826-8) y plantas (Cox et al., 2006, Nat Biotechnol 24(12):1591-7) modificadas mediante glicoingeniería. El uso de un método particular para generar una glicoforma modificada no pretende limitar las realizaciones a ese método. Más bien, las realizaciones descritas en el presente documento abarcan variantes de Fc con glicoformas modificadas independientemente de cómo se produzcan.
[0119] En una realización, las inmunoglobulinas descritas en el presente documento están diseñadas con glicoingeniería para alterar el nivel de sialilación. Los niveles más altos de glicanos Fc sialilados en las moléculas de inmunoglobulina G pueden afectar negativamente a la funcionalidad (Scallon et al., 2007, Mol Immunol.
44(7):1524-34), y las diferencias en los niveles de sialilación de Fc pueden dar como resultado una actividad antiinflamatoria modificada. (Kaneko et al., 2006, Science 313:670-673). Debido a que los anticuerpos pueden adquirir propiedades antiinflamatorias tras la sialilación del polisacárido central de Fc, puede ser conveniente manipular las inmunoglobulinas descritas en el presente documento para obtener un contenido de ácido siálico de Fc mayor o reducido.
[0120] La glicoforma diseñada normalmente se refiere a diferentes carbohidratos u oligosacáridos; así, por ejemplo, una inmunoglobulina puede comprender una glicoforma diseñada. Alternativamente, la glicoforma diseñada puede referirse a la inmunoglobulina que comprende los diferentes carbohidratos u oligosacáridos. En una realización, una composición descrita en el presente documento comprende una variante de Fc glicosilada que tiene una región Fc, en la que aproximadamente un 51-100 % del anticuerpo glicosilado, por ejemplo, un 80 100 %, un 90-100 %, un 95-100 %, etc., del anticuerpo en la composición comprende una estructura de carbohidratos central madura que carece de fucosa. En otra realización, el anticuerpo de la composición comprende una estructura de carbohidratos central madura que carece de fucosa y además comprende al menos una modificación de aminoácidos en la región Fc. En una realización alternativa, una composición comprende una variante de Fc glicosilada que tiene una región Fc, en la que aproximadamente un 51-100 % del anticuerpo glicosilado, un 80-100 % o un 90-100 % del anticuerpo en la composición comprende una estructura de carbohidratos central madura que carece de ácido siálico. En otra realización, el anticuerpo de la composición comprende una estructura de carbohidratos central madura que carece de ácido siálico y además comprende al menos una modificación de aminoácidos en la región Fc. En otra realización, una composición comprende una variante de Fc glicosilada que tiene una región Fc, en la que aproximadamente un 51-100 % del anticuerpo glicosilado, un 80-100 % o un 90-100 % del anticuerpo en la composición comprende una estructura de carbohidratos central madura que contiene ácido siálico. En otra realización, el anticuerpo de la composición comprende una estructura de carbohidratos central madura que contiene ácido siálico y además comprende al menos una modificación de aminoácidos en la región Fc. En otra realización, la combinación de glicoforma diseñada y modificación de aminoácidos proporciona propiedades óptimas de unión del receptor Fc al anticuerpo.
Otras modificaciones
[0121] Las inmunoglobulinas descritas en el presente documento pueden comprender una o varias modificaciones que proporcionan propiedades optimizadas que no están per se específicamente relacionadas con funciones efectoras mediadas por FcyR o complemento. Dichas modificaciones pueden ser modificaciones de aminoácidos o pueden ser modificaciones que se realizan de forma enzimática o química. Es probable que dichas modificaciones proporcionen alguna mejora en la inmunoglobulina, por ejemplo una mejora en su estabilidad, solubilidad, función o uso clínico. En el presente documento se describen una variedad de mejoras que pueden realizarse acoplando las inmunoglobulinas descritas en el presente documento con modificaciones adicionales.
[0122] En una realización, la región variable de un anticuerpo descrito en el presente documento puede madurar por afinidad, es decir, que se han realizado modificaciones de aminoácidos en los dominios VH y/o VL del anticuerpo para mejorar la unión del anticuerpo a su antígeno diana. Dichos tipos de modificaciones pueden mejorar la cinética de asociación y/o disociación para la unión al antígeno diana. Otras modificaciones incluyen aquellas que mejoran la selectividad por el antígeno diana frente a dianas alternativas. Estas incluyen modificaciones que mejoran la selectividad del antígeno expresado en células diana frente a células no diana. Se pueden proporcionar otras mejoras a las propiedades de reconocimiento de dianas mediante modificaciones adicionales. Dichas propiedades pueden incluir, entre otras, propiedades cinéticas específicas (es decir, cinética de asociación y disociación), selectividad por la diana particular frente a dianas alternativas, y selectividad por una forma específica de diana frente a formas alternativas. Los ejemplos incluyen variantes de longitud completa frente a variantes de empalme, formas de superficie celular frente a formas solubles, selectividad para varias variantes polimórficas o selectividad para formas conformacionales específicas del antígeno diana. Las inmunoglobulinas descritas en el presente documento pueden comprender una o varias modificaciones que proporcionan una internalización reducida o mejorada de una inmunoglobulina.
[0123] En una realización, se realizan modificaciones para mejorar las propiedades biofísicas de las inmunoglobulinas descritas en el presente documento, que incluyen, entre otras, estabilidad, solubilidad y estado oligomérico. Las modificaciones pueden incluir, por ejemplo, sustituciones que proporcionan interacciones intramoleculares más favorables en la inmunoglobulina, por ejemplo, para proporcionar una mayor estabilidad, o sustitución de aminoácidos no polares expuestos con aminoácidos polares para una mayor solubilidad. En la publicación de patente EE. UU. n.° 2004/0110226 se describen varios objetivos y métodos de optimización, que pueden resultar útiles para diseñar modificaciones adicionales para optimizar aún más las inmunoglobulinas descritas en el presente documento. Las inmunoglobulinas descritas en el presente documento también se pueden combinar con modificaciones adicionales que reducen el estado o el tamaño oligomérico, de modo que se mejore la penetración en el tumor o las tasas de eliminaciónin vivoaumenten según se desee.
[0124] Otras modificaciones a las inmunoglobulinas descritas en el presente documento incluyen aquellas que permiten la formación específica de moléculas homodiméricas u homomultiméricas. Dichas modificaciones incluyen, entre otras, disulfuros diseñados, así como modificaciones químicas o métodos de agregación que pueden proporcionar un mecanismo para generar homodiméricos u homomultímeros covalentes. Por ejemplo, los métodos de ingeniería y las composiciones de dichas moléculas se describen en Kan et al., 2001, J. Immunol., 2001, 166: 1320-1326; Stevenson et al., 2002, Recent Results Cancer Res. 159: 104-12; EE. UU.
5.681.566; Caron et al., 1992, J. Exp. Med. 176:1191-1195, y Shopes, 1992, J. Immunol. 148(9):2918-22. Las modificaciones adicionales a las variantes descritas en el presente documento incluyen aquellas que permiten la formación específica de moléculas heterodiméricas, heteromultiméricas, bifuncionales y/o multifuncionales. Dichas modificaciones incluyen, entre otras, una o varias sustituciones de aminoácidos en el dominio CH3, en las que las sustituciones reducen la formación de homodímeros y aumentan la formación de heterodímeros. Por ejemplo, los métodos de ingeniería y las composiciones de dichas moléculas se describen en Atwell et al., 1997, J. Mol. Biol. 270(1):26-35, y Carter et al., 2001, J. Immunol. Methods 248:7-15. Las modificaciones adicionales incluyen modificaciones en los dominios bisagra y CH3, en los que las modificaciones reducen la propensión a formar dímeros.
[0125] En realizaciones adicionales, las inmunoglobulinas descritas en el presente documento comprenden modificaciones que eliminan los sitios de degradación proteolítica. Estos pueden incluir, por ejemplo, sitios de proteasa que reducen los rendimientos de producción, así como sitios de proteasa que degradan la proteína administradain vivo.En una realización, se realizan modificaciones adicionales para eliminar sitios de degradación covalente tales como los sitios de desamidación (es decir, desamidación de residuos de glutamilo y asparaginilo a los correspondientes residuos de glutamilo y aspartilo), oxidación y degradación proteolítica. Los sitios de desamidación cuya eliminación es particularmente útil son aquellos que tienen una mayor propensión a la desamidación, incluyendo, entre otros, los residuos de asparaginilo y glutamilo, seguidos de glicinas (motivos NG y QG, respectivamente). En tales casos, la sustitución de cualquiera de los residuos puede reducir significativamente la tendencia a la desamidación. Los sitios de oxidación comunes incluyen residuos de metionina y cisteína. Otras modificaciones covalentes, que pueden introducirse o eliminarse, incluyen la hidroxilación de prolina y lisina, la fosforilación de grupos hidroxilo de residuos serilo o treonilo, la metilación de los grupos "-amino" de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman y otros, San Francisco, págs. 79-86 (1983)), la acetilación de la amina N-terminal y la amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal. Las modificaciones adicionales también pueden incluir, entre otras, modificaciones postraduccionales tales como glicosilación y fosforilación N-enlazadas u O-enlazadas.
[0126] Las modificaciones pueden incluir aquellas que mejoran los rendimientos de expresión y/o purificación de huéspedes o células huésped comúnmente utilizadas para la generación de productos biológicos. Estas incluyen, entre otras, diversas líneas celulares de mamíferos (por ejemplo, CHO), líneas celulares de levadura, líneas celulares bacterianas y plantas. Las modificaciones adicionales incluyen modificaciones que eliminan o reducen la capacidad de las cadenas pesadas para formar enlaces disulfuro entre cadenas. Las modificaciones adicionales incluyen modificaciones que eliminan o reducen la capacidad de las cadenas pesadas para formar enlaces disulfuro dentro de las cadenas.
[0127] Las inmunoglobulinas descritas en el presente documento pueden comprender modificaciones que incluyen el uso de aminoácidos no naturales incorporados usando, por ejemplo, las tecnologías desarrolladas por Schultz y colegas, que incluyen, entre otros, métodos descritos por Cropp y Shultz, 2004, Trends Genet.
20(12):625-30, Anderson et al., 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 101(2):7566-71, Zhang et al., 2003, 303(5656):371-3 y Chin et al., 2003, Science 301(5635):964-7. En algunas realizaciones, estas modificaciones permiten la manipulación de diversas propiedades funcionales, biofísicas, inmunológicas o de fabricación analizadas anteriormente. En realizaciones adicionales, estas modificaciones permiten modificaciones químicas adicionales para otros fines. Otras modificaciones se contemplan en el presente documento. Por ejemplo, la inmunoglobulina puede estar enlazada a uno entre una variedad de polímeros no proteicos, por ejemplo, polietilenglicol (p EG), polipropilenglicol, polioxialquilenos o copolímeros de polietilenglicol y polipropilenglicol. Se pueden realizar modificaciones de aminoácidos adicionales para permitir una modificación química o postraduccional específica o no específica de las inmunoglobulinas. Dichas modificaciones incluyen, entre otras, PEGilación y glicosilación. Las sustituciones específicas que se pueden utilizar para permitir la PEGilación incluyen, entre otras, la introducción de nuevos residuos de cisteína o aminoácidos no naturales de manera que se puedan usar químicas de acoplamiento eficientes y específicas para unir un PEG o una fracción polimérica. La introducción de sitios de glicosilación específicos se puede lograr mediante la introducción de nuevas secuencias N-X-T/S en las inmunoglobulinas descritas en el presente documento.
[0128] Las modificaciones para reducir la inmunogenicidad pueden incluir modificaciones que reducen la unión de péptidos procesados derivados de la secuencia original a proteínas MHC. Por ejemplo, las modificaciones de aminoácidos se diseñarían de manera que no haya o haya un número mínimo de epítopos inmunes que se espera que se unan, con alta afinidad, a cualquier alelo prevalente del MHC. En la técnica se conocen varios métodos para identificar epítopos de unión a MHC en secuencias de proteínas y pueden usarse para puntuar epítopos en un anticuerpo descrito en el presente documento. Ver, por ejemplo, las publicaciones de patente n.° 2002/0119492, 2004/0230380, 2006/0148009, y las referencias citadas en ellas.
[0129] En algunas realizaciones, las inmunoglobulinas descritas en el presente documento se pueden combinar con inmunoglobulinas que alteran la unión de FcRn. Dichas variantes pueden proporcionar propiedades farmacocinéticas mejoradas a las inmunoglobulinas. En particular, las variantes que aumentan la unión de Fc con FcRn incluyen, entre otras: 250E, 250Q, 428L, 428F, 250Q/428L (Hinton et al., 2004, J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216, Hinton et al. 2006 Journal of Immunology 176:346-356, n.° ser. EE. UU. 11/102621, PCT/US2003/033037, PCT/US2004/011213, n.° ser. EE. UU. 10/822300, n.° ser. EE. UU. 10/687118, PCT/US2004/034440, n.° ser. EE. UU. 10/966673), 256A, 272A, 286A, 305A, 307A, 311A, 312A, 376A, 378Q, 380A, 382A, 434A (Shields et al, Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(9):6591-6604, n.° ser. EE. UU.
10/982470, patente EE. UU. n.° 6.737.056, n.° ser. EE. UU. 11/429793, n.° ser. EE. UU. 11/429786, PCT/US2005/029511, n.° ser. EE. UU. 11/208422), 252F, 252T, 252Y, 252W, 254T, 256S, 256R, 256Q, 256E, 256D, 256T, 309P, 311S, 433R, 433S, 433I, 433P, 433Q, 434H, 434F, 434Y, 252Y/254T/256E, 433K/434F/436H, 308T/309P/311 S (Dall Acqua et al. Journal of Immunology, 2002, 169:5171-5180, patente EE. UU. n.° 7.083.784, PCT/US97/03321, patente EE. UU. n.° 6.821.505, PCT/US01/48432, n.° ser. EE. UU.
11/397328), 257C, 257M, 257L, 257N, 257Y, 279E, 279Q, 279Y, inserción de Ser después de 281, 283F, 284E, 306Y, 307V, 308F, 308Y, 311V, 385H, 385N, (PCT/US2005/041220, n.° ser. EE. UU. 11/274065, n.° ser. EE. UU.
11/436.266) 204D, 284E, 285E, 286D y 290E (PCT/US2004/037929).
[0130] Las modificaciones covalentes de anticuerpos están incluidas dentro del alcance de las inmunoglobulinas descritas en el presente documento y generalmente, aunque no siempre, se realizan de forma postraduccional. Por ejemplo, se introducen en la molécula varios tipos de modificaciones covalentes del anticuerpo haciendo reaccionar residuos de aminoácidos específicos del anticuerpo con un agente de derivatización orgánico capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o con los residuos N- o C-terminales.
[0131] En algunas realizaciones, la modificación covalente de los anticuerpos descritos en el presente documento comprende la adición de uno o varios marcadores. El término "grupo de etiquetado" se refiere a cualquier etiqueta detectable. En algunas realizaciones, el grupo de etiquetado se acopla al anticuerpo mediante brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir el posible impedimento estérico. Se conocen en la técnica varios métodos para etiquetar proteínas y pueden usarse para generar inmunoglobulinas descritas en el presente documento. En general, las etiquetas se clasifican en diversas clases, según el ensayo en el que se van a detectar: a) etiquetas isotópicas, que pueden ser isótopos radiactivos o pesados; b) etiquetas magnéticas (por ejemplo, partículas magnéticas); c) fracciones activas redox; d) tintes ópticos; grupos enzimáticos (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, p-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina); e) grupos biotinilados; y f) epítopos polipeptídicos predeterminados reconocidos por un reportero secundario (p. ej., secuencias de pares de cremalleras de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metales, etiquetas de epítopos, etc.). En algunas realizaciones, el grupo de etiquetado se acopla al anticuerpo mediante brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir el posible impedimento estérico. Se conocen en la técnica varios métodos para etiquetar proteínas y pueden usarse para generar inmunoglobulinas descritas en el presente documento. Los marcadores específicos incluyen tintes ópticos, incluidos, entre otros, cromóforos, fósforos y fluoróforos, siendo estos últimos específicos en muchos casos. Los fluoróforos pueden ser flúores de "molécula pequeña" o flúores proteicos. Por "etiqueta fluorescente" se entiende cualquier molécula que pueda detectarse mediante sus propiedades fluorescentes inherentes.
Conjugados
[0132] En una realización, las inmunoglobulinas descritas en el presente documento son "proteínas de fusión" de anticuerpos, a veces denominadas en el presente documento "conjugados de anticuerpos". El compañero de fusión o el compañero conjugado puede ser proteico o no proteico; este último generalmente se genera usando grupos funcionales en el anticuerpo y en el compañero conjugado. Los compañeros conjugados y de fusión pueden ser cualquier molécula, incluyendo polipéptidos y compuestos químicos de molécula pequeña. Por ejemplo, se describen diversos conjugados de anticuerpos y métodos en Trail et al., 1999, Curr. Opin. Immunol.
11:584-588. Los posibles compañeros conjugados incluyen, entre otros, citocinas, agentes citotóxicos, toxinas, radioisótopos, agentes quimioterapéuticos, agentes antiangiogénicos, inhibidores de tirosina quinasa y otros agentes terapéuticamente activos. En algunas realizaciones, los compañeros conjugados pueden considerarse más como cargas útiles, es decir, que el objetivo de un conjugado es la administración dirigida del compañero conjugado a una célula diana, por ejemplo, una célula cancerosa o una célula inmunitaria, mediante la inmunoglobulina. Así, por ejemplo, la conjugación de una toxina con una inmunoglobulina tiene como objetivo el suministro de dicha toxina a células que expresan el antígeno diana. Como apreciará un experto en la técnica, en realidad los conceptos y definiciones de fusión y conjugado se solapan. La designación de una fusión o conjugado no pretende restringirse a ninguna realización particular descrita en el presente documento. Más bien, estos términos se usan de manera vaga para transmitir el concepto amplio de que cualquier inmunoglobulina descrita en este documento puede estar unida genéticamente, químicamente o de otro modo a uno o varios polipéptidos o moléculas para proporcionar alguna propiedad deseable.
[0133] Los conjugados adecuados incluyen, entre otros, etiquetas como las descritas a continuación, fármacos y agentes citotóxicos que incluyen, entre otros, fármacos citotóxicos (por ejemplo, agentes quimioterapéuticos) o toxinas o fragmentos activos de dichas toxinas. Las toxinas adecuadas y sus fragmentos correspondientes incluyen la cadena A de difteria, la cadena A de exotoxina, la cadena A de ricina, la cadena A de abrina, curcina, crotina, fenomicina, enomicina y similares. Los agentes citotóxicos también incluyen productos radioquímicos elaborados mediante la conjugación de radioisótopos con anticuerpos o la unión de un radionúclido a un agente quelante que se ha unido covalentemente al anticuerpo. Las realizaciones adicionales utilizan caliqueamicina, auristatinas, geldanamicina, maitansina y duocarmicinas y análogos; para esta última, véase EE. UU.
2003/0050331.
[0134] En una realización, las inmunoglobulinas descritas en el presente documento están fusionadas o conjugadas con una citocina. Por "citocina", tal como se utiliza en el presente documento, se entiende un término genérico para proteínas liberadas por una población celular que actúan sobre otra célula como mediadores intercelulares. Por ejemplo, como se describe en Penichet et al., 2001, J. Immunol. Methods 248:91-101, las citocinas pueden fusionarse con anticuerpos para proporcionar una variedad de propiedades deseables. Ejemplos de tales citocinas son las linfocinas, las monocinas y las hormonas polipeptídicas tradicionales. Entre las citocinas se incluyen la hormona del crecimiento como, por ejemplo, la hormona del crecimiento humana, la hormona del crecimiento humana N-metionil y la hormona del crecimiento bovina; la hormona paratiroidea; la tiroxina; la insulina; la proinsulina; la relaxina; la prorelaxina; las hormonas glicoproteicas tales como la hormona estimulante del folículo (FSH), la hormona estimulante de la tiroides (TSH) y la hormona luteinizante (LH); el factor de crecimiento hepático; el factor de crecimiento de fibroblastos; la prolactina; el lactógeno placentario; el factor de necrosis tumoral alfa y beta; la sustancia inhibidora de Muller; el péptido asociado a la gonadotropina de ratón; la inhibina; la activina; el factor de crecimiento vascular endotelial; la integrina; la trombopoyetina (TPO); los factores de crecimiento nervioso tales como NGF-beta; el factor de crecimiento plaquetario; los factores de crecimiento transformantes (TGF) tales como el TGF-alfa y el TGF-beta; los factores de crecimiento similares a la insulina I y II; la eritropoyetina (EPO); los factores osteoinductivos; los interferones tales como los interferones alfa, beta y gamma; los factores estimulantes de colonias (CSF) tales como los macrófagos-CSF (M-CSF); los granulocitos-macrófagos-CSF (GM-CSF); y los granulocitos-CSF (G-CSF); las interleucinas (IL) tales como IL-1, IL-1alfa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; IL-15, un factor de necrosis tumoral tal como TNF-alfa o TNF-beta; C5a; y otros factores polipeptídicos que incluyen LIF y ligando kit (KL). Tal como se utiliza en el presente documento, el término citocina incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivos celulares recombinantes, y equivalentes biológicamente activos de las citocinas de secuencia nativa.
[0135] En una realización alternativa, las inmunoglobulinas descritas en el presente documento están fusionadas, conjugadas u operativamente enlazadas a una toxina, que incluye, entre otras, toxinas de molécula pequeña y toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluidos fragmentos y/o variantes de las mismas. Por ejemplo, se describen una variedad de inmunotoxinas y métodos de inmunotoxina en Thrush et al., 1996, Ann. Rev. Immunol. 14:49-71. Las toxinas de molécula pequeña incluyen, entre otras, caliqueamicina, maitansina (EE. UU. 5.208.020), tricoteno y CC1065. En una realización, una inmunoglobulina descrita en el presente documento puede conjugarse con una o varias moléculas de maitansina (p. ej., de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 moléculas de maitansina por molécula de anticuerpo). La maitansina puede, por ejemplo, convertirse en May-SS-Me, que puede reducirse a May-SH3 y hacerse reaccionar con un anticuerpo modificado (Chari et al., 1992, Cancer Research 52: 127-131) para generar un conjugado maitansinoide-anticuerpo. Otro conjugado de interés comprende una inmunoglobulina conjugada con una o varias moléculas de caliqueamicina. La familia de antibióticos de la caliqueamicina es capaz de producir roturas de ADN de doble cadena en concentraciones subpicomolares. Los análogos estructurales de caliqueamicina que pueden usarse incluyen, entre otros, Yi1, a<2>1, a<3>, N-acetil-Yi1, PSAG y © i1 (Hinman et al., 1993, Cancer Research 53:3336-3342; Lode et al., 1998, Cancer Research 58:2925-2928) (EE. UU. 5.714.586; EE. UU. 5.712.374; EE. UU. 5.264.586; EE. UU. 5.773.001). Los análogos de dolastatina 10 tales como auristatina E (AE) y monometilauristatina E (MMAE) pueden usarse como conjugados para las inmunoglobulinas descritas en el presente documento (Doronina et al., 2003, Nat Biotechnol 21(7):778-84; Francisco et al., 2003 Blood 102(4):1458-65). Las toxinas enzimáticamente activas útiles incluyen, entre otras, la cadena A de difteria, fragmentos activos no vinculantes de toxina diftérica, la cadena A de exotoxina (dePseudomonas aeruginosa),la cadena A de ricina, la cadena A de abrina, la cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas dePhytolaca americana(PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y tricotecenos. Ver, por ejemplo, PCT WO 93/21232. Las realizaciones abarcan además un conjugado entre una inmunoglobulina descrita en el presente documento y un compuesto con actividad nucleolítica, por ejemplo, una ribonucleasa o ADN endonucleasa tal como una desoxirribonucleasa (DNasa).
[0136] En una realización alternativa, una inmunoglobulina descrita en el presente documento puede fusionarse, conjugarse o enlazarse operativamente a un radioisótopo para formar un radioconjugado. Se encuentra disponible una variedad de isótopos radiactivos para la producción de anticuerpos radioconjugados. Los ejemplos incluyen, entre otros, At211, 1131, 1125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radiactivos de Lu. Ver, por ejemplo, referencia.
[0137] En otra realización más, una inmunoglobulina descrita en el presente documento se puede conjugar con un "receptor" (por ejemplo, la estreptavidina) para su utilización en la localización previa del tumor donde el conjugado de inmunoglobulina-receptor se administra al paciente, seguido de la eliminación de la circulación del conjugado no unido usando un agente de aclaramiento y luego administrando un "ligando" (p. ej., Avidina) que se conjuga con un agente citotóxico (p. ej., un radionucleótido). En una realización alternativa, la inmunoglobulina se conjuga o se enlaza operativamente a una enzima para emplear la terapia con profármaco mediada por enzimas dependientes de anticuerpos (ADEPT). ADEPT se puede usar conjugando o enlazando operativamente la inmunoglobulina a una enzima activadora de profármaco que convierte un profármaco (por ejemplo, un agente quimioterapéutico de peptidilo, ver PCT WO 81/01145) en un fármaco anticancerígeno activo. Ver, por ejemplo, PCT WO 88/07378 y EE. UU. 4.975.278. El componente enzimático del inmunoconjugado útil para A<d>E<p>T incluye cualquier enzima capaz de actuar sobre un profármaco de tal manera que lo convierta en su forma citotóxica más activa. Las enzimas que son útiles en el método descrito en el presente documento incluyen, entre otras, fosfatasa alcalina útil para convertir profármacos que contienen fosfato en fármacos libres; arilsulfatasa útil para convertir profármacos que contienen sulfato en fármacos libres; citosina desaminasa útil para convertir 5-fluorocitosina no tóxica en el fármaco anticancerígeno 5-fluorouracilo; proteasas, tales como serratia proteasa, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (tales como catepsinas B y L), que son útiles para convertir profármacos que contienen péptidos en fármacos libres; D-alanilcarboxipeptidasas, útiles para convertir profármacos que contienen sustituyentes de D-aminoácidos; enzimas que escinden carbohidratos tales como pgalactosidasa y neuramimidasa, útiles para convertir profármacos glicosilados en fármacos libres; betalactamasa útil para convertir fármacos derivatizados con alfa-lactámicos en fármacos libres; y penicilina amidasas, tales como penicilina V amidasa o penicilina G amidasa, útiles para convertir fármacos derivatizados en sus nitrógenos de amina con grupos fenoxiacetilo o fenilacetilo, respectivamente, en fármacos libres. Alternativamente, se pueden usar anticuerpos con actividad enzimática, también conocidos en la técnica como "abzimas", para convertir los profármacos descritos en el presente documento en fármacos activos libres (ver, por ejemplo, Massey, 1987, Nature 328: 457-458). Se pueden preparar conjugados de inmunoglobulina-abzima para la administración de la abzima a una población de células tumorales. Se contemplan una variedad de conjugados adicionales para las inmunoglobulinas descritas en el presente documento. A continuación se describen una variedad de agentes quimioterapéuticos, agentes antiangiogénicos, inhibidores de tirosina quinasa y otros agentes terapéuticos, que pueden usarse como conjugados de inmunoglobulina.
[0138] Los compañeros conjugados pueden estar enlazados a cualquier región de una inmunoglobulina descrita en el presente documento, incluyendo los terminales N o C, o algún residuo entre los terminales. Una variedad de enlazadores puede usarse en las inmunoglobulinas descritas en el presente documento para enlazar covalentemente compañeros conjugados a una inmunoglobulina. Por "enlazador", "secuencia enlazadora", "espaciador", "secuencia de anclaje" o equivalentes gramaticales de los mismos, en el presente documento se entiende una molécula o grupo de moléculas (por ejemplo, un monómero o polímero) que conecta dos moléculas y a menudo sirve para colocar las dos moléculas en una configuración. Los enlazadores son conocidos en la técnica; por ejemplo, los muy conocidos enlazadores homo o heterobifuncionales (véase el catálogo de Pierce Chemical Company de 1994, sección técnica sobre agentes reticulantes, páginas 155-200). Se pueden utilizar varias estrategias para enlazar moléculas de forma covalente. Estos incluyen, entre otros, enlaces polipeptídicos entre los terminales N y C de proteínas o dominios proteicos, enlaces mediante enlaces disulfuro y enlaces mediante reactivos de entrecruzamiento químicos. En un aspecto de esta realización, el enlazador es un enlace peptídico, generado mediante técnicas recombinantes o síntesis de péptidos. El péptido enlazador puede incluir predominantemente los siguientes residuos de aminoácidos: Gly, Ser, Ala o Thr. El péptido enlazador debe tener una longitud adecuada para unir dos moléculas de tal manera que asuman la conformación correcta entre sí para que conserven la actividad deseada. Las longitudes adecuadas para este fin incluyen al menos uno y no más de 50 residuos de aminoácidos. En una realización, el enlazador tiene una longitud de aproximadamente 1 a 30 aminoácidos, por ejemplo, un enlazador puede tener una longitud de 1 a 20 aminoácidos. Los enlazadores útiles incluyen polímeros de glicina-serina (incluyendo, por ejemplo, (GS)n, (GSGGS)n (establecido como SEC ID N.°:1), (GGGGS)n (establecido como SeC ID N.°:2), y (GGGS)n (establecido como s Ec ID N.°:3), donde n es un número entero con al menos valor uno), polímeros de glicina-alanina, polímeros de alanina-serina y otros enlazadores flexibles, como apreciarán los expertos en la técnica. Alternativamente, una variedad de polímeros no proteicos, que incluyen, entre otros, polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol, polioxialquilenos o copolímeros de polietilenglicol y polipropilenglicol, pueden usarse como enlazadores.
Producción de inmunoglobulinas
[0139] También se describen en el presente documento, y son útiles para comprender la invención, métodos para producir y probar experimentalmente inmunoglobulinas. Los métodos descritos no pretenden limitar las realizaciones a ninguna aplicación o teoría de funcionamiento particular. Más bien, los métodos proporcionados pretenden ilustrar en general que se pueden producir y probar experimentalmente una o varias inmunoglobulinas para obtener inmunoglobulinas. Los métodos generales para la biología molecular, la expresión, la purificación y la detección de anticuerpos se describen en Antibody Engineering, editado por Duebel y Kontermann, Springer-Verlag, Heidelberg, 2001; y Hayhurst y Georgiou, 2001, Curr Opin Chem Biol 5:683-689; Maynard y Georgiou, 2000, Annu Rev Biomed Eng 2:339-76; Antibodies: A Laboratory Manual de Harlow y Lane, Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988.
[0140] En un aspecto útil para comprender la invención, se crean ácidos nucleicos que codifican las inmunoglobulinas y que luego pueden clonarse en células huésped, expresarse y ensayarse, si se desea. Por lo tanto, se pueden producir ácidos nucleicos, y particularmente ADN, que codifiquen cada secuencia de proteínas. Estas prácticas se llevan a cabo utilizando procedimientos bien conocidos. Por ejemplo, una variedad de métodos que pueden encontrar uso en la generación de inmunoglobulinas descritas en el presente documento se describen en Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 3a edición (Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York, 2001) y Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons). Como apreciarán los expertos en la técnica, la generación de secuencias exactas para una biblioteca que comprende un gran número de secuencias es potencialmente costosa y requiere mucho tiempo. Por "biblioteca" en el presente documento se entiende un conjunto de variantes de cualquier forma, incluyendo, entre otras, una lista de secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos, una lista de sustituciones de ácidos nucleicos o aminoácidos en posiciones variables, una biblioteca física que comprende ácidos nucleicos que codifican las secuencias de la biblioteca, o una biblioteca física que comprende las proteínas variantes, ya sea en forma purificada o no purificada. En consecuencia, existe una variedad de técnicas que pueden usarse para generar eficientemente las bibliotecas descritas en el presente documento. Dichos métodos que pueden usarse para generar inmunoglobulinas descritas en el presente documento se describen o se hace referencia a ellos en EE. UU. 6.403.312; pub. EE. UU. n.° 2002/0048772; EE. UU. 7.315.786; pub. EE. UU. n.° 2003/0130827; PCT WO 01/40091; y PCT WO 02/25588. Dichos métodos incluyen, entre otros, métodos de ensamblaje de genes, métodos basados en PCR y métodos que utilizan variaciones de PCR, métodos basados en la reacción en cadena de ligasa, métodos de oligos agrupados tales como los utilizados en el barajado sintético, métodos de amplificación propensa a errores y métodos que utilizan oligos con mutaciones aleatorias, métodos clásicos de mutagénesis dirigida, mutagénesis en casete y otros métodos de amplificación y síntesis de genes. Como se sabe en la técnica, existe una variedad de kits y métodos disponibles comercialmente para ensamblaje de genes, mutagénesis, subclonación de vectores y similares, y dichos productos comerciales se usan para generar ácidos nucleicos que codifican inmunoglobulinas.
[0141] Las inmunoglobulinas descritas en el presente documento pueden producirse cultivando una célula huésped transformada con ácido nucleico, por ejemplo, un vector de expresión, que contiene ácido nucleico que codifica las inmunoglobulinas, en las condiciones apropiadas para inducir o provocar la expresión de la proteína. Las condiciones apropiadas para la expresión variarán con la elección del vector de expresión y la célula huésped, y un experto en la técnica las determinará fácilmente mediante experimentación de rutina. Se puede utilizar una amplia variedad de células huésped apropiadas, incluyendo, entre otras, células de mamíferos, bacterias, células de insectos y levaduras. Por ejemplo, una variedad de líneas celulares que pueden usarse en la generación de inmunoglobulinas descritas en el presente documento se describen en el catálogo de líneas celulares ATCC, disponible en la American Type Culture Collection.
[0142] En un aspecto útil para comprender la invención, las inmunoglobulinas se expresan en sistemas de expresión de mamíferos, incluyendo sistemas en los que los constructos de expresión se introducen en las células de mamífero utilizando virus tales como retrovirus o adenovirus. Puede usarse cualquier célula de mamífero, por ejemplo, células humanas, de ratón, de rata, de hámster y de primate. Las células adecuadas también incluyen células de investigación conocidas, que incluyen, entre otras, células T Jurkat, células NIH3T3, CHO, BHK, COS, HEK293, PER C.6, HeLa, Sp2/0, NS0 y variantes de las mismas. En una realización alternativa, las proteínas de la biblioteca se expresan en células bacterianas. Los sistemas de expresión bacterianos son bien conocidos en la técnica e incluyenEscherichia coli (E. coli), Bacillus subtilis, Streptococcus cremorisyStreptococcus lividans.En realizaciones alternativas, las inmunoglobulinas se producen en células de insecto (por ejemplo, Sf21/Sf9, Trichoplusia ni Bti-Tn5b1-4) o células de levadura (por ejemplo, S.Cerevisiae, Pichia,etc). En una realización alternativa, las inmunoglobulinas se expresanin vitrousando sistemas de traducción libres de células. Hay disponibles sistemas de traducciónin vitroderivados de células procarióticas (por ejemplo,E. coli) y eucariotas (por ejemplo, germen de trigo, reticulocitos de conejo) y se pueden elegir en función de los niveles de expresión y las propiedades funcionales de la proteína de interés. Por ejemplo, como apreciarán los expertos en la técnica, se requiere traducciónin vitropara algunas tecnologías de visualización, por ejemplo, visualización de ribosomas. Además, las inmunoglobulinas se pueden producir por métodos químicos de síntesis. También los sistemas de expresión transgénicos tanto animales (p. ej. leche de vaca, oveja o cabra, huevos embrionados de gallina, larvas enteras de insectos, etc.) como vegetales (p. ej., maíz, tabaco, lenteja de agua, etc.)
[0143] Los ácidos nucleicos que codifican las inmunoglobulinas descritas en el presente documento como útiles para comprender la invención pueden incorporarse en un vector de expresión para expresar la proteína. Se pueden utilizar una variedad de vectores de expresión para la expresión de proteínas. Los vectores de expresión pueden comprender vectores extracromosómicos autorreplicantes o vectores que se integran en un genoma huésped. Los vectores de expresión se construyen para que sean compatibles con el tipo de célula huésped. Por lo tanto, los vectores de expresión que se usan en la generación de inmunoglobulinas descritas en el presente documento incluyen, entre otros, aquellos que permiten la expresión de proteínas en células de mamíferos, bacterias, células de insectos, levaduras y en sistemasin vitro.Como se sabe en la técnica, hay una variedad de vectores de expresión disponibles, comercialmente o de otro tipo, que pueden usarse para expresar las inmunoglobulinas descritas en el presente documento.
[0144] Los vectores de expresión normalmente comprenden una proteína operativamente enlazada con secuencias reguladoras o de control, marcadores seleccionables, cualquier compañero de fusión y/o elementos adicionales. Por "operativamente enlazado" en el presente documento se entiende que el ácido nucleico se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Generalmente, estos vectores de expresión incluyen ácido nucleico regulador transcripcional y traduccional operativamente enlazado al ácido nucleico que codifica la inmunoglobulina, y típicamente son apropiados para la célula huésped utilizada para expresar la proteína. En general, las secuencias reguladoras transcripcionales y traduccionales pueden incluir secuencias promotoras, sitios de unión ribosómica, secuencias de inicio y finalización de la transcripción, secuencias de inicio y finalización de la traducción y secuencias potenciadoras o activadoras. Como también se sabe en la técnica, los vectores de expresión normalmente contienen un gen o marcador de selección para permitir la selección de células huésped transformadas que contienen el vector de expresión. Los genes de selección son bien conocidos en la técnica y variarán según la célula huésped utilizada.
[0145] Las inmunoglobulinas pueden estar operativamente enlazadas a un compañero de fusión para permitir el direccionamiento de la proteína expresada, la purificación, el cribado, la visualización y similares. Los compañeros de fusión pueden unirse a la secuencia de inmunoglobulina mediante secuencias enlazadoras. La secuencia enlazadora comprenderá generalmente un pequeño número de aminoácidos, típicamente menos de diez, aunque también se pueden usar enlazadores más largos. Normalmente, las secuencias enlazadoras se seleccionan para ser flexibles y resistentes a la degradación. Como apreciarán los expertos en la técnica, se puede utilizar como enlazador cualquiera entre una amplia variedad de secuencias. Por ejemplo, una secuencia enlazadora común comprende la secuencia de aminoácidos GGGGS. Un compañero de fusión puede ser una secuencia señal o de dirección que dirige la inmunoglobulina y cualquier compañero de fusión asociado a una ubicación celular deseada o al medio extracelular. Como se sabe en la técnica, ciertas secuencias de señalización pueden apuntar a una proteína para ser secretada en el medio de crecimiento o en el espacio periplásmico, ubicado entre las membranas interna y externa de la célula. Un compañero de fusión también puede ser una secuencia que codifica un péptido o proteína que permite la purificación y/o el cribado. Dichos compañeros de fusión incluyen, entre otros, etiquetas de polihistidina (etiquetas His) (por ejemplo, H6 y H10 u otras etiquetas para usar con sistemas de cromatografía de afinidad por metales inmovilizados (IMAC) (p. ej., columnas de afinidad Ni+2)), fusiones de GST, fusiones de MBP, etiqueta Strep, la secuencia diana de biotinilación de BSP de la enzima bacteriana BirA y etiquetas de epítopos a las que se apuntan anticuerpos (por ejemplo, etiquetas c-myc, etiquetas de bandera y similares). Como apreciarán los expertos en la técnica, dichas etiquetas pueden ser útiles para la purificación, el cribado o ambos. Por ejemplo, se puede purificar una inmunoglobulina usando una etiqueta His inmovilizándola en una columna de afinidad de Ni+2 y luego, después de la purificación, se puede usar la misma etiqueta His para inmovilizar el anticuerpo en una placa recubierta de Ni+2 para realizar un ELISA u otro ensayo de unión (como se describe a continuación). Un compañero de fusión puede permitir el uso de un método de selección para cribar inmunoglobulinas (ver más adelante). Los compañeros de fusión que permiten una variedad de métodos de selección son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, fusionando los miembros de una biblioteca de inmunoglobulinas con la proteína del gen III, se puede emplear la visualización en fagos (Kay et al., Phage display of peptides and proteins: a laboratory manual, Academic Press, San Diego, CA, 1996; Lowman et al., 1991, Biochemistry 30:10832-10838; Smith, 1985, Science 228:1315-1317). Los compañeros de fusión pueden habilitar el etiquetado de inmunoglobulinas. Alternativamente, un compañero de fusión puede unirse a una secuencia específica en el vector de expresión, permitiendo que el compañero de fusión y la inmunoglobulina asociada se enlacen de forma covalente o no covalente con el ácido nucleico que los codifica. Los métodos para introducir ácido nucleico exógeno en células huésped son bien conocidos en la técnica y variarán según la célula huésped utilizada. Las técnicas incluyen, entre otras, transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato cálcico, tratamiento con cloruro de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, infección vírica o de fagos, encapsulación de(los) polinucleótido(s) en liposomas y microinyección directa del ADN en los núcleos. En el caso de células de mamíferos, la transfección puede ser transitoria o estable.
[0146] En una realización, las inmunoglobulinas se purifican o aíslan después de la expresión. Las proteínas se pueden aislar o purificar de diversas formas conocidas por los expertos en la técnica. Los métodos de purificación estándar incluyen técnicas cromatográficas, que incluyen intercambio iónico, interacción hidrófoba, afinidad, filtración por tamaño o por gel, y fase inversa, realizadas a presión atmosférica o a alta presión utilizando sistemas como FPLC y HPLC. Los métodos de purificación también incluyen técnicas electroforéticas, inmunológicas, de precipitación, de diálisis y de cromatoenfoque. También son útiles las técnicas de ultrafiltración y diafiltración, junto con la concentración de proteínas. Como es bien sabido en la técnica, una variedad de proteínas naturales se une a la Fc y a los anticuerpos, y estas proteínas pueden usarse para la purificación de las inmunoglobulinas descritas en el presente documento. Por ejemplo, las proteínas bacterianas A y G se unen a la región Fc. Asimismo, la proteína bacteriana L se une a la región Fab de algunos anticuerpos, al igual que, por supuesto, lo hace el antígeno diana del anticuerpo. La purificación a menudo puede ser habilitada por un compañero de fusión en particular. Por ejemplo, las inmunoglobulinas se pueden purificar usando resina de glutatión si se emplea una fusión GST, cromatografía de afinidad Ni+2 si se emplea una etiqueta His o anticuerpo anti-flag inmovilizado si se usa una etiqueta-bandera. Para obtener orientación general sobre técnicas de purificación adecuadas, consulte, p. ej., Protein Purification: Principles and Practice, 3a edición, Scopes, Springer-Verlag, NY, 1994. El grado de purificación necesario variará dependiendo del cribado o el uso de las inmunoglobulinas. En algunos casos no es necesaria ninguna purificación. Por ejemplo, en una realización, si las inmunoglobulinas se secretan, el cribado puede tener lugar directamente desde el medio. Como es bien conocido en la técnica, algunos métodos de selección no involucran a la purificación de proteínas.
Así, por ejemplo, si una biblioteca de inmunoglobulinas se convierte en una biblioteca de presentación en fagos, es posible que no se realice la purificación de proteínas.
Experimentación in vitro
[0147] Las inmunoglobulinas se pueden cribar utilizando una variedad de métodos, incluidos, entre otros, aquellos que utilizan ensayosin vitro,ensayosin vivoy basados en células, y tecnologías de selección. En los procedimientos de cribado se pueden utilizar tecnologías de cribado de alto rendimiento y automatización. El cribado puede emplear un compañero de fusión o una etiqueta. El uso de compañeros de fusión se ha discutido anteriormente. Por "etiquetado" en el presente documento se entiende que las inmunoglobulinas descritas en el presente documento tienen uno o varios elementos, isótopos o compuestos químicos unidos para permitir la detección en un cribado. En general, las etiquetas se dividen en tres clases: a) etiquetas inmunes, que pueden ser un epítopo incorporado como compañero de fusión que es reconocido por un anticuerpo, b) etiquetas isotópicas, que pueden ser isótopos radiactivos o pesados y c) etiquetas de moléculas pequeñas, que pueden incluir tintes fluorescentes y colorimétricos, o moléculas como la biotina que permiten otros métodos de etiquetado. Las etiquetas pueden incorporarse al compuesto en cualquier posición y pueden incorporarsein vitro o in vivodurante la expresión de proteínas.
[0148] En una realización, las propiedades funcionales y/o biofísicas de las inmunoglobulinas se analizan en un ensayoin vitro.Los ensayosin vitropueden permitir un amplio rango dinámico para cribar propiedades de interés. Las propiedades de las inmunoglobulinas que pueden seleccionarse incluyen, entre otras, estabilidad, solubilidad y afinidad por ligandos de Fc, por ejemplo FcyR. Pueden cribarse múltiples propiedades simultánea o individualmente. Las proteínas pueden estar purificadas o sin purificadas, dependiendo de los requisitos del ensayo. En una realización, el cribado es un ensayo de unión cualitativo o cuantitativo para la unión de inmunoglobulinas a una molécula proteica o no proteica que se sabe o se cree que se une a la inmunoglobulina. En una realización, el cribado es un ensayo de unión para medir la unión al antígeno diana. En una realización alternativa, el cribado es un ensayo para la unión de inmunoglobulinas a un ligando de Fc, que incluye, entre otros, la familia de FcyR, el receptor neonatal FcRn, la proteína del complemento C1q y las proteínas bacterianas A y G. Dichos ligandos de Fc pueden proceder de cualquier organismo. En una realización, los ligandos de Fc proceden de humanos, ratones, ratas, conejos y/o monos. Los ensayos de unión se pueden llevar a cabo utilizando una variedad de métodos conocidos en la técnica, incluyendo, entre otros, ensayos basados en FRET (transferencia de energía por resonancia de fluorescencia) y BRET (transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia), AlphaScreen™ (ensayo homogéneo de proximidad luminiscente amplificado), ensayo de proximidad de centelleo, ELISA (ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima), SPR (resonancia de plasmón de superficie, también conocida como BIACORE®), calorimetría de titulación isotérmica, calorimetría diferencial de barrido, electroforesis en gel y cromatografía, incluyendo la filtración en gel. Estos y otros métodos pueden aprovechar algún compañero de fusión o etiqueta de la inmunoglobulina. Los ensayos pueden emplear una variedad de métodos de detección que incluyen, entre otros, etiquetas cromogénicas, fluorescentes, luminiscentes o isotópicas.
[0149] Las propiedades biofísicas de las inmunoglobulinas, por ejemplo la estabilidad y la solubilidad, pueden examinarse usando una variedad de métodos conocidos en la técnica. La estabilidad de las proteínas se puede determinar midiendo el equilibrio termodinámico entre los estados plegados y desplegados. Por ejemplo, las inmunoglobulinas descritas en el presente documento pueden desplegarse usando desnaturalizante químico, calor o pH, y esta transición puede monitorizarse usando métodos que incluyen, entre otros, espectroscopia de dicroísmo circular, espectroscopia de fluorescencia, espectroscopia de absorbancia, espectroscopia de RMN, calorimetría y proteólisis. Como apreciarán los expertos en la técnica, los parámetros cinéticos de las transiciones de plegado y desplegado también pueden controlarse usando estas y otras técnicas. La solubilidad y la integridad estructural general de una inmunoglobulina se pueden determinar cuantitativa o cualitativamente usando una amplia gama de métodos conocidos en la técnica. Los métodos que pueden usarse para caracterizar las propiedades biofísicas de las inmunoglobulinas descritas en el presente documento incluyen electroforesis en gel, enfoque isoeléctrico, electroforesis capilar, cromatografía, por ejemplo, cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa, mapeo de péptidos, mapeo de oligosacáridos, espectrometría de masas, espectroscopia de absorbancia ultravioleta, espectroscopia de fluorescencia, espectroscopia de dicroísmo circular, calorimetría de titulación isotérmica, calorimetría diferencial de barrido, ultracentrifugación analítica, dispersión dinámica de luz, proteólisis y reticulación, medición de turbidez, ensayos de retardo de filtro, ensayos inmunológicos, ensayos de unión de colorantes fluorescentes, ensayos de tinción de proteínas, microscopía y detección de agregados mediante ELISA u otro ensayo de unión. También puede resultar útil el análisis estructural que emplea técnicas cristalográficas de rayos X y espectroscopia de RMN. En una realización, la estabilidad y/o la solubilidad se pueden medir determinando la cantidad de solución proteica después de un período de tiempo definido. En este ensayo, la proteína puede estar expuesta o no a alguna condición extrema, por ejemplo temperatura elevada, pH bajo o la presencia de desnaturalizante. Debido a que la función normalmente requiere una proteína estable, soluble y/o bien plegada/estructurada, los ensayos funcionales y de unión antes mencionados también proporcionan formas de realizar dicha medición. Por ejemplo, podría ensayarse una solución que comprende una inmunoglobulina para determinar su capacidad para unirse al antígeno diana, luego exponerse a temperatura elevada durante uno o varios períodos de tiempo definidos y luego ensayarse nuevamente para determinar la unión al antígeno. Debido a que no se espera que la proteína desplegada y agregada sea capaz de unirse al antígeno, la cantidad de actividad restante proporciona una medida de la estabilidad y solubilidad de la inmunoglobulina.
[0150] En una realización, la biblioteca se criba usando uno o varios ensayos basados en células oin vitro.Para dichos ensayos, normalmente se añaden de forma exógena inmunoglobulinas, purificadas o no purificadas, de modo que las células se exponen a variantes individuales o grupos de variantes que pertenecen a una biblioteca. Estos ensayos se basan típicamente, pero no siempre, en la biología de la capacidad de la inmunoglobulina para unirse al antígeno diana y mediar algún evento bioquímico, por ejemplo funciones efectoras como lisis celular, fagocitosis, inhibición de la unión de ligando/receptor, inhibición del crecimiento y/o la proliferación, apoptosis y similares. Dichos ensayos a menudo implican monitorizar la respuesta de las células a la inmunoglobulina, por ejemplo, supervivencia celular, muerte celular, fagocitosis celular, lisis celular, cambio en la morfología celular o activación transcripcional como, por ejemplo, la expresión celular de un gen natural o gen reportero. Por ejemplo, dichos ensayos pueden medir la capacidad de las inmunoglobulinas para provocar ADCC, ADCP o CDC. Para algunos ensayos, puede ser necesario añadir células o componentes adicionales, es decir, además de las células diana, por ejemplo, complemento sérico o células efectoras tales como monocitos de sangre periférica (PBMC), células NK, macrófagos y similares. Dichas células adicionales pueden provenir de cualquier organismo, por ejemplo, humanos, ratones, ratas, conejos y monos. Los anticuerpos reticulados o monoméricos pueden provocar la apoptosis de determinadas líneas celulares que expresan el antígeno diana del anticuerpo, o pueden mediar el ataque a las células diana por parte de células inmunitarias que se han añadido al ensayo. Los métodos para monitorizar la muerte o la viabilidad celulares se conocen en la técnica e incluyen el uso de tintes, fluoróforos y reactivos inmunoquímicos, citoquímicos y radiactivos. Por ejemplo, los ensayos de caspasa o los conjugados de anexina-flúor pueden permitir medir la apoptosis, y la absorción o liberación de sustratos radiactivos (por ejemplo, ensayos de liberación de cromo-51) o la reducción metabólica de tintes fluorescentes como el azul de alamar pueden permitir la monitorización del crecimiento, la proliferación o la activación celulares. En una realización, se utiliza el ensayo de citotoxicidad basado en EuTDA DELFIA® (Perkin Elmer, MA). Alternativamente, se pueden controlar las células diana muertas o dañadas midiendo la liberación de una o varias proteínas intracelulares naturales, por ejemplo lactato deshidrogenasa. La activación transcripcional también puede servir como método para ensayar la función en ensayos celulares. En este caso, la respuesta puede monitorizarse ensayando genes o proteínas naturales que pueden estar reguladas al alza o a la baja, por ejemplo, puede medirse la liberación de ciertas interleucinas o, alternativamente, la lectura puede realizarse mediante una luciferasa o un constructo GFP-reportero. Los ensayos basados en células también pueden implicar la medición de cambios morfológicos de las células como respuesta a la presencia de una inmunoglobulina. Los tipos de células para dichos ensayos pueden ser procariotas o eucariotas, y se pueden emplear una variedad de líneas celulares conocidas en la técnica. Alternativamente, los cribados basados en células se realizan utilizando células que han sido transformadas o transfectadas con ácidos nucleicos que codifican las inmunoglobulinas.
[0151] Los ensayosin vitroincluyen, entre otros, ensayos de unión, ADCC, CDC, citotoxicidad, proliferación, liberación de peróxido/ozono, quimiotaxis de células efectoras, inhibición de dichos ensayos mediante anticuerpos con función efectora reducida; rangos de actividades tales como una mejora >100x o una reducción >100x, combinaciones de activación de receptores y los resultados de los ensayos que se esperan de dichos perfiles de receptores.
Experimentación in vivo
[0152] Las propiedades biológicas de las inmunoglobulinas descritas en el presente documento se pueden caracterizar en experimentos con células, tejidos y organismos completos. Como se sabe en la técnica, los fármacos a menudo se prueban en animales, incluidos, entre otros, ratones, ratas, conejos, perros, gatos, cerdos y monos, con el fin de medir la eficacia de un fármaco para el tratamiento contra una enfermedad o modelo de enfermedad o para medir la farmacocinética, la toxicidad y otras propiedades de un fármaco. Dichos animales pueden denominarse modelos de enfermedades. Con respecto a las inmunoglobulinas descritas en el presente documento, surge un desafío particular cuando se usan modelos animales para evaluar el potencial de eficacia en humanos de los polipéptidos candidatos; esto se debe, al menos en parte, al hecho de que las inmunoglobulinas que tienen un efecto específico sobre la afinidad por un receptor Fc humano puede no tener un efecto de afinidad similar con el receptor animal ortólogo. Estos problemas pueden verse exacerbados aún más por las inevitables ambigüedades asociadas con la asignación correcta de ortólogos verdaderos (Mechetina et al., Immunogenetics, 2002 54:463-468), y el hecho de que algunos ortólogos simplemente no existen en el animal (por ejemplo, los humanos poseen una FcyRlla mientras que los ratones no). Las terapias a menudo se prueban en ratones, incluidas, entre otras, cepas de ratón NZB, NOD, BXSB, MRL/Ipr, K/BxN y transgénicas (incluidos knockins y knockouts). Dichos ratones pueden desarrollar diversas afecciones autoinmunes que se asemejan a patologías de enfermedades inflamatorias o autoinmunes sistémicas específicas de órganos humanos, como el lupus eritematoso sistémico (LES) y la artritis reumatoide (AR). Por ejemplo, una inmunoglobulina descrita en el presente documento destinada a enfermedades autoinmunes se puede probar en dichos modelos de ratón tratando a los ratones para determinar la capacidad de la inmunoglobulina para reducir o inhibir el desarrollo de la patología de la enfermedad. Debido a la incompatibilidad entre el sistema receptor de Fcy humano y de ratón, un enfoque alternativo es utilizar un modelo SCID murino en el que a ratones inmunodeficientes se les injertan PBL o PBMC humanos (huPBL-SCID, huPBMC-SCID) que proporcionan un sistema inmunológico humano semifuncional con células efectoras humanas y receptores Fc. En dicho modelo, un desafío antigénico (como el toxoide tetánico) activa las células B para que se diferencien en células plasmáticas y secreten inmunoglobulinas, reconstituyendo así la inmunidad humoral específica del antígeno. Por lo tanto, se puede probar una inmunoglobulina de doble diana descrita en el presente documento que se une específicamente a un antígeno (por ejemplo, CD19 o CD79a/b) y a FcYRIIb en las células B para examinar la capacidad de inhibir específicamente la diferenciación de las células B. Dicha experimentación puede proporcionar datos significativos para la determinación del potencial de dicha inmunoglobulina para el uso terapéutico. También pueden usarse otros organismos para las pruebas, por ejemplo, mamíferos. Por ejemplo, debido a su similitud genética con los humanos, los monos pueden ser modelos terapéuticos adecuados y, por tanto, pueden usarse para probar la eficacia, la toxicidad, la farmacocinética u otras propiedades de las inmunoglobulinas descritas en el presente documento. En última instancia, se requieren las pruebas de las inmunoglobulinas descritas en el presente documento en humanos para su aprobación como fármacos y, de este modo, por supuesto, se contemplan estos experimentos. Por lo tanto, las inmunoglobulinas descritas en el presente documento pueden probarse en humanos para determinar su eficacia terapéutica, su toxicidad, su farmacocinética y/u otras propiedades clínicas.
[0153] Las inmunoglobulinas descritas en el presente documento pueden conferir un rendimiento superior a las terapias que contienen Fc en modelos animales o en humanos. Los perfiles de unión al receptor de dichas inmunoglobulinas, como se describen en esta especificación, pueden seleccionarse, por ejemplo, para aumentar la potencia de fármacos citotóxicos o para apuntar a funciones efectoras específicas o células efectoras para mejorar la selectividad de la acción del fármaco. Además, se pueden seleccionar perfiles de unión al receptor que pueden reducir algunas o todas las funciones efectoras, reduciendo así los efectos secundarios o la toxicidad de dicho fármaco que contiene la Fc. Por ejemplo, se puede seleccionar una inmunoglobulina con unión reducida a FcyRllla, FcyRI y FcyRlla para eliminar la mayoría de las funciones efectoras mediadas por células, o se puede seleccionar una inmunoglobulina con unión reducida a C1q para limitar las funciones efectoras mediadas por complemento. En algunos contextos, se sabe que dichas funciones efectoras tienen posibles efectos tóxicos. Por lo tanto, eliminarlas puede aumentar la seguridad del fármaco que lleva la Fc y dicha seguridad mejorada puede caracterizarse en modelos animales. En algunos contextos, se sabe que dichas funciones efectoras median en la actividad terapéutica deseable. Por lo tanto, mejorarlas puede aumentar la actividad o potencia del fármaco que lleva la Fc y dicha actividad o potencia mejoradas pueden caracterizarse en modelos animales.
[0154] En algunas realizaciones, se puede evaluar la eficacia de las inmunoglobulinas descritas en el presente documento en modelos animales clínicamente relevantes de diversas enfermedades humanas. En muchos casos, los modelos relevantes incluyen varios animales transgénicos para antígenos y receptores específicos.
[0155] Se podrían usar modelos transgénicos relevantes, como aquellos que expresan receptores Fc humanos (por ejemplo, CD32b), para evaluar y probar la eficacia de inmunoglobulinas y fusiones de Fc. La evaluación de inmunoglobulinas mediante la introducción de genes humanos que median directa o indirectamente la función efectora en ratones u otros roedores puede permitir estudios fisiológicos de eficacia en trastornos autoinmunes y AR. Los receptores Fc humanos como FcYRIIb pueden poseer polimorfismos como el del promotor génico (-343 de G a C) o el dominio transmembrana del receptor 187 I o T, lo que permitiría además la introducción de polimorfismos humanos específicos y combinaciones en roedores. Los diversos estudios que involucran FcR específicos de polimorfismo no se limitan a esta sección, sin embargo, abarcan todas las discusiones y aplicaciones de FcR en general como se especifica a lo largo de esta solicitud. Las inmunoglobulinas descritas en el presente documento pueden conferir una actividad superior a los fármacos que contienen Fc en dichos modelos transgénicos; en particular, las variantes con perfiles de unión optimizados para la actividad mediada por FcYRIIb humano pueden mostrar una actividad superior en ratones transgénicos CD32b. Se pueden observar mejoras similares en la eficacia en ratones transgénicos para otros receptores Fc humanos, por ejemplo, FcyRlla, FcyRI, etc., para inmunoglobulinas con perfiles de unión optimizados para los respectivos receptores. Los ratones transgénicos para múltiples receptores humanos mostrarían una actividad mejorada para las inmunoglobulinas con perfiles de unión optimizados para los correspondientes múltiples receptores.
[0156] Debido a las dificultades y ambigüedades asociadas con el uso de modelos animales para caracterizar la eficacia potencial de anticuerpos terapéuticos candidatos en un paciente humano, algunos polipéptidos variantes descritos en el presente documento pueden usarse como sustitutos para evaluar la eficacia potencial en humanos. Dichas moléculas sustitutas pueden imitar (en el sistema animal) el FcR y/o la biología del complemento de una inmunoglobulina humana candidata correspondiente. Es más probable que este mimetismo se manifieste por afinidades de asociación relativas entre inmunoglobulinas específicas y receptores animales frente a humanos. Por ejemplo, si se estuviera usando un modelo de ratón para evaluar la eficacia potencial en humanos de una variante de Fc que tiene afinidad reducida por el FcyRllb humano inhibidor, una variante sustituta apropiada habría reducido la afinidad por el FcyRII de ratón. También cabe señalar que las variantes de Fc sustitutas podrían crearse en el contexto de una variante de Fc humana, una variante de Fc animal o ambas.
[0157] En una realización, la prueba de inmunoglobulinas puede incluir un estudio de eficacia en primates (por ejemplo, modelo de mono cynomolgus) para facilitar la evaluación de la reducción y/o el agotamiento de células diana específicas que albergan el antígeno diana. Los modelos de primates adicionales incluyen, entre otros, el uso del mono rhesus para evaluar los polipéptidos Fc en estudios terapéuticos de enfermedades autoinmunes, trasplantes y cáncer.
[0158] Se realizan estudios de toxicidad para determinar los efectos relacionados con los anticuerpos o la fusión de Fc que no pueden evaluarse en perfiles farmacológicos estándar o que ocurren solo después de la administración repetida del agente. La mayoría de las pruebas de toxicidad se realizan en dos especies (una de roedor y una de no roedor) para garantizar que no se pase por alto ningún efecto adverso inesperado antes de que se introduzcan nuevas entidades terapéuticas en el ser humano. En general, estos modelos pueden medir una variedad de toxicidades, incluida la genotoxicidad, la toxicidad crónica, la inmunogenicidad, la toxicidad para la reproducción/desarrollo y la carcinogenicidad. Dentro de los parámetros antes mencionados se incluyen la medición estándar del consumo de alimentos, el peso corporal, la formación de anticuerpos, la química clínica y el examen macro y microscópico de órganos/tejidos estándar (por ejemplo, cardiotoxicidad). Los parámetros de medición adicionales son el traumatismo en el lugar de la inyección y la medición de anticuerpos neutralizantes, si los hubiera. Tradicionalmente, los tratamientos con anticuerpos monoclonales, desnudos o conjugados, se evalúan en cuanto a reactividad cruzada con tejidos normales, inmunogenicidad/producción de anticuerpos, toxicidad del conjugado o enlazador y toxicidad "colateral" de especies radiomarcadas. No obstante, es posible que dichos estudios deban individualizarse para abordar inquietudes específicas y seguir las pautas establecidas por ICH S6 (estudios de seguridad para productos biotecnológicos, también mencionado anteriormente). Como tal, los principios generales consisten en que los productos estén suficientemente bien caracterizados, que se hayan eliminado las impurezas/contaminantes, que el material de prueba sea comparable durante todo el desarrollo y que se mantenga el cumplimiento de las BPL.
[0159] La farmacocinética (PK) de las inmunoglobulinas descritas en el presente documento se puede estudiar en una variedad de sistemas animales, siendo los más relevantes los primates no humanos como los monos cynomolgus y rhesus. Se puede evaluar la semivida (de días a semanas) de las administraciones intravenosas/subcutáneas únicas o repetidas en un rango de dosis de 6000 veces (0.05-300 mg/kg) utilizando la concentración y el aclaramiento plasmáticos. También se puede medir el volumen de distribución en estado estacionario y el nivel de absorbancia sistémica. Los ejemplos de dichos parámetros de medición generalmente incluyen la concentración plasmática máxima observada (Cmax), el tiempo para alcanzar la Cmax (Tmax), el área bajo la curva de concentración plasmática-tiempo desde el tiempo 0 hasta el infinito [AUC(0-inf] y la semivida de eliminación aparente (T1/2). Los parámetros medidos adicionales podrían incluir el análisis compartimental de los datos de concentración-tiempo obtenidos después de la administración intravenosa y la biodisponibilidad. Se han establecido ejemplos de estudios farmacológicos/toxicológicos utilizando monos cynomolgus para Rituxan y Zevalin en los que los anticuerpos monoclonales contra CD20 tienen reactividad cruzada. También se pueden realizar estudios de biodistribución, dosimetría (para anticuerpos radiomarcados) y farmacocinética en modelos de roedores. Dichos estudios evaluarían la tolerancia a todas las dosis administradas, la toxicidad para los tejidos locales, la localización preferencial en modelos animales de xenoinjerto de roedores y la reducción y/o agotamiento de las células diana (por ejemplo, células CD20 positivas).
[0160] Las inmunoglobulinas descritas en el presente documento pueden conferir una farmacocinética superior a las terapias que contienen Fc en sistemas animales o en humanos. Por ejemplo, una mayor unión a FcRn puede aumentar la semivida y la exposición del fármaco que contiene Fc. Alternativamente, la disminución de la unión a FcRn puede disminuir la semivida y la exposición del fármaco que contiene Fc en los casos en los que la exposición reducida es favorable, como cuando dicho fármaco tiene efectos secundarios.
[0161] Se sabe en la técnica que la serie de receptores Fc se expresa diferencialmente en diversos tipos de células inmunitarias, así como en diferentes tejidos. La distribución tisular diferencial de los receptores Fc puede, en última instancia, tener un impacto en las propiedades farmacodinámicas (PD) y farmacocinéticas (PK) de las inmunoglobulinas descritas en el presente documento. Debido a que las inmunoglobulinas de la presentación tienen afinidades variables por la serie de receptores Fc, un cribado adicional de los polipéptidos para detectar propiedades de PD y/o PK puede ser extremadamente útil para definir el equilibrio óptimo de PD, PK y la eficacia terapéutica conferida por cada polipéptido candidato.
[0162] Los estudios farmacodinámicos pueden incluir, entre otros, apuntar a células específicas o bloquear mecanismos de señalización, medir la inhibición de anticuerpos específicos de antígeno, etc. Las inmunoglobulinas descritas en el presente documento pueden apuntar a poblaciones de células efectoras particulares y, por lo tanto, dirigir los fármacos que contienen Fc a fin de inducir ciertas actividades para mejorar la potencia o aumentar la penetración en un compartimento fisiológico particularmente favorable. Por ejemplo, la actividad y la localización de los neutrófilos pueden estar dirigidas por una inmunoglobulina que apunta a FcyRlllb. Estos efectos farmacodinámicos pueden demostrarse en modelos animales o en humanos.
Uso clínico
[0163] Las inmunoglobulinas descritas en el presente documento pueden usarse en una amplia gama de productos. Una inmunoglobulina descrita en el presente documento se usa en el tratamiento de una enfermedad relacionada con IgG4 en un sujeto. Las inmunoglobulinas pueden usarse en una composición monoclonal o policlonal. Las inmunoglobulinas descritas en el presente documento pueden usarse con fines terapéuticos.
[0164] Un "paciente" para los fines descritos en el presente documento incluye tanto humanos como otros animales, por ejemplo, otros mamíferos. Por tanto, las inmunoglobulinas descritas en el presente documento tienen aplicaciones tanto terapéuticas en humanos como veterinarias. El término "tratamiento" o "tratar" como se describe en el presente documento pretende incluir el tratamiento terapéutico, así como medidas profilácticas o supresoras para una enfermedad o trastorno. Así, por ejemplo, la administración exitosa de una inmunoglobulina antes del inicio de la enfermedad da como resultado el tratamiento de la enfermedad. En otro ejemplo, la administración exitosa de una inmunoglobulina optimizada después de la manifestación clínica de la enfermedad para combatir los síntomas de la enfermedad comprende el tratamiento de la enfermedad. "Tratamiento" y "tratar" también abarcan la administración de una inmunoglobulina optimizada después de la aparición de la enfermedad con el fin de erradicar la enfermedad. La administración exitosa de un agente después del inicio y después de que se hayan desarrollado los síntomas clínicos, con posible disminución de los síntomas clínicos y quizás mejora de la enfermedad, comprende el tratamiento de la enfermedad. Aquellos que "necesitan tratamiento" incluyen mamíferos que ya padecen la enfermedad o trastorno, así como aquellos propensos a padecer la enfermedad o trastorno, incluidos aquellos en los que se debe prevenir la enfermedad o trastorno.
[0165] Las inmunoglobulinas descritas en el presente documento se pueden usar para tratar enfermedades relacionadas con la IgG4 (también denominadas "IgG4-RD"). IgG4-RD también se conoce o se denomina enfermedad sistémica relacionada con la IgG4 (IgG4-RSD), enfermedad esclerosante relacionada con la IgG4, enfermedad esclerosante sistémica relacionada con la IgG4, enfermedad autoinmune relacionada con la IgG4, fibrosis sistémica multifocal asociada con la IgG4, enfermedad asociada con la IgG4, síndrome de IgG4, síndrome IgG4, enfermedad híper-IgG4, síndrome plasmocítico sistémico relacionado con la IgG4, síndrome linfoproliferativo multiorgánico positivo para IgG4 (síndrome linfoproliferativo multiorgánico relacionado con la IgG4 (IgG4-MOLPS)), síndrome esclerosante sistémico relacionado con la IgG4, fibroesclerosis multifocal y fibroesclerosis idiopática multifocal.
[0166] La IgG4-RD es una afección inflamatoria sistémica que puede afectar a cualquier sistema de órganos. Las inmunoglobulinas descritas en el presente documento también se pueden usar para tratar manifestaciones de la IgG4-RD o enfermedades relacionadas con la IgG4-RD. Los ejemplos no limitantes de manifestaciones relacionadas con la IgG4-RD y/o enfermedades relacionadas con la IgG4-RD incluyen: sialoadenitis relacionada con la IgG4 (sialoadenitis esclerosante crónica, tumor de Küttner, enfermedad de Mikulicz), dacrioadenitis relacionada con la IgG4 (enfermedad de Mikulicz), enfermedad oftálmica relacionada con la IgG4 (enfermedad inflamatoria orbitaria idiopática, pseudotumor orbitario), sinusitis crónica, fibrosis angiocéntrica eosinofílica, hipofisitis relacionada con la IgG4 (panhipofisitis relacionada con la IgG4, adenohipofisitis relacionada con la IgG4, infundibuloneurohipofisitis relacionada con la IgG4, hipofisitis autoinmune), paquimeningitis relacionada con la IgG4, leptomeningitis relacionada con la IgG4 (paquimeningitis hipertrófica idiopática), pancreatitis relacionada con la IgG4 (pancreatitis autoinmune tipo 1, pA i relacionada con la IgG4, pancreatitis esclerosante linfoplasmocitaria, pancreatitis crónica con estrechamiento irregular difuso del conducto pancreático principal), enfermedad pulmonar relacionada con la IgG4 (pseudotumor inflamatorio pulmonar), pleuritis relacionada con la IgG4, hepatopatía relacionada con la IgG4, colangitis esclerosante relacionada con la IgG4, colecistitis relacionada con la IgG4, aortitis relacionada con la IgG4 (aneurisma aórtico inflamatorio), periaortitis relacionada con la IgG4 (periaortitis crónica), periarteritis relacionada con la IgG4, pericarditis relacionada con la IgG4, mediastinitis relacionada con la IgG4 (mediastinitis fibrosante), fibrosis retroperitoneal relacionada con la IgG4 (fibrosis retroperitoneal, síndrome de Albarran-Ormond, enfermedad de Ormond (fibrosis retroperitoneal)), fascitis perineal, fascitis/sindrome Gerota, periureteritis fibrosa, lipogranuloma esclerosante, granuloma retroperitoneal esclerosante, inflamación retroperitoneal no específica, retroperitonitis esclerosante, vasculitis retroperitoneal con fibrosis perivascular), mesenteritis relacionada con la IgG4 (los subtipos son: panniculitis mesentéric, lipodistrofia mesentérica y mesenteritis retráctil) (mesenteritis esclerosante, panniculitis nodular sistémica, mesenteritis lipoesclerótica, enfermedad de Weber-Christian mesentérica, lipogranuloma mesentérico, mesenteritis xantogranulomatosa), mastitis relacionada con la IgG4 (mastitis esclerosante), enfermedad renal relacionada con la IgG4 (IgG4-RKD), nefritis tubulointersticial relacionada con la IgG4 (IgG4-TIN), glomerulonefritis membranosa relacionada con la IgG4 (nefritis tubulointersticial idiopática), prostatitis relacionada con la IgG4, fibrosis perivasal relacionada con la IgG4 (orquialgia crónica), pseudotumor paratesticular relacionado con la IgG4, epididimoorquitis relacionada con la IgG4 (pseudotumor fibroso paratesticular, pseudotumor inflamatorio del cordón espermático, proliferaciones miofibroblasticas pseudosarcomatosas del cordón espermático, funiculitis proliferativa, periorquitis proliferativa crónica, periorquitis fibromatosa , periorquitis nodular, periorquitis reactiva, mesotelioma fibroso), linfadenopatía relacionada con la IgG4, enfermedad de la piel relacionada con la IgG4 (hiperplasia angiolinfoide con eosinofilia, pseudolinfoma cutáneo), enfermedad perineural relacionada con la IgG4, y enfermedad de tiroides relacionada con la IgG4 (tiroiditis de Reidel), fibrosis angiocéntrica eosinofílica (que afecta a las órbitas y al tracto respiratorio superior), pseudotumor inflamaftorio y fibrosclerosis multifocal.
[0167] Más específicamente, en algunas realizaciones, las inmunoglobulinas descritas en el presente documento se pueden usar para tratar la pancreatitis autoinmune (pancreatitis esclerosante linfoplasmocitaria), la fibrosis angiocéntrica eosinofílica (que afecta a las órbitas y al tracto respiratorio superior), la mediastinitis fibrosante, la paquimeningitis hipertrófica idiopática, la nefritis tubulointersticial idiopática, el pseudotumor inflamatorio, el tumor del Küttner, la enfermedad de Mikulicz, la fibrosclerosis multifocal, la periaortitis, la periarteritis, el aneurisma aórtico inflamatorio, la enfermedad de Ormond (fibrosis tetroperitoneal), la tiroiditis de Riedel y la mesenteritis esclerosante.
[0168] En realizaciones adicionales, las inmunoglobulinas descritas en el presente documento se pueden usar para tratar la pancreatitis autoinmune (pancreatitis esclerosante linfoplasmocítica). En otras realizaciones, las inmunoglobulinas descritas en el presente documento se pueden usar para tratar la fibrosis angiocéntrica eosinofílica (que afecta a las órbitas y al tracto respiratorio superior). En otras realizaciones, las inmunoglobulinas descritas en el presente documento se pueden usar para tratar la mediastinitis fibrosante. En otras realizaciones, las inmunoglobulinas descritas en el presente documento se pueden usar para tratar la paquimeningitis hipertrófica idiopática. En otras realizaciones, las inmunoglobulinas descritas en el presente documento se pueden usar para tratar la nefritis tubulointersticial idiopática. En otras realizaciones, las inmunoglobulinas descritas en el presente documento se pueden usar para tratar el pseudotumor inflamatorio. En otras realizaciones, las inmunoglobulinas descritas en el presente documento se pueden usar para tratar el tumor del Küttner. En otras realizaciones, las inmunoglobulinas descritas en el presente documento se pueden usar para tratar la enfermedad de Mikulicz. En otras realizaciones, las inmunoglobulinas descritas en el presente documento se pueden usar para tratar. En otras realizaciones, las inmunoglobulinas descritas en el presente documento se pueden usar para tratar la fibrosclerosis multifocal. En otras realizaciones, las inmunoglobulinas descritas en el presente documento se pueden usar para tratar la periaortitis. En otras realizaciones, las inmunoglobulinas descritas en el presente documento se pueden usar para tratar la periarteritis. En otras realizaciones, las inmunoglobulinas descritas en el presente documento se pueden usar para tratar el aneurisma aórtico inflamatorio. En otras realizaciones, las inmunoglobulinas descritas en el presente documento se pueden usar para tratar la enfermedad de Ormond (fibrosis tetroperitoneal). En otras realizaciones, las inmunoglobulinas descritas en el presente documento se pueden usar para tratar la tiroiditis de Riedel. En otras realizaciones, las inmunoglobulinas descritas en el presente documento se pueden usar para tratar la mesenteritis esclerosante.
[0169] Sin desear limitarse a ninguna teoría, una inmunoglobulina de la divulgación para uso en el tratamiento de una IgG4-RD se acopla conjuntamente con FcYRIIb y CD19 expresados en células B. El coacoplamiento de FcYRIIb y CD19 inhibe la activación de la célula B y previene o limita la producción de anticuerpos. Específicamente, el coacoplamiento de FcYRIIb y CD19 inhibe o reduce la producción de anticuerpos específicos de antígeno.
[0170] Como se indicó anteriormente, las inmunoglobulinas descritas en el presente documento se pueden usar para tratar IgG4-RD y manifestaciones y/o enfermedades y afecciones asociadas con IgG4-RD (tales como, entre otras, las enumeradas anteriormente). En algunos aspectos, el tratamiento puede tratar los síntomas asociados con la IgG4-RD. En algunos aspectos, el tratamiento puede prevenir la IgG4-RD. En algunos aspectos, el tratamiento puede ser un tratamiento profiláctico para la IgG4-RD.
[0171] Las inmunoglobulinas descritas en el presente documento se pueden usar para inhibir las células B para el tratamiento de IgG4-RD. Un anticuerpo usado para tratar la IgG4-RD puede ser una inmunoglobulina que comprende un dominio que se une a FcYRllb y un dominio que se une a CD19. Más específicamente, una inmunoglobulina usada para tratar la IgG4-RD puede ser un anticuerpo que comprende un dominio Fc que se une a FcYRllb y un dominio Fv que se une a CD19.
[0172] En algunos aspectos útiles para comprender la invención, el dominio Fc que se une a FcYRIIb comprende al menos una modificación seleccionada entre 234W, 235I, 235Y, 235R, 235D, 236D, 236N, 239D, 267D, 267E, 268E, 268D, 328F y 328Y, donde la numeración se realiza según un índice de la UE como en Kabat. En otro aspecto útil para comprender la invención, el dominio Fc que se une a FcYRIIb comprende al menos una modificación seleccionada del grupo que consiste en 235Y, 235R, 236D, 267D, 267E y 328F. En otro aspecto útil para comprender la invención, el dominio Fc que se une a FcYRllb comprende al menos una modificación seleccionada entre 267E y 328F. En otro aspecto útil para comprender la invención, el dominio Fc que se une a FcYRllb comprende modificaciones seleccionadas entre 235D/267E, 235Y/267E, 235D/267D, 235I/267E, 235I/267D, 235Y/267D, 236D/267E, 236D/ 267D, 267E/328F, 267D/328F, 268D/267E, H268D/S267D, 268E/267E y 268E/267D. En otro aspecto útil para comprender la invención, el dominio Fc que se une a FcYRllb comprende modificaciones seleccionadas entre 235D/267E, 235Y/267E, 235Y/267D, 236D/267E, 267E/328F, 268D/267E, 268E/267E y 268E/267D. En otro aspecto útil para comprender la invención, el dominio Fc que se une a FcYRllb comprende las modificaciones 236D/267E/328F. Según la invención, el dominio Fc que se une a FcYRllb comprende las modificaciones 267E/328F, donde la numeración se realiza según el índice EU como en Kabat. Según la invención, el dominio Fc que une FcYRllb comprende la SEC ID N.°:7 y la SEC ID N.°:9. En algunas realizaciones, el dominio Fv que se une a CD19 comprende una o varias secuencias seleccionadas del grupo que consiste en la SEC ID N.°:35, la SEC ID N.°:36, la SEC ID N.°:37, la SEC ID N.°:38, la SEC ID N.°:39 y la SEC ID N.°:40.
[0173] Como se analizó anteriormente, se puede usar una inmunoglobulina (por ejemplo, un anticuerpo) que coacopla FcYRIIb y CD19 para tratar la IgG4-RD. En una realización, la administración de una inmunoglobulina que coacopla FcYRllb y CDl9 para tratar la IgG4-RD puede aumentar o disminuir los valores de los marcadores farmacodinámicos. En otra realización, la administración de una inmunoglobulina que coacopla FcYRllb y CD19 para tratar la IgG4-RD puede dar como resultado la reducción de la gravedad y/o el número de síntomas asociados con la IgG4-RD. La administración de una inmunoglobulina que coacopla FcYRllb y CD19 para tratar la IgG4-RD también puede reducir la puntuación del índice respondedor de la IgG4-RD (IR de IgG4-RD). El IR de la IgG4-RD se describe con más detalle a continuación. Usando un anticuerpo que coacopla FcYRIIb y CD19, la puntuación de IR de la IgG4-RD se puede reducir significativamente en relación con el valor inicial.
Marcadores farmacodinámicos
[0174] En algunos casos, la administración de una inmunoglobulina que coacopla FcYRIIb y CD19 para tratar la IgG4-RD puede provocar un cambio en el valor de los marcadores farmacodinámicos. En el caso de la inmunoglobulina para uso según la invención, se observa una reducción de plasmoblastos de al menos un 80 % con respecto al número de plasmoblastos antes del tratamiento con dicha inmunoglobulina en los 7 días siguientes a la administración de la inmunoglobulina. Los marcadores farmacodinámicos pueden incluir, entre otros, el número de células B, el número de plasmoblastos, el número de células CTL CD4+ SLAMF7+ y la ocupación del receptor CD19. En algunos casos, puede producirse una disminución en el número total de células B. En otros casos, puede producirse una disminución del número total de plasmoblastos. En otros casos, puede producirse una disminución en el número de células CTL CD4+ SLAMF7+. En otros casos, puede producirse un aumento en la ocupación del receptor CD19.
[0175] Se puede observar un cambio en uno o varios marcadores farmacodinámicos antes del transcurso de 1 día desde la administración. En algunos casos, se puede observar un cambio en uno o varios marcadores farmacodinámicos aproximadamente 1 día después de la administración. En algunos casos, se puede observar un cambio en uno o varios marcadores farmacodinámicos aproximadamente a los 2 días de la administración. En algunos casos, se puede observar un cambio en uno o varios marcadores farmacodinámicos aproximadamente a los 3 días de la administración. En algunos casos, se puede observar un cambio en uno o varios marcadores farmacodinámicos aproximadamente a los 4 días de la administración. En algunos casos, se puede observar un cambio en uno o varios marcadores farmacodinámicos aproximadamente a los 5 días de la administración. En algunos casos, se puede observar un cambio en uno o varios marcadores farmacodinámicos aproximadamente a los 6 días de la administración. En algunos casos, se puede observar un cambio en uno o varios marcadores farmacodinámicos aproximadamente a los 7 días de la administración. En algunos casos, se puede observar un cambio en uno o varios marcadores farmacodinámicos aproximadamente a los 8 días de la administración. En algunos casos, se puede observar un cambio en uno o varios marcadores farmacodinámicos aproximadamente a los 9 días de la administración. En algunos casos, se puede observar un cambio en uno o varios marcadores farmacodinámicos aproximadamente a los 10 días de la administración. En algunos casos, se puede observar un cambio en uno o varios marcadores farmacodinámicos aproximadamente a los 11 días de la administración. En algunos casos, se puede observar un cambio en uno o varios marcadores farmacodinámicos aproximadamente a los 12 días de la administración. En algunos casos, se puede observar un cambio en uno o varios marcadores farmacodinámicos aproximadamente a los 13 días de la administración. En algunos casos, se puede observar un cambio en uno o varios marcadores farmacodinámicos aproximadamente a los 14 días de la administración. En algunos casos, se puede observar un cambio en uno o varios marcadores farmacodinámicos aproximadamente 1 mes después de la administración. En algunos casos, se puede observar un cambio en uno o varios marcadores farmacodinámicos aproximadamente a los 2 meses de la administración. En algunos casos, se puede observar un cambio en uno o varios marcadores farmacodinámicos aproximadamente a los 3 meses de la administración. En algunos casos, se puede observar un cambio en uno o varios marcadores farmacodinámicos aproximadamente a los 4 meses de la administración. En algunos casos, se puede observar un cambio en uno o varios marcadores farmacodinámicos aproximadamente a los 5 meses de la administración. En algunos casos, se puede observar un cambio en uno o varios marcadores farmacodinámicos aproximadamente a los 6 meses de la administración. En algunos casos, se puede observar un cambio en uno o varios marcadores farmacodinámicos aproximadamente a los 7 meses de la administración. En algunos casos, se puede observar un cambio en uno o varios marcadores farmacodinámicos aproximadamente a los 8 meses de la administración. En algunos casos, se puede observar un cambio en uno o varios marcadores farmacodinámicos aproximadamente a los 9 meses de la administración. En algunos casos, se puede observar un cambio en uno o varios marcadores farmacodinámicos aproximadamente a los 10 meses de la administración. En algunos casos, se puede observar un cambio en uno o varios marcadores farmacodinámicos aproximadamente a los 11 meses de la administración. En algunos casos, se puede observar un cambio en uno o varios marcadores farmacodinámicos aproximadamente a los 12 meses de la administración.
[0176] La administración de una inmunoglobulina que coacopla FcYRIIb y CD19 puede reducir el número total de células B en un sujeto con IgG4-RD.
[0177] Se puede observar una reducción de las células B aproximadamente 24 horas, aproximadamente 2 días, aproximadamente 3 días, aproximadamente 4 días, aproximadamente 5 días, aproximadamente 6 días, aproximadamente 7 días, aproximadamente 8 días, aproximadamente 9 días, aproximadamente 10 días, aproximadamente 11 días, aproximadamente 12 días, aproximadamente 13 días, aproximadamente 14 días, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 5 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 2 meses o aproximadamente 3 meses después de la administración de una inmunoglobulina que coacopla FcYRIlb y CD19. Específicamente, se puede observar una reducción de las células B en los 7 días posteriores a la administración de una inmunoglobulina que coacopla FcYRllb y CD19.
[0178] Una reducción de las células B puede determinarse mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el alivio de los signos o síntomas de una IgG4-RD puede tener una correlación con una reducción de las células B. Además, se puede determinar una reducción de las células B midiendo la cantidad de p células B en una muestra biológica. Una muestra biológica puede ser una muestra de tejido o una muestra fluida. Por ejemplo, la microscopía o la citometría de flujo se pueden usar para medir una reducción en las células B.
[0179] Las células B se pueden reducir en más del 10 % con respecto al valor inicial, donde el valor inicial es la cantidad de células B antes del inicio del tratamiento. En algunas variaciones, las células B se pueden reducir en más del 15 % con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, las células B se pueden reducir en más del 20 % con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, las células B se pueden reducir en más del 25 % con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, las p células B se pueden reducir en más del 30 % con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, las células B se pueden reducir en más del 35 % con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, las células B se pueden reducir en más del 40 % con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, las células B se pueden reducir en más del 45 % con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, las células B se pueden reducir en más del 50 % con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, las células B se pueden reducir en más del 55 % con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, las células B se pueden reducir en más del 60 % con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, las células B se pueden reducir en más del 65 % con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, las células B se pueden reducir en más del 70 % con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, las células B se pueden reducir en más del 75 % con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, las células B se pueden reducir en más del 80 % con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, las células B se pueden reducir en más del 85 % con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, las células B se pueden reducir en más del 90 % con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, las células B se pueden reducir en más del 95 % con respecto al valor inicial.
[0180] Además, las células B se pueden reducir en más de 1.2 veces con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, las células B se pueden reducir en más de 1.5 veces con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, las células B se pueden reducir en más de 2 veces con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, las células B se pueden reducir en más de 2.5 veces con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, las células B se pueden reducir en más de 5 veces con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, las células B se pueden reducir en más de 10 veces con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, las células B se pueden reducir en más de 20 veces con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, las células B se pueden reducir en más de 25 veces con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, las células B se pueden reducir en más de 50 veces con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, las células B se pueden reducir en más de 75 veces con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, las células B se pueden reducir en más de 100 veces con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, las células B se pueden reducir en más de 200 veces con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, las células B se pueden reducir en más de 500 veces con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, las células B se pueden reducir en 1000 veces o más con respecto al valor inicial.
[0181] La administración de una inmunoglobulina que coacopla FcYRIIb y CD19 puede reducir o agotar el número de plasmoblastos en un sujeto con IgG4-RD. Un sujeto con IgG4-RD puede tener niveles de plasmoblastos superiores a 100 células/ml. Por ejemplo, un sujeto con IgG4-RD puede tener niveles de plasmoblastos superiores a 100 células/ml, superiores a 200 células/ml, superiores a 300 células/ml, superiores a 400 células/ml, superiores a 500 células/ml, superiores a 600 células/ml, superiores a 700 células/ml, superiores a 800 células/ml, superiores a 900 células/ml, superiores a 1000 células/ml, superiores a 2000 células/ml, superiores a 3000 células/ml, superiores a 4000 células/ml o superior a 5000 células/ml. En consecuencia, una inmunoglobulina para el tratamiento de una IgG4-RD puede agotar o reducir el número de plasmoblastos
[0182] Se puede observar una reducción de las células B aproximadamente 24 horas, aproximadamente 2 días, aproximadamente 3 días, aproximadamente 4 días, aproximadamente 5 días, aproximadamente 6 días, aproximadamente 7 días, aproximadamente 8 días, aproximadamente 9 días, aproximadamente 10 días, aproximadamente 11 días, aproximadamente 12 días, aproximadamente 13 días, aproximadamente 14 días, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 5 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 2 meses o aproximadamente 3 meses después de la administración de una inmunoglobulina que coacopla FcYRIIb y CD19. En el caso de la inmunoglobulina para uso según la invención, se observa una reducción de plasmoblastos de al menos un 80 % con respecto al número de plasmoblastos antes del tratamiento con dicha inmunoglobulina en los 7 días siguientes a la administración de la inmunoglobulina.
[0183] La reducción o el agotamiento de los plasmoblastos pueden determinarse mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el alivio de los signos o síntomas de una IgG4-RD puede tener correlación con una reducción o un agotamiento de los plasmoblastos. Además, la reducción o el agotamiento de los plasmoblastos pueden determinarse midiendo la cantidad de plasmoblastos en una muestra biológica. Una muestra biológica puede ser una muestra de tejido o una muestra fluida. Por ejemplo, la microscopía o la citometría de flujo se pueden usar para medir la reducción o el agotamiento de los plasmoblastos. Los plasmoblastos pueden reducirse o agotarse en más del 10 % con respecto al valor inicial, donde el valor inicial es la cantidad de plasmoblastos antes del inicio del tratamiento. En algunas variaciones, los plasmoblastos pueden reducirse o agotarse en más del 15 % con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, los plasmoblastos pueden reducirse o agotarse en más del 20 % con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, los plasmoblastos pueden reducirse o agotarse en más del 25 % con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, los plasmoblastos pueden reducirse o agotarse en más del 30 % con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, los plasmoblastos pueden reducirse o agotarse en más del 35 % con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, los plasmoblastos pueden reducirse o agotarse en más del 40 % con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, los plasmoblastos pueden reducirse o agotarse en más del 45 % con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, los plasmoblastos pueden reducirse o agotarse en más del 50 % con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, los plasmoblastos pueden reducirse o agotarse en más del 55 % con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, los plasmoblastos pueden reducirse o agotarse en más del 60 % con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, los plasmoblastos pueden reducirse o agotarse en más del 65 % con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, los plasmoblastos pueden reducirse o agotarse en más del 70 % con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, los plasmoblastos pueden reducirse o agotarse en más del 75 % con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, los plasmoblastos pueden reducirse o agotarse en más del 80 % con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, los plasmoblastos pueden reducirse o agotarse en más del 85 % con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, los plasmoblastos pueden reducirse o agotarse en más del 90 % con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, los plasmoblastos pueden reducirse o agotarse en más del 95 % con respecto al valor inicial.
[0184] Además, los plasmoblastos se pueden reducir en más de 1.2 veces con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, los plasmoblastos se pueden reducir en más de 1.5 veces con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, los plasmoblastos se pueden reducir en más de 2 veces con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, los plasmoblastos se pueden reducir en más de 2.5 veces con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, los plasmoblastos se pueden reducir en más de 5 veces con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, los plasmoblastos se pueden reducir en más de 10 veces con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, los plasmoblastos se pueden reducir en más de 20 veces con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, los plasmoblastos se pueden reducir en más de 25 veces con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, los plasmoblastos se pueden reducir en más de 50 veces con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, los plasmoblastos se pueden reducir en más de 75 veces con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, los plasmoblastos se pueden reducir en más de 100 veces con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, los plasmoblastos se pueden reducir en más de 200 veces con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, los plasmoblastos se pueden reducir en más de 500 veces con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, los plasmoblastos se pueden reducir en más de 1000 veces con respecto al valor inicial.
[0185] La administración de una inmunoglobulina que coacopla FcYRllb y CD19 puede reducir el número de células de linfocitos T citotóxicos CD4+ (células CTL CD4+) en un sujeto con IgG4-RD. Más específicamente, la administración de una inmunoglobulina que coacopla FcYRIIb y CD19 puede reducir el número de células CTL CD4+ SLAMF7+ (células CTL CD4+ efectoras) en un sujeto con IgG4-RD. Los números de CTL CD4+SLAMF7+ aumentaron en la sangre periférica de pacientes con IgG4-RD (ver FIG. 29). Se ha informado de que rituximab disminuye los números de CTL CD4+SLMF7+ circulantes en pacientes con IgG4-RD después del tratamiento con rituximab, pero no hasta 1 mes o más después de la terapia. (Hamid Mattoo, et al., J Allergy Clin. Immunol. 2016). La reducción de CTL CD4+SLAMF7+después de la administración de una inmunoglobulina que coacopla FcYRIIb y CD19 ocurre mucho más rápidamente, ya que, en algunos casos, se pueden observar reducciones antes del transcurso de 1 día desde la administración.
[0186] Se puede observar una reducción de las células CTL CD4+ y/o las células CTL CD4+SLAMF7+aproximadamente 24 horas, aproximadamente 2 días, aproximadamente 3 días, aproximadamente 4 días, aproximadamente 5 días, aproximadamente 6 días, aproximadamente 7 días, aproximadamente 8 días, aproximadamente 9 días, aproximadamente 10 días, aproximadamente 11 días, aproximadamente 12 días, aproximadamente 13 días, aproximadamente 14 días, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 5 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 2 meses o aproximadamente 3 meses después de la administración de una inmunoglobulina que coacopla FcYRllb y CD19. Específicamente, se puede observar una reducción de las células CTL CD4+ antes del transcurso de 1 día desde la administración de una inmunoglobulina que coacopla FcYRllb y CD19. Se puede observar una reducción de las células CTL CD4+SLAMF7+ antes del transcurso de 1 día desde la administración de una inmunoglobulina que coacopla FcYRllb y CD19.
[0187] Se puede determinar una reducción de las células CTL CD4+ y/o las células CTL CD4+SLAMF7+ mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el alivio de los signos o síntomas de una IgG4-RD puede tener correlación con una reducción de las células CTL CD4+ y/o las células CTL CD4+SLAMF7+. Además, se puede determinar una reducción de las células CTL CD4+ y/o las células CTL CD4+SLAMF7+ midiendo la cantidad de p células CTL CD4+ y/o células CTL CD4+SLAMF7+ en una muestra biológica. Una muestra biológica puede ser una muestra de tejido o una muestra fluida. Por ejemplo, la microscopía o la citometría de flujo se pueden usar para medir una reducción en las células CTL CD4+ y/o las células CTL CD4+SLAMF7+.
[0188] Las células CTL CD4+ y/o las células CTL CD4+SLAMF7+ se pueden reducir en más del 10 % con respecto al valor inicial, donde el valor inicial es la cantidad de células CTL CD4+ y/o células CTL CD4+SLAMF7+ antes del inicio del tratamiento. En algunas variaciones, las células CTL CD4+ y/o las células CTL CD4+SLAMF7+ se pueden reducir en más del 15 % con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, las células CTL CD4+ y/o las células CTL CD4+SLAMF7+ se pueden reducir en más del 20 % con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, las células CTL CD4+ y/o las células CTL CD4+SLAMF7+ se pueden reducir en más del 25 % con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, las p células CTL CD4+ y/o las células CTL CD4+SLAMF7+ se pueden reducir en más del 30 % con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, las células CTL CD4+ y/o las células CTL CD4+SLAMF7+ se pueden reducir en más del 35 % con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, las células CTL CD4+ y/o las células CTL CD4+SLAMF7+ se pueden reducir en más del 40 % con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, las células CTL CD4+ y/o las células CTL CD4+SLAMF7+ se pueden reducir en más del 45 % con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, las células CTL CD4+ y/o las células CTL CD4+SLAMF7+ se pueden reducir en más del 50 % con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, las células CTL CD4+ y/o las células CTL CD4+SLAMF7+ se pueden reducir en más del 55 % con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, las células CTL CD4+ y/o las células CTL CD4+SLAMF7+ se pueden reducir en más del 60 % con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, las células CTL CD4+ y/o las células CTL CD4+SLAMF7+ se pueden reducir en más del 65 % con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, las células CTL CD4+ y/o las células CTL CD4+SLAMF7+ se pueden reducir en más del 70 % con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, las células CTL CD4+ y/o las células CTL CD4+SLAMF7+ se pueden reducir en más del 75 % con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, las células CTL CD4+ y/o las células CTL CD4+SLAMF7+ se pueden reducir en más del 80 % con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, las células CTL CD4+ y/o las células CTL CD4+SLAMF7+ se pueden reducir en más del 85 % con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, las células CTL CD4+ y/o las células CTL CD4+SLAMF7+ se pueden reducir en más del 90 % con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, las células CTL CD4+ y/o las células CTL CD4+SLAMF7+ se pueden reducir en más del 95 % con respecto al valor inicial.
[0189] Además, las células CTL CD4+ y/o las células CTL CD4+SLAMF7+ se pueden reducir en más de 1.2 veces con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, las células CTL CD4+ y/o las células CTL CD4+SLAMF7+ se pueden reducir en más de 1.5 veces con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, las células CTL CD4+ y/o las células CTL CD4+SLAMF7+ se pueden reducir en más de 2 veces con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, las células CTL CD4+ y/o las células CTL CD4+SLAMF7+ se pueden reducir en más de 2.5 veces con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, las células CTL CD4+ y/o las células CTL CD4+SLAMF7+ se pueden reducir en más de 5 veces con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, las células CTL CD4+ y/o las células CTL CD4+SLAMF7+ se pueden reducir en más de 10 veces con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, las células CTL CD4+ y/o las células CTL CD4+SLAMF7+ se pueden reducir en más de 20 veces con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, las células CTL CD4+ y/o las células CTL CD4+SLAMF7+ se pueden reducir en más de 25 veces con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, las células CTL CD4+ y/o las células CTL CD4+SLAMF7+ se pueden reducir en más de 50 veces con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, las células CTL CD4+ y/o las células CTL CD4+SLAMF7+ se pueden reducir en más de 75 veces con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, las células CTL CD4+ y/o las células CTL CD4+SLAMF7+ se pueden reducir en más de 100 veces con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, las células CTL CD4+ y/o las células CTL CD4+SLAMF7+ se pueden reducir en más de 200 veces con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, las células CTL CD4+ y/o las células CTL CD4+SLAMF7+ se pueden reducir en más de 500 veces con respecto al valor inicial. En algunas variaciones, las células CTL CD4+ y/o las células CTL CD4+SLAMF7+ se pueden reducir en más de 1000 veces con respecto al valor inicial.
[0190] La administración de una inmunoglobulina que coacopla FcYRIIb y CD19 puede provocar la ocupación del receptor CD19 en un sujeto con IgG4-RD. Sin desear limitarse a ninguna teoría, una inmunoglobulina de la divulgación para uso en el tratamiento de una IgG4-RD se acopla conjuntamente con FcYRIIb y CD19 expresados en células B. Este coacoplamiento da como resultado la ocupación del receptor CD19 por parte de la inmunoglobulina que coacopla FcYRIlb y CD19. La ocupación del receptor CD19 se puede determinar mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, entre otros, la citometría de flujo.
[0191] La ocupación del receptor CD19 en un sujeto después de la administración de una inmunoglobulina que coacopla FcYRlIb y CD19 puede ser de aproximadamente del 30 % a aproximadamente el 100 %. En algunas realizaciones, la ocupación del receptor CD19 es igual o superior al 30 %. En algunas realizaciones, la ocupación del receptor CD19 es igual o superior al 40 %. En algunas realizaciones, la ocupación del receptor CD19 es igual o superior al 50 %. En algunas realizaciones, la ocupación del receptor CD19 es igual o superior al 60 %. En algunas realizaciones, la ocupación del receptor CD19 es igual o superior al 70 %. En algunas realizaciones, la ocupación del receptor CD19 es igual o superior al 80 %. En algunas realizaciones, la ocupación del receptor CD19 es igual o superior al 90 %. En algunas realizaciones, la ocupación del receptor CD19 es igual o superior al 95 %. En algunas realizaciones, la ocupación del receptor CD19 es del 100 %.
Reducción de los síntomas
[0192] En algunos casos, la administración de una inmunoglobulina que coacopla FcYRIIb y CD19 puede dar como resultado una reducción de los síntomas asociados con la IgG4-RD. En algunos aspectos, la reducción puede ser una reducción de la gravedad (es decir, la intensidad) de al menos un síntoma. En otros aspectos, la reducción puede ser una reducción en el número de síntomas. En otros aspectos, la reducción puede ser una reducción en el número de órganos o tejidos afectados. En otros aspectos, la reducción es una combinación de una reducción en la gravedad (es decir, intensidad) de al menos un síntoma, una reducción en el número de síntomas o una reducción en el número de órganos o tejidos afectados.
[0193] Los síntomas generalmente se basan en el órgano o tejido afectado por la IgG4-RD. Ejemplos no limitantes de síntomas de la IgG4-RD incluyen fibrosis (cicatrización), disfunción orgánica, insuficiencia orgánica, pérdida de peso, inflamación, dolor, hinchazón, lesiones masivas, ictericia, convulsiones, parálisis o hemiparesia, parálisis de nervios craneales, pérdida auditiva neurosensorial, deficiencias de la hormona pituitaria, pérdida de visión, proptosis, pericarditis constrictiva, bloqueo cardíaco, rotura de aneurisma aórtico, disección aórtica, disección de la arteria carótida, angina, muerte súbita cardíaca, obstrucción de las vías respiratorias, derrame pleural, obstrucción esofágica, obstrucción intestinal, insuficiencia renal, hidronefrosis y dolor testicular. En algunos aspectos, una reducción de los síntomas es una reducción del número de órganos y/o tejidos afectados. En otros aspectos, una reducción de los síntomas es una reducción de la gravedad de los síntomas en al menos un órgano o tejido.
[0194] Un sujeto con IgG4-RD puede presentar síntomas en uno o más órganos. Por ejemplo, un sujeto con IgG4-RD puede presentar síntomas en 1 o más, 2 o más, 3 o más, 4 o más, 5 o más, 6 o más, 7 o más, 8 o más, 9 o más o 10 o más órganos. En diversas realizaciones, un sujeto con IgG4-RD presenta síntomas en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más órganos. En una realización, un sujeto con IgG4-RD puede presentar síntomas en cuatro o más órganos. Ejemplos no limitantes de órganos que presentan síntomas de IgG4-RD incluyen, entre otros, ganglios linfáticos, glándulas submandibulares, glándulas parotídeas, glándulas lacrimales, riñón, corazón, pericardio, órbita, cavidad nasal, pulmones, conductos biliares, glándulas salivales y páncreas. En determinadas realizaciones, los órganos sintomáticos incluyen ganglios linfáticos, glándulas submandibulares, glándulas parótidas y glándulas lagrimales.
[0195] Se puede observar una reducción de los síntomas en los 7 días posteriores a la administración. En algunos casos, se puede observar una reducción de los síntomas aproximadamente a los 7 días de la administración del anticuerpo. En algunos casos, se puede observar una reducción de los síntomas aproximadamente a los 8 días. En algunos casos, se puede observar una reducción de los síntomas aproximadamente a los 9 días. En algunos casos, se puede observar una reducción de los síntomas aproximadamente a los 10 días. En algunos casos, se puede observar una reducción de los síntomas aproximadamente a los 11 días. En algunos casos, se puede observar una reducción de los síntomas aproximadamente a los 12 días. En algunos casos, se puede observar una reducción de los síntomas aproximadamente a los 13 días. En algunos casos, se puede observar una reducción de los síntomas aproximadamente a los 14 días.
[0196] En algunos casos, se puede observar una reducción de los síntomas en los cambios en las glándulas salivales, las glándulas lagrimales, la implicación de los músculos extraoculares, los ganglios linfáticos, los riñones, los conductos biliares y/o la implicación pancreática. Se puede observar una reducción de los síntomas en las glándulas salivales, las glándulas lagrimales, la implicación de los músculos extraoculares, los ganglios linfáticos, los riñones, las vías biliares y/o la implicación pancreática en aproximadamente 7 días. En otros casos, se puede observar una reducción de los síntomas en las glándulas salivales, las glándulas lagrimales, la implicación de los músculos extraoculares, los ganglios linfáticos, los riñones, las vías biliares y/o la implicación pancreática en aproximadamente 8 días. En otros casos, se puede observar una reducción de los síntomas en las glándulas salivales, las glándulas lagrimales, la implicación de los músculos extraoculares, los ganglios linfáticos, los riñones, las vías biliares y/o la implicación pancreática en aproximadamente 9 días. En otros casos, se puede observar una reducción de los síntomas en las glándulas salivales, las glándulas lagrimales, la implicación de los músculos extraoculares, los ganglios linfáticos, los riñones, las vías biliares y/o la implicación pancreática en aproximadamente 10 días. En otros casos, se puede observar una reducción de los síntomas en las glándulas salivales, las glándulas lagrimales, la implicación de los músculos extraoculares, los ganglios linfáticos, los riñones, las vías biliares y/o la implicación pancreática en aproximadamente 11 días. En otros casos, se puede observar una reducción de los síntomas en las glándulas salivales, las glándulas lagrimales, la implicación de los músculos extraoculares, los ganglios linfáticos, los riñones, las vías biliares y/o la implicación pancreática en aproximadamente 12 días. En otros casos, se puede observar una reducción de los síntomas en las glándulas salivales, las glándulas lagrimales, la implicación de los músculos extraoculares, los ganglios linfáticos, los riñones, las vías biliares y/o la implicación pancreática en aproximadamente 13 días. En otros casos, se puede observar una reducción de los síntomas en las glándulas salivales, las glándulas lagrimales, la implicación de los músculos extraoculares, los ganglios linfáticos, los riñones, las vías biliares y/o la implicación pancreática en aproximadamente 14 días. En otros casos, se puede observar una reducción de los síntomas en las glándulas salivales, las glándulas lagrimales, la implicación de los músculos extraoculares, los ganglios linfáticos, los riñones, las vías biliares y/o la implicación pancreática después de aproximadamente 14 días.
Índice respondedor de IgG4-RD
[0197] En algunos casos, la administración de una inmunoglobulina que coacopla FcYRIIb y CD19 puede provocar una reducción en la puntuación del índice respondedor de IgG4-RD (IR de IgG4-RD). Un IR de IgG4-RD es una herramienta diseñada para detectar cualquier cambio en la actividad patológica e identificar mejoras y empeoramientos en la misma y/o diferentes sistemas de órganos. Para obtener una descripción general de la metodología de puntuación del IR de IgG4-RI, consulte Carruthers et al., International Journal of Rheumatology 2012. En resumen, el IR de IgG4-RD utiliza un sistema de puntuación para cada sistema o sitio de órganos y le pide al médico que califique el alcance de la actividad y el daño de la enfermedad en el momento del encuentro clínico. El médico suele clasificar los siguientes órganos: paquimeninges, glándula pituitaria, órbitas y glándulas lagrimales, glándulas salivales, tiroides, ganglios linfáticos, pulmones, aorta y grandes vasos sanguíneos, retroperitoneo, mediastino y mesenterio, páncreas, conducto biliar e hígado, riñón, piel y otra formación de esclerosis/masa. El médico ingresa una puntuación de 0 a 3 para cada órgano/sitio afectado, indica si el sitio del órgano es sintomático (sí/no), indica si la actividad de la enfermedad para cada órgano/sitio requiere tratamiento urgente (sí/no); e indica si la disfunción del órgano/sitio está relacionada con daños y no con la enfermedad activa (sí/no). A efectos de esta divulgación, se ha empleado un sistema de puntuación de 0 a 3. Específicamente, se emplea el siguiente sistema de puntuación para la actividad patológica: 0 - no afectada o no resuelta; 1 - mejorada pero persistente; 2 - nueva o recurrente (mientras no esté en tratamiento) o sin cambios; y 3 - peor o nuevo a pesar del tratamiento. La suma de la actividad patológica en todos los sitios de órganos da como resultado la puntuación total de actividad. Si el sitio de un órgano está etiquetado como urgente ("sí"), la puntuación para ese sitio se duplica. Luego, la puntuación IR de IgG4-RD se puede comparar entre evaluaciones para determinar la actividad patológica a lo largo del tiempo y usarse para criterios de valoración de ensayos clínicos.
[0198] El IR de IgG4-RD puede, en algunos casos como se describe en Currthers et al., tener en cuenta la concentración sérica de la IgG4 del sujeto. Para esta divulgación, el IR de IgG4-RD no tiene en cuenta las concentraciones séricas de la IgG4 del sujeto.
[0199] La puntuación del IR de IgG4-RD se puede mantener con respecto al valor inicial o reducirse con respecto al valor inicial, donde el valor inicial es la puntuación del IR de IgG4-RD antes del inicio del tratamiento. Cuando se mantiene la puntuación del IR de IgG4-RD, no hay cambios en la puntuación del IR de IgG4-RD en relación con el valor inicial.
[0200] En algunos casos, se puede observar una reducción con respecto al valor inicial en la puntuación del IR de IgG4-RD en los 14 días posteriores a la administración. En algunos casos, se puede observar una reducción en la puntuación del IR de IgG4-RD aproximadamente a los 14 días de la administración. En algunos casos, una reducción en la puntuación del IR de IgG4-RD aproximadamente 1 mes después de la administración. En algunos casos, se puede observar una reducción en la puntuación del IR de IgG4-RD aproximadamente a los 2 meses de la administración. En algunos casos, se puede observar una reducción en la puntuación del IR de IgG4-RD aproximadamente a los 3 meses de la administración. En algunos casos, se puede observar una reducción en la puntuación del IR de IgG4-RD aproximadamente a los 4 meses de la administración. En algunos casos, se puede observar una reducción en la puntuación del IR de IgG4-RD aproximadamente a los 5 meses de la administración. En algunos casos, se puede observar una reducción en la puntuación del IR de IgG4-RD aproximadamente a los 6 meses de la administración. En algunos casos, se puede observar una reducción en la puntuación del IR de IgG4-RD aproximadamente a los 7 meses de la administración. En algunos casos, se puede observar una reducción en la puntuación del IR de IgG4-RD aproximadamente a los 8 meses de la administración. En algunos casos, se puede observar una reducción en la puntuación del IR de IgG4-RD aproximadamente a los 9 meses de la administración. En algunos casos, se puede observar una reducción en la puntuación del IR de IgG4-RD aproximadamente a los 10 meses de la administración. En algunos casos, se puede observar una reducción en la puntuación del IR de IgG4-RD aproximadamente a los 11 meses de la administración. En algunos casos, se puede observar una reducción en la puntuación del IR de IgG4-RD aproximadamente a los 12 meses de la administración.
[0201] Cuando la puntuación del IR de IgG4-RD se reduce en relación con el valor inicial, la puntuación puede disminuir en al menos 1 en relación con el valor inicial. En algunas variaciones, la puntuación del IR de IgG4-RD puede disminuir al menos en 2 en relación con el valor inicial. En algunas variaciones, la puntuación del IR de IgG4-RD puede disminuir al menos en 3. En algunas variaciones, la puntuación del IR de IgG4-RD puede disminuir al menos en 4. En algunas variaciones, la puntuación del IR de IgG4-RD puede disminuir al menos en 5. En algunas variaciones, la puntuación del IR de IgG4-RD puede disminuir al menos en 6. En algunas variaciones, la puntuación del IR de IgG4-RD puede disminuir al menos en 7. En algunas variaciones, la puntuación del IR de IgG4-RD puede disminuir al menos en 8. En algunas variaciones, la puntuación del IR de IgG4-RD puede disminuir al menos en 9. En algunas variaciones, la puntuación del IR de IgG4-RD puede disminuir al menos en 10. En algunas variaciones, la puntuación del IR de IgG4-RD puede disminuir al menos en 11. En algunas variaciones, la puntuación del IR de IgG4-RD puede disminuir al menos en 12. En algunas variaciones, la puntuación del IR de IgG4-RD puede disminuir al menos en 13. En algunas variaciones, la puntuación del IR de IgG4-RD puede disminuir al menos en 14. En algunas variaciones, la puntuación del IR de IgG4-RD puede disminuir al menos en 15. En algunas variaciones, la puntuación del IR de IgG4-RD puede disminuir al menos en 16. En algunas variaciones, la puntuación del IR de IgG4-RD puede disminuir al menos en 17. En algunas variaciones, la puntuación del IR de IgG4-RD puede disminuir al menos en 18. En algunas variaciones, la puntuación del IR de IgG4-RD puede disminuir al menos en 19. En algunas variaciones, la puntuación del IR de IgG4-RD puede disminuir al menos en 20 en relación con el valor inicial. En determinadas realizaciones, la puntuación del IR de IgG4-RD se puede reducir a 0.
[0202] Cuando la puntuación del IR de IgG4-RD se reduce en relación con el valor inicial, la puntuación puede disminuir en al menos 1 en relación con el valor inicial en las 2 semanas posteriores a la primera dosis. En algunas variaciones, la puntuación del IR de IgG4-RD puede disminuir al menos en 2 en relación con el valor inicial en las 2 semanas posteriores a la primera dosis. En algunas variaciones, la puntuación del IR de IgG4-RD puede disminuir al menos en 3 en las 2 semanas posteriores a la primera dosis. En algunas variaciones, la puntuación del IR de IgG4-RD puede disminuir al menos en 4 en las 2 semanas posteriores a la primera dosis. En algunas variaciones, la puntuación del IR de IgG4-RD puede disminuir al menos en 5 en las 2 semanas posteriores a la primera dosis. En algunas variaciones, la puntuación del IR de IgG4-RD puede disminuir al menos en 6 en las 2 semanas posteriores a la primera dosis. En algunas variaciones, la puntuación del IR de IgG4-RD puede disminuir al menos en 7 en las 2 semanas posteriores a la primera dosis. En algunas variaciones, la puntuación del IR de IgG4-RD puede disminuir al menos en 8 en las 2 semanas posteriores a la primera dosis. En algunas variaciones, la puntuación del IR de IgG4-RD puede disminuir al menos en 9 en las 2 semanas posteriores a la primera dosis. En algunas variaciones, la puntuación del IR de IgG4-RD puede disminuir al menos en 10 en las 2 semanas posteriores a la primera dosis. En algunas variaciones, la puntuación del IR de IgG4-RD puede disminuir al menos en 11 en las 2 semanas posteriores a la primera dosis. En algunas variaciones, la puntuación del IR de IgG4-RD puede disminuir al menos en 12 en las 2 semanas posteriores a la primera dosis. En algunas variaciones, la puntuación del IR de IgG4-RD puede disminuir al menos en 13 en las 2 semanas posteriores a la primera dosis. En algunas variaciones, la puntuación del IR de IgG4-RD puede disminuir al menos en 14 en las 2 semanas posteriores a la primera dosis. En algunas variaciones, la puntuación del IR de IgG4-RD puede disminuir al menos en 15 en las 2 semanas posteriores a la primera dosis. En algunas variaciones, la puntuación del IR de IgG4-RD puede disminuir al menos en 16 en las 2 semanas posteriores a la primera dosis. En algunas variaciones, la puntuación del IR de IgG4-RD puede disminuir al menos en 17 en las 2 semanas posteriores a la primera dosis. En algunas variaciones, la puntuación del IR de IgG4-RD puede disminuir al menos en 18 en las 2 semanas posteriores a la primera dosis. En algunas variaciones, la puntuación del IR de IgG4-RD puede disminuir al menos en 19 en las 2 semanas posteriores a la primera dosis. En algunas variaciones, la puntuación del IR de IgG4-RD puede disminuir al menos en 20 en relación con el valor inicial en las 2 semanas posteriores a la primera dosis. En determinadas realizaciones, la puntuación del IR de IgG4-RD se puede reducir a 0 en las 2 semanas posteriores a la primera dosis.
Reducción en otras terapias y agentes terapéuticos
[0203] El uso de una inmunoglobulina que coacopla FcYRllb y CD19 para tratar la IgG4-RD puede dar lugar a la reducción o la eliminación de los efectos secundarios asociados con otras terapias. Sin querer limitarse a ninguna teoría, el mecanismo de acción del anticuerpo reduce los efectos no deseados, reduciendo así los efectos secundarios asociados con otras terapias.
[0204] Además, el tratamiento dirigido de IgG4-RD puede reducir o eliminar la necesidad de agentes adicionales para tratar la IgG4-RD. Por ejemplo, el tratamiento dirigido de la IgG4-RD puede reducir o eliminar la necesidad de analgésicos antiinflamatorios (AINE como aspirina, ibuprofeno, naproxeno o Celebrex), paracetamol, esteroides, glucocorticoides (es decir, prednisona), agentes inmunosupresores (es decir, azatioprina, micofenolato de mofetilo) y productos biológicos inmunosupresores (es decir, rituximab, bortezomib) que normalmente se usan para tratar la IgG4-RD.
[0205] En determinadas realizaciones, el tratamiento dirigido de la IgG4-RD usando un anticuerpo que coacopla FcYRIlb y CD19 puede dar como resultado la reducción gradual y la eventual interrupción de los esteroides. Se conocen en la técnica métodos para reducir gradualmente los esteroides. Por ejemplo, se puede reducir la dosis cada 2 o 3 días (por ejemplo, 6 comprimidos tomados los días 1 y 2, 5 comprimidos los días 3 y 4, 4 comprimidos los días 5 y 6, 3 comprimidos los días 7 y 8, 2 comprimidos los días 9 y 10, y 1 comprimido los días 11 y 12). Como alternativa, se puede reducir la dosis a la mitad cada 3 días.
[0206] Además, en algunos casos, la IgG4-RD puede tratarse administrando un anticuerpo que coacopla FcYRllb y CD19 a un sujeto que es refractario a una terapia biológica inmunosupresora (por ejemplo, rituximab, bortezomib). Los sujetos que son refractarios a la terapia biológica inmunosupresora administrada no responden a un producto biológico inmunosupresor determinado, como rituximab o bortezomib, o presentan una respuesta terapéutica y luego vuelven a desarrollar síntomas de la enfermedad. En algunos casos, la IgG4-RD se puede tratar administrando un anticuerpo que coacopla FcYRllb y CD19 a un sujeto que es refractario a rituximab. En algunos casos, IgG4-RD se puede tratar administrando un anticuerpo que coacopla FcYRllb y CD19 a un sujeto que es refractario a bortezomib.
[0207] En algunos casos, la IgG4-RD se puede tratar administrando un anticuerpo que coacopla a FcYRllb y CD19 al sujeto que ha recaído después del tratamiento con un producto biológico inmunosupresor. Un sujeto que ha recaído respondió al tratamiento con un producto biológico inmunosupresor, pero volvió a desarrollar los síntomas de la enfermedad. En algunos casos, el producto biológico inmunosupresor puede ser rituximab. En algunos casos, el producto biológico inmunosupresor puede ser bortezomib.
Polimorfismos de pacientes
[0208] Varios de los receptores que pueden interactuar con las inmunoglobulinas descritas en el presente documento son polimórficos en la población humana. Para un paciente o población de pacientes determinados, la eficacia de las inmunoglobulinas descritas en el presente documento puede verse afectada por la presencia o ausencia de polimorfismos específicos en las proteínas. Por ejemplo, FcyRllla es polimórfico en la posición 158, que comúnmente es V (alta afinidad) o F (baja afinidad). Se observa que los pacientes con el genotipo homocigoto V/V tienen una mejor respuesta clínica al tratamiento con el anticuerpo anti-CD20 Rituxan® (rituximab), probablemente porque estos pacientes presentan una respuesta NK más fuerte (Dall'Ozzo et. al. (2004) Cancer Res. 64:4664-9). Los polimorfismos adicionales incluyen, entre otros, FcyRlla R131 o H131, y se sabe que dichos polimorfismos aumentan o disminuyen la unión de Fc y la actividad biológica posterior, dependiendo del polimorfismo. Las inmunoglobulinas descritas en el presente documento pueden unirse preferentemente a una forma polimórfica particular de un receptor, por ejemplo 158 V de FcyRllla, o unirse con afinidad equivalente a todos los polimorfismos en una posición particular en el receptor, por ejemplo, los polimorfismos 158V y 158F de FcyRllla. En una realización, las inmunoglobulinas descritas en el presente documento pueden tener una unión equivalente a polimorfismos y pueden usarse en un anticuerpo para eliminar la eficacia diferencial observada en pacientes con diferentes polimorfismos. Esta propiedad puede dar una mayor consistencia en la respuesta terapéutica y reducir las poblaciones de pacientes que no responden. Dicha variante de Fc con unión idéntica a polimorfismos del receptor puede tener una actividad biológica aumentada, por ejemplo, ADCC, CDC o semivida circulante, o alternativamente actividad disminuida, mediante la modulación de la unión a los receptores de Fc relevantes. En una realización, las inmunoglobulinas descritas en el presente documento pueden unirse con mayor o menor afinidad a uno de los polimorfismos de un receptor, ya sea acentuando la diferencia existente en la unión o invirtiendo la diferencia. Dicha propiedad puede permitir la creación de terapias particularmente adaptadas para su eficacia con una población de pacientes que posee dicho polimorfismo. Por ejemplo, una población de pacientes que posee un polimorfismo con una mayor afinidad por un receptor inhibidor como FcYRIIb podría recibir un fármaco que contenga una variante de Fc con unión reducida a dicha forma polimórfica del receptor, creando un fármaco más eficaz.
[0209] En una realización, los pacientes se criban para detectar uno o varios polimorfismos con el fin de predecir la eficacia de las inmunoglobulinas descritas en el presente documento. Esta información se puede utilizar, por ejemplo, para seleccionar pacientes para incluirlos o excluirlos de ensayos clínicos o, después de la aprobación, para brindar orientación a médicos y pacientes con respecto a las dosis y opciones de tratamiento adecuadas. Por ejemplo, en pacientes que son homocigotos o heterocigotos para fármacos de anticuerpos FcyRllla 158F como el mAb anti-CD20, el rituximab es mínimamente eficaz (Carton 2002 Blood 99: 754-758; Weng 2003 J. Clin. Oncol. 21:3940-3947 ); dichos pacientes pueden mostrar una respuesta clínica mucho mejor a los anticuerpos descritos en el presente documento. En una realización, los pacientes se seleccionan para su inclusión en ensayos clínicos para una inmunoglobulina descrita en el presente documento si su genotipo indica que es probable que respondan significativamente mejor a una inmunoglobulina descrita en el presente documento en comparación con una o varias terapias de inmunoglobulina utilizadas actualmente. En otra realización, las dosis y los regímenes de tratamiento apropiados se determinan utilizando dicha información del genotipo. En otra realización, los pacientes se seleccionan para su inclusión en un ensayo clínico o para recibir una terapia posterior a la aprobación en función de su genotipo de polimorfismo, donde dicha terapia contiene una inmunoglobulina diseñada para ser específicamente eficaz para dicha población, o alternativamente, donde dicha terapia contiene una variante de Fc que no muestra actividad diferencial para las diferentes formas del polimorfismo.
[0210] También se describen pruebas de diagnóstico para identificar pacientes que probablemente muestren una respuesta clínica favorable a una inmunoglobulina descrita en este documento, o que probablemente muestren una respuesta significativamente mejor cuando se tratan con una inmunoglobulina descrita en este documento frente a una o varias terapias de inmunoglobulina utilizadas actualmente. Se puede utilizar cualquiera entre varios métodos conocidos en la técnica para determinar polimorfismos de FcyR en seres humanos.
[0211] Además, también se describen pruebas de pronóstico realizadas en muestras clínicas tales como muestras de sangre y tejido. Dichas pruebas pueden analizar la actividad de la función efectora, incluyendo, entre otras, ADCC, CDC, fagocitosis y opsonización, o la destrucción, independientemente del mecanismo, de células cancerosas o patógenas en general. En una realización, los ensayos ADCC, como los descritos anteriormente, se usan para predecir, para un paciente específico, la eficacia de una inmunoglobulina determinada descrita en el presente documento. Dicha información puede usarse para identificar pacientes para su inclusión o exclusión de ensayos clínicos, o para informar de decisiones sobre dosis y regímenes de tratamiento apropiados. Dicha información también puede usarse para seleccionar un fármaco que contenga una inmunoglobulina particular que muestre una actividad superior en dicho ensayo.
Formulación
[0212] Se contemplan composiciones farmacéuticas en las que se formulan una inmunoglobulina descrita en el presente documento y uno o varios agentes terapéuticamente activos. Las formulaciones de las inmunoglobulinas descritas en el presente documento se preparan para su almacenamiento mezclando dicha inmunoglobulina que tiene el grado de pureza deseado con portadores, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Osol, A. Ed., 1980), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas e incluyen tampones como fosfato, citrato, acetato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos tales como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; edulcorantes y otros agentes aromatizantes; rellenos tales como celulosa microcristalina, lactosa, maíz y otros almidones; agentes aglutinantes; aditivos; agentes colorantes; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de proteína-Zn); y/o surfactantes no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PeG). En una realización, la composición farmacéutica que comprende la inmunoglobulina descrita en el presente documento puede estar en una forma soluble en agua, por ejemplo, presente como sales farmacéuticamente aceptables, lo que se entiende que incluye tanto sales de adición ácida como básica. "Sal de adición ácida farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas sales que conservan la eficacia biológica de las bases libres y que no son indeseables biológicamente o de otra manera, formadas con ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico y similares, y ácidos orgánicos tales como ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido maleico, ácido malónico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinámico, ácido mandélico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido ptoluenosulfónico, ácido salicílico y similares. Las "sales de adición de bases farmacéuticamente aceptables" incluyen aquellas derivadas de bases inorgánicas tales como sales de sodio, potasio, litio, amonio, calcio, magnesio, hierro, zinc, cobre, manganeso, aluminio y similares. Algunas realizaciones incluyen al menos una de las sales de amonio, potasio, sodio, calcio y magnesio. Las sales derivadas de bases orgánicas no tóxicas farmacéuticamente aceptables incluyen sales de aminas primarias, secundarias y terciarias, aminas sustituidas que incluyen aminas sustituidas de origen natural, aminas cíclicas y resinas de intercambio iónico básicas, tales como isopropilamina, trimetilamina, dietilamina, trietilamina, tripropilamina y etanolamina. Las formulaciones que se van a utilizar para la administraciónin vivopueden ser estériles. Esto se logra fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles u otros métodos.
[0213] Las inmunoglobulinas descritas en el presente documento también pueden formularse como inmunoliposomas. Un liposoma es una pequeña vesícula que comprende varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/o surfactantes que es útil para administrar un agente terapéutico a un mamífero. Los liposomas que contienen la inmunoglobulina se preparan mediante métodos conocidos en la técnica, tales como los descritos en Epstein et al., 1985, Proc Natl Acad Sci EE. UU., 82:3688; Hwang et al., 1980, Proc Natl Acad Sci EE. UU., 77:4030; EE. UU. 4.485.045; EE. UU. 4.544.545; y PCT WO 97/38731. En el EE.UU. 5.013.556 se describen liposomas con tiempo de circulación mejorado. Los componentes del liposoma comúnmente están dispuestos en una formación de bicapa, similar a la disposición de los lípidos de las membranas biológicas. Se pueden generar liposomas particularmente útiles mediante el método de evaporación en fase inversa con una composición lipídica que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado. Opcionalmente, el liposoma contiene un agente quimioterapéutico u otro agente terapéuticamente activo (Gabizon et al., 1989, J National Cancer Inst 81:1484).
[0214] La inmunoglobulina y otros agentes terapéuticamente activos también pueden quedar atrapados en microcápsulas preparadas mediante métodos que incluyen, entre otros, técnicas de coacervación, polimerización interfacial (por ejemplo usando microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina, o microcápsulas de poli(metacilato de metilo)), sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) y macroemulsiones. Dichas técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Osol, A. Ed., 1980. Se pueden realizar preparados de liberación prolongada. Los ejemplos adecuados de preparados de liberación prolongada incluyen matrices semipermeables de polímero hidrófobo sólido, cuyas matrices están en forma de artículos conformados, p. ej., películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación prolongada incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo poli(2-hidroxietil-metacrilato) o poli(vinilalcohol)), polilactidas (EE. UU.
3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma-etil-L-glutamato, etileno vinil acetato no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables como Lupron Depot® (que son microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida), ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico y ProLease® (disponible comercialmente en Alkermes), que es un sistema de administración basado en microesferas compuesto por la molécula bioactiva deseada incorporada en una matriz de poli-DL-lactida-co-glicolida (PLG).
[0215] En una realización, las inmunoglobulinas descritas en el presente documento se formulan para administración intravenosa (IV) o administración subcutánea (SC). Generalmente, una formulación para administración IV o SC comprende inmunoglobulina, uno o varios tampones, uno o varios modificadores de la tonicidad, uno o varios disolventes y uno o varios surfactantes. Los ejemplos no limitantes de tampones incluyen fosfato, citrato, acetato, glutamato, carbonato, tartrato, trietanolamina (TRlS), glicilglicina, histidina, glicina, lisina, arginina y otros ácidos orgánicos. Más específicamente, los ejemplos no limitantes de tampones incluyen HEPES sódico, MES, fosfato potásico, tiocianato potásico, esterilizante, TAE, TBE, sulfato amónico/HEPES, BuffAR, acetato sódico, carbonato sódico, citrato sódico, dihidrógenofosfato sódico, hidrogenofosfato disódico y fosfato sódico. Además, el tampón puede tener diversas formas de hidrato. Por ejemplo, el tampón puede ser un monohidrato, un dihidrato, un trihidrato, un tetrahidrato, un pentahidrato, un hexahidrato, un heptahidrato, un octahidrato, un nonahidrato, un decahidrato, un undecahidrato y un dodecahidrato. Ocasionalmente, un hidrato puede ser fraccionario, como un hemihidrato o un sequihidrato. Los ejemplos no limitantes de modificadores de la tonicidad incluyen cloruro sódico, ácido acético, L-prolina, dextrosa, manitol, cloruro potásico, glicerina y glicerol. Los ejemplos no limitantes de disolventes incluyen agua, propilenglicol, polietilenglicoles, etanol, dimetilsulfóxido, N-metil-2-pirrolidona, glicofurol, Solketal™, glicerol formal, acetona, alcohol tetrahidrofurfurílico, diglima, dimetilisosorbida y lactato de etilo. Los ejemplos no limitantes de disolventes incluyen polisorbatos (por ejemplo, polisorbato-20, polisorbato-80), monooleato de polioxietilensorbitán (Tween 80), monooleato de sorbitán, monolaurato de polioxietilensorbitán (Tween 20), trioleato de sorbitán (span 85), lecitina y copolímeros de polioxietileno-polioxipropileno (Pluronics, Pluronic F-68).
[0216] En determinadas realizaciones, una formulación IV comprende inmunoglobulina, uno o varios tampones, uno o varios modificadores de la tonicidad, uno o varios disolventes y uno o varios surfactantes. Específicamente, el tampón puede consistir en uno o varios tampones de fosfato sódico. Por ejemplo, el tampón puede ser fosfato sódico monobásico monohidrato, fosfato sódico dibásico heptahidrato y combinaciones de los mismos. En una realización, el modificador de tonicidad es cloruro sódico. En otra realización, el disolvente es agua. En otra realización, el surfactante es un polisorbato. Por ejemplo, el polisorbato es polisorbato-20. Específicamente, una formulación IV comprende inmunoglobulina, fosfato sódico monobásico monohidrato, fosfato sódico dibásico heptahidrato, cloruro sódico, agua y polisorbato-20. Las cantidades de inmunoglobulina, tampón, modificador de tonicidad, disolvente y surfactantes pueden variar. La cantidad de inmunoglobulina puede ser de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 500 mg por ml o de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 100 mg por ml o de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 50 mg por ml. La cantidad de tampón puede ser de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 10 mg por ml o de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 5 mg por ml o de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 2.5 mg por ml. La cantidad de modificador de tonicidad puede ser de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 15 mg por ml o de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 10 mg por ml o de aproximadamente 8 mg a aproximadamente 10 mg por ml. La cantidad de surfactante puede ser de aproximadamente 0.01 mg a aproximadamente 1 mg por ml o de aproximadamente 0.01 mg a aproximadamente 0.5 mg por ml o de aproximadamente 0.05 mg a aproximadamente 0.2 mg por ml. Específicamente, una formulación IV comprende la inmunoglobulina en una cantidad de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 500 mg por ml o aproximadamente 1 mg a aproximadamente 100 mg por ml o aproximadamente 1 mg a aproximadamente 50 mg por ml, fosfato sódico monobásico monohidrato y fosfato sódico dibásico heptahidrato en una cantidad de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 mg por ml o aproximadamente 1 a aproximadamente 5 mg por ml o aproximadamente 1 a aproximadamente 2.5 mg por ml, cloruro sódico en una cantidad de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 mg por ml o aproximadamente 1 a aproximadamente 5 mg por ml o aproximadamente 1 a aproximadamente 2.5 mg por ml, agua hasta aproximadamente 1 ml y polisorbato-20 en una cantidad de aproximadamente 0.01 mg a aproximadamente 1 mg por ml o aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.5 mg por ml o aproximadamente 0.05 a aproximadamente 0,2 mg por ml. Específicamente, una formulación IV comprende la inmunoglobulina en una cantidad de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 50 mg por ml, fosfato sódico monobásico monohidratado y fosfato sódico dibásico heptahidrato en una cantidad de aproximadamente 1 a aproximadamente 2,5 mg por ml, cloruro de sodio en una cantidad de aproximadamente 1 a aproximadamente 2.5 mg por ml, agua hasta aproximadamente 1 ml y polisorbato-20 en una cantidad de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,2 mg por ml.
[0217] En determinadas realizaciones, una formulación SC comprende inmunoglobulina, uno o varios tampones, uno o varios modificadores de la tonicidad, uno o varios disolventes y uno o varios surfactantes. Específicamente, el tampón puede ser un tampón de acetato sódico. Por ejemplo, el tampón puede ser acetato sódico trihidrato. En una realización, el modificador de la tonicidad puede ser ácido acético, L-prolina y combinaciones de los mismos. En otra realización, el disolvente es agua. En otra realización, el surfactante es un polisorbato. Por ejemplo, el polisorbato es polisorbato-80. Específicamente, una formulación SC comprende inmunoglobulina, acetato sódico trihidrato, ácido acético y L-prolina, agua y polisorbato-80. Las cantidades de inmunoglobulina, tampón, modificador de tonicidad, disolvente y surfactantes pueden variar. La cantidad de inmunoglobulina puede ser de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 500 mg por ml o de aproximadamente 50 mg a aproximadamente 250 mg por ml o de aproximadamente 100 mg a aproximadamente 250 mg por ml. La cantidad de tampón puede ser de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 10 mg por ml o de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 5 mg por ml o de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 2.5 mg por ml. La cantidad de modificador de tonicidad puede ser de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 50 mg por ml o de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 50 mg por ml o de aproximadamente 20 mg a aproximadamente 40 mg por ml. La cantidad de surfactante puede ser de aproximadamente 0.01 mg a aproximadamente 1 mg por ml o de aproximadamente 0.01 mg a aproximadamente 0.5 mg por ml o de aproximadamente 0.05 mg a aproximadamente 0.2 mg por ml. Específicamente, una formulación SC comprende la inmunoglobulina en una cantidad de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 500 mg por ml o de aproximadamente 50 mg a aproximadamente 250 mg por ml o de aproximadamente 100 mg a aproximadamente 250 mg por ml, acetato sódico trihidrato en una cantidad de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 mg por ml o aproximadamente 1 a aproximadamente 5 mg por ml o aproximadamente 1 a aproximadamente 2.5 mg por ml, ácido acético y L-prolina en una cantidad de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 mg por ml o aproximadamente 10 a aproximadamente 50 mg por ml o aproximadamente 20 a aproximadamente 40 mg por ml, agua hasta aproximadamente 1 ml y polisorbato-80 en una cantidad de aproximadamente 0.01 mg a aproximadamente 1 mg por ml o aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.5 mg por ml o aproximadamente 0.05 a aproximadamente 0.2 mg por ml. Específicamente, una formulación SC comprende la inmunoglobulina en una cantidad de aproximadamente 100 mg a aproximadamente 250 mg por ml, acetato sódico trihidrato en una cantidad de aproximadamente 1 a aproximadamente 2.5 mg por ml, ácido acético y L-prolina en una cantidad de aproximadamente 20 hasta aproximadamente 40 mg por ml, agua hasta aproximadamente 1 ml y polisorbato-80 en una cantidad de aproximadamente 0.05 a aproximadamente 0.2 mg por ml.
Administración
[0218] La administración de la composición farmacéutica que comprende una inmunoglobulina descrita en el presente documento, por ejemplo, en forma de una solución acuosa estéril, se puede realizar de diversas formas, incluidas, entre otras, por vía oral, subcutánea, intravenosa, intranasal, intraótica, transdérmica, tópica (por ejemplo, geles, ungüentos, lociones, cremas, etc.), intraperitoneal, intramuscular, intrapulmonar, vaginal, parenteral, rectal o intraocular. En algunos casos, por ejemplo para el tratamiento de heridas, inflamación, etc., la inmunoglobulina se puede aplicar directamente como una solución o un aerosol. Como se sabe en la técnica, la composición farmacéutica se puede formular en consecuencia dependiendo de la forma de introducción.
[0219] La administración subcutánea se puede utilizar en circunstancias en las que el paciente pueda autoadministrarse la composición farmacéutica. Muchos agentes terapéuticos proteicos no son lo suficientemente potentes como para permitir la formulación de una dosis terapéuticamente eficaz en el volumen máximo aceptable para la administración subcutánea. Este problema puede abordarse en parte mediante el uso de formulaciones proteicas que comprenden arginina-HCl, histidina y polisorbato (véase WO 04091658). Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden ser más susceptibles a la administración subcutánea debido, por ejemplo, a una mayor potencia, una mejor semivida en suero o una mayor solubilidad.
[0220] Como se sabe en la técnica, los agentes terapéuticos proteicos a menudo se administran mediante infusión IV o bolo. Los anticuerpos descritos en el presente documento también pueden administrarse utilizando dichos métodos. Por ejemplo, la administración puede realizarse mediante infusión intravenosa con cloruro sódico al 0.9 % como vehículo de infusión.
[0221] La administración pulmonar se puede lograr usando un inhalador o un nebulizador y una formulación que comprende un agente aerosolizante. Por ejemplo, se puede usar la tecnología inhalable AERx® disponible comercialmente en Aradigm, o el sistema de administración pulmonar Inhance™ disponible comercialmente en Nektar Therapeutics. Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden ser más susceptibles de administración intrapulmonar. FcRn está presente en el pulmón y puede promover el transporte desde el pulmón al torrente sanguíneo (por ejemplo, Syntonix WO 04004798, Bitonti et al. (2004) Proc. Nat. Acad. Sci. 101:9763-8). En consecuencia, los anticuerpos que se unen a FcRn de manera más eficaz en el pulmón o que se liberan de manera más eficiente en el torrente sanguíneo pueden tener una biodisponibilidad mejorada después de la administración intrapulmonar. Los anticuerpos descritos en el presente documento también pueden ser más susceptibles a la administración intrapulmonar debido, por ejemplo, a una solubilidad mejorada o a un punto isoeléctrico alterado.
[0222] Además, las inmunoglobulinas descritas en el presente documento pueden ser más adecuadas para la administración oral debido, por ejemplo, a una estabilidad mejorada al pH gástrico y una mayor resistencia a la proteólisis. Además, FcRn parece expresarse en el epitelio intestinal de adultos (Dickinson et al. (1999), J. Clin. Invest. 104:903-11), por lo que los anticuerpos descritos en el presente documento con perfiles de interacción de FcRn mejorados pueden mostrar una biodisponibilidad mejorada después de la administración oral. El transporte de anticuerpos mediado por FcRn también puede ocurrir en otras membranas mucosas tales como aquellas en los tractos gastrointestinal, respiratorio y genital (Yoshida et al. (2004) Immunity 20:769-83).
[0223] Además, en la técnica se conoce cualquiera de varios sistemas de administración y se puede usar para administrar los anticuerpos descritos en el presente documento. Los ejemplos incluyen, entre otros, encapsulación en liposomas, micropartículas, microesferas (por ejemplo, microesferas de PLA/PGA) y similares. Alternativamente, se puede usar un implante de un material poroso, no poroso o gelatinoso, que incluye membranas o fibras. Los sistemas de liberación prolongada pueden comprender un material o matriz poliméricos tales como poliésteres, hidrogeles, poli(vinilalcohol), polilactidas, copolímeros de ácido L-glutámico y L-gutamato de etilo, acetato de etileno-vinilo, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico tales como el Lupron Deport® y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. También es posible administrar un ácido nucleico que codifica una inmunoglobulina descrita en el presente documento, por ejemplo mediante infección retroviral, inyección directa o recubrimiento con lípidos, receptores de superficie celular u otros agentes de transfección. En todos los casos, se pueden usar sistemas de liberación controlada para liberar la inmunoglobulina en el lugar de acción deseado o cerca de él.
Dosificación
[0224] Las cantidades de dosificación y las frecuencias de administración se seleccionan, en una realización, para que sean terapéutica o profilácticamente eficaces. Como se sabe en la técnica, los ajustes para la degradación de proteínas, la administración sistémica frente a la localizada y la tasa de síntesis de nuevas proteasas, así como la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo, la dieta, el tiempo de administración, la interacción farmacológica y la gravedad de la afección pueden ser necesario y serán comprobables mediante experimentación rutinaria por parte de los expertos en la técnica.
[0225] La concentración de la inmunoglobulina terapéuticamente activa en la formulación puede variar desde aproximadamente el 0.1 al 100 % en peso. En una realización, la concentración de la inmunoglobulina está en el intervalo de 0.003 a 1.0 molar. Para tratar a un paciente, se puede administrar una dosis terapéuticamente eficaz de la inmunoglobulina descrita en el presente documento. Por "dosis terapéuticamente eficaz" en el presente documento se entiende una dosis que produce los efectos para los que se administra. La dosis exacta dependerá del propósito del tratamiento y podrá determinarla un experto en la técnica utilizando técnicas conocidas. Las dosis pueden variar entre 0.0001 y 100 mg/kg de peso corporal o más, por ejemplo 0.1, 1, 5, 10 o 50 mg/kg de peso corporal. En una realización, las dosis varían de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 mg/kg. En otra realización, la dosis es de aproximadamente 5 mg/kg.
[0226] En algunas realizaciones, los anticuerpos usados para tratar una enfermedad relacionada con la IgG4 se pueden administrar en dosis mayores o iguales a 0.2 mg/kg. Por ejemplo, los anticuerpos usados para tratar una enfermedad relacionada con la IgG4 se pueden administrar en dosis mayores o iguales a 0.1 mg/kg, mayores o iguales a 0.5 mg/kg, mayores o iguales a 1 mg/kg, mayores o iguales a 2 mg/kg, mayores o iguales a 5 mg/kg, mayores o iguales a 10 mg/kg, mayores o iguales a 15 mg/kg, mayores o iguales a 20 mg/kg o mayores o iguales 25 mg/kg. Alternativamente, los anticuerpos usados para tratar una enfermedad relacionada con la IgG4 se pueden administrar en dosis mayores o iguales a 25 mg/kg, mayores o iguales a 50 mg/kg, mayores o iguales a 75 mg/kg, mayores o iguales a 100 mg/kg, mayores o iguales a 125 mg/kg, mayores o iguales a 150 mg/kg, mayores o iguales a 175 mg/kg o mayores o iguales a 200 mg/kg. En otras realizaciones, los anticuerpos usados para tratar una enfermedad relacionada con la IgG4 se pueden administrar en dosis de aproximadamente 0.2 mg/kg. Por ejemplo, los anticuerpos usados para tratar una enfermedad relacionada con la IgG4 se pueden administrar en dosis de aproximadamente 0.1 mg/kg, aproximadamente 0.5 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 2 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 15 mg/kg, aproximadamente 20 mg/kg o aproximadamente 25 mg/kg. Alternativamente, los anticuerpos usados para tratar una enfermedad relacionada con la IgG4 se pueden administrar en dosis de aproximadamente 25 mg/kg, aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 75 mg/kg, aproximadamente 100 mg/kg, aproximadamente 125 mg/kg, aproximadamente 150 mg/kg, aproximadamente 175 mg/kg o aproximadamente 200 mg/kg.
[0227] En algunas realizaciones, solo se usa una dosis única de inmunoglobulina. En otras realizaciones, se administran múltiples dosis de inmunoglobulina. El tiempo transcurrido entre administraciones puede ser inferior a 1 hora, de aproximadamente 1 hora, aproximadamente 1-2 horas, aproximadamente 2-3 horas, aproximadamente 3-4 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 48 horas, aproximadamente 2 a 4 días, aproximadamente 4 a 6 días, aproximadamente 7 días, aproximadamente 14 días o más de 14 días. En determinadas realizaciones, la inmunoglobulina se administra cada 14 días. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina se administra en al menos 1 dosis. En otras realizaciones, la inmunoglobulina se administra en al menos 2 dosis. En otras realizaciones, la inmunoglobulina se administra en al menos 3 dosis. En otras realizaciones, la inmunoglobulina se administra en al menos 4 dosis. En otras realizaciones, la inmunoglobulina se administra en al menos 5 dosis. En otras realizaciones, la inmunoglobulina se administra en al menos 6 dosis. En otras realizaciones, la inmunoglobulina se administra en al menos 7 dosis. En otras realizaciones, la inmunoglobulina se administra en al menos 8 dosis. En otras realizaciones, la inmunoglobulina se administra en al menos 9 dosis. En otras realizaciones, la inmunoglobulina se administra en al menos 10 dosis. En otras realizaciones, la inmunoglobulina se administra en al menos 11 dosis. En otras realizaciones, la inmunoglobulina se administra en al menos 12 dosis. En otras realizaciones, la inmunoglobulina se administra en más de 2 dosis. En una realización particular, la inmunoglobulina se administra cada 14 días hasta un total de 12 dosis.
[0228] En otras realizaciones, los anticuerpos descritos en el presente documento se administran en regímenes de dosificación metronómica, ya sea mediante infusión continua o administración frecuente sin períodos de descanso prolongados. Dicha administración metronómica puede implicar dosificación a intervalos constantes sin períodos de descanso. Normalmente, dichos regímenes abarcan una infusión crónica o continua en dosis bajas durante un periodo de tiempo prolongado, por ejemplo 1-2 días, 1-2 semanas, 1-2 meses o hasta 6 meses o más. El uso de dosis más bajas puede minimizar los efectos secundarios y la necesidad de períodos de descanso.
[0229] En determinadas realizaciones, la inmunoglobulina descrita en el presente documento y uno o varios agentes profilácticos o terapéuticos se administran cíclicamente al paciente. La terapia cíclica implica la administración de un primer agente en un momento, un segundo agente en un segundo momento, opcionalmente agentes adicionales en momentos adicionales, opcionalmente un período de descanso, y luego repetir esta secuencia de administración una o más veces. El número de ciclos es típicamente de 2 - 10. La terapia cíclica puede reducir el desarrollo de resistencia a uno o varios agentes, puede minimizar los efectos secundarios o puede mejorar la eficacia del tratamiento.
Terapias de combinación
[0230] Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden administrarse concomitantemente con uno o varios regímenes o agentes terapéuticos diferentes. Los regímenes o agentes terapéuticos adicionales pueden usarse para mejorar la eficacia o la seguridad de la inmunoglobulina. Además, los regímenes o agentes terapéuticos adicionales pueden usarse para tratar la misma enfermedad o una comorbilidad en lugar de alterar la acción de la inmunoglobulina. Por ejemplo, una inmunoglobulina descrita en el presente documento puede administrarse al paciente junto con quimioterapia, radioterapia o ambas a la vez. La inmunoglobulina descrita en el presente documento puede administrarse en combinación con uno o varios agentes profilácticos o terapéuticos, que incluyen, entre otros, agentes citotóxicos, agentes quimioterapéuticos, citocinas, agentes inhibidores del crecimiento, agentes antihormonales, inhibidores de quinasas, agentes antiangiogénicos, cardioprotectores, agentes inmunoestimulantes, agentes inmunosupresores, agentes que promueven la proliferación de células hematológicas, inhibidores de la angiogénesis, inhibidores de la proteína tirosina quinasa (PTK), anticuerpos adicionales, FcYRllb u otros inhibidores del receptor Fc, u otros agentes terapéuticos.
[0231] Los términos "en combinación con" y "coadministración" no se limitan a la administración de dichos agentes profilácticos o terapéuticos exactamente al mismo tiempo. En lugar de ello, se entiende que la inmunoglobulina descrita en el presente documento y el otro agente o agentes se administran en una secuencia y dentro de un intervalo de tiempo tal que puedan actuar juntos para proporcionar un beneficio que aumenta frente al tratamiento solo con la inmunoglobulina descrita en el presente documento o solo con el otro agente o agentes. En algunas realizaciones, las inmunoglobulinas descritas en el presente documento y el otro agente o agentes actúan de forma aditiva y, a veces, sinérgica. Dichas moléculas están adecuadamente presentes combinadas en cantidades que son eficaces para el fin previsto. El médico experto puede determinar de manera empírica, o teniendo en cuenta la farmacocinética y los modos de acción de los agentes, las dosis apropiadas de cada agente terapéutico, así como los tiempos y métodos de administración apropiados.
[0232] En algunas realizaciones, los anticuerpos descritos en el presente documento para el tratamiento de una enfermedad relacionada con la IgG4 se pueden usar en combinación con tratamientos estándar para la IgG4-RD.
Los ejemplos no limitantes de tratamientos estándar para la IgG4-RD incluyen fármacos antiinflamatorios analgésicos (AINE tales como aspirina, ibuprofeno, naproxeno o celebrex), paracetamol, esteroides, glucocorticoides (es decir, prednisona), agentes inmunosupresores (es decir azatioprina, micofenolato de mofetilo), e inmunosupresores biológicos (es decir rituximab, bortezomib)
[0233] En una realización, los anticuerpos descritos en el presente documento se administran con una o varias moléculas adicionales que comprenden anticuerpos o Fc. Los anticuerpos divulgados en el presente documento pueden coadministrarse con uno o varios anticuerpos que tengan eficacia en el tratamiento de la misma enfermedad o una comorbilidad adicional; por ejemplo, se pueden administrar dos anticuerpos que reconozcan dos antígenos que se sobreexpresan en un tipo determinado de cáncer, o dos antígenos que median en la patogénesis de una enfermedad autoinmune o infecciosa.
[0234] Los ejemplos de anticuerpos anticancerígenos que se pueden coadministrar incluyen, entre otros, anticuerpos anti-antígeno de superficie celular 17-1A tales como Panorex™ (edrecolomab); anticuerpos anti-4-1BB; anticuerpos anti-4Dc; anticuerpos anti-A33 tales como A33 y CDP-833; anticuerpos anti-integrina a4p1 tales como natalizumab; anticuerpos anti-integrina a4p7 tales como LDP-02; anticuerpos anti-integrina aVpi tales como F-200, M-200 y SJ-749; anticuerpos anti-integrina aVp3 tales como abciximab, CNTO-95, Mab-17E6 y Vitaxin™; anticuerpos anti-factor 5 del complemento (C5) tales como 5G1.1; anticuerpos anti-CA125 tales como OvaRex® (oregovomab); anticuerpos anti-CD3 como Nuvion® (visilizumab) y Rexomab; anticuerpos anti-CD4 tales como IDEC-151, MDX-CD4, OKT4A; anticuerpos anti-cD6 tales como Oncolysin B y Oncolysin CD6; anticuerpos anti-CD7 tales como HB2; anticuerpos anti-CD19 tales como B43, MT-103 y Oncolysin B; anticuerpos anti-CD20 como 2H7, 2H7.v16, 2H7.v114, 2H7.v115, Bexxar® (tositumomab, anti-CD20 marcado con I-131), Rituxan® (rituximab) y Zevalin® (Ibritumomab tiuxetan, anti-CD20 marcado con Y-90); anticuerpos anti-CD22 tales como Lymphocide™ (epratuzumab, anti-CD22 marcado con Y-90); anticuerpos anti-CD23 tales como IDEC-152; anticuerpos anti-CD25 como basiliximab y Zenapax® (daclizumab); anticuerpos anti-CD30 tales como AC10, MDX-060 y SGN-30; anticuerpos anti-CD33 tales como Mylotarg® (gemtuzumab ozogamicina), Oncolysin M y Smart M195; anticuerpos anti-CD38; anticuerpos anti-CD40 tales como SGN-40 y toralizumab; anticuerpos anti-CD40L tales como 5c8, Antova™ e IDEC-131; anticuerpos anti-CD44 tales como bivatuzumab; anticuerpos anti-CD46; anticuerpos anti-CD52 como Campath® (alemtuzumab); anticuerpos anti-CD55 tales como SC-1; anticuerpos anti-CD56 tales como huN901-DM1; anticuerpos anti-CD64 tales como MDX-33; anticuerpos anti-CD66e tales como XR-303; anticuerpos anti-CD74 tales como IMMU-110; anticuerpos anti-CD80 tales como galiximab e IDEC-114; anticuerpos anti-CD89 tales como MDX-214; anticuerpos anti-CD123; anticuerpos anti-CD138 tales como B-B4-DM1; anticuerpos anti-CD146 tales como AA-98; anticuerpos anti-CD148; anticuerpos anti-CEA tales como cT84.66, labetuzumab y Pentacea™; anticuerpos anti-CTLA-4 tales como MDX-101; anticuerpos anti-CXCR4; anticuerpos anti-EGFR tales como ABX-EGF, Erbitux® (cetuximab), IMC-C225 y Merck Mab 425; anticuerpos anti-EpCAM tales como anti-EpCAM de Crucell, ING-1 e IS-IL-2; anticuerpos anti-efrina B2/EphB4; anticuerpos anti-Her2 tales como Herceptin®, MDX-210; anticuerpos anti-FAP (proteína de activación de fibroblastos) tales como sibrotuzumab; anticuerpos antiferritina tales como NXT-211; anticuerpos anti-FGF-1; anticuerpos anti-FGF-3; anticuerpos anti-FGF-8; anticuerpos anti-FGFR, anticuerpos anti-fibrina; anticuerpos anti-G250 tales como WX-G250 y Rencarex®; anticuerpos gangliósidos anti-GD2 tales como EMD-273063 y TriGem; anticuerpos gangliósidos anti-GD3 tales como BEC2, KW-2871 y mitumomab; anticuerpos anti-gpllb/Illa tales como ReoPro; anticuerpos antiheparinasa; anticuerpos anti-Her2/ErbB2 tales como Herceptin® (trastuzumab), MDX-210 y pertuzumab; anticuerpos anti-HLA tales como Oncolym®, Smart 1D10; anticuerpos anti-HM1.24; anticuerpos anti-ICAM tales como lCM3; anticuerpos anti-receptor IgA; anticuerpos anti-IGF-1 tales como CP-751871 y EM-164; anticuerpos anti-IGF-IR tales como IMC-A12; anticuerpos anti-IL-6 tales como CNTO-328 y elsilimomab; anticuerpos anti-IL-15 tales como HuMax™-IL15; anticuerpos anti-KDR; anticuerpos anti-laminina 5; anticuerpos anti-antígeno Lewis Y tales como Hu3S193 e IGN-311; anticuerpos anti-MCAM; anticuerpos anti-Mucl tales como BravaRex y TriAb; anticuerpos anti-NCAM tales como ERIC-1 e ICRT; anticuerpos anti-antígeno PEM tales como Theragyn y Therex; anticuerpos anti-PSA; anticuerpos anti-PSCA tales como IG8; anticuerpos anti-Ptk; anticuerpos anti-PTN; anticuerpos anti-RANKL tales como AMG-162; anticuerpos anti-RLIP76; anticuerpos anti-antígeno SK-1 tales como Monopharm C; anticuerpos anti-STEAP; anticuerpos anti-TAG72 tales como CC49-SCA y MDX-220; anticuerpos anti-TGF-p tales como CAT-152; anticuerpos anti-TNF-a tales como CDP571, CDP870, D2E7, Humira® (adalimumab) y Remicade® (infliximab); anticuerpos anti-TRAIL-RI y anti-TRAIL-R2; anticuerpos anti-VE-cadherina-2; y anticuerpos anti-VLA-4 como Antegren™. Además, se pueden usar anticuerpos antiidiotipo que incluyen, entre otros, el anticuerpo BEC2 frente al epítopo GD3 y el anticuerpo 105AD7 frente al epítopo gp72. Además, se pueden usar anticuerpos biespecíficos que incluyen, entre otros, el anticuerpo anti-CD3/CD20 Bi20.
[0235] Los ejemplos de anticuerpos que se pueden coadministrar para tratar enfermedades autoinmunitarias o inflamatorias, rechazo de trasplantes, GVHD y similares incluyen, entre otros, anticuerpos anti-integrina-a4p7 tales como LDP-02, anticuerpos anti-integrina beta2 tales como LDP-01, anticuerpos anti-complemento (C5) tales como 5G1.1, anticuerpos anti-CD2 tales como BTI-322, MEDI-507, anticuerpos anti-CD3 tales como OKT3, SMART anti-CD3, anticuerpos anti-CD4 como IDEC-151, MDX-CD4, OKT4A, anticuerpos anti-CD11a, anticuerpos anti-CD14 tales como IC14, anticuerpos anti-CD18, anticuerpos anti-CD23 tales como IDEC 152, anticuerpos anti-CD25 tales como Zenapax, anticuerpos anti-CD40L tales como como 5c8, Antova, IDEC-131, anticuerpos anti-CD64 tales como MDX-33, anticuerpos anti-CD80 tales como IDEC-114, anticuerpos antiCD147 tales como ABX-CBL, anticuerpos anti-E-selectina tales como CDP850, anticuerpos anti-gpllb/Illa tales como ReoPro/Abcixima, anticuerpos anti-ICAM-3 como ICM3, anticuerpos anti-ICE tales como VX-740, anticuerpos anti-FcyR1 tales como MDX-33, anticuerpos anti-IgE tales como rhuMab-E25 , anticuerpos anti-IL-4 tales como SB-240683, anticuerpos anti-IL-5 como SB-240563, SCH55700, anticuerpos anti-IL-8 como ABX-IL8, anticuerpos anti-interferón gamma y anticuerpos anti-TNFa tales como CDP571, CDP870, D2E7, Infliximab, MAK-195F, anticuerpos anti-VLA-4 como Antegren. Los ejemplos de otras moléculas que contienen Fc que pueden coadministrarse para tratar enfermedades autoinmunitarias o inflamatorias, rechazo de trasplantes, GVHD y similares incluyen, entre otros, la fusión del receptor de TNF p75/Fc Enbrel® (etanercept) y la trampa IL-1 de Regeneron.
[0236] Los ejemplos de anticuerpos que se pueden coadministrar para tratar enfermedades infecciosas incluyen, entre otros, anticuerpos anti-ántrax como ABthrax, anticuerpos anti-CMV como CytoGam y sevirumab, anticuerpos anti-cryptosporidium como CryptoGAM, Sporidin-G, anticuerpos anti-helicobacter tales como Pyloran, anticuerpos anti-hepatitis B tales como HepeX-B, Nabi-HB, anticuerpos anti-VIH tales como HRG-214, anticuerpos anti-RSV tales como felvizumab, HNK-20, palivizumab, RespiGam, y anticuerpos antiestafilococos como Aurexis, Aurograb, BSYX-A110 y SE-Mab.
[0237] Alternativamente, los anticuerpos descritos en el presente documento se pueden coadministrar con una o varias moléculas diferentes que compitan por la unión a uno o varios receptores Fc. Por ejemplo, la coadministración de inhibidores del receptor inhibidor FcYRIIb puede dar lugar a un aumento de la función efectora. De manera similar, la coadministración de inhibidores de los receptores activadores como FcYRlla puede minimizar la función efectora no deseada. Los inhibidores del receptor de Fc incluyen, entre otros, moléculas de Fc diseñadas para actuar como inhibidores competitivos para la unión a FcYRIlb FcYRllla u otros receptores de Fc, así como otras inmunoglobulinas y específicamente el tratamiento llamado IVIg (inmunoglobulina intravenosa). En una realización, el inhibidor se administra y se deja actuar antes de administrar la inmunoglobulina. Una forma alternativa de lograr el efecto de la dosificación secuencial sería proporcionar una forma farmacéutica de liberación inmediata del inhibidor del receptor de Fc y luego una formulación de liberación prolongada de una inmunoglobulina descrita en el presente documento. Las formulaciones de liberación inmediata y de liberación controlada podrían administrarse por separado o combinarse en una forma de dosificación unitaria. La administración de un inhibidor de FcYRIlb también puede usarse para limitar respuestas inmunitarias no deseadas, por ejemplo, la respuesta de anticuerpos anti-Factor VIII después de la administración de Factor VIII a hemofílicos.
[0238] En una realización, los anticuerpos descritos en el presente documento se administran con un agente quimioterapéutico. Por "agente quimioterapéutico", tal como se utiliza en el presente documento, se entiende un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen, entre otros, agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida (CYTOXAN™); alquilsulfonatos tales como busulfano, improsulfano y piposulfano; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; antiandrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina; antibióticos tales como aclacinomysinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, caliqueamicina, carabicina, caminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina, epirrubicina, esorubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamycina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; antiestrógenos que incluyen, por ejemplo, tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazoles inhibidores de aromatasa, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY 117018, onapristona y toremifeno (Fareston); antimetabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos del ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas que incluyen altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosfaoramida y trimetilolomelamina; reponedor de ácido fólico como el ácido frolínico; mostazas nitrogenadas tales como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembiquina, fenetesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; análogos del platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; proteínas tales como arginina deiminasa y asparaginasa; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; taxanos, p. ej., paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, Nueva Jersey) y docetaxel (TAXOTERE®, Rhne-Poulenc Rorer, Antony, Francia); inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; inhibidor de timidilato sintasa (como Tomudex); los productos quimioterapéuticos adicionales incluyen aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; amsacrino; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; difluorometilornitina (DMFO); elformitina; acetato de eliptinio; etoglucido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK®; razoxano; sizofurano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; clorambucilo; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; tenipósido; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; ácido retinoico; esperamicinas; capecitabina. También se pueden usar sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.
[0239] Se puede administrar un agente quimioterapéutico u otro agente citotóxico como profármaco. Por "profármaco", tal como se utiliza en el presente documento, se entiende una forma precursora o derivada de una sustancia farmacéuticamente activa que es menos citotóxica para las células tumorales en comparación con el fármaco original y que es capaz de activarse enzimáticamente o convertirse en la forma original más activa. Ver, por ejemplo Wilman, 1986, Biochemical Society Transactions, 615th Meeting, Belfast, 14:375-382; Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery", Directed Drug Delivery; y Borchardt et al, (ed.): 247 267, Humana Press, 1985. Los profármacos que pueden usarse con las inmunoglobulinas descritas en el presente documento incluyen, entre otros, profármacos que contienen fosfato, profármacos que contienen tiofosfato, profármacos que contienen sulfato, profármacos que contienen péptidos, profármacos modificados con D-aminoácidos, profármacos glicosilados, profármacos que contienen betalactámicos, profármacos que contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituidos o profármacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituidos, 5-fluorocitosina y otros profármacos de 5-fluorouridina que pueden convertirse en el fármaco libre citotóxico más activo. Los ejemplos de fármacos citotóxicos que pueden derivatizarse en una forma de profármaco para su uso con los anticuerpos descritos en el presente documento incluyen, entre otros, cualquiera de los agentes quimioterapéuticos antes mencionados.
[0240] Una variedad de otros agentes terapéuticos pueden usarse para la administración con los anticuerpos descritos en el presente documento. En una realización, la inmunoglobulina se administra con un agente antiangiogénico. Por "agente antiangiogénico", tal como se utiliza en el presente documento, se entiende un compuesto que bloquea, o interfiere en algún grado, el desarrollo de los vasos sanguíneos. El factor antiangiogénico puede ser, por ejemplo, una molécula pequeña o una proteína, por ejemplo un anticuerpo, una fusión de Fc o una citocina, que se une a un factor de crecimiento o a un receptor del factor de crecimiento implicado en la promoción de la angiogénesis. En una realización, un factor antiangiogénico puede ser un anticuerpo que se une al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). También se pueden usar otros agentes que inhiben la señalización a través del VEGF, por ejemplo, las terapias basadas en ARN que reducen los niveles de expresión del VEGF o VEGF-R, las fusiones de VEGF-toxina, la trampa VEGF de Regeneron y los anticuerpos que se unen a VEGF-R. En una realización alternativa, el anticuerpo se administra con un agente terapéutico que induce o mejora la respuesta inmune adaptativa, por ejemplo un anticuerpo que apunta a CTLA-4. Los agentes antiangiogénicos adicionales incluyen, entre otros, angiostatina (fragmento de plasminógeno), antitrombina III, angiozima, ABT-627, Bay 12-9566, benefin, bevacizumab, bifosfonatos, BMS-275291, inhibidor derivado del cartílago (CDI), CAI, fragmento de complemento CD59, CEP-7055, Col 3, combretastatina A-4, endostatina (fragmento de colágeno XVIII), inhibidores de farnesil transferasa, fragmento de fibronectina, grobeta, halofuginona, heparinasas, fragmento de hexasacárido de heparina, HMV833, gonadotropina coriónica humana (hCG), IM-862, interferón alfa, interferón beta, interferón gamma, proteína inducible por interferón 10 (IP-10), interleucina-12, kringle 5 (fragmento de plasminógeno), marimastat, inhibidores de metaloproteinasas (por ejemplo, TIMP), 2-metodiestradiol, MMI 270 (C<g>S 27023A), inhibidor del activador del plasminógeno (PAI), factor plaquetario 4 (PF4), prinomastat, fragmento de prolactina de 16 kDa, proteína relacionada con la proliferina (PRP), PTK 787/ZK 222594, retinoides, solimastat, escualamina, SS3304, SU5416, SU6668, SU11248, tetrahidrocortisol-S, tetratiomolibdato, talidomida, trombospondina-1 (TSP-1), TNP-470, factor de crecimiento transformante beta (TGF-P), vasculostatina, vasostatina (fragmento de calreticulina), ZS6126 y ZD6474.
[0241] En una realización, la inmunoglobulina se administra con un inhibidor de tirosina quinasa. Por "inhibidor de tirosina quinasa", como se usa en el presente documento, se entiende una molécula que inhibe hasta cierto punto la actividad tirosina quinasa de una tirosina quinasa. Los ejemplos de dichos inhibidores incluyen, entre otros, quinazolinas, tales como PD 153035, 4-(3-cloroanilino)quinazolina; piridopirimidinas; pirimidopirimidinas; pirrolopirimidinas tales como CGP 59326, CGP 60261 y CGP 62706; pirazolopirimidinas, 4-(fenilamino)-7H-pirrolo(2,3-d)pirimidinas; curcumina (diferuloil metano, 4,5-bis (4-fluoroanilino)ftalimida); tirfostinas que contienen fragmentos de nitrotiofeno; PD-0183805 (Warner-Lambert); moléculas antisentido (por ejemplo, aquellas que se unen al ácido nucleico que codifica ErbB); quinoxalinas (EE. UU. 5.804.396); trifostinas (Ee . u U. 5.804.396); ZD6474 (AstraZeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG); inhibidores pan-ErbB tales como C1-1033 (Pfizer); Affinitac (ISIS 3521; Isis/Lilly); mesilato de imatinib (STI571, Gleevec®; Novartis); PKI 166 (Novartis); GW2016 (Glaxo SmithKline); C1-1033 (Pfizer); EKB-569 (Wyeth); Semaxinib (Sugen); ZD6474 (AstraZeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG); INC-1C11 (Imclón); o según se describe en cualquiera de las siguientes publicaciones de patentes: EE. UU. 5.804.396; PCT Wo 99/09016 (American Cyanimid); PCT WO 98/43960 (American Cyanimid); PCT WO 97/38983 (Warner-Lambert); PCT WO 99/06378 (Warner-Lambert); PCT WO 99/06396 (Warner-Lambert); PCT WO 96/30347 (Pfizer, Inc.); PCT WO 96/33978 (AstraZeneca); PCT WO96/3397 (AstraZeneca); PCT WO 96/33980 (AstraZeneca), gefitinib (IRESSA™, z D1839, AstraZeneca) y OSI-774 (Tarceva™, OSI Pharmaceuticals/Genentech).
[0242] En otra realización, la inmunoglobulina se administra con uno o varios agentes inmunomoduladores. Dichos agentes pueden aumentar o disminuir la producción de una o varias citocinas, regular al alza o a la baja la presentación de autoantígenos, enmascarar antígenos del MHC o promover la proliferación, diferenciación, migración o estado de activación de uno o varios tipos de células inmunitarias. Los agentes inmunomoduladores incluyen, entre otros: fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) como aspirina, ibuprofeno, celecoxib, diclofenaco, etodolaco, fenoprofeno, indometacina, ketoralaco, oxaprozina, nabumentona, sulindaco, tolmentina, rofecoxib, naproxeno, ketoprofeno y nabumetona; esteroides (por ejemplo, glucocorticoides, dexametasona, cortisona, hidroxicortisona, metilprednisolona, prednisona, prednisolona, trimcinolona, azulfidinicosanoides tales como prostaglandinas, tromboxanos y leucotrienos; así como esteroides tópicos tales como antralina, calcipotrieno, clobetasol y tazaroteno); citocoinas tales como TGFb, IFNa, IFNb, IFNg, IL-2, IL-4, IL-10; citocina, quimiocina o antagonistas de receptores, incluidos anticuerpos, receptores solubles y fusiones de receptor de Fc contra BAFF, B7, CCR2, CCR5, CD2, CD3, CD4, CD6, CD7, CD8, CD11, CD14, CD15, CD17, CD18, CD20, CD23, CD28, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD52, CD64, CD80, CD86, CD147, CD152, factores del complemento (C5, D) CTLA4, eotaxina, Fas, ICAM, ICOS, IFNa, IFNp, IFNy, IFNAR, IgE, IL-1, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-5R, IL-6, IL-8, IL-9 IL-12, IL-13, IL-13R1, IL-15, IL-18R, IL-23, integrinas, LFA-1, LFA-3, MHC, selectinas, TGFp, TNFa, TNPp, TNF-R1, receptor de células T, incluido Enbrel® (etanercept), Humira® (adalimumab) y Remicade® (infliximab); globulina antilinfocítica heteróloga; otras moléculas inmunomoduladoras tales como pirimidinas sustituidas con 2-amino-6-aril-5, anticuerpos antiidiotípicos para péptidos de unión a MHC y fragmentos de MHC, azatioprina, brequinar, bromocriptina, ciclofosfamida, ciclosporina A, D-penicilamina, desoxispergualina, FK506, glutaraldehído, oro, hidroxicloroquina, leflunomida, malononitriloamidas (p. ej., leflunomida), metotrexato, minociclina, mizoribina, micofenolato de mofetilo, rapamicina y sulfasasazina.
[0243] En una realización alternativa, las inmunoglobulinas descritas en el presente documento se administran con una citocina. Por "citocina", tal como se utiliza en el presente documento, se entiende un término genérico para proteínas liberadas por una población celular que actúan sobre otra célula como mediadores intercelulares. Ejemplos de tales citocinas son las linfocinas, las monocinas y las hormonas polipeptídicas tradicionales. Entre las citocinas se incluyen la hormona del crecimiento como, por ejemplo, la hormona del crecimiento humana, la hormona del crecimiento humana N-metionil y la hormona del crecimiento bovina; la hormona paratiroidea; la tiroxina; la insulina; la proinsulina; la relaxina; la prorelaxina; las hormonas glicoproteicas tales como la hormona estimulante del folículo (FSH), la hormona estimulante de la tiroides (TSH) y la hormona luteinizante (LH); el factor de crecimiento hepático; el factor de crecimiento de fibroblastos; la prolactina; el lactógeno placentario; el factor de necrosis tumoral alfa y beta; la sustancia inhibidora de Muller; el péptido asociado a la gonadotropina de ratón; la inhibina; la activina; el factor de crecimiento vascular endotelial; la integrina; la trombopoyetina (TPO); los factores de crecimiento nervioso tales como NGF-beta; el factor de crecimiento plaquetario; los factores de crecimiento transformantes (TGF) tales como el TGF-alfa y el TGF-beta; los factores de crecimiento similares a la insulina I y II; la eritropoyetina (EPO); los factores osteoinductivos; los interferones tales como los interferones alfa, beta y gamma; los factores estimulantes de colonias (CSF) tales como los macrófagos-CSF (M-CSF); los granulocitos-macrófagos-CSF (GM-CSF); y los granulocitos-CSF (G-CSF); las interleucinas (IL) tales como IL-1, IL-1alfa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; IL-15, un factor de necrosis tumoral tal como TNF-alfa o TNF-beta; y otros factores polipeptídicos que incluyen LIF y ligando kit (KL). Tal como se utiliza en el presente documento, el término citocina incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivos celulares recombinantes, y equivalentes biológicamente activos de las citocinas de secuencia nativa.
[0244] En una realización, se coadministran citocinas u otros agentes que estimulan las células del sistema inmunológico con la inmunoglobulina descrita en el presente documento. Dicho modo de tratamiento puede mejorar la función efectora deseada. Por ejemplo, se pueden coadministrar agentes que estimulan las células NK, incluyendo, entre otros, IL-2. En otra realización, se pueden coadministrar agentes que estimulan los macrófagos, incluidos, entre otros, C5a, péptidos formílicos tales como N-formil-metionil-leucil-fenilalanina (Beigier-Bompadre et al. (2003) Scand. J. Immunol. 57: 221-8). Además, se pueden administrar agentes que estimulan los neutrófilos, incluyendo, entre otros, G-CSF, GM-CSF y similares. También se pueden usar agentes que promuevan la migración de tales citocinas inmunoestimulantes. Además, agentes adicionales que incluyen, entre otros, el interferón gamma, IL-3 e IL-7 pueden promover una o varias funciones efectoras.
[0245] En una realización alternativa, se coadministran citocinas u otros agentes que inhiben la función de las células efectoras con la inmunoglobulina descrita en el presente documento. Dicho modo de tratamiento puede limitar la función efectora no deseada.
[0246] En una realización adicional, la inmunoglobulina se administra con uno o varios antibióticos, que incluyen, entre otros: antibióticos aminoglucósidos (por ejemplo, apramicina, arbekacina, bambermicinas, butirosina, dibekacina, gentamicina, kanamicina, neomicina, netilmicina, paromomicina, ribostamicina, sisomicina, espectrinomicina), aminociclitoles (p. ej., espectinomicina), antibióticos anfenicoles (p. ej., azidamfenicol, cloranfenicol, florfenicol y tiamfemicol), antibióticos ansamicina (p. ej., rifamida y rifampicina), carbapenems (p. ej., imipenem, meropenem, panipenem); cefalosporinas (por ejemplo, cefaclor, cefadroxilo, cefamandol, cefatrizina, cefazedona, cefozopran, cefpimizol, cefpiramida, cefpiroma, cefprozil, cefuroxina, cefixima, cefalexina, cefradina), cefamicinas (cefbuperazona, cefoxitina, cefminox, cefmetazol y cefotetán); lincosamidas (por ejemplo, clindamicina, lincomicina); macrólidos (por ejemplo, azitromicina, brefeldina A, claritromicina, eritromicina, roxitromicina, tobramicina), monobactámicos (por ejemplo, aztreonam, carumonam y tigemonam); mupirocina; oxacefemas (por ejemplo, flomoxef, latamoxef y moxalactama); penicilinas (p. ej., amdinocilina, amdinocilina pivoxil, amoxicilina, bacampicilina, ácido bexcilpenicilínico, bencilpenicilina sódica, epicilina, fenbenicilina, floxacilina, penamecilina, penetamato yodhidrato, penicilina o-benetamina, penicilina O, penicilina V, benzoato de penicilina V, penicilina V hidrabamina, penimepiciclina y fencihicilina potásica); polipéptidos (por ejemplo, bacitracina, colistina, polimixina B, teicoplanina, vancomicina); quinolonas (amifloxacina, cinoxacina, ciprofloxacina, enoxacina, enrofloxacina, feroxacina, flumequina, gatifloxacina, gemifloxacina, grepafloxacina, lomefloxacina, moxifloxacina, ácido nalidíxico, norfloxacina, ofloxacina, ácido oxolínico, pefloxacina, ácido pipemídico, rosoxacina, rufloxacina, esparfloxacina, temafloxacina, tosufloxacina, trovafloxacina); rifampicina; estreptograminas (por ejemplo, quinupristina, dalfopristina); sulfonamidas (sulfanilamida, sulfametoxazol); tetraciclinas (clortetraciclina, clorhidrato de demeclociclina, desmetilclortetraciclina, doxiciclina, duramicina, minociclina, neomicina, oxitetraciclina, estreptomicina, tetraciclina, vancomicina).
[0247] También se pueden usar agentes antifúngicos como anfotericina B, ciclopirox, clotrimazol, econazol, fluconazol, flucitosina, itraconazol, ketoconazol, niconazol, nistatina, terbinafina, terconazol y tioconazol.
[0248] También se pueden usar agentes antivirales que incluyen inhibidores de proteasa, inhibidores de la transcriptasa inversa y otros, que incluyen interferones de tipo I, inhibidores de fusión viral e inhibidores de neuramidasa. Los ejemplos de agentes antivirales incluyen, entre otros, aciclovir, adefovir, amantadina, amprenavir, clevadina, enfuvirtida, entecavir, foscarnet, ganciclovir, idoxuridina, indinavir, lopinavir, pleconaril, ribavirina, rimantadina, ritonavir, saquinavir, trifluridina, vidarabina y zidovudina.
[0249] Las inmunoglobulinas descritas en el presente documento se pueden combinar con otros regímenes terapéuticos. Por ejemplo, en una realización, el paciente que se va a tratar con una inmunoglobulina descrita en el presente documento también puede recibir radioterapia. La radioterapia se puede administrar según protocolos comúnmente empleados en la técnica y conocidos por los expertos. Dicha terapia incluye, entre otras, radiación de cesio, iridio, yodo o cobalto. La radioterapia puede ser irradiación de todo el cuerpo o puede dirigirse localmente a un sitio o tejido específico dentro del cuerpo o sobre él, como el pulmón, la vejiga o la próstata. Normalmente, la radioterapia se administra en pulsos durante un período de tiempo de aproximadamente 1 a 2 semanas. Sin embargo, la radioterapia se puede administrar durante períodos de tiempo más largos. Por ejemplo, se puede administrar radioterapia a pacientes que tienen cáncer de cabeza y cuello durante un tiempo de aproximadamente 6 a aproximadamente 7 semanas. Opcionalmente, la radioterapia se puede administrar como una dosis única o como dosis múltiples secuenciales. El médico experto puede determinar empíricamente las dosis apropiadas de radioterapia útiles en el presente documento. Según otro, una inmunoglobulina descrita en el presente documento y una o varias terapias anticancerígenas se emplean para tratar células cancerosas ex vivo. Se contempla que dicho tratamiento ex vivo puede ser útil en el trasplante de médula ósea y, en particular, en el trasplante autólogo de médula ósea. Por ejemplo, se puede emplear el tratamiento de células o tejidos que contienen células cancerosas con inmunoglobulina y una o varias terapias anticancerígenas, tales como las descritas anteriormente, para agotar total o sustancialmente las células cancerosas antes del trasplante en un paciente receptor.
[0250] Por supuesto, se contempla que los anticuerpos descritos en el presente documento se puedan emplear en combinación con otras técnicas terapéuticas, tales como cirugía o fototerapia.
EJEMPLOS
[0251] Los ejemplos que se proporcionan a continuación tienen únicamente fines ilustrativos. Estos ejemplos no pretenden limitar ninguna realización descrita en el presente documento a ninguna aplicación o teoría de funcionamiento particular.
Ejemplo 1. Métodos para inhibir las células FcvRIIb+
[0252] FcyRIIb se expresa en una variedad de células inmunitarias, incluidas células B, células plasmáticas, células dendríticas, monocitos y macrófagos, donde desempeña un papel fundamental en la regulación inmunitaria. En su función normal en las células B, FcyRllb sirve como mecanismo de retroalimentación para modular la activación de las células B a través del receptor de células B (BCR). La participación del receptor de antígeno de células B (BCR) por parte del antígeno inmunocomplejado en células B maduras activa una cascada de señalización intracelular, incluida la movilización de calcio, que conduce a la proliferación y diferenciación celulares. Sin embargo, a medida que se producen anticuerpos IgG con especificidad para el antígeno, los complejos inmunes (CI) asociados pueden entrecruzar el BCR con FcyRllb, tras lo cual la activación de BCR se inhibe mediante la participación de FcyRllb y las vías de señalización intracelular asociadas que interfieren con las vías corriente abajo de activación del BCR.
[0253] Las células B no solo funcionan para producir anticuerpos y citocinas que controlan la respuesta inmune, sino que también son células presentadoras de antígenos (APC). La internalización del antígeno por parte del BCR en una célula B puede desempeñar un papel en la presentación y activación de las células T. La regulación de la activación de las células B a través del BCR también está potencialmente regulada por el acoplamiento del anticuerpo FcyRIIb. Otras APC, como las células dendríticas, los macrófagos y los monocitos, son capaces de internalizar el antígeno unido a anticuerpos mediante la activación de receptores como FcyRIla, FcyRIlla y FcyRI. La expresión de FcYRIIb en estos tipos de células, particularmente en células dendríticas, puede inhibir la activación de estos tipos de células y la posterior presentación y activación de células T (Desai et al., 2007, J Immunol).
[0254] Una estrategia para inhibir la activación de los tipos de células antes mencionados es utilizar una única inmunoglobulina para coacoplar FcYRIIb con el antígeno de superficie presente en la célula FcyRllb+. En el caso de las células B, basándose en el mecanismo biológico natural, esto implicaría potencialmente un doble direccionamiento de FcYRllb y BCR, con el objetivo de imitar la supresión de la activación de las células B mediada por complejos inmunes. La FIG. 3 ilustra uno de esos mecanismos potenciales, en el que se usa un anticuerpo para coacoplar tanto FcYRIIb a través de su región Fc, como un antígeno diana asociado con el complejo bCr , en este ejemplo CD19, a través de su región Fv.
Ejemplo 2. Ingeniería de inmunoglobulinas con afinidad mejorada selectivamente por FcYRIIb
[0255] En condiciones fisiológicas, la unión del BCR con FcYRIIb y la posterior supresión de células B se produce a través de complejos inmunes de IgG y antígeno específico. La estrategia de diseño fue reproducir este efecto utilizando un único anticuerpo reticulante. La IgG humana se une al FcYRIIb humano con afinidad débil (aproximadamente 1 pM para IgG1), y la inhibición mediada por FcYRIIb se produce en respuesta a la IgG inmunocomplejada pero no monomérica. Se razonó que sería necesario aumentar la afinidad de Fc por este receptor para una inhibición máxima de la activación de las células B. Se utilizaron métodos de ingeniería de proteínas para diseñar y cribar variantes de Fc para mejorar la unión de FcYRIIb
[0256] Utilizando estructuras resueltas del complejo Fc/FcyRlllb humano (y las secuencias de los FcyR humanos), se utilizaron análisis estructurales y de secuencia para identificar las posiciones de FcyR que contribuyen a la afinidad y la selectividad de FcYRIIb en relación con los receptores activadores. La estrategia de diseño empleó dos pasos. En primer lugar, las posiciones de FcyR que son determinantes en la selectividad de unión de FcYRllb y FcYRllla se identificaron teniendo en cuenta la proximidad a la interfaz FcyR/Fc y la disimilitud de aminoácidos entre FcYRllb y FcyRllla. En segundo lugar, se identificaron las posiciones de secuencia en la región Fc proximal a estas posiciones de F<cy>R. Se diseñaron variantes de Fc que incorporan sustituciones en estas posiciones.
[0257] Se generó y seleccionó una biblioteca de variantes de Fc para explorar modificaciones de aminoácidos en estas posiciones (ver la patente de EE.UU. n° 8.063.187 de Chu et al). Se generaron y seleccionaron variantes en el contexto de un anticuerpo dirigido al antígeno CD19, un componente regulador del complejo correceptor BCR. La región Fv del anticuerpo es una versión humanizada y madurada por afinidad del anticuerpo 4G7, y se denomina HuAM4G7 en el presente documento. Las secuencias de aminoácidos de este anticuerpo se proporcionan en las FIG. 14A - FIG. 14D. Los genes Fv para este anticuerpo se subclonaron en el vector de expresión de mamíferos pTT5 (National Research Council Canada). Las mutaciones en el dominio Fc se introdujeron mediante mutagénesis dirigida (QuikChange, Stratagene, Cedar Creek, TX). Además, se generaron variantes knockout de control con afinidad eliminada por los receptores de Fc que comprenden la sustitución L328R y, o bien una sustitución G236R, o bien una Arg insertada después de la posición 236. Estas variantes (G236R/L328R y A236R/L328R) se denominan Fc-KO o FcyR knockout. Para servir como controles de isotipo de Fc no CD19, se construyeron anticuerpos anti-virus sincitial respiratorio (RSV) y anti-FITC en el vector pTT5 fusionando las regiones V<l>y V<h>apropiadas con los dominios C<lk>y C<h>1-3 con cambios de Fc. Se cotransfectaron constructos de cadenas pesadas y ligeras en células HEK293E para su expresión y los anticuerpos se purificaron utilizando cromatografía de afinidad de proteína A (Pierce Biotechnology, Rockford, IL).
[0258] Las proteínas del receptor de Fc humano FcyRI y FcYRllb para estudios de unión y competencia se obtuvieron en R&D Systems (Minneapolis, MN). Los genes que codifican las proteínas del receptor FcyRlla y FcYRllla se obtuvieron de la colección de genes de mamíferos (ATCC) y se subclonaron en el vector pTT5 (National Research Council Canada) que contenía etiquetas 6X His y GST. Las formas alélicas de los receptores (H131 y R131 para FcYRIIa y V158 y F158 para FcyRllla) se generaron mediante mutagénesis QuikChange. Los vectores que codifican los receptores se transfectaron en células HEK293T y las proteínas se purificaron mediante cromatografía de afinidad con níquel.
[0259] Se cribaron las variantes para determinar la afinidad del receptor utilizando la tecnología Biacore™, también denominada Biacore en el presente documento, una tecnología basada en la resonancia de plasmón superficial (SPR) para estudiar interacciones biomoleculares en tiempo real. Las mediciones de SPR se realizaron utilizando un instrumento Biacore 3000 (Biacore, Piscataway, Nueva Jersey). Se generó un chip biosensor CM5 de proteína A/G (Pierce Biotechnology) (Biacore) utilizando un protocolo de acoplamiento de aminas primarias estándar. Todas las mediciones se realizaron utilizando tampón HBS-EP (HEPES 10 mM, pH 7.4, NaCl 0.15 M, EDTA 3 mM, surfactante P20 al 0.005 % vol/vol, Biacore). Se inmovilizaron anticuerpos a 20 nM o 50 nM en tampón HBS-EP en la superficie de la proteína A/G y se inyectaron los FcyR. Después de cada ciclo, la superficie se regeneró inyectando tampón de glicina (10 mM, pH 1.5). Los datos se procesaron poniendo a cero el tiempo y la respuesta antes de la inyección del FcyR y restando las señales no específicas apropiadas (respuesta del canal de referencia e inyección del búfer en ejecución). Los análisis cinéticos se realizaron mediante ajuste global de los datos de unión con un modelo de unión de Langmuir 1:1 utilizando el software BIAevaluación (Biacore).
[0260] Se muestra un conjunto representativo de sensogramas para la unión de variantes seleccionadas de anticuerpos anti-CD19 a FcyRllb en la FIG. 4.
[0261] Una cantidad útil para el análisis de las variantes es su afinidad de pliegue con respecto a IgG1 WT, que se genera dividiendo la Kd para la unión de IgG1 WT por la Kd para la unión de la variante para cada receptor. Estos resultados de afinidad de pliegue se ofrecen en las FIGS. 5A-5D. Varias variantes tienen mejoras en la unión de FcyRllb de más de 2 log y afinidades sustancialmente reducidas o eliminadas por los receptores activadores. En particular, S267E (sustitución única), así como L235Y/S267E, G236D/S267<e>, S239D/S267E, S267E/H268E y S267E/L328F (sustituciones dobles) tienen una afinidad notablemente mayor por FcyRllb. Además, estas variantes tienen una afinidad por el receptor activador FcyRllla que es comparable a la IgG1 nativa, modestamente mejorada o incluso significativamente reducida.
[0262] La variante con mayor afinidad por FcyRllb, S267E/L328F, muestra una mejora de más de 2 órdenes de magnitud en la afinidad por FcyRllb y una afinidad significativamente reducida por los receptores activadores, incluyendo FcyRllla, FcyRl y H l3 l FcYRIIa.
[0263] Para validar los datos de Biacore y evaluar la unión al receptor de las variantes en la superficie celular, se midió la unión de los anticuerpos seleccionados a las células que expresan FcyRllb. Dado que las células HEK293T no expresan CD19 o FcyR, la transfección de estas células con FcYRllb permitió un análisis de la unión de anticuerpos a receptores de Fc en un sistema aislado en una superficie celular. Se transfectaron células HEK293T en DMEM con FBS al 10 % con ADNc de FcyRllb humano en el vector de expresión pCMV6 (Origene Technologies, Rockville, MD), se cultivaron durante 3 días, se recogieron, se lavaron dos veces en PBS, se resuspendieron en PBS con BSA al 0.1 % (PBS/BSA) y se dividieron en alícuotas de 2 x 105 células por pocillo en placas de microtitulación de 96 pocillos. Los anticuerpos variantes de Fc se diluyeron en serie en PBS/BSA, luego se agregaron a las células y se incubaron con mezcla durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de un lavado extenso con PBS/BSA, se añadió el fragmento F(ab<') 2>de cabra específico anti-Fab humano marcado con ficoeritrina (PE) para la detección. Las células se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente, se lavaron y se resuspendieron en PBS/BSA. La unión se evaluó usando un citómetro de flujo FACSCanto II (BD Biosciences, San José, CA), y la intensidad de fluorescencia media (MFI) se representó en función de la concentración de anticuerpos usando el software GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA) del cual los valores de unión media máxima (CE50) se determinaron mediante modelado de respuesta a la dosis sigmoidea.
[0264] Los niveles de expresión del receptor se evaluaron antes de la unión de los anticuerpos y se determinaron los valores de la concentración efectiva media máxima (CE50) de la MFI a diferentes concentraciones de anticuerpo. La FIG. 6 muestra los resultados de este experimento. Los valores de CE50 de las variantes analizadas mostraron un orden de clasificación similar al de los resultados de Biacore. La unión a la superficie celular confirmó que la variante S267E/L328F de las probadas tiene la mayor afinidad por FcyRllb, con una EC50 de aproximadamente 320 veces en relación con la IgG1 WT. La fuerte concordancia entre estos datos de unión a la superficie celular y los datos de unión de Biacore respaldan la precisión de las mediciones de afinidad.
[0265] Aunque las variantes se seleccionaron en el contexto de la IgG1 humana, se contempla que las variantes podrían usarse en el contexto de otros isotipos de anticuerpos, que incluyen, por ejemplo, entre otros, IgG2 humana, IgG3 humana e IgG4 humana (FIG. 1). Para explorar la transferibilidad de las variantes a otros isotipos de anticuerpos, se construyó y se probó la variante S267E/L328F en el contexto de un anticuerpo IgG1/2 ELLGG, que es una variante de una región Fc de IgG2 (pub. de EE. UU. n.° 2006/0134105). Se construyeron las mutaciones, se purificaron los anticuerpos y se llevaron a cabo los datos de unión como se ha descrito anteriormente. La FIG. 7 muestra las afinidades de los anticuerpos variantes IgG1 e IgG1/2 por los FcyR humanos según lo determinado por Biacore. Los datos indican que la afinidad por FcYRllb muy mejorada y el perfil de unión general de F<cy>R se mantienen en la región Fc de la IgG2 variante, respaldando así el uso de las variantes en otros contextos isotípicos.
[0266] En conjunto, los datos anteriores indican que las variantes que tienen sustituciones específicas proporcionan las propiedades objetivo, es decir, afinidad mejorada por FcyRllb y afinidad selectivamente mejorada por FcYRllb en relación con los receptores activadores FcyRI, FcYRIIa y FcYRIIIa. Las sustituciones para mejorar la afinidad por FcyRllb incluyen: 234, 235, 236, 239, 267, 268 y 328.
[0267] Las combinaciones no limitantes de posiciones para realizar sustituciones para mejorar la afinidad con FcyRllb incluyen: 235/267,236/267,236/267,267/328 y 268/267. Las sustituciones para mejorar la afinidad por FcyRllb incluyen: L234W, L2351; L235Y, L235R, L235D, G236D, G236N, S239D, S267D, S267E, H268E, H268D, L328F y L328Y. Las combinaciones de sustituciones para mejorar la afinidad por FcyRllb incluyen: L235D/S267E, L235Y/S267E, L235D/S267D, L2351/S267E, L235I/S267D, L235Y/S267D, G236D/S267E, G236D/S267D, S267E/L328F, S267D/L328F, H268D/S267E, H268D/S267D, H268E/S267E, H268E/S267D y G236D/S267E/L328F.
Ejemplo 3. Las inmunoglobulinas inhiben la viabilidad de las células B humanas primarias mediada por BCR
[0268] Aunque las células B normales tienen una larga semivida in vivo de aproximadamente cinco semanas, su vida útil se reduce considerablemente in vitro. La estimulación de BCR mediante anticuerpos de reticulación como anti-IgM o anti-CD79b contrarresta esta predisposición in vitro hacia la apoptosis, lo que conduce a la activación de las células B y a una mayor viabilidad de estas. Para demostrar esto, se realizó un ensayo de viabilidad de células B dependiente de ATP. Se purificaron células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) a partir de leucoféresis de voluntarios sanos anónimos (HemaCare, Van Nuys, CA) utilizando gradientes de densidad Ficoll-Paque Plus (Amersham Biosciences, Newark, Nueva Jersey). Las células B humanas primarias se purificaron a partir de PBMC utilizando un kit de enriquecimiento de células B (StemCell Technologies, Vancouver, Columbia Británica). El CD79b antihumano murino (clon SN8) se adquirió en Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). El anti-mu F(ab')2 policlonal se adquirió en Jackson Immunoresearch Lab (West Grove, PA). Las diluciones en serie de anticuerpos anti-mu o anti-CD79b se realizaron por triplicado en placas de microtitulación de 96 pocillos que contenían RPMI1640 con FBS al 10 %. Se agregaron células B humanas primarias purificadas (5-7.5 x 104 por pocillo) a un volumen final de 100 pl y se incubaron a 37 °C durante 3 días. Se cuantificó la luminiscencia dependiente de ATP para determinar la viabilidad celular (ensayo de viabilidad celular Cell Titer-Glo, Promega, Madison, Wl) y se usó un luminómetro Topcount (PerkinElmer, Waltham, MA) para la adquisición de datos. Las FIGS. 15A y 15B muestran los resultados del ensayo, que demuestra la supervivencia de células B humanas primarias tras la activación del BCR, realizada en el presente documento mediante reticulación con anticuerpos anti-mu (A) o anti-CD79b (B). In vivo, dicha activación se produciría a través de un antígeno inmunocomplejado, que por ejemplo podría ser un agente infeccioso, o en el caso de una reacción autoinmune o alérgica podría ser un antígeno o alérgeno autoinmune.
[0269] El ensayo de luminiscencia dependiente de ATP se usó para examinar si la viabilidad mediada por la activación del BCR de células B humanas primarias podía suprimirse mediante un anticuerpo anti-CD19 que tuviera una afinidad de Fc mejorada por FcyRllb. El experimento anterior se repitió, excepto que las diluciones en serie de anticuerpos WT, variantes y de control se realizaron por triplicado en placas de microtitulación de 96 pocillos que contenían RPMI 1640 con FBS al 10 %, más anti-CD79b a 1 pg/ml para estimular el BCR. Los resultados se muestran en la FIG. 9. Nuevamente, las células B poseían una baja viabilidad en ausencia de reticulación del BCR, y la adición de 10 pg/ml de anticuerpo anti-CD79b estimuló la supervivencia aproximadamente 6 veces (células solas frente a anti-CD79b). Anti-CD19-S267E/L328F, la variante con mayor afinidad por FcYRllb, inhibió la viabilidad estimulada por BCR de manera dependiente de la dosis. Por el contrario, los anticuerpos de control que incluyen anti-CD19-IgG1 (control de Fv) y anti-S267E/L328F (control de Fc) suprimieron mínimamente la viabilidad. Para evaluar si este efecto inhibidor requería el coacoplamiento de CD19 y FcYRllb, en lugar de la unión simultánea de cada receptor mediante diferentes anticuerpos, se comparó la variante anti-CD19-S267E/L328F con una combinación de los controles anti-CD19-IgG1 y anti-RSV-S267E/L328F a concentraciones iguales. La combinación de estos anticuerpos debería unirse simultáneamente tanto a CD19 como a FcyRllb pero, a diferencia del anti-CD19-S267E/L328F, no puede reticular estos receptores. Como se muestra en la FIG. 9, la combinación no logró suprimir la supervivencia inducida por la activación del BCR, lo que indica que se requiere el coacoplamiento de FcYRllb y CD19 mediante una sola molécula para inhibir la viabilidad mediada por BCR.
Ejemplo 4. Las inmunoglobulinas inhiben el efecto antiapoptótico dependiente del BCR en las células B humanas primarias
[0270] Aunque las células B normales in vivo tienen una semivida larga de ~5 semanas, in vitro esta vida útil se reduce considerablemente, con un aumento de la apoptosis debido a la falta de un nicho apropiado. La activación de las células B mediante estimulación a través del BCR induce un efecto antiapoptótico y prolonga la viabilidad, como se demuestra en la FIG. 8. Se realizó un ensayo de tinción con anexina-V para determinar si la actividad antiproliferativa de la variante IIbE fue el resultado de neutralizar las señales de supervivencia mediadas por BCR, permitiendo así que se produjera la apoptosis in vitro. Se incubaron 1 x 105 células B humanas primarias purificadas durante 24 h a 37 °C por triplicado con 1 pg/ml de anti-CD79b y diluciones en serie de anti-CD19 o anticuerpos de control en 100 pl de RPM11640 con FBS al 10 %. Después de la incubación, las células se recogieron y se tiñeron con anexina V conjugada con PE (Biovision, Mountain View, CA) y 7-amino-actinomicina D (7-AAD, Invitrogen, Carlsbad, CA) a 5 pg/ml. Las células de anexina V positivas/7-AAD negativas se adquirieron utilizando un citómetro de flujo FACSCanto II y se analizaron con el software de análisis FACSDiva 5 (B<d>Biosciences).
[0271] Los datos se muestran en la FIG. 10. La tinción con anexina V de células B humanas primarias cultivadas en presencia o ausencia de anti-CD79b confirmó que la apoptosis fue suprimida por la activación del BCR (FIG.
10, células solas frente a anti-CD79b). Esta señal de supervivencia se neutralizó de una manera dependiente de la dosis mediante anticuerpos de control anti-CD19-S267E/L328F, pero no mediante anticuerpos de control Fc anti-RSV-S267E/L328F o Fv anti-CD19-lgG1. La inhibición del efecto antiapoptótico, al igual que la inhibición de la movilización de calcio y la proliferación celular, requiere el coacoplamiento de CD19 y FcYRIlb mediante un solo anticuerpo, porque la combinación de anti-CD19-IgG1 y anti-RSV-S267E/L328F (controles Fv y Fc, respectivamente) no estimularon la apoptosis. Estos datos indican que la variante de IIbE anti-CD19 inhibe la proliferación de células B inducida por bCr al suprimir las señales de supervivencia antiapoptóticas.
Ejemplo 5. Datos in vivo que demuestran el potencial para tratar trastornos autoinmunes o inflamatorios [0272] Una característica distintiva de la autoinmunidad en ratones y humanos es la desregulación de la expresión de FcyRllb, lo que da como resultado un nivel superficial más bajo de este receptor inhibidor, lo que lleva a un nivel elevado de activación de las células B y, en consecuencia, a un fallo en la inhibición de las células B autorreactivas y la producción de células plasmáticas que secretan inmunoglobulinas específicas de autoantígeno. Estos complejos inmunes de inmunoglobulina autorreactivos son agentes etiológicos en diversos fallos orgánicos en la autoinmunidad sistémica y otras inflamaciones artríticas como el lupus eritematoso sistémico (LES) y la artritis reumatoide (AR). Las inmunoglobulinas descritas en el presente documento se evaluaron utilizando un modelo de ratón huPBL-SCID como sustituto, examinando la actividad de las células B medida por el número de células B y el desarrollo de células plasmáticas mediante la detección de inmunoglobulinas específicas de antígeno. En este método, se injertan PBL humanos de donantes normales o enfermos (por ejemplo, LES o AR) en ratones SCID inmunodeficientes y se tratan con la inmunoglobulina inhibidora descrita en el presente documento, luego se desafían con un antígeno para examinar el curso del desarrollo de las células B en células plasmáticas. En tal caso, se inhibe la producción de inmunoglobulinas específicas de antígeno, de lo que se puede inferir la inhibición tanto de la activación como de la diferenciación de las células B.
[0273] El protocolo para este estudio se proporciona en la FIG. 11A. En cuatro grupos diferentes de ratones, con cinco ratones en cada grupo, se les injertaron PBL humanos de un donante sano. El día 16, se administraron artículos de prueba que consistían en PBS (control de vehículo), anti-CD19 con Fc de IgG1 nativa (anti-CD19 IgG1 WT), anti-CD19 con Fc de IgG 1 de afinidad mejorada por FcYRllb (anti-CD19 S267E/L328F) o Rituximab IgG1 anti-CD20 a una dosis de 10 mg/kg dos veces por semana, con un total de 6 dosis. El día 24, se realizó un desafío con antígeno utilizando el fragmento C del toxoide tetánico, y los ratones fueron sacrificados los días 31 y 38. Se examinó la producción de anticuerpos específicos del toxoide tetánico (TT). Los resultados de este experimento se muestran en la FIG. 11B. Los datos muestran que antes de la exposición al antígeno, el nivel de anticuerpo específico anti-TT era muy bajo en todos los grupos. Después de la inmunización, el grupo de control de PBS no tratado mostró el nivel más alto de anticuerpos específicos anti-TT. En comparación, el anticuerpo anti-CD20 reductor de células B produjo un nivel bajo de anticuerpos específicos de antígeno. Después de la inmunización, el grupo anti-CD19 S267E/L328F mostró el nivel más bajo de anticuerpos específicos de antígeno, mientras que el grupo anti-CD19 IgG1 WT produjo un nivel más alto de anticuerpos específicos de antígeno. Estos datos in vivo muestran que el anticuerpo anti-CD19 con afinidad mejorada por FcYRllb es capaz de inhibir la activación de las células B y la diferenciación de las células plasmáticas secretoras de inmunoglobulinas y, por tanto, respalda el potencial de las inmunoglobulinas descritas en el presente documento para tratar trastornos autoinmunes e inflamatorios.
Ejemplo 6. Coacoplamiento de FcyRllb
[0274] La variante S267E/L328F (alta afinidad por FcYRllb), junto con las variantes IgG1 WT y Fc-KO (A236R/L328R y/o G236R/L328R) se clonaron en anticuerpos específicos para la expresión de CD19. Las FIG.
14A - FIG. 14D enumeran las regiones variables de cadena pesada y ligera (VH y VL) de los anticuerpos utilizados. Los genes VH y VL que se apuntan a estos antígenos se construyeron mediante síntesis génica y las variantes se construyeron, expresaron y purificaron como se ha descrito anteriormente.
[0275] El efecto del coacoplamiento de alta afinidad de estos antígenos con FcyRllb se evaluó utilizando el ensayo de viabilidad de células B de luminiscencia dependiente de ATP como se ha descrito anteriormente. La FIG. 12 muestra los resultados. Los datos respaldan además que CD19 es un coobjetivo eficaz para utilizar el coacoplamiento de FcyRllb de alta afinidad para inhibir la activación de las células B. Esto es consistente con su papel como componente de señalización del complejo BCR. Los resultados que utilizaron dos anticuerpos anti-CD19 adicionales confirmaron nuevamente la capacidad de este antígeno para controlar la activación de las células B usando la coligadura de Fcy
Rllb de alta afinidad, independientemente del epítopo específico al que se apunta (FIG. 13).
Ejemplo 7. Ensayo de un anticuerpo anti-CD19 S267E/L328F, un inhibidor reversible de las células CD19+, en la enfermedad relacionada con la IgG4.
[0276] La enfermedad relacionada con la IgG4 (lgG4-RD) es una afección mediada por el sistema inmunológico responsable de lesiones fibroinflamatorias que pueden provocar daños irreversibles. No existen terapias aprobadas para la IgG4-RD.
[0277] Se utilizó un anticuerpo monoclonal anti-CD19 con la modificación de Fc S267E/L328F para tratar la IgG4-RD. El anticuerpo anti-CD19 S267E/L328F en este ejemplo tiene una cadena pesada de SEC ID N.°:9 y una cadena ligera de SEC ID N.°:7, y es un anticuerpo anti-CDl9 humanizado con una porción de Fc diseñada para aumentar la afinidad (de 200 a 400 veces mayor que la IgG nativa) por FcyRllb, el único receptor de Fc en las células B. El anticuerpo se une a las células FcYRllb+ y se coacopla a CDl9, potenciando así el papel regulador natural de FcYRllb (inhibición de la activación de las células B) (FIG. 15B). La coligadura de CD19 y FcYRllb conduce a una regulación a la baja y una inhibición de las células del linaje B que portan estas dianas. La inhibición reversible de la función de las células B sin ablación de las células B es una ventaja potencial de este enfoque.
[0278] El ensayo fue una investigación abierta del anticuerpo en sujetos con IgG4-RD activa que tenían un índice de respuesta de IgG4-RD (IR de IgG4-RD) de >3 y actividad de la enfermedad en uno o varios sistemas de órganos.
[0279] El anticuerpo (5 mg/kg) se administra por vía intravenosa cada 14 días hasta un total de 12 infusiones. Se incluyeron sujetos si tenían IgG4-RD activa, un patrón compatible de afectación orgánica consistente con IgG4-RD que no puede atribuirse a otras causas, un diagnóstico histopatológicamente probado de IgG4-RD y un recuento de plasmoblastos en sangre periférica de >900 células/ml y/o niveles elevados de IgG4-RD durante el cribado.
[0280] Se inscribieron quince pacientes y recibieron una mediana de 7 infusiones (rango de 1 a 12). La edad media entre los quince pacientes incluidos fue de 63 años (rango: 43 a 77 años). Diez pacientes eran hombres y cinco mujeres. Doce eran caucásicos, uno negro y dos asiáticos. Los pacientes tenían una IgG4 sérica media de 220 mg/dl (rango: 25 - 2415; normal 3.9 - 86.4 mg/dl). La puntuación media inicial del IR de IgG4-RD fue 12 (rango: 2 - 30). Los pacientes tenían enfermedad inflamatoria activa en al menos un sistema de órganos (rango: 1 - 10, media 4) (FIG. con un promedio de 4 órganos involucrados (rango 1-10) en el momento de entrada al estudio. Los órganos más comúnmente afectados fueron los ganglios linfáticos (11 pacientes; 73 %), las glándulas submandibulares (9 pacientes; 60 %), las glándulas parótidas (8 pacientes; 53 %) y las glándulas lagrimales (7 pacientes, 47 %) (FIG. 17). La implicación del sitio del órgano que se produjo con una frecuencia > 50 % incluyó ganglios linfáticos, glándulas submandibulares y las glándulas parótidas. Diez pacientes (67 %) fueron tratados previamente. Cinco de los quince pacientes tomaban esteroides al inicio del estudio.
[0281] Se realizaron tomografías por emisión de positrones (PET) al inicio del estudio y a los tres y seis meses. La medida primaria de resultados es la proporción de pacientes en el día 169 con una disminución en el IR de IgG4-RD >2 en comparación con el valor inicial. Los glucocorticoides están permitidos, pero no son obligatorios al empezar y deben suspenderse a los dos meses. No se permiten otros medicamentos inmunosupresores. Los estudios mecanicistas se realizan al inicio y en intervalos seleccionados.
[0282] El estudio se diseñó para medir la proporción de pacientes con una mejora en la actividad de IgG4-RD, donde una mejora de la actividad patológica se define por una disminución del índice de respuesta de IgG4-RD mayor o igual a 2 puntos en relación con la puntuación de actividad patológica previa a la administración. El estudio también midió el número y el porcentaje de pacientes que experimentaron un evento adverso surgido del tratamiento según lo evaluado por CTCAE v4.3.
[0283] Cada dos semanas, la administración intravenosa del anticuerpo anti-CD19 S267E/L328F fue bien tolerada. Catorce de los quince pacientes a los que se les administró anticuerpo han mostrado una disminución de >2 puntos en el IR de IgG4-RD, doce de ellos antes de 2 semanas (es decir, después de una dosis única) (FIG. 18), con respuestas que se intensifican con el tiempo. Cinco pacientes llegaron al final del estudio con un IR de IgG4-RD de 0 (sin actividad de la enfermedad, definición de remisión). Tres pacientes interrumpieron el tratamiento antes de completar 12 dosis. De los cinco pacientes que tomaban esteroides al inicio del estudio, todos pudieron reducirlos y suspenderlos.
[0284] La administración del anticuerpo anti-CD19 S267E/L328F demostró una inhibición de células B potente pero reversible. Después de la administración de 2 mg/kg del anticuerpo, se observó una caída rápida en las células que expresan CD86, luego la expresión de CD86 volvió lentamente al valor inicial aproximadamente 100 días después de la administración de la inmunoglobulina (FIG. 19A). La expresión de CD86 es una indicación de la activación de las células B, por lo que la reducción en la expresión de CD86 sugiere que el anticuerpo inhibe eficazmente la activación de las células B. Además, la administración de 2 mg/kg del anticuerpo dio como resultado una disminución reversible en los recuentos de células B periféricas (FIG. 19B). Estos recuentos volvieron a la normalidad aproximadamente entre 40 y 60 días después de la administración del anticuerpo. Además, los sujetos se desafiaron con antígeno del tétanos y luego se les administraron dosis variables de anticuerpo que oscilaban entre 0.03 y 10 mg/kg. En los sujetos a los que se les administró el anticuerpo, hubo una caída detectable en la IgG antitetánica en relación con los sujetos tratados con placebo (FIG. 19C). Estos resultados demuestran que el anticuerpo inhibe la activación de las células B en respuesta al desafío antigénico.
[0285] En sujetos con una enfermedad relacionada con la IgG4 a los que se les administró el anticuerpo, también se observó una reducción significativa tanto en las células B totales como en los plasmoblastos después del tratamiento. Se utilizó citometría de flujo para medir los recuentos de células B totales mediante la expresión de CD19 y CD79b y los recuentos de plasmoblastos mediante la expresión de CD38 y CD27. La estrategia de gating de células B y plasmoblastos durante el tratamiento se muestra en la FIG. 20.
[0286] La FIG. 21 muestra un resumen de los números de células B durante el tratamiento, por paciente. El número total de células B (CD79b+) en once de catorce pacientes disminuyó rápidamente a aproximadamente un 40-50 % después de comenzar el tratamiento. Tres pacientes mostraron disminuciones posteriores en el número total de células B.
[0287] La FIG. 22A-22B muestra un resumen de los números de plasmoblastos durante el tratamiento. Los plasmoblastos son células plasmáticas inmaduras. Los plasmoblastos secretan más anticuerpos que las células B, pero menos que las células plasmáticas. Se dividen rápidamente y todavía son capaces de internalizar antígenos y presentarlos a las células T. Los pacientes con IgG4-RD tienen una mayor cantidad de plasmoblastos CD19+ que los individuos sanos. La FIG. 23 muestra que los plasmoblastos al inicio del estudio son elevados (99.07 ± 16.84 plasmoblastos CD19+ por 104 células B CD19+ (media ± SEM)) en comparación con los donantes sanos (13.73 ± 3.395 plasmoblastos CD19+ por 104 células B CD19+ (media ± SE<m>)). Tanto los plasmoblastos CD79b+ (FIG. 22A) como los plasmoblastos totales (FIG. 22A) se redujeron de 4 a 5 veces siete días después del inicio del tratamiento en todos (los catorce) pacientes. En particular, los plasmoblastos disminuyeron entre un 80 y un 90 % en diez de catorce pacientes.
[0288] A continuación se analizan con más detalle los recuentos individuales de células B y plasmoblastos, así como los niveles séricos de la IgG4 (mg/dl) de varios pacientes.
[0289] Antes del tratamiento con el anticuerpo, el paciente uno tenía un IR de 18 y presentaba colangitis esclerosante y PAI relacionadas con IgG4, inflamación sensible de las glándulas submandibulares y glándulas lagrimales sensibles. Este paciente estaba previamente bajo terapia con esteroides. Para el día 169, este paciente tenía un IR de 0, no tomaba esteroides y seguía teniendo buenos resultados meses después del ensayo. Los recuentos de células B y plasmoblastos del paciente, así como los niveles séricos de IgG4 (mg/dl) se resumen por día de tratamiento en la tabla 1 a continuación.
TABLA 1
[0290] Antes del tratamiento con el anticuerpo, dos pacientes presentaban la enfermedad de Mikulicz, la enfermedad orbitaria, la afectación pulmonar y la afectación de la vesícula seminal derecha relacionadas con la IgG4. El paciente dos tenía un IR de 16 antes del tratamiento y había sido tratado previamente con Rituximab. Para el día 85, este paciente tenía un IR de 0. Los recuentos de células B y plasmoblastos del paciente dos, así como los niveles séricos de IgG4 (mg/dl) se resumen por día de tratamiento en la tabla 2 a continuación.
TABLA 2
[0291] En general, estos datos demuestran que el tratamiento con anticuerpo anti-CD19 S267E/L328F en la IgG4-RD activa se tolera bien. Se observaron respuestas al tratamiento (disminución del IR de IgG4-RD de > 2) en 9 de 11 pacientes (82 %). La respuesta clínica y de sangre periférica inicial al tratamiento se observó antes de dos semanas. En toda la población de pacientes la mejora sostenida fue común. Los recuentos de células B disminuyeron rápidamente en aproximadamente un 50 %, y los plasmoblastos cayeron incluso más rápidamente que las células B. Estos datos sugieren que el anticuerpo es un agente rápido y eficaz en el tratamiento de la IgG4-RD.
[0292] También se examinaron poblaciones de células T CD4+ con actividad citotóxica (CD4+CTL) en los pacientes que recibieron el anticuerpo anti-CD19 S267E/L328F. Se ha informado de que los números de CTL CD4+SLAMF7+ aumentan en la sangre periférica de pacientes con IgG4-RD. Además, se ha informado de que los números de CTL CD4+SLAMF7+ circulantes disminuyen en pacientes con IgG4-RD después de la terapia con rituximab. Como se muestra en la FIG. 29, los números de CTL CD4+SLAMF7+ aumentaron en la sangre periférica de pacientes con IgG4-RD (n=101) en comparación con los controles (n = 35). Se utilizó citometría de flujo para medir los recuentos de CTL CD4+ mediante la expresión de CD4 y SLAMF7 en pacientes con IgG4-RD que recibieron el anticuerpo anti-CD19 S267E/L328F. La estrategia de gating de células B y plasmoblastos durante el tratamiento se muestra en la FIG. 24. La mitad de los pacientes estudiados tenían un porcentaje suficientemente alto de población de CTL CD4+ circulantes distintos (10.1 % - 43.6 %) antes de la terapia para permitir el análisis durante el estudio. De estos, los resultados muestran disminuciones en los CTL CD4 y los CTL CD4 efectores en la mayoría de los pacientes (FIG. 25A-25B).
[0293] También se examinó la apoptosis de las células B en los pacientes que recibieron el anticuerpo anti-CD19 S267E/L328F. Se utilizó citometría de flujo para medir los recuentos de las células B, las células T CD4+ y las células T CD8+ después de la terapia. La estrategia de gating para las células B, las células T CD4+ y las células T CD8+ se muestra en la FIG. 26. Como se muestra en las FIGs .27A-27L, no se observó apoptosis significativa de las células B, las células T CD4+ o las células T CD8+.
[0294] También se examinaron las vías de señalización vinculadas al BCR en los pacientes después de la infusión del anticuerpo anti-CD19 S267E/L328F. Se examinaron los niveles de P-BTK, P-AKT, P-ERK y P-SYK antes del tratamiento (FIG. 28A - 28D), 2 horas después del tratamiento (FIGS. 28E - 28H) y 24 horas después del tratamiento (FIGS. 28I - 28L). Las FIGS. 28A-28l muestran que la fosforilación inducida por BCR de Syk y Btk fue abolida en células B CD20+ 2 horas después de la infusión del anticuerpo. La vía de señalización de Akt corriente abajo se bloqueó totalmente en las células B CD20+ 2 horas después de la infusión. La vía de señalización de Erk corriente abajo no cambia después de 2 horas, pero se bloquea parcialmente en las células B CD20+ 24 horas después de la infusión. Ejemplo 8. Formas de dosificación de un anticuerpo anti-CD19 con la modificación de Fc S267E/L328F.
[0295] Se preparó un anticuerpo anti-CD19 con la modificación de Fc S267E/L328F en dos formas de dosificación. La primera forma de dosificación fue un líquido para infusión intravenosa tras dilución en solución salina normal. Cada vial de un solo uso contenía 100 mg en 10 ml de solución salina tamponada con fosfato. La segunda forma era un líquido para administración subcutánea proporcionado en un vial de un solo uso que contenía 125 mg en 1 ml de solución de prolina tamponada con acetato. La composición del producto farmacéutico formulado por vía intravenosa se proporciona en la tabla 3. La composición del producto farmacéutico formulado por vía subcutánea se proporciona en la tabla 4.
Ejemplo 9. Biodisponibilidad.
[0296] Para caracterizar y comparar la farmacocinética (PK) y la biodisponibilidad, se administró por vía subcutánea (SC) el anticuerpo anti-CD19 con la modificación de Fc S267E/L328F. Los sujetos del estudio tenían entre 18 y 55 años y se dividieron en 3 cohortes. Las formulaciones SC se describen en el ejemplo 8. La cohorte 1 recibió 125 mg (1 ml) de anticuerpo administrado por vía SC cada 14 días x 3. La cohorte 2 recibió 50 mg (2 ml) de anticuerpo administrado por vía SC cada 14 días x 3. La cohorte 3 recibió 375 mg (3 ml) de anticuerpo administrado por vía SC cada 14 días x 3.
[0297] La administración SC de dosis múltiples del anticuerpo fue segura y bien tolerada en dosis de 125 a 375 mg en los 40 sujetos a los que se les administró SC XmAb5871. Los eventos adversos emergentes del tratamiento (TEAE) que ocurrieron en sujetos que recibieron cualquier dosis de SC XmAb5871 fueron de gravedad leve. El único TEAE relacionado con el fármaco que ocurrió en más de dos sujetos que recibieron cualquier dosis de anticuerpo SC consistió en hematomas en el lugar de la inyección (tres sujetos, 8 %). Ningún sujeto que recibió el anticuerpo por vía SC interrumpió el estudio debido a un evento adverso y no hubo eventos adversos graves durante el estudio. Los datos farmacocinéticos y de biodisponibilidad del estudio respaldan un programa de dosificación cada dos semanas.

Claims (6)

REIVINDICACIONES
1. Una inmunoglobulina que se une a FcyRIIb y se coacopla a CD 19 en la superficie de una célula B para su uso en el tratamiento de una enfermedad relacionada con la IgG4 en un sujeto, donde dicha inmunoglobulina comprende una cadena pesada y una cadena ligera, donde dicha cadena pesada comprende la SEC ID N.°: 9, y dicha cadena ligera comprende la SEC ID N.°: 7, donde dicha inmunoglobulina se usa en una dosis terapéuticamente eficaz.
2. Una inmunoglobulina para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicha enfermedad relacionada con la IgG4 se selecciona del grupo que consiste en: sialoadenitis relacionada con IgG4, por ejemplo, sialoadenitis esclerosante crónica, tumor de Küttner y enfermedad de Mikulicz; dacrioadenitis relacionada con IgG4, por ejemplo, enfermedad de Mikulicz; enfermedades oftálmicas relacionadas con la IgG4 tales como enfermedad inflamatoria orbitaria idiopática y pseudotumor orbitario; sinusitis crónica; fibrosis angiocéntrica eosinofílica; hipofisitis relacionada con la IgG4, por ejemplo, panhipofisitis relacionada con la IgG4, adenohipofisitis relacionada con la IgG4, infundibuloneurohipofisitis relacionada con la IgG4 e hipofisitis autoinmune; paquimeningitis relacionada con la IgG4; leptomeningitis relacionada con la IgG4, por ejemplo, paquimeningitis hipertrófica idiopática; pancreatitis relacionada con la IgG4, por ejemplo, pancreatitis autoinmune tipo 1, PAI relacionada con la IgG4, pancreatitis esclerosante linfoplasmocítica y pancreatitis crónica con estrechamiento irregular difuso del conducto pancreático principal; enfermedad pulmonar relacionada con la IgG4, por ejemplo, pseudotumor inflamatorio pulmonar; pleuritis relacionada con la IgG4, hepatopatía relacionada con la IgG4; colangitis esclerosante relacionada con la IgG4; colecistitis relacionada con la IgG4; aortitis relacionada con la IgG4, por ejemplo, aneurisma aórtico inflamatorio; periaortitis relacionada con la IgG4, por ejemplo, periaortitis crónica; periarteritis relacionada con la IgG4; pericarditis relacionada con la IgG4; mediastinitis relacionada con la IgG4, por ejemplo, mediastinitis fibrosante; fibrosis retroperitoneal relacionada con la IgG4, por ejemplo, fibrosis retroperitoneal, síndrome de Albarrán-Ormond, enfermedad de Ormond o fibrosis tetroperitoneal; fascitis perirrenal; fascitis/síndrome de Gerota; periureteritis fibrosa; lipogranuloma esclerosante; granuloma retroperitoneal esclerosante; inflamación retroperitoneal no específica; retroperitonitis esclerosante; vasculitis retroperitoneal con fibrosis perivascular; mesenteritis relacionada con la IgG4, por ejemplo, subtipos de paniculitis mesentérica, lipodistrofia mesentérica y mesenteritis retráctil, mesenteritis esclerosante, paniculitis nodular sistémica, mesenteritis por lipoesclerosis, enfermedad mesentérica de Weber-Christian, lipogranuloma mesentérico y mesenteritis xantogranulomatosa; mastitis relacionada con la IgG4 tal como mastitis esclerosante; enfermedad renal relacionada con la IgG4; nefritis tubulointersticial relacionada con la IgG4; glomerulonefritis membranosa relacionada con la IgG4, como nefritis tubulointersticial idiopática; prostatitis relacionada con la IgG4; fibrosis perivasal relacionada con la IgG4, como orquialgia crónica; pseudotumor paratesticular relacionado con la IgG4; epididimoorquitis relacionada con la IgG4, por ejemplo, pseudotumor fibroso paratesticular, pseudotumor inflamatorio del cordón espermático, proliferaciones miofibroblásticas pseudosarcomatosas del cordón espermático, funiculitis proliferativa, periorquitis proliferativa crónica, periorquitis fibromatosa, periorquitis nodular, periorquitis reactiva y mesotelioma fibroso; linfadenopatía relacionada con la IgG4; enfermedad de la piel relacionada con la IgG4, por ejemplo, hiperplasia angiolinfoide con eosinofilia y pseudolinfoma cutáneo; enfermedad perineural relacionada con la IgG4 y enfermedad de la tiroides relacionada con la IgG4, por ejemplo, tiroiditis de Reidel; fibrosis angiocéntrica eosinofílica que afecta a las órbitas y el tracto respiratorio superior; pseudotumor inflamatorio; y fibroesclerosis multifocal.
3. Una inmunoglobulina para su uso según la reivindicación 4, en la que la enfermedad relacionada con la IgG4 se selecciona del grupo que consiste en la pancreatitis autoinmune como la pancreatitis escleorizante linfoplasmocítica; la fibrosis angiocéntrica eosinofílica que afecta a las órbitas y el tracto respiratorio superior; la mediastinitis fibrosante; la paquimeningitis hipertrófica idiopática; la nefritis tubulointersticial idiopática; el pseudotumor inflamatorio; el tumor de Küttner; la enfermedad de Mikulicz; la fibroesclerosis, la periaortitis; la periarteritis; el aneurisma multifocal aórtico inflamatorio; la enfermedad de Ormond o fibrosis tetroperitoneal; la tiroiditis de Riedel; y la mesenteritis esclerosante.
4. Una inmunoglobulina para uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la célula B es un plasmoblasto de sangre periférica.
5. Una inmunoglobulina para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el sujeto sufre una recaída o es refractario al rituximab.
6. Una inmunoglobulina para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la administración de inmunoglobulina es cada 14 días, preferiblemente cada 14 días durante al menos 2 dosis, cada 14 días durante al menos 6 dosis o cada 14 días durante al menos 12 dosis.
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