ES2964105T3 - Formas cristalinas de un compuesto farmacéutico - Google Patents
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Abstract
La presente invención se refiere a una forma cristalina del compuesto (I) y a un método para preparar la forma cristalina del compuesto (I). La invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden la forma cristalina del compuesto (I). Además, la invención se refiere a métodos para usar esta forma cristalina del compuesto (I) como medicamento y al tratamiento de una enfermedad que implica niveles anormales de glucosilceramida y/o niveles más altos de glicoesfingolípidos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Formas cristalinas de un compuesto farmacéutico
Campo de la invención
La invención se refiere a una forma cristalina del compuesto (I),
La invención también se refiere a un procedimiento de preparación de la forma cristalina del compuesto (I), así como a composiciones farmacéuticas que comprenden la forma cristalina del compuesto (I). Adicionalmente, la invención se refiere a métodos para usar esta forma cristalina del compuesto (I) como medicamento y al tratamiento de una enfermedad que implica niveles anormales de glucosilceramida y/o niveles más altos de glicoesfingolípidos.
Antecedentes de la invención
El estado cristalino de un compuesto puede ser importante cuando el compuesto se usa con fines farmacéuticos. Esto se debe a que la morfología, el tamaño de las partículas, el polimorfismo, la solvatación o la hidratación del estado cristalino de un compuesto pueden afectar la filtración, el flujo, la formación de comprimidos, la disolución y la biodisponibilidad de un agente farmacéutico.
Los derivados de la desoxinojirimicina son una clase importante de moléculas en la química farmacéutica y el descubrimiento de fármacos. La N-(hidroxietil)-desoxinojirimicina se comercializa como Miglitol como agente antidiabético para la diabetes de tipo 2. El Miglitol también actúa como un inhibidor de amplio espectro de varias glicosidasas intestinales (maltasa, sacarosa y lactasa) (Hillebrand et al.,Diabetes,1986, Vol. 35, A93-A93) (Scott and Spencer,Drugs,2000, Vol. 59, 521-549).
El N-butil-desoxinojirimicina (miglustat, Zavesca®) fue desarrollado como un inhibidor de la glucosilceramida sintasa (también llamada ceramida glucosiltransferasa, EC 2.4.1.80, código UniProt: Q16739) y se usa en clínicas para tratar pacientes con el trastorno de almacenamiento lisosomal, la enfermedad de Gaucher (Platt et al.,J. Biol. Chem.,1994, Vol. 269, 8362-8365) (Cox et al.,Lancet,2000, Vol. 355, 1481-1485) y la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C (Pineda et al.Orphanet J. Rare Dis.,2018, Vol. 13, 140).
El documento WO2015/147639 A1 describe nuevos derivados de la desoxinojirimicina, incluido el compuesto (I),
que son eficaces en el tratamiento de enfermedades que están asociadas con niveles anormales de glucosilceramida citosólica o lisosomal y/o niveles más altos de glicoesfingolípidos. El compuesto (I) es un potente inhibidor dual de la glucosilceramida sintasa y de la glucosilceramidasa no lisosomal (GBA2, código UniProt: Q9HCG7).
Los compuestos terapéuticos útiles para tratar los niveles anormales de glucosilceramida y/o niveles más elevados de glicoesfingolípidos se administran a menudo en forma de comprimidos. Cuando se preparan composiciones y formulaciones farmacéuticas para su uso en tales comprimidos, es muy deseable tener una forma cristalina del compuesto terapéutico que tenga bajos niveles de higroscopicidad y/o bajos niveles de delicuescencia, permitiendo así que el compuesto se comprima en una forma o tamaño deseado.
Adicionalmente, un punto de fusión relativamente alto de un compuesto terapéutico (por lo general mayor que aproximadamente 80 °C) favorece la resistencia a la descomposición, facilitando así el almacenamiento y aumentando la vida útil del compuesto terapéutico, lo cual es deseable para cualquier agente farmacéutico.
También es particularmente beneficioso que un compuesto terapéutico sea no higroscópico, o sustancialmente no higroscópico, cuando se considera la manipulación, fabricación y almacenamiento del agente farmacéutico. Si un agente farmacéutico presenta propiedades higroscópicas, pueden surgir muchos problemas, por ejemplo:
• dificultad para reducir el material a pequeñas partículas o polvo mediante trituración;
• humedad no deseada que dificulta las reacciones apropiadas y forma productos finales no deseados, lo que resulta en una calidad mínima y una vida útil reducida;
• producción de comprimidos blandos durante la fabricación o penetración de humedad en el interior del embalaje;
• polvos adheridos al transportador, que pueden afectar el procedimiento de llenado.
De este modo, es deseable tener una forma cristalina del compuesto terapéutico que sea no higroscópica o sustancialmente no higroscópica.
No se ha informado previamente ninguna forma cristalina del compuesto (I). De acuerdo con lo anterior, existe una necesidad de obtener formas cristalinas estables y/o no delicuescentes del compuesto (I), que sean preferiblemente y de forma sustancial no higroscópicas y/o tengan puntos de fusión relativamente altos.
Sumario de la invención
En un primer aspecto, la presente invención proporciona una forma cristalina del compuesto (I),
en la que la forma cristalina muestra una reflexión, expresada como un valor de 20, a 17.8 ± 0.2°, en un patrón de difracción de rayos X en polvo, en el que la reflexión a 17.8 ± 0.2° es una de las cuatro reflexiones más fuertes en el patrón de difracción de rayos X en polvo.
Cada aspecto o realización como se define en este documento puede combinarse con cualquier otro aspecto(s) o realización(es) a menos que se indique claramente lo contrario. En particular, cualquier característica que se indique como preferida o ventajosa puede combinarse con cualquier otra característica o características que se indiquen como preferidas o ventajosas.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende la forma cristalina del compuesto (I) como se describe en este documento.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona la forma cristalina del compuesto (I) como se describe en este documento, o la composición farmacéutica como se describe en este documento, para su uso en terapia.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona la forma cristalina del compuesto (I) como se describe en este documento, o la composición farmacéutica como se describe en este documento, para su uso como medicamento.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a la forma cristalina del compuesto (I) como se describe en este documento, o la composición farmacéutica como se describe en este documento, para su uso en el tratamiento de una enfermedad que implica niveles anormales de glucosilceramida y/o niveles más altos de glicoesfingolípidos. En un aspecto adicional, la presente invención proporciona la forma cristalina del compuesto (I) como se describe en este documento, o la composición farmacéutica como se describe en este documento, para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un procedimiento de preparación de la forma cristalina del compuesto (I) como se describe en este documento, que comprende poner en contacto una muestra del compuesto (I) con un disolvente.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un uso de la base libre del compuesto (I) para preparar la forma cristalina del compuesto (I).
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un procedimiento de preparación de la forma cristalina del compuesto (I) que comprende cristalizar la base libre del compuesto (I).
Otras realizaciones preferidas de los compuestos según la invención aparecen a lo largo de la memoria descriptiva y en particular en los ejemplos.
Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente una forma cristalina del compuesto (I) que es estable y no delicuescente. La presente invención tiene propiedades ventajosas adicionales, tales como una falta sustancial de higroscopicidad y un punto de fusión relativamente alto.
De forma inesperada, los presentes inventores han descubierto adicionalmente una forma cristalina del compuesto (I) que muestra buena solubilidad en agua. Estas propiedades hacen que las formas cristalinas de la presente invención sean particularmente apropiadas para su uso en una composición farmacéutica.
La cristalización de compuestos terapéuticos implica a menudo el uso de diferentes sales. Por lo general, las sales cristalizan fácilmente y el material resultante facilita la cristalización posterior de los compuestos terapéuticos. Por esta razón, el uso de una sal suele ser el método preferido para cristalizar un compuesto terapéutico. Por lo tanto, es sorprendente que los presentes inventores hayan descubierto una forma de base libre cristalina del compuesto (I). Dado que la forma de base libre cristalina de cualquier compuesto terapéutico no requiere la presencia de un contraión, la concentración de un compuesto terapéutico en un polvo de forma cristalina de base libre es normalmente mayor que en la forma de la sal correspondiente, lo cual es muy beneficioso ya que reduce el coste de fabricación del compuesto terapéutico.
Sin desear limitarse a ninguna teoría, se cree que las formas cristalinas de la presente invención tienden a mostrar los efectos ventajosos discutidos anteriormente debido a su estructura cristalina.
Breve descripción de los dibujos
Estos y otros aspectos de la invención se describirán ahora con referencia a las figuras anexas, en las que:
La figura 1 muestra imágenes de ejemplos que se obtienen usando microscopía óptica polarizada de una forma cristalina del compuesto (I), denominada forma 2, que no es según la invención reivindicada, y que se obtiene por equilibrio con acetonitrilo; izquierda: como polvo seco, derecha: disperso en aceite de parafina.
La figura 2 muestra el patrón de difracción de rayos X en polvo de la forma 2, obtenido por equilibrio con acetonitrilo. La figura 3A muestra el termograma TG-FTIR de la forma 2, obtenido por equilibrio con acetonitrilo.
La figura 3B muestra el termograma (DSC) de calorimetría diferencial de barrido de la forma 2, obtenido por equilibrio con acetonitrilo.
La figura 4A muestra la isoterma (DVS) de sorción dinámica de vapor de la forma 2, obtenida por equilibrio con acetonitrilo: el cambio del contenido de agua (curva roja) y la humedad relativa (curva azul) en función del tiempo. La figura 4B muestra la isoterma de DVS de la forma 2, obtenida por equilibrio con acetonitrilo: el cambio del contenido de agua en función de la humedad relativa.
La figura 5 muestra imágenes de ejemplos que se obtienen usando microscopía óptica polarizada de una forma cristalina del compuesto (I), denominada forma 3, obtenida por equilibrio con acetonitrilo, anisol o acetato de etilo, respectivamente.
La figura 6A muestra el patrón de difracción de rayos X en polvo de la forma 3, obtenido por equilibrio con acetonitrilo. La figura 6B muestra una superposición de los patrones de difracción de rayos X en polvo de la forma 3, obtenidos mediante equilibrio con TBME, agua, isopropanol, acetato de etilo, acetonitrilo o anisol, respectivamente.
La figura 7 muestra una superposición de los patrones de difracción de rayos X en polvo de dos formas cristalinas del compuesto (I) obtenidos por equilibrio con acetonitrilo:
1) Forma 3 (ejemplo 3), y
2) Forma 2 (ejemplo 2).
La figura 8A muestra el termograma TG-FTIR de la forma 3, obtenido por equilibrio con acetato de etilo.
La figura 8B muestra el termograma TG-FTIR de la forma 3, obtenido por equilibrio con isopropanol.
La figura 8C muestra el termograma DSC de la forma 3, obtenido por equilibrio con acetato de etilo.
La figura 9A muestra la isoterma de DVS de la forma 3, obtenida por equilibrio con acetato de etilo: el cambio del contenido de agua (curva roja) y la humedad relativa (curva azul) en función del tiempo.
La figura 9B muestra la isoterma de DVS de la forma 3, obtenida por equilibrio con acetato de etilo: el cambio del contenido de agua en función de la humedad relativa.
La figura 10 muestra los niveles medio-sagital aproximados obtenidos siguiendo el protocolo de corte basado en Paxinos & Franklin "The Mouse Brain Atlas, 2nd edition", mostrando las coordenadas estereotáxicas.
La figura 11 muestra un cambio porcentual en el peso corporal de los ratones entre el día (PND) posnatal 11 y la semana 9.
La figura 12 muestra los niveles de glucosilceramida C16:0 y C18:0 después de la administración oral repetida del PND 11-70.
La figura 13 muestra la puntuación de los signos clínicos de PND 56-70 en vehículos NPC (-/-) y ratones tratados con AZ-3102.
La Adicionalmente 4 muestra la puntuación de temblor de PND 56-70 en vehículos NPC (-/-) y ratones tratados con AZ-3102.
La figura 15 muestra la definición de las áreas de interés (ROI). La imagen muestra el contorno de las áreas ROIs del cerebelo, la formación del hipocampo, el cuerpo calloso y el cuerpo estriado (caudate-putamen).
La figura 16 muestra la inmunohistoquímica cerebral: marcado con calbindina-D28k en ratones tratados con vehículo NCP(-/-) y NPC(+/-) en comparación con ratones tratados con NPC (+/+, ratones de tipo salvaje) y NPC (-/-).
La figura 17 resume el modo de acción de la forma cristalina del compuesto (I) (AZ-3102).
Descripción detallada de la invención
A menos que se defina lo contrario en este documento, los términos científicos y técnicos usados en relación con la presente invención tendrán los significados que entienden comúnmente los expertos en la técnica. El significado y alcance de los términos deben ser claros, sin embargo, en caso de cualquier ambigüedad latente, las definiciones proporcionadas en este documento tienen prioridad sobre cualquier diccionario o definición extrínseca.
Debe entenderse que los artículos singulares como "un", "una", “uno” “el” y “ la” se usan a menudo por conveniencia; sin embargo, todas las instancias del singular pretenden abarcar el plural a menos que se indique lo contrario, ya sea explícitamente o por el contexto. Los términos "que comprende", "que incluye" y "que tiene" pretenden ser inclusivos y significan que puede haber elementos adicionales distintos de los elementos enumerados.
El término "aproximadamente" como se usa en este documento para datos numéricos se refiere a un valor dentro del 10 % del parámetro subyacente (es decir, más o menos 10 %), y el uso del término "aproximadamente" al comienzo de una cadena de valores modifica cada uno de los valores (es decir, "aproximadamente 1, 2 y 3" se refiere a aproximadamente 1, aproximadamente 2 y aproximadamente 3). Por ejemplo, una temperatura de "aproximadamente 85 °C" puede incluir temperaturas entre 75 °C y 95 °C.
El término "punto de fusión" en la técnica. El término "punto de fusión relativamente alto", como se usa en este documento, pretende abarcar formas cristalinas que son suficientemente estables para formularse como composiciones farmacéuticas. Preferiblemente, el término "punto de fusión relativamente alto" describe un punto de fusión que es mayor que aproximadamente 65 °C. Aún más preferiblemente, el punto de fusión es mayor que aproximadamente 80 °C.
El término "composición", como se usa en este documento, pretende abarcar un producto que comprende los ingredientes especificados en las cantidades especificadas, así como cualquier producto que resulte, directa o indirectamente, de la combinación de los ingredientes especificados en las cantidades especificadas. Tal término, en relación con la composición farmacéutica, pretende abarcar un producto que comprende la forma cristalina del compuesto (I), y opcionalmente los ingredientes adicionales que componen el portador, así como cualquier producto que resulte, directa o indirectamente, de la combinación, complejación o agregación de cualquier dos o más de los ingredientes, o de la disociación de uno o más de los ingredientes, o de otros tipos de reacciones o interacciones de uno o más de los ingredientes. De acuerdo con lo anterior, las composiciones farmacéuticas de la presente invención abarcan cualquier composición que comprenda una forma cristalina de la presente invención y, opcionalmente, un portador farmacéuticamente aceptable. Por "farmacéuticamente aceptable" se entiende que el portador, diluyente o excipiente debe ser compatible con los demás ingredientes de la formulación y no ser nocivo para el receptor de la misma.
La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" significa la cantidad de una forma cristalina o de una composición farmacéutica que, cuando se administra a un paciente para tratar una enfermedad, es suficiente para efectuar tal tratamiento de la enfermedad. La "cantidad terapéuticamente eficaz" variará dependiendo de la enfermedad y su gravedad, y de la edad y el peso del paciente que se va a tratar. El término "paciente" (o "sujeto") incluye, pero no se limita a, animales tales como, por ejemplo, mamíferos. Preferiblemente, el paciente es un ser humano.
La presente invención proporciona una forma cristalina del compuesto (I),
en la que la forma cristalina muestra una reflexión, expresada como un valor de 20, a 17.8 ± 0.2°, en un patrón de difracción de rayos X en polvo, en el que la reflexión a 17.8 ± 0.2° es una de las cuatro reflexiones más fuertes en el patrón de difracción de rayos X en polvo.
La forma cristalina del compuesto (I) es una base libre cristalina. Además, el compuesto (I) puede formar un cocristal.
La presente invención no se limita a una forma cristalina única del compuesto (I). Los materiales sólidos pueden existir en más de una forma cristalina. Estas formas cristalinas alternativas se denominan polimorfos. Cada polimorfo tiene diferentes orientaciones y/o conformaciones de moléculas en la red cristalina. Cada estado cristalino, o "polimorfo", exhibe un conjunto único de propiedades fisicoquímicas debido a diferencias en la estructura cristalina.
Las formas polimórficas pueden tener diferentes propiedades mecánicas, tales como fluidez y compresibilidad, que afectan las propiedades tecnológicas del compuesto. La estabilidad y la duración del almacenamiento del compuesto también pueden depender del polimorfo.
Los polimorfos se pueden distinguir entre sí de diferentes formas. Los polimorfos exhiben claramente propiedades espectroscópicas y se pueden determinar usando, por ejemplo, espectroscopia infrarroja, espectroscopia Raman y espectroscopia de 13C-RMN. En vista del hecho de que cada forma cristalina refracta los rayos X de diferentes maneras, la difracción de rayos X (XPD) también se puede usar para caracterizar polimorfos. Además, los métodos térmicos tales como la calorimetría diferencial de barrido (DSC) y el análisis termogravimétrico (TTA) pueden proporcionar información única sobre un polimorfo en particular.
Como es bien conocido en el campo de la difracción de rayos X en polvo, se pueden usar alturas de pico relativas de los espectros de difracción de rayos X en polvo para describir diferentes formas cristalinas. De acuerdo con lo anterior, en un aspecto de la "forma 3", la presente invención proporciona una forma cristalina del compuesto (I) que muestra una reflexión, expresada como un valor de 20, a 17.8 ± 0.2°, en un patrón de difracción de rayos X en polvo, en el que la reflexión a 17.8 ± 0.2° es uno de los cuatro reflejos más fuertes en el patrón de difracción de rayos X en polvo. Preferiblemente, la reflexión a 17.8 ± 0.2° es una de las tres reflexiones más fuertes en el patrón de difracción de rayos X en polvo, o en el que la reflexión a 17.8 ± 0.2° es una de las dos reflexiones más fuertes en el patrón de difracción de rayos X en polvo. Más preferiblemente, la reflexión a 17.8 ± 0.2° es la reflexión más fuerte en el patrón de difracción de rayos X en polvo. Aún más preferiblemente, en el aspecto de la "forma 3", la forma cristalina del compuesto (I) muestra una reflexión, expresada como un valor de 20, a 17.8 ± 0.1°, en un patrón de difracción de rayos X en polvo, en el que la reflexión a 17.8 ± 0.1° es una de las cuatro reflexiones más fuertes en el patrón de difracción de rayos X en polvo. Preferiblemente, la reflexión a 17.8 ± 0.1° es una de las tres reflexiones más fuertes en el patrón de difracción de rayos X en polvo, o en la que la reflexión a 17.8 ± 0.1° es una de las dos reflexiones más fuertes en el patrón de difracción de rayos X en polvo. Más preferiblemente, la reflexión a 17.8 ± 0.1° es la reflexión más fuerte en el patrón de difracción de rayos X en polvo.
El término "reflexión más fuerte" describe el pico más alto de un patrón de difracción de rayos X en polvo. La altura de un pico de un patrón de difracción de rayos X en polvo se determina en función de la intensidad de los rayos X (en recuentos o unidades de recuentos/segundo). De este modo, la reflexión más fuerte es aquella que muestra la mayor intensidad de rayos X en el patrón de difracción de rayos X en polvo. Por ejemplo, la reflexión más fuerte del patrón de difracción de rayos X que se muestra en la figura 6A es la reflexión, expresada como un valor de 20, a 17.8 ± 0.2°.
A menos que se indique explícitamente lo contrario, todos los patrones de difracción de rayos X en polvo se determinan usando radiación de cobre K-alfa a 25 °C aproximadamente.
Preferiblemente, en el aspecto de la 'forma 3', la forma cristalina del compuesto (I) muestra además una o más reflexiones, expresadas como un valor de 20, en uno o más de 4.1 ± 0.2°, 8.3 ± 0.2°, 12.4 ± 0.2°, 13.6 ± 0.2°, 14.5 ± 0.2°, 14.9 ± 0.2°, 15.2 ± 0.2°, 17.2 ± 0.2°, 19.3 ± 0.2°, 21.2 ± 0.2°, 22.4 ± 0.2°, 22.9 ± 0.2° y 23.3 ± 0.2°, en un patrón de difracción de rayos X en polvo. Aún más preferiblemente, en el aspecto de la 'forma 3', la forma cristalina del compuesto (I) muestra además una o más reflexiones, expresadas como un valor de 20, en uno o más de 4.1 ± 0.1°, 8.3 ± 0.1°, 12.4 ± 0.1°, 13.6 ± 0.1°, 14.5 ± 0.1°, 14.9 ± 0.1°, 15.2 ± 0.1°, 17.2 ± 0.1°, 19.3 ± 0.1°, 21.2 ± 0.1°, 22.4 ± 0.1°, 22.9 ± 0.1° y 23.3 ± 0.1°, en un patrón de difracción de rayos X en polvo.
Las posiciones de los picos de los espectros de difracción de rayos X en polvo son relativamente insensibles a los detalles experimentales. De este modo, los compuestos cristalinos de la invención pueden caracterizarse por un patrón de difracción de rayos X en polvo que tiene ciertas posiciones de pico. De acuerdo con lo anterior, en el aspecto de la 'forma 3', la forma cristalina del compuesto (I) se caracteriza preferiblemente por reflexiones, expresadas como un valor de 20, a 17.2 ± 0.2°, 17.8 ± 0.2°, 21.2 ± 0.2° y 22.4 ± 0.2°, en un patrón de difracción de rayos X en polvo. Más preferiblemente, en el aspecto de la 'forma 3', la forma cristalina del compuesto (I) se caracteriza por reflexiones, expresadas como un valor de 20, a 4.1 ± 0.2°, 8.3 ± 0.2°, 12.4 ± 0.2°, 13.6 ± 0.2°, 14.5 ± 0.2°, 14.9 ± 0.1°, 15.2 ± 0.2°, 17.2 ± 0.2°, 17.8 ± 0.2°, 19.3 ± 0.2°, 21.2 ± 0.2°, 22.4 ± 0.2°, 22.9 ± 0.2° y 23.3 ± 0.2°, en un patrón de difracción de rayos X en polvo. Aún más preferiblemente, en el aspecto de la 'forma 3', la forma cristalina del compuesto (I) se caracteriza por reflexiones, expresadas como un valor de 20, a 17.2 ± 0.1°, 17.8 ± 0.1°, 21.2 ± 0.1° y 22.4 ± 0.1°, en un patrón de difracción de rayos X en polvo. Lo más preferible, en el aspecto de la 'forma 3', la forma cristalina del compuesto (I) se caracteriza por reflexiones, expresadas como un valor de 20, a 4.1 ± 0.1°, 8.3 ± 0.1°, 12.4± 0.1°, 13.6 ± 0.1°, 14.5 ± 0.1°, 14.9 ± 0.1°, 15.2 ± 0.1°, 17.2 ± 0.1°, 17.8 ± 0.1°, 19.3 ± 0.1°, 21.2 ± 0.1°, 22.4 ± 0.1°, 22.9 ± 0.1° y 23.3 ± 0.1°, en un patrón de difracción de rayos X en polvo.
Las formas cristalinas de un compuesto se pueden caracterizar mediante un termograma de calorimetría diferencial de barrido (DSC). De este modo, la forma cristalina del compuesto (I), en el aspecto de la 'forma 3', se caracteriza preferiblemente por un termógrafo de DSC, que muestra un inicio del flujo de calor endotérmico a aproximadamente 87 °C y/o un punto de fusión de aproximadamente 92.4 °C, como se ve en la figura 8C. De acuerdo con lo anterior, preferiblemente, en el aspecto de la "forma 3", la forma cristalina del compuesto (I) tiene un punto de fusión de 89 °C a 96 °C, como se determina por DSC. Preferiblemente, la forma cristalina, en el aspecto de la 'forma 3', tiene un punto de fusión de 90 °C a 95 °C, como se determina por DSC. Más preferiblemente aún, la forma cristalina del compuesto (I), en el aspecto de la 'forma 3', tiene un punto de fusión de 91 °C a 94 °C, como se determina por DSC. Lo más preferible, la forma cristalina del compuesto (I), en el aspecto de la 'forma 3', tiene un punto de fusión de 92 °C a 93 °C, como se determina por DSC.
Las formas cristalinas de un compuesto se pueden caracterizar por su higroscopicidad. La higroscopicidad de un producto expresa el aumento o disminución de su contenido de agua en función de la humedad relativa a una determinada temperatura. Los productos sustancialmente no higroscópicos no presentan ningún cambio o solo presentan un ligero cambio en su contenido de agua como consecuencia de variaciones en la humedad relativa. En productos fuertemente higroscópicos, el contenido de agua puede variar ampliamente. De acuerdo con lo anterior, preferiblemente la forma cristalina del compuesto (I) es sustancialmente no higroscópica.
Las formas cristalinas de un compuesto se pueden caracterizar por su traza termogravimétrica. De este modo, preferiblemente, la forma cristalina del compuesto (I) puede caracterizarse por su traza termogravimétrica. En una realización, el cristalino del compuesto (I) se caracteriza por la traza termogravimétrica representada en la figura 8A o la figura 8B.
Las formas cristalinas de un compuesto también se pueden caracterizar por su perfil de sorción dinámica de vapor (DVS). De acuerdo con lo anterior, la forma cristalina del compuesto (I) se puede caracterizar preferiblemente por su perfil de DVS, como se ve en las figuras 9A y 9B. Preferiblemente, la forma cristalina del compuesto (I) tiene un perfil de sorción/desorción reversible. Preferiblemente, el perfil de DVS muestra la naturaleza sustancialmente no higroscópica de la forma cristalina.
Las sustancias sustancialmente no higroscópicas muestran una absorción de agua menor que aproximadamente el 2 % a una humedad relativa de aproximadamente 95 % medida a una temperatura de aproximadamente 25 °C. Preferiblemente, la absorción de agua es inferior a aproximadamente el 1 % a una humedad relativa de aproximadamente 95 % medida a una temperatura de aproximadamente 25 °C. Los valores de absorción de agua se obtienen midiendo la ganancia de masa de la forma cristalina que se prueba a una humedad relativa de aproximadamente 95 % y una temperatura de aproximadamente 25 °C con respecto a la masa inicial.
De acuerdo con lo anterior, la forma cristalina del compuesto (I) absorbe preferiblemente del 0 % al 2 % de agua a una humedad relativa de aproximadamente 95 % a una temperatura de aproximadamente 25 °C. Aún más preferiblemente, la forma cristalina del compuesto (I) absorbe de 0 % a 1.5 % de agua a una humedad relativa de aproximadamente 95 % a una temperatura de aproximadamente 25 °C. Más preferiblemente, la forma cristalina del compuesto (I) absorbe de 0 % a 1 % de agua a una humedad relativa de aproximadamente 95 % a una temperatura de aproximadamente 25 °C.
Además, la forma cristalina de la presente invención es preferiblemente estable. Por ejemplo, la incubación prolongada en acetato de etilo (1 semana) a aproximadamente 25 °C produjo formas cristalinas del compuesto (I) de buena calidad, como se muestra en la figura 5.
En un aspecto de la "forma 2", que no se reivindica pero que se considera útil para comprender la invención, se proporciona una forma cristalina adicional del compuesto (I). Esta forma cristalina (forma 2) muestra una reflexión, expresada como un valor de 20, a 16.9 ± 0.2°, en un patrón de difracción de rayos X en polvo, en el que la reflexión a 16.9 ± 0.2° es una de las cuatro reflexiones más fuertes en el patrón de difracción de rayos X en polvo. Preferiblemente, la reflexión a 16.9 ± 0.2° es una de las tres reflexiones más fuertes en el patrón de difracción de rayos X en polvo, o en el que la reflexión a 16.9 ± 0.2° es una de las dos reflexiones más fuertes en el patrón de difracción de rayos X en polvo. Más preferiblemente, la reflexión a 16.9 ± 0.2° es la reflexión más fuerte en el patrón de difracción de rayos X en polvo. Aún más preferiblemente, la forma cristalina, en el aspecto de la "forma 2", muestra una reflexión, expresada como un valor de 20, a 16.9 ± 0.1°, en un patrón de difracción de rayos X en polvo, en el que la reflexión a 16.9 ± 0.1° es uno de los cuatro reflejos más fuertes en el patrón de difracción de rayos X en polvo. Preferiblemente, la reflexión a 16.9 ± 0.1° es una de las tres reflexiones más fuertes en el patrón de difracción de rayos X en polvo, o donde la reflexión a 16.9 ± 0.1° es una de las dos reflexiones más fuertes en el patrón de difracción de rayos X en polvo. Más preferiblemente, la reflexión a 16.9 ± 0.1° es la reflexión más fuerte en el patrón de difracción de rayos X en polvo.
Preferiblemente, la forma cristalina del compuesto (I), en el aspecto de la 'forma 2', que no se reivindica pero se considera útil para comprender la invención, muestra una o más reflexiones, expresadas como un valor de 20, en uno o más de 15.2 ± 0.2°, 16.1 ± 0.2°, 16.5 ± 0.2°, 18.9 ± 0,2°, 23.1 ± 0.2°, 25.5 ± 0.2°, 27.7 ± 0.2° y 28.5 ± 0.2°, en un patrón de difracción de rayos X en polvo. Aún más preferiblemente, en el aspecto de la 'forma 2', la forma cristalina del compuesto (I) muestra una o más reflexiones, expresadas como un valor de 20, en uno o más de 15.2 ± 0.1°, 16.1 ± 0.1°, 16.5 ± 0.1 °, 18.9 ± 0.1°, 23.1 ± 0.1°, 25.5 ± 0.1°, 27.7 ± 0.1° y 28.5 ± 0.1°.
Esta forma cristalina del compuesto (I), en el aspecto de la 'forma 2', que no se reivindica pero se considera útil para comprender la invención, también puede caracterizarse por reflexiones, expresadas como un valor de 20, a 16.1 ± 0.2°, 16.5 ± 0.2°, 16.9 ± 0.2°, 18.9 ± 0.2° y 23.1 ± 0.2°, en un patrón de difracción de rayos X en polvo. Preferiblemente, la forma cristalina del compuesto (I), en el aspecto de la 'forma 2', también puede caracterizarse por reflexiones, expresadas como un valor de 20, a 16.1 ± 0.1°, 16.5 ± 0.1°, 16.9 ± 0.1°, 18.9 ± 0.1° y 23.1 ± 0.1°, en un patrón de difracción de rayos X en polvo.
La forma cristalina del compuesto (I), en el aspecto de la 'forma 2', que no se reivindica pero se considera útil para comprender la invención, se puede caracterizar mediante un termógrafo DSC que muestra un inicio del flujo de calor endotérmico a aproximadamente 58 °C y un punto de fusión de aproximadamente 70 °C, como se ve en la figura 3B. De acuerdo con lo anterior, la forma cristalina del compuesto (I), en el aspecto de la 'forma 2', tiene un punto de fusión de 67 °C a 74 °C. Preferiblemente, la forma cristalina del compuesto (I), en el aspecto de la 'forma 2', tiene un punto de fusión de 68 °C a 73 °C. Aún más preferiblemente la forma cristalina del compuesto (I), en el aspecto de la 'forma 2', tiene un punto de fusión de 69 °C a 72 °C. Lo más preferible, la forma cristalina del compuesto (I), en el aspecto de la 'forma 2', tiene un punto de fusión de 69 °C a 71 °C.
Los inventores de la presente solicitud han descubierto sorprendentemente que la forma cristalina del compuesto (I), en el aspecto de la 'forma 2', que no se reivindica pero se considera útil para comprender la invención, es particularmente soluble en agua. De acuerdo con lo anterior, preferiblemente la forma cristalina del compuesto (I), en el aspecto de la 'forma 2', tiene una solubilidad en agua de aproximadamente 75 mg/mL a aproximadamente 85 mg/mL, medida a aproximadamente 25 °C. Más preferiblemente, la forma cristalina, en el aspecto de la 'forma 2', tiene una solubilidad en agua de aproximadamente 78 mg/mL a aproximadamente 82 mg/mL, medida a aproximadamente 25 °C. Lo más preferible, la forma cristalina del compuesto (I), en el aspecto de la 'forma 2', tiene una solubilidad en agua de aproximadamente 80 mg/mL, medida a aproximadamente 25 °C.
Se conocen en la técnica métodos para medir la solubilidad; por ejemplo, método del matraz de agitación, sonicación, método de elución en columna y método de espectroscopia ultravioleta o visible. A menos que se indique explícitamente lo contrario, la solubilidad en agua se determina usando el método del matraz de agitación y/o sonicación.
La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende la forma cristalina del compuesto (I) como se describe en este documento.
Por lo general, la forma cristalina del compuesto (I) se administra a un paciente en forma de una composición o formulación farmacéutica. Tales composiciones farmacéuticas se pueden administrar al paciente mediante cualquier vía de administración aceptable que incluye, pero no se limita a, modalidades de administración oral, tópica (incluyendo transdérmica) y parenteral.
Las composiciones farmacéuticas de la invención se preparan por lo general mediante un portador farmacéuticamente aceptable y uno o más ingredientes opcionales. Si es necesario o se desea, la mezcla uniforme resultante se puede convertir o dar forma en comprimidos, cápsulas, píldoras, latas, cartuchos, dispensadores y similares usando procedimientos y equipos convencionales.
Cuando están destinadas a la administración oral en una forma de dosificación sólida (es decir, como cápsulas, comprimidos, píldoras y similares), las composiciones farmacéuticas de la invención comprenderán por lo general una forma cristalina del compuesto (I) como ingrediente activo. Preferiblemente, la composición farmacéutica de la invención comprende una forma cristalina del compuesto (I) y ningún otro ingrediente. Preferiblemente, la composición farmacéutica de la invención está contenida en una cápsula. Preferiblemente, la composición farmacéutica de la invención está contenida en la cápsula sin ningún otro ingrediente. La cápsula puede ser una cápsula de gelatina o una cápsula de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC). Alternativamente, la composición farmacéutica de la invención puede comprender una forma cristalina del compuesto (I) como ingrediente activo y uno o más portadores farmacéuticamente aceptables. El experto en la técnica conocerá portadores adecuados farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, grasas, agua, solución salina fisiológica, alcohol (por ejemplo, etanol), glicerol, polioles, solución acuosa de glucosa, agente expansivo, agente desintegrante, aglutinante, lubricante, agente humectante, estabilizador, emulsionante, dispersante, conservante, edulcorante, colorante, agente sazonador o aromatizante, agente concentrador, diluyente, sustancia reguladora, disolvente o agente solubilizante, producto químico para lograr el efecto de almacenamiento, sal para modificar la presión osmótica, agente de recubrimiento o antioxidante, sacáridos tales como lactosa o glucosa; almidón de maíz, trigo o arroz; ácidos grasos tales como ácido esteárico; sales inorgánicas tales como aluminato de metasilicato de magnesio o fosfato de calcio anhidro; polímeros sintéticos tales como polivinilpirrolidona o polialquilenglicol; alcoholes tales como alcohol estearílico o alcohol bencílico; derivados sintéticos de celulosa tales como metilcelulosa, carboximetilcelulosa, etilcelulosa o hidroxipropilmetilcelulosa; y otros aditivos usados convencionalmente tales como gelatina, talco, aceite vegetal y goma arábiga.
La composición farmacéutica que comprende las formas cristalinas del compuesto (I) también se puede administrar por vía transdérmica o transmucosa usando sistemas de administración y excipientes conocidos. Por ejemplo, la composición farmacéutica se puede mezclar con potenciadores de la permeación tales como propilenglicol, monolaurato de polietilenglicol, azacicloalcan-2-onas y similares, e incorporarse en un parche o sistema de administración similar. También se pueden usar excipientes adicionales que incluyen agentes gelificantes, emulsionantes y sustancias reguladoras.
Las inyecciones para administración parenteral incluyen soluciones estériles acuosas o no acuosas, suspensiones y emulsiones. Los disolventes acuosos incluyen, por ejemplo, agua destilada para inyección y/o solución salina fisiológica. Ejemplos de disolventes no acuosos incluyen alcoholes tales como el etanol.
Preferiblemente, la composición farmacéutica comprende uno o más agentes adicionales farmacéuticamente activos. Esta terapia de combinación implica el uso de una forma cristalina del compuesto (I) combinada con uno o más de los agentes farmacéuticamente activos adicionales, ya sea formulados juntos (por ejemplo, empaquetados juntos en una única formulación) o formulados por separado (por ejemplo, empaquetados como unidades unitarias separadas).
En un individuo sano, el glicoesfingolípido central, la glucosilceramida, es hidrolizado en lisosomas por la glucosilceramidasa ácida (también llamada glucocerebrosidasa o GBA1, EC 3.2.1.45, código UniProt: P04062). Además, la glucosilceramidasa no lisosomal (GBA2, código UniProt: Q9HCG7) que reside en el citoplasma también es capaz de procesar la glucosilceramida. Como resultado, tanto GBA1 como<g>BA2 están implicados en los efectos neuropatológicos observados en varios trastornos por depósito lisosomal.
En pacientes con un trastorno por depósito lisosomal, se producen defectos en la biosíntesis o degradación de glicoesfingolípidos, lo que da lugar a niveles anormales de glucosilceramida y/u otros glicoesfingolípidos.
El compuesto (I) demostró previamente (en WO2015/147639 A1) ser eficaz en el tratamiento de enfermedades asociadas con niveles irregulares de glucosilceramida citosólica o lisosomal y/o niveles más altos de glicoesfingolípidos. Como la biodisponibilidad de las formas cristalinas del compuesto (I) es comparable a la biodisponibilidad del compuesto (I) amorfo, las formas cristalinas del compuesto (I) también son eficaces en el tratamiento de enfermedades que están asociadas con niveles anormales de glucosilceramida celular y/o niveles superiores de glicoesfingolípidos. En particular, las formas cristalinas del compuesto (I) son eficaces en el tratamiento de enfermedades que están asociadas con niveles anormales de glucosilceramida citosólica o lisosomal y/o niveles más altos de glicoesfingolípidos.
Como se muestra en el ejemplo 4, la forma cristalina del compuesto (I) (forma 3) es eficaz en el tratamiento de enfermedades que están asociadas con niveles irregulares de glucosilceramida citosólica o lisosomal y/o niveles superiores de glicoesfingolípidos. Específicamente, se demostró que la forma 3 mejora los signos clínicos en ratones con la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C.
De acuerdo con lo anterior, la presente invención proporciona la forma cristalina del compuesto (I) como se describe en este documento, o la composición farmacéutica como se describe en este documento, para su uso en terapia.
La presente invención también proporciona la forma cristalina como se describe en este documento, o la composición farmacéutica como se describe en este documento, para su uso como medicamento.
Preferiblemente, la presente invención proporciona la forma cristalina del compuesto (I) como se describe en este documento, o la composición farmacéutica como se describe en este documento, para su uso en el tratamiento de una enfermedad que implica niveles anormales de glucosilceramida y/o niveles más altos de glicoesfingolípidos.
Preferiblemente, la enfermedad que implica niveles anormales de glucosilceramida y/o niveles más altos de glicoesfingolípidos es una enfermedad de depósito lisosomal, tal como la enfermedad de Gaucher (de tipo 1, 2 y 3), la enfermedad de Fabry, gangliosidosis GM1, gangliosidosis GM2 (tal como la enfermedad de Tay-Sachs, la enfermedad de Sandhoff y la variante AB), sialidosis, la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C y el síndrome de mioclonías de acción-insuficiencia renal, o un síntoma de una de las enfermedades clasificadas colectivamente como síndrome metabólico, tal como obesidad, resistencia a la insulina, hiperlipidemia, hipercolesterolemia, enfermedad renal poliquística, diabetes de tipo II e inflamación crónica, o un trastorno neurodegenerativo, tal como la enfermedad de Parkinson o la demencia con cuerpos de Lewy, o aterosclerosis. Aún más preferiblemente, la forma cristalina del compuesto (I), o la composición farmacéutica que comprende la forma cristalina del compuesto (I), son útiles en el tratamiento de gangliosidosis GM1 y/o gangliosidosis GM2 (tales como la enfermedad de Tay-Sachs, la enfermedad de Sandhoff y la variante AB).
Aún más preferiblemente, la presente invención proporciona la forma cristalina del compuesto (I) como se describe en este documento, o la composición farmacéutica como se describe en este documento, para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C.
La presente invención proporciona la forma cristalina del compuesto (I) como se describe en este documento, o la composición farmacéutica como se describe en este documento, para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Sandhoff.
La forma cristalina del compuesto (I) como se describe en este documento, o la composición farmacéutica como se describe en este documento, se puede usar para aliviar los síntomas de una enfermedad que implica niveles anormales de glucosilceramida y/o niveles más altos de glicoesfingolípidos, tal como la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C o la enfermedad de Sandhoff.
La forma cristalina del compuesto (I) (por ejemplo, la forma 3) puede usarse para mejorar diferentes signos clínicos, por ejemplo:
1) pérdida de peso asociada a enfermedades;
2) temblor; y/o
3) marcha atáxica.
Como se muestra en el ejemplo 4, la forma cristalina del compuesto (I) (por ejemplo, la forma 3) penetra eficazmente hasta el cerebro. De este modo, la forma cristalina del compuesto (I) (por ejemplo, la forma 3) puede usarse para tratar o aliviar una enfermedad o síntomas de enfermedad que se originan en el cerebro. Por ejemplo, la forma cristalina del compuesto (I) (por ejemplo, la forma 3) puede usarse para prevenir o reducir la pérdida de células de Purkinje del cerebelo. La forma cristalina del compuesto (I) (por ejemplo, la forma 3) puede usarse para prevenir o reducir la muerte neuronal. La forma cristalina del compuesto (I) (por ejemplo, la forma 3) se puede usar para prevenir o reducir la atrofia cerebral.
Se entiende que la alta eficacia de la forma cristalina del compuesto (I) en el tratamiento de enfermedades que implican niveles anormales de glucosilceramida y/o niveles más elevados de glicoesfingolípidos resulta de la alta potencia de la forma cristalina del compuesto (I) frente a la glucosilceramida sintasa (GCS) y a la glucosilcerebrosidasa no lisosomal (GBA2).
La administración se puede realizar ya sea por administración oral mediante comprimidos, píldoras, cápsulas, gránulos, polvos, soluciones y similares, o por administración parenteral, tal como inyecciones, tales como inyecciones intraarticulares, intravenosas e intramusculares, supositorios, soluciones oftálmicas, ungüentos para los ojos o agentes para uso externo, tales como preparaciones líquidas transdérmicas, ungüentos, parches transdérmicos, preparaciones líquidas transmucosales, parches transmucosales, inhaladores y similares.
En la administración oral, la dosis diaria es generalmente desde aproximadamente 0.0001 a 10 mg/kg, preferiblemente desde 0.001 a 1 mg/kg, o desde 0.005 a 5 mg/kg, y más preferiblemente de 0.01 a 0.5 mg/kg, por peso corporal. administrado en una porción o en 2 a 4 porciones separadas. Por ejemplo, para un paciente humano de 70 kg, la dosis diaria óptima para la administración oral es de aproximadamente 0.01 a 30 mg/día. En el caso de la administración intravenosa, la dosis diaria se administra adecuadamente desde aproximadamente 0.00001 a 10 mg/kg por peso corporal, una vez al día o dos o más veces al día. Además, se administra un agente transmucosal en una dosis desde aproximadamente 0.0001 a 10 mg/kg por peso corporal, una vez al día o dos o más veces al día. La dosis se decide adecuadamente en respuesta al caso individual teniendo en cuenta los síntomas, la edad, el género y similares.
Dado que la potencia de la forma cristalina del compuesto (I) en el tratamiento de una enfermedad que implica niveles anormales de glucosilceramida y/o niveles más altos de glicoesfingolípidos (por ejemplo, la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C) es muy alta, y la dosis requerida es relativamente baja, la forma cristalina del compuesto (I) es muy alta y la dosis requerida es relativamente baja, la forma cristalina del compuesto (I) produce menos efectos secundarios que los compuestos conocidos para tratar tales enfermedades, por ejemplo el Miglitol (dosis de 1200 mg/kg/día).
La presente invención también proporciona un procedimiento para preparar la forma cristalina como se describe en este documento, que comprende poner en contacto una muestra del compuesto (I) con un disolvente. Preferiblemente, el disolvente se selecciona entre acetonitrilo, acetato de etilo, isopropanol, anisol, agua y tert-butilmetiléter (TBME). Aún más preferiblemente, el disolvente es acetato de etilo, acetonitrilo o isopropanol. Preferiblemente, antes de poner en contacto la muestra del compuesto (I) con el disolvente, la muestra del compuesto (I) se purifica para eliminar los ésteres de borato. Preferiblemente, la muestra del compuesto (I) se purifica usando cromatografía. Aún más preferiblemente, la muestra del compuesto (I) se purifica usando una columna de cromatografía en gel de sílice. Además, y/o alternativamente, la muestra del compuesto (I) se purifica mediante destilación con metanol.
La forma cristalina de la forma 3 del compuesto (I) se puede obtener mediante cualquiera de los siguientes métodos de ejemplo:
1) Agitar una mezcla de aproximadamente 74 mg de compuesto (I) y 2.0 ml de acetonitrilo durante tres días a una temperatura que oscila entre 20 °C y 30 °C, por ejemplo, aproximadamente 25 °C, luego filtrar para obtener la forma cristalina del compuesto (I);
2) Agitar una mezcla de aproximadamente 74 mg de compuesto (I) y 2.0 ml de anisol durante tres días a una temperatura que oscila entre 20 °C y 30 °C, por ejemplo, aproximadamente 25 °C, luego filtrar para obtener la forma cristalina del compuesto (I);
3) Agitar una mezcla de aproximadamente 82 mg de compuesto (I) y 1.0 ml de acetato de etilo durante tres días a una temperatura que oscila entre 20 °C y 30 °C, por ejemplo, aproximadamente 25 °C, luego filtrar para obtener la forma cristalina del compuesto (I);
4) Agitar una mezcla de aproximadamente 82 mg de compuesto (I) y 1.0 ml de isopropanol durante tres días a una temperatura que oscila entre 20 °C y 30 °C, por ejemplo, aproximadamente 25 °C, luego filtrar para obtener la forma cristalina del compuesto (I);
5) Agitar una mezcla de aproximadamente 45 mg de compuesto (I) y 1.0 ml de agua durante tres días a una temperatura que oscila entre 20 °C y 30 °C, por ejemplo, aproximadamente 25 °C, luego filtrar para obtener la forma cristalina del compuesto (I);
6) Agitar una mezcla de aproximadamente 100 mg de compuesto (I) y 3.0 ml de TBME durante tres días a una temperatura que oscila entre 20 °C y 30 °C, por ejemplo, aproximadamente 25 °C, luego filtrar para obtener la forma cristalina del compuesto (I).
Preferiblemente, antes de mezclar el compuesto (I) con el disolvente, la muestra del compuesto (I) se purifica para eliminar los ésteres de borato. Preferiblemente, la muestra del compuesto (I) se purifica usando cromatografía. Aún más preferiblemente, la muestra del compuesto (I) se purifica usando una columna de cromatografía en gel de sílice. Además y/o alternativamente, la muestra del compuesto (I) se purifica mediante destilación con metanol.
Los métodos de filtrado son conocidos para un experto en la técnica e incluyen, pero no se limitan a filtrado con papel y filtrado con vidrio sinterizado.
Los métodos de producción de la forma 3 del compuesto (I) descritos en este documento se pueden realizar a mayor escala manteniendo una proporción similar de reactivos utilizados. Por ejemplo, la forma cristalina de la forma 3 del compuesto (I) se puede obtener agitando una mezcla del compuesto (I) con acetato de etilo en una proporción de entre 0.05-1 a 1 mL [compuesto (I) a acetato de etilo] durante tres días a una temperatura que oscila entre 20 °C y 30 °C, por ejemplo, aproximadamente 25 °C, luego filtrar para obtener la forma cristalina del compuesto (I).
Los métodos para obtener la forma 3 del compuesto (I) descritos en este documento son muy eficaces. El rendimiento de los métodos descritos en este documento es por lo general mayor que 70 % (como una proporción en peso de la cantidad obtenida de la forma 3 a la cantidad de compuesto (I) usada inicialmente). Preferiblemente, el rendimiento de los métodos descritos en el presente documento es mayor que 75 %.
Preferiblemente, la forma cristalina de la forma 2 se forma como un intermedio, antes de la formación de la forma cristalina de la forma 3.
Preferiblemente la forma cristalina de forma 2 caracterizada por reflexiones, expresadas como un valor de 20, a 16.1 ± 0.2°, 16.5 ± 0,2°, 16.9 ± 0.2°, 18.9 ± 0.2° y 23.1 ± 0.2°, en un patrón de difracción de rayos X en polvo se forma como un intermedio, antes de la formación de la forma cristalina de la forma 3 caracterizada por reflexiones, expresadas como un valor de 20, a 17.2 ± 0.2°, 17.8 ± 0.2°, 21.2 ± 0.2° y 22.4 ± 0.2°, en un patrón de difracción de rayos X en polvo.
La presente invención también proporciona el uso de la base libre del compuesto (I) para preparar una forma cristalina del compuesto (I).
La presente invención también proporciona un procedimiento para preparar la forma cristalina del compuesto (I) que comprende cristalizar la base libre del compuesto (I).
Entre otras ventajas, se cree que la formación de una forma cristalina del compuesto (I) es útil para purificar el compuesto (I). Por ejemplo, la forma cristalina del compuesto (I) que se obtiene mediante los métodos descritos en este documento tiene una pureza mayor que 90 % y por lo general mayor que 95 %.
Sección experimental
La calorimetría diferencial de barrido (DSC) se llevó a cabo con un instrumento TA Instruments Q2000 (bandeja de muestra de aluminio cerrada o bandeja de muestra de aluminio con un orificio en la tapa, tasa de calentamiento de 20 K/min). Por punto de fusión se entiende el pico máximo.
Las mediciones de sorción dinámica de vapor (DVS) se realizaron con un "Sorptions Prüfsystem" SPS11-100n de ProUmid (anteriormente "Projekt Messtechnik"), August-Nagel-Str. 23, 89079 Ulm (Alemania). Se pusieron aproximadamente de 5 mg a 20 mg de muestra en una bandeja de muestra de aluminio. Se usaron tasas de cambio de humedad de 5 % por hora. El programa de medición aplicado se puede describir de la siguiente manera:
La muestra se colocó en un soporte de aluminio o platino sobre una microbalanza y se dejó equilibrar a una humedad relativa (RH) del 50 % antes de iniciar los programas de humedad predefinidos:
(1) 2 h al 50 % de humedad relativa
(2) 50 ^ 0 % RH (5 %/h); 5 horas a 0 % RH
(3) 0 ^ 95 % RH (5 %/h); 5 horas a 95 % RH
(4) 95 ^ 0 % RH (5 %/h); 5 horas a 0 % RH
(5) 0 ^ 95 % RH (5 %/h); 5 horas a 95 % RH
(6) 95 ^ 50 % RH (5 %/h); 2h al 50 % RH
La difracción de rayos X en polvo se llevó a cabo con un difractómetro Stoe Stadi P equipado con un detector MythenIK que funciona con Cu-K radiación a-i. Las mediciones con este instrumento se realizaron en transmisión a una tensión de tubo de 40 kV y una potencia de tubo de 40 mA. Un monocromador curvo de Ge permite realizar pruebas con CU-K radiación a-i. Se establecieron los siguientes parámetros: Tamaño de paso de 0.02° 20, tiempo de paso de 12 s, intervalo de barrido de 1.5 a 50.5° a 20 y paso del detector de 1°20 (modo del detector en paso de barrido). Para una preparación de muestra típica, se colocaron aproximadamente 10 mg de muestra entre dos láminas de acetato y se montaron en un soporte de muestra de transmisión Stoe. La muestra se giró durante la medición. Toda la preparación y medición de la muestra se realizó en una atmósfera de aire ambiente (aproximadamente 25 °C).
Las solubilidades aproximadas se determinaron mediante la adición incremental de disolvente a aproximadamente 10 mg del compuesto y la posterior agitación y/o sonicación durante un corto periodo de tiempo. Si la sustancia no se disolvió mediante la adición de un total de al menos 10 ml de disolvente, la solubilidad se indica como <1 mg/ml. Los experimentos se realizaron a aproximadamente 25 °C.
Las mediciones termogravimétricas (TG-FTIR) se llevaron a cabo con la Netzsch Thermo-Microbalance TG 209 acoplada a un espectrómetro Bruker FTIR Vector 22 (bandejas de muestra con un orificio, atmósfera de N2, tasa de calentamiento 10 °C/min).
Ejemplos
Los siguientes ejemplos no limitantes ilustran adicionalmente la presente invención.
Ejemplo 1 - Formación de sales cristalinas
Se llevó a cabo un programa de cribado de sales de alto rendimiento para el compuesto (I) con 16 formadores de sales diferentes identificados en la tabla 1 en seis condiciones diferentes en el intento de obtener una forma cristalina del compuesto (I).
Los experimentos de cribado iniciales se llevaron a cabo agregando una solución 0.05 M del compuesto (I) en acetona a cada placa de microtitulación de 96 pocillos de cuarzo, seguido de la adición de las soluciones madre formadoras de sal a una concentración de 0.1 M. Los disolventes se evaporaron de cada pocillo mediante un flujo de nitrógeno a temperatura ambiente. Los residuos sólidos en los pocillos se estudiaron mediante microscopía óptica polarizada.
Tabla 1. Ácidos seleccionados para el programa de cribado de sales
Aunque el propósito de estos experimentos iniciales era obtener una proporción 1:1 del compuesto (I) con un formador de sal, las investigaciones de microscopía óptica revelaron algunas condiciones experimentales apropiadas para la formación de formas cristalinas. Por ejemplo, el compuesto (I) mezclado con ácido bencenosulfónico, ácido clorhídrico, ácido DL-mandélico, ácido L-tartárico, ácido fosfórico y ácido sulfúrico formaba residuos cristalinos.
En otro ensayo de cribado posterior se seleccionaron seis sistemas de disolventes, a saber, acetona, acetonitrilo, acetato de etilo, etanol, una mezcla de isopropanol y agua (3:1) y una mezcla de acetona y agua (9:1). En cada pocillo se agregaron 200 pl de disolvente al residuo para equilibrar la suspensión. La placa de microtitulación así preparada se agitó a 400 rpm durante un día a temperatura ambiente (aproximadamente 25 °C). Luego, los disolventes se evaporaron con un flujo de nitrógeno y los residuos sólidos obtenidos se estudiaron mediante microscopía óptica polarizada.
Sobre la base de las investigaciones con microscopía óptica se encontraron pistas para posibles sales del ácido bencenosulfónico, ácido gentísico, ácido clorhídrico, ácido L-láctico, ácido D-mandélico, ácido fosfórico, ácido L-tartárico y ácido toluenosulfónico. Algunas de las pistas más prometedoras fueron seleccionadas para experimentos de seguimiento en una escala de 50 a 200 mg (experimentos a mayor escala).
Los experimentos a mayor escala para todas las condiciones probadas dieron como resultado la formación de formas amorfas del compuesto (I) o sales cristalinas líquidas del compuesto (I). Si bien el examen microscópico a menudo revelaba birrefringencia, la filtración de las mezclas obtenidas no fue posible y no se pudo recuperar ningún material sólido en ninguno de los experimentos.
En resumen, todos los experimentos con formadores de sales no lograron producir una forma cristalina del compuesto (I).
Ejemplo 2 - Forma cristalina de la forma 2
Como los experimentos del ejemplo 1 no condujeron a un material cristalino útil, se estudió una forma de base libre del compuesto (I).
El compuesto (I) se purificó usando una columna de gel de sílice para eliminar los ésteres de borato seguido de un breve periodo de equilibrio en acetonitrilo (aproximadamente 1-5 min). Se determinó que la solubilidad del compuesto (I) purificado en acetonitrilo estaba entre 5 mg/mL y 8 mg/mL. También se examinó la solubilidad del compuesto purificado (I) en otros disolventes y se presenta en la tabla 2. Estos valores se determinaron agregando pequeñas alícuotas de disolvente a ~10 mg de compuesto sólido (I) y agitando/sonicando durante un corto periodo de tiempo a temperatura ambiente (aproximadamente 25 °C).
Solvente idad S en [mg/ml] Solve bilidad S en [mg/ml]
Ácido acético S > 120 MEK 40 < S < 50
Acetona 55 < S < 73 Metan S > 160
Acetonitrilo 5 < S < 8 1-Pro 13 < S < 15
DCM S > 160 2-Prop 19 < S < 20
Etanol 0 < S < 53 THF S > 200
Acetato de etilo 12 < S < 13 Agua S ~ 80
Tabla 2. Valores aproximados de solubilidad del compuesto purificado (I).
La forma cristalina de la forma 2 del compuesto (I) resultante de un breve equilibrio (aproximadamente 1-5 minutos) en acetonitrilo se examinó mediante microscopía óptica polarizada, experimentos de difracción de rayos X en polvo (PXRD), TG-FTIR, calorimetría diferencial de barrido (DSC) y sorción dinámica de vapor (DVS).
Los resultados de la investigación con microscopía de luz polarizada se presentan en la figura 1, mientras que el patrón de PXRD se representa en la figura 2. Esta forma cristalina de la forma 2 del compuesto (I) muestra las reflexiones más fuertes a un valor de 20 de 16.1 ± 0.2°, 16.5 ± 0.2°, 16.9 ± 0.2°, 18.9 ± 0.2° y 23.1 ± 0.2°.
Los resultados de la caracterización termoanalítica de la forma cristalina de la forma 2 del compuesto (I) obtenida a partir de un breve periodo de equilibrio en acetonitrilo (termograma TG-FTIR) se visualizan en la figura 3A, mientras que los resultados de la DSC se muestran en la figura 3B. Los resultados revelan que la muestra contenía aproximadamente un 0.5 % de agua que se liberaba al calentarla a aproximadamente 120 °C. A temperaturas más altas, se observó descomposición térmica. La DSC reveló dos eventos endotérmicos importantes. Una primera endotermia intensa con una temperatura máxima de aproximadamente 70 °C y una entalpía de aproximadamente 54 J/g es seguida por una señal más débil a 81°C y una entalpía de aproximadamente 3 J/g.
Además, se estudió el comportamiento de la muestra de base libre cristalina bajo presiones variables de vapor de agua. A una humedad relativa alta, la muestra absorbía aproximadamente el 18 % de agua; sin embargo, la mayor parte del agua absorbida se liberaba cuando la humedad relativa retornaba al 50 % de RH. Los resultados de la medición de la DVS se presentan en las figuras 4A y 4B.
En la tabla 3 se proporciona un resumen de las características de la forma cristalina del compuesto (I) obtenida como parte del ejemplo 2.
Tabla 3. Un resumen de las características de la forma cristalina de la forma 2 del compuesto (I).
La forma cristalina de la forma 2 obtenida del compuesto (I) tenía una baja estabilidad y se convirtió en una forma cristalina adicional de la forma 3 del compuesto (I) tras la exposición a una temperatura aumentada (por encima de aproximadamente 30 °C) durante aproximadamente 1 a 5 minutos. Alternativamente, la forma 2 se convirtió en la forma 3 tras el equilibrio en el disolvente (por ejemplo, acetona) durante más de 5 minutos a aproximadamente 25 °C. Esta forma cristalina adicional de la forma 3 de base libre del compuesto (I) presentaba una mejor estabilidad y un conjunto singular de propiedades fisicoquímicas.
Ejemplo 3 - Forma 3
Independientemente, se obtuvo una forma cristalina estable del compuesto (I) a partir de experimentos de equilibrio de suspensión del compuesto (I) purificado en diversos disolventes respectivos, por ejemplo, en acetonitrilo, acetato de etilo, isopropanol, anisol, agua o TBME respectivamente, a temperatura ambiente (aproximadamente 25 °C).
En particular, se obtuvo una forma cristalina de forma 3 del compuesto (I) mediante los siguientes métodos experimentales:
1) se agregaron aproximadamente 74 mg del compuesto (I) a 2.0 ml de acetonitrilo y la suspensión se agitó durante tres días a temperatura ambiente (aproximadamente 25 °C), luego se filtró;
2) se agregaron aproximadamente 74 mg del compuesto (I) a 2.0 ml de anisol y la suspensión se agitó durante tres días a temperatura ambiente (aproximadamente 25 °C), luego se filtró;
3) se agregaron aproximadamente 82 mg del compuesto (I) a 1.0 ml de acetato de etilo y la suspensión se agitó durante tres días a temperatura ambiente (aproximadamente 25 °C), luego se filtró;
4) se agregaron aproximadamente 82 mg del compuesto (I) a 1.0 ml de isopropanol y la suspensión se agitó durante tres días a temperatura ambiente (aproximadamente 25 °C), luego se filtró;
5) se agregaron aproximadamente 45 mg del compuesto (I) a 1.0 ml de agua y la suspensión se agitó durante tres días a temperatura ambiente (aproximadamente 25 °C), luego se filtró;
6) Se agregaron aproximadamente 100 mg del compuesto (I) a 3.0 ml de TBME y la suspensión se agitó durante tres días a temperatura ambiente (aproximadamente 25 °C), luego se filtró.
El compuesto (I) se purificó usando una columna de gel de sílice antes de la adición del disolvente para eliminar los ésteres de borato.
La forma cristalina del compuesto (I) obtenida se caracterizó mediante microscopía óptica polarizada, difracción de rayos X en polvo, TG-FTIR, DSC y DVS.
Los resultados de la investigación con microscopía óptica polarizada para disolventes seleccionados se presentan en la figura 5.
En la figura 6A se muestra el patrón de PXRD de la forma cristalina de la forma 3 del compuesto (I) obtenida a partir de experimentos de equilibrio de suspensión con acetonitrilo. En la figura 6B se muestra una superposición de los patrones de PXRD de la forma cristalina de la forma 3 del compuesto (I) obtenida a partir de experimentos de equilibrio de suspensión con otros disolventes. Esta forma cristalina del compuesto (I) muestra reflexiones más fuertes a un valor de 20 de 17.2 ± 0.2°, 17.8 ± 0.2°, 21.2 ± 0.2° y 22.4 ± 0.2°. Esto es consistente a pesar de que se usaron diferentes disolventes para obtener la forma cristalina del compuesto (I).
A modo de comparación, la figura 7 muestra una superposición del patrón de PXRD de la forma cristalina obtenida en el ejemplo 2 (forma 2) y el presente ejemplo (forma 3). Las dos formas cristalinas tienen un patrón de PXRD diferente.
Los resultados de experimentos de ejemplos de caracterización TG-FTIR de la forma cristalina de la forma 3 del compuesto (I) se muestran en las figuras 8A (acetato de etilo) y 8B (isopropanol).
La figura 8A revela que la muestra de la forma cristalina de la forma 3 del compuesto (I) obtenida por equilibrio con acetato de etilo contenía aproximadamente 0.7 % de acetato de etilo a pesar de secarse al vacío a 40 °C, durante varios días. El acetato de etilo se libera entre aproximadamente 100 °C y 200 °C. A temperaturas más altas se observa descomposición térmica.
La muestra de la forma 3 que resultó a partir de una suspensión del compuesto (I) en isopropanol (y secado al aire a temperatura ambiente) muestra sorprendentemente que el contenido inicial de isopropanol estaba por debajo del 0.5 % (véase la figura 8B).
En la figura 8C se representan mediciones de ejemplo de la DSC para la muestra de la forma cristalina de la forma 3 del compuesto (I) obtenida mediante equilibrio con acetato de etilo y muestran un pico agudo de fusión endotérmica a aproximadamente 92 °C asociado con una entalpía de aproximadamente 103 J/g. De este modo, la forma cristalina de la forma 3 del compuesto (I) obtenida como parte de este ejemplo tiene un punto de fusión más alto que la forma cristalina del ejemplo 2 (forma 2).
Además, se estudió el comportamiento de la muestra de la forma cristalina de la forma 3 del compuesto (I) obtenida por equilibrio con acetato de etilo con presiones de vapor de agua variables. A la humedad relativa más alta del 95 %, la muestra absorbía aproximadamente el 1.2 % del agua que se liberó cuando la humedad relativa retornó al 50 % de RH. Los resultados de la medición de la DVS se muestran en las figuras 9A y 9B. La cantidad de agua absorbida es pequeña y la sorción de agua es reversible. De este modo, esta forma cristalina de la forma 3 del compuesto (I) es no higroscópica o sustancialmente no higroscópica.
En la tabla 4 se proporciona un resumen de las características de la forma cristalina de la forma 3 del compuesto (I) obtenida como parte del ejemplo 3.
Tabla 4. Un resumen de las características de una forma cristalina de la forma 3 del compuesto (I).
Ejemplo 4 - Efecto de la administración de la forma cristalina del compuesto (I) a ratones que padecen la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C (NPC)
En el ejemplo, la AZ-3102-00 es un nombre para el compuesto (I) en la forma 3.
Objetivo del estudio
El objetivo del estudio fue evaluar el tratamiento de ratones jóvenes NPC1 (NPC (-/-) (P11-P70) con una dosis farmacológicamente activa prevista de la AZ-3102-00 mediante sonda oral, y valorar la PK y los marcadores histológicos para caracterizar la neuropatología que pueda presentarse.
Diseño del estudio
De los 38 ratones que se incluyeron en este estudio, había 30 ratones con deficiencia genética (KO) NPC (-/-), 4 ratones heterocigotos NPC (+/-) y 4 ratones NPC (+/+) de tipo salvaje (WT, Balb/c). Los ratones NPC1(-/-) tienen un truncamiento prematuro de la proteína que elimina 11 de 13 dominios transmembrana dejando intactos los dos primeros dominios transmembrana. Los ratones NPC1(-/-) homocigotos para el alelo NIH recesivo del gen Niemann Pick de tipo C1 (Npc1m1N) muestran una deficiencia dual de la actividad de la esfingomielinasa y glucocerebrosidasa (JAX# 003092). Los animales se criaron en un entorno BALB/c OlaHsd.
Se trataron 24 ratones NPC1 (-/-) mediante sonda oral con AZ-3102-00 a partir del día 11 posnatal (P11) hasta el día 70 posnatal (P70). Los ratones equiparados de control de la misma edad incluyeron 6 ratones NPC (-/-) y 4 ratones NPC (+/-) tratados con el vehículo, y 4 ratones NPC (+/+) recibieron la AZ-3102-00. Después del último tratamiento en P70, se sacrificaron los ratones NPC (-/-) (n = 4 por momento temporal) mediante inyección IP de 600 mg/kg de pentobarbital en los siguientes momentos temporales: 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h y 24 h. Los ratones de control también se sacrificaron después del último tratamiento (el tiempo no es crítico). La sangre terminal se recogió mediante punción cardíaca en tubos recubiertos con EDTA. Se recogió el plasma sanguíneo mediante centrifugación (3000 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente) y se transfirieron alícuotas de 50 pL de plasma a tubos de 1.5 mL, se congelaron en hielo seco y se almacenaron a -80 °C.
Después de la perfusión transcardial, los cerebros fueron extraídos y hemiseccionados. Los hemicerebros derechos se fijaron posteriormente y se encajaron en criomoldes para su posterior análisis inmunohistoquímico. Los hemicerebros izquierdos se congelaron en hielo seco para su posterior análisis.
Los cerebros fueron crioseccionados (12 niveles con 5 secciones cada uno). Luego se usaron 5 secciones por animal para el marcaje inmunofluorescente cuantitativo de microglía (MAC1) y astrocitos (GFAP) en dos regiones del cerebro.
Sistema de prueba y justificación del sistema de prueba.
La enfermedad de Niemann-Pick de tipo C (NPC) es un trastorno neurodegenerativo autosómico recesivo asociado con mutaciones en los genes NPC1 y NPC2 y se caracteriza por la acumulación de colesterol no esterificado y glicoesfingolípidos (GSL). Aproximadamente el 95 % de los casos de Niemann-Pick de tipo C son causados por mutaciones genéticas en el gen NPC1, denominado como de tipo C1; el 5 % son causados por mutaciones en el gen NPC2, denominado como de tipo C2. Las manifestaciones clínicas de Niemann-Pick de tipo C1 y C2 son similares porque los genes respectivos están implicados en la emersión de lípidos, en particular colesterol, desde los endosomas tardíos o lisosomas. El gen NPC1 codifica una proteína que se encuentra en las membranas del interior de la célula y participa en el movimiento del colesterol y los lípidos dentro de las células. Una deficiencia de esta proteína provoca una acumulación anormal de lípidos y colesterol dentro de las membranas celulares. El gen NPC2 codifica una proteína que se une y transporta el colesterol. Los ratones homocigotos para el alelo NIH recesivo del gen Niemann Pick de tipo C1 muestran una deficiencia dual de la actividad de la esfingomielinasa y glucocerebrosidasa. Los ratones mutantes comienzan a perder peso y a mostrar temblores y marcha atáxica aproximadamente a las 7 semanas de edad. La pérdida de peso continúa y los temblores y la ataxia se vuelven más graves hasta la muerte, aproximadamente entre las 12 y 14 semanas de edad. El hígado y el bazo también aumentan de tamaño y las células de Purkinje en el cerebelo están seriamente agotadas. Algunos de estos signos en ratones se parecen a los de los pacientes humanos con la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C.
Ítem de prueba
Tabla 5. Información del ítem de prueba.
Preparación del compuesto:
Las formulaciones de las dosis se dividieron en alícuotas cuando era necesario para permitir su dispensación en cada dosificación.
Tabla 6. Información de la formulación.
La cantidad requerida del ítem de prueba se pesó y se disolvió en agua Elix (p/p) y se ajustó el pH a un pH ácido. No se agregaron más excipientes.
No se hicieron correcciones por la gravedad específica del ítem de prueba ni por la pureza/composición del ítem de prueba.
Después de la preparación de cada dosis, se congeló una parte de la solución para su análisis al final del estudio. Los análisis de estabilidad realizados previamente junto con el estudio de validación y desarrollo del método demostraron que el ítem de prueba es estable en el vehículo cuando se prepara y almacena en las mismas condiciones en concentraciones que abarcan las usadas en este estudio durante al menos 24 horas a temperatura ambiente protegido de la luz, durante al menos 8 días en refrigeración (2-8°C) y durante al menos 3 semanas en el congelador (< -15°C) en concentraciones que abarcan las usadas en el presente estudio (0.01 a 2 mg/mL).
Manejo de los animales
Alojamiento de los animales
Los animales se alojaron en jaulas individuales ventiladas sobre camas para roedores estandarizadas suministradas por Rettenmaier. Cada jaula contenía un máximo de cinco ratones. La temperatura en el cuarto de conservación se mantuvo entre 20 a 24 °C y la humedad relativa se mantuvo entre 45 y 65 %. Los animales se alojaron bajo un ciclo de luz constante (12 horas de luz/oscuridad). Los animales disponían ad libitum de pienso estándar para roedores seco y peletizado (Altromin), así como de agua corriente normal. Se suministró alimento húmedo a los animales bajo la dirección del veterinario a cargo.
Identificación
Los animales se enumeraron consecutivamente mediante marcadores de oreja clásicos
Cada jaula fue identificada mediante una tarjeta de color que indicaba el número del estudio, sexo, los números de registro individual (IRN) de los animales, fecha de nacimiento, así como la asignación al grupo de tratamiento. El genotipo (transgénico o de tipo salvaje) de cada animal se determinó mediante PCR específica para la construcción transgénica. Cada ratón fue genotipado usando ADN aislado de una biopsia de oreja antes del inicio del estudio. Asignación de grupo
Solo se incluyeron en el estudio animales en aparente buen estado de salud. La asignación aleatoria de los grupos se realizó por jaula. Los animales se asignaron a diferentes grupos iniciales (cohortes) que comprendían animales de todos los grupos de tratamiento. Se limitó el número de animales en un grupo inicial para garantizar la misma edad y un manejo uniforme.
Estado de salud y observaciones en la jaula
Antes de ser incorporarse en el estudio, se evaluó el estado de salud de cada animal individual. Durante el estudio, se realizaban observaciones diarias y cualquier observación notable en la jaula quedaba registrada, informando inmediatamente al director del estudio y al veterinario a cargo, quienes decidían sobre las acciones posteriores (por ejemplo, la eutanasia).
Durante la primera semana se registraron diariamente el peso corporal y el estado de salud y luego una vez por semana.
Terminación prematura y punto final humanitario
Ningún animal tuvo que ser sacrificado prematuramente.
Materiales y métodos
Animales
Línea del ratón: NPC (-/-)
Criador: QPS Austria GmbH, Grambach, Austria
Edad al inicio: Día 11 posnatal (P11) a día 70 posnatal (P70)
Sexo: Mezclado
Número de animales: 30 NPC (-/-), 4 NPC (+/-), 4 NPC (+/+)
Tratamiento
Se trataron 24 ratones NPC1 (-/-) (grupos D a I) por sonda oral (10 mL/kg) con AZ-3102-00 desde el día posnatal 11 (P11) hasta el día posnatal 70 (P70). La dosificación comenzará con 1.5 mg/kg desde P11 a P25, seguida de 3 mg/kg desde P26 a P70. Los ratones de control incluyeron 6 ratones NPC1 (-/-) y 4 NPC (+/-) tratados con el vehículo y 4 ratones NPC (+/+) recibieron AZ-3102-00 (grupos A a C).
Después del último tratamiento en el P70, se sacrificaron ratones NPC (-/-) (n = 4 por momento temporal; grupos D a I) mediante inyección IP de 600 mg/kg de pentobarbital en los siguientes momentos temporales: 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h y 24 h. Los ratones de control (grupos A, B y C) también se sacrificaron después del último tratamiento (el tiempo no es crítico).
Tabla 7: Descripción general del grupo de tratamiento
Muestreo de los tejidos
A los 30 min (Grupo D), 1h (+/- 5 min. Grupo E), 2h (+/- 5 min. Grupo F), 4h (+/- 5 min. Grupo G), 8h (+/- 5 min. Grupo H), y 24 h (+/- 5 min. Grupo I) (todo tiempo crítico) después del último tratamiento en el P70, los ratones fueron sacrificados mediante inyección i.p.
6 ratones NPC1 (-/-) del grupo A, 4 NPC (+/-) del grupo B tratados y 4 ratones NPC (+/+) del grupo C sirvieron como controles y también se sacrificaron en el P70 (aproximadamente 2 h después del último tratamiento).
Los ratones se anestesiaron terminalmente mediante inyección i.p. de pentobarbital (600 mg/kg, dosis de 10 pL/gramo de peso corporal).
Muestra de sangre
Se abrió el tórax y se recogió la sangre mediante punción cardíaca con una aguja de calibre 23. Se retiró la aguja y se transfirió la sangre al tubo de muestra (MiniCollect® K2EDTA (ácido etilendiaminotetraacético potásico). El tubo se invirtió completamente para facilitar la distribución homogénea del EDTA y evitar la coagulación. Las muestras de sangre se centrifugaron a 3000 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente (22 °C). Se transfirieron alícuotas de 50 pl de plasma a tubosLoBindEppendorf de 1.5 ml etiquetados previamente, congelados en hielo seco y almacenados a -80 °C.
Perfusión
Luego, los animales se perfundieron por vía transcardiaca con solución salina al 0.9 %. Para ello, se insertó en el ventrículo izquierdo una aguja de calibre 23 conectada a un frasco con solución salina al 0.9 %. La aorta torácica, entre los pulmones y el hígado, se sujetó con unas pinzas hemostáticas para bloquear el flujo de sangre desde el corazón al abdomen, pero permitiendo que la sangre fluyera hacia el cerebro. Se abrió el ventrículo derecho con unas tijeras. Se mantuvo una presión constante de 100 a 120 mm Hg sobre la solución de perfusión conectando la botella de la solución a un compresor de aire controlado por manómetro. La perfusión continuó hasta que la superficie del cráneo se tornó pálida y del ventrículo derecho sólo salía solución de perfusión en lugar de sangre.
Muestreo del cerebro
Después de la perfusión, se abrió el cráneo, se extrajo el cerebro con cuidado y se seccionó por la mitad sobre una superficie enfriada. Se pesó el hemisferio izquierdo, se congeló rápidamente en hielo seco y se almacenó a -80 °C. El hemisferio derecho se fijó mediante inmersión en paraformaldehído al 4 % en solución reguladora de fosfato (pH 7.4) durante 2 horas a temperatura ambiente.
Histología
Preparación de los tejidos
El hemicerebro derecho del ratón se fijó mediante inmersión en paraformaldehído al 4 % recién preparado en PB (pH 7.4) durante dos horas a temperatura ambiente. Posteriormente, los hemisferios se transfirieron a sacarosa al 15 %/PBS y se almacenaron a 4 °C hasta que se hundieron para asegurar la crioprotección. Luego, los bloques de tejido se recortaron según fue necesario, se transfirieron a criomoldes, se incluyeron en un medio de OCT, se congelaron en isopentano enfriado con hielo seco y se almacenaron en un congelador ultra profundo (fijado a una temperatura diana de -80 °C).
Seccionamiento
Se cortaron sagitalmente cinco criosecciones consecutivas con un espesor de 10 pm en un criotomo Leica. Las siguientes 25 secciones por nivel fueron descartadas. Este esquema de recolección se repitió en 12 niveles y es posible que se haya visto modificado para recolectarlos desde los niveles correctos, por ejemplo, si los cerebros eran más pequeños debido a la edad temprana o al genotipo. En total se recogieron 12 x 5 = 60 secciones. Los niveles de seccionamiento se escogieron según el atlas cerebral de Paxinos y Franklin ("The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates", 2nd edition, 2001). La recolección de secciones comenzó en un nivel de ~0.2 mm lateral desde la línea media y se extendió a través del hemisferio para garantizar un muestreo aleatorio sistemático a través de las regiones diana (figuras 10 y 15). Las secciones se almacenaron a -20 °C. Se seccionó casi todo el cerebro, por lo que se desechó el bloque de tejido residual cuando se recogieron todas las secciones.
Inmunofluorescencia Exp3531 (Calbindina-D28k)
Para cada incubación, se seleccionó un conjunto aleatorio sistemático uniforme de cinco secciones por ratón (una sección de cada uno desde los niveles 2, 4, 6, 8, 10); para obtener información sobre el muestreo aleatorio sistemático consulte este enlace: http://www.stereology.info/sampling/
Todos los pasos se realizaron en una solución salina reguladora con fosfato de Dulbecco, pH 7.2-7.8 (PBS) a temperatura ambiente, a menos que se indique lo contrario.
1. Las criosecciones se secaron al aire durante 45 minutos y se lavaron en PBS durante 10 minutos.
2. Los sitios de unión inespecíficos se bloquearon con suero de burro normal al 10 % (Jackson Immuno Research) en TritonX-100/PBS al 0.1 % durante 60 minutos en una cámara húmeda.
3. Las secciones se lavaron 3 x 5 minutos cada una en PBS.
4. Las secciones se incubaron con anticuerpos primarios en suero de burro normal al 1 %/PBS durante la noche a 4 °C en una cámara húmeda.
• Anticuerpo policlonal de cobaya a Calbindin-D28k (Synaptic Systems, 214005) 1:1000
5. Las secciones se lavaron 3 x 5 minutos cada una en PBS.
6. Las secciones se incubaron con anticuerpos secundarios en suero de burro normal al 1 %/PBS durante 60 minutos en una cámara húmeda (protegida de la luz).
• Anti-cobaya de burro (H+L), conjugado con Cy3 (Jackson ImmunoResearch, 706-165-148), 1:500
7. Las secciones se lavaron 3 x 5 minutos cada una en PBS (protegidas de la luz).
8. Las secciones se incubaron con solución de trabajo DAPI durante 15 minutos (protegidas de la luz).
9. Las secciones se lavaron 2 x 5 minutos en PBS (protegidas de la luz).
10. Las secciones se lavaron durante 5 minutos en ddH2O (protegidas de la luz)
11. las secciones se cubrieron con Mowiol y cubreobjetos (protegidas de la luz)
Obtención de imágenes
Los barridos de portaobjetos completos de las secciones teñidas quedaron registrados en un microscopio automático Zeiss AxioScan Z1 con lentes de alta apertura, equipado con una cámara Zeiss Axiocam 506 mono y una cámara Hitachi 3CCD HV-F202SCL, empleando el software Zeiss ZEN 2.3.
Cuantificación
El análisis de imágenes se realizó con Image Pro10 (Media Cybernetics). Al principio, las áreas diana (cerebelo e hipocampo, o cuerpo calloso y cuerpo estriado) se identificaron dibujando regiones de interés (ROI) en las imágenes. Las ROI adicionales excluyen arrugas, burbujas de aire o cualquier otro artefacto que interfiera con la medición. Posteriormente, se evaluó cuantitativamente la inmunofluorescencia dentro de las áreas identificadas.
Para la cuantificación se usa la corrección de fondo cuando era necesario y detectamos objetos inmunorreactivos mediante un umbral adecuado y un filtrado morfológico (tamaño, forma). Luego se cuantificaron diferentes características de los objetos; entre ellos, el porcentaje del área acumulada del objeto según el tamaño de la ROI (área inmunorreactiva; este es el parámetro más completo que indica si existen diferencias en la inmunorreactividad), el número de objetos normalizados al tamaño de la ROI (densidad del objeto), la intensidad de señal media de los objetos identificados (intensidad media; esto indica si hay diferencias en el nivel de expresión celular de las proteínas diana) y el tamaño de los objetos por encima del umbral. Una vez definidos los parámetros de los objetos fijados como objetivo en una prueba de rutina, el análisis cuantitativo de la imagen se desarrolló automáticamente, de modo que los resultados son independientes del operador y totalmente reproducibles.
Los datos sin procesar se organizaron y ordenaron en Excel y luego se transfirieron a GraphPad Prism para su análisis estadístico y la preparación de gráficos. Los gráficos de prisma son parte del informe del estudio y las tablas con datos sin procesar ordenados se adjuntan al informe final tras realizar los controles de calidad.
Medición de AZ-3102 y glucosilceramida en plasma y tejido cerebral de ratones
Primero, las muestras de plasma se precipitaron con proteínas con una solución de acetonitrilo/agua ultrapura/metanol (90:5:5) que contenía 500 nM del estándar interno de glucosilceramida C17:0 (GlcCer C17:0) y ácido fórmico al 0.1 %. Después de 5 minutos de mezcla a temperatura ambiente, las muestras se centrifugaron durante 5 minutos (13.000 rpm, 20 °C) y se transfirieron 50 pl de los sobrenadantes a una placa siliconada de 96 pocillos MTP.
Los tejidos cerebrales se homogeneizaron en una solución de agua ultrapura: metanol (1:1) con ácido fórmico al 0.1 % (4 mL por cada gramo de tejido) usando un homogeneizador Microtube FastPrep 24™. A continuación, los homogeneizados tisulares se mezclaron para la precipitación de proteínas con una solución de acetonitrilo:agua ultrapura:metanol (90:5:5) que contenía 500 nM de GlcCer C17:0 y ácido fórmico al 0.1 %. Después de una incubación de 5 minutos a temperatura ambiente, las muestras se centrifugaron durante 5 minutos (13000 rpm, 20 °C) y se transfirieron 50 pL de los sobrenadantes a una placa siliconada de 96 pocillos MTP.
Mediciones de AZ-3102
Primero se mezclaron muestras de plasma para la precipitación de proteínas con una solución de acetonitrilo que contenía 50 ng/mL de AZ-3101 (estándar interno). Después de 5 minutos de incubación a temperatura ambiente, las muestras se centrifugaron durante 5 minutos (13000 rpm, 4°C) y el sobrenadante se diluyó 10 veces en agua ultrapura con ácido fórmico al 0.1 %.
Los tejidos cerebrales se homogeneizaron en una solución de agua ultrapura: metanol (1:1) con ácido fórmico al 0.1 % (4 mL por cada gramo de tejido) usando un homogeneizador Microtube FastPrep 24™ (MP Biomedicals, EE.UU). Se mezclaron homogeneizados de cerebro para la precipitación de proteínas con una solución de acetonitrilo que contenía 10 ng/mL de AZ-3101 (estándar interno). Después de 5 minutos de incubación a temperatura ambiente, las muestras se centrifugaron durante 5 minutos (13000 rpm, 4°C) y el sobrenadante se diluyó 10 veces en agua ultrapura con ácido fórmico al 0.1 %.
Se inyectaron sobrenadantes de plasma diluido y tejido cerebral en un sistema LC Agilent (Agilent, EE. UU.) mediante un inyector de muestras automatizado (SIL-30, Shimadzu, EE. UU.). Los analitos se separaron por cromatografía líquida usando un gradiente lineal de la fase móvil B a un caudal de 0.800 mL/min en una columna XBridge BEH C8 de fase inversa (2.1 * 50 mm, tamaño de partícula de 2.5 pm; Waters, EE. UU.) que se mantuvo a una temperatura de 40°C. La fase móvil A consistía en agua ultrapura con 0.1 % de ácido fórmico. La fase móvil B era acetonitrilo con ácido fórmico al 0.1 %. Las adquisiciones se lograron en modo de ionización positiva usando un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo API 5500 (AB Sciex, EE. UU.) equipado con una interfaz Turbo Ion Spray. Los datos fueron calibrados y cuantificados usando el sistema de datos Analyst™ (AB Sciex, versión 1.6.3). El LLOQ para la AZ-3102 fue de 0.2 ng/mL en muestras de plasma y de 2 ng/g de tejido cerebral, respectivamente.
Medición de la glucosilceramida
Primero, las muestras de plasma se precipitaron con proteínas con una solución de acetonitrilo/agua ultrapura/metanol (90:5:5) que contenía 500 nM del estándar interno de glucosilceramida C17:0 (GlcCer C17:0) y ácido fórmico al 0.1 %. Después de 5 minutos de incubación a temperatura ambiente, las muestras se centrifugaron durante 5 minutos (13.000 rpm, 20 °C) y se transfirieron 50 j l de los sobrenadantes a una placa de 96 pocillos MTP siliconada.
Los tejidos cerebrales se homogeneizaron en una solución de agua ultrapura: metanol (1:1) con ácido fórmico al 0.1 % (4 mL por cada gramo de tejido) usando un FastPrep 24 ™ Homogeneizador de microtubos. Luego se mezclaron homogeneizados de tejidos para la precipitación de proteínas con una solución de acetonitrilo:agua ultrapura:metanol (90:5:5) que contenía 500 nM de GlcCer C17:0 y ácido fórmico al 0.1 %. Después de una incubación de 5 minutos a temperatura ambiente, las muestras se centrifugaron durante 5 minutos (13000 rpm, 20 °C) y se transfirieron 50 jL de los sobrenadantes a una placa siliconada de 96 pocillos MTP.
Las concentraciones de glucosilceramida C16:0 (GlcCer C16:0), glucosilceramida C18:0 (GlcCer C18:0) y glucosilceramida C24:1 (GlcCer C24:1) en las muestras del cerebro se cuantificaron mediante detección por HPLC-MS/MS usando el modo de monitoreo de reacción múltiple (MRM). Los sobrenadantes se analizaron mediante HPLC-MS/MS mientras se usaba una columna HALO HILIC (150 * 4.6 mm, 2.7 jm ) de Advanced Materials Technology para distinguir entre los isómeros del galactosil y glucosilceramida. Las adquisiciones de MS/MS se lograron en modo de ionización positiva usando un triple cuadrupolo API 4000 (Applied Biosystems, EE. UU.) equipado con una interfaz Turbo Ion Spray. El análisis de GlcCer C16:0 y GlcCer C18:0 se realizó usando un gradiente con la fase móvil A: acetato de amonio 5 mM en 94.5 % de acetonitrilo, 2.5 % de metanol, 2.5 % de agua ultrapura y 0.5 % de ácido fórmico y la fase móvil B: agua ultrapura y 0.1 % de ácido fórmico. El LLOQ en muestras de cerebro para GlcCer 16:0, GlcCer 18:0 y GlcCer 24:1 fue de 25, 1,250 y 381.5 pmol/g de tejido, respectivamente.
Estadísticas
El análisis estadístico se realizó en el GraphPad Prism 9. Los datos se presentan como la media ± error estándar de la media (SEM) o media error estándar de la media.
In vivo: Las diferencias entre los grupos se probaron con el ANOVA de dos factores para mediciones repetidas seguido del análisis post hoc de Bonferroni o Dunnett.
Histología: Debido al bajo n, no se pudo probar la distribución de los datos, por lo que se asumió una distribución normal. Las diferencias entre los grupos se probaron con ANOVA unifactorial seguido del análisis post hoc de Dunnett. Se usó el grupo A(NPC-/-, tratado con el vehículo) como grupo de referencia para las comparaciones por pares.
Resultados
Peso corporal
La figura 11 muestra el cambio porcentual en el peso corporal entre el PND 11 y la semana 9. El gráfico representa el progreso del peso corporal [g] por grupo medido diariamente durante la primera semana de tratamiento y semanalmente a partir de entonces.
Los resultados muestran que la salud general de los animales, como lo indica el porcentaje promedio de aumento de peso corporal, no se vio impedida por la AZ-3102 y ambos géneros de ratones NPC (-/-) tratados con AZ-3102 ganaron más que los NPC (-/-) animales no tratados.
Farmacocinética
Tabla 8. Proporciones de exposición cerebro:plasma para la AZ-3102 después de la administración oral repetida del PND 11-70.
Niveles de glucosilceramida
La figura 12 muestra los niveles de glucosilceramida C16:0 y C18:0 después de la administración oral repetida desde PND 11-70.
Los ratones tratados con AZ-3102 muestran niveles elevados de glucosilceramida C16:0 y C18:0 en el cerebro.
Signos clínicos
Definiciones de puntuaciones clínicas y criterios de valoración humanitarios
Los signos clínicos se monitorearon diariamente a partir de P45 hasta el final del estudio (de acuerdo con la plantilla a continuación en la tabla 9). Los parámetros "pérdida de peso", "salud general", "hallazgos clínicos" y "hallazgos específicos de línea" se registraron y calificaron según una escala de puntuación. La suma de esta puntuación se usó para la evaluación.
Puntuación del temblor
Tabla 10. Puntuación del temblor
La figura 13 muestra un resumen de las puntuaciones totales de signos clínicos de PND 56-70 en todos los dominios y por grupo de tratamiento para cada vehículo NPC (-/-) y por ratones tratados con AZ-3102. Lado izquierdo: puntuaciones totales por animal y grupo de tratamiento visualizadas con un gradiente, con puntuaciones más bajas en verde y puntuaciones más altas en rojo. Lado derecho: resumen de las puntuaciones que alcanzan un umbral numérico. Las puntuaciones de umbrales superiores a 7 son casos poco frecuentes en los grupos tratados; sin embargo, los grupos no tratados presentaron un número más alto en las puntuaciones totales durante el transcurso del estudio.
Los resultados muestran que los ratones tratados con el vehículo NPC (-/-) tuvieron un empeoramiento (puntuaciones mayores) en los signos clínicos generales en comparación con los animales tratados con NPC (-/-) AZ-3102. Esto se muestra además en la figura 13: lado derecho en el que se observaron con mayor frecuencia puntuaciones de, por ejemplo, superiores a 8, en el grupo tratado con el vehículo NPC (-/-) en comparación con los animales tratados con NPC (-/-) AZ-3102. Al estudiar estas puntuaciones, se encontró que el inicio, la duración así como la fuerza del temblor también disminuyeron con el tratamiento con AZ-3102 (figura 14). Se observó un alto nivel de temblor en todos los animales tratados con vehículo NPC (-/-), excepto en uno; mientras que la AZ-3102 esencialmente eliminó este alto nivel de temblor en todos los animales excepto en uno de los 24 animales probados.
La figura 14 muestra la puntuación del temblor desde el día postnatal 56-70 en el vehículo NPC (-/-) y con ratones tratados con AZ-3102. Las barras rosadas (= gris claro) representan la aparición y duración de un nivel alto de temblor (puntuación de 5); mientras que las barras verdes (= gris oscuro) representan la aparición y duración de un temblor leve o moderado. Con la excepción de un solo ratón en el grupo no tratado, todos los demás ratones presentaron un alto nivel de temblor (4 de 5 ratones). Por el contrario, sólo un ratón del grupo tratado con AZ-3102 presentó un alto nivel de temblor (1 de 24). Posibles puntuaciones de temblor: 0: sin temblor 1: Ligera descoordinación, temblor levemoderado; 5: Alto nivel de temblor, movimientos descoordinados; 10: Reflejo de adrizamiento enderezamiento reducido (ningún animal alcanzó esta puntuación).
Resultados histológicos
Definición de regiones diana
Las regiones diana se delinearon manualmente definiendo la región de interés (ROI) para los análisis cuantitativos posteriores del etiquetado fluorescente.
Lecturas del análisis cuantitativo
En la tabla que se presenta a continuación se caracterizan cuatro lecturas estándar.
• Tamaño de región [mm2]: Estos datos muestran el área promedio por sección del cerebro cubierta por la región objetivo. Esta información es importante para verificar el muestreo adecuado. También es útil identificar la atrofia cerebral que forma parte del fenotipo de algunos modelos de animales.
• Área inmunorreactiva [%]: El porcentaje de la ROI que está cubierto por objetos inmunorreactivos por encima del umbral (por ejemplo: somas celulares, neuritas, placas); este es el parámetro más completo que indica si existen diferencias generales en la inmunorreactividad.
• Densidad de objetos [número de objetos por mm2]: El número de objetos inmunorreactivos por encima del umbral normalizado al tamaño del área objetivo; esto es especialmente útil para detectar cambios en la densidad neuronal.
• Intensidad del objeto [a.u.]: El brillo medio de los píxeles de objetos inmunorreactivos por encima del umbral; esto indica si existen diferencias en el nivel de expresión celular de las proteínas diana.
• Tamaño del objeto [|-im2]: El tamaño de los objetos inmunorreactivos por encima del umbral; esto es útil para detectar diferencias en la activación de la microglía o el crecimiento de placas.
Calbindina-D28k
La inmunofluorescencia de la Calbindina-D28k se detectó con el anticuerpo policlonal de cobaya y la señal se cuantificó en la formación del cerebelo y el hipocampo. Los ratones NCP(-/-) muestran un marcador de Calbindina-D28k fuertemente disminuido en comparación con los ratones NCP(+/-) y NPC(+/+). El tratamiento con el ítem de prueba aumentó significativamente la calbindina-D28k en el cerebelo en todas las lecturas. Todos los efectos son específicos de la región porque no se detectaron diferencias grupales significativas en el hipocampo.
La figura 16 muestra los resultados de la inmunohistoquímica cerebral: marcador con calbindina-D28k en ratones tratados con vehículo NCP(-/-) y NPC(+/-) en comparación con ratones tratados con NPC (+/+, ratones de tipo salvaje) y NPC (-/-). Los gráficos presentan las medias de la señal inmunofluorescente medida dentro de la ROI en 5 secciones del cerebro por ratón (n = 2-4 por grupo). Los datos se analizaron por ANOVA unifactorial y la prueba post hoc de Dunnett. Los gráficos de barras representan medias de grupo SEM. Los gráficos de barras representan medias de grupo SEM, *Adj. Valor p: <0.001.
Al emplear técnicas inmunohistológicas que usan el marcador calbindina-D28k para células de Purkinje, se encontró que el tratamiento con AZ-3102, en comparación con el vehículo de los ratones tratados con NPC (-/-), limitó significativamente la pérdida de células de Purkinje cerebelosas (figura 16).
Conclusiones
La AZ-3102 es una nueva molécula pequeña oral desarrollada para una variedad de trastornos de depósito lisosomal. El modo de acción único de la AZ-3102 radica en su alta potencia sobre la glucosilceramida sintasa (GCS), la glucosilcerebrosidasa no lisosomal (GbA2), así como sus propiedades de penetración cerebral. La AZ-3102 se investigó en un modelo de ratón con enfermedad de Niemann-Pick de tipo C [1, 2] en el que ratones, homocigotos para el alelo NIH recesivo del gen NPC, comienzan a perder peso y muestran temblores y marcha atáxica aproximadamente a las 7 semanas de edad [3]. La gravedad de la enfermedad se asocia con una pérdida significativa de células de Purkinje cerebelosas y los signos clínicos empeoran hasta que se alcanza un punto final humanitario (por lo general entre las 12 y 14 semanas de edad) [3]. En este estudio, se investigó la dosificación oral diaria de la Az -3102 desde el día posnatal (PND) 11 al 70 en ratones NPC (-/-), NPC (-/+) y WT (NPC (+/+); Balb/c) para evaluar sus propiedades farmacocinéticas (PK), su capacidad para modular la glucosilceramida (GlcCer C16:0, GlcCer C18:0) y mejorar los signos clínicos. Además, también se examinó el efecto del tratamiento sobre un marcador inmunohistoquímico para las células de Purkinje que coincide con la neuropatología, siguiendo dosis orales diarias repetidas desde PND 11-70, AZ-3102. La salud general de los animales, que se indica por el porcentaje promedio de aumento de peso corporal, no se vio afectada por la AZ-3102 y ambos géneros de ratones n Pc (-/-) tratados con AZ-3102 ganaron más peso que los animales NPC (-/-) no tratados, (figura 11). La AZ-3102 demostró altas exposiciones cerebro:plasma, (tabla 8) y siendo consistente con el compromiso objetivo de la AZ-3102, aumentó las especies de GlcCer medidas a partir de homogeneizados cerebrales completos en comparación con los animales tratados con el vehículo en más de 2 veces para GlcCer 16:0 y aproximadamente 9 veces para GlcCer 18:0. Estas dos especies de GlcCer probablemente sean representativas de otras especies de GlcCer que también responderían a la AZ-3102. Para evaluar si la AZ-3102 alcanza concentraciones cerebrales suficientes para afectar signos más específicos de salud general y neuropatología, se midieron una variedad de signos clínicos, (tabla 9). Estos puntajes, cuando se suman durante el periodo de observación, brindan una imagen de la salud desde el PND 56-70. La figura 13 es una vista gráfica de cada animal por cohorte observada a lo largo del tiempo. En este gráfico, los ratones tratados con el vehículo NPC (-/-) presentaron un empeoramiento (puntuaciones mayores) en los signos clínicos generales en comparación con los animales tratados con NPC (-/-) Az -3102. Esto se cuantifica con más detalle en (figura 13: lado derecho) en el que se observaron con mayor frecuencia puntuaciones de, por ejemplo, superiores a 8 en el grupo tratado con el vehículo NPC (-/-) en comparación con el NPC (-/-) en animales tratados con AZ-3102. Al investigar estas puntuaciones, se encontró que el inicio, la duración y la fuerza del temblor también disminuyeron con el tratamiento con AZ-3102 (figura 14). Se observó un alto nivel de temblor en todos los animales tratados con el vehículo NPC (-/-), excepto en uno; mientras que la AZ-3102 esencialmente eliminó este alto nivel de temblor en todos los animales excepto en uno de los 24 animales probados. Empleando técnicas inmunohistológicas que usan el marcador calbindina-D28k para células de Purkinje, se encontró que el tratamiento con AZ-3102, en comparación con los ratones NP-C (-/-) tratados con el vehículo, limitó significativamente la pérdida de células de Purkinje cerebelosas (figura 16). Este hallazgo tiene relevancia para el tipo C de Niemann-Pick en el hombre, ya que la muerte neuronal y, en particular, las células de Purkinje, así como la atrofia cerebral, son características distintivas de la enfermedad [4]. Como la función cerebelosa es importante para el movimiento, la mejora de los signos clínicos y la reducción significativa del alto nivel de temblor probablemente sean el resultado de la supervivencia de las células de Purkinje cerebelosas.
En resumen, la AZ-3102, un inhibidor altamente potente (nM) disponible por vía oral tanto de GCS como de GbA2, pudo penetrar el cerebro de NPC (-/-) y animales de tipo salvaje. Adicionalmente, la AZ-3102 inhibió estas enzimas en el cerebro, como se muestra claramente mediante la modulación de las especies de GlcCer, mejoró los signos clínicos, redujo significativamente el alto nivel de temblor y limitó la pérdida de células de Purkinje cerebelosas en comparación con los animales tratados con vehículo.
1. Loftus, S.K., et al., Murine model of Niemann-Pick C disease: mutation in a colesterol homeostasis gene. Science, 1997. 277(5323): p. 232-5.
2. Zervas, M., K. Dobrenis, and S.U. Walkley, Neurons in Niemann-Pick disease type C accumulate gangliosides as well as unesterified cholesterol and undergo dendritic and axonal alterations. J Neuropathol Exp Neurol, 2001. 60(1): p. 49-64.
3. Santiago-Mujica, E., et al., Hepatic and neuronal phenotype of NPC1-/-mice. Heliyon, 2019. 5(3).
4. Vanier, M.T., Niemann-Pick C disease type C. Orphanet Journal of Rare Diseases, 2010. 5(1): p. 16.
Ejemplo 5 - Efecto de la administración de la forma cristalina del compuesto (I) a ratones que padecen la enfermedad de Sandhoff (alteración del gen murino Hexb [Hexb (-/-)] mediante mutaciones)
A ratones que padecían la enfermedad de Sandhoff se les administró una cantidad terapéuticamente eficaz de AZ-3102. Los datos iniciales indican que, al igual que en el tratamiento de Niemann-Pick de tipo C, los signos clínicos de los animales enfermos han mejorado.
Claims (13)
- REIVINDICACIONES 1. Una forma cristalina del compuesto (I),en la que la forma cristalina muestra una reflexión, expresada como un valor de 20, a 17.8 ± 0.2°, en un patrón de difracción de rayos X en polvo, en la que la reflexión a 17.8 ± 0.2° es una de las cuatro reflexiones más fuertes en el patrón de difracción de rayos X en polvo.
- 2. La forma cristalina de la reivindicación 1, que muestra además una o más reflexiones, expresadas como un valor de 20, en uno o más de 4.1 ± 0.2°, 8.3 ± 0.2°, 12.4 ± 0.2°, 13.6 ± 0.2°, 14.5 ± 0.2°, 14.9 ± 0.2°, 15.2 ± 0.2°, 17.2 ± 0.2°, 19.3 ± 0.2°, 21.2 ± 0.2°, 22.4 ± 0.2°, 22.9 ± 0.2° y 23.3 ± 0.2°, en un patrón de difracción de rayos X en polvo.
- 3. La forma cristalina de la reivindicación 1 o la reivindicación 2: (a) que tiene un punto de fusión de 89 °C a 96 °C; y/o (b) en la que la forma cristalina es sustancialmente no higroscópica.
- 4. Una composición farmacéutica que comprende la forma cristalina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
- 5. La composición farmacéutica de la reivindicación 4, en la que la composición farmacéutica está contenida en una cápsula.
- 6. La composición farmacéutica de la reivindicación 5, en la que la composición farmacéutica está contenida en la cápsula: (a) sin ningún otro ingrediente; o (b) con al menos un portador farmacéuticamente aceptable.
- 7. La forma cristalina de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, o la composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 4-6, para su uso en terapia.
- 8. La forma cristalina de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, o la composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 4-6, para su uso como medicamento.
- 9. La forma cristalina de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, o la composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 4-6, para su uso en el tratamiento de una enfermedad que implica niveles anormales de glucosilceramida y/o niveles más altos de glicoesfingolípidos.
- 10. La forma cristalina o la composición farmacéutica para su uso de la reivindicación 9, en la que la enfermedad que implica niveles anormales de glucosilceramida y/o niveles más altos de glicoesfingolípidos es una enfermedad de depósito lisosomal, tal como la enfermedad de Gaucher, la enfermedad de Fabry, gangliosidosis GM1, gangliosidosis g M2 (tales como la enfermedad de Tay-Sachs, la enfermedad de Sandhoff o la variante AB), sialidosis, la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C y el síndrome de mioclonías de acción-insuficiencia renal, o un síntoma de una de las enfermedades clasificadas colectivamente como síndrome metabólico, tal como obesidad, resistencia a la insulina, hiperlipidemia, hipercolesterolemia, enfermedad renal poliquística, diabetes de tipo II e inflamación crónica, o un trastorno neurodegenerativo, tal como la enfermedad de Parkinson o la demencia con cuerpos de Lewy, o aterosclerosis.
- 11. Un procedimiento de preparación de la forma cristalina de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende poner en contacto una muestra del compuesto (I) con un disolvente, opcionalmente en el que: (a) el disolvente se selecciona entre acetonitrilo, acetato de etilo, isopropanol, anisol, agua y tert-butilmetiléter (TBME); y/o (b) antes de poner en contacto la muestra del compuesto (I) con el disolvente, la muestra del compuesto (I) se purifica, opcionalmente en el que la muestra del compuesto (I) se purifica usando cromatografía.
- 12. Uso de la base libre del compuesto (I) para preparar la forma cristalina de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
- 13. Un procedimiento de preparación de una forma cristalina de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende cristalizar la base libre del compuesto (I).
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