ES2964145T3

ES2964145T3 - Método para producir un hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero

Info

Publication number: ES2964145T3
Application number: ES21743175T
Authority: ES
Inventors: Thomas Haselgrübler; Christian Hutterer; Stefan Winter; Julia Schartner; Juliane Winkler
Original assignee: Ever Neuro Pharma GmbH
Current assignee: Ever Neuro Pharma GmbH
Priority date: 2020-07-13
Filing date: 2021-07-13
Publication date: 2024-04-04
Anticipated expiration: 2041-07-13
Also published as: EP4114843A1; US20230302080A1; PL4114843T3; WO2022013236A1; EP4114843B1; EP4114843C0

Abstract

Se divulga un método para producir un hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero, que comprende las siguientes etapas: - proporcionar un hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero, - agregar iones Zn al hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero para formar un complejo que comprende los iones Zn y el hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero, - obtener el complejo que comprende los iones Zn y el hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero en una composición de hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Método para producir un hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero

La presente invención se refiere a métodos para producir un hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero, preferentemente para producir un hidrolizado de proteína de cerebro porcino.

En los documentos EP 0452299 A1, CN 103333941 A, WO 2005/074970 A2, WO 2007/128493 A1, RU 2147888 C1, CN 106 868 082 A, y Gromova et al. (Difficult Patient 8 (2010), 25-31), se describen preparaciones farmacéuticas de neuropéptidos generados proteolíticamente de composición única derivados de proteínas de cerebro purificadas. Tales preparaciones comprenden habitualmente 15 a 30% de péptidos de bajo peso molecular (< 10kDa) y aminoácidos libres tales como alanina, ácido aspártico, arginina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, cisteína y valina. Estas disoluciones son preferentemente estériles y están preparadas para inyección o infusión (es decir, satisfacen todos los estándares y requisitos para preparaciones farmacéuticas a administrar a pacientes humanos). Tales hidrolizados de proteína de cerebro son por ejemplo una mezcla de péptidos de cadena corta purificados a partir de cerebros de cerdo, que pueden incluir péptidos que imitan (y no se limitan a) al factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), al factor neurotrófico derivado de la estirpe de células gliales (GDNF), al factor de crecimiento nervioso (NGF), y al factor neurotrófico ciliar (CNTF) (Chen et al., Neurobiol. Aging 28 (2007), 1148-1162; Hartbauer et al., J Neural Transm. 108 (2001), 459-473 y 581-592).

El N-PEP-12 es un fármaco oralmente disponible derivado de una preparación peptídica producida enzimáticamente a partir de proteínas de células nerviosas purificadas, es decir, a partir de una preparación de hidrolizado de proteína de cerebro, pero de menor potencia y área de uso (Windisch et al., J. Neur. Transmission 112 (2005), 1331-1343). El N-PEP-12 consiste en 70% de péptidos basados en contenido de nitrógeno total y 30% de aminoácidos libres, y representa así un derivado rico en péptidos de una preparación de hidrolizado de proteína de cerebro.

Tales hidrolizados de proteína de cerebro se pueden proporcionar como una mezcla de péptidos con propiedades parecidas a las neurotróficas que mejoran los déficits de comportamiento y cognitivo en modelos preclínicos y pacientes con demencia; y mejora la función motora, el rendimiento cognitivo y las actividades de la vida diaria en el accidente cerebrovascular así como en TBI. El modo de acción de tales hidrolizados de proteína de cerebro es pleyotrópico, oscilando desde propiedades neuroprotectoras tales como excitotoxicidad reducida y la formación de radicales libres hasta la recuperación mejorada a través de una mayor neuroplasticidad y neurogénesis.

Tales hidrolizados de proteína de cerebro se usan para el tratamiento del accidente cerebrovascular y de la demencia vascular. Por ejemplo, se dio a conocer un efecto beneficioso sobre la función cognitiva en personas con demencia vascular, posiblemente mediante la menor deposición de beta-amiloide. Los hidrolizados de proteína de cerebro están aprobados para tratar el accidente cerebrovascular en aproximadamente 50 países de todo el mundo. Además, los hidrolizados de proteína de cerebro se usan para el tratamiento de CADASIL (para arteriopatía cerebral dominante autosómica con infartos subcorticales y leucoencefalopatía; o: síndrome de CADASIL), especialmente para reducir la mortalidad en pacientes con CADASIL (documento WO 2019/042983 A1).

Aunque tales hidrolizados de proteína de cerebro ya son por lo tanto un producto comercializado con éxito en el mercado, se desea investigar si es posible una extensión de este producto al campo de los complementos nutricionales, y, si es que sí, cómo se pueden proporcionar tales productos complementarios nutricionales mejorados (tal como NPEP-12) de una manera eficaz (y en una forma activa oralmente disponible). Por lo tanto, un objetivo es proporcionar procedimientos de producción ampliados para hidrolizados de proteína de cerebro de mamífero que, opcionalmente, asimismo sean adecuados para otros productos que son similares a NPEP-12, es decir, productos de hidrolizados de proteínas. Es un objetivo adicional proporcionar nuevas preparaciones de hidrolizados de proteína de cerebro de mamífero que muestren una extensión en propiedades y funciones relevantes en comparación con productos de hidrolizados de proteína de cerebro de mamífero conocidos, especialmente con respecto a los efectos en el sistema neural, tales como efectos mejorados sobre la integridad de las células endoteliales cerebrales (o la barrera hematoencefálica (BBB)). Otros objetos de la presente invención son el establecimiento de un producto de hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero oralmente disponible que se pueda usar incluso como complemento nutricional. Es un objetivo adicional usar tales productos novedosos para la prevención, mejora y, si es aplicable, tratamiento del deterioro de la memoria asociado a la edad (AAMI).

Por lo tanto, la presente invención proporciona un método para la producción de un hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero, preferentemente para producir un producto de complemento nutricional mejorado derivado de tal producto de hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero, que comprende las siguientes etapas:

- proporcionar un hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero,

- añadir iones de Zn al hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero para formar un complejo que comprende los iones de Zn y el hidrolizado de proteína,

- obtener el complejo que comprende los iones de Zn y el hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero en una composición de hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero.

La presente invención proporciona un método para la producción de composiciones de hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero, que se ha desarrollado específicamente para ampliar la disponibilidad y las áreas de uso de las composiciones de hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero.

Para lograr altas concentraciones de cinc y transferir fácilmente iones de cinc a péptidos y aminoácidos a pH neutro, es beneficioso usar fuentes de cinc tal como gluconato de Zn, sulfato de Zn o acetato de Zn, preferentemente gluconato de Zn. El gluconato de cinc es la sal de cinc del ácido glucónico. Es un compuesto iónico que consiste en dos aniones de gluconato por cada catión de cinc (II) (Zn2+). En el gluconato de Zn, el ion de Zn forma un complejo débil con gluconato. En el método según la presente invención, los iones de Zn se añaden como gluconato de Zn, preferentemente en una cantidad de 0.1 a 500 mg/ml, preferentemente de 0.5 a 100 mg/l, y especialmente de 1 a 70 mg/ml.

La composición complejada de cinc según la presente invención se puede administrar oralmente, y muestra una eficacia novedosa y ampliada, por ejemplo en comparación con productos de la técnica anterior, tal como N-PEP (Windisch et al., 2005; “NPEP-sin Z” en la sección de ejemplos), o en comparación con otros hidrolizados que contienen Zn no complejados (“NPEP-bajo pH” en la sección de ejemplos), como se demuestra por ejemplo en ensayos de permeabilidad endotelial o en la reducción de proteínas proinflamatorias (ver, por ejemplo, la sección de ejemplos, a continuación).

En una forma de realización preferida del presente método, el hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero es un hidrolizado de tejido de cerebro porcino o bovino, preferentemente un intermedio del procedimiento de fabricación, especialmente un producto intermedio rico en péptidos. Según una forma de realización preferida, el intermedio es un hidrolizado purificado que carece de componentes de alto peso molecular tales como proteínas o ácidos nucleicos y ácidos grasos (es decir, no detectables, por ejemplo menos de 10 ng/dosis de ácidos nucleicos). Los hidrolizados de proteína de cerebro de mamífero preferidos se describen en los documentos EP 0 452299 A1, WO 2005/074970 A<2>, y WO 2007/128493 A1. En consecuencia, el hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero contiene preferentemente por lo menos un péptido seleccionado de entre el grupo NMVPFPR, ASAFQGIGSTHWVYDGVGNS, y DLHW

Según una forma de realización preferida, el hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero es un hidrolizado de cerebro de mamífero derivado enzimáticamente. Aunque asimismo se pueden usar otros métodos de hidrólisis, tal como hidrólisis básica, ácida, o mecánica, se prefiere la hidrólisis enzimática, principalmente debido a su idoneidad para la estandarización, su conveniencia en la manipulación, y su reproducibilidad. Las enzimas preferidas para obtener la hidrólisis enzimática son enzimas que se pueden obtener en el mercado industrial con alta y gran calidad y reproducibilidad, principalmente enzimas tales como tripsina, pepsina, quimotripsina, papaína, carboxipeptidasa, o mezclas de las mismas (por ejemplo pancreatina).

Preferentemente, los iones de Zn se añaden al hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero a un pH de 2.5 a 7.5, preferentemente de 3.0 a 6.5.

En una forma de realización preferida del presente método, el pH de la composición del hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero cambia al formarse el complejo que comprende los iones de Zn y el hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero.

Preferentemente, el pH final de la composición del hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero se ajusta (y se mantiene para el producto final) a 3.0 hasta 9.0, especialmente de 5.0 y 9.0. Según una forma de realización preferida, el producto final se proporciona con un pH aproximadamente neutro a ligeramente básico (“aproximadamente neutro”; por razones fisiológicas); por lo tanto, el pH se ajusta preferentemente a 6.0 hasta 8.0, especialmente 7.0 a 7.5.

Según una forma de realización alternativamente preferida, un producto más ácido se proporciona con un pH de 3.0 a 6.0, preferentemente 3.5 a 5.0, especialmente 4.0 a 5.0. Un producto específicamente preferido presenta un pH de aproximadamente 4.7 (por ejemplo de 4.5 a 4.9). Esta forma de realización “ácida” preferida presenta ventajas de procedimiento, específicamente por razones de producción y almacenamiento en masa.

Las cantidades relativas de los iones de Zn y del hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero se pueden optimizar para cada hidrolizado; preferentemente (y especialmente adecuado para formar el hidrolizado de proteína de cerebro complejado con cinc según la presente invención), el hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero proporcionado contiene de 0.5 a 100 mg de nitrógeno (N<2>)/ml, preferentemente 1 a 50 mg/ml, más preferido 5 a 30 mg/ml, especialmente 5 a 20 mg/ml.

Según una forma de realización preferida, los iones de Zn se añaden al hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero en una cantidad relativa de 0.05 a 50 mg de Zn por mg de hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero (como mg de N<2>), preferentemente de 0.1 mg a 10 mg de Zn por mg de hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero (como mg de N<2>), especialmente 0.2 mg a 4 mg de Zn por mg de hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero (como mg de N<2>). El contenido de nitrógeno se puede analizar por análisis elemental o mediante el método de Kjeldahl (por ejemplo, Farmacopea Europea (Ph.Eur.), 2.5.9. Determinación de nitrógeno). El contenido de aminoácidos se analiza por análisis de HPLC; el contenido de péptidos se calcula a partir del contenido de aminoácidos libres y del contenido de nitrógeno.

Según una forma de realización preferida del presente método, la concentración de Zn en el hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero complejado con Zn se ajusta a una concentración de 0.05 a 50 mg/ml, preferentemente de 0.1 a 25 mg/ml, especialmente de 0.2 a 20 mg/ml.

Según una forma de realización preferida del presente método, el hidrolizado de cerebro de mamífero complejado con Zn se completa en una preparación final, preferentemente en un complemento nutricional o en una preparación farmacéuticamente aceptable, especialmente de manera preferida introduciendo el hidrolizado de proteína complejado con Zn en una forma de dosificación nutricionalmente aceptable o en un recipiente farmacéuticamente aceptable.

La presente invención representa un método para la producción de un hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero en el que los péptidos y los aminoácidos se complejan con iones de cinc.

Los iones de cinc se añaden preferentemente como gluconato de cinc debido a su buena solubilidad en agua hasta pH 7.5 debido a la formación débil de complejos. Asimismo se pueden usar otras sales de cinc tales como sulfato de cinc y acetato de cinc.

En el método según la presente invención, los iones de cinc se añaden preferentemente en una cantidad de 1 a 50 mg/ml, preferentemente 2 a 20 mg/ml, o como un polvo sólido, al hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero que presenta un contenido de nitrógeno total preferido de 1 - 50 mg/ml, especialmente 5 - 25 mg/ml.

Preferentemente, los iones de Zn se añaden al hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero a un pH de 2.5 a 7.5. El pH final se ajusta preferentemente (en la forma de realización preferida “aproximadamente neutra”) a 6.0 -8.0, especialmente 7.0 - 7.5, para lograr un alto grado de formación de complejo. En la forma de realización preferida “ácida”, el pH final se ajusta a un pH de 3.0 a 6.0, preferentemente de 3.5 a 5.0, especialmente de 4.0 a 5.0 (específicamente a un pH de aproximadamente 4.7 (por ejemplo de 4.5 a 4.9)), nuevamente, asimismo i.a. para lograr un alto grado de formación de complejo.

Las utilizaciones preferidas de los productos obtenidos según la presente invención son la utilización como complemento nutricional y como utilización farmacéutica. En consecuencia, el hidrolizado de proteína complejado con Zn según la presente invención se acaba preferentemente en una preparación final (que permite la comercialización del producto), preferentemente en un complemento nutricional o en una preparación farmacéuticamente aceptable, preferentemente rellenando el hidrolizado de proteína complejado con Zn en una forma de dosificación nutricionalmente aceptable o en un recipiente farmacéuticamente aceptable.

Preferentemente, el hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero complejado con Zn se seca, preferentemente se seca por pulverización, se seca mediante lecho fluidizado, o se liofiliza.

Según una forma de realización preferida, el método según la presente invención comprende mezclar otros componentes con sustancias adicionales antes, después o durante la formación del complejo. Las sustancias adicionales preferidas son aditivos de la formulación, estabilizantes, aditivos nutricionales, excipientes farmacéuticamente aceptables, o mezclas de los mismos, especialmente hidratos de carbono, tales como lactosa, manitol, maltodextrina, sacarosa, dextrano, trehalosa, celulosa, almidón hidrolizado, y mezclas de los mismos (que se pueden usar para todos los fines, especialmente secando por pulverización, secando mediante lecho fluidizado, aditivos de la formulación y estabilizantes (Lee et al., Food Res. 2 (2018), 486-499)).

Preferentemente, el hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero complejado con Zn se seca, preferentemente se seca por pulverización, se seca mediante lecho fluidizado, o se liofiliza, y después se puede llevar a un recipiente final (o se puede liofilizar ya en el recipiente final).

Según otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición que comprende el nuevo hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero complejado con Zn proporcionado por la presente invención, preferentemente obtenible según el método según la presente invención.

Para la presente invención, los hidrolizados preferidos están enriquecidos en péptidos, y contienen - sobre la base del contenido de nitrógeno total - 50 a 90% de péptidos y 50 a 10% de aminoácidos libres, preferentemente 60 a 80% y 40 a 20% de aminoácidos libres.

En base al peso seco total, las composiciones preferidas según la presente invención comprenden 5 a 90% de péptidos, 1 a 90% de aminoácidos libres, y 1 a 90% de sustancias adicionales, tales como aditivos de la formulación, estabilizantes, aditivos nutricionales, excipientes farmacéuticamente aceptables, o mezclas de los mismos.

Las composiciones de complementos nutricionales específicamente preferidas según la presente invención contienen 10 a 50%, preferentemente 10 a 30% de péptidos, 1 a 30%, preferentemente 2 a 20% de aminoácidos libres, y 20 a 89% de sustancias adicionales, especialmente hidratos de carbono, tales como lactosa, manitol, maltodextrina, sacarosa, dextrano, trehalosa, celulosa, almidón hidrolizado, y mezclas de los mismos.

La presente invención se refiere específicamente a la provisión de productos de complementos nutricionales mejorados basados en el presente hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero complejado con cinc, y a la utilización de los presentes hidrolizados de proteína de cerebro de mamífero complejados con cinc como complemento nutricional. La expresión “complemento nutricional” o “complemento alimentario” (que se debe utilizar intercambiablemente en el contexto de la presente invención) se ha de interpretar para la presente invención según la Directiva de la EU 2002/46/EC del 10 de junio de 2002 como “materias alimentarias cuyo fin es complementar la dieta normal y que son fuentes concentradas de nutrientes u otras sustancias con un efecto nutricional o psicológico, solas o en combinación, comercializadas en forma de dosis, principalmente formas tales como cápsulas, pastillas, comprimidos, píldoras y otras formas similares, sobres (“sachets”) de polvo, ampollas de líquidos, botellas dispensadoras de gotas, u otras formas similares de líquidos y polvos diseñadas para ingerirse en cantidades unitarias pequeñas medidas”.

En consecuencia, las formas de dosis preferidas de los complementos nutricionales según la presente invención se seleccionan de entre el grupo de cápsulas, pastillas, comprimidos, píldoras y otras formas similares, saquitos de polvo, ampollas de líquidos, botellas dispensadoras de gotas, u otras formas similares de líquidos y polvos diseñadas para ingerirse en cantidades unitarias pequeñas medidas.

Los complementos nutricionales que comprenden los presentes hidrolizados de proteína de cerebro de mamífero complejados con cinc están destinados por lo tanto, entre otros, a complementar la dieta y proporcionar nutrientes que pueden faltar o que pueden no consumirse en cantidades suficientes en una dieta de una persona.

Según un aspecto preferido, la presente invención se refiere a un complemento nutricional que comprende un hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero complejado con Zn, preferentemente obtenible según el método de acuerdo con la presente invención.

El complemento nutricional según la presente invención se proporciona preferentemente en forma de dosis. Tales formas de dosis son las utilizadas típicamente para complementos nutricionales (complementos alimentarios), es decir, como cápsulas, pastillas, comprimidos, píldoras y otras formas similares, saquitos de polvo, ampollas de líquidos, botellas dispensadoras de gotas, y otras formas similares de líquidos y polvos diseñadas para ser ingeridas en cantidades unitarias pequeñas medidas.

En una forma de realización preferida, la composición de complemento nutricional según la presente invención contiene 5 a 1000 mg, preferentemente 7.5 a 500 mg, especialmente 10 a 300 mg, de hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero complejado con Zn por ml en disolución acuosa, o se puede reconstituir en tal disolución acuosa. Las composiciones según la presente invención se proporcionan preferentemente en forma seca o de disolución (acuosa). Todas las referencias en la presente descripción se refieren a ambas, la forma seca (eventualmente reconstituida en una forma acuosa antes de la administración (oral)) y la forma de disolución. La reconstitución de una forma seca del hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero complejado con Zn se lleva a cabo habitualmente añadiendo agua o una disolución de reconstitución acuosa al producto seco según las instrucciones de uso que acompañan al producto de complemento nutricional.

Preferentemente, la composición de complemento nutricional está en forma de dosis, en la que la dosis contiene 0.1 a 100 ml, preferentemente 1 a 50 ml de hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero complejado con Zn, correspondiente a 21.5 a 21,520 mg de hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero complejado con Zn en disolución acuosa, o se puede reconstituir en tal disolución acuosa.

En una forma de realización preferida, la dosis del complemento nutricional según la presente invención contiene una cantidad total de Zn de 0.05 a 25 mg (por dosis), preferentemente de 0.1 a 15 mg, especialmente de 0.5 a 10 mg.

En una forma de realización preferida, la composición de complemento nutricional según la presente invención presenta un pH en disolución acuosa de 5.0 a 9.0. En la forma de realización “aproximadamente neutra” preferida, el pH de la composición es de 6.0 a 8.0, especialmente de 7.0 a 7.5, o es reconstituible en una disolución acuosa que presenta un pH de 6.0 a 8.0, especialmente de 7.0 a 7.5. En la forma de realización “ácida” preferida, el pH de la composición es de 3.0 a 6.0, preferentemente de 3.5 a 5.0, especialmente de 4.0 a 5.0. Una composición de complemento nutricional específicamente preferida según la presente invención presenta un pH de aproximadamente 4.7 (por ejemplo de 4.5 a 4.9).

Preferentemente, en el complemento nutricional, la concentración de cinc en el hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero complejado con Zn presenta en disolución acuosa una concentración de 0.05 a 50 mg/ml, preferentemente de 0.1 a 25 mg/ml, especialmente de 0.2 a 20 mg/ml, o en la que el hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero complejado con Zn es reconstituible en una disolución acuosa, una concentración de 0.05 a 50 mg/ml, preferentemente de 0.1 a 25 mg/ml, especialmente de 0.2 a 20 mg/ml.

En una forma de dosis preferida de la presente composición de complemento nutricional, la dosis contiene 5 a 1000 mg, preferentemente 7.5 a 500 mg, especialmente 10 a 300 mg, de hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero complejado con Zn.

En una forma de realización preferida, la composición de complemento nutricional según la presente invención contiene un hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero complejado con Zn que contiene por lo menos un péptido seleccionado de entre el grupo NMVPFPR, ASAFQGIGSTHWVYDGVG<n>S, y DLHW. Es conocido que tales péptidos presentan un valor dietético elevado y una actividad neuroprotectora mejorada (documentos e P 0 452 299 A1, WO 2005/074970 A2, y WO 2007/128493 A1). Este efecto se puede incrementar aún más proporcionando estos péptidos en forma complejada con cinc según la presente invención.

Como se menciona anteriormente, el hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero complejado con Zn preferentemente se seca, especialmente se seca por pulverización, se seca en lecho fluidizado, o se liofiliza. Entonces se puede rellenar y acabar, especialmente a la forma de dosis respectiva adecuada para ser comercializada como complemento nutricional. Como complemento nutricional, la capacidad para administrarlo oralmente y la biodisponibilidad mediante el paso eficaz a través del estómago son elementos importantes. En consecuencia, el revestimiento entérico representa una forma de realización preferida de los productos según la presente invención. El revestimiento entérico es una técnica muy disponible para un experto en la materia. Para evitar la disolución o disgregación del hidrolizado en el entorno gástrico, existen diversas sustancias, tales como copolímeros de acrilato de metilo-ácido metacrílico, gelatina, colágeno, acetato-ftalato de celulosa (CAP), acetatosuccinato de celulosa, ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa, acetato-succinato de hidroxipropilmetilcelulosa (acetato-succinato de hipromelosa), acetato-ftalato de polivinilo (PVAP), copolímeros de metacrilato de metiloácido metacrílico, goma laca, acetato-trimelitato de celulosa, alginato de sodio, zeína, disolución acuosa de revestimiento entérico (etilcelulosa, triglicéridos de cadena media (coco), ácido oleico, alginato de sodio, ácido esteárico) (cápsulas blandas revestidas), etc. El hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero complejado con Zn según la presente invención se protege de ese modo de la acidez del estómago, y se puede liberar después del estómago (por ejemplo, en el tracto superior del intestino).

Por lo tanto, el complemento nutricional en forma seca según la presente invención se proporciona preferentemente como cápsula, tableta, comprimido, píldora, o saquito de polvo, especialmente como comprimido o cápsula con un revestimiento entérico, por ejemplo un revestimiento que comprende copolímeros de acrilato de metilo-ácido metacrílico, gelatina, colágeno, acetato-ftalato de celulosa (CAP), acetato-succinato de celulosa, ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa, acetato-succinato de hidroxipropilmetilcelulosa (acetato-succinato de hipromelosa), acetato-ftalato de polivinilo (PVAP), copolímeros de metacrilato de metilo-ácido metacrílico, goma laca, acetatotrimelitato de celulosa, alginato de sodio, zeína, disolución acuosa de revestimiento entérico (etilcelulosa, triglicéridos de cadena media (coco), ácido oleico, alginato de sodio, ácido esteárico) (cápsulas blandas revestidas), o mezclas de los mismos.

Preferentemente, el complemento nutricional comprende, por dosis, 10 mg a 5 g, preferentemente 50 mg a 1 g, especialmente 100 mg a 500 mg, de un hidrato de carbono como sustancia adicional, preferentemente un disacárido, especialmente lactosa, trehalosa, o mezclas de las mismas.

Según una forma de realización preferida de la presente composición, especialmente si se proporciona como complemento nutricional (dietético), la composición comprende además vitaminas, tal como vitamina A, vitaminas diferentes del grupo B, vitamina C, vitamina D, E y/o K. Además, puede comprender sustancias minerales y/u oligoelementos, tales como calcio, magnesio, hierro, cobre, sodio, manganeso, yodo, potasio, selenio, cromo, molibdeno, flúor, cloro, y/o fósforo. Otros ingredientes pueden ser cafeína y taurina, ácidos grasos, tales como ácidos grasos Q, ácido alfalipoico, fosfolípidos, fosfatidilserinas, y/o extractos vegetales. Puede comprender además sustancias saborizantes, colorantes, como dióxido de titanio u óxidos férricos, y/o agentes conservantes. Los ejemplos de tales conservantes son etilparabeno (éster etílico del ácido p-hidroxibenzoico), cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, ácido benzoico, butilparabeno (éster butílico del ácido p-hidroxibenzoico), metilparabeno (éster metílico del ácido p-hidroxibenzoico), sorbato de potasio, ácido propiónico, propilparabeno (éster propílico del ácido p-hidroxibenzoico), benzoato de sodio, propionato de sodio, ácido sórbico, y/o mezclas de los mismos.

Sin embargo, el presente hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero complejado con Zn asimismo se puede utilizar farmacéuticamente, de manera especial para la prevención y el tratamiento de enfermedades humanas. En consecuencia, el hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero complejado con Zn asimismo se puede acabar en una preparación farmacéuticamente aceptable, preferentemente introduciendo el hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero complejado con Zn en un recipiente farmacéuticamente aceptable.

Según otro aspecto, la presente invención asimismo se refiere a una composición farmacéutica que comprende el nuevo hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero complejado con Zn proporcionado por la presente invención, preferentemente obtenible según el método de acuerdo con la presente invención, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Un excipiente farmacéuticamente aceptable puede ser cualquier excipiente usado en formulaciones farmacéuticas, tales como un diluyente, amortiguador, aglutinante, estabilizante, conservante, etc.

El nuevo producto de hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero complejado con Zn según la presente invención se puede aplicar, por supuesto, en todas las indicaciones conocidas o sugeridas para productos de hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero conocidos. Las indicaciones específicamente preferidas son (según la nomenclatura ICD11) enfermedad cerebrovascular, preferentemente isquemia cerebral (8B10, 8B11, 8B1Y/Z), especialmente hemorragia intracraneal (8B00-3), enfermedad cerebrovascular sin síntoma cerebral agudo (8B21), ciertas enfermedades cerebrovasculares específicas (8B22), encefalopatía hipóxica-isquémica (8B24), efectos tardíos de la enfermedad cerebrovascular (8B25), síndromes vasculares del cerebro en enfermedades cerebrovasculares (8B26), enfermedades cerebrovasculares, no especificadas (8B2Z); trastornos con deterioro neurocognitivo como característica principal, preferentemente enfermedad de Alzheimer (8A20), atrofias focales progresivas (8A21), enfermedad de cuerpos de Lewy (8A22), degeneración del lóbulo frontotemporal (8A23), otros trastornos específicos con deterioro neurocognitivo como característica principal (8A2Y), trastornos con deterioro neurocognitivo como característica principal, no específicos (8A2Z); trastornos de cefalea (8A80-85), preferentemente otros trastornos de cefalea específicos (8A8Y) y trastornos de cefalea, no específicos (8A8Z); enfermedades de las neuronas motoras o trastornos relacionados, preferentemente enfermedad de las neuronas motoras (8B60), atrofia muscular espinal (8B61), atrofia muscular progresiva postpolio (8B62), otras enfermedades de las neuronas motoras o trastornos relacionados específicos (8B6Y), y enfermedades de las neuronas motoras o trastornos relacionados, no específicos (8B6Z); lesiones del sistema nervioso, especialmente lesión de nervios craneales (NA04), lesión intracraneal (NA07), y lesión de la cabeza por aplastamiento (NA08); encefalopatía hipóxica isquémica del neonato (8B24KB04), trastornos de la médula espinal excluyendo traumatismo, trastornos de la raíz nerviosa, del plexo y de los nervios periféricos, enfermedades de la unión neuromuscular o de los músculos, trastornos de la raíz nerviosa, del plexo o de los nervios periféricos, parálisis cerebral, trastornos del sistema nervioso autónomo, y trastornos del sistema nervioso posquirúrgicos.

Las indicaciones médicas adicionales preferidas son deterioro de la memoria asociado a la edad, deterioro cognitivo asociado a la edad, apoyo a la agilidad mental, permeabilidad microvascular comprometida asociada a la edad, protección de los constituyentes celulares (ADN, proteínas y lípidos) frente al daño oxidativo, normalización del sistema inmunitario y de la función vascular, mejora de viabilidad y recuperación neuronales, apoyo al crecimiento y conexión nerviosas, mejora de la función cognitiva y activación de la actividad bioeléctrica, preferentemente en sujetos sanos, especialmente en ancianos sanos (edad: 51+), protección frente a lesiones en las neuronas corticales asociadas a la edad y a la enfermedad (Alvarez et al., Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol.

27 (20005), 483-487; Vole, Neurol. Psychiatrie (2005), 1-7; Crook et al., Int. Clin. Psychopharm. 20 (2005), 97-100; Windisch et al., J. Neural Transm. 112 (2005), 1331-1343).

Las composiciones según la presente invención asimismo se pueden usar en un entorno no terapéutico. En esta utilización, las composiciones según la presente invención se administran a sujetos sanos, es decir, personas que no tienen una enfermedad o trastorno. Preferentemente, las composiciones según la presente invención se administran para mejorar la función cognitiva y activar la actividad bioeléctrica en sujetos sanos, especialmente en ancianos sanos (edad: 51+). Preferentemente, las composiciones (nutricionales) según la presente invención son útiles para prevenir, mejorar, y/o contrarrestar deficiencias relacionadas con el proceso de envejecimiento preferentemente en mamíferos, especialmente en seres humanos, todavía más preferentemente en seres humanos ancianos.

Las concentraciones preferidas que se deben utilizar según la presente invención contienen 50 a 1000 mg, preferentemente 100 a 500 mg, especialmente 100 a 250 mg, de hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero complejado con Zn según la presente invención por ml en disolución acuosa.

En el documento EP 0452299 A1 se describe un método preferido para producir hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero usado como base para el método de complejación según la presente invención, y se obtiene a partir de hidrólisis enzimática de fracción de proteína de cerebro de cerdo.

La dosis aplicada puede estar preferentemente en el intervalo de 10 a 10000 mg (0.5 a 50 ml de hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero complejado con Zn). Preferentemente, el tratamiento se lleva a cabo con una dosis en el intervalo de 0.1 a 100 ml, preferentemente 1 a 50 ml, de hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero complejado con Zn, (un hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero complejado con Zn preferido presenta una concentración entre 50 y 1000 mg/ml), preferentemente 75 y 500 mg/ml, especialmente 100 y 300 mg/ml). Si se aplica intramuscularmente, la dosis es habitualmente menor de manera intravenosa (por ejemplo, preferentemente 0.5 a 5 ml, y preferentemente 0.5 a 10 ml, de manera intravenosa). Preferentemente, el tratamiento se lleva a cabo mediante una dosis administrada a intramuscularmente de 0.1 a 10 ml, preferentemente 0.5 a 5 ml, que corresponde a 21.5 mg a 2152 mg de hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero complejado con Zn. El hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero complejado con Zn asimismo se puede infundir de manera continua (habitualmente a volúmenes por encima de 10 ml), y el hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero complejado con Zn se puede diluir por lo tanto, por ejemplo, con disolución de cloruro sódico al 0.9% (9 mg NaCl/ml), con disolución de Ringer (Na+ 153.98 mmol/l, Ca2+ 2,74 mmol/l, K+ 4,02 mmol/l, Cl- 163,48 mmol/l), con glucosa al 5%. La duración de la infusión de típicamente de 5 min a 4 h, preferentemente 10 min a 2 h, especialmente 15 a 60 min, se puede llevar a cabo (preferentemente cada día) por ejemplo durante 1 a 100 d, preferentemente de 5 a 50 d, preferentemente de 10 a 30 d (habitualmente, la administración se lleva a cabo sólo en días laborables, no en fines de semana, de manera que habitualmente un ciclo de tratamiento se aplica en 3-5 x 5 días consecutivos de administración). Según una forma de realización preferida, el tratamiento se lleva a cabo con una dosis administrada intravenosamente de 0.1 a 100 ml, preferentemente 1 a 50 ml, que corresponde a 215.2 a 21,520 mg de hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero complejado con Zn. En una forma de realización preferida, la preparación farmacéutica según la presente invención contiene una cantidad total de Zn de 0.1 a 25 mg (por dosis), preferentemente de 0.5 a 10 mg, especialmente de 0.5 a 5 mg.

Los ciclos de tratamiento se pueden repetir tras un período libre de tratamiento de 1 a 6, de 1 a 3, preferentemente 2 a 3, meses.

La presente invención se describe adicionalmente en los siguientes ejemplos y las figuras, aunque sin estar limitada a ellos.

La figura 1 representa unos cromatogramas de exclusión por tamaño de hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero y complejos de hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero - Zn solubles en agua formados por adición de 2 o 4 mg de gluconato de cinc (ZnGlu)/mg de N<2>en el hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero.

La figura 2 representa la parte agrandada de los cromatogramas de SE que muestra, con la complejación, un desplazamiento en las posiciones de los picos hacia tiempos de retención más cortos, es decir, mayores pesos moleculares, resultante de la unión de los iones de cinc a las moléculas de péptido. Además, cuando se usan 4 mg en lugar de 2 mg de ZnGlu/mg de N<2>en el hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero, el pico a RT ~ 52.5 min pierde en intensidad, y aparece un pequeño pico adicional a RT ~ 48 min. Los aminoácidos eluyen en el pico a RT ~ 58 min. El menor desplazamiento hacia RT más bajos muestra la formación de complejos de aminoácidos con cinc.

La figura 3 representa una respuesta a la dosis de NPEP-Z sobre la permeabilidad de la BBB.

La figura 4 representa unos datos de transferencia Western de NPEP-Z sobre proteínas endoteliales.

La figura 5 representa unos datos de transferencia Western de NPEP-Z sobre proteínas endoteliales bajo condición de tPA.

La figura 6 representa unos datos de transferencia Western de NPEP-Z sobre proteínas endoteliales bajo condición de fibrina.

La figura 7 representa el porcentaje de expresión de p75NTR sobre superficies de células PC12 tratadas diferentemente con respecto a células tratadas con medio. Las células PC12 se cultivaron durante 24 horas con 100 pl/ml de N-PEP-Z o diluciones de solamente Zn como se indica, y se analizaron para determinar la expresión de p75NTR usando citometría de flujo.

Ejemplos

Preparación de complejos de hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero - cinc

- Experimento de laboratorio

Se añadió con agitación una disolución acuosa de gluconato de cinc (10 ml, 350 - 750 mg) a una disolución de hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero (20 ml, 7-15 mg/ml de nitrógeno (N<2>), pH 2-7). El pH cambió, lo que indica formación de complejo. Tras ajustar a neutro, la suspensión se usó para análisis.

- Experimento piloto

La disolución de hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero (40 l) se ajustó a pH 3 usando HCl 6 N. Se añadió gluconato de cinc (858 g) con agitación. La disolución transparente obtenida se filtró de manera estéril. Se ajustaron 40 ml de la disolución a pH 7.2, y después se centrifugaron antes del análisis.

Caracterización analítica

Para determinar el porcentaje de cinc que forma complejos solubles en agua con péptido y aminoácidos, el sobrenadante se sometió a cromatografía de exclusión por tamaño. Las fracciones recogidas se analizaron para determinar el cinc usando digestión con microondas/ICP-MS.

Para determinar el porcentaje de péptidos y aminoácidos libres en la fracción soluble en agua y en el precipitado, se determinaron el contenido de nitrógeno total y la concentración de aminoácidos libres tanto en el sobrenadante como en el hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero.

Para la cromatografía de exclusión por tamaño, se usó una columna Superdex Peptide 10/300. 50 pl del sobrenadante filtrado se eluyeron con acetato de amonio 100 mM en acetonitrilo al 30%, a un caudal de 0.4 ml/min. La detección de UV se realizó a 214 nm. El eluato se recogió en tres fracciones y se analizó para determinar el cinc. Para la calibración de la columna, se usaron ribonucleasa A, somatostatina y serina.

Para el análisis de nitrógeno, se usó el método de combustión dinámica instantánea. La determinación de la concentración de los aminoácidos libres individuales se basó en RP-HPLC con derivatización precolumna.

El contenido de nitrógeno de los péptidos, calculado restando el contenido de nitrógeno de todos los aminoácidos del contenido de nitrógeno total, se usó como un sustituto para el contenido de péptidos.

La figura 1 representa los cromatogramas de exclusión por tamaño de hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero y la fracción soluble en agua de complejos de hidrolizado de proteína - Zn formados por adición de 2 o 4 mg de gluconato de Zn (ZnGlu)/mg de nitrógeno (N2) en el hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero. La figura 2 representa la parte agrandada de los cromatogramas de SE que muestra, con la complejación, un desplazamiento pequeño en las posiciones de los picos hacia tiempos de retención más cortos, es decir, mayores pesos moleculares, resultante de la unión de los iones de cinc a las moléculas peptídicas. Además, cuando se usan 4 mg en lugar de 2 mg de gluconato de Zn (ZnGlu)/mg de N<2>en el hidrolizado de proteína, el pico a RT ~ 52.5 min pierde en intensidad y aparece un pico pequeño adicional a RT ~ 48 min. Los aminoácidos eluyen en el pico a RT ~ 58 min. El desplazamiento menor hacia RT más bajos muestra la formación de complejos de aminoácidos con cinc.

Tabla 1. Porcentaje de cinc encontrado en las fracciones de SEC individuales de complejos solubles en agua de hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero - cinc cuando se usan 2, 4 (ambos experimentos de laboratorio) o 2.5 (experimento piloto) mg ZnGlu/mg de N<2>en el hidrolizado de proteína.

Tabla 2. Porcentaje de aminoácidos y péptidos encontrado en las fracciones de SEC individuales de complejos solubles en agua de hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero - cinc cuando se usan 2, 4 (ambos experimentos de laboratorio) o 2.5 (experimento piloto) mg de ZnGlu/mg de N<2>en el hidrolizado de proteína.

Efectos del complejo DE péptido-cinc sobre células neuroendoteliales humanasin vitro.

Para investigar una respuesta a la dosis de N-PEP-Z sobre la permeabilidad transendotelial, se sembraron células endoteliales cerebrales humanas en el inserto de un Transwell, y se añadió FITC-dextrano en el pocillo insertado (Li et al., Stroke 50 (2019), 2547-2554). Las células endoteliales cerebrales se trataron con activador de plasminógeno tisular (tPA) (10 pl/ml), o fibrina (1.5 pl/ml) en presencia o ausencia de N-PEP-Z o controles. La señal de FITC-dextrano en el pocillo principal se cuantificó como índice de la permeabilidad transendotelial. Las dosis de N-PEP-Z se adaptaron del estudio preclínico con N-PEP-12 (Windisch et al., J. Neural Transm. 112 (2004), 1331 1343). Las señales de FITC se midieron en el pocillo principal individual tras la retirada del Transwell. Las señales de FITC en el grupo de control se normalizaron entonces a 1, y cualesquiera cambios en los grupos de intervención individuales se calcularon y compararon con el grupo de control. Los datos en las figuras 3 a 6 se presentan como número de veces de cambios de la permeabilidad de BBB frente al control (eje y).

Efecto de N-PEP-Z sobre citocinas inflamatorias y proteínas de unión estrecha

Las células endoteliales cerebrales se trataron con tPA y fibrina en presencia o ausencia de N-PEP-Z durante 24 h. Después del tratamiento, las proteínas totales se extrajeron de las células endoteliales tratadas, y se llevó a cabo el análisis de transferencia Western para cuantificar los cambios de las proteínas. Se examinaron las proteínas para inducir trombosis, inflamación y lesión vascular (que incluyen TNFa, molécula 1 de adhesión intercelular (ICAM1), proteína B1 del grupo de alta movilidad (HMGB1) y NFkB), así como proteínas que median la integridad funcional de la barrera hematoencefálica tales como Zonula Occludens 1, (ZO1), Ocludina, y Claudina 5.

Resultados

Se descubrió que todas las dosis ensayadas de N-PEP-Z redujeron significativamente la permeabilidad endotelial inducida por tPA o por fibrina (figura 3), mientras que en una condición sin estrés, 1.6 mg/ml de N-PEP-Z reforzaron significativamente la integridad endotelial y redujeron la inflamación.

Además, se descubrió que, en comparación con la disolución salina, NPEP-sin Z (sin cinc) y NPEP-bajo pH (ausencia de formación del complejo de péptido-cinc) no alteraron significativamente las proteínas proinflamatorias sin el estrés de tPA o de fibrina. Sin embargo, NPEP-cinc redujo significativamente las proteínas proinflamatorias de ICAM1, HMGB1, y NF<k>B activo en comparación con la disolución salina NPEP-sin cinc y NPEP-bajo pH, mientras que los marcadores de la integridad de la barrera hematoencefálica no se vieron afectados (figura 4). tPA (figura 5) o fibrina (figura 6) aumentaron significativamente ICAM1, HMGB1, TNFa, y NFkB activo, y redujeron las proteínas de unión estrecha, ZO1, ocludina, y claudina 5. NPEP-Z (concentración más baja ensayada en la figura 3) invirtió significativamente las proteínas alteradas por tPA (figura 5) o por fibrina (figura 6).

El impacto positivo observado de N-PEP cinc según la presente invención sobre el estado basal de la inflamación (sin estrés de tPA o de fibrina) muestra el uso de esta composición en condiciones no patológicas que presentan una fuerte contribución de componentes inflamatorios. Tales cambios se producen durante el envejecimiento normal, y están asociados con el deterioro cognitivo en ancianos (Simen et al. Ther. Adv. Chronic. Dis. (2011), 175 195) pero asimismo durante el daño inducido por estrés de la formación del hipocampo (Gulyaeva et al., Biochemistry, (2019), 1306-1328).

Efectos de N-PEP-Z sobre la expresión superficial de p75NTR en células PC12

El receptor de neurotrofina p75NTR es un miembro de la superfamilia de receptores de TNF, y está implicado en la regulación de la supervivencia de las neuronas. Es conocido que el receptor está aumentado en condiciones patológicas que median la apoptosis (para un repaso, ver Dechant G. et al., Nature Neuroscience 2002). Muchos estudios muestran el aumento de p75NTR durante accidente cerebrovascular o lesión cerebral traumática (Grade S. et al., PlosOne 2013; Irmady K. et al., J. of Neurosci. 2014; Shi J. et al., Stem Cell 2013), así como en la enfermedad de Alzheimer (Y Hu et al., Cell and Disease 2013; S. Ito et al., Neurochemistry International 2016; B. Charkravathy et al., Journal of Alzheimer's disease 2009) y otras varias enfermedades neurodegenerativas (para un repaso, ver Meeker R. et al., J Neuroimmune Pharmacol. 2014).

Método

Para investigar un efecto putativo de N-PEP-Z sobre la expresión del receptor p75NTR, se sembraron células PC12 en placas de 6 pocillos y se trataron con N-PEP-Z que comprende concentraciones de Zn de 0 a 0.12 con respecto a la disolución madre de N-PEP-Z (31,84 mM de Zn). Las diluciones se prepararon como se describe en la tabla 1 (una disolución de gluconato de Zn se diluyó de la misma manera en P<b>S, que sirve como “control de solamente Zn”). Las células PC12 se trataron con 100 pl/ml de las diluciones respectivas durante 24 h. Después del tratamiento, las células PC12 se recogieron para la tinción de la superficie con anticuerpo anti-p75NTR conjugado con Alexa-647. Las señales de Alexa-647 se midieron usando citometría de flujo, y se normalizaron a células PC12 tratadas con medio (% de expresión). Los datos en la figura 7 se presentan como % de expresión del receptor p75NTR (eje y).

Tabla 3: diluciones utilizadas para el tratamiento de N-PEP-Z

Resultados

La curva de respuesta a la dosis de N-PEP-Z mostró una reducción significativa de la expresión superficial de p75NTR en comparación con el tratamiento de solamente Zn. El punto de inflexión de la curva respuesta a la dosis se determinó a 0.06x Zn (figura 7).

En este estudio, se investigó la disminución del receptor p75NTR mediante complejos de N-PEP-Z en las superficies de células PC12. Estos datos muestran la actividad protectora de los complejos de N-PEP-Z según la presente invención durante la progresión de la enfermedad neurodegenerativa al regular niveles elevados de p75NTR.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Método para producir una composición de hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero, que comprende las etapas siguientes:

- proporcionar un hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero,

- añadir unos iones de Zn al hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero para formar un complejo que comprende los iones de Zn y el hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero,

2. Método según la reivindicación 1, en el que el hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero es un hidrolizado de tejido cerebral porcino o bovino, preferentemente un intermedio del procedimiento de fabricación de hidrolizado de proteína de cerebro, especialmente un producto intermedio enriquecido en péptidos.

3. Método según la reivindicación 1 o 2, en el que los iones de Zn se añaden como tales como gluconato de Zn, sulfato de Zn o acetato de Zn, preferentemente como gluconato de Zn, y preferentemente en una cantidad de 0.1 a 500 mg/ml, preferentemente desde 0.5 a 100 mg/ml, especialmente desde 1 a 70 mg/ml.

4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero es un hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero hidrolizado enzimáticamente, preferentemente hidrolizado mediante pancreatina, tripsina, pepsina, quimotripsina, papaína, carboxipeptidasa, o mezclas de las mismas.

5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el pH de la composición de hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero se ajusta al formar el complejo que comprende los iones de Zn y el hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero a un pH de 3.0 a 9.0, preferentemente

(a) a un pH de 5.0 a 9.0, más preferido a un pH de 6.0 a 8.0, especialmente a un pH de 7.0 a 7.5; o

(b) a un pH de 3.0 a 6.0, más preferido a un pH de 3.0 a 5.0, especialmente a un pH de 4.0 a 5.0, y/o a un pH de aproximadamente 4.7, a saber, de 4.5 a 4.9.

6. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que los iones de Zn se añaden al hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero en una cantidad relativa de 0.01 a 50 mg de Zn por mg de hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero (como mg de N<2>), preferentemente de 0.05 mg a 10 mg de Zn por mg de hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero (como mg de N<2>), especialmente 0.1 mg a 4 mg de Zn por mg de hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero (como mg de N<2>).

7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero complejado con Zn se ajusta a una concentración de 0.05 a 50 mg/ml, preferentemente desde 0.1 a 25 mg/ml, especialmente desde 0.2 a 20 mg/ml.

8. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero complejado con Zn se acaba en una preparación final, preferentemente en un complemento nutricional o en una preparación farmacéuticamente aceptable, especialmente insertando el hidrolizado de proteína complejado con Zn en una forma de dosificación nutricionalmente aceptable o en un recipiente farmacéuticamente aceptable.

9. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero complejado con Zn es secado, preferentemente secado por pulverización, secado mediante lecho fluidizado o liofilizado.

10. Composición que comprende un hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero complejado con Zn, preferentemente obtenible según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

11. Complemento nutricional que comprende un hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero complejado con Zn, preferentemente obtenible según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

12. Complemento nutricional según la reivindicación 11 en forma de dosis, preferentemente como cápsulas, pastillas, comprimidos, píldoras y otras formas similares, sobres de polvo, ampollas de líquidos, botellas dispensadoras de gotas, y otras formas similares de líquidos y polvos concebidas para ser ingeridas en cantidades unitarias pequeñas medidas.

13. Complemento nutricional según la reivindicación 11 o 12, en el que la composición contiene 5 a 1000 mg, preferentemente 7.5 a 500 mg, especialmente 10 a 300 mg, de hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero complejado con Zn por ml en disolución acuosa, o se puede reconstituir en tal disolución acuosa.

14. Composición farmacéutica que comprende un hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero complejado con Zn, preferentemente obtenible según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

15. Composición farmacéutica según la reivindicación 14, para la utilización en un tratamiento terapéutico, en la que la composición contiene hidrolizado de proteína de cerebro de mamífero complejado con Zn.